PT88266B

PT88266B - Processo para a prepracao de composicoes farmaceuticas parenterais contendo dsrna

Info

Publication number: PT88266B
Application number: PT88266A
Authority: PT
Inventors: William A Carter
Original assignee: Hem Res Inc
Priority date: 1987-08-12
Filing date: 1988-08-12
Publication date: 1995-05-04
Also published as: EP0308066B1; PT88266A; AU2053588A; NZ225799A; IL87413A0; AU1001595A; DK449888A; DK449888D0; KR890003402A; EP0308066A3; JPH01131119A; CN1032740A; IE72103B1; FI883763A; RU1834663C; ZA885967B; IE882399L; HUT47854A; CA1327002C; FI883763A0

Description

DESCRIÇÃO

Vários fluídos biológicos incluindo as i lagrimas, as secreções vaginais e as ejaculações masculinas i (ricas em esperma) podem conter vários microorganismos (fun- í ( gos, bactérias e vírus) capazes de causar ou de ajudar a dis- I seminar varias doenças terríveis. Frequentemente usam-se tra i tamentos tópicos ou directos antimicrobianos (espumas, pulve- | :! rizaçoes etc.) apesar do valor limitado destes tratamentos por ! ί j i causa da natureza de sequestro do(s) microorganismo (s) que os

P torna relativamente nao acessíveis aos tratamentos. As aplicações tópicas podem também ser de valor limitado em virtude ; da irritação local que provocam bem como do elevado potencial i para causar reacções alérgicas. Descrevo na presente memória i descritiva vias parenterais de administraçao para administrar í

Ί ARNdc's (dsRNAs) que têm como resultado a libertação inesperada

CR.

de mediadores de defesa do hospedeiro em vários fluídos bioló i gicos incluindo os que normalmente sao permutados durante o i coito. Deste modo, descrevi uma nova técnica para a redução | da infectividade e da disseminação de vários organismos in- ! eluindo os associados com várias doenças incluindo as asso- ! ciadas com verrugas venereas, herpes e vírus da imunodeficiên cia humana, etc,. i ί

ANTECENTES DA INVENÇÃO i

í

Os produtos mais recentes que podem d£ sempenhar papeis cruciais na luta contra as infecções e contra o cancro cancros são os chamados imuno-moduladores, como i sejam os interferões (IFN), as interleuquinas (IL) e os factores de necrose de tumores (TNF). Estes produtos são proteinácios e podem aumentar ou desencadear os esforços naturais do corpo de defesa contra a doença. No entanto, estes produtos contendo proteínas nao podem em geral ser dados sob forma líquida ou de comprimidos porque o estômago destrói estas pro teínas antes de poderem ser absorvidas na corrente sanguínea, j

Para além disso, a administraçao parenteral destes produtos !

____ i (IV. IM ou subcutânea) pode produzir efeitos secundários incó- ! modos, especialmente com altas concentrações ou com períodos j de tratamento prolongados. Em consequência, vãrios investigadores tentaram desenvolver preparações activas tópicas para uso na pele, nos olhos e especialmente para combater várias doenças venéreas. Por exemplo, Rapp e Wrzos (Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Vol. 28, pãg. 449, 1985) descreveram uma espuma ou creme contraceptivo no qual um agente antiviral (IFN) estava combinado com um detergente tensio-activo não ío nico que tinha a finalidade primária de proteger um (ou ambos): dos parceiros durante o coito da disseminação do vírus de her ( pes. A eficácia relativa destes preparados de aplicação tópi_ | ca, etc., nao foi ainda elucidada; no entanto, o uso anterior de preparados antivirais de aplicação tópica tem tido um êxito limitado. As limitações destas abordagens incluem a natureza de sequestro (falta de acessibilidade aos preparados) de algu mas partículas virais bem como a capacidade local imune redu2

ji zida da região do corpo infectada, tornando improvável qualquer resposta terapêutica durável. j

Os tecidos infectados com vírus suscept/ i veis ao IFN, como os vírus (herpes simplex) da pele, dos olhos e das membranas mucosas, sao tratados com composiçoes tópicas dos indutores de interferao ARNdc¹ s, principalmente de poli I.i

C numa formulação de libertação retardada, conforme descrito ;

u na Patente US N°. 4 283 393 (Fieid et al.). A literatura de j ¹ - — - ! patentes descreve também agentes antivirais de aplicação tó- j

I pica, tais como agentes tensio-activos não iónicos como a- í lj gentes de inactivação para herpes simplex, como na Patente US í

Νθ. 4 020 183 (Asculai et al.) isoladamente ou em combinação com um interferao, como na Patente US N°. 4 507 281 (Asculai ' ji et al.) .

H Consegui superar estas limitações ineren h tes dos procedimentos e materiais de acordo com o estado da técnica em virtude de um novo e surpreendente grupo de obser- i vaçoes nas quais eu mostro que a administraçao parenteral de l — ί

ARNdc causa a libertação de fragmentos de ARNdc bioactivos que atravessam rapidamente a barreira sangue-cérebro e pene- j tram nos fluídos compartimentalizados incluindo a saliva, as ' lágrimas, os fluídos serosos, os exsudados serosos e semelhan ; tes. Estes mediadores de combate às doenças penetram facil mente em vários fluídos biologicos — mesmo na ausência de ARNdc intacto detectável nos próprios fluídos.

Na presente memória descritiva a expressão fluídos corporais compartimentalizados refere-se a um fluído corporal localizado exterior a circulação sanguínea sistémica. Estes fluídos corporais compartimentalizados in- ! cluem fluídos sobre superfícies serosas, superfícies mucosas, o revestimento sinovial, as superfícies uretrais, o revesti' mento serviçal, o fluído cerebroespinal e no compartimento do ¹fluído ocular.

Mostro de um modo específico as elaborações dos mediadores que sao capazes de atacar directamente ví rus e simultaneamente de armar o sistema imune local, como no interior do sistema genito-urinário.

Na prática da presente invenção, ilustro de forma drástica como podem ser essencialmente reduzidos ou talvez erradicados da ejaculação masculina os níveis potencialmente elevados de vírus (incluindo o HIV, os vírus de herpes e o citomegalovirus) que de outro modo poderiam causar vãrias doenças terríveis tanto ao próprio como aos seus parceiros sexu ais. A presente invenção é de relevácia imediata também pa ra a produção de mediadores de combate a doenças nos exsuda dos e transudados (articulações artriticas) e nos fluídos cerebroespinais. Deste modo, a presente invenção é directa mente pertinente para doenças tão diferentes como várias ar trites e doenças do sistema nervoso central.

