DE3854829T2

DE3854829T2 - Förderung von Abwehrmechanismen durch systemische Behandlung mit dsRNS

Info

Publication number: DE3854829T2
Application number: DE3854829T
Authority: DE
Inventors: William A Carter
Original assignee: HEM Pharmaceuticals Corp
Current assignee: HEM Pharmaceuticals Corp
Priority date: 1987-08-12
Filing date: 1988-08-12
Publication date: 1996-08-14
Anticipated expiration: 2008-08-13
Also published as: EP0308066B1; PT88266A; AU2053588A; NZ225799A; IL87413A0; AU1001595A; DK449888A; DK449888D0; KR890003402A; EP0308066A3; JPH01131119A; CN1032740A; IE72103B1; FI883763A; RU1834663C; ZA885967B; IE882399L; HUT47854A; CA1327002C; FI883763A0

Description

Biologische Flüssigkeiten, einschließlich Tränen, Scheidensekrete und männliche Ejakulate (Sperma-angereichert), können verschiedene Mikroorganismen (Pilze, Bakterien, Viren) enthalten, die zur Verursachung und Ausbreitung verschiedener gefürchteter Krankheiten befähigt sind. Topische oder direkte antimikrobielle Behandlungen (Schäume, Sprays, etc.) werden trotz ihrem eingeschränkten Wert aufgrund der zurückgezogenen Natur der Mikroorganismen, die sie den Behandlungen relativ nicht-zugänglich macht, oft verwendet. Topische Anwendungen können auch wegen lokaler Entzündung, die sich verursachen, sowie wegen ihrem erhöhten Potential zur Verursachung einer allergischen Reaktion eingeschränkt sein. In dieser Erfindung wird die systemische Verabreichung von nicht richtig angepaßter bzw. mismatched doppelsträniger RNS bzw. dsRNS beschrieben, was eine unerwartete Freisetzung von Wirtsabwehr-Vermittler bzw. - Mediatoren in verschiedene biologische Flüssigkeiten, einschließlich solche, die regelmäßig während dem Geschlechtsverkehr ausgetauscht werden, zur Folge hat. Demgemäß wird in der vorliegenden Erfindung eine neue Technik zur Verringerung der Infektiosität und Ausbreitung verschiedener Organismen, einschließlich solcher, die mit verschiedenen Krankheiten, einschließlich solcher, die durch Kondylome, Herpes und menschlichen Immunmangelvirus verursacht werden, verbunden sind, beschrieben.

Hintergrund der Erfindung

Neuere Erzeugnisse, die eine entscheidende Rolle bei der Bekämpfung von Infektionen und Krebs spielen können, sind die sogenannten Immunmodulatoren wie Interferone (IFN), Interleukine (IL) und Tumor-Nekrosefaktor (TNF). Sie sind proteinartige Arzneimittel, welche die natürlichen Bemühungen des Körpers zur Krankheitsbekämpfung erhöhen oder auslösen können. Jedoch können solche Protein-enthaltenden Erzeugnisse im allgemeinen nicht in flüssiger oder Tablettenform verabreicht werden, da der Magen die Proteine, bevor sie in den Blutstrom absorbiert werden können, darin zerstört. Darüberhinaus kann ihre parenterale (IV-, IM- oder subkutane) Verabreichung auch unangenehme Nebenwirkungen, insbesondere bei höheren Arzneimittelkonzentrationen oder über sehr lange Behandlungszeiträume, hervorrufen. Demgemäß ist in der Forschung versucht worden, solche Arzneimittel für topisch wirksamen Präparate zur Verwendung auf der Haut, den Augen zu entwickeln und insbesondere verschiedene venerische Krankheiten zu bekämpfen. Beispielsweise beschreiben Rapp und Wrzos (Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Bd. 28, S. 449, 1985) einen empfängnisverhütenden Schaum oder eine empfängnisverhütende Creme, in welchen ein antivirales Mittel (IFN) mit einem nichtionischen grenzflächenaktiven Detergens kombiniert wurde, deren primärer Zweck der Schutz von einem (oder beiden) Partnern während des Geschlechtsverkehrs vor einer Herpes-Virusausbreitung war. Die entsprechende Wirksamkeit solcher topisch aufgebrachter Präparate etc. ist noch nicht aufgeklärt, jedoch zeigte die frühere Verwendung von topisch aufgebrachten, antiviralen Präparate eingeschränkten Erfolg. Beschränkungen solcher Anwendungen schließen die zurückgezogene Natur (nicht empfänglich für das Präparat) von einigen Viruspartikeln sowie die reduzierte lokale immunologische Fähigkeit des infizierten Bereichs des Körpers, die eine dauerhafte therapeutische Antwort unwahrscheinlich bzw. unmöglich macht, ein.
Die Gewebe, die mit auf IFN ansprechenden Viren infiziert sind, wie virale (Herpes simplex) Infektionen der Haut, des Auges und der Schleimhaut, werden mit topischen Zusammensetzungen der Interferoninduktoren dsRNS, insbesondere poly I C, in einer Formulierung mit verzögerter Freisetzung, wie im US-Patent 4,22283,393 (Field et al.) beschrieben, behandelt. Die Patentliteratur beschreibt auch topisch aufgebrachte, antivirale Mittel, wie nichtionische grenzflächenaktive Mittel als inaktivierende Mittel für Herpes simplex, allein, wie im US- Patent 4,020,183 (Asculai et al.), oder Kombination mit Interferon, wie im US- Patent 4,507,281 (Asculai et al.).
In der vorliegenden Erfindung werden diese inhärenten Einschränkungen der bisherigen Verfahren und Materialien durch überraschende und neue Beobachtungen überwunden, wobei gezeigt wird, daß die parenterale Verabreichung von dsRNS die Freisetzung von bioaktiven dsRNS-Fragmenten verursacht, die leicht die Blut-Hirn-Schranke überwinden und in kompartimentierten Flüssigkeiten, einschließlich Speichel, Tränen, Serumflüssigkeiten, seröse Exsudate und dergleichen, eindringen. Diese krankheitsbekämpfenden Mediatoren dringen leicht in verschiedene biologische Flüssigkeiten - auch in Abwesenheit von nachweisbarer intakter dsRNS innerhalb der Flüssigkeiten selbst - ein.
Der hier verwendete Begriff "kompartimentierte Körperflüssigkeit" bezieht sich auf eine lokalisierte Körperflüssigkeit außerhalb des systemischen Blutkreislaufes. Diese kompartimentierten Körperflüssigkeiten schließen Flüssigkeiten auf serösen Oberflächen, Schleimhautoberflächen, der Synovialauskleidung, Harnröhreoberflächen, der Muttermundauskleidung, die Cerebrospinalflüssigkeit, und im Augenflüssigkeitskompartiment ein.
In der vorliegenden Erfindung wird insbesondere die physiologische Aufbereitung von Mediatoren gezeigt, die zum direkten Angriff auf Viren und zum gleichzeitigen Bereitmachen des lokalen Immunsystems, wie im urogenitalen System, befähigt sind. Durch Ausführen der Erfindung wird deutlich dargestellt, wie das männliche Ejakulat von einem potentiellen hohen Gehalt an Viren (einschließlich HIV, die Herpes-Viren und das Cytomegalovirus) wesentlich verringert oder sogar befreit werden kann, was ansonsten bei beiden Sexualpartnern verschiedene gefürchtete Krankheiten verursachen könnte. Die Erfindung betrifft auch die Herstellung von krankheitsbekämpfenden Mediatoren innerhalb von Exsudaten oder Transsudaten (arthritische Gelenke) und der Cerebrospinalflüssigkeiten.
In der am 11. März 1987 veröffentlichten europäischen Patentanmeldung 0 213 921 mit dem Titel "Modulation of Virus-Related Events by Double-Stranded RNAs" wird die Inhibierung von HIV in menschlichen Zellkulturen durch dsRNS, insbesondere unter Verwendung von Ampligen , als eine PrototypdsRNS beschrieben.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Figur 1 ist eine dreiteilige graphische Darstellung einer Hochdruckchromatographie (HPLC), wobei die biologische Flüssigkeit eines Patienten auf verschiedene Komponenten des natürlichen (2'-5'-Oligo A/RNase L) antiviralen Wegs vor und nach dsRNS-Verabreichung für Patient A von Beispiel 1 gemessen wird.
Figur 2 ist eine dreiteilige graphische Darstellung, die eine standardisierte Eichung (Lauf 6) und die Ergebnisse der HPLC-Analyse (Läufe 4 und 5) von Patient B von Beispiel 1 zeigt.
Figur 3 ist eine graphische Darstellung, welche die Wirkung der dsRNS-Inhibierung auf eine Cytomegalovirus-Infektion von mit dsRNS vorbehandelten Zellen im Vergleich mit unbehandelten Zellen, wie in Beispiel 4 beschrieben, zeigt.

