KR20010042875A - 폴록사머 및 추가의 살미생물제를 함유하는 국소용 조성물및 어플리케이터 - Google Patents

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데조르모앙드레
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Abstract

본 발명은 병원체 및/또는 질환에 의해 야기되는 점막 및/또는 피부의 감염 및/또는 이상 증상의 예방을 위한 조성물, 더욱 구체적으로는 특히 HIV와 HSV에 의한 성적 접촉에 의해 전달되는 감염을 예방하기 위한 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 피부 및/또는 점막의 감염 및/또는 이상 증상, 더욱 구체적으로는 헤르페스성 병변의 치료를 위한 조성물에도 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 건강 관리 종사자들의 우발적인 감염을 방지하기 위한 예방적 제제로도 이용될 수 있다. 본 발명 조성물은 화상의 완화 및/또는 치료 및 다른 종류의 감염을 예방하는데 이용가능하다. 본 발명은 또한 여하한 병원체 및/또는 질환에 기인하는 점막강의 여하한 감염 및/또는 이상 증상을 치료 및/또는 예방하기 위한 여하한 국소용 조성물을 균일하게 전달하기 위한 독특한 질/항문-직장용 어플리케이터의 개발에도 관한다.

Description

폴록사머 및 추가의 살미생물제를 함유하는 국소용 조성물 및 어플리케이터{TOPICAL FORMULATION COMPRISING POLOXAMERS AND FURTHER MICROBICIDES, AND AN APPLICATOR}
인체 면역 결핍 바이러스 (HIV), 헤르페스 및 기타 병원체에 의해 야기되는 성적으로 전달되는 질환 (STDs: sexually transmitted diseases)의 확산은 걷잡을 수 없는 추세에 있다. STDs의 전세계적인 발병, 질병률, 사망률은 매우 심각하다. 세계적으로 9억명 이상이 성적으로 전달된 병원균에 감염된 것으로 추산되고 있다. 매년 미국에서만 1200만명 이상이 STD의 원인균에 새롭게 감염되고 있다. 헤르페스 심플렉스 바이러스 타잎-1 (HSV-1) 및 타잎-2 (HSV-2)는 선진국에서 생식기 궤양을 일으키는 가장 흔한 원인이다. 생식기의 헤르페스 감염은 일생동안 지속되며 고통스러울 뿐만 아니라 생식기의 병변이 재발하고, 전신적인 합병증, 심리적인 질환 및 HSV의 분만시 감염에 의한 심각한 신생질환을 야기할 수 있다. 이 병원체의 생식기 이환은 대개 자신이 감염된 사실을 모르는 사람들에 의한 무증상적 바이러스 전염에 기인한다. HSV-2는 이제 12세 이상의 미국인 5명 중 1명에서 발견된다. 또한, 전세계 인구의 삼분의 일 이상이 재발적인 HSV에 감염되어 있고 따라서 생식적 감염시 바이러스를 전달할 가능성이 있는 것으로 평가되고 있다. Neisseria gonorrheae 와 Chlamydia trachomatis는 성적으로 전달되는 세균성 감염의 가장 흔한 병원균으로 알려져 있다. 전세계적으로, 연간 2500만명이 gonorrhea에, 5000만명이 chlamydia에 감염되는 것으로 추산되고 있다. 한편, 최근의 유행병 데이타에 의하면 HIV에 감염된 사람들의 수는 전세계적으로 극적으로 증가하고 있다. UN에 따르면, 역학 데이타 통계는 1997년에 매일 16,000만명이 HIV에 감염되었음을 가리키고 있다. 세계보건기구 (WHO)에 의한 최근의 (1997년말 현재) 통계자료는 세계적으로 약 3100만명이 HIV에 감염되었고 이 숫자는 2000년까지는 4000만명에 달할 것으로 추정되고 있다.
세계적으로, HIV 감염은 85-90%은 이성간의 성접촉에 의한 것으로 추정된다. 현재 HIV에 대한 백신이 없기 때문에 이 레트로바이러스의 확산을 감소시킬 수 있는 유일한 방법은 예방 수단이다. 콘돔을 지속적으로, 그리고 주의깊게 사용하면 HIV와 기타 성적으로 감염되는 병원체의 성적 접촉에 의한 전달을 효과적으로 방지할 수 있는 것으로 나타났으나, 감염가능성을 크게 줄이기 위해서는 이들은 모두 성교시에 사용되어야 한다는 위험성을 안고 있다. 아프리카에서, 가장 강력한 예방 프로그램은 단지 매춘부들에 있어서 성교시 약 70%의 비율까지 콘돔 사용률을 증가시킨데 그쳤다. 결국, 고위험군에 있어서 AIDS의 만연을 통제는데 있어서 콘돔의 사용장려에 대한 가능성에 대한 회의가 일고 있다. HIV의 이성간 전염이 중요시되는 상황에서, STD의 접촉 위험성을 여성들이 예방할 수 있다는 예방적 수단은 이 병의 확산을 방지하는 부가적인 수단이 될 수 있다. 이러한 방어수단은 또한 남성의 동성연애 관계에서도 이용될 수 있는데 이는 여성역할을 하는 파트너의 통제하에 부가적인 보호수단을 제공해줄 수 있기 때문이다. 따라서, 성교 파트너에게 요청할 필요없이, 감염으로부터 자신을 스스로 보호할 수 있도록, 콘돔 대용물로서 이용할 수 있는 보호수단을 개발하는 것이 중요하다. AIDS, 헤르페스 및 기타 STD의 원인이 되는 병원체의 초기 전달을 차단하는데 목적이 있는 예방적 수단은 물론 커다란 혜택을 가져다 줄 것이다.
안전한 국소용 살미생물제제의 개발은 HIV 예방 분야에 있어서 세계보건기구 (WHO: World Health Organization)와 미국립보건성 (NIH: National Institutes of Health)의 최우선과제이다. 국소용 살미생물제는 흔히 활성성분과 담체로 구성되어 있다. 활성 성분들은 i) 미생물 세포의 세포막, 엔벨롭 또는 캡시드 지질 또는 단백질 성분 (예컨대 계면활성제형 살정제/노녹시놀-9과 같은 살미생물제), ii) 감염에 필수적인 수용체-리간드 상호작용의 차단 (예컨대 황산화 화합물과 같은 미생물 부착 억제제), iii) 병원체의 세포내 또는 세포외 복제의 억제 (예컨대 항미생물 약물), iv) 질내 환경 변화 및 감염 위험성 감소 (예컨대 정상적인 질내 식물총 및 환경을 유지해주느 제품 및 완충제) 또는 v) 국소면역 응답 촉진제 (예컨대 면역응답 변형제)와 같이 여러가지 다양한 메카니즘을 통해 작용할 수 있다. STDs를 일으키는 병원체의 성적 접촉에 의한 전달에 대한 국소용 살미생물제제의 전체적인 효능은 전달될 활성성분의 효능과 병원체에 대한 최대 효능을 위한 자궁/경부 전 영역을 커버할 수 있는 그의 능력에 달려있다. 자궁 경부 전 영역을 커버할 수 있는 이 활성성분들의 능력은 사용되는 담체의 종류에 의존한다. 전형적인 담체의 에로는 젤, 크림, 포말, 좌약, 스폰지 및 필름을 들 수 있다.
가장 널리 사용되는 질용 조성물은 살미생물제로서 비이온계 계면활성제인 살정자제인 노녹시놀-9이다. 생체외에서, 노녹시놀-9은 HSV, HIV 및 Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae 등 기타 미생물과 같은 엔벨롭화된 바이러스를 불활성화시킨다. 그러나, 노녹시놀-9의 HIV에 대한 잠재효능은 아직까지 명확히 밝혀지지 않았고 이에 관한 임상시험 많은 결과들이 상반되고 있다. 최근 카메룬의 1292 HIV-음성 매춘부를 대상으로 행해진 잘 통제된 시험은 70 mg의 노녹시놀-9을 함유하는 질용 필름이 새로운 HIV, gonohhrea 또는 chlamydia 감염률을 감소시키지 못하였음을 보여주고 있다 (Roddy외, 1998, N. Engl. J. Med., 339:504-510). 이와 같이 노녹시놀-9 필름이 감염성 질환의 전염을 감소시키는데 실패한 것은 노녹시놀-9의 약물 전달 시스템이 자궁/경부 전 영역을 완전히 커버하지 못하였거나, 또는 미생물의 점막 독성 선호 감염의 발생에 그 원인이 있는 것으로 설명될 수 있다. HIV, 헤르페스, 또는 기타 성적으로 전염되는 병원체에 감염되는 인구가 전세계적으로 기하급수적으로 증가하기 때문에, 점막 자극을 최소화하고 질내 식물총과 pH에 최소한도로 영향을 미치면서 이러한 병원균의 성적 전염을 줄일 수 있는 적절한 제품 및/또는 전달 시스템의 개발이 시급한 실정이다.
소듐 라우릴 설페이트 (SLS: sodium lauryl sulfate)는 병원체의 막단백질을 변형시키는 황산화 계면활성제이다. 이것은 따라서 계면활성제로서의 작용과 카오트로픽제제(chaotropic agent)로서의 두가지 작용을 갖는다. 이러한 지식에 기해서, 본 발명자들은 HSV와 HIV에 대한 SLS의 잠재적인 살미생물 효과를 평가하기 위한 실험을 수행하였다. 본 발명자들의 예비시험 연구결과 SLS는 생체외에서 두가지 바이러스 모두의 감염성을 변형시킨다는 것이 명백히 입증되었다. 더욱 최근, Howett 등은 SLS가 HSV-2, HIV-1의 강력한 불활성화제라는 것도 확인한 바 있다 (Antimicrob. Agents Chemother. 43(2):314-321, 1999). 또한, 이들은 저농도의 이물을 이용한 간단한 처리 후에 SLS가 토끼, 소, 그리고 인간의 파필로마바이러스 (papillomaviruses: 엔벨롭화된 바이러스가 아님)에 대해서도 효과적임을 밝혀내었다. 그러나, 이 문헌은 이 잠재적인 살미생물제제를 전달하기 위한 담체의 용도에 대해서는 아무런 언급도 없다. 담체는 이용가능한 약물의 농도, 약물 가용성의 기간 및 조성물에 의한 점막 커버범위 정도등, 침입 병원균에 대한 방어수단을 제공하는 핵심적인 인자들에 영향을 미치기 때문에 담체의 선택은 매우 중요하다. 살미생물제 후보로서 관심을 끄는 또 다른 카테고리는 숙주 세포 수용체와 미생물 사이의 상호작용을 차단하는, 황산화된 화합물과 같은 미생물 부착 억제제이다. 공지의 미생물 부착 억제제의 예로는 덱스트란 설페이트 (DS), 생체외에서 HIV와 헤르페스바이러스의 감염을 억제하는 것으로 알려진 다황산화 탄수화물을 들 수 있다.
본 발명자들은 질, 경부 또는 항문-직장 점막에 적용가능하며 성적 접촉에 의한 병원균의 전염을 방지하는데 효과적인 젤 조성물을 최근 개발하였다. 이 젤 조성물의 한가지 기념비적인 특징은 열 가역적인 (thermoreversible) 특성이다. 즉 실온에서는 액상으로 있다가 체온에서는 젤 상태로 전이하는데 이것은 질 또는 항문-직장 상피와 같이 거칠은 생물학적 표면에 적용될 경우, 젤이 최소의 불규칙적 조직 내로 침투하여 감염물질에 대해 우수한 물리적 장벽을 형성하여야만 하는데 있어서 매우 커다란 중요성을 갖는다. 젤 조성물은 FDA와 NIH가 중요시하는 다음과 같은 핵심적인 특성을 갖는다: i) 무색, 무향이며 얼룩이 지지 않고, ii) 액상으로 적용되므로 질/경부 전 영역을 커버하고, iii) 남성용 라텍스 콘돔과 병용가능하며, iv) 수류 (aqueous flow)에 의한 용출에 내성을 갖고, v) 건강한 절의 pH (pH 4.0-4.5)와 유사한 pH를 가지며, vi) 극한 및 극서 조건하에서도 소망되는 물성을 유지하고, vii) 생체외에서 정상적인 질내 식물총, 특히 Lactobacillus spp에 영향을 미치지 않는다.
본 발명자들의 국제공개 (WO97/42962)는 그 자체로 병원체에 물리적 장벽을 형성할 수 있는 필름-형성 성분을 함유하는 조성물의 용도를 개시하고 있다. 폴록사머 (poloxamers)와 같은 열가역적인 젤이 특히 이러한 용도에 바람직하다. 필름-형성 조성물은 또한 살미생물제, 살정자제 또는 기타의 약물을 추가로 함유할 수 있으며, 그 선택은 불활성화시키거나 치료하거자 하는 병원체, 생물 또는 질환에 의존한다. 따라서, 이 조성물은 물리적으로 효과가 있으며, 임의로 투여 장소에서 지속적인 약물 방출 시스템으로서 이용가능할 뿐만 아니라 화학적 또는 약학적 장벽으로서도 유용하다. 이 조성물은 성적 접촉에 의해 전달되는 질병의 예방 뿐만 아니라, 감염, 암, 염증 또는 약학적 처치를 요하는 여하한 질병 또는 증상을 치료하는데도 이용될 수 있도록 의도된 것이다. 덧붙여, 상기 공개공보는 이 조성물이 노녹시놀-9과 같은 강력한 살정자제/살미생물제의 독성을 감소시켜줌을 기재하고 있다. 그러나, 이 공보는 국소용 조성물내로 혼입시킬 화학물질 후보로서 SLS가 가능함을 특별하게 언급하고 있지는 않다.
HSV-1과 HSV-2는 피부, 말초신경계 및 중추신경계를 비롯한 신경피부 조직을 주로 감염시키는 신경지향적인 바이러스이다. 점막 또는 피부 표면은 흔히 일차로 감염되는 부위이다. 재발성 라비알리스 헤르페그 (labialis herpes)와 생식기 헤르페즈는 각각 HSV-1 및 HSV-2 감염과 관련된 가장 흔한 임상적 악화증상을 나타낸다. 재발성은 자연발생적이지만 물리적 또는 정신적 스트레스, 고열, 자외선 노출, 조직 손상 및 면역억압과도 연관되어 있다. 면역경쟁적인 개체예 있어서는 경미한 질환일지 모르나, HSV 감염은 많은 문제를 안고있는 질환이고, 특히, 빈번한 이력이 있는 환자에게는 더욱 그러하다. 면역 요법 또는 진행중의 질환에 의해 위태로운 환자들은 HSV 감염 위험성이 더 높다. 신장 및 심장 이식 수혜자는 감염 위험이 증가된 것으로 입증되었다. 또한, AIDS의 걷잡을 수 없는 확산은 면역무방비 상태의 숙주에 있어서 HSV 임상 질환의 심각성을 강화시키고 있다.