As composições farmacêuticas da presen te invenção são também eficazes para minimizar a patogenici dade de agentes filtráveis em fluídos biológicos remotos, por exemplo dos agentes filtráveis que se encontram em fluí dos biológicos como o fluído cerebroespinal, particularmente nos envolvidos na doença de Alzheimer e em outras doenças j progressivas ou em vírus lentos que causam uma deterioraçao mental progressiva.

i

No pedido de Patente Europeia publicado sob o número 0 213 921 em 11 de Março de 1987 com o título Modulação de acontecimentos relacionados com vírus por ARNs de dupla cadeia o inventor descreve a inibição de HIV em cultura de células humanas por ARNdc's, usando especificamen te Ampligen^K como um prototipo de ARNdc.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A figura 1 representa um gráfico de uma cromatografia de alta pressão (HPLC) em três partes que analisa os vários componentes da via metabólica antiviral natural (2'-5'-oligo-A/RNase L) do fluído biológico de um paciente antes e depois de administração de ARNdc para o paciente A do Exemplo 1;

A Figura 2 representa um gráfico em três partes de uma cal/ braçao normalizada (pista 6) e os resultados da análise por HPLC (pistas 4 e 5) do paciente B do Exemplo 1; e

A Figura 3 representa um gráfico que mostra o efeito da in/ bição por ARNdc sobre a infecção por citomegalovirus de células previamente tratadas com um ARNdc em comparaçao com células nao tratadas, conforme descrito no Exemplo 4.

i

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Descrevem-se procedimentos para a activa çao das vias antivirais naturais e para o reforço do sistema imune de um indivíduo antes da exposição de uma doença, para a prevenir ou, depois de a contrair, para a tratar, sendo o/ jéctivo da activação induzir o corpo do paciente a libertar ’ mediadores de combate ã doença em vários fluídos biológicos, i incluindo fluídos biológicos em compartimentos localizados do corpo, conforme explicado seguidamente. A administraçao parenteral de ARNdc, de preferência de um ARNdc desemparelhado, conforme explicado em pormenor seguidamente, provoca a liber- ¹taçao de fragmentos bioactivos de ARNdc, referidos por vezes na presente memória descritiva como mediadores de combate a doenças, nestes fluídos biológicos, mesmo na ausência de ARN- ; dc¹s intactos detectáveis nos próprios fluídos. Estes frag- í mentos bioactivos de ARNdc atravessam facilmente a barreira í sangue-cérebro e outros compartimentos corporais separados da |

circulação geral do sangue por tecidos e localizam-se no(s) fluído(s) pretendidos.

Descrevem-se igualmente procedimentos de : ensaio de diagnóstico para a medição dos mediadores de defesa j hospedeiro/paciente inactivos nos fluídos biológicos e, se in í suficientes, para a administraçao de um ARNdc numa quantidade e por um período de tempo suficiente para reduzir a quantidade do agente ou dos agentes patogénicos e/ou para reduzir os processos da doença e restaurar o nível de ARNdc necessário {

para que os respectivos fragmentos bioactivos contribuam para a melhoria dos parâmetros bioquímicos dos mediadores de defe- , sa no fluído em exame.

A doença diagnosticada e/ou tratada por ΐ intermédio das composições preparadas de acordo com a presen te invenção podem ser de natureza virai, por exemplo provoca dora por um vírus da família do herpes, incluindo o citomega lovirus, um vírus da família dos retrovirus, incluindo o HIV, ; uma doença inflamatória como as afecçoes artríticas, doenças provocadas por espécies bacterianas sensíveis ou doenças de j origem em fungos ou em protozoários. ί

Existe uma ampla gama de agentes patogé i nicos potencialmente sequestrados em fluídos biológicos fora j da corrente sanguínea. Estes fluídos biológicos compartimen ι talizados (com exclusão do sangue) sao normalmente inacessí- ;

* - ί í veis aos produtos farmacêuticos que sao constituídos por ma- j cromoléculas (proteínas, ácidos nucleicos, etc.) administrados por via sistémica. Na presente memória descritiva enten ί de-se, tal como na literatura médica, que por administraçao [ ~ i parenteral se entende a introdução directa no sangue, seja j por perfusão IV ou por outros meios, ou a introdução num compartimento que é fácilmente acessível a corrente sanguínea como ocorre quando se administra um produto constituído por macromoléculas por meio de uma introdução (injecçao) inicial ; intramuscular ou subcutânea. Estas macromoléculas de alto pe | so molecular também podem ser administradas por via oral se forem encapsuladas, revestidas com um revestimento enterico ou com um pré-revestimento de modo adequado ou tornadas de qualquer outro modo relativamente inacessíveis às forças des_ i trutivas, como sejam o pH e as enzimas que ocorrem no tracto ; gastro-intestinal superior. Todos estes modos de administra, ção poderão dar origem a níveis mais ou menos detectãveis de · macromoléculas na corrente sanguínea eventualmente mas nao ne ’ t

cessariamente em outros fluídos biológicos (serosos), -- peloί menos nao certamente sob uma forma ou configuração altamente bioactiva.

A dificuldade de alcançar estes fluídos compartimentalizados distais e largamente devida às barreiras

físicas (membranas, células, etc.) que servem para proteger ι vários compartimentos do corpo (tracto G-U, articulações, ca i vidade oral, SNC, etc.) da passagem fácil de agentes patogé- j nicos de um compartimento do corpo para outro (isto é, a di_s seminação dos agentes patogénicos). Deste modo, embora estas barreiras físicas tenham um valor óbvio para o homem em termos de manter as doenças localizadas e reduzir a disseminação de microorganismos incluindo vírus, constituem um impedimento significativo à fácil distribuição das referidas substâncias de combate ãs doenças como imunomoduladores que tendem a ser (a) macromoléculas (embora nao sempre) e ~ - ¹ (b) nao fãcilmente capazes de penetrar nestas barreiras incluindo gradientes célula/membrana.

Deste modo, vários investigadores exploraram os modos de introduzir estes compostos imunomoduladores/antivirais/antican j cro directamente em compartimentos do corpo localizados por i < < - i meio de veículos fisiologicamente compatíveis, como tampões, preservativos, etc.. Até agora, estas abordagens apenas têm tido um êxito limitado.

Uma variedade surpreendente de microorga ¹ i

nismos patogénicos pode ser sequestrada em compartimentos se- ί rosos como local de introdução ou de entrada no corpo humano. í _ i

Um modo de transmissão venéreo (relacionado com o coito) é es í pecialmente alarmante de modo óbvio no que se refere ã clamidia (associada com uma doença inflamatória pélvica e com a infertilidade) e com vários vírus. Por exemplo, o herpes genital e oral, o citomogalovirus, as verrugas genitais e os retrovirus (especialmente o HIV) estão-se disseminando a velo ! cidades alarmantes e actualmente nao existe qualquer evidência que indique que as abordagens que incluem os preparados tópicos baseados em interferoes ou os preparados tópicos de indutores dos interferoes, etc., virão a ser abordagens prof_i ί láticas ou tratamentos definitivos.

Um objectivo da presente invenção consis te portanto num processo para a preparaçao de uma composição farmacêutica útil para um tratamento que produz de modo eficaz mediadores de combate a doença numa variedade de fluídos sero

sos em numerosas localizações do corpo do paciente; o tratamento pode ser usado isoladamente ou em conjunção com trata mentos tópicos. Constitui um valor adicional da minha invenção o facto de que o tratamento pode ser praticado em série com abordagens tradicionais, como sejam por tampões impregna, dos por interferoes, etc., se se pretendem graus mais elevados de protecção tópica para doenças sensíveis e interferoes.

