CA1340915C - Myeloperoxydase humaine et application therapeutique - Google Patents

Abstract

La présente invention a pour objet la myéloperoxydase humaine, sa préparation par génie génétique et son utilisation à titre de médicament pour lutter contre les infections à l'intérieur des macrophages.

Description

La presente invention concerne 1'enzyme myelo-~eroxydase humaine (hMPO) sa preparation par genie genetique et sc>n uti=Lisation a titre de medicament. Elle concerne donc egalement son utilisation pour la fabrica-tion de compositions pharmaceutiques en contenant ainsi que les compositions pharmaceutiques elles-memes.
Plus precisement, 1'application therapeutiaue visee a pour objet 7.e traitement des immunodeficients en therapie humaine par le renforcement de 1'activite anti-microbienne au niveau des macrophages, et ceci daps tous les cas d'im.munodeficiences qu'elles soient occa-sionnees notamment par le SIDA, les br~lures ou les ir-radiations.
La resistance a 1' infection par les micro-organismes met en oE~uvre des fonctions non-specifiques (action d'enzymes, pFi, paroi epitheliale) et des re-ponses immunitaires adaptatives des cellules lympho-cytes B et T.
Les fonct:LOns non specif iques emp~chent 1'in-vasion de la m.ajorii;e des agresseurs. Cependant, lors-que cette premiere :Ligne de defense cede, le systeme phagocytaire entre en jeu, detruit les agents infec-tieux et stimu.le les fonctions,d'immunite conferees par les cellules E~ et T..
Toute anoiaalie, hereditaire ou acquise, ~u systeme phagocytairE~ a des consequences graves ~uisque W

meme les micro-organismes normalement peu pathogenes y echappent et decle~nchent des infections recurrentes.

Par ailleu.rs, touts deficience du systems immunitaire lu:i-mime, au niveau des cellulea T ou H, conduit a une suscep~tibilite exacerbee aux infections virales et bacteriennes intra- ou extracellulaires.

Ces deficiences peuvent ~tre hereditaires ou acquises (ex : SIDA = di3f icience elective en cellules T). La plupart des pe:rsonnes souffrant de ces deficiences su-'10 bissent 1'infe:tion d'organismes opportunistes (bacte-ries, protozoa:ires, etc. ).

Dans 1'ensemble des cas d'immunodepression, il est done somhaitable que le systems phagocytaire soft aussi eff:icace que possible pour limiter les conse-'15 quences des ag:ressions exterieures. Accessoire en condi-tions normales, la phagocytose revet un caractere essen-tiel lorsque la reponse immune H et T s'affaiblit.

Parm:i les cellules associees d la reponse im-munitaire, les leucocytes polymorphonucleaires repre-20 sentent un intE~r~t particulier dens le contexts de la lutte contra les infections. Ces cellules contiennent une enz9me, la myeloperoxydase, dont f action microbi-cide est bien documentee. Les polynucleaires ne pre-sentent aucune speci.ficite vas-a-vas d'un antigens, mais 25 ~ouent u.n r3le essen.tiel en cas d' infla~ation aigue, avec les anticorps et le systems du complement, dens la defense de 1'hi3te contra les micro-organismes. Leur fonc-tion principals est la phagocytose. Au cours de ce pro-cesaus, les micro-organismes sont inclus dens des va-30 cuolea (phagosomes) qua fusionnent avec les granules con-tenant la myeloperox:ydase pour former les phagolysosomes.

Au cours de la phagocytose, 1'activite enzymatique de la myeloperoxydasc~ conduit a la formation d'HOC1, un com-pose bactericide (acids hypochloreux) puissant; cette 35 activate requi~srt H2;02 (eau oxygenee), qua apparait dans le polymorphonucleaire lors de sa stimulation par di-vers agents et notamment par les reactions immunologi-ques provoqueea par les micro-organismes. Z'acide hypo-chloreux est oxydant par lui-mime, mais produit des de-rives plus o~~dants encore, les chloramines. Enfin, reagissant ave3c H202, dont il est iasu, il produit une forma d'oxygene extr~mement oxydante, 1'ox~gene singulet.
Le proble:me ma j eur se s itue toutefo is au ni-veau des macrophages. En effet le macrophage est une 1o tres grande ce:llule, plus robuste qua le polymorphonu-cleaire, capat~le, a 1'instar de ce dernier, de phagocy-ter les micro-~organismes. I1 poss~de egalsment un sys-t~me generateur d'H~~02, mail nest cependant pas capable de produire la. n~yeloperoxydase. Cette deficience diminue son eff icacite defensive. On a decouvert toutefois salon 1'invention, q.ue les macrophages peuveat incorporer et utiliser la myeloperox9dase qui rests active apres pene-tration daps l.es macrophages, acquisition completant ef-ficacement leur arsenal cytolytique et bacteriolytique, en particulier pour la destruction d'agents infectieux divers affectant les patients immunodeprimes.

i;.~

Ouoiq~~e la a~yeloperoxydase une fois dans le plasma soit tree vita cap~tee par les macrophages, des systemes d'ad-ministration speci:fiques delivrant de fagon optimale 1'enzyme danev les macrophages, peuvent etre utilises salon 1'invemtion, realisant dee conjugues de is myelo-peroxydase pair coup lags covalent avec un transporteur presentant un.e aff:inite pour les macrophages. On peut citer a ce ti.tre des transpo rteurs tale qua 1'albumine humaine mannosylee mais aussi des anticorps ou fragments d'anticorps tels qua la partie constants Fc diriges contra des recepteurs presents sur les macrophages.
D'autres systemes consistent a coupler par complexation non covalente ou par manipulation d'ADN
un anticorps ou fragment d'Ac specif ique du macrophage a 1'enzyme myeloperoxydase humaine pour obtenir un"com-plexe immun't L'adminis tration de tale conjugues ou com-plexes immuns conduit au ciblage de la 1'~0 humaine vers le macrophage, a son ingestion par phagocytose et a la liberation de 1'enzyme sous forma active a 1'interieur du macrophage, son site d'action privilegie, ou ells participe a la lutt;e contra les infections.
Dane le <;as des complexes immune prepares par genie genetique, 1"ADN codant pour la MPO active ou sous forma de precurseur natural est couple a 1'ADN codant pour un fragment d"immunoglobuline reconnaissant specifi-quement les ms~crophages.
A

