PT2340307E - Ácidos ribonucleicos de cadeia dupla com uma estrutura físico-química robusta e uma atividade biológica altamente específica - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

ÁCIDOS RIBONUCLEICOS DE CADEIA DUPLA COM UMA ESTRUTURA FÍSICO-QUÍMICA ROBUSTA E UMA ATIVIDADE BIOLÓGICA ALTAMENTE

ESPECÍFICA

CAMPO DA INVENÇÃO A invenção refere-se à descoberta dos inventores de um ácido ribonucleico de cadeia dupla (dsARN) inovador que tem atividades biológicas especificas, que incluem a atuação como um agonista seletivo para a ativação do recetor tipo Toll 3. A sua estrutura molecular "robusta", conforme medida por técnicas fisico-quimicas, é resistente ao desdobramento molecular (isto é, desnaturação). Esta estrutura parece ser responsável pelo aumento da eficácia do dsARN em aplicações terapêuticas e pela melhoria da atividade biológica (por exemplo, utilizado como um agente imunorregulador).

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Poli (I):poli (C12U) AMPLIGEN® (rintatolimod) foi desenvolvido como um ácido ribonucleico de cadeia dupla (dsARN) sintético, para aplicações terapêuticas com base num entendimento de ambos os efeitos benéficos e adversos induzidos por poli(I):poli(C) na fisiologia de um sujeito. Partindo da hipótese de que os requisitos da sequência de nucleótidos para os efeitos benéficos e adversos são diferentes, poli (I):poli(Ci2U) foi desenvolvido pelos inventores para preservar os aspetos benéficos do dsARN sem os efeitos adversos de poli (I):poli(C), por modificação da estrutura deste último com a introdução ocasional de uridilato na cadeia de poli(C) para produzir duplexs que contêm regiões configuradas especificamente que não são de base emparelhada (isto é, "desemparelhadas"), na posição da modificação. Estas regiões aceleram a hidrólise de dsARN e reduzem a toxicidade (Greene, 1984) . Por outro lado, a capacidade de induzir a síntese de interferão foi retida enquanto o dsARN modificado persistiu durante uma semivida de, pelo menos, cinco minutos e a frequência de inserção aleatória na cadeia de poli(ácido ribocitidílico) não foi maior do que cada volta helicoidal de 0,5 a 1,0 de dsARN de base perfeitamente emparelhada (Brodsky, 1987) .

Enquanto poli(I) :poli (Ci2U) é estável em solução, ele é suscetível à hidrólise como todos os outros ácidos nucleicos convencionais. A hidrólise é altamente dependente da estrutura do ácido nucleico, bem como da presença de nuclease e catiões divalentes, pH e temperatura. O ARN é mais suscetível à hidrólise do que o ADN por causa do qrupo 2' -OH presente no anterior que facilita a hidrólise. Além disso, poli (I):poli (Ci2U) foi concebido para se degradar mais rapidamente do que outros dsARN num ambiente contendo nucleases, tal como sangue e outros fluidos dos tecidos. Os ácidos nucleicos são estáveis inicialmente em tampões de sal fisiológicos à temperatura ambiente, mas gradualmente começam a degradar-se com o tempo. Esta taxa de hidrólise é dependente da temperatura e aumenta muito a temperaturas mais elevadas.

As propriedades de poli (I):poli (Ci2U) são caraterizadas por ensaios físico-químicos como mostrado no Quadro 1. O dicroísmo circular (CD) (por exemplo, elipticidade, comportamento de fusão) é utilizado para caracterizar a estrutura de ARN de dupla hélice, que é crítica para a potência. Resumidamente, o recetor tipo Toll 3 (TLR3) é ativado por dsARN (Alexopoulou, 2001), o qual conduz a uma sequência de recrutamento de defesa do hospedeiro, produzindo, em última instância, interferões do tipo I (Schroeder, 2005) . A iniciação da produção de interferão por ligação de dsARN a TLR3 requer a estrutura helicoidal de ARN (Bell, 2006) . Embora a difração de raios-X e a RMN sozinha sejam as técnicas definitivas para determinar a estrutura de segunda ordem de ARN, a medição por CD com uma combinação de modos de rastreio e de stress térmico pode também proporcionar a caracterização precisa da estrutura de dupla hélice critica. Com efeito, pequenas alterações na estrutura de segunda ordem de polinucleótidos têm sido medidas por CD (Gray, 1995), incluindo os efeitos da ligação do ligando (Sumita, 2005).

Assim, o dicroismo circular pode ser utilizado para caracterizar a potência terapêutica de dsARN configurado especificamente incluindo poli(I) :poli (C12U) .

No que se refere a efeitos tóxicos adversos, a semivida de poli(I) :poli (C12U) foi reduzida a um nível seguro de cerca de 4 a 5 minutos por substituição precisa da cadeia de poli(C), especificamente a razão de citidina para uridina (Patente U.S. 5.258.369). A introdução da base desemparelhada uracilo na cadeia de poli (C) numa razão de 1:12 (Greene, 1978) resultou num comprimento de bases emparelhadas mínimo de cerca de uma volta helicoidal, o qual é requerido para a interação de dsARN com o seu recetor bioativo. Além disso, a colocação de uma limitação ao tamanho máximo no dsARN, de cerca de 350 unidades de repetição, resultou numa semivida de cerca de 4 a 5 minutos (Greene, 1978; Pitha, 1972). O documento WO 2008/109083 divulga também Ampligen e divulga um dsARN da fórmula rln-r(Ci2U)n em que n é um número inteiro de 4 a 29.

Era o objetivo dos inventores identificar uma nova família de dsARN melhorados tendo estrutura físico-química específica e atividades biológicas altamente específicas, as quais incluem atuar como um agonista seletivo para TLR3. A sua estrutura robusta, conforme medida por técnicas físico-químicas, é resistente ao desdobramento molecular (isto é, desnaturação) . A melhoria em pelo menos uma ou mais atividades biológicas pode resultar da estrutura robusta desta forma particular de poli(I) :poli (C22U) . Outras vantagens e melhorias estão descritas abaixo ou serão evidentes a partir da divulgação no presente documento.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO E um objetivo da invenção proporcionar formas melhoradas de ácido ribonucleico de cadeia dupla (dsARN). São descritas no presente documento a sua estrutura físico-química e as suas atividades biológicas. Uma molécula "robusta" resistente ao desdobramento molecular (isto é, desnaturação) da sua estrutura helicoidal melhorou a atividade de dsARN como um agonista seletivo do recetor tipo Toll 3 (TLR3). Pelo menos é espectável que a purificação parcial de dsARN robusto a partir de outro dsARN presente, após a síntese, aumente a especificidade na sua utilização como um medicamento e, assim, reduza os efeitos adversos atribuíveis ao dsARN que não é robusto.

Um primeiro aspeto da invenção proporciona um ácido ribonucleico de cadeia dupla (dsARN) isolado que compreende uma cadeia simples constituída por poli (ácido ribocitidí lico4-29uridí lico) e uma cadeia oposta compreendida por poli(ácido riboinosínico) de tal modo que as duas cadeias não formam um duplex na posição da base uracilo, por meio do qual as referidas cadeias são parcialmente hibridadas, caracterizado por: o dsARN ter uma massa molecular de cerca de 250 kDa até cerca de 320 kDa e ser resistente a desnaturação sob condições que são capazes de separar cadeias hibridadas de poli(ácido riboinosínico) e de poli(ácido ribocitidílico).

Num sequndo aspeto, a invenção proporciona um ácido ribonucleico de cadeia dupla (dsARN) isolado que compreende uma cadeia simples constituída por poli(ácido ribocitidí lico4-29uridí lico) e uma cadeia oposta compreendida por poli(ácido riboinosínico), de tal modo que as duas cadeias não formam um duplex na posição da base uracilo, por meio do qual as referidas cadeias são parcialmente hibridadas, caracterizado por: o dsARN ter pelo menos uma cadeia com um comprimento de cerca de 380 bases até cerca de 450 bases e ser resistente a desnaturação sob condições que são capazes de separar cadeias hibridadas de poli(ácido riboinosínico) e de poli(ácido ribocitidílico).

Um terceiro aspeto da invenção proporciona um ácido ribonucleico de cadeia dupla (dsARN) isolado que compreende uma cadeia simples constituída por poli(ácido ribocitidílico4-29uridílico) e uma cadeia oposta constituída por poli (ácido riboinosínico) , de tal modo que as duas cadeias não formam um duplex na posição da base uracilo, por meio do qual as referidas cadeias são parcialmente hibridadas, caracterizado por: o dsARN ter desde cerca de 30 até cerca de 38 voltas helicoidais de cadeias de ARN em duplex e ser resistente a desnaturação sob condições que são capazes de separar cadeias hibridadas de poli(ácido riboinosinico) e de poli(ácido ribocitidílico). 0 dsARN robusto pode ser isolado por, pelo menos, submetendo as cadeias parcialmente hibridadas de uma população de dsARN sintetizado a condições que desnaturam a maioria de dsARN na população (pelo menos 50 mol%, pelo menos 80 mol%, pelo menos 90 mol% ou pelo menos 95 mol%) e em seguida selecionando negativa ou positivamente (ou ambas) para dsARN que permanecem parcialmente hibridados. Após a síntese a pureza de dsARN robusto pode, assim, ser aumentada desde menos de cerca de 0,1-10 mol% (por exemplo, menos de cerca de 5 mol%) em relação a todos os ARN na população. Depois da seleção é preferível que o dsARN robusto seja mais do que cerca de 80-98 mol% em relação a todos os ARN presentes na mesma mistura com o dsARN robusto (pelo menos 80 mol%, pelo menos 90 mol%, pelo menos 95 mol% ou pelo menos 98 mol%) . As condições de desnaturação para desdobramento de cadeias pelo menos parcialmente hibridadas de dsARN, podem compreender escolhas apropriadas de sais tampão, pH, solvente, temperatura ou qualquer combinação dos mesmos. As condições podem ser determinadas empiricamente por observação do desdobramento ou da fusão das cadeias duplex de ácido ribonucleico. O rendimento de dsARN robusto pode ser melhorado por hidrólise parcial das cadeias mais longas de ácido ribonucleico, depois a seleção de cadeias (parcialmente) hibridadas de tamanho e resistência apropriados para a desnaturação. A massa molecular de dsARN robusto pode ser desde cerca de 250 kDa até cerca de 320 kDa ou desde cerca de 270 kDa até cerca de 300 kDa. Os comprimentos de uma cadeia simples ou de ambas as cadeias de dsARN robusto podem ser de cerca de 380 bases até cerca de 450 bases ou desde cerca de 400 bases até cerca de 430 bases. O número de voltas helicoidais feitas por cadeias de ARN em duplex de dsARN robusto pode ser desde cerca de 30 até cerca de 38 ou desde cerca de 32 até cerca de 36.

