ES2284250T3 - Formulaciones para la prevencion o el tratamiento de enfermedades que afectan a la membrana mucosa o la piel, o para la prevencion del embarazo. - Google Patents

Abstract

Formulación tópica para le prevención o el tratamiento de infecciones o para la prevención del emberazo, caracterizada porque consiste en un poloxámero 407 en una concentración de entre el 15% y el 35%, una solución tampón, y una cantidad efectiva de un agente seleccionado de entre el grupo que consiste de lauril sulfato sódico, laurilsarcosina, y una combinación de por lo menos dos agentes de entre lauril sulfato sódico, laurilsarcosina, cloruro de benzalconio, derivados del ácido graso de polioxietileno, y guanidina, en la que cuando se aplica sobre una superficie de la piel o de la mucosa de una persona, la formulación forma una capa semisólida efectiva proporcionando una barrera física y química frente un agente infeccioso o frente a un esperma.

Description

Formulaciones para la prevención o el tratamiento de enfermedades que afectan a la membrana mucosa o la piel, o para la prevención del embarazo.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a formulaciones que comprenden componentes formadores de película y cualquier ingrediente activo, particularmente se refiere a formulaciones tópicas. Más particularmente, la presente invención se refiere a formulaciones tópicas para prevenir o para tratar enfermedades relacionadas con la membrana mucosa o la piel o transmitidas a través de la membrana mucosa o la piel, provocadas por cualquier agente causal, particularmente un patógeno.

Antecedentes de la invención

La propagación de enfermedades de transmisión sexual (ETS) provocada por el virus de inmunodeficiencia humana (VIH), el herpes, y otros patógenos, lleva un ritmo desconcertante. La incidencia global, la morbilidad, y la mortalidad de las ETSs son muy considerables. Se estima que en todo el mundo hay más de 900 millones de individuos infectados por patógenos transmitidos por vía sexual. Cada año, en los Estados Unidos, más de 12 millones de personas resultan nuevamente infectados con un patógeno responsable de las ETSs. El virus del herpes simple tipo 1 (HSV-1) y el virus del herpes simple tipo 2 (HSV-2), son las causas más comunes de ulceración genital en países desarrollados. La infección del herpes genital es para toda la vida, y puede resultar en lesiones genitales dolorosas y recurrentes, complicaciones sistémicas, morbilidad sicológica y también en enfermedades neonatales serias después de una transmisión intraparto del virus HSV. La transmisión genital de este patógeno normalmente se debe a la excreción viral asintomática por parte de personas que no son conscientes de que están infectadas. Hoy en día, el virus HSV-2 puede detectarse en 1 de cada 5 ciudadanos americanos de 12 años de edad o mayores. Además, se estima que más de un tercio de la población mundial presenta infecciones recurrentes del virus HSV y que por lo tanto presenta la capacidad de transmitir el virus durante episodios de infección productiva. La Neisseria gonorrhoeae (gonorrea) y la Chlamydia trachomatis (clamidia) están reconocidas como dos de las infecciones bacterianas que se transmiten por vía sexual más extendidas. En todo el mundo, se produce una incidencia anual estimada de 25 millones de casos de gonorrea y de 50 millones de casos de clamidia. Por otro lado, datos epidemiológicos recientes indican que el número de individuos infectados con el virus VIH está creciendo de manera espectacular por todo el mundo. Según funcionarios de las Naciones Unidas, las estimaciones de los datos epidemiológicos sugieren que durante 1997, cada día, hasta 16.000 individuos resultaron infectados con el virus VIH. Estadísticas recientes (de finales de 1997) de la Organización Mundial de la Salud (OMS) indicaban que hay hasta 31 millones de personas infectadas con el virus VIH por todo el mundo y que se prevé que este número alcance la cifra de 40 millones para el año 2000.

De manera global, entre un 85% y un 90% de las infecciones de VIH se deben a transmisiones heterosexuales. Debido a que no existe una vacuna contra el virus VIH, las únicas herramientas que en la actualidad pueden reducir la transmisión de este retrovirus son las medidas preventivas. La utilización consistente y cuidadosa de los preservativos representa una barrera efectiva frente a la transmisión sexual del virus VIH y de otros patógenos que se transmiten por vía sexual, pero deberían de utilizarse en todas las relaciones sexuales de riesgo para reducir de manera considerable la probabilidad de adquirir la infección. En África, los programas de prevención más intensivos fueron capaces de incrementar el uso de los preservativos solamente hasta aproximadamente un 70% de todas las relaciones sexuales de prostitutas mujeres. Por consiguiente, surgen dudas sobre las posibilidades de la promoción de preservativos en el control de la epidemia del SIDA en grupos de alto riesgo. En situaciones en las que la transmisión heterosexual del virus VIH es importante, las medidas de prevención en las que las mujeres pudieran prevenir su riesgo de contraer ETSs podrían ser una herramienta adicional para contener la epidemia. Dicha herramienta protectiva puede utilizarse también en relaciones homosexuales entre hombres ya que podría proporcionar una protección adicional bajo el control de la pareja receptiva. Por lo tanto, resulta importante desarrollar un procedimiento de barrera que pudiera utilizarse como una alternativa a los preservativos en el que las personas pudieran protegerse a sí mismas contra la infección sin tener que preguntar a sus parejas sexuales. Las medidas de prevención que tienen como objetivo bloquear la transmisión inicial de los patógenos que son los agentes causales del SIDA, el herpes y otras ETSs conducirán, por supuesto, a enormes beneficios.

El desarrollo de microbicidas tópicos seguros es realmente una prioridad muy alta para la Organización Mundial de la Salud (OMS) y para los Institutos Nacionales de la Salud (NIH) en el campo de al prevención del virus VIH. A menudo un microbicida tópico está compuesto de un ingrediente activo y de un vehículo. Los ingredientes activos pueden actuar por medio de una variedad de mecanismos, entre los que se incluyen: i) la alteración de la membrana celular, la envoltura celular o los lípidos de la cápsida o las proteínas constituyentes del organismo (por ejemplo, espermicidas/microbicidas de tipo detergente, tal como el nonoxinol-9), ii) el bloqueo de las interacciones receptor-ligando esenciales para la infectividad (por ejemplo, inhibidores de la adhesión microbiana, tales como los compuestos sulfatados), iii) la inhibición de la replicación intracelular o extracelular del patógeno (por ejemplo, fármacos antimicrobianos), iv) la alteración del entorno vaginal y la reducción de la susceptibilidad a la infección (por ejemplo, agentes tampón y productos que mantienen el entorno y la flora vaginal normal) o v) la mejora de las respuestas inmune locales (por ejemplo, los modificadores de la respuesta inmune). La eficacia global de un microbicida tópico frente a la transmisión sexual de patógenos que producen ETSs depende de la eficacia del ingrediente activo que debe ser administrado y de su capacidad para cubrir todo el área vaginal/cérvix para una máxima eficacia frente a los patógenos. La capacidad de estos agentes activos para cubrir toda la cavidad vaginal depende en gran manera del tipo de vehículo utilizado. Entre las formulaciones típicas de vehículos se incluyen geles, cremas, espumas, supositorios, esponjas y películas.

Las formulaciones vaginales con mayor disponibilidad de la actualidad utilizan el espermicida nonoxinol-9, un tensioactivo no iónico, como un microbicida. In vitro, el nonoxinol-9 inactiva los virus envueltos, tales como el virus HSV, el virus VIH y otros microorganismos, entre los que se incluyen la Chlamydia trachomatis (clamidia), y la Neisseria gonorrhoeae (gonorrea). Sin embargo, la potencial eficacia del nonoxinol-9 contra el virus VIH no ha sido establecida aún de manera clara y los resultados de los ensayos clínicos resultas controversiales. Un ensayo controlado reciente llevado a cabo entre 1292 mujeres profesionales del sexo de Camerún que no tienen el virus VIH mostró que la utilización de una película vaginal que contiene 70 mg de nonoxinol-9 no redujo la tasa de nuevas infecciones de VIH, gonorrea, o clamidia (Roddy et al., 1998, N. Engl. J. Med., 339:504-510). El fracaso de la película de nonoxinol-9 en la reducción de la transmisión de agentes infecciosos podría atribuirse a la cobertura incompleta de toda el área de la vagina/cérvix con el sistema de administración del fármaco para el nonoxinol-9, o a la existencia de una toxicidad mucosa que favorece la infección de microorganismos. Debido al incremento espectacular en el número de individuos, por todo el mundo, que están infectados por el virus VIH, el herpes, u otros patógenos que se transmiten por vía sexual, hay una necesidad urgente de desarrollar productos activos y/o sistemas de administración apropiados que puedan reducir la transmisión sexual de estos patógenos con una irritación mucosa mínima y con efectos mínimos sobre la flora vaginal y sobre el pH.

El lauril sulfato sódico (SLS) es un tensioactivo sulfatado que desnaturaliza las proteínas de membrana de los patógenos. De esta manera, presenta una acción dual, como detergente y como agente caotrópico. Con esta noción, los presentes inventores han llevado a cabo experimentos para evaluar el potencial efecto microbicida del SLS sobre los virus HSV y VIH. Los estudios preliminares de los presentes inventores demostraron claramente que el SLS modifica in vitro la infectividad de ambos virus. Más recientemente, Howett et al. han confirmado los descubrimientos de los presentes inventores con respecto a que el SLS es también un potente inactivador del virus HSV-2 y del virus HSV-1 (Antimicrob. Agents Chemother. 43(2): 314-321, 1999). Además, se ha mostrado que el SLS resulta efectivo contra el papilomavirus humano, el papilomavirus bovino y el papilomavirus del conejo (virus no envueltos) tras un breve tratamiento con bajas concentraciones de este producto. Sin embargo, esta referencia no enseña la utilización de un vehículo para administrar este potencial microbicida. La elección del vehículo es muy importante debido a que afecta a la concentración de fármacos disponibles, a la duración de la disponibilidad de los fármacos y al grado de cobertura mucosa de las formulaciones, factores que resultan clave a la hora de ofrecer protección frente a patógenos invasores. Otra categoría interesante de microbicidas candidatos es la de los inhibidores de la adhesión microbiana, tales como los compuestos sulfatados, que bloquean la interacción entre el receptor de la célula huésped y el microbio. Un ejemplo conocido de inhibidores de adhesión microbiana es el sulfato de dextrano (DS), un carbohidrato polisulfatado, que se ha mostrado que inhibe in vitro la infectividad del virus VIH y de los virus del herpes.