La present;e invention a donc pour objet, a titre de medicament., un compose consistant dans 1'enzyme myeloperoxydase humaine.
L'invention a egalement pour objet, a titre de medicament, un compose consistant Bans un conjugue de la myeloperoxydase par couplage covalent ou comple-xation avec un transporteur presentant une affinite pour les macrophage~3, tels qua 1'albumine humaine manno-sylee ou un anticorp s ou fragments d'anticorps comma la partie constants Fc dirigee contra des recepteurs pre-sents sur les macrophages.
Un autre compose, objet de la presents inven-tion, delivrant la czyeloperoxydase de faCOn optimale vers les macrophageea, consists egalement dans des lipo-somas, notamment des liposomes biopolymerises, daps les-quels la myeloperoxydase se trouve encapsulee.
Les medicaments salon 1'invention sont en par-ticulier utiles pour lutter contra les infections a 1'interieur des mace~ophages.
De preference, 1'enzyme myeloperoxydase hu-maine, utilises salon 1'invention, est d'origine recom-binants, c'est-a-dire prepares par genie genetique.
En outre, la presents invention a pour objet 1'utilisation des composes salon 1'invention pour la fabrication de compositions pharmaceutiques utiles no-tamment pour le traitement des immunodeficiences occa-sionnees en particu7.ier par le SIDA, les brulures ou les irradiations.
Enfin, la presents invention a pour objet des compositions pharma<:eutiques comprenant, a titre de principe actif, les composes salon 1'invention.
Les compositions pharmaceutiques salon 1'in-vention peuvent se presenter sous differentes forges appropriees pour des formes d'administration diverses notamment par ~roie parenterale, systemique ou topic ~~ ou par injection i.ntra-veineuse daps la mesure ou les macrophages ci?:~les sont presents non seulement dans le sang mais aussi dans les autres zones de 1'organisme.
Les compositions pharmaceutiques selon 1'in-vention compor-tent alors outre le principe actif, des supports pharm;s.ceutiques acceptables pour la forme d'ad-ministration en cause.
L'administr ation parenterale de la myeloperoxydase ~ ~ cssel.on 1'invention est tr~s appropriee pour les divers syndromes immunod~pressifs.
La diminution ou la suppression des barrieres naturelles et immunitaires favorise 1'apparition d'infections dues a des germes pathogenes ou opportunistes.
Les ~ieficiences du systeme immunitaire (par exemple deficiences en cellules T, SIDA, irradiation, chimiotherapie anti-cancereuse...) sont souvent associees a des infections generalisees (batteries, mycoses, viroses, protozoaires ...) tres difficiles a controler avec les seuls agents antibiotiques et chimiotherapeutiques existants. Dans ces conditions, la myeloperoxydase peut aussi etre employee par voie systemique afin de renfor-cer 1'activite antiseptique des macrophages, au tours de la phago~~ytose. En effet, les resultats experimentaux indiquent que Les macrophal;es et les monocytes ont une activite cytolytique et bacteriolytique accrue en presence de 1'enzyme.
La myeloperoxydase, ou un compose selon 1'inven-tion, pent ~gal.ement etre administre(e) par applica-tion topique sur notamment des ulceres torpides, ou la microvasculariF~ation est deficiente (ulcere variqueux).
Pour cette application topique la myeloperoxy-dase sera incorporee par exemple daps de la pgte a 1'eau selon une formulation dermatologique connue. Au moment de 1'emploi on pourra proceder a un melange extemporane de la suspension de :uyeloperoxydase avec J

soit une solution cliluee de peroxyde d'hydrogene (con-centration 0,3 % par exemple) - soit une autre enzyme telle que la xanthine oxydase.
Dans ce cas il convie~nt d'ajouter a la suspension de S myeloperoxydase une concentration 10-3M d'hypoxanthine et eventuellement de chlorure d'ammonium. Ce melange de pates produit u.a dega~gement de HC10 et une formation de chlorure d'amine, particulierement efficace pour le net-toyage des plaies toz~pides.
D'autres indications therapeutiques sont envisageables par voie topique I. L'utilisation de la myeloperoxydase est interessante dans la prevention et le traitement des infections intercurrentes au tours des brulures thermiques, chimiques ou par irradiation.
1 S 2~ La fonction phagocytaire apparait deficitaire au tours de 1'eczema atopique. Dans ce cas, 1'application locale de l'enzyme peut avoir une action stimulante benefique sur les macrophages et les monocytes cutanes.
3. La myeloperoxydase peut avoir un role adjuvant dans le traitement des infections gingivales, que ce soit chez les sujets immunodeprimes ou au tours des parodontoses~.
r .rr Selon 1'invention la myeloperoxydase pent etre obtenue par purification analytique a partir de leucocytes polymorphonucleaires.
Neanmoins avantal;eusement 1'enzyme myeloperoxydase humaine utilisee sera produite par ;genie genetique avec la technologie de 1'ADN recombi nant.
Pour ce faire, les etapes essentielles sont construction d'un banque de clones d'ADNc representative des produits synthetises dan s les cellules leucocytaires et criblage de cette banque avec une sonde appropriee caracteristique de la myeloperoxydase humaine. A 1'issu de cette operation, on obtient un clone ADNc codant pour 1'enzyme.
2) 1'ADNc myeloperoxydase dolt alors etre manipule pour permettre son expression dans divers systeme hotes/vecteurs. Une construction modulaire s'impose si~ 1'on veut etre capable d'evaluer 1'expression dans les systemes aussi varies que E. coli, la levure, les cellules de mammiferes ou les cellules d'insectes. L'obtention dune enzyme active, correctement assemblee et processee, est fait avantageusement dans des systemes de cellules eucaryotes.
La pre~sente invention a donc egalement pour objet la hMPO
produite par culture' de celJLules de prokaryotes ou d'eukaryotes transformees par un vecteur d'expression de la hMPO dans lesdites cellules.
Avantageusement, la hMPO selon 1'invention est produite par cultures de cellules d'eukaryotes superieurs notamment par des cellules d'insectes ou de mammiferes.
Pour ce faire, la presente invention a pour objet 1 ) une cassette d'expression HindIII/SnaBI, HindIII/EcorV ou HindIII/HpaI de 2261 pb portant la sequence codante pour la hMPO telles que representees sur la figure l, ainsi que le plasmide pNIV2702 contenant lesdites cassettes, 2) un vecteur d'expression dans des cellules de prokaryotes ou de d'eukaryotes comportant ladite cassette, et en particulier 3) un plasmide de transfert recombinant pour Baculovirus contenant 1'ADNc de hMPO sous le controle du promoteur de polyhedrine, notamment 4) le plasmide pNfV2704 de la figure 5, 5) les cellules d'insectes, notamment de spodoptera frugiperda tels que les cellules Sf9 co--transfe~~tees par un vecteur selon 1'invention avec de 1'ADN viral sauvage et notamment co-transfecfectees par le plasmide pNIV2704, 6) des cellules d'insectes, notamment de spodoptera frugiperda tels que Sf9 infectees par un Baculovirus recombinant obtenu par un vecteur selon 1'invention, notamment a partir du plasmide pNIV2704, 7) la hMPO produite par culture de cellules d'insectes notamment de spodoptera frugiperda gels que Sf9 modifiees par un vecteur d'expression dans lesdites cellules selon 1'invention, 8) un vecteur d'expression dans des cellules de mammiferes, notamment des cellules CHO contenant la cassette HindIII/SnaBI de la figure l, notamment 9) un plasmide pNIV2703, 10)des cellules de mammi:feres, notamment des cellules CHO transfectees par un vecteur d'expression dans lesdites cellules selon 1'invention, notamment par le plasmide pNIV2703, 11)la hMPO produite par culture de cellules de mammiferes, notamment de CHO transfectees par un vecteur d'expression dans lesdites cellules selon 1'invention.
La de~;cription detaillee qui va suivre est destinee a illustrer d'autres caracteristiques et avantages de la presente invention.
L_a figure 1 represente la cassette HindIII/HpaI de 2261 pb contenant les sequences codant pour la myeloperoxydase humaine et cassette HindIII/Sn~3BI.
s l0 13409 15 La sE~quence codante commence a 1'ATG specifiant la methionine N-terminate (Met) et se termine par le codon stop TGA ( * x-~).
Les sequences en gras representent les oligonucleotides synthetiques ajoutes en 5' et en 3' de 1'ADNc de la hMPO.
La figure 2 represente la fixation de serums de lapins en ELISA sur MPO.
La figure 3 represente la fixation de serums de souris en ELISA sur MPO.
La figure 4 represente une courbe standard de test ELISA de detection de la m yeloperoxydase humaine.
La figure 5 represente la construction du vecteur pAcYMl/
MPO11 selon 1'invention (plasmide de transfert pour Baculovirus).
La figure 6 represente la carte du vecteur Tnd a partir duquel est construit le plasmide pNIV2703 selon 1'invention.
Les 3 cassertes dirigent respectivement 1'expression des marqueurs de selec~rion DHFR et Neon, ainsi que celle d'un ADNc etranger (daps le cas illustre ci-dessus, il s'agit du t-PA). Cette derniere cassette peut etre substitue~° par une cassette codant pour tout ADNc approprie, en tirant parti des sil:es de restriction uniques flanquant la cassette t-PA.
Abreviations SV early : promoteur precoce de SV40 ;
5 : extensions non codantes en 5' ;
3 : extensions non codantes en 3' ;
SV : region de polyadenyl.ation de SV40 ;
Rous LTR : sequence repetee terminate (tongue) derivee du virus du sarcome de F;oux ;
bGH : region de polyadenylation du gene de 1'hormone de croissance bovine ;
Betablopro : promoteur principal de la ~-globuline murine.
:,' .

