SK15822000A3 - Prípravok na prevenciu alebo liečbu ochorení postihujúcich sliznicu alebo kožu alebo na prevenciu otehotnenia a aplikátor na dodávanie miestnych prípravkov do slizničných dutín - Google Patents

Description

Prípravky na prevenciu alebo liečbu ochorení postihujúcich sliznicu alebo kožu alebo na prevenciu otehotnenia a aplikátor na dodávanie miestnych prípravkov do slizničných dutín

Oblasť techniky

Tento vynález sa týka prípravkov, ktoré sa skladajú zo zložiek vytvárajúcich film a akejkoľvek aktívnej prísady, najmä miestnych prípravkov. Tento vynález sa týka hlavne miestnych prípravkov na prevenciu ochorení alebo liečbu chorôb spojených s alebo prenášaných cez sliznicu do kože, spôsobených akýmkoľvek pôvodcom, najmä patogénom. Tento vynález sa taktiež týka aplikátora na rovnomerné dodávanie miestnych prípravkov na prevenciu alebo liečbu akýchkoľvek chorôb, spojených s prenosom cez dutiny sliznice alebo na prevenciu napadnutia vonkajším pôvodcom, napríklad spermiou alebo mikróbom.

Doterajší stav techniky

Šírenie pohlavne prenášaných chorôb (STD) (Sexually Transmitted Disease), vyvolávaných vírusom nedostatočnej imunity človeka (HIV-Human Immunodeficiency Vírus), oparom (herpes) a inými patogénmi sa uskutočňuje zarážajúcou rýchlosťou. Globálny výskyt, chorobnosť a úmrtnosť na STD sú veľmi význačné. Celosvetovo sa odhaduje, že viac ako 900 miliónov jedincov je infikovaných pohlavne patogénmi. Každoročne je v USA viac ako 12 miliónov ľudí novo infikovaných patogénmi, ktoré sú pripisované STD. Najobvyklejšími príčinami tvorby vredov na pohlavných orgánoch v rozvinutých krajinách sú vírus oparov pier typu 1 (HSV-1) a typu 2 (HSV-2) (HSV-Herpes Simplex Virus). Oparová infekcia pohlavných orgánov je celoživotná a môže mať za následok bolestivé a recidivujúce genitálne lézie, systemické komplikácie a psychosociálnu chorobnosť a taktiež vážne novorodenecké ochorenia po prenose HSV v období počas pôrodu. Prenos pohlavnými orgánmi týchto patogénov je obvykle následkom bezpríznakového vírusového uvoľňovania endometria u ľudí, ktorí nie sú si vedomí toho, že sú infikovaní. HSV-2 je teraz zistiteľný u jedného z piatich Američanov vo veku 12 rokov ·· ·· ·· ·· • · · · • · · · • · ··· • · · ·· ·· ·· · • · · · • · · • · · · • · · ·· ···· alebo starších. Okrem toho sa odhaduje, že viac ako jedna tretina svetovej populácie má recidivujúcu infekciu HSV a je preto schopná prenášať vírus počas záchvatov produktívnej infekcie Neisseria gonorrhoeae a Chlamydia trachomatis sú uznávané ako najviac sa vyskytujúce pohlavne prenášané bakteriálne infekcie. Celosvetovo sa odhaduje ročný výskyt 25 miliónov prípadov kvapavky a 50 miliónov prípadov chlamydie. Oproti tomu nedávne epidemiologické údaje naznačujú, že počet jedincov infikovaných HIV dramaticky na celom svete vzrastá. Podľa úradných miest OSN odhady epidemiologických údajov uvádzajú, že každý deň sa v roku 1997 infikovalo HIV 16 000 jedincov. Nedávne štatistiky (napr. z konca roka 1997) Svetovej zdravotníckej organizácie WHO (World Health Organization) uvádzajú, že na celom svete je 31 miliónov ľudí infikovaných HIV a črtá sa, že v roku 2000 tento počet dosiahne 40 miliónov.

Celosvetovo je heterosexuálny prenos zdrojom 85 až 90% infekcií HIV. Pretože neexistuje vakcína proti HIV, preventívne opatrenia sú tak jedinými nástrojmi, ktoré v súčasnosti môžu obmedziť prenášanie týchto retrovírusov. Dôsledné a starostlivé používanie prezervatívov predstavuje účinnú bariéru proti pohlavnému prenosu HIV a ďalších pohlavne prenášaných patogénov, ale musí byť používané pri všetkých rizikových pohlavných stykoch, aby sa pravdepodobnosť druhotnej infekcie podstatne znížila. V Afrike boli najintenzívnejšie preventívne programy schopné zvýšiť používanie prezervatívov o približne 70 % pri všetkých pohlavných stykoch prostitútiek. Preto vznikajú pochybnosti o možnostiach prezervatívnej pomoci pri znižovaní epidémie AIDS vo vysoko rizikových skupinách. V situáciách, kde heterosexuálny prenos HIV je významný, preventívne opatrenia, ktorými by ženy mohli zabrániť riziku získania STD, by mohli byť prídavným nástrojom na potlačenie epidémie. Takýto ochranný nástroj je možné taktiež použiť pri mužských homosexuálnych vzťahoch alebo môže poskytnúť prídavnú ochranu pod kontrolou receptívneho partnera. Preto je dôležité vyvinúť bariérový spôsob, ktorý je možné použiť ako alternatívu k prezervatívom tam, kde osoba môže chrániť sama seba pred infekciou bez toho, aby sa musela pýtať svojich sexuálnych partnerov. Preventívne opatrenia, smerujúce k blokovaniu počiatočného prenosu patogénov, ktoré sú príčinnými pôvodcami AIDS, oparov a ďalších STD, budú prirodzene nesmierne prospešné.

Vývoj bezpečných miestnych mikrobicídov má pre Svetovú zdravotnícku organizáciu (WHO) a pre Národné inštitúty zdravia (NIH) (National Institutes of ·· ·· • · · · • · · · • · ··· • · · ·· ·· ·· • · • · • · · • · ·· • β • · ···· ··

Health) na poli prevencie HIV veľmi vysokú prioritu. Miestny mikrobicid sa často skladá z aktívnej prísady a nosiča. Aktívna prísada pôsobí prostredníctvom rôznych mechanizmov, vrátane : i) rozrušenia bunkových membrán organizmov, obalových alebo kapsidových lipidových alebo proteínových zložiek (napr. spermicídy/mikrobicídy detergentného typu, ako je nonoxynol-9), ii) blokovanie receptor-ligandových interakcii, nevyhnutných pre infekčnosť (napr. mikrobiálnymi adhéznymi inhibítormi, ako sú sulfatizované zlúčeniny), iii) inhibícia vnútrobunkovej alebo mimobunkovej replikácie patogénu (napr. antimikrobiálnymi liekmi), iv) zmena vaginálneho prostredia a zníženie náchylnosti na infekciu (napr. pufrovacími činidlami a produktami udržujúcimi normálnu vaginálnu flóru a prostredie) alebo v) zvýšenie miestnej imunitnej odozvy (napr. modifikátormi imunitnej odozvy). Všeobecná účinnosť miestneho mikrobicidu voči pohlavnému prenosu patogénov, ktorý spôsobuje STD, závisí od účinnosti aktívnej látky, ktorá má byť dodaná a na jej schopnosti pokrývať celú oblasť vagíny/cervixu s maximálnou účinnosťou proti patogénom. Schopnosť týchto aktívnych činidiel pokrývať celú vaginálnu dutinu závisí vo veľkej miere od typu použitého nosiča. Typické prípravky nosičov zahrňujú gély, krémy, peny, čipky, tampóny a filmy.

Najnovšie dostupné vaginálne prípravky používajú ako mikrobicíd spermicíd nonoxynol-9, neiónové povrchovoaktívne činidlo. Pri skúmaní okrem živého organizmu nonoxynol-9 inaktivuje vyvinuté vírusy, napr. HSV, HIV a ďalšie mikroorganizmy vrátane Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae. Avšak do úvahy prichádzajúca účinnosť látky nonoxynol-9 oproti HIV nie je doteraz celkom jasne stanovená a výsledky klinických pokusov sú sporné. Nedávno uskutočnené pokusy robené so 1292 HIV negatívnymi ženskými sexuálnymi pracovníčkami v Kamerune ukázali, že použitie vaginálneho filmu s obsahom 70 mg látky nonoxynol-9 neznížilo počet nových infekcií HIV, kvapavky alebo chlamydie (Roddy a spolupr., 1998, N. Engl. J. Med., 339:504-510). Zlyhanie filmu látky nonoxynol-9 pri znižovaní prenosu pôvodcov infekcie je možné pripísať neúplnému pokrytiu celej oblasti vagíny/cervixu systémom dodávajúcim liek nonoxynol-9 alebo výskytom mukóznej toxicity, podporujúcej infekciu mikroorganizmov. Pre dramatický nárast počtu jedincov vo svete, ktorí sú infikovaní HIV, oparmi alebo ďalšími pohlavne prenášanými patogénmi, existuje naliehavá potreba vyvinúť účinné produkty a/alebo príslušné dodávacie systémy, ktoré môžu znížiť pohlavný prenos týchto patogénov pri minimálnom mukóznom dráždení a minimálnom účinku na vaginálnu flóru a pH.

·· » · · « ft* ·· • · · • · · » • · ··· • · · ·· ·· ·· · ·· ····

Sodný laurylsulfát (SLS-Sodium Lauryl Sulfate) je sulfatizované povrchovo aktívne činidlo, ktoré denaturuje membránové proteíny patogénov. Preto pôsobi podvojné ako detergent a ako chaotropné činidlo. S touto predstavou boli urobené pokusy na vyhodnotenie potenciálneho mikrobicídneho účinku SLS na HSV a HIV. Tieto počiatočné štúdie jasne ukázali, že SLS mení pri skúmaní, mimo živého organizmu, infekčnosť obidvoch vírusov. Celkom nedávne Howett a kol. potvrdili tieto zistenia, že SLS je taktiež silný inaktivátor HSV-2 a HIV-1 (Antimicrob. Agents Chemother. 43(2): 314-321, 1999). Okrem toho ukázali, že SLS je účinný proti králičím, hovädzím a ľudským papilomavírusom (nevyvinutým vírusom) po krátkom ošetrení nízkou koncentráciou tohto produktu. Navyše tento odkaz nepoučuje o použití nosiča na dodanie tohto potenciálneho mikrobicídu. Voľba nosiča je veľmi dôležitá, pretože ovplyvňuje koncentráciu liekov, ktoré sú k dispozícii, trvanie dostupnosti liekov a stupeň pokrytia sliznice prípravkom, čo sú kľúčové faktory pre poskytovanie ochrany proti invazívnym patogénom. Ďalšou zaujímavou kategóriou mikrobicídov prichádzajúcich do úvahy na použitie ako mikrobicídy sú mikrobiálne adhézne inhibítory, napr. sulfatizované zlúčeniny, ktoré blokujú interakcie medzi receptorom hostiteľskej bunky a mikróbom. Známym príkladom mikrobiálnych adhéznych inhibítorov je dextransulfát (DS), čo je polysulfatizovaný cukor, ktorý ako sa ukázalo pri skúmaní mimo živého organizmu, inhibuje infekčnosť HIV a skupiny oparových vírusov.

Nedávno bol vyvinutý gélový prípravok, ktorý sa aplikuje na vaginálne, cervikálne alebo anorektálne sliznice a ktorý je účinný pre prevenciu pohlavne prenášaných patogénov. Jedným prvoradým znakom tohto gélového prípravku je jeho termoreverzibilta. Prechod z kvapalného stavu pri teplote miestnosti do gélovitého stavu pri teplote tela má základnú dôležitosť, pretože pri nanášaní na drsné biologické povrchy, napríklad na vaginálny alebo anorektálny epitel, musí gél preniknúť do najmenších nepravidelností a tak vytvoriť dobrú fyzickú bariéru proti pôvodcom infekcií. Gélový prípravok má nasledujúce kľúčové znaky, ktoré ako FDA, tak aj NIH považujú za dôležité : i) je bezfarebný, bez zápachu, netvorí škvrny, ii) pokrýva celú vagínu/cervix, preto sa nanáša v tekutom stave, iii) je kompatibilný s latexovým prezervatívom, iv) odoláva vymývaniu prietokom vody, v) má pH, ktoré sa podobá pH zdravej vagíny (pH 4,0 - 4,5), vi) uchováva si požadované reologické vlastnosti v podmienkach extrémneho tepla a chladu a vii) neovplyvňuje, pri skúmaní mimo živého organizmu, normálnu vaginálnu flóru, hlavne Lactobacillus spp.

·· ·· ·· ·· ·· ···· · · · · · · · ···· · · · · · • · ··· · · · · · · · ·· · · · ·· ·· ·· *· ···· ·· ·

-4aUS patentové zverejnenie 5,275,805 popisuje ústný prostriedok, ktorý obsahuje antiplakové činidlo, zmes povrchovo aktívnych činidiel, ktorá sa skladá z SLS, polyoxyetylénového/polyoypropylenového blokového polyméru a soli taurinu. Zmes povrchovo aktívneho činidla je údajne účinná „pre stabilizovanie ústneho prostriedku pre fázovú separáciu bez ovplyvnenia antibakteriálnej pčinnosti [antiplakového činidla]“. Na tento účel slúži použitie pomerne nízkych koncentrácii každej zo zložiek zmesi povrchovo aktívneho činidla; o týchto nízkych koncentráciách sa predpokladá, že nie sú dostačujúce na dosiahnutie antimikrobiálnej účinnosti a fyzickej bariéry.

Európske patentové zverejnenie číslo 386,960 popisuje nosič na dodávanie lieku, ktorý sa skladá z termoverzibilnej gélovej zložky a film vytvárajúcej zložky. Film vytvárajúca zložka má za účel poskytnúť pevnejšie žele. Do tohoto je možné začleniť spermicídy a tie sú súčasťou zoznamu liekov, určených na dodávanie vagínalnych liekov. Nie je však ukázané, či spermicid, termoreverzibilná gélová zložka a film vytvárajúca zložka budú tvoriť fyzikálne-chemickú bariéru proti patogénom alebo či ďalšia kombinácia týchto zložiek docieli vytvorenie fyzikálne-chemickej bariéry, alebo inak, že akýkoľvek produkt, ktorý rozruší lipidy alebo bunkovú membránu alebo proteínovú štruktúru (detergenty všeobecné alebo chaotropné činidlá) by bol účinný proti patogénom, či samotný alebo v kombinácii s termoreverzibilným gélom.

Pre účinné dodávanie polotuhých alebo kvapalných prípravkov do telovej kavity je nástrojom voľby aplikátor. Ideálny aplikátor musí dodávať okamžite po uvedení do činnosti prípravok na sliznici a to bez vypudenia príliš mnoho vzduchu pred prípravkom.

US patent číslo 2,683,456 popisuje rektálny aplikátor, ktorý sa skladá z preferovaného pozdĺžného tela, ktoré sa vkladá do telovej kavity a proximálne zväčšej časti, ktorá zostáva vo vnútri telovej kavity. Lieková trubica je umiestnená v tesnom susedstve spoja medzi pozdĺžným telom a zväčšenou časťou, tak aby po uvedení do činnosti vyprázdňovala svoj obsah priamo do pozdĺžneho tela. Difúzny kanál, ktorým liek prechádza pred vypudením do telovej kavity je jednoducho tvorený dutinou v pozdĺžnom tele, čo umožňuje priechod a vypudenie veľkého objemu vzduchu.

