DE69219470T2

DE69219470T2 - Topisches Präparat zur besseren Heilung von Herpesverletzungen

Info

Publication number: DE69219470T2
Application number: DE69219470T
Authority: DE
Inventors: Richard Kronenthal; Bruce Miller
Original assignee: ViroTex Corp
Current assignee: Cep Holdings Inc Newark Del Us
Priority date: 1991-06-20
Filing date: 1992-06-19
Publication date: 1997-11-06
Anticipated expiration: 2012-06-20
Also published as: CA2111837A1; ATE152356T1; DK0590024T3; DE69219470D1; AU653248B2; AU2222192A; GR3023867T3; KR940701273A; EP0590024B1; WO1993000114A1; ES2101850T3; KR100243455B1; EP0590024A1; JPH07501045A

Description

Hintergrund der Erfindung

Der Herpes-Simplex-Virus (HSV) verursacht eine Infektion, die durch eine Entzündung der Haut und der Schleimhautmembranen des Mundes sowie der Genitalien gekennzeichnet ist. Bei dem Typ von HSV, der gewöhnlich mit Läsionen oder Verletzungen des Mund- und Gesichtsbereiches verbunden ist, handelt es sich um HSV vom Typ I. HSV vom Typ II ist gewöhnlicherweise mit Läsionen des Genitalbereiches verbunden.
Die Symptome von HSV umfassen allgemein Entzündungen, Schmerzen und Läsionen. Die Symptome umfassen anfänglich ein Beißen oder Brennen, Schmerzen und Anschwellen an der Infektionsstelle, anschließend Läsionen (Zelltod) und Abheilen in etwa 10 bis 14 Tagen. Nach der anfänglichen Intektion können während des ganzen Lebens als Antwort auf verschiedene Reize einschließlich Änderungen der Körpertemperatur, Streß, ultraviolette Strahlung und Chemikalieneinwirkung wiederkehrende Anfälle stattfinden.
Die Behandlungen von HSV sind in ihrer Wirksamkeit beschränkt. Es gibt derzeit kein bekanntes Heilmittel, obwohl verschiedene Zusammensetzungen auf dem Markt erhältlich sind. Acyclovir (Acycloguanosin) wird systemisch zur Behandlung von HSV mit einigem Erfolg verabreicht. Man hat gefunden, daß topisches Acyclovir für die primäre Läsion ein bißchen wirksam ist, jedoch nicht für wiederkehrende Läsionen. Auch Interferon wurde systemisch und topisch gegen HSV getestet, jedoch nur mit begrenzter Wirksamkeit. Es sind so viele Nebenwirkungen mit der systemischen Verabreichung von Anti-Virus-Mitteln verbunden, daß topische Behandlungen größtenteils bevorzugt sind. Bedauerlicherweise ist die topische Verabreichung selbst der Verbindungen, die bei systemischer Verabreichung eine gewisse Wirksamkeit zeigen, im allgemeinen unwirksam, so daß die Läsionen üblicherweise nur mit Trockenmitteln und/oder topischen Anästhetika behandelt werden.
Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, topische Zusammensetzungen und Verfahren zu deren Verwendung zur Linderung der mit Herpes-Simplex-Infektionen oder anderen viralen Läsionen verbundenen Symptome zur Verfügung zu stellen.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, topische Zusammen- setzungen zur Linderung der Symptome von HSV-Infektionen mit miniinalen Nebenwirkungen und zur Erleichterung von Entzündungen und Schmerzen, die normalerweise mit viralen Läsionen verbunden sind, zur Verfügung zu stellen.
EP-A-0 388 306 offenbart ein Verfahren zur Behandlung von mit Gürtelrose (Herpes Zoster) und post-herpesartigen Neuralgien (Nervenschmerzen) verbundenen Schmerzen mit einem lokalen Anästhetikum, z.B. Lidocain und einem Vehikel zur transdermalen Zuführung der Medikation, wobei nichtionische oberflächenaktive Mittel eingesetzt werden können. FR-M 45 79 betrifft parenterale Formulierungen zur Injektion, in denen bestimmte oberflächenaktive Stoffe, z.B. quartäre Annnoniumsalze, mit einem Wirkstoff, z.B. Lidocain, verabreicht werden. FR-A-2 293 219 ist auf ein Verfahren zur Inaktivierung von Herpesviren durch nichtionische oberflächenaktive Stoffe gerichtet. Daneben offenbart EP-A-0 305 551 pharmazeutische Zusammensetzungen zur Behandlung von Herpesvirus-Infektionen, wobei die Zusammensetzungen antivirale, nichtionische oberflächenaktive Stoffe in Kombination mit Interferon als Wirkstoff enthalten.