Beschreibung der Erfindung

Nachstehend sind Verfahren zum Induzieren des Körpers des Patienten für die Freisetzung von krankheitsbekämpfenden Mediatoren in verschiedene kompartimentierte Körperflüssigkeiten beschrieben. Die systemische Verabreichung von mismatched dsRNS, wie nachstehend ausführlicher erläutert, verursacht die Freisetzung von bioaktiven dsRNS-Fragmenten, manchmal hier als krankheitsbekämpfende Mediatoren bezeichnet, in diese biologischen Flüssigkeiten, auch in Abwesenheit von nachweisbarer intakter dsRNS innerhalb dieser Flüssigkeiten. Diese bioaktiven dsRNS-Fragmente durchqueren leicht die Blut-Hirn-Schranke und andere Körperkompartimente, die von dem allgemeinen Blutkreislauf durch Gewebe getrennt sind und in den gewünschten Geweben lokalisiert sind.
Diagnostische Testverfahren zum Messen inaktiver Wirt/Patientenabwehrmediatoren in biologischen Flüssigkeiten und, wenn unzureichend, die Verabreichung einer dsRNS in einer Menge und über einen Zeitraum, die zur Verringerung der Menge des pathogenen Mittels oder Mittel und/oder zur Verringerung der Krankheitsprozesse und zum Wiederherstellen der erforderlichen dsRNS für bioaktive Fragmente davon werden auch beschrieben, um dadurch die biochemischen Parameter der Abwehrmediatoren in der zu untersuchenden Flüssigkeit zu verbessern.
Die durch das erfindungsgemäße Verfahren diagnostizierte und/oder behandelte Krankheit ist viraler Natur, z.B. ein Virus der Herpes-Famihe, einschließlich des Cytomegalovirus, oder ein Virus der Retrovirusfamilie, einschließlich HIV.
Es gibt einen großen Bereich von pathogenen Mitteln, die möglicherweise in biologischen Flüssigkeiten außerhalb des Blutstroms abgesondert werden. Diese kompartimentierten biologischen Flüssigkeiten (außer Blut) sind gewöhnlich nicht für systemisch verabreichte Arzneimittelmakromoleküle (Proteine, Nukleinsäuren, etc.) zugänglich. Wie hier verwendet und in der Medizin verstanden, bedeutet parenteral verabreicht das direkte Zuführen ins Blut über eine IV-Infusion, etc. oder das Einführen in ein Kompartiment, das dem Blutstrom leicht zugänglich ist, wie ein Arzneimittelmakromolekül, das über eine anfängliche intramuskuläre oder subkutane Zuführung (Injektion) zugeleitet wird. Solche Makromoleküle mit einem hohen Molekulargewicht können auch oral zugeführt werden, wenn sie geeigneterweise eingekapselt, darmlöslich oder geschützt sind oder anderweitig relativ unüberwindlich gegenüber zerstörenden Kräften, wie pH-Wert und Enzyme, die ihnen im oberen Gastrointestinaltrakt begegnen, hergestellt sind. Alle solche Zuführungsarten würden einen mehr oder weniger nachweisbaren Gehalt an von Makromolekülen im Blutstrom, möglicherweise, aber nicht notwendigerweise, in anderen biologischen Flüssigkeiten (serös) geben - zumindest sicherlich nicht in einer hochbioaktiven Form oder Konfiguration.
Die Unfähigkeit, solch entfernt liegende kompartimentierte Flüssigkeiten zu erreichen, ist zum großen Teil auf den physikalischen Schranken (Membranen, Zellen, etc.) begründet, die zum Schutz verschiedener Körperkompartimente (G- U-Trakt, Gelenke, Mundhöhle, CNSV etc.) vor der leichten Durchquerung von pathogenen Mitteln von einem Kompartiment des Körpers zu einem anderen (d.h. pathogene Ausbreitung) dienen. Während somit solche physikalischen Schranken einen ersichtlichen Wert für den Menschen hinsichtlich der Lokalisierung von Krankheiten und der Verringerung der Ausbreitung von Mikroorganismen einschließlich Viren aufweisen, dienen solche Schranken auch als signifikantes Hindernis für die leichte Verteilung solcher krankheitsbekämpfenden Substanzen wie Immunmodulatoren, die dazu neigen, (a) makromolekular (obwohl nicht immer) zu sein, und (b) nicht leicht solche "Schranken" einschließlich Zell/Membrangradienten durchdringen zu können. Demgemäß haben verschiedene Forscher nach Wegen gesucht, um solche Immunmodulatoren/antivirale Mittel/Antikrebsverbindungen direkt in lokalisierte Körperkompartimente über physiologisch verträgliche Träger wie Tampons, Kondome und dergleichen einzuführen. Bisher haben solche Anwendungen nur einen beschränkten Erfolg.
Eine überraschende Breite von pathogenen Mikroorganismen werden auch in solche serösen Kompartimente als Tor des anfänglichen Eintritts in den menschlichen Körper abgesondert. Eine venerische (Geschlechtsverkehr-)bezogene Art der Übertragung ist offensichtlich besonders alarmierend hinsichtlich Chlamydia (begleitet von Entzündungskrankheiten des Beckens und von Unfruchtbarkeit) und verschiedenen Viren. Beispielsweise werden genitale und orale Herpes, Cytomegalovirus, genitale Warzen und Retroviren (insbesondere HIV) mit alarmierenden Raten verbreitet, und es gibt bisher keinen Beweis, der anzeigt, daß Ansätze wie auf Interferon basierende topische Präparate oder Interferon-induzierende topische Präparate, etc., definitive Behandlungen oder prophylaktische Methoden sein werden.
Eine Aufgabe dieser Erfindung ist demnach, eine Behandlungsart bereitzustellen, die wirksam krankheitsbekämpfende Mediatoren in einer Vielzahl von serösen Flüssigkeiten in großem Umfang über den Körper des Patienten verteilt, erzeugt; die Behandlung kann allein oder in Verbindung mit topischen Behandlungen verwendet werden. Ein zusätzlicher Wert der vorliegenden Erfindung ist, daß sie zusammen mit herkömmlichen Methoden wie Interferon-imprägnierte Tampons, etc. ausgeführt werden kann, wenn weitere Stufen des äußerlichen Schutzes gegen Interferon-empfindliche Krankheiten gewünscht sind.
