DE69935325T2

DE69935325T2 - Formulierungen für die Prävention oder die Behandlung von Krankheiten, die Schleimhäute oder Haut betreffen oder für die Schwangerschaftsverhütung

Info

Publication number: DE69935325T2
Application number: DE69935325T
Authority: DE
Inventors: Michel G. Sillery Bergeron; Andre Neufchatel Desormeaux; Rabeea F. Sainte-Foy OMAR; Julianna Quebec JUHASZ
Original assignee: Infectio Recherche Inc
Current assignee: Infectio Recherche Inc
Priority date: 1998-04-21
Filing date: 1999-04-21
Publication date: 2007-11-15
Anticipated expiration: 2019-04-22
Also published as: BR9909801A; KR20010042875A; US7192607B2; AU762461B2; HUP0101507A3; PL344111A1; US20030133969A1; DE69935325D1; CN1597008A; CN1302215A; JP4665075B2; EP1769821A1; SK15822000A3; JP2002512180A; US6500460B1; CN100396344C; ID26791A; AR018194A1; TR200102067T2; WO1999053897A2

Description

Hintergrund der Erfindung
Die Breite an Krankheiten, die durch Geschlechtsverkehr übertragen werden („sexually transmitted diseases, STDs) verursacht durch das humane Immundefizienzvirus (HIV), Herpes oder weitere Pathogene breiten sich in einem erstaunlichen Rhythmus aus. Das globale Vorkommen, die Morbidität und Mortalität von STDs sind sehr signifikant. Es wird geschätzt, dass weltweit über 900 Millionen Menschen mit sexuell übertragenen Pathogenen infiziert sind. Jedes Jahr werden in den Vereinigten Staaten mehr als 12 Millionen Menschen neu mit einem Pathogen, das für STD verantwortlich ist, infiziert. Herpes simplex Virus Typ-1 (HSV-1) und Typ-2 (HSV-2) sind die häufigsten Ursachen für Genitalgeschwüre in entwickelten Ländern. Eine Herpes simplex Infektion dauert lebenslang und kann den schmerzvollen und wiederkehrenden genitalen Verletzungen, systemischen Komplikationen, psycho-sozialer Morbidität und ebenfalls zu ernsten frühkindlichen Krankheiten folgend aus der Übertragung von HSV während der Geburt führen. Die genitale Übertragung dieses Pathogens ist normalerweise aufgrund asymptomatischer Virus-Last („viral shedding") durch Leute, die sich nicht bewusst sind, dass sie infiziert sind. HSV-2 ist nun in einem von fünf amerikanischen 12 jährigen oder Älteren detektierbar. Außerdem wird geschätzt, dass über ein Drittel der Weltbevölkerung wiederkehrende HSV-Infektionen hat und daher die Möglichkeit besitzt, den Virus während Abschnitten der produktiven Infektion zu übertragen.
Neisseria gonorrheae und Chlamydia trachomatis sind als zwei der am meisten vorherrschenden sexuell übertragenden bakteriellen Infektionen bekannt. Es wird geschätzt, dass weltweit jährlich 25 Millionen Fälle von Gonorrhea und 50 Millionen Fälle von Chlamydia auftreten. Andererseits haben aktuelle epidemiologische Daten angezeigt, dass die Anzahl von Individuen, die mit HIV infiziert sind in der ganzen Welt dramatisch ansteigen. Nach den Aussagen von Beamten der Vereinten Nationen lassen epidemiologische Daten-Abschätzungen vermuten, dass nicht weniger als 16.000 Individuen sich jeden Tag während der Jahres 1997 mit HIV infiziert haben. Aktuelle Statistiken (Stand Ende 1997) der Weltgesundheitsorganisation (WHO) zeigten, dass es ungefähr 31 Millionen HIV-Infizierte weltweit gibt und diese Zahl soll nach Vorhersagen im Jahr 2000 40 Millionen erreichen.
Global gesehen verursachen heterosexuelle Übertragungen 85 bis 90% der HIV-Infektionen. Da es keinen Impfstoff gegen HIV gibt, sind präventive Maßnahmen die einzigen Werkzeuge, die gegenwärtig die Übertragung dieses Retroviruses reduzieren kann. Die ständige und vorsichtige Verwendung von Kondomen ist ein effektiver Schutz gegen die sexuelle Übertragung von HIV und weiteren sexuell übertragbaren Pathogenen und sie sollten bei allen risikoreichem Geschlechtsverkehr verwendet werden, um die Wahrscheinlichkeit der Infektionsansteckung signifikant zu reduzieren. In Afrika waren die intensivsten Präventionsprogramme lediglich in der Lage, die Verwendung von Kondomen auf ungefähr 70% des Geschlechtverkehrs von weiblichen Prostituierten zu steigern. Daher kommen Zweifel auf über die Möglichkeit der Förderung von Kondomen in der Kontrolle der Aids Epidemie in hohen Risikogruppen. In Situationen, wo die heterosexuelle Übertragung von HIV wichtig ist, könnten vorbeugende Maßnahmen ein zusätzliches Mittel sein, um die Epidemie einzugrenzen, womit Frauen ihr Risiko der Berührung mit STDs verhindern könnten. Ein solch schützendes Werkzeug könnte ebenfalls in homosexuellen Beziehungen von Männer verwendet werden, da es einen zusätzlichen Schutz für die Kontrolle des empfangenen Partners bereitstellen würde. Daher ist es wichtig, ein Schutzverfahren zu entwickeln, das als Alternative zu Kondomen verwendet werden könnte, wobei die Person sich selbst gegenüber Infektionen schützen könnte, ohne ihren Sexualpartner fragen zu müssen. Präventive Maßnahmen, die darauf ausgerichtet sind, die anfängliche Übertragung von Pathogenen zu blockieren, die die ursächlichen Mittel von Aids, Herpes und weiteren STDs, wird natürlich zu großen Vorteilen führen.
Die Entwicklung von sicheren topischen Mikrobiziden hat gegenwärtig eine sehr hohe Priorität für die Weltgesundheitsorganisation (WHO) und das National Institute of Health (NIH) in dem Gebiet der HIV-Prävention. Ein topisches Mikrobizid wird häufig zusammengesetzt aus einem Wirkstoff und einem Träger („vehicle"). Wirksame Bestandteile können über eine Vielzahl von Mechanismen agieren, einschließlich: i) Zerstören der Zellmembran des Organismus, Umhüllen oder Einnehmen von Lipid oder Proteinbestandteilen (z. B. detergentsartige Spermizide/Mikrobizide wie z. B. Nonoxynol-9), ii) Blockieren der Rezeptor-Ligand Wechselwirkung, die für die Infektziösität von Bedeutung ist (z. B. mikrobielle Adhesionsinhibitoren wie z. B. sulfatierte Verbindungen), iii) Inhibieren der intrazellulären oder extrazellulären Replikation des Pathogens (z. B. antimikrobielle Wirkstoffe), iv) Verändern der vaginalen Umgebung und Reduzieren der Empfänglichkeit für Infektionen (z. B. Puffer und Produkte, die die normale Vaginalflora und Umgebung erhalten), oder v) Verbessern der lokalen Immunantwort (z. B. Immunantwort-Modifizierer). Die Gesamteffizienz eines topischen Mikrobizids gegen die sexuelle Übertragung von Pathogenen, die STDs verursachen, hängt von der Effizienz des Wirkstoffs ab, abgegeben zu werden und seiner Fähigkeit, den gesamten Vaginal/Cervix-Bereich für maximale Effizienz gegen Pathogenen abzudecken. Die Fähigkeit dieser Wirkstoffe, die gesamte Vagina abzudecken, hängt hauptsächlich von der Art des Trägers ab, der verwendet wird. Typische Formulierungen von Trägern schließen Gele, Cremes, Schäume, Suppositorien, Schwämme und Filme ein.
Die aktuell erhältlichen Vaginalformulierungen verwenden das Spermizid Nonoxynol-9, ein nicht-ionisches Tensid, als ein Mikrobizid. In Vitro inaktiviert Nonoxynol-9 eingehüllte Viren, wie z. B. HSV, HIV oder weitere Mikroogranismen einschließlich Chlamydia trachomatis und Neisseria gonorrhoe. Die potenzielle Effizienz von Nonoxynol-9 gegenüber HIV ist jedoch nicht klar bestätigt und die Ergebnisse von klinischen Untersuchungen sind widersprüchlich. Eine aktuelle kontrollierte Studie, die an 1.292 HIV-negativen weiblichen Sexarbeitern in Kamerun durchgeführt wurde, zeigte, dass die Verwendung eines vaginalen Films, der 70 mg Nonoxynol-9 enthält, die Rate von neuem HIV, Gonorrhea oder Chlamydia Infektionen nicht reduiziert (Roddy et al., 1998, N. Engl. J. Med., 339:504-510). Das Scheitern des Nonoxynol-9 Films in der Reduktion der Übertragung von Infektionsmitteln könnte auf eine unvollständige Abdeckung des gesamten Vaginal/Cervix-Bereichs mit dem Wirkstoffabgabesystem für Nonoxynol-9 oder auf das Vorhandensein von Schleimhauttoxizität, die Infektionen von Mikroorganismen begünstigt, zurückgeführt werden. Aufgrund des dramatischen Anstiegs der Anzahl von Individuen über die ganze Welt, die mit HIV, Herpes oder weiteren sexuell übertragenen Pathogenen infiziert sind, gibt es einen dringenden Bedarf für die Entwicklung von aktiven Produkten und/oder geeigneten Abgabesystemen, die die sexuelle Übertragung dieser Pathogene mit einer minimalen Schleimhautirritation und minimalen Effekten für die Vaginalflora und den pH-Wert reduziert.
Natriumlaurylsulfat („Sodium lauryl sulfate", SLS) ist ein sulfoniertes Tensid, das Membranproteine der Pathogene denaturiert. Es hat daher zwei Funktionen als ein Tensid und als ein chaotropes Agenz. Mit dieser Absicht haben wir Experimente durchgeführt, um den potenziellen mikrobiziden Effekt von SLS auf HSV und HIV zu beurteilen. Unsere Vorstudien zeigten klar, dass SLS in vitro die Infektiosität von beiden Viren modifiziert. Kürzlich haben Howett et al. unsere Ergebnisse bestätigt, dass SLS ebenfalls ein potenter Inaktivator von HSV-2, HIV-1 (Antimicrob. Agents Chemother. 43(2):314-321, 1999) ist. Zusätzlich haben sie gezeigt, dass SLS gegen Papillomaviren (nicht umhüllter Virus) vom Kaninchen, Rind und Menschen nach kurzer Behandlung mit niedrigen Konzentrationen dieses Produktes wirksam ist. Diese Referenz lehrt jedoch nicht die Verwendung eines Trägers, um das potenzielle Mikrobizid abzugeben. Die Wahl des Trägers ist jedoch sehr wichtig, da es die Konzentration des verfügbaren Wirkstoffs beeinflusst, die Dauer der Wirkstoffverfügbarkeit und das Maß der Abdeckung der Schleimhäute durch die Formulierung, welches Schlüsselfaktoren für die Bereitstellung des Schutzes gegen eindringende Pathogene sind. Eine weitere interessante Kategorie von Mikrobizidkandidaten sind mikrobielle Adhesionsinhibitoren wie z. B. sulfatierte Verbindungen, welche die Interaktion zwischen dem Wirtzellenrezeptor und Mikrobe blockiert. Ein bekanntes Beispiel für mikrobielle Adhesionsinhibitoren ist Dextransulfat (DS), ein polysulfatierter Kohlenwasserstoff, welcher die in vitro die Infektiosität von HIV und Herpesviren inhibiert.