• · ·· • · · · • · · · • · ··· • · · ·· ·· ·· ·· ·· • · · · · · · • · · · · • · · · · · • · · · · ·· ···· ·· ·

-4bEurópske patentové zverejnenie číslo 761246 popisuje aplikátor, ktorý sa skladá zo zásobníka, čerpadla, ktoré má vstupnú bránu v zásobníku, gombíkového spúšťadla na ovládanie čerpadla a trubice, ktorá sa zavádza do telovej kavity a ktorá má na špičke trubice distribučnú hlavicu a táto trubica je pripojená na výstupnú bránu čerpadla. Sekciu trubice vymedzuje difúzny kanál, jednoducho sa skladajúci z dutiny trubice, ktorým liek putuje do distribučnej hlavice. Distribučná hlavica je urobená zo zväčšenej sekcie, ktorá má plniacu časť a množstvo perforácii, prechádzajúcich celou hrúbkou hlavice. Tento dokument nepopisuje žiadny aplikátor, ktorý by mal difúzny kanál malého objemu, ktorý by dodával liek bez dodávania podstatne veľkého objemu vzduchu.

Patentové zverejnenie číslo DE 3513645 popisuje aplikátor, ktorý sa skladá z neperforovanej špičatej časti valcovitého tela, ktoré má vonkajšiu perforovanú stenu. Dutins vymedzená telom je jednoducho vykreslená vonkajšou stenou. Táto dutina tvorí zásobník, kde je umiestnený kvapalný alebo polokvapalný prípravok. Piest tlačí prípravok v zásobníku a stlôačením proti neperforovanej špičkovej časti je prípravok vyháňaný cez perforácie. Dutinu a piest je možné tvarovať v komplementárnom kuželovitom tvare, aby dodávaný objem prípravku bol malý. Avšak, pretože dutina má pomerne veľký objem, tak skôr ako sa dostane do perforácii prípravok, tak perforáciami sa preženie menšie alebo väčšie množstvo vzduchu.

HSV-1 a HSV-2 sú neutropné vírusy, ktoré infikujú v prvom rade neuroektodermálne tkanivá, vrátane kože, periferné nervy a ústredný nervový systém. Sliznica alebo povrch kože sú obvykle miestami primárnej infekcie. Recidivujúci herpes labialis a herpes genitalis predstavujú najobvyklejšie klinické prejavy spojené s infekciami HSV-1 a HSV-2. Recidívy sú spontanné, ale sú spojené s fyzickým a lebo citovým stresom, horúčkou, vystavením ultrafialovému žiareniu, poškodením tkaniva a potlačením imunity. Hoci u jednincov s patričnou imunitou sú infekcie HSV ochorenia mierne, tak pre pacientov, hlavne s častými príhodami, sú ťažké. Pacienty ohrození buď imunologickou liečbou alebo prebiehajúcimi ochoreniami majú zvýšené riziko, že sa u nich vyvinie infekcia HSV. U príjemcov ľadvinových alebo sdečných transplátov je zvýšená závažnosť infekcie. Okrem toho ·· ·· ·· ·· ·· ···· ···· ··· • ••9 ·· · · · • · ··· · · · · · · · ·· ···· ·· ·· · · ·· · · · · ·· ·

-4cvypuknutie AIDS posilnilo u imunitné ohrozených hostiteľov vážnosť klinických ochorení HSV.

Súčasná dostupná miestna antivírusové liečba má iba obmedzenú účinnosť obzvlášť proti symptomaticky recidivujúcemu oparu. Obmedzená účinnosť týchto miestných prípravkov na vývoj oparových mukokutannych poškodení sa pripisuje zlej schopnosti liekov prenikať do kože. Stratum cerneum alebo rohovitá vrstva predstavuje bariéru pre prenikanie väčšiny látok do kože. Táto vrstva sa skladá z korneocytov, uložených v dvojvrstvovej lipidovej matrici, ktorá sa skladá z chloresterolu, voľných alifatických kyselín a ceramídov. V dôsledku toho použitie látok, ktoré zvyšujú prenikanie kožou, predstavuje pohodlnú stratégiu pre zvyšovanie prenikania prípravku miestneho lieku do kože.

Medzinárodná zverejnená prihláška (WO 97/42962) uvádza použitie prípravkov, ktoré sa skladajú zo zložiek vytvárajúcich film, ktoré ako také sú schopné tvoriť fyzickú bariéru pre patogény. Hlavne výhodné na toto použitie sú termoreverzibilné gély, napríklad poloxaméry. Film vytvárajúce prípravky ďalej obsahujú mikrobicídy, spermicidy alebo akékoľvek ďalšie lieky, ktorých voľba sa riadi tým, aké patogény, organizmy alebo choroby majú byť inaktivované alebo liečené. Prípravky sú preto účinné ako fyzická a voliteľne ako chemická alebo farmakologická bariéra a taktiež ako systém trvalo uvoľňujúci lieky na mieste podávania. Tieto prípravky sú určené na použitie pre prevenciu pohlavne prenášaných chorôb a taktiež pri liečbe infekcií, rakoviny, zápalu alebo akéhokoľvek ochorenia alebo stavu, ·* ktorý vyžaduje farmakologickú liečbu. Okrem toho zverejnenie poučuje, že prípravok znižuje toxicitu silných spermicídov/mikrobicídov, napríklad látky nonoxynol-9. Avšak toto uverejnenie konkrétne nepoučuje o použití SLS ako chemickej látky prichádzajúcej do úvahy na začlenenie do miestneho prípravku.

HSV-1 a HSV-2 sú neurotropné vírusy, ktoré infikujú v prvom rade neuroektodermálne tkanivá, vrátane kože, periférne nervy a ústredný nervový systém. Sliznica alebo povrch kože sú obyčajne miestami primárnej infekcie. Recidivujúci herpes labialis a herpes genitalis predstavujú najobvyklejšie klinické prejavy spojené s infekciami HSV-1 a HSV-2. Recidívy sú spontánne, ale sú spojené s fyzickým alebo citovým stresom, horúčkou, vystavením ultrafialovému žiareniu, poškodením tkaniva a potlačením imunity. Hoci u jedincov s príslušnou imunitou sú infekcie HSV miernym ochorením, tak pre pacientov, hlavne s častými príhodami, sú ťažkým. Pacienti ohrození buď imunologickou liečbou alebo prebiehajúcim ochorením majú zvýšené riziko, že sa u nich vyvinie infekcia HSV. U príjemcov ľadvinových alebo srdcových transplantátov je zvýšená závažnosť infekcie. Okrem toho vypuknutie AIDS zosilnilo u imunitné ohrozených hostiteľov vážnosť klinických ochorení HSV.

Súčasná dostupná miestna antivírusová liečba má iba obmedzenú účinnosť najmä proti symptomaticky recidivujúcemu oparu. Obmedzená účinnosť týchto miestných prípravkov na vývoj oparových mukokutánnych poškodení je pripisovaná slabej schopnosti liekov prenikať do kože Stratum corneum alebo rohovitá vrstva predstavuje bariéru pre prenikanie väčšiny látok do kože. Táto vrstva sa skladá z korneocytov, uložených v dvojvrstvovej lipidovej matrici, ktorá sa skladá z cholesterolu, voľných alifatických kyselín a ceramidov. V dôsledku toho použitie ·· ·· • · · · • · · • · · · · • · · ·· ···· ··· ·· · ·· ·· ·· • · · • · · • · • · látok, ktoré zvyšujú prenikanie do kože, predstavuje pohodlnú stratégiu na zvyšovanie prenikania prípravku miestneho lieku do kože.

SLS je povrchovoaktívne činidlo, ktorého vlastnosťou je zvyšovanie prenikania kožou zvýšením tekutosti epidermálnych lipidov. Vlastnosť SLS zvyšovať prenikanie kožou, kombinovaná s jeho schopnosťou meniť vírusovú infekčnosť cestou detergentných a chaotropných vlastností, ďalej zvyšuje účinnosť prípravkov miestnych liekov. Pre svoje chaotropné vlastnosti má SLS okrem toho širšie spektrum účinnosti ako iný obyčajný detergent proti spermiám, bakteriálnym hubám a vírusom.

Poloxaméry sú široko využívané v mnohých farmaceutických aplikáciách a ich netoxické vlastnosti ich robia vhodnými pre systémy trvalého dodávania lieku. Poloxaméry predstavujú vhodné matrice pre dermatologické aplikácie. Pri nanášaní v kvapalnej forme poloxaméry fakticky umožňujú lepšie pokrytie povrchu prenikaním do najmenších nepravidelností sliznice a/alebo pokožky. Okrem toho týmito poloxamérmi vytvorené retikulárne usporiadanie pôsobí ako systém trvalého uvoľňovania lieku a tak predlžuje pôsobenie lieku.

Podstata vynálezu

V súlade s predloženým vynálezom je prvým predmetom poskytnúť prípravky, ktoré sa skladajú z film vytvárajúcej zložky, ktorá sa nanáša na povrch sliznice alebo kože, výhodne vo forme gélu, krému alebo masti. Gélové prípravky sú určené na vytváranie povlaku rôznych typov sliznice, napríklad vagíny, cervixu, anorekta, oka, úst, nosa alebo kože na prevenciu infekcie a/alebo nenormálnych stavov sliznice a/alebo kože. Okrem toho sa gélové prípravky nanášajú miestne do oka na liečbu a/alebo prevenciu infekcií očných stavov. Výhodne sa používa termoreverzibilný gél, ktorý sa nanesie v tekutej forme, natrie na povrch a po dosiahnutí teploty povrchu tela vytvorí polotuhý povlak. Výhodnejšie sa termoreverzibilný gél skladá z poloxaméru 407. Podobné polyméry, napríklad poloxamíny, sú taktiež použiteľné. Vyššie uvedené prípravky taktiež obsahujú činidlo, ktoré je schopné interferovať s bunkovou membránou organizmov, obalovými alebo kapsidovými lipidovými alebo proteínovými zložkami v cieľovej bunke, tkanive alebo mikróbe. Vyššie uvedená ·· ·· • · · · • · · · • · ··· • · · ·· ·· ·· ·· • · · · • · · • · · • · · ·· ···· kombinácia film vytvárajúcej zložky a vyššie uvedeného činidla poskytne prípravky so zlepšenou účinnosťou a zníženou toxicitou.

V špecifickom uskutočnení je činidlo schopné interferovať s viazaním sa mikrobiálneho vonkajšieho proteínu na hostiteľský receptor. V špecifickejšom uskutočnení je činidlom mikrobiálny adhézny inhibítor alebo je to detergent alebo chaotropné činidlo, schopné rozrušovať integritu uvedeného mikrobiálneho vonkajšieho proteínu. V ešte špecifickejšom uskutočnení mikrobiálny adhézny inhibítor je dextran-sulfát; detergent sa vyberie zo skupiny, ktorá sa skladá zo sodného laurylsulfátu, benzalkoniumchloridu, lauroylsarkozínu, polyoxyetylénových alifatických acylderivátov a polyoxyetylénsorbitanových alifatických acylesterderivátov; a chaotropným činidlom je sodný laurylsulfát alebo guanidín. V najšpecifickejšom uskutočnení je činidlom SLS, ktorý je chemickým činidlom prichádzajúcim do úvahy na použitie z dôvodov jeho mnohých vlastností ako detergent a chaotropné činidlo a predpokladaný mikrobiálny adhézny inhibítor. SLS samotný je účinný proti mikróbom. Účinnosť SLS sa ďalej zlepší pri začlenení do týchto prípravkov. Preto sa predpokladá, že SLS alebo akýkoľvek rovnocenný produkt je použiteľný samostatne alebo v kombinácii s vyššie uvedenými film vytvárajúcimi zložkami na prevenciu mikrobiálnej infekcie. SLS sa použije samostatne alebo v kombinácii s vyššie uvedeným prípravkami v akejkoľvek vhodnej koncentrácii, výhodne v koncentrácii 0,1 až 25 % (hmotnostných/objem) a výhodnejšie v koncentrácii 1 až 15 % (hmotnostných/objem). Poloxamér 407 sa použije v akejkoľvek vhodnej koncentrácii, výhodne v koncentrácii 5 až 50 % (hmotnostných/objem) a výhodnejšie v koncentrácii 15 až 35% (hmotnostných/objem). Fyzikálne vlastnosti finálnych prípravkov veľmi závisia od lieku, ktorý sa do nich začlení, od pH a rozpustených látok, použitých pri príprave prípravkov a od viskozity požadovanej pre daný cieľ. Vyššie uvedené prípravky ďalej obsahujú liek, ktorý je účinný na prevenciu infekcie a/alebo nenormálnych stavov sliznice alebo kože. Vaginálne prípravky predstavujú fyzickú a chemickú bariéru v dôsledku ich film vytvárajúcich a mikrobiálne rozrušujúcich zložiek. Spoločne s tým, s účinnosťou proti pôvodcom infekcie, sú tieto prípravky taktiež účinné na prevenciu tehotenstva SLS v prípravkoch výhodne nahradí nonoxynol-9. Na použitie v tomto prípravku prichádza do úvahy SLS, ktoré má širšie spektrum aktivity okrem iného proti spermiám, obaleným a neobaleným vírusom. Gél obsahuje liek, ktorý je účinný na prevenciu infekcie a/alebo nenormálnych stavov sliznice a/alebo kože. Pre účel ·· ·· • · ·· ·· • · · · • · · · ··· · · • · ·· • · · · · • · · · ·· ···· ·· · tohto vynálezu je výraz „liek určený na pokrytie akéhokoľvek antibakteriálneho, baktericídneho, antivírusového, chemoterapeutického, protizápalového, protinádorového, imunomodulačného a akéhokoľvek iného činidla alebo jeho kombinácie, ktoré je účinné na prevenciu infekcie sliznice a/alebo kože. Výraz „liek sa taktiež týka cytokínov alebo antigénov, ktoré povzbudzujú imunitnú odozvu chrániacu proti infekcii. Lieky sa začlenia do nosičov lieku, napríklad gélov, lipozómov, mikročastic alebo cyklodextrínov, ich zapúzdrenie má za následok zlepšenú prevenciu infekcie.

Ďalej je predmetom tohto vynálezu poskytnutie špecifického aplikátora, ktorý je možné použiť vaginálne a/alebo anorektálne na dodávanie miestnych prípravkov na liečbu a/alebo prevenciu infekcie a/alebo nenormálnych stavov sliznice. Aplikátor sa konštruuje rôznymi spôsobmi tak, aby dával rovnaké požadované znaky, špecifikované v podrobnom opise vynálezu. V podrobnom opise sú taktiež diskutované príklady niekoľkých rozdielnych návrhov, ktoré sú určené pre opis niekoľkých všeobecných konštrukčných možností aplikátora, ale v žiadnom prípade nie sú určené na obmedzenie rámca tohto dokumentu. Dôležité je upozorniť, že konečný vzhľad aplikátora sa môže líšiť od príkladov, ktoré sú tu uvedené.

V ďalších výhodných uskutočneniach sa tieto prípravky používajú na liečbu vírusových chorôb a ďalej obsahujú ako liek antivírusové činidlo, napríklad acyclovir alebo foscarnet alebo akékoľvek ďalšie antimikrobiálne činidlá, použité samostatne alebo v kombinácii, v akejkoľvek vhodnej koncentrácii. V najvýhodnejšom uskutočnení sa prípravok skladá z poloxaméru 407 a obsahuje foscarnet v koncentračnom rozmedzí od 0,5 do 5% (hmotnostných/objem). V ďalšom najvýhodnejšom uskutočnení sa prípravok skladá z poloxaméru 407 a obsahuje acyclovir v koncentračnom rozmedzí od 0,5 do 5 % (hmotnostných/objem). V ešte ďalšom najvýhodnejšom uskutočnení sa prípravok skladá z poloxaméru 407 a obsahuje SLS v koncentračnom rozmedzí od 1 do 10% a foscarnet alebo acyclovir vo vyššie uvedených koncentráciách.

