KR0131879B1 - 구획화된 체액 내로 생물학적 활성 dsRNA단편을 방출시키는 항-바이러스 제제 - Google Patents

구획화된 체액 내로 생물학적 활성 dsRNA단편을 방출시키는 항-바이러스 제제

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Abstract

내용없음.

Description

구획화된 체액 내로 생물학적 활성 dsRNA 단편을 방출시키는 항-바이러스 제제
제1도는 실시예 1에서 환자 A에게 dsRNA를 투여하기 전과 후에 자연(2'-5' 올리고 A/RNase L)의 항-바이러스 경로의 각 성분에 대해 환자의 생물학적 체액을 측정하여 3개의 부분으로 도시한 고압 크로마토그래피(HPLC)의 그래프이고.
제2도는 실시예 1의 환자 B에 대한 표준 검정 결과(칼럼 6)와 HPLC 분석 결과(칼럼 4 및 5)를 3개의 부분으로 도시한 그래프이며.
제3도는 실시예 4에서와 같이 dsRNA로 예비-처리한 세포를 미처리된 세포와 거대세포 바이러스 감염증에 대한 dsRNA 억제 효과면에서 비교하여 제시한 그래프이다.
눈물, 질 분비물 및 남성의 사정액(정자가 다량 함유된 것)을 비롯한 생물학적 체액은, 각종 심각한 질환을 유발시키고 전염시킬 수 있는 각종 미생물(진균류, 세균류, 바이러스류)을 함유할 수 있다. 국소적 또는 직접적인 항-미생물 처리법(포옴, 스프레이 처리법 등)이 종종 사용되긴 하나, 이들 방법은 미생물(류)이 이들의 격리 본성으로 인해 치료물에 비교적 잘 접근할 수 없다는 단점을 지니기 때문에 그 효과가 제한적이다. 국소적 처리 시에도 또한, 알레르기 반응을 유발시킬 수 있는 잠재성이 높을 뿐 아니라 국소적 자극을 유발시킬 수 있기 때문에 그 효과가 제한적일 수 있다. 본원에서, dsRNA를 투여함에 따라, 성교시 규칙적으로 교환되는 물질을 비롯한 각종 생물학적 체액 내로 숙주 방어 조절자를 의외적으로 방출시키는 dsRNA의 비경구적 투여 경로를 기재하였다. 따라서, 본원에서는 성병 우췌, 헤르페스 및 사람의 면역 결핍 바이러스(HIV) 등에 의해 야기되는 질환들을 비롯한 각종 질환과 연관된 각종 미생물의 감염성 및 전염성을 감소시키는 새로운 기술을 기재하였다.
감염 및 암을 격퇴시키는데 중요한 작용을 할 수 있는 최근의 제품은 소위 면역-조절자로서, 그 예로는 인터페론(IFN), 인터류킨(IL) 및 종양 괴사 인자(TNF)가 있다. 이들은, 인체의 자연적 질병-격퇴 역량을 상승시키거나 또는 촉진시킬 수 있는 단백질-함유 약물이다. 그러나, 이러한 단백질-함유 제품은 혈류 내에 흡착되기 전에 위에서 단백질이 파괴될 수 있기 때문에, 통상적으로 액체 또는 정제 형태로는 제공될 수 없다. 또한, 이들을 비경구(정맥 내, 근육 내 또는 피하 내) 투여하면, 특히 이들을 보다 높은 약물 농도로 또는 상당히 장기간 동안 투여하면 심각한 부작용이 유발될 수도 있다. 따라서, 연구가들은 피부, 눈에 유용한 국소적 활성 제제형태로 이들 약물을 제조함으로써 각종 성병 질환을 치료하고자 노력해 왔다. 예를 들어, 래프 및 워조스의 문헌 [Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 28권, 449페이지, 1985]에는, 항-바이러스제(INF)가 비이온성 계면활성제 세제와 혼합되어 있는 피임용 포옴 또는 크림이 기재되어 있는데, 이것의 주목적은 성교 시 한쪽 파트너(또는 양 파트너)가 헤르페스 바이러스에 점염되는 것을 방지하고자 하는 용도를 갖는다. 그러한 국소적-도포된 제제 등의 상대적 효과는 아직 상세히 밝혀지지는 않았으나; 종전에는 국소적 도포된 항-바이러스 제제가 그다지 성공적으로 사용되지 못했었다. 그러한 접근법을 제한시키는 인자로는, 1) 격리적 본성(제제에 잘 접근하지 않음); 또는 2) 일부 바이러스 입자; 및 3) 신체의 감염된 영역의 국소적 면역 역량이 감소함에 따라 지속적 치료 반응이 잘 이루어지지 않는 점을 들 수 있다.
IFN에 민감한 바이러스, 예를 들어 피부, 눈 및 점막의 바이러스(단순포진) 감염에 감염된 조직은, 미국 특허 제4,283,393호(필드의 다수)에 기재된 바와 같이 인터페론 유도체인 dsRNA, 특히 폴리 I·C의 국소 조성물을 서방성 제제형태로 하여 처리한다. 상기 '393호 특허에는 또한 국소적-도포된 항-바이러스제가 기재되어 있는데, 이것의 예로는 미국 특허 제4,020,183호(아스쿨라이외 다수)에 개시된 바와 같이 단순 포진용 불활성제로서 비이온성 계면활성제만을 함유한 것; 또는 미국 특허 제4,507,281호(아스쿨라이외 다수)에서와 같이 상기 계면활성제를 인터페론과 함께 함유한 것이 있다.
본원에서는, dsRNA를 비경구 투여할 경우, 혈류-뇌 차단체를 용이하게 통과하여 구획화된 체액(예, 타액, 눈물, 장액, 장액성 삼출액 등) 내로 유입되는 생물학적 활성 dsRNA 단편이 방출된다는 놀랍고도 새로운 점을 밝혀 냄으로써 종래 기술 및 물질 자체의 제한점을 해소시켰다. 이들 질환-격퇴 조절자는, 심지어 검출가능한 완전한 dsRNA가 상기 체액 내에 존재하지 않을 때에도 각종 생물학적 체액 내로 용이하게 유입된다.
본원에 사용된 용어 ''구획화된 체액''이란 전신적인 혈액 순환밖의 국소화된 체액을 칭하는 것이다. 이들 구획화된 체액으로는, 장막면, 점막면, 활막 내막, 요도면, 자궁 경부 내막상의 체액, 뇌척수액 및 국소적 눈분비액이 있다.
본원에서는, 생식기-비뇨 시스템 내에서와 같이 바이러스를 직접 공격하면서 동시에 국소 면역 시스템을 보호할 수 있는 조절자의 생성과정을 구체적으로 밝히고 있다. 본원에서는, 본 발명을 실행함으로써 남성 자체 및 그의 성교 파트너에게 모두 각종 심각한 질환을 유발시킬 수도 있는 남성 사정액 중의 상당량의 바이러스(예, HIV, 헤르페르 바이러스 및 거대세포 바이러스)를 상당히 감소시키거나 또는 박멸시킬 수 있는 방법을 설명하고 있다. 본 발명은 또한 삼출액 또는 여출액(관절) 및 뇌척수액 내에 질환-격퇴 조절자를 생성시키는 방법에 관한 것이기도 한다. 따라서, 본 발명은 각종 관절염 및 중추 신경계 질환과 같은 다양한 질환과 직접 관련이 있다.
