JPH01131119A - 二本鎖ｒｎａを含んで成る非経口投与剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 涙、膣分泌物、及び男性射出物（精子が濃縮されたもの
）を包含する生物学的流体は、種々の懸念される疾患を
惹起しそして伝播する種々の微生物（真菌、細菌、ウィ
ルス）を含有する場合がある。治療に対して自己を比較
的接近しがたくする微生物の隠遁性のためにその限定さ
れた価値にもかかわらず、局所的又は直接的抗−微生物
処置（泡剤、スプレー等）がしばしば用いられる。それ
らが惹起する局所的刺激及びアレルギー反応を惹起する
それらの高められた能力のため局所適用も制限される。

発明者はこの明細書中で、性交中に規則的に交換される
流体を含′む種々の生物学的流体中への宿主防御介在物
質の予想外の放出をもたらす二本鎖ＲＮＡ　（ｄｓＲＮ
Ａ）の非経口的投与経路を記載する。従って本発明者は
、性病症、ヘルペス及びヒト免疫不全ウィルス等により
惹起される疾患を包含する種々の疾患に関連する生物を
含む種々の生物の感染及び伝播を減少せしめる新規な技
法を記載する。

（発明の背景） 感染及び癌の除去において必須の役割を演する新しい生
成物はいわゆる免疫調節物質（ｉｍｍｕｎｏ−ｍｏｄｕ
ｌａｔｏｒｓ）　、例えばインターフェロン（ＩＦＮ）
、インターロイキン（Ｉ　Ｌ）及び腫瘍壊死因子（Ｔ　
Ｎ　Ｆ　）である。これらは、体の自然の疾患防御努力
を強化し又は開始させる蛋白質性薬物である。しかしな
がら、これらの蛋白質含有物は血液系に吸収される前に
胃において破壊されるため、これらを液体又は錠剤の形
で与えることは一般にできない。さらに、これらの非経
口的（静豚内、筋肉内又は皮下）投与はまた、特に高い
薬物濃度又は非常に長い治療期間の場合に、やっかいな
副作用をもたらすことがある。従って、皮膚又は眼に使
用するため、そして特に種々の性病と闘うための局所活
性調製物中薬物を開発することを研究者は試みてきた。

例えば、Ｒａｐｐ及び讐ｒｐｏｓ（Ａｎｔｉ−ｍｉｃｒ
ｏｂｉａｌ　Ａｇｅｎｔｓ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅ
ｒａｐｙ＋　Ｖｏ１２８．４４９頁、１９８５）は、抗
ウィルス剤（ＩＦＮ）を非イオン性界面活性剤（その主
たる目的は性交中に一方又は両者をヘルペスウィルスの
伝播から保護ためである）と組み合わせた避妊泡剤又は
クリームを記載した。この様な局所適用調製物の相対的
な有効性は説明されていないが、しかしながら、局所的
に適用される抗ウイルス調製物を前もって使用すること
は限定された成功を伴うに過ぎない。この様な方法の制
限には幾つかのウィルス粒子の隠遁性（医薬に接近でき
ない）、及びなんらの持続的な療法応答も生じさせそう
にない体の感染した領域の局所免疫活性の低下が含まれ
る。

ＩＦＮに感受性のウィルスにより感染された組織、例え
ば皮膚、眼及び粘膜のウィルス（例えば単純ヘルペス）
感染は、Ｆｉｅｌｄ等の米国特許隘４．２８３，３９８
中に記載されている徐放性制剤中ｄｓＲＮＡ、通常はｐ
ｏｌｙ　１．Ｃであるインターフェロン誘導物質の局所
用組成物により治療される。特許文献はまた、単純ヘル
ペスに対する不活性化剤とてし局所適用抗ウィルス剤、
例えば非イオン性界面活性剤を、例えば米国特許許Ｎａ
４，０２０，１８３　（Ａｓｃｕｌａｉ等）において単
独について、又は米国特許１に４，５０７．２８１（Ａ
ｓｃｕｌａｉ等）においてインターフェロンとの組み合
わせについて、記載している。

本発明者は従来の方法及び材料に内在するこれらの限界
を驚くべき新しい一部の観察により克服する。ここで本
発明者は、ｄｓＲＮＡの非経口投与が、脳血液関門を容
易に通過しそして唾液、涙、脩液、景液滲出物等を包含
する区画された（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎ−ｔａｌｉｚｅ
ｄ）流体に入る生物活性ｄｓＲＮＡ断片放出を惹起する
ことを示す。これらの疾患に対抗する調節物質は、流体
それ自体中に無傷の検出可能なｄｓＲＮＡが存在しなく
ても、種々の生物学的流体中に入る。

この明細書において使用する場合、“区画された体流体
゛なる語は全身的血液循環の外にある局在化された体流
体を意味する。これらの区画された体流体には、漿膜表
面、粘膜表面、滑脱、尿道表面、頚骨面上の流体、脳脊
髄液、及び眼内液が含まれる。

本発明者は特に、性器−尿管系内でウィルスを直接攻撃
しそして同時に局部免疫系を武装する調節物質（ｍｅｄ
　ｉａ　ｔｏｒ）の苦心の作を示す。本発明の実施によ
り、本発明者は、彼自身に又は彼の性交渉の相手に種々
の懸念される疾患を生じさせるかも知れないウィルス（
ＨＩＶ、ヘルペスウィルス及びサイトメガロウィルスを
含む）の本質的に高いレベルを本質的に減少せしめ又は
男性射出物からおそらく根絶することを劇的に例示する
。本発明は滲出液、又は漏出液（関節）及び脳脊髄液中
の疾患を抑制する調節物質の生産にも直接関連する。

従って本発明は、種々の疾患、例えば種々の関節炎及び
中枢神経系疾患に直接関連する。

１９８７年３月１１日に公開された”Ｍｏｄｕｌａｔｉ
ｏｎ　ｏｆＶｉｒｕｓ−Ｒｅｌａｔｅｄ　Ｅｖｅｎｔｓ
　ｂｙ　Ｄｏｕｂｌｅ−５ｔｒａｎｄｅｄ　ＲＮＡ５”
と題するヨーロッパ出願公開ＮＩＯ２１３９２１におい
て、本発明者は、ｄｓＲＮＡによる、特にプロトタイプ
ｄｓＲＮ＾としてアンプリゲンを用いるヒト細胞培養物
中でのＨＩＶの阻害を記載している。

予防のために疾患に暴露される前に又は治療のために疾
患に接触した後に個体の免疫系を武装しそして天然抗ウ
イルス経路を活性化するための方法が記載される。この
活性化の目的は、後に説明するように局在化された体区
画（ｂｏｄｙ　ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）中の生物学的
流体を包含する種々の生物学的流体中に疾患抑制調節物
質（ｍｅｄｉａｔｏｒ）を放出するように患者の体を誘
導することである。後でより詳しく説明するように、ｄ
ｓＲＮＡ、好ましくはミスマツチｄｓＲＮＡの非経口投
与は、流体それ自体中に検出可能な無傷のｄｓＲＮＡが
存在しない場合でさえ、生物学的流体中に、時として疾
患抑制調節物質（ｄｉｓｅａｓｅ−ｆｉｇｈｔｉｎｇ　
ｍｅｄｉａｔｏｒ）と称される生物活性ｄｓＲＮＡ断片
の放出を惹起する。これらの生物活性ｄｓＲＮＡ断片は
脳血管関門を容易に通過し、そして組織により一般血液
循環から分離されておりそして所望の流体中に位置する
他の体区画に入る。

