DE60214547T2

DE60214547T2 - Zusammensetzung und behandlungsverfahren gegen viren

Info

Publication number: DE60214547T2
Application number: DE60214547T
Authority: DE
Inventors: H. James Gilbert BROWN; Robert Gilbert KLEIMAN
Original assignee: International Flora Technologies Ltd
Current assignee: International Flora Technologies Ltd
Priority date: 2001-07-06
Filing date: 2002-06-19
Publication date: 2007-05-24
Anticipated expiration: 2022-06-20
Also published as: WO2003003833A1; CA2423659A1; ATE338459T1; EP1401275B1; CA2423659C; US20030018074A1; JP4610892B2; JP2005519855A; DE60214547D1; EP1401275A1; EP1401275A4

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Zusammensetzung, die sich für die systemische Behandlung verschiedener Virusinfektionen eignet. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung eine systemische antivirale Behandlung, bei der eine Mischung von aus der Umesterung von mehrfach ungesättigtem Jojobaöl mit gesättigtem Jojobaöl erhaltene Komponentenmischung eingesetzt wird. Weiterhin werden Verfahren zur Prävention bzw. Behandlung von Virusinfektionen und zur Behandlung von Haut- oder Membranentzündungen unter Anwendung solcher Zusammensetzungen offenbart.
ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
Virusinfektionen können beträchtliches Leiden und Krankheiten verursachen und letztendlich für das infizierte Individuum tödlich sein. Viren wie Herpessimplex-Viren (HSV-1 und HSV-2), das Cytomegalovirus (CMV), das Epstein-Barr-Virus (EBV), das Varicellazoster-Virus (VZV), Grippeviren, humane lymphotrophe Viren (z.B. HTLV-1) und Human-Immunodeficiency-Viren (z.B. HIV-1) haben eine signifikante Morbidität und Mortalität zur Folge. HSV-1 und HSV-2 sind mit Entzündungen und Läsionen von der Haut und der Schleimhäute einschließlich Herpes-simplex-Bläschen, Fieberbläschen und Herpes-genitalis-Läsionen assoziiert. VZV verursacht Gürtelrose und EBV ist mit infektiöser Mononukleose assoziiert. Grippeviren können Grippesymptome herbeiführen und tödlich sein. HIV ist für die erworbene Immunschwäche verantwortlich, die die infizierten Individuen entkräftet und tötet. Diese Viren liegen in einigen Zellen über unterschiedlich lange Zeiträume latent vor, im allgemeinen führt eine Virusreplikation jedoch zur irreversiblen Zerstörung der infizierten Zelle, was verschiedene klinische Manifestationen der Krankheiten, die von ihnen verursacht werden, zur Folge hat.
Es ist gut bekannt, daß langkettige gesättigte Alkohole verschiedene physiologische Wirkungen zeigen. So ist beispielsweise bekannt, daß 1-Triacontanol das Pflanzenwachstum stimuliert, siehe zum Beispiel die US-Patentschriften Nr. 4,150,970; 4,874,794; 5,070,107; 5, 071, 879; 5, 166, 219; 5, 194, 451; 5, 534, 554, 5, 948, 822 und 5,952,392. In der US-Patentschrift Nr. 4,670,471 wird die Verwendung von Triacontanol in einem geeigneten Träger als Behandlung von entzündlichen Erkrankungen wie Herpes simplex, Ekzem, Gürtelrose, atopischer Dermatitis, Schuppenflechte und dergleichen offenbart. Bei den offenbarten Experimenten kamen ein Aerosol und eine Mischung aus Triacontanol und Palmitinsäure, von der berichtet wurde, daß sie ebenso wirksam sei wie reines Triacontanol, zur Anwendung, und es wurde geschlußfolgert, daß der Aerosolträger die Wirkung von Triacontanol zerstörte und daß ein hydrophiler Träger für Triacontanol benötigt wird, um die gewünschte entzündungshemmende Wirkung zu erzielen. Es gibt einige Anhaltspunkte dafür, daß es sich bei der in 4,670,471 verwendeten Zusammensetzung einfach um verseiftes Bienenwachs gehandelt hat, das wie angegeben Triacontanol und Palmitinsäure enthält, das jedoch als wesentliche Bestandteile auch Hexacosanolsäure und verschiedene andere Kohlenwasserstoffe enthält. Die Ergebnisse der GC-MS-Untersuchung von verschiedenen Zusammensetzungen, von denen man annimmt, daß sie in diesem Patent zur Anwendung gelangten, waren nicht eindeutig, legten jedoch nahe, daß es sich bei wenigstens einigen der anderen Kohlenwasserstoffe um überaus komplexe Mischungen gehandelt haben könnte, von denen einige niedere Alkane, Ester, Säuren oder Alkohole enthalten können. Ob sich diese als wirksame entzündungshemmende Zusammensetzungen herausstellten oder nicht, ist nicht bekannt. Die US-Patentschrift Nr. 4,670,471 legt nahe, daß 5% Triacontanol in einer Grundlage aus verzweigten Estern bei der Behandlung von dorsalen kutanen HSV-1-Infektionen in Meerschweinchen eine gewisse Wirksamkeit zeigte und schloß daraus, daß es sich bei dem Wirkstoff um den langkettigen Alkohol Triacontanol handelte.
Die Verwendung von unpolaren gesättigten geradkettigen (C₂₁ bis C₃₃) Kohlenwasserstoffraktionen aus Bienenwachs bei der Behandlung von entzündlichen Hauterkrankungen wird in der US-Patentschrift Nr. 4,623,667 offenbart.
In der US-Patentschrift Nr. 3,863,633 wird eine Zusammensetzung für die topische Augenbehandlung offenbart, die eine lipophile Substanz, ein hydrophiles quellbares Polymer und von 10 bis 80% oberflächenaktive C₁₂- bis C₂₂-Alkohole wie 1-Hexadecanol, 1-Octadecanol, 1-Eicosanol und 1-Docosanol, die als Stabilisatoren für die Mischung dienen, enthält.
Hinsichtlich aliphatischer Alkohole würde man (wenn in-vitro-Untersuchungen für die Vorhersage von in-vivo-Ergebnissen herangezogen werden können) annehmen, daß es im Kontinuum aliphatischer Alkohole von C₁₀ bis C₃₀ bei C₁₀- bis C₁₄-Alkoholen, bei denen es sich auch um Reizstoffe handelt, zu einer viruziden Aktivität auf sehr geringem Niveau kommen sollte, daß die viruzide Aktivität im C₁₆- bis C₁₈-Bereich verschwinden und dann im C₂₀- bis C₃₂-Bereich wieder auftreten sollte; US-Patentschrift Nr. 4,874,794, US-Patentschrift Nr. 5,071,879, US-Patentschrift Nr. 5,166,219, US-Patentschrift Nr. 5,194,451 und US-Patentschrift Nr. 5,534,554.
Genauer gesagt zeigt ein in einem Tensid suspendierter gesättigter aliphatischer C₂₂-Alkohol, n-Docosanol, starke antivirale Wirkung gegen Viren einschließlich des Herpes-simplex-Virus, des HIV-1 und des Respiratory-Syncytial-Virus in vitro und des Friend-Virus in vivo (Katz, D. H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10825–10829, 1991; US-Patentschrift Nr. 5,534,554). Die antivirale Wirkung von n-Docosanol kann seiner progressiven Bindung und Aufnahme durch Zellen zugeschrieben werden, da eine Präinkubation von Zellen mit dem Alkohol zu einer optimalen antiviralen Wirkung führt. Während der Inkubation findet man 70% des zellassoziierten n-Docosanols in Zellmembrankomponenten und den Rest assoziiert mit löslichen Zellfraktionen (Katz, D. H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10825–10829, 1991). Der Einbau von n-Docosanol in die Zellmembran scheint nicht zu einer Hemmung der Bindung des Virus an die Zelloberfläche zu führen. Statt dessen wird die frühe Virusproteinsynthese zu mehr als 80% inhibiert, und die Viren dringen nicht zu den Kernen vor (Marcelletti, J. F. et al., Drugs of the Future 17 (19): 879–882, 1992). Es könnte sein, daß die antivirale Wirkung von n-Docosanol auf intrazelluläre metabolische Umwandlungen zurückzuführen ist, der Alkohol selbst ist jedoch in Konzentrationen von bis zu 300 mM nicht zytotoxisch (Katz, D. H. et al., Annals N. Y. Acad. Sciences, 724: 472–488, 1994).