Pelo menos um ou mais dsARN robustos diferentes podem ser administrados a um sujeito (por exemplo, um paciente humano ou animal) com necessidade de tal tratamento. dsARN robusto pode ser administrado numa dosagem de desde cerca de 0,5 mg até cerca de 60 mg/dose. Esta dosagem pode ser administrada uma vez por semana ou mês ou duas ou mais doses por semana ou mês. Cada dose (por exemplo, desde cerca de 0,5 mg até cerca de 60 mg, desde cerca de 5 mg até cerca de 4 0 mg ou desde cerca de 10 mg até cerca de 2 0 mg) pode ser proporcionada ao sujeito sem limitação para a formulação da composição farmacêutica ou para a sua via de administração (embora seja preferida a infusão intravenosa). A utilização de uma quantidade eficaz de dsARN robusto para alcançar uma sensação de saúde melhorada e pode ser continuada até que pelo menos um sintoma seja melhorado. A quantidade eficaz requerida para obter essa melhoria pode ser idêntica ou superior à quantidade requerida para a manutenção do(s) efeito(s). O dsARN robusto pode atuar especificamente através de um recetor TLR3. A função e o fenótipo das células dendríticas podem ser normalizados num sujeito (por exemplo, paciente humano ou animal). A administração de pelo menos uma quantidade eficaz de um ou mais dsARN robustos a um sujeito (por exemplo, paciente humano ou animal) pode, assim, diminuir o número ou reduzir a gravidade dos sintomas quando o sujeito é afetado por uma doença ou outra condição patológica. A utilização de dsARN robusto pode corrigir anomalias da maturação das células dendríticas no sujeito sem o risco de induzir uma tempestade de citocinas. Células apresentadoras de antigénio (por exemplo, células dendríticas, macrófagos, células B) e tecidos da mucosa (por exemplo, epitélio gástrico ou respiratório) são alvos preferidos no corpo para dsARN robusto. Um ou mais antigénios podem ser apresentados às células do sistema imunitário, e o(s) antigénio(s) deve(m) ser suscetível/suscetíveis à ação do dsARN robusto atuando seletivamente como um agonista de TLR3. As células do sistema imunitário, micróbios, células cancerosas ou outras células transformadas podem ser suscetíveis a padrões de resposta de citocinas específicas ativadas por dsARN robusto que atua seletivamente como um agonista de TLR3. 0 dsARN robusto é administrado preferivelmente por infusão intravenosa; injeção intradérmica, subcutânea ou intramuscular; inalação intranasal ou intratraqueal ou aplicação orofaríngea ou sublingual.

Num outro aspeto um medicamento é proporcionado como uma composição farmacêutica. Um ou mais dsARN robustos diferentes podem ser utilizados pelo(s) seu (s) efeito(s) benéfico(s) na saúde de um sujeito, como agonista(s) de TLR3 seletivo(s), para tratar uma doença ou outra condição patológica ou para fabricar medicamentos ou composições farmacêuticas para tratar uma doença ou outra condição patológica. Ingredientes inertes opcionais da composição incluem excipientes e um veículo (por exemplo, tampão de solução salina ou água) como uma dose única ou um pacote de doses múltiplas (por exemplo, um frasco ou frascos para injetáveis) e instruções para a sua utilização. Também são proporcionados processos para produzir e utilizar a composição farmacêutica (medicamento). Por exemplo, um ou mais dsARN robustos diferentes podem ser formulados numa concentração desde cerca de 0,05 mg/ml até cerca de 0,25 mg/ml (por exemplo, 10 mg dissolvidos em 4 ml ou 20 mg dissolvidos em 8 ml) em solução salina fisiológica tamponada com fosfato e armazenados a desde 2 °C até 8 °C num frigorífico sob condições assépticas.

Aspetos adicionais da invenção serão evidentes a partir da descrição dos inventores de formas de realização específicas e das reivindicações anexas e das generalizações das mesmas.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 mostra um cromatograma de HPLC para o poli(I) :poli(Ci2U) . 0 pico menor centrado num tempo de retenção de cerca de 5,01 min. é poli(I) :poli (Ci2U) em duplex. O primeiro pico principal centrado num tempo de retenção de cerca de 7,58 min. é o poli (Ci2U) de cadeia simples. O segundo pico principal centrado num tempo de retenção de cerca de 10,05 min. é o poli(I) de cadeia simples. A identidade molecular de cada pico foi determinada por análise de ensaio de fotodiodo (PDA). A Figura 2 mostra as análises de PDA dos três picos de HPLC. Acetonitrilo, que é utilizado como um solvente, é responsável pela absorvância a 230 nm. A absorvância a 245 nm indica a presença de poli(I); a absorvância a 265 nm indica a presença de poli (Ci2U) . A Figura 2A é a análise de PDA do pico centrado num tempo de retenção de cerca de 5,01 min., que contém poli(I) e poli (Ci2U) . A Figura 2B é a análise de PDA do pico centrado num tempo de retenção de cerca de 7,58 min., que contém poli(Ci2U). A Figura 2C é a análise de PDA do pico centrado num tempo de retenção de cerca de 10,05 min., que contém poli(I). A Figura 3 mostra a cromatografia por exclusão de tamanho de complexos de TLR3-ECD e poli (I):poli(Ci2U) (Figura 3A) , apenas o recetor de TLR3-ECD (Figura 3B) e apenas o ligando poli(I) :poli (Ci2U) (Figura 3C) . A Figura 4 mostra o efeito do stress térmico (40 °C) no tamanho de dsARN tal como medido por centrifugação analítica. A diminuição do coeficiente de sedimentação (S2o,w) reflete uma perda de tamanho devido a hidrólise. A Figura 5 mostra o efeito do stress térmico (40 °C) no tamanho do dsARN tal como medido por cromatografia

líquida de alta eficiência (HPLC). O pico de dsARN robusto aumenta á medida que as cadeias maiores de poli(I) e poli (Ci2U) hidrolisam.

DESCRIÇÃO DE FORMAS DE REALIZAÇÃO ESPECÍFICAS São conhecidas muitas utilizações de ácido ribonucleico de cadeia dupla (dsARN). A eficácia de tais tratamentos, que inclui um decréscimo no número e/ou uma redução da gravidade dos efeitos adversos de populações não selecionadas de dsARN, é melhorada pela utilização de dsARN robusto purificado pelo menos parcialmente. 0 dsARN robusto da invenção pode ser utilizado para tratar um sujeito (por exemplo, ser humano ou animal, especialmente aves, peixes ou mamíferos) com uma infeção microbiana incipiente ou estabelecida, para tratar um sujeito com outras condições patológicas marcadas pela proliferação anormal de células (por exemplo, neoplasma ou tumor) ou para ser utilizado como um imunoest imulante para tratar o sujeito com uma doença ou outra condição patológica causada por, pelo menos, infeção, proliferação anormal de células, síndrome de fadiga crónica ou dano celular proveniente de autoimunidade ou neurodegeneração. É preferível que a quantidade de dsARN robusto utilizado seja suficiente para ligar o Recetor tipo Toll 3 (TLR3) em células imunes do sujeito. A imunidade inata ou adaptativa pode ser assim desencadeada. Preferivelmente, o dsARN robusto pode ser utilizado para ativar seletivamente TLR3 sem ativar outros recetores tipo Toll como TLR4 ou uma helicase de ARN como RIG-I ou mda-5, ou sem induzir uma resposta pro-inflamatória excessiva como visto com o poli(I):poli(C) agonista TLR3 não seletivo num fenómeno conhecido na técnica como "tempestade de citocinas". 0 sujeito pode estar infetado com, pelo menos, uma ou mais bactérias, protozoários ou vírus. É administrada ao sujeito uma composição farmacêutica que compreende dsARN robusto numa quantidade suficiente para se ligar a TLR3. Assim, a infeção do sujeito é reduzida ou eliminada, conforme testado por diminuição do tempo de recuperação, imunidade aumentada (por exemplo, aumento do título de anticorpos, proliferação de linfócitos, morte de células infetadas ou atividade de células natural killer), diminuição da divisão ou do crescimento do micróbio ou qualquer combinação dos mesmos, em comparação com o sujeito não tratado com o dsARN robusto. A imunidade induzida por tratamento é preferivelmente especifica para o micróbio, embora a indução da imunidade inata também possa ser eficaz.

Uma infeção por um micróbio pode ser tratada. 0 micróbio pode infetar um sujeito humano ou animal. A infeção pode ser incipiente ou estabelecida. 0 micróbio pode ser uma bactéria, um protozoário ou um vírus; especialmente aqueles que causam doença (isto é, os micróbios patogénicos) . Aqui, os termos "micróbio" e "microrganismo" são utilizados de forma intercambiável A bactéria pode ser uma espécie do género Bacillus (por exemplo, B. anthracis, B. cereus), Bartonella (B. henselae), Bordetella (por exemplo, B. pertussis), Borrelia (por exemplo, B. burgdorferi), Brucella (por exemplo, B. abortus), Campylobacter (por exemplo, C. jejuni), Chlamydia (por exemplo, C. pneumoniae), Clostridium (por exemplo, C. botulinum, C. difficile, C. perfringens, C. tetani), Corynbacterium (por exemplo, C. amycolatum, C. diphtheriae), Escherichia (por exemplo, E. coli 0175:H7), Haemophilus (por exemplo, H. influenzae), Heliobacter (por exemplo, H. pylori), Klebsiella (K. pneumoniae), Legionella (por exemplo, L. pneumophila), Listeria (por exemplo, L. monocytogenes), Mycobacterium (por exemplo, M. avium, M. bovis, M. branderi, M. leprae, M. tuberculosis), Mycoplasma (por exemplo, M. genitalium, M. pneumoniae), Neisseria (por exemplo, N. gonorrheae, N. meningitidis) , Pneumocystis (por exemplo, P. carinii), Pseudomonas (P. aeruginosa) , Rickettsia, (por exemplo, R. rickettsia, R. typhi), Salmonella (por exemplo, S. enterica), Shigella (por exemplo, S. dysenteriae) , Staphylococcus (por exemplo, S. aureus, S. epidermidis) , Streptococcus (por exemplo, 5. pneumoniae, S. pyogenes) , Treponema (por exemplo, T. pallidum), Vibrio (por exemplo, V. cholerae, V. vulnificus) ou Yersinia (por exemplo, Y. pestis). Estes incluem bactérias Gram-negativas ou Gram-positivas, clamidia, espiroquetas, micobactérias e micoplasmas. 0 protozoário pode ser uma espécie do género Cryptosporidium (por exemplo, C. hominis, C. parvum), Entamoeba (por exemplo, E. histolytica), Giardia (por exemplo, G. intestinalis, G. lamblia), Leishmania (por exemplo, L. amazonensis, L. braziliensi, L. donovani, L. mexicana, L. tropica), Plasmodium (por exemplo, P. falciparum, P. vivax), Toxoplasma (por exemplo, T. gondii) ou Trypanosoma (por exemplo, T. bruci, T. cruzi) . 0 vírus pode ser um vírus de ADN ou de ARN que infeta seres humanos e animais. Os vírus de ADN incluem os que pertencem às famílias Adenoviridae, Iridoviridae, Papillomaviridae, Poliomavirididae e Poxviridae (vírus de ADN de cadeia dupla de Grupo I); à família Parvoviridae (vírus de ADN de cadeia simples de Grupo II) . Os vírus de ARN incluem os que pertencem às famílias Birnaviridae e Reoviridae (vírus de ADN de cadeia dupla de Grupo III); às famílias Arteriviridae, Astroviridae, Caliciviridae,