Wir haben kürzlich eine Gelformulierung entwickelt, die auf Vaginal-, Cervix- oder Anorektal-Schleimhäute aufgetragen werden kann und welche effektiv sein könnte, sexuell übertragene Pathogene zu unterdrücken. Eine überragende Eigenschaft dieser Gelformulierung ist seine thermoreversible Eigenschaft. Der Übergang vom flüssigen Zustand bei Raumtemperatur in den Gelzustand bei Körpertemperatur ist von höchster Bedeutung, da, wenn es auf raue biologische Oberflächen wie die vaginal oder anorektal Epithelien aufgetragen wird, das Gel in die kleinsten Unregelmäßigkeiten eindringen soll und eine gute physikalische Barriere gegen Infektionsmittel bilden soll. Die Gelformulierung hat die folgenden Schlüsselcharakteristika, die beide FDA und NIH als wichtig erachten: i) es ist farblos, geruchlos und nicht verfärbend („non-staining"), ii) es sollte die ganze Vagina/Cervix abdecken, da es im flüssigen Zustand angewendet wird, iii) es ist kompatibel mit einem männlichen Latexkondom, iv) es widersteht dem Auswaschen durch wässrigen Fluss, v) es hat einen pH-Wert ähnlich zu der einer gesunden Vagina (pH 4,0-4,5), vi) es erhält die gewünschten rheologischen Eigenschaften unter extremen Hitzebedingungen und Kältebedingungen und vii) es beeinflusst in vitro nicht die normale Vaginalflora, insbesondere Lactobacillus spp.
Unsere internationale Publikation (WO 97/42962) offenbart die Verwendung von Formulierungen, umfassend filmbildende Komponenten, die in der Lage sind per se eine physikalische Barriere für Pathogene zu bilden. Thermoreversible Gele wie z. B. Poloxamere sind besonders bevorzugt für diese Verwendung. Die filmbildenden Formulierungen können ferner Mikrobizide, Spermizide und weiter Wirkstoffe umfassen, wobei die Auswahl durch das Pathogen, Organismus oder die Krankheit, die inaktiviert oder behandelt werden soll, geleitet wird. Die Formulierungen sind daher als eine physikalische und optional als eine chemische oder pharmakologische Barriere wirksam als auch anwendbar als ein verzögertes Wirkstofffreisetzungssystem am Ort der Verabreichung. Diese Formulierungen sind beabsichtigt für die Verwendung in der Prävention von sexuell übertragenen Krankheiten als auch in der Behandlung von Infektionen, Krebs, Entzündung oder jeglicher Krankheit oder Zustand, welche eine pharmakologische Behandlung benötigt. Diese Publikation lehrt weiterhin, dass die Formulierung die Toxizität von potenten Spermiziden/Mikrobiziden wie z. B. Nonoxynol-9 reduzieren. Diese Publikation lehrt jedoch nicht spezifisch die Verwendung von SLS als einen chemischen Kandidaten der Wahl, der in topische Formulierungen eingebunden werden soll.
US Patent Nr. 5,275,805 beschreibt eine orale Zusammensetzung umfassend ein Antiplaque-Mittel, eine Tensidmischung, welche SLS umfassen kann, ein Polyoxyethylen/Polyoxypropylen Block Polymer und ein Tauratsalz. Die Tensidmischung soll wirksam sein, um „die orale Zusammensetzung bis zur Phasenseparation zu stabilisieren, ohne die antibakterielle Effizienz [des antiplaque Mittels] zu beeinträchtigen". Zu diesem Zweck werden eher niedrigen Konzentrationen von jeder Komponente der Tensidmischung verwendet; es wird nicht angenommen, dass diese niedrigen Konzentrationen eine antimikrobielle Aktivität und eine physikalische Barriere erzielen.
Die Europäische Patentanmeldung Nr. 386,960 beschreibt einen Wirkstoffabgabeträger umfassend eine wärmehärtende Gelkomponente und eine filmbildende Komponente. Die filmbildende Komponente dient dem Zweck, ein stärkeres Gel bereitzustellen. Spermizide können darin eingeschlossen werden und sie sind Teil einer Liste von Wirkstoffen, die für die vaginale Wirkstoffabgabe beabsichtigt sind. Es ist jedoch nicht gezeigt worden, dass ein Spermizid, eine wärmehärtende Gelkomponente und eine filmbildende Komponente eine physiko-chemische Barriere für Pathogene bildet oder dass eine Unterkombination dieser Komponenten die Bildung einer physiko-chemischen Barriere erzielt oder anders, dass jedes Produkt, welches die Lipide einer Zellmembran zerstört oder die Konformation eines Proteins zerstört (Detergensien im Allgemeinen oder chaotropische Agenzien) allein oder im Kombination mit einem wärmehärtenden Gel wirksam gegen Pathogene sind.
Für eine effiziente Abgabe von halbfesten oder flüssigen Formulierungen in eine Körperöffnung ist ein Applikator ein Gerät der Wahl. Der ideale Applikator sollte die Formulierung unmittelbar bei Betätigung an die Schleimhaut abgeben und dieses ohne zuviel Luft vor der Formulierung auszutreiben.
US Patent Nr. 2,683,456 beschreibt einen Rektalapplikator, welcher einen perforierten gestreckten Körper umfasst, der in eine Körperöffnung eingeführt werden soll und einen proximal verlängerten Teil, welcher außerhalb der Körperöffnung verbleibt. Ein Medikationsröhrchen wird in unmittelbarer Nähe zu dem Anschluss zwischen den verlängerten Körper und den vergrößerten Teilen, so dass sein Inhalt direkt in den verlängerten Körper bei Betätigung abgegeben wird. Der Diffusionskanal, durch welchen die Medikation wandert, bevor sie an die Körperöffnung ausgegeben wird, ist einfach durch das Lumen des verlängerten Körpers gebildet, welcher den Durchtritt erlaubt und den Ausstoß eines beträchtlichen Luftvolumens. Es gibt keine Offenbarung eines Diffusionskanals von reduziertem Volumen, welcher der Medikation erlauben würde, nahezu sofort ausgestoßen zu werden, ohne dass ein solch großes Luftvolumen vorangegangen ist.
Die Europäische Veröffentlichungsnummer 761246 beschreibt einen Applikator umfassend ein Reservoir, eine Pumpe, die einen Einlass in das Reservoir aufweist, eine Auslösetaste, um die Pumpe zu betätigen und ein Rohr, das in eine Körperöffnung eingeführt werden soll, enthalten einen Verteilerkopf an der Spitze des Rohres, wobei das Rohr an den Auslass der Pumpe angeschlossen ist. Der Rohrabschnitt definiert einen Diffusionskanal, der einfach aus dem Lumen des Rohres besteht, durch welche eine Medikation zu dem Verteilerkopf reist. Der Verteilerkopf ist hergestellt aus einem vergrößertem Abschnitt, der ein Füllstoffteil aufweist und eine Vielzahl von Perforationen, die durch die gesamte Dicke des Kopfes führen. Dieses Dokument beschreibt nicht einen Applikator, welcher einen Diffusionskanal mit einem kleinen Volumen aufweist, welcher eine Medikation abgeben würde, ohne ein wesentliches hohes Volumen an Luft abzugeben.
Die Patentveröffentlichungsnummer DE 3513645 beschreibt einen Applikator, welcher ein nicht-perforiertes Spitzenteil umfasst und einen zylindrischen Körper der eine äußere perforierte Wand aufweist. Das Lumen, das in dem Körper definiert ist, wird einfach durch die äußere Wand beschrieben. Dieses Lumen stellt ein Reservoir dar, worin eine Flüssigkeit oder eine halbfeste Formulierung platziert wird. Ein Stempel schiebt die Formulierung in das Reservoir und durch Kompression gegen den nicht-perforierten Spitzenteil wird die Formulierung durch die Perforationen getrieben. Das Lumen und der Stempel können eine komplementäre konische Form aufweisen, um kleine Volumina der Formulierung abzugeben. Da jedoch das Lumen ein relativ großes Volumen aufweist, kann ein mehr oder minder großes Volumen Luft durch die Perforation getrieben werden, bevor die Formulierung dieses erreicht.
HSV-1 und HSV-2 sind neurotrope Viren, welche hauptsächlich das neuroektodermale Gewebe einschließlich der Haut, die peripheren Nerven und das zentrale Nervensystem infizieren. Schleimhaut oder Hautoberflächen sind die herkömmlichen Stellen der Primärinfektion. Wiederkehrende Herpes labilialis und Herpes simplex stellen die häufigsten klinischen Erscheinungsformen dar, die mit HSV-1 und HSV-2 Infektionen verbunden sind. Wiederholungen treten spontan auf, sind aber mit physischen oder emotionalen Stress, Fieber, Aussetzung gegenüber ultraviolettem Licht, Gewebeschädigung und Immunsuppression verbunden. Obwohl es eine milde Krankheit bei immunkompetenten Individuen ist, sind HSV-Infektionen beschwerlich, insbesondere für Patienten mit regelmäßigen Vorfällen.
Patienten, die entweder mit einer Immuntherapie oder einem Grundleiden belastet sind, haben ein erhöhtes Risiko, HSV-Infektionen zu entwickeln. Renale und kardiale Transplantatempfänger haben eine erhöhte Schwere der Infektionen gezeigt. Außerdem hat der Ausbruch von AIDS die Ernsthaftigkeit von HSV klinischen Krankheiten immunbelasteter Wirten verstärkt.
Die derzeit erhältlichen topischen antiviralen Behandlungen zeigen nur eine begrenzte Wirksamkeit insbesondere gegen symptomatisch wiederkehrenden Herpes. Die begrenzte Wirksamkeit dieser topischen Formulierungen auf die Entwicklung von Mukokutan-Herpes-Verletzungen kann durch die geringe Fähigkeit des Wirkstoffs begründet sein, in die Haut zu penetrieren. Das Statum Corneum oder die Hornhaut stellt eine Barriere für die Penetration der meisten Substanzen in die Haut dar. Diese Schicht besteht aus Corneozyten eingebettet in eine Doppelschichtlipidmatrix zusammengesetzt aus Cholesterin, freien Fettsäuren und Ceramiden. Daher könnte die Verwendung von Mitteln, die die Hautpenetration verbessern, eine geeignete Strategie darstellen, die Penetration von topischen Formulierungen zu steigern.
SLS ist ein Tensid, welches Hautpenetrationsverbesserungseigenschaften besitzt durch die Erhöhung der Fluidität der epidermischen Lipide. Die Hautpenetrationsverbesserungseigenschaften von SLS verbunden mit seiner Fähigkeit die virale Infektiosität durch seine chaotropischen Eigenschaften und Eigenschaften als Detergents zu modifizieren könnte ferner die Wirksamkeit der topischen Wirkstoffformulierung erhöhen. Aufgrund seiner chaotropischen Eigenschaften kann SLS außerdem ein breiteres Spektrum der Aktivität gegen Spermien, Bakterien, Pilzen und Viren als andere einfache Detergenzien aufweisen.
Poloxamere werden weitverbreitet in zahlreichen pharmazeutischen Anwendungen verwendet und aufgrund ihrer nicht-toxischen Eigenschaften eignen sie sich für Wirkstoffabgabesysteme mit verzögerter Freisetzung. Poloxamere stellen geeignete Matrices für dermatologische Anwendungen dar. Wenn sie in flüssiger Form angewendet werden, erlauben Poloxamere eine bessere Oberflächenabdeckung durch Penetration in die kleinsten Unregelmäßigkeiten der Schleimhaut und/oder der Haut. Zusätzlich kann das netzförmige Feld, das durch diese Poloxamere gebildet wird, als ein Wirkstofffreisetzungssystem mit verlängerter Wirkstoffaktion wirken.