Los presentes inventores han desarrollado recientemente una formulación en forma de gel que podría ser aplicada a la membrana mucosa vaginal, cervical o ano-rectal y que podría resultar efectiva para prevenir patógenos que se transmiten por vía sexual. Una característica de suma importancia de esta formulación en forma de gel es su propiedad termorreversible. La transición de un estado líquido a temperatura ambiente, a un estado en forma de gel a temperatura corporal, es de gran importancia debido a que cuando se aplica sobre superficies biológicas ásperas, tales como el epitelio vaginal o el epitelio ano-rectal, el gel debería penetrar las irregularidades más pequeñas formando una buena barrera física contra los agentes infecciosos. La formulación en forma de gel presenta las siguientes características clave que tanto la FDA como el NIH consideran importantes: i) es incoloro, inodoro y no mancha, ii) debería cubrir toda la vagina/cérvix debido a que se aplica en estado líquido, iii) es compatible con el preservativo masculino de látex, iv) se resiste a la elución mediante flujo acuoso, v) presenta un pH similar al pH de una vagina sana (pH de entre 4,0 y 4,5), vi) mantiene las propiedades reológicas bajo condiciones de calor extremo y de frío extremo y vii) no afecta, in vitro, a la flora vaginal normal, especialmente al Lactobacillus spp.

La publicación internacional de los presentes inventores (WO 97/42962) da a conocer la utilización de formulaciones que comprenden componentes formadores de película capaces de formar per se una barrera física a los patógenos. Los geles termorreversibles, tales como los poloxámeros, son particularmente preferentes para ese tipo de utilización. Las formulaciones formadoras de película pueden comprender adicionalmente microbicidas, espermicidas o cualquier otro fármaco, cuya elección es guiada mediante el patógeno, organismo o enfermedad que debe ser inactivada o tratada. Las formulaciones resultan, por lo tanto, eficientes como una barrera física, y opcionalmente, como una barrera química o farmacológica, y se pueden utilizar como un sistema de liberación ininterrumpida de fármacos en el punto de administración.

Estas formulaciones estas destinadas a la utilización en la prevención de enfermedades de transmisión sexual, así como en el tratamiento de infecciones, cáncer, inflamaciones o cualquier enfermedad o estado que requiera un tratamiento farmacológico. Además, esta publicación enseña que la formulación decrementa la toxicidad de potentes espermicidas/microbicidas, tales como el nonoxinol-9. Sin embargo, esta publicación no enseña de manera específica la utilización del SLS como un candidato de elección químico incorporado en las formulaciones tópicas.

La publicación de la patente estadounidense número 5.275.805 describe una composición oral que comprende un agente antiplaca, una mezcla tensioactiva que puede comprender SLS, un polímero en bloque de polioxietileno/polioxipropileno y una sal de taurato. La mezcla tensioactiva se muestra efectiva para "estabilizar la composición oral de separación de fase sin comprometer la eficacia antibacteriana del [agente antiplaca]". Este objetivo se alcanza utilizando concentraciones bastante bajas de cada componente de la mezcla tensioactiva; no se cree que estas concentraciones bajas puedan alcanzar una actividad antimicrobiana y formar una barrera física.

La publicación de patente europea número 386.960 describe un vehículo de administración de fármaco que comprende un componente en forma de gel termoestable y un componente formador de película. El componente formador de película tiene como objetivo proporcionar una gelatina más firme. En el mismo pueden incluirse espermicidas, y son parte de una lista de fármacos destinados a la administración vaginal del fármaco. Sin embargo, no existe ninguna prueba de que un espermicida, un componente en forma de gel termoestable y un componente formador de película formen una barrera físico-química frente a los patógenos, o de que una subcombinación de estos componentes consiga la formación de una barrera físico-química, o si no, de que cualquier producto que pueda alterar los lípidos de una membrana celular o la conformación de una proteína (detergentes en general, o agentes caotrópicos) sea efectivo frente a los patógenos, solo o en combinación con un gel termoestable.

Para una administración eficiente de formulaciones semisólidas o líquidas en una cavidad corporal, un aplicador es una herramienta de elección. El aplicador ideal debería administrar de manera inmediata, bajo accionamiento, la formulación a la mucosa, y ello, sin expulsar demasiado aire antes de la formulación.

La patente estadounidense número 2.683.456 describe un aplicador rectal que comprende un cuerpo alargado perforado que debe ser insertado en el interior de una cavidad corporal, y una parte dilatada próxima, que permanece fuera de la cavidad corporal. Se coloca un tubo de medicación de manera próxima a la unión entre el cuerpo alargado y las partes dilatadas, con el fin de descargar su contenido directamente en el interior del cuerpo alargado bajo accionamiento. El canal de difusión, a través del cual se desplaza el medicamento antes de ser expulsado hacia la cavidad corporal, está formado simplemente por el lumen del cuerpo alargado, que permite el paso y la expulsión de un volumen de aire bastante grande. No existe descripción alguna sobre un canal de difusión de un volumen reducido, que permitiera que el medicamento se expulsara casi de forma inmediata sin ser precedido por un volumen de aire tan grande.

La publicación de la patente europea número 761246 describe un aplicador que comprende un depósito, una bomba que presenta un puerto de entrada en el depósito, un disparador inferior para accionar la bomba y un tubo que debe ser introducido en el interior de una cavidad corporal, que contiene un cabezal de distribución en la punta del tubo, estando dicho tubo conectado a un puerto de salida de la bomba. La sección del tubo define un canal de difusión que simplemente consiste en el lumen del tubo, a través del cual se desplaza un medicamento hasta el cabezal de distribución. El cabezal de distribución comprende una sección dilatada que presenta una parte llenadora y una pluralidad de perforaciones que atraviesan todo el grosor del cabezal. Este documento no describe ningún aplicador que pudiera presentar un canal de difusión de un volumen pequeño que pudiera administrar una medicación sin administrar un volumen de aire considerablemente elevado.

La publicación de patente número DE 3513645 describe un aplicador que comprende una parte de la punta no perforada y un cuerpo cilíndrico que presenta una pared perforada externa. El lumen definido en el cuerpo está delineado simplemente mediante la pared externa. Este lumen constituye un depósito en el que se coloca una formulación líquida o semisólida. Un émbolo empuja a la formulación en el depósito y, mediante compresión contra la parte de la punta no perforada, la formulación es forzada hacia fuera a través de las perforaciones. El lumen y el émbolo pueden presentar una pieza con forma cónica complementaria para administrar pequeños volúmenes de la formulación. Sin embargo, debido a que el lumen presenta un volumen relativamente grande, puede resultar forzado un volumen de aire más o menos alto a través de las perforaciones, ante de que la formulación alcance las mismas.

El virus HSV-1 y el virus HSV-2 son unos virus neurotrópicos que infectan principalmente los tejidos neuroectodermales, entre los que se incluyen la piel, los nervios periféricos y el sistema nervioso central. Las superficies mucosas o de la piel son las zonas habituales de infección principal. El herpes labial y el herpes genital recurrentes representan las manifestaciones clínicas más comunes asociadas a la infección del virus HSV-1 y del virus HSV-2, respectivamente. Las recurrencias son espontáneas pero están asociadas al estrés físico o emocional, la fiebre, la exposición a la luz ultravioleta, a la lesión de los tejidos y a la supresión inmune. A pesar de que se trata de una enfermedad leve en individuos inmunocompetentes, las infecciones del virus HSV son molestas, especialmente para pacientes con episodios frecuentes. Los pacientes comprometidos bien sea por una terapia inmune o una enfermedad subyacente, presentan un riesgo elevado de desarrollar infecciones del virus HSV. Los destinatarios de trasplantes renales y cardiacos demostraron un incremento en la gravedad de la infección. Además, el brote del SIDA ha reforzado la gravedad de la enfermedad clínica del virus HSV en huéspedes inmunocomprometidos.

Los tratamientos antivirales tópicos disponibles en la actualidad presentan solamente una eficacia limitada frente al herpes recurrente sintomático. La eficacia limitada de estas formulaciones tópicas en el desarrollo de lesiones herpéticas mucocutáneas puede ser debido la baja capacidad de los medicamentos para penetrar en la piel. El estrato córneo o capa córnea constituye la barrera para la penetración de la mayoría de las sustancias en la piel. Esta capa consiste de corneocitos contenidos en una matriz lipídica de doble capa compuesta de colesterol, ácidos grasos libres, y ceramidas. Por consiguiente, la utilización de mejoradores de penetración en la piel podría representar una estrategia idónea para incrementar el índice de penetración de formulaciones tópicas de fármacos en la piel.

El SLS es un tensiactivo que posee una propiedad mejoradora de penetración en la piel por el incremento de la fluidez de los lípidos epidérmicos. La propiedad mejoradora de la penetración en la piel del SLS combinada con su capacidad para modificar la infectividad viral por medio de sus propiedades detergentes y caotrópicas podría incrementar adicionalmente la eficacia de las formulaciones tópicas de fármacos. Además, debido a sus propiedades caotrópicas, el SLS puede presentar un espectro de actividad frente al esperma, las bacterias, los hongos y los virus más amplio que otro detergente simple.

Los poloxámeros se utilizan de manera habitual en numerosas aplicaciones farmacéuticas y sus propiedades no tóxicas los hacen adecuados para sistemas de administración ininterrumpida de fármacos. Los poloxámeros representan matrices adecuadas para aplicaciones dermatológicas. De hecho, cuando se aplican en forma de líquido, los poloxámeros permiten una mejor cobertura superficial mediante la penetración en las irregularidades más pequeñas de la mucosa y/o de la piel. Además, la matriz reticular formada por estos poloxámeros puede actuar como un sistema de liberación ininterrumpida de fármacos que prolonga la acción del fármaco.