Hepeviridae e Roniviridae (vírus de ARN de cadeia simples positiva de Grupo IV) e às famílias Arenaviridae,

Bornaviridae, Bunyaviridae, Filoviridae, Paramyxoviridae e Rhabdoviridae (vírus de ARN de cadeia simples negativa de Grupo V) . 0 dsARN robusto pode também ser utilizado para tratar infeção por vírus de ADN da família Herpesviridae e vírus de ARN das famílias Flaviviridae, Hepadnaviridae Orthomyxoviridae, Picomnaviridae, Retroviridae e

Togaviridae. 0 sujeito pode ser afetado por uma doença ou condição patológica que é caracterizada pela proliferação anormal de células (por exemplo, neoplasma ou tumor, outras células transformadas). É administrada ao sujeito uma composição farmacêutica que compreende dsARN robusto numa quantidade suficiente para se ligar a TLR3. Assim, a doença, os sintomas da mesma, o seu número ou a sua gravidade, no sujeito, podem ser reduzidos ou eliminados, conforme testado por morbilidade e mortalidade melhoradas, maior imunidade (por exemplo, aumento do titulo de anticorpos, proliferação de linfócitos, morte de células transformadas ou em proliferação, ou atividade de células NK) , diminuição da divisão ou do crescimento de células em proliferação ou transformadas ou qualquer combinação dos mesmos, em comparação com a condição de um sujeito não tratado com dsARN robusto.

As células do sujeito que estão a passar pela proliferação anormal podem ser um neoplasma ou tumor (por exemplo, carcinoma, sarcoma, leucemia, linfoma), especialmente as células transformadas por um virus tumoral (por exemplo, vírus de ADN ou de ARN portadores de um gene ou oncogene transformador) ou caso contrário infetadas por um vírus associado ao cancro. Por exemplo, o vírus Epstein-Barr está associado com cancro da nasofaringe, linfoma de Hodgkin, linfoma de Burkitt e outros linfomas de células B; os vírus da hepatite B e C humana (VHB e VHC) estão associados com cancro do fígado; o herpesvirus humano 8 (HHV8) está associado com o sarcoma de Kaposi; os papilomavírus humanos (por exemplo, HPV 6, HPV 11, HPV 16, HPV 18 ou combinação dos mesmos) estão associados com cancro do colo do útero, cancro anal e verrugas genitais; e o vírus linfotrópico de células T humano (HTLV) está associado com leucemia e linfoma de células T. Os cancros incluem aqueles com origem nos sistemas orgânicos gastrointestinal (por exemplo, esófago, cólon, intestino, íleo, reto, ânus, fígado, pâncreas, estômago), génito-urinário (por exemplo, bexiga, rim, próstata), músculo-esquelético, nervoso, pulmonar (por exemplo, pulmão) ou reprodutivo (por exemplo, colo do útero, ovário, testículo) . A maturação de células dendríticas pode ser induzida no sujeito. Células dendríticas imaturas, que são capazes de captar antigénios, podem ser induzidas a diferenciar-se em células dendríticas mais maduras, que são capazes de apresentar antigénios e preparar uma resposta imunitária adaptativa (por exemplo, células T específicas de antigénio). Durante a sua conversão de células dendríticas imaturas em maduras podem, pelo menos, mudar a expressão na superfície celular de moléculas do complexo maior de histocompatibilidade (MHC), moléculas co-estimuladoras, moléculas de adesão ou recetores das quimiocinas; diminuir a captação de antigénios; aumentar a secreção de quimiocinas, citocinas ou protéases; desenvolver processos dendríticos; reorganizar o seu citoesqueleto ou qualquer combinação dos mesmos. Podem ser induzidas a migrar para locais de inflamação ou tecido linfoide através do sangue ou linfa, para aproximar os micróbios, células neoplásicas ou tumorais ou outras células transformadas. 0 sujeito pode ser vacinado contra, pelo menos, infeção ou cancro. Em certos casos, por exemplo, cancros induzidos por vírus, tanto a infeção como o cancro podem ser tratados. Imediatamente antes, durante ou imediatamente depois da vacinação (por exemplo, dentro de 10 dias após a vacinação) é administrado ao sujeito um medicamento ou composição farmacêutica que é constituída por dsARN robusto numa quantidade suficiente para se ligar a TLR3. A resposta imunitária a uma vacina ou preparação de células dendríticas é, desta maneira, estimulada. A vacina ou preparação de células dendríticas pode ser composta de micróbios ou células inteiros mortos, fixos ou atenuados (por exemplo, em proliferação ou transformados); uma fração purificada ou lisada de micróbios ou células (por exemplo, em proliferação ou transformadas); um ou mais antigénios microbianos isolados (por exemplo, nativos, sintetizados quimicamente ou produzidos de forma recombinante) ou um ou mais antigénios tumorais isolados (por exemplo, nativos, sintetizados quimicamente ou produzidos de forma recombinante). A vacinação in situ pode ser realizada pela produção pelo sujeito de antigénio num local ou na circulação do mesmo (por exemplo, produzido numa infeção natural ou crescimento de células, ou antigénio perdido) e, após isso, e o dsARN robusto atuando ai como um adjuvante.

Uma cadeia de poli (ácido riboinosinico) pode ser hibridada parcialmente com cadeia de poli (ácido ribocitidílico4-29uridílico) , de poli (ácido ribocitidílicon-i4uridílico) ou de poli (ácido ribocitidílicoi2uridílico) de tal modo que as duas cadeias não formam um duplex na posição da base uracilo (isto é, sem emparelhamento por bases na posição desemparelhada). 0 dsARN configurado especificamente inclui: ribo(I) ·ribo (C4, U) , ribo (I) · ribo (Cu, U) , ribo (I) · ribo (C43, U) , ribo (I)· ribo (C48, U) e ribo(I) -r(C2o, U) . 0 dsARN configurado especif icamente também pode ser modificado nas extremidades da molécula para adicionar uma ou mais dobradiças para evitar o deslizamento dos pares de base, conferindo assim uma bioatividade especifica em solventes ou meios aquosos que existem nos fluidos biológicos humanos. 0 dsARN configurado especificamente descrito nos documentos de Patente U.S. 4.024.222; 4.130.641 e 5.258.369 (incorporados por referência) são geralmente adequados para utilização de acordo com a presente invenção após a seleção para dsARN robusto. Um ou mais dsARN robustos diferentes podem ser complexados com um polímero estabilizador tal como polilisina, polilisina mais carboximetilcelulose, poliarginina, poliarginina mais carboximetilcelulose ou qualquer combinação dos mesmos. O dsARN robusto, como pelo menos uma porção de um medicamento, ou formulado com outras componentes compatíveis numa composição farmacêutica, pode ser administrado a um sujeito (por exemplo, paciente humano ou animal, especialmente aves, peixes ou mamíferos) por qualquer via local ou sistémica conhecida na técnica, incluindo entérica (por exemplo, oral, alimentação por sonda, enema), tópica (por exemplo, um dispositivo tal como um nebulizador para inalação através do sistema respiratório, um penso dérmico que atua por via epicutânea ou via transdérmica, supositório que atua no reto ou na vagina) e parentérica (por exemplo, injeção subcutânea, intravenosa, intramuscular, intradérmica ou intraperitoneal; bucal, sublingual ou transmucosa; inalação ou instilação intranasal ou intratraqueal). 0 dsARN robusto pode ser micronizado por moagem ou por trituração de material sólido, dissolvido num veículo (por exemplo, água ou solução salina tamponada estéril) para injeção ou instilação (por exemplo, pulverização), aplicado topicamente ou encapsulado num lipossoma ou outro veículo para administração direcionada. É preferível dissolver o dsARN robusto em água para injeção (WFI) e injetar a composição no sujeito. Um veículo pode ser utilizado para direcionar o dsARN robusto ao recetor TLR3 em células que apresentam antigénios e epitélio. Por exemplo, células dendríticas imaturas podem ser contactadas em tecidos da pele, da mucosa ou linfoides. Será apreciado que a via preferida pode variar com a idade, condição, sexo ou estado de saúde do sujeito; a natureza da doença ou outra condição patológica, incluindo o número e gravidade dos sintomas e o ingrediente ativo escolhido.

As formulações para administração (isto é, composições farmacêuticas) podem incluir soluções aquosas, xaropes, elixires, pós, grânulos, comprimidos e cápsulas que tipicamente contêm excipientes convencionais tais como agentes aglutinantes, cargas, lubrificantes, desintegrantes, agentes humectantes, agentes de suspensão, agentes emulsionantes, conservantes, sais tampão, aromatizantes, corantes e/ou edulcorantes. Será entendido que a formulação preferida pode variar com a idade, condição, sexo ou estado de saúde do sujeito; a natureza da doença ou outra condição patológica, incluindo o número e gravidade dos sintomas e o ingrediente ativo escolhido. A dosagem recomendada de dsARN robusto dependerá do estado clinico do sujeito e da experiência do médico ou do veterinário no tratamento da doença ou outra condição patológica. Os dsARN robustos podem ser doseados em desde cerca de 0,5 mg até cerca de 60 mg, desde cerca de 5 mg até cerca de 4 0 mg ou desde cerca de 10 mg até cerca de 2 0 mg num sujeito (por exemplo, para um paciente humano com massa corporal de cerca de 70-80 Kg) num regime de uma a três vezes por semana (preferivelmente duas vezes por semana), embora o médico ou o veterinário possam variar a quantidade e/ou a frequência da dose em resposta aos sintomas do sujeito. O ácido nucleico na forma sólida pode ser dissolvido em solução salina fisiológica tamponada com fosfato e, em seguida, administrado por via intravenosa. As células ou tecidos que expressam TLR3 são locais preferidos no sujeito para a administração do ácido nucleico, especialmente células que apresentam antigénios. (por exemplo, células dendriticas, macrófagos, linfócitos B) e endotélio (por exemplo, células endoteliais dos sistemas respiratório e gástrico). Será entendido que a dose preferida pode variar com a idade, condição, sexo ou estado de saúde do sujeito; a natureza da doença ou outra condição patológica, incluindo o número e a gravidade dos sintomas e o ingrediente ativo escolhido.