生物学的流体中の不活性な宿主／患者防御調節物質を測
定し、そしてもし不十分であれば、１又は複数の病原体
の量を減少せしめそして／又は疾患過程を低下せしめそ
して必要なｄｓＲＮＡ又はその生物活性断片を回復する
ために十分な時間及び■においてｄｓＲＮＡを投与し、
これによって被験流体中の防御調節物質の生化学的パラ
メーターを改良する診断試験方法も記載される。

この発明の方法により治療され、そして／又は診断され
る疾患はウィルス性のもの、例えばサイトメガロウィル
スを包含するヘルペス科のウィルスの疾患、ＨＩＶを包
含するレトロウィルス科のウィルスの疾患、関節不全の
ごとく炎症性疾患、感受性細菌種の疾患、又は真菌もし
くは原生動物性の疾患であることができる。

血液流の外で生物学的流体中に潜在的に隠遁している広
範囲の種類の病原体が存在する。これらの区画された生
物学的流体（血液を除く）は通常、全身的に投与された
薬物巨大分子（蛋白質、核酸等）に接近することができ
ない。この明細書において用いられそして医学分野にお
いて理解されるように、“非経口的投与”とは例えば静
脈内注入により直接血液中に入れること、又は血液に容
易に接近し得る区画に入れられること、例えば最初の筋
肉内又は皮下投与（注射）により薬剤巨大分子を投与す
ることを意味する。さらに、この様な高分子量の巨大分
子は、もし適切に封入されており、腸内コートされてお
り又は保護されており、あるいは上部胃腸管中で遭遇さ
れるｐＨ及び酵素のごとき破壊力に比較的耐性にされて
いれば、経口投与することができる。この様な投与態様
のすべてが、最終的には血流中にわずかに検出可能なレ
ベルの巨大分子をもたらすであろうが、他の生物学的流
体（漿液性の）中では必ずしもそうではなく、少なくと
も高度に生物活性の形態又は配置では検出されないであ
ろう。

この様な遠位の区画化された流体への到達が不可能なこ
とは、体の１つの区画から他の区画へ病原体が容易に移
行すること（すなわち、病原体の拡散）から種々の体区
画（Ｇ　−ｔＪ管、関節、口腔、ＣＮＳ等）を保護する
ために役立つ物理的障壁（膜、細胞等）に大きく起因す
る。従って、この様な物理的障壁は疾患を局在化しそし
てウィルスのごとき微生物の拡散を低下せしめる点にお
いてヒトのために自明の価値を有するが、この様な障壁
は（ａ）巨大分子であり（常にそうとは限らないが）、
そして（ｂ）細胞／膜勾配を含む“障壁”を容易に通過
することができない傾向を有する免疫調節物質（ｉｍｍ
ｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒ）のごとき疾患を抑制する物
質の容易な拡散に対する有意な障害として機能する。従
って、多くの研究者がタンポン、コンドームのごとき生
理的に許容されるキャリヤーを介して局在する体区画に
直接、免疫調節物質／抗ウィルス剤／抗癌化合物を供給
する方法を探索している。今日まで、この様な方法は限
られた成功を修めているに過ぎない。

驚くべき広範囲の種類の病原微生物が人体へ・の最初の
入口部分としての漿液区画に隠遁している。

性器伝染（性交関連の）は明らかに特に、クラミジア（
腰部炎症疾患に関連する）及び種々のウィルスに関して
警告的である。例えば、性器ヘルペス及び口内ヘルペス
、サイトメガロウィルス、性器症及びレトロウィルス（
特にＨＩＶ）は驚くべき速度で伝染し、そしてインター
フェロンを基礎とする局所調製物又はインターフェロン
誘導物質の局所調製物のごとき方法が決定的な治療又は
予防法であることを示す証拠は現在存在しない。

従って本発明の目的は、患者の体全体にわたる種々の漿
液中に疾患抑制調節物質を効果的に生産する治療方法を
考案することである。この治療は単独で使用され、又は
局所治療と組み合わせて使用される。本発明の追加の価
値は、インターフェロン惑受性疾患に対する局所的保護
のさらなる段階が望まれる場合、インターフェロンで含
浸されたタンポンのごとき伝統的な方法と共に実施する
ことができることである。

本発明者は、癌及びウィルス性疾患の両者に対する体防
御機構に関連する鍵となる酵素（ＲＮアーゼし）が促進
された且つ見かけ上制御されない態様で機能する、今ま
で検出されなかった生化学的異状を観察した。これらの
及び他の観察が、１９８７年７月１７日に出願された”
Ｄｏｕｂｌｅ−５ｔｒａｎｄｅｄＲＮＡ　Ｃｏｒｒｅｃ
ｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｂｅｒｒａｎｔ　Ｍｅｔａｂｏｌｉ
ｃ　Ｐａｔｈｗａｙｓ八５ｓｏｃｉａへｅｄ　　ｗｉｔ
ｈ　　Ｕｎｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　　Ｔｕｍｏｒ　　Ｃ
ｅ１ｌ　　ａｎｄＶｉｒｕｓ　Ｇｒｏｕｔｈ　Ｃｙｃｌ
ｅｓ”と題する本発明者の係属中の米国特許出願１１ｈ
０７４，６４９に記載されている。別個の実験において
、本発明者はウィルスの攻撃に対抗するこれら２種類の
異る細胞（異状なＲＮＮアーゼを有する細胞）の能力を
比較した。本発明者はの観察によれば、子孫レトロウィ
ルスの力価（収量）が、非常に急速にＮＣＲを生じさせ
る異状なＲＮアーゼし活性を有する細胞中で有意に高か
った。

上に記載した１９８７年７月１７日の本発明者の米国特
許出願に報告されているように、二本鎖ＲＮＡ、特にミ
スマツチｄｓＲＮＡはＲＮＮアーゼの動態及び分解生成
物の正常さを回復する。さらに、二本鎖ＲＮＡによる正
常への回復速度をリンホカインへの事前暴露により促進
することができる。

二本ＢｉＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は二本鎖合成ポリヌクレ
オチド複合体である。

“ミスマツチｄｓＲＮＡ”とは、相対する鎖間の水素結
合（塩基重層）が比較的無傷であり、すなわち２９個の
連続する塩基残基中平均１未満の塩基によって中断され
ているものを意味する。“ミスマツチ”は、リボヌクレ
アーゼによる消化に対するｄｓＲＮＡの弱点を提供する
鎖の内側のふくらみ（ｉｎ−ｐｏｕｃｈｉｎｇ）又は外
側のふくらみ（ｏｕｔ−ｐｏｕｃｈｉｎｇ）によるＲＮ
Ａ二重らせんの正常な幾何学配置の中断である。従って
“ミスマツチｄｓＲＮＡ″は理解されるべきである。

ｄｓＲＮＡは、例えば５塩基中１塩基〜３０塩基中１塩
基のウラシル塩基又はグアニジン塩基を含有するポリイ
ノシン酸とポリシチジル酸との複合体（ｐｏｌｙ　ｌ　
ｐｏｌｙ（Ｃ４−ｚｑ　Ｘ＞Ｏ又はＧ））であることが
できる。