Observei uma anomalia bioquímica antes ainda nao detectada na qual uma enzima chave (a RNase L) as- ί

I sociada aos mecanismos de defesa do corpo contra o cancro e j contra doenças virais funciona de modo acelerado e aparente- : mente descontrolado. Estas e outras observações encontram-se ^!descritas no meu pedido de Patente US com o NQ. de série ί 07/074 649 depositado em 17 de Julho de 1987 e intitulado i Correcçao por ARN de Dupla Cadeia de Vias Metabólicas Aber- , rantes Associadas com Ciclos de Crescimento Descontrolados de !

t

Células Tumorais e de Vírus, que aqui se dá por reproduzido. ! Em experiências separadas, comparei as capacidades relativas j destas duas células diferentes (das com RNase Lanormal e das com quantidades normais de RNase L) para resistir ao ataque í virai. Observei que os títulos (rendimentos) dos retrovirus ! descendentes eram significativamente mais elevados nas célu- j las com a actividade normal de RNase L que geraram tao rápi- ! damente NCP. 5

Os ARNs da dupla cadeia, especialmente os ARNdc's desemparelhados, restauram a normalidade da cinética da RNase L e dos produtos de degradaçao, conforme se faz i notar no meu pedido da Patente US com o NQ. de série 07/074 ί 649 acima referido. Para além disso, a velocidade de restauraçao da normalidade pelo ARN de dupla cadeia pode ser acele- ^:rada por prévia exposição a linfoquinas.

Os ARNs de dupla cadeia (ARNdc¹s) sao complexos polinucleotídicos sintéticos de dupla cadeia. Por j ARNdc desemparelhado entende-se um ARNdc no qual as ligações! de hidrogénio (empilhamento de bases) entre as duas cadeias que o formam estão relativamente intactas, isto é, estão interrompidas em média menos de um par de bases em cada 29 resíduos consecutivos de bases.

desemparelhamento é uma interrupção na geometria normal da dupla hélice do ARN por formaçao de uma bolsa para dentro (ou para fora) das cadeias, o que provoca a ocorrência de pon tos de vulnerabilidade do ARNdc ã digestão pelas ribonucleases. A expressão ARNdc desemparelhado deve ser entendida em concordância.

ARNdc pode ser um complexo de um poliinosinato e de um policitidilato contendo uma proporção de ba ses de uracilo ou de bases de guanidina, por exemplo, desde 1 sn5 até 1 em 30 destas bases (poli I-poli (c₄-c₂₉ X >

U ou G).

ARNdc pode ter a fórmula geral ri 'r ^11-14’^^n ^{ou r}^n'^r(^12’’ θ valor de n é de 4 a 29. Posteriormente discutem-se outros exemplos adequados de ARNdc ' s .

Os ARNdc's desemparelhados preferidos para a utilização na presente invenção sao baseados em copoli nucleótidos seleccionados de entre poli (C , G) nos quais n é um número inteiro com um valor desde 4 até 29 e sao análogos desemparelhados de complexos dos ácidos polirriboinosínico e polirribocitidilico formados por modificação de rI_n'rC_n a fim de se incorporar bases desemparelhadas (uracilo e guanidina) ao longo da cadeia de polirribocitidilato (rC ). Em alternativa, o ARNdc pode ser derivado do ARNdc poli (I) ' poli (C) por modificação do esqueleto de ãcido polirriboinosíni co (ri ), por exemplo por inclusão de resíduos de 2'-0-metilo-ribosilo. Estes análogos desemparelhados na rI_n'rC , dos quais são preferidos os da fórmula geral rl_n'r(C^,U)_n ^e ri lr(C_onG) , sao descritos por Cárter e Ts'o nas Patentes US n 29 n ^r

130 641 e 4 024 222, que aqui se dao por reproduzidas.

Os ARNdc's descritos nessas publicações sao geralmente adequados para utilização na presente invenção.

Nos ARNdc's desemparelhados preferidos, r'r(C^2,U), uma região que é constituída por uma extensão de 6 a 12 pares de bases, isto é, meia volta completa de uma hélice do ARN, tem as funções tanto de desencadear a libertação de linfoquinas como de co-factor obrigatório intracelular

para enzimas que constituem as vias metabólicas antivirais naturais. As regiões desemparelhadas constituídas por resíduos de uracilo estão inseridas periodicamente na cadeia de polipirimidina a fim de acelerar a hidrólise do ARNdc e deste modo evitar a toxicidade.

Outros exemplos de ARNdc's desemparelha dos úteis para utilização na presente invenção são os seguintes :

poli	(I)	. poli	(C₄,U)
poli	(I)	. poli	(C₇,U)
poli	(I)	. poli	(C₁₃,U)
poli	(I)	. poli	^(C22’^U)
poli	(I)	. poli	^(c20’^G)
poli	(I)	. poli	(Cgg,G)
poli	(I)	. poli	(C ) 23

De acordo com a utilização que lhe é da da na presente memória descritiva, o termo linfoquinas inclui os interferões, de preferência o interferao alfa, as interleuquinas, especificamente a interleuquina 2 (IL-2), e a interleu quina-2-recombinante (rIL-2) e o factor de necrose de tumores (TNF). Também se consideram incluídas as células destruidoras activadas por linfoquina (lymphokine activated Killer cells = LAK) formadas em animais em resposta à exposição da uma lin foquina.

Quando a linfoquina usada e o interferao (alfa), proporciona-se uma quantidade desde 0,01 até 100 IRU por mililitro de fluído corporal do paciente. Quando a lin foquina é a IL-2, de preferência a rlL-2, a quantidade adminis 2 trada situa-se numa gama desde cerca de 10 unidades de IL-2 por kg de peso corporal do paciente até um valor próximo dos níveis inaceitáveis para o paciente devido ã toxicidade, os quais podem atingir 10^ unidades de IL-2 . No entanto os valores que permitem uma margem de manobra perante a reacçao tóxi3 4 ca situam-se entre cerca de 10 e cerca de 10 de IL-2 por kg de peso corporal.

As quantidades habituais de ARNdc administradas proporcionam um nível desde 0,1 até 1000 microgramas de ARNdc por mililitro do fluído corporal do paciente.

Por fluído corporal pretende-se significar uma solução de soro, sais, vitaminas, etc., que circula no interior do organi£ mo e que banha os tecidos. 0 volume de fluído corporal do paciente é determinado a partir de tabelas médicas existentes que relacionam o peso do receptor com o seu volume de fluído corporal, o qual é o total do volume de fluído corporal do paciente e o volume de fluido corporal disponível para equill brio com a quantidade necessária do ARNdc. Como exemplo, um paciente com um peso de 60 ou 70 quilogramas terá um volume de fluído corporal de aproximadamente 5 a 6 litros. Quando se administram os dois agentes (um ARNdc e uma linfoquina) estes podem ser administrados sob a forma duma mistura, separada mas simultâneamente ou sequencialmente.