Zusammenfassung der Erfindung

Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung eine topische Zussammensetzung zur Behandlung von durch Herpesvirus verursacht Läsioneen bereit, wie sie in Anspruch 1 definiert ist.
Eine mehrfache tägliche Anwendung einer Zusammensetzung mit einem Anästhetikum und einem anionischen oberflächenaktiven Stoff mit antiviraler Aktivität als Wirkstoffen verringert die Abheitlungszeit der Herpes-Simplex- Virus-Läsionen von etwa 10 Tagen auf 5 Tage und vermindert die Entzündung und die Schmerzen. Die Zusammensetzung wurde ursprünglich als Kombination einer kommerziell erhäultlichen topischen Creme mit interferonhaltigen Tabletten formuliert. Die Tabletten enthalten 1.000 IU Human- Leukocyt-Typ-A-Inteferon in 1.000 IU Vitamin A, Spurenelemente und ggf. Katalase- und Superoxiddismutaseaktivitäten. Das Interferon wurde zur Creme im Verhältnis von 4 Tabletten/ 1/2 Unze pro Volumen Creme zugegeben. Es wurde nun bestimmt, daß das Interferon kein wessentlicher Bestandteil der Zusammensetzung ist. Das Anästhetikum und der anionische oberflächenaktive Stoff sind die wirksamen Bestanteile bei der Steigerung der Heilung und Minimierung der Symptome der viralen Infektion in Abwesenheit des Interferons. Jedoch kann Interferon deren Aktivität steigern.
Die Zusammensetzung wird auf die Läsionen täglich aufgebracht, etwas alle vier Stunden, wobei man vorzugsweise im Anfangs- oder Prodromalstadium der Infektion beginnt. Eine Erleichterung tritt fast chlagartig ein und ist durch eine Abnahme der Schmerzen, der Anschwellung und eine schnellere Heilung, verglichen mit der unbehandelten Läsion gekennzeichnet.

Genaue Beschreibung der Erfindung

Die Formulierung zur Linderung der Symptome von HSV-Läsionen enthält zwei wesentliche Bestandteile, ein topisches oder lokales Anästhetikum und einen anionischen oberflächenaktiven Stoff, die zu einer herkömmlichen Trägercreme, -salbe, -lösung oder einem herkömmlichen Trägergel zugegeben werden, die bzw. das geeignete Stabilisatoren, Puffer und Konservierungsstoffe zur topischen Auftragung auf die Läsion enthält.

Geeignete topische oder lokale Anästhetika

Das bevorzugte Anästhetikum ist Tetracain (entweder als Hydrochlorid oder als ein anderes Salz oder als die freie Base). Topische Anästhetika werden vorteilhafterweise als Ester, Ether oder Amide klassifiziert.
Es gibt weitere Anästhetika, die zur Injektion verwendet werden, z.B. spinale Anästhetika, die nicht üblicherweise als topische Mittel aufgelistet sind, von denen man aber erwartet, daß sie gut auf Läsionen wirken, wo eine intakte Haut keine Barriere darstellt. Einige Beispiele sind:
Chloroprocain Bupivacain
Etidocain
Mepivacain
Prilocain
Tetracain ist das bevorzugte Anästhetikum, da es strukturell ähnlich ist zu Procain, bei dem es sich um das Anästhetikum handelt, das zuerst getestet und an dem gezeigt wurde, daß es wirksam die Haut durchdringt, das in vitro eine virale Anti-Replikations-Aktivität besitzt und das auf der FDA- Monographienliste erscheint, was seinen Vertrieb als Ladenprodukt ("overthe-counter (OTC)"-Produkt) für Fieberbläschen (Herpesbläschen) und Kältegeschwüre bei Konzentrationen zwischen 1 und 2 Gew.-% erlaubt.
In der bevorzugten Ausführungsform wird das Anästhetikum mit einem Träger im Konzentrationsbereich zwischen 1 und 2 Gew. - % kombiniert, jedoch kann das Anästhetikum in einer Konzentration zwischen 0,15 und 15 Gew.-% vorliegen.

Oberflächenaktive Stoffe

Es wurde gefunden, daß oberflächenaktive Stoffe in vitro eine starke antivirale Aktivität bei sehr geringem Grad an Toxizität besitzen. Man geht davon aus, daß der oberflächenaktive Stoff physikalisch die Viren inaktiviert und das Eindringen des Anästhetikums zu den Zellrezeptoren erleichtert, was die Wirksamkeit der Verbindungen bei normalerweise nicht wirksamen Konzentrationen erhöht.
Das Material in der ursprünglichen Formulierung ist Natriumlauryl-(oder Dodecyl)sulfat, genannt "SLS", ein gewöhnlicher oberflächenaktiver Stoff, den man in Zahnpasta und anderen Kosmetikprodukten findet, von dem bekannt ist, daß er die Tertiärstruktur von Proteinen "auffaltet", von dem aber bisher keine tatsächliche antivirale Aktivität bekannt war. SLS ist ein anionischer oberflächenaktiver Stoff mit einer negativ geladenen Sulfatgruppe. SLS vermag auch intakte Haut sehr wirksam zu durchdringen.
Andere schwefelhaltige oberflächenaktive Stoffe, z.B. die Natriumalkylaryl- und -arylsulfonate und die Alkylsulfonate können anstelle von SLS verwendet werden.
In der bevorzugten Ausführungsform ist der oberflächenaktive Stoff mit einem Träger im Konzentrationsbereich zwischen 0,5 bis 2 Gew.-% kombiniert; jedoch kann der oberflächenaktive Stoff in einer Konzentration zwischen 0,1 bis 10 Gew.-% vorliegen. Oberflächenaktive Stoffe unterschiedlicher Eigenschaften können auch bis zu einer Konzentration zwischen 0,1 bis 20 Gew.-% kombiniert werden.

Andere antimikrobielle Mittel

Die Zusammensetzung kann andere antimikrobielle Mittel, einschließlich Antibiotika, Fungiziden und anderen antiviralen Verbindungen, enthalten, die die Aktivität der Basiszusammensetzung vervollständigen oder ergänzen können. Geeignete Antibiotika umfassen Tetracyclin, Polymyxin B oder andere gängige Antibiotika, die in topischen Zusammensetzungen, insbesondere Formulierungen, die über den Ladentisch verkauft werden, verwendet werden. Beispiele geeigneter Fungizide sind solche wie Tolnaftat und Micatin. Beispiele von Antivirusmitteln umfassen Interferon, entweder natürliches oder rekombinantes, sowie Nucleosidanaloge, z.B. Acyclovir.

