ES2960535T3 - Constructos de oligonucleótidos y usos de los mismos - Google Patents

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Abstract

Se describen agonistas inmunoestimulantes del receptor tipo Toll 9 (TLR9) basados en oligodesoxinucleótidos. También se describen composiciones que comprenden los agonistas de TLR9, métodos para preparar los agonistas de TLR9 y métodos para usar los agonistas de TLR9 para tratar enfermedades, trastornos o afecciones inmunes, tales como infecciones virales o cáncer. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Constructos de oligonucleótidos y usos de los mismos
Referencia al listado de secuencias enviado electrónicamente
Esta solicitud contiene un listado de secuencias, que se envía electrónicamente a través de EFS-Web como un listado de secuencias con formato ASCII con un nombre de archivo “ 688097_119U1 Sequence Listing” , fecha de creación del 31 de octubre de 2018, y que tiene un tamaño de 11,3 KB. El listado de secuencias enviado a través de EFS-Web es parte de la especificación
Campo de la invención
La presente descripción se refiere a constructos de oligonucleótidos, composiciones que comprenden los constructos de oligonucleótidos, y métodos para preparar los constructos de oligonucleótidos. Los constructos de oligonucleótidos pueden actuar como moléculas inmunomoduladoras y, en particular, como agonistas del Receptor 9 tipo Toll (TLR9). Por consiguiente, la presente descripción se refiere también a constructos de oligonucleótidos como agonistas de TLR9, solos o junto con otros agentes, para su uso en métodos para tratar o prevenir enfermedades en las que la modulación de la actividad de TLR9 sería ventajosa, tales como enfermedades inmunitarias, trastornos o afecciones, infecciones virales, y cáncer.
Antecedentes
Los receptores tipo Toll (TLR) son una clase de proteínas del receptor de reconocimiento de patrones (PRR) que desempeñan un papel clave en la respuesta inmunitaria innata. Los TLR reconocen patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) a partir de patógenos microbianos, tales como bacterias, hongos, parásitos y virus, que pueden distinguirse de las moléculas huésped. Los TLR son proteínas que atraviesan la membrana que típicamente funcionan como dímeros y se expresan por células involucradas en la respuesta inmunitaria innata, incluidas las células dendríticas presentadoras de antígeno y los macrófagos fagocíticos.
Existen al menos diez miembros de la familia TLR humanos, TLR1 a TLR10, y al menos doce miembros de la familia TLR murinos, TLR1 a TLR9 y TLR11 a TLR13, cada uno de los cuales difiere en los tipos de antígenos que reconoce. Por ejemplo, TLR9 es un TLR de detección de nucleótidos que se activa mediante dinucleótidos de citosina-fosfatoguanosina (CpG) no metilados, en los que la citosina se enlaza a una guanosina mediante un enlace fosfodiéster o fosforotioato, en un ADN monocatenario o bicatenario, que incluye ADN viral.
La activación de los TLR conduce a una serie de eventos de señalización que dan como resultado la producción de interferones (IFN) de tipo I, citocinas inflamatorias y quimiocinas, y la inducción de respuestas inmunitarias. Finalmente, esta inflamación también activa el sistema inmunitario adaptativo, que después da como resultado el espacio libre de los patógenos invasores y las células infectadas.
El TLR9 se expresa en células B y células dendríticas plasmocitoides del sistema inmunitario. La unión del ADN que contiene CpG al TLR9 inicia una cascada de señalización corriente abajo que conduce a la activación de los factores de transcripción NF-<k>B, MAPK e IRF7, que finalmente da como resultado la inducción de inflamación rápida, caracterizada por una mayor expresión de varias interleucinas y citocinas (Yamamoto y Takeda, Gastroenterology Research and Practice, vol. 2010). En particular, la estimulación del TLR9 por los agonistas que contienen CpG da como resultado un aumento de la producción de IFN-a, TNF-a, IL-6 y/o IL-1, dependiendo de la clase de CpG.
El virus de la hepatitis B (VHB) es un virus de ADN bicatenario (ADNbc) que causa enfermedades que incluyen hepatitis B, fibrosis, cirrosis, y carcinoma hepatocelular. Aproximadamente dos mil millones de personas están infectadas con VHB, y casi 400 millones de personas tienen infección crónica por hepatitis B (VHB crónico), caracterizada por virus persistentes y partículas de subvirus en la sangre durante más de 6 meses (Xu y col., 2014, Gastrointest Tumors, 1(3): 135-145). El VHB crónico se trata actualmente con IFN-a y análogos de nucleósidos o nucleótidos, pero no hay una cura final debido a la persistencia del ADN circular cerrado covalentemente (ADNccc) en hepatocitos infectados. El ADNccc retenido desempeña un papel continuo como plantilla para los ARN virales y nuevos viriones. Se considera que inducir respuestas de células B específicas de virus a través de la estimulación de la trayectoria de señalización de t LR9 en las células B usando oligodesoxirribonucleótidos CpG sintéticos (CpG ODN) puede eliminar efectivamente los hepatocitos portadores de ADNccc (Isogawa y col., 2005, J. Virology 79(11) 7269-7272).
La evidencia sustancial indica que la inmunoterapia es una estrategia factible y efectiva para el tratamiento de numerosos tipos de cánceres. Los ligandos que se dirigen a los receptores tipo Toll y otras trayectorias de reconocimiento innato representan una potente estrategia para modular la inmunidad innata para generar inmunidad antitumoral. Los agonistas de TLR están bajo investigación actualmente como adyuvantes de vacunas en terapias contra el cáncer por su capacidad para activar células inmunitarias y promover la inflamación (véase, p. ej., Kaczanowska y col., J Leukoc Biol, junio de 2013; 93(6): 847-863 y referencias en el mismo). Por ejemplo, se informó que además de prolongar su supervivencia de células T CD4+ y suprimir la actividad TReg, los ligandos TLR9 aumentan los números de células T CD4+ y CD8+ aumentando la producción de IL-2 y la expresión de IL-2R(Id.y referencias en los mismos). Se ha demostrado que la estimulación con ODN-CpG de TLR9 en líneas celulares de neuroblastoma disminuye la proliferación celular y aumenta la apoptosis dependiente de caspasa, lo que da como resultado una mayor supervivencia de ratones portadores de tumores(Id.)Sin embargo, también se informó que el acoplamiento de los TLR en las células tumorales puede promover el crecimiento tumoral contribuyendo al mantenimiento de un medio ambiente inflamado crónicamente, lo que induce la proliferación de células cancerosas, y promueve la supervivencia celular. Por ejemplo, se informó que el cáncer de mama humano y las células de carcinoma gástrico que expresan TLR9 tienen una capacidad invasiva mejorada como resultado de la mayor secreción de MMP13 y COX-2 sobre la estimulación de TLR9 en el cultivo de tejidos, mientras que en el caso del glioma, a pesar de sus propiedades inductoras de metástasis, TLR9 no tuvo efecto en la proliferación celular, destacando los diversos efectos que la señalización de TLR9 puede tener en diferentes tipos de células tumorales (Id.).
Las estrategias usadas para facilitar el suministroin vivode oligonucleótidos terapéuticos incluyen la modificación química del oligonucleótido, el uso de nanoportadores lipídicos, que enlaza el oligonucleótido a los agentes dirigidos a receptores y el uso de moléculas pequeñas para potenciar la efectividad del oligonucleótido. Sin embargo, los sistemas de suministro de nanopartículas pueden tener un rango limitado de aplicaciones terapéuticas debido a su incapacidad para acceder a la mayoría de los tejidos y potenciales problemas de toxicidad. Además, a diferencia de antisentido o ARNpi, los agonistas de oligonucleótidos que contienen CpG funcionan mediante la unión directa al TLR9. El impedimento estérico debe evitarse cuando se diseña el conjugado de los agonistas de oligonucleótidos que contienen CpG con moléculas de suministro, tales como el colesterol.
BRANDON KWONG ET AL (“ Induction of potent anti-tumor responses while eliminating systemic side effects via liposome-anchored combinatorial immunotherapy” , BIOMATERIALS, vol. 32, no. 22, 28 de marzo de 2011, páginas 5134-5147) describe los constructos de lípidos-CpG que tienen un efecto inmunoestimulador en el tratamiento de tumores dirigidos a TLR9 para inmunoterapia.
Por lo tanto, permanece la necesidad de agentes terapéuticos efectivos que puedan tratar o prevenir efectivamente enfermedades en las que la modulación de la actividad de TLR9 sería ventajosa, tal como infecciones crónicas por VHB y cánceres.
Resumen
La presente descripción satisface la necesidad de agentes terapéuticos efectivos que puedan tratar o prevenir efectivamente enfermedades en las que la modulación de la actividad de TLR9 sería ventajosa al proporcionar constructos basados en oligodesoxinucleótido (ODN) que estimulan una respuesta inmunitaria a través de la unión y activación de TLR9. La presente descripción también se dirige al uso de estos constructos de ODN, solos o en combinación con otros agentes, para tratar o prevenir enfermedades en las que la modulación de la actividad de TLR9 sería ventajosa, tales como enfermedades inmunitarias, trastornos o afecciones, que incluyen infecciones virales o cánceres.
Los constructos de ODN de la presente descripción comprenden oligodesoxinucleótidos CpG conjugados, a través de enlazadores, hasta restos lipídicos.
El diseño de los constructos de ODN incluye, p. ej., el número y el posicionamiento de motivos de citosina-guanina (CpG) y sus enlaces internucleótidos, así como la estructura y ubicación de los restos lipídicos y la presencia o ausencia de un enlazador. Los restos lipídicos pueden incluir moléculas lipídicas, tales como colesterol y tocoferol, que se conjugan con el constructo de ODN. Además, los constructos de ODN comprenden enlaces internucleótidos de fosfodiéster dentro de uno o más motivos CpG del oligonucleótido.
Se ha demostrado que los constructos de ODN según las realizaciones de la presente descripción logran un nivel inesperado de biodisponibilidad y eficacia mejoradas como agonistas de TLR9. Si bien no desea limitarse a ninguna teoría en particular, la actividad agonista de TLR9 potenciada puede disminuir o eliminar efectivamente los hepatocitos portadores de ADNccc de VHB estimulando la reexpresión de virus latente mientras estimula el sistema inmunitario para reconocer los productos virales. En particular, el sistema inmunitario no reconoce el virus del VHB en su estado latente y la inflamación de bajo nivel inducida por los constructos de ODN descritos puede hacer que el virus emerja de esa latencia. La reexpresión de VHB resultante y la formación de productos de expresión viral recientemente formados son reconocidos después por el sistema inmunitario activado para controlar el virus circulante y matar las células infectadas, eliminando efectivamente los hepatocitos portadores de ADNccc de VHB.
Los constructos de ODN descritos según las realizaciones de la presente descripción también pueden usarse para tratar tumores, preferiblemente cánceres, tales como cáncer colorrectal. Los constructos de CpG ODN descritos inducen inmunidad contra las células tumoralesin vivoy aumento de la supervivencia de ratones portadores de tumores.
En un aspecto general según la reivindicación 1, la presente descripción se refiere a un constructo de CpG ODN que tiene una fórmula de:
(A)
Fórmula (IIa): 5' M-L-[CpG ODN] 3',
o
Fórmula (IIb): 5' [CpG ODN]-L-M 3' en donde:
M representa un resto lipídico, preferiblemente el resto lipídico comprende al menos un resto lipídico seleccionado del grupo que consiste en colesterol, tocoferol, un grupo palmitoilo y un grupo estearilo;
L representa un enlazador que comprende al menos 1 átomo, opcionalmente 10-100 átomos, seleccionado del grupo que consiste en carbono, nitrógeno, oxígeno, hidrógeno, azufre y fósforo, en donde L se enlaza covalentemente al CpG ODN a través de un enlace escindible, preferiblemente a través de un éster o un enlace amida; y
CpG ODN comprende al menos un motivo CpG que tiene un enlace internucleótido po, preferiblemente comprende al menos dos, tres o cuatro motivos CpG cada uno tiene la unión internucleótida po;
opcionalmente, el constructo de CpG ODN de Fórmula (IIa) o (nb) se conjuga además covalentemente con un resto de direccionamiento, que se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en galactosa, N-acetilgalactosamina (GalNAc), fucosa, manosa, ácido siálico, ácido N-acetilneuramínico; o
(B)
Fórmula (IIIa): 5' Ml -Yl -(((CH2)2O)m-X)n-Y2-[CpG ODN]-Y<3>-M<2>3', o Fórmula (IIIb): 5' M<2>-Y<3>-[CpG ODN]-Y<2>-(((CH<2>)<2>O)m-X)n-Y i -M i 3'
en donde:
Mi representa un resto lipídico, preferiblemente el resto lipídico comprende al menos uno seleccionado del grupo que consiste en colesterol, tocoferol, un grupo palmitoilo, y un grupo estearilo,
M2 representa un resto lipídico, un resto de direccionamiento, o está ausente,
Yi es un enlace o un enlazador, preferiblemente etilenglicol que tiene la fórmula ((CH2)2O)o, en donde o es 1-15, enlazado covalentemente a (((CH2)2O)m-X)n a través de un enlace fosfodiéster (po), un enlace fosforotioato (ps) o un enlace, X es independientemente un enlace, un enlace po o un enlace ps,
cada uno de Y2 y Y3 es independientemente un enlace escindible, preferiblemente comprende un éster o un enlace amida, con mayor preferencia comprende un enlace po o un enlace fosforamidato, con máxima preferencia un enlace po, siempre que cuando M2 esté ausente, Y3 esté ausente,
CpG ODN comprende al menos un motivo CpG que tiene un enlace internucleótido po, preferiblemente comprende al menos dos, tres o cuatro motivos CpG cada uno tiene la unión internucleótida po;
m es un número entero del 1 al 15,
n es un número entero del 1 al 5; y
en donde CpG ODN comprende una secuencia de polinucleótidos que tiene al menos 90 % de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:
(1) 5' TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 3' (Id. de sec. n.°: 1); o
(6) 5' TCGTCGTTACGTAACGACGACGTT 3' (Id. de sec. n.°: 6).
También se describen, pero no se reivindican actualmente en la presente descripción, constructos de CpG ODN que tienen un resto lipídico enlazado a un CpG ODN a través de un enlazador. El constructo de CpG ODN puede tener una fórmula de:
Fórmula I: 5' M1-L i-[CpG ODN]-L2-M23',
en donde:
cada uno de Mi y M2 representa independientemente un resto lipídico, preferiblemente el resto lipídico comprende al menos uno seleccionado del grupo que consiste en colesterol, tocoferol, un grupo palmitoilo y un grupo estearilo, opcionalmente uno de M1 y M2 está ausente;
cada uno de L1 y L2 independientemente representa un enlazador, preferiblemente el enlazador comprende al menos 10 átomos seleccionados del grupo que consiste en carbono, nitrógeno, oxígeno, hidrógeno, azufre y fósforo, y L se enlaza covalentemente al CpG ODN a través de un enlace escindible, preferiblemente a través de un éster o un enlace amida, opcionalmente uno de L1 y L2 está ausente cuando el M1 o M2 respectivo está ausente; y preferiblemente, CpG ODN comprende al menos un motivo CpG que tiene un enlace internucleótido fosfodiéster (po); opcionalmente, el constructo de CpG ODN de Fórmula (I) se conjuga además covalentemente con un resto de direccionamiento, que se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en galactosa, N-acetilgalactosamina (GalNAc), fucosa, manosa, ácido siálico, ácido N-acetilneuramínico.
También se describe, pero no se reivindica actualmente en la presente descripción, un constructo de CpG ODN que tiene una fórmula de:
Fórmula (IIa): 5' M-L-[CpG ODN] 3',
o
Fórmula (IIb): 5' [CpG ODN]-L-M 3'
en donde:
M representa un resto lipídico, preferiblemente el resto lipídico comprende al menos uno seleccionado del grupo que consiste en colesterol, tocoferol, un grupo palmitoilo, y un grupo estearilo,
L representa un enlazador que comprende al menos 10 átomos seleccionados del grupo que consiste en carbono, nitrógeno, oxígeno, hidrógeno, azufre y fósforo, en donde L se enlaza covalentemente al CpG ODN a través de un enlace escindible, preferiblemente a través de un éster o un enlace amida; y
CpG ODN comprende al menos un motivo CpG que tiene un enlace internucleótido po, preferiblemente comprende al menos dos, tres o cuatro motivos CpG cada uno tiene la unión internucleótida po;
opcionalmente, el constructo de CpG ODN de Fórmula (IIa) o (nb) se conjuga además covalentemente con un resto de direccionamiento, que se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en galactosa, N-acetilgalactosamina (GalNAc), fucosa, manosa, ácido siálico, ácido N-acetilneuramínico.
En una realización, el enlazador L en la Fórmula (IIa) o (nb) comprende -((CH<2>)<2>O)m-X)n-, en donde m es un número entero de 1 a 15, X es independientemente un enlace fosfodiéster (po) o fosforotioato (ps), y n es un número entero de 1 a 5. En otra realización, el enlazador L en la Fórmula (IIa) o (IIb) se enlaza al resto lipídico M a través de un enlace fosfodiéster (po) o un enlace fosforotioato (ps).
En aún otra realización, el enlazador L en la Fórmula (IIa) o (IIb) se enlaza al CpG ODN a través de un enlace fosfodiéster (po) o un enlace fosforamidato, preferiblemente un enlace po.
También se describe, pero no se reivindica actualmente en la presente descripción, un constructo de ODN que tiene una estructura de:
Fórmula (IIIa): 5' M1-Y1-(((CH2)2O)m-X)n-Y2-[CpG ODN]-Y3-M23', o
Fórmula (IIIb): 5' M2-Y3-[CpG ODN]-Y2-(((CH2)2O)m-X)n-Y1-M13' en donde:
M1 representa un resto lipídico, preferiblemente el resto lipídico comprende al menos uno seleccionado del grupo que consiste en colesterol, tocoferol, un grupo palmitoilo, y un grupo estearilo,
M2 representa un resto lipídico, un resto de direccionamiento, o está ausente,
Yi es un enlace o un enlazador, preferiblemente etilenglicol que tiene la fórmula ((CH2)2O)o, en donde o es 1-15, enlazado covalentemente a (((CH2)2O)m-X)n a través de un enlace fosfodiéster (po), un enlace fosforotioato (ps) o un enlace, X es independientemente un enlace, un enlace po o un enlace ps,
cada uno de Y2 y Y3 es independientemente un enlace escindible, preferiblemente comprende un éster o un enlace amida, con mayor preferencia comprende un enlace po o un enlace fosforamidato, con máxima preferencia un enlace po, siempre que cuando M2 esté ausente, Y3 esté ausente,
CpG ODN comprende al menos un motivo CpG que tiene un enlace internucleótido po, preferiblemente comprende al menos dos, tres o cuatro motivos CpG cada uno tiene la unión internucleótida po;
m es un número entero del 1 al 15, y
n es un número entero del 1 al 5.