''이본쇄의 RNAs에 의한 바이러스-관련 질환의 조절''이라는 명칭 하의 유럽 특허 출원 제0 213 921호(1987.3.11)에는, dsRNA, 구체적으로 앰플리겐(상표명)을 원형 dsRNA로서 사용하여 사람 세포 배양물 중의 HIV를 억제시키는 방법이 개시되어 있다. 본원에는 하기에 보다 상세히 설명된 바와 같이, 질병에 걸리기 전에는 예방을 목적으로, 또는 걸린 후에는 치료를 목적으로, 환자의 국소 신체부 중 생물학적 체액을 비롯한 각종 생물학적 체액 내에 질환-격퇴조절자를 방출시킴으로써 개체의 자연 항-바이러스 경로를 활성화시키고 면역 시스템을 보호하는 방법이 기재되어 있다. 후술되는 바와 같이, dsRNA, 바람직하게는 부정합 dsRNA를 비경구 투여하면, 완전dsRNA가 생물학적 체액 자체 내에서 검출되지 않을 때에도 생물학적 활성 dsRNA 단편(본원에서 종종 질환-격퇴 조절자로도 칭함)이 생물학적 체액 내로 방출된다. 이들 생물학적 활성 dsRNA 단편은, 혈류-뇌차단제; 및 조직에 의해 일반적인 혈액 순환과 분리되어 있는 다른 신체부를 용이하게 통과함에 따라 원하는 체액(들) 중에 존재하게 된다.
본 발명은 또한, 생물학적 체액 내의 비활성 숙주/환자 방어 조절자를 측정하고; 이것만으로 불충분할 경우에는, 병원성 제제(류)의 양을 감소시키거나 또는 질환의 진행을 억제시키면서 생물학적 단편에 필수적인 dsRNA를 보충시키기에 충분한 양의 dsRNA를 충분한 시간 동안 투여함으로써, 검사 하에 체액 내 방어 조절자의 생물학적 매개변수를 개선시키는 진단 시험 방법에 대해서도 기재하고 있다.
본 발명의 방법을 통해 진단 및/또는 치료된 질환은 바이러스성 일 수 있으며, 예를 들면 거대세포 바이러스, 레트로바이러스류(예, HIV), 염증 질환(예, 관절염 질환), 세균-민감성 질환 또는 진균류 또는 원생류에 의한 질환일 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 원거리의 생물학적 체액 중의 여과성 제제, 예를 들면 뇌척수액과 같은 생물학적 체액 중의 여과성 제제의 병원성, 구체적으로 알츠하이머병 또는 정신력을 서서히 감퇴시키는 기타 서서히 진행되는 질병, 즉 ''슬로우 바이러스 질환''의 병원성을 최소화시키는데 효과적이다.
혈류 이외의 생물학적 체액 내에 잠재적으로 격리되는 병원성 제제로는 여러 종이 있다. 이들 구획화된 생물학적 체액(혈액 제외)은 대개 전신 투여된 약물 분자(단백질, 핵산 등)에 잘 접근하지 못한다. 본원에 사용되고 있으며 의학 분야에서는 잘 공지된 용어인 ''비경구 투여''란, 정맥 내 주입 등을 통해 혈액 내에 직접 투여하는 방식, 또는 혈류에 용이하게 접근할 수 있는 신체 부위에 근육 내 또는 피하 투여(주사)를 통해 약물 고분자를 투여하는 방식을 의미한다. 또한 그러한 고분자량의 고분자는, 적당히 캡슐화되거나 장내-코팅 또는 장내-보호된 경우, 또는 위-장 상부관의 pH 및 효소와 같은 파괴력에 의해 비교적 영향을 받지 않도록 제조된 경우에는 경구 투여할 수도 있다. 모든 그러한 전달 방식에 의하면, 상기 고분자의 수준이 혈류 중에서 실제로 다수 검출가능한 수준으로 산출되긴 하나; 상기 고분자가 적어도 고도의 생물학적 활성 형태 또는 배열이 아닌 경우에는, 다른 생물학적 체액(장액) 내까지 반드시 존재한다고 볼 수는 없다.
그러한 말단 구획의 체액까지 상기 고분자가 도달할 수 없는 것은, 한 구획에서 다른 구획으로 병원성 제제가 용이하게 통과(즉, 병원성 전염)하지 못하도록 작용하는 물리적 차단제(막, 세포 등)가 여러 신체 구획(G-U관, 관절, 구강, CNS 등)에 존재하는 데 주로 기인한다. 따라서, 그러한 물리적 차단체는 질병을 국소화시키고 미생물(예, 바이러스)의 전염을 축소시키는 면에서는 사람에게 가치가 있으나, 면역 조절자와 같은 질병-격퇴 물질을 용이하게 분포시키는 데에는 상당한 방해가 된다. 상기 면역 조절자는, (a) 고분자성이며(반드시 그런 것은 아님), (b) 세포/막 구배를 비롯한 상기 ''차단체''를 용이하게 통과할 수 없는 경향이 있다. 따라서, 여러 연구가들은 생리학적-혼화성 담체(예, 탐폰, 콘돔 등)를 통해 국소화된 신체 구획 내로 면역 조절자/항-바이러스제/항암 화합물을 전달시키는 방법을 개발하여 왔다. 그러나, 그러한 접근 방법은 최근까지 단지 제한적인 성공만을 거두었다.
상당히 많은 병원성 미생물이, 인체 내로 유입되는 첫 번째 관문인 장 부위에 잠복되어 있다. 성병의 감염경로(성교에 의한 감염)는, 클라미디아(골반 소염증 및 불임증과 관련) 및 각종 바이러스와 명백한 연관이 있다. 예를 들어, 생식기 및 구강 헤르페스, 거대세포 바이러스, 생식기 우췌 및 레트로바이러스(특히 HIV)는 놀라운 속도로 퍼지며; 인터페론계 국소 제제 또는 인터페론-유도 국소 제제를 사용하는 등의 접근법이 이의 결정적인 치료 또는 예방책이 된다는 입증된 사실도 없다.
따라서 본 발명의 목적은, 환자의 신체에 걸친 각종 장액 중에 질환-격퇴 조절자를 효율적으로 생성시키는 처리 방법을 제공하는 것으로서; 이 처리방법은 단독으로 또는 국소 처리법과 병행하여 사용할 수도 있다. 본 발명의 방법의 또다른 장점은, 인터페론-민감성 질환에 대한 국소적 보호가 상당히 많이 요구되는 경우에, 인터페론-함유 탐폰 등을 사용하는 등의 종래 처리법과 병용할 수 있다는 점이다.
본 출원인은, 암 및 바이러스 질환 모두에 대한 신체의 방어 기전과 관련된 주요 효소(리보뉴클라아제 L: RNase L)가 촉진적 및 비-조절적인 방식으로 작용하는 생화학적 이상(anomaly)를 밝혀 냈으며, 이는 종전에는 검출하지 못했던 것이다. 이들 및 다른 발견점은, 본 출원인에 의한 ''미조절된 종양 세포 및 바이러스 성장 사이클과 연관된 변형 대사 경로의 이본쇄 RNA 교정''이라는 명칭의 미국 특허 출원 제07/074,649호(1997.7.17)에 기재되어 있으며, 이 출원의 내용은 본문에 참고 인용한다.본 출원인은, 바이러스의 공격을 지탱할 수 있는 상대적 능력면에서 비정상적 RNase L을가진 세포와 정상량의 RNase L을 가진 세포를 별도의 실험을 통해 비교하였다. 본 출원인은 또한, 후대의 레트로바이러스의 역가(산출량)가, NCP로 매우 급속히 생성되는 비정상적인 RNase L 활성을 가진 세포의 경우에 상당히 높음을 발견하였다.