Eine Inaktivierung von Viren wurde für ungesättigte langkettige C₁₄- bis C₂₀-Alkohole mit einer bis vier olefinischen Bindungen berichtet. Der wirksamste Alkohol war γ-Linolenylalkohol, ein C₁₈-Alkohol mit drei Doppelbindungen in den Positionen 6, 9 und 12; während ein C₁₈-Alkohol mit einer cis-Doppelbindung und ein C₂₀-Alkohol mit vier Doppelbindungen signifikant weniger wirksam waren als die oben beschriebene n-Docosanolzusammensetzung (Sands et al., Antimicrob. Agents & Chemother. 15: 67–73, 1979).
Einige strukturell mit langkettigen aliphatischen Alkoholen verwandte Verbindungen wurden ebenfalls mit einer antiviralen Wirkung assoziiert. So wird beispielsweise in der US-Patentschrift Nr. 4,513,008 die virusabtötende Wirkung von geradkettigen, mehrfach ungesättigten C₂₀- bis C₂₄-Säuren, -Aldehyden oder -Alkoholen mit fünf bis sieben Doppelbindungen offenbart. Verbindungen mit einer langkettigen fettigen Acylgruppe mit wenigstens drei oder vier ungesättigten Bindungen gebunden an ein Nukleosid oder Nukleosidanalogon sind in der US-Patentschrift Nr. 5,216,142 als antivirale Behandlungen offenbart. In der verwandten US-Patentschrift Nr. 5,276,020 werden antivirale Verbindungen mit einer langkettigen C₁₆-, C₁₈- oder C₂₀-Fettsäuregruppe gebunden an ein Nucleosidanalogon und ein Verfahren zur Behandlung von Virusinfektionen mit diesen Verbindungen offenbart. Zusammensetzungen, die Ölsäure enthalten (C₁₈, eine Doppelbindung) wurden ebenfalls als wirksam für Mittel gegen das Herpesvirus beschrieben (PCT-Patentanmeldung WO 9602244 A1). Antimikrobielle Zusammensetzungen für die topische Behandlung, die einen C₁₅-Glycerinmonoester von Laurinsäure oder einen Monoester eines mehrwertigen Alkohols von Laurinsäure mit einer Mischung von Fettsäuren (C₁₀-Caprinsäure und C₈-Caprylsäure) enthalten, sind in der US-Patentschrift Nr. 5,208,257 offenbart.
Ein Verfahren zur Prävention oder Verminderung von Hautreizungen durch Anwendung eines Polymere von C₁₂- bis C₂₆-Fettsäuren enthaltenden Schutzmittels vor der Einwirkung des allergenen Mittels wird in der US-Patentschrift Nr. 4,076,799 offenbart. Die bevorzugten Polymere weisen zwei bis vier Carboxylgruppen oder Carboxylsalzgruppen auf, vorzugsweise das Triethanolaminsalz von dimerisierter Linolensäure oder dessen gesättigtem Derivat. Andere entzündungshemmende Polymere, die aromatische heterocyclische Reste oder Acylreste in Homopolymeren oder Heteropolymeren enthalten (z.B. Vinylester von C₈- bis C₁₈-Fettsäuren; MW 2,000 bis 1.000.000) und eine größere Aktivität als die Monomere der Komponenten haben, werden in der US-Patentschrift Nr. 3,946,035 offenbart.
In der US-Patentschrift Nr. 4,513,008 wird ein Verfahren zur Desaktivierung von Hüllviren mit mehrfach unge sättigten C₂₀- bis C₂₄-Säuren, -Aldehyden oder -Alkoholen mit 5–7 Doppelbindungen offenbart, und den darin angeführten Literaturstellen. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 15, 67–73 (1979) (antivirale Wirkung von ungesättigten C₁₄- bis C₂₀-Alkoholen mit 1–4 Doppelbindungen), Snipes et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy 11,98–104 (1977) (C₂₀-Tetraenylalkohol mit geringer Aktivität) und Symp. Pharm. Effects Lipids (AOCS Monograph N. 5) 63–74 (1978) (worin eine niedrigere antivirale Aktivität von gesättigten langkettigen Alkoholen nahegelegt wird).
Eine Suspension aus Tensid und Erucylalkohol (cis-13-Docosen-1-ol) wurde untersucht und als antiviral aktiv beschrieben. Die Tensid-Erucylalkohol-Suspensionen hatten keine direkte viruzide Wirkung; d.h. eine 2stündige Inkubation des HSV-2-Virus mit der Tensid-Erucylalkohol-Suspension hatte keine Inaktivierung des Virus zur Folge, wie durch die anschließende Plaquebildung auf Verozellen festgestellt wurde. Die Tensid-Erucylalkohol-Suspension war gegenüber Verozellen toxisch, wenn sie den Kulturen in Konzentrationen zugesetzt wurde, bei denen n-Docosanol wirksam ist (2–15 mM). Bei Konzentrationen, die die Zellen vertrugen (< 1 mM), zeigte sich eine signifikante Inhibierung der Bildung von HSV-2-Plaques (bis zu 93%). Außerdem wurde bei 1 mM Erucylalkohol keine Zelltoxizität beobachtet. Die zur Inhibierung der Plaquebildung um 50% erforderliche Konzentration an Erucylalkohol (EC₅₀ = 0,15 mM) lag um einen Faktor von 60 unter der benötigten n-Docosanol-Konzentration (EC₅₀ = 9 mM). Ebenso wurde auch die antivirale Aktivität des trans-Isomers des einfach ungesättigten C₂₂-Alkohols Brassidylalkohol (trans-13-Docosen-1-ol) beschrieben. Brassidylalkohol zeigt eine antivirale Wirksamkeit ähnlich der von n-Docosanol. Die Zelltoxizität von Brassidylalkohol war signifikant niedriger als die von Erucylalkohol. Ausgehend von diesen Ergebnissen ist ersichtlich, daß die antivirale Wirksamkeit durch die Addition einer einzelnen cis- (jedoch nicht trans-)Doppelbindung in Position 13 des aliphatischen C₂₂-Alkohol stark erhöht wird. Der Alkohol mit der trans-Doppelbindung war weniger toxisch als der Alkohol mit der cis-Doppelbindung.
Bei Erucamid (cis-13-Docosenamid; MW = 337,59) handelt es sich um ein langkettiges C₂₂-Amid mit einer einzelnen Doppelbindung und einer Struktur ähnlich der von Erucasäure. Das C₂₂-Amide war toxisch gegenüber Verozellen, wenn es in Konzentrationen von 3 mM oder mehr eingesetzt wurde, ähnlich der bei Erucylalkohol und n-Docosansäure beobachteten Toxizität. Setzte man den Kulturen Erucamidsuspensionen mit einer Konzentration von 3 mM bis 15 mM zu, so wurden die Zellen rund und lösten sich von der Schale ab. Bei niedrigeren Erucamidkonzentrationen in der Suspension beobachtete man eine signifikante antivirale Aktivität. Bei verträglichen Erucamidkonzentrationen (.ltoreq. 1,7 mM) war die antivirale Aktivität der Erucamidsuspension geringer als bei im wesentlichen äquivalenten Konzentrationen von Erucylalkoholsuspensionen, jedoch größer als die von n-Docosanol-, n-Docosan-, n-Docosansäure- oder Brassidylalkoholsuspensionen. Das heißt, die prozentuale Inhibierung der Plaquebildung durch Erucamidsuspensionen betrug 78% bei 1,7 mM, 68% bei 1,5 mM, 58% bei 1,2 mM, 44% bei 0,89 mM, 42% bei 0,59 mM und 34% bei 0, 03 mM. Das C₂₂-Amid zeigt somit eine signifikante antivirale Wirkung bei zellverträglichen Verdünnungen, hat jedoch eine im Vergleich zum gesättigten aliphatischen C₂₂-Alkohol (n-Docosanol) erhöhte Zytotoxizität ähnlich der, die man bei entsprechenden einfach ungesättigten C₂₂-Erucylalkohol beobachtet.
