ES2553787T3 - Ácidos ribonucleicos de doble cadena con estructura fisicoquímica robusta y actividad biológica muy específica - Google Patents

Abstract

Un ácido ribonucleico de doble cadena (ARNdc) aislado que comprende una cadena sencilla compuesta de poli(ácido ribocitidílico4-29uridílico) y una cadena opuesta compuesta de poli(ácido riboinosínico) de tal manera que las dos cadenas no forman un dúplex en la posición de la base uracilo, de modo que dichas cadenas están parcialmente hibridadas, caracterizado por que: el ARNdc tiene un peso molecular de aproximadamente 250 kDa a aproximadamente 320 kDa y es resistente a la desnaturalización en condiciones que son capaces de separar las cadenas de poli(ácido riboinosínico) y poli(ácido ribocitidílico) hibridadas.

Description

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DESCRIPCION

Acidos ribonucleicos de doble cadena con estructura fisicoqulmica robusta y actividad biologica muy especlfica Campo de la invencion

La invencion se refiere a nuestro descubrimiento de un nuevo acido ribonucleico de doble cadena (ARNdc) que tiene actividades biologicas especlficas, lo que incluye que actua como un agonista selectivo para la activacion del receptor tipo toll 3 (TLR3). Su estructura molecular “robusta”, tal como se mide mediante tecnicas fisicoqulmicas, es resistente al despliegue molecular (es decir, a la desnaturalizacion). Esta estructura parece ser responsable del aumento de la eficacia del ARNdc en aplicaciones terapeuticas y de la mejora de la actividad biologica (por ejemplo, usado como un agente inmunorregulador).

Antecedentes de la invencion

AMPLIGEN® (rintatolimod) poli(I):poli(Ci2U) fue desarrollado como un acido ribonucleico de doble cadena (ARNdc) sintetico para aplicaciones terapeuticas basado en el conocimiento de los efectos tanto beneficiosos como adversos inducidos por poli(I):poli(C) en la fisiologla de un sujeto. Trabajando con la hipotesis de que los requisitos de la secuencia de nucleotidos para obtener efectos beneficiosos y adversos son diferentes, desarrollamos poli(I):poli(Ci2U) para conservar los aspectos beneficiosos del ARNdc sin los efectos adversos de poli(I):poli(C) mediante la modificacion de la estructura de este ultimo con la introduccion ocasional de uridilato en la cadena de poli(C) para producir duplex que contienen regiones especlficamente configuradas sin apareamiento de bases (es decir, “apareamiento erroneo”) en la posicion de la modificacion. Estas regiones aceleran la hidrolisis del ARNdc y disminuyen la toxicidad (Greene, 1984). Por otro lado, la capacidad de inducir la slntesis de interferon se mantenla siempre que el ARNdc modificado persistiera durante una semivida de al menos cinco minutos y la frecuencia de la insercion aleatoria en la cadena del poli(acido ribocitidllico) no fuese mayor de cada 0,5 a 1,0 vuelta de helice del ARNdc perfectamente apareado (Brodsky, 1987).

Aunque el poli(I):poli(C12U) es estable en solucion, es susceptible a la hidrolisis como el resto de acidos nucleicos convencionales. La hidrolisis es muy dependiente de la estructura del acido nucleico, as! como de la presencia de nucleasa y cationes divalentes, pH y temperatura. El ARN es mas susceptible a la hidrolisis que el ADN debido al grupo 2'-OH presente en el primero, lo que facilita la hidrolisis. Por otra parte, el poli(I):poli(C12U) fue disenado para degradarse mas rapidamente que otros ARNdc en un entorno que contiene nucleasa, tales como la sangre y otros fluidos de tejidos. Los acidos nucleicos son inicialmente estables en tampones salinos fisiologicos a temperatura ambiente, aunque comienzan a degradarse gradualmente con el tiempo. Esta velocidad de hidrolisis es dependiente de la temperatura, aumentando en gran medida a temperaturas mas altas.

Las propiedades de poli(I):poli(C12U) se caracterizan por ensayos flsico-qulmicos, como se muestra en la Tabla 1. El dicrolsmo circular (DC) (por ejemplo, la elipticidad, el comportamiento de fusion) se utiliza para caracterizar la estructura de ARN de doble helice, que es crltica para la potencia. En pocas palabras, el receptor de tipo toll 3 (TLR3) es activado por el ARNdc (Alexopoulou, 2001), lo que conduce a una secuencia de reclutamiento de defensa del hospedador y, en ultima instancia, a la produccion de interferones tipo I (Schroeder, 2005). La iniciacion de la produccion de interferon por la union del ARNdc a TLR3 requiere la estructura helicoidal del ARN (Bell, 2006). Aunque la difraccion de rayos X y la RMN por si solas son las tecnicas definitivas para determinar la estructura de segundo orden del ARN, la medicion de DC con una combinacion de modos de barrido y estres termico tambien puede proporcionar una caracterizacion precisa de la estructura de doble helice crltica. De hecho, los cambios de menor importancia en la estructura de segundo orden de los polinucleotidos se han medido por DC (Gray, 1995), incluyendo los efectos de la union del ligando (Sumita, 2005).

Tabla 1. Actividad biologica y atributos medidos

Propiedad medida

Atributo de identidad Atributo de actividad

Conformation: Segundo grado DC: Elipticidad

ARN de doble cadena: integridad de la helice Union a TLR3

DC: Comportamiento de fusion: Punto de fusion Amplitud 1X

ARN de doble cadena: integridad y uniformidad de la helice Union a TLR3

Composition y tamano

Tamano maximo

N° de unidades de repeticion semivida: seguridad

Relacion C:U

Identidad semivida: seguridad

Por lo tanto, el dicrolsmo circular se puede emplear para caracterizar la potencia terapeutica del ARNdc especlficamente configurado, incluyendo el poli(I): poli(C12U).

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En cuanto a los efectos toxicos adversos, la semivida del poli(I):poli(Ci2U) se redujo a un nivel seguro de aproximadamente 4 a 5 minutos por sustitucion precisa de la cadena de poli(C), especlficamente la relacion citidina:uridina (patente US- 5.258.369). La introduccion de la base uracilo no emparejada en la cadena de poli(C) en una proportion de 1:12 (Greene, 1978) dio lugar a una longitud de bases emparejadas minima de aproximadamente una vuelta de la helice, que es la que se requiere para la interaction del ARNdc con su receptor bioactivo. Ademas, la imposition de una limitation del tamano maximo de alrededor de 350 unidades de repetition en el ARNdc dio como resultado una semivida de aproximadamente 4 a 5 minutos (Greene, 1978; Pitha, 1972).

El documento WO 2008/109083 describe tambien AMPLIGEN y divulga un ARNdc de la formula rlnr(C12U)n donde n es un numero entero de 4 a 29.

Era nuestro objetivo identificar una nueva familia de ARNdc mejorado con estructura flsico-qulmica especlfica y actividades biologicas muy especlficas, lo que incluye actuar como un agonista selectivo de TLR3. Su estructura robusta, medida por tecnicas fisicoqulmicas es resistente al despliegue molecular (es decir, la desnaturalizacion). La mejora en al menos una o mas actividades biologicas puede ser consecuencia de la estructura robusta de esta forma particular de poli(I):poli(C12U). Otras ventajas y mejoras se describen a continuation, o serlan evidentes a partir de la presente memoria de la divulgation.

Sumario de la invencion

Es un objetivo de la invencion proporcionar formas mejoradas de acido ribonucleico de doble cadena (ARNdc). Su estructura flsico-qulmica y actividades biologicas se describen en la presente memoria. Una molecula “robusta” resistente al despliegue (es decir, la desnaturalizacion) de su estructura helicoidal tiene actividad de ARNdc mejorada como un agonista selectivo de los receptores tipo toll 3 (TLR3). Se espera que al menos la purification parcial de un ARNdc robusto de otros ARNdc despues de la sintesis presente una mayor especificidad en su uso como un medicamento y, por lo tanto, menos efectos adversos atribuibles al ARNdc que no son robustos.

Un primer aspecto de la invencion proporciona un acido ribonucleico de doble cadena (ARNdc) aislado que comprende una cadena sencilla compuesta de poli(acido ribocitidilico4-29uridilico) y una cadena opuesta compuesta de poli(acido riboinosinico) de tal manera que las dos cadenas no forman un duplex en la position de la base uracilo, de modo que dichas cadenas estan parcialmente hibridadas, caracterizado por que:

el ARNdc tiene un peso molecular de aproximadamente 250 kDa a aproximadamente 320 kDa y es resistente a la desnaturalizacion en condiciones que son capaces de separar las cadenas de poli(acido riboinosinico) y poli(acido ribocitidilico) hibridadas.

En un segundo aspecto, la invencion proporciona un acido ribonucleico de doble cadena (ARNdc) aislado que comprende una cadena sencilla compuesta de poli(acido ribocitidilico4-29uridilico) y una cadena opuesta compuesta de poli(acido riboinosinico) de tal manera que las dos cadenas no forman un duplex en la posicion de la base uracilo, de modo que dichas cadenas estan parcialmente hibridadas, caracterizado por que:

el ARNdc tiene al menos una cadena de una longitud de aproximadamente 380 bases a aproximadamente 450 bases y es resistente a la desnaturalizacion en condiciones que son capaces de separar las cadenas de poli(acido riboinosinico) y poli(acido ribocitidilico) hibridadas.

En un tercer aspecto, la invencion proporciona un acido ribonucleico de doble cadena (ARNdc) aislado que comprende una cadena sencilla compuesta de poli(acido ribocitidilico4-29uridilico) y una cadena opuesta compuesta de poli(acido riboinosinico) de tal manera que las dos cadenas no forman un duplex en la posicion de la base uracilo, de modo que dichas cadenas estan parcialmente hibridadas, caracterizado por que:

el ARNdc tiene desde aproximadamente 30 hasta aproximadamente 38 vueltas de helice de cadenas de ARNdc y es resistente a la desnaturalizacion en condiciones que son capaces de separar las cadenas de poli(acido riboinosinico) y poli(acido ribocitidilico) hibridadas.

El ARNdc robusto puede aislarse sometiendo al menos las cadenas parcialmente hibridadas de una poblacion de ARNdc sintetizado, a condiciones que desnaturalizan la mayor parte del ARNdc (al menos 50 % en moles, al menos 80 % en moles, al menos 90 % en moles, o al menos 95 % en moles) de la poblacion y seleccionando a continuacion negativamente o positivamente (o ambas cosas) el ARNdc que permanece parcialmente hibridado. La pureza del ARNdc robusto puede asi aumentarse desde menos de aproximadamente 0,1-10 % en moles (por ejemplo, menos de aproximadamente 5 % en moles) con respecto a todos los ARN en la poblacion despues de la sintesis. Se prefiere que el ARNdc robusto sea mas de aproximadamente 80 a 98 % en moles con respecto a todos los ARN presentes en la misma mezcla con el ARNdc robusto (al menos 80 % en moles, al menos 90 % en moles, al menos 95 % en moles, o por lo menos 98 % en moles) despues de la selection. Las condiciones de desnaturalizacion para desplegar al menos las cadenas parcialmente hibridadas de ARNdc pueden comprender la election adecuada de sales tampon, pH, disolvente, temperatura o cualquier combination de las mismas. Las condiciones pueden ser determinadas empiricamente mediante la observation del despliegue o la fusion de las

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cadenas duplex de acido ribonucleico. El rendimiento de ARNdc robusto puede mejorarse mediante hidrolisis parcial de cadenas mas largas de acido ribonucleico y seleccionando, a continuacion, cadenas hibridadas de tamano y resistencia adecuada a la desnaturalizacion.

