ES2822584T3 - Inducción de dinucleótidos cíclicos del interferón tipo I - Google Patents

Abstract

Un dinucleótido cíclico que comprende dos enlaces fosfodiéster 2'-5 'para su uso en el tratamiento de una enfermedad celular proliferativa que aumenta la producción de un interferón de tipo I (IFN) al aumentar el nivel de un enlace fosfodiéster 2'-5' que comprende al dinucleótido cíclico en la célula.

Description

DESCRIPCIÓN

Inducción de dinucleótidos cíclicos del interferón tipo I

Campo de la invención

Los interferones (también denominados "IFN'') son proteínas que tienen una serie de actividades biológicas, algunas de las cuales son antivirales, inmunomoduladoras y antiproliferativas. Son polipéptidos de cadena única, específicos de especie y relativamente pequeños, producidos por células de mamíferos como respuesta a la exposición a una serie de inductores tales como virus, polipéptidos, mitógenos, etc. Los interferones protegen a los tejidos y a las células animales frente a los ataques virales y son un importante mecanismo de defensa de los huéspedes. En la mayoría de los casos, los interferones brindan una mejor protección a los tejidos y a las células del tipo de los cuales provienen que a otros tipos de tejidos y células, lo que indica que los interferones de origen humano podrían ser más eficaces frente al tratamiento de enfermedades humanas que los interferones de otras especies. Los interferones pueden clasificarse como interferones de Tipo I, Tipo II y Tipo III. Los interferones de tipo I de mamíferos incluyen IFN-a (alfa), IFN-p (beta), IFN- ^k (kappa), iFn -5 (delta), IFN-s (épsilon), IFN- ^t (tau), IfN- ^w (omega) e IFN-Z (zeta, también conocido como limitin).

Los agentes que inducen la producción de interferones encuentran su uso como adyuvantes de vacunas y en formulaciones que inician respuestas de células T efectoras y de memoria. Los adyuvantes eficaces mejoran las respuestas inmunitarias específicas frente a los antígenos al tiempo que minimizan los efectos secundarios tóxicos de estos, reducen la dosis y la dosificación de las vacunas y amplían su respuesta inmunitaria. Sigue existiendo la necesidad de producir adyuvantes eficaces que puedan formularse conjuntamente con antígenos derivados de patógenos intracelulares y células cancerosas para activar una respuesta inmune celular y humoral eficaz para tratar patógenos intracelulares y reducir la carga tumoral. La actividad inmunomoduladora de las proteínas de interferones y las vías de señalización que regulan la producción de interferones están atrayendo interés como objetivo para el diseño de nuevos adyuvantes.

Por ejemplo, el documento US 2012/0164107 describe métodos para modular la producción de interferón tipo I en las células mediante la introducción de una bacteria en la célula, aumentando dicha bacteria el nivel de actividad del monofosfato de di-adenosina cíclico en el citosol y, por lo tanto, mejorando la producción del interferón tipo I en la célula.

Los interferones tienen cierto potencial en el tratamiento de una gran cantidad de cánceres humanos ya que estas moléculas tienen una actividad anticancerígena que actúa en múltiples niveles. Primero, las proteínas de los interferones pueden inhibir directamente la proliferación de células tumorales humanas. La actividad antiproliferativa también es sinérgica con una serie de agentes quimioterapéuticos aprobados como cisplatino, 5FU y paclitaxel. En segundo lugar, la actividad inmunomoduladora de las proteínas de los interferones puede conducir a la inducción de una respuesta inmunitaria antitumoral. Esta respuesta incluye la activación de las células NK, la estimulación de la actividad de los macrófagos y la inducción de la expresión superficial del MHC de clase I, lo que lleva a la inducción de la actividad de los linfocitos T citotóxicos antitumorales. Además, los interferones juegan un papel en la presentación cruzada de antígenos en el sistema inmunológico. Además, algunos estudios indican además que la proteína IFN-p puede tener actividad anti-angiogénica. La angiogénesis, la formación de nuevos vasos sanguíneos, es fundamental para el crecimiento de tumores sólidos. La evidencia indica que el IFN-p puede inhibir la angiogénesis al inhibir la expresión de factores proangiogénicos tales como bFGF y VEGF. Por último, las proteínas de interferón pueden inhibir la invasividad tumoral al modular la expresión de enzimas, como la colagenasa y la elastasa, que son importantes en la remodelación tisular.

Los interferones también parecen tener actividades antivirales que se basan en dos mecanismos diferentes. Por ejemplo, las proteínas de interferón tipo I (a y p) pueden inhibir directamente la replicación del virus de la hepatitis B humana ("VHB") y del virus de la hepatitis C ("VHC"), pero también pueden estimular una respuesta inmunitaria que ataque a las células infectadas con estos virus.

Compendio

Se proporcionan composiciones para aumentar la producción de un interferón de tipo I (IFN) en una célula, aumentando el nivel de un enlace fosfodiéster 2'-5' que comprende dinucleótido cíclico en una célula de manera suficiente para aumentar la producción del interferón tipo I (IFN) por la célula.

En un aspecto, se proporciona en este documento un dinucleótido cíclico que comprende dos enlaces fosfodiéster 2'-5' para su uso en el tratamiento de una enfermedad celular proliferativa aumentando la producción de un interferón de tipo I (IFN) al aumentar el nivel de un enlace fosfodiéster 2'-5' que comprende un dinucleótido cíclico en la célula. En determinadas realizaciones, el dinucleótido cíclico comprende un nucleósido de guanosina. En algunas realizaciones, el dinucleótido cíclico contiene dos nucleósidos de guanosina. En determinadas realizaciones, el dinucleótido cíclico comprende un nucleósido de adenosina. En algunas realizaciones, el dinucleótido cíclico contiene dos nucleósidos de adenosina. En otras realizaciones, el dinucleótido cíclico comprende un nucleósido de adenosina y un nucleósido de guanosina.

En determinadas realizaciones, el dinucleótido cíclico tiene la siguiente fórmula:

En determinadas realizaciones del método, el nivel del dinucleótido cíclico aumenta incrementando la actividad de una cGAMP sintasa (cGAS) en la célula. En algunas realizaciones, la actividad del cGAS aumenta potenciando la expresión de un ácido nucleico que codifica cGAS. En algunas realizaciones, la actividad del cGAS aumenta introduciendo un ácido nucleico que codifica el cGAS en la célula.

En determinadas realizaciones, la producción del interferón (IFN) alfa o el IFN interferón beta aumenta.

En determinadas realizaciones, el aumento en la producción de un interferón de tipo I (IFN) se produce en una célula de mamífero. En realizaciones particulares, la célula de mamífero es una célula humana. En algunas realizaciones, la célula está in vitro. En otras realizaciones, la célula está in vivo.

En ciertas realizaciones, el sujeto tiene una enfermedad celular proliferativa. En otras realizaciones, el sujeto tiene una enfermedad neoplásica. En determinadas realizaciones, el sujeto es un mamífero. En algunas realizaciones, el mamífero es un ser humano.

También se describe un método para aumentar una respuesta mediada por un estimulador de genes de interferón (STING) en un sujeto, el método incluye la etapa de administrar al sujeto una cantidad de un agente activo de STING eficaz para aumentar una respuesta mediada por STING en el sujeto. La respuesta mediada por STING no responde a un dinucleótido cíclico que tiene dos enlaces fosfodiéster 3'-5'.

El agente activo de STING puede incluir, entre otros, cualquiera de los enlaces fosfodiéster 2'-5' que contienen dinucleótidos cíclicos descritos en el presente documento. En ciertos casos, el dinucleótido cíclico tiene dos enlaces fosfodiéster 2'-5'. En otros casos, el dinucleótido cíclico tiene un enlace fosfodiéster 2'-5' y un enlace fosfodiéster 3'-5', como se describió anteriormente.

El agente activo de STING puede incluir un agente que aumenta la actividad celular de una cGAMP sintasa (cGAS), o el agente comprende un ácido nucleico que codifica el cGAS.

Se describe un agente activo de STING que incluye un agente que aumenta la actividad celular de STING, o un agente que comprende un ácido nucleico que codifica STING.

Se describe el uso del agente STING en el tratamiento de enfermedades neoplásicas.

En otro aspecto, se proporciona en este documento una composición que contiene un enlace fosfodiéster 2'-5' que contiene dinucleótido cíclico y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Breve descripción de las figuras

La invención se comprende mejor a partir de la siguiente descripción detallada cuando se lee junto con los dibujos adjuntos. Se enfatiza que, según la práctica común, las diversas características de los dibujos no están a escala. Por el contrario, las dimensiones de las diversas características se amplían o reducen arbitrariamente para mayor claridad. En los dibujos se incluyen las siguientes figuras:

Las Figuras 1A-1F muestran la capacidad de respuesta variable de las variantes de STING humanas frente a mapas de dinucleótidos cíclicos con respecto a la arginina 232. (A) Las células THP-1 se transdujeron con vectores que codifican un RNAhc dirigido a STING o un RNAhc de control. Luego, las células se estimularon con cíclico-di-GMP (cdG), DNA bicatenario, cíclico-di-AMP (cdA), poli-inosina: citosina (pl: C) o virus Sendai, y se evaluó la inducción de mRNA de interferón-p humano. mediante PCR cuantitativa con transcriptasa inversa. (B) La transferencia Western confirmó que la eliminación de STING era eficaz.

(C) Se transfectaron células HEK293T con las cantidades indicadas de varios plásmidos de expresión STING de ratón (m) o humano (h) y luego se estimularon 6 h después mediante transfección con cdG sintético (5 gM). GT denota el alelo nulo I199N de Sting de ratones Goldenticket (Gt). La activación de STING se evaluó mediante el uso de una construcción informadora de IFN-luciferasa cotransfectada.

(D) Se transdujeron macrófagos Gt (STING-null) con vectores retrovirales que codifican los alelos STING indicados y luego se estimularon 48 h más tarde por transfección con cdG (5 gM) u oligonucleótido DNA bicatenario 70-mer (0,5 pg/mL). La inducción de IFN se midió mediante qRT-PCR. ND, no detectado. (E) Ensayo de unión de STING a 32P-c-di-GMP. Las proteínas STING se expresaron en células HEK293T y los lisados celulares se sometieron a reticulación con UV con 32P-cdG y se resolvieron por SDS-PAGE. La unión se cuantificó mediante autorradiografía. Las transferencias Western de lisados celulares con un anticuerpo policlonal anti-STING confirmaron una expresión similar de las diversas proteínas STING. (F) La capacidad de respuesta de mSTING frente a cGAMP se ve afectada por mutaciones de R231. Los mutantes indicados se probaron como en C.

La Figura 2 muestra la alineación de secuencia de variantes de hSTING. hSTING se clonó a partir de células THP-1 en comparación con el alelo STING de referencia (NCBI NP_938023.1).

La Figura 3 muestra que se requiere R232 de STING humano para responder a c-di-GMP, pero no para la unión de c-di-GMP. (A) Se transfectaron células 293T con los alelos indicados de STING de ratón (m) o STING humano (h) y luego se estimularon con c-di-GMP (cdG). La actividad de STING se detectó mediante la inducción de una construcción informadora de IFN-luciferasa cotransfectada y se expresó como una inducción de veces sobre la actividad de luciferasa de células no estimuladas. (B) Los lisados de células 293T transfectadas se reticularon con UV en presencia de a32P-c-di-GMP, se resolvieron mediante SDS-PAGE y luego se analizaron mediante autorradiografía. Los lisados también se transfirieron por transferencia Western para STING y ACTIN como controles de expresión en paralelo.

La Figura 4 muestra que tanto G230A como H232R son necesarios para una óptima capacidad de respuesta frente a los c-dinucleótidos, pero no se requieren para unirse a los c-dinucleótidos. (A, B) Se transfectaron células 293T con los alelos indicados de STING de ratón (m) o STING humano (h) y luego se estimularon con c-di-GMP (cdG). La actividad de STING se detectó mediante la inducción de una construcción informadora de IFN-luciferasa cotransfectada.

La Figura 5 muestra que las variantes de STING responden a cGAS. (A) Se transfectaron células HEK293T con los alelos STING indicados y con cGAS humano y de ratón (mutantes wt y GS> AA) como se indica. La activación de STING se evaluó mediante una construcción informadora de IFN-luciferasa cotransfectada. (B) Se transfectaron células HEK293T con los alelos STING indicados y con un vector de expresión de mamífero que codifica una cGAMP sintasa (DncV) de V. cholerae. La activación de STING se evaluó como en A. (C) Los productos generados enzimáticamente in vitro de rWspR, rDncV y rcGAS se transfectaron en células HEK293T permeabilizadas con digitonina que expresaban las proteínas STING humanas y de ratón indicadas. Se incluyeron como controles cíclicodi-GMP (cdG) y cGAMP sintetizados químicamente. La activación de STING se evaluó como en A y B.

La Figura 6 muestra que cGAS produce un dinucleótido cíclico no canónico que contiene un enlace fosfodiéster 2'-5'. (A) Se mezclaron WspR recombinante purificado, DncV y cGAS con un 32P-GTP o un 32P-ATP y los nucleótidos no marcados indicados. Las reacciones se mezclaron con tampón de ejecución de TLC y las especies de ácido nucleico se resolvieron en una placa de TLC de PEI-celulosa. (B) Productos WspR, DncV y cGAS marcados con un 32P-GTP se digirieron con nucleasa P1 y fosfodiesterasa de veneno de serpiente y las especies de ácido nucleico se resolvieron en una placa TLC de PEI-celulosa. (C) 1H-31P HMBC del producto de cGAS purificado por HPLC adquirido a 600 MHz y 50°C. Se indican las correlaciones de enlace pasante críticas para los enlaces fosfodiéster. También se muestra la estructura deducida por RMN del producto cGAS.

Las Figuras 7A-7D proporcionan un análisis de RMN adicional del producto cGAS. Toda la adquisición de datos se realizó en D²O y a 50°C. (A, B) Experimento 1H-13C HSQC editado por multiplicidad en un campo de 900 MHz. Las señales de fase positivas correspondientes a protones de metino y metilo se muestran en verde, las señales de fase negativa correspondientes a protones de metileno se muestran en azul. (C) Experimento 1H-1H COSY en un campo de 600 MHz. (D) Experimento 1H-1H NOESY en un campo de 900 MHz.

Descripción detallada

Se proporcionan composiciones para aumentar la producción de un interferón de tipo I (IFN) en una célula. Los aspectos de los métodos incluyen aumentar el nivel de un enlace fosfodiéster 2'-5' que comprende dinucleótido cíclico en una célula de una manera suficiente para aumentar la producción del interferón de tipo I (IFN) por la célula.