Andere Bestandteile

Hautreizmittel zur Beeinflussung tiefersitzender Entzündungsvorgänge, wie z.B. Kampfer und Menthol, Trockenmittel wie Benzylalkohol, Resorcin und Phenol, sowie Adstringentien wie z.B. Zinksulfat und Tannin (Gerbsäure) können auch zu der Zusammensetzung zugefügt werden.
Andere Arten von Mitteln können ebenso der Formulierung zugefügt werden. Zum Beispiel kann ein Sonnenschutzmittel, z.B. PABA, zur Rezeptur zugegeben werden, da bekannt ist, daß Kältegeschwüre durch ultraviolette Strahlung ausgelöst werden können.

Pharmazeutisch verträgliche Träger

Die Zusammensetzung kann auf fast jedem relativ inerten topischen Träger hergestellt werden. Viele derartiger Träger werden routinemäßig verwendet und können unter Verweis auf pharmazeutische Texte erhalten werden. Beispiele umfassen Polyethylenglykole (PEG), Polypropylen-Copolymere (Pluronic) und einige wasserlösliche Gele. Der bevorzugte Träger ist eine emulgierte Creme, statt dessen können aber auch andere herkömmliche Träger wie bestimmte Rohvaseline (Petrolat) oder Salben auf Mineralöl-Basis, in denen der oberflächenaktive Stoff und das Anästhetikum dispergierbar sind, verwendet werden.
Derzeit handelt es sich bei der bevorzugten Zusammensetzung der Erfindung, die am wirksamsten bei der Förderung der Abheilung von viralen Läsionen ist, um die folgende (alle Prozentangaben auf das Gewicht bezogen):
Methylparaben, 0,25% (0,25 bis 0,5%)
Borax, 0,5% (0,3 bis 0,6%)
Lauramid-DEA, 4% (0,3 bis 0,4%)
Stearinsäure, 20% (15 bis 25%)
Bienenwachs, 0,8% (0,5 bis 1,5%)
Tetracain, 1,8% (1 bis 2%)
Natriumlaurylsulfat, 0,8% (0,1 bis 3%)
Eukalyptusöl, 0,025% (0,01 bis 0,05%)
PCMX, 0,4% (0,3 bis 0,5%)
Wasser, auf ein Gesamtgewicht von 100 Gramm.
In den meisten Fällen wird vorzugsweise der pH-Wert des Trägers, der die aktiven Bestandteile enthält, auf einen pH-Wert von 6 bis 8 eingestellt, unter Verwendung von Puffersubstanzen wie Borax, wenngleich verträgliche Puffersubstanzen verwendet werden können.
Zusätzliche Additive können Antioxidationsmittel, Aromen, Farbmittel, Wasser, Konservierungsstoffe (entweder Antioxidationsmittel oder antimikrobielle Mittel), Gleitmittel, Feuchthaltemittel oder Trockenmittel einschließen.

Anwendung

Die Zusammensetzung wird täglich ein- bis sechsmal vom Patienten auf die Läsionen aufgetragen, wobei am meisten bevorzugt unmittelbar nach dem Spüren des Prodroms (Krankheitsvorzeichen) begonnen wird. Es wird genügend Zusammensetzung aufgetragen, um die Läsion oder den prodromalen Bereich abzudecken.
Die Formulierung zeigte sich als aktiv gegen sowohl HSV 1 (Kältegeschwüre und Herpesbläschen) als auch HSV 2 (Genitalherpes). Jedoch kann sie auch gegen andere Viren aktiv sein einschließlich Herpes Zoster (der Gürtelrose verursacht) und den Varicella-Virus, der Windpocken verursacht, die in der Struktur oder im Infektionsmechanismus ähnlich sind.
Die vorliegende Erfindung wird weiterhin unter Bezug auf die folgenden Beispiele erläutert.

Beispiel 1: Bestimmung der Fähigkeit von ausgewählten Bestandteilen der Zusammensetzung, direkt die Replikation von Herpes-Simplex-Virus vom Typ 2 zu inaktivieren oder inhibieren.

Zellen:

Eine kontinuierliche Linie von Human-Embryonen-Lungenzellen (MRC-5) wurde in Eagles minimalem essentiellen Medium (MEM) in Earles-Salzen gezüchtet, das bzw. die mit 2 mM L-Glutamin, 10 mg/ml Gentamicin, 0,25 mg/ml Amphotericin B (Fungison) und 10% hitzeinaktiviertem fötalem Kalbserum (Wachstumsmedium) ergänzt war(en). Die Zellen wurden bei 37ºC in einer befeuchteten 5 %-igen CO&sub2;-Atmosphäre oder in verschlossenen Kolben gezüchtet. Das Wachstumsmedium besaß die gleiche Basiszusammensetzung, außer daß die Konzentration an fötalem Kalbserum 2% betrug. Vero-Zellen (kontinuierliche Linie von Nierenzellen von grünen Affen) wurden auf die gleiche Weise wie die MRC-5-Zeilen gezüchtet.