El peso molecular del ARNdc robusto puede ser de aproximadamente 250 kDa a aproximadamente 320 kDa, o de aproximadamente 270 kDa a aproximadamente 300 kDa. Las longitudes de una cadena sencilla o de ambas cadenas del ARNdc robusto pueden ser de aproximadamente 380 bases a aproximadamente 450 bases, o de aproximadamente 400 bases a aproximadamente 430 bases. El numero de vueltas de helice realizadas por las cadenas de ARNdc robusto pueden ser de aproximadamente 30 a aproximadamente 38, o de aproximadamente 32 a aproximadamente 36.

Al menos uno o mas ARNdc robustos diferentes se pueden administrar a un sujeto (por ejemplo, un paciente humano o animal) en necesidad de tal tratamiento. El ARNdc robusto se puede administrar en una dosificacion de aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 60 mg/dosis. Esta dosis puede administrarse una vez por semana o mes, o dos o mas dosis por semana o mes. Cada dosis (por ejemplo, de aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 60 mg, de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 40 mg, o de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 20 mg) puede ser proporcionada al sujeto sin limitacion a la formulacion de la composicion farmaceutica, o su via de administracion (aunque se prefiere la infusion intravenosa). El uso de una cantidad eficaz de ARNdc robusto para lograr una sensacion de mejora de la salud puede continuarse hasta que se mejora al menos un slntoma. La cantidad eficaz necesaria para obtener dicha mejora puede ser identica o superior a la cantidad necesaria para el mantenimiento del efecto(s).

El ARNdc robusto puede actuar especlficamente a traves de un receptor TLR3. La funcion y el fenotipo de las celulas dendrlticas pueden ser normalizadas en un sujeto (por ejemplo, paciente humano o animal). La administracion de al menos una cantidad eficaz de uno o mas ARNdc robustos a un sujeto (por ejemplo, paciente humano o animal) puede de este modo disminuir el numero o reducir la gravedad de los slntomas cuando el sujeto esta afectado por una enfermedad u otro trastorno patologico. El uso de ARNdc robusto puede corregir anomallas de maduracion de celulas dendrlticas en el sujeto sin el peligro de inducir una tormenta de citocinas.

Las celulas presentadoras de antlgeno (por ejemplo, celulas dendrlticas, macrofagos, linfocitos B) y tejidos de las mucosas (por ejemplo, epitelio, gastrico o respiratorio) son dianas preferidas en el cuerpo para el ARNdc robusto. Uno o mas antlgenos pueden ser presentados a las celulas del sistema inmunitario y el antlgeno(s) debe ser susceptible a la accion del ARNdc robusto que actua selectivamente como un agonista de TLR3. Las celulas del sistema inmunitario, microbios, celulas cancerosas, u otras celulas transformadas pueden ser susceptibles a los patrones de respuesta de citocinas especlficas activadas por ARNdc robusto actuando selectivamente como agonista de TLR3. El ARNdc robusto se administra preferiblemente por infusion intravenosa, inyeccion intradermica, subcutanea o intramuscular, inhalacion intranasal o intratraqueal o administracion orofarlngea o sublingual.

En otro aspecto, se proporciona un medicamento como una composicion farmaceutica. Se pueden usar uno o mas diferentes ARNdc robustos para su efecto beneficioso(s) sobre la salud de un sujeto, como agonista(s) de TLR3 selectivo), para tratar una enfermedad u otro trastorno patologico, o para la fabricacion de medicamentos o composiciones farmaceuticas para el tratamiento de una enfermedad u otro trastorno patologico. Los componentes inertes opcionales de la composicion incluyen excipientes y un vehlculo (por ejemplo, tampon salino o agua) en un envase monodosis o en un envase multidosis (por ejemplo, un vial o viales de inyeccion), e instrucciones para su uso. Tambien se proporcionan procedimientos para preparar y usar la composicion farmaceutica (medicamento). Por ejemplo, uno o mas diferentes ARNdc robustos se pueden formular a una concentracion de aproximadamente 0,05 mg/ml a aproximadamente 0,25 mg/ml (por ejemplo, 10 mg disueltos en 4 ml o 20 mg disueltos en 8 ml) en solucion salina fisiologica tamponada con fosfato y conservarse a una temperatura de 2 °C a 8 °C en una nevera en condiciones asepticas.

Otros aspectos de la invencion seran evidentes a partir de nuestra descripcion de las realizaciones especlficas y las reivindicaciones adjuntas, y generalizaciones a las mismas.

Breve descripcion de las figuras

La Figura 1 muestra un cromatograma de HPLC para el poli(I):poli(C12U). El pico menor centrado en un tiempo de retencion de aproximadamente 5,01 min es poli(I):poli(C12U) de doble cadena. El primer pico principal centrado en un tiempo de retencion de aproximadamente 7,58 min es el poli(C12U) monocatenario. El segundo pico principal centrado en un tiempo de retencion de aproximadamente 10,05 min es el poli(I) monocatenario). La identidad molecular de cada pico se determino mediante analisis de matriz de fotodiodos (MFD).

La Figura 2 muestra analisis de MFD de los tres picos de HPLC. El acetonitrilo, que se utiliza como disolvente, es responsable de la absorbancia a 230 nm. La absorbancia a 245 nm indica la presencia de poli(I); la absorbancia a 265 nm indica la presencia de poli(C12U). La Fig.2A es el analisis de MFD del pico centrado en un tiempo de retencion de aproximadamente 5,01 min, que contiene poli(I) y poli(C12U). La Figura 2B es el analisis de MFD del pico centrado en un tiempo de retencion de aproximadamente 7,58 min, que contiene poli(C12U). La Figura 2C es el analisis de MFD del pico centrado en un tiempo de retencion de aproximadamente 10,05 min, que contiene

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poli(I).

La Figura 3 muestra la cromatografla de exclusion por tamano de los complejos de TLR3-ECD y poli(I):poli(Ci2U) (Fig.3A), el receptor de TLR3-ECD solamente (Fig. 3B) y el ligando poli(I):poli(C12U) solamente (Fig. 3C).

La Figura 4 muestra el efecto del estres termico (40 °C) sobre el tamano del ARNdc tal como se mide por

centrifugacion analltica. La disminucion en el coeficiente de sedimentacion (S20, w) refleja una perdida de tamano

debido a la hidrolisis.

La Figura 5 muestra el efecto del estres termico (40 °C) sobre el tamano del ARNdc tal como se mide por

cromatografla llquida de alto rendimiento (HPLC). El pico del ARNdc robusto a medida que se hidrolizan las

cadenas de poli(I) y poli(Ci2U).

Descripcion de realizaciones especfficas

Se conocen muchos usos del acido ribonucleico de doble cadena (ARNdc). La eficacia de tales tratamientos, que incluye una disminucion en el numero y/o una reduccion en la gravedad de los efectos adversos de poblaciones no seleccionadas de ARNdc, se mejora por el uso de ARNdc robusto al menos parcialmente purificado. El ARNdc robusto de la invention puede ser usado para tratar a un sujeto (por ejemplo, ser humano o animal, especialmente aves, peces o mamlferos) con una infection microbiana incipiente o establecida, para tratar a un sujeto por otros trastornos patologicos caracterizados por la proliferation celular anormal (por ejemplo, neoplasia o tumor), o para su uso como un inmunoestimulante para tratar al sujeto por una enfermedad u otro trastorno patologico causado por, al menos, infeccion, proliferacion celular anormal, slndrome de fatiga cronica o dano celular por autoinmunidad o neurodegeneracion. Se prefiere que la cantidad de ARNdc robusto utilizado sea suficiente para unir el receptor tipo toll 3 (TLR3) de las celulas inmunitarias del sujeto. La inmunidad innata o adaptativa puede ser desencadenada por el mismo. Preferiblemente, el ARNdc robusto puede usarse para activar TLR3 selectivamente sin activar otros receptores tipo toll, como TLR4 o una ARNA helicasa como RIG-I o mda-5, o sin inducir una respuesta pro- inflamatoria excesiva como se ve con el agonista de TLR3 no selectivo poli(I):poli(C) en un fenomeno conocido como “tormenta de citocinas” en la tecnica.

El sujeto puede estar infectado con al menos una o mas bacterias, protozoos o virus. Se administra al sujeto una composition farmaceutica que se compone de ARNdc robusto en una cantidad suficiente para unirse a TLR3. La infeccion del sujeto se reduce o elimina de ese modo como se ha ensayado por la disminucion del tiempo de recuperation, el aumento de la inmunidad (por ejemplo, aumento del tltulo de anticuerpos, la proliferacion de linfocitos, la destruction de celulas infectadas, o la actividad de celulas asesinas naturales), la disminucion de la division o el crecimiento del microbio, o cualquier combination de estas en comparacion con el sujeto no tratado con el ARNdc robusto. La inmunidad inducida por el tratamiento es preferiblemente especlfica para el microbio, aunque la induction de la inmunidad innata tambien puede ser eficaz.

Se puede tratar una infeccion causada por un microbio. El microbio puede infectar a un sujeto humano o animal. La infeccion puede ser incipiente o establecida. El microbio puede ser una bacteria, protozoo, o virus; especialmente los que causan la enfermedad (es decir, los microbios patogenos). Aqul, los terminos “microbio” y “microorganismo” se usan indistintamente.

La bacteria puede ser una especie del genero Bacillus (por ejemplo, B. anthracis, B. cereus), Bartonella (B. henselae), Bordetella (por ejemplo, B. pertussis), Borrelia (por ejemplo, B. burgdorferi), Brucella (por ejemplo, B. abortus), Campylobacter (por ejemplo, C. jejuni), Chlamydia (por ejemplo, C. pneumoniae), Clostridium (por ejemplo, C. botulinum, C. difficile, C. perfringens, C. tetani), Corynbacterium (por ejemplo, C. amycolatum, C. diphtheriae), Escherichia (por ejemplo, E. coli O175:H7), Haemophilus (por ejemplo, H. influenzae), Heliobacter (por ejemplo, H. pylori), Klebsiella (K. pneumoniae), Legionella (por ejemplo, L. pneumophila), Listeria (por ejemplo, L. monocytogenes), Mycobacterium (por ejemplo, M. avium, M. bovis, M. branderi, M. leprae, M. tuberculosis), Mycoplasma (por ejemplo, M. genitalium, M. pneumoniae), Neisseria (por ejemplo, N. gonorrheae, N. meningitidis), Pneumocystis (por ejemplo, P. carinii), Pseudomonas (P. aeruginosa), Rickettsia, (por ejemplo, R. rickettsia, R. typhi), Salmonella (por ejemplo, S. enterica), Shigella (por ejemplo, S. dysenteriae), Staphylococcus (por ejemplo, S. aureus, S. epidermidis), Streptococcus (por ejemplo, S. pneumoniae, S. pyogenes), Treponema (por ejemplo, T. pallidum), Vibrio (por ejemplo, V. cholerae, V. vulnificus), or Yersinia (por ejemplo, Y. pestis). Aqul se incluyen bacterias gram-negativas o gram-positivas, clamidia, espiroquetas, micobacterias y micoplasmas.