También debe entenderse que la terminología utilizada en este documento tiene el propósito de describir únicamente realizaciones particulares y no pretende ser limitante, ya que el alcance de la presente invención estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas.

Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, hasta el décimo de la unidad del límite inferior, a menos que el contexto indique claramente lo contrario, entre el límite superior e inferior de ese intervalo y cualquier otro valor declarado o intermedio en ese intervalo indicado, está incluido dentro de la invención. Los límites superiores e inferiores de estos intervalos más pequeños pueden incluirse independientemente en los intervalos más pequeños y también están incluidos dentro de la invención, sujetos a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo indicado. Cuando el intervalo indicado incluye uno o ambos límites, también se incluyen en la invención los intervalos que excluyen uno o ambos de los límites incluidos.

En el presente documento se presentan determinados intervalos con valores numéricos precedidos por el término "aproximadamente". El término "aproximadamente" se usa en este documento para proporcionar soporte literal para el número exacto que precede, así como un número que está cerca o aproximadamente cerca del número al que precede el término. Para determinar si un número está cerca o aproximadamente cerca de un número citado específicamente, el número citado cercano o aproximado puede ser un número que, en el contexto en el que se presenta, proporciona el equivalente sustancial del número citado específicamente.

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por cada experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento también se pueda utilizar en la práctica o ensayo de la presente invención, en este documento se describen los métodos y materiales ilustrativos representativos.

Cabe señalar que, como se usa en este documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "una", "uno", "un" y "la/el" incluyen a los referentes en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Cabe señalar además que las reivindicaciones pueden redactarse para excluir cualquier elemento opcional. Como tal, esta declaración está destinada a servir como base antecedente para el uso de terminología exclusiva como "únicamente", "solo" y similares en relación con la citación de elementos de reivindicación o el uso de una limitación "negativa".

Como resultará evidente para los expertos en la técnica al leer esta descripción, cada una de las realizaciones individuales descritas e ilustradas en este documento tiene los componentes y las características discretos que pueden separarse fácilmente o combinarse con las características de cualquiera de las otras realizaciones. Cualquier método citado puede llevarse a cabo en el orden de los eventos enumerados o en cualquier otro orden que sea lógicamente posible.

Métodos

Como se resumió anteriormente, se proporcionan composiciones para usar en el tratamiento de una enfermedad proliferativa celular aumentando la producción de un interferón de tipo I (IFN) en una célula, por ejemplo, in vitro o in vivo. Por aumentar la producción de interferón de tipo I se quiere decir que las composiciones objeto aumentan la producción del interferón de tipo I en una célula, en comparación con un control. La magnitud del aumento puede variar y, en algunos casos, ser 2 veces o más, tal y como 5 veces o más, incluyendo 10 veces o más, en comparación con un control adecuado. En esas realizaciones en las que, antes del uso de las composiciones, la producción de interferón no es detectable, el aumento puede dar como resultado cantidades detectables de producción de interferón. La producción de interferón se puede medir usando cualquier método adecuado, incluyendo, entre otros, un bioensayo de exposición al virus de la estomatitis vesicular (VSV), bioensayos basados en replicones de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) o usando un gen indicador (por ejemplo, luciferasa) clonado bajo la regulación de una vía de señalización de interferón tipo I. Véase, por ejemplo, Meager J.

Immunol. Methods 261: 21-36 (2002); Vrolijk et al. C.J. Virol. Methods 110: 201-209 (2003); y Francois et al.

Antimicrob Agents Chemother 49 (9): 3770-3775 (2005).

El dinucleótido cíclico se puede usar en una composición para su uso en el tratamiento de una enfermedad proliferativa celular mediante la producción de cualquier interferón de tipo I, incluidos, entre otros: IFN-a (alfa), IFN-p (beta), IFN- ^k (kappa), IFN-5 (delta), IFN-£ (épsilon), IFN- ^t (tau), IFN-w (omega) e IFN-Z (zeta, también conocido como limitin). En algunas realizaciones, la composición de dinucleótidos cíclicos, utilizada como se describe, aumenta la producción de IFN-a. En algunas realizaciones, la composición de dinucleótidos cíclicos se usa para aumentar el IFN-p.

Los aspectos de la invención incluyen composiciones para su uso en el tratamiento de una enfermedad celular proliferativa aumentando la producción de un interferón de tipo I (IFN) aumentando el nivel de un enlace fosfodiéster 2'-5' que comprende dinucleótido cíclico en una célula de una manera suficiente para aumentar la producción del interferón de tipo I por la célula. Al aumentar el nivel de un enlace fosfodiéster 2'-5' que comprende dinucleótido cíclico se quiere decir que el dinucleótido cíclico objeto se usa para aumentar la cantidad de un enlace fosfodiéster 2'-5' que comprende dinucleótido cíclico en comparación con un control. Como se demuestra en la Sección Experimental a continuación, el enlace fosfodiéster 2'-5' que comprende dinucleótidos cíclicos puede usarse para aumentar los niveles de producción de interferón tipo I. La magnitud del aumento puede variar y, en algunos casos, es 2 veces mayor, como 5 veces mayor, incluyendo 10 veces mayor, 15 veces mayor, 20 veces mayor, 25 veces mayor, 30 veces mayor, 35 veces mayor, 40 veces mayor, 45 veces mayor, 50 veces mayor o 100 veces mayor, en comparación con un control adecuado.

Se puede usar una variedad de enfoques diferentes para aumentar el nivel de un enlace fosfodiéster 2'-5' que comprende niveles de dinucleótidos cíclicos. En algunos casos, el dinucleótido cíclico se usa para proporcionar a una célula diana un agente activo de dinucleótido cíclico que aumenta el enlace fosfodiéster 2'-5' que comprende los niveles de dinucleótido cíclico en la célula diana. Los agentes activos de dinucleótidos cíclicos pueden variar e incluyen, entre otros: moléculas pequeñas, ácidos nucleicos, proteínas y agentes peptídicos.

En algunas realizaciones, la composición que comprende el agente activo de dinucleótido cíclico se usa para aumentar IFN-a (alfa), IFN-p (beta), IFN- ^k (kappa), IFN-5 (delta), IFN-£ (épsilon), IFN- ^t (tau), IFN-w (omega) y / o IFN-Z (zeta, también conocido como limitin) en una célula o sujeto en comparación con un control que no ha sido contactado con el agente activo de dinucleótido cíclico. En tales realizaciones, el aumento es de un aumento de 1,5 veces a un aumento de 50 veces o más, incluido un aumento de 2 veces a un aumento de 45 veces, un aumento de 5 veces a un aumento de 40 veces, de un aumento de 10 veces a un aumento de 35 veces, un aumento de 15 veces a un aumento de 30 veces, un aumento de 20 veces a un aumento de 30 veces, etc.

En algunos casos, el agente activo de dinucleótido cíclico es un enlace fosfodiéster 2'-5' que contiene dinucleótido cíclico o un análogo funcional del mismo. Los enlaces fosfodiéster 2'-5' que contienen dinucleótidos cíclicos incluyen, entre otros, los enlaces fosfodiéster 2'-5' que contienen los dinucleótidos cíclicos descritos en el presente documento.

Como se usa en este documento, "dinucleótido cíclico" se refiere a un compuesto que contiene dos nucleósidos (es decir, un primer y segundo nucleósido), en el que el carbono 2' o 3' de cada nucleósido está unido al carbono 5' del otro nucleósido mediante un enlace fosfodiéster. Por lo tanto, un enlace fosfodiéster 2'-5' que contiene dinucleótido cíclico se refiere a un dinucleótido cíclico, en el que el carbono 2' de al menos el primer o segundo nucleósidos está unido al carbono 5' del otro nucleósido. El enlace fosfodiéster 2'-5' que contiene dinucleótido cíclico se discute con mayor detalle a continuación.

En la práctica de las realizaciones de la invención, la composición comprende una cantidad eficaz del agente activo, es decir, se proporciona un agente activo de dinucleótido cíclico (tal como se describe anteriormente) para su uso en el tratamiento de la célula o células diana. Como se usa en el presente documento, "cantidad eficaz" significa la cantidad del agente activo que, cuando se pone en contacto con la célula, por ejemplo, al introducirse en la célula in vitro, al administrarse a un sujeto, etc., es suficiente para dar como resultado un aumento de los niveles de un dinucleótido cíclico en la célula. La "cantidad eficaz" variará dependiendo de la célula y / o el organismo y / o el compuesto y / o la naturaleza del resultado deseado y / o la enfermedad y su gravedad y la edad, peso, etc., del sujeto a tratar.

En algunos casos, la cantidad eficaz del agente activo se proporciona a la célula poniendo en contacto la célula con una composición que comprenda el agente activo. La puesta en contacto de la célula con una composición que comprenda el agente activo puede ocurrir utilizando cualquier protocolo conveniente. El protocolo puede prever el contacto in vitro o in vivo del agente activo con la célula de destino, dependiendo de la ubicación de la célula de destino. Por ejemplo, cuando la célula diana es una célula aislada, por ejemplo, una célula in vitro (es decir, en cultivo), o una célula ex vivo ("ex vivo" siendo células u órganos se modifican fuera del cuerpo, donde dichas células u órganos se devuelven típicamente a un cuerpo vivo), la composición que comprende el agente activo puede introducirse directamente en la célula bajo condiciones de cultivo celular permisivas de viabilidad de la célula diana. Tales técnicas incluyen, pero no se limitan necesariamente a: infección viral, transfección, conjugación, fusión protoplástica, electroporación, tecnología de pistola de partículas, precipitación con fosfato de calcio, microinyección directa, administración de vectores virales, etc. La elección del método depende generalmente del tipo de célula con la que se contacte y de la naturaleza del agente activo, y de las circunstancias en las que se está produciendo la transformación (por ejemplo, in vitro, ex vivo o in vivo). Una discusión general de estos métodos se puede encontrar en Ausubel, et al, Short Protocols in Molecular Biology, 3a ed., Willey & Sons, 1995. Como otro ejemplo, cuando la célula o células diana forman parte de un organismo multicelular, el agente activo puede administrarse al organismo o sujeto de tal manera que el agente pueda ponerse en contacto con la(s) célula(s) diana(s), por ejemplo, a través de un protocolo in vivo. Por "in vivo" se entiende que la construcción objetivo se administra al cuerpo vivo de un animal.

En algunos casos, el agente activo dinucleótido cíclico se emplea en un tratamiento para modular la actividad de cdi-AMP en células mitóticas o postmitóticas in vitro o ex vivo, es decir, para producir células modificadas que puedan ser reintroducidas en un individuo. Las células mitóticas y postmitóticas de interés en estas realizaciones incluyen cualquier célula eucariota, por ejemplo, células madre pluripotentes, por ejemplo, células ES, células iPS y células germinales embrionarias; células somáticas, por ejemplo, células hematopoyéticas, fibroblastos, neuronas, células musculares, células óseas, células endoteliales vasculares, células intestinales, etc., y sus progenitores y precursores restringidos por linaje; y células neoplásicas, o cáncer, es decir, células que demuestran una o más propiedades asociadas con las células cancerosas, por ejemplo, hiperproliferación, inhibición del contacto, la capacidad de invadir otros tejidos, etc. En ciertas realizaciones, las células eucariotas son células cancerosas. En ciertas realizaciones, las células eucariotas son células hematopoyéticas, por ejemplo, macrófagos, células NK, etc. Las células pueden provenir de cualquier especie de mamífero, por ejemplo, murino, roedor, canino, felino, equino, bovino, ovino, primate, humano, etc. Las células pueden provenirse de líneas celulares establecidas o pueden ser células primarias, donde "células primarias", "líneas celulares primarias" y "cultivos primarios" se utilizan indistintamente en este documento para referirse a las células y a cultivos de células que se han derivado de un sujeto y se les permite crecer in vitro durante un número limitado de pasajes, es decir, de divisiones del cultivo. Por ejemplo, los cultivos primarios son cultivos que pueden haber sido pasados 0 veces, 1 vez, 2 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces o 15 veces, pero que no han pasado suficientes veces por la etapa de crisis. Típicamente, las líneas celulares primarias de la presente invención se mantienen durante menos de 10 pasajes in vitro.

Si las células son células primarias, pueden ser cosechadas a partir de un individuo por cualquier método conveniente. Por ejemplo, las células sanguíneas, por ejemplo, leucocitos, por ejemplo, macrófagos, pueden ser cosechadas por aféresis, leucocitoféresis, separación de gradientes de densidad, etc., mientras que las células de tejidos como la piel, el músculo, la médula ósea, el bazo, el hígado, el páncreas, el pulmón, el intestino, el estómago, etc. pueden ser cosechadas por biopsia. Se puede utilizar una solución adecuada para la dispersión o suspensión de las células cosechadas. Dicha solución será generalmente una solución salina equilibrada, por ejemplo, solución salina normal, PBS, solución de sal equilibrada de Hank, etc., convenientemente suplementada con suero de ternera fetal u otros factores naturales, junto con un tampón aceptable a baja concentración, generalmente de 5-25 mM. Los tampones convenientes incluyen HEPES, tampones de fosfato, tampones de lactato, etc. Las células se pueden utilizar inmediatamente, o pueden ser almacenadas, congeladas, durante largos períodos de tiempo, siendo descongeladas y capaces de ser reutilizadas. En tales casos, las células pueden ser congeladas en 10% DMSO, 50% suero, 40% medio tamponado, o alguna otra solución como se utiliza comúnmente en la técnica para preservar las células a tales temperaturas de congelación, y descongelado de una manera como comúnmente se conoce en la técnica de descongelar las células cultivadas congeladas.

Los agentes activos dinucleótidos cíclicos pueden ser producidos por células eucariotas o por células procarióticas, pueden ser procesados por desnaturalización, por ejemplo, termodesnaturalización, reducción de TDT, etc. y puedes ser renaturalizados, utilizando métodos conocidos en la técnica.

Las modificaciones de interés que no alteren la secuencia primaria incluyen la derivación química de polipéptidos, por ejemplo, acilación, acetilación, carboxilación, amidación, etc. También se incluyen modificaciones de la glicosilación, por ejemplo, las realizadas mediante la modificación de los patrones de glicosilación de un polipéptido durante su síntesis y procesamiento o en pasos de procesamiento posteriores; por ejemplo, exponiendo el polipéptido a enzimas que afectan a la glicosilación, como las enzimas glicosiladoras de mamíferos o de desglucosilación. También se adoptan secuencias que tienen residuos de aminoácidos fosforilados, por ejemplo, fosfotirosina, fosfoserina, o fosfotreonina.