Sumario de la invención

Según la presente invención, es un objetivo proporcionar formulaciones que comprendan un componente formador de película que se aplica a la superficie de la membrana mucosa o de la piel, preferentemente en forma de gel, crema o ungüento. Las formulaciones en forma de gel deben utilizarse para recubrir diferentes tipos de membrana mucosa, tales como la membrana mucosa vaginal, cervical, ano-rectal, la membrana mucosa de los ojos, la membrana mucosa bucal, nasal, o la piel, para prevenir la infección y/o condiciones anormales de la membrana mucosa y/o de la piel. Además, las formulaciones en forma de gel pueden aplicarse por vía tópica en los ojos para el tratamiento y/o la prevención de la infección de las condiciones oftálmicas. Para ello, se utiliza un gel termorreversible, que se aplica en forma de líquido, se extiende sobre la superficie y forma un recubrimiento semisólido tras alcanzar la temperatura de esta superficie corporal. El gel termorreversible está compuesto de poloxámero 407. La formulación indicada anteriormente también comprende un agente según la reivindicación 1 que resulta capaz de interferir con la membrana celular, la envoltura celular o los lípidos de la cápsida o las proteínas constituyentes del organismo en una célula diana, tejido o microbio. La combinación del componente formador de película indicada anteriormente y el agente indicado anteriormente pueden prever formulaciones con una eficacia mejorada y una toxicidad reducida. El lauril sulfato sódico (SLS) solo, como agente caotrópico y como inhibidor putativo de una adhesión microbiana, es eficiente contra los microbios. La eficacia del SLS resulta mejorada adicionalmente cuando se incorpora a las presentes formulaciones. Por lo tanto, se considera que el SLS puede utilizarse solo o en combinación con el componente formador de película indicado anteriormente para prevenir una infección microbiana. El SLS puede utilizarse solo o en combinación con las formulaciones indicadas anteriormente en cualquier concentración adecuada, preferentemente en una concentración de entre el 0,1% y el 25% (p/v), y más preferentemente en una concentración de entre el 1% y el 15% (p/v). Se utiliza una concentración de poloxámero 407 en una concentración de entre el 15% y el 35% (p/v). Las propiedades físicas de las formulaciones finales dependen en gran medida del fármaco que debe incorporarse en las mismas, del pH y de los solutos utilizados en la realización de las formulaciones y de la viscosidad deseada para un objetivo determinado. Las formulaciones indicadas anteriormente podrían comprender adicionalmente un fármaco que resulte efectivo para prevenir una infección y/o condiciones anormales de la membrana mucosa o de la piel. Las formulaciones vaginales constituyen una barrera física y química debido a sus componentes de formación de película y de alteración microbiana. Por consiguiente, cabe decir que, con una actividad contra los agentes infectivos, estas formulaciones pueden también ser efectivas para prevenir el embarazo. El SLS sustituirá de manera ventajosa al nonoxinol-9 en las formulaciones. El SLS, que presenta un espectro de actividad más amplio contra, entre otros, el esperma, los virus envueltos y no envueltos, es un candidato a elegir en la presente formulación. El gel podría contener un fármaco que resulte efectivo para prevenir la infección y/o condiciones anormales de la membrana mucosa y/o de la piel. Para los fines de la invención, el término "fármaco" está destinado a cubrir cualquier agente antimicrobiano, bactericida, virucida, quimioterapéutico, antiinflamatorio, antineoplástico, inmunomodulador o cualquier otro agente o combinación de los mismos que resulte efectivo para la prevención de la infección de la membrana mucosa y/o de la piel. El término "fármaco" también se refiere a citocinas o antígenos que pudieran estimular una respuesta inmune que protegiera frente a una infección. Los fármacos podrían incorporarse en el interior de portadores de fármacos, tales como geles, liposomas, nanopartículas o ciclodextrinas, cuya encapsulación resulta en una prevención mejorada de la infección, con distintas posibilidades del diseño general del aplicador, que no pretenden en modo alguno limitar el alcance del mismo. Es importante indicar que la forma y la apariencia final del aplicador puede diferir de los ejemplos proporcionados en la presente memoria.

En otras formas de realización preferentes, las presentes formulaciones se utilizan para tratar enfermedades virales y comprenden adicionalmente, como fármaco, un agente antiviral, tal como el aciclovir o el foscarnet, o cualquier otro agente antimicrobiano, utilizado solo o en combinación, en cualquier concentración adecuada. En una forma de realización preferente, la formulación está compuesta de poloxámero 407 y contiene foscarnet en una concentración de entre el 0,5% y el 5% (p/v). En otra forma de realización preferente, la formulación está compuesta de poloxámero 407 y contiene aciclovir en una concentración de entre el 0,5% y el 5% (p/v). Todavía en otra forma de realización preferente, la formulación está compuesta de poloxámero 407 y contiene SLS en una concentración de entre el 1% y el 10% y foscarnet o aciclovir en las concentraciones indicadas anteriormente.

Es un objetivo de la presente invención desarrollar nuevas formulaciones tópicas para prevenir la infección de la membrana mucosa y/o de la piel, más particularmente, para prevenir aquellas infecciones que se transmiten por vía sexual e incluso más particularmente aquellas producidas por el virus VIH y el herpes. Los microbicidas o cualquier otro fármaco pueden incluirse en el interior de formulaciones en forma de gel, bien sea libremente o de forma encapsulada en el interior de los portadores de fármacos, tales como liposomas, nanopartículas, o ciclodextrinas. Dichos geles microbicidas podrían prolongar la actividad microbicida local, eliminar la irritación local y reducir los efectos secundarios sistémicos de los agentes activos incorporados.

Es otro objetivo de la presente invención desarrollar formulaciones tópicas de fármacos que pudieran mejorar la eficacia de los agentes química o farmacologicamente activos, frente a las infecciones mucocutáneas y más particularmente frente a aquellas producidas por las infecciones del virus HSV. La eficacia mejorada de los fármacos bajo la incorporación en el interior de matrices y/o portadores de fármacos adecuados podría reducir el intervalo de dosificación y por consiguiente mejorar la calidad de vida de los pacientes. Es también un objetivo de la presente invención desarrollar formulaciones tópicas para el tratamiento y/o la curación de quemaduras, así como para la prevención de su potencial infección.

Descripción de las formas de realización específicas de la presente invención

La presente invención será descrita a continuación en la presente memoria con relación a formas de realización específicas y figuras anejas, cuya finalidad es ilustrar la invención y no limitar su alcance.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra la infectividad del virus HSV-1 (cepa F) sobre células Vero después de un pretratamiento del virus con diferentes concentraciones de SLS (panel A) o DS (panel B) durante 1 hora a 37ºC (_{#}) o después de la adición de SLS o DS a los virus sin pretratamiento (_{)}). Las unidades formadoras de placas (UFC) están expresadas como un porcentaje del control. Los resultados son la media \pm SD (desviación estándar) de 4 experimentos inde-
pendientes.

La Figura 2 muestra la eficacia de diferentes concentraciones de SLS (panel A) o DS (panel B) frente al virus HSV-1 (cepa F) en células Vero. Las unidades formadoras de placas (UFC) están expresadas como un porcentaje del control. Los resultados son la media \pm SD (desviación estándar) de 4 experimentos independientes.

La Figura 3 ilustra el efecto de pretratar el virus VIH-1 (cepa NL4-3) con 500 \muM de SLS durante 1 hora a 37ºC sobre su infectividad sobre células 1G5. Los valores representan la media \pm SD (desviación estándar) de tres determinaciones.

La Figura 4 muestra la micrografía electrónica de células Vero infectadas con el virus HSV-1 (cepa F) pretratado durante 1 hora a 37ºC con 50 \muM (panel B), 75 \muM (panel C) y 100 \muM (panel D) de SLS. Las células infectadas con el virus HSV-1 (cepa F) en ausencia de SLS fueron utilizadas como control (panel A). Ampliación de 70.000 X.

La Figura 5 muestra la cuantificación de la glicoproteína D del virus HSV-1 (cepa F) pretratado durante 1 hora a 37ºC con 12,5 \muM, 25 \muM, 50 \muM, 75 \muM y 100 \muM de SLS en células Vero. Las células infectadas con el virus HSV-1 (cepa F) en EMEN + FBS al 2% fueron utilizadas como control. Los valores están expresados como un porcentaje de la intensidad de la señal de hibridación en comparación con el control.

La Figura 6 muestra le evolución en el tiempo del índice de supervivencia de los ratones infectados por vía intranasal con el virus HSV-2 (cepa 22) pretratados durante 1 hora a 37ºC con 6,25 \muM (_{#}), 25 \muM (_{)}) y 100 \muM (_{%}) de SLS. Los ratones infectados con el virus no tratado fueron utilizados como control (.). Los resultados están expresados como la media de 8 animales por grupo.

La Figura 7 muestra la evolución en el tiempo del valor medio del grado o índice de lesión de los ratones infectados por vía cutánea con el virus HSV-1 (cepa F) pretratado durante 1 hora a 37ºC con diferentes concentraciones (6,25 \muM (_{#}), 25 \muM (_{)}) y 100 \muM (_{%})) de SLS (panel A) o con diferentes concentraciones (0,25 \muM (_{#}), 1 \muM (_{)}) y 10 \muM (_{%})) de DS (panel B). Los ratones infectados con el virus no tratado fueron utilizados como control. Los resultados están expresados como la media de 6 animales por grupo.

La Figura 8 muestra la evolución en el tiempo del valor medio del grado o índice de lesión de los ratones infectados con el virus HSV-1 (cepa F) después de un pretratamiento de los ratones con la formulación de poloxámero solo, 5 minutos (_{)}) antes o 1 hora (_{+}) antes de la infección, o con la formulación de poloxámero que contiene SLS al 5% también 5 minutos (_{#}) antes o 1 hora (_{%}) antes de la infección. Los ratones infectados no tratados fueron utilizados como control (.). Los resultados están expresados como la media de 6 animales por grupo.