ｄｓＲＮＡは一般式、１．．（Ｃ１１−１４，Ｕ）、、
、又はｒｌｎ’（Ｃ＋□、Ｕ）。で表わされるものであ
ることができる。

ｎの値は４〜２９である。ｄｓＲＮＡの他の適当な例を
後に記載する。

この発明における使用のために好ましいミスマツチミス
マツチｄｓＲＮＡはｐｏｌｙ（Ｃ，、Ｇ）　（式中ｎは
４〜２９の値の整数である）から選択されたコポリヌク
レオチドに基礎を置き、そしてｒＩ、、・ｒＣ，ｌを変
形してポリリボシチジル酸Ｌ　Ｃｎ）鎖にそって不対合
塩基（ウラシル又はグアニジンを導入することによって
形成されたポリリボイノシン酸とポリリボシチジル酸と
の複合体のミスマツチ類似体である。あるいは、ｐｏｌ
ｙ（１）　・ｐｏｌｙ（Ｃ）ｄｓＲＮＡから、例えば２
’−０−メチルリボシル残基を含めることによってポリ
リボイノシン酸（ｒ　１　ｎ）のリボシル主鎖を変形す
ることにより透導することができる。これらのｉｎ・ｒ
　Ｃｎのミスマツチ妻旧以体は、その好ましい１つが一
般式ｒ［７，（Ｃｚ−＋ａ、Ｕ）−及び−［−、ｒ（Ｃ
２９，Ｇ）、、で表わされ、Ｃａｒｔｅｒ及びＴｓ’。

の米国特許魚４，１３０，６４１及び阻４，０２４，２
２２に記載されている。これらの特許明細書中に記載さ
れているｄｓＲＮＡは一般に本発明に従って使用するた
めに好ましい。

・好ましいミスマツチｄｓＲＮＡ　（、ｌ−６（Ｃ＋ｚ
、Ｕ）−）において、６〜１２塩基対の中断されない連
続からなる領域、すなわちＲＮＡらせんの０．５〜１回
転、はリンホカインの放出を惹起する生物的引金（ｂｉ
ｏ−Ｌｒｉｇｅｒ）として及び自然の抗ウイルス経路を
構成する酵素の義務的な細胞内コファクターとして機能
する。ウラシル残基から成るミスマツチ領域は、ｄｓＲ
ＮＡの加水分解を促進しそして毒性を防止するためにポ
リピリミジン鎖中に周期的に挿入される。

本発明において使用されるミスマツチｄｓＲＮ＾の他の
例は次の通りである。

ｐｏｌｙ（１）　・ｐｏｌｙ（Ｃａ、ＩＩ）ｐｏｌｙ（
Ｔ）　・ｐｏｌｙ（Ｃ７，Ｕ）ｐｏｌｙ（１）　・ｐｏ
ｌｙ（Ｃ＋＋、Ｕ）ｐｏｌｙ（１）　・ｐｏｌｙ（Ｃｚ
ｚ、Ｕ）ｐｏｌｙ（１）　Ｈｐｏｌｙ（Ｃｚｏ、Ｇ）ｐ
ｏｌｙ（１）　・ｐｏｌｙ（Ｃｚｑ、Ｇ）及びｐｏｌｙ
（１）　・ｐｏｌｙ（Ｃ，）　　２３　Ｇａｐこの明細
書中で検討する様に、リンホカインはインターフェロン
、好ましくはインターフェロン−α、インターロイキン
、特にインターロイキン−２及び組み換えインターロイ
キン（，４Ｌ−２）、並びに腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を
包含することができる。さらに、リンホカインへの暴露
に応答して動物中で形成されるリンホカインで活性化さ
れたキラー（ＬＡＫ）細胞も含まれる。逆転写酵素の阻
害剤、例えば３′−アジド−３′−デオキシチミジン（
ＡＺＴ）をリンホカインに加えて、又はその代りに製剤
に含めることができる。

リンホカインとしてインターフェロン（α）が使用され
る場合、患者の体液ｍｌ当り０．０１−１００，０００
ＩＲＵＯ量が与えられる。リンホカインがＩＬ−２、好
ましくは、ＩＬ−２である場合、投与される量は患者の
体重ｋｇ当り約１０”１Ｌ−２ユニ、ト〜その患者にお
ける許容されないレベルの毒性に達する値までであり、
この上昇は１０６ＩＬ−２ユニツトと高いことができる
。しかしながら、最も効果的な、毒性反応が抑制できる
値は体重当り約１０３〜約１０’１Ｌ−２の範囲である
。

投与されるｄｓＲＮＡの通常の量は患者の体液−当り０
．１〜１，０００μｇのｄｓＲＮＡレベルを与える。体
液なる語は、生物体内を循環しそして組織を浸漬する、
血清、塩、ビタミン等を含む溶液を意味する。

患者の体液の体積は人手可能な表によって決定される。

この表は受容者の体重と体液体積とを関連付けるもので
ありこの体液体積は患者の体液体積と、必要量のｄｓＲ
ＮＡとの平衡に用いられる体液体積との合計である。両
方の薬物（ｄｓＲＮＡ、並びにリンホカイン及び／又は
逆転写酵素の阻害剤）が投与される場合、これらは通常
混合物として投与されるが、しかしながら別々にしかし
同時に、又は順次に投与することもできる。

ｄｓＲＮＡ及びリンホカインの“組み合わせ”投与は、
両方の薬物を療法混合物として一緒に投与する方法、及
び二つの薬物を別々にしかし同時に、すなわち同じ個体
に別々の静脈を通して投与する方法を含む。“組み合わ
せ”投与はさらに、薬物の一方を最初に投与し短時間の
後に他方を投与する分離投与を含む。

本発明の医薬はまた、離れた生物学的流体中の濾過性病
原体、例えば脳脊髄液のごとき生物学的流体中に見出さ
れる濾過性病原体、特にアルツハイマー（Ａｌｚｈｅｉ
ｍｅｒ）病、及び他の徐々に進行する疾患に関連するも
の又は進行する精神的低下を生じさせる“緩慢（ｓｌｏ
ｗ）ウィルス”の病原性を最少にするためにも有効であ
る。

貫−玉 本発明者はミスマツチｄｓＲＮＡ　　（アンプリゲン（
八ＭＰＬＩＧＥＮ（ＩＩＥＭ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｉｎ
ｃ、ロックビル、　ＭＤの商標）、式、１．、、（Ｃ＋
ｚ、ｕ）、のミスマツチｄｓＲＮＡ　）を週当り２０〜
１０００　ｇの量で４０〜７０ｋｇの体重の個体群に投
与し、そしてそれらの脩液、特に膣液及び男性射出物を
、ｄｓＲＮＡにより誘導される宿主防御調節物質の存在
について評価した。仲間の９ｎ床試験において、本発明
者は、過程の特異性を決定するためインターフェロン又
はインターロイキンが注入された個体における類似のパ
ラメーターを研究した。光学顕微鏡下において、処置さ
れた患者からｊ＃離された流体は単核細胞、扁平上皮（
女性性器サンプル）及び精子（男性射出物）を包含する
種々の細胞並びに不定形細胞“破片”を含有した。