A administração de um ARNdc e de uma linfoquina em combinação inclui formas de apresentação em que os dois agentes sao administrados em conjunto sob a forma de uma mistura terapêutica e ainda procedimentos em que os dois agentes sao administrados separada mas simultaneamente, por exemplo por meio de duas linhas intravenosas separadas no mesmo indivíduo. A administraçao em combinação inclui ainda a administraçao separada de uma das substâncias em primeiro lugar seguindo-se a administraçao da outra pouco tempo depois.

EXEMPLO 1

Administrei ARNdc's desemparelhados [AMPLIGEN^) (HEM Research, Inc., Rockville, MD), um ARNdc desemparelhado da fórmula rl ‘r)1 θπι quantidades entre 20 e 1 000 gramas semanalmente (IV) a grupos de indivíduos com pesos entre 40 e 70 quilogramas e analisei os fluídos serosos destes indivíduos, especialmente os fluídos vaginais e os fluídos de ejaculação, para detectar a eventual presença de mediadores de defesa do hospedeiro induzidos ARNdc. Em ensaios clínicos paralelos, estudei parâmetros semelhantes em

indivíduos que tinham recebido perfusões de interferões ou de interleuquinas a fim de determinar a especificidade eventual dos processos. Por observação em microscópio óptico verificou-se que o fluído isolado a partir dos pacientes tratados continha várias células incluindo células mononucleares,, células epiteliais escamosas (nas amostras genitais femininas) e espermatozóides (nos fluídos de ejaculação masculina) bem como resíduoscelulares bastante amorfos.

No quadro que se segue apresenta-se um resumo das observações durante o tratamento de três destes pacientes com o ARNdc durante períodos de tempo variados :

QUADRO 1

Efeito do tratamento Sistémico com ARNdc sobre o Nível de

Vírus Recuperável em Fluidos Biológicos Compartimentalizados

Paciente	Tempo (Qua bic	ARNdc exógeno ntidade receia em gramas)	Carga de Virus por Cocultura
1.Paciente A	pré-tratamento	0	0,6, 0,8, 0,5
(sexo masculi-	4 semanas	1,6	0,3, 0,25,0,25
no infecção
HTLV-III)	30 semanas	12	0,2, 0,15,0,15
2.Paciente B	pré-tratamento	0	1,5, 1,2, 1,2
(sexo masculi-	8 semanas	2,8	0,6, 0,5, 0,7
no infecção
HTLV-III)	40 semanas	10,0	0,15,0,10,0,18
3.Paciente C	pré-tratamento	0	Título de Vírus (PFU) lxlO⁴, 2x10^,2x10
(sexo femini-	8 semanas	2,6	2xl0³, 5x10²,1x10
no infeccao „ „
Herpes	36 semanas	10,8	<1x10 ,/1x10 /1x10
simplex [HS] tipo 2)
vados de HIV-III	Os pacientes A e B recuperáveis a partir dos	tinham títulos elelíquidos de ejacu-

lação quando se mediram 2,0 a 4,0 cc de líquido de ejaculação por co-cultura utilizando a técnica que eu descrevi recentemen te para as células mononucleares de sangue periférico (Cárter et.al., Lancet. Vol. 1,6 de Junho de 1987,pág.1287). Em resumo expus células sanguíneas mononucleares de um dador normal que tinha

sido estimulado por PHA durante 2 a 4 dias e continuei a cultura durante 28 dias, tendo medido em seguida o vírus extracej lular por uma análise de imunosorvente ligado a enzima (ELISA).í 0 titulo da co-cultura foi definido como a densidade optica i média (DO a 490 jum) de análise por ELISA após subtracção de um valor de comparaçao negativo (menos de 0,1). 0 paciente C tinha uma expressão de HS crónica nas secreções vaginais asso ciadas com uma formaçao de uma vasícula perianal. 0 herpes simplex foi cultivado pelo método de Rapp utilizando células HEL confluentes propagadas em placas de 35 mm (Rapp et al., Antimicrob. Agents & Chemoth, Vol. 28, p. 449, 1985).

As figuras 1 e 2 em anexo mostram os re-j sultados da análise das amostras de fluídos dos pacientes antes e depois da administraçao sistémica do ARNdc rIn‘r(Cg2,U)J isoladamente ou em combinação com linfoquinas. Na figura 1, | todas as amostras foram preparadas por TCA e precipitação por acetona, bem como as amostras nas colunas 4 e 5 da Figura 2; a coluna 6 da Figura 2 foi usada para estabelecer uma traçagem de calibraçao normalizada, conforme explicado seguidamente. As figuras estão dispostas do seguinte modo: Na figura 1, a coluna 3 refere-se ao paciente A antes do tratamento; a coluna 2 após 4 semanas de tratamento e a coluna 1, a seguir a 12 semanas de tratamento; na Figura 2, a coluna 5 refere-se ao paciente B antes do tratamento e a coluna 4 durante o tratamento, sendo a coluna 6 a curva de calibraçao. As Figuras 1 e 2 destinam-se a ser comparadas com o Quadro 1 apresen tado anteriormente.

A análise de amostras provenientes de pa cientes por meio de cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) após administraçao sistémica de ARNdc mostra uma melho ria dos mediadores de defesa do hospedeiro. Os fluidos vaginais (paciente ηθ. 3) e de ejaculaçao (pacientes n2s. 1 e 2) foram analisados no que se refere a vários componentes da via metabólica antiviral natural (2'-5'-oligo-A/RNase L) conforme eu descrevi recentemente para as células mononucleares do sangue periférico (Cárter et al., Lancet, referido acima; ver também Kariko et al., Biochem. Biophys. Res. Comm,. Vol. 128, pag. 695, 1985 e Suhadolnik et al·., Biochemistry, Vol.

22, pág. 4153, 1983). Os resultados sao apresentados grafica mente nas Figuras IA, IB e IC. Especificamente, encontrei uma actividade apenas detectável de todos os componentes do siste ma antes da administraçao de ARNdc. No entanto, durante a administração sistémica do ARNdc, observei um enriquecimento específico nos mediadores nestes fluidos serosos, conforme se apresenta nas Figuras 1 e 2, o que estava ligado cineticamente com a redução de expressão virai nos mesmos locais (Quadro 1) e na ausência completa de ARNdc macromolecular detectável. Estes valores foram medidos por técnica de mancha rápida e es pectrofotometria de cintilação líquida que escrevi anterior mente (Brodsky et al., J. Biol. Response Modifiers, Vol. 4, pág. 669, 1985).

A fim de avaliar a especificidade do pro cesso, estudei também indíviduos semelhantes (ou animais) tra tados com altas doses (/LlO mil IRU (d)) de vários interferoes e interleuquinas mas nao consegui mostrar qualquer melhoria nos mediadores de luta contra a doença nos fluidos comparti mentalizados referidos. No entanto, quando combinei linfoqui^ nas injectadas por via sistémica com ARNdc's desemparelhados, a taxa de detecção de mediadores nestes fluidos compartimenta lizados acelerou-se notavelmente. Por HPLC combinada com aná lises de radioligaçao e de cisão radioimune do ARNr confirmou -se a elaboraçao específica de um novo 2’-5'-oligoadenilato como resultado da aplicação de ARNdc em qualquer local no cor po e em quantidades suficientes para causar protecçao perante a doença, este último resultado conforme claramente indicado pelos resultados no Quadro 1.

