DE68918562T2

DE68918562T2 - Menschliche myeloperoxidase und therapeutische verwendung.

Info

Publication number: DE68918562T2
Application number: DE68918562T
Authority: DE
Inventors: Alex Bollen; Carol Deby; Joel Pincemail
Original assignee: La Region Wallonne
Current assignee: La Region Wallonne
Priority date: 1988-06-14
Filing date: 1989-06-13
Publication date: 1995-05-11
Anticipated expiration: 2009-06-14
Also published as: FR2632525A1; WO1989012457A1; DE68918562D1; FR2632525B1; EP0372063A1; ATE112169T1; EP0372063B1; JPH03501327A; CA1340915C

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Enzym Human- Myeloperoxydase (hMPO) seine Herstellung auf gentechnischem Wege und seine Verwendung als Arzneimittel. Sie betrifft außerdem seine Verwendung zur Herstellung von es enthaltenden pharmazeutischen Zusammensetzungen sowie die pharmazeutischen Zusammensetzung selbst.
Ziel der hier in Betracht gezogenen therapeutischen Anwendung ist insbesondere die Behandlung von Immundefiziten in der Humantherapie durch Verstärkung der Antimikroben-Aktivität im Bereich der Makrophagen und dies in allen Fällen der Immundefizite, unabhängig davon, wo sie auftreten, insbesondere bei AIDS, Verbrennungen oder Be- bzw. Verstrahlungen. Das natürliche Enzym Human-Myeloperoxydase und seine therapeutische Verwendung sind beispielsweise beschrieben in der Patentanmeldung GB-A-2108387. Das für das Enzym codierende Gen wurde isoliert und seine Nucleotidsequenz wurde aufgeklärt von Kazuhiro Morishita et al., "Journal Biol. Chem.", Band 262, Nr. 8, 15. März, 1987, Seiten 3844-3851.
Die Resistenz gegenüber einer Infektion durch Mikroorganismen beruht auf nicht-spezifischen Funktionen (Enzym-Wirkung, pH-Wert, Epithel-Wand) und auf adaptiven Immunantworten der Zellen Lymphozyten B und T.
Die nicht-spezifischen Funktionen verhindern das Eindringen des größten Teils der Angreifer. Wenn jedoch diese erste Verteidigungslinie nachgibt, tritt das Phagozyten- System auf den Plan, zerstört die infektiösen Agentien und stimuliert die Immunitäts-Funktionen, die durch die B- und T-Zellen verliehen werden.
Jede Anomalie des Phagozyten-Systems, sei sie ererbt oder erworben, hat schwerwiegende Konsequenzen, da auch die Mikroorganismen, die normalerweise wenig pathogen sind, dieses unterlaufen und wiederkehrende Infektionen auslösen.
Darüber hinaus führt jedes Defizit des Immunsystems selbst im Bereich der T- oder B-Zellen zu einer erhöhten Empfindlichkeit für intra- oder extrazelluläre Bakterien- oder Virus-Infektionen. Diese Defizite können ererbt oder erworben sein (z. B.: AIDS = erworbener Mangel an T-Zellen). Der größte Teil der Personen, die unter diesen Defiziten leiden, erleiden eine Infektion durch opportunistische Organismen (Bakterien, Protozoen und dgl.).
In allen Immundepressions-Fällen ist es daher erwünscht, daß das Phagozyten-System so wirksam wie möglich ist, um die Konsequenzen der Angriffe von außen zu begrenzen. Zusätzlich nimmt unter Normalbedingungen die Phagozytose einen wesentlichen Charakter an, wenn die B- und T- Immunantwort schwächer wird.
Unter den Zellen, die mit der Immunantwort in Verbindung stehen, sind die polymorphonucleären Leukozyten von besonderem Interesse im Zusammenhang mit dem Kampf gegen die Infektionen. Diese Zellen enthalten ein Enzym, die Myeloperoxidase, deren mikrobizide Wirkung gut dokumentiert ist. Die polynukleären Zellen weisen keine Spezifität gegenüber einem Antigen auf, sie spielen jedoch eine wesentliche Rolle im Falle einer akuten Entzündung zusammen mit den Antikörpern und dem Komplement-System bei der Verteidigung des Wirts gegen die Mikroorganismen. Ihre Hauptfunktion ist die Phagozytose. Im Verlaufe dieses Prozesses werden die Mikroorganismen in Vakuolen (Phagosomen) eingeschlossen, die mit den Granula fusionieren, welche die Myeloperoxidase enthalten, unter Bildung der Phagolysosome . Im Verlaufe der Phagozytose führt die enzymatische Aktivität der Myeloperoxidase zur Bildung von HOCl, einer stark bakteriziden Verbindung (Unterchlorige Säure); diese Aktivität erfordert H&sub2;O&sub2; (Wasserstoffperoxid), das in der polymorphonukleären Zelle bei der Stimulierung durch verschiedene Agentien und insbesondere durch die durch die Mikroorganismen hervorgerufenen immunologischen Reaktionen auftritt. Die Unterchlorige Säure ist selbst ein Oxidationsmittel, sie bildet jedoch noch stärker oxidierend wirkende Derivate, die Chloramine. Schließlich entsteht bei ihrer Reaktion mit H&sub2;O&sub2; eine extrem oxidierende Form des Sauerstoffs, der Singulett-Sauerstoff.
Das Hauptproblem liegt jedoch im Bereich der Makrophagen. Der Makrophage ist nämlich eine sehr große Zelle, die unempfindlicher ist als die polymorphonukleäre Zelle, der in der Lage ist, nach dem Muster der letztgenannten die Mikroorganismen zu phagozytieren. Er weist auch ein H&sub2;O&sub2;-Bildungssystem auf, dieses ist jedoch nicht in der Lage, die Myeloperoxidase zu bilden. Dieser Mangel vermindert seine Abwehr-Wirksamkeit. Erfindungsgemäß wurde jedoch gefunden, daß die Makrophagen die Myeloperoxidase inkorporieren und verwerten können, die nach dem Eindringen in die Makrophagen aktiv bleibt, wobei durch diese Aufnahme ihr zytolytisches und bakteriolytisches Arsenal wirksam vervollständigt wird, insbesondere in bezug auf die Zerstörung von verschiedenen infektiösen Agentien, die Patienten mit einer Immundepression befallen.
Obgleich die Myeloperoxidase, wenn sie einmal in dem Plasma ist, durch die Makrophagen sehr schnell auf genommen wird, können erfindungsgemäß spezifische Verabreichungssysteme, die das Enzym den Makrophagen optimal zuführen, verwendet werden, wobei Konjugate der Myeloperoxidase gebildet werden durch kovalente Kupplung mit einem Transporteur (Träger), der eine Affinität gegenüber den Makrophagen aufweist. Als Transporteure (Träger) können beispielsweise genannt werden mannosyliertes Human-Albumin, aber auch Antikörper oder Antikörper-Fragmente, z. B. der konstante Teil Fc, der gegen Rezeptoren gerichtet ist, die sich auf den Makrophagen befinden.
Andere Systeme bestehen darin, daß durch nicht-kovalente Komplexbildung oder durch Manipulation der DNA ein Antikörper oder ein Antikörper-Fragment, der (das) für den Makrophagen spezifisch ist, an das Enzym Human-Myeloperoxidase gekuppelt wird unter Bildung eines "Immun- Komplexes".
Die Verabreichung solcher Konjugate oder Immun-Komplexe führt zur gezielten Einführung der Human-MPO in den Makrophagen, zu ihrer Ingestion durch Phagozytose und zur Freisetzung des Enzyms in der aktiven Form im Innern des Makrophagen, seiner bevorzugten Wirkungsstätte, wo es an dem Kampf gegen die Infektionen teilnimmt.
Im Falle der auf gentechnischem Wege hergestellten Immunkomplexe wird die DNA, die für die aktive MPO oder ihre natürlichen Vorläufer codiert, an die DNA gekuppelt, die für ein Immunglobulin-Fragment codiert, das die Makrophagen spezifisch erkennt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher die Verwendung einer Verbindung, die aus dem Enzym Human- Myeloperoxidase besteht, als Arzneimittel.
Gegenstand der Erfindung ist außerdem die Verwendung einer Verbindung als Arzneimittel, die besteht aus einem Konjugat der Myeloperoxidase, hergestellt durch kovalentes Kuppeln oder durch Komplexbildung mit einem Transporteur (Träger), der eine Affinität gegenüber den Makrophagen aufweist, wie mannosyliertes Human-Albumin, oder mit einem Antikörper oder Antikörper-Fragmenten, wie dem konstanten Teil Fc, der gegen Rezeptoren gerichtet ist, die sich auf den Makrophagen befinden.
Gegenstand der Erfindung ist auch eine andere Verbindung, welche die Myeloperoxidase auf optimale Weise in die Makrophagen einführt, die ebenfalls besteht aus Liposomen, insbesondere biopolymerisierten Liposomen, in denen die Myeloperoxidase eingekapselt ist.
Die erfindungsgemäßen Arzneimittel sind insbesondere verwendbar (nützlich) zur Bekämpfung von Infektionen im Innern der Makrophagen.