この様な３人の患者をｄｓＲＮＡにより種々の期間にわ
たり処置した場合の観察を次の表に要約する。

■上表 区画化された生物学的流体中の回収可能なウィルスのレ
ベルに対する全身的ｄｓＲＮＡ処置の効果患者Ａ及びＢ
は、末梢血単核細胞について最近報告された方法１　　
（Ｃａｒｔｅｒ等、Ｌａｎｃｅｔ　Ｖｏｌｌ、　１９Ｂ
？年６月６日、１２８７頁）を用いる同時培養により２
．０〜４．０　ｃｃの射出物を測定した場合、射出物か
ら回収可能な高力価のＨＩＶ−１１［を有していた。要
約すれば、本発明者は、２〜４日間ＰＨＡにより刺激さ
れた正常提供者からの血液単核細胞を暴露し、２８時間
培養を続け、そして次にエンザイムーリンクド・イムノ
ソルベント・アッセイ（ＥＬＩＳ＾）により細胞内ウィ
ルスを測定した。同時培養力価を、負対照値（０，１未
満）を差引いた後のＥＬＩＳＡアッセイの平均光学濃度
（４９０ｗｎにおけるＯＤ）として定義した。患者Ｃは
膣分泌物中に肛門小胞に関連する慢性Ｈ３発現を有して
いた。単純ヘルペスは３５ｍ■プレート中に増殖したコ
ンフルエントＨＥＬ細胞を用いるＲａｐｐの方法（Ｒａ
ｐｐ等、＾ｎｔｉ−ｍｉｃｒｏｂ、　Ａ　ａｎｔｓ　＆
　ｃｈｅｍｏｔｈ、、　Ｖｏ１２８．４４９頁、１９８
５）により培養した。

第１図及び第２図は、ｄｓＲＮＡ　ｒｌｎ・ｒ（ＣＩｚ
＋Ｕ）＋ｓ単独及びリンホカインとの組み合わせの全身
投与の前及び後の患者の液体のＨＬＰＣ評価の結果を示
している。第１図において、すべてのサンプルは第２図
のカラム４及び５のサンプルと同様ＴＣ人及びアセトン
沈澱により調製し；第２図カラム６は下に説明するよう
に標準化された換算を達成するために使用された。図は
次の様に配置される：第１図カラム３は処置前の患者Ａ
であり；カラム２は処置の４週間後であり；そしてカラ
ム１は処置の１２週間後であり；第２図においてカラム
５は処置前の患者であり、そしてカラム４は処置中であ
り、カラム６は標準曲線である。第１図及び第２図は前
記の第１表と比較されるべきである。

ｄｓＲＮＡの全身投与後の高圧液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）による患者サンプルの評価は宿主防御調節
物質の増強を示す。患者の膣液（１１ｋＬ３　）及び射
出液（Ｉｌｈｌ及び２）を、本発明者が最近末梢血単球
細胞について記載したような（Ｃａｒｔｅｒ等、Ｌａｎ
ｃｅｔ、前に引用；さらににａｒｉｋｏ等、Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ。

Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、Ｒｅｓ、ｃｏｍｍ、＋　Ｖｏｌ、１２
８．　６９５頁、１９８５　；及び５ｕｈａｄｏｌｎｉ
ｋ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　、　Ｖｏｌ、２２．４
１５３頁、１９８３）天然（２’−５’オリゴＡ／ＲＮ
アーゼＬ）抗ウイルス経路の種々の成分について評価し
た。

結果を第１図Ａ、Ｂ及びＣにグラフとして示す。

本発明者は特に、ｄｓＲＮＡ投与前のすべての系成分の
かろうじて検出し得る活性を見出した。しかしながら、
ｄｓＲＮＡの全身投与の間、本発明者は第１図及び第２
図に示すようにこれらの漿液中の調節物質の特異的富化
を観察した。これはこれらの同じ部位（第１表）中及び
検出可能な巨大分子ｄｓＲＮＡの完全な不存在下でのウ
ィルス発現の減少と動的に連動した。これらの値は、本
発明者が前に報告した（Ｂｒｏｄｓｋｙ等、Ｊ、Ｂｉｏ
ｌ、Ｒｅｓ　ｏｎｓｅ　Ｍｏｄ土ｆｉｅｒｅｓ。

Ｖｏｌ、４．６６９頁、１９８５）迅速プロッティング
及び液体シンチレーション分光法により測定した。゛過
程の特異性を評価するため、本発明者はまた、種々のイ
ンターフェロン及びインターロイキンの高投与量（＜　
ｌ　０ｍ１ｌ　ＩＲＵ（ｄ））により処置された類似の
個体（又は動物）を研究したが、しかしこれらの区画さ
れた流体中での疾患を抑制する調節物質の増強を示すこ
とに失敗した。しかしながら、本発明者が全身的に注射
されたリンホカインをミスマツチｄｓＲＮＡと組合わせ
た場合、これらの区画された流体中の調節物質の検出速
度が顕著に加速された。ラジオパインディングアソセイ
、ラジオイミューンアッセイ及びｒＲＮＡ開裂アッセイ
と組み合わされたＩＩＰＬｃは、疾患の保護を生じさせ
るに十分な型で体に適用されたｄｓＲＮＡの結果として
新たな２’−５’オリゴアデニレートの特異的生成を確
認した。後者は第１表に明瞭に示される。

ＴＣＡ及びアセトン沈澱によるサンプルの調製の後、Ｈ
ＰＬＣによる同定（Ｌｅｅ及び５ｕｈａｄｏｌｎｉｋ、
　Ｂｉｏ−堕明ｎ江ＬＶｏ１．２４．５５１頁、１９８
５）を行った。

リン酸アンモニウム１刈行ｉン夜（５０ｎ＋Ｍ）（ｐＨ
７、０）中メタノール及び水のグラジェントを展開する
ことによりウォーターズＣ１ａミクロンボンダパック分
析用カラムを使用した。＃６　（第２図）と称するＨＰ
ＬＣの操作は、酵素的に合成された（Ｌａｙｌｅｙ等、
Ｅｕｒｏ　、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、Ｖｏｌ１４３＋　
１６５頁、１９８４及びそれに引用された文献）真正ｐ
３Ａ３及び、３Ａ４を用いた標準を示す。臨床単離物は
この特定のＩＩＰＬｃにおいて６．８分と７．０分の間
、又は約１２分に現われるＩＩＰＬｃピークである。な
ぜなら、これらのピークは最も生物活性の強い調節物質
を示し、すなわちこれらは、それぞれ２’−５’連結さ
れたオリゴアデニレート調節物質のトリマー及びテトラ
マーである真正な２．Ａ、及び、３Ａ４に対応するもの
であるからである。なお、第１表の患者Ａ〔その射精物
が処置後（第１図中カラム３）及び処置後（４週間後は
カラム２．１２週間後はカラムｌ））は、標準的ＲＮア
ーゼし開裂アッセイを用いる場合生物活性２’−５’レ
ベルの漸増、及びＨＰＬＣにより決定される場合構造的
に真正な２’−５’Ａ分子の増加レベルを示す。患者Ａ
、！：類似する結果が患者Ｂについて見られる（結果は
示していない）。

第２表は、全身的ｄｓＲＮ＾療法の前（第２図中カラム
５）及びその間（カラム４）の患者Ｃの膣分泌物につい
て得られた結果を示す。なお、患者Ｃにおいて、第１表
を第２図と比較することにより、生物活性及び真正な化
学構造の両者として測定された調節物質のレベルが上昇
するに従って、ヘルペスウィルス感染のレベルは１！＋
１的に低下する。

特定の理論及び装作方法に依存することを望まないが、
局在下された体区画においてこれらの効果を本発明者が
達成した機構は、少なくとも部分的にはシグナル変換過
程が関与し、これによってｄｓＲＮＡが血管壁を囲んで
いるか又はその近傍に存在する細胞に作用し、そしてこ
の過程が局在化された区画それ自体中での調節物質の形
成を開始する波状過程を生じさせる、ということの様で
ある。