이본쇄의 RNAs, 특히 부정합 dsRNA는, 본 출원인에 의한 미국 특허 출원 제07/074,649호에 보고된 바와 같이 RNase L의 역학 및 분해 생성물을 정상 수준으로 회복시킨다. 또한, 이본쇄의 RNA에 의한 정상회복 속도는, 사전에 림포카인으로 처리하면 더욱 가속화시킬 수 있다.
이 본쇄의 RNAs(dsRNA)는 이본쇄의 합성 폴리뉴클레오티드 착물이다. ''정합 dsRNA''는, 대향하는 쇄사이의 수소 결합(염기 중첩)이 비교적 완전한 상태로 유지된 것, 즉 29개의 연속적인 염기 잔기마다 평균1개 미만의 염기쌍이 삽입되어 있는 것을 의미한다. 부정합이란, 쇄의 삽입(또는 배출)에 의해 RNA 이중나선의 정상적인 기하학적 형태가 변형되어 dsRNA가 리보뉴클레아제에 의해 쉽게 분해될 수 있는 상태를 일컫는 것이다. 용어 ''부정합 dsRNA''도 이에 따라 이해하면 될 것이다.
dsRNA는, 1/5 염기 내지 1/30 염기와 같은 우라실 염기 또는 구아니딘 염기의 일부를 함유하는 폴리이소시아네이트와 폴리시티딜레이트의 착물(폴리 I.C4-29xU 또는 G)이다.
dsRNA의 일반식은, rIn·(C11-14,U)n또는 rIn·(C12,U)n일 수 있다. n은 4-29이다. dsRNA의 다른 적당한 예는 후술할 것이다.
본 발명의 방법에 사용하기 바람직한 부정합 dsRNA는 폴리(Cn,G)[이 때, n은 4-29의 정수임] 중에서 선택된 코폴리뉴클레이티드를 주성분으로 하는 것으로서, 폴리리보이노신산과 폴릴리보시티딜산의 착물의 유사체이다. 이유사체는, rIn·rCn을 변성시켜 폴리리보시틸딜레이트(rCn)쇄를 따라 비-쌍 염기(우라실 또는 구아니딘)를 삽입시킴으로써 제조한 것이다. 대안적으로는, 폴리(I)·폴리(C) dsRNA 중에 2'-0-메틸리보실 잔기를 혼합시키는 등의 방식을 통해 폴리보이노신산의 리보실 골조(rIn)를 변성시킴으로써 상기 dsRNA를 제조할 수도 있다. 이들 rIn·rCn의 부정합 유사체[이 중 바람직한 것은 식 rIn·r(C11-14,U)n및 rIn·r(C29G)n의 유사체임]는, 본문에 참고 인용된 미합중국 특허 제4,130,641호 및 제4,024,222호(카터 및 츠오)에 기재되어 있다. 본문에 기재된 dsRNA는 본 발명 사용하기가 적합하다.
바람직한 부정합 dsRNA, 즉 rIn·(C12,U)n에 있어서, 6-12개 염기쌍의 비-삽입부, 즉 RNA 나선의 1/2 내지 완전 1회전(turn)으로 구성된 부위는, 자연 항-바이러스 경로를 포함한 효소의 세포 내 필수 공동 인자인 림포카인을 방출시키는 생물학적 촉진제로서 작용한다. 우라실 잔기로 구성된 부정합 부위가 폴리피리미딘 쇄 내에 주기적으로 삽입되면, dsRNA의 가수분해가 촉진되어 독성이 방지된다.
본 발명에 유용한 부정합 dsRNA의 다른 예는 다음과 같다 :
폴리(I)·폴리(C4,U)
폴리(I) ·폴리(C7,U)
폴리(I)·폴리(C13,U)
폴리(I)·폴리(C22,U)
폴리(I)·폴리(C20,G)
폴리(I)·폴리(C29,G) 및
폴리(I)·폴리(Cp)23Gp
본원에 거론된 바와 같이, 림포카인에는 인터페론, 바람직하게는 인터페론 α, 인터류킨, 구체적으로 인터류킨-2(IL-2), 재조합 인터류킨-2(rIL-2), 종양 피사 인자(TNF)가 있다. 또한 림포카인으로 처리된 데 대한 반응으로 동물 중에 생성된 림포카인 활성화 킬러(LAK)세포도 또한 림포카인에 포함된다.
인터페론(α)을 림포카인으로 사용할 경우에는, 환자의 체액 1ml당 0.01-100,000 IRU의 양으로 사용하는 것이 적당하다. 림포카인으로서 IL-2, 바람직하게는 rIL-2를 사용할 경우, 그 투여량은 환자 체중 1kg당 102IL-2 단위 내지 환자에서의 독성이 비-허용적인 수준에 도달하는 수준(즉, 106IL-2) 이하까지의 범위로 한다. 그러나, 독성 반응을 제어할 수 있는 가장 효과적인 투여량은 약 103-104IL-2/체중(kg)이다.
dsRNA의 통상적인 투여량은, 환자의 체액 1㎖당 0.1-1.000㎍의 dsRNA이다. 체액이란 유기체 내에서 순환하면서 조직을 세정하는 혈청, 염, 비타민 등의 용액을 일컫는 것이다. 환자의 체액 부피는, 환자의 체중과 여성 또는 남성 체액 부피를 상호 관련시켜 나타낸 의학용 표를 통해 알 수 있으며, 상기 여성 또는 남성의 체액 부피는 필요량의 dsRNA를 평형화시키는데 사용될 수 있는 체액 부피와 환자 체액 부피의 총합이다. 예를 들어, 60 또는 70㎏ 체중의 환자는 체액량이 약 5-61이다. 2종의 제제(dsRNA 및 림포카인)를 투여할 경우에는, 이들을 혼합물로서 투여하거나, 또는 별도로 동시에 투여하거나 별도로 순차적으로 투여할 수도 있다.
dsRNA와 림포카인을 ''혼합'' 투여하는 방법에는, 이들 두 제제를 치료 혼합물로서 함께 투여하는 방법; 및 이들 두 제제를 각각 투여하되 동시에 투여하는 방법(예, 동일개체의 각기 다른 정맥 라인에 동시에 투여하는 방법)이 있다. ''혼합'' 투여 방법에는, 약물 하나를 투여한 직후에 나머지 약물을 투여하는 분리 투여 방법도 포함된다.