Los agentes activos dinucleótidos cíclicos pueden ser preparados por síntesis in vitro, utilizando cualquier método adecuado. Varios aparatos sintéticos comerciales están disponibles, por ejemplo, sintetizadores automatizados de Applied Biosystems, Inc., Beckman, etc. Mediante el uso de sintetizadores, pueden ser sustituidos los aminoácidos naturales por aminoácidos artificiales. La secuencia particular y la forma de preparación se determinarán por conveniencia, economía, pureza requerida, etc.

Los agentes activos dinucleótidos cíclicos también pueden aislarse y purificarse de acuerdo con los métodos convencionales de síntesis recombinante. Se puede preparar un lisado del huésped de la expresión y el lisado purificado usando HPLC, cromatografía de exclusión, electroforesis de gel, cromatografía de afinidad u otra técnica de purificación. En su mayor parte, las composiciones que se utilicen incluirán el 20% o más en peso del producto deseado, como el 75% o más en peso del producto deseado, incluyendo el 95% o más en peso del producto deseado, y con fines terapéuticos, pueden ser del 99,5% o más en peso, en relación con los contaminantes relacionados con el método de preparación del producto y su purificación (donde los porcentajes pueden basarse en la proteína total).

Para modular la actividad cíclica-dinucleotídica y/o la producción, el agente activo dinucleótido cíclico-- moléculas pequeñas (por ejemplo, enlace 2'-5' fosfodiéster que contiene dinucleótidos cíclicos) --pueden utilizarse en una composición para el tratamiento de las células durante un período suficiente de tiempo, por ejemplo, de 30 minutos a 24 horas, por ejemplo, 1 hora, 1,5 horas, 2 horas, 2,5 horas, 3 horas, 3,5 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 12 horas, 16 horas, 18 horas, 20 horas o cualquier otro período de 30 minutos a 24 horas, que puede repetirse con una frecuencia de cada día a cada 4 días, por ejemplo, cada 1,5 días, cada 2 días, cada 3 días, o cualquier otra frecuencia de aproximadamente cada día a aproximadamente cuatro días. Los agentes se pueden utilizar con las células del sujeto una o más veces, por ejemplo, una vez, dos, tres veces o más de tres veces, y las células pueden incubarse con los agentes durante algún tiempo después de cada evento de contacto, por ejemplo, 16-24 horas, después de lo cual los medios se reemplazan con medios recién preparados y las células se siguen cultivando.

En ciertas realizaciones, dos agentes activos dinucleótidos cíclicos se utilizan en una composición para el tratamiento de una célula de una manera suficiente para aumentar la producción de un interferón de tipo I por la célula. En algunos casos, los agentes activos incluyen dos o más enlaces diferentes 2'-5' fosfodiéster que comprenden dinucleótidos cíclicos.

Una cantidad efectiva de agentes activos dinucleótidos cíclicos se utiliza en una formulación que se proporciona a las células para dar lugar a un cambio en los niveles dinucleótidos cíclicos. Una cantidad efectiva de agente activo dinucleótido cíclico es la cantidad que dará lugar a un aumento de 2 veces o más en la cantidad de producción del dinucleótido cíclico observada en relación con un control negativo, por ejemplo, una célula puesta en contacto con un vector vacío o polipéptido irrelevante. Es decir, una cantidad o dosis efectiva de un agente activo dinucleótido cíclico dará como resultado un aumento de 2 veces, un aumento de 3 veces, un aumento de 4 veces o más en la cantidad del dinucleótido cíclico observado, en algunos casos un aumento de 5 veces, un aumento de 6 veces o más, a veces un aumento de 7 o 8 veces o más en la cantidad de la actividad observada, por ejemplo, un aumento de 10 veces, 50 veces, 100 o más, en algunos casos, un aumento de 200 veces, 500 veces, 700 veces, o 1000 veces o más, en la cantidad de la actividad observada. La cantidad de actividad puede medirse por cualquier método adecuado. Por ejemplo, la cantidad de interferón producida por la célula se puede evaluar después del contacto con los agentes activos dinucleótidos cíclicos, por ejemplo, 2 horas, 4 horas, 8 horas, 12 horas, 24 horas, 36 horas, 48 horas, 72 horas o más después del contacto con el agente activo dinucleótido cíclico.

La puesta en contacto de las células con una composición que comprende el agente o los agentes activos dinucleótidos cíclicos puede ocurrir en cualquier medio de cultivo y bajo cualquier condición de cultivo que promueva la supervivencia de las células. Por ejemplo, las células pueden suspenderse en cualquier medio nutritivo adecuado que sea conveniente, como el DMEM modificado de Iscove o RPMI 1640, suplementado con suero de ternera fetal o suero de cabra inactivado por calor (alrededor de 5-10%), L-glutamina, un tiol, particularmente 2-mercaptoetanol, y antibióticos, por ejemplo, penicilina y estreptomicina. El cultivo puede contener factores de crecimiento a los que las células responden. Los factores de crecimiento, tal como se definen en el presente documento, son moléculas capaces de promover la supervivencia, el crecimiento y/o la diferenciación de las células, ya sea en el cultivo o en el tejido intacto, a través de efectos específicos sobre un receptor transmembrana. Los factores de crecimiento incluyen polipéptidos y factores no polipéptidos.

Siguiendo los usos descritos anteriormente, una célula puede ser modificada ex vivo para tener un aumento en los niveles dinucleótidos cíclicos. En algunas realizaciones, puede ser deseoso seleccionar la célula modificada, por ejemplo, para crear una población enriquecida de células modificadas. Se puede utilizar cualquier modificación conveniente en las células que marque las células como modificadas con un agente activo dinucleótido cíclico. Por ejemplo, se puede insertar un marcador seleccionable en el genoma de la célula, de modo que la población de células pueda enriquecerse para aquellos que comprenden la modificación genética separando las células marcadas genéticamente de la población restante. La separación puede ser por cualquier técnica de separación conveniente apropiada para el marcador seleccionable utilizado. Por ejemplo, si se ha insertado un marcador fluorescente, las células pueden separarse mediante la clasificación celular activada por fluorescencia, mientras que si se ha insertado un marcador de superficie celular, las células pueden separarse de la población heterogénea mediante técnicas de separación por afinidad, por ejemplo, separación magnética, cromatografía de afinidad, "panoramización" con un reactivo de afinidad unido a una matriz sólida u otra técnica conveniente. Las técnicas que proporcionan una separación precisa incluyen clasificadores de células activados por fluorescencia, que pueden tener diferentes grados de sofisticación, como múltiples canales de color, canales de detección de dispersión de luz obtusa y ángulo bajo, canales de impedancia, etc. Las células se pueden seleccionar contra células muertas mediante el empleo de tintes asociados con células muertas (por ejemplo, yoduro de propidio). Se puede emplear cualquier técnica que no sea excesivamente perjudicial para la viabilidad de las células modificadas genéticamente. Las composiciones celulares altamente enriquecidas para células que comprenden agentes activos dinucleótidos cíclicos se logran de esta manera. Por "altamente enriquecido" se entiende que las células modificadas genéticamente serán 70% o más, 75% o más, 80% o más, 85% o más, 90% o más de la composición celular, por ejemplo, alrededor del 95% o más, o 98% o más de la composición celular. En otras palabras, la composición puede ser una composición sustancialmente pura de células que comprenden agentes activos dinucleótidos cíclicos.

Las células que comprenden agentes activos dinucleótidos cíclicos producidos por los métodos descritos en el presente documento pueden utilizarse inmediatamente. Alternativamente, las células pueden congelarse a las temperaturas del nitrógeno líquido y almacenarse durante largos períodos de tiempo, pueden ser descongeladas y capaces de ser reutilizadas. En tales casos, las células pueden ser congeladas en 10% de DMSO, 50% de suero, 40% de medio tamponado, o alguna otra solución como se utiliza comúnmente en la técnica para preservar las células a tales temperaturas de congelación, y descongelarse de una manera como comúnmente se conoce en la técnica de la descongelación de las células cultivadas congeladas.

Las células que comprenden agentes activos dinucleótidos cíclicos pueden ser cultivadas in vitro bajo diversas condiciones de cultivo. Las células pueden reproducirse en cultivo, es decir, ser cultivadas en condiciones que promuevan su proliferación. El medio de cultivo puede ser líquido o semisólido, por ejemplo, que contenga agar, metilcelulosa, etc. La población celular puede suspenderse en un medio nutritivo adecuado, como el DMEM modificado de Iscove o RPMI 1640, normalmente suplementado con suero de ternera fetal (alrededor del 5-10%), L-glutamina, un tiol, particularmente 2-mercptoetanol, y antibióticos, por ejemplo, penicilina y estreptomicina. El cultivo puede contener factores de crecimiento a los que las células T reguladoras respondan. Los factores de crecimiento, tal como se definen en el presente documento, son moléculas capaces de promover la supervivencia, el crecimiento y/o la diferenciación de las células, ya sea en el cultivo o en el tejido intacto, a través de efectos específicos sobre un receptor transmembrana. Los factores de crecimiento incluyen polipéptidos y factores no polipeptídicos.

Las células que han sido modificadas con composiciones de agentes activos dinucleótidos cíclicos pueden ser trasplantadas a un sujeto para tratar una enfermedad o como un antiviral, agente antipatogénico o anticancerígeno terapéutico o para investigación biológica. El sujeto puede ser un neonato, un menor o un adulto. De particular interés son los sujetos mamíferos. Las especies de mamíferos que pueden ser tratadas con los presentes métodos incluyen caninos y felinos; equinos; bovinos; ovinos; etc. y primates, particularmente seres humanos. Los modelos animales, en particular los mamíferos pequeños, por ejemplo, murino, lagomorpha, etc., pueden utilizarse para investigaciones experimentales.

Las células pueden ser proporcionadas al sujeto solo o con un sustrato o matriz adecuado, por ejemplo, para apoyar su crecimiento y/u organización en el tejido al que están siendo trasplantadas. En algunos casos, se administrarán al menos 1x103 células, por ejemplo 5x103 células, 1x104 células, 5x104 células, 1x105 células, 1 x 106 células o más. Las células pueden introducirse en el sujeto a través de cualquiera de las siguientes vías: parenteral, subcutánea, intravenosa, intracraneal, intraespinal, intraocular o en el líquido cefalorraquídeo. Las células pueden introducirse por inyección, catéter o similares. Ejemplos de métodos para la administración local, es decir, la administración al lugar de la lesión, incluyen, por ejemplo, a través de un depósito de Ommaya, por ejemplo, para la administración intratecal (véanse, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos No 5.222.982 y 5385582); por inyección de bolo, por ejemplo, por una jeringa, por ejemplo, en una articulación; por perfusión continua, por ejemplo, por canulación, por ejemplo, con convección (véase, por ejemplo, la solicitud de los Estados Unidos No 20070254842,); o mediante la implantación de un dispositivo en el que las células se han colocado de forma reversible (véase, por ejemplo, la Solicitud de los Estados Unidos No 20080081064 y 20090196903).

En otros aspectos de la invención, se emplean las composiciones de agentes activos dinucleótidos cíclicos para aumentar la producción del interferón in vivo de tipo I. En estas realizaciones in vivo, las composiciones de agentes activos dinucleótidos cíclicos se administran directamente al individuo. En algunas realizaciones, las composiciones de agente activo dinucleótido cíclico administradas al sujeto contienen un enlace fosfodiéster 2'-5' que contiene un fosfodiéster dinucleótido cíclico.

Las composiciones de agentes activos dinucleótidos cíclicos pueden administrarse mediante cualquier método adecuado para la administración de péptidos, moléculas pequeñas y ácidos nucleicos a un sujeto. Las composiciones de agentes activos dinucleótidos cíclicos se pueden incorporar en una serie de formulaciones. Más concretamente, los agentes activos dinucleótidos cíclicos de la presente invención pueden formularse en composiciones farmacéuticas mediante su combinación con vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables apropiados. A continuación se describen las composiciones farmacéuticas que se pueden utilizar en la práctica de los métodos objeto.

En tales casos, se administra al sujeto una cantidad efectiva de las composiciones de agentes activos dinucleótidos cíclicos. Por una "cantidad efectiva" o una "cantidad terapéuticamente efectiva" de las composiciones de agentes activos dinucleótidos cíclicos se entiende una cantidad que se requiere para reducir la gravedad, la duración y / o los síntomas de la enfermedad. En algunas realizaciones, la cantidad efectiva de una composición farmacéutica que contiene composiciones de agente activo dinucleótido cíclico, según lo dispuesto en el presente documento, está entre 0,025 mg/kg y 1000 mg/kg de peso corporal de un sujeto humano. En ciertas realizaciones, la composición farmacéutica se administra a un sujeto humano con una cantidad de 1000 mg/kg de peso corporal o menos, 950 mg/kg de peso corporal o menos, 900 mg/kg de peso corporal o menos, 850 mg/kg de peso corporal o menos, 800 mg/kg de peso corporal o menos, 750 mg/kg de peso corporal o menos, 700 mg/kg de peso corporal o menos, 650 mg/kg de peso corporal o menos, 600 mg/kg de peso corporal o menos, 550 mg/kg de peso corporal o menos, 500 mg/kg de peso corporal o menos, 450 mg/kg de peso corporal o menos, 400 mg/kg de peso corporal o menos, 350 mg/kg de peso corporal o menos, 300 mg/kg de peso corporal o menos, 250 mg/kg de peso corporal o menos, 200 mg/kg de peso corporal o menos, 150 mg/kg de peso corporal o menos, 100 mg/kg de peso corporal o menos, 95 mg/kg de peso corporal o menos, 90 mg/kg de peso corporal o menos, 85 mg/kg de peso corporal o menos, 80 mg/kg de peso corporal o menos, 75 mg/kg de peso corporal o menos, 70 mg/kg de peso corporal o menos, o 65 mg/kg de peso corporal o menos.