Eine bisher unentdeckte, biochemische Anomalie wurde beobachtet, in welcher ein Schlüsselenzym (RNase L), das mit Körperabwehrmechanismen gegen sowohl Krebs als auch virale Krankheiten verbunden ist, in einer beschleunigten und scheinbar unkontrollierten Weise arbeitet. Diese und andere Beobachtungen sind in der anhängigen europäischen Patentanmeldung EP-A-0299745 (88 306 419.8) mit dem Titel "Double-stranded RNA Correction of Abberrant Metabolic Pathways Associated With Uncontrolled Tumor Cell in Virus Growth Cycles" beschrieben. In getrennten Experimenten davon wurden die entsprechenden Fähigkeiten dieser zwei unterschiedlichen Zellen mit abnormaler RNase L und solche mit normalen Mengen an Rnase L verglichen, um der viralen Herausforderung standzuhalten. Es wurde beobachtet, daß die Titer (Ausbeute) der Nachkommenschaft der Retroviren in solchen Zellen mit abnormaler Rnase L- Aktivität, was sehr schnell NCP hervorruft, signifikant höher sind.
Doppelsträngige RNS, insbesondere mismatched dsRNS, stellt den Normalzustand der RNase L-Kinetik und die Abbauprodukte, wie in der vorstehend aufgeführten EP-A-0 299 745 beschrieben, wieder her. Ferner kann die Wiederherstellungsrate des Normalzustands durch doppelsträngige RNS durch vorherige Exposition mit Lymphokinen beschleunigt werden.
Doppelsträngige RNS (dsRNS) sind doppelsträngige synthetische Polynukleotidkomplexe. "Mismatched bzw. nicht richtig angepaßte dsRNS" bedeutet eine solche, in welcher die Wasserstoffbindung (Basenpaarung) zwischen den gegenüberliegenden Strängen relativ intakt ist, d.h. von durchschnittlich weniger als ein Basenpaar in jeden 29 nachfolgenden Basenresten unterbrochen ist. Mismatching bzw. nicht richtige Anpassung ist eine Unterbrechung der normalen Geometrie der RNS-Doppelhelix, Einbauschen (oder Ausbauschen) der Stränge, was die Stellen der Anfälligkeit der dsRNS gegen Abbau durch Ribonukleasen darstellt. Der Begriff "mismatched bzw. nicht richtig angepaßte dsRNS" sollte demgemäß verstanden werden.
Die dsRNS kann ein Komplex aus Polyinosinat und einem Polycytidylat sein, der einen Anteil von Uracilbasen oder Guanidinbasen, z.B. von 1 in 5 bis 1 in 30 solcher Basen (poly I C&sub4;&submin;&sub2;&sub9;x > U oder G) enthält.
Die dsRNS kann die allgemeine Formel rIn (C&sub1;&sub1;&submin;&sub1;&sub4;,U)n oder rIn (C&sub1;&sub2;U)n aufweisen. Der Wert für n ist von 4 bis 29. Andere geeignete Beispiele von dsRNS sind nachstehend erörtert.
Die mismatched dsRNSn, die bevorzugt in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, basieren auf Copolynukleotiden, ausgewählt aus Poly(Cn,G), worin n eine Zahl mit einem Wert von 4 bis 29 ist, und sind mismatched Analoga der Komplexe aus Polyriboinosin- und Polyribocytydilsäuren, die durch Modifizieren von rI&sub0; rCn zum Einbau von ungepaarten Basen (Uracil oder Guanidin) entlang des Polyribocytidylat (rCn)-Strangs gebildet werden. In einer anderen Ausführungsform kann die dsRNS von poly (I) poly (C) dsRNS durch Modifizieren des Ribosylrückgrats der Polyriboinosinsäure (rIn), z.B. durch Beinhalten von 2'-O- Methylribosylresten, hergeleitet werden. Diese mismatched Analoga von rIn rCn, deren bevorzugte die allgemeine Formel rIn r(C&sub1;&sub1;&submin;&sub1;&sub4;,U)n und rIn r(C&sub2;&sub9;,G)n aufweisen, sind von Carter und Ts'o in den US-Patenten 4,130,641 und 4,024,222 beschrieben. Die darin beschriebenen dsRNSn sind im allgemeinen zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet.
In der bevorzugten mismatched dsRNS, rIn (C&sub1;&sub2;,U)n, dient ein Bereich, der aus einen ununterbrochenen Strang von 6 bis 12 Basenpaaren besteht, z.B. eine halbe bis eine vollständige Umdrehung einer RNS-Helix, sowohl als Biotrigger bzw. -Auslöser, der die Freisetzung von Lymphokinen verursacht, als auch als obligatorischer intrazellulärer Co-Faktor für Enzyme, die den natürlichen Antivirusweg umfassen. Die nicht angepaßten, aus Uracilresten bestehenden Bereiche sind periodisch in den Polypyrimidinstrang eingefügt, um die dsRNS-Hydrolyse zu beschleunigen und somit eine Toxizität zu verhindern.
Andere Beispiele von mismatched dsRNS zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung beinhalten:
poly (I) poly (C&sub4;,U)
poly (I) poly (C&sub7;,U)
poly (I) poly (C&sub1;&sub3;,U)
poly (I) poly (C&sub2;&sub2;,U)
poly (I) poly (C&sub2;&sub0;,G)
poly (I) poly (C&sub2;&sub9;,G) und
poly (I) poly (Cp) 23 G> p
Wie hier erläutert, werden Lymphokine derart verstanden, daß sie Interferone, vorzugsweise Interferon alpha, die Interleukine, insbesondere Interleukin-2 (IL-2) und rekombinantes Interleukin-2- (rIL-2), und Tumor-Nekrosefaktor (TNF) einschließen. Ferner sind Lymphokin-aktivierte Killer (LAK)-Zelien, die in Tieren als Antwort auf eine Lymphokinexposition gebildet werden, eingeschlossen.
Die gewöhnlich verabreichten Mengen an dsRNS liegen im Bereich von 0,1 bis 1.000 Mikrogramm dsRNS pro Milliliter Körperflüssigkeit des Patienten. Der Begriff "Körperflüssigkeit" soll sich auf die Lösung von Serum, Salzen, Vitaminen, etc., beziehen, die innerhalb des Organismus zirkuliert und die Gewebe umspült. Das Körperflüssigkeitsvolumen des Patienten wird nach erhältlichen medizinischen Tabellen bestimmt, die das Gewicht des Patienten zu seinem Körperflüssigkeitsvolumen in Beziehung bringt, was das gesamte Körperflüssigkeitsvolumen des Patienten und das Körperflüssigkeitsvolumen, das für das Gleichgewicht mit der erforderlichen Menge an dsRNS verfügbar ist, darstellt. Als Beispiel wird ein 60 oder 70 kg Patient ein Körperflüssigkeitsvolumen von ungefähr 5 bis 6 Litern aufweisen.