Viren:

Ein klinisches Isolat von einer genitalen Läsion eines Herpes-Simplex-Virus vom Typ (HSV-2) wurde verwendet.
Virenausgangsmaterial wurde durch Infizieren von MRC-5-Zellen bei einer Multiplizität von 0,01 Plaque-bildenden Einheiten (PFU) pro Zelle gezüchtet und in Wachstumsmedium gesammelt. Der Virus wurde durch drei Zyklen von Gefrieren bei -70ºC und Auftauen, mit anschließender Zentrifugation bei 1000 x g bei 4ºC für 15 Minuten zur Entfernung von Zelltrümmern gesammelt. Das erhaltene Virusmaterial wurde aliquotiert und bei -70ºC eingefroren.

Chemikalien:

Stammlösungen von Lidocain-hydrochlorid, Niacin, Natriumlaurylsulfat und Tetracain wurden aus kommerziell erhältlichen Reagenzien hergestellt. Die Stammlösungen wurden in Eagles MEM ohne Zusätze hergestellt und bei 4ºC gelagert.

Cytotoxizitätsuntersuchungen:

Cytotoxizitätsassays wurden in MRC-5-Zellen und Vero-Zellen durchgeführt. Die Testverbindung wurde im Wachstumsmedium bei ausgewählten Konzentrationen gelöst und auf MRC-5- oder Vero-Zellen in 96 Gewebekulturplatten mit Vertiefungen inokuliert. Für jede Konzentration wurde dreimal inokuliert. Die Platten wurden bei 37ºC in 5% CO&sub2; inkubiert und 24, 48 und 72 Stunden nach Inokulieren gemäß ihrer Cytotoxizität klassifiziert. Die höchste Konzentration einer Verbindung, die 50% Cytotoxizität nach 72 Stunden zeigte, wurde als der Endpunkt bezeichnet.
Die Ergebnisse sind wie folgt:

Procainhydrochlorid.

Procain-HCl zeigt eine signifikante Cytotoxizität in MRC-5-Zellen nach 24 Stunden Inkubation bei Konzentrationen über 0,25 %. Procain-HCl war in Vero-Zellen nicht so cytotoxisch wie in MRC-5-Zellen, wobei es eine signifikante Toxizität nur bei Konzentrationen über 2,0% zeigt.

Tetracain-HCl.

Tetracain-HCl war auch gegenüber MRC-5-Zellen toxischer, wobei es eine signifikante Toxizität bei Konzentrationen über 0,03 % bei 24 Stunden zeigt, aber nicht in Vero-Zellen.

Niacin.

Niacin ist in MRC-5-Zellen bis zu Konzentrationen von 0,25 % nicht toxisch.

Natriumlaurylsulfat (SLS).

SLS ist hochtoxisch gegenüber MRC-5-Zellen bei Konzentrationen über 0,0025 %.

Inaktivierungsstudien:

Zur Bestimmung, wann eine Testverbindung direkt HSV-2 inaktiviert, wurden 0,5 ml von Reihenverdünnungen der zu testenden Verbindung mit 0,5 ml Ausgangs-HSV-2 (Titer = 5,0 x 10 PFU/ml) vermischt und bei Raumtemperatur 30 Minuten inkubiert. Nach 30 Minuten wurde das Verbindung- Virus-Gemisch 10.000-fach im Wachstumsmedium verdünnt und die Rückgewinnung von Virus wurde durch Inokulieren von MRC-5-Zellen bestimmt.
Die Zellen wurden nach 24 Stunden, 48 Stunden und 72 Stunden gemäß ihrem cytopathischen Effekt klassifiziert.

Procain-HCl.

Procain-HCl inaktiviert nicht direkt HSV-2 bei den getesteten Konzentrationen, bis zu 4%.

Tetracain-HCl.

Tetracain-HCl inaktiviert nicht direkt HSV-2 bei den getesteten Konzentrationen, bis zu 2%.

Niacin.

Niacin inaktiviert nicht direkt HSV-2 bei den getesteten Konzentrationen, bis zu 0,25 %.

Natriumlaurylsulfat.

SLS inaktiviert direkt HSV-2 bei Konzentrationen von 30% bis runter zu 0,02% und inaktiviert teilweise den Virus bei Konzentrationen runter bis zu 0,0025 %. Keine Inaktivierung fand bei einer Konzentration von 0,00032% statt.

Antivirale Untersuchungen:

Die antivirale Aktivität, d.h. die Fähigkeit der Verbindung, eine Infektion oder Replikation des Virus in den Zellen zu inhibieren, wurde gemessen durch Infizieren von kotifluenten Monolayern von MRC-5-Zellen in 12 x 100 mm Kulturröhrchen bei einer Multiplizität der Infektion ("multiphcity of infection", MOI) von 3,0 Plaque-bildenden Einheiten (PFU) pro Zelle HSV-2 durch Entfernen des Wachstumsmediums, dreimaliges Waschen der Monolayer mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und Zugeben von 0,1 ml HSV-1 suspendiert in PBS. Die Multiplizität der Infektion wurde berechnet, indem man die Anzahl der lebensfähigen Zellen in einem zweiten gleichen Röhrchen zählte und den Stammvirus zur Erzeugung eines viralen Inokulums (Impfmaterials) in einem Volumen von 0,1 ml verdünnte, das dreimal so viel PFUs wie die Anzahl der gezählten Zellen enthielt. Nach einer Absorptionsdauer von 60 Minuten wurde das Inokulum entfernt und 4 ml der Testverbindung wurden bei geeigneten Konzentrationen zu Wachstumsmedium zugefügt oder Wachstumsmedium (Kontrolle) wurde zugefügt. Die Röhrchen wurden weitere 23 Stunden bei 37ºC inkubiert. 24 Stunden nach der Infektion wurde das Medium entfernt und die Monolayer wurden zweimal mit PBS gewaschen und gefroren und aufgetaut dreimal in 1 ml Wachstumsmedium. Die Virusausbeuten wurden durch Reihen-Endpunkttitrationen in Gewebekulturplatten mit 96 Vertiefungen, die MRC-5-Zellen enthielten, bestimmt. Alle Versuche wurden dreifach durchgeführt. Die 50%-Endpunkte wurden berechnet und die Titer in TCID 50-Einheiten ausgedrückt. Der antivirale Effekt wurde bestimmt durch Substrahieren der Differenz zwischen den TCID 50-Werten der Testverbindung und von den TCID 50-Werten des HSV-2-Virusstammaterials, das im gleichen Versuch titriert wurde, und in Prozentangaben berechnet.