11 ~ 3 4 0 9 15 Exemple 1 . rp epa.ration de la hP2P0 par ctenie geneti~ue A. Construction dune casse_rte contenant 1'enti'rete d . 'guen PS ~nr~ant pour la ~elc~peroxvdase maine flanq~P de sites de restric ion ah~Pr,r~
de 1' ADNc de la m~Plc~peroxvdase ( MPO ) .
1. But . Obtention dune cassette HindIII/Hpal contenant les sequences codant pour la MPO humaine et inserable dans differents vecteurs d'expression.
2. Materiel de departs : - Le plasmide bacterien pMP062 contenant un ADNc de la MPO humaine complet (.Johnson et a1.,1987, Nucleic Acids Research 15, 2013-2026);
- un vecteur de clonage quelconque contenant des sites de restriction adequats. Notre choix s'est porte sur le plasmide pTNDPC2, un plasmide derive du pTND (Connors et a1.,1988, DNA i, 651-661~Le plasmide pTNDPC2 nest pas essentiel a 1'obtention de la dite cassette; il aurait ete parfaitem.ent possible d'utiliser un autre vecteur de clonage contenant les sites de restriction necessaires tel que le plasmide pJRDl84 (Heusterspreute et al., Gene 39 (1985) 299-309).
3. Obtention d'olig_onucleotides par synthese chimig_~e.
- Pour obtenir un site HinciIII directement en amont de 1'ATG de la hMPO, nous aeons choisi de synthetiser, grace a des methodes chimiques bien connues dans notre domaine, une paire d'oligonucleotides qui une fois rehybrides entre eux, contiennent, dans le sens 5'- 3' de la fibre codante, un site de restriction HindIII, les bases ACC, les sequences codant pour les 11 premiere acides amines et la lere base du triplet du douzieme acide amine de la hMPO, qui est a cheval sur un site s~sll. Ces oligonucleotides sont denomaies MPOIII et MPOIV tschema 1 ci-apres) .
- Pour obtenir un site Hpal en aval du codon stop de la hMPO, un~ deuxieme paire d'oligonucleotides a ete synthetisee. Une fois rehybrides, ceux-ci sy ~.-z._~