[실시예 1]
체중이 40 내지 70kg인 개체군에 대해 1주일당 20내지 1000g의 부정합
Figure kpo00001
Figure kpo00002
; 식 rIn·r (C12,U)n의 부종합 ds RNA]를 투여한 뒤, 장액, 특히 질 분비물 및 남성의 사정액에 있어서 dsRNA에 의해 유도된 숙주 방어 조절자의 존재 여부를 측정하였다. 동반된 임상시험에서는, 인터페론 또는 인터류킨을 투여한 개체에 있어서 유사한 매개변수를 연구함으로써 투여 과정의 특이성(존재하는 경우)을 측정하였다. 광현미경으로 관찰한 결과, 처리한 환자에서 추출한 체액에는 단핵세포, 편평 상피 세포(여성의 생식기에서 취한 샘플) 및 정자(남성의 사정액)뿐 아니라 무정형 세포인 조직파편증을 비롯한 각종 세포가 함유되어 있었다.
처리기간을 다양하게 하여 3명의 환자를 dsRNA로 처리한 결과는 다음 표1에 요약하여 제시한다.
Figure kpo00003
말초 혈액 단핵 세포에 대해 최근 보고된 공동 배양물 이용 기술 Ⅰ(카터외 다수의 문헌 [Lancet, Vol.1, 1987. 6. 6.])을 이용하여 2.0-4.0cc의 사정액을 측정한 결과, 환자 A 및 B의 사정액으로 부터 회수 가능한 HIV-Ⅲ의 역가는 상당히 높았다. 간단히 말하면, 2-4일간 PHA로 처리한 정상인 혈액의 단핵 세포를 추출하여 28일간 계속 배양시킨 후 효소-결합 면역 흡착 검사(ELISA)를 통해 세포 외 바이러스 역가를 측정했다. 공동 배양물의 역가는, ELISA 검사의 평균 광학밀도(490nm에서의 OD)에서 음-대조값(0.1 미만)을 뺀 값으로 정의되었다. 환자 C는, 항문 주위에 소낭이 형성되는 증상을 보이는 만성 HS가 질 분비물에서 검출되었다. 35nm판에 번식시킨 융합성 HEL 세포를 이용하는 래프 방법(래프 외 다수의 문헌[Antimicrob, Agents ＆ Chem oth., Vol.28, p.449, 1985]을 통해 단순 포진 바이러스를 배양하였다.
첨부된 제1도 및 제2도는, dsRNA rIn·r (C12,U)n을 단독 및 림포카인과 혼합 투여하기 전과 후에 환자의 체액 샘플을 HPLC 평가한 결과를 나타낸 것이다. 제1도의 모든 샘플은, 제2도의 칼럼 4 및 5의 샘플과 같이 TCA 및 아세톤 침강법을 통해 제조하였다; 제2도의 칼럼 4 및 5의 샘플과 같이 TCA 및 아세톤 침강법을 통해 제조하였다; 제6도의 칼럼 6은, 후술되는 바와 같이 표준 검정 추적을 수행하는데 사용하였다. 도면은 다음과 같이 배열하였다; 제1도의 칼럼 3은 치료 전의 환자 A, 칼럼 2는 치료 4주 후의 환자 A, 칼럼 3은 치료 12주 후의 환자 A이고; 제2도의 칼럼5는 치료 전의 환자 B, 칼럼 4는 치료 과정중의 환자 B, 칼럼 6은 표준 곡선이다. 제1도 및 제2도는 상기 표1과 비교하기 위한 것이다.
dsRNA를 전신 투여한 후의 환자 샘플을 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)로 평가한 결과, 숙주 방어 조절자가 증가된 것으로 나타났다. 환자의 질 분비액(칼럼 3) 및 사정액(칼럼 1 및 2)을 자연(2'-5' 올리고 A/RNase L 항-바이러스 경로의 각종 성분에 대해 평가하였다. 이 성분에 대해서는, 말초 혈액의 단핵 세포 부분에 대해 최근 기재된 바 있다. (카터의 다수의 문헌 [Lancet]; 카리코 외 다수의 문헌 [Biochem, Biophys, Res, Comm., Vol.128, pg.695, 1985] 및 수하돌니크 외 다수의 문헌 [Biochemistry, Vol.22 pg.4153, 1983]). 결과는 모두 제1도에 그래프로 도시하였다. dsRNA 투여 전에는 모든 시스템 성분의 활성이 거의 검출 불가능한 수준인 것으로 관찰되었다. 그러나 dsRNA의 전신 투여과정 중에는 제1도 및 제2도에 도시된 바와 같이 장액 중의 조절자 수준이 특이적으로 다량 관찰되었으며, 이와 함께 역학적으로는, 검출가능한 고분자 dsRNA가 전혀 존재하지 않는 상태에서도 동일 부위에서의 바이러스 발현이 감소하였다(표1참조). 이러한 결과치는, 이미 공지된 급속 블로팅(blotting) 및 액체 신틸레이션 분광계로 측정한 것이다. 이 측정법은 브로드스키 외 다수의 문헌 [J. Biol, Response Modifiers, Vol.4, pg.669, 1985]을 참고한다.
본 발명의 방법의 특이성을 평가하기 위해, 다량(10밀 미만의 IRU(d))의 각종 인터페론 및 인터류킨으로 처리한 유사종의 개체(또는 동물)를 연구하였으나, 구획화된 체액 중에서 질환-격퇴 조절자의 증가를 관찰할 수는 없었다. 그러나, 부정합 dsRNA와 림포카인을 혼합하여 전신 투여한 경우에는 구획화된 체액 중의 조절자 검출율이 현저하게 향상되었다. 방사성 결합, 방사성 면역 및 rRNA 절단 검사와 함께 HPLC를 수행한 결과, 질환으로 부터 보호하기에 충분한 양의 dsRNA를 체내 임의 부위에 투여했을 때 신규의 2'-5'올리고아데닐레이트가 특이적으로 생성되는 것으로 확인되었다. 이는 표1의 결과에서 명백히 입증되었다.
TCA 및 아세톤 침강법을 통해 샘플을 제조한 후, HPLC에 의한 확인 작업을 수행하였다(리 및 수하돌니크의 문헌 [Biochemistry, Vol.24, pg.551, 1985]). 인산 암모늄(50㎜) 완충액(pH 7.0) 중에 메탄올 및 물을 구배시키는 방식으로 물 C18미크론 본다팩 분석 칼럼을 수행하였다. 제2도에서 번호 6으로 칭한 HPLC 실험결과, 효소적으로 합성된 p3A3및 진짜 p3A3에 의한 표준 검정이 이루어 졌다(레이리 외 다수의 문헌 [Europ.J. Biochem., Vol.143, pg.165, 1984]). 피크는 가장 높은 생물학적 활성을 지닌 조절자, 즉 각각 2'-5' 결합된 올리고아데닐레이트 조절자의 삼량체 및 사량체인 진짜 p3A3및 p3A3에 상응하는 조절자를 지시하는 것이므로, 결정적인 분리물은 HPLC의 피크로서 나타나며, 이 피크는 본 발명의 HPLC 형태에서는 6.8 내지 7.0분 또는 약 12분에 존재한다. 표1의 환자 A[사정액을 치료 전(제1도의 칼럼 3) 및 치료 후(4주 후는 칼럼 2,12주 후는 칼럼1)에 분석한 환자]는, 표준 RNase L 절단 검사를 이용하여 측정한 생물학적 활성을 지닌 2'-5'의 수준과 HPLC로 측정한 구조적으로 진짜의 2'-5' A분자의 증분량이 모두 급격히 증가되었음을 알 수 있다. 환자 A와 유사한 결과가 환자 B에서도 나타났다(결과는 제시하지 않음). 제2도는, dsRNA를 전신 투여하기 전(칼럼 5) 및 투여과정 동안(칼럼 4)에 환자 C의 질 분비액을 분석하여 산출한 결과이다, 표1과 제2도를 비교해 봤을 때, 환자 C의 경우, 생물학적 활성 및 진짜 화학 구조로 측정된 조절자의 수준이 증가함에 따라 헤르페르 바이러스 감염 수준을 현격히 저하되었음을 알 수 있다.