A identificação por HPLC (ver Lee e Suha dolnik. Biochemistry. Vol. 24, pág. 551, 1985) foi levada a efeito após preparaçao das amostras por TCA e precipitação por acetona. Usou-se uma coluna analítica Waters C^g Micron Bondapak com gradientes de revelaçao de metanol e água num tampao de fosfato de amónio (50 mM) a pH 7,0. A análise por HPLC designada por =ff6, (Figura 2) mostra uma calibração normal com P^A^ ^e P3A4 autênticos que foram sintetizados enzimáticamente (Layley et al., Europ. J. Biochem, Vol. 143, pág. 165, 1984 e referências referidas nesse trabalho).

Os produtos isolados critícos sao os picos de HPLC que apare- j cem tanto a 6,8 como a 7,0 minutos ou a cerca de 12 minutos nesta configuração particular de HPLC porque estes picos sao indicativos dos mediadores mais bioactivos, nomeadamente os que correspondem a P^A^ e p^A^ autênticos que são respectivamente, o trímero e o tetrâmero de mediadores de oligoaden^ lato ligados em 2'-5'. Note-se que o paciente A do Quadro 1 [de que se analisou o produto da ejaculaçao seminal antes do tratamento (coluna 3, Figura 1) e após o tratamento (coluna 2 ãs 4 semanas e coluna 1 após 12 semanas)] apresenta um aumen- j to progressivo tanto nos níveis de 2'-5'-A bioactivo utilizan j do a análise de cisão por RNase L normal como nos níveis cres í centes de moléculas de 2'-5'-A estruturalmente autênticas, conforme determinado por HPLC. Verificaram-se resultados semelhantes aos do paciente A no paciente B (resultados nao apresentados). A Figura 2 mostra resultados obtidos com as secreções vaginais do paciente C antes (coluna marcada 5) e durante (coluna marcada 4 na Figura 2) de terapia sistémica com ARNdc. Note-se que no paciente C, por comparaçao do Quadro 1 com a Figura 2, o nível de infecção pelo vírus de herpesi i

decresceu drasticamente, ao mesmo tempo que os níveis dos me- j didores, medidos tanto por bioactividade como por estruturas j químicas autênticas, aumentavam.

Embora nao queira ficar limitado por qua_l quer teoria ou modo de operaçao particular, o mecanismo por meio do qual consegui estes efeitos de compartimentos localizados do corpo parece envolver, pelo menos em parte, um pro cesso transductivo de sinal em que o ARNdc actua sobre as células que rodeiam ou que estão próximas das paredes dos vasos sanguínios e este processo causa um processo em onda que de- [ sencadeia a formaçao de mediadores no próprio compartimento , localizado.

EXEMPLO 2 inventor determinou que a estrutura es_ pecífica do ARNdc desemparelhado constitui o modus operandi mais favorável para a prática do objecto da presente invenção.

Isto é devido ao facto em que o desemparelhamento do ARNdc í tem como resultado a ocorrência de regiões de fragilidade no j interior do complexo de ARNdc, o qual de outro modo seria relativamente estável: como resultado, pequenos fragmentos de ARNdc, sendo mais móveis, podem ter acesso a compartimentos corporais especializados nos quais produzem um efeito imunomo dulatório e antiviral localizado e altamente específico. A í circunstância de ter acesso aos compartimentos que normalmen- , te estão sequestrados nao é uma propriedade da maior parte dos ARNdc's aplicados na minha experiência.

Entre outras experiências usadas para de monstrar estes fenómenos, simulei in vivo . condiçoes de biode gradação por exposição ã nuclease Si (uma enzima degradativa do ARNdc) de aliquotas de ARNdc com bases perfeitamente emparelhadas (poli I -poli C) e comparei os resultados com ali quotas de ARNdc desemparelhado (poli I -poli Cj^U). Os perfis das duas curvas de degradaçao eram completamente diferentes e, creio eu, esta diferença está relacionada com as pro priedades terapêuticas completamente diferentes. A curva de degradaçao do poli I -poli C era monoespecífica e levava sim plesmente a material residual de ãcidos nucleicos de pequena dimensão e nao bio-reactivo. Enquanto que, em contraste, a curva de degradaçao do ARNdc desemparelhado era bifásica: na primeira fase, Fase 1, da curva de degradaçao, formavam-se pequenos fragmentos bioactivos; embora a molécula de partida progenitora tivesse um comprimento de cerca de 1 000 pares de bases correspondendo a um valor (S₂q ) de sedimentação (ultra centrifugação analítica) de cerca de 11,0 a 15,0 S, os produtos filhos (hidrólise parcial) tinham apenas 50 a 100 pares de bases de comprimento. Surpreendentemente, verifiquei que í estes expressam ainda uma alta bioactividade como catalisado- i res intracelulares de fracções de componentes da via metaból_i ca crítica 2'-5'A de defesa natural no homem. Estes fragmentos nao estavam presentes de forma detectável· quando eu colhi amostras dos frascos de poli I-C que tinham sido expostos a quantidades comparáveis de enzimas de degradaçao de ARNdc, co mo a nuclease Si, sob condiçoes semelhantes.

Na Fase 2 da curva de degradaçao de ARNdc foram recuperados fragmentos de ARNdc de menos de 50 pares de ι bases. A estes últimos fragmentos dei o nome de núcleos re- j sistentes a nuclease e não consegui distinguir estes fragmen tos residuais dos gerados com poli I-poli C. Deste modo eu cheguei ã conclusão de que durante a biodegradaçao de certas I configurações de ARNdc (nomeadamente de ARNdc desemparelhado) j são criadas as classes particulares de biofragmentos de ARNdc í í

e que estes fragmentos possuem propriedades especiais e ines- : peradas, como seja a capacidade de penetrarem de modo eficaz nos fluidos corporais (compartimentos) exteriores à circulação sistémica ou ao fornecimento de sangue. Estes compartimentos incluem várias superfícies serosas e/ou mucosas, como por exemplo o revestimento sinovial, a superfície uretral, ο I revestimento cervical bem como os fluidos dos compartimentos cerebro-espinal e ocular mas nao estão limitados a estes.

EXEMPLO 3

Levaram-se a efeito em seguida experiências in vitro/in vivo a fim de confirmar a hipótese de que as novas espécies moleculares de ARNdc, geradas durante o proces so de biodegradaçao, contribuíam para o inesperado nível ele- j vado de mediadores do sistema natural de defesa (por exemplo, j o sistema 2'—5' A) em vários fluidos biologicos (corporais).

Degradaçao por nuclease de Poli I · C em comparaçao com

ARNdc's desemparelhados

A susceptibilidade dos ARNs(ARNdc's) a hidro lise pelas nucleases foi estudada utilizando poli I -poli C radioactivo e ARNdc desemparelhado. O ácido [8-^^C]-poliinossinico (act.esp.3,6 yUCi/pmole) foi adquirido a P-L Brochemicals. Este poli I marcado tinha um comprimento de 1000 bases. 0 [8-^^C]-poli I foi misturado com poli I -poli C nao marcado ou com ARNdc desemparelhado e as misturas foram desnaturadas por calor e retemperadas a fim de se obterem ARNdc ’s desemparelhados.