현재 이용가능한 국소용 항바이러스 치료법은 증상을 나타내는 재발성 헤르페스에 대해서만 특정적으로 한정된 효능을 나타낸다. 헤르페스성 점막피부 병변의 진행에 이와 같은 국소용 조성물이 한정된 효능만을 갖는 것은 피부에 침투하는 약물의 능력이 미약하기 때문일 수 있다. 각질층 또는 딱딱한 층은 대부분의 물질이 피부내로 침투하는데 장벽이 되고 있다. 이러한 층은 콜레스테롤, 유리 지방산 및 세라마이드로 구성된 이중층 지질 매트릭스 내에 심어진 각질세포로 구성된다. 결국, 피부 침투 촉진제의 사용은 국소용 제약 조성물의 피부 침투성을 증진시키는 간편한 전략을 나타낸다고 할 수 있다.
SLS는 상피 지질의 유동성을 증가시킴으로써 피부 침투 촉진 특성을 갖는 게면활성제이다. SLS는 그의 피부 침투 촉진 특성과 계면활성제 및 카오트로픽 특성을 통한 바이러스 감염성을 변형시키는 능력이 복합되어 국소용 제약 조성물의 효능을 한층 더 증진시킬 수 있다. 또한, 그의 카오트로픽 특성으로 인해, 기타 단순한 계면활성제에 비해 SLS는 정자, 세균, 곰팡이 및 바이러스에 대해 보다 넓은 활성 스펙트럼을 가질 수 있다.
폴록사머는 수많은 약학적 응용예에 광범위하게 이용되며 독성이 없기 때문에 지속적인 약물 전달계에 사용하는데도 적합하다. 폴록사머는 피부학적 응용예에서도 적절한 매트릭스가 된다. 실제로, 액상 형태로 적용시, 폴록사머는 최소의 불규칙적인 점막 및/또는 피부로 침투함으로써 보다 우수한 표면 커버력을 가질 수 있다. 또한, 이러한 폴록사머에 의해 형성된 망상구조는 약물 활성을 연장시키는 지속적인 약물 방출 시스템으로서 작용할 수도 있다.
발명의 요약
본 발명의 첫번째 목적은 바람직하게는 젤, 크림 또는 연고 형태로 점막 또는 피부 표면에 적용되는 필름-형성 성분을 포함하는 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 젤 조성물은 점막 및/또는 피부의 감염 및/또는 비정상적인 증상을 예방하기 위해 질, 자궁경부, 항문-직장, 눈, 입, 코 또는 피부와 같은 여러 종류의 점막이나 피부를 코팅하는데 이용된다. 바람직하게는, 액상으로 적용되어 표면위에 퍼져서 체표면의 온도가 되면 반-고체 코팅을 형성하는, 열가역적인 젤을 사용하는 것이 좋다. 더욱 바람직하게는, 이 열가역적인 젤이 폴록사머 407로 구성된 것이 좋다. 폴록사민과 같은 유사 폴리머도 이용가능하다. 상기 조성물은 또한 표적 세포, 조직 또는 미생물에서 개체 세포막, 엔벨롭 또는 캡시드 지질 또는 단백질 구성성분과 간섭할 수 있는 제제를 함유한다. 필름-형성 성분과 상기 제제의 이와 같은 조합에 의해 조성물의 효능이 증가하고 독성이 감소될 수 있다.
특정 구체예에서, 이 제제는 미생물의 외부 단백질이 숙주 수용체에 결합하는 것을 방해할 수 있다. 더욱 특정적인 구체예에서, 이 제제는 미생물 부착 억제제이거나, 또는 상기 미생물 외부 단백질의 고유성을 파괴시킬 수 있는 계면활성제 또는 카오트로픽 제제이다. 보다 특수한 구체예에서, 미생물 부착 억제제는 덱스트란 설페이트이고; 계면활성제는 소듐 라우릴 설페이트, 벤잘코늄 클로라ㅣㅇ드, 라우로일 사르코신, 폴리옥시에틸렌 지방 아실 유도체 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방 아실 에스테르 유도체 중에서 선택되며; 카오트로픽 제제는 소듐 라우릴 설페이트 또는 구아니딘이다. 가장 특정적인 구체예에서, 상기 제제는 SLS이고, 이 후자는 게면활성제 및 카오트로픽 제제 및 잠재적인 미생물 부착 억제제로서의 많은 특성을 가짐에 따라 선택가능한 화학물질 후보가 되는 것이다. SLS 단독으로도 미생물에 효과가 있다. SLS 효능은 본 발명 조성물 내로 혼합되면 더욱 증가된다. 따라서, SLS 또는 이와 동등한 물질을 단독으로 또는 상술한 필름-형성 성분과 조합 사용하여 미생물 감염을 막을 수 있을 것으로 생각된다. SLS는 단독으로 또는 상기 조성물과 어떠한 농도로도 혼합사용될 수 있다. 바람직한 농도는 약 0.1-25% (w/v), 더욱 바람직하게는 약 1-15% (w/v) 농도이다. 폴록사머 407은 어떠한 적절한 농도로도 사용가능하나, 바람직한 농도는 약 5-50% (w/v), 더욱 바람직하게는 약 15-35% (w/v)이다. 최종 조성물의 물리적 특성은 그 안에 함유하고자 하는 약물, 조성물을 조성하는데 이용된 pH 및 용질, 그리고 주어진 목적에 알맞은 점도에 따라 크게 좌우된다. 상기 조성물은 감염 및/또는 비정상적인 점막 또는 피부 조건을 예방하는데 효과적인 약물을 추가로 함유할 수 있다. 질용 조성물은 그의 필름-형성 성분 및 미생물 파괴 성분때문에 물리적 및 화학적 장벽을 함유한다. 감염물질에 대한 활성과 함께, 이 조성물들은 피임용으로도 효과적이다. SLS는 조성물 중 노녹시놀-9을 유리하게 대체할 수 있다. 특히 정자, 엔벨롭화되거나 되지 않은 방러스에 대ㅎ 광범위한 활성 스펙트럼을 갖는 SLS는 본 발명 조성물의 사용되도록 선택가능한 후보이다. 본 발명의 젤은 점막 및/또는 피부의 감염 및/또는 비정상적인 증상을 예방하는데 효과적인 약물을 함유할 수 있다. 본 발명의 목적에 있어서, "약물"이라는 용어는 모든 항미생물제, 살균제, 살바이러스제, 화학요법제, 소염제, 항신생조직제, 면역조절제, 그리고 점막 및/또는 피부의 감염을 예방하는데 효과적인 이들 제제의 여하한 조합 또는 기타의 제제를 총망라하는 것이다. "약물"이라는 용어는 또한 감염으로부터 보호해줄 수 있는 면역 응답을 자극해질 수 있는 항원 또는 시토카인도 칭한다. 이러한 약물은 젤, 리포좀, 나노파티클 또는 시클로덱스트린과 같이, 캡슐화에 의해 감염예방을 증진시킬 수 있는 약물 담체 내에 혼입될 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 점막의 감염 및/또는 비정상적인 증상의 치료 및/또는 예방용 국소용 조성물을 질 및/또는 항문-직장으로 전달하는데 사용될 수 있는 독특한 어플리케이트를 제공하는 것이다. 이 어플리케이터는 후술되는 바와 같은 동일한 요구 특성을 부여하기 위해 여러가지 방식으로 고안될 수 있다. 이러한 몇가지 개념의 예도 다음에 상세히 설명되며 이러한 예는 본 발ㄹ명 어플리케이터의 일반적인 디자인 가능성의 일부를 설명하고자 의도된 것으로서, 결코 본 발명이 이들 예시된 범위로 한정되는 것은 아니다. 어플리케이터의 최종 형상과 외관은 본 발명 명세서에 주어진 실시예마다 다를 수 있다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명 조성물은 바이러스 질환을 치료하는데 사용되며 약물로서 아시클로버 (acyclovir), 포스카넷 (foscarnet)과 같은 항바이러스제, 또는 기타 여하한 항미생물제를 적절한 농도로 단독으로 또는 조합하여 추가로 포함할 수 잇다. 가장 바람직한 구체예에서, 이 조성물은 폴록사머 407을 포함하며 0.5 내지 5% (w/v) 농도의 포스카넷을 함유한다. 또 다른 가장 바람직한 구체예에서, 이 조성물은 폴록사머 407과 0.5 내지 5% (w/v)의 아시클로버를 함유한다. 또 다른 가장 바람직한 구체예에서, 이 조성물은 폴록사머 407로 되고 SLS를 1 내지 10 % 농도범위로, 그리고 포스카넷 또느 ㄴ아시클로버를 상기 농도범위로 함유한다.
본 발명의 한가지 목적은 점막 및/또는 피부의 감염을 예방하기 위한 새로운 국소용 조성물을 개발하는 것으로, 더욱 구체적으로는 성절 접촉에 의해 전달되는 감염, 특히 HIV와 헤르페스에 기인하는 감염을 예방하기 위한 것이다. 살미생물제 또는 기타의 약물을 리포좀, 나노파티클 또는 시클로덱스트린과 같은 약물 담체 내로 캡슐화시키거나 또는 유리형태로 하여 젤 조성물 내로 트래핑시킬 수 있다. 이러한 살미생물 젤은 국소적인 살미생물 작용을 연장시킬 수 있고, 따라서 혼입된 활성 약제의 전신 부작용을 감소시키고 국소적인 자극을 제거할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 병원체의 성적 접촉에 의한 전달을 최대한 막기 위해 질 전체 (측면으로의 전달) 및 경부 (입구 쪽으로의 전달)에 내용물을 균일하게 분포시킬 수 있게 해주는, 질에의 적용을 위한 독특한 어플리케이터를 개발하는 것이다. 따라서, 본 발명자들은 그 내용물을 질 내부로, 그리고 멀리 경부까지 약 360°로 분포시킬 수 있게 해주는 독특한 어플리케이터를 고안하였는데, 이 어플리케이터는 기존의 질용 어플리케이터가 단지 입구쪽 (오직 경부 부분만)에만 내용물을 전달하는 것에 비하면 엄청나게 진보된 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 점막 감염, 특히, HSV 감염에 의해 야기되는 점막 감염에 대한 화학적 또는 약학적 활성제제의 효능을 증진시킬 수 있는 국소용 약제 조성물을 개발하는데 있다. 적절한 매트릭스 및/또는 약물 담체 중에 혼입된 약물은 그 효능이 증가됨으로 해서 투여 간격을 줄일 수 있고 따라서 환자의 삶의 질을 향상시킬 수 있다. 본 발명은 또한 화상의 치료 및/또는 아물음 뿐만 아니라 그에 따른 잠재적인 감염을 방지하기 위한 국소용 조성물을 개발하는데도 그 목적이 있다.
이하에 특정 구체예와 첨부된 도면을 참조로 본 발명을 더욱 상세히 설명하나, 이는 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하고자 하는 목적일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 필름-형성 성분 및 활성 성분을 함유하는 조성물, 특히 국소용 조성물에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 여하한 발병원인, 특히 병원체에 기인하는, 점막 또는 피부를 통해 전달되거나 이에 관련된 질환을 예방 또는 치료하기 위한 국소용 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 점막강 (mucosal cavity)을 통해 전달되거나 이에 관련된 질환을 예방 또는 치료하거나, 또는 정자 또는 미생물과 같은 위래물질의 침입에 의한 임신을 방지하기 위한 국소용 조성물을 균일하게 전달하기 위한 어플리케이터에 관한 것이다.
도 1은 HSV-1 (균주 F)를 37℃에서 1시간 동안 여러가지 농도의 SLS (패널 A) 또는 DS (패널 B)와 함께 1시간 동안 전처리시키거나 (●) 또는 전처리 시키지 않고 SLS 또는 DS를 첨가한 후에 (○) Vero 세포에 감염시킨 경우를 나타낸 도면이다. 플라크 형성 단위 (PFU)는 대조군에 대한 백분율로서 표현한다. 결과를 4회의 독립적인 실험을 거쳐 평균치 ± SD로 나타내었다.
도 2는 Vero 세포 중에서 HSV-1 (균주 F)에 대한 여러가지 농도의 SLS (패널 A) 또는 DS (패널 B)의 효과를 나타낸 도면이다. 플라크 형성 단위 (PFU)는 대조군에 대한 백분율로서 표현하였다. 결과를 4회읠 독립적인 실험으로부터 얻어진 평균치 ± SD로 표시하였다.
도 3은 HIV-1 (균주 NL4-3)을 500μM의 SLS로 37℃에서 1시간 동안 전차리한 경우 1G5 세포에 대한 그의 감염 효과를 나타낸 것이다. 값은 3회 측정값의 평균치 ± SD로서 나타내었다.
도 4는 50μM (패널 B), 75μM (패널 C), 및 100μM (패널 D)의 SLS를 이용하여 37℃에서 1시간동안 전처리시킨 HSV-1 (균주 F)에 의해 감염된 Vero 세포의 전자현미경 사진이다. SLS 부재하에 HSV-1 (균주 F)에 의해 감염된 세포들을 대조군 (패널 A)으로서 사용하였다. 배율 70,000X.
도 5는 Vero 세포중에서 12.5, 25, 50, 75 및 100μM의 SLS로 37℃에서 1시간 동안 전처리된 HSV-1 (균주 F)의 당단백질 D의 정량화를 나타낸 도면이다. EMEM + 2% FBS 중 HSV-1 (균주 F)로 감염된 세포들을 대조군으로서 사용하였다. 값은 대조군에 대한 하이브리다이제이션 시그날 강도의 백분율로서 표현한 것이다.
도 6은 6.25(●), 25(○) 및 100(▲)μM의 SLS로 37℃에서 1시간 전처리된 HSV-2 (균주 22)에 의해 비강 감염된 시간 경과에 따른 마우스 생존률을 나타낸 것이다. 미처리 바이러스에 의해 감염된 마우스를 대조군 (□)으로서 사용하였다. 결과를 1그룹 당 8마리의 동물의 평균치로서 나타내었다.
