RU1834663C - Способ лечени вирусных инфекций - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к медицине и может быть использовано дл  активации естественных защитных сил организма. Цель - повышение естественных противовирусных реакций и креплени  иммунной системы в локализованных отделах организма. В качестве иммуномодул тора используют препараты двунитчатой РНК с неправильным св зыванием, представл ющий собой комплекс полиинозината и полицитидилата. содержащий от 1:5 до 1:30 урациловых или гуанидиновых оснований формулы rln r(Ci2-i4 V)n или rln(C29. G)n и ввод т его в дозе 0,1-1000 мкг на 1 мл. Способ позвол ет повысить резистентность организма к вирусной инфекции.1 табл.

Description

Изобретение относитс  к медицине и может быть использовано при лечении инфекционных заболеваний.

К числу новейших продуктов, которые могут сыграть решающую роль в борьбе с инфекционными и раковыми заболевани ми , относ тс  так называемые имму- номодул торы такие, как интерфероны, интерлекины и факто.р некроза опухоли. Они представл ют собой белкосодержащие лекарственные средства, которые способны активизировать естественные защитные силы организма.

Цель изобретени  - повышение естественных противовирусных реакций и укрепление иммунной системы в локализованных отделах организма человека.

Способ осуществл етс  следующим, образом .

РНК с двойной нитью, особенно рибонуклеиновые кислоты с неправильным св зыванием , восстанавливают нормальную кинетику рибонуклеазы L и продуктов разложени . Более того, скорость восстановлени  нормального состо ни  с помощью двуниточной РНК может быть ускорена посредством предварительного воздействи  лимфокинами.

Двуниточные РНК представл ют собой синтетические полинуклеотидные комплексы , включающие по две парные нити, Под двуниточной РНК с неправильным св зыванием подразумеваютс  такие кислоты, в которых водородные св зи (упаковка оснований) между парными нит ми  вл ютс  сравнительно неповрежденными, т.е. прерывание имеет место в среднем в одной паре оснований на каждые 29 последующих групп. Неправильное св зывание есть нарушение нормальной геометрической конфигурации двойной спирали РНК за счет провисани  нитей внутрь (или наружу). Эти участки представл ют собой точки повышенной чувствительности двуниточной РНК к биологической обработке рибонуклеаза- ми. Следует правильно понимать термин

сл

с

оо

СО

N

О

о со

Сд

двуниточна  РНК с неправильным св зыанием .

Двуниточна  РНК может представл ть обой комплекс полиинозинатз (поли 1) и олицитидилата (поли С), содержащий рациловые (У) или гуанидиновые (G) осовани  в определенных соотношени х, например, от 1:5 до 1:30 таких оснований

ПОЛИ I С4-29Х V ИЛИ G).

Двуниточна  РНК может иметь общую фор-.

улу Г|п (Cl 1-14 /)пИЛИГ|п (С12 V)n.

Значение п мен етс  от 4 до 29. Другие подход щие примеры двуниточной РНК рассматриваютс  далее,

Основу двуниточной РНК с неправильным св зыванием, использование которых  вл етс  предпочтительным в соответствии с предлагаемым изобретением, составл ют сополинуклеотиды, выбираемые из поли (Cn, G), где п - множитель, принимающий значени  от 4 до 29. Эти РНК  вл ютс  аналогами комплексов из полирибоинозиновой и полирибоцитидиловой кислот, образующимис  путем модификации rln Cn в цел х внедрени  непарных оснований (урацило- вых или гуанидиновых) вдоль полирибоци- тидилатной нити (гСп). Альтернативным способом получени  двуниточной РНК  вл етс  модификаци  основной рибосильной нити полирибоиноциновой кислоты (г1п), например , за счет включени  2-0-метилрибо- сильных групп. Эти аналоги соединени  rln г Cn, имеющие неправильное св зывание ,  вл ютс  предпочтительными. Те из них, которые отвечают формулам г1п г(Сп- 14, V)n и rln г(Саэ, G)n, описаны Картером и Т оу в патентах США Ns 4130641 и № 4024222, упоминаемых здесь в форме ссылок на источник. Описанные в этих патентах двуниточные РНК, вообще говор , пригодны дл  использовани  в соответствии с предлагаемым изобретением.