旌−り 本発明者は、本発明の実施のためにミスマツチｄｓＲＮ
Ａのユニークな構造が最も好都合な態様であることを決
定した。これは、ｄｓＲＮＡのミスマツチが、そうでな
ければ比較的安定なｄｓＲＮＡ？、３Ｊ合体中にもろい
領域をもたらし、その結果、ｄ　ｓ　ＲＮ　Ａ　／Ｉｓ
さい生物活性断片が、より一層移動しやすく、特定され
た体区画に接近することができ、ここでそれらが局在化
された、高度に特異的な、免疫調節性のそして抗ウイル
ス性の効果を生じさせるためである。そうでなければ分
離されている区画への接近は、本発明者の経験によれば
ほとんどの外的に適用されたｄｓＲＮＡの性質ではない
。

この現象を証明するために使用された他の実験の中で、
本発明者は、Ｓ１ヌクレアーゼ（ｄｓＲＮＡに対する分
解酵素）に完全に塩基対合したｄｓＲＮＡ（ｐｏｌｙ　
１．　ｐｏｌｙ　Ｃ）のアリコートを暴露することによ
り生物分解の生体内条件を刺激し、そしてその結果をミ
スマツチｄｓＲＮＡ（ｐｏｌｙ　１　・ｐｏｌｙ　Ｃ＋
ｚ、１１）　−のアリコートと比較した。２つの分解曲
線のプロフィールは完全に異り、そして本発明者はこの
差異が非常に異る療法的性質に基くと信する。ｐｏｌｙ
Ｉ−ｐｏｌｙ　Ｃ分解曲線は単一特異的であり、そして
単に小さな非生物活性の残留核酸物質を導（。・これに
対して、ミスマツチｄｓＲＮＡの分解曲線は二相的であ
り、分解曲線の最初の相（第土則）において小さな生物
活性断片が生成し、親分子は約１１．０〜１５．ＯＳの
沈降値（Ｓｚ。１．）（分析的超遠心）に対応する約１
，０００塩基対の長さであり、娘生成物（部分的加水分
解生成物）はわずかに５０〜１００塩基対の長さである
。驚くべきことに、本発明者が見出したところによれば
、ヒトの必須の２′−５’Ａ天然防御系経路の成分部分
の細胞内触媒として高い生物活性をなお発現した。類似
の条件下でＳｌヌクレアーゼのごときｄｓＲＮＡ分解酵
素の匹敵する量に暴露されたｐｏｌｙ　１．Ｃのバイア
ルをサンプリングした場合、これらの断片は検出可能に
存在しなかった。

本発明者のミスマツチｄｓＲＮＡ分解曲線の第二朋にお
いて、５０未満の塩基対のｄｓＲＮＡの断片が回収され
た。本発明者は、これらの後者の断片を“ヌクレアーゼ
耐性コアー”と称し、そして本発明者はこの様な残留断
片をｐｏｌｙ　１．　ｐｏｌｙ　Ｃから生じたものと区
別することができなかった。従って、本発明汗は次の様
に結論する。ｄｓＲＮＡ　（すなわち、ミスマツチｄｓ
ＲＮＡ）のある種の配置の生物分解の間、ｄｓＲＮＡの
生物断片の特定のクラスが生成し、そしてこれらの断片
は、特定のそして予想外の性質、例えば全身循環又は血
液供給外が特定の体液（区画）を効果的に貫通させる能
力を有する。これらの区画は、限定的ではないが、種々
の湘液及び／又は粘質表面、例えば滑表面、尿意表面、
頚骨表面、並びに脳脊髄、及び眼液区画を包含する。

例−」ユ 次に、生物分解過程の間に生ずるｄｓＲＮＡの新たな分
子種が種々の生物学的（体）流体中の天然防御系（例え
ば、２’−５’Ａ系）の調節物質の予想外に高いレベル
に等与するという予想を評価するため、生体内／生体外
で実験を行った。

ヌクレアーゼによる加水分解に対する二本鎖ＲＮＡ（ｄ
ｓＲＮＡの感受性を放射性ｐｏｌｙ　Ｉ　・ｐｏｌｙ　
Ｃ１及びミスマツチｄｓＲＮＡを用いて検討した。（８
−１４Ｃ）−ポリイノシン酸（比活性３．６μＣｉ−μ
モル）をＰ−Ｌバイオケミカルスから購入した。このラ
ベルされたｐｏｌｙ　Ｉは＞　ｔｏｏｏ塩基の長さを有
していた。

（８−”Ｃ）　ｐｏｌｙ　Ｉを非ラベル化ｐｏｌｙ　１
．　ｐｏｌｙ　Ｃ又はミスマツチｄｓＲＮＡと混合し、
そしてこの混合物を熱変性し、そしてアニールして放射
性ｄｓＲＮＡを得た。

最初の研究はＳ１ヌクレアーゼ（Ｅ、Ｃ，３，１，３０
，１）による消化を測定した。Ｓ、ヌクレアーゼは単鎖
核酸を消化して二本鎖領域を無傷のまま残す。Ｓ１ヌク
レアーゼによるｐｏｌｙ　ｒ、　ｐｏｌｙ　Ｃの消化は
、１分当りｄｓＲＮＡの１．４％をＴＣＡ可溶性にする
速度の一相速度を示した。熱変性の後、加水分解速度は
１．８％／分に上昇した。

ラベルされたミスマツチｄｓＲＮＡを用いる類似の実験
は、消化の動態が二相的であることを示した。

もとのミスマツチｄｓＲＮＡの消化は最初の早い消化（
３，２％／分）とそれに続く緩慢な消化（０，５％／分
）から成った。変性されたミスマツチｄｓＲＮＡは比較
的迅速な分解（４，５％／分）を示した。

もとのｐｏｌｙ　１．　ｐｏｌｙ　Ｃ及びミスマツチｄ
ｓＲＮＡの４５分間にわたる全分解は類似していた。前
に報告した様に（Ｃａｒｔｅｒ等、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏ
ｌ、、　７０　：　５６７゜１９７２）　、ミスマツチ
ｄｓＲＮＡの加水分解速度は最初はｐｏｌｙ　１．ｐｏ
ｌｙ　Ｃのそれよりも大であった。しかしながら、ミス
マツチｄｓＲＮＡ分解の二相動態はこの物質及び正しく
そろった（十分に塩基対合したｐｏｌｙ　１．　ｐｏｌ
ｙ　Ｃ分子間の見かけ上の物理的差異を示す。これらの
結果は、これらのｄｓＲＮＡ間のヌクレアーゼ感受性の
差異をもたらす二次構造及び三次構造の有意な差異並、
びにこの明細書に開示される予想外の結果を示唆する。

さらに、ある種のｄｓＲＮＡの二相部分間の加水分解速
度の有意な６倍の低下及び遅い部分の比較的低い加水分
解は、このクラスのｄｓＲＮＡ中に、ｐｏｌｙ　１．　
ｐｏｌｙ　Ｃ中にはないと思われる相対的にヌクレアー
ゼに対して耐性を有するコアーの存在を示している。

ミスマツチｄｓＲＮＡのヌクレアーゼ分解はまた、１０
％の熱失活ウシ胎児血清又はヒト血清が補充された標準
的′ｌＪｉ織培養培地（ＲＰＭｌ　１６４０）を用いて
行われた。この血清はりボヌクレアーゼ源である。