도 7은 여러가지 농도의 (6.25(●), 25(○) 및 100(▲)μM) SLS (패널 A) 또는 상이한 농도 (0.25(●), 1(○) 및 10(▲)μM)의 DS (패널 B)에 의해 37℃에서 1시간 전처리된 HSV-1 (균주 F)으로 피부 감염된 마우스의 시간 경과에 따른 평균 병변 점수를 나타낸 도면이다. 미처리 바이러스로 감염된 마우스를 대조군(□)으로서 사용하였다. 결과를 1그룹 당 6마리의 동물의 평균치로서 나타내었다.
도 8은 감염 5분전 (○) 또는 1시간전 (△)에 폴록사머로 마우스를 전처리시키거나 또는 감염 5분전 (●) 또는 1시간 전 (▲) 5% SLS를 함유하는 폴록사머 조성물로 전처리시킨 뒤 HSV-1에 의해 감염된 마우스의 시간 경과에 따른 평균 병변 점수를 나타낸 것이다. 감염된 미처리 마우스를 대조군 (□)으로서 나타내었다. 결과를 1그룹 당 6마리의 동물의 평균치로서 나타내었다.
도 9는 감염 5분 전에 젤 단독 (■,▲,●)으로 전처리된 HSV-2 (균주 333)에 의해 질내 감염된 마우스의 시간 경과에 다른 평균 병변 점수 (패널 A) 및 생존률 (패널 B)을 나타낸 것이다. 감염된 미처리 마우스를 대조군 (□,△,○)으로서 사용하였다. 결과를 1그룹 당 8마리의 동물의 평균치로서 나타내었다.
도 10은 감염 5분 전 2.5% SLS (★) 또는 젤 + 2.5% SLS (●)로 전처리한 HSV-2 (균주 333)으로 질내 감염시킨 마우스의 시간 경과에 따른 생존률을 도시한 것이다. 감염된 미처리 마우스를 대조군 (□)으로서 사용하였다. 결과는 1그룹 당 8마리 동물의 평균치로서 나타내었다.
도 11은 감염 5분 전에 5% 폴리옥시에틸렌 40 스테아레이트 (●), 젤 + 5% 구아니딘 (○), 젤 + 2.5% 라우로일 사르코신 (▲), 젤 + 2.5% 벤잘코늄 클로라이드 (△) 또는 젤 + 5% tween 80(◆)으로 전처리된 HSV-2 (균주 333)에 의해 질내 감염된 마우스의 시간경과에 따른 생존률을 나타낸 도면이다. 감염된 미처리 마우스를 대조군 (□)으로서 사용하였다. 결과는 1그룹 당 7 내지 10마리의 동물의 평균치로 나타낸 것이다.
도 12a는 본 발명의 한가지 측면에 따른 어플리케이터의 제 1 태양을 도시한 사시도이다.
도 12b는 도 12a의 어플리케이터의 크기를 인치로 표시한 측면도이다.
도 12c는 도 12a의 어플리케이터의 구성 요소들의 분해도이다.
도 12d는 도 12a의 어플리케이터의 내벽의 기부 (proximal)의 외부표면을 상세하게 도시한 사시도이다.
도 13a는 본 발명의 한 측면에 따른 어플리케이터의 제 2 태양을 도시한 사시도이다.
도 13b는 도 13a의 어플리케이터의 삽입 위치와 작동 위치 두가지 모두에서의 크기를 인치로 표시한 측면도이다.
도 13c는 도 13a의 어플리케이터의 분해도이다.
도 14a는 본 발명의 한가지 측면에 따른 어플리케이터의 제 3 태양의 사시도로서; 삽입위치의 어플리케이터를 그린 것이다.
도 14b는 도 14a의 어플리케이터를 작동 위치에서 도시한 사시도이다.
도 14c는 도 14a의 어플리케이터의 삽입 위치에서의 내부 상세를 도시한 측면도이다.
도 14d는 도 14a의 어플리케이터의 작동 위치에서의 내부 상세를 도시한 측면도이다.
도 15a는 본 발명의 한 측면에 대한 어플리케이터의 제 4 태양의 사시도이다.
도 15b는 도 15a의 어플리케이터의 분해도이다.
도 15c는 도 15a의 어플리케이터의 내벽의 측면도로서 크기를 인치로 표시한 것이다.
도 15d는 도 15a의 어플리케이터의 피스톤/용기의 측면도로서 크기를 인치로 표시한 것이다.
도 15e는 도 15a의 어플리케이터의 일부분의 측단면도로서 어플리케이터 몸체의 외벽 및 내벽과 관련한 피스톤/용기의 배열을 상세하게 도시한 것이다.
도 16은 HSV-1에 의해 피부감염된 다음 폴록사머 단독 (■), 수용액 중 0.5% 포스카르넷 (○), 또는 0.5% 포스카르넷을 함유하는 폴록사머 (●)로 국소처리된 제모 마우스의 시간 경과에 따른 평균 병변 점수 (패널 A) 및 생존률 (패널 B)을 나타낸 도면이다. 감염된 미처리 마우스를 대조군 (□)으로서 나타내었다. 감염된지 24시간 후부터 치료를 개시하였고 4일간 매일 3회 반복시켰다. 표시된 값은 1그룹 당 4마리 동물의 평균치이다.
도 17은 HSV-1 (균주 F)에 의해 피부감염되고 감염된지 24시간 후에 5% 아시클로버를 함유하는 폴록사머 (●) 또는 Zovirax연고를 함유하는 폴록사머 (○) 중 어느 한가지가 적용된 제모 마우스의 시간 경과에 따르 평균 병변 점수 (패널 A)와 생존률 (패널 B)을 나타낸 것이다. 감염된 미처리 마우스 (□)를 대조군으로서 나타내었다. 나타낸 값은 1그룹 당 7 내지 10마리의 평균치이다.
도 18은 HSV-1 (균주 F)에 의해 피하 감염된 후 폴록사머 단독 (■), 5% 아시클로버를 함유하는 폴록사머 (●), 또는 Zovirax연고 (○)로 치료된 제모 마우스의 시간 경과에 따른 평균 병변 점수 (패널 A)와 생존률 (패널 B)를 도시한 그림이다. 감염된 미처리 마우스 (□)를 대조군으로서 사용하였다. 감염 5일 후에 치료를 개시하여 4일간 하루 3회씩 반복치료하였다. 나타낸 값은 1그룹 당 7 내지 10마리의 평균치이다.
도 19는 감염되지 않은 피부조직 (패널 A, C, E) 및 감염된 피부조직 (패널 B, D, F)에 있어서 포스카르넷 (△,▲)과 아시클로버 (○,●)를 포스페이트 완충액 (색칠되지 않은 기호)과 함께 또는 폴록사머 (색칠된 기호)와 함께 국소적용한지 24시간 후의 이들 포스카르넷과 아시클로버의 분포를 도시한 도면이다. 패널 A 및 B는 각질 스트립(stratum corneum strips)에서 포스카르넷과 아시클로버의 분포를 보여준다. 패널 C와 D는 표피(epidermis) 중의 포스카르넷과 아시클로버의 농도를 나타내는 반면 패널 E와 F는 진피(dermis) 중의 포스카르넷과 아시클로버의 농도를 나타낸다. 나타낸 값들은 1그룹당 4 내지 6 마리의 동물에 대한 평균치이다.
도 20은 감염되지 않은 마우스와 감염된 마우스에게 아시클로버를 포스페이트 완충액과 함께 (색칠하지 않은 막대) 또는 폴록사머와 함께 (색칠된 막대) 투여한지 24시간 후의 혈장 중의 아시클로버의 농도를 나타낸 도면이다. 나타낸 값들은 1그룹 당 4 내지 6 마리의 동물에 대한 평균치이다.
도 21은 HSV-1 (균주 F)에 의해 피하 감염된 후 폴록사머 단독 (■), 3% 포스카르넷을 함유하는 폴록사머(○), 5% SLS를 함유하는 폴록사머 (●) 또는 3% 포스카르넷 + 5% SLS를 함유하는 폴록사머 (△)로 치료된 제모 마우스의 시간 경과에 따른 평균 병변 점수 (패널 A)와 생존률 (패널 B)를 도시한 그림이다. 감염된 미처리 마우스 (□)를 대조군으로서 사용하였다. 결과는 1그룹 당 5마리 동물에 대한 평균치이다.
도 22는 Vero 세포에 있어서 포스카르넷과 SLS의 여러가지 농도 조합에 대한 HSV-1 (균주 F)의 감작성을 도시한 그림이다. 나타낸 값은 3회 측정치의 평균치 ± SD이다.
젤 형성
폴록사머 407은 폴리옥시에틸렌과 폴리옥시프로필렌과의 중량비가 7:3인 블록 코폴리머로서 평균 분자량은 12500이다. 이 블록 코폴리머의 한가지 중요한 특징은 열가역적인 젤을 형성할 수 있는 능력이 있다는 것이다. 저온에서 액상으로 있다가 체온에서 젤 상태로 변하는 이러한 상전이 (상전이 온도는 부분적으로는 젤의 농도, 이온강도 및 혼합된 용질에 따라 달라진다)에 의해 국소 적용을 비롯한 여러가지 의약적인 적용이 가능하다. 먼저 점막에 유체상태로 국소투여되고 난 후 적용도중 피부 및/또는 점막의 불규칙상태로 보다 잘 침투될 수 있게 하고 일단 젤이 체온에 도달하면 보다 장기간 지속될 수 있도록 하기 위해 젤 형성이 이루어져야 한다는 점에서 이러한 특징은 매우 중요한 것이다. 본 발명의 젤 조성물은 독성과 자극이 극히 낮기 때문에, 국소용 약물 전달계에 응용하는데 유리하다. 본 발명의 젤 조성물의 제조방법을 이하에 상세히 설명한다. 본 발명은 여하한 적절한 농도의 폴록사머 407, 더욱 특정하게는 약 10 내지 35% w/w 농도의 폴록사머 407의 젤 조성물을 포함한다. 본 발명은 또한 기타 폴록사머, 폴록사민 또는 화학물질을 비롯하여 여하한 기타 필름-형성 성분, 젤, 크림, 연고 또는 열가역적인 물질도 포괄한다.
약물
병원체 및/또는 여하한 질환에 의해 야기되는 점막 및/또는 피부의 감염 및/또는 비정상적 증상의 예방 또는 치료에 효과적인 여하한 항미생물제, 항균제, 항바이러스제, 화학요법제, 항염제, 항신생물질제, 면역조절제 또는 이들의 여하한 조합이 본 발명 범위에 속한다. 병원체의 막을 파열시킬 수 있는 여하한 계면활성제, 약물 및/또는 약물 담체가 점막 및/또는 피부에 침투하는 것을 증진시키는 여하한 피부침투 촉진제, 표적 세포내로 병원체가 유입되는 것을 예방하는 여하한 미생물 부착 억제제, 병원체에 의한 감염을 방지해줄 면역 응답을 촉진할 수 있는 여하한 시토카인 또는 항원이 모두 본 발명 범위에 속한다. 본 발명은 또한 국소용 조성물 및/또는 약물의 여하한 조합도 포함한다.
감염 예방을 위한 본 발명 젤 조성물을 비롯한 실시예
다음의 실시예는 여하한 병원체 및/또는 질환에 의해 야기되는 점막 및/또는 피부의 감염 및/또는 비정상적 증상을 예방하는데 효과적일 수 있는 젤 조성물의 제조방법을 입증하기 위해 제시된 것으로, 본 발명의 범위가 이 범위로 한정되는 것은 아니다.
젤 조성물의 제조
젤 조성물은 원하는 농도가 얻어지도록 적절한 용량의 증류수, 완충액 또는 기타 적절한 수용액을 폴록사머 407에 첨가하여 제조한다. 이어서 적절한 양의 약물을 폴록사머 분말 또는 용액에 첨가하여 소망 농도가 되도록 한다. 젤 조성물의 pH는 본 발명 조성물로 커버하고자 하는 각각의 표적 조직의 요구사항에 맞도록 조정할 수 있다. 예컨대, 질 점막을 커버하는데 조성물을 이용헐 경우에는, pH가 약 4.0~4.5인 산성 용액을 사용한다. 폴리머의 백분율은 따라서 액상에서 고상으로 적절한 전이온도가 얻어지도록 조정할 수 있다. 이러한 조정은 당업자에게 잘 알려져있다.
본 발명이 비록 특정 경우에 한정하여 설명되어도, 여하한 필름 형성 성무ㅊ 및/또는 약물 및/또는 리포좀 (또는 다른 약물 담체) 또는 여하한 이들의 조합이 이들 국소용 조성물의 개발을 위한 잠재적인 후보군으로 될 수 있고 본 발명의 범위에 속한다. 본 발명 조성물은 또한 필름 형성 성분 및/또는 약물 및/또는 리포좀 (또는 기타 약물 담체) 또는 이들 물질을 적절한 농도로 조합한 것을 모두 포함한다.
SLS 또는 DS로 전처리된 헤르페스 바이러스에 의한 생체외 감염
여러가지 헤르페스 바이러스 균주를 SLS 또는 DS로 전처리시킨 경우 민감 세포에 대한 이들의 바이러스 감염성을 평가하였다. 간략히 말해서, 세포들을 24 웰-플레이트 (Costar, Montreal, QC, Canada)에 접종하였다. 감염시키기에 앞서, 바이러스를 배양배지 또는 포스페이트 완충염수 (PBS)에 현탁시키거나 또는 PBS 중 여러 농도으 SLS와 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 점성이 생기면 플레이트를 원심분리함으로써 (20℃에서 45분간 750 x g) 바이러스가 흡착되도록 세포들을 바이러스 현탁액과 함께 인큐베이션시켰다. 바이러스를 제거하고 난 후, 적절한 배양배지 중에 준비해 둔 0.5ml의 0.6% 아가로스 Seaplaque (Marine Colloids, Rockland, MA)를 세포 시트 위에 오버레이하였다. 이 플레이트를 37℃에서 2일간 인큐베이션시켰다. 세포들을 PBS 중 10% 포름알데히드로 20분간 고정시킨 다음, 탈이온수로 세척하고 0.05% 메틸렌 블루로 염색시켰다. 바이러스 감염성을 플라크 형성 단위 (PFU: plaque forming units)를 측정함으로써 평가하였다.