También se describe una composición para aumentar un estimulador de la respuesta mediada por los genes de interferón (STING) en un sujeto, por ejemplo, una respuesta inmune mediada por STING. En algunos casos, el método incluye el paso de administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad de un agente activo STING eficaz para aumentar una respuesta mediada por STING en el sujeto. Una respuesta mediada por "STING" se refiere a cualquier respuesta mediada por STING, incluyendo, entre otras, respuestas inmunitarias frente a patógenos bacterianos, patógenos virales y patógenos eucariotas. Véase, por ejemplo, Ishikawa et al. Immunity 29: 538-550 (2008); Ishikawa et al. Nature 461: 788-792 (2009); y Sharma et al. Immunity 35: 194-207 (2011). STING también funciona en ciertas enfermedades autoinmunes iniciadas por el reconocimiento inapropiado del propio DNA (véase, por ejemplo, Gall et al. Immunity 36: 120-131 (2012), así como para la inducción de la inmunidad adaptativa en respuesta a las vacunas contra el DNA (véase, por ejemplo, Ishikawa et al. Nature 461: 788-792 (2009)). Por aumentar una respuesta mediada por STING en un sujeto se entiende un aumento en una respuesta mediada por STING en un sujeto en comparación con un sujeto de control (por ejemplo, un sujeto al que no se le administre un agente activo STING). En ciertos casos, la composición es para aumentar un estimulador de la respuesta mediada de los genes de interferón (STING) en un sujeto, en el que la respuesta mediada por STING no responde a un dinucleótido cíclico que tiene dos enlaces fosfodiéster de 3'-5' (es decir, un dinucleótido cíclico canónico).

Como se describe en la Sección Experimental a continuación, se ha demostrado que los dinucleótidos cíclicos que tienen enlaces fosfodiéster de 2'-5' activan la señalización STING. Además, se ha demostrado que estos dinucleótidos cíclicos que tienen enlaces fosfodiéster de 2'-5' estimulan los alelos de STING que no responden a los dinucleótidos cíclicos que tienen dos enlaces fosfodiéster. Por tanto, el agente activo STING es un agente activo dinucleótido cíclico descrito en el presente documento (por ejemplo, el dinucleótido cíclico, el ácido nucleico que codifica cGAS).

Los métodos anteriores encuentran su uso en una serie de aplicaciones diferentes. Algunas aplicaciones se revisan a continuación en la siguiente sección de Utilidad.

Utilidad

Las composiciones proporcionadas en este documento encuentran su uso en una serie de aplicaciones, donde tales aplicaciones incluyen el aumento del interferón de tipo I (por ejemplo, el interferón p) en un sujeto que lo necesita. Además, las composiciones proporcionadas en este documento encuentran su uso en una serie de aplicaciones, donde tales aplicaciones incluyen el aumento de la respuesta mediada por STING en un sujeto que lo necesita. Las aplicaciones específicas de interés incluyen aquellas en las que un sujeto es tratado para una condición de enfermedad que se beneficiaría de un aumento en el interferón de tipo I proporcionando al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente activo dinucleótido cíclico. En algunos casos, puede ser deseable aumentar una respuesta mediada por interferón o STING de tipo I en un individuo sano, por ejemplo, para la prevención de una enfermedad o condición. Por tanto, en algunas realizaciones, las composiciones proporcionadas en este documento se pueden utilizar para producir un efecto "adyuvante" en una vacuna para prevenir una infección u otra enfermedad, en la que el agente activo estimula la memoria inmunológica para proteger contra futuras enfermedades o infecciones.

En algunas realizaciones, la composición de la presente invención se puede utilizar en el tratamiento de individuos que tienen una enfermedad proliferativa celular, como una enfermedad neoplásica (por ejemplo, un cáncer). La enfermedad proliferativa celular se caracteriza por la propagación no deseada de las células, incluyendo, entre otras, enfermedades neoplásicas, por ejemplo, el cáncer.

Algunos ejemplos de enfermedades proliferativas celulares incluyen, entre otras, la estimulación anormal de las células endoteliales (por ejemplo, la aterosclerosis), tumores sólidos y metástasis tumoral, tumores benignos, por ejemplo, hemangiomas, neuromas acústicos, neurofibromas, tracomas y granulomas piógenos, mal funcionamiento vascular, cicatrización anormal de heridas, trastornos inflamatorios e inmunológicos, enfermedad de Bechet, artritis de gota o gota, angiogénesis anormal que acompaña, por ejemplo, a la artritis reumatoide, psoriasis, retinopatía diabética, otras enfermedades angiogénicas como la retinopatía de prematuridad (fibroplástico retrolental), degeneración macular, rechazo del injerto corneal, glaucoma neurovascular y síndrome de Oster Webber, psoriasis, restenosis, infecciones fúngicas, parasitarias y virales tales como las infecciones citomegalovirales. Los sujetos que se van a tratar de acuerdo con las composiciones de la invención incluyen a cualquier individuo que tenga cualquiera de los trastornos antes mencionados.

Los términos "sujeto" y "paciente" se refieren a un miembro o miembros de cualquier especie de mamífero o no mamífero que pueda tener una necesidad de las composiciones descritas en el presente documento. Por lo tanto, los sujetos y pacientes incluyen, sin limitación, primates (incluidos los humanos), caninos, felinos, ungulados (por ejemplo, equinos, bovinos, porcinos (por ejemplo, cerdo)), aviares y otros sujetos. Los seres humanos y los animales no humanos que tienen importancia comercial (por ejemplo, ganado y animales domesticados) son de particular interés.

"Mamífero" significa un miembro o miembros de cualquier especie de mamífero, e incluye, a modo de ejemplo, los caninos; felinos; equinos; bovinos; ovinos; rodentia, etc. y primates, particularmente los seres humanos. Los modelos animales no humanos, en particular los mamíferos, por ejemplo, primates, murina, lagomorpha, etc., pueden utilizarse para investigaciones experimentales.

El uso de "tratar" o "el tratamiento" de una afección o enfermedad incluyen su uso en: (1) prevenir al menos un síntoma de las condiciones, es decir, hacer que un síntoma clínico no se desarrolle significativamente en un mamífero que pueda estar expuesto o predispuesto a la enfermedad pero que aún no experimente o muestre síntomas de la enfermedad, (2) inhibir la enfermedad, es decir, detener o reducir el desarrollo de la enfermedad o sus síntomas, o (3) aliviar la enfermedad, es decir, causar la regresión de la enfermedad o sus síntomas clínicos. Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "uso en el tratamiento" se utiliza así para referirse tanto a la prevención de la enfermedad, como al uso en el tratamiento de condiciones preexistentes. Por ejemplo, cuando se administra el agente activo dinucleótido cíclico, la prevención de la proliferación celular se puede lograr mediante la administración de los compuestos objeto antes del desarrollo de la enfermedad manifiesta, por ejemplo, para prevenir el recrecimiento de tumores, prevenir el crecimiento metastásico, etc. Alternativamente, los compuestos se utilizan en el tratamiento de la enfermedad en curso, mediante la estabilización o mejora de los síntomas clínicos del paciente.

Terapia combinada

El agente activo dinucleótido cíclico descrito en el presente documento puede administrarse en combinación con otros agentes farmacéuticamente activos, incluidos otros agentes para su uso en el tratamiento de la afección subyacente o un síntoma de la afección. "En combinación con", tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere a usos en los que, por ejemplo, el primer compuesto se administra durante todo el curso de la administración del segundo compuesto; cuando el primer compuesto se administra durante un período de tiempo que se superpone con la administración del segundo compuesto, por ejemplo, cuando la administración del primer compuesto comienza antes de la administración del segundo compuesto y la administración del primer compuesto termina antes de que finalice la administración del segundo compuesto; cuando la administración del segundo compuesto comienza antes de la administración del primer compuesto y la administración del segundo compuesto termina antes de que finalice la administración del primer compuesto; cuando comienza la administración del primer compuesto antes de que comience la administración del segundo compuesto y la administración del segundo compuesto termine antes de que finalice la administración del primer compuesto; cuando comienza la administración del segundo compuesto antes de que comience la administración del primer compuesto y la administración del primer compuesto termine antes de que termine la administración del segundo compuesto. Por tanto, "en combinación" también puede referirse a un régimen que implique la administración de dos o más compuestos. "En combinación con", tal y como se utiliza en el presente documento, también se refiere a la administración de dos o más compuestos que pueden ser administrados en la misma formulación o diferentes formulaciones, por la misma de diferentes rutas, y en el mismo tipo de forma de dosificación o diferente.

Ejemplos de otros agentes para su uso en terapia combinada de enfermedad neoplásica incluyen, entre otros, talidomida, marimastat, COL-3, BMS-275291, escualomina, 2-ME, SU6668, neovastat, Medi-522, EMD121974, CAI, celecoxib, interleucina-12, IM862, TNP470, avastin, gleevec, herceptin y sus mezclas. Ejemplos de agentes quimioterapéuticos para su uso en terapia combinada incluyen, entre otros, daunorubicina, daunomicina, dactinomicina, doxorubicina, epirubicina, idarubicina, esorubicina, bleomicina, mafosfamida, ifosfamida, citosina arabinosida, bis-cloroetilnitrosurea, bisulfano, mitomicina C, actinomicina D, mitramicina, prednisona, hidroxiprogesterona, testosterona, tamoxifeno, dacarbazina, procarbazina, hexametilmelamina, pentametilmelamina, mitoxantrona, amsacrina, clorambucilo, metilciclohexilnitrosurea, mostazas de nitrógeno, melfalán, ciclofosfamida, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-azacitidina, hidroxiurea, desoxicoformicina, 4-hidroxiperoxiciclofosforoamida, 5-fluorouracilo (5-FU), 5-fluorodesoxiuridina (5-FUdR), metotrexato (MTX), colquicina, taxol, vincristina, vinblastina, etopósido (VP-16), trimetrexato, irinotecán, topotecán, gemcitabina, tenipósido, cisplatino y dietilestilbestrol (DES).

Otros agentes antivirales también pueden administrarse en los métodos de tratamiento de la invención. Por ejemplo, los compuestos que inhiben la inosina monofosfato deshidrogenasa (IMPDH) pueden tener el potencial de ejercer actividad antiviral directa, y tales compuestos se pueden administrar en combinación con el mutante Listeria, como se describe en este documento. Los medicamentos que son inhibidores eficaces de la proteasa de la hepatitis C NS3 se pueden administrar en combinación con el mutante Listeria, como se describe en el presente documento. Los inhibidores de la proteasa de la hepatitis C NS3 inhiben la replicación viral. Otros agentes como los inhibidores de la helicasa NS3 del VHC también son medicamentos atractivos para la terapia combinada, y se contemplan para su uso en las terapias combinadas descritas en el presente documento. Las ribozimas como e1HeptazymeTM y los oligonucleótidos de fosforotioato que son complementarios a las secuencias de proteínas del VHC y que inhiben la expresión de proteínas virales del núcleo también son adecuados para su uso en las terapias combinadas descritas en el presente documento.

Ejemplos de otros agentes para su uso en terapia combinada de esclerosis múltiple incluyen, entre otros; glatiramer; corticosteroides; relajantes musculares, como Tizanidina (Zanaflex) y baclofeno (Lioresal); medicamentos para reducir la fatiga, como la amantadina (Symmetrel) o modafinilo (Provigil); y otros medicamentos que también se pueden usar para la depresión, el dolor y los problemas de control de la vejiga o los intestinos que pueden estar asociados con la MS.

En el contexto de una terapia combinada, los compuestos de terapia combinada pueden administrarse por la misma vía de administración (por ejemplo, intrapulmonar, oral, enteral, etc.) que se administran los agentes activos dinucleótidos cíclicos. Alternativamente, los compuestos para su uso en terapia de combinación con el agente activo dinucleótido cíclico pueden ser administrados por una vía de administración diferente.

Adyuvantes

En ciertas realizaciones para su uso en el tratamiento, el agente activo dinucleótido cíclico funciona como un adyuvante cuando se administra junto con un medicamento o vacuna para tratar o prevenir una enfermedad o condición, incluyendo, entre otras, las enfermedades y condiciones descritas en el presente documento. En algunas realizaciones, las composiciones de agentes activos de dinucleótidos cíclicos se administran junto con una vacuna. Estos agentes activos que se administran con una vacuna pueden funcionar como un adyuvante para mejorar la respuesta inmune provocada por la vacuna, incluyendo estimular la memoria inmunológica para proteger contra futuras enfermedades y / o infecciones.

En algunos casos, los agentes activos de dinucleótido cíclico o STING se utilizan como adyuvante para una vacuna, por ejemplo, aumentar la inmunogenicidad de antígenos más débiles, reducir la cantidad de antígeno necesario para obtener una respuesta inmunitaria, reducir la frecuencia de inmunización necesaria para mantener la inmunidad protectora, mejorar la eficacia de las vacunas en individuos inmunocomprometidos u otros individuos con respuestas inmunitarias reducidas, y/o aumentar la inmunidad en un tejido objetivo, como la inmunidad a la mucosa. En tales realizaciones, los agentes activos de dinucleótidos cíclicos, cuando se administran conjuntamente con uno o más antígenos, pueden utilizarse en un tratamiento para inducir un perfil particular de citoquinas y promover la inmunidad celular y humoral contra el antígeno aumentando la eficacia de la vacunación.

Los antígenos utilizados para preparar vacunas pueden derivarse a partir de una variedad de microorganismos como virus, bacterias y parásitos que contienen sustancias que normalmente no están presentes en el cuerpo, así como células tumorales. Estas sustancias se pueden utilizar como antígenos para producir una respuesta inmune para destruir tanto el antígeno como las células que contienen el antígeno, como una célula bacteriana o una célula cancerosa. En algunos casos, los antígenos aislados o crudos de patógenos microbianos pueden utilizarse en vacunas para tratar enfermedades infecciosas; antígenos aislados o crudos de células tumorales se pueden utilizar en vacunas para tratar el cáncer; antígenos aislados o crudos que se sabe que están asociados con una célula patológicamente aberrante se pueden utilizar para tratar diversas enfermedades en las que es beneficioso apuntar a células particulares para la destrucción.

Los microorganismos que pueden ser una fuente de antígeno incluyen microorganismos clínicamente relevantes, como bacterias, incluidas bacterias patógenas; virus (por ejemplo, gripe, sarampión, coronavirus); parásitos (por ejemplo, Trypanosoma, Plasmodium, Leishmania); hongos (por ejemplo, Aspergillus, Candida, Coccidioides, Cryptococcus); etc. Por ejemplo, el antígeno puede provenir de bacterias, particularmente de bacterias patógenas, como el agente causal del ántrax (Bacillus anthracis), la peste (Yersinia pestis), la tuberculosis (Mycobacterium tuberculosis), la salmonelosis (Salmonella enterica), el cáncer de estómago (Helicobacter pylori), las enfermedades de transmisión sexual (Chlamydiacho tramatis o Neisseria gonorrhea) y enfermedades similares. Otros ejemplos representativos incluyen antígenos de ciertos virus, como el virus de la gripe, el virus de Norwalk, el virus de la viruela, el virus del Nilo Occidental, el virus del SRAS, el virus MERS, el virus respiratorio sincitial, el virus del sarampión etc. Los hongos de interés incluyen, entre otros Candida albicans o Aspergillus spp., y los parásitos de interés incluyen los agentes causantes de la tripanosomiasis, leishmania, peste neumónica, y la enfermedad de lyme (Borrellia burgdorferi).