В предпочтительной модификации РНК с неправильным св зыванием формулы rln(Ci2,V)n область, включающа  непрерывный участок из 6-12 пар оснований, т.е. длиной от половины до полного витка спирали РНК, служит в качестве биотриггера, вызывающего выделение лимфокинов и в качестве внеклеточного софактрра ферментов, участвующих ва естественных противовирусных реакци х. -Области неправильного св зывани , состо щие из урацильных групп, внедрены с определенной периодичностью в полипиримидйновую цепочку дл  ускорени  гидролиза РНК и устранени  таким образом токсичности.

Другими примерами возможных модификаций двуниточных РНК с неправильным

св зыванием, пригодных дл  использовани  в соответствии с предлагаемым изобретением ,  вл ютс :

поли (I), поли (, V) поли (I), поли (Ст, V)

поли (I), поли (Ci3, V)

поли (I), поли (С22. V)

поли (I), поли (С20, G)

ПОЛИ (I), ПОЛИ (С29, G)

поли (I), поли (Ср/23 С р)

Обычно вводимые дозы двуниточной РНК составл ют 0,1-1000 мкг на 1 мл жидкости в теле пациента. Термин изолированна  жидкость тела относитс  к раствору

сывороточной жидкости, солей, витаминов и т.п., который циркулирует в организме, омыва  ткани. Объем жидкости в теле пациента определ ютс  по имеющимс  медицинским таблицам, которые содержат

сведени  о взаимосв зи веса реципиента с

объемом содержащейс  в его или ее теле жидкости. Эта величинаа представл ет собой суммарный объем содержащейс  в теле пациента жидкости, который и  вл етс  тем

объемом, который используют дл  установлени  необходимого дл  сохранени  равновеси  количества РНК с двойной нитью. Например, в теле пациента весом 60 или 70 кг содержитс  примерно 5-6 л жидкости.

При использовании обоих агентов (двуниточна  РНК и лимфокин) их можно вводить в виде смеси, раздельно, но одновременно или раздельно в определенной последовательности .

К введению двуниточной РНК и лимфокина в комбинации относ тс  случаи, когда агенты ввод тс  вместе в виде терапевтической смеси, а также те процедуры, при которых два агента ввод т раздельно, но

одновременно, например, одному и тому же пациенту по разным внутривенным пут м. Способ введени  в комбинации также включает раздельное введение лекарств, при котором сначала ввод т одно, а спуст 

короткий промежуток времени - другое ле- карственное средство.

П р и м ер 1. Ввод т образцы двуниточной РНК с неправильным св зыванием, представл вшей собой двуниточную РНК с

неправильным св зыванием общей формулы rln r(Ci2, V)n в количестве 20-1000 г еженедельно группе лиц весом 40-70 кг и проводил анализ их сывороточных жидкостей , в частности, влагалищных секреций и

мужского э кул та на присутствие в них индуцированных двуниточных РНК защитных медиаторов реципиента. В ходе групповых клинических испытаний изучались аналогичные параметры на индивидах, которым было проведено вливание их интерферонов

или интерлейкинов, с целью вы влени  специфики процессов, если это имело место. С помощью световой микроскопии было установлено , что жидкость, вз та  у пациентов, которым были сделаны вливани , содержали различные клетки, в т.ч. мононуклеарные, клетки сквомозного эпители  (образцы из жестких половых органов) и сперматозоиды (мужска  семенна  жидкость), а также аморфную массу клеточных остатков. В нижерасположенной таблице привод тс  обобщенные результаты наблюдений за трем  пациентами при лечении их с помощью двуниточных РНК с неправильным св зыванием в течение различных периодов времени.

В случае пациентов А и В отмечены высокие титры вируса иммунодефицита человека (HLV-III) из э кул тов. Измерени  проводили при объеме э кул тов 2,0-4,0 см с помощью сокультуры. Дл  этого брали мононуклеарные клетки крови обычного донора , который подвергалс  стимул ции с помощью фиттогемагглютинина в течени 2- 4 дней, и выращивали культуру в течение 28 дней, а затем проводил измерени  на присутствие внеклеточного вируса, методом иммуносорбентного анализа с. ферментной меткой. Титр сокультуры определ ли по средней оптической плотности (оптическа  плотность при 490 нм) образца дл  иммуносорбентного анализа после вычитани  отрицательного контрольного значени  (менее 0,1). У пациента С отмечено хроническое про вление вируса простого герпеса во влагалищных секреци х, св занных с формированием периональной визикулы. Вирус простого герпеса культивировали по способу Раппа с использованием конфлуентных клеток HEL, репродуцированных в питательных сло х чашки Петри толщиной 33 мм.. Анализ образцов жидкости пациента с помощью жидкостной хромотографии при высоком давлении после системного введе- ни   двуниточной РНК показывает, что произошло увеличение количества защитных медиаторов реципиента. Влагалищные и семенные жидкости пациентов анализировали на наличие различных компонентов естественной (21 - 5 - олиго А/рибонуклеаза А) противовирусной реакции в соответствии с ранее описанным мною применительно к периферическим мононуклеарным .клеткам крови.