BEISPIEL 1

Mismatched dsRNS [AMPLIGEN (HEM Research, Inc., Rockville, MD) der Formel rIn r(C&sub1;&sub2;,U)n)] wurde in Mengen zwischen 20 und 1000 g wöchentlich einer Gruppe von Individuen mit einem Gewicht zwischen 40 und 70 kg (IV) ver abreicht und ihre serösen Flüssigkeiten, insbesondere Vaginalflüssigkeiten und männliche Ejakulate, wurden auf das mögliche Vorhandensein von dsRNS- induzierten Wirtsabwehrmediatoren ausgewertet. In begleitenden klinischen Tests wurden entsprechende Parameter in Individuen, die mit entweder Interferonen oder Interleukinen infundiert wurden, untersucht, um die Spezifität, wenn vorhanden, der Verfahren zu bestimmen. Unter dem Lichtmikroskop enthielt die von behandelten Patienten isolierte Flüssigkeit eine Vielzahl von Zellen einschließlich mononuklärer Zellen, Plattenepithele (weibliche Genitalproben) und Spermatozyten (männliches Ejakulat) sowie fast amorphe Zelltrümmer.
Eine Zusammenfassung der Beobachtungen der Behandlung von drei solcher Patienten mit der dsRNS über verschiedene Zeiträume ist in der folgenden Tabelle dargestellt: Tabelle 1 Wirkung der systemischen dsRNS-Behandlung, basierend auf wiedergewinnbarem Virus in kompartimentierter(n) Flüssigkeit(en) Patient Dauer Exogene dsRNS (erhaltene Menge in g) Virusbelastung durch Co-Züchtung Patient (Mann mit HTLV-III Infektion) Patient C (Frau mit chron. Herpes simplex [HS]Typ 2 Infektion Vorbehandlung Wochen Virus-Titer (PFU)
Die Patienten A und B zeigten hohe Titer von wiedergewinnbarem HTLV-III aus Ejakulat, wenn 2,0 bis 4,0 cm³ Ejakulat durch Co-Züchtung unter Wendung einer Technik, die vor kurzem für periphere mononukleare Blutzellen beschrieben worden ist (Carter et al., Cancet, Bd. 1, 6. Juni 1987, S. 1287), gemessen wurden. Kurz erläutert wurden mononukleare Blutzellen aus einem normalen Spender, der mit PHA für 2-4 Tage stimuliert worden war, präpariert und weiter für 28 Tage gezüchtet und danach wurde das extrazelluläre Virus durch einen Enzym-gebundenen Immunosorbent-Test (ELISA) gemessen. Der Co-Züchtungstiter wurde als die durchschnittliche optische Dichte (OD bei 490 nm) des ELISA- Tests nach Subtraktion eines negativen Kontrollwerts (weniger als 0,1) definiert. Patient C zeigte eine chronische HS-Expression in Vaginalsekreten, verbunden mit perianaler Vesikelbildung. Herpes simplex wurde nach der Methode von Rapp unter Verwendung zusammenfließender bzw. cofluenter HEL-Zellen, die in 35 mm Platten vermehrt wurden, gezüchtet (Rapp et al., Antimicrob. Agents & Chemoth., Bd. 28, S.449, 1985).
Die beigefügten Figuren 1 und 2 zeigen das Ergebnis der HLPC-Auswertung der Patienten-Flüssigkeitsproben vor und nach der systemischen Verabreichung von dsRNS rIn r(C&sub1;&sub2;,U)n alleine und in Kombination mit Lymphokinen. In Figur 1 wurden alle Proben durch TCA- und Acetonpräzipitation hergestellt und waren die Proben in den Spalten 4 und 5 von Figur 2; Figur 2, Spalte 6 wurde zur Etablierung einer standardisierten Eichkurve, wie nachstehend erläutert, verwendet. Die Figuren sind wie folgt angeordnet: Figur 1, Spalte 3 ist Patient A vor der Behandlung; Spalte 2 nach 4 Wochen Behandlung und Spalte 1 nach 12 Wochen Behandlung; Figur 2, Spalte 5 ist Patient B vor der Behandlung und Spalte 4 während der Behandlung, Spalte 6 ist eine Standardkurve. Figuren 1 und 2 sind mit vorstehender Tabelle 1 zu vergleichen.
Die Auswertung der Patientenproben mit Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) nach der systemischen Verabreichung von dsRNS zeigt eine Erhöhung der Wirtsabwehrmediatoren. Die Vaginal (Nr.3)- und Ejakulat (Nr. 1 und 2)- Flüssigkeiten der Patienten wurden hinsichtlich verschiedener Komponenten des natürlichen (2'-5' oligo A/RNase L)-Antiviruswegs ausgewertet, wie vor kurzem für periphere mononukleare Blutzellen beschrieben (Carter et al., Lancet, s.o.; Cariko et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., Bd. 128, S. 695, 1985, und Suhadolnik et al., Biochemistry, Bs. 22, S.4153, 1983). Die Ergebnisse sind in Figuren 1A, 1B und 1C graphisch dargestellt. Es wurde eine gerade noch nachweisbare Aktivität von allen Systemkomponenten vor der dsRNS-Verabreichung festgestellt. Während der systemischen Verabreichung von dsRNS wurde jedoch eine spezifische Anreicherung der Mediatoren in diesen serösen Flüssigkeiten, wie in Figuren 1 und 2 gezeigt, beobachtet, was kinetisch mit der Verringerung der viralen Expression in diesen gleichen Stellen (Tabelle 1) und mit der vollständigen Abwesenheit von nachweisbarer makromolekularer dsRNS gekoppelt war. Diese Werte wurden durch Schnellblotten und Flüssigszintillationsspektrophotometrie gemessen, was bereits beschrieben ist (Brodsky et al, J. Biol. Response Modifiers, Bd. 4, S.669, 1985).
Zur Auswertung der Spezifität des Verfahrens wurden entsprechende Individuen (oder Tiere), die mit hohen Dosen (< 10 mol IRU (d)) von verschiedenen Interferonen und Interleukinen behandelt wurden, aber keine Erhöhung der krankheitsbekämpfenden Mediatoren in diesen kompartimentierten Flüssigkeiten zeigten, untersucht. Wenn jedoch systemisch injizierte Lymphokine mit mismatched dsRNS kombiniert wurden, war die Nachweisrate der Mediatoren in diesen kompartimentierten Flüssigkeiten merklich erhöht. HPLC kombiniert mit Radiobindungs-, Radioimmun- und rRNS-Spaltungstests bestätigte die spezifische Ausführung des neuen 2'-5'-Oligoadenylats als Ergebnis der dsRNS, die anderswo im Körper und in ausreichender Menge zur Erzeugung eines Krankheitsschutzes aufgebracht wurde, wobei das letztere deutlich durch die Ergebnisse von Tabelle 1 dargestellt ist.
Die HPLC-Identifikation (siehe Lee und Suhadolnik, Biochemistry, Bd. 24, S. 551, 1985) wurde nach der Probenpräparation durch TCA- und Aceton-Präzipitation ausgeführt. Eine analytische Waters C&sub1;&sub8;-Micron Bondapak-Säule wurde unter Entwicklung eines Methanol- und Wassergradienten in einem Ammoniumphosphat (50 mM)-Puffer, pH 7,0, verwendet. Der als #6 (Figur 2) bezeichnete HPLC-Lauf zeigt eine Standard-Eichung mit authentischen p&sub3;A&sub3; und p&sub3;A&sub4;, die enzymatisch synthetisiert worden sind (Layley et al., Europ. J. Biochem., Bd. 143, S. 165, 1984 und darin zitierte Literaturstellen). Die entscheidenden Isolate sind die HPLC-Signale, die entweder zwischen 6,8 und 7,0 Minuten oder bei ungefähr 12 Minuten in dieser besonderen HPLC-Konfiguration erscheinen, da diese Signale auf die bioaktivsten Mediatoren hinweisen, nämlich solche, die den authentischen p&sub3;A&sub3; und p&sub3;A&sub4;, die das Trimer bzw. Tetramer der 2'-5'-verknüpften Oligoadenylat-Mediatoren sind, entsprechen. Es wird angemerkt, daß Patient A von Tabelle 1 [dessen Samenejakulat vor der Behandlung (Spalte 3, Figur 1) und nach der Behandlung (Spalte 2 bei 4 Wochen und Spalte 1 nach 12 Wochen) analysiert ist] eine progressive Erhöhung von sowohl bioaktiven 2'-5' A- Gehalt unter Verwendung des Standard-RNase L-Spalttests und von zusätzlichem Gehalt an strukturell authentischen 2'-5' A-Molekülen, wie durch HPLC bestimmt, zeigt. Ergebnisse, ähnlich zu Patient A, waren bei Patient B ersichtlich (Ergebnisse nicht gezeigt). Figur 2 zeigt die Ergebnisse, die mit den Vaginalsekreten von Patient C vor (mit 5 bezeichnete Spalte) und während (mit 4 bezeichnet Spalte, Figur 2) der systemischen dsRNS-Therapie erhalten wurden. Durch Vergleich der Tabelle 1 mit Figur 2 wird bei Patient C angemerkt, daß der Gehalt an infektiösem Herpes-Virus drastisch abfällt, wenn sich der Gehalt an Mediatoren, die sowohl als Bioaktivität als auch als authentische chemische Strukturen gemessen wurden, erhöhte.
Während kein Festhalten an irgendeine bestimmte Theorie oder Funktionsweise gewünscht ist, scheint der Mechanismus, durch welchen diese Wirkungen in lokalisierten Körperkompartimenten erzielt wird, mindestens teilweise ein Signalübertragungsverfahren zu umfassen, wodurch dsRNS auf Zellen, welche die Blutgefäßwandungen umgeben oder diesen nahe sind, wirken, und dieses Verfahren verursacht einen wellenähnlichen Vorgang, der die Mediator-Bildung innerhalb des lokalisierten Kompartiments selbst auslöst.