Es besteht somit gegenwärtig und weiterhin ein Bedarf an verbesserten antiviralen Elementen. Bei der vorliegenden Erfindung handelt es sich um eine einzigartige Zusammensetzung, die eine Kombination an einfach ungesättigten Fettalkoholen enthält und wirksam ist bei der systemischen Behandlung von virusinduzierten Krankheiten und bei der Prävention oder Inhibierung von Infektionen durch krankheitserregende Viren. Andere Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung können Salze langkettiger Fettsäuren und/oder gemischte Ester enthalten.
KURZE DARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung findet ihre Ausführung in Verfahren zur Prävention, Inhibierung und Behandlung von Viruskrankheiten in Menschen oder anderen Tieren, einschließlich der intravenösen, intramuskulären, transmukosalen, transdermalen oder oralen Einführung einer Zusammensetzung, die wenigstens Alkohole der allgemeinen Formel R¹CH₂-OH enthält, wobei R¹ für CH₃-(CH₂)₇-CH=CH-CH₂-(CH₂)_x- steht und x für 6, 8, 10 und 12 steht, in einem physiologisch unbedenklichen Träger, in den zu behandelnden Menschen bzw. das zu behandelnde Tier und für die Durchführung eines solchen Verfahrens geeignete Zusammensetzungen. Andere Zusamnmensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung können Salze von langkettigen Fettsäuren und/oder gemischten Estern enthalten.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG
1 zeigt das Umwandlungs-Proliferations-Profil der Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung.
2 zeigt die antivirale Wirkung der Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung gegen HSV-1 Stamm 6143.
3 zeigt die antivirale Wirkung der Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung gegen HSV-1 Stamm 16571.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Bei der vorliegenden Erfindung handelt es sich um eine Zusammensetzung, und ein entsprechendes Verfahren dazu, die (bzw. das) sich für die Behandlung verschiedener Virusinfektionen eignet. Das Verfahren läßt sich mit Zusammensetzungen, die Alkohole der allgemeinen Formel R¹CH₂-OH enthalten, wobei R¹ für CH₃-(CH₂)₇-CH=CH-CH₂-(CH₂)_x- steht und x für 6, 8, 10 und 12 steht, oder mit vergleichbaren Zusammensetzungen, die auch andere physiologisch wirksame Bestandteile enthalten können, die die Wirksamkeit der Primärzusammensetzung der vorliegenden Erfindung nicht beeinträchtigen, durchführen. Diese anderen physiologisch wirksamen Bestandteile können Salze von langkettigen Fettsäuren und/oder gemischten Estern einschließen, wie weiter unten beschrieben.
Bei einer Ausführungsform enthalten die Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung Fettalkohole und können weiterhin gemischtkettige Ester und nicht umgesetzte Wachsester enthalten. Bei dieser Ausführungsform lassen sich die Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung durch die basenkatalysierte Alkoholysereaktion zwischen einem Wachsester wie Jojobaöl und einem Alkylalkohol wie Isopropylalkohol erhalten. Bei der Alkoholysereaktion handelt es sich bei den basischen Katalysatormaterialien beispielsweise – wobei diese Aufzählung nicht umfassend sein soll – um Metallalkoholate und insbesondere Alkalialkoholate, anorganischen Hydroxide, insbesondere Alkalihydroxide, und dergleichen wie NaOCH₃ (Natriummethanolat), NaOCH₂CH₃ (Natriumethanolat) und ihre Kalium-, Calcium oder Lithium-Gegenstücke, KOH and NaOH (z.B. wasserfreie Alkalihydroxide in alkoholischer Lösung, wobei es sich bei dem Alkohol der Lösung um den in der Umsetzung verwendeten Alkohol handelt).
Die bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung zur Anwendung gelangenden grundlegenden Umsetzungen können allgemein in der folgenden Weise betrachtet werden. Als Ausgangsmaterialien könnten die folgenden Verbindungen Verwendung finden:
ungesättigte Wachsester (wobei Jojobawachsester die bevorzugten ungesättigten Wachsester sind), R¹-COO-CH₂-R¹ I.,wobei R¹ für CH₃-(CH₂)₇-CH=CH-CH₂-(CH₂)_x- steht und x für 6, 8, 10 und 12 steht, und
ein Alkohol R²-OH II.,wobei R² für eine Alkylgruppe oder eine andere aliphatische Gruppe vorzugsweise mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, besonders bevorzugt eine Isoalkylgruppe und ganz besonders bevorzugt eine Isopropylgruppe steht.
Typische Produktkomponenten aus dieser bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung angewandten Synthesereaktion der ersten Ausführungsform können die folgenden einschließen:
gemischtkettige Ester (Isopropylester, falls Isopropylalkohol verwendet wurde) R¹-COO-R² (R¹-COO-CH-(CH₃)₂) III.und/oder
einfach ungesättigte Fettalkohole umfassend: R¹CH₂-OH IV..
Die Grundreaktion, die bei dieser ersten Ausführungsform der Herstellung der Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung zur Anwendung gelangen kann, kann wenigstens die folgenden Vorschriften umfassen.
In und II + Katalysator => Ir, III und IV
Die tiefgestellten Buchstaben n und r stehen für die natürliche Verteilung von Wachsestern (n) beziehungsweise die von während der Umsetzungen auftretenden Umlagerungen herrührende randomisierte Verteilung von Wachsestern (r). Es sollte angemerkt werden, daß die Reaktionsprodukte Zusammensetzungen mit einem breiten Schmelzpunktbereich liefern.
Ein Verfahren zur Herstellung der Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung kann die folgenden Schritte umfassen:

a) Bereitstellung einer Zusammensetzung, die wenigstens einen Wachsester wie Jojobaöl enthält,
b) Zugabe eines Alkohols z.B. mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen zu dieser Zusammensetzung,
c) Zugabe eines Katalysators und Zufuhr von ausreichend Hitze, so daß der/die Wachsester mit dem Alkohol alkoholysiert wird/werden und es zu einer Umesterung zwischen Wachsestern kommt.