Дл  оценки специфичности процесса проводили исследовани  на подобных пациентах (или животных), котрые проходили лечение высокими дозами (10 млн. IRV/d/) различных интерферонов и йнтерлекинов..

Однако в этих случа х не удалось обнаружить увеличени  количества участвующих в борьбе с болезнью медиаторов в изолированных жидкост х. При комбинированном 5 системном введении лимфокинов и двуниточной РНК с неправильным св зыванием скорость вы влени  медиаторов в этих изолированных жидкост х значительно возросла . Жидкостна  хроматографи  при высоком

10 давлении в сочетании с методами радиационного св зывани  и радиоимунного анализа репродуцированной РНК подтвердила такую специфическую особенность, как выработка во всех част х тела нового 2 -5 -оли15 гоаденилата в результате применени  двуниточной РНК, причем в количествах, достаточных дл  защиты организма от болезни .

Идентификацию методом жидкостной

0 хромотографии при высоком давлении проводили после подготовки образца с использованием трихлоруксусной кислоты и ацетонового осаждени . Использовали аналитическую колонку Уотерса Cie микрон

5 Бондапак, при этом создавали градиенты метанола и воды в буферном растворе из фосфагата аммони  (50 мл) при рН 7.0. Тест, проводившийс  с помощью метода жидкостной хромотографии, соответствует стан0 дартной калибровке с аутентичными РзАз и РзА4, которые были синтезированы ферментативным путем. На графике резко выдел ютс  те пики, которые по вились при проведении жидкостной хромотографии в

5 соответствии с данной схемой через 6,8- 7,0 мин или через 12 мин, поскольку именно они указывают на наиболее активные медиаторы, в частности соответствующие аутентичным РзАз и РзАз,  вл ющихс  соот0 ветственно тримером и тетрамером 2-5 олигоаденилатных медиаторов.

Обнаруживаетс , что механизм, обусловивший эти  влени  в локализованных отделах организма, включает, по крайней мере,

5 частично сигнальный трансдуктивный процесс , входе которого двуниточна  РНК действует на окружение клеток или стенки расположенного вблизи кровеносного сосуда , вызыва  волнообразный процесс вклю0 чени  формировани  медиаторов в самой локализованной секции.

Изобретатель установил, что уникальна  структура двуниточной РНК с неправильным св зыванием  вл етс  наиболее

5 благопри тной дл  практического использовани  в качестве объекта изобретени . Это обусловылено тем фактом, что неправильное св зывание в РНК с двум  нит ми приводит к образованию слабых областей в относительно стабильном в остальной части

комплексе. Результатом этого  вл етс  то, что маленькие биоактивные фрагменты двуниточной РНК, будучи более мобильными, получают доступ к специализированным отделам организма, обуславлива  про вление в них локального высокоспецифичного им- муномодул торного и противовирусного эффекта. Опыт свидетельствует о том, что получение доступа к другим изолированным отделам не  вл етс  свойством большинства экзогенно примен емых двуниточных РНК.

С целью подтверждени  предположени  о том, что новые молекул рные разновидности двуниточной РНК, образующиес  в процессе биоразложени , способствуют созданию требующегос  высокого уровн  медиаторов естественной защитной системы (например, системы 2 -5 А) в различных биологических жидкост х (жидкости в теле пациента), проводили эксперименты как в лабораторных услови х, так и на живом организме . , А. Сравнение разложени  поли I, поли С и двуниточной РНК с неправильным св зыванием под действием нуклеазы.

Чувствительность двуниточных РНК к гидролизу нуклеазной изучалась с помощью радиоактивных поли I, поли С и двуниточных РНК с неправильным св зыванием. По- лиинозинова  кислота (8- С) (спектральна  активность 3,6 мк кюри (мкмоль) была куплена у фирмы Р-Брокемикалз, Эта маркированна  полиинрзинова  кислота имела более 1000 оснований по длине молекулы. Полиинозиновую кислоту (8- С) смешивали с немаркированными поли , поли С или двуниточной РНК с неправильным св зыванием , смесь подвергали тепловой денатурации и реданатурации с получением радиоактивных двуниточных РНК.