어떤 특정의 작동이론 또는 형식에 구애되지 않더라도, 국소화된 체내 부위에서 상기 효과를 이루기 위한 본 발명의 매카니즘은 표시 형질도입 과정(이에 의하면, dsRNA가 혈관 벽 둘레 또는 부근의 세포에 작용한다)을 적어도 부분적으로 수반하며, 이 형질 도입 과정에 의해 국소화된 구획 자체 내에 파상 고정-유도 조절자가 생성된다.
[실시예 2]
본 발명을 수행하는데 있어서 가장 바람직한 작용 기전(modus operandi)은 부정합 dsRNA의 독특한 구조라고 볼 수 있다. 이는, dsRNA의 부정합으로 인해, 비교적 안정한 dsRNA 착물 내에 파괴되기 쉬운 부위가 생성되기 때문이다: 그 결과, 보다 유동적인 생물학적 활성의 dsRNA 소편의 특정 체내 구획에 접근할 수 있게 되어, 이 체내 구획 내에서 국소적으로 고도의 특이성을 지닌 면역조절적/항 바이러스 효과를 발휘할 수 있다. 이와 같이 격리된 구획까지 dsRNA가 접근할 수 있는 것은, 본 발명의 경험에 의하면 신체의 치외곽부에 투여된 dsRNA의 특성으로 인한 것은 아니다.
상기 현상을 증명하기 위한 방법으로서, 본 원에서는 완전 염기쌍의 dsRNA(폴리 Ⅰ·폴리 C)의 일정분획을 제공하여 생체 내의 생물학적 분해조건을 그대로 조성시킨 뒤 부정합 dsRNA(폴리 Ⅰ·폴리 C12, U)의 일정 분획과 S1, 뉴클레아제(dsRNA의 분해효소)에 의한 분해도를 비교하였다. 이들 2개의 분해 곡선형태는 완전히 달랐으며, 이러한 차이는 현격히 다른 치료적 특성을 가진 염기로 인한 것으로 추측된다. 폴리 Ⅰ·폴리 C의 분해 곡선은 단일 특이적이므로, 단지 생물학적 불활성인 작은 헥산 잔기 물질만을 형성시킨다. 이에 반해, 부정합 dsRNA의 분해곡선은 2단계로 나타났는데 ; 제1단계는 분해곡선으로서, 생물학적 활성을 지닌 보다 작은 단편이 생성되었다; 그러나, 모분자는 약11.0-15.0 S의 침강(초원심 분리적 분석) 값(S20, W)에 상응하는 약 1,000 염기부의 길이를 가지는 한편, 자(부분 가수분해) 생성물은 단지 50-100개의 염기쌍 길이에 불과했다. 놀랍게도, 이들 염기쌍은 인체의 결정적 2'-5' A 자연 방어 경로의 성분부의 세포 내촉매로서 여전히 높은 생물학적 활성을 나타내 보였다. 이러한 단편은, 유사한 조건 하에 필적할 만한 양의 S1뉴클레아제와 같은 dsRNA 분해 효소로 처리한 폴리 Ⅰ·C의 바이알을 샘플링 했을 때에는 검출되지 않는다.
부정합 dsRNA 분해 곡선의 제2단계에서는, 50개 미만의 염기 쌍을 가진 dsRNA 단편이 회수되었다. 이 제2단계의 단편은 뉴클레아제에 내성을 지닌 코어로서 정의하였으며, 이 잔기 단편과 폴리 Ⅰ·폴리 C에 의해 생성된 단편을 구별하는 것은 불가능했다. 따라서, 특정 배열의 dsRNA(즉, 부정합 dsRNA)의 생물학적 분해동안에는, 특정류의 dsRNA의 생물학적 단편이 형성되고, 그러한 단편은 특수하고 의외적인 특성, 즉 전신 순환 외부의 특정 체액(구획부) 또는 혈류를 효과적으로 통과할 수 있는 특성을 갖는다. 이러한 구획부로는 장막면 및/또는 점막면, 예를 들면 활막내막, 요도면, 자궁경부내막, 뇌척수 및 차단적 체액 국소부가 있으나, 이것에 국한되는 것은 아니다.
[실시예 3]
본원에서는 시험관내/생체 내에서의 실험을 통해, 생물학적 분해 과정동안 생성된 신규 분자류의 dsRNA로 인해 각종 생물학적 체액 중에 상당한 다량의 자연방어 세스템(예, 2'-5'A 시스템)의 조절자가 존재하게 됨을 확인하였다.
A. 폴리 Ⅰ·폴리 C와 부정합 dsRNA의 뉴클레아제에 의한 분해면에서의 비교
뉴클레아제에 의한 가수분해에 대한 이본쇄 RNA(dsRNA)의 민감성을, 방사성 폴리 Ⅰ및 부정합 dsRNA를 이용하여 연구하였다. [8-14C] 폴리이노신산(sp. act. 3.6μ/μmole)은 P-L 바이오케미칼스사에서 구입하였다. 상기 표시된 폴리 Ⅰ은 1000개를 초과하는 염기 길이를 갖는다. [8-14C] 폴리 Ⅰ를 비표시된 폴리 Ⅰ·폴리 C 또는 부정합 dsRNA와 혼합하여, 열 변성시킨 후 재-어니일링 처리함으로써 방사성 dsRNA를 수득하였다.
처음 연구에서는, Si 뉴클레아제(E.C.3.1.30.1)에 대한 분해도를 측정하였다. Si 뉴클레아제는 단일쇄의 헥산을 분해시킴으로써, 이본쇄 영역은 그대로 유지시킬 것이다. Si 뉴클레아제에 의한 Ⅰ·폴리 C 의 분해 양상은, TCA에 의해 1분당 1.4%의 dsRNA가 용해도는 1단계의 역학 관계를 나타내 보였다. 열-변성 후에는, 가수분해율이 1.8%/분으로 상승되었다.
표시된 부정합 dsRNA를 이용한 유사 실험에서는, 분해 속도의 양상이 2단계인 것으로 입증되었다. 원상태의 부정합 dsRNA는 처음에는 성분의 분해속도가 빨랐으나(3.2%/분) 이후에는 상당히 느려졌다(0.5%/분). 변성된 부정합 dsRNA는 비교적 급속히 분해되었다.(4.5%/분)
45분의 실험과정에 걸친 원래의 Ⅰ·폴리 C 및 부정합 dsRNA의 총분해 속도는 비슷하였다. 상기 카터 외 다수의 문헌 [J.Mol.Biol., 70 : 567, 1972])에 보고된 바와 같이, 부정합 dsRNA의 처음 가수분해 속도는 Ⅰ·폴리 C 보다 빨랐다. 그러나, 부정합 dsRNA가 2단계의 분해 속도 양상을 보이는 것으로 볼 때, 상기 부정합 dsRNA와 완전-염기쌍의 Ⅰ·폴리 C 분자 사이에는 명백한 물리적 차이가 있음이 입증되었다. 이들 결과는, 2차 또는 3차 구조 간에 상당한 차이가 존재함에 따라 상기 dsRNA들 사이의 뉴클레아제에 대한 민감성의 차이와, 이에 따른 예상치 못한 생물학적 결과가 산출됨을 말해 준다(이 결과는 본 명세서 상에 보고하였다). 특정 dsRNA의 2성분의 가수분해 속도 간에는 거의 6배 차이가 존재하는데, 가수분해 속도가 비교적 느린 성분이 존재한다는 것은, Ⅰ·폴리 C에서는 볼 수 없었던 뉴클레아제-내성 코어가 이러한 류의 dsRNA중에 존재한다는 것을 말해 준다.