La Figura 9 muestra la evolución en el tiempo del valor medio del grado o índice de lesión (panel A) y del índice de supervivencia (panel B) de los ratones infectados por vía intravaginal con el virus HSV-2 (cepa 333) pretratado con el gel solo (_{|, \ %, \ #}) 5 minutos antes de la infección. Los ratones infectados no tratados fueron utilizados como control (‘_{,+,)}). Los resultados son la media de 8 animales por grupo.

La Figura 10 muestra la evolución en el tiempo del índice de supervivencia de los ratones infectados por vía intravaginal con el virus HSV-2 (cepa 333) pretratado con SLS al 2,5% (_{4}), o gel + SLS al 2,5% (_{#}) 5 minutos antes de la infección. Los ratones infectados no tratados fueron utilizados como control (_{,}). Los resultados están expresados como la media de 8 animales por grupo.

La Figura 11 muestra la evolución en el tiempo del índice de supervivencia de los ratones infectados por vía intravaginal con el virus HSV-2 (cepa 333) pretratado con gel + estearato de polioxietileno 40 al 5% (_{#}), gel + guanidina al 5% (_{)}), gel + laurilsarcosina al 2,5% (_{%}), gel + cloruro de benzalconio al 2,5% (_{+}) o gel + Tween 80 al 5% (_{..}) 5 minutos antes de la infección. Los ratones infectados no tratados fueron utilizados como control (.). Los resultados son la media de entre 7 y 10 animales por grupo.

La Figura 16 muestra la evolución en el tiempo del valor medio del grado o índice de lesión (panel A) y del índice de supervivencia (panel B) de ratones sin pelo infectados por vía cutánea con el virus HSV-1 y tratados por vía tópica con el poloxámero solo (_{!}), foscarnet al 0,5% en solución acuosa (_{)}) o poloxámero que contiene foscarnet al 0,5% (_{#}). Los ratones infectados no tratados fueron utilizados como control (.). El tratamiento se inició 24 horas después de la infección y se repitió 3 veces por día durante 4 días. Los valores están expresados como la media de 4 animales por grupo.

La Figura 17 muestra la evolución en el tiempo del valor medio del grado o índice de lesión (panel A) y del índice de supervivencia (panel B) de los ratones sin pelo infectados por vía cutánea por el virus HSV-1 (cepa F) y tratados 24 horas después de la infección con una única aplicación bien sea de poloxámero que contiene aciclovir al 5% (_{#}) o del ungüento Zovirax® (_{)}). Los ratones infectados no tratados (.) fueron utilizados como control. Los valores están expresados como la media de entre 7 y 10 animales por grupo.

La Figura 18 muestra la evolución en el tiempo del valor medio del grado o índice de lesión (panel A) y del índice de supervivencia (panel B) de los ratones sin pelo infectados por vía cutánea con el virus HSV-1 (cepa F) y tratados con el poloxámero solo (_{!}), con poloxámero que contiene aciclovir al 5% (_{#}), o con el ungüento Zovirax® (_{)}). Los ratones infectados no tratados (.) fueron utilizados como control. El tratamiento dio comienzo 5 días después de la infección y se repitió 3 veces al día durante 4 días. Los valores están expresados como la media de entre 7 y 10 animales por grupo.

La Figura 19 muestra la distribución del foscarnet (_{+,%}) y del aciclovir (_{)#}) en tejidos de la piel de ratones no infectados (paneles A, C, E) y de ratones infectados (paneles B, D, F) 24 horas después de su aplicación tópica, bien sea en tampón fosfato (símbolos abiertos) o en el poloxámero (símbolos rellenos). Los paneles A y B muestran la distribución del foscarnet y del aciclovir en las tiras de estrato córneo. Los panales C y D muestran la concentración de foscarnet y de aciclovir en la epidermis mientras que los paneles E y F muestran la concentración de foscarnet y de aciclovir en la dermis. Los valores están expresados como la media de entre 4 y 6 animales por grupo.

La Figura 20 muestra la concentración de aciclovir en el plasma de los ratones no infectados y de los ratones infectados 24 horas después de su aplicación tópica, bien sea en tampón fosfato (barras abiertas) o en el poloxámero (barras rellenas). Los valores están expresados como la media de entre 4 y 6 animales por grupo.

La Figura 21 muestra la evolución en el tiempo del valor medio del grado o índice de lesión (panel A) y del índice de supervivencia (panel B) de ratones sin pelo infectados por vía cutánea con el virus HSV-1 (cepa F) tratado con el poloxámero solo (_{!}), con poloxámero que contiene foscarnet al 3% (_{)}), con poloxámero que contiene SLS al 5% (_{#}) o con poloxámero que contiene foscarnet al 3% + SLS al 5% (_{+}). Los ratones infectados no tratados (.) fueron utilizados como control. Los resultados están expresados como la media de 5 animales por grupo.

La Figura 22 muestra la susceptibilidad del virus HSV-1 (cepa F) a combinaciones de diferentes concentraciones de foscarnet y SLS en células Vero. Los valores están expresados como la media \pm SD (desviación estándar) de 3 determinaciones.

Formulaciones en forma de gel

El poloxámero 407 es un copolímero de polioxietileno y de polioxipropileno en bloque en una proporción en peso de 7:3, con un peso molecular medio de 12.500. Una característica importante de este copolímero en bloque es su capacidad para formar un gel termorreversible. La transición entre el estado líquido a baja temperatura y el estado en forma de gel a temperatura corporal (siendo la temperatura de transición de fase dependiente, en parte, de la concentración del gel, de la fuerza iónica y del soluto incorporado) permite una serie de interesantes aplicaciones médicas entre las que se incluyen las aplicaciones tópicas. Dicha característica es de suma importancia debido a que cuando el gel se aplica, en su estado fluido, por vía tópica a la mucosa, la formulación en forma de gel debería permitir una mejor penetración en las irregularidades de la piel y/o de la membrana mucosa durante la aplicación y una persistencia más duradera una vez que el gel ha alcanzado la temperatura corporal. Debido a la toxicidad y a la irritabilidad extremadamente bajas de las formulaciones en forma de gel de la presente invención, dichas formulaciones representan una propuesta atractiva para los sistemas de administración tópica de fármacos. Los detalles de la preparación de las formulaciones en forma de gel son proporcionados más adelante en la presente memoria. La presente invención cubre formulaciones de poloxámero 407 en forma de gel de cualquier concentración adecuada, y más particularmente aquellas de una concentración de entre el 10% y el 35% p/p. La presente invención también cubre cualquier otro componente formador de película, gel, crema, ungüento o sustancia termorreversible que incluya otros poloxámeros, poloxaminas o sustancias químicas.

Fármacos

Cualquier agente antimicrobiano, bactericida, virucida, quimioterapéutico, antiinflamatorio, antineoplástico, inmunomodulador, o una combinación de los mismos, que resulte efectivo para prevenir o tratar una infección y/o condiciones anormales de la membrana mucosa y/o de la piel provocados por cualquier patógeno y/o cualquier enfermedad se encuentra dentro del alcance de la presente invención. Cualquier detergente que pueda alterar la membrana de los patógenos, cualquier mejorador de la penetración en la piel que pueda incrementar la penetración de los fármacos y/o de los portadores de fármacos en la membrana mucosa y/o en la piel, cualquier inhibidor de la absorción microbiana que previene la entrada del patógeno en una célula diana, cualquier citocina o antígeno que pudiera estimular una respuesta inmune que protegería frente a la infección del patógeno, también se encuentra dentro del alcance de la presente invención. La presente invención también cubre cualquier combinación de formulaciones tópicas y/o fármacos.

Ejemplos que incluyen las formulaciones en forma de gel de la presente invención para la prevención de infecciones

Los ejemplos que se describen a continuación tratan de demostrar la preparación de las formulaciones en forma de gel que podrían resultar eficientes para prevenir una infección y/o condiciones anormales de la membrana mucosa y/o de la piel provocados por cualquier patógeno y/o cualquier enfermedad, pero no pretenden en modo alguno limitar el alcance de la presente invención.

Preparación de las formulaciones en forma de gel

Las formulaciones en forma de gel se preparan mediante la adición de un volumen de agua destilada apropiado, tampón o cualquier otra solución acuosa adecuada, al poloxámero 407 para obtener la concentración deseada. A continuación se añaden unas cantidades de fármacos adecuadas bien sea al polvo o a la solución de poloxámero para obtener la concentración deseada. El pH de la formulación en forma de gel puede ajustarse para que cumpla los requerimientos de cada uno de los tejidos diana que deben ser recubiertos con las presentes formulaciones. Por ejemplo, si debe utilizarse una formulación para recubrir la mucosa vaginal, se utilizará una solución acídica con un pH de entre aproximadamente 4,0 y 4,5. El porcentaje del polímero puede ajustarse consiguientemente para obtener una temperatura de transición adecuada entre el estado líquido y el estado sólido. Estos ajustes dependen de los conocimientos y la habilidad del experto en la materia.

A pesar de que la descripción de la presente invención se encuentra limitada a unos casos específicos, cualquier componente formador de película y/o fármaco y/o liposoma (u otros portadores de fármacos) o cualquier combinación de los productos indicados anteriormente son considerados potenciales candidatos para el desarrollo de estas presentaciones tópicas y se encuentran dentro del alcance de la presente invención. Las formulaciones también incluyen cualquier componente formador de película y/o fármaco y/o liposoma (u otros portadores de fármacos) o cualquier combinación de estos productos en cualquier concentración adecuada.