presentent, dans le sens ~'-3' sur la fibre codante, les deux dernieres bases du triplet de 1'acide amine 731, la sequence codant pour les 14 derniers acides amines de 1a hMPO, un codon stop (TGA) different du codon stop naturel de la hMPO et quinze bases contenant un site EcoRV, un site SnaBI et le complement d'un site Hpal. Ces oligonucleotides sont denommes MPOI et MPOII (schema 1 ~i-apr~s! .
4. Sous-clona~es.
Sous-clonage 1 Un fragment Nsll/BgZII de 2053 pb (paires de bases) a ete extrait du plasmide pMP062. Ce fragment; et le fragment synthetique HindIII/Nsil de 42 pb obtenu par rehybridation des oligonucleotides MPOIII et MPOIV ont ete ligues a un fragment HindIII;'BgZII de 6755 pb du pTNDPC2. Le plasmide pscMP01 resultant a ete introduit dans la souche d'Escher~ichia coZi MM294, suivant une methode bien c:onnue, dans le but de produire le plasmide pscMP01 en plus grande quantite. Le plasmide pscMP01 contient ainsi un fragment de 2095 pb allant d'un site HindIII a un site BgZII situe approximativement a 1'acide amine 696 de la hMPO.
Un fragment Xbal/Pstl de 1825 pb a ete extrait du plasmide pMP062.
Ce fragment et le fragment synthetique Pstl/Hpal de 62 pb obtenu par rehybridation des oligonucleotides MPOI et MPOII ont ete ligues a un fragment Xbal/Hpal de 3283 pb du TNDPC2. Le plasmide pscMP02 resultant a ete introduit dans la souche d'Escherichia coZi MM294 dans le but de le produire en plus grande quar~tite.
Le plasmide pscMP02 contient. donc un fragment de 1887 pb allant d'un site Xbal debutant par la premiere base de 1'acide amine 123 de la hMPO a un site Hpal.
:'r 5. Construction du plasmide pNIV2702 a partir des pscMP01 et ~scMP02.
Pour finalement obtenir 7_a cassette hMPO HindIII/Hpal, un fragment HindIII/Xbal de 374 pb contenant la sequence codant pour les acides amines 1 a 122 de la hMPO et un fragment Xbal/Hpal de 1887 pb contenant la sequence codant pour les acides amines 123 a 745 de la hMPO ont ete extraits respectivement des plasmides pscMP01 et pscMP02. Ces deux fragments ont ensuite ete religues a un fragment HindIII/Hpal de 5165 pb du TNDPC2 pour obtenir le plasmide pNIV2702.
Le plasmide pNIV2702 cont.Lent done une cassette HindIII/Hpal de 2261 pb portant 1'entierete des sE~quences codant pour 1a hMPO (Fig.1). Cette cassette peut aisem.ent et: re extraite et transferee daps differents vecteurs d'expressicn pour cellules d'ovaires de hamster (CHO) ou pour cellules d'insectes (Spodoptera frugiperda) via le baculovirus.
P I
StOD
GTACACTTCCTGCA.TTGAAC(:TGGCTTCCTGGAGGGAAGCCTCCT~TATCTACGTATGGTT 3' 3' ACGTCATGTGAAGGACGTAACTTG(aACCGAAGGACCTCCCTTCGGAGGACTATAGATGCATACCAA 5' MPOII
Pstl EcoRV SnaBI Hpal 3' terminus MPO
MP III
5' AGCTTACCA'II~GGGGTTCCCTTCTTCTCTTCTCTCAGATGCA 3' 42-mer 3' ATGGTP,CCCCCAAGGGAAGAAGAGAAGAGAGTCT 5' 34-mer MP I
HindIII Nsil 5' terminus MPO
r :;i B. Mise au point d''un test ELISA pour la detection de myeloperoxydase nature:lle et recombinante.
a) Obtention d'anticorps anti-MPO
Des serums anti-M:PO ont ete obtenus chez le lapin et la souris. Its ont ete teates en ELISA sur MPO. (La plaque est Goatee avec MPO et saturee a la BSA. On y ajoute les anticorps a testier, puffs un conjugue phosphatase alcaline anti-Ig). Dans l.es deux Gas, on obtient un titre d'anticorps anti-MPO au moina 8,000 fois plus eleve dans le serum immun que dans un seruia normal ( Figs . 2 et 3 ) .
b) Mise au point du vtest Un test "en sandwich" a ete realise en utilisant des Ig de lapin anti-MPO (Pro:aan-Dakopatts A398) et un de nos serums de souris anti-MF~O. La plaque est Goatee avec les Ig de lapin a 7, 6 gamma/ml clans PUBS pH 7.8, une nuit a 4 °C. Elle est saturee par 1% BSA daps PBS pH 7.8 Tween 20 0,05% 1h40 a temperature ambiante. Les echantillons a tester sont laisses 2h a temperature ambiante, puffs le serum de souris, dilue 1000 fois dans la solution de saturation, 2h a temperature ambiante, enfin :Le conjugue Fab2 de lapin anti-Ig de souris-phosphatase alca:Line (:Prosan-Dakopatts D314) dilue 1000 fois dans du tampon TBS (Tris-HC1 0,05M pH 7.5, NaCl 0,15M) contenant 1% BSA et 0,,05% Tween 20. Entre chaque etape la plaque est lavee 5 fois avec soit TBS Tween 20 0, 05 % (avant et apres la raise du conjugue), soit PBS Tween* 20 (autres etapes). La revE:lation se fait grace a une solution de para-nitrophenyl phosphate :1 mg/ml dans 10% diethanolamine, 0,01%
MgCl2 6H20, 0,02% NaN3 pH 9.8, et 1'arret de la reaction par NaOH 3M. La lecture se fait a 410 nm. La figure 4 montre une courbe de fixati~~n d'u.ne MPO pure (Green Cross Corporation) diluee daps un ~~urnageant de culture de cellules d'insecte SFMJ (milieu TC100 ave:c 10% FCS) . On voit que le test est utilisable pour closer 7_a MPO dans une gamme de concentrations comprises entre 0,1 ng,/ml et 100 ng/ml.
*MARQUE DE COMMERCE

C) Clonage de 1'ADNc iyiPO dins le plasmide de tranfert pour Baculovirus L'ADN du plasmide de -transfert pAcYM1 (Baculovirus (ref.
Matsuura et al. J. Gen. Virol (1987) 68, 1233-1250 a ete li~
neari se par BamHI et melange au fragment d'ADN HpaI-HindIII de 2261 pb correspondant a la i!~O. Le melange a ete traite a la T4 ADN polymerise, ligue et utilise povur transformer des cellules competentes E. coli 1~I294. La selection des clones a ete faite par croissance sur ampicillir~.
Apres plusieurs restrictions enzymatiques contoles sur 48 clones, le clone 11 a ete identifie pour avoir 1'insert MPO cans la tonne orientation par rapport au promotew: de la polyhedrine (pNIV2704) (figure 5).
Les jonctions oli~;onucleotides synthetiques/MPO additionnees en 5' et en 3' au cDNA MPO lops des constructions precedentes ont ete confirmees par sequen~age de ces region:a. La methode de sequen~age sur ADN double brin avec la sequenase a ete utilisee.
"Co-transfection" eat '_'pla<<~ue assay"
Le plasmide recomt~inant :L1 a ete utilise en conjonction avec 1'ADN viral sauvage pour co-transfecter des cellules Spodoptera frugiperda (Sf9) en culture (Le protocole est bien connu et est detaille daps le manuel de M.D. Summers et G.E. Sm_Cth, "A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures, Texas University, College Station, 1987).
Les surnageants de cotransfection de fours 5 et 7, apres recombinaison homologue, ont ete util_Cses en "plaque assay" de maniere a avoir 100 a 1000 plages de lyse par bo3te. Les virus recombinants ne contenant pas de polyhedrine ont ete idE~ntifies 5 fours plus tard visuellement ou par hybridation d'ADN. 13 candidate ont ete repiques et purifies.