В первоначальных исследовани х определ ли расщепление нуклеазой Si (Е. С.3.1.30. 1). Нуклеаза Si расщепл ет нуклеиновые кислоты с одной нитью, оставл   сдвоенные области неповрежденными. Рас щепление с помощью нуклеазы Si поли I, поли С имело монофазнывй кинетический механизм, при этом скорость генерировани  двуниточной РНКтрихлоруксусной кислоты достигала 1,4% в минуту. После тепловой денатурации скорость гидролиза увеличивалась до 1,8% в минуту.

Аналогичные эксперименты с использованием маркированных двуниточных РНК с неправильным св зыванием продемонстрировали , что в этом случае кинетический мэ- ханизм был бифазным. Исходна  двуниточна  РНК с-неправильным св зыванием имели быстро разлагающийс  компонент (3,2% в минуту), за разложением которого следовала фаза расщеплени  боле медленно разлагающегос  компонента (0,5% в минуту). Денатурированна  двуниточна 

РНК с неправильным св зыванием разлагалась сравнительно быстро (4,5% в минуту). Степень общего разложени  исходных поли I. поли Си двуниточной РНК с неправильным св зыванием спуст  45 мин, после

начала эксперимента была примерно одинаковой . Как сообщалось ранее, скорость гидролиза двуниточной РНК с неправильным св званием изначально была больше, чем поли I. поли С. Однако двухфазный кинетический механизм расщеплени  двуниточной РНК с неправильным св зыванием свидетельствует о  вном физическом различии между этими материалом и хорошо фиксированными (полностью спаренными по

основани м) молекулами поли I, поли С. Результаты указывают на наличие существенного отличи  во вторичной и третичной структурах, которое приводит к неодинаковой чувствительности этих двуниточных

РНК к нуклеазе и обуславливает получение неожиданных биологических результатов, описанных в предлагаемой патентной за вке . Кроме того, значительное, т.е. шестикратное уменьшение скорости гидролиза

компонентов определенной двуниточной РНК во второй фазе по сравнению с первой и сравнительно слабый гидролиз медленно расщепл ющегос  компонента указывают на то, что в двуниточных РНК этого типа

существует  дро, обладающее относительной стойкостью по отношению к нуклеазе. Это не имеет места в случае поли I, поли С. Разложение двуниточной РНК с неправильным св зыванием под действием нуклеазы проводили с использованием стандартной тканевой питательной среды. (RPMI 1640), дополненной дезактивированной теплом сывороточной жидкостью эмб- .риона теленка или человека в количестве

10%. Эта.сывороточна  жидкость  вл етс 

источником рибонуклеаз. Разложение двуниточной РНК с неправильным св зыванием в этой среде происходило быстро, примерно 40% этой двуниточной РНК дало

растворимую трихлоруксусную кислоту в течение 3 мин. При дальнейшем расщеплении в течение почти двух часов не отмечалось дополнительной деградации в значительной степени. Серийное разбавление среды

после трехминутной инкубации вс присутствии двухниточной РНК с неправильным св - зыванием снова продемонстрировало высокую степень разложени  - примерно 50% при разбавлении 1:16, котора  не возрастала при использовании более концентрировэнной сывороточной жидкости. Поскольку количество осаждаемого трехук- сусной кислотой материала остаетс  относительно посто нным в течение длительных периодов времени и при различных степен х разбавлени , то пролонгированна  стабильность осаждаемого трехуксус- ной кислотой материала, веро тно, не св зана с его преимущественной деградацией . Эти результаты также подтверждают .наличие в молекуле двуниточной РНК с неправильным св зыванием  дра резистент- ности по отношению к нуклеазе.

Б. Молекул рный вес резистентного по отношению к нуклеазе  дра двуниточной РНК с неправильным св зыванием.

Молекул рный вес определ ли путем установлени  коэффициентов седиментации . Необработанные образцы двуниточной РНК анализировали в ультрацентрифуге Бекмэн модел Е при скорости 48000 оборотов в минуту и 20°С. Коэффициенты седиментации рассчитывали по п ти точкам,при интервале в 8 мин. Образцы двуниточной РНК разбавл ли гак, чтобы оптическа  плотность (OD26o) e буферном растворе А/0.15 молей NaCI 0,01 моль фосфата натри , 0,001 мольМдС а рН 7,2/ достигала 0,63. Образцы двуниточной РНК, обработанные нуклеазой Si, анализировали при скорости 52000 оборотов в минуту, 20°С в буферном растворе с OD260 0,65. Коэффициенты седиментации рассчитывали методом полувысот и второго момента.