Predmetom tohto vynálezu je taktiež vyvinúť nové miestne prípravky na prevenciu infekcie sliznice a/alebo kože, hlavne pohlavne prenášaných infekcií a to najmä infekcií spôsobených HIV a oparmi. Mikrobicídy alebo akýkoľvek ďalší liek sa zachytia do gólových prípravkov buď ako voľné alebo zapuzdrené do nosičov liekov, napríklad lipozómov, mikročastic alebo cyklodextrínov. Tieto mikrobicídne gély ·· ·· ·· • · · · · · · • · · · · • · · · · · • · · · · ·· ···· ·· · ·· ·· • · · · β · · ·

Η β · · ·· · · predlžujú lokálnu mikrobicídnu aktivitu, vylučujú miestne dráždenie a znižujú systemické vedľajšie účinky začlenených aktívnych činidiel.

Predmetom tohto vynálezu je taktiež vyvinutie špecifického aplikátora na vaginálne aplikácie, ktorý umožňuje rovnomernú distribúciu obsahu do celej vagíny (dodávanie na steny) a na cervix (dodávanie na prednú stranu) pre maximálnu ochranu pred pohlavným prenosom patogénov. Preto bol navrhnutý špecifický aplikátor, ktorý umožňuje 360 stupňovú distribúciu jeho obsahu do vagíny a ďalej na cervix, čo je veľké zlepšenie v porovnaní s existujúcimi obvyklými vaginálnymi aplikátormi, ktoré dodávajú obsahy iba na prednú stranu (iba do oblasti cervixu).

Ďalším predmetom tohto vynálezu je vyvinutie miestnych prípravkov liekov, ktoré zlepšia účinnosť chemicky alebo farmakologicky aktívnych činidiel proti mukokutánnym infekciám a hlavne proti infekciám HSV. Zlepšená účinnosť liekov po začlenení do vhodných matríc a/alebo nosičov liekov redukuje dávkovací interval a v dôsledku tohto zlepšuje kvalitu života pacientov. Taktiež je predmetom tohto vynálezu vyvinutie miestnych prípravkov na liečbu alebo/hojenie popálenín a taktiež na prevenciu ich potenciálnej infekcie.

Tento vynález bude ďalej popísaný odkazovaním na špecifické uskutočnenia a priložené vyobrazenia, ktorých účelom je vynález skôr objasniť, ako obmedziť jeho rámec.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1 ukazuje infekčnosť HSV-1 (kmeň F) pre bunky Vero po predošetrení vírusov rôznymi koncentráciami SLS (panel A) alebo DS (panel B) počas 1 h pri 37° C (·) alebo po pridaní SLS alebo DS k vírusom bez predošetrenia (o). Plak tvoriacej jednotky (PFU - Plague Forming Units) je vyjadrený ako percento kontrolnej vzorky. Výsledky sú ± stredná hodnota SD štyroch nezávislých pokusov.

Obr. 2 ukazuje účinnosť rôznych koncentrácií SLS (panel A) alebo DS (panel B) na HSV - 1 (kmeň F) v bunkách Vero. Plak tvoriacej jednotky (PFU) je vyjadrený ako percento kontrolnej vzorky. Výsledky sú ± stredná hodnota SD štyroch nezávislých pokusov.

··· • · · ·· · ·· • · · · · · · • · · · · • · · · · ·

I · · · · ·· ···· ·· *

Obr. 3 objasňuje vplyv predošetrení HIV-1 (kmeň NL4-3) počas 1 hodiny pri 37°C 500 μΜ SLS na jeho infekčnosť pre bunky IG5. Hodnoty predstavujú ± strednú hodnotu SD troch stanovení.

Obr. 4 ukazuje elektronickú mikrosnímok buniek Vero infikovaných vírusom HSV-1 (kmeňom F), predošetrovaným 1 h pri 37°C 50 μΜ SLS (panel C) 100 μΜ SLS (panel D). Bunky infikované vírusom HSV-1 (kmeň F) v neprítomnosti SLS boli použité ako kontrolné (panel A). Zväčšenie je 70 000 násobné.

Obr. 5 ukazuje hodnotenie množstva glykoproteínu D HSV-1 (kmeň F) predošetrovaného počas 1 h pri 37°C 12,5 μΜ SLS, 50 μΜ SLS a 100μΜ SLS v bunkách Vero. Ako kontrolné boli použité bunky infikované HSV-1 (kmeň F) v EMEM + 2% FBS. Hodnoty sú vyjadrené ako percentá hybridizácie signálnej intenzity v porovnaní s kontrolnou vzorkou.

Obr. 6 ukazuje časový priebeh prežívania myši infikovaných intranazálne vírusom HSV-2 (kmeň 22), predošetreným počas 1 h pri 37°C 6,25 μΜ SLS (·), 25μΜ SLS (o) a 100 μΜ SLS (^A). Ako kontrolné (□) boli použité myši, ktoré boli infikované neošetrenými vírusmi. Výsledky sú vyjadrené ako stredná hodnota 8 zvierat na skupinu.

Obr. 7 ukazuje časový priebeh stredného bodového ohodnotenia lézií myší infikovaných vírusom HSV-1 (kmeň F), predošetreným 1 h pri 37°C rôznymi koncentráciami [62,5 μΜ SLS (·), 25 μΜ SLS (o) a 100 μΜ SLS (^A). (panel A)] alebo rôznymi koncentráciami [0,25 nM DS (·), 1 nM DS (o) a 100 nM DS (^). (panel B)]. Ako kontrolné (□) boli použité myši, ktoré boli infikované neošetrenými vírusmi. Výsledky sú vyjadrené ako stredná hodnota 6 zvierat na skupinu.

Obr. 8 ukazuje časový priebeh stredného bodového ohodnotenia lézií myší infikovaných vírusom HSV-1 (kmeň F) po predošetrení myší poloxamérovým prípravkom samotným 5 min (o) alebo 1 h (Δ) pred infikovaním alebo poloxamérovým prípravkom s obsahom 5% SLS, taktiež 5 min (·) alebo 1 h(^A) pred infikovaním. Ako kontrolné (U) boli použité myši, ktoré neboli ošetrené. Výsledky sú vyjadrené ako stredná hodnota 6 zvierat na skupinu.

Obr. 9 ukazuje časový priebeh stredného bodového ohodnotenie lézií (panel A) a prežitia (panel B) myší infikovaných intravaginálne vírusom HSV-2 (kmeň 333), predošetrených gélom samotným ( , ^A ,·) 5 min pred infikovaním. Ako kontrolné (l l, • · ·· ·· ·· · ·· ·· • · · · • · ··· • · 9 ·· ·· ·· • · • · • 9 • · ·· • · ····

Δ,o ) boli použité infikované neošetrované myši. Výsledky sú stredná hodnota 8 zvierat na skupinu.

Obr. 10 ukazuje priebeh prežitia myší infikovaných intravaginálne vírusom HSV-2 (kmeň 333), predošetrených 2,5% SLS ($) alebo gélom + 2,5% SLS (·) 5 min pred infikovaním. Ako kontrolné ( ') boli použité infikované neošetrené myši. Výsledky sú vyjadrené ako stredná hodnota 8 zvierat na skupinu.

Obr. 11 ukazuje časový priebeh prežitia myší infikovaných intravaginálne vírusom HSV-2 (kmeň 333), predovšetkým gélom +5 % polyoxyetylén-40-stearátom (·), gélom +5 % guanidínom (o), gélom + 2,5 % lauroylsarkozínom (^A), gélom + 2,5 % benzalkoniumchloridom (Δ) alebo gélom + 5% Tween 80 (♦) 5 min pred infikovaním. Ako kontrolné (□) boli použité infikované neošetrené myši. Výsledky sú stredná hodnota 7 až 10 zvierat na skupinu.

Obr. 12A je celkový pohľad, objasňujúci prvé uskutočnenie aplikátora podľa hľadiska tohto vynálezu.

Obr. 12B je pohľad z boku, ukazujúci rozmery v palcoch aplikátora z obr.

12A.

Obr. 12C je rozložený pohľad na zložky aplikátora z obr. 12A.

Obr. 12D je pohľad, objasňujúci podrobnosti vonkajších povrchov proximálneho konca vnútornej steny aplikátora z obr. 12A.

Obr. 13A je celkový pohľad, objasňujúci druhé uskutočnenie aplikátora podľa hľadiska tohto vynálezu.

Obr. 13B je pohľad zboku, objasňujúci rozmery v palcoch aplikátora z obr. 13A ako vo vkladacej, tak aj v činnej polohe.

Obr. 13C je rozložený pohľad na zložky aplikátora z obr. 13A.

Obr. 14A je celkový pohľad na tretie uskutočnenie aplikátora podľa hľadiska tohto vynálezu, aplikátor je vyobrazený vo vkladacej polohe.

Obr. 14B je celkový pohľad na aplikátor z obr. 14A, vyobrazený v činnej polohe.

Obr. 14C je pohľad z boku, objasňujúci vnútorné podrobnosti aplikátora z obr. 14A vo vkladacej polohe.

Obr. 14D je pohľad z boku, objasňujúci vnútorné podrobnosti aplikátora z obr. 14A v činnej polohe.

• · ·· • · · • · · ·· ·· ·· ··· · · • · ·· ···· • · · • · • · · • · ·· ·

Obr. 15A je celkový pohľad na štvrté uskutočnenie aplikátora podľa hľadiska tohto vynálezu

Obr 15B je rozložený pohľad na aplikátor z obr. 15A.

Obr 15C je pohľad z boku, objasňujúci vonkajšiu stenu aplikátora z obr. 15A, kde rozmery sú udané v palcoch.

Obr. 15D je pohľad zboku na piest/zásobník aplikátora z obr. 15A, kde rozmery sú udané v palcoch.

Obr. 15E je pohľad z boku v rezu na diel aplikátora z obr. 15A, objasňujúci podrobnosti usporiadania piest/zásobník so zreteľom na vnútorné a vonkajšie steny tela aplikátora.

Obr. 16 ukazuje časový priebeh stredného bodového ohodnotenia léziou (panel A) a prežitie (panel B) bezsrstnatých myší infikovaných kožné vírusom HSV-1 a ošetrených miestne samotným poloxamérom (), 0,5 % foscarnetom vo vodnom roztoku (o) alebo poloxamérom s obsahom 0,5% foscarnetu (·). Infikované neošetrené myši boli použité (□) ako kontrolné. S ošetrovaním bolo začaté 24 h po infikovaní a opakovalo sa trikrát denne počas 4 dní. Výsledky sú vyjadrené ako stredná hodnota 4 zvierat na skupinu.

Obr. 17 ukazuje časový priebeh stredného bodového ohodnotenia lézií (panel A) a prežitia (panel B) bezsrstnatých myší infikovaných kožné vírusom HSV-1 (kmeň F) a ošetrených 24 h po infikovaní jedinou aplikáciou buď poloxaméru s obsahom 5% acycloviru (·) alebo masťou Zovirax® (o). Infikované neošetrené myši boli použité (□)ako kontrolné. Výsledky sú vyjadrené ako stredná hodnota 7 až 10 zvierat na skupinu.

Obr. 18 ukazuje časový priebeh stredného bodového ohodnotenia lézií (panel A) a prežitie (panel B) bezsrstnatých myší infikovaných kožné vírusom HSV-1 (kmeň F) a ošetrených miestne samotným poloxamérom (), poloxamérom s obsahom 5% acycloviru (·) alebo masťou Zovirax® (o). Infikované neošetrené myši boli použité (E) ako kontrolné. S ošetrovaním sa začalo 5 dní po infikovaní a opakovalo sa trikrát denne počas 4 dní. Výsledky sú vyjadrené ako stredná hodnota 7 až 10 zvierat na skupinu.

Obr. 19 Ukazuje distribúciu foscarnetu (Δ, ^A)a acycloviru (o,·) v kožnom tkanive neinfikovaných (panely A, C, E) a infikovaných (panely B, D, F) myší 24 h po miestnej aplikácii buď vo fosfátovom pufri (obrysové symboly) alebo poloxaméri (plné • · • · ·

9 9

9

9 ··

999 • 9 99

9 9 9 · ·

9 9

9 9

9999

9 symboly). Panely A a B ukazujú distribúciu foscarnetu a acycloviru v prúžkoch stratum corneum. Panely C a D ukazujú koncentráciu foscarnetu a acycloviru v epidermis, zatiaľ čo panely E a F ukazujú koncentráciu foscarnetu a acycloviru v koži. Hodnoty sú vyjadrené ako stredná hodnota 4 až 6 zvierat na skupinu.

Obr. 20 ukazuje koncentráciu acycloviru v plazme neinfikovaných a infikovaných myší 24 h po miestnej aplikácii buď vo fosfátovom pufri (obrysové stĺpce grafu) alebo v poloxaméri (plné stĺpce). Hodnoty sú vyjadrené ako stredná hodnota 4 až 6 zvierat na skupinu.

Obr. 21 ukazuje časový priebeh stredného bodového ohodnotenia lézií (panel A) a prežitia (panel B) bezsrstnatých myší infikovaných kožné vírusom HSV-1 (kmeň F), ošetrených samotným poloxamérom (), poloxamérom s obsahom 3% foscarnetu (o), poloxamérom s obsahom 5 % SLS (·) alebo poloxamérom s obsahom 3 % foscarnetu +5 % SLS (Δ). Infikované neošetrené myši boli použité (□) ako kontrolné. Výsledky sú vyjadrené ako stredná hodnota 5 zvierat na skupinu.

Obr. 22 ukazuje citlivosť HSV-1 (kmeň F) na kombinácie rôznych koncentrácií forscarnetu a SLS v bunkách Vero. Hodnoty sú vyjadrené ako stredná hodnota ± SD troch stanovení.

Gélové prípravky

Poloxamér 407 je blokový kopolymér polyoxyetylénu a polyoxopropylénu v hmotnostnom pomerom 7 : 3, s priemernou relatívnou molekulovou hmotnosťou 12.500. Jedným dôležitým znakom tohto blokového kopolyméru je jeho schopnosť tvoriť termoreverzibilný gél. Prechod z kvapalného stavu pri nízkej teplote do gélového stavu pri teplote tela (teplota fázového prechodu čiastočne závisí od koncentrácie gélu, iónovej koncentrácie a začlenených rozpustených látkach) umožňuje mnoho zaujímavých liečebných aplikácií, vrátane miestnych aplikácií. Tento znak má prvoradú dôležitosť, pretože pri miestnom aplikovaní v kvapalnom stave na sliznicu musí gélový prípravok umožniť počas aplikácie lepšie prenikanie do nepravidelností kože a/alebo sliznice a ďalšie pretrvávanie, akonáhle gél dosiahol teplotu tela. Pretože naše gélové prípravky majú mimoriadne nízku toxicitu a dráždivosť, predstavujú príťažlivé použitie systému na miestne dodanie lieku. Podrobnosti prípravy gélových prípravkov sú poskytnuté ďalej v tomto dokumente. Tento vynález pokrýva gélové prípravky poloxamérov 407 akékoľvek vhodnej koncentrácie a hlavne koncentrácie medzi 10 a 35 % hmotnostnými/objem Tento vynález taktiež pokrýva akúkoľvek ďalšiu film vytvárajúcu zložku, gél, krém, masť alebo termoreverzibilnú látku vrátane iných poloxamérov, poloxaminov alebo chemikálií.

Lieky

Do rámca tohto vynálezu spadá akýkoľvek antimikrobiálny, baktericídny, antivírusový, chemoterapeutický, protizápalový, protinádorový, imunomodulačný liek alebo ich kombinácie, ktorý je účinný na prevenciu alebo liečbu infekcie a/alebo nenormálnych stavov sliznice a/alebo kože, spôsobených akýmkoľvek patogénom a/alebo ochorením. V rámci tohto vynálezu je zahrnutý taktiež akýkoľvek detergent, ktorý je schopný rozrušiť membránu patogénov, akékoľvek činidlo zvyšujúce prenikanie kožou, ktoré zvyšuje prenikanie a/alebo nosičov lieku do sliznice a/alebo kože, akýkoľvek mikrobiálny adsorpčný inhibítor, zabraňujúci patogénom vo vstupe do cieľovej bunky, akýkoľvek cytokín alebo antigén, schopný podporiť imunitnú odozvu, ktoré by chránili proti infekcii patogénmi. Tento vynález taktiež pokrýva akúkoľvek kombináciu miestnych prípravkov a/alebo liekov.