El protozoo puede ser una especie del genero Cryptosporidium (por ejemplo, C. hominis, C. parvum), Entamoeba (por ejemplo, E. histolytica), Giardia (por ejemplo, G. intestinalis, G. lamblia), Leishmania (por ejemplo, L. amazonensis, L. braziliensi, L. donovani, L. mexicana, L. tropica), Plasmodium (por ejemplo, P. falciparum, P. vivax), Toxoplasma (por ejemplo, T. gondii) o Trypanosoma (por ejemplo, T. bruci, T. cruzi).

El virus puede ser un virus de ADN o ARN que infecta a los seres humanos y animales. Virus de ADN incluyen los pertenecientes a las familias Adenoviridae, Iridoviridae, Papillomaviridae, Polyomavirididae y Poxviridae (Grupo I virus de ADN de doble cadena); la familia Parvoviridae (Grupo II virus de ADN de cadena sencilla). Los virus ARN incluyen los pertenecientes a las familias Birnaviridae y Reoviridae (Grupo III virus de ADN de doble cadena); las familias Arteriviridae, Astroviridae, Caliciviridae, Hepeviridae y Roniviridae (Grupo IV virus de ARN de cadena sencilla positivo) y las familias Arenaviridae, Bornaviridae, Bunyaviridae, Filoviridae, Paramyxoviridae y

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Rhabdoviridae (Grupo V virus de ARN de cadena sencilla negativo). El ARNdc robusto tambien se puede utilizar para tratar la infeccion por virus de ADN de la familia Herpesviridae y por virus de ARN virus de las familias Flaviviridae, Hepadnaviridae, Orthomyxoviridae, Picornaviridae, Retroviridae y Togaviridae.

El sujeto puede estar afectado por una enfermedad o trastorno patologico que se caracteriza por la proliferacion anormal de celulas (por ejemplo, neoplasia o tumor, otras celulas transformadas). Se administra al sujeto una composicion farmaceutica que se compone de ARNdc robusto en una cantidad suficiente para unirse a TLR3. La enfermedad, los slntomas de la misma, su numero, o su gravedad en el sujeto puede ser reducida o eliminada de ese modo como se ha ensayado por la mejora en la morbilidad o mortalidad, el aumento de la inmunidad (por ejemplo, aumento del tltulo de anticuerpos, la proliferacion de linfocitos, la destruccion de celulas en proliferacion o transformadas o actividad de las celulas asesinas), la disminucion de la division o crecimiento de celulas en proliferacion o transformadas o cualquier combination de estas mismos en comparacion con el sujeto no tratado con el ARNdc robusto.

Las celulas del sujeto que sufren una proliferacion anormal pueden constituir una neoplasia o tumor (por ejemplo, carcinoma, sarcoma, leucemia, linfoma), especialmente las celulas transformadas por un virus tumoral (por ejemplo, virus de ADN o virus de ARN que lleva un gen u oncogen transformante) o que son de otro modo infectadas por un virus asociado con el cancer. Por ejemplo, el virus de Epstein-Barr se asocia con el cancer nasofarlngeo, el linfoma de Hodgkin, el linfoma de Burkitt, y otros linfomas; los virus de hepatitis B y C humana (VHB y VHC) estan asociados con el cancer de hlgado; el virus del herpes humano 8 (VHH-8) esta asociado con el sarcoma de Kaposi; el virus del papiloma humano (por ejemplo, VPH6, VPH11, VPH16, VPH18, o combinacion de ellos) estan asociados con el cancer cervical, el cancer anal y las verrugas genitales y el virus linfotropico-T humano (VLTH) esta asociado con la leucemia de linfocitos T y el linfoma. Los canceres incluyen aquellos que se originan en el tracto gastrointestinal (por ejemplo, esofago, colon, intestino, Ileon, recto, ano, hlgado, pancreas, estomago), genitourinario (por ejemplo, vejiga, rinon, prostata), musculoesqueletico, nervioso, pulmonar (por ejemplo, pulmon) o sistemas de organos reproductivos (por ejemplo, cuello uterino, ovario, testlculo).

La maduracion de celulas dendrlticas puede inducirse en el sujeto. Las celulas dendrlticas inmaduras, que son capaces de captar antlgenos, pueden inducirse a diferenciarse en celulas dendrlticas mas maduras, que pueden presentar antlgenos y cebar una respuesta inmunitaria adaptativa (por ejemplo, linfocitos T especlficos de antlgeno). Durante su conversion de celulas dendrlticas inmaduras en maduras, estas pueden cambiar al menos la expresion de la superficie celular del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC), moleculas coestimuladoras, moleculas de adhesion, o receptores de quimiocinas; disminuir la captation de antlgenos; aumentar la secretion de quimiocinas, citocinas o proteasas; hacer crecer procesos dendrlticos; reorganizar su citoesqueleto; o cualquier combinacion de los mismos. Pueden inducirse a migrar a sitios de inflamacion o del tejido linfoide a traves de la sangre o la linfa para traer a las proximidades microbios, celulas neoplasicas o tumorales, u otras celulas transformadas.

El sujeto puede vacunarse contra al menos una infeccion o cancer. En algunos casos, por ejemplo, los canceres inducidos por virus, tanto la infeccion como el cancer pueden ser tratados. Inmediatamente antes, durante, o inmediatamente despues de la vacunacion (por ejemplo, dentro de los 10 dlas de la vacunacion), se administra al sujeto un medicamento o una composicion farmaceutica que se compone de ARNdc robusto en una cantidad suficiente para unirse a TLR3. De esta forma, se estimula la respuesta inmunitaria a una vacuna o preparation de celulas dendrlticas. La vacuna o preparacion de celulas dendrlticas puede estar compuesta de microbios o celulas enteras muertas, fijas o atenuadas (por ejemplo, en proliferacion o transformadas); un lisado o fraction purificada de microbios o celulas (por ejemplo, en proliferacion o transformadas); uno o mas antlgenos microbianos aislados (por ejemplo, nativos, sintetizados qulmicamente, o producidos de forma recombinante); o uno o mas antlgenos tumorales aislados (por ejemplo, nativos, sintetizados qulmicamente, o producidos de manera recombinante). La vacunacion in situ puede lograrse tras la production por el sujeto del antlgeno en un sitio o en la circulation (por ejemplo, producido en una infeccion natural o crecimiento celular o antlgeno circulante) y el ARNdc robusto puede actuar como un adyuvante en el mismo.

Una cadena de poli(acido riboinoslnico) puede estar parcialmente hibridada con una cadena de poli(acido ribocitidllico4-29uridllico), poli(acido ribocitidllico11-14uridllico) o poli(acido ribocitidllico12uridllico) de tal manera que las dos cadenas no forman un duplex en la position de la base uracilo (es decir, no existe apareamiento de bases en la position de desapareamiento). ARNdc configurados especlficamente incluyen: ribo(I) ■ ribo(C4, U), ribo(I) ■ ribo(Cn, U), ribo(I) ■ ribo(C13, U), ribo(I) ■ ribo(C18, U) y ribo(I) ■ r(C20, U). Los ARNdc configurados especlficamente tambien pueden estar modificados en los extremos de la molecula para anadir una bisagra(s) para evitar el deslizamiento de los pares de bases, confiriendo de este modo una bioactividad especlfica en disolventes o entornos acuosos que existen en los fluidos biologicos humanos. Los ARNdc configurados especlficamente descritos en las patentes US- 4.024.222; US-4.130.641 y US-5.258.369 (incorporados por referencia) son generalmente adecuados para su uso de acuerdo con la presente invention despues de la selection para ARNdc robusto. Uno o mas ARNdc robusto pueden formar complejos con un pollmero estabilizante tal como polilisina, polilisina, mas carboximetilcelulosa, poliarginina, poliarginina mas carboximetilcelulosa o cualquier combinacion de los mismos.

El ARNdc robusto como al menos una portion de un medicamento o formulado con otros componentes compatibles en una composicion farmaceutica puede administrarse a un sujeto (por ejemplo, paciente humano o animal,

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especialmente aves, peces o mamlferos) por cualquier via local o sistemica conocida en la tecnica, incluyendo enteral (por ejemplo, oral, tubo de alimentacion, enema), topica (por ejemplo, dispositivo tal como un nebulizador para inhalacion a traves del sistema respiratorio, parche dermico de accion epicutanea o transdermica, supositorio que actua en el recto o vagina) y parenteral (por ejemplo, inyeccion subcutanea, intravenosa, intramuscular, intradermica o intraperitoneal; bucal, sublingual o transmucosa; inhalacion o instilacion intranasal o intratraqueal). El ARNdc robusto puede estar micronizado por molienda o trituracion del material solido, disuelto en un vehlculo (por ejemplo, solucion salina tamponada esteril o agua) para inyeccion o instilacion (por ejemplo, aerosol), aplicarse topicamente o estar encapsulado en un liposoma u otro vehlculo para la administracion dirigida. Se prefiere la disolucion del ARNdc robusto en agua para inyeccion (WFI) y la inyeccion de la composicion en el sujeto. Se puede utilizar un vehlculo para dirigir el ARNdc robusto al receptor TLR3 sobre las celulas presentadoras de antlgeno y el epitelio. Por ejemplo, las celulas dendrlticas inmaduras pueden ser contactadas en los tejidos de la piel, mucosa o linfoide. Se apreciara que la via preferida puede variar con la edad, condicion, sexo o estado de salud del sujeto; la naturaleza de la enfermedad u otro trastorno patologico, incluyendo el numero y la gravedad de los slntomas y el principio activo elegido.

Las formulaciones para administracion (es decir, composiciones farmaceuticas) pueden incluir soluciones acuosas, jarabes, elixires, polvos, granulos, comprimidos y capsulas que contienen generalmente excipientes convencionales tales como agentes aglutinantes, cargas, lubricantes, disgregantes, agentes humectantes, agentes de suspension, agentes emulsionantes, conservantes, sales tampon, aromatizantes, colorantes y/o agentes edulcorantes. Se apreciara que la formulacion preferida puede variar con la edad, condicion, sexo o estado de salud del sujeto; la naturaleza de la enfermedad u otro trastorno patologico, incluyendo el numero y la gravedad de los slntomas y el principio activo elegido.

La dosis recomendada de ARNdc robusto dependera del estado cllnico del sujeto y el tratamiento de la experiencia del medico o el veterinario en el tratamiento de la enfermedad u otro trastorno patologico. El ARNdc robusto puede administrarse a una dosis de aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 60 mg, de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 40 mg o de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 20 mg en un sujeto (por ejemplo, de masa corporal de aproximadamente 70-80 kg para un paciente ser humano) en una pauta de una a tres veces por semana (preferiblemente dos veces por semana), aunque la cantidad y/o frecuencia de la dosis puede ser variada por el medico o veterinario en respuesta a los slntomas del sujeto. El acido nucleico en forma solida se puede disolver en solucion salina fisiologica tamponada con fosfato y posteriormente perfundirse por via intravenosa. Las celulas o tejidos que expresan TLR3 son sitios preferidos en el sujeto para la administracion del acido nucleico, especialmente la celula presentadora de antlgeno (por ejemplo, celulas dendrlticas, macrofagos, linfocitos B) y el endotelio (por ejemplo, celulas endoteliales de los sistemas respiratorio y gastrico). Se apreciara que la dosis preferida puede variar con la edad, condicion, sexo o estado de salud del sujeto; la naturaleza de la enfermedad u otro trastorno patologico, incluyendo el numero y la gravedad de los slntomas y el principio activo elegido.