En una realización, la presente descripción se refiere a un constructo de CpG ODN que tiene una fórmula de:
Fórmula (IVa): 5' M-Y1-(((CH2)2O)m-X)n-Y2-[CpG ODN] 3', o
Fórmula (IVb): 5' [CpG ODN]-Y2-(((CH2)2O)m-X)n-Y1-M 3' en donde:
M representa un resto lipídico, preferiblemente el resto lipídico comprende al menos uno seleccionado del grupo que consiste en colesterol, tocoferol, un grupo palmitoilo, y un grupo estearilo,
Y<1>es un enlace o un enlazador, preferiblemente etilenglicol que tiene la fórmula ((CH<2>)<2>O)o, en donde o es 1-15, enlazado covalentemente a (((CH<2>)<2>O)m-X)n a través de un enlace fosfodiéster (po), un enlace fosforotioato (ps) o un enlace, X es independientemente un enlace, un enlace fosfodiéster (po) o un enlace fosforotioato (ps),
Y<2>es un enlace escindible, preferiblemente comprende un éster o un enlace amida, con mayor preferencia comprende un enlace po o un enlace fosforamidato, con máxima preferencia un enlace po;
CpG ODN comprende al menos un motivo CpG que tiene un enlace internucleótido po, preferiblemente comprende al menos dos, tres o cuatro motivos CpG cada uno tiene la unión internucleótida po;
m es un número entero del 1 al 15, preferiblemente 6; y
n es un número entero del 1 al 5, preferiblemente 2;
opcionalmente, el constructo de CpG ODN de la Fórmula (IVa) o (IVb) se conjuga covalentemente con un resto de direccionamiento, que se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en galactosa, N-acetilgalactosamina (GalNAc), fucosa, manosa, ácido siálico, ácido N-acetil neuramínico.
Según realizaciones particulares, el resto lipídico representa un colesterol, tocoferol o un grupo palmitoilo.
Según realizaciones particulares, el CpG ODN en cada una de las Fórmulas (I) a (IVb) tiene uno o más enlaces internucleótidos de fosforotioato (ps). Según un aspecto más particular, todos los enlaces internucleótidos del constructo de ODN en la Fórmula (I) son enlaces fosforotioato (ps). Según un aspecto particular, al menos uno de los enlaces internucleótidos entre la C y G de un dinucleótido CpG en el constructo de ODN es un enlace internucleótido de fosforotioato (ps) estereodefinido. Según un aspecto particular, al menos uno de los enlaces internucleótidos entre la C y G de un dinucleótido CpG en el CpG ODN es un enlace internucleótido fosfodiéster (po), y cada uno de los enlaces internucleótidos restantes del CpG ODN son enlaces fosforotioato (ps). Según un aspecto particular, el CpG ODN tiene una longitud de 19 a 24 nucleótidos.
En otro aspecto general según la reivindicación 12, la presente descripción se refiere a una composición farmacéutica que comprende un constructo de ODN de la presente descripción y un portador farmacéuticamente aceptable. En otro aspecto general según la reivindicación 13, la presente descripción se refiere a un método para preparar una composición farmacéutica de la presente descripción, que comprende combinar un constructo de o Dn de la presente descripción con un portador farmacéuticamente aceptable.
También se describe, pero no se reivindica actualmente en la presente descripción un método para estimular una respuesta inmunitaria en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto una composición farmacéutica de la presente descripción.
En otro aspecto general según la reivindicación 15, la presente descripción se refiere a una composición farmacéutica para su uso en un método de tratamiento del virus de la Hepatitis B (VHB) o cáncer.
También se describe, pero no se reivindica actualmente en la presente descripción un método para tratar una enfermedad en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto la composición farmacéutica de la presente descripción. Preferentemente, la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en enfermedades inmunológicas, trastornos o afecciones, tales como infecciones virales o cánceres. Más preferiblemente, la enfermedad es infección crónica por VHB o un cáncer de tumor sólido.
Otros aspectos, características y ventajas de la presente descripción resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción, incluida la descripción detallada presente y sus realizaciones preferidas y las reivindicaciones adjuntas.
Breve descripción de las figuras
El resumen anterior, así como la siguiente descripción detallada de la presente descripción, se entenderán mejor cuando se leen junto con los dibujos adjuntos. Debe entenderse que la presente descripción no se limita a las realizaciones precisas mostradas en los dibujos.
En los dibujos:
la Figura 1 muestra la activación de TLR9 de una línea celular indicadora, medida por el nivel de OD630, por agonistas de TLR9 que tienen motivos CpG enlazados a fosfodiéster en diversas posiciones;
la Figura 2 muestra la activación de TLR9 de una línea celular indicadora, medida por el nivel de OD630, mediante constructos de ODN según realizaciones de la presente descripción que comprenden motivos CpG enlazados a fosfodiéster conjugados con colesterol por un enlazador escindible;
la Figura 3 muestra la activación de TLR9 humano (panel izquierdo) y de ratón (panel derecho) en líneas celulares indicadoras, normalizadas al ODN2006, mediante constructos de ODN según realizaciones de la presente descripción;
la Figura 4 muestra una inducciónin vivode citocinas en ratones (IL-6, panel izquierdo; panel medio, TNF-a; panel derecho, MIP-1p) mediante constructos de ODN según las realizaciones de la presente descripción a las 4 h después de la administración de los constructos de ODN;
la Figura 5 muestra un esquema de un experimento llevado a cabo para analizar el efecto de los constructos de ODN según realizaciones de la presente descripción sobre la infección por VHB en ratones;
la Figura 6 muestra los niveles de ADN de VHB en ratones tras el tratamiento con una dosis única (panel izquierdo) o dosis múltiples (panel derecho) de constructos de ODN según las realizaciones de la presente descripción;
la Figura 7 muestra los niveles de HBsAg en ratones tras el tratamiento con una dosis única (panel izquierdo) o dosis múltiples (panel derecho) de constructos de ODN según las realizaciones de la presente descripción;
la Figura 8 muestra los niveles de HBeAg en ratones tras el tratamiento con una dosis única (panel izquierdo) o dosis múltiples (panel derecho) de constructos de ODN de la presente descripción;
la Figura 9 muestra una inducción invivode citocinas (panel izquierdo, IL- 12p40; panel medio, IL-6; panel derecho, MIP-1p) en ratones mediante inyección subcutánea de constructos de ODN de la presente descripción;
la Figura 10 muestra una inducción invivode citocinas (panel izquierdo, IL- 12p40; panel medio, IL-6; panel derecho, MIP-1p) en ratones mediante inyección intravenosa de un constructo de ODN de la presente descripción denominada AG8;
la Figura 11 muestra el nivel de IgG específica de HBsAg en el día 14 de los ratones dosificados por vía intravenosa (IV) o subcutánea (SC) con HBsAg y un constructo de ODN;
la Figura 12 ilustra constructos de ODN ejemplares según realizaciones de la presente descripción;
la Figura 13A muestra los niveles de HBsAg, anticuerpo anti-HB, y ADN de VHB en ratones AAV-VHB tras la administración subcutánea de AG9, un constructo de<o>D<n>según una realización de la presente descripción;
la Figura 13B muestra los niveles de HBsAg, anticuerpo anti-HB, y ADN de VHB en ratones AAV-VHB tras la administración intravenosa de AG9;
la Figura 13C muestra los niveles de HBsAg, anticuerpo anti-HB y ADN de VHB en ratones AAV-VHB tras la administración intravenosa de AG19, un constructo de ODN según una realización de la presente descripción; la Figura 13D muestra los niveles de células T específicas de HBsAg en ratones AAV-VHB tras la administración de constructos de ODN según las realizaciones de la presente descripción;
la Figura 14 muestra un esquemático de un estudio de eficacia piloto con un constructo de ODN según las realizaciones de la presente descripción dosificado por vía intratumoral (IT) e intravenosa (IV) en ratones portadores de tumor MC-38 (modelo de cáncer colorrectal);
la Figura 15 muestra el volumen tumoral en ratones C57BL/6 sin tratamiento previo implantado con células de carcinoma de colon MC-38 después de dosificarse por vía intravenosa con cantidades crecientes de constructos de ODN según las realizaciones de la presente descripción, en particular,
la Figura 15A muestra el volumen tumoral en los ratones dosificados por vía intravenosa con el constructo de ODN AG1; la Figura 15B muestra el volumen tumoral en los ratones dosificados por vía intravenosa con el constructo de ODN AG9; y la Figura 15C muestra el volumen tumoral en los ratones dosificados por vía intravenosa con el constructo de ODN AG17; la Figura 16 muestra una esquemática de un estudio de dosis máxima tolerada (MTD)/eficacia con un constructo de ODN según una realización de la presente descripción en ratones portadores de tumor MC-38;
la Figura 17 ilustra una esquemática de síntesis para constructos de ODN según realizaciones de la presente descripción; la Figura 18 muestra los niveles de CD40 en células B purificadas a partir de esplenocitos de ratón aislados de ratones C57BL/6 y estimulados con constructos de ODN según las realizaciones de la presente descripción; la Figura 19 muestra la activación del TLR9 humano en una línea celular indicadora, normalizada a ProMune, mediante constructos de ODN según realizaciones de la presente descripción;
la Figura 20 muestra la activación de TLR9 de ratón, normalizada al ODN1826, mediante constructos de ODN según realizaciones de la presente descripción;
la Figura 21A muestra que la administración subcutánea (SC) de AG21 (AG9 conjugado con AlexaFluor-647) a ratones dio como resultado la acumulación de oligo en los ganglios linfáticos de drenaje de los ratones en comparación con el AG20 (AG1 conjugado con AlexaFluor 647);
la Figura 21B muestra que la administración intravenosa (IV) de AG21 a ratones dio como resultado la acumulación de oligo en el bazo de los ratones en comparación con AG20;
la Figura 22A muestra que el tocoferol podría facilitar la unión del CpG ODN a proteínas séricas tales como albúmina sérica bovina (BSA);
la Figura 22B demuestra que conjugar el CpG ODN con palmitoilo facilitó la interacción del ODN a proteínas séricas dentro de suero fetal bovino (FBS); y
la Figura 23 demuestra que la conjugación de tocoferol del CpG ODN impartió la propiedad de formación de micelas en el ODN.
Descripción detallada
Se citan o describen diversas publicaciones, artículos y patentes en los antecedentes y en toda la memoria descriptiva. La discusión de documentos, actos, materiales, dispositivos, artículos o lo similar que se han incluido en la presente memoria descriptiva es con el fin de proporcionar el contexto para la presente descripción. Tal discusión no es una admisión de que cualquiera o todos estos asuntos forman parte de la técnica anterior con respecto a cualesquier invenciones descritas o reivindicadas.
Definiciones
Salvo que se defina de cualquier otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente descripción tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece la presente descripción. De cualquier otra manera, ciertos términos usados en la presente descripción tienen los significados que se establecen en la memoria descriptiva. Debe observarse que, como se usa en la presente descripción y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “ un” , “ uno/una” y “ el/la” incluyen una referencia plural salvo que el contexto indique claramente de cualquier otra manera.
A lo largo de esta memoria descriptiva y las reivindicaciones que siguen, salvo que el contexto requiera de cualquier otra manera, la palabra “ comprende” y variaciones tales como “ comprende” y “ que comprende” , se entenderán que implica la inclusión de un número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas establecidos, pero no la exclusión de cualquier otro número entero o etapa o grupo de número entero o etapa. Cuando se usa en la presente descripción, el término “ que comprende” puede sustituirse con el término “ que contiene” o “ que incluye” o a veces cuando se usa en la presente descripción con el término “ que tiene” .
Cuando se usa en la presente descripción, “ que consiste en” excluye cualquier elemento, etapa, o ingrediente no especificado en el elemento de la reivindicación. Cuando se usa en la presente descripción, “ que consiste esencialmente en” no excluye los materiales o etapas que no afectan materialmente las características básicas y novedosas de la reivindicación. Cualquiera de los términos mencionados anteriormente de “ que comprende” , “ que contiene” , “ que incluye” y “ que tiene” , siempre que se use en la presente descripción en el contexto de un aspecto o realización de la invención puede reemplazarse por el término “ que consiste en” o “ que consiste esencialmente en” para variar los alcances de la descripción.
Como se usa en la presente descripción, el término “TLR9” o “ receptor de tipo Toll 9” , también conocido como CD289, UNQ5798 o PRO19605, se refiere a un TLR de detección de nucleótidos que se activa por dinucleótidos de citosina-fosfatoguanina (CpG) no metilados. Los ejemplos de TLR9 incluyen, pero no se limitan a, un TLR9 humano que es una proteína de 1032 aminoácidos de longitud codificada por un transcrito de ARNm de 3922 nucleótidos de longitud (NM_017442,3). La secuencia de aminoácidos del TLR9 humano ejemplificado se representa en el acceso de GenBank núm. NP_059138,1. Como se usa en la presente descripción, el término “TLR9” incluye homólogos de TLR9 de especies distintas de seres humanos, tales como MacacaFascicularis(mono cinomolgo) oPan troglodytes(chimpancé). Como se usa en la presente descripción, el término “TLR9” incluye proteínas que comprenden mutaciones, p. ej., mutaciones puntuales, fragmentos, inserciones, deleciones y variantes de corte y empalme de TLR9 de tipo salvaje de longitud completa. El término “TLR9” también abarca modificaciones postranslacionales de la secuencia de aminoácidos de TLR9.
Como se usa en la presente descripción, el término “ agonista” se refiere a una molécula que se une a uno o más TLR e induce una respuesta mediada por el receptor. Por ejemplo, un agonista puede inducir, estimular, aumentar, activar, facilitar, mejorar, o regular la actividad del receptor. Tales actividades se denominan “ actividades agonísticas” Por ejemplo, un agonista de TLR9 puede activar o aumentar la señalización celular a través del receptor unido. Los agonistas incluyen, pero no se limitan a, ácidos nucleicos, moléculas pequeñas, proteínas, carbohidratos, lípidos o cualquier otra molécula que se unan o interactúen con los receptores. Los agonistas pueden imitar la actividad de un ligando receptor natural. Los agonistas pueden ser homólogos a estos ligandos de receptores naturales con respecto a la secuencia, conformación, carga u otras características de tal manera que puedan ser reconocidos por los receptores. Este reconocimiento puede dar como resultado cambios fisiológicos y/o bioquímicos dentro de la célula, de tal manera que la célula reaccione a la presencia del agonista de la misma manera que si estuviera presente el ligando receptor natural. Como se usa en la presente descripción, el término “agonista de TLR9” se refiere a cualquier compuesto que actúe como un agonista de TLR9.
Como se usa en la presente descripción, los términos “ inducir” y “ estimular” y variaciones de los mismos se refieren a cualquier aumento medible en la actividad celular. La inducción de una actividad celular mediada por TLR9 puede incluir, por ejemplo, activación, proliferación o maduración de una población de células inmunitarias, aumentando la producción de una citocina y/u otro indicador de la función inmunitaria aumentada. En ciertas realizaciones, la inducción de una respuesta inmunitaria puede incluir aumentar la proliferación de células B, producir anticuerpos específicos de antígeno, aumentar la proliferación de células T específicas de antígeno, mejorar la presentación de antígenos de células dendríticas y/o una expresión creciente de ciertas citocinas, quimiocinas y marcadores coestimuladores.
Como se usa en la presente descripción, un “ resto lipídico” se refiere a un resto que contiene una estructura lipofílica. Los restos lipídicos, tales como un grupo alquilo, un ácido graso, un triglicérido, diglicérido, esteroide, esfingolípido, glicolípido o un fosfolípido. Por ejemplo, un resto lipídico puede incluir un esterol tal como colesterol, un anillo de cromanol metilado con una cadena lateral hidrófoba metilada tal como tocoferol, o un ácido graso saturado tal como ácido palmítico o un éster del mismo. Los restos lipídicos cuando se unen a moléculas altamente hidrófilas, tales como ácidos nucleicos, pueden mejorar sustancialmente la unión de la proteína plasmática y por consiguiente la vida media de circulación de las moléculas hidrófilas. Además, se ha demostrado que la unión a ciertas proteínas plasmáticas, tales como lipoproteínas, aumenta la absorción en tejidos específicos que expresan los receptores de lipoproteínas correspondientes (receptor HDL de receptor de LDL o el receptor eliminador SR-B1). Véase, p. ej., Bijsterbosch, M. K., y col. (2000) Nucleic Acids Res. 28, 2717-25; Wolfrum, C., y col. (2007) Nat Biotechnol 25:1149-5725.
También puede usarse un resto lipídico en combinación con un resto de direccionamiento para mejorar el tráfico intracelular del enfoque de suministro dirigido. El resto de direccionamiento puede ser cualquier resto o ligando adecuado unido directa o indirectamente a un CpG ODN de la presente descripción que pueda dirigir el constructo de ODN a objetivos invivotales como macromoléculas (p. ej., receptores), células (p. ej., macrófagos, células dendríticas, hepatocitos, células tumorales) o componentes de los mismos. Por consiguiente, un resto de direccionamiento puede incluir cualquier molécula de origen natural o sintética adecuada tales como lípidos, derivados de ácido lipídico, galactosa, N-acetilgalactosamina (GalNAc), fucosa, mañosa, ácido siálico, ácido N-acetil neuramínico, anticuerpos, liposomas, micelas, dendrímeros, nanoesferas, nanocápsulas, péptidos, proteínas, albúmina y hormonas.