표 1은 여러가지 HSV-1 및 HSV-2 균주를 37℃에서 SLS로 1시간 동안 전처리시키자 농도-의존 방식으로 이들의 Vero 세포에 대한 감염성이 감소되었음을 보여준다. HSV-1 (균주 F)의 감염성은 이 바이러스 입자들을 25μM의 SLS로 전처리시키자 21%까지 감소되었다. 모든 HSV-2의 감염성은 25μM의 SLS와 함께 프리인큐베이션시키자 50 내지 70%로 감소하였다. 바이러스들을 50μM의 SLS로 전처리시키자 시험된 모든 균주에서 감염성이 완전히 상실된 것으로 나타났다. Vero 세포를 HSV-1 (균주 F)에 감염시키기 전에 6.25 내지 100μM의 농도 범위의 SLS로 37℃에서 1시간 프리인큐베이션시키는 것은 바이러스의 감염성을 상실시키지 않았다 (결과 나타내지 않음). 이러한 결과는 SLS는 바이러스에 직접 작용하고 세포에는 작용하지 않음을 시사하는 것이다.
도 1은 여러가지 농도의 SLS 또는 DS로 전처리시킨 HSV-1 (균주 F)의 Vero 세포에 대한 그의 감염효과를 도시한 것이다. Vero 세포를 감염시킨 후 Vero 세포에 SLS로 직접 첨가하자, 바이러스 감염성의 상실효과는 동일 농도의 SLS로 37℃에서 1시간 동안 전처리시킨 바이러스를 이용한 경우 얻어진 결과에 비해 약했다. 전처리 하자, 바이러스를 전처리시키지 않은 경우 75μM인 것에 비해 20μM 농도에서 바이러스 감염성이 50% 상실된 것으로 나타났다. 뿐만 아니라, 50μM SLS와 함께 프리인큐메이션시킨 후에는 바이러스 감염성이 완전히 억제되었지만, 전처리하지 않은 경우에는 심지어 100μM에서도 억제가 완전치 않았다. 마찬가지로, SLS로 HSV-2 (균주 333)을 전처리하자 이 균주의 감염성에도 영향이 미쳤다 (데이타 나타내지 않음). 한편, DS는 바이러스를 DS로 전처리했는지의 여부와 무관하게 바이러스의 감염성을 감소시킨다. 이 경우, 약 1nM 농도에서 바이러스 감염성이 50% 상실된 것으로 관찰되었다.
도 1 및 표 1에 사용된 것과 비슷한 농도의 SLS 또는 DS에 37℃에서 1시간 동안 노출된 Vero 세포의 생존가능성도 MTS 테스트를 이용하여 시험하였다. 사용된 농도 범위에서는 어떠한 세포독성 징후도 입증되지 않았다 (데이타 나타내지 않음).
도 2는 Vero 세포에 있어서 HSV-1 (균주 F)에 대한 여러 농도의 SLS (패널 A) 또는 DS (패널 B)의 효능을 도시한 것이다. 요약하면, 세포들을 37℃에서 2시간 동안 바이러스로 감염시켰다. 이어서, 상등액을 제거하고 세포에 0.6% 아가로스 Seaplaque 및 소망 농도의 SLS 또는 DS를 함유하는 0.5ml의 EMEM + 2% FBS를 오버레이하였다. 플레이트를 37℃에서 2일간 5% CO2분위기 하에 인큐베이션시켰다. 세포를 PBS 중 10% 포름알데히드로 20분간 고정시킨 다음 탈이온수로 세척하고 0.05% 메틸렌 블루로 염색하였다. PFU 측정에 이어 바이러스 감염성을 평가하였다. 평가결과 SLS와 DS 두가지 모두 농도-의존 방식으로 유사하게 바이러스 복제를 감소시킨 것으로 나타났으며 SLS와 DS는 각각 100μM와 20nM에서 완전한 효능을 나타내었다. 어떠한 메카니즘에도 구속됨이 없이, 상기 겨과는 SLS가 미생물 부착 억제 효과를 가질 수 있다는 것을 시사하는 것이다.
SLS로 전처리된 HIV-1의 생체외 감염성
HIV-1SF2의 조절 하에 루시페라제 유전자로 만들어진 2개의 안정한 통합 구조물을 지니는 Jurkat E6-1 유도체인 1G5 세포에 대한, SLS로 전처리된 HIV-1 (균주 NL4-3)의 감염 효과도 평가하였다. 요약해서, 감염에 앞서 바이러스를 배양배지 또는 500μM SLS와 함께 37℃에서 1시간 인큐베이션시켰다. 이어서 세포 (1x105세포/웰)를 HIV-1 균주 NL4-3 (p24 10ng)과 함께 37℃에서 2시간동안 5% CO2분위기 하에서 인큐베이션시켰다. 그 후, 세포들을 세척하고 200μl의 완전 배양 배지 중에 재현탁시킨 다음, 96-웰의 평평한 바닥으로된 조직 배양 플레이트 (Microtest III, Falcon; Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ)로 옮겼다. 37℃에서 48시간 인큐베이션시킨 후, 세포를 용균시키고, 냉동-해동 사이클을 반복시켜 마이크로플레이트 발광계 (MLX; Dynex Technologies, Chantilly, VA)를 이용하여 루시페라제 활성을 모니터링하였다. 이들 일련의 실험으로부터 얻어진 결과는 37℃에서 1시간 동안 500μM의 SLS로 HIV-1 (균주 NL4-3)을 전처리시키자 1G5 세포에 대한 HIV-1 감염성이 거의 완벽하게 억제되었음을 명백히 보여준다 (도 3).
SLS로 전처리된 HSV-1 (균주 F)에 감염된 Vero 세포의 전자현미경 관찰
37℃에서 1시간 동안 여러 SLS 농도 (50, 75, 및 100μM)로 전처리된 HSV-1 (균주 F)의 모습을 전자현미경을 이용하여 Vero 세포 중에서 관찰하였다. 요약하면, 세포 (80-90% 컨플루언트)들을 37℃에서 48시간 동안 CO2분위기 하에서 바이러스 (14ml 중 약 70 PFU/ml)로 감염시켰다. 세포들을 접시로부터 긁어내어 배지에 재현탁시켰다. 세포들을 원심분리시키고 (4℃에서 10분간 515 x g) 상등액을 따라낸 다음 세포를 약 500μl 배지에 재현탁시켰다. 세포들을 에펜도르프 뉴브에 옮기고 원심분리시켰다 (4℃에서 5분간 10,000 x g). 약 200μl의 20% 소 혈청 알부민 (BSA)에 펠렛을 재현탁시켰다. 혼합물에 몇방울의 25% 글루타르알데히드을 첨가하고 샘플을 아이스배쓰에 즉시 넣어 BSA를 중합시켰다. 이어서 펠렛을 1 mm3크기의 샘플로 절단하고 이어서 PBS 중 2% 글루타르알데히드에서 1시간, PBS 중 1% OsO4로 1시간, 이어서 PBS 중 0.1% 탄닌산 중에서 30분간 고정시켰다. 샘플들을 일반공정에 따라 탈수시키고 Epon에 심었다. 섹션 (약 75nm 두께)을 구리 그리드 (200 메쉬) 상에 장착시켰다. 시편들을 우라닐 아세테이트로 염색하고, 구연산 납으로 카운터 염색시킨 다음 JEOL 1010 전자현미경 (JEOL Canada Inc., St-Hubert, QC, Canada)으로 관찰하였다.
도 4 (패널 A)는 Vero 세포의 핵 중 바이러스의 정상적인 모습을 나타낸다. 바이러스 입자들은 육각형 모양의 캡시드를 가지며, 전자가 조밀한 DNA 중심을 함유한다. 엔벨롭에 의해 둘러싸인 뉴클레오캡시드에 의해 형성된 완전한 바이러스 입자들도 대부분 세포의 세포질에서 발견되었다. 50 (패널 B), 75 (패널 C), 및 100 (패널 D)μN의 SLS로 전처리된 바이러스에 의해 감염된 Vero 세포에 있어서, 바이러스 입자들은 핵에서는 재생될 수 있었으나, 세포질에서는 그렇지 못하였다. 핵에서는 성숙한 뉴클레오캡시드가 관찰되지 않았으나 바이러스 입자들은 불연속적으로 축적된 전자-조밀 물질들을 함유하는 캡시드에 의해 구성되었다. SLS로 전처리된 바이러스에 의해 감염된 세포의 핵에서 발견된 속이 빈 캡시드의 수는 전처리에 이용된 약물의 농도가 증가할수록 감소하였다. 10μM SLS로 전처리된 바이러스에 의해 감염된 세포에서, 핵 중 빈 캡시드를 갖는 세포들은 단지 몇개만이 검색되었다. 이들 결과는 SLS 존재 하에 헤르페스 바이러스의 감염성 상실을 설명해 줄 수 있는 것이다.
HSV 당단백질 D 유전자의 정량
감염된 세포에서 바이러스 DNA가 존재하는지를 알아보기 위해 SLS로 전처리된 HSV-1 (균주 F)의 당단백질 D 유전자의 정량화를 Vero 세포에서 평가하였다. 요약하면 HSV-1 (균주 F)을 37℃에서 1시간 동안 EMEM +2% FBS 중 여러 농도의 SLS (12.5, 25, 50, 74 및 100μM)로 전처리시켰다. Vero 세포 (80-90% 컨플루언트)를 5% CO2분위기 하 37℃에서 48시간 동안 바이러스 (20ml 중 100PFU/ml)로 감염시켰다. 배양배지를 제거하고 세포 시트를 1X HBSS로 2회 세척하였다. 세포들을 접시로부터 긁어내어 EMEM + 2% FBS에 재현탁시켰다. 표준 페놀/클로로포름 공정을 이용하여 총 DNA를 추출하였다. Burton 공정을 이용하여 총 DNA를 정량하였다. 이 연구에 이용된 프로브는 다음 프라이머:
를 이용하여 PCR에 의해 생산한 HSV-2 (균주 333)의 당단백질 D의 일부에 해당하였으며, 무작위 프라이밍에 의해 [32P]-표지시켰다. 0.25M Na2HPO4(오르토인산을 이용 pH 6.8) 및 7% SDS 중, 65℃에서 하이브리다이제이션을 수행하였다. 40mM Na2HPO4(오르토인산을 이용하여 pH 6.8)와 1% SDS를 이용하여 65℃에서 20분간, 이어서 25℃에서 20분간 세척하였다.
도 5 (패널 A)는 Vero 세포 중 여러 농도의 SLS로 전처리시킨 HSV-1의 당단백질 D 유전자의 정량화를 나타낸 것이다. 48시간 인큐베이션시킨 후, 세포들을 수집하고 총 DNA를 추출하였다. 패널 A에서는 BglII-절단된 DNA 앨리쿼트 (325ng)를 0.8% 아가로스 젤에 적용시켜 나일론 막에 옮긴 다음 당단백질 D 프로브와 함께 하이브리다이즈시켰다. 패널 B는 AlphaImager를 이용하여 오토라디오그램의 주사밀도계에 의해 얻어진 HSV-1 DNA 농도의 정량화 측정을 도시한다. 대조군에 비해, 12.5, 25, 및 50μM의 SLS로 전처리된 HSV-1 (균주 F)로 감염된 세포에서는 바ㅣㅇ러스의 당단백질 D 유전자의 발현시 이렇다할 변동이 관찰되지 않았다. 오토라디오그램의 주사밀도계에 의해 얻어진 HSV-1 DNA 수준의 정량적 측정도 유사하였다 (패널 B). 그러나, 바이러스를 더 높은 농도의 SLS (75 및 100μM)로 전처리시키자, DNA 수준이 각각 대조군의 65.1%와 34.9%로 감소하는 것과 함께 당단백질 D 유전자의 발현이 현저히 감소되는 것으로 나타났다. 이러한 데이타는 SLS가 뉴클레오캡시드의 성숙화 속도를 둔화시키거나 또는 캡시드 껍데기내로 DNA가 캡슐화되는 것을 방해함으로써 바이러스 뉴클레오캡시드의 성숙을 방해할 수 있다는 것을 암시하는 것이다.
SLS로 전처리된 헤르페스 바이러스의 생체내 감염성 (비강 모델)
바이러스 감염성에 미치는 SLS의 HSV-2 (균주 22)의 전처리 효과를 쥐의 비강 감염 모델을 이용하여 평가하였다. 요약하면, 4주령의 암컷 Balb/c 마우스 (Charles River Breeding Laboratories Inc., St-Constant, QC, Canada)를 이 연구에 이용하였다. 감염시키기 전에, HSV-2 (균주 22)를 37℃에서 1시간 동안 PBS 또는 여러 농도의 SLS (6.25, 25 또는 100μM)와 함께 인큐베이션시켜 최종적으로 2,000 PFU/20μl의 바이러스 접종물이 되도록 하였다. 마우스들을 Aerrane(Isoflurane, USP; Janssen, North York, ON, Canada)을 이용하여 살짝 마취시키고 바이러스 현탁액 (20μl 총 부피)을 마우스의 외부 왼쪽 콧구멍에 적용하였다. 이어서 마우스를 우리 안에 되돌려보내고 매일 매일 생존여부를 평가하였다.
도 6은 미처리 바이러스에 감염된 모든 마우스가 제 9일 및 제 11일 사이에 뇌염으로 죽었음을 보여준다. 이와 대조적으로, 6.25 및 25μM SLS에 의해 전처리된 바이러스 접종물로 감염된 마우스의 67%는 감염으로부터 살아났다. 가장 관심을 끄는 것은, 100μM SLS로 전처리된 바이러스 현탁액에 의해 감염된 마우스는 모두 생존하였을 뿐만 아니라 어떠한 질병 징후도 입증되지 않았다는 것이다.