As células dendriticas que atuam como células sentinela possuem estruturas da superfície molecular que reconhecem padrões moleculares associados a agentes patogénicos (PAMPs). Estes PAMPs incluem um conjunto de recetores tipo Toll (TLRs) que reconhecem especificamente todos os dsARN. Em particular, o dsARN é um agonista seletivo de TLR3. 0 dsARN robusto pode ser utilizado como um agente seletivo para a ativação de TLR3. A disfunção na molécula co-estimuladora (por exemplo, CD80, CD83, CD86) de sinalização em células dendriticas pode estar associada com a doença ou outra condição patológica a ser tratada. Esta anormalidade pode ser normalizada utilizando dsARN robusto como um agonista de TLR3 seletivo. Os efeitos de dsARN robusto podem ser inibidos ou bloqueados através de mutação do gene TLR3 (por exemplo, deleção), regulação negativa da sua expressão (por exemplo, siARN), ligação com um competidor pelo local de ligação do ligando de TLR3 (por exemplo, anticorpos neutralizantes) ou um antagonista recetor ou por interferência com um componente a jusante da via de sinalização de TLR3 (por exemplo, MyD88 ou TRIF). 0 dicroismo circular (CD) é uma técnica fisico-quimica para caracterizar a conformação de dsARN configurado especificamente. Também pode ser usada como um substituto para a ligação de poli(I) :poli (C12U) AMPLIGEN® (rintatolimod) como um agonista recetor ao seu recetor TLR3. Além disso, a estrutura helicoidal do dsARN robusto e os requisitos estruturais para a ligação de dsARN configurado especificamente a TLR3 podem ser caracterizados com precisão por CD.

Outras técnicas fisico-quimicas que podem ser utilizadas para caracterizar dsARN robusto são cromatografia de fase reversa, análise de PDA (ensaio de fotodiodo), cromatografia de pressão de gás (GPC), ligação de ligando especifico ao recetor de TLR3 e velocidade de sedimentação medida por ultracentrifugação. 0 dsARN robusto proporciona um agente seletivo para dissecar os efeitos da ativação de TLR3 no sistema imunitário, que não estava disponível anteriormente com tal potência. Outros agentes como adaptadores de TLR3 MyD88 e TRIF medeiam a sinalização por todos os TLR ou TLR3/TLR4, respetivamente. Assim, a ativação ou inibição da sinalização por meio de MyD88 ou TRIF não iria restringir os efeitos biológicos aos mediados por TLR3. Uma vez que a presença de TLR3 e a sua sinalização é um requisito para poli(I) :poli (C12U) AMPLIGEN® (rintatolimod) atuar como um agonista do recetor, pode-se testar quanto à ausência de mutações de TLR3, à presença da proteína TLR3, à sinalização mediada por TLR3 intacta ou qualquer combinação das mesmas, na célula ou tecido dum sujeito antes da administração do agonista. Esta confirmação da atividade de TLR3 pode ser realizada antes, durante, ou depois da administração do agonista. 0 agonista pode ser utilizado para restringir a resposta imunitária à ativação de TLR3 sem ativar outros recetores tipo Toll ou helicases de ARN. Por exemplo, a produção de citocina anormal (por exemplo, IFN-a, IFN-β, IFN-γ TNF-a, IL-6, IL-10, IL-12) ou a sinalização de molécula co-estimuladora (por exemplo, CD80, CD83, CD86) de sinalização podem ter resultado de, pelo menos, infeção pelo micróbio, proliferação celular anormal, dano autoimune ou neurodegeneração. Esta anormalidade pode ser remodelada utilizando dsARN robusto como um agonista seletivo de TLR3. A apresentação de antigénio pode ser melhorada pela conjugação do antigénio (ou um análogo peptídico do mesmo) a um ligando (ou um recetor) que se liga especificamente à superfície celular (especialmente um componente da via de internalização de endossoma-fagossoma) de uma ou mais células que apresentam antigénio. A molécula de ligação especifica pode ser um anticorpo para uma molécula de superfície celular ou um derivado do mesmo (por exemplo, Fab, scFv). A expressão de CD80, CD83 e CD86 pode ser analisada por citometria de fluxo utilizando anticorpos marcados com fluorescência. Na sequência do carregamento durante a noite, as amostras de sangue são coradas dentro de uma hora após a receção. São utilizadas técnicas convencionais para a lise de glóbulos vermelhos e análises de marcador de células por citometria de fluxo. As células dendríticas são identificadas com base na expressão de nível baixo de linfócitos, monócitos e marcadores de células NK, juntamente com expressão de HLA-DR elevada. As células dendríticas também podem ser caracterizadas de acordo com expressão de CDllc e CD123. Os monócitos são identificados por análise de dispersão lateral e expressão de um marcador de linhagem de monócitos. As análises de expressão de CD80, CD83 e CD86 são realizadas após a identificação do tipo de célula. Medições a partir de voluntários saudáveis servem como controlos e irão indicar a distribuição normal e níveis de expressão do marcador para células dendríticas maduras, tais como CD80, CD83 e CD86.

EXEMPLOS A síntese de poli(I) e poli (Ci2U) de cadeia simples, começou com a síntese enzimática de polinucleótido dos polinucleótidos a partir dos respetivos materiais de partida mononucleótidos: inosina para poli(I); citidina (C) e uridina (U) para poli(C12U). Depois foram utilizadas etapas repetitivas de extração e precipitação para remover impurezas residuais. As soluções da reação contendo os produtos foram concentradas por ultrafiltração e extraídas quatro vezes, com fenol. As soluções concentradas e extraídas foram precipitadas, dissolvidas e voltaram a ser precipitadas a partir de etanol aquoso (50:50). Enquanto poli(I) precipitado foi separado por centrifugação, a fase liquida do sobrenadante (resíduo) de poli(Ci2U) aderente foi simplesmente removida por aspiração. As pastas precipitadas voltaram a ser dissolvidas, depois concentradas, diafiltradas e adicionalmente concentradas. As soluções finais em bruto contendo polinucleótidos foram filtradas. A solução filtrada foi liofilizada e as matérias-primas foram armazenadas congeladas. Síntese Enzimática. A síntese enzimática utilizada no processo de fabrico é dependente da enzima polinucleótido fosforilase para sintetizar ácido poliinosinico e ácido policitidílicoi2uridílico a partir dos seus respetivos materiais de partida: citidina 5'-difosfato, sal trissódico (CDP -Na3) , uridina 5'-difosfato, sal dissódico (UDP-Na2) e inosina 5'difosfato, sal trissódico (IDPNa3) . A enzima catalisa a formação de polinucleótido numa reação reversível que utiliza Mg++ como um cofator e ATP como uma fonte de energia. Os polinucleótidos foram sintetizados na direção de 5' para 3' com a libertação concomitante de fosfato inorgânico. 0 rendimento máximo foi limitado pelo equilíbrio entre taxas de síntese e de reversão, reação de degradação (fosforólise). 0 progresso da reação foi seguido por medição do consumo de CDP ou IDP. A viscosidade da solução de reação também foi monitorizada. Água purificada foi filtrada para dentro do tanque. Os seguintes ingredientes foram adicionados ao tanque, um de cada vez, misturando: TRIS (hidroximetil) aminometano, ureia, cloreto de magnésio hexahidratado (MgCl-6H20) e ácido etilenodiaminotetra-acético (edetato), sal dissódico (EDTA·Na2) . Também foram adicionados mononucleótidos de matéria-prima.

Cada ingrediente foi dissolvido antes do próximo ser adicionado. Depois de todos os ingredientes terem sido adicionados, a solução foi misturada durante um mínimo de 10 minutos. A mistura foi depois ajustada e foi adicionada água purificada para obter um volume final do lote. Esta mistura de reação de pré-enzima foi amostrada quanto à concentração inicial de CDP ou de IDP. A enzima polinucleótido fosforilase foi adicionada misturando, após o que começou a síntese de polinucleótido. Também o perfil de viscosidade na concentração de enzima ótima deve apresentar o habitual aumento da viscosidade ao longo do tempo, sem diminuição significativa na conclusão da reação do lote; uma diminuição significativa na viscosidade indicaria a degradação indesejada do polinucleótido. Depois de ser adicionada ao lote de produção a quantidade otimizada de enzima, a síntese enzimática progrediu, sob agitação constante e controlada. 0 consumo de CDP ou IDP foi monitorizado aproximadamente a cada hora. A reação foi terminada pela adição de uma solução de terminação. Apenas para informação, a viscosidade também foi monitorizada durante o processo.

Concentração da solução de reação. Para minimizar o volume necessário de fenol para extrações, a solução do produto de reação foi concentrada.

Extração de Poli (I) e Poli (C12U) . A enzima residual foi removida predominantemente por extração com fenol. As soluções do produto de reação de poli (Ci2U) ou poli(I) concentradas foram transferidas para o tanque de extração e foram adicionados TRIS a 2 M e dodecil sulfato de sódio (SDS). Depois de misturar durante pelo menos 5 minutos, foi adicionado fenol liquefeito e a solução de duas fases foi misturada para dispersar a fase de fenol na fase aquosa. Foi empregue SDS como um agente tensioativo para facilitar a dissolução da proteína desnaturada na fase de fenol; TRIS foi necessário para tamponar a solução a um pH ótimo para a estabilidade do polinucleótido. A mistura de extração ficou sem ser misturada durante tempos de assentamento predeterminados, para se obter a coalescência das fases. A fase inferior de resíduos de fenol é então bombeada para recipientes para eliminação. A localização do corte de fenol foi importante, de modo a separar de forma eficaz o fenol e a proteína da fase de produto superior, que contém poli (C12U) ou poli(I) . A fase de fenol e uma camada intermédia de "desperdícios", que contém sólidos de proteína desnaturada, foram descartados por observação visual do líquido que flui através do indicador de nível na saída do tanque. Quando o fenol e a camada de desperdícios desapareceram e só foi observada a fase do produto, a válvula de saída foi encerrada e o corte de fenol é considerado como completo.

Precipitação de Poli (C12U) ou Poli (I) . Fenol contaminante, SDS e outros sais remanescentes na solução foram removidos por precipitação com álcool etílico desnaturado. A solução concentrada de poli(Ci2U) ou poli(I) foi bombeada para o tanque de precipitação. 0 álcool desnaturado foi adicionado e, depois de misturado o precipitado, foi separado.

Concentração e Dia filtração. Os sais em bruto remanescentes, uma pequena quantidade de mononucleótido que não reaqiu e o fenol foram removidos por diafiltração contra água. 0 precipitado foi dissolvido no recipiente de precipitação original misturando suavemente e com aquecimento. Depois de dissolvida, a solução foi depois concentrada e diafiltrada contra água para injeção (WFI). A solução foi filtrada antes da liofilização.