Como se usa en la presente descripción, el término “ enlazador” se refiere a un resto químico que une un nucleótido, tal como el nucleótido terminal 5' o 3' de un CpG ODN, a un resto lipídico o un resto de direccionamiento. El término “ enlazador escindible” se refiere a un enlazador o porción del mismo que experimenta escisión para eliminar el resto lipídico o el resto de direccionamiento del nucleótido cuando se desee en ciertas condiciones sin alterar el nucleótido o la molécula de ácido nucleico a la que se enlaza. Dependiendo de la naturaleza del enlace, la escisión puede lograrsein vitroo invivo,por ejemplo, mediante tratamiento con ácido o base (p. ej., de hidrazona), por escisión enzimática (p. ej., nucleasas o proteasas), por oxidación o reducción del enlace (p. ej., de puentes disulfuro), mediante tratamiento con luz (p. ej., por fotoblanqueo). Según realizaciones particulares, el enlazador comprende cualquier enlazador escindible flexible. Los enlazadores incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, un enlace covalente, un alquilo sustituido o no sustituido, un heteroalquilo sustituido o no sustituido tal como polietilenglicol (PEG), uno, dos o tres grupos abásicos y/o ribitol, restos de etilenglicol, o un péptido. Según las realizaciones de la presente descripción, el enlazador se une covalentemente al CpG ODN a través de un enlace escindible, tal como un enlace fosfodiéster (po), enlace fosforamidato (np) o fosforotioato (ps), preferiblemente mediante un éster o un enlace amida, tal como un enlace po o un enlace np, con máxima preferencia un enlace po. Según las realizaciones de la presente descripción, el enlazador comprende etilenglicol que tiene la fórmula ((CH<2>)<2>O)o, en donde o es 1-15, unida covalentemente al CpG ODN a través de un enlace po, np, o ps.
En una realización, el enlace escindible tal como un enlace po es escindible por una enzima fosfodiesterasa, tal como, p. ej., un nucleótido cíclico fosfodiesterasa, fosfolipasas C, fosfolipasas D, autotaxina, esfingomielina fosfodiesterasa, DNasa, RNasa, o una endonucleasa de restricción.
Según las realizaciones de la presente descripción, un enlazador comprende ((CH<2>)<2>O)m, en donde m es un número entero de 1 a 15, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15. Según realizaciones particulares, el enlazador comprende uno o más restos de hexaetilenglicol (HEG) que tienen la siguiente fórmula molecular: ((CH<2>)<2>O)<6>.
En una realización, el enlazador comprende uno o más restos HEG enlazados por uno o más enlaces fosfodiéster (po) o fosforotioato (ps). En una realización, el enlazador comprende un resto HEG enlazado al CpG ODN a través de un enlace po. En una realización, el enlazador comprende dos restos HEG enlazados por un enlace po y al CpG ODN a través de un enlace po.
Según otras realizaciones, el enlazador comprende un grupo disulfuro escindible. Según otras realizaciones, el enlazador comprende un péptido escindible por proteasa, tal como, por ejemplo, un enlazador peptídico que comprende un sitio de escisión para una proteasa específica para un microambiente tumoral, tal como uPA, legumaína, matriptasa, o catepsina.
Según las realizaciones de la invención, un resto lipídico (M), tal como un colesterol, tocoferol, un grupo palmitoilo, o un grupo estearilo, puede enlazarse covalentemente a CpG ODN a través de un enlazador. El enlazador puede comprender uno o más restos enlazadores tales como un etilenglicol que tiene la fórmula ((CH<2>)<2>O)m, donde m es 1-15. En las realizaciones, m es 6 y el resto enlazador es un hexaetilenglicol (HEG).
Según las realizaciones de la invención, un resto lipídico (M), tal como un colesterol, tocoferol, un grupo palmitoilo, o un grupo estearilo, puede enlazarse covalentemente a un resto HEG directamente mediante un enlace, o indirectamente a través de un segundo enlazador, tal como un enlazador que comprende etilenglicol que tiene la fórmula ((CH<2>)<2>O)o, en donde o es 1-15. El segundo enlazador puede unirse covalentemente a la HEG a través de un enlace, un enlace fosfodiéster (po), un enlace fosforamidato (np) o un enlace fosforotioato (ps).
Cada resto de enlazador puede unirse independientemente a los otros restos de enlazadores mediante un enlace tal como un enlace seleccionado del grupo que consiste en un enlace fosfodiéster (po), un enlace fosforamidato (np) o un enlace fosforotioato (ps). El enlazador puede unirse además al CpG ODN a través de un enlace escindible tal como un enlace escindible seleccionado del grupo que consiste en un enlace fosfodiéster (po), un enlace fosforamidato (np) y un enlace fosforotioato (ps). En realizaciones, el enlazador comprende un resto de enlazador entre el resto lipídico y CpG ODN. En realizaciones, el enlazador comprende dos restos de enlazadores entre el resto lipídico y CpG ODN. En las realizaciones, cada resto de enlazador se une a al menos otro resto de enlazador a través de un enlace po. En las realizaciones, cada resto de enlazador se une a al menos otro resto de enlazador a través de un enlace ps. En las realizaciones, cada resto de enlazador se une a al menos otro resto de enlazador a través de un enlace np. En las realizaciones, el resto de enlazador se enlaza covalentemente al resto lipídico mediante un segundo enlazador, tal como un enlazador que comprende etilenglicol que tiene la fórmula ((CH<2>)<2>O)o, en donde o es 1-15, y el segundo enlazador se alinea covalentemente con el resto lipídico mediante un enlace, un enlace fosfodiéster (po), un enlace fosforamidato (np) o un enlace fosforotioato (ps). En las realizaciones, el enlazador comprende dos restos de enlazadores unidos por un enlace po entre el resto lipídico y CpG ODN. En las realizaciones, el enlazador comprende dos restos de enlazadores unidos por un enlace ps entre el resto lipídico y CpG ODN. En las realizaciones, el enlazador comprende dos restos de enlazadores unidos por un enlace np entre el resto lipídico y CpG ODN.
El resto lipídico (M) puede unirse al enlazador a través de un enlace o enlace tal como un enlace seleccionado del grupo que consiste en un enlace fosfodiéster (po), un enlace fosforamidato (np) o un enlace fosforotioato (ps). Como se usa en la presente descripción, “ M-po(HEG)” o “ (HEG)po-M” significa que el resto lipídico M se enlaza covalentemente al resto HEG directamente a través de un enlace fosfodiéster (po), o indirectamente a través de un segundo enlazador, tal como un enlazador que comprende etilenglicol que tiene la fórmula ((CH<2>)<2>O)o, en donde o es 1-15, y el segundo enlazador se enlaza covalentemente al resto HEG a través de un enlace fosfodiéster (po). Por ejemplo, como se usa en la presente descripción, “Toco-ps(HEG)” puede referirse a un grupo tocoferol enlazado covalentemente a CpG ODN a través de un segundo enlazador tal como etilenglicol que tiene la fórmula ((CH<2>)<2>O)o, en donde o es 1-15, que se enlaza covalentemente a un resto HEG a través de un enlace fosfodiéster (po).
Como se usa en la presente descripción, M-ps(HEG)” o “ (HEG)ps-M” significa que el resto lipídico M se enlaza covalentemente al resto HEG directamente mediante un enlace fosforotioato (ps), o indirectamente a través de un segundo enlazador, tal como un enlazador que comprende etilenglicol que tiene la fórmula ((CH<2>)<2>O)o, en donde o es 1-15, y el segundo enlazador se enlaza covalentemente al resto HEG mediante un enlace fosforotioato (ps). Por ejemplo, como se usa en la presente descripción, “Toco-ps(HEG)” puede referirse a un grupo tocoferol enlazado covalentemente a CpG ODN a través de un segundo enlazador tal como etilenglicol que tiene la fórmula ((CH<2>)<2>O)o, en donde o es 1-15, que se enlaza covalentemente a un resto HEG mediante un enlace fosforotioato (ps).
Como se usa en la presente descripción, el término “ CpG” o “ motivo CpG” se refiere a una secuencia de dinucleótidos que contiene citosina-guanina no metilada (es decir, una citosina (C) seguida de una guanina (G), es decir, 5 “ -CG-3” ) enlazada por un enlace fosfato o una cadena principal que contiene fósforo tal como un enlace fosfodiéster (po).
Como se usa en la presente descripción, “ oligonucleótido” , “ oligodesoxinucleótido” u “ ODN” se refiere a un polinucleótido formado a partir de una pluralidad de unidades de nucleótidos enlazadas. Tales oligonucleótidos pueden obtenerse a partir de fuentes de ácido nucleico existentes o pueden producirse mediante métodos sintéticos. En algunas realizaciones, cada uno de los oligonucleótidos tiene de aproximadamente 5 a aproximadamente 30 residuos de nucleótidos, preferiblemente de aproximadamente 10 a aproximadamente 25 residuos de nucleótidos, más preferiblemente de aproximadamente 19 a aproximadamente 24 residuos de nucleótidos. En una realización, el ODN contiene 19 residuos de nucleótidos. En una realización, el ODN contiene 20 residuos de nucleótidos. En una realización, el ODN contiene 21 residuos de nucleótidos. En una realización, el ODN contiene 22 residuos de nucleótidos. En una realización, el ODN contiene 23 residuos de nucleótidos. En una realización, el ODN contiene 24 residuos de nucleótidos. Los ODN de la presente descripción pueden obtenerse a partir de fuentes de ácido nucleico existentes (p. ej., genómica o ADNc) pero son preferiblemente sintéticas (p. ej., producidas por síntesis de oligonucleótidos).
Como se usa en la presente descripción, “ nucleótido” incluye cualquier nucleótido nativo o natural, que incluye una base nitrogenada seleccionada del grupo que consiste en adenina (a), timidina (T), citosina (C), guanina (G) y uracilo (U), un azúcar de desoxirribosa, y un grupo fosfato. Los nucleótidos ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, bases de nucleótidos naturales, p. ej., adenina, guanina, citosina, uracilo, y timina.
Como se usa en la presente descripción, los términos “ oligonucleótido CpG” , “ oligodesoxinucleótido CpG” y “ CpG ODN” se usan indistintamente y se refieren a un oligonucleótido que comprende al menos un motivo CpG. Los CpG ODN de la presente descripción pueden incluir una o más clases de CpG ODN, tales como un ODN de clase A, clase B, clase C o clase P, como se describe en Bode y col., 2011, Expert Rev Vaccines, 10(4): 499-511. Los CpG ODN de clase A, también denominados tipo D, contienen un motivo palindrómico que contiene CpG central y motivos de poli-G en los extremos 5' y/o 3'. Los CpG ODN de clase B, también denominados tipo K, típicamente están completamente estabilizados por una cadena principal de fosforotioato completa e incluyen uno o más dinucleótidos CpG dentro de ciertos contextos de base preferidos. Los CpG ODN de clase C típicamente están completamente estabilizados por una cadena principal de fosforotioato completa e incluyen un motivo CpG palindrómico central así como otros dinucleótidos CpG. Los CpG ODN de clase P típicamente están completamente estabilizados por una cadena principal de fosforotioato completa e incluyen dos palindromos y múltiples dinucleótidos CpG.
Como se usa en la presente descripción, el término “ enlace internucleótido” se refiere a un enlace químico para unir dos nucleótidos adyacentes a través de sus azúcares que consisten en un átomo de fósforo y un grupo cargado o neutro entre nucleósidos adyacentes. Los ejemplos de enlaces internucleótidos incluyen fosfodiéster (po), fosforotioato (ps), fosforamidato (np), fosforoditioato (ps2), metilfosfonato (mp), y metilfosforotioato (rp). El fosforotioato, fosforamidato, fosforoditioato, metilfosfonato y metilfosforotioato son enlaces internucleótidos estabilizadores, mientras que el fosfodiéster es un enlace internucleótido natural.
Los fosforotioatos oligonucleótidos se sintetizan típicamente como una mezcla racémica aleatoria de enlaces de fosforotioato Rp y Sp. Sin embargo, según realizaciones particulares, los enlaces fosforotioato de los constructos de ODN descritos contienen una mezcla de enlaces fosforotioato Rp y Sp. Según realizaciones particulares, el CpG ODN del constructo de ODN tiene un enlace internucleótido ps estereodefinido, es decir, el enlace ps es Rp o Sp en al menos el 75 %, tal como al menos el 80 %, o al menos el 85 %, o al menos el 90 %, o al menos el 95 %, tal como al menos el 99 % de las moléculas oligonucleótidas presentes en el CpG ODN.
Según realizaciones particulares, uno a cuatro, preferiblemente tres o cuatro, de los dinucleótidos CpG en el CpG ODN cada uno tiene un enlace internucleótido fosfodiéster (po), y cada uno de los enlaces internucleótidos restantes del CpG ODN son enlaces internucleótidos de fosforotioato. En las realizaciones, cada uno de los dinucleótidos CpG en el CpG ODN tiene un enlace internucleótido fosfodiéster (po), y cada uno de los nucleótidos restantes en el CpG ODN tiene un enlace internucleótido de fosforotioato (ps).
Como se usa en la presente descripción, el término “ portador” se refiere a cualquier excipiente, diluyente, carga, sal, regulador, estabilizador, solubilizante, aceite, lípido, vesícula que contiene lípidos, microesfera, encapsulación liposomal u otro material bien conocido en la técnica para su uso en formulaciones farmacéuticas. Se entenderá que las características del portador, excipiente o diluyente dependerán de la vía de administración para una aplicación particular. Como se usa en la presente descripción, el término “ portador farmacéuticamente aceptable” se refiere a un material no tóxico que no interfiere con la efectividad de una composición según la presente descripción o la actividad biológica de una composición según la presente descripción. Según realizaciones particulares, en vista de la presente descripción, puede usarse cualquier portador farmacéuticamente aceptable adecuado para su uso en una composición farmacéutica agonista basada en CpG ODN en la presente descripción.
Como se usa en la presente memoria, el término “ sujeto” se refiere a un animal. Según realizaciones particulares, el sujeto es un mamífero que incluye un no primate (p. ej., un camello, burro, cebra, vaca, cerdo, caballo, cabra, oveja, gato, perro, rata, conejo, cobaya o ratón) o un primate (p. ej., un mono, chimpancé, o ser humano). En realizaciones particulares, el sujeto es un ser humano.
Como se usa en la presente descripción, el término “cantidad terapéuticamente efectiva” se refiere a una cantidad de un ingrediente activo o componente que provoca la respuesta biológica o medicinal deseada en un sujeto. Una cantidad terapéuticamente efectiva puede determinarse empíricamente y de manera rutinaria, en relación con el propósito indicado. Por ejemplo, pueden emplearse opcionalmente ensayos in vitro para ayudar a identificar intervalos de dosificación óptimos. La selección de una dosis efectiva particular puede determinarse (p. ej., mediante ensayos clínicos) por los expertos en la técnica basándose en la consideración de varios factores, que incluyen la enfermedad a tratar o prevenir, los síntomas implicados, la masa corporal del paciente, el estado inmunitario del paciente y otros factores conocidos por el experto en la técnica. La dosis precisa que se va a emplear en la formulación también dependerá de la vía de administración y la gravedad de la enfermedad, y debe decidirse según el criterio del médico y las circunstancias de cada paciente. Las dosis efectivas pueden extrapolarse a partir de curvas de dosis-respuesta derivadas de sistemas de prueba de modelos animales o in vitro.
Como se usa en la presente descripción, los términos “tratar” , “ tratado” y “ tratamiento” pretenden referirse a una mejora o reversión de al menos un parámetro físico medible relacionado con una enfermedad en la que la modulación de la actividad de TLR9 sería ventajosa, tal como una enfermedad, trastorno o afección inmunitaria, que no es necesariamente discernible en el sujeto, pero puede ser discernible en el sujeto. Los términos “ tratar” , “ tratando” y “ tratamiento” también pueden referirse a causar regresión, prevenir la progresión, o al menos ralentizar la progresión de la enfermedad, trastorno, o afección. En una realización particular, “tratar” , “ tratando” y “ tratamiento” se refieren a un alivio, prevención del desarrollo o inicio, o reducción en la duración de uno o más síntomas asociados con la enfermedad en la que la modulación de la actividad de TLR9 sería ventajosa tal como una enfermedad, trastorno, o afección inmunitaria, que incluye una infección viral o un cáncer. En una realización particular, “ tratar” , “ tratando” y “ tratamiento” se refieren a la prevención de la recurrencia de la enfermedad, trastorno, o afección. En una realización particular, “ tratar” , “ tratar” y “tratamiento” se refieren a un aumento en la supervivencia de un sujeto que tiene la enfermedad, trastorno, o afección. En una realización particular, “tratar” , “ tratar” y “ tratamiento” se refieren a la eliminación de la enfermedad, trastorno o afección en el sujeto.
Como se usa en la presente descripción, una “ enfermedad en la que la modulación de la actividad de TLR9 sería ventajosa” incluyen enfermedades en las que la estimulación de la señalización de TLR9 sería ventajosa para el sujeto. Por ejemplo, una enfermedad en la que la modulación de la actividad de TLR9 sería ventajosa puede incluir enfermedades inmunitarias, trastornos o afecciones. Según realizaciones particulares, la enfermedad, trastorno o afección a tratar es un cáncer, una enfermedad, trastorno o afección inflamatoria, una enfermedad, trastorno o afección autoinmune, o una enfermedad, trastorno o afección causada por un patógeno, tal como una infección viral.
Según realizaciones particulares, la infección viral es un virus de ARN o ADN tal como adenovirus, citomegalovirus, virus de la hepatitis A (VHA), hepadnavirus que incluyen VHB, VHB crónico, flavivirus que incluyen virus de la fiebre amarilla, heppacivirus que incluyen virus de la hepatitis C (VHC), herpes simple tipo 1 y 2, herpes zóster, herpesvirus humano 6, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus del papiloma humano (VPH), virus de la influenza a, virus de la influenza B, sarampión, virus de la parainfluenza, pestivirus, poliovirus, poxvirus, rinovirus, coronovirus, virus respiratorio sincitial (VRS), múltiples familias de virus que causan fiebres hemorrágicas, incluidos los arenavirus, los bunyavirus y los filovirus, y un rango de encefalitis víricas causadas por virus ARN y ADN.