Infectividad in vitro de los virus del herpes pretratados con SLS o DS

Se ha evaluado el efecto de pretratar diferentes cepas de los virus del herpes con SLS o con DS sobre su infectividad viral sobre células susceptibles. En resumen, las células fueron sembradas en placas de 24 pocillos (Costar, Montreal, QC, Canadá). Previamente a la infección, se suspendió el virus en un medio de cultivo o en solución salina tamponada con fosfato (PBS), o se incubó con diferentes concentraciones de SLS en PBS durante 1 hora a 37ºC. En confluencia, se incubaron las células con las suspensiones virales mediante centrifugación de las placas (750 x g durante 45 minutos a 20ºC) para permitir la absorción del virus. Se eliminó el virus y a continuación se recubrieron las láminas de células con 0,5 ml de agarosa Seaplaque al 0,6% (Marine Colloids, Rockland, MA) preparada en un medio de cultivo apropiado. Se incubaron las placas por 2 días a 37ºC. A continuación se fijaron las células con formaldehído en PBS al 10% durante 20 minutos, se lavaron con agua desionizada y se tiñeron con azul de metileno al 0,05%. Se evaluó la infectividad viral por medio de la determinación de las unidades formadoras de placas (PFU).

La tabla 1 muestra que el pretratamiento de diversas cepas del virus HSV-1 y del virus HSV-2 con SLS durante 1 hora a 37ºC redujo, de una manera dependiente de la concentración, su infectividad sobre las células Vero. La infectividad del virus HSV-1 (cepa F) resultó reducida hasta un 21% cuando las partículas virales fueron pretratadas con 25 \muM de SLS. La infectividad de todas las cepas del virus HSV-2 era de entre el 50% y el 70% después de una preincubación con 25 \muM de SLS. Se obtuvo una pérdida total de la infectividad de todas las cepas sometidas a ensayo después de un pretratamiento de los virus con 50 \muM de SLS. La preincubación de las células Vero durante 1 hora a 37ºC con concentraciones de SLS de entre 6,25 \muM y 100 \muM previamente a su infección con el virus HSV-1 (cepa F) no resultó en una pérdida de la infectividad del virus (datos no mostrados). Estos resultados sugieren que el SLS actúa directamente sobre el virus y no sobre las células.

TABLA 1 Infectividad de diversas cepas de los virus HSV-1 y HSV-2 pretratados con diferentes concentraciones de SLS durante 1 hora a 37ºC

1

La Figura 1 muestra el efecto del pretratamiento del virus HSV-1 (cepa F) con diferentes concentraciones de SLS o DS sobre su infectividad sobre células Vero. Cuando el SLS fue añadido de manera inmediata, a las células Vero, después de su infección, la pérdida de la infectividad viral resultó menos espectacular en comparación a la pérdida obtenida para el virus pretratado durante 1 hora a 37ºC con las mismas concentraciones de SLS. Después del pretratamiento, se observó una pérdida de la infectividad viral de un 50% a una concentración de 20 \muM en comparación a la concentración de 75 \muM cuando el virus no era pretratado. Además, a pesar de que se obtuvo una inhibición total de la infectividad viral después de la preincubación con 50 \muM de SLS, la inhibición no resultó completa incluso con una concentración de 100 \muM sin pretratamiento. De manera similar, el pretratamiento del virus HSV-2 (cepa 333) con SLS también influyó sobre la infectividad de esta cepa (datos no mostrados). Por otro lado, el DS reduce la infectividad del virus independientemente de que el virus fuera pretratado con DS. En este caso, se observó una pérdida de la infectividad viral del 50% a una concentración de aproximadamente 1 nM.

También se sometió a ensayo la viabilidad de las células Vero sometidas durante 1 hora a 37ºC a concentraciones de SLS o DS similares a las utilizadas en la Figura 1 y en la Tabla 1, utilizando un ensayo MTS. No pudo demostrarse signo alguno de toxicidad en el intervalo de concentraciones utilizado (datos mostrados).

La Figura 2 muestra la eficacia de diferentes concentraciones de SLS (panel A) o de DS (panel B) frente al virus HSV-1 (cepa F) en células Vero. En resumen, las células fueron infectadas con el virus durante 2 horas a 37ºC. Después, se retiró el supernadante y se recubrieron las células con 0,5 ml de EMEM + 2% de FBS que contenía agarosa Seaplaque al 0,6% y SLS o DS en una concentración deseada. A continuación se incubaron las placas por 2 días a 37ºC en una atmósfera de CO_{2} al 5%. Se fijaron las células con formaldehído en PBS al 10% durante 20 minutos, se lavaron con agua desionizada y se tiñeron con azul de metileno al 0,05%. Se evaluó la infectividad viral después de la determinación de las PFU. Los resultados muestran que tanto el SLS como el DS redujeron de una manera dependiente de la concentración, la replicación viral de manera similar con total eficacia a concentraciones de 100 \muM y de 20 nM de SLS y DS, respectivamente. Si estar ligados a ningún mecanismo, los resultados indicados anteriormente sugieren que el SLS puede tener un efecto inhibidor de la adhesión microbiana.

Infectividad in vitro del virus VIH-1 pretratado con SLS

También se ha evaluado el efecto de pretratar el virus VIH-1 (cepa NL4-3) con SLS sobre su infectividad sobre células 1G5, un derivado de Jurkat E6-1 que da refugio a dos construcciones integradas de manera estable que comprenden el gen de la luciferasa bajo el control del LTR del VIH-1_{SF2}. En resumen, previamente a la infección, se incubó el virus con un medio de cultivo o con 500 \muM de SLS durante 1 hora a 37ºC. A continuación se incubaron las células (1 x 10^{5} células/pocillo) con la cepa NL4-3 (10 ng de p24) del virus VIH-1 durante 2 horas a 37ºC bajo una atmósfera de CO_{2} al 5%. Después, se lavaron la células, se resuspendieron en 200 \mul de un medio de cultivo completo y se transfirieron en una placa de cultivo de tejidos de fondo plano de 96 pocillos (Microtest III, Falcon; Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ). Tras una incubación de 48 horas a 37ºC, las células fueron sometidas a lisis, sujetas a un ciclo de congelación-descongelación y se monitorizó la actividad de la luciferasa utilizando un luminómetro de microplacas (MLX; Dynex Technologies, Chantilly, VA). Los resultados obtenidos a partir de este conjunto de experimentos muestran claramente que el pretratamiento del virus VIH-1 (cepa NL4-3) con 500 \muM de SLS durante 1 hora a 37ºC inhibió casi completamente la infectividad del virus VIH-1 sobre las células 1G5 (Figura 3).

Microscopía electrónica de células Vero infectadas con el virus HSV-1 (cepa F) pretratado con SLS

Se ha evaluado la apariencia del virus HSV-1 (cepa F) pretratado con diferentes concentraciones de SLS (50 \muM, 75 \muM y 100 \muM) durante 1 hora a 37ºC en células Vero utilizando las microscopía electrónica. En resumen, las células (confluentes entre un 80% y un 90%) fueron infectadas con el virus (aproximadamente 70 PFU/ml en 14 ml) durante 48 horas a 37ºC en una atmósfera de CO_{2} al 5%. Las células fueron retiradas por raspado de las placas y resuspendidas en un medio de cultivo. Las células fueron centrifugadas (515 x g durante 10 minutos a 4ºC) y se decantó el supernadante, y las célula fueron resuspendidas en un medio de aproximadamente 500 \mul. Se transfirieron las células en un tubo "eppendorf" y fueron centrifugadas a (10.000 x g durante 5 minutos a 4ºC). Se resuspendió el pellet en aproximadamente 200 \mul de albúmina de suero bovino (BSA) al 20%. Se añadieron unas pocas gotas de glutaraldehído al 25% a la mezcla y las muestras fueron colocadas de forma inmediata en un baño de hielo para permitir la polimerización de la BSA. A continuación se cortó el pellet en muestras de 1 mm^{3} que a continuación fueron fijadas en glutaraldehído en PBS al 2% durante 1 hora, en OsO_{4} en PBS al 1% durante 1 hora y a continuación con ácido tánico en PBS al 0,1% durante 30 minutos. Las muestras fueron aclaradas 3 veces en PBS durante 5 minutos entre cada etapa. Las muestras fueron teñidas con 2% de acetato de uranilo en etanol al 10% durante 30 minutos. Las muestras fueron deshidratadas y encapsuladas en Epon siguiendo procedimientos rutinarios. Se colocaron secciones (de un grosor aproximado de 75 nm) sobre una red de cobre (200 mallas). Los espécimenes fueron teñidos con acetato de uranilo, contrateñidos con citrato de plomo y observados con un microscopio electrónico JEOL 1010 (JEOL Canada Inc., St-Hubert, QC, Canadá).

La Figura 4 (panel A) muestra el aspecto normal del virus en los núcleos de las células Vero. Las partículas virales estaban compuestas de una cápsida, de forma hexagonal, y que contenía un núcleo de ADN electrón-denso. En el citoplasma de la mayoría de las células también se encontraron partículas virales completas formadas por una nucleocápsida rodeada por una envoltura. En las células Vero infectadas con los virus pretratados con 50 \muM (panel B), 75 \muM (panel C) y 100 \muM (panel D) de SLS, se pudieron recuperar las partículas virales en los núcleos pero no en el citoplasma de las células. No se pudo observar ninguna nucleocápsida madura en los núcleos pero las partículas virales estaban constituidas por cápsidas que contenían una acumulación discreta de material electrón-denso. El número de cápsidas vacías encontradas en los núcleos de las células infectadas con los virus pretratados con SLS decreció con las concentraciones incrementadas del fármaco utilizado para el tratamiento. En las células infectadas con los virus pretratados con 100 \muM de SLS, solamente pudieron detectarse unas pocas células con cápsidas vacías en los núcleos. Tomados en conjunto, los resultados pudieron explicar la pérdida de la infectividad de los virus del herpes en presencia de SLS.