Las celulas dendrlticas que actuan como celulas centinela poseen estructuras superficiales moleculares que reconocen patrones moleculares asociados a patogenos (PMAP). Estos PMAP incluyen un conjunto de receptores tipo toll (TLR) que reconocen especlficamente todos los ARNdc. En particular, el ARNdc es un agonista selectivo de TLR3. El ARNdc robusto se puede usar como un agente selectivo para la activacion de TLR3. La disfuncion en la senalizacion de la molecula co-estimuladora (por ejemplo, CD80, CD83, CD86) en las celulas dendrlticas puede estar asociada con la enfermedad u otro trastorno patologico a tratar. Esta anomalla puede ser normalizada mediante el uso de ARNdc robusto como un agonista de TLR3 selectivo. Los efectos del ARNdc robusto pueden ser inhibidos o bloqueados por mutacion del gen de TLR3 (por ejemplo, delecion), regulando a la baja su expresion (por ejemplo, ARNsi), la union con un competidor por el sitio de union al ligando de TLR3 (por ejemplo, anticuerpos neutralizantes) o una antagonista del receptor o interfiriendo con un componente de etapas posteriores de la via de senalizacion de TLR3 (por ejemplo, MyD88 o TRIF).

El dicrolsmo circular (DC) es una tecnica flsico-qulmico para la caracterizacion de la conformacion del ARNdc configurado especlficamente. Tambien se puede utilizar como un indicador directo para la union de AMPLIGEN® (rintatolimod) poli(I):poli(Ci2U) como un agonista del receptor a su receptor TLR3. Ademas, la estructura helicoidal del ARNdc robusto y los requisitos estructurales para la union del ARNdc configurado especlficamente para TLR3 se pueden caracterizar precisamente por DC.

Otras tecnicas flsico-qulmicas que pueden utilizarse para caracterizar el ARNdc robusto son la cromatografla de fase inversa, el analisis de mFd (matriz de fotodiodos), la cromatografla de presion de gas (CPG), la union especlfica del ligando al receptor TLR3 y la velocidad de sedimentation medida por ultracentrifugacion.

El ARNdc robusto proporciona un agente selectivo para el analisis minucioso de los efectos de la activacion de TLR3 en el sistema inmunitario que no estaba disponible anteriormente con tal potencia. Otros agentes como los adaptadores de TLR3 MyD88 y TRIF median la senalizacion de todos los TLR o TLR3/TLR4, respectivamente. Asl, la activacion o inhibition de la senalizacion a traves de MyD88 o TRIF no restringirla los efectos biologicos a aquellas mediados por TLR3. Dado que la presencia de TLR3 y su senalizacion es un requisito para que AMPLIGEN® (rintatolimod) poli(I):poli(Ci2U) actue como un agonista del receptor, se podrla analizar la ausencia de mutaciones de TLR3, la presencia de protelna TLR3, la senalizacion intacta mediada por TLR3 o cualquier

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combinacion de los mismos en la celula o tejido de un sujeto antes de la administracion del agonista. Dicha confirmacion de la actividad TLR3 se puede realizar antes, durante o despues de la administracion del agonista. El agonista se puede utilizar para restringir la respuesta inmunitaria a la activacion de TLR3 sin activar otros receptores de tipo toll o ARN helicasas. Por ejemplo, la produccion anormal de citocinas (por ejemplo, IFN-a, IFN-p, IFN-y, TNF- a, IL-6, IL-10, IL-12) o la senalizacion de la molecula co-estimuladora (por ejemplo, CD80, CD83, CD86) de senalizacion puede ser el resultado de, al menos, la infeccion por el microbio, la proliferacion celular anormal, el dano autoinmunitario o la neurodegeneracion. Esta anomalla puede ser remodulada mediante el uso de ARNdc robusto como un agonista selectivo de TLR3. La presentacion del antlgeno se puede mejorar mediante la conjugacion del antlgeno (o un analogo de peptido del mismo) a un ligando (o un receptor) que se une especlficamente a la superficie celular (especialmente un componente de la via de internalizacion endosoma- fagosoma) de una o mas celulas presentadoras de antlgeno. La molecula de union especlfica puede ser un anticuerpo a una molecula de superficie celular, o un derivado del mismo (por ejemplo, Fab, scFv).

La expresion de CD80, CD83 y CD86 puede analizarse por citometrla de flujo usando anticuerpos marcados con fluorescencia. Tras el transporte durante la noche, las muestras de sangre se tinen en una hora desde su recepcion. Las tecnicas convencionales se utilizan para el analisis de la lisis de globulos rojos y analisis de marcadores por citometrla de flujo. Las celulas dendrlticas son identificadas basandose en un bajo nivel de expresion de los linfocitos, monocitos y marcadores de celulas NK junto con una expresion alta de HLA-DR. Las celulas dendrlticas tambien pueden caracterizarse de acuerdo con la expresion de CD11c y CD123. Los monocitos se identifican mediante analisis de dispersion lateral y la expresion de un marcador de linaje de monocitos. Los analisis de la expresion de CD80, CD83, CD86 se realizan despues de la identificacion del tipo de celula. Las mediciones de voluntarios sanos sirven como controles que indicarlan la distribucion normal y los niveles de expresion de los marcadores de celulas dendrlticas maduras tales como CD80, CD83 y CD86.

Ejemplos

La slntesis de poli(I) y poli(C12U) monocatenario comenzo con la slntesis enzimatica de los polinucleotidos de los materiales de partida mononucleotido respectivos: inosina para el poli(I); citidina (C) y uridina (U) para el poli(C12U). A continuacion se usaron etapas de extraccion y precipitation repetitivas para eliminar las impurezas residuales. Las soluciones de reaction que contienen los productos se concentraron por ultrafiltracion y se extrajeron con fenol cuatro veces. Las soluciones concentradas y extraldas se precipitaron, se disolvieron y se precipitaron de nuevo en etanol acuoso (50:50). Mientras que el poli(I) precipitado se separo por centrifugation, la fase llquida sobrenadante (residuos) del poli(C12U) adherente se elimino simplemente por aspiration. Las pastas de precipitados se volvieron a disolver, a continuacion se concentraron, se diafiltraron y se concentraron de nuevo. Las soluciones a granel finales que contienen polinucleotido se filtraron. La solution filtrada se liofilizo y las materias primas se almacenaron congeladas.

Slntesis enzimatica. La slntesis enzimatica utilizada en el proceso de fabrication es dependiente de la enzima polinucleotido fosforilasa para sintetizar el acido poliinoslnico y policitidllico12uridllico a partir de sus respectivos materiales de partida: citidin 5'-difosfato, sal trisodica (CDPNa3), uridin 5'-difosfato, sal disodica (UDPNa2) e inosin 5'-difosfato, sal trisodica (IDPNa3).

La enzima cataliza la formation de polinucleotido en una reaccion reversible utilizando Mg++ como un co-factor y ATP como fuente de energla. Los polinucleotidos se sintetizaron en la direction 5' a 3' con la liberation concurrente de fosfato inorganico. El rendimiento maximo se vio limitado por el equilibrio entre las velocidades de slntesis y reversion, la reaccion de degradation (fosforolisis). El progreso de la reaccion se siguio midiendo el consumo de CDP o IDP. La viscosidad de la solucion de reaccion tambien se controlo. Se filtro agua purificada en el tanque. Al tanque se anadieron de una vez los siguientes componentes y se mezclo: TRIS (hidroximetil)aminometano, urea, cloruro de magnesio hexahidratado (MgCl 6H2O) y acido etilendiaminotetraacetico (edetato), sal disodica (EDTANa2). Tambien se anadieron materia prima de mononucleotidos.

Cada componente se disolvio antes de anadir el siguiente. Despues de que se hubieran anadido todos los componentes, la solucion se mezclo durante un mlnimo de 10 minutos. A continuacion, la mezcla se ajusto y se anadio agua purificada hasta obtener un volumen final del lote. De esta mezcla de reaccion pre-enzima se tomaron muestras para determinar la concentration inicial de CDP o IDP. La enzima polinucleotido fosforilasa se anadio mezclando, con lo cual comenzo la slntesis de polinucleotidos. Ademas, el perfil de viscosidad a la concentracion optima de la enzima debe exhibir el aumento habitual de la viscosidad con el tiempo sin una disminucion significativa al termino de la reaccion de lote; una disminucion significativa de la viscosidad indicarla la degradacion no deseada de los polinucleotidos. Despues de anadida la cantidad optimizada de enzima al lote de produccion, la slntesis enzimatica progreso con agitation constante y controlada. El consumo de CDP o IDP se controlo aproximadamente cada hora. La reaccion se termino mediante la adicion de una solucion de parada. La viscosidad tambien se controlo, a tltulo informativo, durante el proceso.

Concentracion de la solucion de reaccion. Para reducir al mlnimo el volumen requerido de fenol para las extracciones, se concentro la solucion del producto de reaccion.

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Extraccion de Poli(I) y Poli(Ci2U). La enzima residual se elimino predominantemente por extraccion con fenol. Las soluciones del producto de reaccion poli(C12U) o poli(I) concentradas se transfirieron al tanque de extraccion y se anadieron TRIS 2M y dodecilsulfato de sodio (SDS). Despues de al menos 5 minutos de mezclado, se anadio fenol licuado y la solucion de dos fases se mezclo para dispersar la fase de fenol en la fase acuosa. Se empleo SDS como un agente tensioactivo para facilitar la disolucion de la protelna desnaturalizada en la fase fenol; se requirio TRIS para tamponar la solucion a un pH optimo para la estabilidad de los polinucleotidos. La mezcla de extraccion permanece sin mezclar durante tiempos de sedimentacion predeterminados para que se produzca la coalescencia de las fases. La fase de residuos de fenol inferior se bombea a continuacion a los contenedores para su eliminacion. La ubicacion del corte de fenol era importante con el fin de separar eficazmente el fenol y la protelna de la fase de producto superior, que contiene poli(Ci2U) o poli(l). La fase de fenol y una capa intermedia de emulsion que contiene solidos de protelna desnaturalizada, se descartaron observando visualmente el llquido que fluye a traves del cristal en la salida del tanque. Cuando la capa de fenol y la capa de emulsion desaparecieron y solo se observo fase de producto, la valvula de salida se cerro y el corte de fenol se considero completo.

Precipitacion de Poli(Ci2U) o Poli(I). El fenol contaminante, SDS y otras sales restantes en la solucion se eliminaron por precipitacion con alcohol etllico desnaturalizado. La solucion de poli(Ci2U) o poli(I) concentrada se bombeo en el tanque de precipitacion. Se anadio el alcohol desnaturalizado y despues de mezclar se separo el precipitado.

Concentration y diafiltracion. Las sales a granel restantes, una pequena cantidad de mononucleotido sin reaccionar y el fenol se eliminaron mediante diafiltracion frente a agua. El precipitado se disolvio en el recipiente de precipitacion original con mezcla suave y calefaccion. Despues de disolver, la solucion se concentro de nuevo y se diafiltro frente a agua para inyeccion (WFI). La solucion se filtro antes de la liofilizacion.