Bei der Zubereitung der Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung gibt man gereinigten Wachsester in eine geeignetes Gefäß, aus dem sich die Luft entfernen läßt und das mit Vorrichtungen zum Rühren, Erhitzen und Abkühlen ausgestattet ist. Die Ausgangsmaterialien werden zunächst zum weitgehenden bzw. vollständigen Entfernen von Feuchtigkeit im Vakuum bei einer Temperatur von 90°C getrocknet. Dann wird die Mischung mit wasserfreiem Alkohol versetzt, wobei die Menge an Alkohol im Bereich von etwa 20 Gew.-% bis etwa 50 Gew.-% der Wachsester beträgt. Das Reaktionsgefäß wird verschlossen und so erhitzt, daß die Temperatur der Reaktionsmischung auf etwa 70–75°C gebracht wird. Es ist wichtig, daß unter Luftausschluß gearbeitet wird und sich an der Austrittsöffung des Reaktionsgefäßes ein Kühler befindet, so daß nicht umgesetzter Alkohol zurückgewonnen wird. Beim Erreichen einer Temperatur von 70–75°C erfolgt eine erste Katalysatorzugabe (z.B. eines Katalysators für die Alkoholyse und die Umesterung, wie Natriummethanolat). Die zugesetzte Menge liegt im Bereich von etwa 0,05 oder von 0,1 Gew.-% bis etwa 0,6 Gew.-% des Wachsesters, wobei etwa 0,3 bevorzugt ist. Nach etwa 2 Stunden entnimmt man eine Probe, die auf das Vorhandensein von nicht umgesetzten Wachsestern analysiert wird. Ist der Gehalt an nicht umgesetzten Wachsestern größer als etwa 35 Gew.-% und ist eine höhere Konzentration an einfach ungesättigten Fettalkoholen in der Reaktionsmischung gewünscht, so erfolgt eine zweite Katalysatorzugabe von etwa 0,1 Gew.-% der ursprünglichen Menge an Wachsester. Die Umsetzung wird dann eine weitere Stunde lang fortgesetzt. Daraufhin wird eine Probe der Reaktionsmischung entnommen und analysiert. Ist der Gehalt an verbliebenem Ausgangsmaterial auf zwischen etwa 25–35% abgesunken, so kann man die Umsetzung als abgeschlossen ansehen. Es wird nicht länger erhitzt, jedoch auch nicht gekühlt. Wird die Umsetzung als unvollständig angesehen, so kann eine dritte Katalysatorzugabe erfolgen und die Umsetzung wie zuvor beschrieben fortgesetzt werden. Noch verbliebener Katalysator kann durch Zugabe von Citronensäure neutralisiert und desaktiviert werden. Nach etwa 15 Minuten Rühren wird der neutralisierte Katalysator (Natriumcitrat) abfiltriert. Nach dem erfolgten Entfernen des Katalysators kann noch verbliebener Alkohol vom Produkt abdestilliert werden, wobei der zurückgewonnene Alkohol für eine nochmalige Verwendung absolut trocken gehalten werden sollte.
Verwendet man als Wachsesterquelle Jojobaöl, so beträgt die Zusammensetzung an in Jojobaöl natürlich vorkommenden fettigen Substituenten 1%, 44%, 45% und 9% für C₁₈, C₂₀, C₂₂ beziehungsweise C₂₄. Die oben beschriebene Alkoholysereaktion würde die langkettigen, einfach ungesättigten Alkohols in entsprechenden Anteilen liefern. Die am meisten bevorzugte Ausführungsform der Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung enthält somit langkettige, einfach ungesättigte Fettalkohole, in denen die Alkohole in den folgenden relativen Anteilen vorliegen: Octadecenol etwa 1%, Eicosenol etwa 44%, Docosenol etwa 45% und Tetracosenol etwa 9%.
Bei einer anderen Ausführungsform kann man Wachsester unter Bildung von einfach ungesättigten, langkettigen Alkoholen und Salzen langkettiger Fettsäuren hydrolysieren. Diese Umsetzung verläuft wie unten beschrieben: Die bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung zur Anwendung gelangenden grundlegenden Umsetzungen können allgemein in der folgenden Weise betrachtet werden. Als Ausgangsmaterialien könnten die folgenden Verbindungen Verwendung finden:
ungesättigte Wachsester (wobei Jojobawachsester die bevorzugten ungesättigten Wachsester sind), R¹-COO-CH₂-R¹ I.,wobei R¹ für CH₃-(CH₂)₇-CH=CH-CH₂-(CH₂)_x- steht und x für 6, 8, 10 und 12 steht, und
ein Alkalihydroxid M-OH II.,wobei M+ für ein Metallion, vorzugsweise die Alkalimetalle Kalium oder Natrium, steht.
Typische Produktkomponenten aus dieser bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung angewandten Synthesereaktion der zweiten Ausführungsform können die folgenden einschließen:
Salze langkettiger Fettsäuren R¹-COO^–M⁺ III. und
einfach ungesättigte Fettalkohole umfassend: R¹CH₂-OH IV.,
Die Grundreaktion, die bei dieser ersten Ausführungsform der Herstellung der Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung zur zur Anwendung gelangen kann, kann wenigstens die folgenden Vorschriften umfassen.
I und II => III und IV
Vorzugsweise unterzieht man Stoffzusammensetzungen, die Wachse, Öle und/oder Fette (Lipide) enthalten und Ester enthalten, einer alkalischen Hydrolysereaktion, wodurch man eine nicht schäumende, substantive Zusammensetzung mit einzigartigen Eigenschaften erhält, die wie hier beschrieben als Wirkstoff oder auch als Träger für die Anwendung anderer Wirkstoffe, z.B. als Trägerbasis für die Anwendung kosmetischer, pharmazeutischer oder anderer Wirkstoffe, eingesetzt werden kann. Im Handel erhältliche Extrakte auf biologischer Grundlage mit einem hohen Anteil an nicht verseifbaren Bestandteilen schließen (wobei diese Aufzählung nicht einschränkend verstanden werden sollte) Candelillawachs, Carnubawachs, Jojobaöl und Lanolin ein.
Die als Ausgangsmaterialien für die Hydrolysereaktion gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten Extrakte können vor der Hydrolysereaktion auch alkoxyliert, polymerisiert, acetyliert, oxidiert, reduziert, konzentriert, teilweise hydriert, umgeestert, an der Doppelbindung modifiziert, randomisiert, aufgereinigt oder anderweitig modifiziert werden.
Die Produkte aus der Hydrolysereaktion von organischen Materialien, die nicht verseifbare Materialien liefern, enthalten eine Mischung aus: a) polaren hydrophilen Salzen (verseifbare Bestandteile); und b) unpolare, lipophile Materialien (nicht verseifbare Bestandteile), die wenigstens einfach ungesättigte Fettalkohole und Salze langkettiger Fettsäuren gemäß den obigen Formeln III und IV enthalten, wobei es auch möglich ist, daß andere Materialien vorhanden sind, je nach Quelle, Zustand und Form des ursprünglichen Reaktanden.
Die nach diesem Verfahren erzeugten Materialzusammensetzungen werden durch die Umsetzung von wäßrigen Alkalihydroxiden, z.B. NaOH, LiOH, KOH (das bevorzugte Hydroxid), Ca (OH)₂, Mg(OH)₂ und dergleichen, mit organischen Fettzusammensetzungen, gewöhnlich Pflanzenextrakte, -öle, -fette, oder -wachse (aus den Extrakten oder Derivaten der Extrakte), und vorzugsweise als langkettige Ester, hergestellt.
Als Fallbeispiel kann Jojobaöl untersucht werden. Jojobaöl enthält verschiedene Anteile an langkettigen zweifach ungesättigten Estern. Bei Hydrolysaten von auf gereinigtem Jojobaöl handelt es sich um eine nahezu 55:45-Mischung von polaren, hydrophilen, langkettigen Salzen (Alkalisalzen) und relativ unpolaren lipophilen Materialien (Fettalkoholen). Bei der lipophilen Fraktion handelt es sich um die nicht verseifbaren Materialien gemäß der in diesem Dokument verwendeten Definition. Beide diese Jojobahydrolysate haben Kohlenstoffkettenlängen, die zwischen einschließlich C₁₈ und C₂₄ schwanken, und ω-9 Doppelbindungen als Teil jedes Moleküls. Es wurde gefunden, daß die Kombination von verseifbaren und nicht verseifbaren Fraktionen der Hydrolysate gemäß der vorliegenden Erfindung Eigenschaften aufweist, die die Formulierung von kosmetischen, pharmazeutischen und anderen Zusammensetzungen erleichtert.
Die Produkte, die während der Durchführung der vorliegenden Erfindung aus der Hydrolyse von Lipiden mit einem hohen Prozentanteil an nicht verseifbaren Materialien hervorgehen, können, gleich ob sie in unver dünnter Form, in gemischter Form, in gelöster Form, in dispergierter Form oder in emulgierter Form mit Hilfsstoffen, Lösungsmitteln oder Trägern zur Anwendung gelangen, wertvolle Eigenschaften aufweisen und diese Eigenschaften Oberflächen, auf die sie aufgetragen werden, verleihen. Bei diesen Oberflächen kann es sich um lebende Oberflächen, insbesondere menschliche Haut, Pflanzenoberflächen und selbst die Oberflächen von nicht lebenden Objekten, zum Beispiel Objekten aus Holz, Fasern oder Kunststoff, handeln. Zu diesen Eigenschaften können Substantivität, Emulgieren, Hydratisierung und dergleichen zählen, wobei diese Aufzählung nicht einschränkend verstanden werden sollte.