Príklady uskutočnenia vvnálezu

Príklady sa týkajú gélových prípravkov na prevenciu infekcie

Nasledujúce príklady sú určené na doloženie prípravy gélových prípravkov, ktoré sú účinné na prevenciu infekcie a/alebo nenormálnych stavov sliznice a/alebo kože, spôsobených akýmkoľvek patogénom a/alebo ochorením, ale v žiadnom prípade nie sú určené ako obmedzujúci rámec tohto vynálezu.

Príprava gélových prípravkov

Gélové prípravky sa pripravia pridaním príslušného objemu destilovanej vody, pufru alebo akéhokoľvek vodného roztoku do poloxaméru 407, aby sa získala požadovaná koncentrácia. Potom sa pridá príslušné množstvo liekov do prášku alebo roztoku poloxaméru, aby sa docielila požadovaná koncentrácia. Hodnota pH gólového prípravku sa nastaví tak, aby vyhovovala požiadavkám príslušného ·· ·· • · · • · • · ·· • · ··· · · • · ·· • · • · ·· ··· cieľového tkaniva, ktorá má byť týmito prípravkami pokrytá Napríklad, ak sa prípravok má použiť ako povlak vaginálnej sliznice, tak sa použije kyslý roztok s pH 4,0 až 4,5. Percento polyméru sa nastaví tak, aby sa získala odpovedajúca teplota prechodu z kvapalného do tuhého stavu Toto nastavenie je v medziach znalostí a schopnosti skúseného odborníka.

Hoci popis tohto vynálezu je obmedzený na špecifické prípady, sú akékoľvek film vytvárajúce zložky a/alebo lipozómy (alebo iné nosiče liekov) alebo akékoľvek kombinácie vyššie uvedených materiálov považované za potenciálne prichádzajúce do úvahy pre vývoj týchto miestnych prípravkov a sú v rámci tohto vynálezu. Prípravky taktiež zahrňujú akúkoľvek film vytvárajúcu zložku a/alebo liek a/alebo lipozómy (alebo iné nosiče) alebo akékoľvek kombinácie týchto produktov v akejkoľvek vhodnej kombinácii.

Infekčnosť oparových vírusov predošetrených SLS alebo DS pri skúmaní mimo živého organizmu

Vyhodnocovaný bol účinok predošetrenia rôznych kmeňov oparových vírusov látkami SLS alebo DS na ich vírusovú infekčnosť pre chúlostivé bunky. V stručnosti: bunky boli rozočkované do dvadsaťštyrijamkových platní (Costar, Montreal, QC, Kanada). Pred infikovaním bol vírus buď suspendovaný do kultivačného média alebo fosfátovej pufrovanej soľanky (PBS - Phospate Buffered Saline) alebo bol inkubovaný 1 h pri 37 °C s rôznymi koncentráciami SLS v PBS. Pri splývaní boli bunky inkubované s vírusovými suspenziami odstreďovaním platní (750 x g počas 45 min pri 20 °C), aby sa umožnila adsorpcia vírusov. Vírusy boli odstránené a listy buniek potom boli prekryté 0,5 ml 0,6 % agarózovým prípravkom Seaplague (Marine Colloids, Rockland, MA, USA), pripraveným v príslušnom kultivačnom médiu. Platne boli inkubované 2 dni pri 37 °C. Potom boli bunky 20 min fixované v 10 % formaldehyde v PBS, boli premyté deionizovanou vodou a sfarbené 0,05 % metylénovou modrou. Vírusová infekcia bola vyhodnocovaná stanovením plaku tvoriacich jednotiek (PFU - Plaque Forming Units).

Tabuľka 1 ukazuje, že predošetrenie rôznych kmeňov HSV-1 a HSV-2 látkou SLS počas 1 h pri 37 °C znižuje, spôsobom závislým od koncentrácie, ich infekčnosť pre bunky Vero. Infekčnosť HSV-1 (kmeň F) bola znížená na 21 %, keď boli vírusové častice predošetrené 25 μΜ SLS. Infekčnosti všetkých kmeňov HSV-2 boli medzi 50 • · • · · • · • · · • · · ·· ··· ·· ·· • · · · • · · · • · ··· • · · ·· ·· • · ·· * a 70 % po preinkubácii s 25 μΜ SLS. Úplná strata infekčnosti všetkých skúšobných kmeňov bola docielená po predošetrení vírusov 50 μΜ SLS. Preinkubácia buniek Vero počas 1 h pri 37 °C s koncentráciami SLS v rozmedzí od 6,25 do 10 μΜ pred ich infikovaním HSV-1 (kmeň F) nemala za následok stratu infekčnosti vírusu (údaje neuvedené). Tieto výsledky naznačujú, že SLS pôsobí na vírus a nie na bunky.

Tabuľka 1 : Infekčnosť niektorých kmeňov HSV-1 a HSV-2, predošetrených 1 h pri 37 °C rôznymi koncentráciami SLS

PFU (% kontrolnej vzorky) pre

Koncentrácia SLS HSV-1 HSV-2 HSV-2 HSV-2 HSV-2 (μΜ) (F)^a (333)^a (22)^a (6)^b (15589)°

6,25	101,1±7,0	102,9±23,5	128,0±18,5	105,3±12,4	108,7±22,2
1,25	79,2±36,4	115,4+17,0	103,4±14,9	82,1±40,7	115,1±17,5
25	21,2±18,0	72,9±9,1	63,8±11,9	51,1±30,1	59,0±24,0
50	0	0	0	0	0

^a kmeň divokého typu ^b kmeň odolný oproti acycloviru ^c kmeň odolný oproti foscarnetu

Obr. 1 ukazuje vplyv predošetrenia HSV-1 (kmeň F) rôznymi koncentráciami SLS a DS na jeho infekčnosť pre bunky Vero. Ak sa SLS pridal k bunkám Vero po ich infikovaní, bola strata vírusovej infekčnosti menej dramatická v porovnaní s infekčnosťou, ktorá sa docielila vírusom predošetrovaným 1 h pri 37 °C rovnakými koncentráciami SLS. Po predošetrení bola pozorovaná strata 50 % vírusovej infekčnosti pri koncentrácii 20 μΜ v porovnaní s 75 μΜ, ak vírus nebol predošetrený. Okrem toho, hoci úplné potlačenie infekčnosti bolo docielené po preinkubácii 50 μΜ SLS, potlačenie bez predošetrenia nebolo úplné ani pri 100 μΜ. Podobne, predošetrenie HSV-2 (kmeň 333) látkou LSL taktiež ovplyvnilo infekčnosť tohto kmeňa (údaje neuvedené). Naproti tomu DS znižuje infekčnosť vírusu nezávisle od toho, či vírus bol predošetrený látkou DS. V tomto prípade bola pozorovaná strata 50 % vírusovej infekčnosti pri koncentrácii 1nM.

S použitím skúšky MTS bola taktiež skúšaná životaschopnosť buniek Vero, vystavených počas 1 h pri 37 °C koncentráciám SLS alebo DA, podobných koncentráciám, ktoré boli použité v obr. 1 a Tabuľke 1. V medziach použitých koncentrácií neboli preukázané žiadne znaky škodlivosti pre bunky (údaje neuvedené).

Obr. 2 ukazuje účinnosť rôznych koncentrácií SLS (panel A) alebo DS (panel B) oproti HSV-1 (kmeň F) v bunkách Vero. Stručne : bunky boli 2 h pri 37 °C infikované vírusom. Potom bola z povrchu odstránená kvapalina a bunky boli prekryté 0,5 ml EMEM + 2 % FBS s obsahom 0,6 % agarózového prípravku Seaplaque a SLS alebo DS požadovanej koncentrácie. Potom boli 2 dni platne inkubované pri 37 °C v atmosfére 5 % CO₂. Bunky boli 20 min fixované 10 % formaldehydom v PBS, premyté deionizovanou vodou a sfarbené 0,05 % metylénovou modrou. Vírusová infekčnosť bola vyhodnocovaná stanovením PFU. Výsledky ukazujú, že ako SLS, tak aj DS znižuje spôsobom závislým od koncentrácie vírusovú replikáciu podobným spôsobom s úplnou účinnosťou pri 100 μΜ pre SLS, prípadne 20 nM pre DS. Bez viazania sa na akýkoľvek mechanizmus vyššie uvedené výsledky naznačujú, že SLS má mikrobiálne adhézny inhibičný účinok.

Infekčnosť HIV-1 predošetreného látkou SLS, pri skúmaní mimo živý organizmus

Podobne bol vyhodnocovaný vplyv predošetrenia HIV-1 (kmeň NL4-3) látkou SLS na jeho infekčnosť pre bunky 1G5, derivát Jurkat E6-1, ktorý v sebe skrýva dve pevne integrované konštrukcie vytvorené z luciferázového génu pod vplyvom HIV1sf2LTR. V stručnosti : pred infikovaním bol vírus 1 h pri 37 °C inkubovaný s kultivačným médiom alebo s 500 μΜ SLS. Potom boli bunky (1 x 10 ⁵ buniek/jamku) 2 h pri 37 °C inkubované v atmosfére 5 % CO₂ s HIV-1 kmeňom NL4-3 (10 ng p24). Potom boli bunky premyté, spätne suspendované do 200 μΙ úplného kultivačného média a prenesené do devädesiatšesť jamkových platní s plochými dnami pre tkanivové kultúry (Microtest III, Falcon; Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ, USA). Po štyridsaťosemhodinovom inkubačnom čase pri 37 °C boli bunky lyzované, podrobené cyklu mrznutia a topenia a aktivita luciferázy bola sledovaná použitím

. · · · · · ·· ·· ·· ···· mikroplatňového luminimetra (MLX; Dynex Technologies, Chantilly, VA, USA). Výsledky z tohto súboru skúšok jasne ukazujú, že predošetrenie HIV-1 (kmeň NL4-3) 500 μΜ SLS počas 1 h pri 37 °C takmer celkom potlačilo infekčnosť HIV-1 pre bunky 1G5. (obr. 3)

Elektrónová mikroskopia buniek Vero infikovaných vírusom HSV-1 (kmeň F), predošetreným SLS

S použitím elektrónovej mikroskopie bol v bunkách Vero vyhodnocovaný výskyt vírusu HSV-1 (kmeň F), predošetrovaného počas 1 h pri 37 °C rôznymi koncentráciami SLS (50, 75 a 100 μΜ ). V stručnosti: bunky (80 až 90 % splývania) boli 48 h pri 37 °C v atmosfére 5 % CO₂ infikované vírusom (približne 70 PFU/ml v 14 ml). Bunky boli zoškrabané z misiek a spätne suspendované do kultivačného média. Bunky boli odstredené (515 x g, 10 min pri 4 °C) a kvapalina nad usadeninou bola dekantovaná a bunky boli spätne suspendované do približne 500 μΙ média. Bunky boli prenesené do eppendorfskej trubice a boli odstredené (10.000 x g, 5 min pri 4 °C). Hrudky boli spätne suspendované do približne 200 μΙ 20 % albumínu z hovädzieho séra (BSA-Bovine Sérum Albumín). Do zmesi sa pridalo niekoľko kvapiek 25 % glutaraldehydu a vzorky boli ihneď vložené do ľadového kúpeľa, aby sa umožnila polymerácia BSA. Hrudky boli potom rozrezané na 1 mm³ vzorky, ktoré boli potom 1 h fixované v 2 % glutaraldehyde v PBS, v 1 % OsO₄ v PBS 1 h a potom 30 min v 0,1 % kyseline tanínovej v PBS. Vzorky boli trikrát prepláchnuté v PBS s 5 minútami medzi každým krokom. Vzorky boli 30 min farbené 2 % uranylacetátom v 10 % etanole. Vzorky boli dehydratované a bežným postupom uložené do Eponu. Rezy (s hrúbkou približne 75 nm) boli upevnené na medenú mriežku (200 mesh). Vzorky boli odfarbené uranylacetátom, kontrastne sfarbené citranom olova a pozorované pod elektrónovým mikroskopom JEOL 1010 (JEOL Canada Inc., StHubert, QC, Kanada).

Obr. 4 (panel A) ukazuje normálny výskyt vírusu v jadre buniek Vero. Vírusové častice sa skladali z kapsidov hexagonálneho tvaru a obsahujúceho elektrónovo husté jadro DNA. V cytoplazme väčšiny buniek boli taktiež nájdené úplné vírusové častice, tvorené obalom obklopenými nukleokapsidom. V bunkách Vero, infikovaných vírusmi predovšetkým 50 μΜ SLS (panel B), 75 μΜ SLS (panel C) a 100 (panel C) a ·· • · · • · • · • · ·· • · · • · · • · • · ·· · • ·· • · · · • · · • · · · • · ·· ·· ·

100 (panel D) μΜ SLS boli izolované vírusové častice z jadier, nie však z cytoplazmy V jadrách neboli pozorované žiadne zrelé nukleokapsidy, ale vírusové častice boli tvorené kapsídami s obsahom nespojitého nahromadenia elektrónovo hustého materiálu. Počet prázdnych kapsidov, nájdených v jadrách buniek infikovaných vírusom predošetreným SLS, sa znižuje so zvyšujúcimi sa koncentráciami lieku použitého na predošetrenie. V bunkách infikovaných vírusmi predošetrenými 100 μΜ SLS bolo v jadrách zistených iba niekoľko buniek s prázdnými kapsidmi. Zhrnuté : tieto výsledky vysvetľujú stratu infekčnosti oparových vírusov v prítomnosti SLS.

Stanovenie množstva glykoproteínového D génu HSV

Na stanovenie prítomnosti vírusovej DNA v infikovaných bunkách bolo taktiež na bunkách Vero vyhodnocované množstvo glykoproteínového D génu HSV-1 (kmeň F) po predošetrení látkou SLS. V stručnosti : HSV-1 (kmeň F) bol 1 h pri 37 °C pred ošetrovaný rôznymi koncentráciami SLS (12,5, 25, 50, 75 a 100 μΜ ) v EMEM + 2 % FBS. Bunky Vero (80 až 90 % splývania) boli 48 h pri 37 °C v atmosfére 5 % CO₂ infikované vírusom (100 PFU/ml v 20 ml). Kultivačné médium bolo odstránené a povlak buniek bol dvakrát premytý prípravkom 1X HBSS. Bunky boli zoškrabané z misiek a znova suspendované do EMEM + 2 % FBS. Celá DNA bola extrahovaná štandardným fenol/chloroformovým postupom. Množstvo celkovej DNA bolo stanovené s použitím Burtonovho postupu. Pre túto štúdiu použitá vzorka odpovedá časti glykoproteínu D HSV-2 (kmeň 333), vytvoreného pomocou PCR s použitím nasledujúcich primérov:

P1 (5'-GCCACCATGGGGCGTTTGACC-3') a P2 (5'- AAACTCAGTTATCTAGTCCTCGGGGTC-3') a bol označený [³²P] náhodným značením. Hybridizácia bola robená pri 65 °C v 0,25M Na₂HPO₄ (pH 6,8 s kyselinou ortofosforečnou) a 7 % SDS. Premytie bolo urobené v 40 nM Na₂HPO₄(pH 6,8 s kyselinou ortofosforečnou) a 1% SDS počas 20 min pri 65 °C a následne počas 20 min pri 25 °C.