Una célula patológicamente aberrante que se utilizará en una vacuna se puede obtener de cualquier fuente, como de una o más personas con una condición patológica o células cultivadas ex vivo o in vitro obtenidas de uno o más de esos individuos, incluida una persona específica para ser tratada con la vacuna resultante.

Una formulación de vacuna para su uso con un adyuvante que contenga agentes activos de dinucleótidos cíclicos puede incluir, por ejemplo, patógenos virales y bacterianos atenuados e inactivados de pacientes infectados o cultivos propagados, macromoléculas purificadas, polisacáridos, toxoides, antígenos recombinantes, organismos que contienen un gen extraño a partir de un patógeno, péptidos sintéticos, ácidos polinucleicos, anticuerpos y células tumorales.

Los antígenos recombinantes pueden obtenerse, por ejemplo, aislando y clonando un gen que codifique cualquier polipéptido inmunogénico, por ejemplo, en células bacterianas, de levadura, de insectos, reptiles o de mamíferos utilizando métodos recombinantes habituales en la técnica y descritos, por ejemplo en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York (1992) y en Ansubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1998). Varios genes que codifican antígenos superficiales a partir de patógenos virales, bacterianos y protozoarios han sido clonados, expresados y utilizados con éxito como antígenos para el desarrollo de vacunas. Por ejemplo, el antígeno superficial principal del virus de la hepatitis B, HbsAg, la subunidad b de la poliotoxina, la enterotoxina de E. coli, la proteína circunsporozoíta del parásito de la malaria y un antígeno de membrana de glicoproteína del virus Epstein-Barr, así como antígenos de células tumorales, se han expresado en diversos sistemas vectoriales/huésped habituales, purificados y utilizados en vacunas.

Una formulación de vacuna que contenga el dinucleótido cíclico o agentes activos STING puede contener ventajosamente otros adyuvantes y vehículos de vacunas. Estos vehículos y adyuvantes incluyen, entre otros, resinas de intercambio iónico, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, proteínas séricas, tales como albúmina sérica humana, sustancias tampón como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potasio, mezclas parciales de glicéridos de ácidos grasos vegetales saturados, solución salina tamponada de fosfato, agua, emulsiones (por ejemplo, emulsión de aceite/agua), sales o electrolitos como sulfato de protamina, hidrógeno-fosfato disódico, hidrógeno-fosfato potásico, cloruro de sodio, sales de zinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinilpirrolidona, sustancias a base de celulosa y polietilenglicol.

Puede ser empleado cualquier método conveniente para determinar si un compuesto o formulación de la vacuna induce una respuesta inmune innata, humoral, mediada por células, o cualquier combinación de estos tipos de respuesta inmune. Dichos métodos para detectar la respuesta inmunitaria innata generalmente se pueden realizar a las pocas horas de la administración de la vacuna. La capacidad de un compuesto o formulación de la vacuna para inducir una respuesta humoral se puede determinar midiendo el título de anticuerpos específicos del antígeno en un animal inmunizado con la vacuna y reforzado con el antígeno, o determinando la presencia de anticuerpos reactivos cruzados con un antígeno por ELISA, transferencia Western u otros métodos conocidos. Las respuestas inmunitarias celulares se pueden determinar, por ejemplo, midiendo la respuesta de los linfocitos T citotóxicos frente al antígeno utilizando una serie de métodos, como, por ejemplo, la clasificación FACS, y otros métodos habituales en la técnica. Los métodos para detectar las respuestas inmunitarias humorales y celulares generalmente se pueden realizar días o semanas después de la administración de la vacuna.

Dinucleótidos cíclicos

La presente invención proporciona composiciones que comprenden los dinucleótidos cíclicos que contienen la unión del fosfodiéster 2'-5' para los usos descritos. Tal y como se utiliza en el presente documento, "dinucleótido cíclico" se refiere a un compuesto que contiene dos nucleósidos (es decir, un primer y segundo nucleósido), donde el carbono de 2' o 3' de cada nucleósido está unido al carbono de 5' del otro nucleósido por un enlace fosfodiéster. Por lo tanto, un dinucleótido cíclico que contiene el enlace fosfodiéster de 2'-5' se refiere a un dinucleótido cíclico, en el que el carbono de 2' de al menos uno de los nucleósidos está unido al carbono de 5' del otro nucleósido. Como se explica en el presente documento, el enlace de fosfodiéster de 2'-5' que contiene dinucleótidos cíclicos se puede utilizar en la práctica de los métodos descritos en el presente documento para aumentar la producción de un interferón de tipo I en una célula o sujeto. Como se utiliza en el presente documento, un "d-nucleótido cíclico" también incluye todas las formas estereoisoméricas de los dinucleótidos cíclicos descritos en el presente documento.

Tal y como se utiliza en el presente documento, un "nucleósido" se refiere a una composición que contiene una base nitrogenada unida covalentemente a un azúcar (por ejemplo, ribosa o desoxirribosa) o un análogo del mismo. Ejemplos de nucleósidos incluyen, entre otros, citidina, uridina, adenosina, guanosina, timidina e inosina. En algunas realizaciones, el nucleósido contiene un azúcar desoxirribosa. Los análogos de los nucleósidos incluyen, entre otros, los análogos de desoxiadenosina (por ejemplo, Didanosina y Vidarabina); análogos de la desoxicitidina (p. ej., Citarabina, Ematricitabina, Lamivudina y Zalcitabina); análogos de la desoxiguanosina (Abacavir y Entecavir); análogos de (desoxi-)timidina (por ejemplo, Stavudina, Telbivudina y Zidovudina); y análogos de la desoxiuridina (p. ej., Idoxuridina y Trifluridina).

Sin estar vinculados a ninguna teoría particular de la operación y tal y como se muestra en los ejemplos siguientes, los dinucleótidos cíclicos pueden aumentar la producción de IFN de tipo I en una célula. En ciertas realizaciones, los dinucleótidos cíclicos aumentan la producción de IFN tipo I a través de un mecanismo que implica un estimulador de genes de interferón (STING).

Los dinucleótidos cíclicos incluyen los descritos específicamente en el presente documento, así como las isoformas (por ejemplo, tautómeros) de las descritas específicamente en el presente documento que se pueden utilizar en la práctica de los métodos objeto. Los dinucleótidos cíclicos se pueden obtener utilizando cualquier método adecuado. Por ejemplo, los dinucleótidos cíclicos pueden ser fabricados por síntesis química utilizando derivados de nucleósidos como material de partida. Los dinucleótidos cíclicos también pueden ser producidos por síntesis in vitro, utilizando cGAMP purificado recombinante (cGAS), como se describe en la Sección Experimental a continuación. Además, las estructuras de estos dinucleótidos cíclicos pueden confirmarse mediante el análisis de RMN.

Los dinucleótidos cíclicos descritos en el presente documento pueden describirse mediante la siguiente nomenclatura: [X1(A-5')pX2(B-5')p]cíclico, en la que X¹ y X² son el primer y segundo nucleósido, A es el carbono del primer nucleósido (por ejemplo, la posición 2' o 3') que está unida al carbono de 5' del segundo nucleósido a través de un enlace fosfodiéster y B es el carbono del segundo nucleósido (por ejemplo, la posición 2' o 3') que está unida al carbono 5' del primer nucleósido por un enlace fosfodiéster. Por ejemplo, sobre la base de esta nomenclatura, [G(2'-5')pA(3'-5')p]cíclico tiene la siguiente fórmula:

En ciertas realizaciones, el dinucleótido cíclico contiene dos enlaces de 2'-5'fosfodiester ( [X1(2'-5')pX2(2'-5')p]cíclico). En realizaciones particulares, el dinucleótido cíclico contiene además un enlace fosfodiéster de 2'-5' y 3'-5' (por ejemplo, [X1(2'-5')pX2(3'-5')p]cíclico o [X1(3'-5')pX2(2'-5')p]cíclico).

En ciertas realizaciones, el dinucleótido cíclico es: [A(2'-5')pA2'-5')p]cíclico; [T(2'-5')pT(2'-5')p]cíclico; [G(2'-5')pG(2'-5')p]cíclico; [C(2'-5')pC(2'-5')p]cíclico; o [U(2'-5')pU(2'-5')p]cíclico. En ciertas realizaciones, el dinucleótido cíclico es:

[A(2'-5')pA(3'-5')p]cíclico; [T(2'-5')pT(3'-5')p]cíclico; [G(2'-5')pG(3'-5')p]cíclico; [C(2'-5')pC(3'-5')p]cíclico; [U(2'-5')pU(3'-5')p]cíclico; [A(2'-5')pT(3'-5')p]cíclico; [T(2'-5')pA(3'-5')p]cíclico; [A(2'-5')pG(3'-5')p]cíclico; [G(2'-5')pA(3'-5')p]cíclico;

[A(2'-5')pC (3'-5')p]cíclico; [C(2'-5')pA(3'-5')p]cíclico; [A(2'-5')pU(3'-5')p]cíclico; [U(2'-5')pA(3'-5')p]cíclico; [T(2'-5')pG(3'-5')p]cíclico; [G(2'-5')pT(3'-5')p]cíclico; [T2'-5')pC(3'-5')p]cíclico; [C(2'-5')pT(3'-5')p]cíclico; [T(2'-5')pU(3'-5')p]cíclico;

[U(2'-5')pT(3'-5')p]cíclico; [G(2'-5')pC(3'-5')p]cíclico; [C2'-5')pG(3'-5')p]cíclico; [G(2'-5')pU(3'-5')p]cíclico; [U(2'-5')pG(3'-5')p]cíclico; [C(2'-5')pU(3'-5')p]cíclico; o [U(2'-5')pC(3'-5')p]cíclico.

En ciertas realizaciones, el dinucleótido cíclico tiene la siguiente fórmula:

donde X e Y pueden ser cualquier molécula orgánica incluyendo una base nitrogenosa. Como se utiliza en el presente documento, una "base nitrogenada" se refiere a moléculas que contienen nitrógeno que tienen las propiedades químicas de una base que incluyen, entre otros, derivados de pirimidina (por ejemplo, citosina, timina y uracilo) y derivados de la purina (por ejemplo, adenina y guanina), así como derivados de pirimidina y purina sustituidos, análogos de pirimidina y purina, y sus análogos de purina, y sus tautómeros. En ciertas realizaciones, X e Y son cada una de las siguientes:

En ciertas realizaciones, el dinucleótido cíclico tiene la siguiente fórmula ([G(2'5')pA(3'5')p]cíclico):

En ciertas realizaciones, el dinucleótido cíclico tiene la siguiente fórmula ([G(3'5')pA(2'5')p]cíclico):

En otras realizaciones, el dinucleótido cíclico tiene la siguiente fórmula [G(2'5')pA(2'5')p]cíclico: En otras realizaciones, el dinucleótido cíclico tiene la siguiente fórmula [A(2'5')pA(3'5')p]cíclico:

En otras realizaciones, el dinucleótido cíclico tiene la siguiente fórmula [G(2'5')pG(3'5')p]cíclico:

En ciertas realizaciones, el dinucleótido cíclico tiene la siguiente fórmula [A(2'5')pA(2'5')p]cíclico:

En ciertas realizaciones, el dinucleótido cíclico tiene la siguiente fórmula [G(2'5')pG(2'5')p]cíclico: Ċ

En ciertas realizaciones, el dinucleótido cíclico tiene una de las siguientes fórmulas:

donde R es cualquier cadena lateral de aminoácidos.

Composiciones farmacéuticas

En otro aspecto, siempre que se disponga de una composición farmacéutica que contenga cualquiera de los agentes activos dinucleótidos cíclicos proporcionados en este documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En ciertas realizaciones de la composición farmacéutica, el agente activo dinucleótido cíclico es uno o más dinucleótidos cíclicos.

La expresión "farmacéuticamente aceptable" significa que está aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o que se encuentra en un listado de la Farmacopea de los Estados Unidos u otra farmacopea extranjera generalmente reconocida para su uso en animales y, más particularmente, en seres humanos. El término "vehículo" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra el inhibidor de la proteína de transporte mitocondrial. Estos vehículos farmacéuticos pueden ser, por ejemplo, líquidos estériles, como soluciones salinas en agua y aceites, incluidos los de origen de petróleo, animal, vegetal o sintético, como el aceite de cacahuete, el aceite de soja, el aceite mineral, el aceite de sésamo etc. Una solución salina es un vehículo preferido cuando la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa. Las soluciones salinas y las soluciones acuosas de dextrosa y glicerol también se pueden emplear como vehículos de líquidos, especialmente para soluciones inyectables. Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche desnatada seca, glicerol, propilenglicol, agua, etanol etc. La composición, si se desea, también puede contener pequeñas cantidades de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes tamponantes del pH. Estas composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, tabletas, píldoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida, etc. La composición se puede formular como un supositorio, con aglutinantes tradicionales y vehículos como los triglicéridos. Los inhibidores pueden formularse como formas neutras o salinas. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las formadas con grupos de aminoácidos libres como las derivadas de los ácidos clorhídricos, fosfóricos, acéticos, oxálicos, tartáricos, etc., y las formadas con grupos carboxilo libres como los derivados del sodio, potasio, amonio, calcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etillamino etanol, histidina, etc. Ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E. W. Martin, por la presente incorporada como referencia en este documento en su totalidad. Tales composiciones contendrán una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína de transporte mitocondrial (por ejemplo, una proteína Miro, una proteína TRAK, o inhibidor Khc), preferiblemente en forma purificada, junto con una cantidad adecuada de vehículo con el fin de proporcionar la forma para una administración adecuada al paciente. La formulación debe adaptarse al modo de administración.

La composición farmacéutica también puede incluir cualquiera de una variedad de agentes estabilizadores, como un antioxidante, por ejemplo. Cuando la composición farmacéutica incluya un polipéptido, el polipéptido se puede complejar con varios compuestos conocidos que mejoren la estabilidad in vivo del polipéptido, o de otra manera mejorar sus propiedades farmacológicas (por ejemplo, aumentar la semivida del polipéptido, reducir su toxicidad, mejorar la solubilidad o la absorción). Ejemplos de tales modificaciones o agentes complejantes incluyen sulfato, gluconato, citrato y fosfato. Los polipéptidos de una composición también se pueden complejar con moléculas que mejoren sus atributos in vivo. Estas moléculas incluyen, por ejemplo, carbohidratos, poliaminas, aminoácidos, otros péptidos, iones (por ejemplo, sodio, potasio, calcio, magnesio, manganeso) y lípidos.