Das erfindungsgemäß verwendete Enzym Human-Myeloperoxidase stammt aus einer Rekombination, d. h. es ist gentechnisch hergestellt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist außerdem die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen für die Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen, die insbesondere verwendbar (geeignet) sind für die Behandlung von Immundefekten, wie sie insbesondere bei AIDS, Verbrennungen oder Bestrahlungen bzw. Verstrahlungen auftreten.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind schließlich pharmazeutische Zusammensetzungen, die als aktives Prinzip (Wirkstoff) die erfindungsgemäßen Verbindungen enthalten.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können in verschiedenen Formen vorliegen, die für verschiedene Arten der Verabreichung geeignet sind, insbesondere auf parenteralem, systemischem oder topischem Wege oder durch intravenöse Injektion, sofern die Ziel-Makrophagen nicht nur im Blut, sondern auch in anderen Zonen des Organismus vorhanden sind.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen enthalten außer dem aktiven Prinzip (Wirkstoff) pharmazeutisch akzeptable Träger für die jeweilige Verabreichungsform.
Die parenterale Verabreichung der Myeloperoxidase oder der erfindungsgemäßen Verbindungen ist sehr geeignet für die verschiedenen immundepressiven Syndrome.
Die Verminderung oder Suppression der natürlichen Sperren und Immunsperren begünstigt das Auftreten von Infektionen, die auf pathogene oder opportunistische Keime zurückzuführen sind.
Die Defekte des Immunsystems (beispielsweise der Mangel an T-Zellen, AIDS, durch Bestrahlung, durch Antikrebs- Chemotherapie . . . ) stehen häufig in Zusammenhang mit generellen Infektionen (durch Bakterien, Pilze, Viren, Protozoen . . . ), die nur mit den existierenden antibiotischen Agentien und chemotherapeutischen Agentien sehr schwer zu kontrollieren (zu bekämpfen) sind. Unter diesen Bedingungen kann die Myeloperoxidase auch auf systemischem Wege verwendet werden, um die antiseptische Aktivität der Makrophagen im Verlaufe der Phagozytose zu verstärken. Die experimentellen Ergebnisse zeigen nämlich, daß die Makrophagen und die Monozyten in Gegenwart des Enzyms eine erhöhte zytolytische und bakteriolytische Aktivität aufweisen.
Die Myeloperoxidase oder eine erfindungsgemäße Verbindung kann auch durch topischen Auftrag insbesondere auf torpide Geschwüre, bei denen ein Mangel an Mikrovascularisation auftritt (variköses Geschwür), verabreicht werden.
Für diesen topischen Auftrag wird die Myeloperoxidase beispielsweise in die wäßrige Paste gemäß einer bekannten dermatologischen Formulierung eingearbeitet. Im Augenblick der Verwendung kann man eine Instant-Mischung der Myeloperoxidase-Suspension herstellen mit
- entweder einer verdünnten Wasserstoffperoxidlösung (beispielsweise mit einer Konzentration von 0,3%)
- oder einem anderen Enzym, wie Xanthinoxidase.
In diesem Falle ist es zweckmäßig, zu der Myeloperoxidase-Suspension Hypoxanthin in einer Konzentration von 10&supmin;³ M und gegebenenfalls Ammoniumchlorid zuzugeben. Diese Pastenmischung ergibt eine Freisetzung von HOCl und eine Chloraminbildung, die besonders wirksam ist zur Reinigung von torpiden Wunden.
Weitere therapeutische Indikationen sind auf topischem Wege vorstellbar:
1) Die Verwendung der Myeloperoxidase ist interessant (vorteilhaft) bei der Prävention und Behandlung von Infektionen, wie sie während des Verlaufs von thermischen Verbrennungen, chemischen Verbrennungen oder Verbrennungen durch Bestrahlung (Verstrahlung) auftreten.
2) Die phagozytäre Funktion erscheint defizitär im Verlauf eines atopischen Ekzems. In diesem Fall kann der lokale Auftrag des Enzyms eine günstige stimulierende Wirkung auf die Makrophagen und die Haut-Monozyten haben.
3) Die Myeloperoxidase kann bei der Behandlung von Gingival-Infektionen eine ergänzende Rolle spielen, wie dies der Fall ist bei den Patienten mit Immundepression oder auch im Verlaufe von Parodontosen.
Erfindungsgemäß kann die Myeloperoxidase durch analytische Reinigung aus polymorphonukleären Leukozyten erhalten werden. Dennoch wird zweckmäßig das Enzym Human-Myeloperoxidase auf gentechnischem Wege unter Anwendung der rekombinanten DNA-Technologie hergestellt.
Um dies zu erreichen, werden im wesentlichen die folgenden Stufen durchgeführt:
1) Konstruktion einer Bank von cDNA-Klonen, die repräsentativ ist für die in den Leukozyten-Zellen synthetisierten Produkte und Klassieren dieser Bank mit einer geeigneten Sonde, die für die Human-Myeloperoxidase charakteristisch ist. Als Ergebnis dieser Operation erhält man einen cDNA-Klon, der für das Enzym codiert.
2) Die cDNA-Myeloperoxidase muß dann manipuliert werden, um ihre Expression in verschiedenen Wirt/Vektor-Systemen zu erlauben. Es entsteht eine modulare Konstruktion, wenn man in der Lage sein will, die Expression in den Systemen zu bewerten, die ebenso vielfältig ist wie E. coli, Hefe, Säugetierzellen oder Insektenzellen. Die Herstellung eines aktiven Enzyms, das korrekt zusammengebaut und behandelt ist, erfolgt zweckmäßig in Systemen von Eukaryontenzellen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die hMPO, die durch Kultivierung von Prokaryontenzellen oder Eukaryontenzellen gebildet wird, die durch einen Vektor zur Expression der hMPO in den genannten Zellen transformiert worden sind. Zweckmäßig wird die erfindungsgemäße hMPO durch Kultivierung von höheren Eukaryontenzellen, insbesondere von Insektenzellen oder Säugetierzellen, hergestellt.
Um dies zu erreichen, betrifft die vorliegende Erfindung:
1) eine Expression-Kassette HindIII/SnaBI, HindIII/EcoRV oder HindIII/HpaI von 2261 bp, welche die Sequenz trägt, die für hMPO codiert, wie in der Fig. 1 dargestellt, sowie das Plasmid pNIV2702, welches die genannten Kassetten enthält,
2) einen Vektor zur Expression in Prokaryonenzellen oder Eukaryontenzellen, welche die genannte Kassette enthalten, und insbesondere
3) ein rekombinantes Transfer-Plasmid für Baculovirus, das die cDNA von hMPO unter der Kontrolle des Polyhydrin- Promotors enthält, insbesondere
4) das Plasmid pNIV2704 der Fig. 5,
5) die Insektenzellen, insbesondere die Zellen von Spodoptera frugiperda, wie die Zellen Sf9, die durch einen erfindungsgemäßen Vektor mit der Wild-Virus-DNA co-transfektiert worden sind und insbesondere durch das Plasmid pNIV27o4 co-transfektiert worden sind,
6) Insektenzellen, insbesondere die Zellen von Spodoptera frugiperda, wie Sf9, die durch ein rekombinantes Baculovirus infiziert worden sind, die erhalten werden durch einen erfindungsgemäßen Vektor, insbesondere aus dem Plasmid pNIV2704,
7) die hMPO, die durch Kultivierung von Insektenzellen, insbesondere von Spodoptera frugiperda, wie Sf9, modifiziert durch einen Expressions-Vektor, in den genannten erfindungsgemäßen Zellen gebildet wird,
8) einen Vektor zur Expression in Säugetierzellen, insbesondere CHO-Zellen, welche die Kassette HindIII/SnaBI der Fig. 1 enthalten, insbesondere
9) ein Plasmid pNIV2703,
10) Säugetierzellen, insbesondere CHO-Zellen, die durch einen Expressionsvektor in den genannten erfindungsgemäßen Zellen, insbesondere durch das Plasmid pNIV2703, transfektiert worden sind,
11) die hMPO, die durch Kultivierung von Säugetierzellen, insbesondere von CHO, gebildet wird, die durch einen Expressionsvektor in den genannten erfindungsgemäßen Zellen transfektiert worden sind.
Die folgende detaillierte Beschreibung dient der Erläuterung weiterer Charakteristika und Vorteile der vorliegenden Erfindung.
Die Fig. 1 repräsentiert die Kassette HindIII/HpaI von 2261 bp, welche die Sequenzen enthält, die für die Human-Myeloperoxidase codieren, und die Kassette HindIII/SnaBI.
Die codierende Sequenz beginnt mit der ATG, welche das N-terminale Methionin (Met) angibt und endet mit dem Stoppcodon TGA(*s**).
Die Fett-Sequenzen repräsentieren die synthetischen Oligonucleotide, die an den 5'- und 3'-Stellen der cDNA der hMPO hinzugefügt worden sind.
Die Fig. 2 repräsentiert die Fixierung von Kaninchen- Seren bei dem ELISA-Test auf MPO.
Die Fig. 3 repräsentiert die Fixierung von Mäuse-Seren bei dem ELISA-Test auf MPO.
Die Fig. 4 repräsentiert eine Standard-Kurve des ELISA-Tests zum Nachweis der Human-Myeloperoxidase.
Die Fig. 5 repräsentiert die Konstruktion des erfindungsgemäßen Vektors pAcYMI/MPOII (Transfer-Plasmid für Baculovirus).
Die Fig. 6 repräsentiert die Karte des Vektors Tnd aus dem das erfindungsgemäße Plasmid pNIV2703 hergestellt wird.
Die drei Kassetten lenken jeweils die Expression der Selektions-Marker DHFR und Neo® sowie diejenige einer Fremd-cDNA (in dem vorstehend erläuterten Fall handelt es sich dabei um t-PA). Diese Kassette kann durch eine Kassette ersetzt werden, die für jede geeignete cDNA codiert, wenn man einen Teil der einzelnen Restriktionsstellen abzieht, welche die Kassette t-PA flankieren.