Procain-HCl.

Konzentrationen an Procain-HCl bis zu 2% vermochten die Replikation von HSV-2 nicht zu inhibieren.
Tetracain-HCl.
Tetracain-HCl inhibierte teilweise die Replikation von HSV-2 bei 0,25% und 0,5%. Es ist wahrscheinlich, daß höhere Konzentrationen an Tetracain-HCl vollständig die Replikation von HSV-2 inhibieren wurden.

Niacin.

Niacin inhibiert nicht die Replikation von HSV-2.

Natriumlaurylsulfat.

SLS inhibiert nicht die virale Replikation bei Konzentrationen von 0,0025% und 0,0013%.
Zusammengefaßt zeigen die Ergebnisse, daß SLS als Inaktivator von HSV-2 bei Konzentrationen bis zu 0,02% hinunter der aktivste Bestandteil von den getesteten ist, und daß Tetracain-HCl eine gewisse antivirale Aktivität bei einer Konzentration von 0,5 % besitzt, obwohl Procain-HCl keine besitzt. Bei hohen Konzentrationen kann SLS auch wirken durch Abschuppung (Desquamation) von infizierten Zellen in den Läsionen, durch deren schnelle Entfernung durch "Fängerzellen" (scavenger cells) und Waschen und durch schnellere Abheilung als Ergebnis.

Beispiel 2: Auswertung der in vivo Wirksamkeit von ausgewählten Bestandteilen der Zusammensetzung auf eine primäre Genitalinfektion des Herpes-Simplex-Virus vom Typ 2 von Meerschweinchen.

Die antivirale Aktivität von einigen Verbindungen in einer primären Genital- HSV-2-Infektion von Meerschweinchen wurde getestet. Die Versuche wurden mit Placebos kontrolliert und nicht infizierte Tiere wurden mit jeder der Präparationen behandelt, um die Hautreizung zu beurteilen. Mit 5 % Acyclovir behandelte Gruppen wurden als Positivkontrollen miteingeschlossen.

Materialien und Methoden

Genitale HSV-2-Infektion von Meerschweinchen:

Virus und virale Inokulation.

Der MS-Stamm von HSV-2 wurde zum Infizieren der Tiere verwendet. Weibliche Meerschweinchen vom Hartley- Stamm, Charles River Breeding Laboratories, Kingston, NY, die 250 bis 300 g wogen, wurden intravaginal mit 1,4 x 10&sup5; Plaque-bildenden Einheiten HSV-2 eine Stunde, nachdem sie zur Entfernung vaginaler Sekretionen abgewischt worden waren, inokuliert.

Behandlung der Meerschweinchen.

Gruppen von 10 infizierten Meerschweinchen wurden topisch behandelt, 0,1 ml intravaginal und 0,1 ml auf die äußere Genitalhaut, dreimal täglich, etwa alle acht Stunden, über sieben Tage, beginnend entweder 6 h oder 48 h nach der HSV-Inokulation. Gruppen von drei nicht infizierten Tieren wurden eingesetzt, um die Toxizität jeder Präparation zu beurteilen.

Probensammeln und Virusassays.

Zur Bestimmung der Wirkung der Behandlung auf die vaginale Virusreplikation wurden Abstriche von vaginalen Sekretionen 1, 3, 5, 7 und 10 Tage nach der HSV-2-Inokulation erhalten, in einem Röhrchen, das 2,0 ml Medien enthielt, eingebracht, gevortext bzw. verwirbelt und bei -70ºC bis zur Titration von HSV-2 gefroren. Sobald alle Proben gesammelt waren, wurden sie aufgetaut, hintereinander verdünnt und die HSV-2-Titer unter Verwendung eines Mikrotiter-CPE-Assays in Kaninchennierenzellen bestimmt. Die mittleren Peak-Virustiter und -flächen unter den Virustiter-Tag-Kurven wurden berechnet und analysiert.

Bewertung der äußeren Genitalläsionen.

Zur Bestimmung der Wirkung der Therapie auf die Entwicklung und Ausbreitung von externen Genitalläsionen wurde die Läsionsschwere auf einer 0- bis 5+-Skala über die primäre Infektion (21 Tage) bewertet. Die mittleren Peak-Läsionsscores (oder -bewertungen) und die Flächen unter den Läsionsscore(-bewertung)-Tag-Kurven wurden berechnet und analysiert.

Auswertung der Wirksamkeit.