Zusammenfassung der Erfindung
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung ist es eine Aufgabe, Formulierungen bereitzustellen, welche eine filmbildende Komponente umfassen, welche auf die Oberfläche von Schleimhäuten oder Haut bevorzugt in Form eines Gels, einer Creme oder einer Salbe aufgetragen werden. Die Gelformulierungen können verwendet werden, um verschiedene Arten von Schleimhäuten wie z. B. vaginale, cervex, anorektal, Augen, Mund, Nase oder Haut zu bedecken, um Infektionen und/oder abnormale Zustände von Schleimhäuten und/oder Haut zu verhindern. Die Gelformulierungen können außerdem topisch auf das Auge für die Behandlung und/oder die Prävention von Infektionen von ophtalmischen Zuständen aufgetragen werden. Dazu wird ein thermoreversibles Gel verwendet, welches in flüssiger Form aufgetragen wird, sich über der Oberfläche erstreckt und nachdem es die Temperatur der Körperoberfläche erreicht hat eine halbfeste Beschichtung bildet. Das thermoreversible Gel wird aus Poloxamer 407 gebildet. Die obige Formulierung kann ebenfalls ein Mittel gemäß Anspruch 1 umfassen, das in der Lage ist, mit der Zellmembran des Organismus, umhüllte oder capsid Lipid- oder Proteinbestandteile in der Zielzelle, Gewebe oder Mikrobe zu interferieren. Die obige Kombination der filmbildenden Komponente und des obigen Agens können Formulierungen mit verbesserter Wirksamkeit und reduzierter Toxizität bereitstellen.
Ein chaotropes Agens und ein mutmaßlicher mikrobieller Adhesionsinhibitor Natriumlaurylsulfat (SLS) sind allein wirksam gegen Mikroben. Die SLS-Wirksamkeit wird ferner verbessert, wenn sie in die vorliegende Formulierung eingebunden wird. Daher wird betrachtet, dass SLS allein oder in Kombination mit der obigen filmbildenden Komponente verwendet werden kann, um mikrobielle Infektionen zu verhindern. SLS kann allein oder in Kombination mit den obigen Formulierungen verwendet werden bei jeder geeigneten Konzentration, bevorzugt bei einer Konzentration von ungefähr 0,1 bis 25% (w/v), und mehr bevorzugt bei einer Konzentration von ungefähr 1 bis 15% (w/v). Die Poloxamer 407 Konzentration wird bei einer Konzentration von 15 bis 35% (w/v) verwendet. Die physikalischen Eigenschaften der endgültigen Formulierungen hängen zu einem großen Teil von dem Wirkstoff ab, der darin eingebunden ist, vom pH-Wert und den gelösten Stoffen, die in der Herstellung der Formulierungen verwendet werden und von der Viskosität, die für den vorgegebenen Zweck gedacht ist. Die obigen Formulierungen können ferner einen Wirkstoff umfassen, welcher wirksam ist, um Infektionen und/oder abnormale Zustände von Schleimhäuten oder Haut zu verhindern. Vaginale Formulierungen stellen eine physische und eine chemische Barriere, auf Grund ihrer filmbildenden und mikrobiellen zerstörenden Komponenten dar. Neben einer Aktivität gegenüber Infektionsmitteln können diese Formulierungen ebenfalls wirksam Schwangerschaft verhüten. SLS wird Nonoxynol-9 vorteilhaft in den Formulierungen ersetzen. SLS hat ein breiteres Spektrum der Aktivität gegen z. B. Spermien, umhüllten und nicht umhüllten Viren, es ist ein Kandidat der Wahl in der vorliegenden Formulierung. Das Gel kann einen Wirkstoff enthalten, welcher wirksam ist in der Verhinderung von Infektionen und/abnormaler Zuständen von Schleimhäuten und/oder Haut. Für den Zweck der Erfindung bedeutet der Begriff „Wirkstoff", dass jedes antimikrobielle, bakterielle, virizide, chemotherapeutische, entzündungshemmende, antineoplastische, immunmodulierende Mittel oder jedes weitere Mittel oder Kombinationen davon, welches wirksam ist für die Verhinderung von Infektionen von Schleimhäuten und/oder Haut. Der Begriff „Wirkstoff" bezieht sich ebenfalls auf Zytokine oder Antigene, die eine Immunantwort stimulieren können, die gegen eine Infektion schützen würden. Der Wirkstoff kann in Wirkstoffträgern wie z. B. Gelen, Liposomen, Nanopartikeln oder Zyklodextrinen eingebunden werden, wobei die Einbindung in einer verbesserten Verhinderung von Infektionen resultiert.
Die allgemeinen Designmöglichkeiten des Applikators sollen in keinster Weise den Bereich der Erfindung einschränken. Es ist wichtig zu erwähnen, dass die endgültige Form und Erscheinung des Applikators von den hier gezeigten Beispielen abweichen kann.
In weiteren bevorzugten Ausführungsformen werden die vorliegenden Formulierungen verwendet, um virale Krankheiten zu behandeln und sie umfassen ferner als einen Wirkstoff ein antivirales Mittel wie z. B. Acyclovir oder Foscarnet oder jedes andere mikrobielle Mittel, das allein oder in Kombination bei einer geeigneten Konzentration verwendet werden kann. In der bevorzugtesten Ausführungsform ist die Formulierung aus Poloxamer 407 zusammengesetzt und enthält Foscarnet bei einer Konzentration im Bereich von 0,5 bis 5% (w/v). In einer weiteren bevorzugtesten Ausführungsform ist die Formulierung aus Poloxamer 407 zusammengesetzt und enthält Acyclovir bei einer Konzentration im Bereich von 0,5 bis 5% (w/v). In einer weiteren bevorzugtesten Ausführungsform ist die Formulierung aus Poloxamer 407 zusammengesetzt und enthält SLS bei einer Konzentration im Bereich von 1 bis 10% und Foscarnet oder Acyclovir in den obigen Konzentrationen.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue topische Formulierungen zu entwickeln, um Infektionen von Schleimhäuten und/oder Haut zu verhindern, insbesondere sexuell übertragende Infektionen und mehr bevorzugt solche verursacht durch HIV und Herpes. Die Mikrobizide und weiteren Wirkstoffe können entweder als freie Wirkstoffe oder eingeschlossen in Wirkstoffträger wie z. B. Liposomen, Nanopartikel oder Zyklodextrinen in die Gelformulierung eingeschlossen werden. Solche mikrobiziden Gele können die lokale mikrobizide Aktivität verlängern, lokale Irritationen eliminieren und systemische Nebeneffekte von den eingeschlossenen Wirksoffen reduzieren.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, topische Formulierung von Wirkstoffen zu entwicklen, welche die Wirksamkeit von chemisch oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Mukokutaninfektionen und insbesondere solche verursacht durch HSV-Infektionen. Die verbesserte Wirksamkeit von Wirkstoffen gegenüber Einbindung in geeignete Matrizes und/oder Wirkstoffträger kann das Dosierungsintervall reduzieren und daher die Lebensqualität der Patienten verbessern. Es ist ebenso eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, topische Formulierungen für die Behandlung und/oder Heilung von Brandwunden als auch für die Verhinderung ihrer potentiellen Infektionen zu entwickeln.
Beschreibung von spezifischen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung
Die Erfindung wird nun folgend durch Bezug auf spezifische Ausführungsbeispiele und angehängte Figuren beschrieben, welche der Verdeutlichung der Erfindung dienen sollen und nicht limitierend ausgelegt werden sollen.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 zeigt die Infektiosität von HSV-1 (Stamm F) gegenüber Verozellen nach einer Vorbehandlung des Virus mit verschiedenen Konzentrationen von SLS (Feld A) oder DS (Feld B) für 1 Stunde bei 37°C (_#) oder gefolgt von der Zugabe von SLS oder DS zum Virus ohne Vorbehandlung (,). Die plaquebildenden Einheiten („Plaque forming units", PFU) sind als Prozentsatz der Kontrolle ausgedrückt. Ergebnisse werden als Mittel Standardabweichung von 4 unabhängigen Experimenten angegeben.
2 zeigt die Wirksamkeit von verschiedenen Konzentrationen von SLS (Feld A) oder DS (Feld B) gegen HSV-1 (Stamm F) in Verozellen. Die Plaquebildungseinheiten („plaque forming units", PFU) sind als Prozent der Kontrolle ausgedrückt. Die Ergebnisse sind der Mittelwert ± Standardabweichung von 4 unabhängigen Experimenten.
3 zeigt den Effekt der Vorbehandlung von HIV-1 (Stamm NL4-3) mit 500 μM SLS für 1 Stunde bei 37°C auf seine Infektiosität gegenüber 1G5 Zellen. Die Werte stellen den Mittelwert ± Standardabweichung von 3 Bestimmungen dar.
4 zeigt Elektronmikroskopaufnahmen von Verozellen, die mit HSV-1 (Stamm F) infiziert sind, vorbehandelt für 1 Stunde bei 37°C mit 50 μM (Feld B), 75 μM (Feld C) und 100 μM (Feld D) SLS. Zellen, die mit HSV-1 (Stamm F) infiziert waren, wurden in Abwesenheit von SLS als Kontrolle verwendet (Feld A). Vergrößerung 70.000-fach.
5 zeigt die Menge an Glykoprotein D von HSV-1 (Stamm F) vorbehandelt für 1 Stunde bei 37°C mit 12.5, 25, 50, 75 und 100 μM SLS in Verozellen. Zellen, die mit HSV-1 (Stamm F) infiziert waren, in EMEM + 2% FBS wurden als Kontrolle verwendet. Die Werte wurden als Prozentzahl der Hybridisierungsignalintensität verglichen zur Kontrolle angegeben.
6 zeigt die Zeitentwicklung des Überlebens von Mäusen, die intranasal mit HSV-2 (Stamm 22) infiziert waren, vorbehandelt für 1 Stunde bei 37°C mit 6,25 (_#), 25 (,) und 100 (_%) μM SLS. Mäuse, die mit einem unbehandelten Virus infiziert waren, wurden als Kontrolle (.) verwendet. Die Ergebnisse sind als Mittel von 8 Tieren pro Gruppe dargestellt.
7 zeigt die Zeitentwicklung der mittleren Verletzungpunktzahl von Mäusen, die cutan mit HSV-1 (Stamm F) infiziert waren, vorbehandelt für 1 Stunde bei 37°C mit verschiedenen Konzentrationen (6,25 (_#), 25 (,) und 100 (_%) μM) SLS (Feld A) oder verschiedenen Konzentrationen (0,25 (_#), 1 (,) und 10 (_%) nM) DS (Feld B). Mäuse, die mit einem unbehandelten Virus infiziert waren, wurden als Kontrolle (.) verwendet. Die Ergebnisse sind als Mittel von 6 Tieren pro Gruppe dargestellt.
8 zeigt die Zeitentwicklung der mittleren Verletzungpunktszahl von Mäusen, die mit HSV-1 (Stamm F) infiziert waren, gefolgt von der Vorbehandlung der Mäuse mit der Poloxamerformulierung allein für 5 Minuten (,) oder 1 Stunde (₊) vor der Infektion oder mit der Poloxamerformulierung enthalten 5% SLS ebenfalls für 5 Minuten (_#) oder 1 Stunde (_%) vor der Infektion. Infizierte, unbehandelte Mäuse wurden als Kontrolle (.) verwendet. Die Ergebnisse sind als Mittel von 6 Tieren pro Gruppe dargestellt.