Abkürzungen

SV early: frühreifer Promotor von SV40;
5: nicht-codierende Extensionen in 5'-Stellung
3: nicht-codierende Extensionen in 3'-Stellung
SV: Polyadenylierungs-Region von SV40;
Rous LTR: wiederkehrende (lange) terminale Sequenz, die aus dem Virus des Roux-Sarkoms stammt;
bGH: Polyadenylierungs-Region des Gens des Rinder-Wachstumshormons;
Betablopro: Haupt-Promotor des Maus-β-Globulins.

Beispiel 1

Herstellung der hMPO auf gentechnischem Wege

A. Konstruktion einer Kassette, welche die Gesamtheit der Sequenzen enthält, die für die Human- Myeloperoxidase codieren, flankiert von Restriktions-Stellen die in der cDNA der Myeloperoxidase (MPO) fehlen

1. Ziel: Herstellung einer Kassette HindIII/HpaI, welche die Sequenzen enthält, die für die Human-MPO codieren und in verschiedene Expressionsvektoren inserierbar sind.
2. Ausgangsmaterial: Das Bakterien-Plasmid pMPO62, enthaltend eine vollständige cDNA der Human-MPO (Johnson et al., 1987, "Nucleic Acids Research" 15, 2013-2026);
- ein beliebiger Klonierungs-Vektor, der geeignete Restriktionsstellen (Restriktionssequenzen) enthält. Die Wahl erstreckt sich auf das Plasmid pTNDPC2, ein Plasmid, das pTND abgeleitet ist (Connors et al., 1988, "DNA", 7, 5651-661). Das Plasmid pTNDPC2 ist nicht wesentlich für die Herstellung der genannten Kassette; es wäre vollständig möglich gewesen, einen anderen Klonierungs-Vektor zu verwenden, der die erforderlichen Restriktionsstellen bzw. - frequenzen enthält, wie z. B. das Plasmid pJRD184 (Heusterspreute et al., "Gene" 39 (1985), 299-309).

3. Herstellung von Oligonucleotiden durch chemische Synthese

- Zur direkten Herstellung einer HindIII-Stelle (Frequenz) stromaufwärts von der ATG der hMPO wurde unter Anwendung von auf diesem Gebiet gut bekannten chemischen Verfahren die Synthese eines Oligonucleotid-Paares gewählt, die, wenn sie untereinander einmal rehybridisiert worden sind, enthalten in der 5'-3'-Richtung der codierenden Faser eine Restriktionsstelle HindIII, die Basen ACC, die Sequenzen, die für die 11 ersten Aminosäuren und für die erste Base des Tripletts der zwölften Aminosäure der hMPO codieren, die auf einer Stelle nslI reitet. Diese Oligonucleotide werden als MPOIII und MPOIV bezeichnet (siehe das nachfolgende Schema 1).
- Zur Herstellung einer Stelle HpaI stromabwärts von dem Stopp-Codon der hMPO wurde ein zweites Oligonucleotid- OPaar synthetisiert. Wenn sie einmal rehybridisiert worden sind, weisen sie auf in der 5'-3'-Richtung auf der codierenden Faser die beiden letzten Basen des Tripletts der Aminosäure 731, die Sequenz, die für die 14 letzten Aminosäuren der hMPO codiert, einen Stopp-Codon (TGA), der von dem natürlichen Stopp-Codon der hMPO verschieden ist, und 15 Basen, die eine EcoRV-Stelle enthalten, eine SnaBHI- Stelle und das Komplement einer Stelle HpaI. Diese Oligonucleotide werden als MPOI und MPOII bezeichnet (vgl. das nachfolgende Schema 1).