Коэффициенты седиментации, двуниточной РНК, определенные методом полувысот и второго момента, составл ли соответственно 12,74 и 13,29. После гидролиза в присутствии нуклеазы Si коэффициенты седиментации двуниточной РНК, определ вшиес  методом полувысот, снизились до 6,18, а полученные методом второго моменте, уменьшились до 7,21. Эти данные показывают, то при обработке нук- лазрй Si двуниточна  РНК с неправильным св зыванием расщепл етс  на низкомолекул рные фрагменты.

С. Биологическа  активность резистентного по отношению к нуклеазе  дра двуниточной РНК.Биологическа  активность расщепленной нуклеазой двунитотчной РНК испытывалась с помощью стандартного анализа на вы вление замедлени  роста культуры опухолевой ткани. Двуниточную РНК инкубировали с нуклеазой Si в течение 120 мин, а затем использовали дл  ингибировани  роста культуры клеток человеческой фибро- сэркомы НТ 1080 С14. Через 72 ч обработки двуниточной РНК с неправильным св зыванием , расщепленной нуклеазой, в количестве 50 мкг/мл отмечалс  определенный рост необработанных контрольных клеток. Замедление роста клеток необработанной 5 двуниточной РНК составл ло примерно 50%. Аналогичное замедление наблюдалось и в случае использовани  двуниточной РНК с неправильным св зыванием, обработанной нуклеазой Si. причем вне за исимо10 сти от степени обработки нуклеазой Si. Теплова  денатураци  в сочетании с обработкой нуклеазой Si приводила к исчезновению антипролиферативного вли ни  двуниточной РНК с неправильным св зыва15 ниемГ

Эти результаты указывают на то, что антипролиферативна  активность двуниточной РНК с неправильным .св зыванием сохран етс  даже при длительной обработ0 ке нуклеазой. В св зи с тем, что резистентное по отношению к нуклеазе  дро формируетс  в этой системе в первые 15-20 мин расщеплени , то в последующие моменты времени торможение роста указыва5 ет на сохранение антипрофилеративной активности в резистентном по отношению к нуклеазе  дре двуниточной РНК. Это, в свою очередь, может  вл тьс  причиной удивительно интенсивной выработки биоло0 гически активных медиаторов в различных отделах организма,

С целью дальнейшего изучени  биологической активности резистентного по шению к нуклеазе  дра, проводили

5 расщепление двуниточной РНК с помощью нуклеазы Si в течение 60 мин. Аликвоту этого материала затем подвергали осаждению метанолом с целью удалени  низкомолекул рных продуктов расщеплени , которые не

0 могут быть осаждены с помощью такой процедуры . Дл  определени  биологической активности культуру клеток глиомы человека линии А 1235 обрабатывали нерасщеппен- ной двуниточной РНК в количестве 200

5 ммкг/мл, рэсщепленннойнуклеа,зой и осажденной этанолом двуниточной РНК и расщепленным нуклеаэой Si Амплигеном. Через 72 часа в культуре клеток линии А 1235 торможение в случае Амплигена составило 99,8%. при

0 использовании обработанного нуклеазой Si Амплигена - 78,4%, а дл  Амплигена.обрабо- танного нуклеазой и осажденного этанолом - 84,4%. Таким образом,, антипролиферативна  активность двуниточной РНК сохран лась при

5 различных видах обработки.

Оценивали также способность этих пре- паратов индуцировать 2-5А синтетазу {АТФ:(2. 51 - олиго (А) аденилил-трансфера- за) (ЕС 2.7.7.19) в этих клетках линии А 1235. Осадок клеток после центрифугировани 

промывали фосфатно-солевым раство- ром,ресуспендировали в 5 мл раствор ющего буферного раствора (20 миллимолей Трис, рН 7,5; 0,1 миллимолей этилендиа- минтетрауксусной кислоты, 0.25 мол  сахарозы , 50 миллимолей KCI 2 миллимол  MgCte и 1 милливоль DTT) и выдерживали на льду в течение 5 мин. После двукратного промывани  фосфатносолевым буферным раствором осадки клеток ресуспендировали в 0,1 мл буферного раствора В (20 миллимолей HEPES, рН 7,5; 5 миллимолей MgCb. 120 миллимолей DTT и 10% глицерина), содержащего 0,5% Monldet - Р40, и выдерживали на льду дл  растворени  клеток. Цитоплазменные экстракты получали центрифугированием в течение 6 мин (8000 г) и хранили в виде 50-миллилитровых аликвот при-70°С.