Según realizaciones particulares, el cáncer o tumor es un tumor sólido o cáncer de sangre. Según realizaciones particulares, el cáncer o tumor es un carcinoma, sarcoma, melanoma, linfoma, o leucemia. Según realizaciones particulares, el cáncer o tumor es un carcinoma, un sarcoma, una leucemia, o un cáncer causado por un virus. Según realizaciones particulares, el cáncer es un carcinoma de mama, colon, vejiga, pulmón, próstata, estómago, o páncreas o una leucemia linfoblástica o mieloide.
Como se usa en la presente descripción, el término “ en combinación” , en el contexto de la administración de dos o más terapias a un sujeto, se refiere al uso de más de una terapia. El uso del término “ en combinación” no restringe el orden en que las terapias se administran a un sujeto o el tiempo entre dicha administración. Por ejemplo, una primera terapia (p. ej., una composición descrita en la presente descripción) puede administrarse antes (p. ej., 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 16 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 horas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas, o 12 semanas antes) concomitantemente con, o posterior a (p. ej., 5 minutos, 15 minutos antes), concomitantemente con, o posterior a (p. ej., 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 16 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 horas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas, o 12 semanas después), de la administración de una segunda terapia a un sujeto.
Constructos de ODN
En una realización, el constructo de CpG ODN tiene una fórmula de:
Fórmula I: 5' M1-L i-[CpG ODN]-L2-M23',
en donde:
cada uno de M1 y M2 representa independientemente un resto lipídico, preferiblemente el resto lipídico comprende al menos un resto lipídico seleccionado del grupo que consiste en colesterol, tocoferol, un grupo palmitoilo, y un grupo estearilo, opcionalmente uno de M1 y M2 está ausente;
cada uno de L1 y L2 independientemente representa un enlazador, preferiblemente el enlazador comprende al menos 10 átomos seleccionados del grupo que consiste en carbono, nitrógeno, oxígeno, hidrógeno, azufre y fósforo, y L se enlaza covalentemente al CpG ODN a través de un enlace escindible, preferiblemente a través de un éster o un enlace amida, opcionalmente uno de L1 y L2 está ausente cuando el M1 o M2 respectivo está ausente; y preferiblemente, CpG ODN comprende al menos un motivo CpG que tiene un enlace internucleótido fosfodiéster (po). En una realización, la presente descripción se refiere a un constructo de CpG ODN que tiene una fórmula de:
Fórmula (IIa): 5' M-L-[CpG ODN] 3',
o
Fórmula (IIb): 5' [CpG ODN]-L-M 3'
en donde:
M representa un resto lipídico, preferiblemente el resto lipídico comprende al menos uno seleccionado del grupo que consiste en colesterol, tocoferol, un grupo palmitoilo, y un grupo estearilo,
L representa un enlazador que comprende al menos 10 átomos seleccionados del grupo que consiste en carbono, nitrógeno, oxígeno, hidrógeno, azufre y fósforo, en donde L se enlaza covalentemente al CpG ODN a través de un enlace escindible, preferiblemente a través de un éster o un enlace amida; y
CpG ODN comprende al menos un motivo CpG que tiene un enlace internucleótido po internucleótido, preferiblemente comprende al menos dos, tres o cuatro motivos CpG cada uno que tiene el enlace internucleótido. Según aspectos particulares, el enlazador L comprende 5-100 átomos, más preferiblemente 20-80 átomos, 20-40 átomos o 30-60 átomos de longitud seleccionados del grupo que consiste en carbono, nitrógeno, oxígeno, hidrógeno, azufre y fósforo. Según aspectos particulares, el enlazador comprende un enlace fosfodiéster (po) o fosforotioato (ps), y comprende ((CH<2>)<2>O)m, en donde m es un número entero de 1 a 15, preferiblemente de 5 a 10, más preferiblemente de 6.
En una realización, el enlazador L en la Fórmula (IIa) o (nb) comprende -((CH<2>)<2>O)m-X)n-, en donde m es un número entero de 1 a 15, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15, X es independientemente un enlace fosfodiéster (po) o fosforotioato (ps), y n es un número entero de 1 a 5, tal como 1, 2, 3, 4, o 5.
En otra realización, el enlazador L en la Fórmula (IIa) o (IIb) se enlaza al resto lipídico M a través de un enlace fosfodiéster (po) o un enlace fosforotioato (ps).
En aún otra realización, el enlazador L en la Fórmula (IIa) o (IIb) se enlaza al CpG ODN a través de un enlace fosfodiéster (po) o un enlace fosforamidato, preferiblemente un enlace po.
En una realización, L es -Yi -(((CH2)2O)m-X)n-Y2 -; o L es -Y2-(((CH2)2O)m-X)n-Yi -, en donde,
Yi es un enlace o un enlazador, preferiblemente etilenglicol que tiene la fórmula ((CH2)2O)o, en donde o es 1-15, enlazado covalentemente (((CH2)2O)m-X)n a través de un enlace (po) fosfodiéster, un enlace fosforotioato (ps) o un enlace, Y2 es un enlace escindible que comprende un éster o un enlace amida;
cada X es independientemente un enlace, un enlace po o un enlace ps;
m es un número entero del 1 al 15; y
n es un número entero del 1 al 5.
En realizaciones, Y2 es un enlace po o un enlace np.
En otro aspecto, la presente descripción se refiere a un constructo de ODN que tiene una estructura de:
Fórmula (IIIa): 5' M1-Y1-((CH2)2O)m-X)n-Y2-[CpG ODN]-Ya-M23', o
Fórmula (IIIb): 5' M2-Ya-[CpG ODN]-Y2-(((CH2)2O)m-X)n-Y1-M13' en donde:
M1 representa un resto lipídico, preferiblemente el resto lipídico comprende al menos uno seleccionado del grupo que consiste en colesterol, tocoferol, un grupo palmitoilo, y un grupo estearilo,
M2 representa un resto lipídico, un resto de direccionamiento, o está ausente,
Y1 es un enlace o un enlazador, preferiblemente etilenglicol que tiene la fórmula ((CH2)2O)o, en donde o es 1-15, enlazado covalentemente a (((CH2)2O)m-X)n a través de un enlace fosfodiéster (po), un enlace fosforotioato (ps) o un enlace, X es independientemente un enlace, un enlace po o un enlace ps,
cada uno de Y2 y Y3 es independientemente un enlace escindible, preferiblemente comprende un éster o un enlace amida, con mayor preferencia comprende un enlace po o un enlace fosforamidato, con máxima preferencia un enlace po, siempre que cuando M2 esté ausente, Y3 esté ausente,
CpG ODN comprende al menos un motivo CpG que tiene un enlace internucleótido po internucleótido, preferiblemente comprende al menos dos, tres o cuatro motivos CpG cada uno que tiene un enlace internucleótido; m es un número entero del 1 al 15, y
n es un número entero del 1 al 5.
En una realización, la presente descripción se refiere a un constructo de CpG ODN que tiene una fórmula de:
Fórmula (IVa): 5' M-Y1-(((CH2)2O)m-X)n-Y2-[CpG ODN] 3', o
Fórmula (IVb): 5' [CpG ODN]-Y2-(((CH2)2O)m-X)n- Y1-M 3' en donde:
M representa un resto lipídico, preferiblemente el resto lipídico comprende al menos uno seleccionado del grupo que consiste en colesterol, tocoferol, un grupo palmitoilo, y un grupo estearilo,
Y1 es un enlace o un enlazador, preferiblemente 1-5 restos de etilenglicol, enlazados covalentemente a (((CH2)2O)m-X)n a través de un enlace fosfodiéster (po), un enlace fosforotioato (ps) o un enlace,
X es independientemente un enlace, un enlace fosfodiéster (po) o un enlace fosforotioato (ps),
Y2 es un enlace escindible, preferiblemente comprende un éster o un enlace amida, con mayor preferencia comprende un enlace po o un enlace fosforamidato, con máxima preferencia un enlace po;
CpG ODN comprende al menos un motivo CpG que tiene un enlace intemudeótido po, preferiblemente comprende al menos dos, tres o cuatro motivos CpG cada uno tiene la unión internudeótida po;
m es un número entero del 1 al 15, preferiblemente 6; y
n es un número entero del 1 al 5, preferiblemente 2;
opcionalmente, el constructo de CpG ODN de la Fórmula (IVa) o (IVb) se conjuga covalentemente con un resto de direccionamiento, que se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en galactosa, N-acetilgalactosamina (GalNAc), fucosa, manosa, ácido siálico, ácido N-acetil neuramínico.
Según una realización particular, X es independientemente un enlace fosfodiéster (po) o ausente, Y es un enlace po, M es 6, n es 2, M representa un resto lipídico que comprende un tocoferol o un grupo palmitoilo.
Según una realización particular, el constructo de ODN tiene una estructura seleccionada del grupo que consiste en:
5' M-po(HEG)po(HEG)po-[CpG ODN] 3';
5' M-ps(HEG)po(HEG)po-[CpG ODN] 3',
5' M-ps(BEG)ps(BEG)po-[CpG ODN] 3',
5' M-po(HEG)ps(HEG)po-[CpG ODN] 3',
5' [CpG ODN]-po(HEG)po(HEG)po-M 3',
5' [CpG ODN]-po(HEG)ps(HEG)po-M 3',
5' [CpG ODN]-po(HEG)po(HEG)ps-M 3',
y
5' [CpG ODN]-po(HEG)po(HEG)ps-M 3',
en donde:
M representa un resto lipídico que comprende al menos uno seleccionado del grupo que consiste en colesterol, tocoferol, un grupo palmitoilo, y un grupo estearilo;
po representa un enlace fosfodiéster;
HEG representa ((CH<2>)<2>O) 6;
ps representa un enlace fosforotioato; y
el CpG ODN comprende al menos un motivo CpG que tiene un enlace internucleótido po, preferiblemente comprende al menos dos, tres o cuatro motivos CpG que tienen cada uno el enlace internucleótido po, en donde M se enlaza covalentemente a (HEG) directamente a través de un enlace po o ps, o indirectamente a través de un segundo enlazador que se enlaza a (HEG) directamente a través de un enlace po o ps.
Según una realización particular, el constructo de ODN tiene una estructura seleccionada del grupo que consiste en: 5' Toco-po(HEG)po(HEG)po-[CpG ODN] 3', en donde Toco representa tocoferol,
5' Col-po(HEG)po(HEG)po-[CpG ODN] 3', en donde Col representa colesterol,
5' Palma-po(HEG)po(HEG)po-[CpG ODN] 3', en donde Palma representa un grupo palmitoilo,
5' [CpG ODN]-po(HEG)ps-Col 3', en donde Col representa colesterol,
5' [CpG ODN]-po(HEG)ps-Toco 3', en donde Toco representa tocoferol, y
5' [CpG ODN]-po(HEG)ps-Palma 3', en donde Palma representa un grupo palmitoilo,
en donde:
po representa un enlace fosfodiéster;
HEG representa ((CH<2>)<2>O) 6;
ps representa un enlace fosforotioato; y
el CpG ODN comprende al menos un motivo CpG que tiene un enlace internucleótido po, preferiblemente comprende al menos dos, tres o cuatro motivos CpG que tienen cada uno el enlace internucleótido po,
en donde el tocoferol, el colesterol, o el grupo palmitoilo se enlaza covalentemente al (HEG) directamente a través de un enlace po o ps, o indirectamente a través de un segundo enlazador que se enlaza a (HEG) directamente a través de un enlace po o ps.
En una realización, el CpG ODN contiene un número de dinucleótidos CpG adecuados para activar TLR9. En una realización, el CpG ODN contiene al menos un dinucleótido CpG. En una realización, el CpG ODN contiene al menos dos dinucleótidos CpG. En una realización, el CpG ODN contiene al menos tres dinucleótidos CpG. En una realización, el CpG ODN contiene al menos cuatro dinucleótidos CpG. En una realización, el CpG ODN contiene un dinucleótido CpG. En una realización, el CpG ODN contiene dos dinucleótidos CpG. En una realización, el CpG ODN contiene tres dinucleótidos CpG. En una realización, el CpG ODN contiene cuatro dinucleótidos CpG.
En una realización, los dinucleótidos CpG del CpG ODN se colocan dentro del CpG ODN para activar TLR9. En una realización, un primer dinucleótido CpG del CpG ODN se separa de un segundo dinucleótido CpG por al menos un nucleótido. En una realización, un primer dinucleótido CpG del CpG ODN se separa de un segundo dinucleótido CpG por al menos dos nucleótidos. En una realización, un primer dinucleótido CpG del CpG ODN se separa de un segundo dinucleótido CpG por al menos tres nucleótidos. En una realización, un primer dinucleótido CpG del CpG ODN se separa de un segundo dinucleótido CpG por al menos cuatro nucleótidos. En una realización, un primer dinucleótido CpG del CpG ODN se separa de un segundo dinucleótido CpG por al menos cinco nucleótidos. En una realización, un primer dinucleótido CpG del CpG ODN se separa de un segundo dinucleótido CpG por al menos seis nucleótidos. En una realización, un primer dinucleótido CpG del CpG ODN se separa de un segundo dinucleótido CpG por un nucleótido. En una realización, un primer dinucleótido CpG del CpG ODN se separa de un segundo dinucleótido CpG por dos nucleótidos. En una realización, un primer dinucleótido CpG del CpG ODN se separa de un segundo dinucleótido CpG por tres nucleótidos. En una realización, un primer dinucleótido CpG del CpG ODN se separa de un segundo dinucleótido CpG por cuatro nucleótidos. En una realización, un primer dinucleótido CpG del CpG ODN se separa de un segundo dinucleótido CpG por cinco nucleótidos. En una realización, un primer dinucleótido CpG del CpG ODN se separa de un segundo dinucleótido CpG por seis nucleótidos.
En una realización, un dinucleótido CpG se separa del extremo 3' del CpG ODN por al menos un nucleótido. En una realización, un dinucleótido CpG se separa del extremo 3' del CpG ODN por al menos dos nucleótidos. En una realización, un dinucleótido CpG se separa del extremo 3' del CpG ODN por al menos tres nucleótidos. En una realización, un dinucleótido CpG se separa del extremo 3' del CpG ODN por al menos cuatro nucleótidos. En una realización, un dinucleótido CpG se separa del extremo 3' del CpG ODN por al menos cinco nucleótidos. En una realización, un dinucleótido CpG se separa del extremo 3' del CpG ODN por un nucleótido. En una realización, un dinucleótido CpG se separa del extremo 3' del CpG ODN por dos nucleótidos. En una realización, un dinucleótido CpG se separa del extremo 3' del CpG ODN por tres nucleótidos. En una realización, un dinucleótido CpG se separa del extremo 3' del CpG ODN por cuatro nucleótidos. En una realización, un dinucleótido CpG se separa del extremo 3' del CpG ODN por cinco nucleótidos.
En una realización, un dinucleótido CpG se separa del extremo 5' del CpG ODN por al menos un nucleótido. En una realización, un dinucleótido CpG se separa del extremo 5' del CpG ODN por al menos dos nucleótidos. En una realización, un dinucleótido CpG se separa del extremo 5' del CpG ODN por al menos tres nucleótidos. En una realización, un dinucleótido CpG se separa del extremo 5' del CpG ODN por al menos cuatro nucleótidos. En una realización, un dinucleótido CpG se separa del extremo 5' del CpG ODN por al menos cinco nucleótidos. En una realización, un dinucleótido CpG se separa del extremo 5' del CpG ODN por un nucleótido. En una realización, un dinucleótido CpG se separa del extremo 5' del CpG ODN por dos nucleótidos. En una realización, un dinucleótido CpG se separa del extremo 5' del CpG ODN por tres nucleótidos. En una realización, un dinucleótido CpG se separa del extremo 5' del CpG ODN por cuatro nucleótidos. En una realización, un dinucleótido CpG se separa del extremo 5' del CpG ODN por cinco nucleótidos.
Según aspectos particulares, el CpG ODN del constructo de ODN tiene un enlace internucleótido fosforotioato (ps). Según aspectos particulares, el CpG ODN del constructo de ODN tiene un enlace internucleótido de fosforotioato (ps) estereodefinido. Según aspectos particulares, uno a cuatro, preferiblemente tres o cuatro de los dinucleótidos CpG en el CpG ODN del constructo de ODN cada uno tiene un enlace internucleótido fosfodiéster (po), y cada uno de los enlaces internucleótidos restantes del CpG ODN son enlaces internucleótidos de fosforotioato (ps). Según otros aspectos particulares, dos de los enlaces internucleótidos en el CpG ODN tienen cada uno un enlace internucleótido fosfodiéster (po), y cada uno de los enlaces internucleótidos restantes del CpG ODN son enlaces fosforotioato (ps). Según otros aspectos particulares, tres de los enlaces internucleótidos en el CpG ODN tienen cada uno un enlace internucleótido fosfodiéster (po), y cada uno de los enlaces internucleótidos restantes del CpG ODN son enlaces fosforotioato (ps). Según otros aspectos particulares, cuatro de los enlaces internudeótidos en el CpG ODN tienen cada uno un enlace internudeótido fosfodiéster (po), y cada uno de los enlaces internudeótidos restantes del CpG ODN son enlaces fosforotioato (ps). Según aún otros aspectos particulares, cinco o más de los enlaces internudeótidos en el CpG ODN tienen cada uno un enlace internucleótido fosfodiéster (po), y cada uno de los enlaces internudeótidos restantes del CpG ODN son enlaces fosforotioato (ps).
Según algunas realizaciones, un constructo de ODN de la presente descripción comprende un agonista de TLR9 que comprende un CpG ODN que comprende, preferiblemente consiste en una secuencia de polinucleótido seleccionada del grupo que consiste en:
5' TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 3' (Id. de sec. n.°: 1); y
5' TCGTCGTTACGTAACGACGACGTT 3' (Id. de sec. n.°: 6);.
También se describe pero no se reivindica actualmente en la presente descripción un constructo de ODN que comprende un agonista de TLR9 que comprende un CpG ODN, que comprende preferiblemente una secuencia de polinucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:
5' GGGGGACGATCGTCGGGGGG 3' (Id. de sec. n.°: 2);
5' GGGGTCAACGTTGAGGGGGG 3' (Id. de sec. n.°: 3);
5' TCCATGACGTTCCTGACGTT 3' (Id. de sec. n.°: 4);
5' TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG 3' (Id. de sec. n.°: 5); y
5' T CGTCGTTTT GT CGTTTT GT CGT 3' (Id. de sec. n.°: 7).
