BRPI0808637A2

BRPI0808637A2 - Agonista restritivo do receptor 3 similar a toll (tlr3)

Info

Publication number: BRPI0808637A2
Application number: BRPI0808637-0A
Authority: BR
Inventors: Brian B Gowen
Original assignee: Univ Utah State
Priority date: 2007-03-05
Filing date: 2008-03-05
Publication date: 2014-08-05
Also published as: AU2008223446A1; EP2134172A4; US20100183638A1; ZA200905954B; NZ579433A; CA2680134A1; JP2010520284A; WO2008109083A3; KR20090130019A; CN101652062A; EP2134172A2; AU2008223446B2; WO2008109083A2

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "AGONISTA RESTRITIVO DO RECEPTOR 3 SIMILAR A TOLL (TLR3)".

Referência Cruzada Ao Pedido De Patente Relacionado

Este pedido de patente reivindica o benefício de prioridade do Pedido de Patente U.S. provisório Ne 60/904.792, depositado em 5 de março de 2007.

Pesquisa ou Desenvolvimento Patrocinado pelo Governo Federal

O governo dos EUA possui certos direitos nesta invenção conforme previsto pelos termos do NIH-N01-AI-15435, que foi concedido pelo Departamento de Saúde e Serviços Humanos (Department of Health and Human Services).

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se ao fornecimento de um agonista para o receptor 3 similar a Toll (TLR3) para uso como agente antiviral, agente antiproliferativo, imunoestimulante ou qualquer uma de suas comnações. São fornecidos métodos de tratamento médico e processos para a produção dos medicamentos.

Antecedentes da Invenção

O RNA de filamento duplo como poli(l:C) foi utilizado como um agonista do TLR3. Porém, sua utilidade como um medicamento é limitada por sua toxicidade. São assim pesquisados medicamentos melhorados que possam ser utilizados como um agente antiviral, um agente antiproliferativo e/ou um imunoestimulante através do direcionamento específico ao TLR3, ao invés de outros receptores que pertencem a esta família. Por exemplo, um medicamento desejável teria um maior índice terapêutico (por exemplo, a proporção da dose que produz um efeito tóxico dividida pela dose que produz um efeito terapêutico tal como LD50 dividida pela ED50) para o tratamento de uma infecção incipiente ou estabelecida, para o tratamento de um estado de saúde pré-canceroso ou canceroso ou para a indução de uma resposta inflamatória que é mediada pelo TLR3.

O ácido ribonucleico de filamento duplo (dsRNA) ativa a imunidade inata (por exemplo, a produção de interferon e outras citocinas) através de mecanismos de defesa antivirais intracelulares dependentes de dsRNA incluindo as vias da 2’,5’-oligoadenilato sintetase/RNase L e da proteína quinase p68. O AMPLIGEN® poli(l:C-12U) da HEMISPHERx® opharma é um dsRNA configurado especificamente com propriedades antivirais e imunoes5 timuladoras, mas que exibe toxicidade reduzida. O AMPLIGEN® poli(l:C-i2U) inibe o crescimento viral e de células cancerosas através de atividades pleiotrópicas: este regula as vias da 2’,5’-oligoadenilato sintetase/RNase L e da proteína quinase p68 como fazem outras moléculas de dsRNA. Aqui, é descoberto que o poli(l:Ci2U) medeia seus efeitos no corpo atuando como um 10 agonista específico do TLR3.

Portanto, é um objetivo fornecer tratamento para um paciente que necessita de um agente antiviral, um agente antiproliferativo e/ou um imunoestimulante. Dedica-se aqui a uma necessidade sentida há muito tempo de um agonista seletivo do TLR3. São fornecidos métodos para o trata15 mento de indivíduos e processos para a produção de medicamentos, envolvendo especialmente doença infecciosa, proliferação celular e/ou vacinação. Objetivos e vantagens adicionais da invenção são descritos a seguir e seriam evidentes para um perito na técnica partindo de tal discussão.

Sumário da Invenção A invenção pode ser utilizada para tratar um indivíduo (por e

xemplo, humano ou animal) com uma infecção viral incipiente ou estabelecida, um estado de saúde patológico marcado pela proliferação celular anormal (por exemplo, neoplasma ou tumor) ou como um imunoestimulante para vacinar o indivíduo contra infecção viral. É preferido que a quantidade de 25 ácido ribonucleico de filamento duplo (dsRNA) com pareamento errado utilizada seja suficiente para se ligar ao Receptor 3 Similar a Toll (TLR3) nas células imunológicas do indivíduo. A imunidade inata pode ser ativada dessa maneira. Em particular, um dsRNA configurado especificamente pode ser utilizado para ativar o TLR3 sem ativar outros receptores similares a Toll 30 como o TLR4 ou uma RNA helicase como RIG-I ou mda-5.

O indivíduo pode estar infectado por um vírus, especialmente um bunyavírus ou mais particularmente um flebovírus. Uma composição farmacêutica que é compreendida de dsRNA configurado especificamente em uma quantidade suficiente para se ligar ao TLR3 é administrada ao indivíduo. A infecção viral do indivíduo é reduzida ou eliminada dessa maneira que pode ser avaliada através do tempo de recuperação menor, da imunida5 de maior (por exemplo, aumento no título de anticorpos, na proliferação de linfócítos, na morte de células infectadas ou na atividade de células exterminadoras naturais (NK)), do menor número de replicação do vírus ou uma comnação dos mesmos quando comparado com o indivíduo não-tratado com o dsRNA configurado especificamente.

O indivíduo pode estar sofrendo de uma proliferação celular a

normal (por exemplo, neoplasma ou tumor, outra célula transformada). É possível que uma composição farmacêutica, que é compreendida do dsRNA configurado especificamente em uma quantidade suficiente para se ligar ao TLR3, seja administrada ao indivíduo. A proliferação celular é reduzida, as 15 células neoplásicas são eliminadas e/ou a doença ou a mortalidade do indivíduo é melhorada dessa maneira comparada ao estado de saúde de um indivíduo não-tratado com o dsRNA configurado especificamente.

O indivíduo pode ser vacinado contra o vírus ou o neoplasma. Imediatamente antes, durante ou imediatamente após a vacinação, uma 20 composição farmacêutica que é compreendida do dsRNA configurado especificamente em uma quantidade suficiente para se ligar ao TLR3 é administrada ao indivíduo. A resposta imunológica à vacina é estimulada dessa maneira. A vacina pode ser compreendida de um vírus inativado ou atenuado, uma fração de uma célula neoplásica, uma ou mais proteínas virais isoladas 25 ou um ou mais antígenos tumorais isolados. Uma vacina in situ pode ser compreendida de antígeno produzido no local e o dsRNA configurado especificamente atuando como um adjuvante no mesmo. O vírus pode ser um bunyavírus, mais particularmente um flebovírus.