4. Subklonierungen

Subklonierung 1

Ein Fragment NslI/BglII von 2053 bp (Basenpaaren) wurde aus dem Plasmid pMPO62 extrahiert. Dieses Fragment und das synthetische Fragment HindIII/NslI von 42 pb, das durch Rehybridisierung der Oligonucleotide MPOIII und MPOIV erhalten wurde, wurden mit einem Fragment HindIII/BglII von 6755 pb des pTNDPC2 ligiert. Das resultierende Plasmid pscMPO1 wurde in den Stamm Escherichia coli MM294 nach einem allgemein bekannten Verfahren eingeführt mit dem Ziel, das Plasmid pscMPO1 in größerer Menge zu bilden. Das Plasmid pscMPO1 enthält so ein Fragment von 2095 bp, das von einer Stelle HindIII bis zu einer Stelle BglII geht, die etwa bei der Aminosäure 696 der hMPO liegt.

Subklonierung 2

Ein Fragment XbaI/PstI von 1825 bp wurde aus dem Plasmid pMPO62 extrahiert. Dieses Fragment und das synthetische Fragment PstI/HpaI von 62 bp, das erhalten wurde durch Rehybridisierung der Oligonucleotide MPOI und MPOII, wurden mit einem Fragment XbaI/HpaI von 3283 bp des TNDPC2 ligiert. Das resultierende Plasmid pscMPO2 wurde in den Stamm Escherichia coli MM294 eingeführt mit dem Ziel, es in größerer Menge zu bilden. Das Plasmid pscMPO2 enthält ein Fragment von 1887 bp, das von einer Stelle XbaI, beginnend bei der ersten Base der Aminosäure 123 der hMPO, bis zu der Stelle HpaI geht.

5. Konstruktion des Plasmids pNIV2702 aus pscMPO1 und pscMPO2

Um schließlich die Kassette hMPO HindIII/HpaI zu erhalten, wurden ein Fragment HindIII/Xbal von 374 bp, enthaltend die Sequenz, die für die Aminosäuren 1 bis 122 der hMPO codiert, und ein Fragment XbaI/HpaI von 1887 pb, enthaltend die Sequenz, die für die Aminosäuren 123 bis 745 der hMPO codiert, jeweils aus den Plasmiden pscMPO1 und pscMPO2 exrahiert. Diese beiden Fragmente wurden anschließend wieder mit einem Fragment HindIII/HpaI von 5165 pb des TNDPC2 ligiert zur Herstellung des Plasmids pNIV2702.
Das Plasmid pNIV2702 enthält somit eine Kassette HindIII/HpaI von 2261 bp, welche die Gesamtheit der Sequenzen trägt, die für die hMPO codieren (Fig. 1). Diese Kassette kann leicht extrahiert und transferiert werden in verschiedene Expressionsvektoren für Hamster-Eizellen (CHO) und für Insektenzellen (Spodoptera frugiperda) über den Baculovirus.
3'-Terminus MPO
5'-Terminus MPO

Schema 1

B. Entwicklung eines ELISA-Tests für den Nachweis von natürlicher und rekombinanter Myeloperoxidase

a) Herstellung von Anti-MPO-Antikörpern

Anti-MPO-Seren wurden erhalten beim Kaninchen und bei der Maus. Sie wurden in einem ELISA-Test auf MPO getestet (die Platten ist beschichtet mit MPO und gesättigt mit BSA. Man gibt die zu testenden Antikörper, dann ein alkalisches Phosphatase-Konjugat-Anti-Ig zu). In den beiden Fällen erhält man einen Anti-MPO-Antikörper-Titer, der mindestens 8000 mal höher war in dem Immunserum als in einem normalen Serum (Fig. 2 und 3).

b) Durchführung des Tests

Ein "Sandwich"-Test wurde durchgeführt unter Verwendung der Ig von Kaninchen-Anti-MPO (Prosan-Dakopatts A398) und eines der erfindungsgemäßen Anti-MPO-Maus-Seren. Die Platte wurde mit den Kaninchen-Ig mit 7,6 Gamma/ml in PBS pH 7,8 eine Nacht lang bei 4ºC beschichtet. Sie wurde mit 1% BSA in PBS pH 7,8 Tween 20, 0,05%, 1h40 min bei Umgebungstemperatur gesättigt. Die zu untersuchenden Proben werden 2 h lang bei Umgebungstemperatur stehen gelassen, dann wird das Maus-Serum, verdünnt auf das 1000-fache in der Sättigungslösung 2 h bei Umgebungstemperatur stehen gelassen, schließlich wird das Konjugat Fab&sub2; von Kaninchen-Anti-Ig der alkalischen Maus-Phosphatase, verdünnt auf das 1000-fache in dem Puffer TBS (Tris-HCl 0,05 M, pH 7,5, NaCl 0,15 M), enthaltend 1% BSA und 0,05% Tween 20, zugegeben. Zwischen jeder Stufe wird die Platten 5 mal entweder mit TBS Tween 20 0,05% (vor und nach der Entnahme des Konjugats) oder mit PBS Tween 20 (andere Stufen) gewaschen. Der Nachweis erfolgt mit einer p- Nitrophenylphosphat-Lösung mit 1 mg/ml in 10% Diethanolamin, 0,01% MgCl&sub2;·6H&sub2;O, 0,02% NaN&sub3;, pH 9,8, und die Reaktion wird mit 3M NaOH abgestoppt. Das Lesen erfolgt bei 410 nm. Die Fig. 4 zeigt eine Fixierungskurve eines reinen MPO (Green Cross Corporation), verdünnt in einem Kulturüberstand von Insektenzellen SFMJ (Medium TC100 mit 10% FCS). Man sieht, daß der Test zur Dosierung der MPO in einem Konzentrationsbereich zwischen 0,1 und 100 ng/ml verwendbar ist.

C) Klonierung der cDNA MPO in dem Transfer-Plasmid für Baculovirus

Die DNA des Transfer-Plasmids pAcYMI (Baculovirus, vgl. Matsuura et al., "J. Gen. Virol" (1987) 68, 1233- 1250), wurde linearisiert mit BamHI und gemischt mit dem DNA-Fragment HpaI-HindIII von 2261 bp, das der MPO entsprach. Die Mischung wurde mit T4 DNA-Polymerase behandelt, ligiert und verwendet zur Transformation von kompetenten Zellen von E. coli MM294. Die Selektion der Klone erfolgte durch Wachsenlassen auf Ampicillin. Nach mehreren enzymatischen Kontroll-Restriktionen auf 48 Klonen wurde der Klon 11 identifiziert als derjenige, der das Insert MPO in der richtigen Orientierung, bezogen auf den Promotor des Polyhydrins, aufweist (pNIV2704) (Fig. 5).
Die synthetischen Oligonucleotid/MPO-Verbindungsstellen, denen in der 5'-Stellung und in der 3'-Stellung cDNA MPO bei den vorhergehenden Konstruktionen zugesetzt worden waren, wurden bestätigt durch Sequenzierung dieser Regionen. Es wurde das Sequenzierungsverfahren auf einer Doppelstrang-DNA mit Sequenase angewendet.