Bei der Herstellung gibt man eine abgemessene Menge an Kaliumhydroxidpellets in einen Dampfkessel mit einer angemessenen Menge an destilliertem, vollentsalzten oder durch Umkehrosmose aufgereinigtem Wasser. Die zum vollständigen Verseifen der freien organischen Säure und/oder des Esters der organischen Säure eingesetzte Menge an Kaliumhydroxid läßt sich aus dem Verseifungswert des Ausgangsmaterials berechnen und ist theoretisch die stöchiometrische Menge. In der Praxis setzt man jedoch bevorzugt etwas weniger als die stöchiometrische Menge an Kaliumhydroxid ein, um sicherzustellen, daß die gebildeten Hydrolysate nicht durch nicht verbrauchtes Alkali verunreinigt sind. Die Menge an eingesetztem Kaliumhydroxid kann beträchtlich unter der stöchiometrische Menge liegen; je nachdem, welches Ergebnis gewünscht ist, kann man sogar nur 50% der stöchiometrischen Menge oder weniger einsetzen. Es versteht sich jedoch, daß man auch eine Kaliumhydroxidmenge, die über der stöchiometrische Menge liegt, zum Beispiel um bis zu 10% über der stöchiometrische Menge liegt, einsetzen kann, wenn man die organische Säure bzw. den Ester vollständig verseifen will. Am Ende der Umsetzung noch verbliebenes Kaliumhydroxid kann nach herkömmlichen Verfahren entfernt werden.
Die Kaliumhydroxidpellets und das Wasser werden mit dem Propellermixer zusammengerührt, bis die Kaliumhydroxidpellets in Lösung gegangen sind. Aus Sicherheitsgründen ist es wichtig, anzumerken, daß es während dieses Schritts zu Hitzeentwicklung kommt und die Mischung recht ätzend ist. In der Nähe befindliche Personen sollten Handschuhe sowie Augen- und Gesichtsschutz und sowohl gegen thermische als auch chemische Verbrennungen schützende Kleidung tragen.
Als nächstes wird eine abgemessene Menge eines aufgereinigten oder derivatisierten organischen Materials, das einen hohen Anteil an nicht verseifbaren Bestandteilen enthält, wie z.B. Jojobaöl, vorsichtig in den Dampfkessel gegeben, wobei darauf geachtet wird, daß die darin enthaltene ätzende Lösung nicht spritzt.
Der Dampfkessel wird auf 90–95°C erhitzt und unter ständigem Rühren zwei Stunden lang in diesem Temparaturbereich gehalten. Nun sollte die auf diese Weise erhaltene Mischung auf ihren pH-Wert untersucht werden. Liegt der pH-Wert der Lösung über 10,0, so wird die Mischung weiter unter ständigem Rühren auf 90–95°C erhitzt. Die Lösung wird in regelmäßigen Abständen erneut getestet, bis ein pH-Wert von 10,0 oder weniger erreicht ist.
Ist ein pH-Wert von 10,0 oder weniger erreicht, wird eine Probe für die Analyse entnommen. Diese Probe sollte durch Verfahren wie Chromatographie oder durch ein anderes verwandtes oder ähnliches Verfahren daraufhin analysiert werden, ob die Umsetzung wie gewünscht abgelaufen ist.
Das auf diese Weise erhaltene Hydrolysat kann dann durch Zugabe einer zweiten abgemessenen Menge an Wasser oder eines anderen Verdünnungsmittels zum Dampfkessel und Rühren mit dem Mischpropeller verdünnt werden. Die Hitze sollte kontinuierlich zugeführt werden, unter 80°C, bis die Mischung homogen ist.
Ist die Hydrolysatmischung homogen, so wird sie auf 60°C abgekühlt, wobei weiter mit dem Propeller gerührt wird. Die Hydrolysatmischung kann dann in einen Aufbewahrungsbehälter überführt und auf Raumtemperatur abkühlen gelassen werden, bevor der Aufbewahrungsbehälter verschlossen wird.
Zum leichteren Transfer der Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung zu dem in der Behandlung befindlichen Tier bzw. Menschen kann man einen Träger bereitstellen. Die Zusammensetzung des Trägers ist nicht kritisch, solang der Träger physiologisch kompatibel mit dem Blut und den Geweben des zu behandelnden Menschen bzw. anderen Tieres ist und im wesentlichen keine störende physiologische Wirkung aufweist.
Im besten Fall senken die Zusammensetzungen wirksam den Virus-Gesamttiter im behandelten Patienten, insbesondere bei einer systemischen Behandlung, und bei Läsionen, insbesondere bei der topischen Behandlung der betroffenen Haut- bzw. Schleimhautregionen. Die offenbarten Behandlungsverfahren reduzieren auch die Symptome von Virusinfektionen (z.B. mit durch Viren verursachten Läsionen assoziierten Schmerzen) und fördern einen schnelleren Verlauf der Wundheilung, als man ihn ohne Behandlung sehen würde.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung umfaßt die Verabreichung einer den Wirkstoff und ein Tensid enthaltenden Zusammensetzung an einen Menschen oder ein Tier zur Behandlung bzw. Prävention einer Virusinfektion. Die Verabreichung erfolgt vorzugsweise an die Haut bzw. Schleimhaut, wobei ein Stift wie z.B. ein Lippenstift oder Lippenbalsam), eine Creme, eine Lotion, ein Gel, eine Salbe, eine Suspension, ein Aerosolspray oder eine halbfeste Formulierung (z.B. ein Zäpfchen) verwendet wird, die jeweils nach im Stand der Technik bekannten Methoden formuliert werden. Die Anwendung der den Wirkstoff und Tensid enthaltenden, bei der Prävention oder Behandlung von Virusinfektionen wirksamen Zusammensetzungen besteht aus einer bis zehn Anwendungen von 10 mg bis 10 g pro Anwendung über einen bis vierzehn Tage. Die Anwendungen erfolgen im allgemeinen einmal alle zwölf Stunden und bis zu einmal alle vier Stunden. Vorzugsweise reichen zwei bis vier Anwendungen der Zusammensetzung pro Tag von etwa 0,1 g bis 5 g pro Anwendung über ein bis sieben Tage für die Prävention bzw. Behandlung einer Virusinfektion aus. Bei topischen Anwendungen werden die Zusammensetzungen vorzugsweise auf die Läsionen aufgetragen, sobald die Symptome (z.B. Schmerz, Schwellung oder Entzündung) festgestellt werden.
Die Zusammensetzungen und Verfahren eignen sich für die Prävention bzw. Behandlung verschiedener Virusinfektionen wie den durch Herpesviren einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, HSV-1, HSV2 und HSV-6, Cytomegalovirus (CMV), Epstein-Barr-Virus (EBV) und Varicella-Zoster-Virus (VZV), durch Grippeviren, Human-Lymphotrophic-Viren (z.B. HTLV-1), Human-Immunodeficiency-Viren (z.B. HIV-1), Papillomavirus und Respiratory-Syncytial-Virus verursachten.