As células apresentadoras de antígenos (por exemplo, células dendríticas, macrófagos) e tecidos de mucosa (por exemplo, epitélio gástrico ou respiratório) são alvos preferidos no corpo para o dsRNA configurado especificamente. O vírus ou o tumor pode ser apresentado e o antígeno deve ser susceptível à ação única do dsRNA configurado especificamente que atua exclusivamente como um agonista do TLR3. O dsRNA configurado especificamente é preferencialmente administrado através de infusão intravenosa; injeção intradérmica, subcutânea ou intramuscular; inalação intranasal ou intratraqueal; ou exposição orofaringeal.

São também fornecidos processos para a utilização e para a produção de medicamentos. Deve ser observado, entretanto, que uma reivindicação direcionada ao produto não está necessariamente limitada a estes processos a não ser que as etapas particulares do processo sejam citadas na reivindicação do produto.

Aspectos adicionais da invenção serão evidentes a um perito na técnica partindo da descrição detalhada e das reivindicações e generalizações para a mesma.

Breve Descrição dos Desenhos A figura 1 mostra que o tratamento com poli(l:C-i2U) limita a do

ença hepática e a carga viral sistêmica em camundongos do tipo selvagem, mas não TLRS^'. Grupos de camundongos rLf?3'7' (figuras 1A, 1C, 1G e 1E) e do tipo selvagem (figuras 1B, 1 D, 1E e 1F) com 8 semanas de idade foram desafiados com vírus com PTV (dia 0) e tratados com 10 pg de poli(l:Ci2U) 20 ou placebo de solução salina 24 horas após a infecção. São mostrados os níveis médios de ALT no soro (figuras 1A-1B), escores do fígado (figuras ΙΟΙ D), títulos virais no fígado (figuras 1E-1F) e títulos virais no soro (figuras 1G-1H) para as amostras coletadas nos dias pós-infecção indicados. Os dados representam a média e o desvio padrão de cinco animais por grupo, po25 li(l:Ci2U), mdsRNA. IU, unidades internacionais. * P < 0,05; P < 0,01 comparado com os controles tratados com solução salina.

A figura 2 mostra a indução de IFN-β em camundongos TLR3'A e do tipo selvagem não-infectados após a exposição ao poli(l:Ci2U). Grupos de camundongos com 8 semanas de idade receberam injeção i.p. de 10 pg 30 de poli(l:C12U) e os níveis de IFN-β sistêmico foram determinados para as amostras de soro coletadas nos tempos indicados após a exposição. Os dados representam a média e o desvio padrão de três animais por grupo. Descrição de Modalidades Específicas da Invenção

A invenção pode tratar uma infecção através de um vírus de RNA que pertence ao Grupo III, ao Grupo IV ou ao Grupo V do sistema de classificação de Baltimore. Este possui ácido ribonucleico (RNA) como seu 5 material genético e não se replica utilizando um DNA intermediário. O RNA é geralmente de filamento simples (ssRNA), mas pode ocasionalmente ser de filamento duplo (dsRNA). Os vírus de RNA podem ainda ser classificados de acordo com o sentido ou a polaridade de seu RNA em vírus de RNA de sentido negativo e de sentido positivo. O RNA viral de sentido positivo é idêntico 10 ao mRNA viral e pode assim ser imediatamente traduzido pela célula hospedeira. O RNA viral de sentido negativo é complementar ao mRNA e assim tem que ser convertido no RNA de sentido positivo por uma RNA polimerase antes da tradução. Dessa maneira, o RNA purificado de um vírus de sentido positivo pode causar diretamente infecção embora este possa ser menos 15 infeccioso que a partícula viral inteira. O RNA purificado de um vírus de sentido negativo não é infeccioso por si só uma vez que precisa ser transcrito no RNA de sentido positivo.

Os vírus de RNA que infectam seres humanos e animais incluem aqueles que pertencem às famílias rnaviridae e Reoviridae (vírus de dsRNA 20 do Grupo III); às famílias Arteriviridae, Astroviridae, Caliciviridae, Hepeviridae e Roniviridae (vírus de ssRNA de sentido positivo do Grupo IV); e às famílias Arenaviridae, Bornaviridae, Bunyaviridae, Fiioviridae, Paramyxoviridae e Rhabdoviridae (vírus de ssRNA de sentido negativo do Grupo V). O ácido ribonucleico de filamento duplo (dsRNA) configurado especificamente é tam25 bém conhecido por tratar infecção causada por vírus das famílias Flaviviridae, Hepadnaviridae, Orthomyxoviridae, Picornaviridae, Retroviridae e Togaviridae. Os vírus destas famílias podem ou não ser incluídos dentro do âmto da invenção.

As células do indivíduo que estão sofrendo proliferação anormal podem ser um neoplasma ou um tumor (por exemplo, carcinoma, sarcoma, leucemia, linfoma), especialmente células transformadas por vírus de tumor (por exemplo, vírus de DNA ou de RNA que carrega um gene ou um oncogene de transformação) ou infectadas de outra maneira por um vírus associado com câncer. Por exemplo, o vírus de Epstein-Barr está associado com câncer nasofaringeal, Iinfoma de Hodgkin, Iinfoma de Burkitt e outros Iinfomas B; os vírus das hepatites BeC humanas (HBV e HCV) estão associa5 dos com câncer no fígado; o herpesvírus humano 8 (HHV8) está associado com o sarcoma de Kaposi; os papilomavírus humanos (por exemplo, HPV6, HPV11, HPV16, HPV18 ou uma comnação dos mesmos) estão associados com câncer cervical, câncer anal e verrugas genitais; e o vírus T-linfotrófico humano (HTLV) está associado com leucemia e Iinfoma de células T. Os 10 cânceres incluem aqueles que se originam dos sistemas gastrointestinal (por exemplo, esôfago, cólon, intestinos, íleo, reto, ânus, fígado, pâncreas, estômago), genitourinário (por exemplo, bexiga, rins, próstata), musculoesquelético, nervoso, pulmonar (por exemplo, pulmões) ou de órgãos reprodutivos (por exemplo, cérvix, ovários, testículos).