Die Anzahl der infizierten Tiere gegenüber der Anzahl der inokulierten, die Läsionsscore(-bewertung)-Tag-Flächen und Virustiter-Tag-Flächen unter der Kurve, Peak-Läsionsscores (oder -bewertungen) und Peak-Virustiter wurden zwischen unbehandelten und Placebo-behandelten oder Placebo-behandelten und mit Arzneimittel behandelten Tieren unter Anwendung des Mann-Whitney-(U-)Tests (Mann-Whitney U rank sum test) verglichen. Ein p-Wert von 0,05 oder weniger wurde als signifikant angesehen.

Proben:

1A Basisformulierung ohne Procain
2A Basisformulierung ohne Procain oder SLS
3A Basisformulierung ohne SLS, mit 1,8% Procain
3 Basisformulierung mit 1,3 % SLS und 1,8% Procain
5 Basisformulierung ohne Procain, mit 1,6% Tetracain und SLS
6 Basisformulierung ohne Procain, mit 1,6% Tetracain, Interferon (Schering Plough, 200.000 Einheiten), und SLS
Die Basisformulierung ist wie für die bevorzugte Ausführungsform der Zusammensetzung zur Förderung der Abheilung von viralen Läsionen definiert, jedoch ohne SLS oder Anästhetikum. Acyclovir (ACV) wurde als Positivkontrolle (d.h. mit antiviraler Aktivität) verwendet. Placebo (PBS)- behandelte Tiere wurden mit einem unbehandelten Kontrolltier verglichen. 2A wurde mit den unbehandelten Tieren und Placebo-behandelten Tieren verglichen. ACV-Gruppen wurden mit der Placebo-behandelten Gruppe verglichen. Alle anderen wurden mit 2A verglichen.

Ergebnisse:

Zur Bestimmung der primären Reizung wurden Gruppen von drei Meerschweinchen mit jeder der Proben oder Kontrollen behandelt. Es wurden keine sichtbaren Zeichen irgendeiner Hautreizung oder genitalen Toxizität beobachtet. Die Tiere blieben während der gesamten Untersuchung gesund und in ihrem Verhalten normal.

Wirkung auf die virale Replikation.

Nach der HSV-2-Inokulation erreicht die virale Replikation im Vaginaltrakt am 3. bis 5. Tag einen Peak und nimmt dann allmählich ab, wobei die meisten Tiere sich bis zum 10. Tag vom Virus befreit haben. Lediglich 5 % ACV, gegeben 6 h nach der viralen Impfung, reduzierten signifikant die Virustiter-Tag-Fläche unter der Kurve ("area under the curve", AUC) oder den mittleren Peak-Virustiter (p-Werte von 0,05 bzw. < 0,01). Alle anderen Formulierungen vermochten nicht die vaginale virale Replikation zu ändern, ungeachtet dessen, wann die Therapie begonnen wurde.

Wirkung auf die Läsionsentwicklung.

Drei bis vier Tage nach der HSV-Inokulation beginnen bläschenförmige (vesikuläre) Läsionen auf der äußeren genitalen Haut zu erscheinen. Die Läsionen entwickelten sich bis zum ulzerativen (geschwürigen) Stadium bis zum 7. bis 8. Tag weiter und heilten allmählich bis zum 15. bis 21. Tag ab. Mit dem PBS-Placebo bei +6 h behandelte Tiere zeigten einen signifikant erhöhten Läsionsscore-(bewertungs-)Tag-AUC-Wert bei Vergleich mit der unbehandelten Kontrollgruppe (p-Wert < 0,05). Die Vehikelkontrolle für die Formulierungen (2A), gegeben bei +6 h zeigte einen signifikant niedrigeren Läsionsscore-(bewertungs-)Tag-AUC-Wert bei Vergleich mit der unbehandelten Kontrollgruppe (p-Wert < 0,05). Die Vehikelkontrolle für die Formulierungen (2A), gegeben bei +6 h zeigte ein signifikant niedrigeres Läsionsscore- (bewertungs-)Tag-AUC bei Vergleich mit den +6 h Placebo- und den unbehandelten Kontrollgruppen (p-Wert < 0,05 bzw. 0,001). Jedoch führte eine 2A-begonnene Inokulation nach 48 Stunden zu einem signifikant größeren Läsionsscore-(bewertungs-)Tag-AUC bei Vergleich mit sowohl den +48 h- Placebo- als auch den unbehandelten Kontrollgruppen (p-Werte < 0,01 bzw. 0,001). Eine Therapie mit 1A, 5, 6 oder 5% ACV, begonnen 6 h auf die HSV-2-Inokulation senkte signifikant die Läsionsentwicklung (p-Werte < 0,05 oder weniger). 5 % ACV reduzierte auch den mittleren Peak-Läsionsscore (bzw. -bewertung) (p-Wert < 0,001). Eine Therapie mit diesen Formulierungen bei +48 Stunden vermochte nicht die Läsionsentwicklung zu inhibieren. Erhöhte Läsionsscore-(bewertungs-)Tag-AUCs und mittlere Peak-Scores (oder -Bewertungen) wurden mit 1A und 5 (p-Werte 0,06 oder niedriger) erhalten.
Es ist wichtig anzumerken, daß das Placebo einen Läsionsscore von 42,5 zeigte. Die Proben 1A, 3, 5 und 6, die alle 1,3% SLS enthielten, zeigten Bewertungen von 17,2, 31,7, 19,8 bzw. 17,4, während die Proben 2A und 3A, die kein SLS enthielten, Bewertungen von 27,8 bzw. 21,0 zeigten. Die Proben 3 und 3A zeigten atypische Bewertungen, wobei man glaubt, daß dies auf Fehler bei der Formulierung oder beim Testen zurückzuführen ist. Jedoch ist offensichtlich, daß die Anwesenheit von SLS in der Formulierung die Schwere des Läsionsverlaufes in diesem Modell reduziert.
Während es aufgrund des verwendeten Tiermodells in Kombination mit der Variation bei der Löslichkeit der Komponenten in den Formulierungen, insbesondere den nicht-SLS-enthaltenden Formulierungen, eine große Standardabweichung bei den Ergebnissen gibt, ist der Durchschnittsgesamtscore (bzw. -bewertung) der SLS-haltigen Proben von 12 im Vergleich zu 23 für die nicht-SLS-haltigen Proben eine 48 %-ige Abnahme in der Schwere. In der 24 Stunden-Gruppe sind die Durchschnittsscores (-bewertungen) von 14 für die SLS-Proben und 17,2 für die Kontrollen eine Verbesserung um 19%, während in den 72 Stunden-Gruppen vergleichbare Scores (Bewertungen) von 10,5 gegenüber 26 eine 60%-ige Verringerung in der Läsionsschwere bringen.