Cuantificación del gen de la glicoproteína D del virus HSV

También fue evaluada la cuantificación del gen de la glicoproteína D del virus HSV-1 (cepa F) pretratado con SLS en células Vero con el fin de determinar la presencia de ADN viral en las células infectadas. En resumen, el virus HSV-1 (cepa F) fue pretratado con diferentes concentraciones de SLS (12,5 \muM, 25 \muM, 50 \muM, 75 \muM y 100 \muM) en EMEM + FBS al 2% durante 1 hora a 37ºC. Las células Vero (confluentes entre un 80% y un 90%) fueron infectadas con el virus (100 PFU/ml en 20 ml) durante 48 horas a 37ºC en una atmósfera de CO_{2} al 5%. Se retiró el medio de cultivo y se lavó la lámina de células dos veces con 1X HBSS. Se retiraron las células de las placas, por raspado, y fueron resuspendidas en EMEN + FBS al 2%. Se extrajo el ADN total utilizando un procedimiento estándar de fenol/cloroformo. Se alcanzó la cuantificación del ADN total utilizando el procedimiento de Burton. La sonda utilizada para este estudio corresponde a una parte de la glicoproteína D del virus HSV-2 (cepa 333), generada por PCR utilizando los siguientes cebadores:

P1 (5'-GCCACCATGGGGCGTTTGACC-3') y

P2 (5'-AAACTCAGTTATCTAGTCCTCGGGGTC-3')

y fue [^{32}P]-marcada por cebado aleatorio. La hibridación fue llevada a cabo a 65ºC en Na_{2}HPO_{4} 0,25 M (pH 6,8 con ácido ortofosfórico) y SDS al 7%. Los lavados fueron llevadas a cabo en Na_{2}HPO_{4} 40 mM (pH 6,8 con ácido ortofosfórico) y SDS al 1% durante 20 minutos a 65ºC, seguido de 20 minutos a 25ºC.

La Figura 5 (panel A) muestra la cuantificación del gen de la glicoproteína D del virus HSV-1 (cepa F) pretratado con diferentes concentraciones de SLS en células Vero. Después de una incubación de 48 horas, las células fueron recogidas y se extrajo el ADN total. El panel A muestra alícuotas de ADN BGlII-fragmentado (325 ng), aplicados a un gel de agarosa al 0,8%, transferidos a una membrana de nailon, e hibridizados con la sonda de la glicoproteína D. El panel B muestra las medidas cuantitativas de los niveles de ADN del virus HSV-1 obtenidas por densitometría de barrido del autorradiograma utilizando un densitómetro Alphalmager. No se pudo observar ninguna modificación importante en la expresión del gen de la glicoproteína D del virus en las células infectadas con el virus HSV-1 (cepa F) pretratado con 12,5 \muM, 25 \muM y 50 \muM de SLS en comparación al control. Las medidas cuantitativas de los niveles de ADN del virus HSV-1 obtenidas mediante densitometría por barrido del autorradiograma resultaron similares (panel B). Sin embargo, cuando el virus fue pretratado con mayores concentraciones de SLS (75 \muM y 100 \muM), se observó una reducción notable en la expresión del gen de la glicoproteína D con una reducción en los niveles de ADN de hasta un 65,1% y hasta un 34,9% de los valores de control, respectivamente. Estos datos sugieren que el SLS podría interferir con la maduración de las nucleocápsidas virales bien sea mediante la reducción de su tasa de maduración o mediante la interferencia con la encapsulación del ADN en la envoltura cápsida.

Infectividad in vivo del virus del herpes pretratado con SLS (modelo intranasal)

También ha sido evaluado el efecto de pretatar el virus HSV-2 (cepa 22) con SLS sobre la infectividad viral en un modelo de infección intranasal murino. En resumen, se utilizaron ratones hembra Balb/c (Charles River Breeding Laboratories Inc., St-Constant, QC, Canadá) de 4 semanas de edad durante todo este estudio. Previamente a la infección, se incubó el virus HSV-2 (cepa 22) durante 1 hora a 37ºC con PBS o con diferentes concentraciones de SLS (6,25 \muM, 25 \muM o 100 \muM) para alcanzar un inóculo viral final de 2.000 UPF/20 \mul. Los ratones fueron ligeramente anestesiados utilizando Aerrane® (Isoflurane, USP; Janssen, North York, ON, Canadá) y se aplicó una suspensión viral (20 \mul de volumen total) en el orificio nasal externo de los ratones. A continuación los ratones fueron devueltos a sus jaulas y se evaluó el índice de supervivencia diariamente.

La Figura 6 muestra que todos los ratones infectados con el virus no tratado murieron de encefalitis entre el día 9 y el día 11. Por el contrario, el 67% de los ratones infectados con el inóculo viral pretratado con 6,25 \muM y 25 \muM de SLS, sobrevivieron a la infección. Todos los ratones infectados con una suspensión viral pretratada con 100 \muM de SLS sobrevivieron a la infección y no demostraron ningún signo de enfermedad, lo que resulta de sumo interés.

Infectividad in vivo del virus del herpes pretratado con SLS o DS (modelo cutáneo)

También ha sido evaluado el efecto de pretratar el virus HSV-1 (cepa F) con SLS sobre la infectividad viral en un modelo de infección cutánea murino. Se utilizaron ratones hembra sin pelo (SKH1; Charles River Breeding Laboratories Inc., St-Constant, QC, Canadá) de entre 5 y 6 semanas de edad durante todo este estudio. Previamente a la infección, se incubó el virus HSV-1 (cepa F) durante 1 hora a 37ºC con PBS, con 6,25 \muM, 25 \muM o 100 \muM de SLS o con 0,25 nM, 1 nM o 10 nM de DS, para obtener un inóculo viral final de 3 x 10^{5} UPF/50 \mul. Los ratones fueron anestesiados mediante una inyección intraperitoneal de una mezcla que contenía 70 mg/kg de hidrocloruro de ketamina (Rogarsetic* injection USP; Rogar/STB Inc. Montreal, QC, Canadá). El virus fue inoculado sobre el lado lateral del cuerpo en la zona de piel lumbar izquierda. La piel fue sometida a raspado 6 veces siguiendo un patrón reticulado con una aguja de calibre 27-G sostenido verticalmente. Se depositó una suspensión viral (50 \mul) sobre el área escarificada y se frotó por un tiempo de entre 10 segundos y 15 segundos con un aplicador con algodón en la punta saturado con EMEM + FBS al 2% o soluciones de SLS o DS. Se protegió el área escarificada con un apósito para callos que se mantuvo sobre el cuerpo de los ratones con cinta quirúrgica. La pared interior porosa de la abertura del apósito para callos fue impermeabilizada con adhesivo tisular previamente a su utilización para prevenir la absorción del fármaco. La abertura del apósito también fue cerrada con cinta quirúrgica. Los ratones fueron devueltos a sus jaulas y observados dos veces al día.

La Figura 7 muestra la evolución en el tiempo del valor medio del grado o índice de lesión de los ratones sin pelo infectados por vía cutánea con el virus HSV-1 (cepa F) pretratado con diferentes concentraciones de SLS o DS durante 1 hora a 37ºC. La evaluación del grado o índice de lesión fue llevada a cabo según los criterios presentados en la Tabla 2. En los ratones infectados no tratados, no se apreció ningún signo patológico visible de infección cutánea durante los primeros cuatro días posteriores a la infección y solamente se mantuvo visible la zona escarificada. Al cabo del día 5, comenzaron a hacer presencia lesiones herpéticas de la piel en algunos ratones en forma de pequeñas vesículas distantes de la zona de inoculación. Al cabo del día 6, prácticamente todos los ratones no tratados desarrollaron lesiones herpéticas de la piel en forma de bandas de un ancho de entre 4 mm y 5 mm que se extendían desde la columna hasta la línea media ventral del dermatoma infectado similar a las infecciones del tipo zoster. El máximo valor medio del grado o índice de lesión fue observado al cabo del día 8. Después el valor medio del grado o índice de lesión decreció entre los días 11 y 15 debido a una regresión espontánea de las lesiones cutáneas en algunos ratones. Los ratones infectados con el virus pretratado con 6,25 \muM y 25 \muM de SLS no mostraron una reducción considerable del valor medio del grado o índice de lesión. Sin embargo, los ratones infectados con el virus pretratado con 100 \muM de SLS no mostraron signo alguno de lesiones cutáneas. Todos los ratones infectados con el virus pretratado con 100 \muM de SLS sobrevivieron a la infección (datos no mostrados, lo que resulta de suma importancia. Por otro lado, los ratones infectados con el virus pretratado con 0,25 nM de DS mostraron una reducción parcial del valor medio del grado o índice de lesión mientras que los ratones infectados con el virus pretratado, bien sea con 1 nM de DS o con 10 nM de DS mostraron una mejor protección frente al desarrollo de lesiones herpéticas.

TABLA 2 Criterios utilizados para la evaluación de lesiones cutáneas herpéticas

2

Efecto profiláctico in vivo de las formulaciones de poloxámero que contienen o no SLS (modelo cutáneo)

También ha sido evaluada la eficacia del poloxámero solo y del poloxámero que contiene SLS al 5% para prevenir el desarrollo de las lesiones cutáneas en los ratones. Durante todo este estudio se utilizaron ratones hembra sin pelo de edades de entre 5 semanas y 6 semanas. En resumen, los ratones fueron anestesiados mediante una inyección intraperitoneal de una mezcla que contenía 70 mg/kg de hidrocloruro de ketamina y 11,5 mg/kg de xilazina. Las formulaciones fueron aplicadas por vía tópica sobre el lado lateral del cuerpo en la zona de piel lumbar izquierda. Cinco minutos y 1 hora más tarde de la aplicación, se depositó una gota del inóculo viral (3,15 x 10^{8} PFU/ml) sobre la piel y se realizó una escarificación con una aguja de calibre 27-G por toda la gota para simular un accidente que puede ocurrir a trabajadores del servicio sanitario. En este modelo, el inóculo viral necesita ser superior para obtener una erupción cutánea zosteriforme en prácticamente todos los ratones. Sin embargo, el índice de mortalidad asociado a la infección resultó reducido y no pudo utilizarse como un criterio para evaluar la eficacia de los tratamientos. El área escarificada fue protegida con un apósito para callos que se mantuvo sobre el cuerpo de los ratones con cinta quirúrgica. La abertura del apósito para callos también se cerró con cinta quirúrgica. A continuación los ratones fueron devueltos a sus jaulas y observados dos veces al día.