Obr. 5 (panel A) ukazuje hodnotenie množstva glykoproteínového D génu HSV-1 (kmeň F) predošetreného rôznymi koncentráciami látky SLS v bunkách Vero. Po štydsaťosemhodinovej inkubácii boli bunky zachytené a extrahovaná bola celá DNA. Panel A ukazuje podiely Bg /II fragmentovanej DNA (325 ng), nanesené na

0,8% agarózový gél, prenesené na nylonovú membránu a hybridizované glykoproteínovou D sondou Panel B ukazuje kvantitatívne meranie hladín HSV-1 DNA, získaných skanovacou denzitometriou autorádiogramu prístrojom Alphalmager. Žiadne veľké zmeny obsahu glykoproteínového D génu vírusu v bunkách infikovaných HSV-1 (kmeň F), predošetrených 12,5 μΜ SLS, 25 μΜ SLS a 50 μΜ SLS, neboli pri porovnaní s kontrolnou vzorkou pozorované. Kvantitatívne meranie hladín DNA HSV-1, získaných skanovacou denzitometriou autorádiogramu (panel B) bolo podobné. Avšak keď bol vírus predošetrený vyššími koncentráciami SLS (75 μΜ a 100 μΜ ), bolo pozorované výrazné zníženie obsahu glykoproteínového D génu so znížením hladín DNA na 65,1 %, prípadne 34,9 % kontrolných hodnôt. Tieto údaje naznačujú, že SLS ich interferuje s dozrievaním vírusových nukleokapsidov buď znížením ich rýchlosti dozrievania alebo interferovaním so zakapsidovaním DNA do kapsidovej šupky.

Skúmanie infekčnosti oparových vírusov, predošetrených látkou SLS, na živom organizme (intranzálny model).

Účinok predošetrenia HSV-2(kmeň 22) látkou SLS na vírusovú infekčnosť bol taktiež vyhodnocovaný na myšom infekčnom intranázalnom modeli. V stručnosti : v tejto štúdii boli používané 4 týždne staré samice myší Balb/c (Charles River Breeding Laboratories Inc., St-Constant, QC, Kanada). Pred infikovaním bol HSV-2 (kmeň 22) inkubovaný 1 h pri 37 °C s PBS alebo s rôznymi koncentráciami SLS (6,25 μΜ , 25 μΜ alebo 100 μΜ ) na dosiahnutie konečného vírusového inokula s 2000 PFU/20 μΙ. Myši boli slabo narkotizované použitím prípravku Aerrane® (Isolfurane, USP; Jansens, North York, On, Kanada) a vírusová suspenzia (celkový objem 20 μΙ) bola aplikovaná do ľavej nosnej dierky myší. Potom boli myši vrátené do klietky a denne bolo vyhodnocované prežívanie.

Obr. 6 ukazuje, že všetky myši, infikované neošetreným vírusom, skapali na encefalitídu medzi 9. a 11. dňom. Na rozdiel od toho 67 % myší, infikovaných vírusovým inokulom predošetreným 6,25 μΜ SLS, infekciu prežilo. Zvláštny význam má to, že všetky myši, infikované vírusovou suspenziou predošetrenou 100 μΜ SLS, infekciu prežili a nevykazovali žiadne príznaky choroby.

• · · • ·

·· ·· ·· ·· ···· · · · · • · · · · · .

• · ··· · · · ·

Skúmanie infekčnosti oparových vírusov, predošetrených SLS alebo DS, na živom organizme (kožný model)

Účinok predošetrema HSV-1 (kmeň F) látkou SLS na vírusovú infekčnosť bol taktiež vyhodnocovaný na modeli myšej kožnej infekcie. V tejto štúdii boli používané 5 až 6 týždňov staré samice bezsrstných myši (SKH1; Charles River Breeding Laboratories Inc., St-Constant, QC, Kanada). Pred infikovaním bol HSV-1 (kmeň F) 1 h pri 37°C inkubovaný s PBS, s 6,25 μΜ SLS, 25μΜ SLS alebo 100 μΜ SLS alebo s 0,25 nM DS, 1 nM alebo 10 nM DS na získanie vírusového inokula s 3 x 10⁵ PFU/50 μΙ. Myši boli narkotizované intraperitoneálnou injekciou zmesou obsahujúcou 70 mg/kg ketamínhydrochloridu (injekcie Rogarsetic® USP; Rogar/STB Inc., Montreal, QC, Kanada) a 11,5 mg/kg xylazínu (Rompun® ; Miles Canada Inc., Etobicoke, ON, Kanada). Vírus bol naočkovaný na laterálnu stranu tela v ľavej bedrovej kožnej oblasti. Koža bola šesťkrát poškriabaná skríženými čiarami zvisle držanou ihlou kalibru 27. Vírusová suspenzia (50 μΙ) bola nanesená na poškrabanú oblasť a zatieraná 10 až 15 sekúnd aplikátorom s bavlnenou špičkou, nasýtenou roztokmi EMEM + 2% FBS alebo SLS alebo DS. Poškrabaná oblasť bola chránená tampónom na kurie oká, ktorý bol na telách myši pridržiavaný chirurgickou páskou. Pórovitá vnútorná stena otvoru v tampóne na kurie oká bola pred použitím impregnovaná tkanivovým lepidlom, aby sa zabránilo absorpcii lieku. Otvor tampónu na kurie oká bol taktiež uzatvorený chirurgickou páskou. Potom boli myši vrátené do klietky a dvakrát denne boli pozorované.

Obr. 7 ukazuje časový vývoj stredného bodového ohodnotenia lézií bezsrstnatých myší, kožné infikovaných HSV-1 (kmeňom F), predbežne 1 h pri 37 °C ošetrovaných rôznymi koncentráciami SLS alebo DS. Vyhodnotenie bodového ohodnotenia lézií bolo robené podľa kritéria, ktoré je uvedené v Tabuľke. V infikovaných neošetrených myšiach počas prvých štyroch dní po infikovaní neboli viditeľné žiadne chorobné príznaky kožnej infekcie a zostávala viditeľná iba poškrabaná oblasť. Piaty deň sa u niektorých myší začali objavovať oparové lézie kože vo forme malých pľuzgierikov, vzdialených od miesta očkovania. Šiesty deň sa takmer u všetkých neošetrených myší vyvinula oparová lézia kože infikovaného dermatómu vo forme 4 až 5 mm širokého pruhu, prebiehajúceho od chrbtice k brušnej stredovej čiare, podobajúceho sa pásovým oparom. Maximálne stredné ·· ·· •· ·· ·· ···· ···· ··· • · · · ·· · · · ) · · ··· · · · · · · · ‘-t. ······ · ·· ·· ·· ···· ·· · bodové ohodnotenie lézií bolo pozorované ôsmy deň. Stredné bodové ohodnotenie lézií potom u niektorých myší od 11. do 15. dňa následkom živelného ústupu kožných lézií klesalo. Myši infikované vírusom, predošetreným 6,25 μΜ SLS a 25 μΜ SLS, nevykazovali významné zníženie stredného bodového ohodnotenia lézií. Avšak myši infikované vírusom, predošetreným 100 μΜ SLS nevykazovali žiadny príznak kožných lézií. Základnú dôležitosť má poznatok, že všetky myši, infikované vírusom predošetreným 100 μΜ SLS, infekciu prežili (údaje sa neuvádzajú). Naproti tomu myši infikované vírusom predošetreným 0,25 nM DS, vykazovali čiastočné zníženie stredného bodového ohodnotenia lézií, zatiaľ čo myši infikované vírusom predošetrným buď 1 nM DS alebo 10 nM DS vykazovali lepšiu ochranu proti vývoju oparových lézií.

Tabuľka 2 : Kritériá použité na vyhodnotenie oparových kožných lézií

Bodové ohodnotenie Vzhľad lézií

Žiadna viditeľná infekcia

Infekcia viditeľná iba na mieste očkovania, oblasť poškrabania

Infekcia iba na mieste očkovania, s opuchom, stvrdnutím a Sčervenaním kože

Infekcia na mieste očkovania s nespojitými léziamí, vytvárajúcimi sa ďalej od očkovaného miesta

Exantém viditeľný na polovine tela, ale ešte nesplývajúci

Exatém splývajúci, ale ešte nie nekrózny alebo zvredovatelý

Úplný exantém s nekrózou alebo zvredovatením, paralýza zadných končatín, nafúknutie brucha, smrť.

Profylaktický účinok poloxamérových prípravkov obsahujúcich alebo neobsahujúcich SLS, skúmaný na živom organizme (kožný model)

Taktiež bola vyhodnocovaná účinnosť poloxaméru samotného a poloxaméru s obsahom 5% SLS na zabránenie vývoja kožných lézií u myší. V tejto štúdii boli

9 9 9

9 9 • 99

9 9

9· ···· ·· 99 • 9 · ·

9 9 9 • · ···

9 9 • 9 99 použité samice bezsrstnatých myší ( staré 5-6 týždňov). V stručnosti ' myši boli narkotizované intraperitoneálnou injekciou zmesou obsahujúcou 70 mg/kg ketamínhydrochloridu a 11,5 mg/kg xylazínu. Prípravky boli nanesené miestne na laterálnu stranu tela v ľavej bedrovej kožnej oblasti Päť minút a 1 hodinu po nanesení bola jedna kvapka inokula (3,15 x 10⁸ PFU/ml) nanesená na kožu a poškrabanie bolo urobené ihlou 27G sem a tam v kvapke, aby bola napodobnená nehoda, ktorá sa môže prihodiť zdravotníkom. V tomto modeli musí byť vírusové inokulum vyššie, aby sa získal úplný exantém formy pásového oparu v takmer všetkých myšiach. Avšak úmrtnosť spojená s infekciou bola nízka a nebola použiteľná ako kritérium na vyhodnotenie účinnosti ošetrenia. Poškrabaná oblasť bola chránená tampónom na kurie oká, ktorý bol na telách myší pridržiavaný chirurgickou páskou. Otvor tampónu na kurie oká taktiež uzatvorený chirurgickou páskou. Potom boli myši vrátené do klietky a boli dvakrát denne pozorované.

Obr. 8 ukazuje časový vývoj stredného bodového ohodnotenia lézií infikovaných a neošetrených myší a myší predošetrených poloxamérom samotným alebo poloxamérom s obsahom 5% SLS 5 minút alebo 1 h pred ich kožnou infekciou HSV-1 (kmeň F). Výsledky ukazujú, že predošetrenie myší gélom samotným 5 minút alebo 1 h pred infekciou poskytovalo iba slabú ochranu proti vývoju kožných lézií. Najdôležitejšou zaujímavosťou je to, že u myší predošetrených ako 5 minút, tak aj 1 h poloxamérom s obsahom 5% SLS bola pozorovaná úplná ochrana proti kožným léziám. Tieto výsledky ukazujú veľké možnosti našich prípravkov ako profylaktický prístup na zabránenie infekcií patogénmi. Tento nástroj fakticky chráni proti náhodnej infekcii zdravotníkov.

Účinnosť gélových prípravkov pri ochrane proti infekcii spôsobenej oparovými vírusmi, skúmaná na živom organizme (intravaginálny model)

Účinnosť gélových prípravkov na prevenciu genitálneho prenosu HSV - bola vyhodnocovaná na myšom intravaginálnom infekčnom modeli. V stručnosti: pre túto štúdiu boli použité samice myši Balb/c 4 týždne staré. Na zvýšenie náchylnosti myši na opar bol každej myši podaný subkutánne progesteron (Depo-Provera) v množstve 2,5 mg 7 dní pred a 1 deň pred naočkovaním HSV-2. Narkotizované myši boli naočkované 5 μ 2,4x10⁷ PFU/ml HSV-2 (kmeň 333) po vyšetrení vagíny kalciumalginátom na tenko zašpicatenom tampóne. Na stanovenie účinnosti gélových

• · • · · · • · t · • · ··· ♦ • · · ·· ·· • · • · • · ·· ···· ·· prípravkov v blokovaní oparovej infekcie bolo 15 μΙ gélu dodaných špičkou pipety do vagíny niekoľko minút pred očkovaním. Špičkou pipety bolo pohybované štyrikrát tam a von na simulovanie pohybovej akcie pri pohlavnom styku, pričom sa dbalo, aby nebolo spôsobené krvácanie.

Obr. 9 ukazuje bodové ohodnotenie lézií a pomer prežitia infikovaných neošetrených myší a myši predošetrených intravaginálene gélom samotným pred infekciou HSV-2 (kmeň 333). Štyri dni po infikovaní vykazovali infikované neošetrené zvieratá edém a sčervenania a za 6 až 12 dní väčšina z nich skapala na encefalitídu. Základný význam má to, že všetky myši ošetrené samotným gélom infekciu prežili a do 16 dní infikovania nevykazovali žiadne príznaky ochorenia. Prítomnosť samotného gélu preto infekciu HSV-2 ruší.

Obr. 10 ukazuje pomer prežitia infikovaných neošetrených myši a myší predošetrených intravaginálne 2,5 % SLS alebo gélom s obsahom 2,5 SLS pred infikovaním HSV-2 (kmeňom 333). Štyri dni po infikovaní vykazovali infikované neošetrené zvieratá perineálny edém a sčervenanie a za 6 až 12 dní väčšina skapala na encefalitídu. Základný význam má to, že všetky myši ošetrené buď 2,5 % SLS samotným alebo gélom s obsahom 2,5% SLS infekciu prežili a do 16 dní po infikovaní nevykazovali žiadne príznaky ochorenia. Zhrnuté : tieto výsledky jasne naznačujú, že použitie nášho gélového prípravku predstavuje inovačné preventívne opatrenie na zníženie pohlavného prenosu oparu, HIV a ďalších patogénov, ktoré spôsobujú STD.

Obr. 11 ukazuje pomer prežitia infikovaných neošetrených myší a myší predbežne intravaginálne ošetrených gélom obsahujúcim rôzne zlúčeniny pred infikovaním HSV-2 (kmeň 333). Tieto zlúčeniny boli vybrané tak, aby zastupovali ďalšie sulfatizované a nesulfatizované zlúčeniny, ktoré nemajú detergentné vlastnosti. Taktiež zastupujú rôzne iónové (aniónové a katiónové) a neiónové zlúčeniny. Tento vyšetrovací prístup bol určený na nájdenie ďalších potencionálnych látok, prichádzajúcich do úvahy ako mikrobicídy. Výsledky ukázali, že gélové prípravky s obsahom 2,5 % laurylsarkozínu poskytovali úplnú ochranu pred infekciou (100 % prežitie). Opačne gélové prípravky s obsahom 2,5 % benzalkoniumchloridu, 5% polyoxyetylén-40-stearátu a 5% guanidinu dávali 60 %, resp. 60% a 30% prežitie. Naše prípravné výsledky ukázali, že laurylsarkozín má dobrý potenciál, aby sa zobral do úvahy ako mikrobicíd, čo je teraz skúmané. Napriek tomu ďalšie zlúčeniny, napríklad benzalkoniumchlorid, polyoxyetylén-40-stearát a guanidín, ktoré ·· • · • · ·· ·· • · · · • · · · • · ··· · • · · ·· ·· • · · • · · • · · ·· ····

preukázali čiastočný mikrobicídny potenciál, je možné taktiež využiť pri optimalizácii ich koncentrácie pre lepšiu účinnosť. Alternatívne môžu kombinácie týchto zlúčenín, pokiaľ sú kompatibilné, poskytnúť optimálnu účinnosť. Bez viazania na akúkoľvek teóriu je možné predpovedať, že kombinácia detergentu s chaotropným činidlom zaisti účinnosť rovnako dobrú alebo lepšiu ako SLS. Toto sú špecifické príklady potenciálnych mikrobicídov, ale v žiadnom prípade nie sú určené na obmedzenie rámca tohto vynálezu.