Poli(riboinosínico) é parcialmente hidrolizado em po

li(ribocitosínicoi2uracílico) e pode ser representado como rln.r(Ci2U)n. Outro dsRNA configurado especificamente que pode ser utilizado se baseia em copolinucleotídeos selecionados de poli(CnU) e poli(CnG) em que n é um número inteiro de 4 até 29 ou são análogos com pareamento errados de 20 complexos dos ácidos polirriboinosínico e polirribocitidílico, formados através da modificação de rln.rCn para incorporar bases não-pareadas (uracila ou guanina) ao longo do filamento de polirribocitidilato (rCn). Alternativamente, o dsRNA com pareamento errado pode ser derivado de r(l)-r(C) dsRNA através da modificação da estrutura de ribosila do ácido polirriboinosínico (rln), 25 por exemplo, através da inclusão de resíduos de 2’-0-metil ribosila.

O dsRNA com pareamento errado pode ser complexado com um polímero que estaliza RNA tal como Iisina celulose. Destes análogos com pareamento errado de rln.rCn, os preferidos são os da fórmula geral rln.r(Cni4U)n e são descritos nas Patentes U.S. 4.024.222 e 4.130.641; que são in30 corporadas aqui como referência. O dsRNA descrito aqui é geralmente adequado para uso de acordo com a presente invenção. Ver também a Patente U.S. 5.258.369. O dsRNA configurado especificamente pode ser administrado através de qualquer via local ou sistêmica adequada incluindo enteral (por exemplo, oral, tubo de alimentação, enema), tópica (por exemplo, adesivo que atua de forma epicutânea, supositório que atua no reto ou na vagina) e parenteral (por exemplo, adesivo transdermal; injeção subcutânea, íntravenosa, intramuscular, intradermal ou intraperitoneal; bucal, sublingual ou transmucosa; inalação ou instilação intranasal ou intratraqueal). O ácido nucleico pode ser micronizado para inalação, dissolvido em um carreador (por exemplo, solução salina tamponada esterilizada ou água) para injeção ou instilação ou encapsulado em um Iipossomo ou outro carreador para o fornecimento direcionado. São preferidos os veículos que direcionam o ácido nucleico ao receptor TLR3 nas células apresentadoras de antígenos e no epitélio. Um medicamento pode ser formulado como uma composição farmacêutica que contém pelo menos uma quantidade eficiente de dsRNA configurado especificamente produzido (e opcionalmente armazenado) sob condições assépticas e testado em relação ao baixo conteúdo de microorganismos e à contaminação por endotoxinas. O medicamento pode conter ainda um veículo ou um portador fisiologicamente aceitável. Será considerado que a via preferida pode variar com o estado de saúde e a idade do indivíduo, a natureza da doença infecciosa ou neoplásica e o ingrediente ativo escolhido. A dosagem recomendada do ácido nucleico dependerá da con

dição clínica do indivíduo e da experiência do médico ou do veterinário no tratamento da infecção viral ou do tamanho do tumor. O dsRNA configurado especificamente pode ser dosado em aproximadamente 200 mg até aproximadamente 400 mg por infusão intravenosa a um indivíduo de 70 kg em um 25 programa de duas vezes por semana, embora a quantidade e/ou a frequência das doses possa ser variada pelo médico ou pelo veterinário em resposta ao estado de saúde do indivíduo. As células ou os tecidos que expressam TLR3 são sítios preferidos para o fornecimento do ácido nucleico, especialmente células apresentadoras de antígenos (por exemplo, células dendríti30 cas e macrófagos) e endotélio (por exemplo, sistemas respiratório e gástrico). Os efeitos do dsRNA configurado especificamente pode ser inido ou bloqueado através da mutação do gene TLR3 (por exemplo, deleção), da regulação para menos de sua expressão (por exemplo, siRNA), da ligação com um competidor para o sítio de ligação ao Iigante de TLR3 (por exemplo, anticorpo neutralizador) ou com um antagonista do receptor ou que interfere com um componente a jusante da via de sinalização de TLR3 (por exemplo, 5 MyD88 ou TRIF).

O AMPLIGEN® poli(l:C-12U) fornece um agente de seleção para examinar minuciosamente os efeitos da ativação do TLR3 sobre o sistema imunológico que não estava disponível anteriormente. Outros agentes como os adaptadores do TLR MyD88 e TRIF medeiam a sinalização através de 10 todos os TLR ou de TLR3/TLR4, respectivamente. Assim, a ativação ou a inição da sinalização através de MyD88 ou TRIF não restringiria os efeitos ológicos aos mediados pelo TLR3. Uma vez que a presença do TLR3 e sua sinalização são um requerimento para que o AMPLIGEN® poli(l:Ci2U) atue como um agonista do receptor, poderia ser analisada a ausência de muta15 ções no TLR3, a presença da proteína TLR3, a sinalização mediada pelo TLR3 intacto ou qualquer comnação das mesmas na célula ou no tecido de um indivíduo antes da administração do agonista. Tal confirmação da atividade do TLR3 pode ser realizada antes, durante ou depois da administração do agonista. O agonista pode ser utilizado para restringir a resposta imuno20 lógica à ativação do TLR3 sem ativar outros receptores similares a Toll ou RNA helicases.

Os exemplos a seguir ilustram adicionalmente as modalidades específicas da invenção e não é pretendido que limitem seu âmto, que é descrito anteriormente.

Exemplos

O vírus Punta Toro (PTV) está intimamente relacionado em relação à filogenia aos víruss que causam a Febre do Rift Valley e a febre do mosquito pólvora. Ao contrário de com flebovírus altamente patogênicos, a infecção humana pelo PTV produz doença que é geralmente limitada a uma 30 doença febril branda. Foram descritos modelos de infecção em roedores pequenos que produzem doença aguda com envolvimento hepático similar ao observado na infecção causada pelo vírus da Febre do Rift Valley de seres humanos e ungulados domesticados. Vários grupos descreveram a susceptiIidade de hamsters a uma doença grave induzida pela infecção causada pelo PTV. A disponilidade destes modelos com roedores torna o PTV uma alternativa viável para o uso do vírus da Febre do Rift Valley para estudos de 5 antivirais uma vez o segundo é altamente restrito e requer unidades de contenção de alto nível. Para esta finalidade, várias avaliações de antivirais promissores foram realizadas utilizando os modelos de PTV de doença aguda induzida por flebovírus. Além disso, vários grandes estudos envolviam a avaliação de moduladores imunológicos e demonstraram que o PTV é muito 10 sensível aos indutores de IFN. A importância do IFN do tipo I é confirmada no modelo de infecção de PTV de camundongos. O tratamento com anticorpos neutralizadores para IFN-α/β elimina completamente a resistência à infecção relatada em camundongos adultos. Foi provado de forma consistente que indutores potentes do IFN do tipo I tal como poli(l:C) ou poli(l:C-i2U) são 15 altamente eficientes na proteção de camundongos recém-desmamados do desafio com PTV letal.