La Figura 8 muestra la evolución en el tiempo del valor medio del grado o índice de lesión de ratones infectados no tratados y de ratones pretratados con el poloxámero solo o con poloxámero que contiene SLS al 5%, 5 minutos antes o 1 hora antes de su infección cutánea con el virus HSV-1 (cepa F). Los resultados muestran que los ratones pretratados con el gel solo, 5 minutos antes o 1 hora antes de la infección, muestran solamente una protección modesta frente el desarrollo de lesiones cutáneas. En los ratones pretratados tanto 5 minutos antes como 1 hora antes con el poloxámero que contiene SLS al 5%, se observó una protección completa frente al desarrollo de lesiones cutáneas, lo que resulta de sumo interés. Los resultados muestran el gran potencial de las formulaciones de la presente invención como una propuesta profiláctica para prevenir infecciones con patógenos. De hecho, dicha herramienta podría proteger frente a infecciones accidentales de los trabadores del servicio sanitario.

Eficacia in vivo de las formulaciones en forma de gel para la protección frente a infecciones provocadas por los virus del herpes (modelo intravaginal)

Se ha evaluado la eficacia de las formulaciones en forma de gel para prevenir la transmisión genital del virus HSV-2 en un modelo de infección intravaginal murino. En resumen, se utilizaron ratones hembra Balb/c de 4 semanas de edad durante todo este estudio. Para incrementar la susceptibilidad de los ratones al virus del herpes, se administró una dosis de 2,5 mg de progesterona (Depo-Provera) por vía subcutánea a cada ratón 7 días antes y un día antes de la inoculación con el virus HSV-2. Los ratones anestesiados fueron inoculados con 5 \mul de 2,4 x 10^{7} PFU/ml de HSV-2 (cepa 333) tras limpiar la vagina con un bastoncillo de algodón de punta fina con alginato de calcio. Para determinar la eficacia de las formulaciones en forma de gel para bloquear la infección del herpes, se administró una dosis de 15 \mul del gel con una punta de pipeta en el interior de la vagina unos minutos antes de la inoculación. Se movió la punta de pipeta hacia dentro y hacia fuera cuatro veces para estimular la acción de la agitación de la relación sexual teniendo cuidado de no provocar ningún sangrado.

La Figura 9 muestra el valor medio del grado o índice de lesión y la tasa de supervivencia de los ratones infectados no tratados y de los ratones pretratados por vía intravaginal con el gel solo, previamente a la infección con el virus HSV-2 (cepa 333). Cuatro días después de la infección, los animales infectados no tratados mostraron un edema perineal y rojez, y al cabo de entre 6 y 12 días, la mayoría de ellos murieron de encefalitis. Todos los ratones pretratados con el gel solo, sobrevivieron a la infección y no mostraron ningún signo de enfermedad hasta 16 días después de la infec-
ción, lo que resulta de suma importancia. La presencia del gel solo, pudo así suprimir la infección del virus HSV-2.

La Figura 10 muestra la tasa de supervivencia de los ratones infectados no tratados y de los ratones pretratados por vía intravaginal con SLS al 2,5% o con un gel que contenía SLS al 2,5% previamente a la infección con el virus HSV-2 (cepa 333). Cuatro días después de la infección, los animales infectados no tratados mostraron une edema perineal y rojez, y al cabo de entre 6 y 12 días, la mayoría de ellos murieron de encefalitis. Todos los ratones pretratados bien sea con SLS al 2,5% solo o con el gel que contenía SLS al 2,5% sobrevivieron a la infección y no mostraron ningún signo de enfermedad hasta 16 días después de la infección, lo que resulta de suma importancia. Tomados en conjunto, estos resultados indican claramente que la utilización de la preparación en forma de gel de la presente invención podría representar una medida de prevención innovadora para reducir la transmisión sexual del herpes, del virus VIH y de otros patógenos causantes de las ETSs.

La Figura 11 muestra la tasa de supervivencia de los ratones infectados no tratados y de los ratones pretratados por vía intravaginal con un gel que contenía diversos compuestos, previamente a la infección con el virus HSV-2 (cepa 333). Dichos compuestos fueron seleccionados para representar otros compuestos sulfatados y no sulfatados que presentan o no propiedades detergentes. También representan diversos compuestos iónicos (aniónicos y catiónicos) y no iónicos. Este procedimiento de cribado tenía como objetivo encontrar otros potenciales microbicidas candidatos. Los resultados mostraron que la formulación en forma de gel que contenía laurilsarcosina al 2,5% ofrecía una protección completa frente la infección (100% de supervivencia). Por otro lado, las formulaciones en forma de gel que contenían cloruro de benzalconio al 2,5%, estearato de polioxietileno 40 al 5% y guanidina al 5% ofrecieron una tasa de supervivencia del 60%, 60% y 30% respectivamente. Los resultados preliminares de los presentes inventores mostraron que la laurilsarcosina presenta un buen potencial como microbicida candidato, lo que en realidad está siendo explorado por los presentes inventores. Sin embargo, otros compuestos, tales como el cloruro de benzalconio, el estearato de polioxietileno 40 y la guanidina, que mostraron un potencial microbicida parcial, pueden también ser explorados mediante la optimización de sus concentraciones para una mejor eficacia. De manera alternativa, las combinaciones de estos compuestos podrían también ofrecer una eficacia óptima, en caso de que resulten compatibles. Sin estar ligada a ninguna teoría, es de prever que la combinación de un detergente con un agente caotrópico pueda prever una eficacia tan buena como la del SLS, o incluso mejor. Estos son ejemplos específicos de potenciales microbicidas, pero no pretenden en modo alguno limitar el alcance de los mismos.

Ejemplos que incluyen las formulaciones de poloxámero de la presente invención para el tratamiento de la infección

Con el fin de someter a ensayo la eficacia de las formulaciones en forma de gel de la presente invención en un modelo murino de una infección cutánea del virus HSV-1, las soluciones fueron preparadas en el interior de un tampón fosfato (0,2 M, pH 6) para ser compatibles con el pH de la piel.

Eficacia comparativa de formulaciones tópicas de foscarnet, aciclovir, y del ungüento Zovirax frente a lesiones cutáneas producidas por el virus HSV-1 en ratones

Se han evaluado la eficacia de las diferentes formulaciones tópicas de la presente invención en un modelo murino de la infección cutánea del virus HSV-1. En resumen, se anestesiaron ratones hembra sin pelo (SKH1; Charles River Breeding Laboratories Inc., St-Constant, QC, Canadá), de edades de entre 5 semanas y 7 semanas mediante una inyección intraperitoneal de una mezcla que contenía 70 mg/kg de hidrocloruro de ketamina y 11,5 mg/kg de xilazina. El virus fue inoculado en el lado lateral del cuerpo en la zona de piel lumbar izquierda. La piel fue sometida a raspado seis veces con una aguja de calibre 27-G sostenida verticalmente en un patrón reticulado. Se aplicó, por frotación, una dosis de cincuenta \mul de una suspensión viral (cepa F del virus HSV-1, 1,5 x 10^{6} unidades formadoras de placas (PFU)/ml) durante un tiempo de entre 10 segundos y 15 segundos sobre la zona de la piel escarificada con un aplicador con algodón en la punta saturado con un medio de cultivo [medio esencial mínimo (MEM)] suplementado con 100 U/ml de penicilina-estreptomicina, L-glutamina 2 mM y suero bovino fetal (MEM-E + FBS al 2%). La zona escarificada fue protegida con un apósito para callos que se mantuvo sobre el cuerpo de los ratones con cinta quirúrgica. La pared interior porosa de la abertura del apósito para callos fue impermeabilizada con adhesivo tisular previamente a la utilización para prevenir la absorción del fármaco. La abertura del apósito para callos también se cerró con cinta quirúrgica. A continuación se devolvieron los ratones a sus jaulas y fueron observados dos veces al día.

En este estudio se evaluaron diferentes regímenes de tratamiento. En resumen, se retiró la cinta utilizada para cerrar la abertura del apósito para callos y se lavó la zona escarificada con un aplicador con algodón en la punta saturado con agua fría. Se aplicó una dosis de quince \mul de las diferentes formulaciones sobre la zona escarificada. Se cerró la abertura del apósito para callos con cinta quirúrgica para evitar una retirada rápida del fármaco por los ratones. Este procedimiento también previene tratamientos sistémicos accidentales que podrían producirse debido a la potencial lamedura de las lesiones tratadas. La eficacia de las diferentes formulaciones fue evaluada utilizando grados o índices de lesión y de supervivencia.

La Figura 16 (panel A) muestra la evolución en el tiempo del valor medio del grado o índice de lesión de los ratones infectados no tratados o de los ratones tratados con una solución de foscarnet o con foscarnet incorporado en el poloxámero. El tratamiento dio comienzo 24 horas después de la infección y se repitió 3 veces al día durante 4 días. En los ratones tratados con el poloxámero solo, se observó un patrón muy similar al observado con los ratones no tratados excepto que la regresión de las lesiones cutáneas parecía ir a mayor velocidad en este último grupo. En los ratones tratados con una solución de foscarnet al 0,5%, se pudo observar una gran reducción del valor medio del grado o índice de lesión, que resultó ser más pronunciado cuando se asoció el fármaco a la formulación de poloxámero. La Figura 16 (panel B) muestra el correspondiente índice de supervivencia para los ratones infectados no tratados y para los ratones tratados con las formulaciones de los fármacos. Se produjo muerte por encefalitis en un 75% de los ratones infectados no tratados entre el día 7 y el día 8. La mortalidad fue similar en los ratones que habían recibido el poloxámero solo y se produjo entre el día 8 y el día 10. La mitad de los ratones tratados con una solución de foscarnet sobrevivieron a la infección. El 75% de los ratones tratados con la formulación de poloxámero de foscarnet sobrevivió a la infección (p < 0,05), lo que resulta de sumo interés.