Für die intravenöse oder intramuskuläre Injektion in menschliche oder tierische Patienten geeignete Zusammensetzungen enthalten Alkohole der allgemeinen Formel R¹CH₂-OH, wobei R¹ für CH₃-(CH₂)₇-CH=CH-CH₂-(CH₂)_x- steht und x für 6, 8, 10 und 12 steht, in einem für die intravenöse oder intramuskuläre Injektion geeigneten Träger. So kann man beispielsweise eine Suspension von 0,1 mg/ml bis 300 mg/ml der Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung suspendiert in einer Trägerlösung von einen geeigneten Konservierungsstoff wie 0,1 bis 1,5% Benzylalkohol, Stabilisatoren wie 0,25 bis 1% Carboxymethylcellulose-Natrium und 0,005 bis 0,1% Polysorbat 80 und ausreichende Natriumhydroxid oder Salzsäure zum Einstellen des pH-Wertes auf 5,0 bis 7,5, jeweils in Gewichtsprozenten, enthaltender isotonischer Kochsalzlösung entweder für die intravenöse oder die intramuskuläre Injektion verwenden.
Bei einer anderen für die intravenöse oder intramuskuläre Injektion in den menschlichen oder tierischen Patienten geeignete Zusammensetzung kann es sich um die Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung suspendiert in einer Trägerlösung aus Ethylalkohol (1–10%), Glycerin (10–20%) und Wasser (restliche 70–89%), zusammen mit geeigneten Konservierungsstoffen, handeln.
Solche Zusammensetzungen können in geeigneten Mengen injiziert werden, so daß dem Patienten eine Dosis von 0,1 mg/50 kg Körpergewicht bis 2 gm/50 kg Körpergewicht zugeführt wird. Es ist wünschenswert, eine Konzentration der angegebenen Zusammensetzung im Körper im Bereich von wenigstens etwa 0,1 mg/kg Körpergewicht zu erzielen und aufrechtzuhalten.
Die Zusammensetzung, auf die sich die vorliegende Erfindung richtet, läßt sich wirksam über das Schleimhautsystem des menschlichen oder tierischen Patienten einführen. Eine solche Einführung kann beispielsweise über die vaginalen, analen, oralen oder nasalen Membranen erfolgen. Die obigen flüssigen Zusammensetzungen in einem geeigneten flüssigen Träger lassen sich zum Beispiel für die Einführung einer solchen Zusammensetzung über die Schleimhaut in den Blutkreislauf des zu behandelnden Menschen oder Tiers verwenden, beispielsweise indem man eine solche Flüssigkeit als Aerosol in die Mund- oder Nasenpassagen oder als Flüssigkeit in die Vaginal oder Analpassage des Körpers einbringt, wobei diese Verbindungen das Virus lokal desaktivieren, die den Übertritt des Virus in die Membran hemmen und über die Membran in den Blutkreislauf des Patienten gelangen, wobei die Verbindungen als Inhibitoren der Virusaktivität und -infektivität wirken und das Virus desaktivieren. Für die letztgenannten Anwendungen kommen jedoch zweckmäßigerweise eher Gele, Cremen oder Zäpfchen zum Einsatz.
Die alkoholhaltige Zusammensetzung kann ebenso über den Anus einführt werden, wobei sie ebenfalls das Virus desaktiviert, den Übertritt des Virus in die Membran hemmt und über die Membran in den Blutkreislauf des Patienten gelangt, wo sie als Inhibitor der Virusaktivität und -infektivität wirkt und das Virus im Blutkreislauf und in durch den Blutkreislauf versorgten Zellen desaktiviert. Die beschriebene Zusammensetzung kann in einer beliebigen physiologisch unbedenklichen Form vorliegen, z.B. als Creme- oder Zäpfchenzusammensetzungen. Ein beispielhaftes Zäpfchen kann im wesentlichen aus der Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung allein oder in einer Konzentration von 0,05 mg/gm an Träger bis 400 (oder mehr) mg/gm an Träger bestehen. Als Zäpfchenträgerkomponente wird herkömmlicherweise Kakaobutter verwendet, allein oder als Mischung beispielsweise mit Weinsäure und Äpfelsäure. Als Träger für Zäpfchen kommen auch Polyethylenglykole mit einem geeigneten Molekulargewicht in Frage. Zäpfchen können auch einen Konservierungststoff wie Methylparaben oder Benzethoniumchlorid sowie, falls gewünscht, Säure- oder Basenkomponenten, mit denen der pH-Wert auf einen Bereich von etwa pH 5 bis pH 7,5 eingestellt werden kann, enthalten. Zur Herstellung eines empfängnisverhütenden und/oder antiviralen Zäpfchens kann man mit der Zusammensetzung eine beliebige geeignete der obigen oder eine andere Zäpfchenträgerzusammensetzung verwenden. Bei dem Zäpfchen muß es sich, damit es kommerziell und ästhetisch annehmbar ist, bei Raumtemperatur, d.h. allgemein im Bereich von etwa 27°C, um einen festen Stoff handeln, der bei oder etwas unter Körpertemperatur, d.h. im allgemeinen Bereich von etwa 37°C, schmilzt. Bei diesen Temperaturen handelt es sich natürlich nur um allgemeine Bereiche, und der genaue Schmelzpunkt ist nicht kritisch.
Eine transmembranale Einführung der Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung läßt sich über die Einführung kleiner Mengen solcher Alkohole in unverdünnter Form bewerkstelligen, eine solche Einführung ist jedoch schwer zu steuern und ineffizient.
Creme- und Gelzusammensetzungen in Konzentrationen von etwa 0,1 mg/ml bis 300 mg/ml (oder mehr) in einen geeigneten Creme- oder Gelträger können ebenfalls effektiv eingesetzt werden. Ein solches Gel kann beispielsweise ein Suspendiermittel wie Carbomer^®-Polyacrylsäure quervernetzt mit Allylsaccharose, Polyethylenglykol, Wasser und geeignete Konservierungsstoffe enthalten. Eine geeignete Cremgrundlage kann zum Beispiel Vaseline, Polyoxyethylenstearat, Cetylalkohol, Stearylalkohol, Propylenglykol, Isopropylmyristat, Sorbitanmonooleat und Wasser zusammen mit geeigneten Konservierungsstoffen eingestellt auf einen pH-Wert von pH 5 bis pH 7,5 enthalten.
Die hier interessierende Zusammensetzung kann auch durch Inhalieren der Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung in einem geeigneten physiologisch unbedenklichen Träger für die transmembranale Passage in den Blutkreislauf des menschlichen oder tierischen Patienten sowie als Prophylaxe gegen Infektion durch ein aerogenes Virus eingeführt werden. Die zuvor erwähnten flüssigen Zusammensetzungen können beispielsweise in einen Vernebler abgepackt und auf herkömmliche Weise über die nasalen oder oralen Passages eingeführt werden. Eine exemplarische Zusammensetzung enthält die Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung suspendiert in einem Aerosoltreibmittel wie Trichlormonofluormethan und/oder Dichlordifluormethan, zusammen mit Verdünnungsmitteln, Konservierungsstoffen, Mitteln zum Einstellen des pH-Wertes usw. Die exemplarische Aerosolzusammensetzung führt der Schleimhaut eine im wesentlichen reine Zusammensetzung zu. Eine exemplarische Ohrtropfenzusammensetzung führt dem Trommelfell eine im wesentlichen reine Zusammensetzung zu. Vergleichbare flüssige Tropfen können unter Verwendung von entsprechenden Tropfern den Augen, den Ohren und dem Mund zum Einbringen in und zur Passage durch die Membranen in den betreffenden Organen zugeführt erden.
Alle transmembranen Zusammensetzungen können zusätzlich zu anderen Bestandteilen auch penetrationsfördernde Substanzen enthalten. Eine Reihe solcher Substanzen sind als penetrationsfördernde Substanzen bekannt und können in den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung zur Anwendung gelangen. Ein solches Vehikel ist Dimethylsulfoxid, das in der US-Patentschrift Nr. 3,551, 54 beschrieben wird. Andere solche penetrationsfördernde Substanzen sind offenbart in den US-Patentschriften Nr. 3,989,816; 3,991,203; 4,112,170; 4,316,893; 4,415,563; 4,423,040; 4,424,210; 4,444,762, manchmal bezeichnet als Azone^®.
Die antivirale Wirksamkeit dieser Alkohole wurde durch in-vitro-Tests bestätigt, wie aus dem folgenden Beispiel hervorgeht.