"Co-Transfektion" und "Plaque-Assay"

Das rekombinante Plasmid 11 wurde in Verbindung mit der Wild-Virus-DNA verwendet, um Zellen von Spodoptera frugiperda (Sf9) bei der Kultivierung zu co-transfektieren (der Versuchsablauf ist allgemein bekannt und ist in dem Manual von M.D. Summers und G.E. Smith, "A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures", Texas University, College Station, 1987 beschrieben).
Die Cotransfektions-Überstände der Tage 5 und 7 nach der homologen Rekombination wurden in dem "Plaque-Assay" so verwendet, daß 100 bis 1000 Lysis-Zonen pro Schale erhalten wurden. Die rekombinanten Viren, die kein Polyhydrin enthielten, wurden 5 Tage später visuell oder durch DNA-Hybridisierung identifiziert. Es wurden 13 Kandidaten aussortiert und gereinigt.

Test zur Bildung von rekombinanter MPO

Zwei rekombinante Baculoviren, als MPO1.1 und MPO5.2 bezeichnet, wurden verwendet, um Sf9-Zellen zu infizieren und die Fähigkeit derselben, die Myeloperoxidase zu bilden, zu bestimmen. In den beiden Fällen sekretieren die infizierten Zellen in dem Kulturmedium ein Protein, das bekanntermaßen spezifisch ist für die Anti-Myeloperoxidase-Antikörper und deren Menge durch den ELISA-Test als ± 0,2 ug/ml bestimmt wurde. (Die infizierten Zellen wurden in einer Dichte von 10&sup6; Zellen/ml geerntet). Das rekombinante Produkt wurde auch in dem Zell-Rohextrakt in einer Menge von ± 0,06 ug/10&sup6; Zellen gefunden.
- Co-Transfektion von Insektenzellen Sf9 (Spodoptera frugiperda) Verwendung des konstruierten rekombinanten Vektors (pNIV2704) PAcYbLI/MPO 11, der MPO stromabwärts von dem Baculovirus-Promotor des Polyhydrins enthält, wobei 100 ug in Verbindung mit 1 ug Virus-DNA verwendet wurden. Transformations-Technik mit Calciumchlorid.
- Verwendung des Überstandes nach 5j (Tagen) der Co- Transfektion für den "Plaque-Assay". Verdünnungen von -1 bis -7; 5 Schalen pro Verdünnung.
- Verwendung des Überstandes nach 7j unter den gleichen Bedingungen.
Die gesammelten Überstände wurden verwendet zur Herstellung von Lysis-Zonen in Monoschichten der Zellen Sf9 (Infektion der Zellen - 3 Millionen pro Schale - durch Verdünnungen des Co-Transfektions-Überstandes während 60 min. Entnahme mit dem Inokulum und Gießen einer Agarschicht mit niedrigem Schmelzpunkt in einer Endkonzentration von 1,5%. Abdecken des Mediums EX-Cell 400 J.R. Scientific, versetzt mit Antibiotika und Stehenlassen in einem Ofen bei 28ºC 4 Tage lang). Verfärbung der Schalen mit Neutralrot nach 4-tägiger Infektion und Hybridisierung der Filter mit einem MPO-DNA-Fragment, das mit α³²P markiert worden ist, dCTP-Kopien von 13 Kandidaten nach der Autoradiographie. Anschließend wurden nacheinander zwei "Plaque-Assay-Reinigungen" durchgeführt.

D. Klonierung der cDNA hMPO in dem Expressionsvektor pTDN für Säugetierzellen (CHO) und Einführung in die Zellen

Versuchsprotokoll

a. Herstellung des Expressionsvektors pNIV2703

Mit dem Ziel, die hMPO durch chinesische Hamster-Eizellen (CHO) produzieren zu lassen, wurde die Kassette HindIII/SnaBI von 2253 bp des pNIV2702, welche die für die hMPO codierenden Sequenzen trug, zwischen die Stellen HindIII und SnaBI des Säugetier-Expressionsvektors pTDN eingeführt. Der Vektor pTDN, dessen Anwendungsprinzip identisch ist mit dem Vektor pTND (Connors et al., 1988), von dem er abstammt, trägt zwei Gene, die für Selektionsmarker codieren [Resistenz gegenüber Neomycin (bakterielle Neophosphotransferase Neo®) und Dihydrofolat-Reduktase (DHFR)] und eine Kassette zur Expression des interessierenden Moleküls, in diesem Falle ht-PA (Gewebe-Aktivator des Human-Plasminogens). Die vorstehend beschriebene Manipulation besteht darin, die Kassette HindIII/SnaBI, welche die Gesamtheit der Sequenzen trägt, die für die ht-PA codieren, durch diejenige zu ersetzen, die für die hMPO codiert. Wenn dieser Ersatz einmal durchgeführt worden war, wurden das erhaltene rekombinante Plasmid pNIV2703 in den E. coli-Stamm MM294 eingeführt mit dem Ziel, eine ausreichende Menge davon zu reinigen für die Transfektion der CHO-Zellen. Die Fig. 6 beschreibt in schematischer Form den Expressionsvektor pTND (Connors et al., 1988). Der Vektor pTDN entspricht dem Vektor pTND mit Ausnahme der Tatsache, daß die Kassette DHFR eine umgekehrte Leserichtung hat und zwischen der Kassette Neo und der Kassette t- PA angeordnet ist.

b) Transfektion durch Elektroporation von CHO-Zellen

Aufgrund einer Digestion durch das Restriktionsenzym Not 1 wurden die Sequenzen bakteriellen Ursprungs (PUC19 in der Fig. 6) von dem Fragment getrennt, welches die drei Expressionskassetten für Säugetierzellen trägt. Wenn er einmal digeriert ist, wird der Vektor pNIV2703 durch Elektroporation, eine Transfektions-Methode, in CHO DHFR-Zellen eingeführt unter Anwendung eines Verfahrens analog zu demjenigen, wie es von Zerbib et al. (1985, "Biochem. Biophys. Res. Comm." 129, 611-618) beschrieben ist. Die Zellen wurden anschließend in ein Kreuzungs-Medium eingeführt, das G418 enthielt, das den Zellen nicht erlaubte, die Neophosphotransferase zum Überleben zu exprimieren. Nach einer Zeitspanne von 1 bis 3 Wochen überleben so nur die Zellen, die das geeignete Selektions-Gen erhalten haben, das von dem Vektor pNIV2703 getragen wird, und vermehren sich. Die so erhaltenen Zell-Klone wurden schließlich getestet auf die Expression der hMPO. Zu diesem Zweck wurden der Kulturüberstand und ein Zellextrakt jeder dieser Klone analysiert unter Anwendung eines ELISA-Tests (Enzym-gebundender Immunosorbens-Assay), der es erlaubt, die hMPO spezifisch zu qualifizieren und zu quantifizieren.
Die Ergebnisse zeigen, daß die rekombinanten Klone in dem Kulturmedium die rekombinante MPO sekretieren. Die Produktionsmenge, abgeschätzt durch ELISA, liegt zwischen 0,1 und 1 ug pro ml Überstand.