Beispiel 3: Nachweis der in vivo Wirksamkeit bei der Förderung der Abheilung von HSV-Läsionen in Menschen.

Die Daten der Fallstudien flir sechs Patienten wurden in einem offenen Versuch unter Verwendung von Proben, die SLS und Procain enthielten, erhalten. Es wurde gezeigt, daß die durchschnittliche Anzahl von Tagen bis zur Abheilung auf sechs von zehn von einem historischen Mittel bei den gleichen Patienten verringert wurde. Darüber hinaus schien sich der Krankheitsverlauf günstig zu ändern. Die Infektionsstadien sind wie folgt definiert:
Erythem (Ery)
Papel (Pap)
Vesikular (Bläschen) (Ves)
Ödem (Öde)
Schorf (Sch)
Tabelle I zeigt die Ergebnisse einer klinischen Studie, in der die Creme täglich viermal topisch auf eine wiederkehrende (nicht-primäre) Läsion aufgetragen wurde: Tabelle I: Klinische Versuchsergebnisse
Es ist wichtig anzumerken, daß vier der sechs Patienten nie über das Papelstadium hinauskamen und daß die durchschnittliche Anzahl von Tagen zur Abheilung um 44% verringert wurde im Vergleich zu historischen Kontrollen, die mit systemischem Acyclovir durchgeführt worden waren. Mit den Läsionen verbundene Schmerzen wurden in allen Fällen reduziert oder eliminiert.

Beispiel 4: Studie an Humanpatienten in größerem Maßstab.

33 Subjekte, 15 randomisiert (zufällig ausgewählt) zur Placebokontrolle (Placebo) und 18 Subjekte randomisiert (zufällig ausgewählt) für die aktive Verbindung (Aktiv), wurden gegen eine Herpes-Simplex-I-Infektion behandelt.
Die Patienten waren durch die Anwesenheit von Herpesläsionen auf den Lippen und im Gesichtsbereich gekennzeichnet, die überwiegend vom Herpes-Simplex-Virus vom Typ I stammten. Die Patienten wurden angewiesen, die Salbe/Creme alle zwei Stunden während der Wachstunden aufzutragen, in einer Menge, die zur Abdeckung der Läsionen ausreichend ist, beginnend innerhalb 48 Stunden von dem prodromalen Stadium bis der Schorf abfällt. Die Salbe enthielt, bezogen auf Gewichtsprozent, 1,9% Tetracain und 1,0% Natriumlaurylsulfat in einer wäßrigen Grundlage von Eukalyptusöl, Stearinsäure, Lauramid DEA, PCMX, Bienenwachs, Methylparaben und Borax. Die Werte auf der Beurteilungsskala des Arztes für Schmerzen, Jucken, Abheilen und klinische Wirksamkeit sowie die Einschätzung der Patienten über den empffindenen Nutzen der Behandlung sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2. Mittelwerte, Standardfehler und Probengrößen für die individuellen Bewertungsskalen und die Zeit in Tagen bis zur Schorfbildung und zum Schorfabfall für die Behandlungsgruppe.
Wie aus Tabelle 2 ersichtlich, hatte die Aktiv-Gruppe bei allen Einteilungen eine bessere Bewertung. Bei einem einschwänzigen (one-tailed) (Aktiv besser als Placebo) Wilcoxon-Test (Wilcoxon Rank Sums Test) war der empfundene Vorteil statistisch signifikant (p=.043), während die Bewertung für das Jucken gerade nicht mehr signifikant war (p=.055).
Eine Kaplan-Meier-Analyse der Verteilung der Zeiten bis zum Schorfabfall wurde durchgeführt. Die zwei Kurven sind signifikant verschieden bei dem Log-Rank-Test (p=.049), wobei die Aktiv-Gruppe die kürzeren Zeiten zeigt.
Die klinischen Folgerungen der vorläufigen statistischen Analyse sind somit unmittelbar:
1. Die größere subjektive Variable (Zeit, bis der Schorf abfällt) wird von 7,1 auf 5,3 Tage gesenkt. Dies ist etwa eine 18%-ige Abnahme bei der Abheilungszeit und ist statistisch signifikant (p=.049).
2. Die objektiven Beurteilungen durch die Untersuchenden zeigen Jucken nahe an der Signifikanz und positive Trends für jede der anderen Variablen (Schmerzen, Abheilen, Gesamtwirksamkeit). Es sollte erkannt werden, daß die Meinung des Untersuchenden bis zu einem bestimmten Grad die Meinung des Patienten und auch seine eigene negative Neigung gegenüber einer topischen Behandlung von Herpesinfektionen reflektiert.
3. Die Meinung des Patienten über den Vorteil ist statistisch signifikant (p=.043) und stellt eine wichtige Erkenntnis dar.
4. Es wurde die Frage bezüglich der Nicht-Reagierenden aufgeworfen. Es gibt zwei Typen von Nicht-Reagierenden; Placebo-behandelte Patienten, die eine günstige Meinung über die Medikation haben und Aktiv-behandelte Patienten, die eine ungünstige Meinung haben. Die Variabilität in der Antwort ist in jeder klinischen Studie für jede Krankheit ein natürliches Phänomen, das sich durch die Variabilität in der Humanbiologie bei unterschiedlichen Individuen erklärt. Es gibt in jeder Studie Nicht- Reagierende. Tatsächlich wäre eine Studie höchst verdächtig, wenn es keine Nicht-Reagierenden gäbe. Dies ist umso augenscheinlicher, sobald subjektive Bewertungen verwendet werden, da es keine direkten harten Messungen gibt.
Jedoch scheint in Summe die Zusammensetzung, die SLS und Tetracain enthält, einheitlich bessere Ergebnisse mit statistischer Signifikanz bei wichtigen Parametern trotz der kleinen Proben zu ergeben.