Liofilização. 0 material filtrado de poli(Ci2U) ou poli(I) foi carregado num liofilizador. 0 material foi congelado, e foi então aplicado um vácuo. 0 produto foi considerado seco quando o ciclo programado se completou.

Fabrico de Solução Estéril de Poli (I):Poli (C12U) , para Infusão intravenosa. Poli(I) e poli (Ci2U) foram dissolvidos em solução salina tamponada com fosfato. Quantidades equimolares foram misturadas num passo de hibridação e arrefecidas até à temperatura ambiente. As soluções foram filtradas estéreis.

Preparação de Veículo Tampão, Solução Excipiente. Foi adicionada WFI ao tanque. Os excipientes foram adicionados ao tanque e misturados. Após a mistura, o lote foi amostrado quanto ao pH e osmolaridade. 0 controlo de qualidade deve estar dentro dos limites durante o processo, antes da utilização para formular as soluções que contêm poli(I) e poli (Ci2U) .

Formulação de soluções de Poli (I) e Poli (C12U) . Uma quantidade inicial de solução tampão foi subdividida de acordo com a fórmula do lote e foi filtrada para dentro do tanque. Foram adicionados à solução tampão Poli(I) ou poli (C12U) e dissolvidos por mistura. A temperatura da solução foi aumentada e mantida com mistura. A solução é depois recirculada.

Hibridação de Cadeias Poli I : Poli C12U. Quantidades equivalentes de poli(I) e poli(Ci2U) foram transferidas para o tanque. Com mistura continua, a temperatura da solução foi aumentada. Foram removidas amostras e testadas quanto à potência e pH.

Filtração Estéril. 0 volume formulado foi esterilizado por filtração em linha num recipiente de compensação esterilizado a vapor.

Operações de Enchimento. A operação de enchimento foi realizada. Depois de cada frasco para injetáveis ser cheio, uma rolha estéril é utilizada para tapar o frasco. Os frascos tapados foram depois transportados a partir da área de processamento asséptica onde foram selados. 0 dsARN robusto foi isolado a partir do poli(I) :poli (C12U) hibridado, o qual foi preparado de acordo com o referido acima, por uma cromatografia analítica ou por uma cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), como uma molécula ativa farmaceuticamente e substancialmente purificada. A sua massa molecular é de cerca de 286 kDa e tem cerca de 413 pares de bases de comprimento, com cerca de 34 voltas completas da hélice de ARN. É apenas desde cerca de 1 mol% até cerca de 4 mol% de uma composição não fracionada de AMPLIGEN® (rintatolimod) . Após a síntese, a maioria de dsARN (cerca de 96 mol% a cerca de 99 mol%) tem uma massa molecular de cerca de 1,2 Mda e tem cerca de 2000 pares de bases de comprimento com cerca de 166 voltas completas da hélice de ARN. O dsARN robusto no pico de HPLC de 5 min. é cerca de 4,9 vezes menor do que o volume do dsARN, e ajusta-se mais intimamente ao sítio de ligação do ligando do seu recetor na superfície celular (TLR33).

Devido à sua estrutura, o dsARN robusto é invulgarmente resistente ao fracionamento da sua dupla hélice de ARN e ao desdobramento molecular. Assim, o dsARN robusto, sob as condições de ensaio descritas no presente documento, tem cerca de 100 até cerca de 1.000 vezes maior bioatividade que o mesmo peso de poli(I) :poli (Ci2U) AMPLIGEN® (rintatolimod) não selecionado. (a) A Proteção por Poli(I) :Poli (Ci2U) é através de Ativação Seletiva de TLR3 A Ativação de TLR3 está Ligada à Expressão de JFJV-α/β, IL-6 ou IL-12. A relação entre a expressão de IFN por meio da ativação de TLR3 por dsARN foi estabelecida por Alexopoulou (2001), utilizando células 293T que expressam diferentes recetores de tipo Toll (TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6 ou TLR9 humano) . Apenas aquelas células que contêm TLR3 humano mostraram expressão marcada de IFN-α/β, IL-6 ou IL-12, quando estimuladas com poli(I):poli(C).

Poli (I):Poli (C12U) Induz Modulação do Gene de Defesa do Hospedeiro pela Ativação Altamente Seletiva de TLR.3. Para compreender a relação entre a resposta imunitária inata dependente de TLR3 com a proteção virai, Gowen (2007) submeteu ratinhos deficientes em TLR3 a dsARN e mediu a expressão de IFN-α/β, IL-6 e IL-12. Os ratinhos também foram subsequentemente desafiados pela exposição ao vírus Punta Toro (PTV) . A proteção contra o desafio virai foi extremamente sensível ao tratamento com poli (I):poli(Ci2U) . A proteção virai conferida por poli(I):poli(Ci2U) foi completamente abolida para o caso de ratinhos deficientes em TLR3. Quando contrastado com a eficácia parcial, mas significativa, de poli(I) :poli (C) em ratinhos TLR3_/_, é evidente que as substituições estruturais de uridina na cadeia de citidina de poli (I):poli(Ci2U) são responsáveis pela via dependente de TLR3 altamente específica. Além disso, as medições de IFN-α/β e IL-6 ligam diretamente a proteção contra PTV ou falta da mesma à modulação destas citocinas.

Este direcionamento seletivo da via de sinalização de TLR3 representa uma vantagem significativa para aplicações terapêuticas de poli(I):poli(Ci2U) em comparação com outros mecanismos citosólicos possíveis, tais como, por exemplo, a utilização de dsARN poli(I):poli(C) não substituído para estimular a produção de citocinas por meio de helicases de ARN, tais como MDA-5 e RIG-1(Pichlmair, 2006) .

(b) A ligação de dsARN a TLR3 Requer a Conformação Helicoidal de dsARN

Local de Ligação de TLR3. Ao estudar a estrutura de cristais de TLR3 nativo, Choe (2005) , constatou que TLR3 é uma grande estrutura solenoide, em forma de ferradura, dextra, composta por 23 repetições ricas em leucina. A superfície convexa glicosilada e as superfícies côncavas carregadas negativamente são locais de ligação improváveis para dsARN. Consequentemente, propuseram que a ligação de dsARN ocorra em placas carregadas positivamente localizadas na face lateral.

Ao utilizar a análise mutacional, Bell (2005, 2006), modificou locais putativos de ligação de TLR3 nas placas carregadas positivamente e observou, por cromatografia de exclusão de tamanho, a formação de um complexo de dsARN/TLR3. Apesar da presença de numerosos resíduos carregados positivamente, apenas dois aminoácidos N541 e H539 foram necessários para a ligação. O grupo amido de H539 pode interagir com dsARN por ligação de hidrogénio. A proximidade do segundo resíduo carregado positivamente N541 também era importante, embora o papel deste aminoácido não fosse tão claro. A mutação para aspirado carregado negativamente impediu a ligação por dsARN, no entanto, a conversão para um resíduo de alanina neutro não teve efeito na ligação por dsARN. A Ligação a TLR3 Requer a Conformação Helicoidal de dsARN. Após a determinação estrutural das superfícies de ligação de dsARN em TLR3 mais prováveis, Choe (2005), propôs ainda que a simetria helicoidal da estrutura de dsARN é necessária para a criação da forma de dimero simétrico de TLR3 ativado e associado à membrana. No complexo ternário na superfície da membrana, duas moléculas simetricamente opostas de TLR3 estão ligadas a ambos os lados da hélice do dsARN comum.

Conforme discutido acima, ao utilizar análise mutacional, Bell (2005, 2006), definiu dois resíduos altamente conservados (N541 e H539) que são necessários para a ligação de dsARN a TLR3. Além disso, o requisito obrigatório para a ligação do ligando a ambos estes resíduos de TLR3 só é satisfeito pela arquitetura do sulco menor da conformação (helicoidal) de dsARN. Quando fosfato de dsARN se liga na proximidade de H539 sensível a carga, então o lado da amida (H541) fica alinhado com o local de ligação de hidrogénio de um hidroxilo de dsARN 2', apenas quando são utilizadas as dimensões helicoidais. (c) Conformação Helicoidal de dsARN e Alteração da Mesma que Acompanha Interações de Ligando são Caracterizadas com Precisão por Dicroísmo Circular O dicroísmo circular proporciona informações detalhadas sobre as estruturas helicoidais secundárias, de dsARN ou alterações das mesmas que acompanham a ligação do ligando; bem como alterações estruturais causadas por hidrólise enzimática e adição de iões de metal. Além disso, no modo de stress térmico, a informação conformacional transmitida por CD proporciona uma compreensão valiosa para explicar a estabilidade de ARN.

Caracterização de dsARN. Gray (1995) mostrou que o CD, aplicado no protocolo da curva de mistura, co-implementava medições de absorção ultravioleta para determinar a estequiometria de ARN duplex (A-G : C-T (U) ) . Nesta abordagem, a propriedade ótica é analisada como uma função das razões adicionadas de cadeias individuais. As magnitudes das diferenças de traçados de CD foram máximas para misturas a 50:50. Além disso, o comportamento isodicróico correlacionou-se com a formação de estruturas intra-cadeia ou de ordem superior.

Interações de Ligando. Ghazaryan (2006) estudou a interação de ligando de dsARN com uma família de porfirinas de piridínio com carga positiva. A partir de medições de CD descobriram que modificações mínimas da estrutura de porfirina levaram a profundas diferenças no modo da sua fixação à estrutura de hélice dupla. Enquanto TEtOHPyP4 se associou por intercalação, TMetAIPyP4 ligou-se através da formação de uma montagem externa e auto-empilhada.

Utilizando dicroísmo circular, Brown (2002) mostrou que ADAR1, um dsARN humano (quimérico) convertido a partir da forma A a Za após ligação a adenosina desaminase. A corroboração foi proporcionada por cristalização do complexo e espectroscopia Raman. Sorrentino (2003) estudou a poderosa degradação enzimática de dsARN por ribonuclease pancreática humana (HP-RNase). Dicroísmo circular do complexo ARN/enzima revelou que a ligação multi-local do dsARN a HP-RNase foi responsável pela desestabilização da hélice de ARN.

Estabilidade de dsARN. Ao estudar o componente de rARN do complexo ribossomal 70S, Sumita (2005), mostrou que as substituições de pseudouridina estabilizaram a hélice de dsARN com base na informação estrutural proporcionada por dicroísmo circular (CD) . Especificamente, as substituições de pseudouridina criaram regiões duplex com pares de bases de encerramento e ligações de hidrogénio mediadas por água. Neste estudo a estabilização por Mg++ também foi caracterizada por CD. Ao investigar a estabilidade dos híbridos de ARN-ADN com variantes na composição de base, Lesnik (1995), mostrou que os híbridos mais estáveis retêm elipticidade a 210 nm, um comprimento de onda caracteristico do único componente de banda de ARN (híbrido de forma A) . Em contraste, os híbridos menos estáveis mostraram elipticidade inferior a 210 nm, valores esses que foram intermédios entre os dos componentes de ARN e ADN.