Há cada vez mais evidências de que duas vias estão envolvidas nos eventos de ativação que resultam da exposição ao dsRNA, um intermediário da replicação dos vírus de RNA. Em adição à via de resposta ao 20 TLR3, uma via independente de TLR3 mediada pelos sensores citoplasmáticos da RNA helicase que contêm domínios que recrutam caspase (CARDs) foi recentemente descoberta. A sinalização por estes sensores de dsRNA ocorre através de vias distintas que convergem para compartilhar várias quinases e fatores transcricionais que regulam a produção de IFN-β, um fator 25 crítico na regulação da imunidade antiviral. Devido a sua restrição endossomal, o TLR3 está provavelmente envolvido no reconhecimento do dsRNA que é internalizado através do processo fagocítico celular. A localização citosólica dos detectores de dsRNA da RNA helicase, a proteína I induzida pelo ácido retinoico (RIG-I) e o gene-5 associado com a diferenciação de 30 melanoma (mda-5), pode perceber a infecção viral dentro da célula. Uma evidência recente sugere que o mda-5 desempenha uma função dominante sobre o TLR3 na resposta do IFN do tipo I ao poli(l:C). São fornecidos aqui dados que demonstram a função do TLR3 na indução da imunidade protetora pelo poli(l:Ci2U).

Indivíduos Animais

Os camundongos TLRev' eram derivados e retrocruzados em uma base de C57BL/6 na Yale University (Alexopoulou e outros, Nature 413:732-738, 2001). Estes são criados e mantidos sob condições livres de agentes patogênicos específicos na Utah State University. Os camundongos C57BL/6 (do tipo selvagem) foram obtidos no The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Fêmeas de camundongos com idades iguais foram utilizadas em todos os experimentos. Todos os procedimentos com animais utilizados nestes estudos estavam de acordo com as normas de procedimentos determinadas pelo U.S. Department of Agriculture (Departamento de Agricultura dos EUA) e pelo Utah State University Animal Care and Use Committee (Comitê de Cuidado e Uso de Animais da Universidade do Estado de Utah). Moduladores imunolóqicos

O poli(l:Ci2U) foi fornecido por HEMISPHERx® opharma (Philadelphia, PA) em uma concentração de 2,4 mg/mL. Foi diluído até a concentração apropriada com solução salina esterilizada imediatamente antes da injeção. Os materiais para gerar complexos de Iipossomo-DNA catiônicos 20 (CLDC) foram fornecidos pela Juvaris oTherapeutics, Inc. (Pleasanton, CA). Os lipossomos, o DNA e a preparação de CLDC para injeção foram descritos anteriormente por Gowen e outros (Antiviral Res. 69:165-172, 2006). O antígeno do protozoário Eiméria recomnante (rEA) foi fornecido pelo Barros Research Institute (Holt, Ml) e foi utilizado como descrito por Gowen e outros 25 (Antimicrool. Agents Chemother. 50:2023-2029, 2006). A ribavirina foi fornecida pela ICN Pharmaceuticals (Costa Mesa, CA). Todos os materiais foram administrados através da via intraperitoneal (i.p.).

Avaliação de PoIi(LCi7U) em Camundongos TLRS^' e do Tipo Selvagem Infectados com PTV

O PTV, cepa Adames, foi obtido do Dr. Dominique Pifat do U.S.

Army Medicai Research Institute for Infectious Diseases (Frederick, MD). Os estoques de vírus foram preparados após quatro passagens do estoque de vírus original através de células LLC-MK2 (American Type Culture Collection, Manassas1 VA). Camundongos TLR3'A e C57BL/6 recém-desmamados (3-4 semanas de idade) foram inoculados através de injeção subcutânea (s.c.) com 2 x 104 de 50% de doses infecciosas para cultura de células (CCID50) 5 de PTV.

No primeiro estudo, uma dose única de 10 pg de poli(l:Ci2U), 1 pg de CLDC ou placebo de solução salina foi administrada i.p. 24 horas após o desafio infeccioso. Também foi incluído um grupo de tratamento com ribavirina em que o tratamento foi administrado duas vezes por dia durante 5 10 dias começando 4 horas antes do desafio viral. Os camundongos em cada grupo foram observados em relação à morte até 21 dias. No segundo estudo, um grupo de tratamento com 1 pg de rEA substituiu os grupos de CLDC e ribavirina. Ainda, foram incluídos animais adicionais para a análise da doença hepática no 3- dia de infecção. O soro foi coletado dos camundongos 15 (n = 5) sacrificados no 3° dia de infecção e os fígados foram classificados em uma escala de 0 até 4 para icterícia hepática: 0 sendo normal e 4 sendo descoloração amarelada máxima. A atividade da alanina aminotransferase (ALT) no soro foi determinada utilizando o ALT (SGPT) Reagent Set obtido na Pointe Scientific1 Inc. (Lincoln Park, Ml).

Um estudo temporal foi realizado para comparar as cargas virais

sistêmica e no fígado, a descoloração hepática e os níveis de ALT em camundongos TLR3'a e do tipo selvagem tratados com poli(l:Ci2U). Grupos de camundongos com 8 semanas de idade (n = 5) foram sacrificados para coleta de amostras no dia 2, 3, 4 ou 5 de infecção após a intervenção terapêutica 25 com poli(l:C-i2U) ou solução salina. As amostras do dia 1 também foram coletadas para fornecer uma linha de base inicial durante o curso da infecção Camundongos mais velhos foram utilizados neste estudo uma vez que são supostamente mais resistentes à infecção pelo PTV facilitando a análise em estágios tardios da infecção. Os títulos virais foram analisados utilizando um 30 ensaio infeccioso de cultura de células que é descrito por Sidwell e outros (Antimicrob. Agents. Chemother. 32:331-336, 1988). Sucintamente, um volume específico de homogenato de fígado ou de soro foi diluído em série e adicionado em poços em triplicata de monocamadas de células LLC-MK2 em microplacas de 96 poços. O efeito citopático viral (CPE) foi determinado seis dias após a exposição ao vírus e os pontos finais a 50% foram calculados como descrito por Reed & Muench (Am. J. Hyg. 27:493-497, 1938).

5 IFN-β em Camundongos TLR3'A e do Tipo Selvagem Após o Tratamento com Polid.CipU)

Grupos de camundongos TLR3'A e do tipo selvagem de 8 semanas de idade (n = 3 por grupo) foram tratados com 10 pg de PoIi(LCi2U). O soro foi coletado 0, 1,5, 3, 6 e 24 horas após a exposição. Os níveis sistêmicos de IFN-β foram medidos utilizando reagentes de ELISA da PBL (Piscataway, NJ) como especificado pelo fabricante.