SLS 또는 DS로 전처리된 헤르페스 바이러스의 생체내 감염성 (피부 모델)
바이러스 감염성에 미치는 SLS에 의한 HSV-1 (균주 F)의 전처리 효과도 쥐의 피부 감염 모델을 이용하여 평가하였다. 5-6주령의 암컷 제모 마우스 (SKH1; Charles River Breeding Laboratories Inc., St-Constant, QC, Canada)를 이 실험에 사용하였다. 감염시키기 전에, HSV (균주 F)를 37℃에서 1시간 동안 PBS, 6.25, 25 또는 100μM의 SLS 또는 0.25, 1, 또는 10nM의 DS와 함께 인큐베이션시켜 3 x 105PFU/50μl의 바이러스 접종물을 얻었다. 70mg/kg 케타민 염산염 (Rogarsetic*주사 USP; Rogar/STB Inc. Montreal, QC, Canada) 및 11.5 mg/kg의 자일라진 (Rompun; Miles Canada Inc., Etobicoke, ON, Canada)를 함유하는 혼합물을 복강내로 주사하여 마우스를 마취시켰다. 좌측 허리 피부 주변의 몸통 측부에 바이러스를 접종하였다. 곧추 세운 27-게이지의 바늘을 이용하여 십자가 해치형태로 피부를 6회 흠집을 내었다. 바이러스 현탁액 (50μl)을 상처난 부분에 붓고 EMEM + 2% FBS 또는 SLS 또는 DS 용액을 적신 면봉 어플리케이터로 10 내지 15초간 문질렀다. 외과수술용 테잎으로 마우스의 몸통위에 유지된 원추형 쿠션으로 상처난 부분을 보호하였다. 약물의 흡수를 방지하기 위해 사용 전에 원추형 쿠션의 틈의 다공성 내벽을 티슈 접착제로 불침투성으로 만들었다. 원추형 쿠션의 틈을 외과수술용 테잎으로도 막았다. 이어서 마우스를 우리 안으로 돌려보내고 하루 2회 관찰하였다.
도 7은 37℃에서 1시간 동안 여러 농도의 SLS 또는 DS로 전처리된 HSV-1 (균주 F)에 의해 피부감염된 제모 마우스의 시간의 경과에 따른 평균 병변 점수를 보여준다. 병변 점수의 평가는 표 2에 제시된 기준에 따라 수행하였다. 감염된 미처리 마우스에 있어서는, 감염 후 처음 4일 동안에는 이렇다할 병리학적 피부감염의 증상이 보이지 않았으며 단지 상처만 선명하게 남아있었다. 제 5일에, 접종 부위로부터 멀리 떨어진 부위에 작은 포낭 형태로 헤르페스성 피부 병변이 몇몇 마우스에서 나타나기 시작했다. 제 6일, 거의 모든 미처리 마우스에 있어서 척추부터 복부 중간선에 이르기까지 폭 4-5mm의 밴드형의 조스터-형 감염과 유사한 감염된 진피마디 (dermatome) 헤르페스성 피부 병변이 생겼다. 최대의 평균 병변 점수는 제 8일에 관찰되었다. 몇몇 마우스에 있어서 피부 병변의 자연발생적인 퇴행으로 인해 평균 병변 점수는 제 11일부터 제 15일 사이에 감소하였다. 6.25 및 25μM SLS로 전처리된 바이러스에 의해 감염된 마우스들은 평균 병변 점수가 크게 감소된 것으로 입증되지는 않았다. 그러나, 100μM SLS로 전처리된 바이러스에 의해 감염된 마우스는 어떠한 피부 병변의 징후도 입증되지 않았다. 특히 중요한 것은, 100μM SLS에 의해 전처리된 바이러스로 감염된 모든 마우스들이 감염으로부터 생존했다는 것이다 (데이타 나타내지 않음). 한편, 0.25 nM DS로 전처리된 바이러스에 의해 감염된 마우스는 평균 병변 점수가 부분적으로 감소된 반면 1 또는 10nM DS로 전처리된 바이러스에 의해 감염된 마우스에서는 헤르페스성 병변의 진행에 대해 더 나은 보호 효과가 관찰되었다.
헤르페스성 피부 병변의 평가에 이용된 기준
점수 병변의 외관
0 육안관찰가능한 감염증상 없음
1 접종 부위, 상처 부위에만 육안관찰가능하게 감염됨
2 팽윤, 부스럼 및 부종을 동반하여, 접종 부위에만 감염됨
3 접종 부위로부터 떨어진 부분에서 형성된 불연속적인 병변과 함께 접종 부위에 감염됨
4 아직 융합되진 않으나 몸통 절반에서 발진이 육안관찰됨
5 발진이 융합되었으나 아직까지는 괴사 또는 괴양화되지 않음
6 괴사 또는 궤양화된 완전한 발진, 뒷다리가 마비되고, 고창증(bloating), 사망
SLS를 함유 또는 함유하지 않은 폴록사머 조성물의 생체내 예방 효과
(피부 모델)
마우스에 있어서 피부 병변의 진행을 예방하는 폴록사머 단독 및 5% SLS를 함유하는 폴록사머의 효과도 평가하였다. 암컷 제모 마우스 (5-6주령)를 이 연구에 이용하였다. 요약하면, 70mg/kg 케타민 염산염과 11.5mg/kg 자일라진을 함유하는 혼합물을 복강내 주사하여 마우스를 마취시켰다. 좌측 허리 피부 부근의 몸통 측부에 조성물을 국소 적용시켰다. 적용한지 5분 및 1시간 후, 바이러스 접종물 한방울 (3.15 x 108PFU/ml)을 피부에 떨어뜨리고, 건강관리 종사자에게 발생할 수 있는 사고를 모방하도록 상기 바이러스 접종물이 떨어진 부위에 27G 바늘을 이용하여 상처를 냈다. 이 모델에서, 바이러스 접종물은 거의 모든 마우스에서 완전한 조스터형 (zosteriform) 발진이 얻어질 수 있을만큼 높을 필요가 있다. 그러나, 감염과 관련된 사망률은 낮았으며 치료 효과를 평가하는 기준으로서는 이용될 수 없었다. 외과수술용 테잎으로 마우스 몸통위에 부착시켜둔 원추형 쿠션으로 상처부위를 보호하였다. 원추형 쿠션의 틈을 외과수술용 테잎으로도 막았다. 이어서 마우스를 우리 안으로 되돌려보내고 하루 두번씩 관찰하였다.
도 8은 감염된 미처리 마우스 및 HSV-1 (균주 F)로 피부감염시키기 5분 또는 1시간 전에 폴록사머 단독 또는 5% SLS를 함유하는 폴록사머로 전처리된 마우스의 시간경과에 따른 평균 병변 점수를 나타낸 것이다. 이 결과는 감염 5분 또는 1시간 전 젤 단독으로 전처리된 마우스는 피부 병변의 진행에 대해 가장 약한 보호효과를 나타내었음을 보여준다. 가장 흥미로운 것은, 감염 5분 또는 1시간 전에, 5% SLS를 함유하는 폴록사머로 전처리된 마우스에 있어서는, 피부 병변의 진행에 대해 완전한 보호효과가 관찰되었다는 것이다. 이 결과들은 병원체에 의한 감염을 방지하는 예방적 접근방식으로서 본 발명 조성물이 커다란 잠재성을 가짐을 보여주는 것이다. 이러한 도구는 실제로 건강관리 종사자들의 우발적인 감염에 대한 보호수단을 제공해줄 수 있다.
젤 조성물의 헤르페스 바이러스 감염에 대한 생체내 보호효능
(질내 모델)
HSV-2의 생식기 전달을 방지하기 위한 젤 조성물의 효능을 쥐의 질내 감여 모델에서 평가하였다. 요약하면, 4주령 암컷 Balb/c 마우스를 이 연구에 이용하였다. 헤르페스에 대한 마우스의 민감성을 증진시키기 위해, HSV-2를 접종하기 7일전과 1일 전에 프로제스테론 (Depo-Provera) 2.5mg을 각각의 마우스에게 피하투여하였다. 끝이 얇은 칼슘 알지네이트 약솜으로 질을 닦아 낸 후, 마취된 마우스에 2.4 x 107pfu/ml의 HSV-2 (균주 333) 5μl를 접종하였다. 헤르페스 감염을 차단하는 젤 조성물의 효능을 측정하기 위해, 접종하기 수분 전에 질 내로 피펫 끝에 15μl의 젤을 묻혀 투입하였다. 출혈이 일어나지 않도록 주의하면서 성교시와 유사한 자극을 주기 위해 피펫 끝을 몇차례 왕복시켰다.
도 9는 HSV-2 (균주 333) 감염에 앞서 젤 단독으로 질내를 전처리시킨 마우스 및 감염된 미처리 마우스의 생존률과 평균 병변점수를 나타낸 것이다.
감염 4일 후, 감염된 미처리 동물들에서 회음부 부종 및 발적이 일어났고 6일 내지 12일까지는, 대부분의 마우스가 뇌염으로 죽었다. 특히 중요한 것은, 젤 단독으로 전처리된 모든 마우스가 감염으로부터 생존하였고 감염 후 16일까지 어떠한 질병 징후도 나타내지 않았다는 것이다. 따라서 젤이 단독으로 존재해도 HSV-2 감염을 피할 수 있었다.
도 10은 HSV-2 (균주 333) 감염에 앞서 2.5% SLS 또는 2.5% SLS를 함유하는 젤을 이용하여 질내를 전처리시킨 마우스 및 감염된 미처리 마우스의 생존률을 나타낸 것이다. 감염 4일 후, 감염된 미처리 동물은 제 6 내지 12일까지 회음부 부종과 발적을 나타내었고, 이들 대부분은 뇌염으로 죽었다. 특히 중요한 것은, 2.5% SLS 단독 또는 2.5% SLS를 함유하는 젤로 전처리된 모든 마우스는 감염으로부터 생존하였고 2ㅔ 16일까지 어떠한 후감염 질병 증상을 나타내지 않았다는 것이다. 이러한 결과는 본 발명의 젤 조성물이 헤르페스, HIV 및 기타 STD를 일으키는 병원체의 성적 접촉에 의한 전달을 감소시키는 획기적인 예방 수단이 될 수 있음을 명백히 가리키는 것이다.
도 11은 HSV-2 (균주 333)에 의한 감염 전에 여러가지 화합물을 함유하는 젤로 질내를 전처리한 마우스와 처리하지 않은 감염 마우스의 생존률을 나타낸 것이다. 이 화합물들은 계면활성 특성을 갖거나 갖지 않는 다른 황산화 및 비-황산화 화합물 중에서 선택하였다. 이들은 또한 다양한 이온 (음이온 및 양이온) 및 비이온 화합물이다. 이러한 스크리닝 접근방식은 다른 잠재적인 후보 살미생물제를 발견하기 위한 것이다. 그 결과 2.5% 라우로일 사르코신을 함유하는 젤 조성물이 감염을 완전히 예방하는 것으로 나타났다 (100% 생존). 한편, 2.%% 벤잘코늄 클로라이드, 5% 폴리옥시에틸렌 40 스테아레이트 및 5% 구아니딘을 함유하는 젤 조성물은 각각 60, 60 및 30%의 생존률을 나타내었다. 본 발명의 예비결과들은 라우로일 사르코신이 살미생물제 후보로서 우수한 가능성을 가지고 있음을 보여주었으며 현재 이에 관해 연구를 진행하고 있다. 그러나, 벤잘코늄 클로라이드, 폴리옥시에틸렌 40 스테아레이트 및 구아니딘과 같이 부분적인 살미생물 능력을 나타낸 다른 화합물 역시 보다 나은 효능을 위해 그의 농도를 최적화시킴으로써 더욱 개발의 여지가 있다. 한편, 이러한 화합물의 조합 역시 최적의 효능을 제공할 수 있다. 어떠한 이론에 구애됨이 없이, 계면활성제와 카오트로픽 제제의 조합은 심지어 SLS보다도 더 우수한 효능을 제공할 수 있을 것으로 예상된다. 이들은 잠재적인 살미생물제의 특정한 예일 뿐 이들로 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
질/항문-직장에 조성물을 전달하기 위한 어플리케이터의 고안
상기한 바와 같이, 본 발명의 한가지 목적은 여하한 병원체 및/또는 질병에 기인하는 점막 및/또는 피부의 감염 및/또는 비정상적인 증상을 예방하기 위한 조성물을 제공하는 것이다. 질에의 적용을 위해서는, 내용물을 질 전체 (측면으로의 전달) 및 경부 (입구쪽으로의 전달)에 최대의 효능으로 균일하게 전달해주는 어플리케이터를 이용하여 국소용 조성물을 투여하여야 한다. 따라서, 본 발명자들은 그 내용물을 질 내부로, 그리고 멀리 경부까지 약 360°로 분포시킬 수 있게 해주는 독특한 어플리케이터를 고안하였는데, 이 어플리케이터는 기존의 질용 어플리케이터가 단지 입구쪽 (경부 부분)에만 내용물을 전달하는 것에 비하면 엄청나게 진보된 것이다. 본 발명의 독특한 어플리케이터가 국소용 조성물을 전달하기 위해 요구되는 여러가지 목적과 중요 특성에는 다음이 포함된다:
a) 액상 또는 젤상의 국소용 조성물을 질/경부 전체에 균일하게 분포시킬 것
b) 그 내용물을 효과적이고 신속하게 전달할 것
c) 온도 변화(-40 ~ 60℃)에 내성이 있을 것
d) 젤 조성물과 어플리케이터의 폴리머가 상용가능할 것
e) 살균하기 쉬울 것
f) 새지 않을 것
g) 작동과 삽입이 용이할 것
h) 운반시 진동, 내용물의 팽창 및 파괴에 내성이 있을 것
i) 주위 환경에 존재하는 물질 및/또는 조건과 잘 어울릴 수 있을 것
기술적 배경 및 전략
STDs를 일으키는 병원체의 성적 접촉에 의한 전달을 차단하기 위한 조성물의 효능은 i) 전달하고자 하는 조성물의 특성 및 ii) 질/경부 전체 영역을 커버할 수 있는 그의 능력에 달려 있다. 다른 물질과 달리, 본 발명자들은 질/경부 점막의 가장 작은 불규칙 대역에 조성물을 효과적으로 침투시킬 수 있는 액상 형태로 전달되는 열가역적 특성을 갖는 독특한 조성물을 발명하였다. 최대의 예방을 위해, 이러한 조성물은 질/경부를 완전히 커버해야 한다. 그러나, 기존의 질 어플리케이터는 그 첨단에 독특한 구멍이 있어서 내용물이 질을 제외한 경부 영역에만 전달됨으로 해서 그의 효능에 한계가 있었다. 본 발명의 독특한 질 어플리케이터는 복수개의 구멍 및/또는 슬롯 (첨단부 및 측부에)을 가지므로 해서, 본 발명 조성물 또는 STDs, 암, 또는 기타의 질환을 치료 또는 예방하기 위한 기타의 여하한 필름-형성 성분, 젤, 크림, 연고 및/또는 항미생물제, 살균제, 살바이러스제, 화학요법제 항염제, 항신생물질제 또는 면역조절제, 계면활성제, 미생물 부착 억제제, 피부침투 촉진제, 시토카인, 항원, 백신, 또는 이들의 조합물을 질과 경부 양쪽 모두를 최대의 방어효과를 갖도록 균일하게 커버할 수 있도록 전달할 수 있다. 문헌조사 결과 시판중인 어떠한 어플리케이터나 그와 유사한 제품도 내용물을 질/경부 전체 영역에 전달할 수 있는 디자인을 갖지 못하는 것으로 나타났다.