La Figura 17 (panel A) muestra la evolución en el tiempo del valor medio del grado o índice de lesión de los ratones infectados no tratados y de los ratones tratados con una única aplicación 24 horas después de la infección del poloxámero que contenía aciclovir al 5% o ungüento de Zovirax®. La formulación de poloxámero que contenía aciclovir al 5% demostró una buena eficacia frente el desarrollo de lesiones cutáneas en los ratones, mientras que el ungüento de Zovirax® ejerció solamente un efecto modesto, lo que resulta de sumo interés. Sin embargo, el aciclovir incorporado en el poloxámero redujo de manera considerable el índice de letalidad (p < 0,05), pero no así el ungüento de Zovirax® (panel B). La eficacia superior de la formulación de poloxámero de aciclovir con respecto al ungüento de Zovirax® sugiere sumamente que el poloxámero podría ser un mejor vehículo para la administración tópica de este fármaco.

La Figura 18 (panel A) muestra la evolución en el tiempo del valor medio del grado o índice de lesión de los ratones de control y de los ratones tratados 3 veces al día durante 4 días cuyo tratamiento fue iniciado 5 días después de la infección con el poloxámero solo, con poloxámero que contenía aciclovir al 5% o con ungüento de Zovirax®. En los ratones que recibieron el poloxámero solo, se pudo observar una reducción del valor medio del grado o índice de lesión en comparación a los ratones infectados no tratados. El tratamiento con el ungüento de Zovirax® ejerció solamente un efecto modesto. Sin embargo, se pudo observar una reducción notable del valor medio del grado o índice de lesión en los ratones tratados con la formulación de poloxámero que contenía aciclovir al 5%, en comparación a los animales infectados no tratados. Todos los ratones tratados con el poloxámero que contenía aciclovir al 5% sobrevivieron a la infección (p < 0,001) (Figura 18, panel B), lo que resulta de sumo interés. El tratamiento con el ungüento de Zovirax® incrementó en menor grado el índice de supervivencia de los ratones infectados (p < 0,05).

Penetración en la piel in vivo de agentes antivirales

La Figura 19 muestra la distribución del foscarnet y del aciclovir en tejidos de la piel de ratones no infectados (paneles A, C, E) y de ratones infectados (Panales B, D, F) a las 24 horas de su aplicación tópica, bien sea en tampón fosfato o en la matriz de poloxámero. La distribución de ambas formulaciones de foscarnet y de la solución tamponada de aciclovir resultó similar en las tiras de cinta del estrato córneo de los ratones no infectados y de los ratones infectados. Por el contrario, la incorporación del aciclovir en el poloxámero incrementó de manera notable la cantidad del fármaco recuperado en el estrato córneo tanto de los ratones no infectados como de los ratones infectados; siendo el incremento de la penetración del fármaco más pronunciada en los ratones infectados. No se encontró ninguna cantidad o se encontraron cantidades despreciables de foscarnet en la epidermis y dermis subyacentes de los ratones no infectados sin tomar en consideración el portador utilizado para la aplicación del fármaco. La concentración de foscarnet en la epidermis y en la dermis de los ratone infectados resultó considerablemente superior cuando el fármaco fue incorporado en el poloxámero. La concentración de aciclovir era superior que la de foscarnet en la epidermis y en la dermis tanto de los ratones no infectados como de los ratones infectados sin tomar en consideración el portador utilizado. La concentración de aciclovir incorporado al poloxámero en la epidermis de los ratones no infectados era 6,1 veces superior a la del fármaco en la solución tamponada. La infección de los ratones no incrementó de manera considerable la cantidad de aciclovir en la epidermis. La concentración de aciclovir en la dermis de los ratones infectados resultó 7,9 veces superior a la de los ratones no infectados cuando el fármaco fue administrado en la matriz de poloxámero.

La Figura 20 muestra la concentración de aciclovir en el plasma de los ratones no infectados y de los ratones infectados a las 24 horas de su aplicación por vía tópica, bien sea en tampón fosfato o en la matriz de poloxámero. Se encontraron concentraciones similares de aciclovir en el plasma de los ratones no infectados para ambas formulaciones. La infección de los ratones incrementó de manera notable la concentración de aciclovir en el plasma, especialmente cuando se incorporó el fármaco en la matriz de poloxámero, alcanzando un incremento de la concentración de 4 veces. La concentración de aciclovir en el plasma de los ratones infectados resultó ser 2,1 veces superior cuando se incorporó el fármaco en la matriz de poloxámero.

Efectos del SLS sobre la eficacia de las formulaciones de poloxámero que contienen foscarnet o aciclovir frente a las lesiones cutáneas producidas por el virus HSV-1 en los ratones

también se ha evaluado la influencia del SLS sobre la eficacia de las formulaciones de poloxámero que contienen foscarnet frente a la infección del virus HSV-1 en los ratones. La Figura 21 (panel A) muestra la evolución en el tiempo del valor medio del grado o índice de lesión de los ratones infectados no tratados y de los ratones infectados tratados con una única aplicación (administrada 24 horas después de la infección) del poloxámero solo, del poloxámero que contiene foscarnet al 3%, del poloxámero que contiene SLS al 5%, o del poloxámero que contiene foscarnet al 3% + SLS al 5%. El poloxámero solo no ofreció protección alguna frente a la infección. Además, se pudo observar una modesta reducción del valor medio del grado o índice de lesión en los ratones tratados con poloxámero que contenía bien sea SLS al 5% o foscarnet al 3% en comparación a los ratones infectados no tratados. En los ratones tratados con el poloxámero que contenía foscarnet al 3% y SLS al 5%, se pudo observar una reducción notable e importante (p < 0,05) en el valor medio del grado o índice de lesión en comparación al de los ratones infectados no tratados, lo que resulta de sumo interés. En el panel B se muestran las tasas de supervivencia correspondientes para los mismos grupos de tratamiento que soportan los resultados de los valores medios del grado o índice de lesión. La propiedad mejoradora de penetración en la piel del SLS en combinación con su capacidad para modificar la infectividad viral podría explicar la eficacia mejorada de la formulación de foscarnet.

Susceptibilidad in vitro del virus HSV-1 a la combinación de foscarnet y SLS

Se investigó el efecto del SLS sobre la eficacia del foscarnet frente al virus HSV-1 (cepa F) en células Vero. En resumen, las células fueron sembradas en placas de 24 pocillos (Costar, Montreal, QC, Canadá) y fueron incubadas con la cepa F del virus HSV-1 (aproximadamente 100 PFU/ml) durante 2 horas a 37ºC para permitir la absorción del virus. Después, se retiró el virus y se recubrieron la células con 0,5 ml de agarosa Seaplaque al 0,6% (Marine Colloids, Rockland, MA) que contenía diferentes concentraciones de foscarnet, de SLS o de una combinación de ambos compuestos. Las placas fueron incubadas durante 2 días a 37ºC. A continuación se fijaron las células con formaldehído en PBS al 10% durante 20 minutos, se lavaron con agua desionizada y se tiñeron con azul de metileno al 0,05%. Se evaluó la susceptibilidad del virus por medio de la determinación de las PFU. La Figura 22 muestra la susceptibilidad de la cepa F del virus HSV-1 a la combinación de diferentes concentraciones de foscarnet y SLS sobre células Vero. Los resultados muestran que la presencia del SLS mejoró la eficacia del foscarnet frente al virus HSV-1 (cepa F) en las células Vero.

Aplicaciones potenciales

Los ejemplos que se describen a continuación en la presente memoria son aplicaciones potenciales específicas de las formulaciones tópicas de la presente invención, pero no pretenden en modo alguno limitar el alcance de la misma. Tal como se ha demostrado en los resultados indicados anteriormente, la formulaciones en forma de gel de la presente invención podrían utilizarse para la prevención de una infección de la piel y/o de la membrana mucosa y más particularmente para le prevención de virus HSV y del virus VIH. Además, los resultados de la presente invención han mostrado que las formulaciones en forma de gel de la presente invención pueden servir como un agente profiláctico para prevenir la infección accidental de los trabajadores de los servicios sanitarios. Tal como también se ha demostrado en los resultados indicados anteriormente, las formulaciones en forma de gel podrían utilizarse para el tratamiento y la prevención de la infección de las condiciones de la piel y/o de la membrana mucosa, y más particularmente para el tratamiento y la prevención de las lesiones herpéticas. Además de las aplicaciones indicadas anteriormente, las formulaciones de la presente invención pueden utilizarse en potenciales aplicaciones adicionales como i) la curación y/o el tratamiento de quemaduras y la prevención de una posterior infección y ii) el tratamiento y/o la prevención de la infección de las condiciones oftálmicas. En los ejemplos indicados anteriormente, las formulaciones en forma de gel de la presente invención pueden contener cualquier agente antimicrobiano, bactericida, virucida, quimioterapéutico, antiinflamatorio, antineoplástico, inmunomodulador o cualquier otro agente o combinación de los mismos que resulte efectivo para el tratamiento y/o la prevención de una infección y/o de las condiciones anormales de la membrana mucosa y/o de la piel producidas por cualquier patógeno y/o cualquier enfermedad.

Claims (7)

1. Formulación tópica para le prevención o el tratamiento de infecciones o para la prevención del embarazo, caracterizada porque consiste en un poloxámero 407 en una concentración de entre el 15% y el 35%, una solución tampón, y una cantidad efectiva de un agente seleccionado de entre el grupo que consiste de lauril sulfato sódico, laurilsarcosina, y una combinación de por lo menos dos agentes de entre lauril sulfato sódico, laurilsarcosina, cloruro de benzalconio, derivados del ácido graso de polioxietileno, y guanidina, en la que cuando se aplica sobre una superficie de la piel o de la mucosa de una persona, la formulación forma una capa semisólida efectiva proporcionando una barrera física y química frente un agente infeccioso o frente a un esperma.

2. Formulación tópica según la reivindicación 1, que adicionalmente incluye una cantidad efectiva de un agente antiviral.

3. Formulación tópica según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que dicho agente antiviral es foscarnet o aciclovir.

4. Formulación tópica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicho agente comprende lauril sulfato sódico y/o laurilsarcosina.

5. Formulación tópica según la reivindicación 4, en la que dicho agente es lauril sulfato sódico o laurilsarcosina.

6. Formulación tópica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dichos derivados del ácido graso del polioxietileno es estearato de polioxietileno 40.

7. Formulación tópica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el lauril sulfato sódico está presente en una concentración de entre el 1% y el 15% (p/v).