2-5А синтетазу анализировали в соответствии с описанным методом (Оухадоль- ник и др., Biochemistry 22: 4153, 1983). Отта вший экстракт (эквивалент 25 мг белка ) смешивали с 30 мл упакованной поли (rl). поли (гС) - агарозой и инкубировали при 25°С в течение 20 мин. Несв занный белок удал ли двукратным промыванием в 0,4 мл буферного раствора В. Ферментативный синтез 2-5-олигоаденилатов (2-5А) инициировали добавлением 10 мл буферного раствора В, содержащего 2,5 миллимол  ( р) аденазин - 5 - трифосфата (0,12 Кюри) мил- лимоль), 2,5 миллимол  DTT, 3 единицы (мл креатиновой фосфокиназы и 10 молей креа- тинового фосфата). После 20-часовой инкубации при 30°С агарозу отдел ли центрифугированием (3 мин., 8000 г, 25°С). Смесь олигомеров 2-5А во всплывшем отстое анализировали в колонке дл  диэтила- миноэтилцеллюлозной хромотографии в соответствии с описанием Доетша и др. (Nature:291:355, 1981). Образование продукта устанавливали по величине изменени  радиоактивности при замещении материала в колонке дл  д иэтиламиноэтил- целлюлозной хроматографии буферным раствором, содержащим 0,35 мол  KGI, деленнойна общую величину полученной радиоактивности .

Синтез 2-5А олигомеров путем инкубировани  с освобождением из клеток экстрактом двуниточной РНК, обработанным нуклеазой. после осаждени , показал, что переход аденазин - 5 -трифосфата в 2-5А олигомер зависит от времени. Получено несколько удивительных результатов. Во-первых , через 18 часов инкубации освобожденных от клеток экстрактов с необработанной двуниточной РНК с неправильным св зыванием удельна  активность 2-5А синтетазы

составила 41,5. Во-вторых, после обработки нуклеазой Si было отмечено заметное увеличение конверсии аденозин-5 -трифосфата в 2-5А синтетазу. Например, после 18 часов

инкубации удельна  активность достигала 284, что почти в 7 раз больше, чем в случаев необработанной двуниточной РНК с неправильным св зыванием. В-третьих, при использовании двуниточной РНК, обработайной нуклеазой Si после осаждени , максимальный выход синтетазы 2-5А наблюдалс  после 12-часовой инкубации. Эти данные показывают, что ферментативный синтез тримеров, тетрамеров и более сложных олигомеров 2-5А значительно увеличиваетс  после обработки двуниточной РНК с неправильным соединением нуклеазой Si. Позитивна  св зь увеличени  ферментной активности с уменьшением размеров двуниточной РНК  вл етс  свидетельством того, что здесь может иметь место взаимодействие с аллостериновым модификатором, т.е. частично расщепленной двуниточной РНКс неправильным соединением, которое

может приводить к его св зыванию и улучшению активации синтетазы 2-5А по сравнению со случаем необработанной двуниточной РНК с неправильным св зыванием . Терапевтическое значение таких наблюдений  вл етс  очевидным. В тех случа х, когда низкомолекул рные продукты разложени  обработанной нуклеазой Si, двуни- тотчной РНК с неправильным св зыванием удал ли путем осаждени , максимально высокий синтез 2-5А синтетазы наблюдали после 12 часов инкубации. Максимально активное формирование синтетазы 2-5А при использовании двуниточной РНК, обработанной нуклеазой Si после осаждени  указывает на то, что резистентное по отношению к нуклеазе  дро может активизировать 2-5А синтетазу точно так же, как это происходит при активации с помощью двуниточной РНК с неправильным св зыванием, обработанной нуклеазой после 18-часовой инкубации .

Эти данные подтверждают наличие в двуниточной РНКс неправильным св зыванием биологически активных фрагментов и

. служат объ снением физической основы терапевтической активности этих фрагментов в биологической жидкости. Эти данные же свидетельствуют о том, что биологическа  активность этих фрагментов больше.

чему исходного соединени .