Beispiel 2

Therapeutische Anwendung der hMPO-Rolle der Leukozyten- Myeloperoxidase

Die Verteidigung unseres Organismus gegen fremde Mikroorganismen wird durch die weißen Blutkörperchen oder Leukozyten gewährleistet, unter denen sich befinden die Lymphozyten, die Antikörper bilden, die Makrophagen, die Eosinophilen und die Neutrophilen (oder Polymorphonucleären), die den fremden Mikroorganismus durch Phagozytose zerstören. Im Verlaufe derselben bilden die Neutrophilen sehr toxische und bakterizide Peroxid-Moleküle: das Superoxid-Anion, das Wasserstoffperoxid, den Hydroxyl-Rest, singulären (atomaren) Sauerstoff.
Die bakterizide Wirkung des Wasserstoffperoxids (H&sub2;O&sub2;) wird auf das 1000-fache erhöht durch die Myeloperoxidase (MPO), das Enzym, das in den Azurophilen (oder primären) Körnchen der Neutrophilen lokalisiert ist. Dieses Enzym katalysiert nämlich in Gegenwart von H&sub2;O&sub2; die Oxidation des Chloridions (Cl&supmin;) unter Bildung der Unterchlorigen Säure (HOCl) (1), die bakterizide Eigenschaften aufweisen.
Die Monozyten, bei denen es sich um die Vorläufer der Makrophagen handelt, weisen einen antimikrobiellen Aktivitätsmechanismus auf, der ähnlich demjenigen der Neutrophilen ist, sie bilden jedoch nur wenig H&sub2;O&sub2; und darüber hinaus enthalten sie etwa dreimal weniger Myeloperoxidase als die Neutrophilen (2). Andererseits haben in vitro-Versuche gezeigt, daß im Verlaufe ihrer Reifung zum Makrophagen sie ihren Gehalt an Myeloperoxidase vollständig verlieren, was sich auch in einer Abnahme der antibakteriellen Aktivität äußert (3). Frisch isolierte Monozyten haben somit eine Cytotoxizität von 90% gegenüber zugeführten Toxoplasmes gondii, während die Makrophagen (nach 10-tägiger Kultivierung) eine Cytotoxizität von nicht mehr als 12% aufweisen.
Mehrere Arbeiten haben gezeigt, daß die Makrophagen Zellbruchstücke von Neutrophilen phagozytieren können (4,5) und so eine Myeloperoxidase-Aktivität erwerben können mit der Folge einer Erhöhung der Toxizität der geringen Menge an durch die Makrophagen gebildetem Wasserstoffperoxid. Andere Untersuchungen haben die Bedeutung der Erhöhung der Peroxidase-Aktivität der Makrophagen unterstrichen, da dann, wenn die T. gondii vorher mit der Peroxidase von Pferde-Eosinophilen inkubiert worden sind, die Makrophagen dann eine Cytotoxizität von 90% aufweisen, die äquivalent zu derjenigen der Monozyten ist (3,6). Die gleichen Beobachtungen wurden gemacht mit S. aureus (7), mit T. cruzi (8) oder mit Tumorzellen (9).

Materialien und Verfahren

Reinigung der Human-Monozyten

Mit 50 ml Blut eines normalen Patienten wurden Abstriche gemacht auf Calciparin (0,3 ml mit 25 000 U/ml), dann zur Hälfte mit dem Puffer PBS 0,01 M pH 7,2 verdünnt. 35 ml verdünntes Blut wurden dann auf einem Dichtegradienten, bestehend aus 15 ml Ficoll-Paque (Pharmacia), abgeschieden.
Nach dem Zentrifugieren für 30 min bei Umgebungstemperatur mit 1800 UpM werden die an der Grenzfläche des Gradienten angeordneten Lymphozyten und Monozyten gewonnen und auf Eis aufbewahrt. Die Zellen werden anschließend ein erstes Mal mit dem Puffer PBS gewaschen, dann 10 min lang mit 2000 UpM bei 4ºC zentrifugiert. Der Arbeitsgang wird noch zweimal wiederholt, dann werden die Zellen kultiviert.

Kultivierung der Human-Monozyten

Die Monozyten werden durch Haftung an Glas gereinigt. In Alveolen mit einem Durchmesser von 2,5 cm (Limbro) werden die Zellen mit 1 ml des Kulturmediums MEM, enthaltend 10% Human-Serum, in Kontakt gebracht. Nach 2-stündiger Inkubation bei 37ºC in einer Atmosphäre mit 5% CO&sub2; werden die nicht-haftenden Zellen (Lymphozyten) eliminiert durch Entfernung des Kulturüberstandes. Die haftenden Monozyten werden wieder mit 1 ml MEM, enthaltend ebenfalls 10% Human-Serum, in Kontakt gebracht und dann in der Kultur belassen.

I. Nachweis der Einarbeitung der Myeloperoxidase in die Monozyten durch das Mikroskop

I.1 Verfahren

Die Monozyten werden mit 980 ng/ml halb-gereinigter Human-Leukozyten-Myeloperoxidase zusammengebracht. Nach 4- stündige Inkubation bei 37ºC wird das Kulturmedium MEM entfernt und die Monozyten werden mit dem Puffer PBS gründlich gereinigt. Die Monozyten werden anschließend durch starkes Rühren mit 1 ml des Puffers PBS abgelöst, dann zentrifugiert zur Bildung einer Abscheidung auf einem Mikroskop-Plättchen.
Die Plättchen werden mit einer Ethanol-Formaldehyd (9 : 1)-Lösung bei Umgebungstemperatur fixiert, anschließend mit Wasser gewaschen und dann an der Luft getrocknet. Die Peroxidase-Aktivität der Monozyten wird nachgewiesen durch Abscheidung einiger Tropfen einer Mischung von 1% Benzidin (30 ml), 4% Natriumnitroprussiat, verdünnt auf das 10-fache (0,3 ml), und 0,3 ml H&sub2;O&sub2;, verdünnt auf das 80- fache.
Nach 2-minütigem Kontakt bei Umgebungstemperatur werden die Plättchen mit Wasser gründlich gewaschen und dann an der Luft getrocknet.
In einer zweiten Stufe werden die Plättchen mit Giemsa gefärbt, um Zellen nachzuweisen. Die Plättchen werden anschließend mit dem Mikroskop betrachtet.

1.2 Ergebnisse

Vergleichs-Monozyten weisen nur eine geringe positive Reaktion gegenüber Benzidin auf. Nur einige Monozyten entwickeln eine leicht bräunliche Färbung, was ebenfalls zeigt, daß die Myeloperoxidase nur in geringer Menge in diesen Zellen vorhanden ist.
Dagegen reagieren Monozyten in einer 24-stündigen Kultur, die mit Myeloperoxidase in Kontakt gebracht werden, positiv und sehr stark auf Benzidin. Diese zuerst genannten Ergebnisse bestätigen die Einarbeitung der Myeloperoxidase durch einfache Phygozytose in die Monozyten.