Test de production de ~1P0 recombinante Deux Baculovirus recombinants, denommes MPO1.1 et MP05.2 ont ete utilises pour infecter des cellu."Lee Sf9 et mesurer la capacite de celles-ci de produire de la myeloperoxydase. Dans lee deux cas, les cellules infectees secretent dare le milieu de culture une proteine reconnue specifiquement par lee anticorps anti myeloperoxydase et dont la quantite a ete evaluee par test ELISA a s 0,2 ug/ml. (Lee cellules infectees ont ete recoltees a la densite de lOb cellul.es/ml). Le produit recombinant a ete retrouve aussi dare 1'extrait cellulaire brut a raison de = 0,06 ugjl0°
ceilules.
. Co-transfection des cellules d'insectes Sf9 (Spodontera frugiperda).
Utilisation du vecteur recombinant construit (pNIV2704) pAcYM1/I~C~ 11 contenant la 1~0 em aval du promoteur baculovirus de la polyhedrine, 100 ~,g utilises en conjoncaion avec 1 ~,g d'ADN viral.
Technique de transfection au chlorure de calcium.
Utilisation du surna~;eant de 5 j de co-transfection pour le "plaque assay". Dilutions de -1 a -7; 5 boites par dilution.
. Utilisation du surnageant de ~j, dare lee memes conditions.
Les surnageants recoltE~s ont ete utilises pour produire des plages de lyse dare des monocouche~s de cellules Sf9 (infection des cellules - 3 millions par boite - par des dilutions du surnageant de co-transfection, pendant 60'. Enleve:r 1'inoculum et couler une couche d'agar a bas point de fusion 1,5% final. Recouvrir de milieu EX-Cell 400 J.R.Scientific addi tionne d'antibiotiques et laisser a 1'etuve a 28°C pendant 4 fours).
Coloration des boits~s au rouge neutre apres 4 j d'infection et hybridation des filtres avec un fragment d'ADN MPO marque au a32P r~c'.TP.
Repiquages de 13 candidate d'apres 1'autoradiographie.
Deux "plaque assay purification" ont ete realises ensuite successivement.
* !KARQUE DE COMME RCE
,:'.

'3409 15 D. Clonage de 1'AI)Nc hMPO daps le vecteur d'expression pTDN our cellules de mammiferes (CHO'i et introduction dans les cellules.
1. Protocols a- Obtention du vecteur d'expression NIV2703 Dans le but de faire produire la hMPO par des cellules ovar-iennes de hamster chinois (CF!0), nous aeons introduit la cassette HindIII/SnaBI de 2253 pb du pNIV2702 portant les sequences codant pour la hMPO entre les sites HindIII et Sr..aBI du vecteur d'expression mammifere pTDN. Le vecteur pTDN, dont ie Principe d'utilisation est identique au vecteur pTND
(Connors et al., 1988) dont il est issu, porte 2 genes encodant des marqueurs de selection jr°esistance a la neomycine (neophosphotransferase bacterienne, Neop} et dihydrofolate reductase (DHFR)] et une cassette d'expression de la molecule d'interet, dans ce cas, le ht-PA (activateur tissulaire du plasminogene humain). La manipulation decrite precedemment consiste done a remplacer la cassette HindIII/SnaBI portant 1'entierete des sequences codant pour le ht-PA par celle encodant la ~MPO. Ce remplacement une fois effectue, le plasmide recombinant obtenu, pNIV2703, a ete introduit dans la souche d'E.coli MM294 daps le but d'en purifier une quantite suffisante pour la transfection des cellules de CHO. La fig. 6 decrit schematiquement le vecteur d'expression pTND (Connors et al., 1988). Le vecteur pTDN correspond au vecteur pTND excepts le fait que la cassette DHFR a un ordre de lecture inverse et est localise entre l.a cassette n~o et la cassette t-PA.
b- Transfection par electroporation des cellules CHO
Grace a une di~3estion par 1'enzyme de restriction dot 1, les sequences d'origine bacterienne (PUC19 sur la fig. 5 ont ete separees du fragment portant les 3 cassettes d'expression pour cellules de mammiferes. Une fois A

digere, 1e vecteur ~~.'II':27J? est intrcduit par electroporation, :ne methode de transfection, daps des cellu'_es de CHO DHFR- suivant une methods analogue a cells decrite par Zerbib et al. (1985, Biochem. Biophys. Pes.
Comm. 1~9 , 611-618;. ':es cell!sles ont ensuite ete placees daps un milieu de croissance contenant du 6418, lequel ne permet pas aux ~=e11v1es r,'a~;primany pas la neophosphotransferase de survivre. Ainsi, apres a~e periods de 1 a 3 semaines, seules les cellules ayant acquis le gene ~aa selection adequat ports par le vecteur pNIV2703 survivent et se multiplient. Tes clones de cellules ainsi obtenus ont finalement ate testes pour 1'expression de~ la hMPO. Pour cela, le surnageant de c~nlture et un extrait cellulaire de chacun de ces clones a ete analyse grace a un test ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) permettant de qualifier et quantifier specifiquement la hMPO.
Les resultats indiquent que less ejones recombinants secretent dens le milieu de culture de la MPO recombin~nte. Le taux de production, estim~~ par El.ISA, est compris entre 0.1 et 1 mg par mI de surnage,ant.