Por meio de estudos iniciais mediu-se a

digestão por nuclease Si (E.C.3.1.30.1). A nuclease Si digere os ácidos nucleicos de cadeia simples, deixando as regiões de cadeia dupla intactas. A digestão de poli I ·ρο1ί C pc>^r nuclease Si tem uma cinética monofásica com uma velocidade de 1,4Z do ARNdc transformando em TCA solúvel por minuto. Após desnaturaçao térmica, a veloci. dade de hidrólise aumentou para 1,8Z por minuto.

Experiências semelhantes usando ARNdc desemparelhado marcado demonstraram que a cinética da digestão era bifásica. O ARNdc desemparelhado teve um componente inicial de digestão rápida (3,2 Z por minuto) seguido de um componente de digestão muito mais lento (0,5 Z por ensaio). 0 ARNdc desemparelhado desnaturado mostrou uma degradaçao relativamente rápida (4,5 Z minuto) .

A degradaçao total durante o período de 45 minutos experiências para o poli I *poli C nativo e para o ARNdc desemparelhado foi semelhante. Conforme an teriormente descrito (Cárter et al., J. Mol. Biol., 70: 567, 1972), a velocidade de hidrólise de ARNdc desemparq lhado era inicialmente superior à do poli I -poli C.

No entanto, a cinética bifásica da degradaçao no ARNdc desemparelhado demonstra uma diferença fídica aparente entre este material e moléculas de poli I -poli C em re gisto perfeito (completamente emparelhadas). Estes resul tados sugerem uma diferença significativa na estrutura secundária ou terciária dando origem a diferenças na sus ceptibilidade ã nuclease entre estes ARNdc's e resultados biológicos inesperados, resultados estes que sao descritos no presente pedido de patente. Além disso, a diminui çao significativa de 6 vezes na taxa de hidrólise entre os componentes bifásicos de alguns ARNdc's e a hidrólise relativamente reduzida do componente lento indica a exis_ tência de um núcleo relativamente resistente à nuclease nesta classe de ARNdc's que não ocorre em poli I -poli C.

A degradaçao por nuclease do ARNdc desem parelhado foi também levada a efeito usando um meio de

cultura de tecidos normalizado (RPMI 1640) suplementado j com 10 % de soro fetal de vitela ou soro humano inacti- j vado termicamente. A degradação do ARNdc desemparelhado foi rápida, tornando-se aproximadamente 40 Z deste ARNdc solúvel a TCA em 3 minutos. Por digestão mais prolongada, até duas horas, nao se obteve qualquer degradação si. gnificativa adicional. Por diluição em série dos meios seguida por uma incubaçao de 3 minutos na presença de ARNdc desemparelhado verificou-se novamente uma degradaçao de cerca de 50 / a uma diluição de 1/16 que nao au mentou com soro mais concentrado. Uma vez que o material precipitável por TCA se conserva aproximadamente constan te durante longos períodos e com uma variedade significa tiva de diluições, a estabilidade prolongada ao material precipitável por TCA nao é provavelmente devida ã degradaçao preferencial do material solúvel em TCA. Estes re sultados sugerem novamente a presença de um núcleo resi_s tente a nuclease na molécula de ARNdc desemparelhado.

B. Peso molecular do Núcleo resistente a Nuclease do ARNdc desemparelhado peso molecular foi medida pela determjL naçao dos coeficientes de sedimentação. Fizeram-se correr amostras de ARNdc nao tratado numa ultracentrifuga Beckman modelo E a 48 000 RPM e a 20QC. Usaram-se cinco pontos a 8 minutos de intervalo para calcular os coeficientes de sedimentação. As amostras de ARNdc foram diluídas até uma DC^q de 0,63 em tampao A (NaCl 0,15 M, fosfato de sódio 0,01 M e MgCl₂ 0,001 M a pH 7,2). As amostras de ARNdc tratadas por Si foram feitas correr a 52 000 RPM¹, 20QC em tampao A a uma Οθ260 de 0,65. Os j coeficientes de sedimentação foram calculados pelos méto dos do semi-peso e do segundo momento.

Os coeficientes de sedimentação do ARNdc determinados pelos métodos do semi-peso e do segundo momento foram de 12,74 e de 13,29, respectivamente. Depois de hidrólise por nuclease Si, o coeficiente de sedimenta çao do ARNdc determinado pelo método do semi-peso dimi20

nuiu para 6,18 e pelo método do segundo momento para 7,21. Estes dados mostram que o tratamento com nuclease Si degrada o ARN de dupla cadeia desemparelhado até fra£ mentos de baixo peso molecular.

C. Actividade Biológica do Núcleo do ARNdc Resistente a

Nuclease

Ensaiou-se a actividade biológica do ARNdc digerido com nuclease Si num ensaio normalizado de inibição do crescimento de um tumor numa cultura de tecido. 0 ARNdc foi incubado com nuclease Si durante um máximo de 120 minutos e em seguida foi usado para inibir o crescimento da linha de células do fibrossarcoma humano, HT1080 C14. A percentagem de crescimento das células de comparaçao nao tratadas foi observada após 72 horas de tratamento com 50 ^og/ml de ARNdc desemparelhado digerido com nu. 0 ARNdc nao tratado inibiu o crescimen to celular em aproximadamente 50 Z„. Verificou-se uma inibiçao semelhante no ARNdc desemparelhado tratado com nuclease Si independentemente da duraçao do tratamento com nuclease Si. Por desnaturaçao térmica combinada com tratamento com nuclease Si o efeito antiproliferativo do ARNdc foi abolido.

Estes resultados indicam que a actividade antiproliferativa do ARNdc desemparelhado se mantém mesmo depois de um tratamento prolongado com nuclease. Uma vez que o núcleo resistente a nuclease parece ser gerado durante os primeiros 15 a 20 minutos da digestão neste sistema, a inibição do crescimento nos pontos referentes aos últimos períodos sugere que a actividade antiproliferativa dos resultados de ARNdc reside no núcleo resistente a nuclease e que este, por seu turno, pode ser responsável por altos rendimentos de mediado res biologicamente activos em vários compartimentos corporais .

A fim de explorar ainda mais a actividade biológica do núcleo resistente à nuclease, digeriu-se

ARNdc durante 60 minutos com nuclease Si.

etanol a fim de eliminar potencialmente os produtos pe- | quenos da degradaçao que nao precipitam por este procedimento. Para medida da actividade biológica, tratou-se a linha de células do glioma humano A1235 yug/ml de ARNdci nativo, Ampligen digerido com nuclease Si e ARNdc dige- í rido e precipitado com etanol. Após 72 horas em cultu- j ra, as células A1235 foram inibidas em 99,8 % pelo Am- ί pligen, em 78,4 X pelo Ampligen tratado com nuclease Si em 84,4 I pelo Ampligen tratado com nuclease Si e pre: cipitado com etanol. Deste modo, a actividade antiprol_i ferativa do ARNdc conservou-se através destes diferentes tratamentos.