Según algunas realizaciones, un constructo de ODN de la presente descripción comprende un agonista de TLR9 que comprende un CpG ODN que comprende, preferiblemente consiste en una secuencia de polinucleótidos que es, o es al menos, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica, o cualquier porcentaje entre tales valores, a una de las Id. de sec. n.°: 1 o 6.
También se describe pero no se reivindica actualmente en la presente descripción un constructo de ODN que comprende un agonista de TLR9 que comprende un CpG ODN que comprende, preferiblemente consiste en una secuencia de polinucleótido que es, o es al menos, 70 %, 75 %, 80 % o 85 % idéntica, o cualquier porcentaje entre tales valores, a una de las Id. de sec. n.°: 1-7.
Según aspectos particulares, un constructo de ODN de la presente descripción comprende un CpG ODN que comprende, preferiblemente consiste en una secuencia de polinucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: (1)
5’
TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpo GpsTpsT 3’ (Id.de sec. n.°: 8);
(2)
5’
TpsCpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCps GpsTpsT 3’ (Id. de sec. n.°: 9);
(3)
5’
T psCpsGpsT psC poGpsT psT psT psT psGpsT psCpoGpsT psT psT psT psGpsTpsCps GpsTpsT 3’ (Id. de sec. n.°: 10);
(4)
5<’>
T psCpsGpsT psC psGpsT psT psTpsT psGpsT psC poGpsT psTpsTpsT psGpsT psC ps GpsTpsT 3’ (Id. de sec. n.°: 11);
(5)
5’ TpsCpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpo GpsTpsT 3’ (Id. de sec. n.°: 12);
(6)
5’ TpsCpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpo GpsTpsT 3’ (Id. de sec. n.°: 13);
(7)
5’ TpsCpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpo GpsTpsT 3’ (Id. de sec. n.°: 14);
(8)
5’ TpsCpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsApsCpsGpsTpsApsApsCpsGpsApsCpsGpsApsCp sGpsTpsT 3’ (Id. desee. n.°: 15);
(9)
5’
TpsCpsGpsT psCpoGpsT psT ps ApsCpsGpsT ps Aps ApsCpsGps ApsCpsGpsApsCp sGpsTpsT 3’ (Id. de sec. n.°: 16);
(10)
5’
TpsC psGpsTpsC poGpsT psT ps ApsCpoGpsT ps Aps ApsC psGps ApsCpsGps ApsC p sGpsTpsT 3’ (Id. de sec. n.°: 17);
(11)
5’ TpsCpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsApsCpoGpsTpsApsApsCpoGpsApsCpsGpsApsC psGpsTpsT 3’ (Id. de sec. n.°: 18); y
(12)
5’ TpsCpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsApsCpoGpsTpsApsApsCpoGpsApsCpoGpsApsCps GpsTpsT 3’ (Id. desee. n.°: 19);
en donde:
po representa un enlace intemucleótido fosfodiéster; y
ps representa un enlace intemucleótido fosforotioato.
También se describe, pero no se reivindica actualmente en la presente descripción un constructo de ODN que comprende un CpG ODN, que comprende preferiblemente una secuencia de polinucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: (13)
5’ GpsGpsGpsGpsGpsApsCpoGpsApsTpsCpoGpsTpsCpoGpsGpsGps GpsGpsG
3’ (Id. de sec. n.°: 20;
(14)
5' GpsGpsGpsGpsTpsCpsApsApsCpoGpsTpsTpsGpsApsGpsGpsGpsGpsGpsG
3’ (Id. de sec. n.°: 21);
(15) 5' TpsCpsCpsApsTpsGpsApsCpsGpsTpsTpsCpsCpsTpsGpsApsCpsGpsTpsT 3' (Id. de sec. n.°:22);
(16)
5’
TpsCpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsCpsGpsGpsCpsGpsCpsGpsCpsGpsCpsCps
G 3’ (Id. de sec. n.°: 23);
(17)
5’
TpsCpoGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCps GpsT 3’ (Id. de sec. n.°: 24);
(18)
5’
TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCps GpsT 3’ (Id. de sec. n.°: 25); y
(19)
5’
TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCps GpsT 3’ (Id. de sec. n.°: 26);
en donde:
po representa un enlace internucleótido fosfodiéster; y
ps representa un enlace internucleótido fosforotioato.
Según algunas realizaciones, un constructo de ODN de la presente descripción comprende un agonista de TLR9 que comprende un CpG ODN que comprende, preferiblemente consiste en una secuencia de polinucleótidos que es, o es al menos, aproximadamente 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica, o cualquier porcentaje entre tales valores, a una de las Id. de sec. n.°: 8 -26.
También se describe, pero no se reivindica actualmente en la presente descripción un constructo de ODN de la presente descripción que comprende un agonista de TLR9 que comprende un CpG ODN que comprende, preferiblemente consiste en una secuencia de polinucleótidos que es, o es al menos, aproximadamente 70 %, 75 %, 80 % u 85 % idéntica, o cualquier porcentaje entre tales valores, a una de las Id. de sec. n.°: 8-26.
Según aspectos particulares, un constructo de ODN de la presente descripción comprende una estructura seleccionada del grupo que consiste en:
(1)
5’ Toco-po(HEG)po(HEG)po-TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpo GpsTpsT3’ (Id. desee. n.°: 2 7 ) ; ..................................................................
(2)
5’ Toco-po(HEG)po(HEG)po-TpsCpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCps GpsTpsT 3’ (Id. de sec. n.°: 28);
(3)
5’
TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpo GpsTpsT-(HEG)po(HEG)po-T<oco>3’ (Id. de sec. n.°: 29);
(4)
5’
TpsCpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCps GpsTpsT-(HEG)po(HEG)po-Toco 3’ (Id. de sec. n.°: 30);
(5)
5’ Chol-po(HEG)po(HEG)po-TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpo GpsTpsT 3’ (Id. desee. n.°: 31); '
(6)
5’ Cholpo(H£G)po(H£G)poTpsCpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTp sTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsT 3’ (Id. de sec. n.°: 32);
(7)
5’ Chol-po(HEG)po(HEG)po-TpsCpoGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCps GpsTpsT 3’ (Id. de sec. n.°: 33);
(8)
5’ Chol-po(HEG)po(HEG)po-TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCps GpsTpsT 3’ (Id. de sec. n.°: 34);
(9)
5’ Chol-po(HEG)po(HEG)po-TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCps GpsTpsT 3’ (Id. de sec. n.°: 35);
(10)
5’ Chol-po(HEG)po(HEG)po-TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpo GpsTpsT3’ (Id. desee. n.°: 36); ................................
(11)
5’ TpsCpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCps GpsTpsTps-(HEG)po(HEG)po-Chol 3’ (Id. de sec. n.°: 37);
(12)
5’ TpsCpoGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCps GpsTpsTps-(HEG)po(HEG)po-Chol 3’ (Id. de sec. n.°: 38);
(13)
5’ TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCps GpsTpsTps-(HEG)po(HEG)po-Chol 3’ (Id. de sec. n.°: 39);
(14)
5’ TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpo GpsTpsTps-(HEG)po(HEG)po-Chol 3’ (Id. de sec. n.°: 40);
(15)
5’ TpsCpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCps GpsTpsTps-(HEG)po(HEG)po-Toco 3’ (Id. de sec. n.°: 41);
(16)
5’ Toco-po(HEG)po(HEG)po-TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpo GpsTpsT 3’ (Id. de sec. n.°: 42);
(17)
5’ TpsCpoGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCps GpsTpsTps-(HEG)po(HEG)po-Toco 3’ (Id. de sec. n.°: 43);
(18)
5’ TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCps GpsTpsTps-(HEG)po(HEG)po-Toco 3’ (Id. de sec. n.°: 44);
(19)
5<’ ’>TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCps GpsTpsTps-(HEG)po(HEG)po-Toco 3’ (Id. de sec. n.°: 45);
(20)
5’ TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpo GpsTpsTps-(HEG)po(HEG)po-Toco 3’ (Id. de sec. n.°: 46);
(21)
5’ Toco-po(HEG)po(HEG)po-TpsCpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCps GpsTpsT 3’ (Id. de sec. n.°: 47);
(22)
5’ Toco-po(HEG)po(HEG)po-TpsCpoGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCps GpsTpsT 3’ (Id. desee. n.°: 48);
(23)
5’ Toco-po(HEG)po(HEG)po-TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCps GpsTpsT 3’ (Id. de sec. n.°: 49);
(24)
5’ Toco-po(HEG)po(HEG)po-TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCps GpsTpsT 3’ (Id. de sec. n.°: 50);
(26)
5’-TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCps GpsTpsTps (HEG)po(HEG)po-Chol 3’ (Id. de sec. n.°: 52);
(30)
5’ Palmitoyl-po(HEG)po(HEG)po-TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpo GpsTpsT 3’ (Id. de sec. n.°: 56);
en donde:
Col representa colesterol;
Toco representa tocoferol;
palmitoilo representa un grupo palmitoilo;
HEG representa ((CH<2>)<2>O) 6;
po representa un enlace fosfodiéster; y
ps representa un enlace fosforotioato.
en donde el tocoferol, el colesterol, o el grupo palmitoilo se enlaza covalentemente al (HEG) directamente a través de un enlace po o ps, o indirectamente a través de un segundo enlazador que se enlaza a (HEG) directamente a través de un enlace po o ps.
También se describe, pero no se reivindica actualmente en la presente descripción un constructo de ODN que comprende una estructura seleccionada del grupo que consiste en:
(25)
5’-TpsCpoGpsTpsCGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGps TpsTps-HEGps-Chol 3’ (Id. de sec. n.°: 51);
(27)
5'-GpsGpsGpsGpsTpsCpsApsApsCpoGpsTpsTpsGpsApsGpsGpsGpsGpsGpsGps-HEGps-Chol 3’ (Id. de sec. n.°: 53);
(28)
5’-TpsCpsCpsApsTpsGpsApsCpsGpsTpsTpsCpsCpsTpsGpsApsCpsGpsTpsTps-HEGos-Chol 3’ (Id. de sec. n.°: 54);
(29)
5’-TpsCpsCpsApsTpsGpsApsCpsGpsTpsTpsCpsCpsTpsGpsApsCpsGpsTpsTps HEGps-Toco 3’ (Id. de sec. n.°: 55);
en donde:
Col representa colesterol;
Toco representa tocoferol;
palmitoilo representa un grupo palmitoilo;
HEG representa ((CH<2>)<2>O) 6;
po representa un enlace fosfodiéster; y
ps representa un enlace fosforotioato.
en donde el tocoferol, el colesterol, o el grupo palmitoilo se enlaza covalentemente al (HEG) directamente a través de un enlace po o ps, o indirectamente a través de un segundo enlazador que se enlaza a (HEG) directamente a través de un enlace po o ps.
En una realización, el constructo de ODN tiene la siguiente estructura:
o una quiralidad racémica o alternativa del mismo, en donde los “ oligonucleótidos” representan un CpG ODN que tiene actividad agonista para TLR9.
En una realización, el constructo de ODN tiene la siguiente estructura:
o una quiralidad racémica o alternativa del mismo, en donde los “ oligonucleótidos” representan un CpG ODN que tiene actividad agonista para TLR9.
En una realización, CpG ODN contiene Id. de sec. n.°: 1, preferiblemente Id. de sec. n.°: 8: 5' T psCpoGpsT psCpoGpsT psT psT psT psGpsT psCpoGpsT psT psT psT psGpsT psCpoGpsT psT 3'.
En una realización, CpG ODN contiene la siguiente estructura:
Según aspectos particulares, un constructo de ODN de la presente descripción puede conjugarse adicionalmente con un resto de direccionamiento. Como se usa en la presente descripción, el término “ resto de direccionamiento” se refiere a cualquier resto adecuado para el suministro de su agonista conjugado a células diana. Los ejemplos de restos de direccionamiento incluyen, p. ej., un carbohidrato, un péptido, una proteína, una molécula pequeña, un resto lipídico, o una toxina, que se reconoce específicamente por un receptor de la superficie celular. Los restos de carbohidratos útiles incluyen, pero no se limitan a, galactosa, N-acetilgalactosamina (GalNAc), fucosa, manosa, y ácido siálico (ácido N-acetil neuramínico). Según realizaciones particulares, el resto de direccionamiento se une a los receptores presentes en los tipos de células diana particulares de interés. El resto de direccionamiento ayuda a dirigir el constructo del ODN al sitio diana requerido. Una manera en que un resto de direccionamiento puede mejorar la administración es por actividad endocitótica mediada por receptor. Este mecanismo de absorción implica el movimiento del constructo de ODN unido a los receptores de membrana en el interior de un área que está envuelta por la membrana mediante la invaginación de la estructura de membrana o mediante la fusión del sistema de administración con la membrana celular. Este proceso se inicia mediante la activación de una superficie celular o receptor de membrana después de la unión de un ligando específico al receptor. Se conocen y han estudiado muchos sistemas endocitópticos mediados por receptor, incluidos aquellos que reconocen azúcares tales como galactosa, manosa, manosa-6-fosfato, péptidos y proteínas tales como transferrina, asialoglicoproteína, vitamina B12, insulina y factor de crecimiento epidérmico (EGF). El receptor de asialoglicoproteína (A<s>G<p>-R) es un receptor de alta capacidad, que es muy abundante en hepatocitos. El ASGP-R muestra una afinidad 50 veces mayor por N-acetil-D-galactosilamina (GalNAc) que D-Gal. El trabajo previo ha demostrado que se requiere multivalencia para lograr una afinidad nM, mientras que la separación entre azúcares también es crucial. El receptor de manosa, con su alta afinidad por D-manosa representa otro par importante de ligandoreceptor basado en carbohidratos. El receptor de manosa se expresa mucho en tipos de células específicos tales como macrófagos y posiblemente conjugados de manosa de células dendríticas así como portadores de fármacos manosilados se han usado con éxito para dirigir moléculas de fármaco a esas células. Por ejemplo, véase Biessen y col. (1996) J. Biol. Chem. 271, 28024-28030; Kinzel y col. (2003) J. Peptide Sci. 9, 375-385; Barratt y col. (1986) Biochim. Biophys. Acta 862, 153-64; Diebold y col. (2002) Somat. Cell Mol. Genetics 27, 65-74. Según realizaciones, el resto de direccionamiento es un resto lipídico. Por ejemplo, el tocoferol puede servir como un resto de direccionamiento para los receptores de vitamina E, y un grupo palmitoilo puede servir como un resto de direccionamiento para los receptores de LDL.
Según realizaciones particulares, el resto de direccionamiento se une a los receptores presentes en los tipos de células diana particulares de interés
Un constructo de ODN de la presente descripción puede conjugarse con un resto de direccionamiento directa o indirectamente a través de un enlazador.
Síntesis
Los constructos de ODN de la presente descripción pueden prepararse mediante el uso de métodos conocidos en la técnica en vista de la presente descripción. Por ejemplo, los oligorribonucleótidos y oligorribonucleósidos usados según la presente descripción pueden prepararse con síntesis en fase sólida, véase por ejemplo “ Oligonucleotide synthesis, a practical approach” , Ed. M. J. Gait, IRL Press, 1984; “ Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach” , Ed. F. Eckstein, IRL Press, 1991 (p. ej., Capítulo 1, Métodos modernos asistidos por máquina de síntesis de ODN, Capítulo 2, Síntesis de oligoribonucleótidos, Capítulo 4, Oligonucleótidos de fosforotioato, Capítulo 5, Síntesis de fosforoditioatos oligonucleótidos). Otros procedimientos sintéticos, reactivos, grupos de bloqueo y condiciones de reacción particularmente útiles se describen en Martin, P., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504; Beaucage, S. L. and Iyer, R. P., Tetrahedron, 1992, 48, 2223 2311 y Beaucage, S. L. y Iyer, R. P., Tetrahedron, 1993, 49, 6123-6194, o referencias a las que se hace referencia en el mismo. Los compuestos de cadena principal mezclados que tienen, como por ejemplo, enlaces PO o PS alternos pueden prepararse como se describe en la patente de Estados Unidos 5.378.825, 5.386.023, 5.489.677 y en las solicitudes PCT publicadas PCT/US92/04294 and PCT/US92/04305 (publicada como WO 92/20822 y WO 92/20823, respectivamente).
Un ejemplo de un esquema de síntesis que puede usarse para preparar constructos de ODN de la presente descripción se ilustra en la Figura 17 y se describe en el Ejemplo 1.
Composiciones farmacéuticas y métodos de tratamiento
Según aspectos particulares, la presente descripción se refiere a un constructo de ODN que induce la actividad de TLR9. El efecto de un constructo de ODN con actividad agonista para TLR9 en una respuesta inmunitaria dependiente de TLR puede determinarse in vitro midiendo una respuesta de células inmunitarias (p. ej., células mononucleares de sangre periférica (PBMC), que consisten principalmente en linfocitos y monocitos) o células indicadoras (p. ej., células HEK293 que expresan un constructo reportero para TLR9) en contacto con el agonista. El efecto de un constructo de ODN con actividad agonista para TLR9 en una respuesta inmunitaria dependiente de TLR también puede determinarse in vivo, p. ej., midiendo la inducción de citocinas en un animal después de la inyección con el agonista. Los métodos ilustrativos se describen en la presente descripción, p. ej., en los ejemplos siguientes.
Los constructos de ODN de la presente descripción pueden usarse para tratar enfermedades, trastornos, o afecciones inmunitarias, tales como infecciones virales o cáncer.
Por lo tanto, en otro aspecto general, la presente descripción se refiere a una composición farmacéutica que comprende un constructo de ODN de la presente descripción y un portador farmacéuticamente aceptable.
En otro aspecto general, la presente descripción se refiere a un método para estimular una respuesta inmunitaria en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto una composición farmacéutica que comprende un constructo de ODN de la presente descripción y un portador farmacéuticamente aceptable.
En otro aspecto general, la presente descripción se refiere a una composición farmacéutica de la presente descripción para su uso en un método para tratar o reducir los síntomas de una enfermedad, trastorno o afección, tal como una enfermedad, trastorno o afección inmunitaria, tal como una infección viral o cáncer, en un sujeto que lo necesita.