Claims

1. Topische Zusammensetzung zur Behandlung von durch Herpesvirus verursachte Läsionen, enthaltend einen pharmazeutisch verträglichen topischen Träger und als Wirkstoff die Kombination eines Anästhetikums mit einem anionischen oberflächenaktiven Stoff, zur Verringerung der Abheilungszeit der Läsionen.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Anästhetikum aus Tetracain, Dibucain, Dyclonin, Benzocain, Lidocain, Pramoxin, Proparacain, Procain, Trinitrophenol-2-butyl-p-aminobenzoat. Chloroprocain, Bupivacain, Etidocain, Mepivacain und Prilocain ausgewählt ist.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei das topische Anästhetikum aus Tetracain und Procain in einer Konzentration zwischen 0,1 und 20 Gewichtsprozent ausgewählt ist.

4. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der anionische oberflächenaktive Stoff aus Natriumlaurylsulfat, Natriumalkylarylsulfonaten und Alkylsulfonaten ausgewählt ist.

5. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem Anästhetikum um Tetracain in einer Konzentration zwischen etwa 0,2 und 2 Gewichtsprozent handelt und bei dem oberflächenaktiven Stoff um Natriumlaurylsulfat in einer Konzentration zwischen 0,5 und 5 Gewichtsprozent handelt.

6. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, weiter enthaltend Verbindungen ausgewählt aus Antibiotika, Fungiziden und Antivirus-Mitteln, die von der wirksamen Kombination von Anästhetikum mit anionischem oberflächenaktivem Stoff verschieden sind.

7. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, weiter enthaltend Verbindungen ausgewählt aus Puffersubstanzen, Antioxidationsmitteln, Konservierungsstoffen, Farbmitteln, Aromen, Gleitmitteln, Feuchthaltemitteln, Sonnenschutzmitteln oder Trockenmitteln.

8. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Träger Stearinsäure, Lauramid-DEA, Natriumlaurylsulfat, Borax, Tetracain, Eucalyptusöl, Bienenwachs, Konservierungsstoff und Methylparaben enthält.

9. Verwendung einer Zusammensetzung, enthaltend die Kombination eines Anästhetikums mit einem anionischen oberflächenaktiven Stoff in einem pharmazeutisch verträglichen Träger zur Herstellung eines topischen Mittels zur Behandlung von durch Herpesvirus verursachte Läsionen.

10. Verwendung nach Anspruch 9, wobei es sich bei dem Anästhetikum oder dem anionischen oberflächenaktiven Stoff um eines bzw. einen handelt wie in einem der Ansprüche 2 bis 5 definiert.

11. Verwendung nach Anspruch 9 oder 10, wobei die Zusammensetzung weiterhin eine oder mehrere Verbindungen wie in Anspruch 6 oder 7 definiert enthält.

12. Verwendung nach einem der Ansprüche 9 bis 11, wobei die Zusammensetzung zwischen ein- und sechsmal täglich topisch auf die Läsionen aufgetragen wird.

13. Verwendung nach einem der Ansprüche 9 bis 12, wobei die Zusammensetzung auf Läsionen aufgetragen wird, die mit dem Herpes-Simplex-Virus vom Typ I oder vom Typ II infiziert sind.

14. Zusammensetzung, enthaltend die Kombination eines Anästhetikums mit einem anionischen oberflächenaktiven Stoff in einem pharmazeutisch verträglichen Träger zur Verwendung als topisches Mittel in einem Verfahren zur Behandlung von durch Herpesvirus verursachte Läsionen.

15. Zusammensetzung nach Anspruch 14, wobei es sich bei dem Anästhetikum oder dem anionischen oberflächenaktiven Stoff um eines bzw. einen handelt wie in einem der Ansprüche 2 bis 5 definiert.

16. Zusammensetzung nach Anspruch 14 oder 15 weiterhin enthaltend eine oder mehrere Verbindungen wie in Anspruch 6 oder 7 definiert.