Zur Abschätzung der antiviralen Wirkung der Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung wurde ein Standard-Plaqueassay verwendet. Diesen Plaqueverminderungsassay verwendet man gewöhnlich in der pharmazeutischen Industrie für die Untersuchung von Material auf antivirale Aktivität. In diesem Assay werden gegenüber einer Virusinfektion empfindliche Säugetierzellen in Gewebekultur herangezogen. Diese Kulturen werden nichttoxischen Konzentrationen der Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung und anschließend lebendem Virus ausgesetzt. Die Anzahl der Zellen, die infiziert werden, sterben und das Virus an die umgebenden Zellen weitergeben wird gemessen, indem man die Regionen in der Kultur zählt, in denen es keine lebensfähigen Zellen (d.h. Plaques) gibt. Der erste Schritt bei der Durchführung des Assays ist daher die Bestimmung der Zytotoxizität der getesteten Zusammensetzung in Verozellen. Verozellen sind epithelähnliche Zellen, die ursprünglich aus der Niere der normalen afrikanischen Grünen Meerkatze stammen. Diese Säugetierzellen sind gegenüber einer Virusinfektion empfindlich. Die Zytotoxizität der Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung wurde mit einem Mikrokultur-Tetrazoliumassay (MTA) bestimmt.
Dann wurde mit nichttoxischen Konzentrationen der Zusammensetzungen über einen Plaquereduktionsassay die virale Wirksamkeit (d.h. die antiviralen Eigenschaften) der Zusammensetzungen bei der Anwendung zur Behandlung von Verozellen, die dem Herpes-Simplex-Virus Typ 1 (HSV-1) ausgesetzt worden waren, bestimmt.
Die Zusammensetzungen wurden in Eagles Minimum Essentials Medium, das 10 mg/ml PLURONIC F-68 (von BASF), ein nichtionisches Tensid, das auf 50°C erhitzt worden war, enthielt, suspendiert. Das Tensid diente zur Erleichterung des Dispergierens der nicht leicht wasserlöslichen Zusammensetzungen in einem Medium auf Wasserbasis. Die Zusammensetzungen wurden zu verschiedenen Aliquots zu Konzentrationen von 25%, 10%, 5%, 2,5%, 1%, 0,5%, 0,25% und 0,1% zugesetzt.
Konfluente Verozellen in Mikrokulturplatten mit 96 Vertiefungen wurden in einem Inkubator mit angefeuchteter Luft (36–38°C in 5–7% CO₂) ungefähr 72 Stunden lang mit wie oben hergestellten Suspensionen behandelt. Die Suspensionen wurden abgesaugt und die Kulturen wurden vorsichtig mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde quantifiziert, indem man einen Mikrokultur-Tetrazoliumassay (MTA) mit 2,3-Bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5[(phenylamino) carbonyl]-2H-tetrazoliumhydroxid (abgekürzt "XTT") durchführte. In jede der Vertiefungen wurde für 3–5 Stunden bei 36–38°C in 5–7% CO₂ eine 1-mg/ml-Lösung von XTT ergänzt mit 6,12 μg/ml Phenazinmethylsulfat gegeben.
Das XTT-Reagens dringt in die Zellen ein. In lebensfähigen Zellen wird das XXT-Reagens durch die Mitochondrien metabolisiert, wobei ein löslicher blauer Formazinfarbstoff entsteht. Wenn die mit den Suspensionen behandelten Zellen in der Vertiefung abgestorben bzw. nicht dazu in der Lage sind, das XTT zu metabolisieren (d.h. nicht lebensfähig), so ist die Menge an produziertem Farbstoff geringer als die in lebensfähigen Kulturen produzierte Menge. Die Menge an während der Verstoffwechselung des XTT-Reagens produzierten Farbstoffs wurde durch unter Verwendung eines Spektrophotometers (450 nm) erhaltene Werte für die optische Dichte (OD) quantifiziert. Die prozentuale zelluläre Umwandlung in den behandelten Zellen wurde durch Vergleich mit den OD-Werten von Kontrollzellen berechnet. Die Verstoffwechslung von XTT wird mit unbehandelten Kontrollkulturen verglichen und als Prozentsatz der unbehandelten Kontrollen ausgedrückt. Da der MTA-Assay ein Maß für lebensfähige Zellen ist, kann er auch Informationen zur Proliferation (vermehrte Zellteilung) von behandelten Zellen im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen liefern. Die Ergebnisse des MTA-Assays sind unten in Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1. MTA-Assay
BESTIMMUNG DER ANTIVIRALEN WIRKUNG
Nierenzellen der Grünen Meerkatze (Verozellen, ATTC CCL81) wurden mit dem Virusstamm VML-6143 des Typ-1 Herpes-Simplex-Virus (HSV-1), der gegenüber allen bekannten Anti-HSV-Arzneimitteln empfindlich ist, bzw. dem Stamm 15671, der gegen Acyclovir, Penciclovir und Ganciclovir resistent ist, infiziert. Dies erfolgte zur Bestimmung der Auswirkungen der Anwendung von Suspensionen der vorliegenden Zusammensetzungen auf die Effizienz der Plaquebildung. Die Verozellen wurden in Eagles Minimal Essentials Medium (E-MEM) ergänzt mit 2–10% hitzedesaktiviertem fetalen Rinderserum (FBS), 100 Einheiten/ml Penicillin, 2,5 μg/ml Amphotericin B und 10 μg/ml Gentamicin bei 36–38°C in einer Kammer mit angefeuchter Atmosphäre mit 5–7% CO₂ herangezogen und erhalten. Am Tag vor der Infektion wurden Kontrolltensidsuspensionen bzw. die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung enthaltende Suspensionen zu den 90% = 100% konfluenten Verokulturen gegeben. Nach 24 Stunden wurde der HSV-1-Virus zu den Kulturen gegeben, wobei ungefähr 30 plaquebildende Einheiten (plaque forming units, PFU) pro Vertiefung in Platten mit 12 Vertiefungen gegeben wurden. Ungefähr 48 Stunden nach der Zugabe von HSV-1 wurden die Kulturen einmal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen. Die Zellen wurden mit SafeFix fixiert, mit 0,8%iger Kristallvioletlösung angefärbt und an der Luft trocknen gelassen. Die Plaques wurden mit Hilfe eines Stereoskops und eines elektronischen Handkolonienzählers ausgezählt. Die angegebenen Daten sind die Durchschnittswerte (Mittelwerte) von zwei Kulturen. Die Daten wurden zur Bestimmung der Konzentration, die zu einer 50%igen Verminderung der Plaques führte (IC₅₀), graphisch analysiert.
Die Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung bewirkte eine dosisabhängige Inhibierung der Plaquebildung, was auf eine direkte antivirale Wirkung gegen die klinischen HSV-1-Standardkontrolle, Stamm 6143, und acyclovirresistentes HSV-1, Stamm 15671, hindeutet. Die Plaque-Daten für Stamm 6143 sind in Tabelle 2 aufgeführt. Die Plaque-Daten für Stamm 15671 sind in Tabelle 3 aufgeführt.
Tabelle 2. HSV-1, Stamm 6143 – Anti-Plaque-Wirkung der getesteten Zusammensetzung
Tabelle 3. HSV-1, Stamm 15671 – Anti-Plaque-Wirkung der getesteten Zusammensetzung
Die geschätzten Konzentrationen, bei denen die Anzahl an Plaques im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollvertiefungen um 50% reduziert waren, betrugen 5,1 mg/ml für Stamm 6143 und 2,2 mg/ml für Stamm 15671. Überraschenderweise wurde festgestellt, daß die Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung nicht nur gegen den. behandlungsresistenten Stamm wirkt, sondern auch eine geringere IC₅₀-Konzentration erfordert als der nichtresistente Stamm.