9 zeigt die Zeitentwicklung der mittleren Verletzungpunktszahl (Feld A) und Überlebensrate (Feld B) der Mäuse, die intravaginal mit HSV-2 (Stamm 333) infiziert waren, vorbehandelt mit dem Gel alleine (_|,%,#) 5 Minuten vor der Infektion. Infizierte, unbehandelte Mäuse wurden als Kontrolle (_.,+,_|) verwendet. Ergebnisse sind als Mittel von 8 Tieren pro Gruppe angegeben.
10 zeigt die Zeitentwicklung der Überlebensrate der Mäuse, die intravaginal mit HSV-2 (Stamm 333) infiziert waren, vorbehandelt mit 2,5% SLS (₄) oder Gel + 2,5% SLS (_#) 5 Minuten vor der Infektion. Infizierte, unbehandelte Mäuse wurden als Kontrolle (.) verwendet. Die Ergebnisse sind als Mittel von 8 Tieren pro Gruppe dargestellt.
11 zeigt die Zeitentwicklung des Überlebens von Mäusen, die intravaginal mit HSV-2 (Stamm 333) infiziert waren, vorbehandelt mit Gel + 5% Polyoxythylen 40 Stearat (_#), Gel + 5% Guanidin (,), Gel + 2,5% Lauroylsarcosin (_%), Gel + 2,5% Benzalkoniumchlorid (₊) oder Gel + 5% Tween 80 (..) 5 Minuten vor der Infektion. Infizierte, unbehandelte Mäuse wurden als Kontrolle (.) verwendet. Die Ergebnisse sind als Mittel von 7 von 10 Tieren pro Gruppe gezeigt.
16 zeigt die Zeitentwicklung der mittleren Verletzungspunktzahl (Feld A) und Überlebensrate (Feld B) von haarlosen Mäusen, die cutan mit HSV-1 infiziert waren und topisch mit Poloxamer allein (_|), 0,5% Foscarnet in wässriger Lösung (,) oder Poloxamer enthaltend 0,5% Foscarnet (_#) behandelt wurden. Infizierte, unbehandelte Mäuse wurden als Kontrolle (.) verwendet. Die Behandlung wurde 24 Stunden nach der Infektion gestartet und wurde 3 Mal täglich für 4 Tage wiederholt. Die Werte sind als Mittelwert von 4 Tieren pro Gruppe angegeben.
17 zeigt die Zeitentwicklung der mittleren Verletzungspunktzahl (Feld A) und Überlebensrate (Feld B) von haarlosen Mäusen, die cutan mit HSV-1 (Stamm F) infiziert wurden und 24 Stunden nach der Infektion mit einer einfachen Anwendung entweder von Poloxamer enthaltenden 5% Acyclovir (_#) oder Zovirax^® Salbe (,) behandelt wurden. Infizierte, unbehandelte Mäuse (.) wurden als Kontrolle verwendet. Die Werte wurden als Mittel von 7 von 10 Tieren pro Gruppe angegeben.
18 zeigt die Zeitentwicklung der mittleren Verletzungspunktzahl (Feld A) und Überlebensrate (Feld B) von haarlosen Mäusen, die cutan mit HSV-1 (Stamm F) infiziert waren und mit dem Poloxamer allein (_|), Poloxamer enthalten 5% Acyclovir (_#) oder Zovirax^® Salbe (,) behandelt wurden. Infizierte, unbehandelte Mäuse (.) wurden als Kontrolle verwendet. Die Behandlung wurde 5 Tage nach der Infektion gestartet und wurde 3 Mal täglich für 4 Tage wiederholt. Werte wurden als Mittelwert von 7 von 10 Tieren pro Gruppe angegeben.
19 zeigt die Verteilung von Foscarnet (_+,%) und Acyclovir (_,#) in Hautgewebe von nichtinfizierten (Felder A, C, E) und infizierten (Felder B, D, F) Mäusen 24 Stunden nach ihrer topischen Anwendung, entweder in Phosphatpuffer (offene Symbole) oder mit dem Poloxamer (ausgefüllte Symbole). Die Felder A und B zeigen die Verteilung von Foscarnet und Acyclovir in stratum corneum Streifen. Die Felder C und D zeigen die Konzentration von Foscarnet und Acyclovir in der Epidermis, wobei die Felder E und F die Konzentration von Foscarnet und Acyclovir in der Dermis zeigen. Werte sind als Mittelwert von 4 von 6 Tieren pro Gruppe angegeben.
20 zeigt die Konzentration von Acyclovir im Plasma von nichtinfizierten und infizierten Mäusen 24 Stunden nach ihrer topischen Anwendung, entweder in Phosphatpuffer (offene Balken) oder in Poloxamer (ausgefüllte Balken). Die Werte sind als Mittelwert von 4 von 6 Tieren pro Gruppe angegeben.
21 zeigt die Zeitentwicklung der mittleren Verletzungspunktzahl (Feld A) und Überlebensrate (Feld B) von haarlosen Mäusen, die cutan mit HSV-1 (Stamm F) infiziert wurden, behandelt mit dem Poloxamer allein (_|), Poloxamer enthalten 3% Foscarnet (,), Poloxamer enthalten 5% SLS (_#) oder Poloxamer enthalten 3% Foscarnet und 5% SLS (₊). Infizierte, unbehandelte Mäuse (.) wurden als Kontrolle verwendet. Die Ergebnisse sind als Mittelwert von 5 pro Gruppe dargestellt.
22 zeigt die Suszeptibilität von HSV-1 (Stamm F) gegenüber Kombinationen von verschiedenen Konzentrationen von Foscarnet und SLS in Verozellen. Die Werte sind als Mittelwert ± Standardabweichung von drei Bestimmungen angegeben.
Gel Formulierungen
Poloxamer 407 ist ein Blockcopolymer von Polyoxythylen und Polyoxypropylen in einem 7:3 Gewichtsverhältnis mit einem durchschnittlichem Molekulargewicht von 12 500. Eine wichtige Charakteristik dieses Blockcopolymers ist seine Fähigkeit, thermoreversible Gele zu bilden. Der Übergang vom flüssigen Zustand bei niedriger Temperatur zum Gelzustand bei Körpertemperatur (wobei die Phasenübergangstemperatur z.T. von der Konzentration des Gels, der Ionenstärke und der eingeschlossenen gelösten Substanzen abhängt) erlaubt eine Anzahl von interessanten medizinischen Anwendungen einschließlich topischen Applikationen. Eine solche Eigenschaft ist von äußerster Wichtigkeit, da, wenn es in seinem flüssigen Zustand topisch auf die Schleimhaut aufgetragen wird, erlaubt die Gelformulierung eine bessere Penetration in die Unregelmäßigkeiten der Haut und/oder der Schleimhäute während der Anwendung und eine längere Persistenz, sobald das Gel die Körpertemperatur erreicht hat. Aufgrund der extrem niedrigen Toxizität und Irritationen unserer Gelformulierungen stellen sie einen attraktiven Ansatz für topische Wirkstoffabgabesysteme dar. Details für die Herstellung der Gelformulierung werden nachfolgend bereit gestellt. Die Erfindung deckt Gelformulierungen von Poloxamer 407 von jeglicher geeigneter Konzentration und insbesondere solche zwischen ungefähr 10 und 35% w/w ab. Die Erfindung deckt ebenfalls weitere filmbildende Komponenten, Gel, Creme, Salben oder thermoreversible Substanzen einschließlich weiterer Poloxamere, Poloxamine oder Chemikalien ab.
Wirkstoffe
Jedes mikrobizide, bakterizide, virizide, chemotherapeutisches, entzündungshemmendes, antineoplastisches, immunmodulierendes Mittel oder Kombinationen von diesen, welches wirksam ist in der Verhinderung oder Behandlung von Infektionen und/oder abnormalen Zuständen von Schleimhäuten und/oder Haut, die durch jegliches Pathogen und/oder jegliche Krankheit verursacht werden, die im Bereich dieser Erfindung liegen, kann angewendet werden. Jedes Detergenz, welches die Membran von Pathogenen zerstören kann, jedes Mittel, das die Hautpenetration verstärkt, das die Penetration von Wirkstoffen und/oder Wirkstoffträgern in die Schleimhäute und/oder Haut steigert, jeder mikrobielle Adsorbtionsinhibitor, welcher den Eintritt des Pathogens in die Zielzelle verhindert, jedes Cytokin oder Antigen, das eine Immunantwort stimmuliert, das vor der Pathogeninfektion schützt, ist ebenfalls im Bereich dieser Erfindung. Diese Erfindung deckt ebenfalls Kombinationen von topischen Formulierungen und/oder Wirkstoffen ab.
Beispiele, die unsere Gelformulierung zur Verhinderung von Infektionen verwenden
Die folgenden Beispiele dienen der Demonstration der Zusammensetzung der Gelformulierung, die wirksam sein können, um Infektionen und/oder abnormale Zustände von Schleimhäuten und/oder Haut zu verhindern, die durch jegliches Pathogen und/oder jegliche Krankheit verursacht werden, sollen aber in keinster Weise den Bereich der vorliegenden Erfindung einschränken.
Herstellung der Gelformulierungen
Die Gelformulierungen werden hergestellt durch Zugabe eines geeigneten Volumens destillierten Wassers, Puffers oder jeglicher anderer geeigneter wässriger Lösung zu dem Poloxamer 407, um die gewünschte Konzentration zu erhalten. Eine geeignete Menge des Wirkstoffs wird dann entweder zu dem Pulver oder der Lösung des Poloxamers hinzugegeben, um die gewünschte Konzentration zu erreichen. Der pH-Wert der Gelformulierung kann eingestellt werden, um die Voraussetzungen für jedes Zielgewebe zu erfüllen, das mit den vorliegenden Formulierungen bedeckt werden soll. Zum Beispiel wird eine saure Lösung mit einem pH-Wert von ungefähr 4,0 bis 4,5 verwendet werden, wenn die Formulierungen verwendeten werden sollen, um die Vaginalschleimhaut zu bedecken. Der Prozentsatz an Polymer kann entsprechend angepasst werden, um eine adäquate Übergangstemperatur vom flüssigen zum festen Zustand zu erreichen. Diese Anpassungen sind durch die Kenntnisse und Fähigkeiten des Fachmanns leicht erzielbar.
Obwohl die Beschreibung dieser Erfindung auf spezifische Fälle begrenzt ist, ist jede filmbildende Komponente und/oder Wirkstoff und/oder Liposomen (oder weitere Wirkstoffträger) oder jegliche Kombination der obigen als potenzielle Kandidaten für die Entwicklung dieser topischen Zusammensetzungen angesehen und sind im Bereich dieser Erfindung. Die Formulierungen schließen ebenfalls jede filmbildende Komponente und/oder Wirkstoff und/oder Liposomen (oder andere Wirkstoffträger) oder jegliche Kombination von diesen Produkten bei jeder geeigneten Konzentration ein.
In vitro Infektiosität von Herpes Viren vorbehandelt mit SLS oder DS
Der Effekt der Vorbehandlung von verschiedenen Stämmen von Herpesviren mit SLS oder DS auf ihre virale Infektiosität gegenüber empfänglichen Zellen ist beurteilt worden. Kurz dargestellt, wurden Zellen in 24 Well-Mikrotitier Platten (Costar, Montreal, QC, Canda) gesetzt. Vor der Infektion wurde der Virus entweder im Kulturmedium oder Phosphatgepufferten Saline („Phosphate buffered saline", PBS) suspendiert oder mit verschiedenen Konzentrationen SLS in PBS für eine Stunde bei 37°C inkubiert. Zugleich wurden die Zellen mit einer Viralsuspension durch Zentrifugieren der Platten (750 × g für 45 Minuten bei 20°C) inkubiert, um die Virusadsorbtion zu erlauben. Die Viren wurden entfernt und die Zellschichten („ceel sheets") wurden dann mit 0,5 mm 0,6% Agarose Seaplaque (Marine Colloids, Rockland, MA) überschichtet, hergestellt in einem geeignetem Kulturmedium. Die Platten für 2 Tage bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden dann mit 10% Formaldehyd in PBS für 20 Minuten fixiert, mit entionisierten Wasser gewaschen und mit 0,05% Methylenblau gefärbt. Die virale Infektiosität wurde durch die Bestimmung der Plaquebildungseinheiten (PFU) beurteilt.