BEISPIEL 2

Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß die einzigartige Struktur der mismatched dsRNS der am meisten bevorzugte modus operandi zur Ausführung der vorliegenden Erfindung ist. Dies ist auf der Tatsache begründet, daß Mismatching von dsRNS zerbrechliche Bereiche innerhalb des ansonsten relativ stabilen dsRNS-Komplexes zur Folge hat: als Ergebnis können kleine bioaktive Fragmente der dsRNS, die mobiler sind, Zugang zu bestimmten Körperkompartimenten erreichen, in welchen sie eine lokalisierte, hochspezifische, immunmodulierende und antivirale Wirkung erzeugen. Das Erreichen eines Zugang zu ansonsten abgesonderten Kompartimenten ist keine Eigenschaft von meist exogen aufgebrachten dsRNSn.
Unter anderen Experimenten, die zur Demonstration dieses Phänomens verwendet werden, wurden in vivo-Bedingungen des biologischen Abbaus durch Exposition von Aliquots von perfekt basengepaarter dsRNS (poly I poly C) einer S&sub1;-Nuklease (ein abbauendes Enzym für dsRNS) simuliert mit Eergebnissen von Aliquots von mismatched dsRNS (poly I poly C&sub1;&sub2;,U) verglichen. Die Profile der zwei Abbaukurven sind völlig unterschiedlich und dieser Unterschied ist wahrscheinlich auf den äußerst unterschiedlichen therapeutischen Eigenschaften begründet. Die poly I poly C-Abbaukurve war monospezifisch und führt einfach zu kleinem, nicht-bioaktivem Restnukleinsäurematerial. Im Gegensatz dazu war die Abbaukurve von mismatched dsRNS zweiphasig: In der ersten Phase, Phase 1, der Abbaukurve wurden kleinere, bioaktive Fragmente gebildet; das zugegebene Elternmolekül war ungefähr 1.000 Basenpaare lang, entsprechend einem Sedimentations (analytische Ultrazentrifugation) -wert (S20,w) von etwa 11,0 - 15,0 S, die Tochterprodukte (Teilhydrolyse) waren nur 50 - 100 Basenpaare lang. Überraschenderweise wurde festgestellt, daß sie noch eine hohe Bioaktivität als intrazelluläre Katalysatoren von Teilen des entscheidenden, natürlichen 2'-5'A Abwehrwegs beim Menschen zeigten. Diese Fragmente waren nicht nachweisbar vorhanden, wenn Proben aus den Gefäßen von poly I C genommen wurden, das vergleichbaren Mengen an dsRNS-abbauenden Enzymen wie S&sub1;-Nuklease unter ähnlichen Bedingungen ausgesetzt worden ist.
In Phase 2 der mismatched dsRNS-Abbaukurve wurden Fragmente der dsRNS mit weniger als 50 Basenpaare wiedergewonnen. Diese letzeren Fragmente werden als "Nuklease-resistenter Kern" bezeichnet und es war nicht möglich, solche Restfragmente von solchen, die mit poly I poly C erzeugt wurden, zu unterscheiden. Demgemäß wurde gefolgert, daß während des biologischen Abbaus von bestimmten Konfigurationen der dsRNS (nämlich mismatched dsRNS) diese besonderen Klassen von Biofragmenten von dsRNS erzeugt werden, und daß solche Fragmente spezielle und unerwartete Eigenschaften, wie die Fähigkeit, wirksam in spezielle Körperflüssigkeiten (Kompartimente) außerhalb des systemischen Kreislaufes oder der Blutzufuhr einzudringen, vermitteln. Diese Kompartimente umfassen verschiedene seröse und/oder muköse Oberflächen, wie die Synovialauskleidung, Harnröhrenoberfläche, Muttermundauskleidung sowie cerebralspinale und Augenflüssigkeitskompartimente, aber sind nicht darauf beschränkt.

BEISPIEL 3

Danach wurden Experimente in vitrolin vivo durchgeführt, um die Annahme zu bestätigen, daß die neuen Molekülarten der dsRNS, die während des biologischen Abbauprozesses erzeugt werden, zum unerwartet hohen Gehalt an Mediatoren des natürlichen Abwehrsystems (z.B. 2'-5' A-System) in verschiedenen biologischen (Körper-) Flüssigkeiten beitragen.

A. Nukleaseabbau von poly I poly C gegen mismatched dsRNS

Die Anfälligkeit von doppelsträngiger RNS (dsRNS) für Hydrolyse durch Nukleasen wurde unter Verwendung radioaktiver poly I poly C und mismatched dsRNS untersucht. [8-¹&sup4;C]-Polyinosinsäure (spez. Akt. 3,6 µCi/µMol) wurde von P-L Brochemicals bezogen. Dieses markierte poly I war > 1000 Basen lang. Das [8-¹&sup4;C]-poly I wurde mit unmarkiertem poly I poly C oder mismatched dsRNS vermischt und die Gemische wurden unter Hitze denaturiert und zum Erhalt radioaktiver dsRNS wieder abgekühlt.
In den anfänglichen Untersuchungen wurde der Abbau durch S&sub1;-Nuklease (E.C.3.1.30.1) gemessen. S&sub1;-Nuklease baut einzelsträngige Nukleinsäuren ab, wobei doppelsträngige Bereiche intakt gelassen werden. Der Abbau von poly I poly C durch S&sub1;-Nuklease ergab einphasige Kinetiken mit einer Rate von 1,4% dsRNS TCA-löslich gehalten pro Minute. Nach der Hitzedenaturierung erhöhte sich die Hydrolyserate auf 1,8% pro Minute.
Ähnliche Experimente unter Verwendung von markierter mismatched dsRNS zeigten, daß die Kinetiken des Abbaus zweiphasig waren. Native mismatched dsRNS zeigte einen anfänglichen schnellen Abbauanteil (3,2% pro Minute) und anschließend einen viel langsameren Abbauanteil (0,5% pro Lauf). Denaturierte mismatched dsRNS zeigte einen relativ schnellen Abbau (4,5% pro Minute).
Der Gesamtabbau für native poly I poly C und mismatched dsRNS über einen 45-minütigen Zeitraum dieser Experimente war ähnlich. Wie zuvor beschrieben (Carter et al., J.Mol. Biol., 70: 567, 1972) war die Hydrolyserate von mismatched dsRNS anfänglich größer als die für poly I poly C. Jedoch zeichnet die zweiphasige Kinetik des mismatched dsRNS-Abbaus einen offensichtlichen physikalischen Unterschied zwischen diesem Material und genau passenden (vollständig basengepaarten) poly I poly C-Molekülen. Diese Ergebnisse legen einen signifikanten Unterschied in der Sekundär- oder Tertiärstruktur nahe, was Unterschiede bezüglich der Nukleaseanfälligkeit zwischen diesen dsRNS und unerwartete biologische Ergebnisse liefert, wobei diese Ergebnisse in der vorliegenden Erfindung beschrieben werden. Zusätzlich zeigt die signifikante 6- fache Abnahme bezüglich der Hydrolyserate zwischen dem zweiphasigen Anteil von bestimmter dsRNS und der relativ geringen Hydrolyse des langsamen Anteils die Existenz eines relativ Nuklease-resistenten Kerns in dieser Klasse von dsRNS an, was bei poly I poly C nicht ersichtlich ist.
Der Nukleaseabbau von mismatched dsRNS wurde auch unter Verwendung eines Standard-Gewebekulturmediums (RPMI 1640), versetzt mit 10% Hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum oder menschlichem Serum, ausgeführt. Dieses Serum ist eine Quelle für Ribonukleasen. Der Abbau von mismatched dsRNS mit dem Medium war schnell, mit ungefähr 40% dieser dsRNS, die innerhalb 3 Minuten TCA-löslich gehalten wurde. Ein weiterer Abbau für bis zu zwei Stunden zeigte keinen signifikanten Anteil eines zusätzlichen Abbaus. Eine serielle Verdünnung der Medien und eine anschließende 3-minütige Inkubation in Gegenwart von mismatched dsRNS zeigte wieder einen ungefähr 50%igen Abbau bei einer 1/16-Verdünnung, was durch konzentrierteres Serum nicht weiter erhöht wurde. Da die Menge an TCA-präzipitierbarem Material relativ konstant über lange Zeiträume und einem signifikanten Bereich von Verdünnungen bleibt, basiert die verlängerte Stabilität des TCA-präzipitierbaren Materials wahrscheinlich nicht auf dem bevorzugten Abbau des TCA-löslichen Materials. Diese Ergebnisse legen wieder das Vorhandensein eines Nuklease-resistenten Kerns innerhalb des mismatched dsRNS-Moleküls nahe.