,A

Exemple 2 . A~~lication th~ra eutique de la hMPO
Role de la myel. operoxydase leucocytaire La d,efense.de notre organisme contre des mi-croorganismes etrangers est assuree par les globules blancs ou leucocytes parmi lesquels on trouve les lym-phocytes qui produisent des anticorps, les macrophages, les eosinophiles et les neutrophiles (ou polymorphonu-cleaires) qui detrui.sent le microorganisme etranger par phagocytose. Au cours de celle-ci les neutrophiles 1o generent des especes oxygenees tree toxiques et bacte-ricides . 1'anion superoxyde, le peroxyde d'hydrogene, le radical hydroxyle~, 1'oxygene singulet.
L'action bactericide du peroxyde d'hydrogene (H202) est augmentee~ de mille fois par la myeloperoxy Base (I~0), enzyme l.ocalisee daps lee granules azuro philes (ou primaires) des neutrophiles. En effet, cette enzyme catalysis, en presence d'H202, 1'oxydation d'ion chlorure (C1-) pour gene rer de 1'acide hypochloreux (HOC1) (1) qui presente des proprietes bactericides.
r~o H20,~ + C1- - ~+ -> HOC1 + H20 Les monocytes qui sont lee precurseurs des macrophages posseden.t un mecanisme d'activite antimi-crobienne semb:lable aux neutrophiles mais ils ne pro-duisent que peu d'H202 et de plus ils possedent environ trois fois moins de myeloperoxydase que les neutrophiles (2). D'autre pairt, des experiences in vitro ont montre que, au cours de leur maturation en macrophages, ils 3o pendent totalement leur contenu en myeloperox9dase, ce qui se traduit egalement par une decroissance de 1'ac-tivite antibact;erienne (3). Ainsi des monocytes frai-chement isoles ont-ils une cytotoxicite de 90 % vis-a-vis de Toxopla:>ma g~ondii ingeres tandis que les ~acro-phages (10 fours de culture) ne presentent plus aue 12 % de cytoto~:ic ite .
Cependant :plusieurs travaux ont montre :ue les macrophages pou.vaient phagocyter des debris cellu-laires de neui;rophiles (4, 5) et acquerir ainsi une activite myeloperoxydasique, avec comme consequence une augmentation de la toxicite de la faible quantite de pe ~ xyde d'hydrogene produite par les macrophages.
D'autres etudes ont souligne 1'importance de 1'augmen-tation de 1'activitE~ peroxydasique des macrophages puisque, si les T gc~ndii soot prealablement incubes avec de la pervxydase d'eosinophiles de chevaux, les macrophages retrouve~nt alors une cytotoxicite de g0 %, equivalente a celle des monocytes (3, 6). Les memes observations o:at ete~ faites avec S. sureus ('7) ,le _T.
cruzi (8) ou des cel.lules tumorales (9).
MATERIELS ET METHOD~ES
Purification des monocytes humains.
50 m.l de sang d'un sujet normal sont preleves sur Calciparine~ (0,;5 m1 a 25 000 U/ml) puffs dilues de moitie avec du tampon PBS*0,01M pH '7,2. 35 ml de sang dilue sont alors deposes un gradient de densite cons-titue de 15 ml de Fi.coll-Paque*(Pharmacia).
Aprea une centrifugation a temperature am-biante a 1800 t/min pendant 30 minutes, les lymphocytes et les monocytE~s situes a 1'interface du gradient sont recuperes et conserves sur glace. Les cellules sont en-suite levees une premiere fois avec du tampon PHS puffs centrifugees a 2000 t/min pendant 10 minutes a 4°C.
L' operation est~ encore repetee deux fois puffs les cel-lules sont wises en culture.
Culture des monoc;ytes humains.
Les monocyl;es sont purifies par adherence sur verre. Dens des alveoles d'un diametre de 2,5 cm (Limbro), les cellules soat wises en contact avec 1 ml de milieu de culture 1'IEM contenant 10 / de serum humain. Apres une incubation a 3'7°C pendant 2 haures Bans une atmosphere a * MARQUE DE COMMERCE

% C02, les ~~ellul.es non-adherentes (lymphocytes) soot eliminees en enleva,nt le surnageant. Les monocytes adhe-rents sont re;~is en contact avec 1 ml de. MEM contenant egalement 10 ';o de :serum humain puffs laisses en culture.
5 I. Mise en evidence par microsco ie de 1'incornoration de la mye:L,operox~rdase dans les monocytes I.1 Methode Les monocytes soot mis en presence de 980 ng/ml de myeloperoxydase leucocytaire h~aine semi-purifiee. Apres 4 heures d'incubation a 37°C,le milieu de culture MEM est enleve et les monocytes soot laves soigneusement avec du tampon PHS. Les monocytes soot ensuite decroc:hes par agitation forte avec 1 ml de tampon PHS pu:is centrifuges de faCOn a former un dep3t sur une lame <ie microscope.
Les lames soot fixees par une solution d'e-thanol-formaldehyde (9:1) a temperature ambiante, la-vees ensuite avec de 1'eau puffs sechees a f air. L'ac-tivite peroxydasique des monocytes est wise en evidence en deposant sur la lame quelques gouttes d'un melange de benzidine 'I % (30 ml), de nitroprussiate de sodium 4%
dilue au dixie~me (0,3 ml) et 0,3 ml d'H202 dilue 80 foil.
AprE~s un contact de 2 minutes a temperature ambiante, les lames soot lavees abondamment avec de 1'eau puffs se<:hees a fair.
Dan:; une derniere etape, les lames soot colo-rees avec du Ciiemsa~pour la wise en evidence des cel-lules.
Les lames sont ensuite visualisees au micros-cope.
I.2 Resultats Des ,nonocytes temoins ne pr~sentent que tres peu de reaction positive a la benzidine.
* MAROUE DE COMMERCE.
:a Seuls quelque~; mono<:ytes developpent une coloration l~gerement bru.natre, demontrant bien ainsi que la myelo-peroxydase n' e~st prE~sente qu' en fa ible quantite dans ces cellules.
Par contrE~, des monocytes en culture depuis 24 heures et mis en contact avec de la myeloperoxydase reagissent po~~itivement et de maniere tres nette a la benzidine ~ yes pre;miers rEsultats confirment une incorporation de la myeloperoxydase par simple phagocytose dens le:a monocytes.
II. Mise en evidence par radioimmunoessai de 1'incor-poration de la myeloperoxydase par les monocytes II.1 Me t;hode AprE~s une mise en contact des monocytes adhe-rents avec 1 ml de 'tampon MOM contenant de la myelope-roxydase semi-~purif:iee ou des debris de neutrophiles obtenus par sonicat:ion (le protocole de quatre expe-riences est de~crit en detail dans les resultats), le surnageant est: recu.pere puffs centrifuge a 2000 t/min pendant 10 minutes a fin de recuperer les monocytes qui se seraient eventue:llement decroches (culot 1).
Les monoc;ytes adherents sont decroches par agitation efficace ,avec 1 ml de tampon PES. Its soot ajoutes au cu7.ot 1 ;puffs centrifuges a 2000 t/min pen-dant 10 minute's a 4°C. Apres trois lavages avec du tampon PES, leis cellules soot comptees puffs diluees of in d'obtenir 3 millions de monocytes pa r ml.
La myelop~eroxydase des monocytes est solubi-lisee en trait;ant les cellules avec du bromure de cetyl-trimethylammonium (0,01 ;c) et par deux congelations suc-cessives.
Apre~s le retour a temperature ordinaire , 100~u1 du mil:~eu Boat preleves pour la quantification ;r de 1'enzyme se:Lon une technique de radioimmunoessai specifique (10,).
II.2 Resultats Experience 1 Trois millions de monocytes en culture depuis 24 heures sont mis en contact pendant 2 heures avec 1 ml de milieu de culture MEM contenant .
a) MPO 1 _ mye7.operoxydase semi-purifiee a une concen-tration de 980 ng/ml.
b) MPO 2 = 50 ~il d'une suspension concentree de debris de neutrophiles soniques.
1 myelo- ~% augmen-peroxy- tation du dase contenu ng/ml intracel-lulaire Monocytes 24h (3 millions) 80 ~ Mono cyte s 24h + MPO 1 88 1 ,1 2 heures incubation ~ rlonocytes 24h + rLPO 2 358 , 44'7 Le taux basal de monocytes n'ayant pas ete mis en contact avec de la myeloperoxydase est de 80 ng/ml. Aprea une incubation de 2 heures avec de la myeloperoxydase~ semi-purifiee, le taux intracellulaire en myeloperoxydase des monocytes reste inchange. Par contre, une forte augmentation (44~ % du taux basal) de la concentration intracellulaire en myeloperoxydase est observee lorsque les monocytes soot mis au contact de debris de nE~utrophiles. Cette derniere observation montre que les monocytes sont bien capables de phagocy-ter des debris de neutrophiles.
., .V