Пример 2. Другим примером практического применени  изобретеник  вл етс  предотвращение заболеваний, распростран емых половым путем, например, таких,

как цитомегаловирусные инфекции. Цито- мегаловирус (ЦМВ). вход щем в семейство вирусов герпеса, только в США заражено более 1 млн. человек. У людей с ослабленной иммунной системой он может вызывать желудочно-кишечные расстройства или слепоту (обе серозные поверхности легко инфицируютс  вирусами, а вместе с тем не отличаютс  доступностью дл  многих системно примен емых противовирусных аген- тов).ЦМВ передаетс  половым путем. Более высока  степень торможени  (ингибирова- ни) может быть достигнута путем генерировани  с течением времени биоактивных фрагментов (например, при введении двуниточной РНК с неправильным св зыванием (Амплиген). Например, показано, что ингибирование ЦМВ после 24-часового воздействи  фрагментов Амплигена достигает 100%. Такое регулируемое выделение биоактивного материала, как происходит при использовании двуниточной РНК относительно нетоксичного типа, не может быть легко достигнуто в случае применени  мазей местного действи  и подобных средств.

Генерирование биоактивных фрагментов двуниточной РНК подтверждают исследовани  культуры тканей с ЦВМ. Часто поражени  ЦМВ называют цетамега- ловирусными инкулузи ми, последние представл ют собой обнаруживаемые в увеличенных клетках, пораженных вирусом, включени . Цетамегаловирусы человека составл ют подгруппу вирусных агентов, тесно св занных или вход щих в группу вирусов герпеса. Несмотр  на повсеместное распространение, число лиц, пораженных ЦМВ, переданным половым путем в США, по оценкам, достигло в 1988 г. 1 илн. человек. Инфицирование обычно  вл етс  бессимптомным, однако, у лиц с ослабленной иммунной системой могут возникать желудочно-кишечные расстройства или слепота . Особенно чувствительны к ЦМВ новорожденные , этот вирус-также может быть причиной выкидышей, мертворождени  и послеродовой смерти.

В данном эксперименте использовали следующие процедуры и материалы.

Извлекали фибропласты крайней плоти человека у новорожденных и выдерживали при низкой пассировке(20) в физиологическом растворе с сол ми Эрла,.куда добавл ли 10% сывороточной жидкости эмбриона быка, 2 миллимол  L-глютамина, 1 миллимоль пи рувата натри , 20 миллимо- лей буфера HEPES и антибиотики. После сли ни  клеток их выдерживали в вышеописанном растворе, из которого было удалено

5% сывороточной жидкости эмбриона быка. Ежедневно проводили анализы клеток на бактериальное или микоплазменное загр знение .

5В исследовани х использовали штамм

человеческого цетамегаловируса (ЦМВ ATpC/VR - 538. ветвь AD 169). Он состо л из второго посева в фибропласт крайней плоти человека, который собирали, когда действи- 10 ем ЦМВ было охвачено 75% реципиентных клеток. Освобожденный из клеток штамм вируса помещали в трубки дл  хранени  и держали при -120°С. Тесты на бактериальную и микоплазменную стерильность дали

5 отрицательные результаты. Титр инфекционной активности препаратов шиамма ЦМВ определ ли на клетках фиброшпста крайней плоти человека.он составл л 4x10 флю- орисцентообразующих инклуэий на

0 миллилитр (см.далее).

Использовали лиофлизид - клинический сорт Амплигена (двуниточна  РНК с неправильным св зыванием, поли I, поли Ci2, V фирма Нем рисерч, Роквилл, шт.

5 Мэриленд, США). В соответствии с инструкци ми производител  Амплиген был реструктурирован , аликвотирован и хранилос  при -120°С.Дл  каждого эксперимента проводили размораживание свежей аликвоты

0 путем вращени  в вод ной бане при 50°С и разводили в вышеописанной тканевой питательной среде до нужных концентраций.

Лекарственное средство инкубировали с клетками фибропластов крайней плоти че5 ловека при различных услови х. К числу измен емых параметров относились: (1) концентраци  Амплигена; (2) последовательность воздействи  Амплигеном на вирусные инклузии; (3) продолжительность

0 воздействи  Амплигена на эти клетки фибропласта . Жизнеспособность обработанных Амплигеном клеток фибропласта краййей плоти человека была такой же, как и в случае необработанных клеток, что опре5 дел ли по инклузии голубого трипана (т.е. 99%). Конфлуентные клетки фибропластова крайней плоти человека культивировали на круглых покровных стеклах в ампулах с кожухом емкостью 3,7 мл (1 драхма). Вирусную

0 инфекцию инициировали инкубированием этих ампул с 0,25 мл культуры ЦМВ соответствующего разбавлени . Клетки крайней плоти человека подвергали воздействию ЦВМ в течение одного часа (700 кг, 37°С)

5 дл  обеспечени  поглощени  вируса. Ампулы промывали 2-3 раза дл  устранени  внеклеточного вируса. Затем в ампулы снова помещали 1 мл тканевой питательной среды и обычно инкубировали их 18-24 часа, при37°С-72 часа.