Tal como é mostrado na Figura 1, uma composição de ARN de cadeia dupla pode ser analisada por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) . A análise de um lote representativo de poli (I):poli(C12U) AMPLIGEN® (rintatolimod) resultou em dois picos distintos: um com tempos de retenção desde 9,85 até 10,35 min., correspondendo à cadeia de poli(I) e desde 7,30 até 7,80 min., correspondendo à cadeia de poli (Ci2U) . O dsARN robusto é encontrado num tempo de retenção de cerca de 5 min. que representa uma espécie molecular singularmente resistente à desnaturação e desdobramento. As condições de desnaturação eliminariam a atividade biológica exclusivamente devido à ligação ao recetor TLR3. Este método analítico também pode ser utilizado como um ensaio indicador de estabilidade e, em particular, pode ser utilizado para mostrar que o dsARN robusto é singularmente resistente ao fracionamento da sua dupla hélice e ao desdobramento molecular. A identidade de cada pico é determinada por análise com um detetor de matriz de fotodíodos (PDA), como mostrado na Figura 2. Em cada tempo de retenção selecionado foi obtido um varrimento de absorção de UV de comprimentos de onda desde 200 nm até 360 nm. As cadeias poli(I) :poli(Ci2U) duplex e poli(I) e poli (Ci2U) individuais têm os seus próprios comprimentos de onda de picos de absorção específicos. Os picos de absorção centrados a 248 nm e 265 nm indicam a presença de dsARN robusto (cerca de 286.000 daltons) tendo poli(I) e poli (Ci2U) , respetivamente (Figura 2A). O pico de absorção centrado a cerca de 265 nm indica a presença da cadeia de poli (Ci2U) (Figura 2B) . O pico de absorção centrado a cerca de 248 nm indica a presença da cadeia de poli(I) (Figura 2C). A absorção centrada a cerca de 230 nm é devida a utilização de acetonitrilo como solvente. Devido à escassez relativa de dsARN robusto, o sinal a 230 nm foi subtraído da Figura 2A.

Nome comum: espécie predominante poli(I) : poli (Ci2U)

Nome químico: poli(ácido inosínico) :poli ( (ácido citidílico) i2 (ácido uridílico)) Número de registo CAS: 3864-92-5 Outros nomes: YY057

É mostrada acima uma vista parcial de cadeias de poli(I):poli(C12U) parcialmente hibridadas e a interação de bases de poli(I) individual e as cadeias de poli (C12U) . Bases de inosina simples ligam-se a bases de citosina, mas não à base de uridina. Nesta estrutura, o poli (ácido inosínico) é ligado por hidrogénio (linhas tracejadas entre as bases) a poli (ácido citidílico), com a substituição do ácido uridílico ocorrendo numa média de cada 12-13 bases. Fórmula molecular: (13Ci0HnN4O7P) n: ( (12C9H12N307P) (CgHuNzOgP) ) n Tamanho molecular: cerca de 1.200.000 daltons O número de unidades de repetição (n) que corresponde ao tamanho de poli(I) :poli (C12U) de aproximadamente 1,2 Mda é de 2000 pares de bases ou 166 voltas helicoidais completas.

Nome comum: espécie menor variante poli(I) : poli(C12U) (286.000 daltons)

Nome químico: poli(ácido inosínico) :poli ( (ácido citidílico) 12 (ácido uridílico))

É mostrada acima uma vista parcial de cadeias de poli(I):poli(Ci2U) parcialmente hibridadas e a interação de bases de poli(I) individual e as cadeias de poli (Ci2U) . Bases de inosina simples ligam-se a bases de citosina, mas não à base de uridina. Nesta estrutura, o poli (ácido inosínico) é ligado por hidrogénio (linhas tracejadas entre as bases) a poli (ácido citidílico), com a substituição do ácido uridílico ocorrendo numa média de cada 12-13 bases. Este é dsARN "robusto". Fórmula molecular: (13Ci0HnN4O7P) n: ( (12C9H12N307P) (C9HnN208P))n

Tamanho molecular: cerca de 286.000 daltons O número de unidades de repetição (n) que corresponde ao intervalo de tamanho da nova variante, também denominado dsARN robusto (também denominado pico 5 min. em HPLC) tem 286 kDa tendo 413 pares de bases representando 34 voltas completas da hélice de ARN e é resistente à desmontagem de cadeias ligadas a hidrogénio sob condições térmicas elevadas ou iónicas anormais. O dicroísmo circular (CD) tem sido utilizado para medir a estrutura secundária (hélices em duplex) de polímeros biológicos e sintéticos, incluindo proteínas e ácidos nucleicos. O CD é a medição de absorção de luz polarizada circularmente à direita ou à esquerda, num comprimento de onda específico, por moléculas quirais. A quiralidade química é a propriedade de uma molécula não ser sobreponível na sua imagem de espelho. Um átomo que torna a sua molécula quiral é chamado um átomo quiral ou, mais vulgarmente, um centro quiral. Poli (I):poli (C42U) tem um número de centros quirais devido às suas estruturas primária e secundária. Os centros quirais são encontrados nas bases de nucleótidos, que formam as duas estruturas primárias para as duas cadeias de ARN individual (ssARN) de poli(I) :poli(C22U) . Centros quirais adicionais provêm da hibridação de cada ssARN com o outro através de ligações de hidrogénio das suas bases complementares. A ligação hidrofóbica entre bases adjacentes de dsARN é conhecida como empilhamento de bases e produz uma estrutura secundária helicoidal, simétrica linear, flexível de forma e tamanho definidos. Os espectros de CD para poli (I):poli (C42U) AMPLIGEN® (rintatolimod) , que são dependentes do comprimento de onda, são observados como sendo uma função que reflete a absorção Gaussiana para cada centro quiral. Portanto, o espectro de CD para um dsARN tal como poli (I) :poli(Ci2U) está dependente do emparelhamento de bases complementares de estruturas de cadeia dupla e da quiralidade complexa da estrutura helicoidal resultante.

Foi demonstrado por espetroscopia de UV e de CD que a atividade biológica do dsARN é dependente destas configurações espaciais e estéricas específicas. Uma vez que a perturbação da estrutura helicoidal resulta na perda dos centros quirais característicos da estrutura secundária, a análise e monitorização da estrutura secundária por CD proporciona um método para caracterizar as propriedades físico-químicas de poli (I):poli(Ci2U) que estão associadas com a sua bioatividade. A elipticidade específica, medida num varrimento de comprimento de onda proporciona um parâmetro quantitativo, que é calculado como a razão de elipticidade a certos comprimentos de onda "críticos". 0 valor deste parâmetro estrutural, a razão de CD278 /CD245 , é única para poli(I) :poli (Ci2U) . Numa segunda análise de CD, a elipticidade é medida durante o aquecimento. Como poli (I) :poli(C22U) é aquecido e desnaturado termicamente, o poli(I) individual e as cadeias de poli(C22U) desenrolam-se devido à quebra de ligações de hidrogénio entre pares de bases complementares. Quando a derivada da temperatura da elipticidade é traçada, o valor mínimo da derivada corresponde à temperatura de fusão, definido como o ponto em que 50% da conformação da cadeia dupla está desenrolada. A largura a meia altura do pico, uma medida da uniformidade estrutural, torna-se também uma indicação da sua integridade. Tomados em conjunto, estes índices térmicos proporcionam uma medida da força das hélices de dsARN. O varrimento do comprimento de onda deteta dois picos: um primeiro pico a 245 nm que corresponde à hélice de cadeia dupla do poli(I) :poli (C22U) e um segundo pico a 278 nm que corresponde ao empilhamento de pares de bases do ácido nucleico.

Precisão, poli (I) :poli(Ci2U) AMPLIGEN® (rintatolimod) , lote 9807CD, a uma concentração de 2,5 mg/ml foi testado repetidamente para investigar a precisão do ensaio de CD. A percentagem de desvio-padrão relativo (%DPR) para a temperatura de fusão (TM) , para a largura a meia altura para a primeira derivada da curva de fusão e para a razão das medições dos picos do CD a 278 nm e 245 nm foram calculados como 0,76%, 9,09% e 1,41%, respetivamente. Isto demonstrou que o ensaio de CD de poli (I) :poli (Ci2U) AMPLIGEN® (rintatolimod) atua de forma precisa durante a análise térmica para a determinação da TM e da largura a meia altura da primeira derivada da curva de fusão térmica e durante a análise de varrimento do CD para determinar a razão do CD a 278 nm até o CD a 245 nm.

Especificidade. Este método de CD para caracterizar poli (I):poli (Ci2U) também é especifico porque pode diferenciar entre ácidos nucleicos em duplex e ácidos nucleicos de cadeia simples ou outros ácidos nucleicos de cadeia dupla semelhantes que não cumprem as especificações de fabrico e lançamento para poli (I):poli (C12U) AMPLIGEN® (rintatolimod). A especificidade deste método, no que diz respeito à análise de ácidos nucleicos de cadeia simples versus cadeia dupla, foi demonstrada comparando os perfis de varrimento e as curvas de temperatura de fusão. Os varrimentos de moléculas de cadeia dupla, tais como poli (I):poli (C12U) ; poli (I):poli (C) e poli (A) :poli (U) diferem significativamente das obtidas durante a análise de moléculas de cadeia simples, tais como poli(I) e poli (Ci2U) . Além disso, cada um dos varrimentos de CD foi único para a espécie molecular a ser testada. A especificidade do ensaio também foi investigada para avaliar, de forma inequívoca, a capacidade de detetar compostos de estrutura intimamente relacionada. (a) Ácidos ribonucleicos de cadeia dupla de composição de bases nucleotídicas diferentes, tais como poli (I) :poli (Ci2U) , poli (I) :poli (C) e poli (A) :poli (U) . (b) poli (I):poli (Ci2U) AMPLIGEN® (rintatolimod) que cumpre com a especificação do tamanho do polímero. (c) Ácido ribonucleico de cadeia dupla formulado a partir de cadeias poli(I) e poli (CxUy) com uma razão de base de citidina para uridina de 11-14 para 1 (razão C:U = 11:1 a 14:1) . A especificidade dos ensaios para dsARN que diferiram na sua composição de base nucleotidicas foi evidenciada pela comparação de varrimentos de CD e curvas de fusão de moléculas de cadeia dupla semelhantes, mas diferentes, tais como poli (I):poli (Ci2U) , poli (I):poli (C) e poli (A) :poli (U) . Os perfis de varrimento de CD parecem ser semelhantes, como observado nos varrimentos de poli(I) :poli (C12U) AMPLIGEN® e poli(I) :poli (C) . Mas cálculos das razões obtidas a 278 nm e 245 nm e subsequente análise estatística por teste-t para médias iguais, mostraram que o varrimento de CD de AMPLIGEN® (rintatolimod) difere significativamente de dsARN semelhante com diferentes composições de bases nucleotidicas. A especificidade para o dsARN de diferente composição de bases de ácido nucleico, também foi demonstrada pelas suas curvas de fusão térmica. As curvas de fusão térmica para dsARN diferiram significativamente umas das outras. A análise estatística (teste-t para médias iguais) dos dados a partir de traçados da primeira derivada das curvas de fusão confirmou que os resultados obtidos para as suas respetivas TM e largura a meia altura, são significativamente diferentes. Assim, a especificidade do método de CD diferencia o AMPLIGEN® (rintatolimod) de outras moléculas de dsARN por parâmetros tanto do varrimento como dos perfis de fusão térmica. 0 método de CD é específico para a deteção de poli(I):poli(Ci2U) formulados a partir de polímeros que não satisfazem as especificações supracitadas para o tamanho. Quando um ou ambos os polímeros da molécula de poli (I) :poli(Ci2U) estão fora da especificação de tamanho 4-8S, os resultados da análise de CD destas moléculas não satisfazem as especificações para AMPLIGEN® (rintatolimod) em relação a TM e largura a meia-altura da primeira derivada da curva de fusão térmica. 0 fracasso em satisfazer as especificações para estes parâmetros de CD é observado com estas formulações, mesmo quando a especificação do diferencial de tamanho ± 1,5S está satisfeita. Em relação aos dados obtidos a partir das análises de fusão térmica das formulações de AMPLIGEN® (rintatolimod), as determinações da razão CD278 /CD245 foram menos específicas. Os varrimentos de CD sozinhos não diferenciaram entre formulações de poli(I) :poli (C22U) e não-poli(I) :poli (C22U) que não cumpriam especificações de fabrico e/ou de lançamento para o tamanho do polímero.