뉴클레아제에 의한 부정합 dsRNA의 분해 실험은, 열-불활성화된 태아 상태의 송아지 혈청 또는 사람 혈청(10%)이 강화된 표준 조직 배양 배지(RPMI 1640)를 사용하여 수행하였다. 이 혈청은 리보뉴클레아제의 제공원으로 사용한 것이다. 상기 배지에 의한 부정합 dsRNA의 분해속도는 매우 빨랐으며, 이 때 dsRNA의 약 40%가 3분 내에 TCA에 의해 용해되었다. 2시간 이하로 분해 과정을 더 계속 수행하여도, 더 이상의 분해는 이루어 지지 않았다. 배지를 연속 희석한 후 부정합 dsRNA의 존재 하에 3분간 항온 배양시킨 결과, 1/16의 희석율 하에서 약 50%의 분해율을 보였으며, 보다 진한 혈청을 사용해도 분해율이 더 향상되지는 않았다. TCA 침전성 물질은 광범위한 희석도 하에서 비교적 장기간 동안 비교적 일정하게 유지되므로, TCA-침전성 물질이 장기간 안정한 것이 TCA 용해성 물질의 차별적 분해율에 기인된 것이라고 볼 수는 없을 것이다. 이러한 결과도 역시, 부정합 dsRNA 분자 내에 뉴클레아제-내성 코어가 존재함을 시사해 주는 것이다.
B. 부정합 dsRNA 중의 뉴클레아제 내성 코어의 분자량
침강계수를 측정하여 분자량을 결정하였다. 먼저 미처리된 dsRNA 샘플을, 20℃ 하에 48,000RPM으로 작동하는 벡맨 모델 E 초원심 분리기를 사용하여 원심분리하였다. 8분 간격의 5개 값을 사용하여 침강계수를 산출하였다. 이어서, dsRNA 샘플을 완충액 A(0.15M NaCl, 0.01M의 인산 나트륨, 0.001M의 MgCl2, pH 7.2)중에 0.63의 OD260으로 희석시켰다. 그리고, S1뉴클레아제로 처리된 dsRNA 샘플을 20℃ 및 52,000RPM의 원심 분리기로 원심분리시킨 후 완충액 A 중에 0.65의 OD260으로 희석시켰다. 침강 계수는, 하프-하이트(Half-height)법 및 세컨드 모멘트 방법(second moment)으로 산출하였다.
상기 하프-하이트법 및 세컨드 모멘트법으로 산출한 dsRNA의 침강 계수는 각각 12.74 및 13.29이었다.
S1뉴클레아제로 가수분해시킨 후의 dsRNA의 침강계수는, 하프-하이트법으로 측정한 결과 6.18로 저하된 한편; 세컨드 모멘트법으로 측정했을 때에는 7.21로 저하되었다. 이 데이터는, 부정합 이본쇄 RNA를 S1뉴클레아제로 처리하면 저분자량의 단편으로 분해됨을 말해준다.
C. dsRNA의 뉴클레아제-내성 코어의 생물학적 활성
표준 조직 배양 종양 성장 억제 분석법을 통해, S1뉴클레아제에 의해 분해된 dsRNA의 생물학적 활성을 시험하였다. 먼저, dsRNA를 S1뉴클레아제와 함께 120분간 항온 배양시킨 후, 사람의 섬유 육종 세포주(HT1080 C14)의 성장을 억제시키는데 사용하였다. 미처리된 대조군 샘플의 세포 성장율은, 50μg/ml의 S1뉴클레아제로 분해시킨 부정합 dsRNA를 처리한 지 72시간 후에 관찰하였다. 미처리 dsRNA는 세포 성장율이 약 50% 억제되었다. S1뉴클레아제-처리된 부정합 dsRNA는, S1뉴클레아제의 처리도와는 무관하게 유사한 억제율을 보였다. S1뉴클레아제로의 처리와 함께 열변성시킨 경우에는, 부정합 dsRNA의 증식 억제 효과가 사라졌다.
상기 결과는, 뉴클레아제로 장기간 처리한 후에도 부정합 dsRNA의 증식 억제 활성이 그대로 유지되었음을 말해 준다. 뉴클레아제-내성 코어는 상기 시스템의 분해 과정 중 처음 15-20 이내에 생성되기 때문에, 그 이후에 종양의 성장 억제가 이루어 졌다는 것은 dsRNA의 증식 억제 활성이 뉴클레아제-내성 코어에 있음을 말해 주며, 이로써 다양한 체내 구획 중에 상당히 높은 수준의 생물학적 활성 조절자가 존재하게 될 수도 있다.
뉴클레아제-내성 코어의 생물학적 활성을 탐구하기 위해, dsRNA를 S1뉴클레아제로 60분간 분해시켰다. 이어서 이 물질의 일정 분획을 에탄올 중에 침전시킨 후, 침전되지 않은 소편의 분해 생성물들을 제거하였다. 생물학적 활성을 측정하기 위해, 사람의 교종 세포주 A1235를, 200μg/ml의 원상태 dsRNA; S1뉴클레아제-분해된 앰플리겐; 및 에탄올에 의해 침전되고 분해된 dsRNA(앰플리겐)로써 처리하였다. 이것을 72시간 동안 배양시킨 후 A1235에 대한 증식 억제율은, 앰플리겐으로 처리한 경우 99.8%; S1뉴클레아제-처리 앰플리겐으로 처리한 경우 78.4%; 및 에탄올에 의한 침전화 및 S1뉴클레아제-처리된 앰플리겐으로 처리한 경우에는 84.4%였다. 따라서 dsRNA의 증식 억제 작용은 상기 3종의 다른 처리 시 모두 그대로 유지되었다.
상기 A1235 세포 중에서 상기 3종의 제제가 2-5A 합성 효소[ATP : (2',5'-올리고(A) 아데닐일 전이효소(EC2.7.7.19)]를 유도해 내는 능력도 또한 측정하였다. 먼저 세포 펠릿을 PBS로 세척하고 5ml의 분해 완충액(20mM의 트리스(pH 7.5), 0.1mM의 EDTA, 0.25M의 수크로즈, 50mM의 KCl, 2mM의 MgCl2,1mM의 DTT)에 재현탄시킨 뒤, 얼음에서 5분간 유지하였다. 다시 PBS로 2회 세척한 후, 세포 펠릿을 0.5%의 Nonidet-P40이 함유된 0.1ml의 완충액 B(20mM의 HEPES(pH 7.5), 5mM의 MgCl2, 120mM DTT, 및 10% 글리세롤) 중에 재현탁시킨 뒤 얼음에서 10분간 유지한 후 세포를 분해시켰다. 이 분해물 8000g을 6분간 원심 분리시켜 세포질 추출물을 취한 후 추출물 50μL 분획을 -70℃에서 보관하였다.