Tabelle 1 zeigt, das die Vorbehandlung von zahlreichen HSV-1 und HSV-2 Stämmen mit SLS für 1 Stunde bei 37°C die Infektiosität von Verozellen in einer konzentrationsabhängigen Weise verringerten. HSV-1 (Stamm F) Infektiosität wurde um 21% reduziert, wenn die viralen Partikel mit 25 μM SLS vorbehandelt wurden. Die Infektiositäten von allen HSV-2 Stämmen waren zwischen 50 bis 70% nach einer Pre-Inkubation mit 25 μM SLS. Ein vollständiger Verlust der Infektiosität von allen Stämmen, die getestet wurden, wurde nach einer Vorbehandlung der Viren mit 50 μM SLS erhalten. Die Pre-Inkubation von Verozellen für 1 Stunde bei 37°C mit SLS Konzentrationen im Bereich von 6,25 bis 100 μM vor ihrer Infektion mit HSV-1 (Stamm F) resultierte nicht in einem Verlust der Infektiosität des Virus (Daten sind nicht gezeigt). Diese Ergebnisse legen nahe, das SLS direkt an den Virus und nicht an den Zellen wirkt.
Tabelle 1:
Infektiosität von zahlreichen HSV-1 und HSV-2 Stämmen, die mit verschiedenen Konzentrationen von SLS für eine Stunde bei 37°C vorbehandelt wurden.

^aWild-Typ Stamm
^bAcyclovir-resistenter Stamm
^cFoscarnet-resistenter Stamm

1 zeigt den Effekt der Vorbehandlung des HSV-1 (Stamm F) mit verschiedenen Konzentrationen von SLS oder DS auf seine Infektiosität gegenüber Verozellen. Wenn SLS direkt zu den Verozellen nach ihrer Infektion hinzugegeben wurde, war der Verlust an viraler Infektiosität weniger stark verglichen zu dem, der erhalten wurde, wenn der Virus für 1 Stunde bei 37°C mit den gleichen SLS Konzentrationen vorbehandelt wurde. Nach der Vorbehandlung wurde ein Verlust von 50% der viralen Infektiosität bei einer Konzentration von 20 μM verglichen mit 75 μM erhalten, wenn der Virus nicht vorbehandelt wurde. Obwohl zusätzlich eine vollständige Inhibition der viralen Infektiosität nach einer Pre-Inkubation mit 50 μM SLS erhalten wurde, war die Inhibierung selbst bei 100 μM ohne Vorbehandlung nicht vollständig. Die Vorbehandlung von HSV-2 (Stamm 333) mit SLS beeinflusste ebenfalls ähnlich die Infektiöisität dieses Stammes (Daten nicht gezeigt). Andererseits reduziert DS die Infektiosität von Viren unabhängig davon, ob der Virus mit DS vorbehandelt wurde. In diesem Fall war ein Verlust von 50% der viralen Infektiosität bei einer Konzentration von ungefähr 1 nM beobachtet worden.
The Lebensfähigkeit von Verozellen, die für 1 Stunde bei 37°C gegenüber SLS oder DS Konzentrationen ähnlich wie solche, die in 1 und Tabelle 1 verwendet wurden, ausgesetzt waren, wurden ebenfalls unter Verwendung eines MTS Testes getestet. Es konnten keine Zeichen von Zytotoxizität im Bereich von Konzentrationen, die verwendet wurden, gezeigt werden (Daten nicht gezeigt).
2 zeigt die Wirksamkeit von verschiedenen Konzentrationen von SLS (Feld A) oder DS (Feld B) gegen HSV-1 (Stamm F) in Verozellen. Kurz gesagt, wurden die Zellen mit dem Virus für 2 Stunden bei 37°C infiziert. Danach wurde der Überstand entfernt und die Zellen wurden mit 0,5 ml EMEM und + 2% FBS enthalten 0,6% Agarose Seaplaque und SLS oder DS bei der gewünschten Konzentration überschichtet. Die Platten wurden dann für 2 Tage bei 37°C in einer 5% CO₂ Atmosphäre überschichtet. Die Zellen wurden mit 10% Formaldehyd in PBS für 20 Minuten fixiert, mit entionisiertem Wasser gewaschen und mit 0,05% Methylenblau gefärbt. Die virale Infektiosität wurde gefolgt von der Bestimmung von PFU beurteilt. Die Ergebnisse zeigen, dass beide SLS und DS in einer konzentrationsabhängigen Weise die virale Replikation in einer ähnlichen Weise mit vollständiger Wirksamkeit bei 100 μM und 20 nM für jeweils SLS und DS reduziert wurde. Ohne an einen bestimmten Mechanismus gebunden zu sein, legen die obigen Ergebnisse nahe, dass SLS einen mikrobiellen Adhesionsinhibitoreffekt aufweist.
In vitro Infektiosität von HIV-1 vorbehandelt mit SLS
Der Effekt der Vorbehandlung von HIV-1 (Stamm NL4-3) mit SLS auf seine Infektiosität gegenüber 1G5-Zellen, einem Jurkat E6-1 Derivat, das zwei stabile integrierte Konstrukte beherbergt, die von dem Luziferase Gen unter der Kontrolle von HIV-1_SF2 LTR hergestellt wurden, wurden beurteilt. Kurz beschrieben wurde der Virus vor der Infektion entweder mit den Kulturmedium oder 500 μM SLS für 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Die Zellen (1 × 10⁵ Zellen/Well) wurden dann mit HIV-1 Stamm NL4-3 (10 ng p24) für 2 Stunden bei 37°C bei 5% CO₂ Atmosphäre inkubiert. Danach wurden die Zellen gewaschen, in 200 μL vollständigem Kulturmedium resuspendiert und in eine 96-Well Gewebekultur Platte mit flachem Boden (Mikrotest III, Falcon; Becton Dickison, Lincoln Park, NJ) transferiert. Nach einer Inkubationszeit von 48 Stunden bei 37°C wurden die Zellen lysiert, einem Gefrier-Auftau-Zyklus unterzogen und die Luziferase Aktivität wurde unter Verwendung eines Mikroplattenluminometers (MLX; Dynex Technologies, Chantilly, VA) gemessen. Die Ergebnisse dieses Ansatzes zeigten deutlich, dass die Vorbehandlung von HIV-1 (Stamm NL4-3) mit 500 μM SLS für 1 Stunde bei 37°C fast vollständig die HIV-1 Infektiosität gegenüber 1G5 Zellen inhibiert (3).
Elektronenmikroskopie von Verozellen, die mit HSV-1 (Stamm F), vorbehandelt mit SLS, infiziert sind
Die Erscheinung von HSV-1 (Stamm F) vorbehandelt mit variierenden Konzentrationen SLS (50, 75 und 100 μM) für 1 Stunde bei 37°C in Verozellen wurde unter Verwendung eines Elektronenmikroskops beurteilt. Kurz beschrieben wurden die Zellen (80-90% konfluent) mit dem Virus infiziert (ungefähr 70 PFU/ml in 14 ml) für 48 Stunden bei 37°C in einer 5% CO₂ Atmosphäre. Die Zellen wurden von den Platten gekratzt und im Kulturmedium resuspendiert. Die Zellen wurden zentrifugiert (515 × g für 10 Minuten bei 4°C) und der Überstand wurde dekantiert und die Zellen wurden in ungefähr 500 μL Medium resuspendiert. Die Zellen wurden in ein Eppendorf-Röhrchen transferiert und zentrifugiert bei (10.000 × g für 5 Minuten bei 4°C). Das Pellet wurde in ungefähr 200 μL 20% Rinderserumalbumin („bovine serum albumin", BSA) resuspendiert. Es wurden wenige Tropfen von 25% Glutaraldehyd zu der Mischung gegeben und die Proben wurden sofort in ein Eisbad gegeben, um die BSA Polymerisation zu ermöglichen. Das Pellet wurde dann in 1 mm³ Proben zerschnitten, welche dann in 2% Glutaraldehyd in PBS für 1 Stunde, 1% OsO₄ in PBS für 1 Stunde und dann mit 0,1% Gerbsäure in PBS für 30 Minuten fixiert. Die Proben wurden dreimal in PBS für 5 Minuten zwischen jedem Schritt gespült. Die Proben wurden mit 2% Uranylacetat in 10% Ethanol für 30 Minuten gefärbt. Die Proben wurden dehydratisiert und durch Routineverfahren in Epon eingebettet. Abschnitte (ungefähr 75 nm Dicke) wurden auf einem Kupfergitter (200 Mesh) befestigt. Proben wurden mit Uranylacetat gefärbt, mit Bleizitrat gegengefärbt und mit einem JEOL 1010 Elektronenmikroskop (JEOL Canada Inc., St.-Hubert, QC, Canada) untersucht.
4 (Feld A) zeigt die normale Erscheinung des Viruses in dem Kern von Verozellen. Die viralen Partikel sind aus einem Kapsid, der eine hexagonale Form aufweist, zusammengesetzt und enthalten einen elektronenreichen DNA Kern. Vollständige virale Partikel, die durch ein Nukleokapsid, umhüllt von einer Hülle, gebildet wurden, wurden ebenfalls mit Cytoplasma der meisten Zellen gefunden. In Verozellen, die mit Viren infiziert waren, die mit 50 (Feld B), 75 (Feld C) und 100 (Feld D) μM SLS infiziert waren, konnten virale Partikel im Kern, aber nicht im Cytoplasma der Zelle wiedergewonnen werden. Im Kern konnte kein reifes Nukleokapsid beobachtet werden, aber die viralen Partikel bestanden aus Kapsiden, die eine diskrete Anhäufung von elektronenreichem Material enhalten. Die Anzahl von leeren Kapsiden, die im Kern der Zelle gefunden wurden, die mit Viren infiziert waren, die mit SLS vorbehandelt wurden, nahm mit ansteigender Konzentration des Wirkstoffs, der in der Vorbehandlung verwendet wurde, ab. In Zellen, die mit Viren infiziert waren, die mit 100 μM SLS vorbehandelt waren, konnten nur wenige Zellen mit leeren Kapsiden im Kern beobachtet werden. Zusammengefasst könnte dieses Ergebnis den Verlust der Infektiosität von Herpesviren in der Gegenwart von SLS erklären.