Beim Testprotokoll erfolgte vor der Zugabe des Virus eine 24stündige Inkubation mit den Suspensionen, ausreichend Zeit für die Aufnahme und Verstoffwechselung der Zusammensetzung durch die Zellen. Aufnahme und Verstoffwechselung werden bei einigen langkettigen Alkoholen als für das Herbeiführen von antiviraler Wirkung notwendig erachtet. Eine minimale Erhöhung der zellulären Proliferation von Verozellen, die langkettigen Alkoholen ausgesetzt waren, wurde ebenfalls berichtet.
Die Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung zeigte somit keine Zytotoxizität bis zu und einschließlich Konzentrationen von 250 mg/ml, der höchsten getesteten Konzentration. Die Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung reduzierte die Plaquebildung in mit HSV-1 infizierten Zellen in einer konzentrationsabhängigen Weise, zeigte spezifische antivirale Wirkung sowohl gegen den klinischen HSV-1-Standardstamm (6143) als auch gegen den acyclovirresistenten Stamm (15671). Der IC₅₀-Wert ist die niedrigste Konzentration, die entweder den Schweregrad der Virusinfektion oder die Anzahl an durch Viruspartikel infizierten Zellen um 50% senkt. Es ist weiterhin die Konzentration, die zu einer 50%igen Verminderung der durch das Virus verursachten Plaques führt. Der IC₅₀ der getesteten Zusammensetzung betrug 0,51% für Stamm 6143 und 0,22% für Stamm 15671.
Die Entdeckung, daß diese Kombination von Alkoholen entweder alleine oder in Kombination mit anderen Zusammensetzungen wie Salzen von langkettigen Fettsäuren und/oder gemischten Estern, die natürlich vorkommen und in den relevanten Konzentrationsbereichen im wesentlichen nichttoxisch sind, eine signifikante antivirale Wirkung haben, wird als sehr wichtig angesehen, da hierdurch der Weg geöffnet wird zu einem sicheren und wirksamen Verfahren zur Behandlung von Viruskrankheiten und zur Prävention oder zumindest zur signifikanten Verminderung der Wahrscheinlichkeit einer Virusinfektion eines menschlichen oder tierischen Patienten, ohne signifikante Nebenwirkungen und ohne die Erfordernis einer intensiven Kontrolle durch den behandelnden Arzt, wie dies bei von Natur aus toxischen Verbindungen der Fall ist.
Als Behandlung der erworbenen Immunschwäche (acquired immunodeficiency syndrome, AIDS), als Verfahren zur prophylaktischen Behandlung von Personen, die AIDS ausgesetzt sind und/oder das AIDS-Virus tragen, jedoch keine AIDS-Symptome zeigen, und als Verfahren und Zusammensetzungen zur Prävention oder Verminderung des Risikos einer Infektion durch AIDS und virusinduzierte Krankheiten wird die vorliegende Erfindung als eine signifikante Verbesserung angesehen.
Ein anderer wichtiger Aspekt der Erfindung ist, daß sie eine sichere und wirksame Möglichkeit zur Behandlung von Krankheiten bieten kann, die von einer Infektion des Patienten durch lipidhaltige Viren wie HTLV-1, HSV-1, HSV-2, Cytomegalovirus (CMV), Epstein-Bar (EBV) und Grippeviren herrühren.
Das Infektionsrisiko durch Viren wie HIV, HSV-1, HSV-2, CMV, EBV, Grippeviren und andere Viren, die durch persönlichen Kontakt, Kontakt mit verunreinigtem Blut oder Gewebe oder Laborinstrumenten oder -geräten, Aerosolübertragung usw., übertragen werden, kann durch die Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung wesentlich reduziert werden.

Claims

Physiologisch unbedenkliche Medikamentenzusammensetzung, enthaltend: wenigstens einen einfach ungesättigten C_n-Alkohol, wobei 18 ≤ n ≤ 24; wenigstens ein Salz einer Fettsäure der Formel R¹-COO^–M⁺, wobei: R¹ CH₃-(CH₂)₇-[CH=CH-CH₂-(CH₂)_x]^– enthält; x für wenigstens eine der Zahlen 6, 8, 10 und 12 steht; M⁺ für ein einwertiges Alkalimetallion steht und einen physiologisch unbedenklichen Träger.
Physiologisch unbedenkliche Medikamentenzusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der einfach ungesättigte Alkohol die Formel CH₃-(CH₂)₇-CH=CH-CH₂-(CH₂)_xCH₂OH aufweist, wobei x für wenigstens eine der Zahlen 6, 8, 10 und 12 steht;
Physiologisch unbedenkliche Medikamentenzusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, weiterhin enthaltend wenigstens eine die Penetration verbessernde Verbindung, wobei der physiologisch unbedenkliche Träger injizierbar ist, wobei die Medikamentenzusammensetzung geeigneterweise für die transdermale Verabreichung, intravenöse Injektion und/oder intramuskuläre Injektion in Menschen oder andere Säugetiere ausgelegt ist.
Physiologisch unbedenkliche Medikamentenzusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, bei der es sich um ein Zäpfchen für die transmembrane Verabreichung in den Anus und/oder die Vagina von Menschen oder anderen Säugetieren handelt, wobei der physiologisch unbedenkliche Träger bei Raumtemperatur im wesentlichen fest ist und bei ungefähr 37°C schmilzt.
Medikament nach einem der Ansprüche 1, 2, 3 und 4, wobei die Zusammensetzung weiterhin wenigstens einen gemischten Ester der Formel R¹-COO-R² enthält, wobei: R¹ für CH₃-(CH₂)₇-[CH=CH-CH₂-(CH₂)_x] steht; x für wenigstens eine der Zahlen 6, 8, 10 und 12 steht und R² für eine Alkylgruppe und/oder eine aliphatische Gruppe steht.
Medikament nach Anspruch 5, wobei die aliphatische Gruppe 1 bis 12 Kohlenstoffatome aufweist.
Medikament nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Verhältnisse der Alkohole 1% Octadecenol; 44% Eicosenol; 45% Docosenol; und 9% Tetracosenol betragen.
Verwendung von wenigstens einem Octadecenol, Eicosenol, Docosenol und Tetracosenol und wenigstens einem Salz einer Fettsäure der Formel R¹-COO^–M⁺, wobei: R¹ für CH₃-(CH₂)₇-[CH=CH-CH₂-(CH₂)_x]^– steht; x für wenigstens eine der Zahlen 6, 8, 10 und 12 steht; und M⁺ für ein einwertiges Alkalimetallion steht, bei der Herstellung einer intravenösen, intramuskulären, transmukosalen, transdermalen oder oralen Zusammensetzung zur Prävention, Inhibierung oder Behandlung von Viruskrankheiten in Menschen oder Tieren.
Verwendung nach Anspruch 8, bei der man wenigstens einen gemischten Ester der Formel R¹-COO-R² zusetzt, wobei: R¹ für CH₃-(CH₂)₇-[CH=CH-CH₂-(CH₂)_x] steht; x für wenigstens eine der Zahlen 6, 8, 10 und 12 steht; und R² für eine Alkylgruppe und/oder eine aliphatische Gruppe steht, die vorzugsweise 1 bis 12 Kohlenstoffatome aufweist.
Verwendung nach Anspruch 8 oder 9, wobei die Alkohole in Verhältnissen von 1% Octadecenol; 44% Eicosenol; 45% Docosenol; und 9% Tetracosenol vorliegen.
Verwendung nach Anspruch 8 zur Herstellung eines Medikaments zur Prävention oder Behandlung von Virusinfektionen, die durch Herpesviren, Grippeviren, humane lymphotrophe Viren, Human-Immunodeficiency-Viren, Papillomaviren oder Respiratory-Syncitial-Virus verursacht werden.
Verwendung nach Anspruch 8 zur Herstellung eines Medikaments zur Prävention oder Behandlung von Vireninfektionen, die durch HSV-1, HSV-2, HSV-6, Cytomegalovirus (CMV), Epstein-Barr-Virus (EBV) oder Varicella-Zoster-Virus (VZV) verursacht werden.