Konštrukcia aplikátora pre vaginálne/anorektálne dodávanie prípravkov

Ako bolo uvedené vyššie, predmetom tohto vynálezu je poskytnutie prípravkov na prevenciu infekcií a/alebo nenormálnych stavov sliznice a/alebo kože spôsobených akýmkoľvek patogénom a/alebo ochorením. Pre vaginálne aplikácie musia byť akékoľvek miestne prípravky podávané pomocou aplikátora, ktorý pre maximálnu účinnosť umožňuje rovnomernú distribúciu obsahu do celej vagíny (dodávanie na steny) a cervix (dodávanie na prednú stranu). Preto bol skonštruovaný špecifický aplikátor, ktorý umožňuje 360 stupňovú distribúciu obsahu do vagíny a ďalej na cervix, čo je veľké zlepšenie proti existujúcim obvyklým vaginálnym aplikátorom, ktoré dodávajú obsah iba na prednú stranu (oblasť cervixu). Rozdielne ciele, ktoré musia byť dosiahnuté a hlavné znaky, ktoré predmetný špecifický aplikátor musí pre dodávanie miestnych prípravkov mať, zahrňujú :

a) rovnomernú distribúciu miestnych prípravkov ako sú kvapalina a gél do celej vagíny/cervixu

b) účinné a rýchle dodanie jeho obsahu

c) odolnosť voči teplotným zmenám (- 40 až 60 °C)

d) kompatibilitu polyméru aplikátora s gélovými prípravkami

e) ľahkosť sterilizácie

f) tesnosť

g) ľahké ovládanie a vkladanie

h) odolnosť voči rozbitiu, rozpínaniu obsahu a otrasom v dôsledku dopravy

i) kompatibilitu s činidlami a/alebo podmienkami, ktoré sú prítomné v okolitom prostredí

Technické predpoklady a stratégie • · ·· ·· • · · · • · · · • · ··· • · · • · · · • · · • · • · · • · ···· • · ·· ·

Účinnosť prípravkov blokovať pohlavný prenos patogénov, ktoré spôsobujú STD závisí i) od povahy prípravku, ktorý má byť dodávaný a ii) od jeho schopnosti pokrývať celú oblasť vagíny/cervixu. Na rozdiel od iných produktov tento špecifický prípravok s termoreverzibilnými vlastnosťami je dodávaný v kvapalnej forme, zaisťujúcej dobré prenikanie prípravku do najmenších nepravidelnosti vaginálnej/cervikálnej sliznice. Pre maximálnu ochranu musí tento prípravok pokrývať celú vaginu/cervix. Avšak existujúce vaginálne aplikátory majú jediný otvor na špičke, takže obsah je dodávaný iba do oblasti cervixu s vylúčením vagíny a tým obmedzujú svoju účinnosť. Predmetný špecifický vaginálny aplikátor má viac otvorov a/alebo štrbín (na špičke a po stranách) na dodávanie prípravku alebo akejkoľvek film vytvárajúcej zložky, gélu, krému, masti a/alebo antimikrobiálneho, baktericídneho, antivírusového, chemoterapeutického, protizápalového, protinádorového alebo imunomodulačného činidla, detergentu, mikrobiálne absorpčeného inhibítora, činidla zvyšujúceho prenikanie kožou, cytokínu, antigénu, vakcíny alebo ich kombinácie na liečbu alebo prevenciu STD, rakoviny alebo hociktorého iného ochorenia, na rovnomerné pokrytie ako vagíny tak cervixu pre maximálnu ochranu. Prieskum literatúry odhalil, že na trhu neexistujú aplikátory alebo podobné produkty, ktoré majú takúto konštrukciu, ktorá umožňuje dodávanie ich obsahu do celej vagíny/cervixu.

Znaky predmetného aplikátora

Všetky existujúce aplikátory dodávajú prípravky vo forme gélu/krému, čo má tú nevýhodu, že nie je pokrývaná celá oblasť vagíny/cervixu. Na druhej strane predmetný prípravok má dôležitú vlastnosť termoverzibility byť kvapalný pri teplote miestnosti a gélovatieť pri teplote tela. Pri dodávaní ako kvapalina tento prípravok pokrýva celú vaginu/cervix a preniká do najmenších nepravidelností vaginálnej a cervikálnej sliznice. Pre tento špecifický prípravok alebo inú film vytvárajúcu zložku, gél, krém, masť a/alebo antimikrobiálne, baktericídne, antivírusové, chemoterapeutické, protizápaiové, protinádorové alebo imunomodulačné činidlo, detergent, mikrobiálne absorpčný inhibítor, činidlo zvyšujce prenikanie kožou, cykotín, antigén, vakcínu alebo ich kombinácie na liečbu alebo prevenciu STD, rakoviny alebo akéhokoľvek iného ochorenia je potrebný špecifický aplikátor, dodávajúci tak, aby pokryl od naprostého konca a taktiež stien celú vaginu/cervix, čo ·· ·· ·· ·· ·· ···· ···· ···

Q ·Π ****** ···

Λ. / ············ ·· ···· ·· ·· ·· ·· ···· ·· · je kľúčový činiteľ poskytnutia maximálnej ochrany proti patogénom, ktoré spôsobujú STD. Hlavné rysy aplikátora sú diskutované dole (pozri taktiež Tabuľku 3).

a) Rovnomerná distribúcia miestnych prípravkov ako kvapaliny alebo gélu do celej vagíny/cervixu

Aplikátor musí dodávať prípravok rovnomerne a musí pokryť celú oblasť vagíny/cervixu dodávaním apikálnym a laterálnymi otvormi. Okrem toho aplikátor musí dodávať dostatočné množstvo na pokrytie ako cervixu, tak aj vagíny. To umožní maximálnu ochranu jednotlivcov proti patogénom, ktoré spôsobujú STD.

b) Účinné a rýchle dodávanie obsahu

Väčšina existujúcich vaginálnych aplikátorov dodáva časť svojho obsahu, čo obmedzuje účinnosť prípravku. Preto aplikátor musí dodávať buď celý svoj obsah bez zanechania zostatkového materiálu v zásobníku, alebo dodávať množstvo, požadované ako dostačujúce na pokrytie celej cieľovej sliznice. To je dosiahnuté konštrukciou zásobníka a prepočítaním priemernej sily prstov, ktoré na zásobník tlačia, aby sa obsah uvoľnil. Čas dodávania sa mení v závislosti od toho, či obsah sa dodáva ako kvapalina, poloviskózny materiál alebo gél. Avšak dodávanie obsahu aplikátora musí byť rýchle.

c) Odolnosť proti tepelným zmenám

Polymér použitý pre vývoj vaginálneho aplikátora nesmie ovplyvňovať vlastnosti gélového prípravku (stálosť, viskozitné parametre, nejedovatosť, účinnosť v blokovaní patogénov, atď.)

e) Ľahkosť sterilizácie

Konštrukcia a materiál aplikátora musia zaisťovať možnosť sterilizácie s použitím vhodného spôsobu a nesmú mať za následok zmeny charakteristík aplikátora alebo jeho obsahu.

f) Tesnosť

Aplikátor musí byť nepriepustný v podmienkach skladovania a dopravy. Ak sú však krabice naskladané na seba, tak aplikátor nesmie prepúšťať svoj obsah.

• · • · ··· · · ·· ····

g) Ľahkosť ovládateľnosti a vkladania

Aplikátor musí byť prijemný pre užívateľa, ľahko ovládateľný a ľahko vkladateľný bez spôsobenia nepohodlia pre jeho užívateľa. Okrem toho musi byť pre užívateľa príťažlivý.

h) Odolnosť proti rozbitiu, rozpínaniu obsahu a otrasom v dôsledku dopravy

Aplikátor musi byť odolný oproti rozbitiu, keď užívateľovi vypadne z rúk, alebo pri manipulácii počas dopravy. Musí byť taktiež odolný proti rozpínaniu svojho obsahu. Okrem toho musi byť aplikátor stabilný a musí odolávať otrasom počas dopravy.

i) Kompatibilita s činidlami a/alebo podmienkami, ktoré sú prítomné v okolitom prostredí

Aplikátor musí odolávať činidlám a/alebo rôznym podmienkam v okolitom prostredí. Na aplikátor nesmie napríklad pôsobiť kyslé prostredie pH vagíny, vaginálne sekréty a podobné podmienky.

Tabuľka č. 3 : Požadované funkcie a cieľové hodnoty aplikátora

Čís.	Funkcia	Popis	Cieľová hodnota
1	Distribuuje prípravok ako kvapalinu, poloviskóznu látku, gél, krém, masť alebo inú film vytvárajúcu zložku	Ako náhle sa raz zaháji, tak pokračuje vypudzovanie a distribúcia prípravkov	Množstvo 3 až 5 ml
2	Rovnomerná distribúcia prípravkov	Distribúcia prípravku tak, aby pokryla celú vagínu/cervix	Distribúcia v 360°C vo vagíne a v 360°v cervixe
3	Obsahuje prípravok ako kvapalinu, poloviskóznu látku, gél, krém, masť alebo inú film vytvárajúcu zložku	Aplikátor má zásobník	Minimálne s obsahom injikovaného objemu
4	Nepriepustnosť	Žiadny únik z balenia a po	0 ml

·· ·· ·· ·· ·· • ·· · · ·· · · ··· e · a · · · · · · · • · ··· ··· ···· · • · · · · · · · · ·· ·· ·· ···· ·· ··· počiatočnej manipulácii í

'5 1 i		Priaznivý názor dobrovoľníkov (7/10)
! Ľahká ovládateľnosť	Aplikátor je možné ľahko .držať a je pre užívateľa príjemný
6 1 1	Ľahkosť vkladania	Aplikátor sa vkladá bezbolestne a s minimálnym odporom	Stredná dĺžka 4,5 palca (115 mm), vrátane zásobníka a držiaka
7	Dodáva do vagíny/cervixu	Dĺžka aplikátora umožňuje dosiahnutie cervixu	Stredná dĺžka 4,5 palca (115 mm), vrátane zásobníka držiaka
8	Odolnosť pri páde	Aplikátor sa nesmie rozbiť a obsah nesmie uniknúť, keď vypadne užívateľovi z rúk	Pád z výšky 60 palcov (1,5 m)
9	Odolnosť proti vplyvom prostredia	Na aplikátor nesmie pôsobiť vlastný obsah, vaginálne sekréty ani obalový materiál	Údaje od výrobcu termoplastickej živice
10	Nejedovatosť a neovplyvňovanie stavu	Nepôsobí na zloženie alebo akosť prípravku ; taktiež nepôsobí na okolité prostredie	Údaje od výrobcu termoplastickej živice a majiteľa miestneho prípravku
11	Odolnosť voči otrasom počas dopravy	Aplikátor a zásobník sa nesmú poškodiť a musia po doprave normálne fungovať	Overiť štandardy
12	Byť účinným	Je funkčný (obsah dodáva a distribuuje rovnomerne bez	Priaznivý názor dobrovoľníkov
___		zlyhania)	(9/10)
13	Rýchle dodávanie	Obsah je z aplikátora injektovaný rýchlo	Približne 5 s
14 I ______i	Odolávať teplotným zmenám	Aplikátor nesmie byť ovplyvnený zmenami	-40°C až + 60°C

99 99 99 99 9 • 99 9 9 99 9 9 999

9999 99 9 99 9 • 9 999 · 9 9 9999 9

9999 999 • 9 99 ·9 9999 99 999

	' íeoloTy	r. - - ,
15 ; Oplachovateľný vodou	i Je ho možné opláchnuť,	Údaje oď výrobcu!
	ikeď užívateľovi vypadne z	termoplastickej !
I	í rúk	živice
16 ! Sterizovateľnosť	ί Vybrať vhodné spôsoby	Overiť štandardy i

V nasledujúcom texte sú príklady niektorých odlišných konceptov, ktoré sú určené pre popis niektorých zo všeobecných konštrukčných možnosti aplikátora, ale v žiadnom prípade nie sú určené ako obmedzujúce rámec tohto dokumentu Dôležité je zmieniť sa, že konečný tvar apikátora sa môže odchyľovať od príkladov uvedených v tomto dokumente. Považuje sa za vhodné, že tieto konštrukcie je možné upravovať tak, aby vyhovovali anorektálnemu použitiu.

Obr. 12 až 15 objasňujú špecifické príklady aplikátorov podľa jedného hľadiska tohto vynálezu. Nasledujúce pojednanie popisuje štyri uskutočnenia na týchto výkresoch vyobrazených aplikátorov.

Všeobecne konštatované, tento aplikátor je konštruovaný pre rovnomerné dodávanie akéhokoľvek prípravku, ako kvapaliny, poloviskóznej látky, gélu, krému, masti alebo akejkoľvek inej film vytvárajúcej zložky, popísanej vyššie v tomto dokumente, do sliznicovej kavity, s najmenším zostatkovým množstvom, ktoré v aplikátore zostane. Tento aplikátor sa skladá z pozdĺžneho tela, ktoré má proximálny a distálny koniec. Proximálny koniec je umiestnený blízko vnútorného miesta sliznicovej kavity, prístupného pacientovi. Telo má vonkajšiu perforáciu na rovnomerné dodávanie akéhokoľvek vyššie popísaného prípravku do pacientovej sliznicovej kavity, vyhotovenej ako mnoho štrbín alebo otvorov. Po vložení aplikátora a vypudení prípravku do sliznicovej kavity musí prípravok, ktorý je obsiahnutý v zásobníku, pred vypudením cez perforácie výhodne putovať difúznym kanálom s malým objemom. To fakticky umožní rýchle vypudenie prípravku a minimalizovanie množstva prípravku, ktorý v aplikátore po vypudení zostane.

Difúzny kanál je tvorený voľným priestorom medzi dvoma telo vymedzujúcimi stenami. Prvá stena je vonkajšia stena tela a sú v nej otvory. Druhá, neperforovaná, vnútorná stena je vo vnútri steny prvej, aby bol vytvorený difúzny kanál. Vnútorná stena má taký tvar a veľkosť, že je klzné vložená do prvej steny. Alternatívne je ·· ·· ·· • · ···· · é · · ·

-.- · · ··· · · · · · · · si ······ ·· ·· ·· ·· ···· ·· vnútorná stena dimenzovaná ako menšia než prvá stena, integrálne vylisovaná s vonkajšou stenou tela.

Vnútorná stena má proximálny koniec, ktorý je vstupným koncom pre prípravok do difúzneho kanála Na usmernenie prípravku do vstupného konca difúzneho kanála je možné taktiež zabudovať usmerňovači prvok. Usmerňovači prvok takto zabraňuje vstupu prípravku do iného oddelenia ako do difúzneho kanála.

Časťou aplikátora je taktiež zásobník, ktorý obsahuje prípravok. Zásobník je umiestnený blízko tela aplikátora alebo vo vnútri tela. Zásobník je funkčne spojený s vypudzovacim prvkom. Vypudzovací prvok je ako taký spojený s proximálnym koncom tela spojovacím prvkom. Vypudzovací prvok je ovládaný pacientom. Po vynaložení tlaku, ťahu alebo posunu uvoľňuje vypudzovací prvok obsah zásobníka, ktorý je v styku s proximálnym vstupným koncom difúzneho kanála. Prípravok preto putuje difúznym kanálom do sliznicovej kavity a je vypudzovaný perforáciou.