Según las realizaciones de la presente descripción, la composición farmacéutica comprende una cantidad terapéuticamente efectiva del constructo de o Dn . Como se usa en la presente descripción con referencia a los constructos de ODN, una cantidad terapéuticamente efectiva significa una cantidad de un constructo de ODN que estimula una respuesta inmunitaria en un sujeto que lo necesita. También como se usa en la presente descripción con referencia a un constructo de ODN, una cantidad terapéuticamente efectiva significa una cantidad de un constructo de ODN que da como resultado el tratamiento de una enfermedad, trastorno, o afección inmunitaria, tal como una infección viral o cánceres; previene o ralentiza la progresión de la enfermedad, trastorno, o afección inmunitaria, tal como infección viral o cáncer; reduce o alivia completamente los síntomas asociados con la enfermedad, trastorno o afección inmunitaria, tal como infección viral o cáncer.
Según realizaciones particulares, una cantidad terapéuticamente efectiva se refiere a la cantidad de terapia que es suficiente para lograr uno, dos, tres, cuatro, o más de los siguientes efectos: (i) reducir o aminorar la gravedad de la enfermedad, trastorno o afección a tratarse o un síntoma asociado con los mismos; (ii) reducir la duración de la enfermedad, trastorno o afección a tratarse, o un síntoma asociado con los mismos; (iii) prevenir la progresión de la enfermedad, trastorno o afección a tratar, o un síntoma asociado con los mismos; (iv) causar la regresión de la enfermedad, trastorno o afección a tratar, o un síntoma asociado con los mismos; (v) prevenir el desarrollo o inicio de la enfermedad, trastorno o afección a tratar, o un síntoma asociado con los mismos; (vi) prevenir la recurrencia de la enfermedad, trastorno o afección a tratar, o un síntoma asociado con los mismos; (vii) reducir la hospitalización de un sujeto que tiene la enfermedad, trastorno o afección que se va a tratar, o un síntoma asociado con los mismos; (viii) reducir la duración de la hospitalización de un sujeto que tiene la enfermedad, trastorno o afección que se va a tratar, o un síntoma asociado con los mismos; (ix) aumentar la supervivencia de un sujeto con la enfermedad, trastorno o afección a tratar, o un síntoma asociado con los mismos; (x) inhibir o reducir la enfermedad, trastorno o afección a tratar, o un síntoma asociado con el mismo en un sujeto; y/o (xi) potenciar o mejorar el efecto o efectos profilácticos o terapéuticos de otra terapia.
Según realizaciones particulares, la enfermedad, trastorno o afección a tratar es una enfermedad, trastorno o afección inmunitaria. Según realizaciones particulares, la enfermedad, trastorno o afección a tratar es un cáncer, una enfermedad, trastorno o afección inflamatoria, una enfermedad, trastorno o afección autoinmune, o una enfermedad, trastorno o afección causada por un patógeno, tal como una infección viral. Según realizaciones particulares, el cáncer o tumor es un cáncer causado por un virus, un carcinoma, un sarcoma o una leucemia. Según realizaciones particulares, el cáncer es un carcinoma de mama, colon, vejiga, pulmón, próstata, estómago, o páncreas o una leucemia linfoblástica o mieloide. Según realizaciones particulares, la infección viral es un virus de ARN o ADN tal como adenovirus, citomegalovirus, virus de la hepatitis A (VHA), hepadnavirus que incluyen VHB, VHB crónico, flavivirus que incluyen virus de la fiebre amarilla, heppacivirus que incluyen virus de la hepatitis C (VHC), herpes simple tipo 1 y 2, herpes zóster, herpesvirus humano 6, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus del papiloma humano (VPH), virus de la influenza a, virus de la influenza B, sarampión, virus de la parainfluenza, pestivirus, poliovirus, poxvirus, rinovirus, coronovirus, virus respiratorio sincitial (VRS), múltiples familias de virus que causan fiebres hemorrágicas, incluidos los arenavirus, los bunyavirus y los filovirus, y un rango de encefalitis víricas causadas por virus ARN y ADN. Según realizaciones más particulares, la enfermedad a tratar es infección por VHB o infección crónica por VHB.
El VHB crónico se caracteriza preferiblemente por la presencia detectable de VHB en un sujeto durante más de 6 meses. Más preferiblemente, una infección crónica por VHB a la que se hace referencia en la presente descripción sigue la definición publicada por los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC), según la cual una infección crónica por VHB se caracteriza por los siguientes criterios de laboratorio: (i) negativo para los anticuerpos IgM contra el antígeno del núcleo de la hepatitis B (anti-HBc IgM) y positivo para el antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg), el antígeno de la hepatitis B (HBeAg) o la prueba de ácido nucleico para el<a>D<n>del virus de la hepatitis B, o (ii) positivos para la prueba de HBsAg o ácido nucleico para el ADN del VHB, o positivos para HBeAg dos veces al menos 6 meses de diferencia.
Según realizaciones particulares, una cantidad terapéuticamente efectiva se refiere a la cantidad de una terapia que es suficiente para tratar una infección crónica por VHB. Por consiguiente, una cantidad terapéuticamente efectiva se refiere a la cantidad de terapia que es suficiente para lograr uno, dos, tres, cuatro, o más de los siguientes efectos: (i) reducir o aminorar la gravedad de una infección por VHB o un síntoma asociado con el mismo; (ii) reducir la duración de una infección por VHB o síntoma asociado con el mismo; (iii) prevenir la progresión de una infección por VHB o síntoma asociado con el mismo; (iv) causar la regresión de una infección por VHB o síntoma asociado con el mismo; (v) prevenir el desarrollo o inicio de una infección por VHB o síntoma asociado con el mismo; (vi) prevenir la recurrencia de una infección por VHB o síntoma asociado con el mismo; (vii) reducir la hospitalización de un sujeto que tiene una infección por VHB (viii) reducir la duración de la hospitalización de un sujeto que tiene una infección por VHB (ix) aumentar la supervivencia de un sujeto con una infección por VHB; (x) eliminar una infección de VHB en un sujeto; (xi) inhibir o reducir la replicación del VHB en un sujeto; y/o (xii) potenciar o mejorar el efecto o efectos profilácticos o terapéuticos de otra terapia.
Según realizaciones particulares, una cantidad terapéuticamente efectiva se refiere a la cantidad de una terapia que es suficiente para lograr uno, dos, tres o cuatro de los siguientes efectos: (i) reducir la cantidad de antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) en el sujeto en un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más; (ii) reducir la cantidad de antígeno de la hepatitis B e (HBeAg) en el sujeto en un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más; (iii) reducir la cantidad de ADN del virus de la hepatitis B en el sujeto en un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más; y/o (iv) reducir la cantidad de anticuerpos anti-HBsAg en el sujeto en un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más.
Según realizaciones particulares, una cantidad terapéuticamente efectiva se refiere a la cantidad de una terapia que es suficiente para tratar un cáncer. Por consiguiente, una cantidad terapéuticamente efectiva se refiere a la cantidad de terapia que es suficiente para lograr uno, dos, tres, cuatro, o más de los siguientes efectos: (i) reducir o aminorar la gravedad de un cáncer o un síntoma asociado con el mismo; (ii) reducir la duración de un cáncer o síntoma asociado con el mismo; (iii) prevenir la progresión de un cáncer o síntoma asociado con el mismo; (iv) causar la regresión de un cáncer o síntoma asociado con el mismo; (v) prevenir el desarrollo o inicio de un cáncer o síntoma asociado con el mismo; (vi) prevenir la recurrencia de un cáncer o síntoma asociado con el mismo; (vii) reducir la hospitalización de un sujeto que tiene un cáncer; (viii) reducir la duración de la hospitalización de un sujeto que tiene un cáncer; (ix) aumentar la supervivencia de un sujeto con un cáncer; (x) eliminar un cáncer en un sujeto; y/o (xi) potenciar o mejorar el efecto o efectos profilácticos o terapéuticos de otra terapia.
La cantidad o dosificación terapéuticamente efectiva puede variar según diversos factores, tales como los medios de administración, el sitio diana, el estado fisiológico del sujeto (que incluye, p. ej., edad, peso corporal, salud), si el sujeto es un ser humano o un animal, otros medicamentos administrados, y si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. Las dosificaciones de tratamiento se titulan de manera óptima para optimizar la seguridad y la eficacia.
La manera de administración para el uso terapéutico de los constructos de ODN de la presente descripción puede ser cualquier vía adecuada que suministre el agente al huésped. Por ejemplo, las composiciones descritas en la presente descripción pueden formularse para ser adecuadas para administración parenteral, p. ej., administración intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal o intracraneal, o pueden administrarse en el líquido cefalorraquídeo del cerebro o columna vertebral.
Según realizaciones particulares, las composiciones descritas en la presente descripción se formulan para ser adecuadas para la vía de administración prevista para un sujeto. Por ejemplo, las composiciones descritas en la presente descripción pueden formularse para ser adecuadas para la administración intravenosa, subcutánea, intratumoral o intramuscular. Según las realizaciones preferidas, las composiciones descritas en la presente descripción se formulan para ser adecuadas para la administración intravenosa, subcutánea o intratumoral.
El tratamiento puede administrarse en un programa de dosis única, o como un programa de dosis múltiples en el que un curso principal de tratamiento puede ser con 1-10 dosis separadas, seguido de otras dosis administradas en intervalos de tiempo posteriores requeridos para mantener y/o reforzar la respuesta, por ejemplo, a 1-4 meses para una segunda dosis, y si es necesario, una dosis o dosis posteriores después de varios meses. Los ejemplos de programas de tratamiento adecuados incluyen: (i) 0, 1 mes y 6 meses, (ii) 0, 7 días y 1 mes, (iii) 0 y 1 mes, (iv) 0 y 6 meses, u otros programas suficientes para provocar las respuestas deseadas que esperan reducir los síntomas de la enfermedad o reducir la gravedad de la enfermedad.
Según realizaciones particulares, una composición usada en el tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección inmunitaria, o una enfermedad viral, tal como el VHB crónico, o un cáncer, puede usarse en combinación con otros agentes que son efectivos para el tratamiento de enfermedades, trastornos o afecciones relacionadas. Los ejemplos de tales agentes incluyen, pero no se limitan a, CAM, AAD, otros TLR, ASO/ARNpi, inhibidores de puntos de regulación, otros quimioterapéuticos, CAR-T.
En otro aspecto general, la presente descripción se refiere a un método para producir una composición farmacéutica que comprende un constructo de ODN de la presente descripción, que comprende combinar un constructo de ODN con un portador farmacéuticamente aceptable para obtener la composición farmacéutica.
En otro aspecto general, la presente descripción se refiere a una composición farmacéutica que comprende un constructo de ODN de la presente descripción para su uso en un método para tratar la infección crónica por VHB en un sujeto que lo necesita.
En otro aspecto general, la presente descripción se refiere a una composición farmacéutica que comprende un constructo de ODN de la presente descripción para su uso en un método de tratamiento de un tumor, preferiblemente un cáncer, en un sujeto que lo necesita.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos de la presente descripción son para ilustrar adicionalmente la naturaleza de la presente descripción. Debe entenderse que los siguientes ejemplos no limitan la presente descripción y que el alcance de la presente descripción debe determinarse mediante las reivindicaciones adjuntas.
Los métodos experimentales usados en los siguientes ejemplos, salvo que se indique lo contrario, son todos métodos ordinarios. Los reactivos usados en las siguientes realizaciones, salvo que se indique lo contrario, se compran de proveedores de reactivos ordinarios.
Ejemplo 1
Síntesis de AG9
AG9: Fórmula química: C298H420N70O164P26S19, Peso molecular: 9021,42
(5’- Toco-(po)-HEG(po)-HEG(po)-TpsCGpsTpsCGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCGpsTpsT-3’)
El AG9 se sintetizó usando un esquema de síntesis ilustrado en la Figura 17. Más específicamente, se realizó la síntesis de AG9 usando tecnología de síntesis en fase sólida y un sintetizador automatizado. La síntesis se realizó dos veces a una escala de 218 umol para una escala total de 436 umol. La síntesis se realizó usando una columna fija de 6,3 ml (GE Healthcare). El OligoPilot 100 se usó para la síntesis del compuesto. El soporte de NittoPhase Unylinker con una carga de ~303 ^mol/g fue el soporte sólido usado para esta síntesis. La síntesis se llevó a cabo ejecutando un método iterativo de 4 etapas diseñado específicamente para la fabricación de AG9. Las cuatro etapas incluyen detritilación, acoplamiento, sulfuración y taponado, y se repitieron durante 16 ciclos usando las amiditas específicas para producir el producto deseado. Después de cada etapa, se realizó un lavado apropiado de acetonitrilo para evitar reacciones no deseadas. La destritilación del soporte sólido se realizó usando ácido dicloroacético al 3 % en tolueno y se monitorizó a 436 nm. El acoplamiento se realizó mezclando 40 % (en volumen) de una solución de amidita 0,1 M con 60 % del activador en línea antes de la adición a la columna. El total de 2,5 equivalentes de la amidita añadida por acoplamiento. Después de cargar la mezcla de activador/amidita en la columna, la mezcla de acoplamiento se hizo circular mediante un bucle de reciclado durante 5 minutos para el ADN. Las fosforamiditas de a-tocoferol se disolvieron en DMF al 10 % en acetonitrilo. Se usó un acoplamiento extendido de 10 min para el conector de HEG y la fosforamidita de a-tocoferol. Para garantizar una alta eficiencia de acoplamiento, las soluciones de amidita y activador permanecieron sobre tamices moleculares durante al menos 4-6 horas después de la preparación. La tercera etapa, la sulfuración, se realizó mediante la adición de 1,2 volúmenes de columna de una solución de disulfuro de acetil fenilo (PADS) de 0,2 M en lutidina: acetonitrilo (1: 1). La solución se dejó envejecer al menos 12 horas antes de su uso en la síntesis. Se realizó un tiempo de contacto de 2,0 minutos con 2,0 CV para la tiolación. Para la oxidación, se usó yodo 0,05 M en piridina/agua 90/10. La última etapa en el ciclo de alargamiento, el taponado, se realizó mediante la adición de una mitad del volumen de la columna de una mezcla de los tres reactivos de taponado (Taponado A: Taponado B1: Taponado B2; 50/25/25; v/v/v).
Después de que se sintetizó la secuencia AG9 de longitud completa, el soporte se lavó con 2,0 CV dedietilaminaal 20 % (DEA) en acetonitrilo. Esta etapa permitió la eliminación de los grupos protectores cianoetilo beta del producto mientras el producto todavía estaba unido al soporte.
Tabla 1 - Lista de reactivos de síntesis y proveedores
0,7 g de la resina Unylinker™ se llenó en la columna Akta 6,3 ml y la columna se colocó en la posición 1 de columna. El flujo a través de la columna y las posibles fugas de la columna se verificaron mediante el ensayo de flujo.
La escisión y desprotección del oligonucleótido sintetizado se realizó usando hidróxido de amonio concentrado. Se añadió hidróxido de amonio (~60 ml) al oligonucleótido unido al soporte sólido y se agitó suavemente hasta que el soporte estuvo bien dispersado. La mezcla se agitó a 55 °C durante aproximadamente 16 horas. Después del tiempo asignado transcurrido, el soporte sólido se separó del producto que contenía la solución filtrándolo a través de un filtro de vidrio sinterizado. A continuación se lavó el soporte sólido en el filtro (3 x 20 ml) con una solución de etanol 50:50 (v/v): H<2>O. Se retiró una pequeña alícuota de la solución de oligonucleótidos en bruto para el análisis del espectro de masas, HPLC, y UV.
La purificación se realizó usando cromatografía de fase inversa en un sistema de HPLC Akta Pur (GE Healthcare) y una columna phenomenox Luna C8250*21,2 con un diámetro interno de 21,2 cm.
Lista de reactivos de purificación y proveedores
Después de la carga de la muestra, la columna se equilibró durante 2 volúmenes de columna (CV) del Eluyente A. El gradiente consistió en un segmento inicial en el que se suministró el Eluyente B al 8 % durante 2,0 CV para eliminar cualquier muestra no unida de la columna y después el gradiente se hizo pasar del Eluyente B 8 % a 50 % sobre una longitud de 6,0 CV. Las fracciones se recogieron en viales estériles de 50 ml y después se analizaron por HPLC.
Condiciones de purificación
Una vez que se completaron los datos de fracción, se prepararon grupos de simulación. Las agrupaciones simuladas contenían todas las fracciones mayores que 75 % FLP. Después del análisis, se agruparon estas mismas fracciones para desalar por ultrafiltración.
El producto bruto, las fracciones, las agrupaciones simuladas, los grupos, el producto desalado y el producto final se analizaron por RP-HPLC. El producto bruto y final también se analizó por LCMS. Los métodos fueron los siguientes: Análisis RP-HPLC de AG9
Análisis ESI/MS de AG9
Los grupos seleccionados para cada lote de síntesis purificado, que habían permanecido separados hasta ese punto, se combinaron para la ultrafiltración. Los grupos combinados se sometieron a concentración y desalación mediante ultrafiltración con un total de tres 0,1 m2 membranas PES (Pall Corp). Los grupos se concentraron a aproximadamente 2 litros en cuyo punto se inició la diafiltración. La diafiltración continuó hasta que la conductividad del permeado fue menor o igual a 50 pS/cm.
La liofilización se realizó mediante el uso de un sistema secador por congelación VirTis SP Scientific Bench Top Pro. La solución concentrada se filtró a través de un filtro de 0,2 micrones, después se distribuyó uniformemente en viales de 50 ml y se liofilizó. El producto final se muestreó mediante CC y se preparó para pruebas in vivo. Ejemplo 2
Ensayos de activación de TLR9
Ensayo indicador HEK293
Las líneas celulares HEK-Blue mTLR9 y HEK-Blue mTLR9 son líneas celulares comerciales (Invivogen, San Diego, CA) que se transfectan de manera estable con un constructo reportero NF-kB-SEAP (fosfatasa alcalina embrionaria secretada), y TLR9 humano o TLR9 de ratón.
24 horas antes de comenzar el ensayo, una capa subconfluente de células se coloca en una placa de fondo plano de 96 pocillos. El día del ensayo, se añaden concentraciones de valoración volumétrica del compuesto a analizar a las células, y los cultivos se incuban durante la noche. En estas células, la capacidad del compuesto para activar el receptor TLR9 es proporcional a la concentración de la molécula informadora, SEAP, en el sobrenadante. La concentración de SEAP puede determinarse mediante un ensayo colorimétrico donde el sustrato QUANTI-Blue (Invivogen) se añade al sobrenadante del cultivo durante 3 horas. El sustrato escindido se detecta mediante el uso de un espectrofotómetro a OD630 nm, y se comparan las concentraciones relativas.