2-5A 합성 효소는 수하돌니크 외 다수의 문헌[Biochemistry 22 : 4153, 1983]에 기재된 바와 같이 분석하였다. 결빙시킨 세포 추출물(25μg의 단백질과 상응)을 30μl의 폴리(rI) 폴리(rC)-아가로즈 팩과 혼합한 후 25℃에서 20분간 항온 배양시켰다. 이어서, 0.4mL의 완충액 B로 2회 세척하여 비결합 단백질을 제거하였다. 효소에 의한 2'-5'-올리고알데닐레이트(2-5A)의 합성과정은, 2.5mM의 [-32P]ATP(0.12Ci/mmol), 2.5mM의 DTT, 3단위/ml의 크레아틴 포스포키나제 및 10mM의 크레아틴 인산염이 함유된 10μL의 완충액 B를 첨가하는 단계로 시작하였다. 이어서, 30℃에서 20시간 동안 항온 배양시킨 후 아가로즈를 원심 분리(3분, 8000g, 27℃)하여 펠릿화시켰다. 상청액 중의 2-5A 혼합물은, 도에취 외 다수의 문헌 [Nature, 291 : 355, 1981]에 기재된 DEAE-셀룰로즈 칼럼 크로마토그래피로 분석하였다. 생성물의 형성량은, 0.35M의 KCL 완충액이 수용된 DEAE-셀룰로즈 칼럼으로 부터 제거된 방사능을 회수된 총 방사능으로 나눈 값에 의해 결정되었다.
dsRNA 뉴클레아제-처리된 dsRNA 및 뉴클레아제-처리된 dsRNA의 세포-유리 추출물을 효소와 항온 배양한 후 침전화시켜 2-5A를 합성하는 방법에서는, ATP가 2-5A로 전환되는데 미치는 시간의 영향을 말해 준다. 여기에서는 몇 가지 놀라운 결과가 나타났다. 첫째, 미처리된 부정합 dsRNA와 함께 세포-유리 추출물을 18시간 동안 항온 배양시킨 후의 2-5A 합성 효소의 특이 활성은 41.5였다. 둘째, S1뉴클레아제로 처리한 후에는 ATP의 2-5A로의 전환율이 상당히 증가하였다. 예를 들어, 18시간 동안 항온 배양한 후의 특이 활성은 284로서, 이것은 미처리된 부정합 dsRNA 자체 활성의 약 7배에 해당하는 활성이었다. 셋째, S1뉴클레아제로 처리한 후 침전화시킨 dsRNA는, 12시간 동안 항온 배양시킨 후에 2-5A를 최대량 합성시켰다. 이러한 데이타에 따르면, 2-5A의 삼량체, 사량체 및 이 보다 분자량이 더 높은 소중합체의 효소적 합성량이 부정합 dsRNA를 S1뉴클레아제로 처리한 후에 상당히 증가하였음을 알 수 있다. 효소 활성의 증가와 dsRNA의 크기 감소 간에 양성적 관계가 존재함에 따라, 알로스테릭 변형체, 즉 부분 분해된 부정합 dsRNA와 상호 반응이 이루어 질 수 있으며, 이로써 상기 부정합 dsRNA가 2-5A 합성 효소에 결합되어 미처리된 부정합 dsRNA 보다 상기 2-5A 합성 효소를 훨씬 더 활성화시킬 수 있다는 점이 입증되었다.
이러한 발견으로 치료 효과는 명백해졌다. 이와는 대조적으로, 뉴클레아제 S1으로 처리된 부정합 dsRNA의 저분자량 분해 생성물을 침전화시켜 제거한 경우에는, 12시간의 배양후에 2-5A가 최대로 합성되었다. S1뉴클레아제에 의해 분해시킨 후 침전화시킨 dsRNA 중의 2-5A 합성 효소가 최대의 활성을 지닌다는 것은, 18시간 동안 항온 배양시킨 후 S1뉴클레아제-처리된 부정합 dsRNA에 의해 2-5A 합성 효소를 활성화시키는 방식과 동등한 방식으로, 뉴클레아제-내성 코어가 2-5A 합성 효소를 활성화시킬 수 있음을 시사해 준다.
이러한 데이타는 부정합 dsRNA의 생물학적 활성 단편이 존재함을 확인시켜 주며, 생물학적 체액 중의 상기 단편의 치료 활성에 대한 물리적 원리를 설명해 주고 있다. 이들 데이타는 또한, 이러한 생물학적 활성 단편이 모화합물보다 활성이 더 큼을 입증해 준다.
[실시예 4]
본 발명의 또 다른 사용에는, 거대 세포 바이러스(CMV)와 같은 성관계에 의한 질병을 방지하는 것이다(뉴욕 타임즈, 1988년 7월 14일, pg.135; 성관련 질환의 급속한 증가를 요약한 부분임). 거대 세포 바이러스(헤르페스 바이러스군의 일종)는 미합중국에서만 1백만명 이상 감염되어 있으며, 장애적 면역 시스템을 지닌 사람들은 이로 인해 위장 문제 또는 실명이 될 수도 있다(이 부위는 바이러스에 감염된 장액 접촉면 및 전신에 다회 투여된 항-바이러스제가 쉽게 투과될 수 없는 부위임). CMV는 성관계에 의해 감염된다.
예를 들어, 부정합 dsRNA(앰플리겐)을 투여하는 등의 방식으로 시간의 경과에 따라 생물학적 활성 단편을 형성시키면, 상당히 높은 수준의 억제율이 수득된다. 예를 들어, 제3도는 24시간 동안 앰플리겐 단편으로 처리했을 때 CMV가 100% 억제되었음을 나타낸 것이다. 비교적 비독성 변종의 dsRNA를 사용한 경우, 국소 연고 형태로는 상기와 같이 용이하게 생물학적 활성 물질을 지속적으로 방출시킬 수가 없다.
dsRNA의 생물학적 단편의 경시적 생성율은, 종종 바이러스에 감염된 확대 세포 중에서 발견되는 헥내봉입체를 일컫는 소위 거대 세포 봉입 질환의 거대 세포 바이러스를 사용하여 수행한 조직 배양 연구에서 설명하였다. 사람의 거대 세포 바이러스는 헤르페르 바이러스군 또는 이와 관련된 바이러스제의 아군(subgroub)이다. 성관계에 의해 CMV에 걸린 사람은, 다소 편재되어 있긴 하나 1988년 미합중국에서 백만명 이상인 것으로 최근 보고된 바 있다. 이 감염을 대개 증상이 없으나, 장애적 면역 시스템을 가진 사람에게는 위장 문제 또는 실명을 일으킬 수도 있다. 신생아가 특히 감염되기 쉬우며, CMV는 유산, 사산, 출생 후 사망 등을 일으킬 수 있다. 문헌[The Merck Manual, 14판(1982), pp.205-206]에는 이 질환에 대한 특이적인 요법이 전혀 제시되어 있지 않다.
이 실험에서는, 후술되는 방법 및 물질을 사용하였다.