B. Molekulargewicht des Nuklease-resistenten Kerns der mismatched dsRNS

Das Molekulargewicht wurde durch Bestimmung der Sedimentationskoeffizienten untersucht. Unbehandelte dsRNS-Proben wurden in einer Beckman Model E Ultrazentrifuge bei 48.000 UPM, 20ºC, zentrifugiert. Fünf Punkte bei 8 Minuten- Intervallen wurden zur Berechnung der Sedimentationskoeffizienten verwendet. Die dsRNS-Proben wurden bis zu einem OD&sub2;&sub6;&sub0; von 0,63 in Puffer A (0,15 M NACl, 0,01 M Natriumphosphat, 0,001 M MgCl&sub2;, pH 7,2) verdünnt. Die S&sub1;- Nuklease-behandelten dsRNS-Proben wurden bei 52.000 UPM, 20ºC, in Puffer A bei einem 0D&sub2;&sub6;&sub0; von 0,65 zentrifugiert. Die Sedimentationskoeffizienten wurden durch die halbhohe und Zweit-Moment-Methoden (engl. "half-height and second moment methods") berechnet.
Die durch halbhohe und Zweit-Moment-Methoden bestimmten Sedimentationskoeffizienten der dsRNS waren 12,74 bzw. 13,29. Nach der Hydrolyse mit S&sub1;- Nuklease erniedrigten sich die durch die Halbhoch-Methode bestimmten Sedimentationskoeffizienten der dsRNS auf 6,18 und die durch die Zweit-Moment- Methode bestimmten auf 7,21. Diese Daten zeigen, daß die Behandlung mit S&sub1;- Nuklease die mismatched doppelsträngige RNS zu Fragmenten mit niedrigem Molekulargewicht abbaut.