Quantifizierung des HSV Glykoprotein D Gens
Die Quantifizierung des Glykoprotein D Gens des HSV-1 (Stamm F), das mit SLS vorbehandelt war, wurde ebenfalls in Verozellen beurteilt, um die Anwesenheit von viraler DNA in den infizierten Zellen zu bestimmen. Kurz beschrieben, wurde HSV-1 (Stamm F) mit verschiedenen SLS Konzentrationen (12,5, 25, 50, 75 und 100 μM) in EMEM +2% FBS für 1 Stunde bei 37°C vorbehandelt. Verozellen (80-90% konfluent) wurden mit dem Virus infiziert (100 PFU/ml in 20 ml) für 48 Stunden bei 37°C in einer 5% CO₂ Atmosphäre. Das Kulturmedium wurde entfernt und die Zellenschicht wurde zweimal mit 1 × HBSS gewaschen. Die Zellen wurden von den Platten gekratzt und in EMEM + 2% FBS resuspendiert. Die gesamte DNA wurde unter Verwendung eines standard Phenol/Chloroformverfahrens extraktiert. Die Quantifizierung der gesamten DNA wurde unter Verwendung des Burton Verfahrens erzielt. Die Probe, die für diese Untersuchung verwendet wurde, korrespondiert zu einem Teil des Glycoproteins D von HSV-2 (Stamm 333), erzeugt durch PCR unter Verwendung der folgenden Primer:
P1 (5'-GCCACCATGGGGCGTTTGACC-3') und
P2 (5-AAACTCAGTTATCTAGCCTCGGGGTC-3')
und war [³²P] gelabelt durch Random Priming. Die Hybridisierung wurde bei 65°C in 0,25 M Na₂HPO₄ (pH 6,8 mit Orthophosphorsäure) und 7% SDS durchgeführt. Waschungen wurden in 40 mM Na₂HPO₄ (pH 6,8 mit Orthophosphorsäure) und 1% SDS für 20 Minuten bei 65°C gefolgt von 20 Minuten bei 25°C durchgeführt.
5 (Feld A) zeigt die Quantifizierung des Glycoproteins D Gens von HSV-1 (Stamm F) vorbehandelt mit unterschiedlichen Konzentrationen SLS in Verozellen. Nach 48 Stunden Inkubation wurden die Zellen gesammelt und die gesamte DNA extrahiert. Feld A zeigt Bg/II-fragmentierte DNA Aliqoute (325 ng) aufgetragen auf ein 0,8% Agarose Gel, übertragen auf eine Nylonmembran und hybridisiert mit der Glycoprotein D Probe. Feld B zeigt die quantitativen Messungen von HSV-1 DNA Gehalten, die durch Scanning Densitometrie des Autoradiogramms unter Verwendung eines Alphamagers erhalten wurde. Es wurde keine große Modifikation in der Expression des Glycoproteins D Gens des Virus beobachtet in Zellen, die mit HSV-1 (Stamm F) infiziert waren, die mit 12,5, 25 und 50 μM SLS vorbehandelt waren im Vergleich zur Kontrolle. Quantitative Messungen von HSV-1 DNA Gehalten, die durch Scanning Densitometrie des Autoradiogramms erhalten wurden, waren ähnlich (Feld B). Wenn der Virus jedoch mit höheren Konzentrationen SLS (75 und 100 μM) vorbehandelt war, wurde eine merkliche Reduktion in der Expression des Glycoproteins D Gens mit einer Reduktion in den DNA Gehalten von jeweils 65,1% bzw. 34,9% der Kontrollwerte beobachtet. Diese Daten legen nahe, dass SLS mit der Reifung von viralen Nukleokapsiden entweder durch Reduktion ihrer Reifungsgeschwindigkeit oder durch Interferieren mit dem Einschließen der DNA in die Kapsidhülle interferiert.
In vivo Infektiosität von Herpesviren, die mit SLS (intranasales Modell) vorbehandelt sind
Der Effekt des Vorbehandels von HSV-2 (Stamm 22) mit SLS auf die virale Infektiosität wurde ebenfalls durch ein mausartiges intranasales Infektionsmodell beurteilt. Kurz beschrieben, wurden weibliche Balb/c Mäuse (Charles River Breeding Laboratories Inc., St.-Constant, QC, Canada), die 4 Wochen alt waren, in dieser ganzen Studie verwendet. Vor der Infektion wurde HSV-2 (Stamm 22) für 1 Stunde bei 37°C mit PBS oder mit verschiedenen Konzentrationen SLS (6,25, 25 oder 100 μM) inkubiert, um ein endgültiges virales Inoculum von 2.000 PFU/20 μL zu erreichen. Die Mäuse wurden leicht anästhesiert unter Verwendung von Aerrane^® (Isofluran, USP; Janssen, North York, ON, Canada) und die virale Suspension (20 μL Gesamtvolumen) wurde in das externe linke Nasenloch der Mäuse verabreicht. Die Mäuse wurden in ihre Käfige zurückgebracht und das Überleben wurde täglich beobachtet.
6 zeigt, dass alle Mäuse, die mit dem unbehandelten Virus infiziert waren, zwischen Tag 9 und Tag 11 an Encephalitis starben. Im Gegensatz dazu überlebten 67% der Mäuse, die mit den viralen Inoculum, das mit 6,25 und 25 μM SLS vorbehandelt waren, die Infektion. Dabei ist vom höchsten Interesse, dass alle Mäuse, die mit einer viralen Suspension infiziert wurden, die mit 100 μM SLS vorbehandelt war, die Infektion überlebten und keine Zeichen von Krankheit zeigten.
In vivo Infektiosität von Herpesviren, die mit SLS oder DS vorbehandelt wurden (cutanes Modell)
Der Effekt der Vorbehandlung von HSV-1 (Stamm F) mit SLS auf die virale infektiosität ist ebenfalls in einem cutanem Mausinfektionsmodell beurteilt worden. Weibliche haarlose Mäuse (SKH1; Charles River Breeding Laboratories Inc., St.-Constant, QC, Kanada), die 5 bis 6 Wochen alt waren, wurden durchgehend in dieser Studie verwendet. Vor der Infektion wurde HSV-1 (Stamm F) für 1 Stunde bei 37°C mit PBS, mit 6,25, 25 oder 100 μM SLS oder 0,25, 1 oder 10 nM DS inkubiert, um ein virales Inoculum von 3 × 10⁵ PFU/50 μL zu erhalten. Die Mäuse wurden durch eine intraperitoneale Injektion einer Mischung enthaltend 70 mg/kg Ketamin Hydrochlorid (Rogarsetic Injektion USP; Rogar/STB Inc. Montreal, QC, Kanada) und 11,5 mg/kg Xylazin (Rompun^®; Miles Canada Inc., Etobicoke, ON, Kanada) anästhesiert. Der Virus wurde auf der lateralen Seite des Körpers im linken Lendenhautbereich inokuliert. Die Haut wurde 6 Mal in einem querschraffierten Muster mit einer Kanüle Nummer 27, die vertikal gehalten wurde, angeritzt. Die virale Suspension (50 μL) wurde auf den verletzten Bereich aufgetragen und für 10 bis 15 Sekunden mit einem baumwollbestückten Applikator, der mit EMEM + 2% FBS oder SLS oder DS Lösungen gesättigt war, eingerieben. Der eingeritzte Bereich wurde mit einem Hühneraugenpflaster („corn cushion") geschützt, welcher mit einem medizinischem Klebestreifen am Körper der Mäuse gehalten wurde. Die poröse innere Wand der Öffnung des Hühneraugenpflasters wurde mit Gewebeklebstoff vor der Anwendung undurchlässig gemacht, um die Absorbtion des Wirkstoffs zu verhindern. Die Öffnung des Hühneraugenpflasters wurde ebenfalls mit medizinischem Gewebeband verschlossen. Die Mäuse wurden in ihre Käfige zurückgebracht und zweimal täglich beobachtet.
7 zeig die Zeitentwicklung der mittleren Verletzungszahl von haarlosen Mäusen, die cutan mit HSV-1 (Stamm F) infiziert wurden, die mit verschiedenen Konzentrationen von SLS oder DS für 1 Stunde bei 37°C vorbehandelt wurden. Die Beurteilung der Verletzungszahl wurde gemäß den Kriterien, die in Tabelle 2 vorgestellt werden, durchgeführt. Bei infizierten, unbehandelten Mäusen wurden keine pathologischen Zeichen von cutaner Infektion während der ersten vier Tage nach der Infektion sichtbar und nur der angeritzte Bereich blieb sichtbar. Am Tag 5 begannen Herpeshautverletzungen bei einigen Mäusen in Form von kleinen Vesikeln zu erscheinen, die von der Inokulationsstelle entfernt waren. Am Tag 6 entwickelten fast alle unbehandelten Mäuse Herpeshautverletzungen in Form von einem 4-5 mm breitem Band, das sich vom Rückgrat zu der Bauchmittellinie der infizierten Dermatome ähnlich zu Zoster-ähnlichen Infektionen ausbreitete. Die maximale mittlere Verletzungszahl wurde am Tag 8 beobachtet. Die mittlere Verletzungszahl verringerte sich fortan von Tag 11 bis Tag 15, aufgrund des spontanen Rückgangs von cuntanen Verletzungen bei einigen Mäusen. Mäuse, die mit dem Virus infiziert wurden, der mit 6,25 und 25 μM SLS vorbehandelt war, zeigten keine signifikante Reduktion der mittleren Verletzungszahl. Mäuse, die jedoch mit dem Virus infiziert wurden, der mit 100 μM SLS vorbehandelt war, zeigten keine Zeichen von cutanen Verletzungen. Von äußerster Wichtigkeit ist, dass alle Mäuse, die mit dem Virus infiziert wurden, der mit 100 μM SLS vorbehandelt war, die Infektion überlebten (Daten nicht gezeigt). Auf der anderen Seite zeigten Mäuse, die mit dem Virus infiziert wurden, der mit 0,25 nM DS vorbehandelt war, einen teilweisen Rückgang der mittleren Verletzungszahl, wobei Mäuse, die mit Virus infiziert wurden, der entweder mit 1 oder 10 nM DS vorbehandelt wurde, einen besseren Schutz gegen die Entwicklung von Herpesverletzungen aufwiesen. Tabelle 2: Kriterien, die für die Beurteilung von cutanen Herpesverletzungen verwendet wurden
In vivo prophylaktischer Effekt der Poloxamer Formulierungen enthaltend oder nicht enthaltend SLS (cutanes Modell)
Die Wirksamkeit von Poloxamer allein oder von Poloxamer enthaltend 5% SLS, um die Entwicklung von cutanen Verletzungen der Mäuse zu verhindern, wurde ebenfalls bewertet. In dieser Studie wurden durchweg weibliche haarlose Mäuse (5 bis 6 Wochen alt) verwendet. In Kürze beschrieben, wurden die Mäuse durch eine intraperitonale Injektion einer Mischung enthalten 70 mg/kg Ketamin Hydrochlorid und 11,5 mg/kg Xylazin anästhesiert. Die Formulierungen wurden topisch auf die Lateralseite des Körpers im linken Lendenhautbereich aufgetragen. 5 Minuten und 1 Stunde nach der Anwendung wurde 1 Tropfen virales Inokulum (3,15 × 10⁸ PFU/ml) auf die Haut aufgetragen und eine Einritzung wurde mit einer Nadel Nummer 27G über den Tropfen erzeugt, um einen Unfall zu imitieren, der Pflegepersonal passieren kann. In diesem Modell muss das virale Inokulum höher sein, um eine vollständige Zoster-förmige Hautrötung in fast allen Mäusen zu erzielen. Die Mortalität, die mit der Infektion verbunden war, war jedoch gering und konnte nicht verwendet werden als Kriterium zur Beurteilung der Wirksamkeit der Behandlungen. Der eingeritzte Bereich wurde mit einem Hühneraugenpflaster geschützt, welcher mit einem medizinischen Klebeband am Körper der Mäuse befestigt wurde. Die Öffnung des Hühneraugenpflasters wurde mit medizinischem Klebeband verschlossen. Die Mäuse wurden dann zu ihren Käfigen zurückgebracht und zweimal am Tag beobachtet.