この培地によるミスマツチｄｓＲＮ＾の分解は急速であ
り、このｄｓＲＮＡの約４０％が３分間以内にＴ’ＣＡ
可溶性となった。２時間までのさらなる消化は有意な量
の追加の分解物を生じさせなかった。この培地の逐次的
稀釈及びその後のミスマツチｄｓＲＮＡの存在下での３
分間のインキュベーションは、１／１６稀釈における約
５０％の分解を示し、これはさらに濃厚な血清によって
増加しなかった。ＴＣＡ沈澱性物質の量は長時間及びか
なりの範囲の稀釈にわたって比較的一定のままであるか
ら、ＴＣＡ沈澱物の長時間の安定性はおそら＜ＴＣＡ可
溶性物質の優先的な分解のためではないであろう。

これらの結果は再びミスマツチｄｓＲＮ＾分子中のヌク
レアーゼ耐性コアーの存在を示唆する。

沈降係数の決定により分子量を測定した。未処理のｄｓ
ＲＮＡサンプル゛をベックマツ・モデルＥ超遠心機中で
４８．０００Ｒｒ’Ｍ、２０°Ｃにて処理した。沈降系
数をを計算するために８分間融で５時点を用いた。ｄｓ
ＲＮ＾サンプル ０、０１Ｍリン酸ナトリウム、０．００１Ｍ　ＭｇＣ　
Ｉ！　２＋　　ｐＨ７、２）中に０．６３のＯＤ２．。

まで（希釈した。Ｓ，ヌクレアーゼ処理されたｄｓＲＮ
Ａサンプルを緩衝液Ａ中で０．６５のＯＤｚｈｏにて、
５２．　ＯＯＯＲＲＭで２０℃にて処理した。沈降係数
はｈａｌｆ−ｈｅ４ｇｈｔ法及びｓｅｃｏｎｄｍｏｍｅ
ｎ　を法により計算した。これらの方法により決定され
たｄｓＲＮＡの沈降係数はそれぞれ１２．７４及び１３
、２９であった。Ｓ１ヌクレアーゼによる加水分解の後
、ｈａｌｆ−ｈｅｉｇｔ法によるｄｓＲＮＡの沈降係数
は６、１８に低下し、そしてｓｅｃｏｎｄ　ｍｏｍｅｎ
ｔ法により測定した場合７．２１に低下した。これらの
データーは、Ｓ１ヌクレアーゼによる処理がミスマツチ
二本鎖ＲＮＡを低分子量断片に分解することを示してい
る。

Ｃ，　　ｄｓＲＮＡのヌクレアーゼ　　コアー〇生　ゞ
ヌクレアーゼで消化されたｄｓＲＮ＾の生物活性を、標
準的組織培養腫瘍増殖阻害アッセイにより試験した。ｄ
ｓＲＮＡを１２０分間までインキュベートし、そして次
にヒト繊維肉腫細胞系ＨＴ１０８０　Ｃ１４の増殖を阻
害するために使用した。５０Ｍｇ／ｒｎ！のＳｌヌクレ
アーゼ消化ミスマツチｄｓＲＮＡによる処理の７２時間
後に見られる未処理対象細胞増殖の％、未処理ｄｓＲＮ
Ａは細胞増殖を約５０％阻害した。Ｓ１ヌクレアーゼ処
理の程度には関係なく、Ｓ，ヌクレアーゼで処理された
ミスマツチｄｓＲＮＡを用いて類似の阻害が見られた。

Ｓｌヌクレアーゼ処理と組み合わされた熱変性がミスマ
ツチｄｓＲＮ＾の抗増殖効果を廃止した。

これらの結果は、ミスマツチｄｓＲＮＡの抗増殖活性が
長時間のヌクレアーゼ処理の後においても維持されるこ
とを示している。ヌクレアーゼ耐性コアーはこの系にお
ける消化の最初の１５〜２０分間以内に生ずるらしいか
ら、後の時点における増殖阻害は、ｄｓＲＮＡの抗増殖
活性はヌクレアーゼが耐性コアー中に存在し、そしてこ
れは今度は種々の体区画中での生物学的に活性な調節物
質の驚くべき高い収量を説明することができることを示
唆する。

ヌクレアーゼ耐性コアーの生物学的活性をさらに探索す
るため、ｄｓＲＮＡを３１ヌクレアーゼにより６０分間
消化した。次にこの物質のアリコートエタノール沈澱せ
しめ、この方法によって沈澱しない小さい分解生成物を
潜在的に除去した。生物学的活性の測定として、ヒト−
グリオーマ細胞系Ａ１２３５を２００ｕ／−のもとのｄ
ｓＲＮＡ　％　Ｓ　１　ヌクレアーゼで消化されたアン
プリゲン、及び消化されエタノール沈澱したｄｓＲＮＡ
で処理した。７２時間の培養の後、＾１２３５細胞は了
ンプリゲンにより９９．８％、Ｓ１ヌクレアーゼ処理ア
ンプリゲンにより７８．４％、そしてＳ１ヌクレアーゼ
処理されエタノール沈澱したアンプリゲンにより８４．
４％阻害された。従って、ｄｓＲＮＡの抗増殖活性はこ
れらの異る処理の間維持された。

これらのＡｌ２３５細胞中で２−５Ａシンセターゼ（Ａ
ＴＰ：２’−５’−オリゴ（Ａ）アデニリルトランスフ
エラーゼ（ＥＣ２，７，７，１９）　）を誘導するこれ
らの調製物の能力も測定した。細胞ペレットをＰＢＳで
洗浄し、５ｄの細胞溶解緩衝液（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、
　　ｐＨ７，５、０，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、　　０．２５
Ｍシュークロース、５０ｍＭ　　ＭＣＩ！、　　２ｍＭ
　Ｍｇ（Ｊｚ及び１ｍＭＤＴＴ）中に再懸濁し、そして
水中に５分間保持した。

ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞ペレットを０．１　ｍＺ
の緩衝液Ｂ　（２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、　ｐＨ７，５，
５ｍＭ　ＭｇＣ４２２゜１２０ｍＭ　ＤＴＴ及び１０％
グリセロール）（０，５％のノニデソトーＰ４０を含有
する）中に再）懸濁し、そして氷上に１０分間装いて細
胞を溶解せしめた。６分間８０００　ｇにて遠心分離す
ることにより細胞質抽出物を得、そして−７０℃にて５
０ｐ！のアリコート中に貯蔵した。

２−５Ａシンセターゼを記載されているようにして（Ｓ
ｕｈａｄｏｌｎ　ｉｋ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　　
２２：４１５３，１９８３）測定した。解凍した細胞抽
出物（２５μｇの蛋白質に相当する）を３０μｌのバッ
クされたｐｏｌｙ（、Ｉ）・ｐｏｌｙＬｃ）−アガロー
スと混合し、そして２５°Ｃにて２０分間インキュベー
トした。０．４　ｍＺの緩衝液Ｂで２回洗浄することに
より未結合の蛋白質を除去した。２．５　ｍＭ　（”　
Ｐ　）　ＡＴＰ（０，１２Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ）　。