II. Nachweis der Einarbeitung der Myeloperoxidase durch die Monozyten durch Radioimmunoassay

II.1 Verfahren

Nach dem Inkontaktbringen der anhaftenden Monozyten mit 1 ml des Puffers MOM, der die halbgereinigte Myeloperoxidase oder Bruchstücke von Neutrophilen, die durch die Ultraschallbehandlung erhalten wurden, enthielt (das Protokoll der vier Versuche ist im Detail in den Ergebnissen beschrieben), wird die überstehende Flüssigkeit abgetrennt, dann 10 min lang mit 2000 UpM zentrifugiert, um die Monozyten zu gewinnen, die gegebenenfalls abgelöst werden (Rückstand 1).
Die anhaftenden Monozyten werden durch wirksames Rühren mit 1 ml des Puffers PBS abgelöst. Sie werden anschließend dem Rückstand 1 zugegeben, dann 10 min lang bei 4ºC mit 2000 UpM zentrifugiert. Nach 3-maligem Waschen mit dem Puffer PBS werden die Zellen gezählt, dann werden sie verdünnt, so daß man 3 Millionen Monozyten pro ml erhält.
Die Myeloperoxidase der Monozyten wird solubilisiert, indem man die Zellen mit Cetyltrimethylammoniumbromid (0,01%) behandelt, und durch zweimaliges aufeinanderfolgendes Einfrieren.
Nach Rückkehr zu Normaltemperatur werden 100 ul aus dem Medium entnommen zur quantitativen Bestimmung des Enzyms nach einem spezifischen Radioimmunoassay-Verfahren (10).

II.2 Ergebnisse

Versuch 1

3 Millionen Monozyten in der Kultur innerhalb von 24 h werden 2 h lang mit 1 ml des Kulturmediums MEM in Kontakt gebracht, das enthält:
a) MPO1 = halbgereinigte Myeloperoxidase in einer Konzentration von 980 ng/ml
b) MPO2 = 50 ul einer konzentrierten Suspension von Bruchstücken von mit Ultraschall behandelten Neutrophilen. Myeloperoxidase Zunahme des intrazellulären Gehaltes Monozyten
Der Grundgehalt an Monozyten, der nicht mit der Myeloperoxidase in Kontakt gebracht wurde, beträgt 80 ng/ml. Nach 2-stündiger Inkubation mit der halbgereinigten Myeloperoxidase bleibt der intrazelluläre Gehalt an Myeloperoxidase der Monozyten unverändert. Dagegen ist eine starke Zunahme (447% des Grundgehaltes) der intrazellulären Konzentration an Myeloperoxidase zu beobachten, wenn die Monozyten mit Bruchstücken von Neutrophilen in Kontakt gebracht werden. Diese zuletzt genannte Beobachtung zeigt, daß die Monozyten sehr wohl in der Lage sind, Bruchstücke von Neutrophilen zu phagozytieren.

Versuch 2

Die Bedingungen sind identisch mit denjenigen in dem Versuch 1, jedoch mit der Ausnahme, daß die Inkubationszeit 4 h beträgt. Diesmal stellt man eine deutliche Zunahme (440%) des intrazellulären Gehaltes an Myeloperoxidase der Monozyten fest, die mit dem Enzym in Kontakt gebracht worden sind. Desgleichen werden die Bruchstücke von Neutrophilen noch besser phagozytiert als in dem vorhergehenden Versuch, da eine Zunahme des intrazellulären Gehaltes an Myeloperoxidase um 2070% auftritt. Myeloperoxidase Zunahme des intrazellulären Gehaltes Monozyten

Versuch 3

Die nachfolgende Tabelle zeigt, daß Monozyten in einer 48-stündigen Kultur die Myeloperoxidase oder die Bruchstücke von Neutrophilen nach 2-stündiger Inkubation besser einarbeiten als Monozyten in einer 24-stündigen Kultur. Myeloperoxidase Zunahme des intrazellulären Gehaltes Monozyten

Versuch 4

Monozyten in einer 24-Stunden-Kultur werden dismal 2 h lang und 6 h lang mit 1 ml Kultur-Puffer, der 3920 ng/ml halbgereinigte Myeloperoxidase (MPO3) enthält, in Kontakt gebracht. Myeloperoxidase Zunahme des zellulären Gehaltes Monozyten Inkubation
Nach 2-stündigem Inkontaktbringen mit dem Enzym erhöht sich bei den Monozyten ihr intrazellulärer Gehalt auf 150%, während in dem Versuch 1 dieser Gehalt unverändert bleibt. Die Erhöhung ist noch deutlicher nach 6-stündem Inkontaktbringen. In diesem Versuch wurde auch in den Monozyten die enzymatische Aktivität der Myeloperoxidase, bestimmt durch Oxidation von o-Dianisidin in Gegenwart von H&sub2;O&sub2;, bestimmt. Der Grundgehalt von 0,6 U/ml nimmt in dem Maße zu, in dem die Kontaktzeit ansteigt (doppelter Wert nach 6 h). Diese Feststellung ist der Nachweis dafür, daß die exogene Myeloperoxidase, die den Monozyten einverleibt worden ist, enzymatisch aktiv bleibt.

III. Zytotoxizität der Monozyten denen die Myeloperoxidase einverleibt worden ist, gegenüber Schistosomen

III.1 Verfahren

Die Schistosomen werden aus Zerkarien unter Anwendung einer künstlichen Methode isoliert (Filtration durch ein Stück Haut einer Maus). Es wurde das folgende Versuchsprotokoll eingehalten: 24 h alte Monozyten werden 2 h lang mit der Myeloperoxidase inkubiert, dann mit dem Kulturmedium MEM gründlich gewaschen. Anschließend werden die Monozyten, die mit der Myeloperoxidase behandelt worden sind oder nicht behandelt worden sind, 6 h lang mit dem Serum eines Patienten, der von Bilharziose befallen war (10%) oder mit einem Serum eines gesunden Patienten (10%), das zur Kontrolle diente (Eigeneffekt des Serums), inkubiert. Die vorher mit Myeloperoxidase behandelten oder nicht behandelten Schistosomen werden anschließend dem Kulturmedium zugegeben. Nach 16 h werden die lebenden und toten Schistosomen gezählt und auf diese Weise wird der Prozentsatz der Zytotoxizität der Monozyten bestimmt. Monozyten: 100 bis 200 000 Zellen in einer 24-stündigen Kultur Versuch 5 gesundes Serum Schistosomen Ablesung Bilharziose-Serum
Diese Ergebnisse zeigen, daß die Zytotoxizität der Monozyten, denen vorher MPO 1 oder MPO 2 einverleibt worden ist, gegenüber Schistosomen in Gegenwart eines Bilharziose-Serums um 50% erhöht ist, bezogen auf die Vergleichs-Monozyten. Der tatsächliche Prozentsatz der Zytotoxizität wird erhalten, indem man den mit dem gesunden Serum erhaltenen Wert abzieht (Eigeneffekt des Serums) von dem Wert, der mit dem Beilharziose-Serum erhalten wurde. Zytotoxizität der Monozyten Bilharziose-Serum gesundes Serum reale Zytotoxizität

Versuch 6

In diesem Versuch wurde die Zytotoxizität von Monozyten, denen die Myeloperoxidase einverleibt worden ist oder nicht einverleibt worden ist, gegenüber normalen Schistosomen (Stimulus 1) und gegenüber Schistosomen, die vorher 2 h lang mit 980 ng/ml Myeloperoxidase in Kontakt gebracht worden waren (Stimulus 2) verglichen. Zytotoxizität der Monozyten Stimulus Bilharziose-Serum gesundes Serum reale Zytotoxizität
Die mit der Myeloperoxidase nicht behandelten Monozyten weisen eine Zytotoxizität auf, die von 23,5 auf 40,5% steigt, wenn sie mit Schistosomen in Kontakt gebracht werden, die mit Myeloperoxidase bedeckt sind.
Obgleich das Modell verschieden ist (in diesem Fall töten die Monozyten nicht die Schistosomen durch Phagozytose, sondern durch einfaches Anhaften an denselben), stimmt diese Beobachtung überein mit den früheren Arbeiten, die zeigen, daß die Zytotoxizität der Makrophagen ansteigt, wenn der phagozytierte infektiöse Organismus (T. gondii) mit einer Peroxidase bedeckt ist (3,6).
Die Kombination von Monozyten, denen die Myeloperoxidase einverleibt worden ist, mit Schistosomen, die mit dem Enzym bedeckt sind, erlaubt die Erzielung einer sehr hohen Zytotoxizität (64%).
(Agranulozytose) oder erworbenen Immundefiziten (AIDS) leiden.