Experience 2 ' Les conditions sont identiques que daps 1'ex-perience 1, excepte que le temps d'incubation est de 4 heures. On constat;e cette fois une nette augmentation (440 /) du contenu i.ntracellulaire en myeloperoxydase des monocytes ayant ete mis en contact avec 1'enzyme.
De meme, les d~°bris de neutrophiles sont encore mieux phagocyter que daps 1'experience precedente puisqu'il y a une augmentation d.e 20'70 ~b du contenu intracellulaire en myeloperoxydase.
2 myelo- % augmen-peroxy- tation du dase contenu ng/ml intracel-lula ire Monocytes 24h (3 mi:Llions) 54 T~Ionocytes 24h + i''IPO 1 238 4 heures incubation Monocytes 24h + MPO 2 1120 ~ 20'70 Experience 3 Le tableau ci-dessous montre que des monocytes en culture depuis 4~8 heures intorporent mieux la myelo peroxydase ou 7_es debris de neutrophiles apres 2 heures d'incubation que des monocytes en culture depuis 24 heu-res.
Monocytes 48h (3 millions) i 102 Monocytes 48h + rIPO 1' 204 ' 220 2 heures ~ I
incubation I
ionocytes 48h + rIPO 2 X88 i ;%'72 I

Experience 4 Des monoc;Ytes en culture depuis 24 heures sont mis cette fois en contact pendant 2 heures et 6 heures avec 1 ml de tampon de culture contenant 3920 ng/ml de myelop eroxydase semi-purifies (MP03).
-__ 4 myeloperoxydase % augmen-tation du ng/ml U/ml contenu cellulaire Monocytes 24h (3 millions) 90 0,6 T~Ionocytes 24h + MP0 3 136 0,86 151 (2 heures incubation) Monocytes 24h + tTPO 3 324 1 ,3 360 (6 heures i:acubat;ion) Apre;s 2 heures de wise en contact avec 1'en-zyme, les monoc:ytes augmentent leur contenu intracellu-laire de 151 ,°~ alors que daps 1'experience 1, ce conte-nu etait rests inchange. L'augmentation est encore plus nette apres 6 heures de wise en contact. Dans cette ex-perience. on a egalement mesure dens les monocytes 1'activite enzymatique de la myeloperoxydase determines par 1'oxydation de 1'o-dianisidino en presence d'H202.
Le taux basal de 0,6 U/ml augments au fur et a mesure que le temps der miss en contact augments (valeur dou-bles apres 6 he~ures). Cette constatation est la preuve que la myeloperoxyda;se exogene incorporee dans le mono-cyte rests biers. enzymatiquement active.
III. C~totoxicite des monocytes ayant incorpore de la m9elopero dase vis-a-vis de schistosomules III.1 Methods Les schistosomules soot isoles a partir ~' a cercaires par une technique artificielle (filtration a travers un morceau de: peau de souris): Le protocols experimental suivant a ete retenu . des monocytes de 24 heures sont incub~es pendant 2 heures avec de la myeloperoxydas~a puffs laves soigneusement avec du milieu de culture MEM. Ensu.ite, les monocytes traites ou non avec de la mye:Loperoxydase soot incubes pendant 6 heures avec du serum d'un sujet atteint de bilharziose (10 ;o) ou avec un serum d'un sujet sain (10 ~o) qui sert de con-trole (effet propre du serum). Des schistosomules prea-lablement traii~es ou non avec de la myeloperoxydase sont ensuite ajoutes au milieu de culture. Apres 16 heures, les schistosomules vivants et morts sont comptes et un de cytotoxicite des monocy-tes est ainsi determine.
TMonocytes . 100 a 200 000 cellules en culture depuis 24 heures 0 2h 8h 24h I~'~PO 1 serum sain schistosomules lecture ou MFO 2 serum b ilharzien Experience 5 Ces resultats montrent que la cytotoxicite des monocytes ayant :prealablement incorpores MPO 1 ou MPO 2 vis-a-vis des achistosomules en presence de se rum de bilharzien east au~gmentee de 50 % par rapport aux mo-nocytes temoin~~. Le :pourcentage reel de cytotoxicite est obtenu en soustrayant la valeur obtenue avec 1e serum sain (eff.'et pr~opre du serum) de la valeur obtenue avec le serum d.e billaarzien.
.' ~ % cytotoxicite des monocytes sans 1"IP01 + MPO 1 i + rIPO 2 serum bilharzie~n 10 ,% 42,5 + 5 70,5 ~ 10,5171,5 + 31 serum sain 10 %~ 19 + 0 26 + 1 ,4~ 25 + 5 reel cytotoxicite 23,5 I 44,5 46,5 Experience 6 Dans cette experience, on a compare la cyto-toxicite de mot;ocyte;s ayant ou n'ayant pas incorpore de la myeloperoxydas~e vis-a-vis de schistosomules nor-S maux (stimulus 1) et de schistosomules ayant ete prea-lablement mis eon cont act pendant 2 heures avec 980 ng/
ml de myeloperoxydas~e (stimulus 2).
6 io cytotoxicite des monocytes sans P'IPO I + MPO 1 f stimulus stimulus stimulus~stimulu:
1 ~ 2 ~ 1 2 serum bilharzien 142,5 + 5 62,5 + 2 70,5+10,5 99 ,serum sain 10 % ~'19 + 0 22 + 4 26 + 1~4~35,5 + 2 --'r ;
i t reel cytotoxicitei 23,5 40,5 44,5 ! 64 ', Zes monocytes non traites avec de la myelo peroxydase ont une cytotoxicite qui passe de 23,5 a ~,5 % lorsqu'~.ls soot mis en contact avec des schisto-somules recouve~rts de myeloperoxydase.
Bien que le modele soit different (daps ce cas, le monocyt;e ne tue pas le schistosomule par phago-~.