신생아의 포피 섬유 아세포(HFF)를 분리한 후, 10%의 태아 상태 송아지 혈청, 2mM의 L-글루타민, 1mM의 소듐 피루베이트, 20mM의 HEPES 안충액 및 항생제가 강화된 열(Earl's)염을 함유한 최소 필수 배지 중에 20회 미만의 낮은 통과 횟수로 유지시켰다. 세포가 융합되면, 상기 배지로 부터 5%의 태아 상태소혈청을 제외시킨 배지 내에서 유지시켰다. 세포를 일부일 단위로 검사한 결과, 세균 및 마이코플라스마에 의한 오염은 거의 없었다.
사람의 거대 세포 바이러스 원료(CMV, ATCC #VR-538, 균주 AD169)를 연구 전반에 걸쳐 사용했다.
CMV의 세포 변성 효과가 숙주 세포의 75%에서 나타난 경우에는, HFF에 2차로 통과시켰다. 세포-유리 바이러스 원료를 저장튜브에 분산시킨 후 -120℃로 유지시켰다. 세균 및 마이코플라스마에 대한 살균 시험 결과는 네거티브였다. CMV에 의한 HFF 세포의 감염 역가를 측정한 결과, 4×106의 형광성 봉입물/ml로 나타났다(하기 참조).
동결 건조된 임상 등급의 앰플리겐(부정합 dsRNA; 폴리 I·폴리 C12, U ; 헴 리서취사; 미국, 매릴랜드, 록빌 소재)을 사용하였다. 제조업자의 지시에 따라, 앰플리겐을 재구성하고, 일정량을 분취한 후 -20℃에서 저장하였다. 각 실험에서는, 50℃의 수재 내에서 교반시키면서 새로운 분취량을 냉각시킨 후 상기 조직 배양 배지 중에서 소정의 농도로 희석시켰다.
이 약물은 여러 조건 하에서 HFF 세포와 함께 항온 배양시켰다. 이 때이 변수는 다음과 같다 : (1) 앰플리겐의 농도; (2) 바이러스 흡수율에 대한 앰플리겐의 처리 순서 ; (3) HFF를 앰플리겐으로 처리한 시간.
앰플리겐으로 처리한 HFF의 생존율은, 트리판 블루 배제기법으로 측정한 결과 미처리한 HFF와 동일하였다(즉, 99%)
융합성 HFF를, 1드램(용량 3.7ml)의 쉘 바이알 내 원형 커버슬립 상에서 배양하였다. 이것을 적당히 희석된 CMV 0.25ml와 함께 쉘 바이알에서 항온 배양시킴으로써 바이러스로 감염시켰다. HFF 700g을 1시간동안 37℃에서 CMV로 처리하여 이 바이러스를 HFF에 흡수시켰다. 이러서, 바이알을 2-3회 세척하여 세포 외 바이러스를 제거하였다. 바이알 1ml의 조직 배양 배지를 재공급한 후 37℃에서 18-24시간 동안 항온 배양시켰다.
CMV의 증식률은 다음과 같이 측량하였다. 100% 아세톤 중에 HFF를 고정시킴으로써 바이러스의 증식을 중지시켰다. HFF가 부착된 커버 슬립을 헹군 후, 72킬로 달톤의 초기 단백질에 특이성을 지닌 항-CMV의 쥐 단일클론 항체(듀퐁)과 함께 항온 배양시켰다. 결합된 항체는, FITC-표시된 항-쥐 IgG F(ab)2(시그마)를 첨가하여 검출하였다. 바이러스에 감염된 세포는, 상향 형광 현미경으로 250 배율 하에 관찰했을 때 밝은 사과-녹색의 핵 형광체를 나타내 보였다. 이어서, CMV-감염된 세포의 수(즉, 형광성 핵 봉입물을 나타내 보이는 세포의 수)를 현미경으로 계측하였다. 이어서 양성 원료를 희석시킴으로써, 앰플리겐의 부재하에, 24시간 동안 항온 배양시킨 후 1개의 커버 슬립당 200-1200개의 CMV-감염된 세포가 존재하도록 하였다. 산출된 다중 감염도(MOI)는 0.04였다.
각 실험 조건마다 복재 커버 슬립 중의 CMV 봉입물의 평균 수를 측정한 후, 앰플리겐을 투여하지 않은 양성 대조군과 비교하였다. 앰플리겐 또는 CMV로 처리하지 않은 음성 대조군도 함께 평가하였다. 앰플리겐의 항-바이러스 활성은 다음과 같이 표현하였다.
CMV 봉입물의 억제율(%)
Figure kpo00004
거대 세포 바이러스에 의한 사람의 포피 섬유 아세포의 감염에 대해, 앰플리겐으로의 사전 처리 시간이 미치는 효과를 제3도에 제시한다. 사람의 포피 섬유 아세포의 복제 단층을 (1) 10μg/ml의 앰플리겐으로 사전 처리하거나(오픈 바 사용); 또는 (2) CMV 흡수전에 지정된 시간 간격을 두고 100μg/ml로 사전 처리하였다(크로스-헤치 바 사용). CMV의 감염도는, 바이러스 흡수 24시간 후에 상기된 IFA 방법을 통해 측정하였다. 앰플리겐으로 처리한 배양물에 있어서 하나의 커브슬립당 CMV 봉입물의 평균수를, 약물-미처리 대조물의 평균수와 비교하였다. 이 결과는, 앰플리겐 사전 처리 시간이 CMV 감염의 억제도와 정비례한다는 점을 지시해 준다. 최대의 CMV 억제율은, HFF를 24시간 동안 앰플리겐으로 사전 처리했을 때 얻어진다.
상기 연구에서는, 시간이 경과함에 따라 CMV에 대한 항-바이러스 효과가 향상되는 dsRNA의 능력; 사용 농도와 무관하게 일정시간 후 부정합 dsRNA에 대한 CMV의 민감도; 및 비교적 비독성 변종의 dsRNA의 국소 투여 시에는 이루어 지지 않는 서방성 수준 등을 입증하였다.
본 발명의 방법은 또한 원거리의 생물학적 체액 중의 여과성 제제, 예를 들면 뇌척수액과 같은 생물학적 체액 중의 여과성 제제의 병원성, 구체적으로 알츠하이머병 또는 정신력을 서서히 감퇴시키는 기타 서서히 진행되는 질병, 즉 슬로우 바이러스 질환의 병원성을 최소화시키는데 효과적이다.

Claims (6)

  1. 식 rin·r(C12-4,U) 또는 rin·r(C29-4,G)n의 1/5 내지 1/30 우라실 또는 구아니딘 염기를 함유한 폴리이노시네이트와 폴리시티딜레이트의 착물을 포함하며, 환자에게 비경구적으로 전신 투여했을 때 환자의 구획화된 체액 내로 상기 생물학적 활성 dsRNA 단편을 방출시키는 항-바이러스 제제.
  2. 제1항에 있어서, 포유 동물의 구획화된 체액 내의 감염성 바이러스 역가를 조절하는 항-바이러스 제제.
  3. 제2항에 있어서, 포유 동물 사이에 바이러스 감염의 전달을 제어하는 항-바이러스 제제.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 바이러스가 헤르페스과에 속하는 것인 항-바이러스 제제.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 바이러스가 거대 세포 바이러스인 항-바이러스 제제.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 구획화된 체액이 타액, 눈물, 장액성 유출물, 장액성 산출물 및/또는 뇌척수액인 항-바이러스 제제.
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