Liofilizacion. El material poli(Ci2U) o poli(I) filtrado se cargo en un liofilizador. El material se congelo y a continuacion se aplico un vaclo. El producto se considero liofilizado cuando se completo el ciclo programado.

Fabrication de la solucion esteril de Poli(I):Poli(Ci2U) para infusion intravenosa. El poli(I) y poli(Ci2U) se disolvieron en solucion salina tamponada con fosfato. Se mezclaron cantidades molares iguales en una etapa de hibridacion y se enfriaron a temperatura ambiente. Las soluciones se filtraron esterilmente.

Preparation de la solution con excipiente, vehiculo tampon. Se anadio WFI al tanque. Los excipientes se anadieron al tanque y se mezclaron. Despues de mezclar, se tomaron muestras del lote para determinar el pH y la osmolalidad. El control de calidad debe estar dentro de los llmites durante el proceso antes de su uso para la formulacion de las soluciones que contienen poli(I) y poli(Ci2U).

Formulacion de las soluciones de Poli(I) y Poli(C12). Una cantidad inicial de solucion de tampon se subdividio segun la formula del lote y se filtro y se anadio al tanque. El poli(I) o poli(Ci2U) se anadio a la solucion tampon y se disolvio mezclando. La temperatura de la solucion se aumento y se mantuvo con mezclado. La solucion se recirculo a continuacion.

Hibridacion de las cadenas de Poli I y Polii2U. Se transfirieron al tanque cantidades equivalentes de poli(I) y poli(Ci2U). Con mezclado continuo, se aumento la temperatura de la solucion. Se extrajeron muestras y se analizaron para determinar la potencia y el pH.

Filtration esteril. La solucion a granel se filtro esterilmente en llnea en un recipiente de compensacion esterilizado al vapor.

Operaciones de llenado. Se llevo a cabo la operacion de llenado. Despues de llenado cada vial, se uso un tapon esteril para tapar el vial. Los viales con tapon fueron transportados desde el area de procesamiento aseptico donde fueron sellados.

El ARNdc robusto se aislo del poli(I):poli(Ci2U) hibridado, que se preparo de acuerdo con lo anterior, ya sea por cromatografla analltica o cromatografla llquida de alto rendimiento (HPLC) preparativa como una molecula sustancialmente purificada y farmaceuticamente activa. Su peso molecular es de aproximadamente 286 kDa y tiene aproximadamente 4i3 pares de bases de longitud con aproximadamente 34 vueltas completas de la helice de ARN. Solo es de aproximadamente i % en moles a aproximadamente 4 % en moles de una composicion no fraccionada de AMPLIGEN® (rintatolimod). La mayorla del ARNdc (alrededor de 96 % en moles a aproximadamente 99 % en moles) despues de la slntesis tiene un peso molecular de aproximadamente i,2 Mda y tiene una longitud de aproximadamente 2.000 pares de bases con aproximadamente i66 vueltas completas de la helice de ARN. El ARNdc robusto en el pico de HPLC 5 min es aproximadamente 4,9 veces mas pequeno que la mayor parte del ARNdc y encaja mejor con el sitio de union al ligando de su receptor de superficie celular (TLR33).

Debido a su estructura, el ARNdc robusto es inusualmente resistente a la interrupcion de su ARN de doble helice y desplegado molecular. Por lo tanto, el ARNdc robusto en las condiciones de ensayo descritas en la presente memoria tiene aproximadamente i00 a aproximadamente i000 veces mayor de bioactividad que el mismo peso de AMPLIGEN® (rintatolimod) poli(I):poli(Ci2U) no seleccionado.

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(a) Proteccion por poli(I):poli(Ci2U) mediante la activacion selectiva de TLR3

La activacion de TLR3 esta asociada a la expresion de IFN-a/p, IL-6 o IL-12. La relacion entre la expresion de IFN a traves de la activacion de TLR3 por el ARNdc fue establecida por Alexopoulou (2001) utilizando celulas 293T que expresan diferentes receptores de tipo toll (TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TlR6 o TlR9 humano). Solo aquellas celulas que contienen TLR3 humano mostraron una expresion marcada de IFN-a/p, IL-6 o IL-12 cuando se estimulaban con poli(I):poli(C).

Poli(I):poli(Ci2U) Induce la modulacion del gen de defensa del hospedador a traves de una activacion de TLR3 muy selectiva. Para entender la relacion entre la respuesta inmunitaria innata dependiente de TLR3 y la proteccion viral, Gowen (2007), sometio a ratones deficientes en TLR3 a ARNdc y midio la expresion de IFN-a/p, IL-6 e IL-12. Los ratones tambien fueron posteriormente estimulados por exposicion al virus de Punta Toro (PTV). La proteccion contra la estimulacion viral era exquisitamente sensible al tratamiento con poli(I):poli(C12U). La proteccion viral conferida por poli(I):poli(C12U) estaba completamente abolida en el caso de los ratones deficientes de TLR3. Cuando se compara con la eficacia parcial pero significativa de poli(I):poli(C) en ratones TLR3'/_, esta claro que las sustituciones estructurales de la uridina en la cadena de citidina de poli(I):poli(C12U) son responsables de la via dependiente de TLR3 altamente especlfica. Ademas, las mediciones de IFN-a/p e IL-6 establecen una asociacion directa entre la proteccion o la falta de la misma frente al PTV y la modulacion de estas citocinas.

Esta orientacion selectiva de la via de serialization de TLR3 representa una ventaja significativa para las aplicaciones terapeuticas de poli(I):poli(C12U) en comparacion con otros posibles mecanismos citosolicos tales como, por ejemplo, el uso de poli(I):poli(C) en el ARNdc no sustituido para estimular la production de citocinas a traves de aRn helicasas tales como MdA-5 y RIG-1 (Pichlmair, 2.006) .

(b) La union del ARNdc a TLR3 requiere la conformation helicoidal del ARNdc

Sitio de union a TLR3. Al estudiar la estructura de los cristales nativos de TLR3, Choe (2005) observo que TLR3 es una estructura grande solenoide, dextrogiro, en forma de herradura formada por 23 repeticiones ricas en leucina. La superficie convexa glicosilada y las superficies concavas cargadas negativamente son sitios poco probables para la union del ARNdc. En consecuencia, propusieron que la union del ARNdc se produce en areas cargadas positivamente, situadas en la cara lateral.

Utilizando el analisis mutacional, Bell (2005, 2006) modificaron presuntos sitios de union a TLR3 en las areas cargadas positivamente y observaron la formation de un complejo ARNdc/TLR3 por cromatografla de exclusion por tamano. A pesar de la presencia de numerosos residuos cargados positivamente, solo se requerlan para la union dos aminoacidos N541 y H539. El grupo amido de H539 podrla interactuar con el ARNdc mediante un enlace de hidrogeno. La proximidad del segundo residuo cargado positivamente N541 tambien era importante, aunque el papel de este aminoacido no era tan claro. La mutation en el aspirado cargado negativamente evitaba la union del ARNdc, sin embargo la conversion en un residuo de alanina neutro no tuvo ningun efecto sobre la union del ARNdc.

La union a TLR3 requiere la conformacion helicoidal del ARNdc. Tras la determination estructural de las superficies de union mas probables del ARNdc en TLR3, Choe (2005) propuso, ademas, que la simetrla helicoidal de la estructura del ARNdc es necesaria para la creation de la forma activada de dlmero simetrico de TLR3 asociado a la membrana. En el complejo ternario en la superficie de la membrana, dos moleculas de TLR3 simetricamente opuestas se unen a cada lado de la helice de la ARNdc comun.

Como se discutio anteriormente, utilizando el analisis mutacional, Bell (2005, 2006) definio dos residuos altamente conservados (N541 y H539) que son necesarios para la union del ARNdc a TLR3. Ademas, el requisito de restriction para la union del ligando a ambos de estos residuos de TLR3 se satisface solo por la arquitectura del surco menor de la conformacion (helicoidal) del ARNdc. Cuando el fosfato del ARNdc se une en las proximidades a H539 sensible a la carga, entonces el lado amida (H541) se alinea con el sitio de union al hidrogeno de un grupo 2'- hidroxilo del ARNdc solo cuando se utilizan dimensiones helicoidales.

(c) La conformacion helicoidal del ARNdc y la consiguiente alteration debida a las interacciones con el ligando se caracterizan con precision mediante dicrolsmo circular

El dicrolsmo circular proporciona information detallada acerca de las estructuras helicoidales secundarias del ARNdc o sus alteraciones debidas a la union al ligando; as! como los cambios estructurales causados por la hidrolisis enzimatica y la adicion de iones metalicos. Ademas, en el modo de estres termico, la informacion conformacional ofrecida por el DC proporciona informacion valiosa para explicar la estabilidad del ARN.

Caracterizacion del ARNdc. Gray (1995) mostro que el DC, aplicado en el protocolo de la curva de mezcla, coimplementaba mediciones de absorcion ultravioleta para determinar la estequiometrla del ARN bicatenario (A- G:C-T(U)). En este enfoque, la propiedad optica se analiza como una funcion de las proporciones anadidas de cadenas individuales. Las magnitudes de las graficas de diferencia del DC eran maximas para las mezclas 50:50. Ademas, el comportamiento isodicroico se correlacionaba con la formacion de estructuras mas ordenadas o

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Interacciones con el ligando. Ghazaryan (2006) estudio la interaccion del ligando con el ARNdc con una familia de piridinio porfirinas cargadas positivamente. A partir de las mediciones de DC observaron que pequenas modificaciones de la estructura de porfirina conduclan a profundas diferencias en el modo de su union a la estructura de doble helice. Mientras que TEtOHPyP4 se asociaban por intercalacion, TMetAlPyP4 se unla formando una estructura externa de auto-apilamiento.

Usando el dicrolsmo circular, Brown (2002) mostro que ADAR1, un ARNdc humano (quimerico) se convertla de la forma A a la forma Za tras la union a adenosina desaminasa. La corroboracion se obtuvo por cristalizacion del complejo y espectroscopia de Raman. Sorrentino (2003) estudio la potente degradacion enzimatica del ARNdc por la ribonucleasa pancreatica humana (HP-RNasa). El dicrolsmo circular del complejo ARN/enzima revelo que la union multi-sitio del ARNdc a la HP-RNasa era responsable de la desestabilizacion de la helice de ARN.

Estabilidad de ARNdc. Al estudiar el componente ARNr del complejo ribosomal 70S, Sumita (2005) mostro que las sustituciones de psuedouridina estabilizan la helice del ARNdc basandose en la informacion estructural proporcionada por dicrolsmo circular (DC). Especlficamente, las sustituciones de pseudouridina creaban regiones bicatenarias con pares de bases de cierre y enlaces de hidrogeno mediados por agua. La estabilizacion mediante Mg++ tambien se caracterizo por DC en este estudio. Investigando la estabilidad de los hlbridos de ADN-ARN con variantes en la composition de bases, Lesnik (1995) mostro que los hlbridos mas estables conservan la elipticidad a 210 nm, una longitud de onda caracterlstica de la banda de ARN de un solo componente (forma hlbrida A). Por el contrario, hlbridos menos estables mostraban menor elipticidad a 210 nm, valores que fueron intermedios entre los componentes de ARN y ADN.