Como discutido acima, a especificidade da análise de CD é sensível ao tamanho das cadeias do polímero de cadeia simples. Além disso, quando a diferença de tamanho entre os componentes do polímero de cadeia simples complementares, poli(I) e poli (Ci2U) é 2,4S ou maior, as análises de fusão térmica de CD irão diferenciar poli(I):poli(Ci2U) de moléculas semelhantes que não satisfaçam a especificação para o diferencial de tamanho do polímero complementar.

A análise de CD pode distinguir entre poli(I) :poli (C22U) e moléculas semelhantes que não satisfaçam as especificações para a quantidade de encadeamento duplo ou emparelhamento de bases entre o poli(I) e cadeias de poli (C22U) complementares. A quantidade de emparelhamento de bases é dependente da proporção relativa de ácido citidílico para ácido uridílico (razão C:U) do polímero poli (CxUy) . A razão de citidina para uridina no polímero poli (CxUy) afeta a temperatura de fusão (TM) , bem como a largura a meia-altura da primeira derivada da curva de fusão. Quando a razão de citidina para uridina é inferior a 11:1, há menos encadeamento duplo ou emparelhamento de bases (entre as cadeias complementares de ácido poliinosinico e ácido policitidílico da hélice de ARN em duplex) do que para AMPLIGEN® (rintatolimod). Isto resulta em Tm' s inferiores observadas e maiores larguras a meia altura para a primeira derivada das curvas de fusão térmica em relação às observadas para poli(I) :poli(C12U) . 0 aumento da razão de citidina para uridina da cadeia de poli (CxUy) aumenta o emparelhamento de bases entre as cadeias complementares da hélice e, assim, aumenta a TM observada e diminui a largura observada a meia altura da primeira derivada da curva térmica. Foi demonstrado que as determinações da razão CD278 /CD245 são menos sensíveis às diferenças na razão C:U nas formulações de AMPLIGEN® (rintatolimod).

Tanto o tamanho das cadeias de polímero complementares e a razão C:U da cadeia de poli (Ci2U) contribuem para o encadeamento duplo da molécula de poli(I) :poli(Ci2U) . 0 encadeamento duplo, por sua vez, contribui para a eficácia do produto farmacêutico como discutido na introdução. Portanto, o método de CD é uma importante ferramenta analítica para a caracterização de poli(I) :poli(Ci2U) . Embora os varrimentos de CD e as determinações da razão CD278 /CD245 sejam menos específicas do que as determinações de análise de fusão térmica de TM e a largura a meia altura da primeira derivada da curva de fusão, todos os três parâmetros de CD podem ser utilizados em combinação para a caracterização e identificação completa de poli (I) :poli (Ci2U) :

Bioatividade e Estabilidade de dsARN robusto A bioatividade de dsARN e poli(I) :poli (Ci2U) foi medida e, em seguida comparada utilizando um ensaio de ligação ao ligando. A estabilidade foi medida utilizando o teste de libertação do produto, ensaio de HPLC de fase reversa.

Um resumo dos resultados é apresentado abaixo, seguido por uma discussão mais detalhada. A combinação de uma bioatividade melhorada e uma estabilidade muito maior sob o stress térmico de 40 °C ilustram a "robustez" desta variante inovadora de dsARN (ou seja, dsARN robusto) e sugerem que será mais biodisponivel que a maioria das moléculas de dsARN numa formulação de Ampligen® (rintatolimod). 1. A bioatividade de dsARN robusto mostra uma afinidade de ligação duas vezes maior em comparação com dsARN não selecionado

Os locais de ligação de dsARN robusto tornam-se insaturados a uma razão de 0,50:1 (TLR3 : dsARN robusto) ou superior. Mas locais de ligação para poli(I):poli(Ci2U) Ampligen® (rintatolimod) tornam-se insaturados a uma razão de 0,20:1 (TLR3 : dsARN não selecionado) ou superior. 2. A estabilidade de dsARN robusto é quatro vezes maior que a de dsARN não selecionado

Poli (I):poli(Ci2U) Ampligen® (rintatolimod) é estável (isto é, Sw,2o > 10,0) durante menos de 90 dias quando submetido a hidrólise sob stress térmico de 40 °C. Por contraste, dsARN robusto é estável durante mais de 360 dias sob as mesmas condições. 3. Os dados de estabilidade e de bioatividade mostram que o dsARN robusto é mais biodisponivel que dsARN não selecionado A partir destas considerações de estabilidade e bioatividade, o dsARN robusto é mais biodisponivel para o recetor de sinalização relevante que transmite o beneficio terapêutico. O dsARN robusto tem o beneficio adicional de manter uma estabilidade a longo prazo a temperaturas ambiente, o que tem importantes implicações clinicas para o tratamento de populações em regiões do mundo sem capacidades de refrigeração adequadas.

Antecedentes da Bioatividade

Os recetores tipo Toll (TLR) são moléculas de sinalização que reconhecem padrões moleculares associados a agentes patogénicos (PAMP) e ativam mecanismos de defesa imunitária inatos: o TLR3 reconhece dsARN, a estrutura genómica de alguns vírus e também um intermediário gerado durante a replicação do ARN virai. 0 dsARN também é produzido intracelularmente pela formação de hairpins e ou com ARNm alinhados com siARN. 0 AMPLIGEN® (rintatolimod) é composto de moléculas de dsARN que atuam através da ligação de TLR3 e eventos de sinalização a jusante. Enquanto a sinalização de poli(I):poli(C) tem vias alternativas, a via de poli(I) :poli (Ci2U) atua exclusivamente através da ligação de TLR3 já que o tratamento com AMPLIGEN® (rintatolimod) protege ratinhos TLR3+/+ mas não TLR3_/_ contra a infeção com o vírus Punta Toro. As células TLR3_/_ não produzem IFN no tratamento com poli(I) :poli (C12U) , enquanto o IFN é induzido por poli(I):poli(C) em células knockout para TLR3. A conformação do ectodomínio (ECD) da molécula de TLR3 e a sua relação com a ligação de dsARN está bem caracterizada, incluindo o local de ligação prospetivo. Os aminoácidos H539 e N541 estão envolvidos na interação com a hélice dupla. A análise mutacional destes aminoácidos no local de ligação fortalece o argumento. É conhecido o efeito do comprimento e estrutura de dsARN na ligação de TLR3 e indução de IFN. Inosina3o (130) :poli (C) ou poli (I) : Citosina30 (C30) induziram o interferão (IFN), mas extensões mais curtas de dsARN não induzem IFN. Em comparação com eles, no entanto, a indução de IFN por poli (I) :poli (C) , foi sempre superior. I2o:C2o, l3o:C3o e l4o:C4o foram indutores de IFN ineficazes. Assim, a caracterização de AMPLIGEN® (rintatolimod) pela sua capacidade de ligação a TLR3, é um biomarcador para prever a sua atividade biológica. Método de Bioatividade

Um intervalo de razões de TLR3-ECD para Ampligen® (rintatolimod) não selecionado ou dsARN robusto reagem pelo método de Leonard (2008) . Os componentes são separados pelo método de cromatografia por exclusão de tamanho descrito abaixo. A partir das quantidades de pico de TLR3-ECD livre e o complexo de recetor-ligando, é determinada a razão de TLR3-ECD que é necessária para a saturação de ambos, Ampligen® (rintatolimod) ou dsARN robusto. Esta razão de TLR3-ECD/dsARN limiar proporciona uma indicação direta da força da ligação recetor-ligando e, portanto, da bioatividade. O método seguinte é uma adaptação dos procedimentos experimentais utilizados para caracterizar a ligação do ligando a TLR3 a um nível molecular. Visto que TLR3-ECD (1,12 x 102 kDa) e poli(I) :poli (C12U) (0,2-2 x 103 kDa) têm diferentes padrões de eluição, eles podem ser separados um do outro através de cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) . De acordo com os resultados obtidos a partir de poli(I):poli(C) utilizando uma coluna SUPERDEX 200 PC 3.2/30 e recolhendo frações de 80 μΐ, a maior parte do poli (I):poli(C) aparece nas frações 3-5, enquanto TLR3-ECD é eluído nas frações 9-12 (Bell, 2005) . A ligação de TLR3-ECD a poli(I):poli(C) ou poli(I) :poli (Ci2U) cria um complexo que é maior em tamanho do que cada um dos componentes iniciais. Mais tarde o TLR3-ECD livre eluído é separado do complexo. A otimização da separação identificou que a coluna SUPEROSE 200 PC proporcionou uma ligação superior com a redução de resíduos, devido à ausência de interações não especificas com dsARN. A Figura 3 mostra os cromatogramas resultantes, obtidos a partir da mistura reativa de TLR3- ECD/poli(I) :poli (Ci2U) , comparados com injeções de componentes de apenas TLR3-ECD e poli(I) :poli (Ci2U) , respetivamente.