Análise Estatística

A análise log-rank foi utilizada para avaliar diferenças nos dados de sobrevivência. O teste exato de Fisher (caudal) foi utilizado para a avalia15 ção de aumentos nos sobreviventes totais. O teste de Mann-Whitney (caudal) foi realizado para analisar as diferenças no dia médio até a morte, títulos virais e níveis de ALT no soro. A análise de soma de postos de Wilcoxon foi utilizada para comparações de escores médios do fígado. O teste t de Student (bilateral) foi utilizado para determinar diferenças nos níveis de IFN-β 20 entre camundongos TLR3'A e do tipo selvagem tratados com poli(l:Ci2U).

Camundongos deficientes em relação ao TLR3 falham no desenvolvimento da imunidade protetora à infecção pelo PTV após o tratamento com poli(l:Ci2U)

Foi relatado anteriormente que o poli(l:C--|2U) é um fármaco que 25 confere proteção completa em C57BL/6 recém-desmamados contra o desafio letal com PTV, que reduz os títulos virais e que limita a disfunção hepática e doença associada à infecção com o PTV (Sidwell e outros, Ann. N.Y. Acad. Sei. 653:344-35, 1992). Para determinar se a atividade do TLR3 desempenha uma função importante na indução de defesas antivirais contra o 30 PTV pelo poli(l:C12U), camundongos TLR3'A e do tipo selvagem de 3-4 semanas de idade foram tratados 24 horas após o desafio infeccioso em um primeiro estudo. Não havia sobreviventes no grupo de camundongos TLR3'A tratados com poli(l:Ci2U) (Tabela 1). Em contraste, cinco de oito camundongos estimulados com CLDC, que provavelmente atua primariamente através do reconhecimento de TLR9 de motivos CpG presentes na estrutura do DNA plasmideal, sobreviveram à infecção. Nos camundongos do tipo selvagem, 5 tanto o dsRNA quanto o CLDC protegeram 100% dos camundongos (Tabela 1), verificando que as preparações de fármacos imunomoduladores eram altamente ativas. O tratamento com ribavirina também foi incluído como um controle positivo adicional uma vez que esta protege rotineiramente 90% ou mais dos camundongos do tipo selvagem do desafio letal com PTV. De for10 ma notável, a ribavirina protegeu somente 75% (seis de oito camundongos) dos camundongos TLR3'A da morte enquanto que a proteção completa foi observada nos animais do tipo selvagem (Tabela 1). Isto pode ser devido aos camundongos TLR3'A mais jovens (~3 semanas de idade) utilizados comparados com camundongos do tipo selvagem ligeiramente mais velhos 15 (~3-4 semanas de idade). Alternativamente, a deleção do TLR3 pode reduzir a capacidade destes camundongos de limitar a infecção e combater a doença. Tanto o CLDC quanto a ribavirina melhoraram significativamente o resultado de sobrevivência.

Tabela 1. O CLDC. mas não o dsRNA com pareamento errado. poli(l:C-i?U) ativou imunidade protetora para a infecção com PTV em camundongos desprovidos de TLR3.

Dia da Morteb Log-Rank Linhagem Tratamentoa Vivos/Total Média + SD Faixa Prob>Chi Quadrado TLR3A poli(l:C12U), 0/9 4,1 ±0,3 4-5 0,6775 10 pg CLDC, 1 μ9 5/8** 3,7 ±0,6 3-4 0,0163 Ribavirina 75 6/8** 6,0 ±2,8 4-8 0,0003 mg/kg/dia Solução sali¬ 0/9 4,2 ± 1,0 3-6 na esterilizada Tipo Sel- poli(l:C12U), vagem 10 Mg

<0,0001 Dia da Morteb Log-Rank Linhagem Tratamento3 Vivos/Total Média + SD Faixa Prob>Chi Quadrado CLDC, 1 Mg 10/10*** <0,0001 Ribavirina, 75 10/10*** <0,0001 mg/kg/dia Solução sali¬ 1/11 4,5 ±0,7 4-6 na esterilizada 3Tratamentos com dose única de poli(l:Ci2U), CLDC e solução salina administrados i.p. 24 horas após o desafio com o vírus. Ribavirina fornecida i.p. duas vezes ao dia durante cinco dias començando quatro horas antes do desafio com o vírus 5 b Média e faixa de dia da morte de camundongos que morrem

até o 21s dia.

*P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001 comparados com os respectivos controles tratados com solução salina.

Um segundo estudo foi realizado para verificar as observações iniciais. Em adição ao fato de se ter camundongos com idades comnadas de forma mais próxima (~ 4 semanas de idade), cinco camundongos adicionais foram incluídos para sacrifício no 3- dia de infecção com a finalidade de avaliar as diferenças na doença do fígado como uma conseqüência da infecção com PTV. Como mostrado na Tabela 2, o poli(l:C12U) falhou novamente em proteger camundongos TLR3'A de uma dose altamente letal de vírus e falhou em limitar a doença do fígado o que é refletido pelos níveis reduzidos de ALT no soro e escores do fígado. O rEA, um modulador imunológico de controle positivo que atua através do TLR11, era altamente eficiente na proteção de camundongos da morte e na redução de forma significativa dos níveis de ALT no soro. Como esperado, o tratamento de camundongos do tipo selvagem com poli(l;Ci2U) e rEA ativou 100% de proteção contra o inóculo de desafio altamente letal (Tabela 2). De forma interessante, a terapia com poli(l:C-i2U), que é conhecida por induzir o IFN do tipo I, terminou drasticamente com a icterícia hepática enquanto que o rEA, que não mostrou ser indutor do IFN do tipo I, não induziu escores médios do fígado em qualquer uma das linhagens de camundongo. Não havia diferenças significativas quando eram comparados os grupos de tratamento com placebo de solução salina e com rEA de TLR3'A e do tipo selvagem sugerindo que ambas as linhagens eram igualmente susceptíveis à infecção com o PTV e respondiam similarmente ao rEA. Tabela 2. O agonista do TLR11, rEA, mas não o dsRNA com pareamento errado, poli(l:C12U), protegeu camundongos deficientes em relação ao TLR3 da doença letal causada por PTV.