본 발명의 어플리케이터의 특징
기존의 모든 질 어플리케이터는 젤/크림 형태의 조성물을 전달하는데, 이러한 형태는 질/경부 전체를 커버하지 못한다는 단점이 있다. 이와 반대로, 본 발명 조성물은 실온에서 액상이고 체온에서 젤화하는 중요한 열가역적 특성을 갖느다. 액상으로 전달될 때, 본 발명 조성물은 질/경부 전체를 커버할 수 있고 이것은 질과 경부 점막의 가장 작은 불규칙 부분을 통해 침투한다. 본 발명의 독특한 조성물 또는 STDs, 암, 또는 기타의 질환을 치료 또는 예방하기 위한 기타의 여하한 필름-형성 성분, 젤, 크림, 연고 및/또는 항미생물제, 살균제, 살바이러스제, 화학요법제 항염제, 항신생물질제 또는 면역조절제, 계면활성제, 미생물 부착 억제제, 피부침투 촉진제, 시토카인, 항원, 백신, 또는 이들의 조합물에 있어서, 본 발명자들은 STDs를 일으키는 병원체에 대해 최대의 보호효과를 제공하기 위한 핵심적인 관건으로서 질/경부 전체를 측면 뿐만 아니라 말단까지 커버할 수 있도록 내용물을 전달할 수 있는 독특한 어플리케이터가 필요하였다. 이러한 어플리케이터의 중요한 특징을 다음에 설명한다 (표 3도 참조할 것):
a) 액상 또는 젤상의 국소용 조성물을 질/경부 전체에 균일하게 분포시킬 것
어플리케이터는 조성물을 균일하게 전달하여야 하고 첨단부와 측부의 구멍을 통해 내용물을 전달함으로써 질/경부 전 영역을 커버할 수 있어야 한다. 뿐만 아니라, 어플리케이터는 경부와 질 두가지 모두가 충분한 양으로 커버될 수 있도록 내용물을 전달하여야 한다. 이렇게 함으로써 STDs를 일으키는 병원체에 대에 최대의 방어효과를 거둘 수 있다.
b) 그 내용물을 효과적이고 신속하게 전달할 것
대부분의 기존의 어플리케이터는 그 내용물의 일부만을 전달함으로 해서 조성물의 효능에 한게가 있었다. 따라서, 어플리케이터는 용기에 잔여물을 남김이 없이 내용물 전체를 전달하거나 또는 모든 표적 점막을 충분히 커버하는데 요구되는 양의 내용물을 전달할 수 있어야만 한다. 이것은 용기의 디자인과 내용물을 방출시키기 위해 그에 가해지는 손가락 압력의 평균 힘을 계산함으로써 달성할 수 있을 것이다. 전달시점은 내용물이 액상, 반점성, 또는 젤상으로 전달되는지에 따라 달라질 것이다. 그러나, 어플리케이터의 내용물의 전달은 신속히 이루어져야 한다.
c) 온도 변화(-40 ~ 60℃)에 내성이 있을 것
보관 및 유통 환경이 지역마다 큰 차이가 날 수 있기 때문에 어플리케이터는 온도변화에 대한 내성을 가져야만 한다. 따라서 어플리케이터와 조성물이 -40 ~ 60℃ 범위의 온도조건하에서도 변치않고 유지될 수 있도록 고안되어야 한다.
d) 젤 조성물과 어플리케이터의 폴리머가 상용가능할 것
질 어플리케이터를 개발하는데 사용된 폴리머는 젤 조성물의 특성 (안정성, 점성 변수, 비-세포독성, 병원체 차단 효능등)에 영향을 미쳐서는 안된다.
e) 살균하기 쉬울 것
어플리케이터의 디자인과 그 재질은 적절한 방법에 의해 살균할 수 있어야 하며 어플리케이터 자체 또는 그의 내용물의 특성에 변화를 일으켜서는 안된다.
f) 새지 않을 것
어플리케이터는 보관 및 유통 조건하에서 누출이 방지되어야 한다. 서로서로 포장이 겹쳐 쌓이더라도, 어플리케이터로부터 내용물이 새어나와서는 안된다.
g) 작동과 삽입이 용이할 것
어플리케이터는 사용자에게 친숙하고, 작동이 용이해야하며, 사용자에게 어떠한 불쾌감을 유발하는 일 없이 삽입이 용이해야 한다 또한, 사용자에게 친화력이 있어야 한다.
h) 운반시 진동, 내용물의 팽창 및 파괴에 내성이 있을 것
어플리케이터는 사용자가 떨어뜨리거나 운반시 조작 이상에 의해 떨어져도 깨지지 않아야 한다. 또한 내용물이 팽창되어서도 안된다. 뿐만 아니라, 어플리케이터는 안정해야 하며 운반시 진동에도 잘 견뎌야 한다.
i) 주위 환경에 존재하는 물질 및/또는 조건과 잘 어울릴 수 있을 것
어플리케이터는 주변환경에 존재하는 물질 및/또는 다양한 조건에 잘 견딜 수 있어야 한다. 예컨대, 질의 산성 pH, 질 분비물 또는 기타 유사한 조건에 의해 영향을 받아서는 안된다.
어플리케이터에 요구되는 기능 및 표적 가치
번호 기능 설명 표적 가치
1 조성물을 액상, 반-점성, 젤상, 크림, 연고 또는 여하한 필름-형성 성분으로서 분포시킴 일단 도입되면 조성물을 방출 및 확산시킨다. 약 3-5 ml
2 조성물을 균일하게 분포시킴 조성물을 질/경부 전체를 커버하도록 분산시킨다. 자궁내 약 360° 및 경부 약 360°에 걸쳐 분산시킬 것
3 조성물을 액상, 반-점성, 젤상, 크림, 연고 또는 여하한 필름-형성 성분으로서 함유함 어플리케이터는 용기를 갖는다. 주입된 용량의 최소 함량
4 누출-방지될 것 포장이 새서도 안되고 최초 사용 후에 새도 안된다. 0 ml
5 조작 용이할 것 어플리케이터는 다루기 쉽고 사용자에게 친숙해야 한다. 자원자로부터 우호적인 의견 (7/10)
6 삽입 용이할 것 어플리케이터는 고통없이, 최소의 저항감도 없이 삽입가능해야 한다. 평균 직경 약 0.5 인치 (12.5mm)
7 질/경부에의 전달 어플리케이의 길이는 경부에 닿을 수 있을 정도여야 한다 용기와 손잡이를 포함해서 평균 길이 약 4.5 인치 (115 mm)
8 떨어져도 안 깨질것 어플리케이터는 깨져서는 안되고 손에서 떨어뜨려도 내용물이 누출되면 안된다. 약 60 인치 (1.5m) 높이에서 떨어뜨릴 경우
9 주변 조건에 잘 견딜것 어플리케이터는 그 내용물, 질 분비물 또는 포장재질에 영향받으면 안된다. 열가소성 수지 제조시 의 데이타
10 독성이 없고 주위 환경에 영향을 미치지 않을 것 조성물의 품질에 영향을 미치지 않을 것; 또한 주변환경에도 영향을 미치지 말것 열가소성 수지 제조 및 국소용 조성물 소유자로부터의 데이타
11 운반시 진동에 잘 견딜것 어플리케이터와 용기는 파괴되어서는 안되고 유통 후 정상작동해야 한다. 입증되어야 할 기준
12 효과적인 것 잘 작동해야 한다 (내용물을 절단하고 실수없이 고르게 분포시켜야 한다) 자원자로부터 호의적인 의견 (9/10)
13 신속히 전달할 것 내용물이 어플리케이터로부터 신속히 분출되어야 한다. 약 5초
14 온도변화에 내성이 있을 것 어플리케이터는 온도변화에 영향받으면 안된다. -40℃ 내지 +60℃
15 물로 헹굴 수 있을 것 떨어뜨릴 경우 세정가능해야 한다. 열가소성 수지 제조시 데이타
16 살균가능할 것 선택된 적절한 방법 입증되어야 할 기준
다음의 예는 어플리케이터의 일반적인 디자인 가능성의 몇가지를 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다. 어플리케이터의 최종 외관은 본문에 주어진 실시예들마다 상이할 수 있음에 주목해야 한다. 이러한 디자인은 항문-직장 적용에 적합하게 변형될 수도 있다.
도 12-15는 본 발명의 한가지 측면에 따른 어플리케이터의 특정예를 도시한 것이다. 다음의 설명은 이들 도면에 도시된 네가지 구체예에 따른 어플리케이터에 대한 것이다.
일반적으로 말해서, 본 발명의 어플리케이터는 상기한 여하한 액상, 반-점성, 젤, 크림, 연고 또는 기타 필름-형성 성분 형태로서의 여하한 조성물을 점막강 내로, 어플리케이터에 잔류하는 내용물의 잔량을 최소화하면서 균일하게 전달하기 위해 고안된 것이다. 본 발명의 어플리케이터는 기부(proximal) 말단과 원위부(distal) 말단을 갖는 길죽하게 뻗어있는 몸통을 갖는다. 기부 말단은 환자에게 접근할 수 있는 점막강의 외부에 근접하게 위치한다. 몸통은 환자의 점막강내로 전달될 상술한 여하한 조성물을 균일하게 분포시키기 위한 일련의 슬롯과 구멍으로 만들어진 외부 천공을 갖는다. 어플리케이터를 삽입하여 점막강 내로 조성물의 방출시, 용기 내에 함유되어 있던 조성물은 천공을 통해 방출되기 전에, 적은 용량의 확산 채널을 통해 이동하여야 한다. 실제로, 이로 인해 조성물의 신속한 방출과 방출 후 어플리케이터에 잔류하는 조성물의 양을 최소화하는 것이 가능하다.
확산 채널은 몸체의 경계를 정하는 2개의 벽 사이의 빈 공간에 의해 만들어진다. 첫번째 벽은 몸체의외벽으로서 구멍을 포함한다. 두번째의 천공되지 ㅇ낳은 내벽은 첫번째 벽 내부에 제공되어 확산 채널을 만든다. 내벽은 또한 첫번째 벽 내로 미끌어져 들어갈 수 있는 크기와 형태를 갖는다. 한편, 첫번째 벽보다 크기가 작은 내벽은, 몸체 외벽과 일체로 성형될 수도 있다.
내벽은 조성물이 확산 채널로 유입될수 있게 해주는 유입구 말단인 기부 말단을 갖는다. 확산 채널의 유입구 말단 내로 조성물을 지향시킬 수 있도록 지시부재 (directing element) 제공될 수 있다. 지시 부재는 따라서 조성물이 확산 채널 이외의 공간에 유입되는 것을 방지해준다
조성물을 저장할 수 있는 용기도 어플리케이터의 일부분이다. 용기 (reservoir)는 어플리케이터의 몸체 부근 또는 몸체 내부에 위치할 수 있다. 용기는 방출 부재에 작동적으로 연결된다. 방출 요소는 그 자체가 연결 부재를 통해 몸체의 기부 말단에 열결되어 있다. 방출 부재는 환자에 의해 작동된다. 압축, 밀고 당기는 움직임을 적용시키면, 방출 부재는 용기의 내용물을 방출시키고, 이것은 확산 채널의 기부 유입 말단과 접촉하게 된다. 따라서 조성물은 확산채널 내부를 통해 천공을 통해 방출됨으로써 점막 강으로 이동하게 된다.
다시 첨부된 도 12a ~ 12d를 참고하여, 본 발명의 한가지 측면에 따른 첫번째 구체예를 설명한다. 도 12b는 이 첫번째 어플리케이터의 분해도이다. 어플리케이터 몸체의 외벽 (1)은 외벽의 원위부 말단에서 간섭받음이 없이, 몸체 한쪽으로부터 반대쪽을 통해 뻗어있는 하나의 단일 슬롯으로 만들어진 천공 (2) (오직 하나만 도시함)을 나타낸다. 따라서, 긴 슬롯은 측면의 원위부 천공의 경계를 그어준다. 이 구체예에서, 용기와 방출 부재는 압축가능한 소재로 만들어진 하나의 단일 부재(3)이다. 조성물은 손가락으로 노름으로써 그 내용물을 분사시키는 용기 내에 함유되어 있다. 용기는 압착(4)에 대한 저항성이 낮은 막에 의해 막혀있다. 방출부재인 용기는 스크류될 수 있거나 스냅-인 (snap-in) 연결부재에 의해 대표되는 연결 부재 (5)를 통해 몸체의 기부 말단에 연결되어 있다. 이 특정 구체예에서, 몸체의 내벽(6)은 외벽보다 크기가 작은 분리 부재로서 제공된다. 내벽의 기부 말단은 외벽의 기부 말단에 형성된 연결 부재 상에 얹혀진 돌출된 칼라로 막혀있다. 내벽의 기부 부분은 내벽에 의해 형성된 내강을 밀봉하는 밀봉 부재(7)를 포함한다. 밀봉 부재는 디스크 형태일 수 있다. 한편, 내벽의 기부 말단은 간단히 밀봉될 후자에 의해 일체형으로 성형될 수 있다. 이 밀봉 부재와 같은 중심을 갖는 것으로 밀봉 부재의 가장자리에 위치한 개방형 동심 부재(8)가 있다. 이 부재들은 일반적으로 수위 방향 부재를 제공하는데, 이것은 조성물이 내벽과 외벽 사이에 형성된 확산 채널로 형하게 하고 내벽 (6)의 내면으로부터 떨어지게 한다. 도 12c는 또한 적절한 압력이 가해질 경우 막(4)를 파열하도록 제공된, 지시 수단의 중심에 위치한, 차츰 가늘어지는 부재(9)도 보여준다.