C. Biologische Aktivität des Nuklease-resistenten Kerns der dsRNS

Die biologische Aktivität der S&sub1;-Nuklease-abgebauten dsRNS wurde in einem Standardgewebekulturtumorwachstumsinhibierungstest untersucht. Die dsRNS wurde mit S&sub1;-Nuklease für bis zu 120 Minuten inkubiert und danach zum Inhibieren des Wachstums der menschlichen Fibrosarcom-Zellinie HT1080 C14 verwendet. Der prozentuale Anteil von unbehandeltem Kontrollzellwachstum wurde nach 75-stündiger Behandlung mit 50 µg/ml S&sub1;-Nuklease-abgebauter mismatched dsRNS beobachtet. Unbehandelte dsRNS inhibierte das Zellwachstum ungefähr 50%ig. Eine ähnliche Inhibierung wurde mit der S&sub1;-Nuklease-behandelten mismatched dsRNS ohne Rücksicht auf das Ausmaß der S&sub1;-Nukleasebehandlung beobachtet. Die mit der S&sub1;-Nukleasebehandlung kombinierte Hitzedenaturierung hob die antiproliferative Wirkung der mismatched dsRNS auf.
Diese Ergebnisse zeigen, daß die antiproliferative Aktivität von mismatched dsRNS auch nach einer längeren Nukleasebehandlung aufrechterhalten wird. Da der Nuklease-resistente Kern scheinbar innerhalb der ersten 15-20 Minuten des Abbaus in diesem System erzeugt wird, legt die Wachstumsinhibierung zu späteren Zeitpunkten nahe, daß die antiproliferative Aktivität der dsRNS dem Nuklease-resistenten Kern innewohnt, und dieser selbst für die überraschend hohen Ausbeuten an biologisch aktiven Mediatoren in verschiedenen Körperkompartimenten verantwortlich sein kann.
Um die biologische Aktivität des Nuklease-resistenten Kerns weiter zu untersuchen, wurde dsRNS für 60 Minuten mit S&sub1;-Nuklease abgebaut. Ein Aliquot dieses Materials wurde danach mit Ethanol präzipitiert, um möglicherweise kleine Abbauprodukte zu entfernen, die durch dieses Verfahren nicht präzipitieren. Als Maß für die biologische Aktivität wurde die menschliche Glimoa-Zellinie A1235 mit 200 µg/ml nativer dsRNS, S&sub1;-Nuklease-abgebautes Ampligen und Ethanolpräzipitierter abgebauter dsRNS behandelt. Nach 72-stündiger Züchtung wurden die A1235-Zellen zu 99,8% durch Ampligen, zu 78,4% durch das S&sub1;-Nukleasebehandelte Ampligen und zu 84,4% durch das Ethanol-präzipitierte, S&sub1;-Nukleasebehandelte Ampligen inhibiert. Somit wurde die antiproliferative Aktivität der dsRNS durch diese unterschiedlichen Behandlungen aufrechterhalten.
Die Fähigkeit dieser Präparate zur Induktion der 2-5A Synthetase ([ATP:(2',5'- Oligo(A)adenylyl-Transferase (EC2.7.7.19)) in diesen A1235-Zellen wurde auch gemessen. Die Zellpellets wurden mit PBS gewaschen, in 5 ml Lysierungspuffer (20 mM Tri, Ph 7,5, 0,1 mM EDTA, 0,25 M Saccharose, 50 mM KCl, 2 mM MGCl&sub2; und 1 mM DTT) resuspendiert und für 5 Minuten auf Eis gehalten. Nach zweimaligem Waschen mit PBS wurden die Zellpellets in 0,1 ml Puffer B (20 mM HEPES, pH 7,5, 5 mM MgCl&sub2;, 120 mM DTT und 10% Glyzerin), der 0,5% Nonidet-P&sub4;&sub0; enthält, resuspendiert und 10 Minuten zur Lyse der Zellen auf Eis gehalten. Die Zytoplasmaextrakte wurden durch Zentrifugation für 6 Minuten bei 8000 g erhalten und in 50 µL Aliquots bei -70ºC gelagert.
2-5A-Synthetase wurde wie beschrieben untersucht (Suhadolnik et al., Biochemistry 22: 4153, 1983). Aufgetaute Zellextrakte (äquivalent zu 25 µg Protein) wurden mit 30 µL gepackter poly(rI) poly(rC)-Agarose vermischt und bei 25ºC für 20 Minuten inkubiert. Ungebundenes Protein wurde durch zweimaliges Waschen mit 0,4 mL Puffer B entfernt. Die enzymatische Synthese von 2'-5'- Oligoadenylaten (2-5A) wurde durch Zugabe von 10µL Puffer B, der 2,5 mM [&supmin;³²P)ATP (0,12 Ci/mMol), 2,5 mM DTT, 3 Einheiten/mL Kreatinphosphokinase und 10 mM Creatinphosphat enthält, initiiert. Nach 20-stündiger Inkubation bei 30ºC wurde die Agarose durch Zentrifugation (3 Minuten, 800 g, 25ºC) pelletiert. Das Gemisch von 2-5A im Überstand wurde durch DEAE-Cellulose-Säulenchromatographie, wie bei Doetsch et al. (Nature, 291: 355, 1981) beschrieben, analysiert. Die Produktbildung wurde durch die Radioaktivitätsmenge, die von der DEAE-Cellulosesäule mit 0,35 M KCl-Puffer verdrängt wurde, geteilt durch die wiedergewonnene Gesamtradioaktivität bestimmt.
Die Synthese von 2-5A bei der Enzyminkubation mit zellfreien Extrakten von dsRNS, Nuklease-behandelter dsRNS und der Nuklease-behandelten dsRNS nach Präzipitation zeigt den Zeiteffekt auf die Umwandlung von ATP zu 2-5A. Es gibt einige überraschende Ergebnisse. Erstens betrug die spezifische Aktivität der 2- 5A-Synthetase nach 18-stündiger Inkubation der zellfreien Extrakte mit unbehandelter mismatched dsRNS 41,5. Zweitens wurde eine bemerkenswerte Erhöhung hinsichtlich der Umwandlung von ATP zu 2-5A nach S&sub1;-Nukleasebehandlung festgestellt. Beispielweise beträgt die spezifische Aktivität 284 nach einer 18- stündigen Inkubation, was etwa 7 mal höher ist als die, welche mit der unbehandelten mismatched dsRNS beobachtet wird. Drittens zeigte die nach der Präzipitation mit S&sub1;-Nuklease behandelte dsRNS eine maximale Synthese von 2- 5A nach 12-stündiger Inkubation. Diese Daten zeigen, daß die enzymatische Synthese des Trimers, Tetramers und höherer Oligomere von 2-SA nach S&sub1;- Nukleasebehandlung von mismatched dsRNS signifikant erhöht wird. Diese positive Verbindung zwischen der Erhöhung der Enzymaktivität mit abnehmender Größe der dsRNS zeigt, daß eine Wechselwirkung mit dem allosterischen Modifizierungsmittel, d.h. der teilweise abgebauten, mismatched dsRNS, vorliegen kann, so daß sie an die 2-5A-Synthetase viel besser als die unbehandelte mismatched dsRNS binden und diese aktivieren kann. Die therapeutische Bedeutung dieser Erkenntnisse ist offensichtlich. Im Gegensatz dazu, wenn Abbauprodukte der Nuklease-S&sub1;-behandelten mismatched dsRNS mit niedrigem Molekulargewicht durch Präzipitation entfernt wurden, war eine maximale Synthese von 2- 5A nach 12-stündiger Inkubation beobachtbar. Diese maximale 2-5A-Synthetaseaktivität der S&sub1;-Nuklease-abgebauten dsRNS nach Präzipitation legt nahe, daß der Nuklease-resistente Kern die 2-5A-Synthetase in einer Weise aktivieren kann, die zur Aktivierung durch S&sub1;-Nuklease-behandelter mismatched dsRNS nach 18- stündiger Inkubation äquivalent ist.
Diese Daten bestätigen das Vorhandensein von biologisch aktiven Fragmenten der mismatched dsRNS und erklären eine physikalische Basis für die therapeutische Aktivität dieser Fragemente in den biologischen Flüssigkeiten. Diese Daten zeigen auch, daß die biologisch aktiven Fragmente aktiver sind als die Eltern- Verbindungen.