Dia da Morteb

Linhagem

TLRJa

T ratamento3

Vivos/Total

poli(l:C12U) 10 pg 0/10 rEA, 1 pg 10/10*"

Solução salina esterilizada

1/10

Média ± SD 4,1 +0,6

4,1+0,6

Faixa

3-5

Log-Rank

ProfcoChi

Quadrado

0,4861

<0,0001

Fígado

ALTcd + SD Escorece + SD

2700±1576 155 ±77**

3837 + 234

3.2 ±0,4

3.3 ±0,3

3,5+ 0,0

Tipo selvagem poli(l:Ci2U) 10 pg

rEA, 1 pg

10/10***

10/10**

<0,0001

3 ±6** 93 ± 56**

0,6 ± 0,2** 3,3 ±0,3

Solução salina esterilizada

vírus.

1/20 4,8 ± 1,1 3-7 3650 ± 823 3,2 ±0,3

esitn ιιι^αυα

aTratamentos com dose única de poli(l:Ci2U), rEA e solução salina administrados i.p. 24 horas após o desafio com o

b Média e faixa de dia da morte de camundongos que morrem até o 21- dia. c Determinado no 3- dia da infecção; 4-5 camundongos por grupo. d ALT, alanina aminotransferase; medida em unidades internacionais por litro. e Escore de 0 (fígado normal) até 4 (descoloração máxima).

P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001 comparados com os respectivos controles tratados com solução salina. Camundongos deficientes em relação ao TLR3 falham em reduzir a gravidade da doença e a carga vira! em resposta ao poli(l:Ci2U)

Embora o PTV seja altamente letal em camundongos C57BL/6 recém-desmamados, supostamente animais com 8 semanas de idade são refratários à infecção. Assim, foi realizado um estudo de curso de tempo abrangendo o processo de infecção e doença todo utilizando camundongos mais velhos para avaliar adicionalmente a contribuição do TLR3 para o efeito protetor da imunoterapia com poli(l:Ci2U). Como observado na figura 1A, níveis notáveis de ALT não estavam presentes até o 3S dia de infecção nos camundongos TLR3"A e do tipo selvagem e atingiram o máximo no 4- dia antes de voltarem a diminuir. Não havia diferenças nos níveis de ALT entre camundongos TLR3'A tratados com poli(l:C-i2U) e tratados com solução salina enquanto que os níveis permaneciam próximos à linha de base nos camundongos do tipo selvagem que receberam terapia com dsRNA (figuras 1A-1B). De forma interessante, apesar da grande variação observada nos dias 3 e 4 de infecção, os camundongos do tipo selvagem tratados com solução salina apresentavam níveis médios de ALT três vezes maiores que seus correspondentes deficientes em relação ao TLR3. Para os danos avaliados por exame visual geral, a doença indicada pela descoloração foi notada primeiro no 2- dia e teve seu máximo no 4- dia em camundongos tratados com solução salina (figuras 1C-1D). De acordo com a doença no fígado refletida pelos dados de ALT, uma redução significativa na icterícia hepática comparada com o controle de tratamento com solução salina nos dias 4 e 5 foi demonstrada apenas em camundongos do tipo selvagem capazes de responder ao poli(l:C-i2U). Novamente, foi observada a sugestão de maior gravidade de doença do fígado em camundongos do tipo selvagem uma vez que estes possuíam escores médios do fígado no 4e dia maiores comparados com os dos camundongos TLR3V' (3,7 ± 0,3 e 3,4 ± 0,4, respectivamente). E de forma coerente com a ausência de proteção observada nos estudos de desafio anteriores (Tabelas 1 e 2), os dados indicam que o TLR3 desempenha uma função vital na mediação da imunidade protetora contra o PTV após o tratamento com poli(l:C~i2U). Também foi verificada a carga viral no fígado e sistêmica durante o curso da infecção após o tratamento com poli(l:Ci2Ü) ou com solução salina. De forma inesperada, não foram observadas diferenças consideráveis nas cargas virais no fígado, em parte devido ao alto grau de varialidade 5 observado nos camundongos do tipo selvagem (figuras 1E-1F). Os títulos médios eram mais altos nos dias 2 e 3 nos camundongos do tipo selvagem tratados com poli(l:Ci2U), mas não estatisticamente significativos como demonstrado em vários casos com níveis de ALT no soro e escores do fígado. De forma notável, em contraste com os camundongos TLR3'A, o vírus foi 10 detectado tão logo quanto no 12 dia em vários animais do tipo selvagem (figuras 1E-1F). Embora não fosse detectável no 1a dia da infecção, o vírus no soro aumentou drasticamente no 2- dia, com a exceção dos camundongos do tipo selvagem tratados com dsRNA que eram capazes de controlar a infecção até níveis dificilmente detectáveis, o que é mostrado por uma redu15 ção maior que três Iogs do vírus (figuras 1G-1H). Mais uma vez, o efeito da terapia com poli(l:C-i2U) observado nos animais do tipo selvagem foi perdido nos camundongos deficientes em relação ao TLR. Como com a comparação de cargas virais no fígado em camundongos TLR3'A e do tipo selvagem, não foram observadas diferenças significativas de forma sistêmica nos títulos 20 máximos para os grupos tratados com solução salina (figuras 1G-1H). Porém, os títulos virais médios nos camundongos TLR3~/~ caíram abruptamente em mais de três Iogs após o 3- dia, enquanto que apenas um decréscimo gradual foi observado no tipo selvagem. A comparação entre os grupos de camundongos tratados com solução salina confirma o perfil de doença no 25 fígado mais grave sugerido observado com os animais do tipo selvagem. O vírus no fígado podia ser detectado mais cedo (dia 1) e o vírus sistêmico persistia mais tempo nos animais do tipo selvagem (figuras 1E-1H). Camundongos deficientes em relação ao TLR3 não produzem IFN-β em resposta ao tratamento com poli(l:C12U)

O dsRNA é um indutor principal do IFN-β, um fator crítico no es

tabelecimento das defesas antivirais do hospedeiro. Para testar se a ausência de TLR3 funcional altera o perfil de resposta de IFN-β, grupos de camundongos do tipo selvagem e TZ_R3y" foram tratados com a dosagem de 10 pg de PoIi(LC-^U) utilizada em todos os experimentos e a produção de IFNβ sistêmico foi determinada em vários pontos de tempo. Após um período de exposição de 1,5 hora, um aumento significativo nos níveis de IFN-β foi observado nos camundongos do tipo selvagem comparados com os camundongos TLR3'a (figura 2). Em 3 horas, os níveis de IFN-β atingiram o máximo nos camundongos do tipo selvagem enquanto permaneceram nos níveis basais nos camundongos TLR3'f\ Em 6 horas, os níveis de IFN-β tinham retomado para a linha de base nos camundongos do tipo selvagem (figura 2). Não havia indicação de indução de IFN-β em qualquer um dos pontos de tempo avaliados para os camundongos TLR3'A. As diferenças na produção de IFN-β nos tempos de amostragem de 1,5 e 3 horas eram significativas e provavelmente exercem influência na incapacidade do poli(l:Ci2U) de ativar imunidade protetora contra a infecção causada por PTV em animais deficientes em relação ao TLR3.