Caracterização de Picos. A identificação e quantificação de TLR3-ECD em frações de cromatografia por exclusão de tamanho são possíveis num formato de ELISA. 0 TLR3-ECD comercialmente disponível é uma proteína recombinante contendo uma etiqueta His. Um anticorpo de captura anti-etiqueta His imobiliza TLR3-ECD num poço de microplaca. Um segundo, anticorpo primário biotinilado, liga-se quantitativamente ao TLR3-ECD imobilizado. Este anticorpo secundário é escolhido para ter um epítopo distai do local de ligação a dsARN na molécula de TLR3-ECD e também do epítopo reconhecido pelo anticorpo de captura. Estreptavidina conjugada com HRP reconhece o segundo anticorpo primário biotinilado. 0 substrato apropriado metabolizado pela HRP produz uma cor solúvel apropriada para a medição quantitativa de TLR3-ECD. A concentração de AMPLIGEN® (rintatolimod) nas frações de cromatografia por exclusão de tamanho é medida por fluorescência utilizando diluições padrão e frações de cromatografia num teste quantitativo RiboGreen. Este ensaio permite testar AMPLIGEN® (rintatolimod) tal como diretamente do recipiente (ou seja, não selecionado para dsARN robusto) sem processamento, preparação ou extração adicional, mantendo assim a sua condição como um produto farmacêutico.

Resultados de Bioatividade. Os resultados no Quadro 3 mostram a percentagem de TLR3-ECD livre que permanece numa série de reações que utilizam diferentes razões de TLR3-ECD para dsARN: Estes estudos foram realizados quer com AMPLIGEN® (rintatolimod) não selecionado como com dsARN robusto. A ligação de TLR3-ECD a dsARN robusto é mais eficaz que a ligação de TLR3-ECD a AMPLIGEN® (rintatolimod) não selecionado. Uma razão aproximadamente duas vezes maior de TLR3-ECD é necessária para "não saturar" dsARN robusto (0,50:1) comparado com AMPLIGEN® (rintatolimod) (0,25:1). Também o perfil de ligação, a variadas razões, mostra um ponto final para a saturação muito mais acentuado no caso de dsARN robusto que pode refletir uma uniformidade estrutural maior para este dsARN mais compacto.

A ligação de TLR3 a dsARN robusto é duas vezes melhor que a ligação a recetor de AMPLIGEN® (rintatolimod) não selecionado. TLR3 livre (área >10%) aparece numa razão TLR3:dsARN de 0,25:1 para AMPLIGEN® (rintatolimod) não selecionado comparado com 0,50:1 para dsARN robusto

Estabilidade de dsARN Robusto. A estabilidade de poli(I):poli(C12U) foi medida numa condição de temperatura acelerada de 40 °C, em comparação com a temperatura de armazenamento a longo prazo de desde 2 °C até 8 °C. Como mostrado na Figura 5, o tamanho de poli(I) :poli (Ci2U) decai a esta temperatura como medido por ultracentrifugação analítica (S2o,w) · A diminuição no tamanho é devida ao desdobramento da hélice dupla (perda de ligações de hidrogénio) e da hidrólise coincidente das ligações fosfodiéster. A bioatividade de dsARN requer um coeficiente de sedimentação desde cerca de 10,0 até cerca de 15,0 S (20,w) enquanto o tamanho de poli(I) :poli (Ci2U) a mais do que 180 dias indica uma perda de bioatividade de cerca de 8, 0 S (20,w) · A Figura 6 mostra os resultados de um segundo parâmetro indicador de estabilidade, o ensaio por HPLC de fase reversa, descrito anteriormente, que separa poli(I): poli (Ci2U) nas suas cadeias individuais. É claramente evidente que a hidrólise começa com a cadeia de poli(I) seguida pela cadeia de poli (Ci2U) . Os resultados de HPLC mostram que a perda de tamanho não começa até ao inicio da hidrólise da segunda cadeia de poli(C12U); a molécula de ARN retém a estrutura de cadeia dupla quando apenas uma das cadeias sofre hidrólise. Esta perda de tamanho a cerca de 90 dias ocorre com a hidrólise das cadeias de ambos poli(I) e poli (C12U) .

Significativamente, o pico (5 min.) de dsARN robusto é inteiramente não afetado pelo stress térmico. Na verdade, aumenta em relação às cadeias de poli(I) e poli(Ci2U). Isto mostra de forma conclusiva que o dsARN robusto não é apenas "robusto" mas pode formar-se espontaneamente a partir de cadeias menores de poli (I) :poli (Ci2U) degradado.

Ao declarar um intervalo numérico, deve ser entendido que todos os valores dentro do intervalo também são descritos (por exemplo, um para dez também inclui todos os valores de números inteiros entre um e dez, bem como todos os intervalos intermédios, tais como dois para dez, um para cinco e três para oito). O termo "cerca de" pode referir-se à incerteza estatística associada com uma medição ou à variabilidade numa quantidade numérica que um perito na especialidade entenderia não afetar o funcionamento da invenção ou a sua patenteabilidade.

Todas as modificações e substituições que estejam dentro do significado das reivindicações e no intervalo dos seus equivalentes legais devem ser abrangidas no seu âmbito. Uma reivindicação que relate "que compreende" permite a inclusão de outros elementos como estando dentro do âmbito da reivindicação; a invenção também é descrita por tais reivindicações que relatam as frases de transição "que consiste essencialmente em" (isto é, que permite a inclusão de outros elementos como estando dentro do âmbito da reivindicação, se não afetarem materialmente o funcionamento da invenção) ou "que consiste em" (isto é, que permite apenas os elementos enumerados na reivindicação para além de impurezas ou atividades inconsequentes que normalmente estão associadas com a invenção) em vez do termo "que compreende". Qualquer uma destas três transições pode ser utilizada para reivindicar a invenção.

Deve ser entendido que um elemento descrito na presente memória descritiva não deve ser interpretado como uma limitação da invenção reivindicada a menos que seja expressamente relatado nas reivindicações. Assim, as reivindicações concedidas são a base para determinar o âmbito da proteção legal, em vez de uma limitação da memória descritiva que é lida nas reivindicações. Em contraposição, a técnica anterior é explicitamente excluída da invenção até à extensão de formas de realização específicas que antecipariam a invenção reivindicada ou destruiriam a inovação.

Além disso, não se pretende nenhuma relação particular entre ou dentro de limitações de uma reivindicação a menos que tal relação seja explicitamente relatada na reivindicação (por exemplo, não é uma limitação da reivindicação a disposição dos componentes numa reivindicação de produto ou a ordem das etapas numa reivindicação de método, a menos que explicitamente declarado ser assim). Todas as possíveis combinações e permutações dos elementos individuais divulgados no presente documento são consideradas como sendo aspetos da invenção. Do mesmo modo, generalizações da descrição da invenção são consideradas como sendo parte da invenção.

As formas de realização descritas devem ser consideradas apenas como ilustrativas, não restritivas, porque o âmbito da proteção legal proporcionada para a invenção será indicado pelas reivindicações anexas e não por esta memória descritiva.

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DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • US 5258369 A [0005] [0030] • WO 2008109083 A [0006] • US 4024222 A [0030] • US 4130641 A [0030]

Documentos de não patente citados na descrição • ALEXOPOULOU L ; HOLT AC ; MEDIZHITOV R ; FLAVELL R.

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Lisboa, 18 de Novembro de 2015

Claims (11)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Um ácido ribonucleico de cadeia dupla (dsARN) isolado que compreende uma cadeia simples constituída por poli (ácido ribocitidílico4-29uridílico) e uma cadeia oposta constituída por poli(ácido riboinosínico) de tal modo que as duas cadeias não formam um duplex na posição da base uracilo, por meio do qual as referidas cadeias são parcialmente hibridadas, caracterizado por: o dsARN ter uma massa molecular de cerca de 250 kDa até cerca de 320 kDa e ser resistente a desnaturação sob condições que são capazes de separar cadeias hibridadas de poli(ácido riboinosínico) e poli(ácido ribocitidílico).
2. 2. Um ácido ribonucleico de cadeia dupla (dsARN) isolado que compreende uma cadeia simples constituída por poli (ácido ribocitidílico4-29uridílico) e uma cadeia oposta constituída por poli(ácido riboinosínico) de tal modo que as duas cadeias não formam um duplex na posição da base uracilo, por meio do qual as referidas cadeias são parcialmente hibridadas, caracterizado por: o dsARN ter pelo menos uma cadeia com um comprimento desde cerca de 380 bases até cerca de 450 bases e ser resistente a desnaturação sob condições que são capazes de separar cadeias hibridadas de poli(ácido riboinosínico) e de poli(ácido ribocitidílico).
3. 3. Um ácido ribonucleico de cadeia dupla (dsARN) isolado que compreende uma cadeia simples constituída por poli (ácido ribocitidílico4-29uridílico) e uma cadeia oposta constituída por poli(ácido riboinosínico) de tal modo que as duas cadeias não formam um duplex na posição da base uracilo, por meio do qual as referidas cadeias são parcialmente hibridadas, caracterizado por: o dsARN ter desde cerca de 30 até cerca de 38 voltas helicoidais de cadeias de ARN duplex e ser resistente a desnaturação sob condições que são capazes de separar cadeias hibridadas de poli(ácido riboinosínico) e de poli(ácido ribocitidílico).
4. 4. O dsARN de qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que apenas a referida cadeia simples do referido dsARN compreende uma ou mais bases uracilo ou guanina que não são emparelhadas por base com a cadeia oposta.
5. 5. O dsARN de qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que ambas as cadeias do referido dsARN compreendem uma ou mais bases uracilo ou guanina que não são emparelhadas por base com a cadeia oposta.
6. 6. O dsARN de qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que o referido dsARN compreende ribo(In) . ribo (Cn-i4U) n.
7. 7. O dsARN da reivindicação 6, em que o referido dsARN compreende ribo(In) · ribo(Ci2U)n·
8. 8. Uma composição que compreende um ou mais dsARN diferentes tal como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.
9. 9. A utilização de dsARN tal como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7 para fabricar um medicamento ou uma composição farmacêutica.
10. 10. O dsARN definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7 para utilização numa quantidade de produto farmacêutico para tratar um sujeito, a referida quantidade de produto farmacêutico ser preferivelmente para infusão intravenosa; injeção intradérmica, subcutânea ou intramuscular; inalação intranasal ou intratraqueal ou aplicação intranasal, intratraqueal, orofaringea ou sublingual.
11. 11. A composição da reivindicação 8 para utilização numa quantidade de produto farmacêutico para tratar um sujeito, a referida quantidade de produto farmacêutico ser preferivelmente para infusão intravenosa; injeção intradérmica, subcutânea ou intramuscular; inalação intranasal ou intratraqueal ou aplicação intranasal, intratraqueal, orofaringea ou sublingual. Lisboa, 18 de Novembro de 2015