２、５ｍＭ　ＤＴＴ、　３ユニツト／ｒｎ！クレアセン
ホスホキナーゼ及び１０ｍＭタレアチンホスフエートを
含有する１０ｍの緩衝液Ｂを添加することにより２′−
５′−オリゴアデニレート（２−５Ａ）の酵素的合成を
開始した。３０℃にて２０時間のインキュベーションの
後、遠心骨ｉ？１ｌ（３分間、８’ＯＯＯｇ　。

２５℃）によりアガロースをペレット化した。上清中の
２−５への混合物を、Ｄｏｃ　ｔｓｃｈ等、Ｎａｔｕｒ
ｅ２９１　：　３５Ｂ、　１９８１　、により記載され
ているようにしてＤＥＡＥ−セルロースカラムクロマト
グラフィーにより分析した。生成物の形成は、０．３５
Ｍ　　ＫＧβ緩衝液によりＤＥＡＥ−セルロースカラム
から除去される放射能の量を全放射能で除すことにより
決定した。

ｄｓＲＮＡヌクレアーゼ処理ｄｓＲＮＡの無細胞抽出物
との酵素インキュベーション中２−５Ａの合成、及び沈
澱後のヌクレアーゼ処理ｄｓＲＮＡはＡＴＰの２−５Ａ
への転換に対する時間の効果を示す。幾つかの顕著な結
果が存在する。第一に、無細胞抽出液と未処理ミスマツ
チｄｓＲＮＡとの１８時間のインキュベーションの後、
２−５Ａシンセターゼの比活性は４１．５であった。第
二に、Ｓ、ヌクレアーゼ処理の後、ＡＴＰの２−５Ａへ
の転換の顕著な増加が存在した。例えば、１８時間のイ
ンキュベーションの後、比活性は２８４であり、これは
未処理ミスマツチｄｓＲＮＡにおいて観察されたそれに
比べて約７倍大であった。第三に、ＳＩヌクレアーゼに
より処理されたｄｓＲＮＡは沈澱の後、１２時間のイン
キュベーションの後に最大の２−５Ａ合成を示した。こ
れらのデーターは、ミスマツチｄｓＲＮＡのＳｌヌクレ
アーゼ処理の後に２−５Ａのトリマー、テトラマー及び
高級オリコマ−の酵素的合成が有意に増加することを示
している。酵素活性の上界とｄｓＲＮＡＯサイズの減少
との間の正の関係は、アロステリック変性物質、すなわ
ち部分的に分解されたミスマツチｄｓＲＮＡ　との相互
作用が存在し、未処理のｄｓＲＮＡより良好に２−５Ａ
シンセターゼに結合しそれを活性化することができるこ
との証拠である。これに対して、ＳＩヌクレアーゼ処理
ミスマツチｄｓＲＮＡの低分子■分解生成物が沈澱によ
り除去された場合、１２時間のインキュベーション後の
２−５Ａの最大合成が存在した。沈澱後の８１ヌクレア
ーゼ消化ｄｓＲＮＡのこの最大２−５Ａシンセターゼ活
性は、ヌクレアーゼ耐性コアーが、１８時間のインキュ
ベーション後のＳ、ヌクレアーゼ処理ミスマツチｄｓＲ
ＮＡによる活性化と同様な方法で２−５Ａ合成を活性化
することができることを示唆している。

これらのデーターはミスマツチｄｓＲＮＡの生物学的に
活性な断片の存在をｒｌＩ！認し、そして生物学的流体
中でのこれらの断片の療法活性の物理的基礎を説明する
。これらのデーターはまた、生物学的に活性な断片が鋭
化合物より活性であることを示している。

貫−玉 この発明をいかに実施することができるかを示す他の例
はサイトメガロウィルス又はＣＭ　Ｖ　（Ｎ、Ｙ。

Ｔｉｍｅｓ、　　１９８８年７月１４日、８６頁、を参
照のこと、これは性関連疾患の急激な増加を記載してい
る）のごとき性的に伝染する疾患の予防による。サイト
メガロウィルス（ヘルペスウィルス科の構成員）は米国
のみで１００万人に影響を及ぼしており、そして不完全
な免疫系を有するヒトは胃腸管の問題を起こし又は盲目
になるかもしれない（いずれもウィルスに感染される様
になる漿液表面、及び多くの全身的に投与された抗ウィ
ルス剤により容易に通過されない区画を有する）。ＣＭ
Ｖは性的に伝染する。長時間にわたって活物活性断片を
生じさせることにより、例えばミスマツチｄｓＲＮＡ　
（アンプリゲン）を投設することにより、非常に高レベ
ルの阻害を達成することができる。例えば、第３図はア
ンプリゲン断片に２４時間暴露された場合のＣＭＶの１
００％の阻害を示す。生物活性物質のこの様な制御され
た放出は、相対的に非毒性のｄｓＲＮＡを使用する場合
、局所的膏薬等によっては容易には達成することができ
ない。

長時間にわたるｄｓＲＮＡの生物活性断片の生成は、サ
イトメガロウィルスを用いて行われる組織培養研究にお
いて例示され、このウィルスは時として巨大細胞封入体
病とも呼ばれ、これは該ウィルスに感染された拡張され
た細胞中に見出される核内封入体を意味する。ヒトサイ
トメガロウィルスは、ヘルペスウィルス群に関連するか
又はこれに属するウィルスの亜群である。

いたるところに存在するが、性的に伝染されるＣＭＶの
頻度は１９８８年米国において１００万人を超えると最
近報告された。染色は通常は無症状であるが、しかし不
全な免疫系を有するヒトは胃腸の問題又は失明を生じさ
せるかもしれない。新生児は特に感受性であり、そして
ＣＭＶは流産、死産又は産後死を惹起するかも知れない
。Ｔｈｅ　ＭｅｒｃｋＭａｎｕａｌ　１４版（１９８２
）　２０５〜２０６頁はこの疾患に対する特定の療法を
与えていない。

この実験において次の方法及び材料を使用した。

ヒト包皮繊維芽細胞（ＨＦＦ）を新生児から単離し、そ
して１０％０％ウシ胎清、２ｍＭ　　Ｌ−グルタミン、
１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２０Ｉｌ１Ｍ１１ＥＰＥ
ｓ緩衝液、及び抗生物質を補充されたＢａｒｌｅ塩を含
む最少必須培地中で低継代（＜２０）で維持した。細胞
がコンフルエンシーに達した後、これらを上記の様にし
て、但し５％ウシ胎児血清を除去して維持しり。毎週の
細胞アッセイは、細菌及びマイコプラズマ感染について
陰性であった。

研究を通じてヒト−サイトメガロウィルス（ＣＭＶ。

ＡＴＣＣ＃ＶＲ−５３８，ＡＤ１６９株）のストック調
製物を使用した。これはＨＦＦを通しての第二世代から
成り、宿主細胞の７５％が細胞変性効果を受けた時に収
穫した。無細胞ストックウィルスを貯蔵チューブから取
り出し、そして−１２０℃にて維持した。

細菌及びマイコプラズマ無菌試験は陰性であった。

ＣＭＶストック調製物の感染力価をＨＦＦ細胞上で決定
し、そして４Ｘ１０’蛍光形成封入体／ｍｌ（下記）で
あった。

凍結乾燥した臨床銘柄のアンプリゲン（ミスマツチｄｓ
ＲＮＡ　　；　ｐｏｌｙ　Ｉ、　ｐｏｌｙ　Ｃ＋２１Ｕ
　；　ｔｌｅｍ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ社、ロックビル、メ
リーランド、　ｕｓＡ）を使用した。