Literaturstellen

1. J.M. Zgliczynski, T. Stelmaseynska, J. Domanski und W. Ostrowski, "Chloramines as intermediates of oxidative reaction of amino acids by myeloperoxidase", in "Biochim. Biophys. Acta", 1971, 235: 419-424.
2. A. Dos, R. Wever und D. Roos, "Characterization and quantification of the peroxidase in human monocytes" in "Biochim. Biophys. Acta", 1978, 525 : 37-44.
3. R.M. Lochsley, C.S. Nelson, J.E. Fankhauser und S.J. Klebanoff, "Loss of granule myeloperoxidase during in vitro culture of human monocytes correlates with decay in antiprotozoa activity" in "Am. J. Trop. Med. Hyg", 1987, 36(3) :541-548.
4. L. Hoifets, I. Katsuyuki und G. Mayer, "Expression of peroxidase-dependent iodination by macrophages ingesting neutrophils debris" in "J. Reticuloendothel Soc.", 1980, 28(3):391-404.
5. O. Atwal, "Cytoenzymological behavior of peritoneal exudate cells of rat in vivo" in "J. Reticuloendothel Soc.", 1971, 10 : 163-172.
6. R.M Locksley, C.B. Wilson und S.J. Klebanoff, "Role of endogenous and acquired peroxidase in the toxoplasmacidal activity of murine and human mononuclear phagocytes", in "J. Clin Invost", 1982, 69 : 1099-1111.
7. P.G. Ramsey, T. Martin, E. Chi und S.J. Klebanoff, "Arming of mononuclear phagocytes by eosinophil peroxidase bound to staphylococcus aureus" in "J. Immunol.", 1982, 128 : 415-420.
8. N.H. Nogueira, S.J. Klebanoff und Z.A. Cohn Teruzi, "Sensitization to nacrophage killing by eosinophil peroxidase" in "J. Immunol.", 1982, 128 : 1705-1708.
9. C.F. Nathan und S.J. Klebanoff, "Augmentation of spontaneous macrophage-mediated cytolysis of eosinophil peroxidase" in "J. Exp. Med.", 1982, 155 : 1291-1308.
10. G. Deby-Dupont, J. Pincemail, A. Thirion und C. Deby, "A radioimmunoassay for polymorphonuclear leucocytes myeloperoxidase: preliminary results" in "Arch. Int. Physiol Biochim.", 1987 (im Druck).

Claims

1. Biologisch aktive Human-Myeloperoxidase, hergestellt durch Kultivierung von Eukarioten-Zellen, die durch einen Expressionsvektor der hMPO in den genannten Zellen transformiert worden sind, unter Ausschluß des natürlichen Enzyms.

2. Human-Myeloperoxidase nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie durch Kultivierung von Insekten- oder Säugetier-Zellen hergestellt worden ist.

3. Kassette zur Expression der Human-Myeloperoxidase, die besteht aus dem Fragment HindIII/SnaBI, HIndIII/EcorV oder HindIII/HpaI, welches die für hMPO codierende Sequenz trägt, wie sie in der Fig. 1 dargestellt ist.

4. Klonierungsvektor-Plasmid, das eine Kassette nach Anspruch 3 enthält.

5. Expressionsvektor in Eukarioten-Zellen, der eine Kassette nach Anspruch 3 enthält.

6. Rekombinantes Transfer-Plasmid für Baculovirus, das die cDNA der hMPO unter der Kontrolle des Polyhedrin-Promotors enthält.

7. Plasmid pNlV2704, wie es in der Fig. 5 dargestellt ist.

8. Insektenzellen, die durch ein Plasmid nach den Ansprüchen 6 und 7 und die Wild-Virus-DNA kotransfektiert worden sind.

9. Insektenzellen von Spodoptera frugiperda, die durch ein rekombinantes Baculovirus infiziert worden sind, das aus einem Plasmid nach den Ansprüchen 6 und 7 erhalten wurde.

10. hMPO, hergestellt durch Kultivierung von Insektenzellen von Spodoptera frugiperda, die durch einen Expressionsvektor in den genannten Zellen nach Anspruch 9 transfektiert worden sind.

11. Expressionsvektor der hMPO in CHO-Zellen, der die Kassette HindIII/SnaBI enthält, welche die für hMPO codierende Gesamtsequenz trägt, wie in der Fig. 1 dargestellt.

12. Plasmid nach Anspruch 11, das besteht aus dem Plasmid pNIV2703, dadurch gekennzeichnet, daß es die Kassette HindIII/SnaBI enthält, die das für hMPO codierende Gen trägt, das in einen Vektor pTN inseriert worden ist, indem man, wie in der Fig. 6 dargestellt, die Kassette HindIII/SnaBI, welche die für ht-PA codierende Sequenz trägt, durch diejenige, die für hMPO codiert, ersetzt.

13. hMPO, hergestellt durch Kultivierung von Säugetierzellen, insbesondere CHO-Zellen, die durch einen Vektor nach den Ansprüchen 11 und 12 transfektiert worden sind.

14. Arzneimittel, das besteht aus rekombinanter hMPO nach einem der Ansprüche 1, 2, 10 und 13.

15. Arzneimittel, das besteht aus einer chemischen Verbindung, die aus dem konjugierten Human-Myeloperoxidase- Enzym aufgebaut ist.

16. Arzneimittel nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Myeloperoxidase durch kovalente Kupplung oder Komplexbildung mit einem Transporteur (Träger), der eine Affinität für die Makrophagen aufweist, konjugiert ist.

17. Arzneimittel nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Transporteur (Träger) mannosyliertes Human- Albumin oder ein Antikörper oder ein Antikörperfragment ist, wie z. B. der konstante Teil Fc, der gegen Rezeptoren gerichtet ist, die auf den Makrophagen vorliegen.

18. Arzneimittel nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Myeloperoxidase in Liposome eingekapselt ist.

19. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 14 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Myeloperoxidase hergestellt worden ist nach der rekombinanten DNA-Methode nach einem der Ansprüche 1 bis 13.

20. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 15 bis 19, das geeignet ist für die Bekämpfung von Infektionen im Innern von Makrophagen.

21. Verwendung der freien Human-Myeloperoxidase oder des Medikaments nach einem der Ansprüche 15 bis 20 zur Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen für die Bekämpfung von Infektionen im Innern von Makrophagen.

22. Verwendung der freien Human-Myeloperoxidase oder des Arzneimittels nach einem der Ansprüche 15 bis 21 zur Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen, die insbesondere geeignet sind für die Behandlung von Immundefekten, die insbesondere verursacht worden sind durch AIDS, Verbrennungen und Bestrahlungen.

23. Pharmazeutische Zusammensetzung, die als Wirkstoff (aktives Prinzip) ein Arzneimittel nach einem der Ansprüche 15 bis 21 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger enthält.

24. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 23, die geeignet ist für die Behandlung von Immundefekten, die insbesondere durch AIDS, Verbrennungen oder Bestrahlungen hervorgerufen worden sind.