Репликацию ЦМВ измер ли следующим образом. Вирусную репликацию останавливали , фиксиру  фибропласты крайней плоти человека в 100%-ном ацетоне. Покровные стекла, на которых находились прилипшие клетки этих фибропластов, промывали и инкубировали с моноклональным антителом мыши (Дюпон) антицетамега- ловирусного типа, специфичным дл  непосредственного предшествующего белка массой 72 килодальтона. Св занное антитело детектировали путем добавлени  антиагента IgGF /ab/2/э IGMA/ марки FITC. Инфицированные вирусом клетки давали  блочно-зеленое  дерное флюоресцентное свечение при рассмотрении в эпифлюорес- центном микроскопе с 250-кратным увеличением . В микроскопе осуществл лс  подсчет числа инфицированных клеток (т.е. тех, что; содержали дающие  дерное флюо- рисцентное свечение инклузии). Препарат позитивного штамма разбавл ли так, чтобы в отсуствие Амплигена он позвол л получать 200-1200 зараженных ЦМВ клеток в расчете на одно предметное стекло через 24 часа инкубировани . Это достигалось при мультиплетности инфекции 0,04.

Определ ли среднее число инклузии ЦМВ дл  репликатиых покровных стекол в услови х всех экспериментов и сравнивали результаты с данными дл  позитивных контрольных клеток, не получавших Амплиген. Параллельно оценивали негативные контрольные образцы, которые не подвергали воздействию Амплигена или ЦМВ. Противовирусна  активность Амплигена рассчитывалась в соответствии со следующей формулой:.

% ингибировани  инклузии ЦМВ-среднее число инклузий ЦМВ/покровное стекло дл  обработанных Амплигеном клеток НГГ 100% - среднее число инклузии ЦМВ/покровное стекло дл  необработанных контрольных клеток НГГ

Данные о вли нии продолжительности предварительной обработки Амплигеном на инфицирование фибропластов крайней плоти человека с цетэмегаловирусом. Репли- катные монослои фибропластов крайней плоти человека подвергали: предварительной обработке 10 мкг/мл Амплигена или предварительной обработке. 100 мг/мл Амплигена в течение указанных промежутков времени до поглощени  ЦМВ. Степень инфицировани  ЦМВ определ ли через 24 часа после поглощени  вируса описанным методом IFA. Среднее число инклузии ЦМВ на одно покровное стекло дл  обработанных Амплигеном культур сравнивали с контрольыми результатами дл  необработанных лекарством культур. Полученные результаты свидетельствуют о том, что степень ингибировани  цетамегаловирусной инфекции пр мо пропорциональна продолжительности предварительной обработки Амплиге- ном. Максимальное ингибирование наблюдалось при предварительной обработке клеток HFF Амплигеном в течение 24 часов.

Данное исследование демонстрирует способность двуниточной РНК с неправильным св зыванием оказывать противовирусное действие по отношению к ЦМВ, которое возрастает с течением времени, и чувствительность ЦМВ к двуниточной РНК с неправильным св зыванием вне зависимости от использованной концентрации остаетс  с течением времени на уровне, который не достижим при местном применении двуниточных РНК относительно нетоксичной группы.

Процедуры также эффективны дл  снижени  до предела потогенности фильтруемых агентов, выдел емых биологических

жидкост х, например, фильтруемых агентов , найденных в биологических жидкост х, таких как спинномозгова  (цереброспинальна .) жидкость, особенно агентах, имеющих место при болезни Альцхеймера и

других медленно прогрессирующих болезн х , или медленных вирусов, вызывающих медленно прогрессирующее умственное ухудшение.

Claims (1)

1.В; 1.2; 1,2 0.6; 0,5; 0.7 0,15; 0.10; 0,18 Титр вируса (готового к употреблению) 1 х 104. 2 х 104. 2 х104 2хЮ3.5-х102, 1х103 1 х 102. 1 х 102. 1 х102