Una composicion de ARNdc puede ser analizada por cromatografla llquida de alto rendimiento (HPLC) como se muestra en la Fig. 1. El analisis de un lote representativo de AMPLIGEN® (rintatolimod) poli(I):poli(C12U) dio como resultado dos picos distintos: uno con tiempos de retention de 9,85 a 10,35 min que corresponde a la cadena de poli(I) y de 7,30 a 7,80 min, lo que corresponde a la cadena de poli(C12U). El ARNdc robusto se encuentra en un tiempo de retencion de aproximadamente 5 min, lo que representa una especie molecular unica resistente a la desnaturalizacion y al desplegado. Las condiciones desnaturalizantes eliminarlan la actividad biologica exclusivamente debida a la union al receptor TLR3. Este metodo analltico puede usarse tambien como un ensayo que indica la estabilidad y, en particular, puede ser utilizado para mostrar que el ARNdc robusto es inusualmente resistente a la interruption de su doble helice y al despliegue molecular.

La identidad de cada pico se determina por analisis con un detector de matriz de fotodiodos (MFD) como se muestra en la Fig. 2. En cada tiempo de retencion seleccionado, se obtuvo una exploration de absorcion UV de longitudes de onda de 200 nm a 360 nm. El duplex poli(I):poli(C12U) y las cadenas individuales de poli(I) y poli(C12U) tienen sus propias longitudes de onda de absorcion pico especlficos. Los picos de absorcion centrados en 248 nm y 265 nm indican la presencia de ARNdc robusto (alrededor de 286.000 dalton) que tiene poli(I) y poli(C12U), respectivamente (Fig. 2A). El pico de absorcion centrado en aproximadamente 265 nm indica la presencia de la cadena poli(C12U) (Fig. 2B). El pico de absorcion centrado en aproximadamente 248 nm indica la presencia de la cadena poli(I) (Fig. 2C). El pico de absorcion centrado en aproximadamente 230 nm se debe al acetonitrilo utilizado como disolvente. Debido a la escasez relativa de ARNdc robusto, la senal a 230 nm se resto de la Fig. 2A.

Nombre comun: poli(I):poli(C12U) especie predominante

Nombre qulmico: poli(acido inoslnico):poli((acido citidllico)12(acido uridllico))

CAS, numero de registro: 3864-92-5 Otros nombres: YY057

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Arriba se muestran una vista parcial de las cadenas de poli(I):poli(Ci2U) parcialmente hibridadas y la interaccion de bases de las cadenas individuales de poli(l) y poli(C12U). Bases individuales de inosina se unen a bases de citosina, pero no a la base uridina. En esta estructura, el poli(acido inoslnico) esta unido a traves del hidrogeno (llneas discontinuas) al poli(acido citidllico), ocurriendo la sustitucion de acido uridllico cada 12-13 bases como promedio. Formula molecular: (13C1oH11N4O7P)n: ((12C9H12N3O7P)(C9H11N2OsP))n Tamano molecular: aproximadamente 1.200.000 daltons

El numero de unidades de repeticion (n) correspondientes al tamano de poli(I):poli(C12U) de aproximadamente 1,2 Mda es 2000 pares de bases o 166 vueltas helicoidales completas.

TABLA 2. Peso molecular (PM) de los componentes

PM Unidad de repeticion PM de unidad de repeticion

Inosin 5' monofosfato

330 13 4527

Citidin 3' monofosfato

305 12 3880

Acido uridllico

306 1 324

Global

Promedio: 318 N/A Suma: 8730

Nombre comun: poli(I):poli(C12U) especie menor variante (286.000 daltons) Nombre qulmico: poli(acido inoslnico):poli((acido citidllico)12(acido uridllico))

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Arriba se muestra una vista parcial de las cadenas parcialmente hibridadas de poli(I):poli(C12U) y la interaccion de bases de las cadenas individuales de poli(I) y poli(C12U). Las bases individuales de inosina se unen a bases de citosina, pero no a la base de uridina. En esta estructura, el poli(acido inoslnico) esta unido a traves del hidrogeno (llneas discontinuas) al poli(acido citidllico), ocurriendo la sustitucion de acido uridllico cada 12-13 bases como promedio. Este es el ARNdc “robusto”.

Formula molecular: (13C10HnN4O7P)n: ((12C9H12N3O7P)(C9HnN2O8P))n Tamano molecular: aproximadamente 286.000 daltons

El numero de unidades de repeticion (n) correspondiente al intervalo de tamano de la nueva variante, tambien denominado ARNdc robusto (tambien denominado pico de 5 min en la HPLC) es de 286 Kda teniendo 413 pares de bases, lo que representa 34 vueltas completas de la helice de ARN y es resistente al desensamblaje de las cadenas unidas a traves del hidrogeno en condiciones de temperatura elevada o ionicas anormales.

El dicrolsmo circular (DC) se ha utilizado para medir la estructura secundaria (helices bicatenarias) de pollmeros biologicos y sinteticos, incluyendo protelnas y acidos nucleicos. El DC es la medicion de la absorcion de la luz polarizada circular a derecha o izquierda, a una longitud de onda especlfica, por moleculas quirales. La quiralidad qulmica es la propiedad de una molecula de ser o no ser superponible sobre su imagen especular. Un atomo que hace que su molecula sea quiral se llama un atomo quiral o, mas comunmente, un centro quiral. El poli(I):poli(C12U) tiene una serie de centros quirales debido a sus estructuras primarias y secundarias. Los centros quirales se encuentran en las bases de nucleotidos, que forman las dos estructuras primarias de las dos cadenas de ARN individuales (ARN monocatenario) de poli(I):poli(C12U). Los centros quirales adicionales proceden de la hibridacion de cada ARN monocatenario con el otro a traves de enlaces de hidrogeno de sus bases complementarias. La union hidrofoba entre las bases adyacentes de ARNdc se conoce como apilamiento de bases y produce una estructura

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secundaria helicoidal, flexible, lineal simetrica de forma y tamano definidos. Los espectros de DC para AMPLIGEN® (rintatolimod) poli(I):poli(C12U), que es dependiente de la longitud de onda, se observa que es una funcion que refleja la absorcion de Gauss para cada centro quiral. Para ello, el espectro de DC de un ARNdc tal como poli(I):poli(Ci2U) es dependiente del apareamiento de bases complementarias de las estructuras de doble cadena y el complejo de quiralidad de la estructura helicoidal resultante.

Se ha demostrado por espectroscopia UV y DC que la actividad biologica del ARNdc es dependiente de estas configuraciones espaciales y estericas especlficas. Dado que la perturbacion de la estructura helicoidal tiene como resultado la perdida de los centros quirales caracterlsticos de la estructura secundaria, el analisis y la monitorizacion de la estructura secundaria por DC proporciona un metodo para caracterizar las propiedades fisicoqulmicas del poli(I): poli(Ci2U) que estan asociados con su bioactividad.

La elipticidad especlfica medida en un barrido de longitud de onda proporciona un parametro cuantitativo, que se calcula como la relacion de elipticidad en ciertas longitudes de onda “crlticas”. El valor de este parametro estructural, la relacion DC278/DC245, es unica para el poli(I):poli(Ci2U). En un segundo analisis de DC, la elipticidad se mide durante el calentamiento. A medida que el poli(I):poli(Ci2U) se calienta y se desnaturaliza termicamente, las cadenas de poli(I) y poli(Ci2U) individuales se desenrollan debido a la ruptura de enlaces de hidrogeno entre pares de bases complementarias. Cuando se representa la derivada de la temperatura de elipticidad, el valor mlnimo derivado corresponde a la temperatura de fusion, definido como el punto en el que se desenrolla el 50 % de la conformacion de doble cadena. La anchura a media altura del pico, una medida de la uniformidad estructural, tambien se convierte en una indicacion de su integridad. En conjunto, estos Indices termicos proporcionan una medida de la resistencia de las helices de ARNdc.

La exploracion de longitud de onda detecta dos picos: un primer pico a 245 nm correspondiente a la helice de cadena doble del poli(I):poli(Ci2U) y un segundo pico a 278 nm que corresponde al apilamiento de pares de bases del acido nucleico.

Precision. AMPLIGEN® (rintatolimod) poli(I):poli(Ci2U), lote 9807CD, a una concentracion de 2,5 mg/ml se sometio a ensayo varias veces para investigar la precision del ensayo de DC. Las desviaciones estandar relativas porcentauales (% DER) para la temperatura de fusion (Tm), para la anchura a media altura para la primera derivada de la curva de fusion y para la relacion entre las mediciones de los picos de DC a 278 nm y 245 nm se calcularon como 0,76 %, 9,09 % y i,4i %, respectivamente. Esto demostro que el ensayo de DC de AMPLIGEN® (rintatolimod) poli(I):poli(Ci2U) actua de una manera precisa durante el analisis termico para la determinacion de Tm y la anchura a media altura de la primera derivada de la curva de fusion termica y durante el analisis de exploracion de DC para la determinacion de la relacion de DC a 278 no a DC a 245 nm.

Especificidad. Este metodo de DC para la caracterizacion de poli(I):poli(Ci2U) tambien es especlfico, ya que puede diferenciar entre acidos nucleicos de doble cadena de acidos nucleicos de una cadena sencilla u otros acidos nucleicos de doble cadena similares que no cumplen con las especificaciones de fabrication y liberation de AMPLIGEN® (rintatolimod) poli(I):poli(Ci2U). La especificidad de este metodo, en lo que respecta al analisis de acidos nucleicos de una cadena frente a los de doble cadena, se demostro mediante la comparacion de los perfiles de exploracion y curvas de temperatura de fusion. Las exploraciones de moleculas de doble cadena, tales como poli(I):poli(Ci2U); poli(I):poli(C) y poli(A):poli(U) difieren significativamente de las obtenidos durante el analisis de moleculas de una cadena sencilla tales como poli(I) y poli(Ci2U). Ademas, cada una de las exploraciones de DC fue unica para las especies moleculares que se ensayaron.

La especificidad del ensayo tambien se investigo para evaluar, de forma inequlvoca, la capacidad de detectar compuestos de estructura estrechamente relacionada.

(a) Acidos ribonucleicos de doble cadena de diferente composition de bases de nucleotidos, tales como

poli(I):poli(Ci2U), poli(I):poli(C) y poli(A): poli(U).

(b) AMPLIGEN® (rintatolimod) poli(I): poli(Ci2U) que cumpla con la especificacion de tamano del pollmero.

(c) Acido ribonucleico de doble cadena formulado a partir de las cadenas de poli(I) y poli(CxUy) con una relacion

entre bases de citidina y uridina de ii-i4 a i (relacion C:U = ii:i a i4:i).