Ensayo de PBMC
Las PBMC se aíslan de sangre completa mediante centrifugación en gradiente de ficoll. Se siembran 1*106 de PBMC en el fondo de placas de cultivo de 96 pocillos, y se añaden concentraciones de valoración volumétrica del compuesto a analizar a las células. Los cultivos se incuban durante 48 horas, durante las cuales se inducen las dianas celulares para expresar citocinas. Los niveles de citocina se miden mediante el muestreo de sobrenadante y la detección de citocinas individuales mediante el uso de un ensayo Luminex. Además, las PBMC se recolectan y se tiñen usando anticuerpos conjugados con fluorocromo dirigidos a receptores individuales. Los niveles de expresión se miden mediante el uso de un citómetro de flujo. Ensayo de células PHH
Los hepatocitos humanos primarios se cultivan e infectan con Hepatitis B. En el día 4 después de la infección, el medio se intercambia por el medio de PBMC tratada con compuesto (véase anteriormente). Después de 4 días de incubación adicional (día 8 después de la infección), se cambia el medio y se mide el sobrenadante para la producción de HBsAg. Después de 4 días más (día 12 después de la infección), el sobrenadante se mide nuevamente para la producción de HBsAg.
Inducción de citocinas in vivo
Los ratones C57BL/6 se inyectan por vía subcutánea o intravenosa con el compuesto a analizar. Cuatro horas más tarde, los ratones se sangran por punción venosa submandibular. Las citocinas séricas se miden mediante el uso de un ensayo Luminex.
Modelo AAV-VHB
Los ratones C57BL/6 se infectan con partículas de AAV-VHB. Aproximadamente 1 mes después de la infección, los ratones se inyectan por vía subcutánea o intravenosa con el compuesto a analizar. La dosificación del compuesto se repite quincenalmente (cada dos semanas) durante un período de tiempo especificado, típicamente durante 8 semanas. Los ratones se sangran semanalmente. El suero se mide para diversos criterios de valoración, tales como HBsAg circulante, ADN de VHB y anti-HBs Ab.
Modelo de tumor MC38
A ratones C57BL6 se les implantan por vía subcutánea 0,5x106 células de carcinoma de colon MC38, y se monitoriza el crecimiento del tumor. Cuando el volumen medio del tumor alcanza 100-200 mm3 (aproximadamente 12 días después de la implantación), se inicia la dosificación. El tamaño del tumor se monitoriza cada 3-4 días.
Procedimiento ELISpot
Se aislaron células de bazo frescas de ratones tratados que se sacrificaron en puntos de tiempo predeterminados, aproximadamente 1 mes después de la dosis final. Los esplenocitos se dividieron en alícuotas por triplicado en pocillos de placa de microtitulación a una concentración de 2x105 células/pocillo. Se añadieron epítopos de VHB individuales conocidos del núcleo y la superficie y péptidos superpuestos de 15 mer del consenso de VHB B, C&D (superposición por 11 aminoácidos) a los pocillos a una concentración final de 2 pg/ml. Las células se incubaron durante cantidades variables de tiempo, después las células activadas se revelaron mediante el kit ELISpot de IFN-y de ratón (Mabtech 3321-2A) según las instrucciones del fabricante. Las células activadas se cuantificaron mediante el analizador CTL FluoroSpot.
Procesamiento de imágenes IVIS
Para la obtención de imágenes in vivo, se usaron ratones macho C57B1/6 de entre 7-8 semanas. Los oligonucleótidos CpG marcados con AF647 (AG20 y AG21) se inyectaron por vía intravenosa o subcutánea (20 nmol en volumen total de 100 pl). 24 horas después de la inyección, se sacrificaron los animales y se extirparon los bazos, los ganglios linfáticos drenantes, los hígados, los riñones y los pulmones. Se obtuvieron imágenes de los órganos usando IVIS (Ami HTX). Se recolectaron conjuntos de imágenes (Ex: 605, Em: 670, f 5, 10 s). El software de obtención de imágenes Spectral Instruments Aura se usó para adquirir y cuantificar los conjuntos de datos de formación de imágenes de fluorescencia. Se usó una herramienta de región de interés para medir la eficiencia radiante de cada órgano.
Inmunofluorescencia
Se usaron ratones machos C57Bl/6 entre 7-8 semanas. Los oligonucleótidos CpG marcados con AF647 (AG20 y AG21) se inyectaron por vía intravenosa o subcutánea (20 nmol en volumen total de 100 pl). 24 horas después de la inyección, se sacrificaron los animales y se extirparon los bazos, los ganglios linfáticos drenantes, los hígados, los riñones y los pulmones. Los órganos se fijaron en formalina, después se seccionaron en un microtomo usando procedimientos estándar. La tinción de inmunofluorescencia se realizó mediante el uso de una inmunotintura automatizado Leica Bond en ganglios linfáticos y bazo de ratón fijados con formalina e incluidos en parafina (FFPE). La recuperación de antígeno inducida por calor se realizó usando un regulador de recuperación de epítopo de Leica Bon 2 (solución de EDTA, pH 9,0) durante 20 minutos. La tinción se realizó con una incubación durante la noche para anticuerpos primarios, un anti-CD45R de rata (B220) (RA3-6B2), anticuerpo eFluor 570 y anticuerpo anti-CD3 de conejo. Se aplicó un anticuerpo secundario, Goat-anti Rabbit IgG Alexa Flúor Plus 488 y se montaron portaobjetos con DAPI en Fluprogel II para visualización nuclear.
HPLC y unión a proteínas séricas
Para el análisis se usó un sistema Ultimate-3000 HPLC equipado con detectores UV y de fluorescencia. Se prepararon muestras de oligonucleótidos, proteínas, y mezclas de oligonucleótidos-proteína en PBS 1X con KCL 20 mM y se analizaron mediante cromatografía de exclusión por tamaño. Para los ensayos de formación de micelas, se prepararon oligonucleótidos en una solución de urea 2 M o 4 M o PBS. Las muestras se inyectaron en un aumento Superdex 75 (GE Healthcare). Una fase móvil de 1xPBS con 20 mM. Se usó KCL a 0,075 ml/min para la cromatografía y la columna de exclusión por tamaño se mantuvo a temperatura ambiente. Los cromatogramas UV se registraron a 260, 280 y 500 nm. La longitud de onda de excitación de 490 nm y longitud de onda de emisión de 530 nm se usaron para obtener cromatogramas por el detector de fluorescencia.
Ejemplo 3
Fosfodiésteres en una actividad potenciada con CpG ODN
Basándose en la bibliografía, el 5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3' (ODN2006) prototípico puede estimular las células humanas y de ratón que expresan TLR9. Esta secuencia tiene una cadena principal de fosforotioato (ps) para la estabilidad in vivo. Los enlaces ps en los motivos CpG del ODN2006 (5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3') se reemplazaron con enlaces fosfodiéster (po) y se evaluó la activación de TLR9. Los resultados, representados en la Figura 1, demuestran que el reemplazo de 3 o 4 de los restos de los motivos CpG ps con enlaces po dio como resultado constructos de ODN altamente activos que tienen actividad agonística para TLR9. La versión del ODN2006 que tiene los cuatro enlaces ps de los motivos CpG reemplazados por enlaces po (AG1) tiene un valor de EC502-3 veces menor que el del ODN2006, y una actividad máxima 20-35 % mayor que ODN2006. Se observó una actividad similar a AG1 para AG2 y AG3 que tienen enlaces ps de 3 motivos CpG reemplazados por el enlaces po. Este experimento demuestra que sustituir po en la cadena principal de los motivos CpG mejora las propiedades agonistas del oligonucleótido.
Ejemplo 4
Enlace de colesterol directo a un CpG ODN anuló la actividad
Los oligonucleótidos se conjugaron con diversos restos que permitirían la distribución diferencial del oligo. Por ejemplo, el colesterol y el tocoferol son moléculas lipofílicas que se cree que se localizan en el hígado. Cuando el colesterol y el tocoferol se conjugaron directamente al extremo 5' o 3' del CpG ODN, la molécula resultante no activó las células que expresan TLR9 (datos no mostrados). Estos experimentos demostraron que la conjugación directa de un compuesto sobre el extremo del oligonucleótido podría afectar su capacidad para agonizar a TLR9.
Ejemplo 5
Colesterol conjugado indirectamente a través de un enlazador escindible a una actividad potenciada con CpG ODN
Debido a posibles efectos estéricos, la conjugación de un resto lipófilo proximal al oligonucleótido puede haber anulado la capacidad de la molécula para unirse al receptor TLR9. Para explorar esta posibilidad, el colesterol se conjugó con constructos de ODN que tenían actividad agonista para TLR9, también denominado en la presente descripción agonistas de TLR9, como un resto de direccionamiento que usa un enlazador escindible y se evaluó la activación de TLR9. Los resultados, mostrados en la Figura 2, indican que la conjugación de un resto de direccionamiento a los agonistas de TLR9 a través de un enlazador escindible preserva su actividad agonista.
Por ejemplo, un agonista de TLR9 denominado AG8 se diseñó usando un enlazador escindible para separar el colesterol del CpG ODN del AG1. El enlazador para AG8 fue (HEG)po(HEG)po-. Cuando se estimularon células HEK-Blue hTLR9 con AG8, la actividad se potenció, en relación con el precursor no conjugado, AG1. El AG8 tuvo un valor de EC502-3x menor que el de AG1, y mayor que 9 veces más bajo que el del ODN2006. La actividad máxima de AG8 fue aproximadamente un 10 % mayor que la del AG1, y aproximadamente un 50 % mayor que la del ODN2006. Se probaron análogos de AG1 que estaban enlazados al colesterol de la misma manera que el AG8. AB4, AG5, AG6 y AG7 tienen 0, 1, 2 y 3 (respectivamente) motivos CpG reemplazados con po. Como se muestra en la Figura 2, cuanto mayor es el número de motivos CpG con enlaces po, mayor es la actividad. AG4 tiene una cadena principal de ps completa y se conjuga con colesterol a través de un enlazador indirecto. AG5 es similar a AG4, pero tiene 1 motivo CpG reemplazado con un enlace po. Estos dos compuestos tienen una actividad similar en el ensayo celular HEK-Blue hTLR9, siendo su EC506,4-10 nM. AG6 y AG7 tienen 2 y 3 motivos CpG reemplazados por un enlace po, y sus EC50 fueron aproximadamente 4,5 nM y 2,6 nM respectivamente. Este experimento demostró que al conjugar un resto de direccionamiento indirectamente a través de un enlazador escindible, se conservaba la actividad del farmacóforo.
Ejemplo 6
Tocoferol conjugado indirectamente a través de un enlazador escindible, actividad potenciada con CpG ODN
Para probar la versatilidad de la estrategia de conjugación, el tocoferol se conjugó con un agonista de TLR9 mediante el uso de un enlazador escindible. Por ejemplo, el agonista de TLR9 denominado AG9, cuya síntesis se describe en el Ejemplo 1 anterior, se diseñó usando un enlazador escindible para separar el tocoferol del oligonucleótido de AG1. El enlazador para AG9 fue (HEG)po(HEG)po-. Cuando se estimularon células HEK-Blue hTLR9 con AG9, la actividad fue equivalente a la del conjugado de colesterol AG8 (datos no mostrados). Estos experimentos demostraron que podrían conjugarse diferentes restos de direccionamiento con el CpG ODN, y el CpG<o>D<n>podría retener actividad.
Ejemplo 7
La conjugación indirecta usando un enlazador escindible en el extremo 5' o 3' de un CpG ODN dio como resultado una actividad equivalente
Para probar la polaridad del resto conjugado, se conjugó el colesterol o el tocoferol con el extremo 3' de un ODN de TLR9 usando un enlazador escindible. Por ejemplo, un agonista de TLR9 denominado AG10 se diseñó usando un enlazador escindible, -po(HEG)po(HEG), para separar el colesterol del extremo 3' del oligonucleótido de AG1, y un agonista de TLR9 denominado AG11 se diseñó usando un enlazador escindible, -po(HEG)po(HEG), para separar el tocoferol del extremo 3' del oligonucleótido de AG1. La actividad de los conjugados se analizó usando el HEK-BLUE hTLR9. Como se muestra en la Figura 3, AG8 y AG10, que tenía un colesterol conjugado indirectamente con los extremos 5' o 3' del CpG ODN, respectivamente, tuvo actividad equivalente.
Curiosamente, en las células HEK-BLUE hTLR9, AG10 y AG11 tenían una actividad similar a sus homólogos conjugados 5', AG8 y AG9, respectivamente. Sin embargo, no fueron activos en las células HEK-BLUE mTLR9, lo que indica que la polaridad del conjugado es importante para el reconocimiento por parte del receptor TLR9 de ratón pero no para el receptor TLR9 humano (AG8 y AG10 se muestran en la Figura 3, los datos no se muestran para AG9 y AG11).
Para probar los efectos de los sitios de escisión dentro del enlazador, se sintetizaron análogos de AG9 en los que los sitios de escisión de fosfodiéster se reemplazaron con enlaces de fosforotioato que son resistentes a la escisión. Como se ilustra en la Figura 12, el AG12 tiene enlaces de fosforotioato no escindibles que reemplazan los enlaces fosfodiéster escindibles entre el oligo y el enlazador, entre el resto de tocoferol y el enlazador, y entre las moléculas de HEG del enlazador. Se cree que esta molécula no puede escindirse eficientemente, y la molécula completa interactuará con TLR9. AG13 tiene enlazadores de fosforotioato no escindibles que reemplazan los enlaces fosfodiéster escindibles entre el enlazador y el oligo. Se cree que después de la escisión, parte del enlazador permanece unida al oligo. AG14 tiene enlazadores de fosforotioato no escindibles que reemplazan los enlaces fosfodiéster escindibles entre el enlazador y el tocoferol. Se cree que después de la escisión, se elimina el tocoferol y el enlazador completo permanece unido al oligo. AG16 es una variante de AG1 que se conjuga con tocoferol a través de un enlace de fosforotioato. AG15 es una variante de AG1 que se conjuga con tocoferol a través de un enlace de fosforotioato y que tiene un enlace fosforotioato entre las bases 21 y 22.
Todos los análogos que conservaron cualquier porción del enlazador y/o tocoferol tuvieron actividad reducida en el ensayo indicador HEK-Blue, como se muestra en las Figuras 19 y 20. En particular, se demostró que la conjugación directa de un resto de direccionamiento (tal como tocoferol) a un oligo como se representa por los constructos AG15 y AG16 anularon la actividad agonista de TLR9 del oligo (datos no mostrados). La conjugación del oligo con tocoferol a través de un enlazador escindible preservó la actividad agonista de TLR9 del oligo, y se obtuvo una actividad óptima cuando se escindieron el tocoferol y el enlazador (Figura 19). Los datos sugieren que una vez endocitosado por la célula, el ODN se libera por escisión del enlazador y del resto de direccionamiento, y que esta liberación es necesaria para una actividad completa. Se obtuvieron resultados similares con colesterol o ácido palmítico conjugados al oligo mediante este método. Los resultados sugieren que cualquier molécula, tal como un péptido, proteína, toxina, molécula orgánica o inorgánica, etc., puede conjugarse al oligo usando esta estrategia del enlazador escindible.
Usando células indicadoras HEK-Blue mTLR9, se descubrió que el AG9 también activó el TLR9 de ratón y logró una actividad similar a la AG1 original no conjugada y superior a ProMune, un fosforotioato completo, no modificado que contenía ODN2006, en las células indicadoras, lo que indica que el AG9 podría usarse en los modelos de ratónin vivo(Figura 20). Los resultados indican que en un agonista de TLR9 según una realización de la presente descripción, se prefiere un enlazador escindible para optimizar su capacidad estimuladora de TLR9.
Ejemplo 8
Análisis In vivo de agonistas de TLR9
A los ratones se les inyectaron por vía subcutánea 7,6-10,8 mg/kg de agonistas de TLR9 AG8 y AG10 y se les sangró 4 horas después. AG8 se conjuga con colesterol y un enlazador escindible en el extremo 5' del oligo, y AG10 se conjuga con colesterol y un enlazador escindible en el extremo 3' del oligo. Las muestras recogidas se analizaron para determinar los niveles de citocinas usando un ensayo Luminex. Los resultados, mostrados en la Figura 4, indican que los agonistas de TLR9 indujeron la producción de citocinas in vivo. Estos experimentos indicaron que, como se observó in vitro con el ensayo indicador de células HEK-BLUE mTLR9, la polaridad del enlazador y el colesterol fue importante en la capacidad de AG10 para agonizar a TLR9. Si bien AG10 tenía poca actividad in vivo, AG8 podría inducir citocinas proinflamatorias tales como IL-6, TNFa y MIP-1b después de la administración de la dosis. Notablemente, los niveles de citocinas producidas fueron en promedio más altos que los del control ODN2006, y a la par con ODN1826. Por lo tanto, el CpG ODN conjugado con colesterol es activo in vivo.
Ejemplo 9
Análisis del efecto de los agonistas de TLR9 en ratones infectados con AAV-VHB
En la figura 5 se muestra una esquemática de un experimento llevado a cabo para analizar el efecto de los agonistas de TLR9 en la infección por VHB en ratones.
A los ratones que se les había inyectado el virus AAV-VHB en el día -28 se les administró vehículo o agonistas de TLR9 y se evaluaron los niveles de indicadores del VHB. Los ratones recibieron una dosis única el día 0 o dosis múltiples, los días 7, 21, 35 y 49. Como punto de referencia, a un grupo de ratones se les administró la dosis por vía oral con GS9620, un agonista de molécula pequeña de TLR7. Todos los ratones fueron evaluados para determinar el nivel de ADN del VHB (véase la figura 6), HBsAg (el antígeno de superficie de HBV; véase la Figura 7), y HBeAg (el antígeno envolvente de HBV; véase la Figura 8). Los resultados indicaron que la administración de los agonistas de TLR9 suprimió exitosamente el ADN del VHB, el HBsAg y el HBeAg en ratones a los que se administró AAV-HBV.