BEISPIEL 4

Eine weitere Erläuterung, wie die Erfindung verwendet werden kann, ist durch Vorbeugung sexuell übertragbarer Krankheiten wie Cytomegalovirus oder CMV (siehe N.Y. Times, 14. July 1988, 5. B6, welche die starke Erhöhung von mit Sexualität im Zusammenhang stehenden Krankheiten zusammenfaßt) aufgezeigt. Cytomegalovirus (ein Mitglied der Herpes-Virusfamilie) befällt mehr als 1 Million Menschen allein in den Vereinigten Staaten, und Menschen mit geschwächtem Immunsystem können gastromtestinale Probleme oder Blindheit entwickeln (jeweils seröse Oberflächen, die viral infiziert wurden und die Kompartimente können von vielen systemisch aufgebrachten, antiviralen Mitteln nicht leicht durchquert werden). CMV wird sexuell übertragen. Durch Erzeugung von bioaktiven Fragmenten mit der Zeit, wie durch Verabreichen von mismatched dsRNS (Ampligen), wird ein viel höherer Inhibierungsgrad erreicht. Beispielsweise zeigt Figur 3 eine 100%ige Inhibierung von CMV, wenn es für 24 Stunden Ampligen-Fragmenten ausgesetzt wird. Eine solche kontrollierte Freisetzung von bioaktivem Material kann durch topische Salben etc. nicht leicht erreicht werden, wenn dsRNS von einer relativ nicht-toxischen Varietät verwendet wird.
Die Erzeugung von bioaktiven Fragmenten von dsRNS mit der Zeit wurde in Gewebekulturuntersuchungen dargestellt, die mit Cytomegalovirus, manchmal auch als Cytomegali-Einschlußerkrankung bezeichnet, die sich auf die intranukleären Einschlüsse bezieht, die in vergrößerten, mit dem Virus infizierten Zellen gefunden werden, durchgeführt wurden. Die menschlichen Cytomegaloviren sind eine Untergruppe viraler Agentien, die eng mit der Herpes-Gruppe von Viren verwandt sind, oder ein Mitglied davon sind. Obwohl überall zu finden, wurde über das Auftreten von sexuell übertragbarem CMV mit Schätzungen von über einer Million in den Vereinigten Staaten im Jahr 1988 infizierten Personen berichtet. Die Infektion ist gewöhnlicherweise asymptomatisch, aber Menschen mit einem geschwächten Immunsystem können gastromtestinale Probleme oder Blindheit entwickeln. Neugeborene sind besonders anfällig und CMV kann Fehlgeburten, Totgeburten oder postnatalen Tod verursachen. Das Merck-Handbuch, 14th Ausgabe (1982), S.205-206, gibt keine spezifische Therapie für die Krankheit an.
In diesem Experiment wurden die folgenden Verfahren und Materialien verwendet.
Menschliche Vorhaut-Fibroblasten (HFF) wurden von Neugeborenen isoliert und bei niedriger Passage (< 20) in Minimalmedium mit Earles Salzen, versetzt mit 10%igem fötalem Rinderserum, 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 20 mM HEPES-Puffer und Antibiotika, gehalten. Wenn die Zellen Konfluenz erreichten, wurden sie wie vorstehend gehalten, mit der Ausnahme von 5%igem fötalem Rinderserum. Wöchentliche Tests der Zellen waren bezüglich bakteriellen und Mycoplasma-Kontaminationen negativ.
Ein Stammpräparat von menschlichem Cytomegalovirus (CMV, ATCC #VR-538, Stamm AD169) wurde in dieser Untersuchung verwendet. Sie bestand aus einer zweiten Passage über HFF, die geerntet wurde, wenn die cytopathische CMV- Wirkung 75% der Wirtszellen umfaßte. Der zellfreie Stammvirus wurde in Lagerröhrchen verteilt und bei -120ºC gehalten. Bakterielle und Mycoplasma- Sterilitätstests waren negativ. Der infektiöse Titer der CMV-Stammpräparation wurde mit HFF-Zellen bestimmt und betrug 4 x 106 fluoreszenzbildende Einschlüsse/ml (siehe unten).
Lyophilisiertes Ampligen vom klinischen Grad (mismatched dsRNS; poly I poly C&sub1;&sub2;,U, Hem Research, Inc., Rockville, Maryland, USA) wurde verwendet. Unter Verwendung der Anweisungen des Herstellers wurde das Ampligen rekonstituiert, aliquotiert und bei -120ºC gelagert. Für jedes Experiment wurde ein frisches Aliquot unter Herumwirbeln in einem 50ºC Wasserbad aufgetaut und in dem vorstehend beschriebenen Gewebekulturmedium in gewünschte Konzentrationen verdünnt.
Das Arzneimittel wurde mit HFF-Zellen unter verschiedenen Bedingungen inkubert. Diese Variationen umfaßten: (1) die Konzentration von Ampligen; (2) die Abfolge der Ampligen-Exposition in Bezug auf die Virusaufnahme; und (3) die Zeitdauer, bei der HFF Ampligen ausgesetzt wurde. Die Lebensfähigkeit von Ampligen-behandelten HFFn war identisch zu unbehandelten HFFn, wie durch Trypan blau Ausschluß (d.h. > 99%) bestimmt wurde.
Konfluente bzw. zusammenfließende HFF wurden auf kreisförmigen Deckgläser in ein "dram" (Kapazität 3,7 ml)-Schalengefäßen gezüchtet. Die virale Infektion wurde durch Inkubation der Schalengefäße mit 0,25 ml einer geeigneten Verdünnung von CMV initiiert. Die HFF wurden dem CMV bei 37ºC für 1 Stunde bei 700 x g ausgesetzt, um die Virusaufnahme zu ermöglichen. Die Gefäße wurden zwei- bis dreimal zur Entfernung von extrazellulären Viren gewaschen. Die Gefäße wurden mit einem mL Gewebekulturmedium erneut versetzt und normalerweise für 18 bis 24 Stunden bei 37ºC für 72 Stunden inkubiert.
Die CMV-Replikation wurde wie folgt quantifiziert. Die virale Replikation wurde durch Fixieren der HFF in 100%igem Aceton gestoppt. Die Deckgläser, welche die anhaftenden HFF enthalten, wurden gespült und mit einem anti-CMV-Maus monoklonalen Antikörper (Dupont), spezifisch für das 72 Kilodalton unmittelbar frühe Protein, inkubiert. Der gebundene Antikörper wurde durch Zugabe eines FITC-markierten Antimaus IgG F (ab)&sub2; (SIGMA) detektiert. Die Virus-infizierten Zellen zeigten eine strahlend-apfelgrüne nukleäre Fluoreszenz, wenn sie bei 250- facher Vergrößerung mit einem Epifluoreszenz-Mikroskop betrachtet wurden. Die Anzahl der CMV-infizierten Zellen (d.h. solche, die fluoreszierende nukleäre Einschlüsse zeigen), wurde unter dem Mikroskop gezählt. Die positive Stammpräparation wurde so verdünnt, daß in Abwesenheit von Ampligen zwischen 200 und 1200 CMV-infizierte Zellen pro Deckglas nach 24-stündiger Inkubation erzeugt wurden. Dies wurde mit einer Infektionsmultiplikation (MOI) von 0,04 erreicht.
Die durchschnittliche Anzahl von CMV-Einschlüssen aus replizierten Deckgläsern für jede experimentelle Bedingung wurde bestimmt und mit der einer positiven Kontrolle verglichen, die kein Ampligen erhalten hat. Negative Kontrollen, die weder Ampligen noch CMV ausgesetzt wurden, wurden parallel ausgewertet. Die antivirale Aktivität von Ampligen wurde durch die folgende Formel ausgedrückt:
% Inhibierung von CMV-Einschlüssen = 100%-[(Durchschnitts-% von CMV-Einschlüssen/Deckglas in Ampligen-behandelten HFF/Durchschnitts-% von CMV-Einschlüssen/Deckglas in unbehandelten Kontroll-HFF) x 100]
Die Wirkung der Ampligen-Vorbehandlungsdauer auf die Infektion von menschlichen Vorhautfibroblasten mit Cytomegalovirus ist in Figur 3 dargestellt. Replizierte Monoschichten von menschlichen Vorhautfibroblasten wurden entweder (1) mit 10 µg/ml Ampligen (offene Balken) vorbehandelt oder (2) mit 100 µg/ml (quergestreifte Balken) Ampligen für die angegebenen Zeitintervalle vor der CMV-Aufnahme vorbehandelt. Das Ausmaß der CMV-Infektion wurde 24 Stunden nach der Virusaufnahme durch die beschriebene IFA-Methode bestimmt. Die durchschnittliche Anzahl der CMV-Einschlüsse pro Deckglas für Ampligenbehandelte Kulturen wurde mit der von Arzneimittel-freien Kontrollen verglichen Die Ergebnisse zeigen, daß die Ampligen-Vorbehandlungsdauer direkt proportional zum Ausmaß der Inhibierung der CMV-Infektion ist. Die maximale CMV Inhibierung wird erreicht, wenn die HFF mit Ampligen für 24 Stunden vorbehandelt werden.
Diese Untersuchung zeigt die Fähigkeit der mismatched dsRNS, eine antivirale Wirkung gegen CMV auszuüben, die sich mit der Zeit erhöht, und die CMV- Anfälligkeit für mismatched dsRNS nach der Zeit, ungeachtet der verwendeten Konzentration, und einen verzögerten Freisetzungsgrad, der durch topisches Aufbringen von dsRNS von einer relativ nicht-toxischen Varietät nicht erreicht wird.

Claims

1. Verwendung von nicht richtig angepaßter doppelsträngiger RNS (dsRNS) in der Herstellung eines antiviralen Medikamentes für die systemische Verabreichung, die eine Freisetzung von bioaktiven doppelsträngigen RNS- Fragmenten in kompartimentierten Körperflüssigkeiten eines Säugetieres hervorruft.

2. Verwendung nach Anspruch 1, zur Kontrolle des Virustiters in kompartimentierten Körperflüssigkeiten eines Säugetieres.

3. Verwendung nach Anspruch 2, zur Kontrolle der Übertragung von Virusinfektionen zwischen Säugetieren.

4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Virus ein Mitglied der Herpes-Familie ist.

5. Verwendung nach Anspruch 4, wobei das Virus ein Cytomegalovirus ist.

6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Virus ein Mitglied der Retrovirus-Familie ist.

7. Verwendung nach Anspruch 6, wobei es sich bei dem Retrovirus um HIV handelt.

8. Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei es sich bei der nicht richtig angepaßten doppelsträngigen RNS um einen Komplex aus Polyinosinat und einem Polycytidylat, das zwischen 1 aus 5 bis 1 aus 30 Uracil oder Guanidin-Basen enthält, und vorzugsweise

In r(C&sub1;&sub2;&submin;&sub2;&sub4;,U)n oder rIn r(C&sub2;&sub9;&sub0;,G)n ist.

9. Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche , wobei die kompartimentierte Körperflüssigkeit Speichel, Tränen, seröse Exsudate, seröse Transsudate und/oder zerebrospinale Flüssigkeit ist.