La especificidad de los ensayos para el ARNdc que diferla en su composicion de bases de nucleotidos se puso de manifiesto por comparacion de las exploraciones de DC y las curvas de fusion de moleculas de doble cadena, similares, pero diferentes, tales como poli(I):poli(Ci2U), poli(I):poli(C) y poli(A):poli(U). Los perfiles de la exploracion de DC parecen ser similares, como se ha visto con las exploraciones de AMPLIGEN® poli(I):poli(Ci2U) y poli(I):poli(C). Pero los calculos de las relacionas obtenidas a 278 nm y 245 nm y el analisis estadlstico con la prueba t posterior para la igualdad de las medias, mostraron que la exploracion de DC de AMPLIGEN® (rintatolimod) difiere significativamente del ARNdc similar que tiene diferentes composiciones de bases de nucleotidos. La especificidad para el ARNdc de diferente composicion de bases de acido nucleico tambien se demostro por sus curvas de fusion termica. Las curvas de fusion termica del ARNdc diferlan significativamente entre si. El analisis estadlstico (prueba t para medias iguales) de los datos de las graficas de la primera derivada de las curvas de fusion confirmo que los resultados obtenidos para sus respectivas Tm y la anchura a media altura son significativamente diferentes. Por lo

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tanto, la especificidad del metodo de DC diferencia AMPLIGEN® (rintatolimod) de otras moleculas de ARNdc por parametros tanto de la exploracion como de los perfiles de fusion termica.

El metodo de DC es especlfico para la deteccion de poli(I):poli(Ci2U) formulado a partir de pollmeros que no cumplan con las especificaciones antes mencionadas para el tamano. Cuando uno o ambos pollmeros de la molecula de poli(I):poli(Ci2U) esta fuera de la especificacion de tamano 4-8S, los resultados del analisis de DC de estas moleculas no cumplen con las especificaciones de AMPLIGEN® (rintatolimod) en lo que respecta a Tm y a la anchura a media altura de la primera derivada de la curva de fusion termica. El no cumplimiento con las especificaciones de estos parametros de DC se observa con estas formulaciones, incluso cuando se satisface la especificacion de tamano diferencial ± 1,5S. En relacion con los datos obtenidos de los analisis de fusion termica de las formulaciones de AMPLIGEN® (rintatolimod), las determinaciones de la relacion DC278/DC245 eran menos especlficas. Las exploraciones de DC por si solas no diferencian entre las formulaciones de poli(I):poli(Ci2U) y no- poli(I):(Ci2U) que no cumpllan con las especificaciones de fabricacion y/o liberacion para el tamano del pollmero.

Como se indico anteriormente, la especificidad del analisis de DC es sensible al tamano de las cadenas de pollmero de una cadena sencilla. Ademas, cuando la diferencia de tamano entre los componentes complementarios del pollmero de una cadena sencilla, poli(I) y poli(Ci2U), es 2,4S o mayor, el analisis de fusion termica por DC va a diferenciar poli(I):poli(Ci2U) a partir de moleculas similares que no cumplen con la especificacion para la diferencia en el tamano del pollmero complementario.

El analisis de DC puede distinguir entre poli(I):poli(Ci2U) y moleculas similares que no cumplen con las especificaciones de la cantidad de estructura de doble cadena ni con el apareamiento de bases entre las cadenas poli(I) y poli(Ci2U) complementarias. La cantidad de apareamiento de bases es dependiente de la proporcion relativa entre acido citidllico y acido uridllico (relacion C:U) del pollmero (CxUy). La relacion entre citidina y uridina en el pollmero (CxUy) afecta a la temperatura de fusion, (Tm), as! como a la anchura a media altura de la primera derivada de la curva de fusion. Cuando la relacion entre citidina y uridina es inferior a ii:i, hay menos cantidad de estructura de doble cadena o apareamiento de bases (entre las cadenas complementarias de acido poliinoslnico y acido policitidllico de la helice de ARN bicatenario) que la de AMPLIGEN® (rintatolimod). Esto se traduce en Tm observadas menores y anchuras mas grandes a media altura para la primera derivada de las curvas de fusion termica respecto a lo observado para poli(I):poli(Ci2U). El aumento de la relacion entre citidina y uridina de la cadena poli(CxUy) aumenta el apareamiento de bases entre las cadenas complementarias de la helice y, por lo tanto, aumenta la Tm observada y disminuye el ancho observado a media altura de la primera derivada de la curva termica. Las determinaciones DC278/DC245 resultaron ser menos sensibles a las diferencias en la relacion C:U en las formulaciones de AMPLIGEN® (rintatolimod).

Tanto el tamano de las cadenas complementarias de pollmero como la relacion C:U de la cadena del poli(Ci2U) doble contribuyen a la estructura de doble cadena de una molecula de poli(I):poli(Ci2U). La estructura de doble cadena, a su vez, contribuye a la eficacia del farmaco, como se ha discutido en la introduccion. Por lo tanto, el metodo de DC es una herramienta analltica importante para la caracterizacion de poli(I):poli(Ci2U). Aunque las exploraciones de DC y las determinaciones DC278/DC245 son menos especlficas que las determinaciones del analisis de fusion termica de Tm y la anchura a media altura de la primera derivada de la curva de fusion, los tres parametros de DC se pueden utilizar en combination para la caracterizacion e identification exhaustiva de poli(I):poli(Ci2U):

Bioactividad y estabilidad de del ARNdc robusto

Se midio la bioactividad del ARNdc y del poli(I):poli(Ci2U) y, a continuation, se compararon utilizando un ensayo de union a ligando. La estabilidad se midio usando el ensayo de liberacion de producto, ensayo de HPLC de fase inversa.

A continuacion se presenta un resumen de los resultados, seguido de una discusion mas detallada. La combinacion de una mayor bioactividad y una estabilidad mucho mayor en condiciones de estres termico de 40 °C ilustran la “robustez” de esta novedosa variante de ARNdc (es decir, ARNdc robusto) y sugieren que estara mas biodisponible que la mayorla de las moleculas de ARNdc en una formulation de AMPLIGEN® (rintatolimod).

1. Bioactividad del ARNdc robusto que muestra dos veces mayor afinidad de union en comparacion con el ARNdc no seleccionado.

Los sitios de union al ARNdc robusto se convierten en insaturados en una proporcion de 0,50:i (TLR3:ARNdc robusto) o superior. Pero los sitios de union para AMPLIGEN® (rintatolimod) poli(I):poli(Ci2U) se convierten en insaturados en una proporcion de 0,20: i (TLR3:ARNdc no seleccionado) o superior.

2. La estabilidad del ARNdc robusto es cuatro veces mayor que la del ARNdc no seleccionado

AMPLIGEN® (rintatolimod) poli(I):poli(Ci2U) es estable (es decir, Sw,20 > i0,0) durante menos de 90 dlas cuando se somete a hidrolisis bajo estres termico de 40 °C. Por el contrario, el ARNdc robusto es estable durante mas de 360 dlas en las mismas condiciones.

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3. Los datos de estabilidad y bioactividad muestran que el ARNdc robusto esta mas biodisponible que el ARNdc no seleccionado

A partir de estas consideraciones de estabilidad y bioactividad, el ARNdc robusto esta mas biodisponible para el receptor de senalizacion relevante que transmite el beneficio terapeutico. El ARNdc robusto tiene el beneficio adicional de mantener la estabilidad a largo plazo a temperatura ambiente, lo que tiene importantes implicaciones cllnicas para el tratamiento de las poblaciones en las regiones del mundo sin las capacidades de refrigeracion adecuadas.

Bioactividad de fondo

Los receptores tipo toll (TLR) son moleculas de senalizacion que reconocen patrones moleculares asociados a patogenos (PMAP) y activan los mecanismos de la defensa inmunitaria innata: TLR3 reconoce el ARNdc, la estructura genomica de algunos virus, y tambien un intermedio generado durante la replicacion del ARN viral. El ARNdc tambien se produce intracelularmente mediante la formacion de una estructura de tipo tallo-bucle o con ARNsi-ARNm. AMPLlGEN® (rintatolimod) esta compuesto de moleculas de ARNdc que actuan a traves de la union de TLR3 y en procesos de senalizacion de etapas posteriores. Aunque la senalizacion de poli(I):poli(C) tiene rutas alternativas, la via del poli(I):poli(Ci2U) actua exclusivamente a traves de la union a TLR3, ya que el tratamiento con AMPLlGEN® (rintatolirnod) protege a los ratones TLR3+/+ pero no TLR3-/- de la infeccion por el virus Punta Toro. Las celulas TLR3-/- no producen IFN tras el tratamiento con poli(I):poli(Ci2U), mientras que el IFN es inducido por el poli(l):poli(C) en las celulas con TLR3 desactivado.

La conformacion del ectodominio (ECD) de la molecula TLR3 y su relacion con la union de ARNdc esta bien caracterizada, incluyendo el potencial sitio de union. Los aminoacidos H539 y N541 estan implicados en la interaccion con la doble helice. El analisis mutacional de estos aminoacidos en el sitio de union refuerza aun mas el argumento.

Se conoce el efecto de la longitud y la estructura de ARNdc sobre la union a TLR3 y la induction de IFN. La inosina30 (I30):poli(C) o poli(I):citosina30 (C30) indujo el interferon (IFN), pero tramos mas cortos de ARNdc no inducen IFN. Sin embargo, en comparacion con ellos, la induccion de IFN por poli(I):poli(C) era siempre superior. I20: C20, I30:C30 e I40:C40 eran inductores de IFN ineficaces. Por lo tanto, la caracterizacion de AMPLIGEN® (rintatolimod) por su capacidad de union a TLR3 es un biomarcador para predecir su actividad biologica.

Metodo de bioactividad

Un intervalo de relaciones entre TLR3-ECD y AMPLIGEN® (rintatolimod) no seleccionado o ARNdc robusto se hacen reaccionar por el metodo de Leonard (2008). Los componentes se separan mediante el metodo de cromatografla de exclusion por tamano descrito a continuation. A partir de las cantidades maximas de TLR3-ECD libre y del complejo ligando-receptor, se determina la relacion de TLR3-ECD que se requiere para la saturation de cualquiera de AMPLIGEN® (rintatolimod) o ARNdc robusto. Esta relacion TLR3-ECD/ARNdc umbral proporciona una indication directa de la fuerza ligando-union del ligando y, por tanto, de la bioactividad.

El siguiente metodo es una adaptation de los procedimientos experimentales utilizados para caracterizar la union al ligando TLR3 a nivel molecular. Dado que TLR3-ECD (1,12 x 102 Kda) y poli(I):poli(Ci2U) (0,2-2 x 103 Kda) tienen diferentes patrones de elucion, pueden ser separados unos de otros por cromatografla de exclusion por tamano (SEC). De acuerdo con los resultados obtenidos a partir del poli(I):poli(C) utilizando una columna SUPERDEX 200 PC 3.2/30 y recogiendo fracciones de 80 ql, la mayorla del poli(I):poli(C) aparece en las fracciones 3-5, mientras que TLR3-ECD se eluye en las fracciones 9-12 (Bell, 2005).

La union de TLR3-ECD a poli(I):poli(C) o poli(I):poli(C12U) crea un complejo que es mas grande de tamano que cualquiera de los componentes iniciales. La elucion posterior de TLR3-ECD libre se separa del complejo. La optimization de la separation identifico que la columna SUPEROSE 200 PC proporcionaba una union superior mediante la reduction del efecto de cola, debido a la ausencia de interacciones no especlficas con el ARNdc.

La Fig. 3 muestra los cromatogramas resultantes obtenidos a partir de la mezcla reaccionada de TLR3- ECD/poli(I):poli(C12U) en comparacion con las inyecciones de los componentes de TLR3-ECD y poli(I):poli(C12U) solos, respectivamente.