Puede encontrarse más información sobre formulaciones que son adecuadas para varios tipos de administración en el manual Remington's Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17th ed. (1985). Para una breve revisión de los métodos para la administración de medicamentos, véase Langer, Science 249:1527-1533 (1990).

Los componentes utilizados para formular las composiciones farmacéuticas son preferiblemente de alta pureza y están sustancialmente libres de contaminantes potencialmente dañinos (por ejemplo, al menos un grado de National Food (NF), generalmente al menos un grado analítico y, más típicamente, al menos un grado farmacéutico). Además, las composiciones pretendidas para su uso in vivo pueden ser estériles. En la medida en que el compuesto determinado debe sintetizarse antes de su uso, el producto resultante suele estar sustancialmente libre de agentes potencialmente tóxicos, particularmente cualquier endotoxina, que puede estar presente durante el proceso de síntesis o purificación. Las composiciones para la administración parental también son estériles, sustancialmente isotónicas y hechas bajo condiciones GMP.

La composición farmacéutica se puede formular para la administración intravenosa, oral, vía implante, transmucosa, transdérmica, intramuscular, intratecal o subcutánea. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica está formulada para su administración intravenosa. En otras realizaciones, la composición farmacéutica está formulada para la administración subcutánea. Los siguientes sistemas de administración, que emplean a una serie de vehículos farmacéuticos de uso rutinario, son sólo representativos de las muchas realizaciones previstas para administrar las presentes composiciones.

Los sistemas de administración de medicamentos inyectables incluyen soluciones, suspensiones, geles, microesferas e inyectables poliméricos, y pueden comprender excipientes tales como agentes que alteran la solubilidad (por ejemplo, etanol, propilenglicol y sacarosa) y polímeros (por ejemplo, policaprolactonas y PLGA). Los sistemas implantables incluyen varillas y discos, y pueden contener excipientes tales como el PLGA y la policaprolactona. La osteopontina o los ácidos nucleicos de la invención también se pueden administrar unidos a partículas utilizando una pistola genética.

Los sistemas de administración oral incluyen tabletas y cápsulas. Estos pueden contener excipientes como los aglutinantes (por ejemplo, hidroxipropilmetilcelulosa, polivinilpirrolidona otros materiales celulósicos y almidón), diluyentes (por ejemplo, lactosa y otros azúcares, almidón, fosfato dicálcico y materiales celulósicos), agentes desintegrantes (por ejemplo, polímeros de almidón y materiales celulósicos) y agentes lubricantes (por ejemplo, estearatos y talcos).

Los sistemas de administración transmucosos incluyen parches, tabletas, supositorios, pesarios, geles y cremas, y pueden contener excipientes tales como solubilizadores y potenciadores (por ejemplo, propilenglicol, sales biliares y aminoácidos), y otros vehículos (por ejemplo, polietilenglicol, ásteres y derivados de ácidos grasos, y polímeros hidrófilos como la hidroxipropilmetilcelulosa y el ácido hialurónico).

Los sistemas de administración dérmica incluyen, por ejemplo, geles acuosos y no acuosos, cremas, emulsiones múltiples, microemulsiones, liposomas, pomadas, soluciones acuosas y no acuosas, lociones, aerosoles, bases hidrocarbonadas y polvos, y pueden contener excipientes como solubilizadores, potenciadores de la permeación (por ejemplo, ácidos grasos, ásteres de ácidos grasos, alcoholes grasos y aminoácidos) y polímeros hidrofílicos (p. ej., policarófilos y polivinilpirrolidona). En una realización, el vehículo farmacéuticamente aceptable es un liposoma o un potenciador transdármico.

En ciertas realizaciones, la composición farmacéutica que contiene el agente activo dinucleótido cíclico está formulada para cruzar la barrera hematoencefálica (BBB). Una estrategia para la administración de fármacos a través de la barrera hematoencefálica (BBB) implica la rotura de la BBB, ya sea por medios osmóticos como manitol o leucotrienos, o bioquímicamente por el uso de sustancias vasoactivas como la bradiquinina. Un agente disruptor de la BBB se puede coadministrar con las composiciones terapéuticas cuando las composiciones se administran mediante inyección intravascular. Otras estrategias para pasar a través de la BBB pueden implicar el uso de sistemas de transporte endógenos, incluyendo transcitosis mediada por caveoil-1, transportadores mediados por vehículos como los vehículos de glucosa y aminoácidos, transcitosis mediada por receptores para insulina o transferrina, y transportadores activos de eflujo como la glicoproteína p. Los restos de transporte activo también pueden conjugarse con los compuestos terapéuticos para su uso en la invención para facilitar el transporte a través de la pared endotelial del vaso sanguíneo. Alternativamente, la administración de medicamentos de la composición farmacéutica de la ND detrás de la BBB puede ser por administración local, por ejemplo por administración intratecal, por ejemplo, a través de un depósito de Ommaya (véase, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos No 5.222.982 y 5385582, incorporadas en el presente documento como referencia); por inyección de bolo, por ejemplo, por una jeringa, por ejemplo, intravitreal o intracranealmente; por perfusión continua, por ejemplo, por canulación, por ejemplo, con convección (véase, por ejemplo, la Solicitud de patente de los Estados Unidos No 20070254842, incorporada en este documento como referencia); o mediante la implantación de un dispositivo en el que se haya colocado de forma reversible la composición farmacéutica del inhibidor (véanse, por ejemplo, las Solicitudes de patente de los Estados Unidos No 20080081064 y 20090196903, incorporadas en este documento como referencia).

En ciertas realizaciones, la composición farmacéutica que contiene los agentes activos dinucleótidos cíclicos o STING se formula en un vehículo de administración, por ejemplo, para mejorar el transporte citosólico. Se puede emplear cualquier protocolo conveniente para facilitar la administración del agente activo dinucleótido cíclico a través de la membrana plasmática de una célula y en el citosol. En determinadas realizaciones, los agentes activos dinucleótidos cíclicos o STING y un antígeno eficaz para su uso en una vacuna pueden ser formulados juntos para ser suministrados por el mismo vehículo de administración en la composición farmacéutica.

En algunos casos, los agentes activos dinucleótido cíclico o STING pueden encapsularse en un vehículo de administración que comprenda liposomas en la composición farmacéutica. Métodos de uso de liposomas para la administración de medicamentos y otros usos terapéuticos se conocen en la técnica. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. Nos. 8329213, US6465008, US5013556, solicitud de EE.UU. No. 20070110798, y Andrews et al., Mol Pharm, 2012, 9:1118.

Los liposomas pueden ser modificados para hacer su superficie más hidrófila mediante la adición de polietilenglicol ("pegilado") a la bicapa, lo que aumenta su tiempo de circulación en el torrente sanguíneo. Estos se conocen como liposomas "sigilosos" y son especialmente útiles como vehículos de moléculas hidrófilas (solubles en agua), como los agentes activos dinucleótidos cíclicos.

En ciertas realizaciones, nano- o micropartículas hechas de materiales biodegradables como poli(ácido láctico), poli(Y-ácido glutámico), poli(ácido glicólico), ácido poliláctico-co-glicólico. La polietilenimina, o micropartículas de alginato y micropartículas catiónicas, incluidas las dedrículas, como las ciclodextrinas, pueden emplearse como vehículos de administración de agentes activos dinucleótidos cíclicos o STING para promover la absorción celular. Véanse, por ejemplo, la patente de EE.UU. No. 8187571, Krishnamachari et al., Adv Drug Deliv Rev, 2009, 61:205, Garzon et al., 2005, Vaccine, 23:1384.

En otra realización, se puede emplear la internalización fotoquímica para mejorar la absorción citosólica de agentes activos de dinucleótido cíclico o STING. Véase, por ejemplo, la solicitud de patente de EE. UU. No. 20120226217. En tales realizaciones, los agentes activos de dinucleótido cíclico o STING pueden ser adicionados conjuntamente con un agente fotosensibilizante. Luego, la exposición de las células diana a la luz de una longitud de onda específica desencadena la internalización de los agentes activos de dinucleótido cíclico o STING.

En ciertas realizaciones, el vehículo de entrega para la administración de los agentes activos de dinucleótido cíclico o STING también puede dirigirse a los vehículos de administración, por ejemplo, un liposoma que contiene uno o más restos de direccionamiento o modificadores de la biodistribución en la superficie del liposoma. Un resto de direccionamiento puede ser cualquier agente que sea capaz de enlazar o interactuar específicamente con una diana deseada.

El agente de unión específico puede ser cualquier molécula que se una específicamente a una proteína, péptido, biomacromolécula, célula, tejido, etc. que está siendo dirigido (por ejemplo, un péptido de proteína, biomacromolécula, célula, tejido, etc. en el que el agente activo del dinucleótido cíclico o STING ejerce su efecto deseado). Dependiendo de la naturaleza del sitio diana, el agente de unión específico puede ser, entre otros, un anticuerpo contra un epítopo de un analito peptídico, o cualquier molécula de reconocimiento, como un miembro de un par de unión específico. Por ejemplo, los pares de enlace específicos adecuados incluyen, entre otros: un miembro de un par receptor/ligando; una porción de unión de ligandos de un receptor; un miembro de un par de anticuerpos/antígenos; un fragmento de unión a antígenos de un anticuerpo; un hapteno; un miembro de un par de lectina/hidrato de carbono; un miembro de un par de enzimas/sustratos; biotina/avitina; biotina/estreptavidina; digoxina/antidigoxina; un miembro de un par de unión de aptámeros de péptido; etc.

En ciertas realizaciones, el resto de unión específica incluye un anticuerpo. Un anticuerpo, tal como se define en este documento, puede incluir fragmentos de anticuerpos que retienen una unión específica al antígeno, incluyendo, entre otras, fragmentos de Fab, Fv, scFv y Fd, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos de cadena única y proteínas de fusión que comprendan una porción de unión a antígenos de un anticuerpo y una proteína no de anticuerpo. Los anticuerpos también pueden incluir Fab', Fv, F(ab^')2 y otros fragmentos de anticuerpos que retengan la unión específica al antígeno.

En ciertas realizaciones, el resto de direccionamiento es un agente de unión que interactúa específicamente con una molécula expresada en una célula tumoral o una célula inmune (por ejemplo, CD4, CD8, CD69, CD62L, etc), de modo que el vehículo de suministro dirigido que contiene los agentes activos de dinucleótido cíclico o STING se administran al sitio de un tumor o a células inmunitarias específicas.

Cuando se desee, cualquier combinación de los vehículos de administración mencionados anteriormente podrá utilizarse de manera ventajosa para mejorar la administración de los agentes activos de dinucleótido cíclico o STING a las células diana.

Los componentes de la composición farmacéutica se pueden suministrar por separado o mezclados en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o concentrado libre de agua. Cuando la composición se administre por perfusión, se puede dispensar con un frasco de perfusión que contenga agua estéril de grado farmacéutico o solución salina. Cuando la composición se administra por inyección, se puede proporcionar una ampolla de agua estéril para inyección o solución salina para que los ingredientes puedan mezclarse antes de la administración.

En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se suministra como un polvo liofilizado esterilizado en seco capaz de ser reconstituido a la concentración adecuada para su administración a un sujeto. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se suministra como un concentrado sin agua. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se suministra como polvo liofilizado estéril seco a una dosis unitaria de al menos 0,5 mg, al menos 1 mg, al menos 2 mg, al menos 3 mg, al menos 5 mg, al menos 10 mg, al menos 15 mg, al menos 25 mg, al menos 30 mg, al menos 35 mg, al menos 45 mg, al menos 50 mg, al menos 60 mg, o al menos 75 mg.

Las soluciones, suspensiones y polvos para sistemas de administración reconstituibles incluyen vehículos como agentes de suspensión (por ejemplo, gomas, xantanos, celulósicos y azúcares), humectantes (por ejemplo, sorbitol), solubilizantes (por ejemplo, etanol, agua, PEG y propilenglicol), tensioactivos (por ejemplo, lauril sulfato de sodio, spans, Tweens y cetil piridina), conservantes y antioxidantes (por ejemplo, parabenos, vitaminas E y C, y ácido ascórbico), agentes anticársticos, agentes de recubrimiento y agentes quelantes (p. ej., EDTA).

En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se formula como una forma de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las formadas con aniones como las derivadas de los ácidos clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartáricos, etc., y las formadas con cationes como las derivadas de sodio, potasio, amonio, calcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína, etc.

En ciertas realizaciones, la composición farmacéutica contiene un derivado profármaco de cualquiera de los agentes activos de dinucleótido cíclico o STING proporcionados en el presente documento. Estos profármacos pueden convertirse posteriormente en una forma activa del agente activo de dinucleótido cíclico o STING en el cuerpo del sujeto al que se ha administrado la composición farmacéutica.

Parte experimental

I. Resultados y discusión

El reconocimiento del ácido nucleico derivado de patógenos es un mecanismo importante por el cual se inician las respuestas inmunitarias innatas en mamíferos (Barbalat et al., Annu Rev Immunol (2011) 29: 185). Se han descrito varias familias de sensores de ácido nucleico codificados en línea germinal, incluidos los receptores tipo Toll (TLR) y los receptores tipo RIG-I (RLR) (Palm et al., Immunol Rev (2009) 227: 221; Takeuchi et al., Cell (2010) 140: 805). Al unirse los ácidos nucleicos, estos sensores inician cascadas de señalización que conducen a la producción de citoquinas y otras proteínas efectoras inmunes que proporcionan defensa del huésped.

La presencia citosólica de DNA extraño de doble cadena (ds) desencadena una potente respuesta antiviral dominada por la producción de interferones de tipo I (IFN) (Ishii et al., Nat. Immunol. (2006) 7: 40; Stetson et al., Immunity (2006) 24:93). Sin embargo, el mecanismo molecular que vincula DNA bicatenario con la producción de interferón no ha sido bien caracterizado (Burdette & Vance, Nat. Immunol. (2013) 14: 19). Se identificó una proteína huésped, STING, que se requería para la respuesta de IFN al DNA bicatenario citosólico (Ishikawa & Barber, Nature (2008) 455: 674; Ishikawa et al., Nature (2009) 461: 788; Sun et al., Proc Natl Acad Sci U S A (2009) 106: 8653; y Zhong et al., Immunity (2008) 29:538). También se demostró que STING era necesario para la respuesta del interferón a los segundos mensajeros derivados de bacterias llamados dinucleótidos cíclicos (CDN) (Jin et al., J Immunol (2011) 187: 2595; y Sauer et al., Infect Immun (2011) 79: 688). Los CDN son secretados o liberados en el citosol por ciertos patógenos bacterianos (Woodward et al., Science (2010) 328: 1703) y se unen directamente a STING (Burdette et al., Nature (2011) 478: 515). Curiosamente, sin embargo, se identificó un alelo mutante (R231A) de STING de ratón que abolió la capacidad de respuesta frente a los CDN, pero que no afectaba sensiblemente a la respuesta del interferón al DNA citosólico (Id). Por el contrario, las células 293T que expresan el STING de tipo salvaje de ratón son sensibles a los CDN, pero no a DNA bicatenario. Por lo tanto, aunque las respuestas de IFN frente a los CDN citosólicos y al DNA bicatenario ambos requieren STING, las respuestas a estos ligandos químicamente distintos pueden desacoplarse genéticamente.