Discussão

Há várias linhas de evidência que vão de encontro com a proteína quinase dependente de dsRNA (PKR), o sensor citosólico clássico para o dsRNA, como sendo a via proeminente para a indução do IFN do tipo I e a defesa antiviral do hospedeiro. Os resultados anteriores mostram que o receptor de reconhecimento de padrão TLR3 é essencial para a imunidade protetora ativada pelo poli(l:Ci2U) em camundongos. As descobertas recentes de outros sensores de dsRNA citoplasmáticos e seu envolvimento na imunidade antiviral do hospedeiro sugerem que o mda-5 é o mecanismo predominante para a indução de IFN do tipo I e para a condição antiviral resultante. Foi observado, entretanto, que animais desprovidos de TLR3 falhavam em desenvolver imunidade protetora contra e em limitar a doença associada à infecção com PTV após um tratamento de dose única com poli(l:Ci2U). Além disso, a deficiência de TLR3 resultava em uma replicação viral não verificada e na ausência de uma resposta de IFN-β claramente evidente nos animais do tipo selvagem tratados com poli(l:Ci2U).

Uma advertência associada com estudos antivirais em camundongos com imunodeficiências, tal como a deleção do TLR3 é que a ausência de eficácia pode ser causada em parte pela interrupção de uma resposta mediada pelo TLR3 para a infecção com PTV independente de poli(l:Ci2U). Para esta finalidade, é concebível que a eliminação do TLR3 predisponha os

5 camundongos à doença mais grave e, consequentemente, a uma maior dificuldade de tratar a infecção. Os resultados do primeiro estudo (Tabela 1) sugerem que este pode ser o caso uma vez que os fármacos de controle positivo ribavirina e CLDC, que normalmente protegem 100% e mais de 80% dos camundongos desafiados, respectivamente, eram menos eficientes. Es10 tes resultados podem, entretanto, ter sido influenciados pela idade dos camundongos TLR3'A, que eram de forma notável menores e presumidamente alguns dias mais jovens que os camundongos do tipo selvagem neste experimento. Esta explicação é apoiada pelos resultados do segundo estudo, em que os camundongos tiveram as idades comnadas de forma mais rigorosa 15 de forma que todos estariam próximos a 4 semanas de idade. De fato, uma proteção muito similar era observada entre as duas linhagens de camundongos em resposta ao rEA e uma Ietalidade similar foi observada com os grupos de placebo de solução salina (tabela 2). Assim, uma evidência adicional refutando a capacidade diminuída dos camundongos TLRJa de combater a 20 infecção com PTV também foi observada em camundongos mais velhos. No estudo de curso de tempo que foi realizado para determinar adicionalmente as diferenças na capacidade dos camundongos TLRJi' e do tipo selvagem de responder ao poli(l:C12U), uma comparação entre os camundongos tratados com placebo sugere que os camundongos TLR3'a podem ser mais resis25 tentes à infecção e à doença causada pelo PTV. Os camundongos do tipo selvagem apresentavam maiores níveis de ALT e escores do fígado e, apesar de terem títulos máximos no soro similares, o vírus persistia mais tempo mostrando uma redução gradual enquanto que os títulos nos camundongos TLR3'a diminuíam abruptamente após o 3° dia de infecção. Estudos adicio30 nais de desafio em camundongos TLR3'A e do tipo selvagem não-tratados confirmam estas descobertas indicando que os camundongos TLR3'A não são mais susceptíveis à infecção com PTV que seus correspondentes do tipo selvagem.

Uma investigação recente do mecanismo fundamental da resposta do hospedeiro ao imitador de dsRNA utilizado comumente, poli(l:C), fornece evidência convincente de que o sensor de dsRNA citosólico, mda-5, 5 é a via de resposta primária para a produção de IFN do tipo I. Os resultados anteriores sugerem que o TLR3 é o mecanismo de resposta de dsRNA dominante. É essencial para a atividade antiviral e para a indução de IFN-β. Várias discussões ocorrem quando estas descobertas são comparadas com as de Gitlin e outros. Em seus estudos, 100 pg de poli(l:C) foram administra10 dos através de injeção intravenosa i.v. enquanto que o tratamento neste estudo foi limitado a 10 pg de poli(l:C12U) administrados através da via i.p.. A quantidade de 10 pg se baseava em experimentos planejados para determinar a dose mais apropriada para a atividade antiviral máxima no modelo de infecção com PTV. Aparentemente, a composição do dsRNA, sua via de 15 administração e a quantidade inoculada contribuíam significativamente para as discrepâncias observadas nas respostas de IFN do tipo I. É plausível que o mda-5 tenha maior especificidade pela forma poli(l:C) do dsRNA enquanto que o TLR3 possui maior afinidade pelo poli(l:C-12U). Ainda, a via de fornecimento é importante no fato de que parece haver diferenças específicas ao 20 tipo celular no reconhecimento do dsRNA. Através do fornecimento do dsRNA i.v., o material é inicialmente acessado na zona marginal do baço popuIada por células dendríticas (DCs) que não expressam níveis significativos de TLR3, resultando assim na indução de IFN do tipo I mediada predominantemente pelo mda-5. Em contraste, a administração i.p. resulta no encontro 25 inicial por populações de macrófagos peritoneais inflamatórios residentes e infiltrantes em que a ativação mediada pelo TLR3 parece ser a via principal utilizada. Esta ideia é sustentada por um número de estudos ex vivo que exploraram as respostas ao dsRNA por macrófagos peritoneais deficientes em relação a TLR3 e TRIF em cultura. Assim, a exposição direta de macrófagos 30 ao dsRNA na cavidade peritoneal produz um perfil de resposta diferente ao que seria observado quando a exposição ocorre através do fornecimento sistêmico direto que se direciona a DCs negativos em relação a CD8 apropriados para a indução de IFN do tipo I mediada pelo mda-5.