8 zeigt die Zeitentwicklung der mittleren Verletzungspunktzahl von infizierten, unbehandelten Mäusen und von Mäusen, die mit Poloxamer allein oder Poloxamer enthalten 5% SLS 5 Minuten oder 1 Stunde vor ihrer cutanen Infektion mit HSV-1 (Stamm F) vorbehandelt wurden. Die Resultate zeigen, dass Mäuse, die mit Gel allein 5 Minuten oder 1 Stunde vor der Infektion vorbehandelt wurden, lediglich einen mäßigen Schutz gegen die Entwicklung von cutanen Verletzungen aufweisen. Von hohem Interesse ist, dass die Mäusen, die sowohl 5 Minuten oder 1 Stunde mit Poloxamer enthalten 5% SLS vorbehandelt wurden, ein vollständiger Schutz gegen die Entwicklung von cutanen Lesionen beobachtet wurde. Diese Ergebnisse zeigen das große Potenzial unserer Formulierungen als einen prophylaktischen Ansatz zur Verhinderung von Infektionen mit Pathogenen. Solch ein Werkzeug könnte tatsächlich Schutz gegen zufällige Infektionen von Pflegepersonal bieten.
In vivo Wirksamkeit von Gelformulierungen, um gegen Infektionen zu schützen, die durch Herpesviren verursacht werden (intravaginal Modell)
Die Wirksamkeit von Gelformulierungen, um die genitale Übertragung von HSV-2 zu verhindern, ist in einem Mausintravaginalinfektionsmodell beurteilt worden. Kurz beschrieben, wurden weibliche Balb/c Mäuse, die 4 Wochen alt waren, für diese Studie verwendet. Um die Suszeptilität von Mäusen gegenüber Herpes zu erhöhen, wurden 2,5 mg Progesteron (Depo-Provera) jeder Maus 7 Tage vor und 1 Tag nach der Inokulation mit HSV-2 subcutan verabreicht. Die anästhesieren Mäuse wurden mit 5 μL von 2,4 × 10⁷ PFU/ml HSV-2 (Stamm 333) inokuliert, nachdem die Vagina mit einem Kalziumalginat dünn beschichteten Tupfer abgestrichen wurde. Um die Wirksamkeit der Gelformulierungen zu bestimmen, Herpesinfektionen zu blockieren, wurden wenige Minuten vor der Inokulation 15 μL des Gels mit einer Pipettenspitze in die Vagina abgegeben. Die Pipettenspitze wurde viermal ein- und ausgeführt, um rührende Handlungen von Geschlechtsverkehr zu simulieren, wobei darauf acht gegeben wurden, dass keine Blutung erzeugt wurde.
9 zeigt die mittlere Verletzungspunktzahl und Überlebensrate von infizierten, unbehandelten Mäusen und von Mäusen, die vor der Infektion mit HSV-2 (Stamm 333) intravaginal mit dem Gel allein vorbehandelt wurden. 4 Tag nach der Infektion zeigten die infizierten, unbehandelten Tiere perineale Oedeme und Rötungen und zwischen 6 und 10 Tagen starben die meisten von ihnen an Encephalitis. Von äußerster Wichtigkeit ist, dass alle Mäuse, die mit dem Gel alleine vorbehandelt wurden, die Infektion überlebten und keine Zeichen von Krankheit bis zu 16 Tage nach der Infektion zeigten. Die Anwesenheit des Gels allein konnte daher die HSV-2 Infektion abwehren.
10 zeigt die Überlebensrate von infizierten, unbehandelten Mäuse und von Mäusen, die intravaginal mit 2,5% SLS oder Gel enthaltend 2,5% SLS vor der Infektion mit HSV-2 (Stamm 333) vorbehandelt wurden. 4 Tage nach der Infektion zeigten die infizierten, unbehandelten Tiere perineale Oedeme und Rötungen und zwischen den Tagen 6 bis 12 starben die meisten von ihnen an Encephalitis. Von äußerster Wichtigkeit ist, dass alle Mäuse, die entweder mit 2,5% SLS allein oder mit Gel enthaltend 2,5% SLS vorbehandelt waren, die Infektion überlebten und keine Zeichen der Krankheit bis zu 16 Tage nach der Infektion zeigten. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse klar, dass die Verwendung von unserer Gelzubereitung eine innovative, präventive Maßnahme darstellt, um die sexuelle Übertragung von Herpes, HIV oder anderen Pathogenen, die STDs verursachen, reduziert.
11 zeigt die Überlebensrate von infizierten, unbehandelten Mäusen und von Mäusen, die intravaginal mit Gel enthaltend zahlreiche Verbindungen vor der Infektion mit HSV-2 (Stamm 333) vorbehandelt wurden. Diese Verbindung wurden ausgewählt, um weitere sulfatierte und nicht-sulfatierte Verbindungen darzustellen, die Detergenzeigenschaften aufweisen oder nicht. Sie stellen ebenfalls zahlreiche ionische (anionische und kationische) und nicht-ionische Verbindungen dar. Dieser Screening-Ansatz soll darauf abzielen, weitere potenzielle Mikobizidkandidaten zu finden. Die Ergebnisse zeigen, dass die Gelformulierung, die 2,5% Laurylsarcosin enthält, einen vollständigen Schutz gegenüber der Infektion ergab (100% Überlebensrate). Andererseits ergaben die Gelformulierungen, die 2,5% Benzalkoniumchlorid, 5% Polyoxythylen-40-Stearat und 5% Guanidin enthielten, jeweils 60, 60 bzw. 30% Überlebensrate. Unsere vorläufigen Ergebnisse zeigen, dass Lauroylsarcosin gutes Potenzial als Mikrobizidkandidat aufweist, das wir gegenwärtig ausforschen. Andere Verbindungen, wie z.B. Benzalkonimchlorid, Polyoxyethylen-40-Stearat und Guanidin, die teilweises mikrobizides Potenzial aufweisen, können jedoch ebenfalls erforscht werden durch Optimierung ihrer Bedingungen zur besseren Wirksamkeit. Alternativ können Kombinationen dieser Verbindungen ebenfalls eine optimale Wirksamkeit, wenn sie kompatibel sind, erzielen. Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, ist es vorhersagbar, dass die Kombination eines Detergenz mit einem chaotropen Agens eine Wirksamkeit aufweist, die so gut ist oder besser ist als die von SLS. Dieses sind spezifische Beispiele von potenziellen Mikrobiziden und sind in keinster Weise gedacht, den Umfang der Erfindung zu limitieren.
Beispiele, die unsere Poloxamerformulierung in der Behandlung von Infektionen einsetzen
Zum Zweck des Testens der Wirksamkeit unserer Gelformulierungen in einem Mausmodell cutaner HSV-1 Infektionen wurden die Lösungen mit einem Phosphatpuffer (0,2 M, pH 6) hergestellt, um mit dem pH-Wert der Haut kompatibel zu sein.
Vergleichende Wirksamkeit von topischen Formulierungen von Foscarnet, Acyclovir und Zovirax Salben gegenüber HSV-1 cutanen Verletzungen bei Mäusen
Die Wirksamkeit unserer verschiedenen topischen Formulierungen ist in einem Mausmodell von cutanen HSV-1 Infektionen beurteilt worden. Kurz gesagt, wurden weibliche haarlose Mäuse (SKH-1; Charles River Breeding Laboratories Inc.; St-Constant, QC, Kanada), die 5-7 Wochen alt waren, durch intraperitoneale Injektionen einer Mischung enthaltend 70 mg/kg Ketamin Hydrochlorid und 11,5 mg/kg Xylazin anästhesiert. Der Virus wurde auf der lateralen Seite des Körpers im linken Lendenhautbereich inokuliert. Die Haut wurde sechsmal mit einer Kanüle Nummer 27, die vertikal gehalten wurde, in einem querschraffierten Muster angeritzt. 50 μL der viralen Suspension (HSV-1 Stamm F, 1,5 × 10⁶ plaquebildende Einheiten (PFU)/ml) wurden für 10 bis 15 Sekunden auf dem eingeritzten Hautbereich mit einem Applikator mit Baumwollspitze, die mit Kulturmedium gesättigt war [minimales wirksames Medium (MEM) ergänzt mit 100 U/ml Penizillin-Streptomycin, 2mM L-Glutamin und 2% fetalen Rinderserum (MEM-E + 2% FBS)] eingerieben. Der eingeritzte Bereich wurde mit einem Hühneraugenpflaster geschützt, welches mit medizinischem Klebeband an den Körper der Maus befestigt wurde. Die poröse innere Wand der Öffnung des Hühneraugenpflasters wurde mit Gewebeklebstoff vor der Verwendung impermeabel gemacht, um die Absorbtion des Wirkstoffs zu verhindern. Die Öffnung des Hühneraugenpflasters wurde ebenfalls mit medizinischem Klebeband verschlossen. Die Mäuse wurden dann in ihre Käfige zurückgebracht und zweimal am Tag beobachtet.
Verschiedene Behandlungsregime wurden in dieser Studie beurteilt. Kurz gesagt, wurde das Klebeband, welches die Öffnung des Hühneraugenpflasters verschlossen hat, entfernt und der eingeritzte Bereich mit einem Applikator mit Baumwollspitze, der mit kaltem Wasser gesättigt war, gereinigt. 15 μL von verschiedenen Formulierungen wurden auf den eingeritzten Bereich aufgetragen. Die Öffnung des Hühneraugenpflasters wurde mit medizinischem Klebeband verschlossen, um das schnelle Entfernen des Wirkstoffs durch die Mäuse zu verhindern. Dieses Verfahren verhindert ebenfalls zufällige systemische Behandlungen, die auftreten können aufgrund von potenziellem Lecken der behandelten Verletzungen. Die Wirksamkeit der verschiedenen Formulierungen wurde unter Verwendung von Verletzungspunktzahlen und Überlebensrate beurteilt.
16 (Feld A) zeigt die Zeitentwicklung der mittleren Verletzungspunktzahl von infizierten, unbehandelten Mäusen oder Mäusen, die mit Foscarnet in Lösung oder eingeschlossen in Poloxamer behandelt wurden. Die Behandlung wurde 24 Stunden nach der Infektion begonnen und wurde dreimal täglich für 4 Tage wiederholt. In Mäusen, die mit dem Poloxamer allein behandelt wurden, beobachteten wir ein Muster, das eine große Ähnlichkeit mit dem aufwies, wie es für unbehandelte Mäuse beobachtet wurde, mit der Ausnahme, dass die Regression von cutanen Verletzungen in der letzten Gruppe schneller erschien. Bei Mäusen, die mit einer Lösung von 0,5% Foscarnet behandelt wurden, beobachteten wir eine große Reduktion der mittleren Verletzungspunktzahl, welche stärker ausgeprägt war, wenn der Wirkstoff mit der Poloxamerformulierung verbunden war. 16 (Feld B) zeigt die entsprechende Überlebensrate für infizierte, unbehandelte Mäuse und Mäuse, die mit den Wirkstoffformulierungen behandelt wurden. Tod durch Encephalitis gab es in 75% von unbehandelten, infizierten Mäusen zwischen Tag 7 und Tag 8. Die Mortalität war vergleichbar bei Mäusen, die das Poloxamer allein erhalten hatten und zwischen Tag 8 und 10 erfolgte. Die Hälfte der Mäuse, die mit Foscarnet in Lösung behandelt wurden, überlebte die Infektion. Von großem Interesse ist, dass 75% der Mäuse, die mit der Poloxamerformulierung von Foscarnet behandelt wurden, die Infektion überlebten (p < 0,05).