Na obr. 12A až 12D na priložených výkresoch bude popísané prvé uskutočnenie aplikátora podľa hľadiska tohoto vynálezu. Obr. 12B ukazuje rozložený pohľad na tento prvý aplikátor. Vonkajšia strana 1_ tela aplikátora má perforácie 2 (vyobrazená iba jedna), urobené ako jedna jednoduchá štrbina, prebiehajúca z jednej strany tela k protiľahlej strane bez prerušenia na distálnom konci vonkajšej steny 1. Podlhovastá štrbina preto vymedzuje laterálne a distálne perforácie. V tomto uskutočnení sú zásobník a vypudzovací prvok jeden jediný prvok 3 , vyrobený zo stlačiteľného materiálu. Prípravok je obsiahnutý v zásobníku, z ktorého je obsah vypudzovaný stláčaním prstami. Zásobník je zakončený membránou s malou pevnosťou v tlaku 4 . Zásobník, ktorý je vypudzovacim prvkom, je pripojený na proximálny koniec tela prostredníctvom spojovacie prvku 5, predstavovaného závitovým alebo zaskakovacím spojovacím prvkom. V tomto konkrétnom uskutočnení je vnútorná stena 6 tela vyhotovená ako oddelený prvok, dimenzovaný tak, aby bol menší ako vonkajšia stena. Proximálny koniec vnútornej steny končí presahujúcim nákružkom, ktorý sedí v spojovacom prvku, vytvoreným na proximálnom konci vonkajšej steny. Proximálna časť vnútornej steny má uzatvárací prvok 7 , ktorý uzatvára vnútornú dutinu, tvorenú vnútornou stenou. Uzatvárací prvok má tvar kotúča. Pre jednoduché zatváranie je alternatívne proximálny koniec vnútornej steny vylisovaný integrálne s posledne uvedeným. Sústredne k tomuto uzatváraciemu prvku sa nachádza otvorený sústredný prvok 8 , umiestnený na periférii uzatváracieho prvku. Tieto prvky zaisťujú všeobecne nazývaný usmerňovači • · ·· ·· • · · · • · · · • · ··· · • · · ·· ·· «· ·· • · · · • · · • · · • · · ·· ···· prvok, ktorý usmerňuje prípravok do difúzneho kanála, vytvoreného medzi vnútornou a vonkajšou stenou a smerom od vnútorného povrchu vnútornej steny 6. Obr. 12C taktiež ukazuje kónický prvok 9, umiestnený v strede usmerňovacie prvku, určený na pretrhnutie membrány 4_, keď je vyvinutý príslušný tlak.

Druhé uskutočnenie aplikátora je objasnená na obr. 13. V tomto aplikátori sú použité rovnaké periférne a vnútorné steny ako na obr. 12. Avšak na vonkajšej stene je rozmiestnených viac pravidelne od seba vzdialených štrbín. V tomto špecifickom uskutočnení sú zásobník a vypudzovací prvok taktiež ten jeden jediný prvok. Avšak vypudzovací prvok nie je stlačiteľným zásobníkom. Je skôr konštrukcia podoby piestu 10, ktorá obsahuje prípravok v tobolke 11 V tomto uskutočnení je spojovací prvok 5_teleskopicky vložený do piestovej konštrukcie 10 . Tobolka je vyrobená z materiálu s nízkou pevnosťou v tlaku. Na pretrhnutie tejto membrány je na proximálnom konci vnútornej steny kónusovitý prvok. Obr. 13 ukazuje tento kónusovitý prvok 9 ako kotúč opatrený zahrotenou časťou. Kotúč sedí na proximálnom konci vnútornej steny, zahrotená časť smeruje na tobolku 11 Pri použití užívateľ stláča piestovú konštrukciu 10 , membrána sa zahroteným dielom prederaví a prípravok je potom hnaný difúznym kanálom a vypudzovaný perforáciami.

Obr. 14 objasňuje tretiu alternatívu tohto aplikátora. Zatiaľ čo dve predchádzajúce alternatívy majú zásobník umiestnený blízko proximálneho konca difúzneho kanála, tak tretia alternatíva má zásobník 12 ďalej od proximálneho konca difúzneho kanála. V tomto prípade sa pamätá na dosadaciu plochu 13 , umiestnenú mimo zásobník. Dosadacia plocha je funkčne spojená s piestom 14 , umiestneným proximálne vzhľadom k zásobníku 12. Užívateľ ťahá za piest a tým stláča zásobník, ktorého obsah je zavedený do proximálneho vstupného konca difúzneho kanála. Prípravok je vypudzovaný perforáciami, vytvorenými vo vonkajšej stene aplikátora, ktoré sú na obr. 14 znázornené ako množstvo otvorov 2 . Otvory sú rozmiestnené takým spôsobom, že prípravok je rovnomerne distribuovaný do sliznicovej kavity. Otvory sú rozmiestnené v pozdĺžnej sekcii vonkajšej steny a taktiež aj na jej distálnom konci. Obr. 14 ďalej ukazuje to, že vnútorná a vonkajšia stena tela aplikátora sú vytvarované integrálne. Alternatívne taktiež má vnútorná stena tvar steny z obr. 12 a 13, bez potreby existencie kónusovitého prvku. Zásobník má membránu s nízkou pevnosťou v tlaku, takže pri stlačení ťažným pohybom piesta 14 sa membrána pretrhne a obsah sa dostane do difúzneho kanála. V tejto alternatíve aplikátora je usmerňovači prvok tvorený proximálnym vstupným koncom difúzneho ·· ·· ·· ·· ·· ···· · · · · · · · I · e · · · · · · • · ··· · · · · · · · ······ · · ·· ·· ·· ···· ·· · kanála a uzatváracím prvkom, umiestneným tentokrát na proximálnom konci tiel (nie je vyobrazené).

Obr. 15 ukazuje štvrtú alternatívu aplikátora podľa jedného hľadiska tohoto vynálezu. V tejto alternatíve sú zásobník a vypudzovací prvok tým istým prvkom. Membrána 4 s nízkou pevnosťou je umiestnená na proximálnom konci tela 1 . Vonkajšia stena aplikátora má štrbiny, ktoré sú vyhotovené ako množstvo drážok. Vnútorná stena 6 je vytvarovaná integrálne s vonkajšou stenou. Vnútorná stena konči na svojom proximálnom konci kónusovitým prvkom 15. Zásobník/piest 16 má priemer, ktorý je o niečo väčší ako vonkajší priemer steny, ale menší ako vnútorný priemer vonkajšej steny telesa aplikátora. Pri použití sa zásobník kĺzavo vsunie medzi dve steny, membrána sa prepichne a jeho obsah je hnaný do difúzneho kanála a do perforácií po stranách a na distálnom konci vonkajšej steny.

Poznamenáva sa, že vo všetkých vyššie popísaných alternatívach je usmerňovači prvok vytvarovaný integrálne s proximálnym koncom vnútornej steny tela alebo je vyhotovený ako uzatvárací prvok alebo kotúč na blokovanie priechodu prípravku do vnútornej dutiny tvorenej vnútornou stenou a na usmernenie toku prípravku do difúzneho kanála.

Ďalej, pre ľahkosť použitia, sa v niektorých alternatívach vyskytujú uchytávacie prvky, ktoré pomáhajú užívateľovi udržať aplikátor na mieste počas ovládania vypudzovacieho prvku. Konkrétnejšie : v druhej alternatíve je uchytávací prvok vymedzený prstencovou objímkou 17 , vytvorenou na vonkajšej periférii spojovacieho prvku 5. Prstencová objímka má vonkajšiu hrúbku takú, že užívateľ má dostatok priestoru na uchytenie distálneho konca objímky medzi prsty a na tlačenie piestu (pozri 18). Vonkajšia stena tela má väčší prierez ako piest, užívateľ drží telo aplikátora za jeho proximálny koniec jednou rukou a ťahá za piest druhou rukou. Konečne vo štvrtej alternatíve je uchytávací prvok vyhotovený ako elipsovité držadlo 19 , umiestnené na proximálnom konci tela aplikátora a obopína spojovací prvok. Toto držadlo sa drží medzi dvoma prstami a piest sa tlačí ďalším prstom.

Príklady týkajúce sa poloxamérových prípravkov na liečbu infekcií

Na účely skúšania účinnosti predmetných gélových prípravkov na myšom modeli kožnej infekcie HSV-1 bol pripravený roztok vo fosfátovom pufre (0,2 M, pH 6), aby bol kompatibilný s pH kože.

• · · · • · · ·· ·· • · · · • · · · • · ··· • · · ·· ·· ··

··· · · • · ··

Porovnávacia účinnosť miestnych prípravkov foscarnetu, acycloviru a masti Zovirax na kožné lézie HSV-1 na myšiach

Účinnosť našich rôznych miestnych prípravkov bola vyhodnocovaná na myšom modeli kožných lézií HSV-1. Stručne : samice bezsrstnatých myši (SKH1; Charles River Breeding Laboratories Inc., St- Constatnt, QC, Kanada), 5 až 7 týždňov staré boli narkotizované intraperitoneálnou injekciou zmesou obsahujúcou 70 mg/kg ketam í n hydrochlorid u a 11,5 mg/kg xylazínu. Vírus bol naočkovaný na laterálnu stranu tela v ľavej bedrovej kožnej oblasti. Koža bola šesťkrát škrabnutá skríženými čiarami zvisle držanou ihlou kalibru 27. 50 μΙ vírusovej suspenzie [HSV1 kmeň F, 1,5 x 10⁶ plak tvoriacich jednotiek (PFU)/ml] bolo natieraných 10 až 15 sekúnd na poškrabanú oblasť aplikátorom s bavlnenou špičkou, nasýteným kultivačným médiom [minimálne esenciálne médium (MEM) doplnené 100 U/ml penicilín-streptomycínu, 2 mM L-glutamínu a 2 % plodového hovädzieho séra (MEM-E + 2 % FBS)]. Poškrabaná oblasť bola chránená tampónom na kurie oká, ktorý bol na telách myší pridržiavaný chirurgickou páskou. Pórovitá vnútorná stena otvoru v tampóne na kurie oká bola pred použitím impregnovaná tkanivovým lepidlom, aby sa zabránilo absorpcii lieku. Otvor tampónu na kurie oká bol rovnako uzatvorený chirurgickou páskou. Potom boli myši vrátené do klietky a dvakrát denne pozorované.

V tejto štúdii boli vyhodnocované rôzne liečebné režimy. Stručne : páska uzatvárajúca otvor v tampóne na kurie oká bola odstránená a poškrabaná oblasť bola očistená bavlneným zašpicateným aplikátorom nasýteným studenou vodou. Na poškrabanú oblasť bolo nanesené 15 μΙ rôznych prípravkov. Otvor v náplasti na kurie oká bol uzatvorený chirurgickou páskou, aby sa predišlo tomu, že myš liek rýchlo odstráni. Postup taktiež zabraňuje náhodnej systemickej liečbe, ku ktorej by došlo potenciálnym lízaním liečenej lézie. Účinnosť prípravkov bola vyhodnocovaná bodovým ohodnotením lézií a prežitím.

Obr. 16 (panel A) ukazuje časový priebeh stredného bodového ohodnotenia lézií infikovaných neošetrených myší alebo myší ošetrených foscarnetom v roztoku alebo začleneným do poloxaméru. Ošetrovanie začalo 24 h po infikovaní a opakovalo sa trikrát denne počas 4 dní. U myší ošetrených samotným poloxamérom bola pozorovaná schéma podobná tej, ktorá bola vidieť pri neošetrených myšiach s výnimkou toho, že ústup kožných lézií sa zdal rýchlejší v druhej skupine. U myší ·· ·· ·· ·· ·· ···· · · · · · · · ···· · · · · · • ·········· ·

J ·-) .····· ·· ·· ·· ·· ···· ·· · ošetrených roztokom 0,5 % foscarnetu bolo pozorované veľké zníženie stredného bodového ohodnotenia lézií, ktoré bolo výraznejšie, ak bol liek zapojený do poloxamérového prípravku. Obr. 16 (panel b) ukazuje odpovedajúce prežitie infikovaných neošetrených myší a myší ošetrených liekovými prípravkami. Smrť následkom encefahtidy nastala pri 75 % neošetrených myši infikovaných medzi 7. a 8. dňom. Úmrtnosť bola podobná u myší, ktoré dostali samotný poloxamér a nastala medzi 8. a 10. dňom. Polovica myší ošetrených foscarnetom v roztoku infekciu prežila. Najdôležitejšiou zaujímavosťou je to, že 75 % myší ošetrených poloxamérovým prípravkom foscarnetu infekciu prežilo (p<0,05).

Obr. 17 (panel A) ukazuje časový priebeh stredného bodového ohodnotenia lézií infikovaných neošetrených myší a myši ošetrených jedinou aplikáciou 24 h po infikovaní poloxamérom s obsahom 5% acycloviru alebo masti Zovirax®. Najdôležitejšou zaujímavosťou je to, že poloxamérový prípravok s obsahom acycloviru vykazoval dobrú účinnosť proti vývoju kožných lézií u myší, napriek tomu masť Zovirax® sa prejavovala iba slabým účinkom. Acyclovír, začlenený do poloxaméru, letalitu významne znížil (p<0,05), ale neznížila ju masť Zovirax® (panel B). Vyššia účinnosť poloxamérového prípravku acycloviru ako má komerčná masť Zovirax® vysoko nasvedčuje, že poloxamér je lepší nosič na miestne dodávanie do lieku.

Obr. 18 (panel A) ukazuje časový priebeh stredného bodového ohodnotenia lézií kontrolných myší a myší ošetrovaných trikrát denne počas 4 dní a iniciovaných 5 dní po infekcii samotným poloxamérom, poloxamérom s obsahom 5 % acycloviru alebo masti Zovirax®. V myšiach, ktoré dostali poloxamér samotný, bolo pozorované zníženie stredného bodového ohodnotenia lézií v porovnaní s infikovanými neošetrenými myšami. Ošetrenie masťou Zovirax® sa prejavuje iba slabým účinkom. Výrazné zníženie stredného bodového ohodnotenia lézií bolo pozorované u myší ošetrených poloxamérovým prípravkom s obsahom 5 % acycloviru v porovnaní s neošetrenými infikovanými zvieratami. Najdôležitejšou zaujímavosťou je to, že všetky myši ošetrené poloxamérom s obsahom 5 % acycloviru infekciu prežili (p<0,001) (obr. 18, panel B). Ošetrenie masťou Zovirax® zvyšuje prežitie infikovaných myší v menšom rozsahu (p<0,05).

Na živom organizme skúmané prenikanie antivírusových činidiel kožou ·· • · · · • · · · • · · · · • · · ·· ··

Obr 19 ukazuje distribúciu foscarnetu a acycloviru (o, ·) v kožnej aplikácii neinfikovaných (panely A, C, E) a infikovaných (panely B, D, F) myší 24 h po miestnej aplikácii buď vo fosfátovom pufri alebo poloxamérovej matrici. Distribúcia obidvoch neinfikovaných a infikovaných myši bola podobná. Na rozdiel od toho začlenenie acycloviru do poloxaméru výrazne zvýšilo množstvo lieku izolovaného zo stratum corneum ako neinfikovaných, tak infikovaných myší; zvýšené prenikanie lieku bolo zjavnejšie u infikovaných myší Žiadne alebo zanedbateľné množstvá foscarnetu boli nájdené na dole umiestnenej epidermis a koži neinfikovaných myší bez ohľadu na nosič, ktorý bol pre aplikáciu lieku použitý. Koncentrácia foscarnetu v epidermis a dermis infikovaných myši bola význačne vyššia, keď liek bol začlenený do poloxaméru. Koncentrácia acycloviru bola vyššia ako koncentrácia foscarnetu v epidermis a dermis ako neifikovaných, tak infikovaných myší bez ohľadu na použitý nosič. Koncentrácia acycloviru začleneného do poloxaméru v epidermis neinfikovaných myší bola 6,1 násobne vyššia ako koncentrácia lieku v pufrovanom roztoku. Infekcia myší významne nezvýšila množstvo acycloviru v epidermis. Koncentrácia acycloviru v dermis infikovaných myší bola 7,9 násobne väčšia ako koncentrácia u neinfikovaných myší, ak liek sa podával v poloxamérovej matrici.

Obr. 20 ukazuje koncentráciu acycloviru v plazme neinfikovaných a infikovaných myší 24 h po miestnej aplikácii buď vo fosfátovom pufri alebo v poloxamérovej matrici. Podobné koncentrácie acycloviru boli zistené vplazme neinfikovaných myší pre obidva prípravky. Infekcia myši výrazne zvýšila koncentráciu acycloviru v plazme, hlavne keď liek bol začlenený do poloxamérovej matrice, pre ktorú bolo dosiahnuté štvornásobné zvýšenie koncentrácie. Koncentrácia acycloviru vplazme infikovaných myší bola 2,1 krát vyššia, ak bol liek začlenený do poloxamérovej matrice.