A capacidade destes preparados para indu zir a sintetase de 2-5A [ATP: (2 '-5 ¹ -oligo (A) adenilil -trans ferase (EC 2.7.7.19)] nestas células foi também medida.

Os agregados celulares foram lavados com PBS, suspensos em 5 ml de tampao de lisina (Tris 20 mM, pH 7,5, EDTA 0,1 mM, sacarose 0,25 M, KC1 50 mM, MgCl₂ 2 mM e DTT 1 mM) e conservados em gelo durante 5 minutos. Após a la. vagem duas vezes com PBS, os agregados celulares foram ressuspensos em 0,1 ml de tampao B (HEPES 20 mM, pH 7,5, ; MgCl₂ 5 mM, DTT 120 mM e 10 % de glicerol) contendo 0,5X de Nonidet-P40 e foram conservados em gelo durante 10 minutos para lise das células. Obtiveram-se extractos citoplasmáticos por centrifugação durante 5 minutos a 8000 g e conservaram-se em aliquotas de 50 yuL a70QC.

A sintetase de 2-5A foi analisada conforme descrito (Suhadolnik et al., Biochemistry 22: 4153, 1983).

I

Misturou-se um extracto celular descongelado (equivalen-j te a 25 /jg de proteina)com 30 de poli (rl). poli (rC)-a^irOse canprimido e incubou-se a 25QC durante 20 minutos. A proteína nao ligada foi eliminada por duas lavagens com 0,4 mL de tampao B. Iniciou-se a sintese enzimática de 2'-5'-oligoadenilatos (2-5A) por adição de 10yuL de tam pao B contendo 2,5 mM de [ ^p/^TP (0,12 Ci/mmole), DTT

2,5 mM, 3 unidades/mL de fosfoquinase de creatinina e fosfato de creatinina 10 mM.

Após 20 horas de incubaçao a 302C, separou-se a agarose por centrifugação (3 minutos, 8000 g, 25QC) . Analisou -se a mistura de 2-5A no sobrenadante por cromatografia em coluna de DEAE-celulose conforme descrito por Doetsch et al. (Nature, 291: 355, 1981). A formação do produto foi determinada pela quantidade de radioactividade deslocada a partir das colunas de DEAE-celulose com tampao de KC1 0,35 M dividida pelo total de radioactividade re ; cuperada. I

A síntese de 2-5A na incubaçao enzimãtica com extractos de ARNdc tratados com nuclease de ARNdc isentos de células e o ARNdc tratado com nuclease a s£ guir a precipitação mostram o efeito do tempo na conversão de ATP em 2-5A. Verificam-se vários resultados importantes. Em primeiro lugar, a seguir a 18 horas de incubações dos extractos isentos de células com ARNdc desemparelhado nao tratado, a actividade específica da sintetase de 2-5A era de 41,5. Em segundo lugar, a seguir a tratamento com nuclease Si, existe um aumento marcado na conversão de ATP em 2-5A. Por exemplo, depois de uma incubaçao de 18 horas, a actividade específica e de 284, o que é cerca de 7 vezes superior do que a observada com o ARNdc desemparelhado não tratado. Em terceiro lugar, o ARNdc tratado com nuclease Si mostrava, a seguir a precipitação, uma síntese máxima de 2-5A após 12 horas de incubaçao. Estes dados mostram que a síntese enzimãtica do trímero, do tetrâmero e dos oligó meros superiores de 2-5A aumenta significativamente a seguir ao tratamento do ARNdc desemparelhado com nuclease Si. A associaçao positiva entre o aumento na actividade enzimática e a diminuição da dimensãodo ARNdc cons_j titui uma evidência de que pode haver uma interacção | l

com o modificador alosterico, isto e, o ARNdc desempare-ί lhado parcialmente degradado, se tal modo que este pode ligar-se à sintetasede 2-5A e activar este enzima muito melhor do que o ARNdc desemparelhado nao tratado. A implicação terapêutica destas constatações é óbvia.

Pelo contrário, quando se eliminaram por precipitação produtos de degradação de baixo peso molecular de ARNdc desemparelhado tratado por nuclease St, ocorreu uma síntese máxima de 2-5A após 12 horas de incubação.

Esta actividade máxima da sintetase de 2-5A do ARNdc digerido com nuclease Si a seguir ã precipitação sugere que o núcleo resistente ã nuclease pode activar a sinte tase de 2-5A de um modo equivalente ao da activação de ARNdc desemparelhado tratado com nuclease Si depois de incubações de 18 horas.

Estes dados confirmam a presença de fra£ mentos activos biologicamente de ARNdc desemparelhado e explicam uma base física para a actividade terapêutica destes fragmentos no fluido biológico. Esses dados demonstram também que os fragmentos biologicamente activos sao mais activos do que o composto original.

EXEMPLO 4

Outra ilustração da utiiizaçao na prática da presente invenção relaciona-se com a prevenção da trans missão sexual de doenças como o citomegalovirus ou CMV (ver Ν.Y. Times, 16 de Julho de 1988, página B6, onde se refere r_e sumidamente o rápido aumento das doenças transmitidas sexualmente) . 0 citomegalovirus (um membro da família de vírus do herpes) afecta mais de 1 milhão de pessoas só nos Estados Uni dos e as pessoas com sistemas imunes atingidos podem desenvol. ver problemas gastrointestinais ou cegueira (ambos em superfí. cies serosas que sao infectadas pelo vírus e em compartimentos que não sao facilmente atravessados por muitos agentes an tivirais de aplicaçao sistémica). 0 CMV é transmitido sexualmente. Por geraçao de fragmentos bioactivos ao longo do tempo, como se faz quando se administra um ARNdc desemparelhado (Ampligene), consegue-se um nível muito mais alto de inibição. Por exemplo, a Figura 3 mostra uma inibição de 100 Z> do CMV quando é exposto a fragmentos de Ampligen durante 26 horas. Esta libertação provocada de material bioactivo nao pode ser

facilmente conseguida por pomadas tópicas etc., quando se usam ARNdc¹s de uma variedade relativamente nao tóxica.

A geração de fragmentos bioactivos de ARNdc ao longo do tempo foi ilustrada em estudos de cultura de tecidos conduzidos com citomegalovirus, por vezes designado por doenças de inclusão citomegãlica, designação que se refere ãs inclusões intranucleares que se verificam em células aumentadas infectadas pelo vírus. 0 citomegalovirus humano é um subgrupo de agentes virais relacionados de perto com o grupo de vírus do herpes ou membros deste grupo.

Embora muito disseminada, a incidência do CMV transmitido sexualmente foi mencionada recentemente com estimativas de mais de um milhão de pessoas infectadas nos Estados Unidos em 1988. A infecção é normalmente assintomãtica mas as pessoas com sistemas imunes afectados podem desenvolver problemas gas_ trointestinais ou cegueira. Os recém-nascidos sao particular mente susceptíveis e o CMV pode causar aborto, nados-mortos ou morte post-natal. 0 The Merck Manual, 14ã edição (1982), pags. 205-206, de uma terapia especifica para a doença.

Nesta experiência usaram-se os seguin ' tes procedimentos e materiais.