28 13~+~9 15 cytose mais pair simple adherence avec lui), cette ob-servation rejoint le~s travaux ante rieurs montrant que la cytotoxicitE~ des macrophages est augmentee lorsque 1'organisme in.fectieux (T. gondii) phagocyte est recou-vert avec une peroxydase (3,6).
La combinaison de monocytes ayant incorpore de la myeloperoxydase avec des schistosomules reconverts avec 1'enzyme pe rmet d'obtenir une cytotoxicite tres elevee (64 /).
Conclusions I1 et;ait seulement montre daps la litterature que les monocyt;es peuvent acquerir une peroxydase ac-compagnee, c'est-a-dire associee a un support qui est un microorganisme et voir ainsi lent cytotoxicite augmentee vis-a-vis de toute une serie d'organismes infectieux. Dans ces experiences, il faut en effet remarquer que la myeloperoxy~jase etait d'abord liee a 1'organisme infectieux qui etait ensuite ingere par le monocyte ou macrophage.
Selo:a 1' irwention il a ete utilise de la mye-loperoxydase granulocytaire humaine et on a decouvert que .
'1°) la myeloperoxydase pent etre directement pha~oc~tee sans 1'intervent;ion d'un activateur par le monocyte, 2°) 1'enzyme i:ngeree: reste enzymatiquement tres active ainsi que le montrent les resultats de cytotoxicite vis-a-vis des sc;histosomules.
Ces observations indiquent que de la myelope-roxydase exogene administree daps 1'organisme sera re-prise par les monocytes ou macrophages humains et des lots pent etre utilisee comma un moyen de therapeutique chez des patients souffrant de deficiences hereditaires (agranulocytose) ou acquise (SIDA).
r r~.

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Claims (23)

1. Myéloperoxydase humaine biologiquement active, à l'exclusion de la myéloperoxidase humaine naturelle, produite par culture de cellules eukaryotes transformées par un vecteur d'expression de la hMPO dans lesdites cellules, le vescteur comprenant le fragment HindIII/SnaBI, HindIII/EcorV ou HindIII/HpaI portant la séquence codante de la hMPO tells que représentée sur la figure 1.

2. Myéloperoxydase humaine selon la revendication 1 caractérisée en ce qu'elle est produite par une culture de cellules d'insectes ou de mammifères.

3. Cassette d'expression de la méloperoxydase humaine consistant dans le fragment HindIII/SnaBI, HindIII/EcorV ou HindIII/HpaI portant la séquence codante de la hMPO telle que représentée sur la figure 1.

4. Plasmide vecteur de clonage contenant une cassette selon la revendication 3.

5. Vecteur d'expression dans des cellules eukaryotes comportant une cassette selon la revendication 3.

6. Plasmide de transfert recombinant pour Baculovirus contenant: l'ADNc de la hMPO sous le contrôle du promoteur de polyhédrine.

7. Plasmide pNIV2704 représenté a la figure 5.

8. Cellules de spodoptera frugiperda cotransfectées par un plasmide selon la revendication 6 ou 7 et de l'ADN viral sauvage.

9. Cellules d'insectes de spodoptera frugiperda infectées par un Baculovirus recombinant obtenu à partir d'un plasmide selon la revendication 6 ou 7.

10. hMPO produite par culture de cellules d'insectes, spodoptera frugiperda transfectées par un vecteur d'expression dans lesdites cellules selon la revendication 9, à l'exclusion de la myéloperoxidase humaine naturelle.

11. Vecteur d'expression de la hMPO dans des cellules CHO contenant la cassette HindIII/SnaBI portant la séquence codante vtotale pour la hMPO telle que représentée sur la figure 1.

12. Plasmide selon la revendication 11 consistant dans le plasmide pNIV2703.

13. hMPO produite par culture de cellules de mammifères CHO transfectées par un vecteur selon la revendication 11 ou 12, à l'exclusion de la myéloperoxidase humaine naturelle.

14. Médicament consistant en l'enzyme myéloperoxydase humaine recombinante selon l'une des revendications 1, 2, 10 ou 13.

15. Médicament consistant en un composé chimique constitué par l'enzyme myéloperoxydase humaine conjuguée.

16. Médicament selon la revendication 15, caractérisé en ce que la myéloperoxydase est conjuguée par couplage covalent ou complexation a un transporteur présentant une affinité pour les macrophages.

17. Médicament selon la revendication 16, caractérisé en ce que la transporteur est l'albumine humaine mannosylée ou un anticorps ou fragment d'anticorps dirigé contre des récepteurs présents sur les macrophages.

18. Médicament selon la revendication 14, caractérisé en ce que la myéloperoxydase est encapsulée dans des liposomes.

19. Médicament selon la revendication 14, 15, 16 ou 17, utile pour lutter contre les infections à
l'intérieur des macrophages.

20. Utilisation de la myéloperoxydase humaine libre ou du médicament selon la revendication 14, 15, 16 ou 17 pour la préparation de compositions pharmaceutiques utiles pour lutter contre les infections à l'intérieur des macrophages.

21. Utilisation de la myéloperoxydase humaine libre ou du médicament selon la revendication 14, 15, 16 ou 17 pour la préparation de compositions pharmaceutiques utiles pour la traitement des immunodéficiences occasionnées par le SIDA, les brûlures et les irradiations.

22. Composition pharmaceutique comprenant à titre de principe actif un médicament selon la revendication 14, 15, 16 ou 17 et un support pharmaceutiquement acceptable.

23. Composition pharmaceutique selon la revendication 22 utile pour la traitement des immunodéficiences.