Caracterizacion de los picos. La identification y cuantificacion de TLR3-ECD en fracciones de cromatografla de exclusion por tamano es posible en un formato ELISA. El TLR3-ECD comercialmente disponible es una protelna recombinante que contiene una cola de His. Un anticuerpo de captura anti-cola de His inmoviliza TLR3-ECD en un pocillo de la microplaca. Un segundo anticuerpo primario, biotinilado se une cuantitativamente al TLR3-ECD inmovilizado. Este anticuerpo secundario se selecciona para que tenga un epltopo distal respecto al sitio de union al ARNdc en la molecula de TLR3-ECD y tambien respecto al epltopo reconocido por el anticuerpo de captura. La estreptavidina conjugada con HRP reconoce el segundo anticuerpo primario biotinilado. El sustrato apropiado metabolizado por HRP produce un color soluble adecuado para la medicion cuantitativa de TLR3-ECD.

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La concentration de AMPLIGEN® (rintatolimod) en las fracciones de cromatografla de exclusion por tamano se mide por fluorescencia utilizando diluciones estandar y fracciones de cromatografla en una prueba de RiboGreen cuantitativa. Este ensayo permite el analisis de AMPLIGEN® (rintatolimod) fuera de su envase (es decir, el ARNdc robusto no seleccionado) sin transformation, preparation o extraction adicional, manteniendo as! su condition como producto farmaceutico.

Resultados de bioactividad. Los resultados de la Tabla 3 muestran el porcentaje de TLR3-ECD libre que permanece en una serie de reacciones usando diferentes proporciones entre TLR3-ECD y ARNdc: Estos estudios se realizaron con cualquier AMPLIGEN® (rintatolimod) no seleccionado, as! como ARNdc robusto.

La union de TLR3-ECD al ARNdc robusto es mas eficaz que la union del TLR3-ECD a AMPLIGEN® (rintatolimod) no seleccionado. Se requiere una relation aproximadamente 2 veces mayor entre TLR3-ECD y el ARNdc robusto “insaturado” (- 0: 50:1) en comparacion con AMPLIGEN® (rintatolimod) (0,25:1). Ademas, el perfil de union con varias relaciones muestra un punto final mucho mas agudo para la saturation para el caso del ARNdc robusto, lo cual puede reflejar una mayor uniformidad estructural para este ARNdc mas compacto.

TABLA 3. Mediciones de bioactividad del ARNdc no seleccionado frente al ARNdc robusto

Relacion molar TLR3-ARNdc

AMPLIGEN® (rintatolimod) no seleccionado, Lote n° 0701 HE ARNdc robusto

% Area del complejo ARNdc/TLR3

% Area TLR3 libre % Area del complejo ARNdc/TLR3 % Area TLR3 libre

0,20: 1

99,0 0,978 99,4 0,577

0,25: 1

78,4 21,6 99,1 0,880

0,33: 1

20,9 79,1 92,9 7,086

0,50: 1

58,9 41,1 60,3 39,723

0,67: 1

15,4 84,6 11,3 88,660

La union a TLR3 del ARNdc robusto es 2 veces mejor que la union al receptor de AMPLIGEN® (rintatolimod) no seleccionado. TLR3 libre (area> 10 %) aparece en una relacion TLR3:ARNdc de 0,25:1 para AMPLIgEn® (rintatolimod) no seleccionado en comparacion con un 0,50:1 para el ARNdc robusto.

Estabilidad del ARNdc robusto. La estabilidad del poli(I):poli(C12U) se midio en unas condiciones de temperatura aceleradas de 40 °C en comparacion con la temperatura de conservation a largo plazo de 2 °C a 8 °C. Como se muestra en la Fig. 5, el tamano de poli(I):poli(C12U) decae a esta temperatura segun se mide por ultracentrifugacion analltica (S20,w). La disminucion en el tamano se debe al despliegue de la doble helice (perdida de enlaces de hidrogeno) y a la hidrolisis concomitante de los enlaces fosfodiester. La bioactividad del ARNdc requiere un coeficiente de sedimentation de aproximadamente 10,0 a aproximadamente 15,0 S(20,w), mientras que el tamano de poli(I):poli(C12U) despues de mas de 180 dlas indica una perdida de bioactividad en alrededor de 8,0 S(20,w).

La Fig. 6 muestra los resultados de un segundo parametro indicador de la estabilidad, el ensayo de HPLC de fase inversa, descrito anteriormente, que separa poli(I):poli(C12U) en sus cadenas individuales; es claramente evidente que la hidrolisis comienza con la cadena de poli(I) seguido de la cadena de poli(C12U). Los resultados de HPLC muestran que la perdida de tamano no comienza hasta el inicio de la hidrolisis de la segunda cadena de poli(C12U); la molecula de ARN conserva la estructura de doble cadena cuando solo una de las hebras sufre hidrolisis. Esta perdida de tamano en alrededor de 90 dlas se produce con la hidrolisis tanto de la cadena poli(I) como de poli(C12U).

Es importante destacar que el pico del ARNdc robusto (5 min) no se ve afectado en ningun grado por el estres termico. De hecho, aumenta en relacion con las cadenas de poli(I) y poli(C12U). Esto muestra de forma concluyente que el ARNdc robusto no solo es “robusto”, sino que puede formarse espontaneamente a partir de cadenas mas pequenas de poli(I):poli(C12U) degradado.

Al indicar un intervalo numerico, se debera entender que tambien se describen todos los valores dentro del intervalo (por ejemplo, de uno a diez tambien incluye todo valor entero entre uno y diez, as! como todos los intervalos intermedios, tales como dos a diez, uno a cinco y tres a ocho). El termino “aproximadamente” puede referirse a la incertidumbre estadlstica asociada con una medicion o a la variabilidad de una cantidad numerica que una persona experta en la tecnica entenderla no afecta al funcionamiento de la invention o su patentabilidad.

Todas las modificaciones y sustituciones que se incluyan dentro del significado de las reivindicaciones y el intervalo de sus equivalentes legales estan abarcadas dentro de su alcance. Una reivindicacion que rece “comprende” permite la inclusion de otros elementos que esten dentro del alcance de la reivindicacion; la invencion tambien se describe mediante tales reivindicaciones en las que se citan frases de transition “consiste esencialmente en” (es decir, que permite la inclusion de otros elementos para que esten dentro del alcance de la reivindicacion si no

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afectan materialmente al funcionamiento de la invention) o “que consiste en” (es decir, permitiendo solo los elementos que figuran en la reivindicacion que no sean impurezas o actividades intrascendentes que normalmente se asocian con la invencion) en lugar del termino “que comprende”. Cualquiera de estas tres transiciones puede ser usada para reivindicar la invencion.

Se debe entender que un elemento descrito en esta memoria descriptiva no debe interpretarse como una limitation de la invencion reivindicada a menos que expllcitamente se cite en las reivindicaciones. Por lo tanto, las reivindicaciones concedidas son la base para determinar el alcance de la protection legal en lugar de una limitacion de la especificacion que se lee en las reivindicaciones. En contraposition, la tecnica anterior se excluye expllcitamente de la invencion en la medida en que realizaciones especlficas anticipasen la invencion reivindicada o destruyesen la novedad.

Por otra parte, no se pretende una relation especial entre dos o mas limitaciones de una reivindicacion a menos que dicha relacion se cite de manera expllcita en la reivindicacion (por ejemplo, la disposition de los componentes en una reivindicacion de producto u orden de pasos en una reivindicacion de metodo no es una limitacion de la reivindicacion a menos que se indique expresamente que es asl). Todas las posibles combinaciones y permutaciones de elementos individuales aqul divulgados se consideran aspectos de la invencion. Del mismo modo, las generalizaciones de la description de la invencion se consideran parte de la invencion.

Las realizaciones descritas se deben considerar solamente como ilustrativas, no restrictivas, ya que el alcance de la proteccion legal proporcionado por la invencion estara indicado por las reivindicaciones adjuntas mas que por esta memoria.

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   REIVINDICACIONES

   1. Un acido ribonucleico de doble cadena (ARNdc) aislado que comprende una cadena sencilla compuesta de poli(acido ribocitidilico4-29uridilico) y una cadena opuesta compuesta de poli(acido riboinosinico) de tal manera que las dos cadenas no forman un duplex en la posicion de la base uracilo, de modo que dichas cadenas estan parcialmente hibridadas, caracterizado por que:

   el ARNdc tiene un peso molecular de aproximadamente 250 kDa a aproximadamente 320 kDa y es resistente a la desnaturalizacion en condiciones que son capaces de separar las cadenas de poli(acido riboinosinico) y poli(acido ribocitidilico) hibridadas.
2. 2. Un acido ribonucleico de doble cadena (ARNdc) aislado que comprende una cadena sencilla compuesta de poli(acido ribocitidilico4-29uridilico) y una cadena opuesta compuesta de poli(acido riboinosinico) de tal manera que las dos cadenas no forman un duplex en la posicion de la base uracilo, de modo que dichas cadenas estan parcialmente hibridadas, caracterizado por que:

   el ARNdc tiene al menos una cadena de una longitud de aproximadamente 380 bases a aproximadamente 450 bases y es resistente a la desnaturalizacion en condiciones que son capaces de separar las cadenas de poli(acido riboinosinico) y poli(acido ribocitidilico) hibridadas.
3. 3. Un acido ribonucleico de doble cadena (ARNdc) aislado que comprende una cadena sencilla compuesta de poli(acido ribocitidilico4-29uridilico) y una cadena opuesta compuesta de poli(acido riboinosinico) de tal manera que las dos cadenas no forman un duplex en la posicion de la base uracilo, de modo que dichas cadenas estan parcialmente hibridadas, caracterizado por que:

   el ARNdc tiene desde aproximadamente 30 hasta aproximadamente 38 vueltas de helice de cadenas de ARNdc y es resistente a la desnaturalizacion en condiciones que son capaces de separar las cadenas de poli(acido riboinosinico) y poli(acido ribocitidilico) hibridadas.
4. 4. El ARNdc de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que solo dicha cadena sencilla de dicho ARNdc, comprende una o mas bases uracilo o guanina que no estan emparejadas con la cadena opuesta.
5. 5. El ARNdc de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que ambas cadenas de dichos ARNdc, comprenden una o mas bases uracilo o guanina que no estan emparejadas con la cadena opuesta.
6. 6. El ARNdc de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho ARNdc se compone de ribo(ln).ribo(Cn- 14U)n.
7. 7. El ARNdc de la reivindicacion 6, en donde dicho ARNdc se compone de ribo(ln). ribo(C12U)n.
8. 8. Una composition que comprende uno o mas ARNdc diferentes como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
9. 9. Uso de ARNdc como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para la fabrication de un medicamento o de una composicion farmaceutica.
10. 10. El ARNdc como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para su uso en una cantidad terapeutica para el tratamiento de un sujeto, siendo dicha cantidad terapeutica preferiblemente para infusion intravenosa; inyeccion intradermica, subcutanea o intramuscular; inhalation intranasal o intratraqueal; o administration intratraqueal, orofaringea o sublingual.
11. 11. La composicion de la reivindicacion 8 para su uso en una cantidad terapeutica para el tratamiento de un sujeto, siendo dicha cantidad terapeutica preferiblemente para infusion intravenosa; inyeccion intradermica, subcutanea o intramuscular; inhalacion intranasal o intratraqueal; o administracion intratraqueal, orofaringea o sublingual.