Em adição às fontes potenciais anteriores que contribuem para as diferenças observadas entre este estudo e Gitlin e outros, a quantidade de dsRNA utilizada era significativamente diferente. Aqui, foram utilizadas 10 5 vezes menos dsRNA, que comnado com a via de fornecimento i.p., resultavam em níveis comparavelmente menores de IFN-β sistêmico. A administração de 100 pg de dsRNA nu através da via i.v. produziu um excesso de mais de 10 vezes de IFN-β que o observado neste estudo (cf. Gitlin e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:8459-8464, 2006). Todavia, a quantidade de 10 IFN-β induzida pela dose mais baixa era mais que suficiente para induzir a imunidade protetora no modelo de infecção de PTV. Na verdade, um pg ou menos do material de poli(l:Ci2U) ainda fornece proteção adequada contra o desafio letal com PTV, que é mais provável e fisiologicamente relevante no contexto da infecção viral e na imunoterapia potencial com poli(l:C12U). O 15 que foi citado por último é especialmente importante considerando a toxicidade conhecida de poli(l:C). Presumidamente1 a incapacidade de produzir o tipo IFN-β após a exposição ao poli(l:Ci2U) administrado i.p. era prejudicial de forma vital para o resultado dos estudos de desafio com os camundongos TLRev-.

Patentes, pedidos de patentes, livros e outras publicações cita

dos aqui são incorporados como referência em sua totalidade.

Na determinação de uma faixa numérica, deve ser entendido que todos os valores dentro da faixa também são descritos (por exemplo, um até dez também inclui cada valor inteiro entre um e dez assim como todas as 25 faixas intermediárias tais como dois até dez, um até cinco e três até oito). O termo "aproximadamente" pode se referir à incerteza estatística associada com uma medida da varialidade em uma quantidade numérica que um perito na técnica entenderia que não afeta a operação da invenção ou sua possilidade de ser patenteada.

Todas as modificações e substituições que se encaixam dentro

do significado das reivindicações e da faixa de seus equivalentes legais devem ser admitidas dentro de seu âmto. Uma reivindicação que cita "compreendendo" permite a inclusão de outros elementos dentro do âmto da reivindicação; a invenção é também descrita por tais reivindicações que citam as expressões transicionais "consistindo essencialmente em" (isto é, permitindo a inclusão de outros elementos dentro do âmto da reivindicação se estes 5 não afetarem materialmente a operação da invenção) ou "consistindo em" (isto é, permitindo apenas os elementos listados na reivindicação sem ser impurezas ou atividades irrelevantes que estão geralmente associadas com a invenção) ao invés do termo "compreendendo". Qualquer uma destas três transições pode ser utilizada para reivindicar a invenção.

Deve ser entendido que um elemento descrito neste relatório

descritivo não deve ser interpretado como uma limitação da invenção reivindicada a não ser que seja explicitamente citado nas reivindicações. Assim, as reivindicações concedidas são a base para a determinação do âmto de proteção legal ao invés de uma limitação do relatório descritivo que extrai um 15 sentido não-explícito das reivindicações. Em contradistinção, a técnica anterior é explicitamente excluída da invenção até a extensão das modalidades específicas que antecipariam a invenção reivindicada ou destruiriam a inovação.

Além disso, nenhuma relação entre ou dentre as limitações de 20 uma reivindicação é pretendida a não ser que tal relação seja explicitamente citada na reivindicação (por exemplo, o arranjo de componentes em uma reivindicação de produto ou ordem de etapas em uma reivindicação do método não é uma limitação da reivindicação a não ser que seja explicitamente citado que seja assim). Todas as comnações e substituições possíveis de 25 elementos individuais divulgados aqui são consideradas como sendo aspectos da invenção. Similarmente, generalizações da descrição da invenção são consideradas como fazendo parte da invenção.

Partindo do que foi descrito anteriormente, seria evidente a um perito nesta técnica que a invenção pode ser incorporada em outras formas específicas sem se afastar do espírito ou de características essenciais. As modalidades descritas devem ser consideradas apenas como ilustrativas, não-restritivas, devido ao fato de que o âmto da proteção legal fornecida para a invenção será indicado pelas reivindicações em anexo e não por este relatório descritivo.

Claims

1. Método de iniciação de uma resposta inata mediada apenas pelo Receptor 3 Similar a Toll (TLR3), o dito processo compreendendo a administração a um indivíduo de pelo menos poli(l:Ci2U) em uma quantidade suficiente para ativar o TLR3 sem ativar outros receptores similares a Toll ou RNA helicases.

2. Método de tratamento de um indivíduo (i) infectado com um vírus ou (ii) que carrega um tumor ou outra célula transformada, o dito processo compreendendo a administração de uma composição farmacêutica compreendida de poli(l:Ci2U) em uma quantidade suficiente para se ligar ao Receptor 3 Similar a Toll (TLR3) para reduzir ou eliminar (i) a infecção do indivíduo pelo vírus ou (ii) a proliferação do tumor ou outra célula transformada no indivíduo, respectivamente.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, em que o indivíduo está infectado com um vírus.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, em que o vírus é um bunyavírus.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, em que o vírus é um flebovírus.

6. Método de vacinação de um indivíduo contra um vírus ou um tumor, o dito processo compreendendo a administração de (i) uma vacina que induz uma resposta imunológica contra o vírus ou o tumor e (ii) uma composição farmacêutica compreendida de poli(l:Ci2U) em uma quantidade suficiente para se ligar ao Receptor 3 Similar a Toll (TLR3) e para estimular a resposta imunológica contra um antígeno viral ou de tumor da vacina no indivíduo.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, em que o indivíduo é vacinado contra um vírus.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, em que o vírus é um bunyavírus.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, em que o vírus é um flebovírus.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que o indivíduo é um ser humano.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 9, em que o vírus ou o tumor é susceptível à ação isolada de PoIi(I--C12U) que 5 atua exclusivamente como um agonista do TLR3.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 9, em que o vírus ou o tumor expressa um antígeno que é selecionado espontaneamente por poli(l:Ci2U) como um alvo in situ para iniciar uma resposta imunológica contra o antígeno.

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que o poli(l:Ci2U) é infundido de forma intravenosa.

14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que o poli(l:C12U) é injetado de forma intradermal, subcutânea ou intramuscular; inalado de forma intranasal ou intratraqueal; ou exposto à orofaringe.

15. Uso de um ácido ribonucleico de filamento duplo com pareamento errado da fórmula geral rln.r(Cii-i4U)n, em que n é um número inteiro de 4 até 29, para produzir um medicamento para se ligar ao Receptor 3 Similar a Toll (TLR3) em células imunológicas de um indivíduo infectado por um vírus, carregando um tumor ou vacinado contra um vírus ou um tumor.

16. Ácido ribonucleico de filamento duplo com pareamento errado da fórmula geral ^rvr(Cn--I4U)n, em que n é um número inteiro de 4 até 29, que é produzido sob condições assépticas, utilizado para tratar um indivíduo infectado por um vírus, carregando um tumor ou vacinado contra um vírus ou um tumor.