Sobre la base de dos estudios (Sun, et al., Science (2013) 339: 786; y Wu et al., Science (2013) 339: 826), se propuso que la presencia citosólica de DNA bicatenario conduce a la producción de un CDN, GMP-AMP cíclico (cGAMP), por un sensor dependiente de DNA llamado cGAMP sintasa (cGAS). Se ha demostrado que cGAMP se une y activa STING. Sin embargo, no estaba claro cómo el mutante STING R231A todavía podía iniciar respuestas al DNA bicatenario a pesar de carecer de capacidad de respuesta frente a los CDN. Por lo tanto, se investigó el mecanismo por el cual cGAS activa STING.

Los estudios anteriores (Sauer et al., Burdette et al.) se han centrado principalmente en el STING del ratón y aún no queda claro si el STING humano puede responder a los CDN (Conlon et al., J Immunol, (2013) 190: 5216). Como se describió anteriormente (Sun et al., Wu et al.) se encontró que la línea celular humana THP-1 respondía fuertemente a los CDN de una manera dependiente de STING (FIG. 1A, B). hSTING fue clonado a partir de células THP-1 y se comparó su secuencia de aminoácidos con el alelo de referencia previamente estudiado (NP_938023.1; denominado en este documento como hSTINGREF) (7) (FIG. 2). Se encontró que hSTINGREF y HSTINGTHP-1 diferían en cuatro posiciones de aminoácidos. En particular, hSTINGREF codifica una histidina (H) en la posición de aminoácido 232, mientras que HSTINGthp-1 codifica una arginina (R) en esa posición, lo que corresponde a R231 en mSTING y es fundamental para la capacidad de respuesta frente a las CDN. Por lo tanto, la funcionalidad de los alelos hSTING individuales se probaron expresando estos alelos en células 293T que carecían de STING endógeno (Burdette et al.). Como se ha observado anteriormente (Burdette et al.), la sobreexpresión de mSTING en células 293T es suficiente para inducir la activación independiente del ligando de una construcción de reportero de IFN-luciferasa; sin embargo, la transfección de células 293T con cantidades más bajas de mSTING hace que las células respondan a los CDN. Del mismo modo, las células 293T que expresan HSTINGthp-1 respondieron a la estimulación de CDN. Por el contrario, las células que expresaban hSTINGREF eran poco sensibles o no respondían en absoluto (FIG. 1C). Curiosamente, se observó que tres estructuras de cristal recientes de STING unidas a di-GMP cíclico eran de la proteína hSTINGREF poco sensible (Huang, et al., Nature Struct. & Mol. Biol. (2012) 19: 728; Ouyang et al., Immunity (2012) 36: 1073; Yin et al., Mol Cell (2012) 46: 735).

Las células 293T no responden a la estimulación provocada por el DNA bicatenario, presumiblemente debido a la falta de expresión de cGAS (Sun et al.) o tal vez a otros sensores del DNA. Por lo tanto, para probar si las variantes hSTING podían responder a la estimulación del DNA, STING-null ('goldenticket') (Saueret al.), pero (cGAS+) los macrófagos fueron transducidos con vectores de expresión hSTING. Curiosamente, incluso la variante hSTINGREF que no responde a los CDN confirió la capacidad de respuesta frente al DNA bicatenario (FIG. 1D). hSTINGREF por lo tanto fenocopia el mutante R231A de ratón STING, descrito previamente que desacopla la capacidad de respuesta frente a los CDN y DNA bicatenario (Burdette et al.). Al igual que la variante mSTINGR231A, hSTINGREF todavía está vinculado a los CDN (FIG. 1E) (Huang et al., Ouyang et al., y Yin et al.), lo que indica que este alelo se ve comprometido en un paso posterior a la unión de CDN.

De acuerdo con los resultados anteriores con alelos hSTING, un mutante R231H de mSTING fue poco sensible a los CDN, al igual que las variantes R232A o R232H de HSTIⁿG^thp (FIG. 3A). Por lo tanto, se llegó a la conclusión de que la arginina 231/232 es fundamental para la capacidad de respuesta frente a los CDN en el STING de ratón/humano. La introducción de una mutación H232R en el hSTINGREF, sin embargo no fue suficiente para restaurar la capacidad de respuesta frente a los CDN; de hecho, se observó que también se requería una segunda sustitución (G230A) (FIG. 4). Una vez más, todos los alelos de las variantes de STING que fueron probados se unieron al di-GMP cíclico, de acuerdo con el hecho de que los residuos 230 y 232 se encuentran en bucles que cubren pero no forman la bolsa de unión de CDN (FIG. 3B) (Burdette & Vance).

Es importante destacar que mSTINGR231A tampoco respondió a cGAMP sintetizado químicamente (FIG. 1F) (Kellenberger, et al., J Am Chem Soc. (2013). 135:4906). Esto planteó la cuestión de si las variantes R231A/R232H de STING responderían a la enzima cGAS que se cree que activa STING a través de la producción de cGAMP. Se encontró que la expresión de cGAS humana o de ratón era suficiente para activar fuertemente las variantes hSTINGREF y mSTINGR231A, incluso en niveles muy bajos de expresión cGAS (FIG. 5A). Se consideraron varias explicaciones para este resultado. Una explicación es que la respuesta se debe simplemente a la sobreexpresión de la sintasa en las células de los mamíferos; sin embargo, la sobreexpresión de una enzima bacteriana que produce cGAMP (DncV de V. cholerae) (Davies, Cell (2012)149: 358) no activó hSTINGREF o mSTINGR231A, pero sí activó mSTING y HSTINGthp-1 de tipo salvaje (FIG. 5B). Una hipótesis alternativa es que cGAS podría interactuar físicamente con STING y así activar STING de una manera independiente de la producción de cGAMP. Sin embargo, esta explicación también parece ser incorrecta. Como se ha demostrado anteriormente (Sun et al.), la sobreexpresión de mutantes catalíticamente muertos de cGAS de humanos o ratones no pudo activar STING (GS>AA; figura 2A), argumentando que la señalización de cGAS depende de la producción de un segundo mensajero en lugar de una interacción física directa con STING. Para confirmar esta interpretación, el producto enzimático de cGAS se produjo proporcionando ATP, GTP y DNA bicatenario a cGAS recombinantes purificados in vitro. Como control negativo, el DNA bicatenario (necesario para estimular la actividad de cGAS) se omitió de una reacción paralela. Los productos cGAS resultantes fueron purificados y transfectados en células 293T que expresaban las variantes de STING. A diferencia del cGAMP sintético, el producto cGAS pudo activar hSTINGREF y mSTINGR231A (FIG. 5C). Este experimento descartó un modelo en el que cGAS activaba hSTINGREF a través de una interacción física directa.

Por lo tanto, se lanzó la hipótesis de que el producto real de cGAS podría no ser un CDN canónico como se había propuesto anteriormente (Sun et al., Wu et al.). Se penó en la hipótesis de que cGAS podría producir un nuevo CDN con uno o varios enlaces de fosfodiéster de 2'-5' que serían capaces de estimular alelos de la variante de STING. Es importante destacar que tales CDN no canónicos serían de una masa idéntica a los CDN canónicos del enlace 3'-5' fosfodiéster y, por lo tanto, los dos productos no habrían sido fáciles de distinguir por análisis espectrométricos de masas publicados previamente del producto cGAS (Sun et al., Wu et al.) Para probar esta hipótesis se proporcionaron a32P-GTP o a32P-ATP radiomarcados a cGAS purificados recombinados o DncV de V. cholerae y los productos fueron analizados por cromatografía de capa fina. Como se describió anteriormente, DncV produjo algunos c-di-AMP si se proporcionaba sólo ATP, y algunos c-di-GMP si se proporcionaba sólo GTP, pero se prefirió hacer cGAMP cuando se proporcionaban ATP y GTP (Davies, et al., Cell (2012)149: 358). (FIG. 6A). Curiosamente, cGAS requería ambos sustratos de ATP y gTp y el producto resultante migraba insignificantemente de manera diferente a cualquiera de los CDN canónicos producidos por DncV, lo que sugirió que cGAS producía un nuevo CDN no canónico (FIG. 6A).

Los productos cGAS y DncV fueron analizados por digestión específica de nucleasas. El producto cGAS fue parcialmente cortado por la nucleasa P1, que digiere selectivamente los enlaces fosfodiéster de 3'-5', lo que sugiere que el producto cGAS contiene al menos un enlace fosfodiéster de 3'-5' (FIG. 6B). Sin embargo, la digestión de la nucleasa P1 fue incompleta, ya que no condujo a la generación de GMP, en oposición al tratamiento del producto cGAS con la fosfodiesterasa de veneno de serpiente, que dividió tanto los enlaces 2'-5' y 3'-5' del fosfodiéster (FIG.

3B). Esto sugiere que el producto cGAS contiene un enlace fosfodiéster de 2'-5'.

Se ha propuesto que los CDN pudieran ser útiles como adyuvantes de vacunas o inmunoterapias (Chen, et al., Vaccine (2010) 28:3080). Un activador sintético STING, DMXAA, ha sido probado en ensayos clínicos en humanos como un nuevo agente quimioterapéutico. Desafortunadamente, DMXAA no se encontró que era eficaz en los seres humanos, probablemente porque era incapaz de estimular el hSTING (Conlon et al.). En este contexto, los resultados de los inventores son significativos ya que indican que los CDN unidos no canónicos de 2'-5' funcionan como potentes pan-agonistas de diversas variantes STING, incluidas aquellas variantes que sólo responden mal a los CDN canónicos o DMXAA.

II. Materiales y métodos:

A. Ratones y líneas celulares

Se cultivaron células THP-1 en RPMI 1640 suplementado con 10% de FBS, penicilina-estreptomicina y L-glutamina. Se cultivaron células HEK293T en DMEM suplementado con 10% de FBS, penicilina-estreptomicina y L-glutamina. Se mantuvieron líneas celulares de empaquetamiento retroviral de Gp2 en DMEM suplementado con 10% de FBS, penicilina-estreptomicina y L-glutamina. Los protocolos de animales fueron aprobados por la Universidad de California, Berkeley Animal Care and Use Committee.

B. Inactivación de STING

La inactivación de STING humano (ID del clon NM_198282.1-901s1c1) se logró utilizando pLKO.1 (The RNAi Consortium). La secuencia para la inactivación de STING humano es de 5' - GCA GAG CTA TtT CCT TCC ACA (SEQ ID NO:07) lo que corresponde a 5'- CCG GGC AGA GCT ATT TCC TTC CAC ACT CGA GTG TGG AAG GAA ATA GCT CTG CTT TTT G (SEQ ID NO:08) oligo directo y 5'- AAT TCA AAA AGC AGA GCT ATT TCC TTC CAC ACT CGA GTG TGG AAG GAA ATA GCT CTG C (SEQ ID NO:09) oligo inverso. Los oligos fueron recocidos y clonados en pLKO.1 digerido con Agel y EcoRI (Addgene) y fueron transducidos con retrovirales en células THP-1 en paralelo con construcciones de control de shRNA revuelto. Las líneas celulares estables se seleccionaron con puromicina. Las células THP-1 se diferenciaron con 1 pg/ml de PMA durante 24 horas. A las células se les dejó reposar durante 24 horas y luego se volvieron a estimular durante 6 horas con los ligandos indicados. La inducción de IFN se midió por qRT-PCR como se describe a continuación.

C. Estimulación celular y reactivos

Los macrófagos de médula ósea y las células HEK293T se estimularon utilizando Lipofectamina 2000 (Invitrogen). A menos que se especifique lo contrario, se prepara DNA cíclico-di-GMP, cíclico-di-AMP, polil:C y 70mer de Virus Vaccinia como se ha descrito anteriormente (Burdette et al.) y se utiliza a concentraciones similares. El virus Sendai fue comprado en Charles River Laboratories. cGAMP fue sintetizado como se describe anteriormente (Kellenberger et al).