17 (Feld A) zeigt die Zeitentwicklung der mittleren Verletzungspunktzahl von infizierten, unbehandelten Mäusen und Mäusen, die mit einer einfachen Anwendung von Poloxamer enthaltend 5% Acyclovir oder Zovirax^® Salbe 24 Stunden nach der Infektion behandelt wurden. Es ist von größtem Interesse, dass die Poloxamerformulierung, die 5% Acyclovir enthält, eine gute Wirksamkeit gegenüber der Entwicklung von cutanen Verletzungen bei Mäusen zeigt, während die Zovirax Salbe lediglich einen mäßigen Effekt zeigt. Acyclovir, das in das Poloxamer eingebunden wurde, zeigte jedoch eine signifikante Reduizierung der Letalität (p < 0,05), aber nicht die Zovirax Salbe (Feld B). Die höhere Wirksamkeit der Poloxamerformulierung von Acyclovir gegenüber der kommerziell erhältlichen Zovirax^® Salbe legt nahe, dass das Poloxamer ein besserer Träger für die topische Abgabe dieses Wirkstoffs sein könnte.
18 (Feld A) zeigt die Zeitentwicklung der mittleren Verletzungspunktzahl von Kontrollmäusen und Mäusen, die dreimal täglich über 4 Tagen behandelt wurden und beginnend 5 Tage nach der Infektion mit dem Poloxamer allein, Poloxamer enthaltend 5% Acyclovir oder Zovirax Salbe. Bei Mäusen, die das Poloxamer allein bekamen, wurde eine Reduktion in der mittleren Verletzungspunktzahl verglichen zu infizierten, unbehandelten Mäusen beobachtet. Die Behandlung mit Zovirax^® Salbe zeigte nur einen mäßigen Effekt. Eine deutliche Reduktion der mittleren Verletzungspunktzahl wurde jedoch bei Mäusen beobachtet, die mit der Poloxamerformulierung, enthaltend 5% Acyclovir behandelt wurden, wenn sie mit unbehandelten, infizierten Tieren verglichen wurden. Es ist von großer Bedeutung, dass alle Mäuse, die mit Poloxamer enthaltend 5% Acyclovir behandelt wurden, die Infektion überlebten (p < 0,001) (18, Feld B). Die Behandlung mit Zovirax^® Salbe erhöhte zu einem geringerem Ausmaß die Überlebensrate der infizierten Mäuse (p < 0,05).
In vivo Hautpenetration von Antivirusmitteln
19 zeigt die Verteilung von Foscarnet und Acyclovir in Hautgewebe von nichtinfizierten (Felder A, C, E) und infizierten (B, D, F) Mäusen 24 Stunden nach ihrer topischen Anwendung entweder in Phosphatpuffer oder in der Poloxamer-Matrix. Die Verteilung der beiden Formulierungen von Foscarnet und der gepufferten Lösung von Acyclovir war ähnlich im Abriss des Stratum corneums von nichtinfizierten und infizierten Mäusen. Im Gegensatz dazu steigerte die Einbindung von Acyclovir in das Poloxamer merklich die Menge des Wirkstoffs, die im Stratum corneum von beiden, nicht-infizierten Mäusen und infizierten Mäusen wiedergewonnen wurde; wobei die erhöhnte Wirkstoffpenetration bei den infizierten Mäusen deutlicher ausgeprägt war. Keine oder vernachlässigbare Mengen von Foscarnet wurden in der darunter liegenden Epidermis und Dermis von nicht-infizierten Mäusen unabhängig von dem Träger, der für die Wirkstoffverabreichung verwendet wurde, gefunden. Die Konzentration von Foscarnet in der Epidermis und Dermis von infizierten Mäusen war signifikant höher, wenn der Wirkstoff in das Poloxamer eingebunden war. Die Konzentration von Acyclovir war höher als die von Foscarnet in der Epidermis und Dermis bei beiden, nicht-infizierten und infizierten Mäusen unabhängig vom verwendeten Träger. Die Konzentration von Acyclovir, das in das Poloxamer eingebunden wurde, in der Epidermis von nicht-infizierten Mäusen war 6,1 Mal größer als die des Wirkstoffs in der gepufferten Lösung. Die Infektionen der Mäuse steigerte die Menge von Acyclovir in der Epidermis nicht signifikant. Die Konzentration von Acyclovir in der Dermis von infizierten Mäusen war 7,9 Mal größer als die, bei nicht-infizierten Mäusen, wenn der Wirkstoff in der Poloxamer Matrix verabreicht wurde.
20 zeigt die Konzentration von Acyclovir im Plasma bei nicht-infizierten und infizierten Mäusen 24 Stunden nach ihrer topischen Anwendung, entweder in Phosphatpuffer oder in der Poloxamer-Matrix. Ähnliche Konzentrationen von Acyclovir wurden im Plasma von nichtinfizierten Mäusen für beide Formulierungen gefunden. Infektionen von Mäusen steigerten die Konzentrationen von Acyclovir im Plasma merklich, insbesondere, wenn der Wirkstoff in die Poloxamer Matrix eingebunden wurde, für welche eine 4-fach gesteigerte Konzentration erreicht wurde. Die Konzentration von Acyclovir im Plasma von infizierten Mäusen war 2,1 Mal größer als die, wenn der Wirkstoff in die Poloxamer-Matrix eingebunden war.
Effekt von SLS auf die Wirksamkeit der Poloxamerformulierungen enthaltend Foscarnet oder Acyclovir gegen HSV-1 cutane Verletzungen bei Mäusen
Der Einfluss von SLS auf die Wirksamkeit von Poloxamerformulierungen, die Foscarnet enthalten, gegenüber HSV-1 Infektionen wurde bei Mäusen beurteilt. 21 (Feld A) zeigt die Zeitentwicklung der mittleren Verletzungspunktzahl von unbehandelten, infizierten Mäusen und von infizierten Mäusen, welche mit einer einfachen Anwendung von Poloxamer allein (verabreicht 24 Stunden nach der Infektion), Poloxamer enthalten 3% Foscarnet, Poloxamer enthaltend 5% SLS oder Poloxamer enthaltend 3% Foscarnet + 5% SLS behandelt wurden. Poloxamer allein gibt keinen Schutz gegenüber der Infektion. Weiterhin wurde eine mäßige Abnahme in der mittleren Verletzungspunktzahl bei Mäusen beobachtet, die mit Polxamer enthaltend entweder 5% SLS oder 3% Foscarnet behandelt wurden, verglichen zu unbehandelten, infizierten Mäusen. Es ist von großem Interesse, das bei Mäusen, die mit Poloxamer enthaltend 3% Foscarnet und 5% SLS behandelt wurden, wir eine merkliche und signifikante Reduktion (p < 0,05) in der mittleren Verletzungspunktzahl beobachteten, verglichen zu der von unbehandelten infizierten Mäusen. Die entsprechenden Überlebensraten für die gleichen Behandlungsgruppen sind in Feld B gezeigt, welches die Ergebnisse der mittleren Verletzungspunktzahl unterstützt. Die Hautpenetrationverbesserungseigenschaften von SLS, kombiniert mit seiner Fähigkeit, die virale Infektiosität zu modifizieren, könnte die gesteigerte Wirksamkeit der Foscarnet Formulierung erklären.
In vitro Suszeptiliät von HSV-1 gegenüber Kombinationen von Foscarnet und SLS
Der Effekt von SLS auf die Wirksamkeit von Foscarnet gegen HSV-1 (Stamm F) wurde bei Verozellen untersucht. Kurz gesagt, wurden die Zellen in 24 Well Mikrotitierplatten (Costar, Montreal, QC, Kanada) eingesetzt und mit HSV-1 Stamm F (ungefähr 100 PFU/ml) für 2 Stunden bei 37°C inkubiert, um die Virusabsorbtion zu ermöglichen. Danach wurde der Virus entfernt und die Zellen mit 0,5 ml 0,6% Agarose Seaplaque (Marine Colloids, Rockland, MA) überschichtet, die verschiedene Konzentrationen an Foscarnet, SLS oder Kombinationen von beiden Verbindungen enthalten. Die Platten wurden für 2 Tage bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden dann mit 10% Formaldehydin in PBS für 20 Minuten fixiert, mit entionisierten Wasser gewaschen und 0,05% Methylenblau gefärbt. Die Virussuszeptilität wurde durch die Bestimmung von PFU beurteilt. 22 zeigt die Suszeptilität des HSV-1 Stamm F in Kombination mit verschiedenen Konzentrationen von Foscarnet und SLS auf Verozellen. Die Ergebnisse zeigen, dass die Anwesenheit von SLS die Wirksamkeit von Foscarnet gegenüber HSV-1 (Stamm F) in Verozellen steigert.
Potenzielle Anwendungen
Die folgenden Beispiele, die hier nachfolgend beschrieben werden, sind spezifische potenzielle Anwendungen für unsere topischen Formulierungen, sollen aber in keinster Weise den Bereich begrenzen. Wie durch die obigen Ergebnisse gezeigt wurde, können unsere Gelformulierungen in der Prävention von Infektionen von Haut und/oder Schleimhäuten und insbesondere in der Prävention von HSV und HIV verwendet werden. Unsere Ergebnisse zeigen weiterhin, dass unsere Gelformulierungen als ein prophylaktisches Mittel dienen können, um zufällige Infektionen von Pflegepersonal zu verhindern. Wie durch die obigen Ergebnisse ebenfalls gezeigt wurde, können unsere Gelformulierungen in der Behandlung und Prävention von Infektionen oder Zuständen von Haut und/oder Schleimhäuten und insbesondere in der Behandlung und Prävention von Herpesverletzungen verwendet werden. Neben den obigen Anwendungen sind weitere potenzielle Anwendungen unserer Gelformulierungen i) für die Heilung und/oder Behandlung von Brandwunden und Prävention von weiteren Infektionen und ii) für die Behandlung und/oder Prävention von Infektionen von ophtalmischen Zuständen. In den obigen Beispielen können unsere Gelformulierungen jedes mikrobizide, bakterizide, virizide, chemotherapeutische, entzündungshemmendes, antineoplastisches, immunmodulierendes Mittel oder jeder weitere Agens oder Kombinationen von diesen enthalten, welches wirksam ist in der Behandlung und/oder Prävention von Infektionen und/oder abnormalen Zuständen von Schleimhäuten und/oder Haut, die durch jedes Pathogen und/oder jede Krankheit verursacht werden.

Claims

Eine topische Formulierung zur Prävention oder Behandlung von Infektionen oder zur Schwangerschaftsverhütung, dadurch charakterisiert, dass sie aus einem Poloxamer 407 in einer Konzentration von 15% bis 35%, einer Pufferlösung und einer effektiven Menge eines Agents ausgewählt aus der Gruppe aus Natriumlaurylsulfat, Lauroylsarcosin und einer Kombination von mindestens zwei von Natriumlaurylsulfat, Lauroylsarcosin, Benzalkonimchlorid, Polyoxythylenfettsäureacylderivaten und Guanidin besteht, wobei, wenn sie auf eine Oberfläche einer Haut oder Schleimhaut einer Person aufgetragen wird, die Formulierung eine halbfeste Schicht ausbildet, die wirksam ist, um eine physikalische oder chemische Barriere gegen ein Infektionsmittel oder gegen ein Spermium bereitzustellen.
Topische Formulierung gemäß Anspruch 1, welcher ferner eine effektive Menge eines Antiviralmittels einschließt.
Topische Formulierung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Antiviralmittel Foscarnet oder Acyclovir ist.
Topische Formulierung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Mittel Natriumlaurylsulfat und/oder Lauroylsarcosin umfasst.
Topische Formulierung gemäß Anspruch 4, wobei das Mittel Natriumlaurylsulfat oder Lauroylsarcosin ist.
Topische Formulierung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Polyoxythylenfettsäureacylderivat Polyoxythylen-40-Stearat ist.
Topische Formulierung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei Natriumlaurylsulfat in einer Konzentration von 1% bis 15% (w/v) zugegen ist.