Isolaram-se fibroblastos do prepúcio huma no (FPH) a partir de recém-nascidos e mantiveram-se em passagem reduzida (Z20)em meio essencial mínimo com sal de Earle suplei mentado com 10 % de soro fetal de vitela, L-glutamina 2mM, piruvato de sódio 1 mM, tampão HEPES 20 mM e antibióticos.

I Uma vez que as células atingiram a confluência, mantiveram-se como anteriormente com a excepção de que se usou 5 £ de soro fetal de vitela. Efectuaram-se análises semanais das células que deram resultados negativos para contaminaçao bacteriana e micoplasmal.

Usou-se ao longo do presente estudo uma preparaçao de base de citomegalovirus humano (ÇMV ATCC #VR-538l estirpe AD169). Esta preparaçao era constituída por uma segunda passagem através de FPH que tinham sido colhidos quando o efeito citopático do CMV tinha atingido 75Z das células ho£ pedeiras. A preparaçao da base do vírus isenta de células foi distribuída por tubos de armazenagem e conservada a -120QC.

Os ensaios de contaminaçao bacteriana e micoplasmal deram re suitados negativos. 0 título infeccioso da preparação de :

base do CMV foi determinada em células de FPH e era de 4 x 1Õ j inclusões de formaçao fluorescente /ml (ver seguidamente).

Usou-se Ampligen^ ' liofilizado de grau clínico(ARNdc desemparelhado; poli I-poli C^.U, Hem Resear- ’ ch, Inc., Rockville, Maryland, EUA). Reconstitui-se o Ampli- j gen de acordo com as instruções do fornecedor, formaram-se ; aliquotas e guardou-se a -1202C. Para cada experiência, de£ congelou-se uma nova aliquota com agitaçao num banho de água j a 50QC e diluiu-se no meio da cultura de tecido anteriormente descrita nas concentração desejadas. j

Incubou-se o produto com células de FPH sob várias condiçoes. Estas variações incluiam (1) concentra çao de Ampligen: (2) a sequência da exposição do Ampligen em relaçao à absorçao de vírus: e (3) o período de tempo durante o qual os FPH foram expostos ao Ampligen. A viabilidade de FPH tratados com Ampligen era idêntica a de FPH nao tratados , conforme se determinou por exclusão de azul de tri^ '

I pano (isto e,>99 X) . j

I

As células confluentes de FPH foram cul- tivadas em lamelas circulares numa gota sobre frascos (capacjL ; dade 3,7 ml). A infecção virai foi iniciada por incubaçao j dos frascos com 0,25 ml de uma diluição apropriada de CMV.

As células de FPH foram expostas ao CMV a 372C durante uma ho ra a 700 x g, a fim de permitir a absorçao do vírus. Os frascos foram lavados duas a tres vezes a fim de eliminar os vírus extracelulares. Adicionou-se a cada frasco 1 mL de meio de cultura de tecidos e incubaram-se normalmente durante 18 a 24 horas a 37QC durante 72 horas.

A replicação do CMV foi quantificada como se segue. A replicação virai foi feita parar por fixaçao das células do FPH em 100QC de acetona. As lamelas contendo

I as células de FPH aderentes foram lavadas e incubadas com um í anticorpo monoclonal de rato anti-CMV (DuPont) específico para a proteína precose imediata a 72quilodalton. 0 anticorpo ligado foi detectado pela adição de uma IgG F (ab)₂ antirato marcada por FITC (SIGMA).

nuclear verde-maçã brilhante quando observadas com uma amplia-} ção de 250 x com um microscópio de epifluorescência. 0 número de células infectadas por CMV (isto é, as que mostram inclusoes nucleares fluorescêntes) foi contado ao microscópio.

preparado de base positivo foi diluído de tal modo que, na ausência de Ampligen, foram produzidas entre 200 e 1200 célu} las infectadas por CMV por lamela após 24 horas de incubação, j Este resultado foi atingido com uma multiplicidade de infecção } (MDI) de 0,04. í

Determinou-se o número médio de inclusões} de CMV de lamelas réplica para cada condição experimental e j comparou-se este numero com um ensaio de comparaçao positivo ; que nao tinha recebido Ampligen. Os ensaios de comparaçao ne , gativos que não tinham sido expostos nem a Arpligen nsn a CMV foran analisados em paralelo. A actividade antiviral do Ampligen foi ex- } pressa de acordo com a fórmula: ί í

i (% de inibição de inclusões de CMV = }

100%

EB. médio de inclusões de QW/Lansla on EBí tratado com Aipli^i '

EB. nédio de inclusões ie CEV/Laiela on FHí nao tratado ocm Aipligpi x 100

Na Figura 3 mostra-se o efeito da duraçãoj do pré-tratamento com Ampligen sobre a infecção de fibroblas- í tos de prepúcio humano com citomegalovirus. Réplicas em mono ί camada da fibroblastos de prepúcio humano foram, em alternat/ } va: (1) pré-tratados com 10 yug/ml de Ampligen (barras em branco) ou (2) pré-tratadas com 100 ^ug/ml (barras em trace- ί jado) para os intervalos de tempo indicados antes da absorçao de CMV. 0 grau de infecção com CMV foi determinado 24 horas após a absorçao virai pelo método IFA descrito. 0 número médio de inclusões por CMV por lamela para as culturas tratadas com Ampligen foi comparado com o de ensaios de comparaçao sem

tratamento. Os resultados indicam que o período do pré-trata mento com Ampligen é directamente proporcional ã extensão de inibição da infecção por CMV. A inibição máxima do CMV é conseguida quando os FPH sao pré-tratados com Ampligen durante 24 horas.

Este estudo demonstra a capacidade do ARNdc desemparelhado para exercer um efeito antiviral contra o CMV que aumenta ao longo do tempo e a sensibilidade do CMV ao ARNdc desemparelhado após algum tempo, independentemente da concentração usada, um nível de libertação retardada que nao é conseguida pelas aplicações tópicas de ARNdc's de uma variedade relativamente não tóxica.

Claims

- lê Processo para a preparação de composiçoes farmacêuticas parenterais caracterizado por se incorporar como ingrediente activo um dsRNA desemparelhado constituído por um complexo de poliinosinato e um policitidilato con tendo desde 1 em 5 até 1 em 30 bases uracilo ou guanidina, sendo de preferência rln .r(íá'U)n ou rIn.<2g-G)n, em combinação com um veículo farmacêuticamente aceitável.
- 2§ Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por se obter uma composição farmacêutica activa contra doenças virais.

- 3ê Processo de acordo com a reivindicação 2 caracterizado por os vírus serem um membro da família herpes.

- 4â Processo de acordo com a reivindicação 3 caracterizado por o vírus ser um citomeglovirus.

- 5ê Processo de acordo com a reivindicação 2 caracterizado por o vírus ser um membro da família retrovirus

- 6ê Processo de acordo com a reivindicação 5 caracterizado por o retrovirus ser HIV.

A requerente declara que o primeiro pedido desta patente foi apresentado nos Estados Unidos da América em 12 de Agosto de 1987, sob o número de série 07/084,227.

Lisboa, 12 de Agosto de 1988