製造者の指示に従って、アンプリゲンを再溶解し、小分
けし、そして−１２０℃に貯蔵した。各実験のため、５
０℃の水浴中で渦動しながら新鮮なアリコートを解凍し
た。次に、上記の組織培養培地中に所望の濃度で稀釈し
た。

薬物をＨＦＦ細胞と共に種々の条件下でインキエベート
した。これらの変数には、（１）アンプリゲンの濃度、
（２）ウィルス取り込みに関するアンプリゲン暴露の順
、及び（３）ＨＦＦがアンプリゲンに暴露される時間の
長さ、が含まれる。

トリバンブルー排除により決定する場合、アンプリゲン
で処理されたＨＦＦの生存性は未処理ＨＦＦのそれと同
じくすなわち、〉９９％）であった。

コンフルエントＨＦ　Ｆを１ドラム（容量３．７　ｍｌ
）シェルバイアル中円形オーバースリップ上で培養した
。シェルバイアルを０．２５ｍ１の適当な稀釈のＣＭＶ
と共にインキュベートすることによりウィルス感染を開
始した。ＨＦＦをＣＭＶに３７℃にて１時間７００Ｘｇ
で暴露してウィルスの取り込みを可能にした。バイアル
を２〜３回洗浄して細胞外ウィルスを除去した。バイア
ルに１ｍｌのｍ織培養培地を再供給しそして通常１８〜
２４時間３７℃にて７２時間インキュベートした。

ＣＭＶの複製を次の様にして定量した。１００％アセト
ン中でＨＦ　Ｆを固定することによりウィルスの複製を
停止した。付着したＨＦ′Ｆを含有するカバースリップ
をすすぎ、そして７２キロダルトン直接初３１Ｊｌ（ｉ
ｍｍｅｄｉａｔｅ　ｅａｒｌｙ）蛋白質に対して特異的
な抗−ＣＭＶマウスモノクローナル抗体（デュポン）と
共にインキュベートした。ＦＩＴＣ−ラベル化抗マウス
Ｉ、ＧＦ　（−ｂ）　ｚ　（シグマ）の添加により、結
合した抗体を検出した。エビフルオレッセント（ｅｐｉ
ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ）顕微鏡を用いて２５０倍の倍
率で観察した場合、ウィルスが感染した細胞は明るいア
ップルグリーンの核蛍光を示した。ＣＭＶが感染した細
胞（すなわち、蛍光核封入体を示すもの）の数を顕微鏡
で計数した。陽性ストック調製物を稀釈して、アンブリ
ゲンの非存在下で２４時間のインキュベーションの後カ
バースリップ当り２００〜１２００個のＣＭＶ惑染感染
を生成する様にした。

これは０．０４の多重感染度（ＭＯりにより達成された
。

２枚のカバースリップからのＣＭＶ封大体の平均数を決
定し、そしてアンプリゲンを受理しなかった陽性対照の
それと比較した。アンブリゲン又はＣＭＶに暴露されな
かった負対照を平行して評価した。アンプリゲンの抗ウ
ィルス活性を次の式に従って表現した。

ＣＭＶ封人偉人体害（％）＝ サイトメガロウィルスによるヒト包皮繊維芽細胞の感染
に対するアンプリゲン前処理の長さの効果を第３図に示
す。ヒト包皮繊維芽細胞の２枚のモルレーヤーを（１）
１０μｔｒ／ｍｌのアンプリゲンで前処理する（中空柱
）か、又は（２）１００μｇ／ｍｌで前処理する（斜線
柱）。これはＣＭＶの取り込みに先立って表に示された
間行う。ＣＭＶ感染の程度を記載されているＩＦＡ法に
よりウィルス取り込みの後２４時間にわたり決定した。

アンプリゲン処理された培養物についてのカバースリッ
プ当りＣＭＶ封人偉人体均数を薬物不合対照のそれと比
較した。この結果は、アンプリゲン前処理の長さはＣＭ
Ｖ感染の阻害の程度と直接比例することを示している。

ＨＦＦがアンプリゲンにより２４時間前処理された場合
に最大ＣＭＶ阻害が達成される。

この研究は、時間と共に上昇するＣＭＶに対する抗ウイ
ルス効果を発揮するミスマツチｄｓＲＮＡの能力及び使
用される濃度に関係なく、ミスマツチｄｓＲＮＡへのＣ
ＭＶ−感受性、並びに相対的に非毒性のｄｓＲＮＡの局
所投与によっては達成されない持続放出レベルを示す。

【図面の簡単な説明】

第１図は、例１の、患者ＡについてｄｓＲＮＡ投与の前
及び後における天然（２’−５’オリゴＡ／ＲＮアーゼ
Ｌ）抗ウイルス径路の種々の成分について患者の生物学
的流体を測定する高圧クロマトグラフィー（ＩＩＰＬＣ
）のグラフである。 第２図は、例１の患者ＢからのＩＩＰＬｃ分析の結果（
レーン４及び５）並びに標準換算（レーン６）を示すグ
ラフである。 第３図は、例４に記載するように、ｄｓＲＮＡにより処
理された細胞のサイトメガロウィルス感染に対するｄｓ
ＲＮ＾阻害の効果を未処理細胞と比較して示す。 手続補正書（方式） 昭和６３年１２月１千日 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 １、　事件の表示 昭和６３年特許願第２００２５０号 ２、発明の名称 二本鎖ＲＮＡを含んで成る非経口投与剤３、　補正をす
る者 事件との関係　　　特許出願人 名称　エイチイーエム　リサーチ。 インコーホレイティド ４、代理人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号５、
補正命令の日付 ６、補正の対象 （１）願書の「出願人の代表者」の欄 （２）委任状 （３）明細書 （４）図面（Ｆ；）・す ７、補正の内容 （１）（２）　　別紙の通り （３）明細書の浄書（内容に変更なし）（４）　　図面
の浄書（内容に変更なし）８、添附書類の目録

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、天然抗ウィルス経路を活性化しそして免疫系を防衛
   することによりヒト又は動物の局在化された体区画中の
   疾患を治療するための、二本鎖ＲＮＡを含んで成る医薬
   。 ２、前記疾患がウィルス性である、請求項１に記載の医
   薬。 ３、前記ウィルスがヘルペス科の構成員である請求項２
   に記載のｄｓＲＮＡ。 ４、前記ウィルスがサイトメガロウイルスである請求項
   ３に記載の医薬。 ５、前記ウィルスがレトロウイルス科の構成員である請
   求項２に記載の医薬。 ６、前記レトロウイルスがＨＩＶである請求項５に記載
   の医薬。 ７、前記二本鎖ＲＮＡが、５個に１個〜３０個に１個の
   ウラシル又はグアニジン塩基を含有するポリイノシン酸
   とポリシチジル酸との複合体であるミスマッチ二本鎖Ｒ
   ＮＡである請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬。 ８、前記ミスマッチＲＮＡがＩ＿ｎ＿・＿ｒ（Ｃ＿１＿
   ２＿−＿１＿４、Ｕ）＿ｎ、又は＿ｒＩ＿ｎ＿・＿ｒ（
   Ｃ＿２＿０、Ｇ）＿ｎで表わされるものである、請求項
   ７に記載の医薬。 ９、前記局在化された体区画が人体の区画流体、唾液、
   涙、漿液性滲出物、漿液性漏出液及び／又は脳脊髄流体
   である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の医薬。 １０、アルツハイマー（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ）病の治療
   のための請求項１に記載の医薬。