도 13에는 어플리케이터의 두번째 구체예가 도시되어 있다. 이 어플리케이터에는 도 12에 도시된 것과 동일한 외벽 및 내벽이 이용된다. 그러나, 서로 일정 간격으로 이격된 복수개의 슬롯이 외벽에 제공되어 있다. 이 특별한 버젼에서는, 방출 부재와 용기도 하나의 단일 부재이다. 그러나, 방출 부재는 압착가능한 용기가 아니다. 이것은 오히려 파우치(11) 내에 제공된 조성물을 함유하는 피스톤-형 구조물(10)이다. 이 구체예에서, 연결 부재(5)는 피스톤-형 구조물 (10) 내에 현미경처럼 삽입가능하다. 파우치는 압축에 대해 저항성이 낮은 소재로 만들어진다. 이 막을 파열시키기 위해, 끝이 점점 가늘어지는 부재가 내벽의 기부 말단에 제공된다. 도 13은 이 점차 가늘어지는 부재(9)를 끝이 뾰족한 디스크로서 도시한다. 디스크는 내벽의 기부 말단에 위치하며, 끝이 뾰족한 부분은 파우치(11)를 마주보게 위치한다. 사용시, 피스톤-형 구조물(10)을 사용자가 누르면, 막이 뾰족한 부분에 의해 찢어지고 조성물이 확산 채널을 통해 천공으로부터 방출된다.
도 14는 본 발명의 어플리케이터의 세번째 구체예를 나타낸 것이다. 전술한 두가지 구체예는 확산 채널의 기부 말단 근방에 용기가 위치하였지만 이 세번째 구체예에서는 용기(12)가 확산 채널의 기부 말단으로부터 멀리 떨어져있다. 이 경우,용기로부터 떨어져 위치한 시트(13)가 제공된다. 시트는 용기(12)에 기부 위치한 피스톤(14)에 작동적으로 연결되어 있다. 사용자는 피스톤을 잡아당김으로써 용기에 압력을 가하고, 그 내용물이 확산 채널의 기부 유입구 말단으로 인게이지된다. 조성물은 도 14에 여러개의 구멍 (2)로 도시된 바와 같이, 어플리케이터 몸체의 외벽에 만들어진 천공을 통해 방출된다. 구멍들은 조성물이 점막강 내로 균일하게 분포되도록 하는 방식으로 위치한다. 구멍들은 외벽의 길이부 뿐만 아니라 원위부 말단에도 위치한다. 도 14는 또한 어플리케이터 몸체의 외벽과 내벽이 일체로 형성될 수 있음을 보여준다. 한편, 내벽은 또한 점차 가늘어지는 부재를 이용할 필요 없이, 도 12와 도 13에 도시된 것과 같은 모양을 가질 수도 있다. 용기는 피스톤(14)의 당기는 작동에 의해 압착될 경우, 막이 파열되어 그의 내용물을 확산 채널 내로 방출하게하는 방식으로 압착에 대항 저항이 약한 막을 함유할 수 있다. 이러한 구체예의 어플리케이터에서는, 지시 부재가 확산 채널의 기부 유입 말단과 몸체의 기부 말단에 위치하는 밀봉 부재에 의해 형성된다 (도시하지 않음).
도 15는 본 발명의 한가지 측면에 따른 어플리케이터의 네번째 구체예를 도시한 것이다. 이 구체예에서, 용기와 방출 부재는 단일 부재이다. 저항성이 약한 막(4)은 몸체(1)의 기부 말단에 인접하여 위치한다. 어플리케이터의 외벽은 여러개의 그루브로서 실현된 슬롯을 포함한다. 내벽(6)은 외벽과 일체로 형성되어 있다. 내벽의 기부 말단은 점점 가늘어지는 부재(15)에 의해 종결된다. 용기/피스톤(16)의 직경은 내벽의 외경보다 약간 크지만, 어플리케이터 몸체의 외벽의 내경보다는 작다. 사용시, 용기는 두개의 벽 사이에 미끌어지듯 맞물리게 되고, 막은 파열되어 그의 내용물이 확산 채널 및 외벽의 원위부와 측부에 위치한 천공내로 유입된다.
전술한 모든 구체예에 있어서, 지시 부재는 몸체 내벽의 기부 말단에 일체형으로 형성되거나 또는 밀봉 부재로서 제공되거나 또는 외벽에 의해 형성된 내강내로 조성물이 흐르는 것을 방지하거나 또는 확산 채널 내로 조성물이 유입되게 하는 디스크로서 제공된다.
또한, 사용을 용이하게 하기 위해, 사용자로 하여금 방출 부재를 작동시킬때 어플리케이터가 제 위치에 있도록 유지시키는 것을 돕도록 몇몇 구체예에서 손잡이 부재 (grasping element) 를 제공할 수 있다. 더욱 구체적으로, 두번째 구체예에서, 손잡이 부재는 연결 부재(5)의 외과 말단에 형성된 환형 칼라에 의해 경계가 지어진다. 환형 칼라는 사용자가 손가락 사이에 칼라의 원위부 말단을 잡을 수 있고 다른 손가락으로 피스톤을 밀기에 충분한 공간을 갖도록 하는 외부 두께를 갖는다. 이 세번째 구체예에서, 손잡이 부재는 피스톤의 기부 말단에 제공된다 (숫자 18을 참조할 것). 몸체의 외벽은 피스톤보다 큰 섹션이므로, 사용자는 한손으로 어플리케이터의 기부 말단을 잡고 다른 손으로 피스톤을 당겨서 어플리케이터의 몸체를 잡을 수 있다. 마지막으로, 네번째 구체예에서, 손잡이 부재는 어플리케이터 몸체의 기부 말단에 위치한 타원형 핸들 (19)로서 제공되어 연결 부재를 감싼다. 이 핸들은 2개의 손가락 사이에 지지될 수 있는 바면, 피스톤은 다른 손가락으로 밀게된다.
감염 치료를 위한 본 발명의 폴록사머 조성물을 비롯한 실시예
마우스의 HSV-1의 피부 감염 모델에 있어서, 본 발명의 젤 조성물의 효능을 평가하기 위해, 여러 용액들을 피부의 pH와 상용되는 포스페이트 완충액 (0.2M, pH 6)중에서 제조하였다.
마우스에 있어서 HSV-1 피부 병변에 대한 포스카르넷, 아시클로버
및 Zovirax 연고를 함유하는 국소용 조성물의 효능 비교
피부 HSV-1 감염 마우스 모델에서 본 발명의 여러가지 국소용 조성물의 효능을 평가하였다. 요약하면, 5-7주령의 암컷 제모 마우스 (SKH1; Charles River Breeding Laboratories Inc., St-Constant, QC, Canada)를 70 mg/kg 케타민 염산염과 11.5 mg/kg 자일라진을 함유하는 혼합물을 복강내 주사함으로써 마취시켰다. 바이러스를 좌측 허리 피부의 몸체 측부에 접종하였다. 곧추 세운 27-게이지의 바늘을 이용하여 십자가 해치 형태로 피부를 6회 흠집을 내었다. 배양 배지 [100 U/ml 페니시린-스트렙토마이신, 2mM L-글루타민 및 2% 소 태아 혈청 (MEM-E + 2% FBS)]로 포화된 면봉 오플리케이터를 이용하여 상처난 피부부위에 바이러스 현탁액 50μl (HSV-1 균주 F, 1.5 x 106플라크 형성 단위 (PFU)/ml)를 10-15초간 문질렀다. 외과수술용 테잎으로 마우스의 몸통위에 유지된 원추형 쿠션으로 상처난 부분을 보호하였다. 약물의 흡수를 방지하기 위해 사용 전에 원추형 쿠션의 틈의 다공성 내벽을 티슈 접착제로 불침투성으로 만들었다. 원추형 쿠션의 틈을 외과수술용 테잎으로도 막았다. 이어서 마우스를 우리 안으로 돌려보내고 하루 2회 관찰하였다.
이 연구에서는 여러가지 처리 방법을 평가하였다. 요약하면, 원추형 쿠션의 틈을 막는 테잎을 제거하고, 상처부위를 냉수로 적신 면봉 어플리케이터로 씻었다. 여러가지 조성물 50μl를 상처 부위에 적용하였다. 원추형 쿠션의 틈을 외과수술용 테잎으로 밀봉하여 마우스에 의해 약물이 급히 제거되는 것을 막았다. 이 공정은 또한 치료된 병변을 잠재적으로 핥을 수 있음으로 해서 일어날 수 있는 우발적인 전신 치료 가능성을 방지하기도 한다. 여러가지 조성물의 효능을 병변 점수와 생존률을 이용하여 평가하였다.
도 16 (패널 A)는 용액 중의 포스카르넷 또는 폴록사머 내로 혼입된 포스카르넷으로 처리된 마우스 또는 처리되지 않은 감염된 마우스의 시간 경과에 따른 평균 병변 전수를 나타낸 것이다. 치료는 감염 24시간 후부터 개시하였고 4일간 하루 3회씩 반복하였다. 폴록사머 단독으로 치료된 마우스에 있어서, 본 발명자들은 피부 병변의 퇴행이 미처리 마우스 그룹보다 빨리 진행되는 것을 제외하고 미처리 마우스와 거의 유사한 패턴을 발견하였다. 0.5% 포스카르넷 용액으로 처리된 마우스에 있어서는, 폴록사머 조성물과 약물을 결합시켰을 경우 더욱 현저한, 평균 병변 점수의 대폭적인 감소를 관찰하였다. 도 16 (패널 B)은 약물 조성물로 처리된 마우스와 처리되지 않은 감염된 마우스의 상응하는 생존률을 보여준다. 제 7일과 제 8일 사이에 미처리 감염 마우스의 75%가 뇌염으로 죽었다. 이러한 사망률은 폴록사머 단독으로 처리된 마우스에서와 유사한 것이었으며 제 8일과 10일 사이에 일어났다. 용액 중 포스카르넷으로 처리된 마우스의 절반은 감염으로부터 생존하였다. 특히 중요한 것은, 포스카르넷의 폴록사머 조성물로 처리된 마우스으 75%가 감염으로부터 생존하였다는 것이다 (p＜0.05).
도 17 (패널 A)는 5% 아시클로버 또는 Zorirax연고를 함유하는 폴록사머로 감염 24시간 후에 1회 적용에 의해 처리된 마우스와 처리하지 않은 감염된 마우스의 시간 경과에 따른 평균 병변 점수를 도시한다. 특히 중요한 것은, 5%아시클로버를 함유하는 폴록사머 조성물이 마우스에 있어서 피부 감염의 진행에 맞서 우수한 효능을 나타낸 반면, Zovirax연고는 미약한 효과만 나타내었다는 것이다. 그러나, 폴록사머 내로 혼입된 아시클로버는 치사율을 현저히 감소시켰으나 (p＜0.05), Zovirax연고는 그렇지 못했다 (패널 B). 시판하는 Zovirax연고에 비해 아시클로버의 폴록사머 조성물의 효능이 높다는 것은 폴록사머가 이 약물의 국소 전달에 보다 우수한 담체일 수 있음을 가리키는 것이다.
도 18 (패널 A)는 대조군 마우스의 평균 병변 점수와 폴록사머 단독, 5% 아시클로버 또는 Zovirax연고를 함유하는 폴록사머로 감염 후 5일부터 개시되어 4일간 하루 3회씩 처리된 마우스의 평균 병변 점수를 나타낸 것이다. 폴록사머 단독으로 치료된 마우스에 있어서, 평균 병변 점수의 감소는 감염된 미처리 마우스의 그것과 필적할만 하였다. Zovirax연고를 이용한 처리는 가장 약한 효과를 나타내었다. 그러나, 5% 아시클로버를 함유하는 폴록사머 조성물로 처리된 마우스에 있어서는 미처리 감염 동물과 비교할 때 가장 현저한 평균 병변 점수의 감소가 관찰되었다. 특히 흥미로운 것은, 5% 아시클로버를 함유하는 폴록사머로 처리된 모든 마우스가 감염으로부터 생존하였다는 것이다 (p＜0.001) (도 18, 패널 B). Zovirzx연고를 이용한 치료는 감염된 마우스의 생존률을 덜 증가시켰다 (p＜0.05).
항바이러스제의 생체내 피부 침투
도 19는 감염되지 않은 피부조직 (패널 A, C, E) 및 감염된 피부조직 (패널 B, D, F)에 있어서 포스카르넷과 아시클로버를 포스페이트 완충액과 함께 또는 폴록사머와 함께 국소적용한지 24시간 후의 이들 포스카르넷과 아시클로버의 분포를 도시한 도면이다. 포스카르넷 조성물과 아시클로버의 완충 용액 조성물의 두가지 모두으 분포는 감염된 마우스와 감염되지 ㅇ낳은 마우스의 각칠 테이프 스트립에서 유사하였다. 이와 대조적으로, 폴록사머 내로 아시클로버를 혼입시킨 것은 감염된 마우스와 감염되지 않은 마우스 두가지 모두의 각질층에서 회수된 약물의 양을 현저히 증가시켰다; 증가된 약물 침투는 감염된 마우스에 있어서 보다 현저하였다. 약물 적용에 사용된 담체와 무관하게 마우스의 표피와 진피에서는 포스카르넷이 전혀 또는 극소량 발견되었다. 감염된 마우스의 표피와 진피에서의 포스카르넷의 농도는 폴록사머 내로 약물이 혼입된 경우 특히 현저하게 높았다. 아시클로버의 농도는 사용된 담체 종류와 관게없이 감염된 마우스와 감염되지 않은 마우스 두가지 모두에 있어서 진피와 표피에서 포스카르넷의 농도보다 높았다. 감염되지 않은 마우스의 표피에서 폴록사머 내로 혼입된 아시클로버의 농도는 완충 용액 중의 약물의 농도보다 6.1배 더 높았다. 마우스의 감염은 표피 중의 아시클로버의 양을 유의적으로 증가시키지 않았다. 감염된 마우스의 진피 중의 아시클로버의 농도는 폴록사머 매트릭스 중에 약물을 투여한 경우 감염되지 않은 마우스에 있어서의 농도보다 7.9배 더 높았다.