Vplyv SLS na účinnosť poloxamérových prípravkov s obsahom foscarnetu a acycloviru na kožnú léziu HSV-1 u myší

Na myšiach bol taktiež vyhodnocovaný vplyv SLS na účinnosť poloxamérových prípravkov s obsahom foscarnetu na infekciu HSV-1. Obr. 21 (panel A) ukazuje časový priebeh stredného bodového ohodnotenia lézií a prežitia infikovaných myší a neinfikovaných myší ošetrených jedinou aplikáciou (podanou 24 h po injekcii) samotného poloxaméru, poloxaméru s obsahom 3 % foscarnetu, ·· ·· • · · • · ··· • · ·· · poloxamérom s obsahom 5 % SLS alebo poloxaméru s obsahom 3 % foscarnetu + 5 % SLS. Samotný poloxamér nedával žiadnu ochranu proti infekcii. Okrem toho v myšiach ošetrených poloxamérom s obsahom buď 5 % SLS alebo 3 % foscarnetu bolo pozorované mierne zníženie stredného bodového ohodnotenia lézií pri porovnaní s neošetrenými infikovanými myšami. Najdôležitejšou zaujímavosťou je to, že v myšiach ošetrených poloxamérom s obsahom 3 % foscarnetu a 5 % SLS bolo pozorované výrazné a významné zníženie (p<0,05) stredného bodového ohodnotenia lézií v porovnaní so stredným bodovým ohodnotením lézií v neošetrených infikovaných myšiach. Odpovedajúce miery prežitia pre rovnaké ošetrované skupiny sú uvedené v paneli B, čo podporuje výsledky stredného bodového ohodnotenia lézií. Vlastnosť SLS, zvyšovať prenikanie kožou, kombinovaná s jeho schopnosťou modifikovať vírusovú infekciu, vysvetľuje zvýšenú účinnosť foscarnetového prípravku.

Vnímavosť HSV-1 na kombináciu foscarnetu a SLS pri skúškách mimo živý organizmus

Vplyv SLS na účinnosť foscarnetu proti HSV-1 (kmeň F) bola skúmaná na bunkách Vero. Stručne : bunky boli rozočkované do dvadsaťštyri jamkových platní (Costar, Montreal, QC, Kanada) a boli inkubované s kmeňom F HSV-1 (približne 100 PFU/ml) počas 2 h pri 37 °C, aby sa umožnila adsorpcia vírusu. Potom bol vírus odstránený a bunky boli prekryté 0,5 ml 0,6 % agarovým prípravkom Seaplaque (Marine Colloids, Rockland, MA, USA) obsahujúcim rôzne koncentrácie foscarnetu, SLS alebo kombinácie obidvoch zlúčenín. Platne boli inkubované 2 dni pri 37 °C. Potom boli bunky 20 minút fixované 10 % formaldehydom v PBS, premyté deionizovanou vodou a odfarbené 0,05 % metylénovou modrou. Vnímavosť vírusu bola vyhodnocovaná stanovením PFU. Obr. 22 ukazuje vnímavosť kmeňa F HSV-1 na kombináciu rôznych koncentrácií foscarnetu a SLS na bunky Vero. Výsledky ukazujú, že prítomnosť SLS zvyšuje účinnosť foscarnetu oproti HSV-1 (kmeň F) v bunkách Vero.

Potenciálna aplikácia ·· ·· ·· ·· • ·· · · ·· · • · · · · · • 999999 9 · · • · 9 9·· ·· 99 ····

Nasledujúce príklady, opísané v tomto dokumente, sú špecifické potenciálne aplikácie predmetných miestnych prípravkov, ale v žiadnom prípade nie sú určené ako obmedzenie rámca tohto dokumentu. Ako je ukázané na vyššie uvedených výsledkoch, gélové prípravky sú použiteľné na prevenciu infekcie kože a/alebo sliznice a hlavne na prevenciu HSV a HIV. Okrem toho tieto výsledky ukázali, že gélové prípravky môžu slúžiť ako profylaktické činidlo na prevenciu náhodných infekcií zdravotníkov Ako bolo taktiež ukázané vo vyššie uvedených výsledkoch, gélové prípravky sú použiteľné na liečbu a prevenciu infekcie a stavov kože a/alebo sliznice a hlavne na liečbu a prevenciu oparových lézií. Okrem vyššie uvedených aplikácií sú d'alšie potenciálne aplikácie použitia predmetných prípravkov i) na hojenie a/alebo ošetrovanie popálenín a prevenciu ďalšej infekcie a ii) na liečbu a/alebo prevenciu infekcie očných stavov. Vo vyššie uvedených príkladoch gélové prípravky obsahujú akékoľvek mikrobiálne, baktericídne, antivírusové, chemoterapeutické, protizápalové, protinádorové, imunomodulačné alebo akékoľvek ďalšie činidlo alebo ich kombinácie, ktoré je účinné na liečbu a/alebo prevenciu infekcie a/alebo nenormálnych stavov sliznice a/alebo kože, spôsobené akýmkoľvek patogénom a/alebo ochorením.

Nasledujúce príklady, popísané v tomto dokumente, sú špecifické potenciálne použitia predmetného špecifického aplikátora, ale nie sú v žiadnom prípade mienené ako obmedzujúce rámec tohto dokumentu. Ako je popísané vyššie, tento aplikátor je použiteľný na dodávanie akýchkoľvek prípravkov, používaných pre pokrytie cervikálnej/vaginálnej/anorektálnej sliznice na liečbu a/alebo prevenciu infekcie a/alebo nemormálnych stavov sliznice. Aplikátor je taktiež požiteľný na dodávanie i) akýchkoľvek miestnych prípravkov, ktoré zabraňujú pohlavnému prenosu patogénov spôsobujúcich STD, ii) vaginálnych antikoncepčných prípravkov, iii) miestnych mikrobicídnych prípravkov proti špecifickým ochoreniam a iv) akéhokoľvek antimikrobiálneho, baktericídneho, antivírusového, chemoterapeutického, protizápalového, protinádorového alebo imunomodulačného činidla, detergentov, mikrobiálne absorpčného inhibítora, činidla zvyšujúceho prenikanie kožou, cytokínu, antigénu, vakcíny, rádioaktívných činidiel alebo ich kombinácie.

Claims (36)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Použitie činidla schopného interferovať s proteínovými interakciami alebo rozrušovať proteínovú štruktúru v cieľovej bunke, tkanine alebo mikróbe, na prípravu miestneho prípravku na liečbu alebo ochorenie, ktoré postihuje sliznicu pacienta alebo kožu alebo prevenciu napadnutia vonkajším činidlom, napríklad spermiou alebo mikróbom, s tou výhradou, že toto činidlo nie je nonoxynol-9.
2. 2. Miestny prípravok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje vhodné množstvo film vytvárajúcej zložky, schopnej šíriť a vytvárať ochrannú vrstvu na sliznici pacienta alebo koži a účinné množstvo činidla schopného interferovať s proteínovými interakciami alebo rozrušiť proteínovú štruktúru v cieľovej bunke, tkanive alebo mikróbe s tou výhradou, že toto činidlo nie je nonoxynol-9.
3. 3. Miestny prípravok podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúci sa tým, že činidlo je schopné interferovať s viazaním sa mikrobiálneho vonkajšieho proteínu na hostiteľský receptor.
4. 4. Miestny prípravok podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3, vyznačujúci sa tým, že činidlo je mikrobiálny adhézny inihibítor alebo je to detergent alebo chaotropné činidlo, schopné rozrušovať integritu proteínu.
5. 5. Miestny prípravok podľa nároku 4, vyznačujúci sa tým, že mikrobiálny adhézny inhibítor je dextránsulfát.
6. 6. Miestny prípravok podľa nároku 4, vyznačujúci sa tým, že detergent je vybraný zo skupiny skladajúcej sa zo sodného laurylsulfátu, benzalkoniumchloridu, lauroylsarkozínu, polyoxyetylénových alifatických acylderivátov a polyoxyetylén sorbitanových alifatických acylesterderivátov.
7. 7. Miestny prípravok podľa nároku 4, vyznačujúci sa tým, že chaotropné činidlo je sodný laurylsulfát alebo guanidín.

   • · • · ·· ·· • · · · • · · · • · ·· · • · · • · ·· • · • · • · • · ··
8. 8. Miestny prípravok podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7, vyznačujúci sa tým, že činidlon je sodný laurylsulfát.
9. 9. Miestny prípravok podľa nároku 8, vyznačujúci sa tým, že činidlom je sodný laurylsulfát v koncentrácii až 15% hmotnostných/objem.
10. 10. Miestny prípravok podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 9, vyznačujúci sa tým, že film vytvárajúcu zložka je poloxamér 407.
11. 11. Miestny prípravok podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že poloxamér 407 sa použije v koncentrácii 15 až 35 % hmotnostných/objem.
12. 12. Miestny prípravok podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 11, vyznačujúci sa tým, že ďalej obsahuje liek účinný proti ochoreniu, pôsobiaci na sliznicu alebo kožu alebo prenášaný cez kožu na sliznicu.
13. 13. Miestny prípravok podľa nároku 12, vyznačujúci sa tým, že liekom je jeden alebo viac liekov vybraných zo skupiny, ktorá sa skladá z antimikrobiálneho, spermicídneho, baktericídneho, antivírusového, chemoterapeutického, protizápalového, protinádorového, imunomodulačného alebo akéhokoľvek iného činidla.
14. 14. Miestny prípravok podľa nároku 13, vyznačujúci sa tým, že obsahuje antivírusové činidlo.
15. 15. Miestny prípravok podľa nároku 14, vyznačujúci sa tým, že antivírusové činidlo je acyclovir alebo foscarnet.
16. 16. Miestny prípravok podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 15, vyznačujúci sa tým, že ďalej obsahuje činidlo zvyšujúce prenikanie kožou.
17. 17. Aplikátor na dodávanie kvapalného alebo polotuhého prípravku do slizničnej kavity pacienta, vyznačujúci sa tým, že sa skladá z :

    • · · · • · 9 · • · ·· · • · · • · ·· ···· ··

    - tela, ktoré má proximálny a distálny koniec, pozdĺžne prebiehajúci vonkajšou stenou opatrenou perforáciami a pozdĺžne prebiehajúci vnútornou stenou usporiadanou a dimenzovanou tak, že je prietorovo oddelená od vonkajšej steny difúznym kanálom medzi nimi; difúzny kanál má proximálny vstupný koniec;

    - zásobníka schopného prijať akýkoľvek prípravok ;

    - vypudzovacieho prvku, funkčne spojeného so zásobníkom a uvádzaného do činnosti pacientom na vylúčenie akéhokoľvek prípravku zo zásobníka do difúzneho kanála; čím, keď sa uvedie do činnosti, tak vypudzovací prvok posúva prípravok zo zásobníka do difúzneho kanálu cez jeho proximálny vstupný koniec a prípravok sa dodáva do slizničnej kavity cez perforácie.
18. 18. Aplikátor podľa nároku 17, vyznačujúci sa tým, že ďalej sa skladá zo :

    - spojovacieho prvku na spojenie vypudzovacieho prvku s proximálnym koncom tela ; a

    - usmerňovacieho prvku, umiestneného na proximálnom konci tela na usmerňovanie akéhokoľvek prípravku do proximálneho vstupného konca difúzneho kanála.
19. 19. Aplikátor podľa nároku 17, vyznačujúci sa tým, že perforácie vonkajšej steny zahrňujú ako pozdĺžne, tak distálne perforácie.
20. 20. Aplikátor podľa nároku 17, vyznačujúci sa tým, že vypudzovací prvok a zásobník sú jeden jediný prvok.
21. 21. Aplikátor podľa nároku 20, vyznačujúci sa tým, že vypudzovací prvok je pružný prvok, ktorý sa uvádza do činnosti stlačením.
22. 22. Aplikátor podľa nároku 20, vyznačujúci sa tým, že vypudzovací prvok je piest, ktorý uvádza do činnosti pacient.
23. 23. Aplikátor podľa nároku 17, vyznačujúci sa tým, že vypudzovací prvok zahrňuje piest, uvádzaný do činnosti pacientom.

    ·· ···· ·· · « ·
24. 24. Aplikátor podľa nároku 23, vyznačujúci sa tým, že vypudzovací prvok má tiež ako súčasť dosadaciu plochu, umiestnenú distálne vzhľadom k zásobníku v dutine tvorenej vnútornou stenou, táto dosadacia plocha je funkčne spojená s piestom umiestneným blízko zásobníka ;

    čím, keď pacient ťahá za piest, dosadacia plocha stláča zásobník, čo vypudzuje prípravok do difúzneho kanála.
25. 25. Aplikátor podľa nároku 23, vyznačujúci sa tým, že piest má vonkajšiu stenu s priemerom väčším ako je vonkajší priemer vnútornej steny a menším ako je vnútorný priemer vonkajšej steny tela a pacient uvádza piest do činnosti kĺzavým ovládaním jeho vonkajšej steny medzi vnútornou a vonkajšou stenou tela.
26. 26. Aplikátor podľa ktoréhokoľvek z nárokov 17 až 23 a 25, vyznačujúci sa tým, že usmerňovači prvok zahrňuje uzatvárací prvok na uzatváranie vnútornej dutiny tvorenej vnútornou stenou tela.
27. 27. Aplikátor podľa nároku 26, vyznačujúci sa tým, že usmerňovači prvok sa ďalej skladá z otvoreného prvku, sústredného s uzatváracím prvkom, tento otvorený prvok sa otvára do proximálneho vstupného konca difúzneho kanála a cez ktorý sa prípravok posúva uvádzaním do činnosti vypudzovacieho prvku.
28. 28. Aplikátor podľa nároku 26 alebo 27, vyznačujúci sa tým, že usmerňovači prvok je vytvorený integrálne s proximálnym koncom vnútornej steny telesa.
29. 29. Aplikátor podľa nároku 24, vyznačujúci sa tým, že usmerňovači prvok je tvorený proximálnym vstupným kanálom a uzatváracím prvkom na proximálnom konci tela.
30. 30. Aplikátor podľa ktoréhokoľvek z nárokov 17 až 29, vyznačujúci sa tým, že sa ďalej skladá z membrány s malou pevnosťou, umiestnenou medzi zásobníkom a proximálnym koncom tela.

    ·· • · ·· ·· • · · · • ·« · • 9 ·· · • · · ·· ·· • · · · • · · • · · • · ♦ ·· ···· • · • · · • · • · · • · ·· ·
31. 31. Aplikátor podľa nároku 30, vyznačujúci sa tým, že sa ďalej skladá z kónusovitého prvku na pretrhnutie membrány, ktorý je umiestnený na proximálnom konci usmerňovacieho prvku.
32. 32. Aplikátor podľa ktoréhokoľvek z nárokov 17 až 31, vyznačujúci sa tým, že perforácie tvoria aspoň dve štrbiny pozdĺžne umiestnené v podstatne rovnakej vzdialenosti a distálnej perforácie.
33. 33. Aplikátor podľa nároku 32, vyznačujúci sa tým, že štrbiny a distálne perforácie sú súvislé.
34. 34. Aplikátor podľa ktoréhokoľvek z nárokov 17 až 31, vyznačujúci sa tým, že perforácie tvorí množstvo otvorov, ktoré sú rozmiestnené takým spôsobom, že prípravok sa dodáva podstatne rovnomerne do slizničnej kavity.
35. 35. Aplikátor podľa ktoréhokoľvek z nárokov 17 až 34, vyznačujúci sa tým, že ďalej obsahuje uchytávací prvok, umiestnený na vonkajšej periférii spojovacieho prvku.
36. 36. Aplikátor podľa ktoréhokoľvek z nárokov 17 až 34, vyznačujúci sa tým, že ďalej obsahuje uchytávací prvok, vytvorený integrálne so spojovacím prvkom.