D. Clonación, mutagénesis y plásmidos

El alelo THP-1 STING fue amplificado de cDNA usando 5' hSTING HindIII(5' - ATCGAA GCT TCC ACC ATG CCC CAC TCC AGC CTG) (SEQ ID NO:10) y 3' hSTING Notl (5' - ATC GGC GGC CGC TCA GGC GGC ATA GTC AGG CAC GTC ATA ATA AGA AGA GAA ATC CGT GCG GAG AG) (SEQ ID NO:11). El producto PCR resultante se clonó en pCDNA3 utilizando la digestión Hindlll/Notl. THP-1 STING se amplificó y clonó en MSCV2.2 utilizando la imprimación de 3' enumerada anteriormente y 5' hSTING Xhol (5' - ATC g Ct CgA GCC ACC ATG CCC CAC TCC ^a G^c CTG)(SEQ ID NO:12) y digestión con Xhol/Notl. Se utilizaron plásmidos de IFN-luciferasa, TKRenilla y STING de ratón como se ha descrito anteriormente (Burdette et al.). Se introdujeron mutaciones en STING humano utilizando el Kit de Mutagénesis Dirigida al Sitio Quikchange (Stratagene). Los clones de cDNA correspondientes a cGAS de ratón y humanos (cDNA de MB21D1 Totalmente Secuenciado Humano de MGC, N° de entrada: BC108714.1, Clon ID: 6015929; cDNA de E330016A19Rik totalmente secuenciado de Ratón EST, N° de entrada: BC145653.1, Clon ID: 40130956) se obtuvieron de Open Biosystems y corresponden a los descritos anteriormente (Sun et al., Wu et al.). El cGAS del ratón se amplificó a partir de clones de cDNA con un marcador flag N-terminal con oligo directo 5'-mcGAS-KpnI (5'-ATC GGG TAC CCC ACC ATG GAT TAC GAT GAC GAT GAC AAG GAA GAT CCG C C AGT AGA AGG) (SEQ ID NO:13) y oligo inverso 3'-mcGAS-Notl (5'-ATC GGC GGC CGC TCA AAG CTT GTC AAA AAT TGG) (SEQ ID NO:14). Del mismo modo, hcGAS se amplificó con oligo directo 5'-hcGAS-flag-Kpnl (5'-ATC GGG TAC CCC ACC ATG GAT TAC AAG GAT GAC GAT GAC AAG CAG CCT TGG CAC GGA AAG G) (SEQ ID NO:15) e inverso 3'- hcGAS-NotI (5'ATC GGC GGC CGC TCA AAA TTC ATC AAA AAC TGG AAA C)(SEQ ID NO:16). Ambos productos de la PCR fueron clonados en pcDNA3 en sitios de enzimas de restricción de Kpnl y Notl. DncV se amplió utilizando DncV fwd BamHI (5' - GCA TGG ATC CGC CAC CAT GAC TTG GAA CTT TCA CCA G) (SEQ ID NO:17) y DncV rev Notl (5' - GCA TGC GGC CGC TCA GCC ACT TAC CAT TGT GCT GC)(SEQ ID NO:18) y fue clonado en pCDNA3 utilizando BamHI y Notl. Para la clonación en MSCV2.2, DncV se amplificó utilizando DncV fwd Xhol (5' - GCA TCT CGA GCC ACC ATG ACT TGG AAC TTT CAC CAG) (SEQ ID NO:19) y DncV rev Notl. El DNA resultante fue clonado en MSCV 2.2 digerido con Xhol/Notl. Las construcciones para la sobreexpresión bacteriana de mcGAS se construyeron de la siguiente manera. El marcador N termina1His6-SUMO amplificado por PCR utilizando His6 SUMO Nco (5' - TAA TAA GGA GAT ATA CCA TGG GCA GCA GCC) (SEQ ID NO:20) y His6 SUMO Sal (5' - GAA TTC GTC GAC ACC AAT CTG TTC TCT GTG AGC)(SEQ ID NO:21) fuera de la plantilla pCDF-Duet2 (donación del laboratorio M. Rape, UC-Berkeley) y clonado en pET28a usando Ncol y SalI para hacer pET28a-H6SUMo. El mcGAS de longitud completa fue amplificado por PCR a partir del clon cDNA de ratón descrito anteriormente usando mcGAS fwd Sal (5' - GAT GTC GAC ATG GAA GAT CCG CGT AGA AGG ACG)(SEQ ID NO:22) y mcGAS rev Xho (5' - ATC CTC GAG TCA AAG CTT GTC AAA AAT TGG AAA CC) (SEQ ID NO:23) y fue clonado en pET28a-H6SUMo usando SalI y Xhol para hacer pET28a-H6SUMO-mcGAS que expresa mcGAS de longitud completa fusionados a un marcador N-terminal His6 SUMO.

E. Purificaciones de proteínas

La construcción WspR (pQE-WspR*) fue una generosa donación de Steve Lory (Harvard). La purificación WspR y las reacciones de síntesis c-di-GMP se llevaron a cabo como se describió anteriormente (Merighi, et al., Mol Microbiol (2007)65: 876). J. Mekalanos proporcionó cepas de sobreexpresión y plásmidos para DncV y el mutante de DncV. La proteína DncV fue sobreexpresada y purificada como se describió anteriormente (Davies et al.). Brevemente, la producción de proteínas DncV se indujo en fase de registro medio durante 3h a 37°C con 1 mM de IPTG. Las células fueron sometidas a liofiliación y la proteína DncV fue purificada en condiciones de desnaturalizado. El lisado separado fue incubado con Ni-NTA y eluido en tampón de elución de urea (Urea 2M, Tris 10 mM pH=8.0, NaCl 150 mM, Imidazol 250 mM). La proteína eluida fue dializada en Tris-Cl 25 mM, pH=7.5, NaCl 300 mM, Mg(OAc⁾² 5 mM, 10% de glicerol, TDT 2 mM. H6SUMO-mcGAS se expresó en células de pLysS Rosetta(DE3) por inducción nocturna con 0,5 mM de IPTG a 18°C. Las células se convirtieron en lisados en Tris-Cl 50 mM, pH=8, NaCl 300 mM, Imidazol 20 mM, BME 5 mM y PMSF 0,2 mM por French Press. El lisado separado fue incubado con Ni-NTA y la proteína unida fue eluida con Tris-Cl 20 mM, pH=7,4, NaCl 150 mM, Imidazol 300 mM. El eluente fue dializado a Tris-Cl 20 mM, pH=7,4, NaCl 150 mM, p-mercaptoetanol 5 mM con 10% de glicerol. La proteína se congeló rápidamente y se almacenó a -80°C.

F. Purificación de productos cGAS y caracterización estructural

El producto cGAS fue purificado usando HPLC de fase inversa en un aparato de HPLC Agilent 1260 Infinity equipado con una columna C18-A Agilent Polaris (5 |um, 250 mm x 10 mm, 180 Á). Las condiciones de purificación incluyen un gradiente del 100% al 0% del disolvente A durante 20 min a 50°C y un caudal de 5 ml/min, donde el disolvente A es 100 mM de acetato de amonio en agua y el disolvente B es acetonitrilo. Las fracciones de elución purificadas se evaporaron varias veces con el fin de eliminar el exceso de amoníaco. Las asignaciones de picos de la resonancia se realizaron utilizando COSY, 1H-13C HSQC, NOESY, 1H-13C HMBC y 1H-31P HMBC. Caracterización del producto cGAS: 1H NMR (900 MHz, D²O, 50°C, 5): 8,44 (1H, s), 8,42 (1H, s), 8,03 (1H, s), 6,31 (1H, s), 6,09 (1H, J = 8 Hz, d), 5,75 (1H, m), 5,18 (1H, m), 4,93 (1H, s), 4,74, 4,62, 4,59 (1H, J = 12 Hz, d), 4,55 (1H, s), 4,38 (1H, m), 4,33 (1H, J = 12 Hz, d), 4,28 (1H, J = 12 Hz, d); 31P {1H desacoplado} RMN (600 MHz, D²O, 50°C, 5): (todas las resonancias son singletes) -0,96, -1,86; HRMS (m/z): [M-H]- masa monoisótópica calculada para C²⁰H²⁴N¹⁰O¹³P² , 673,0927; encontrado, 673,0909. [M+Na 2H]- masa monoisótópica calculada para C²⁰H²⁴N¹⁰O¹³P² , 695,0752; encontrado, 695,0728.

G. Ensayo de Luciferasa

Las células HEK293T fueron colocadas en placas de 96 pocillos tratadas con TC a 0,5%-%106%células%ml-1. Al día siguiente, las células fueron transfectadas con las construcciones indicadas, junto con las construcciones de la luciferasa de luciérnaga de IFN-p y la luciferasa de TKRenilla. Después de la estimulación durante 6 h con los ligandos indicados, las células fueron lisadas en tampón de lisis pasiva (Promega) durante 5 min a 25°C. Los lisados celulares fueron incubados con sustrato de luciferasa de luciérnaga (Biossynth) y el sustrato de Renilla de luciferasa coelenterazina (Biotium), y la luminiscencia se midió en un lector de microplacas SpectraMax L (Molecular Devices). La expresión Ifnb relativa se calculó como la luminiscencia de la luciérnaga en relación con la luminiscencia de Renilla.

H. Síntesis in vitro del dinucleótido cíclico

Las reacciones in vitro de DncV se llevaron a cabo en Tris-Cl 20 mM, pH=8, Mg(OAc)² 20 mM, 10% de glicerol y TDT 1 mM, 0,1 mg/mL de BSA. Las reacciones contenían 250 |uM de GTP, 250 |uM de At P o 125 |uM de GTP y 125 |uM de ATP como se indica en las figuras. Además, se incluyeron a32P-GTP 33 nM (3000Ci/mmol, Perkin-Elmer) o a32P-ATP 33nM (3000Ci/mmol, Perkin-Elmer) en la reacción cuando se indica. Las reacciones se iniciaron mediante la adición de proteína DncV purificada 1 |uM. Las reacciones in vitro de cGAS se llevaron a cabo en Tris-Cl 40 mM, pH=7,5, NaCl 100 mM, MgCb 10 mM. El nucleótido en frío y el GTP marcado con alfa se encuentran a las mismas concentraciones que en las reacciones de DncV. Las reacciones se iniciaron mediante la adición de cGAS purificado 200 nM. Cuando se indicaba, se añadía DNA de testículos de arenque (Sigma) a las reacciones a una concentración final de 0,1 mg/ml. Las reacciones WspR se realizaron como se describe anteriormente (14). Las reacciones se incubaron durante 1 hora a 37°C, se hirvieron durante 5 minutos a 95°C y se centrifugaron durante 10 minutos a 13.000 rpm. Las reacciones se eliminaron y se mezclaron 1:5 con búfer de operación TLC (1:1,5 (v/v) saturado con NH⁴SO⁴ y KH² PO⁴1,5M, pH 3,6) y se corrieron en la placa TLC de PEIcelulosa (Sigma). Después de la migración de disolventes, la placa TLC se expuso a una pantalla de detección de fósforo y se tomó una imagen con escáner Typhoon. Para la transfección in vitro del producto en células 293T, se amplificaron las reacciones, se omitió el nucleótido radiomarcado y la concentración de ATP y GTP se aumentó a 2 mM.

I. Digestiones con nucleasa

Se compraron Nucleasa P1 de Penicillium citrinum y fosfodiesterasa I de veneno de serpiente de Crotalus_adamanteus en Sigma. Las reacciones de síntesis in vitro de dinucleótido cíclico marcado con 32P-GTP se diluyeron 1:5 en cualquier tampón P1 (Tris-Cl 40 mM, pH=6, ZnCl² 2 mM) o tampón SVPD (Tris-Cl 40 mM, pH=8, MgCl² 10 mM) seguido de una digestión con 2,5 mU de nucleasa P1 o SVPD, respectivamente. Las digestiones se incubaron durante 45 minutos a 37°C y los productos del nucleótido fueron resueltos por TLC.

J. Datos de RMN

En el espectro HMBC de 1H-31P mostrado en la FIG. 6C, el núcleo de fósforo, P-11, está correlacionado con el protón de 2' ribosa (H-12) de guanosina, así como con los protones de metileno de 5' ribosa (H-10) y el protón de 4' ribosa (H-9) de adenosina. El otro núcleo de fósforo (P-22) está correlacionado con el protón de 3' ribosa (H-8) de adenosina, así como con los protones de metileno de 5' ribosa (H-21) y protones 4' ribosa (H-20) de guanosina. Por lo tanto, se determinó que la regioquímica de los enlaces de fosfodiéster era [G(2'-5')pA(3'-5')p]cíclica. Con el fin de asignar los picos anteriores, fue fundamental identificar con precisión los sistemas de espín de ribosa correspondientes a la guanosina y la adenosina, respectivamente. Los protones correspondientes a la nucleobase de adenina (H-2, H-5) y nucleobase de guanina (H-17) se asignaron respecto a los espectros de referencia para las nucleobases individuales, RMN de 1H-13C HMBC y 1H-13C HSQC (FⁱG. 7A y 7B). El experimento 1H-1H NOESY mostró interacciones a través del espacio entre H-5 y el protón ribosa de 3' (H-8), así como entre el protón de guanina H-17 y el protón de 1' ribosa (H-18) (FIG. 7D). Los protones restantes en los sistemas de espín de ribosa correspondientes se identificaron mediante 1H-1H COSY (FIG. 7C), y la multiplicidad 1H-13CHSQC editada (FIG. 7A y 7B), que distinguía los protones de metileno de 5', en particular (H-10 y H-21).

K. Síntesis de RNA, DNAc y RT-PCR cuantitativa

El RNA de las líneas celulares de mamíferos se extrajo utilizando reactivo Trizol (Invitrogen) o el Mini Kit RNeasy (Qiagen). El RNA fue tratado con DNasa sin RNase RQ1 (Promega). El RNA fue transcrito inversamente con Superscript III (Invitrogen). Se cuantificó ifnB de ratón en relación con el rps17 de ratón como se ha descrito anteriormente (Woodward et al). El ifnB humano se cuantificó en relación con el S9 humano como se ha descrito anteriormente (Wu et al).

Los ejemplos anteriores se limitan a ilustrar los principios de la invención. Se apreciará que los expertos en la técnica podrán idear diversas disposiciones que, aunque no se describen o muestran explícitamente en este documento, representan los principios de la invención. Por lo tanto, el alcance de la presente invención no pretende limitarse a las realizaciones ejemplares que se muestran y describen en el presente documento, sino que más bien el alcance de la presente invención se define por las reivindicaciones anexas.

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Un dinucleótido cíclico que comprende dos enlaces fosfodiéster 2'-5 'para su uso en el tratamiento de una enfermedad celular proliferativa que aumenta la producción de un interferón de tipo I (IFN) al aumentar el nivel de un enlace fosfodiéster 2'-5' que comprende al dinucleótido cíclico en la célula.

2. Un dinucleótido cíclico que comprende un enlace fosfodiéster 2'-5' y un enlace fosfodiéster 3'-5' para su uso en el tratamiento de una enfermedad celular proliferativa que aumenta la producción de un interferón de tipo I (IFN) aumentando el nivel de un enlace fosfodiéster 2'-5 'y 3'-5' que comprende el dinucleótido cíclico en la célula.

3. Un dinucleótido cíclico para su uso según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el dinucleótido cíclico comprende un nucleósido de guanosina.

4. Un dinucleótido cíclico para su uso según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el dinucleótido cíclico comprende un nucleósido de adenosina.

5. Un dinucleótido cíclico para su uso según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el dinucleótido cíclico comprende un nucleósido de adenosina y un nucleósido de guanosina.

6. Un dinucleótido cíclico para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la mayor producción de IFN proviene del interferón alfa o del interferón beta.

7. Un dinucleótido cíclico para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la célula está in vivo.

8. Un dinucleótido cíclico para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la célula es una célula de mamífero.

9. Un dinucleótido cíclico para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la célula de mamífero es una célula humana.

10. Un dinucleótido cíclico para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la enfermedad celular proliferativa es una enfermedad neoplásica.

11. Una composición que contiene un enlace fosfodiéster 2'-5' que contiene un dinucleótido cíclico y un vehículo farmacéuticamente aceptable en el que el dinucleótido cíclico contiene uno o más nucleósidos de adenosina o guanosina.

12. Una composición que contiene un enlace fosfodiéster 2'-5' y un enlace fosfodiéster 3'-5' que contiene un dinucleótido cíclico y un vehículo farmacéuticamente aceptable en el que el dinucleótido cíclico contiene un nucleósido de adenosina y guanosina.