도 20은 포스페이트 완충액 또는 폴록사머 매트릭스 중에서, 아시클로버를 국소투여한지 24시간 후 감염된 마우스와 감염되지 않은 마우스에 있어서의 혈장 중 아시클로버의 농도를 나타낸 것이다. 두가지 조성물 모두에 있어서 감염되지 않은 마우스의 혈장에서 유사한 아시클로버 농도가 발견되었다. 마우스의 감염은 혈장 중 아시클로버의 농도를 극적으로 증가시켰으며, 특히 약물을 폴록사머 매트릭스 내에 혼입하여 사용한 경우 농도증가가 4배에 달하였다. 감염된 마우스의 혈장 중의 아시클로버의 농도는 약물을 폴록사머 매트릭스 내로 혼입시킨 경우 2.1배 더 컸다.
마우스에 있어서 HSV-1 피부 병변에 대한 포스카르넷 또는
아시클로버를 함유하는 폴록사머 조성물의 효능에 미치는 SLS의 효과
HSV-1 감염에 대해 포스카르넷을 함유하는 폴록사머 조성물의 효능에 대한 SLS의 영향도 마우스에서 평가하엿다. 도 21 (패널 A)는 폴록사머 단독, 3% 포스카르넷을 함유한느 폴록사머, 5% SLS를 함유하는 폴록사머, 3% 포스카르넷 + 5% SLS를 함유하는 폴록사머를 단일 적용 (감염 후 24시간) 시켜 어리된 감염된 마우스와 감염되니 미처리 마우스의 시간 경과에 따른 평균 병변 점수를 보여준다. 폴록사머 단독은 감염에 대해 어떠한 보호효과도 주지 못했다. 한편, 미처리 감염 마우스에 비해 5% SLS 또는 3% 포스카르넷을 함유하는 폴록사머로 처리된 마우스에서는 평균 병변 점수의 감소가 가장 미약한 것으로 관찰되었다. 특히 흥미로운 것은, 3% 포스카르넷과 5% SLS를 함유하는 폴록사머로 처리된 마우스에 있어서, 감염된 미처리 마우스에 비해 평균 병변 점수가 현저히, 그리고 유의적으로 감소 (p＜0.05)된 것으로 관찰되었다는 것이다. 동일한 치료 그룹에 있어서 상응하는 생존률을 패널 B에 나타내었으며 이것은 평균 병변 점수 결과를 뒷받침해준다. SLS의 바이러스 감염성 변형능력과 함께 그의 피부 침투 촉진 특성은 포스카르넷 조성물의 증진된 효능을 설명해줄 수 있다.
포스카르넷과 SLS와의 조합에 대한 HSV-1의 생체외 감수성
Vero 세포에 있어서 HSV-1 (균주 F)에 대한 포스카르넷의 효능에 미치는 SLS의 효과를 조사하였다. 요약하면, 세포를 24-웰 플레이트 (Costar, Montreal, QC, Canada)에 접종하고 37℃에서 2시간 동안 HSV-1 균주 F (약 100PFU/ml)를 인큐베이션시켜 바이러스 흡착시켰다. 그 후, 바이러스를 제거하고 여러가지 농도로 포스카르넷, SLS 또는 이 두가지 화합물의 조합을 함유하는 0.6% 아가로스 Seaplaque (Marine Colloids, Rockland, MA) 0.5ml로 세포를 오버레이하였다. 플레이트를 37℃에서 2일간 인큐베이션시켰다. 이어서 PBS 중 10% 포름알데히드에 세포를 20분간 고정시키고, 탈이온수로 세정한 다음 0.05% 메틸렌 블루로 염색하였다. PFU를 측정함으로써 바이러스 민감성을 평가하였다. 도 22는 Vero 세포에 미치는 SLS와 포스카르넷의 여러가지 농도 조합에 대한 HSV-1 균주 F의 민감성을 보여준다. Vero 세포에 있어서 SLS의 존재로 인해 HSV-1 (균주 F)에 대한 포스카르넷의 효능이 증진되었다.
잠재적인 응용
다음의 예는 본 발명 국소용 조성물의 특수한 잠재적인 응용예로서 본 발명의 범위가 이들로 한정되는 것은 아니다. 상기 결과에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 젤 조성물은 피부 및/또는 점막의 감염을 방지하고 더욱 특히는 HSV와 HIV를 예방하는데 이용될 수 있다. 또한, 본 발명의 결과는 본 발명 조성물이 건강관리 종사자들의 우발적인 감염을 방지하기 위한 예방용 제제로서도 이용될 수 있음을 보여주었다. 상기 결과에서도 입증된 바와 같이, 본 발명 조성물은 피부 및/또는 점막의 감염 증상의 치료 및 예방, 더욱 특히는 헤르페스성 병변의 치료 및 예방에 이용될 수 있다. 상기한 응용예 외에도, i) 화상의 치유 및/또는 처치와 그 밖의 감염의 예방 및 ii) 안과 증상의 감염의 치료 및/또는 예방에도 본 발명의 젤 조성물이 잠재적으로 이용될 수 있다. 상기 예들 중, 본 발명의 조성물은 여하한 항미생물제, 살균제, 살바이러스제, 화학요법제, 항염제, 항신생조직제, 면역조절제 또는 기타 여하한 병원체 및/또는 질병에 기인하는 점막 및/또는 피부의 감염 및/또는 비정상적인 증상을 치료 및/또는 예방하는데 효과적인 여하한 제제 또는 이들의 조합을 함유할 수 있다.
본문에 설명된 다음의 예들은 본 발명의 독특한 어플리케이터의 특정의 잠재적인 용도를 제시한 것으로 본 방명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다. 상기한 바와 같이, 본 발명의 어플리케이터는 점막의 감염 및/또는 비정상적인 조건의 치료 및/또는 예방을 위해 경부/질/항문-직장 점막을 커버하는데 사용되는 여하한 국소용 조성물의 전달에 이용가능하다. 본 발명의 어플리케이터는 또한 i) STDs를 일으키는 병원체의 성적 접촉에 의한 전달을 예방할 수 있는 여하한 국소용 조성물, ii) 질용 피임 조성물, iii) 특정 질병에 대한 국소용 살미생물 조성물 및 iv) 여하한 항미생물제, 살균제, 살바이러스제, 화학요법제, 항염제, 항신생조직제, 면역조절제, 계면활성제, 미생물 부착 억제제, 피부침투 촉진제, 시토카인, 항원, 백신, 방사능 제제 또는 이들의 조합을 전달하는데도 이용될 수 있다.

Claims (36)

  1. 환자의 점막 또는 피부에 영향을 미치는 질환의 치료 또는 예방 또는 정자 또는 미생물과 같은 외부 물질에 의한 침입을 예방하기 위한 국소용 조성물을 제조하기 위한, 표적세포, 조직 또는 미생물에 있어서 단백질 상호작용을 방해하거나 단백질 형성을 파괴할 수 있는 제제의 용도: 단, 상기 제제는 노녹시놀-9가 아님.
  2. 환자의 점막 또는 피부상에 퍼져서 보호층을 형성할 수 있는 적절한 양의 필름-형성 성분과 표적 세포, 조직 또는 미생물에서 단백질 상호작용을 방해하거나 단백질 형성을 파괴할 수 있는 제제의 유효량을 함유하는 국소용 조성물: 단, 상기 제제는 노녹시놀-9가 아님.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 제제가 숙주 수용체에 대한 미생물성 외래 단백질의 결합을 방해할 수 있는 것이 특징인 국소용 조성물.
  4. 제 1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제가 미생물 부착 억제제이거나 또는 단백질의 통합을 파괴시킬 수 있는 카오트로픽 제제 또는 계면활성제인 국소용 조성물.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 미생물 부착 억제제가 덱스트란 설페이트인 국소용 조성물.
  6. 제 4항에 있어서, 상기 계면활성제가 소듐 라우릴 설페이트, 벤잘코늄 클로라이드, 라우로일 사르코신, 폴리옥시에틸렌 지방 아실 유도체 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방 아실 에스테르 유도체 중에서 선택된 것인 국소용 조성물.
  7. 제 4항에 있어서, 상기 카오트로픽 제제가 소듐 라우릴 설페이트 또는 구아니딘인 국소용 조성물.
  8. 제 1항 내지 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제가 소듐 라우릴 설페이트인 국소용 조성물.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 제제가 약 1 내지 15% (w/v) 농도의 소듐 라우로일 설페이트인 국소용 조성물.
  10. 제 1항 내지 9항 중 어느 한 항에 있어서, 필름 형성 성분이 폴록사머 407인 국소용 조성물.
  11. 제 10항에 있어서, 폴록사머 407이 15 내지 35% (w/v) 농도로 사용된 국소용 조성물.
  12. 제 1항 내지 11항 중 어느 한 항에 있어서, 피부 또는 점막에 영향을 미치거나 피부 또는 점막을 통해 전달되는 질환에 효과적인 약물을 추가로 함유하는 것이 특징인 국소용 조성물.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 약물이 항미생물제, 살정자제, 살균제, 살바이러스제, 화학요법제, 항염제, 항신생조직제, 면역조절제 또는 여하한 다른 제제 중에서 선택된 한가지 이상의 약물인 것이 특징인 국소용 조성물.
  14. 제 13항에 있어서, 항바이러스제를 함유하는 것이 특징인 국소용 조성물.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 항바이러스제가 아시클로버 또는 포스카르넷인 국소용 조성물.
  16. 제 1항 내지 15항 중 어느 한 항에 있어서, 피부 침투 촉진제를 추가로 함유하는 국소용 조성물.
  17. - 기부 및 원위부 말단, 천공이 뚫린 길이방향으로 뻗어있는 외벽, 및 상기 외벽과의 사이에 확산 채널이 생기도록 하는 크기와 배열을 갖는 상기 외벽으로부터 격리된 내벽 (상기 확산 채널은 기부 유입구 말단을 가짐)을 갖는 몸체;
    - 여하한 조성물을 수납할 수있는 용기;
    - 상기 용기에 작동적으로 연결되어 상기 용기로부터 상기 확산채널로 조성물을 방출시킬 수 있도록 환자에 의해 작동가능한 방출 부재를 포함하며, 작동시, 상기 방출 부재가 상기 용기의 외부로부터 그의 기부 유입구 말단을 통해 확산 채널 내부로 조성물을 밀어냄으로써, 상기 천공을 통해 조성물을 점막강으로 전달시키는, 환자의 점막강내로 액상 내지 반고상 조성물을 전달하기 위한 어플리케이터.
  18. 제 17항에 있어서,
    - 상기 몸체의 기부 말단과 상기 방출 부재를 연결시키기 위한 연결 부재; 및
    - 상기 몸체의 기부 말단에 위치하여 조성물을 상기 확산 채널의 상기 기부 유입구 말단에 지향시키기 위한 지시 부재를 추가로 포함하는 어플리케이터.
  19. 제 17항에 있어서, 상기 외벽의 상기 천공들은 길이 방향과 원위부 방향의 천공을 모두 포함하는 어플리케이터.
  20. 제 17항에 있어서, 상기 방출 부재와 상기 용기는 하나의 단일 부재인 것이 특징인 어플리케이터.
  21. 제 20항에 있어서, 상기 방출 부재는 압축에 의해 작동되는 유연성 소재로 된 것인 어플리케이터.
  22. 제 20항에 있어서, 상기 방출 부재는 환자에 의해 피스톤 작동가능한 것이 특징인 어플리케이터.
  23. 제 17항에 있어서, 상기 방출 부재는 환자에 의해 작동가능한 피스톤을 포함하는 것이 특징인 어플리케이터.
  24. 제 23항에 있어서, 상기 방출 부재가 상기 내벽에 의해 형성된 강(루멘) 사이의 상기 용기로부터 원위부에 위치한 시트도 포함하고, 상기 시트는 상기 용기 근처에 위치한 피스톤에 작동적으로 연결되어 있으며; 상기 피스톤은 환자에 의해 당겨지면, 시트가 상기 용기를 압착하여 확산 채널 내로 조성물을 방출시키게 되는 것이 특징인 어플리케이터.
  25. 제 23항에 있어서, 상기 피스톤의 직경은 상기 내벽의 외경보다는 크고 상기 몸체의 외벽의 내경보다는 작으며, 상기 피스톤은 그의 외벽을 상기 몸체의 내벽과 외벽 사이에 미끌어져 맞물리게 함으로써 환자에 의해 작동되는 것인 어플리케이터.
  26. 제 17항 내지 23항 및 25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지시 부재는 상기 몸체의 내벽에 의해 형성된 내강을 밀봉하는 밀봉 부재를 포함하는 것이 특징인 어플리케이터.
  27. 제 26항에 있어서, 상기 지시 부재는 밀봉 부재와 동일 중심을 갖는 개방된 부재를 포함하고, 상기 개방된 부재는 상기 확산 채널의 기부 유입구 말단내로 개방되어, 방출 부재 작동시 상기 유입구 말단을 통해 조성물이 방출되게 되는 것이 특징인 어플리케이터.
  28. 제 26항 또는 제 27항에 있어서, 상기 지시 부재가 상기 몸체의 내벽의 상기 기부 말단과 일체형으로 만들어진 것이 특징인 어플리케이터.
  29. 제 24항에 있어서, 상기 지시 부재가 상기 몸체의 기부 말단에 제공된 밀봉 부재와 기부 입구 채널에 의해 형성된 것이 특징인 어플리케이터.
  30. 제 17항 내지 29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 몸체의 기부 말단과 용기 사이에 위치한, 저항성이 약한 막을 추가로 함유하는 어플리케이터.
  31. 제 30항에 있어서, 상기 막을 파열시키기 위한 점점 가늘어지는 부재를 추가로 함유하고, 상기 점차 가늘어지는 부재는 상기 지시 부재의 기부 말단에 위치하는 것이 특징인 어플리케이터.
  32. 제 17항 내지 31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 천공들은 실제로 동일한 거리와 원위부의 천공에 의해 길이방향으로 격리된 2개 이상의 슬롯에 의해 형성된 것이 특징인 어플리케이터.
  33. 제 32항에 있어서, 상기 슬롯과 원위부 천공들이 연속적인 것이 특징인 어플리케이터.
  34. 제 17항 내지 31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 천공들은, 조성물이 점막강 내로 실질적으로 균일하게 전달될 수 있도록 하는 방식으로 배치된, 복수개의 구멍에 의해 형성된 것이 특징인 어플리케이터.
  35. 제 17항 내지 34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 연결 부재의 외부 말단에 위치한 손잡이 부재를 추가로 포함하는 것이 특징인 어플리케이터.
  36. 제 17항 내지 34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 연결 부재와 일체형으로 형성된 손잡이 부재를 추가로 포함하는 것이 특징인 어플리케이터.
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