Los ratones que fueron inyectados por vía subcutánea con el agonista de TLR9 AG8 se evaluaron para determinar la producción de citocinas inducida. Los resultados, mostrados en la Figura 9, indican que 3 nmol del agonista de TLR9 AG8, que no produjo reacciones de sitio de inducción, indujeron niveles de citocinas similares al agonista de TLR9 AG10.
Los ratones que fueron inyectados por vía intravenosa (IV) con el agonista de TLR9 AG8 se evaluaron para determinar la producción de citocinas inducida. Los resultados, mostrados en la Figura 10, indican que 15 nmol del agonista de TLR9 a G8 indujeron niveles de citocinas. Los ratones inyectados con IV también se analizaron para determinar su carga viral del VHB. Como se muestra en la Figura 11, la dosificación IV con AG8 redujo la carga viral del VHB.
Estos experimentos demostraron que el AG8, ya sea como una dosis única, o dada QOW durante 8 semanas podía suprimir la carga viral.
Ejemplo 10
Los agonistas de TLR9 indujeron un perfil de citocinas diferencial
A los ratones C57BL/6 sin tratamiento se les inyectaron los agonistas de TLR9 AG1, AG8 y AG9, respectivamente. Se tomaron muestras de suero a las 4 h después de la inyección y se midió las citocinas mediante un ensayo Luminex.
Como se muestra por los resultados en la Figura 9, AG8 y AG9 tuvieron una mayor actividad en la inducción de citocinas IL-12p40, IL-6 y M1P1b, y los dos activaron un perfil de citocinas diferente al de la molécula parental, AG1 (datos no mostrados). También se observó un patrón de inducción similar para otras citocinas, p. ej., IL-12p70, IL-10, G-CSF, IFN-g, IFN-a, TNF-a (datos no mostrados). La inducción de citocinas fue dependiente de la dosificación (Figura 10).
Ejemplo 11
AG9 induce niveles más altos de a-HBsAg que AG1
Los ratones se inmunizaron por vía subcutánea o intravenosa con 10 |jg de HBsAg recombinante en combinación con 30 nmol de AG1 o AG9. Siete días después, se sangraron los ratones y se cuantificaron las concentraciones en suero de anticuerpos específicos de HBsAg mediante ELISA.
Como se muestra en la Figura 11, cuando se administró la dosis por vía subcutánea, hubo un promedio de 1,65 veces en los niveles de a-HBsAg entre los ratones dosificados con AG1 (0,332 AU) y AG9 (0,551 AU). Cuando se administró la dosis por vía intravenosa, la cantidad de anticuerpos específicos de HBsAg inducidos por AG9 (1,41 AU) fue 2,5 veces mayor que la cantidad de anticuerpos inducidos por AG1 (0,59 AU) (p<0,009). Esto sugiere que la conjugación del tocoferol con el oligonucleótido aumenta la actividad inmunoestimuladora para amplificar el proceso de inmunización. Además, la administración intravenosa del CpG ODN conjugado con tocoferol fue mucho más efectiva para inducir una respuesta humoral que la administración subcutánea, o la administración intravenosa del precursor no conjugado, AG1. Este resultado sugiere que el tocoferol afecta la biodistribución del CpG ODN que da como resultado una mayor actividad en la respuesta humoral.
Ejemplo 12
La conjugación de agonistas de TLR en restos lipófilos mediante enlazadores escindibles logró curas funcionales en ratones AW-VHB
Se infectaron ratones C57BL/6 sin tratar con AAV-VHB. Una vez que se estableció la infección, a los ratones se les administró por vía intravenosa o subcutánea cada dos semanas, 15 o 30 nmol del conjugado de tocoferol AG9 o el precursor, AG1.
Aunque los ratones infectados respondieron a la administración subcutánea de cualquiera de los compuestos, una reducción en el ADN de VHB circulante o HBsAg fue transitoria, y los niveles se recuperaron después de dos semanas (Figura 13 A y B).
La administración intravenosa repetida de 15 nmol de AG9 fue más potente que la del AG1 precursor, según lo medido por la capacidad de reducir el<a>D<n>circulante del VHB y HBsAg por debajo del nivel inferior de cuantificación. Además, después del período de tratamiento, los ratones se monitorizan por la recuperación viral. Los ratones tratados con AG9 lograron una respuesta duradera, con una supresión estable de HBsAg y una recuperación mínima de los niveles de ADN de VHB observados a 1 mes después de la dosis (Figura 13 A y B). Esto fue acompañado por la inducción de Ab a-HBsAg en la mayoría de los ratones, y por la inducción de CTL específicos de HBsAg en algunos de los ratones. Por el contrario, 3/5 ratones tratados con el precursor, AG1, lograron una respuesta duradera, y esto estaba acompañado de una seroconversión de Ab a-HBsAg y desarrollo de CTLd específicos de HBsAg. Los ratones tratados con 2/5 AG1 no se seroconvirtieron. La administración intravenosa parecía ser más eficaz que la administración subcutánea.
El análisis de Ab a-HBsAg reveló que más ratones tratados con AG9 se habían seroconvertido, y en promedio tenían mayores concentraciones circulantes de Ab a-HBsAg en comparación con los ratones tratados con el parental, AG1. Estos resultados demuestran que el oligonucleótido CpG AG9 conjugado con tocoferol tenía una mayor capacidad para producir curas funcionales en ratones infectados con AAV-VHB que el precursor no conjugado,<a>G1.
Para probar si la eficacia mejorada podría aplicarse a otros restos lipófilos, se sintetizó AG19 en el que se sustituyó palmitoilo para tocoferol. Los experimentos in vitro en la línea HEK-hTLR9 confirmaron que el AG19 tenía una actividad similar a AG9 (datos no mostrados). Se repitió el régimen de dosificación en ratones infectados con AAV-VHB como antes, con AG19. A los ratones se les administró por vía subcutánea o intravenosa cada 2 semanas durante 14 semanas con 15 nmol de compuesto. Cuando se administró la dosis por vía intravenosa (Figura 13C), AG19 fue tan efectivo como AG9 para reducir el HBsAg circulante y el ADN de VHB. Después del período de tratamiento, los niveles de HBsAg permanecieron por debajo del límite de cuantificación, y los niveles de ADN-VHB se suprimieron de manera estable. Similarmente a los ratones tratados con AG9, la supresión de la carga viral se acompañó con una fuerte inducción de Ab a-HBsAg.
Al final del estudio, medimos la respuesta CTL específica del VHB mediante ELISpot. Se cuantificó el número de CTL que responden a péptidos de HBsAg y se observó que los ratones tratados con AG9 y AG19 tenían un número significativamente mayor de a-HB CTL, en comparación con PBS o ratones tratados con AG1 parental (Figura 13D). Por lo tanto, conjugar CpG ODN con restos lipófilos tales como tocoferol o palmitoilo potenció las propiedades agonistas del ODN. Se generaron respuestas humorales y celulares específicas para el VHB que suprimían la carga viral incluso después de retirar el fármaco. Por definición, AG9 y AG19 pudieron establecer una cura funcional en el sujeto infectado con VHB.
Ejemplo 13
El AG9 logra regresión tumoral completa y control tumoral en el modelo de tumor MC-38
A ratones C57BL/6 sin tratar se les implantaron células de carcinoma de colon MC-38, y se monitorizó el tamaño del tumor. Después de que se estableció el tumor, a los ratones se les administró por vía intratumoral o intravenosa con cantidades crecientes del conjugado de tocoferol AG9 o el AG1 parental. AG14, otro CpG ODN que tiene la secuencia de
TpsCpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsApsCpsGpsTpsApsApsCpsGpsApsCpsGpsApsCpsGpsTpsT, también se probó. Las dosis usadas fueron 40 |jg, 12o |jg y 360 |jg, correspondientes a 1,6 mpk, 4,8 mpk y 14,4 mpk, respectivamente. Cuando los ratones fueron tratados por vía intratumoral, recibieron 4 dosis durante 10 días (d12, d15, d19 y d22 después de la implantación). Cuando los ratones recibieron las dosis por vía intravenosa, se les administraron 2 dosis con 7 días de diferencia (d12, día 19 después de la implantación). El crecimiento tumoral se monitorizó cada 3 días. Véase la Figura 14 para obtener información adicional sobre el estudio.
La dosificación intratumoral de AG1 o AG9 tuvo una eficacia equivalente (datos no mostrados). A la dosis de 40 jg de cada grupo, un ratón tuvo regresión tumoral completa, y los ratones restantes retrasaron el crecimiento tumoral. En la dosis de 120 jg de cada grupo, tres ratones tuvieron regresión tumoral completa y dos habían retrasado el crecimiento tumoral. En la dosis de 360 jg de AG1, tres ratones tuvieron regresión completa y un ratón retrasó el crecimiento tumoral. En la dosis de 360 jg de<a>G9, dos ratones tuvieron regresión completa, y los ratones restantes tuvieron estasis tumoral.
Como se muestra en los resultados de la Figura 15, cuando se administró la dosis por vía intravenosa, el AG9 fue más eficaz que AG1 y AG14. A la dosis de 40 jg de cada grupo, tres ratones tratados con AG9 habían retrasado el crecimiento tumoral, mientras que dos ratones tratados con AG1 tuvieron un crecimiento tumoral retrasado. En la dosis de 120 jg , tres ratones tratados con AG9 tuvieron regresión tumoral completa y los otros dos ratones retrasaron el crecimiento tumoral. Un ratón en el grupo tratado con AG1 tuvo regresión tumoral completa, y otros cuatro ratones retrasaron el crecimiento tumoral. A la dosis más alta de 360 jg, todos los ratones que recibieron AG9 tuvieron regresión tumoral completa. En los ratones tratados con AG9, no se observó ingesta o crecimiento tumoral incluso después de que los ratones volvieron a exponerse con células tumorales MC-38 el día 40 después de la implantación del tumor inicial. De los ratones que recibieron AG1, cuatro de los cinco ratones tuvieron regresión tumoral completa y uno retrasó el crecimiento tumoral. Estos datos demuestran que la administración de CpG ODN para activar TLR9 in vivo tiene ventajas terapéuticas en el tratamiento del cáncer. Además, la conjugación de tocoferol por un enlazador escindible al CpG ODN puede mejorar su ventaja terapéutica. En el contexto MC38, AG9 estimuló la respuesta inmunitaria que dio como resultado la eliminación del tumor y una respuesta de memoria que evitó el reinjerto tumoral. La inmunomodulación usando AG9 pudo activar una respuesta antitumoral y permitió la formación de una respuesta de memoria que proporcionó protección contra cualquier mayor recurrencia del tumor.
Ejemplo 14
Estudio de MTD/eficacia con AG9
A ratones C57BL/6 sin tratar se les implantan células de carcinoma de colon MC-38 y se monitorizó el tamaño del tumor. Después de que se establece el tumor, p. ej., con un volumen tumoral medio de 100-200 mm3, a los ratones se les administra vía intratumoral o intravenosa cantidades crecientes del conjugado de tocoferol AG9 o el AG1 parental (Figura 16). A los ratones se les administra por vía intravenosa una vez por semana durante dos semanas (qwk x 2), p. ej., el día 12 y el día 19, o se les administra una dosis una vez por vía intratumoral (qd x1) el día 12.
El objetivo principal del estudio es determinar la dosis máxima tolerada (MTD) de AG9, administrada qwk x 2, en ratones portadores del tumor MC-38. El objetivo secundario del estudio es determinar la eficacia de AG9, administrada qwk x 2, en tumores.
Los grupos (qwk * 2 y qd x 1, n=5/grupo) y las dosis son como lo siguiente:
Grupo n Compuesto Dosis (mpk) Grupo n Compuesto Dosis (mpk)
(O 1 10 Vehículo
oo2 10 AG9 1,6 7 5 CPG7909 1,4
0 3 10 AG9 4,8 8 5 CPG7909 4,1
T 3
-<c>o 4 10 AG9 14,4 9 5 CPG7909 12,3
oo5 5 AG9 28,9 10 5 CPG7909 24,6
6 5 AG9 43,3 11 5 CPG7909 36,9
T 03
12 3 Vehículo
13 3 AG9 1,6
ro
<o>r0o 14 3 AG9 48
<M>
1<—>
I_____ 15 I 3 AG9 14,4
Se monitorizaron los ratones y el crecimiento tumoral.
Ejemplo 15
Otros modelos tumorales
El AG9 se probó en el modelo de cáncer de próstata en ratón con tumor CT26. A los ratones BALB/C se les implantaron por vía subcutánea 3x105 de células tumorales CT26 en el flanco y se monitorizó el crecimiento tumoral cada 3-4 días. Cuando el volumen medio del tumor alcanza 75-125 mm3 (aproximadamente 12 días después de la implantación), se inicia la dosificación. A los ratones se les implantaron dos dosis, Q1W, de 40 nmol de AG1 o AG9. Después de 40 días de monitorización, todos los 8 ratones dosificados con AG9 estaban libres de tumores. Por el contrario, 7/8 de los ratones que recibieron AG1 u 8/8 que recibieron PBS tuvieron tumores y fueron sacrificados cuando los volúmenes del tumor excedieron los 1000 mm3.
AG9 se probó en el modelo de linfoma de ratón con tumor A20. A los ratones BALB/C se les implantaron por vía subcutánea 3x106 de células tumorales de linfoma A20 en el flanco y se monitorizó el crecimiento tumoral cada 1-4 días. Cuando el volumen medio del tumor alcanza 75-125 mm3 (aproximadamente 19 días después de la implantación), se inicia la dosificación. Los ratones recibieron dos dosis, Q1W, de 40 nmol de AG9. Los ratones se monitorizaron durante 60 días. Al final del período de monitorización, el 50 % de los ratones estaban libres de tumores. En los otros 5 sujetos, el crecimiento tumoral se retrasó. Los ratones 2/10 experimentaron una carga tumoral de aproximadamente 300 mm3 y se sacrificaron alrededor del día 30. Un ratón experimentó una carga tumoral de aproximadamente 1000 mm3 alrededor del día 40. Un ratón experimentó una carga tumoral de aproximadamente 300 mm3 y se sacrificó alrededor del día 50. Un ratón experimentó una carga tumoral de aproximadamente 1000 mm3 y se sacrificó alrededor del día 50. En contraste, los ratones tratados con PBS 8/8 experimentaron cargas tumorales superiores a 1500 mm3 antes del día 20 y se sacrificaron.
En resumen, estos experimentos demuestran la efectividad de los constructos de ODN descritos tales como AG9 para tratar diversos cánceres tales como carcinoma colorrectal, cáncer de próstata y linterna.
Ejemplo 16
Ensayo de células B
Los esplenocitos de ratón se aislaron de los ratones C57BL/6, después las células B se purificaron usando una columna de separación de células de glóbulos magnéticos MACS, siguiendo el protocolo del fabricante. Se estimularon 1x106 células B con la concentración indicada de oligonucleótido a 37 °C durante 48 h. Después las células se tiñeron con anticuerpos específicos para marcadores de activación, tal como CD40 durante 30 min, después se lavaron tres veces con el regulador FACS (PBS FBS al 3 %). A continuación, las células se analizaron mediante citometría de flujo siguiendo métodos estándar. La intensidad superficial de los marcadores se cuantificó mediante la intensidad de fluorescencia media. Los resultados de este ensayo se presentan en la Figura 18. Comparamos AG9 y su AG1 original y AG18, un tocoferol conjugado mediante un enlazador indirecto a AG17, y su AG17 parental. Los linfocitos B de ratón respondieron a todos los agonistas probados, y la regulación positiva de CD40 se observó tras la estimulación por los agonistas de una manera dependiente de la dosis. Notablemente, a 0,016 pM, el ODN conjugado con tocoferol AG9 y AG18 fueron más potentes que sus respectivos precursores no conjugados, AG1 y AG17. Este experimento demostró que las células B podían estimularse directamente mediante los ODN conjugados con tocoferol, y que la conjugación de tocoferol potenció la actividad agonista.
Ejemplo 17
La conjugación de agonistas de TLR con tocoferol a través de enlazadores escindibles facilita la biodistribuciónin vivoa regiones específicas dentro de órganos linfoides secundarios
Para determinar si la conjugación de tocoferol afectaría las propiedades de biodistribución in vivo del CpG ODN, los ratones se inyectaron con AG21 (que es un análogo de<a>G9 conjugado con AlexaFluor-647) o AG20 (que es un análogo de AG1 conjugado con AlexaFluor 647) ya sea por vía subcutánea o intravenosa. 24 h después de los bazos de la inyección, se extirparon los ganglios linfáticos de drenaje, hígados, riñones y pulmones y se obtuvieron imágenes mediante el uso del generador de imágenes IVIS. Como se muestra en la Figura 21A, cuando se inyectó AG21 por vía subcutánea, se localizó en el ganglio linfático de drenaje en comparación con AG20. Cuando se cuantificaron, hubo más de 2 veces de diferencia entre la localización AG21 que la de AG20. En la Figura 21B, se cuantificaron los bazos 24 h después de la inyección IV de cualesquiera de los compuestos. Después de la administración IV, el tocoferol afectó la biodistribución del compuesto y mediante el uso de IVIS la mayoría del AG21, pero no AG20 se visualizó en el bazo, el hígado y en menor medida, el riñón (datos no mostrados). En el bazo, hubo un aumento de casi 10 veces en la cantidad de localización de AG21 en comparación con AG20. Después de la administración subcutánea o intravenosa AG21 se localiza en órganos linfoides secundarios tales como los ganglios linfáticos de drenaje o el bazo, donde se coloca para activar las células inmunitarias. Estos experimentos demuestran que la conjugación de tocoferol afecta drásticamente su biodistribución.
Para visualizar la distribución de AG21 dentro de los órganos linfoides secundarios, se repitió el experimento, se incluyó en parafina los ganglios linfáticos y el bazo, se seccionaron y se visualizó la localización de ODN mediante inmunofluorescencia. Los tejidos se tiñeron con anticuerpos dirigidos contra células T o células B. Después de la inyección subcutánea se observó tinción intensa con a G21 dentro de la región folicular de células B del ganglio linfático (datos no mostrados). Curiosamente después de la inyección intravenosa, se observó tinción con AG21 intensa dentro de regiones extrafoliares. En los ratones tratados con AG1, se observó tinción con ODN débil pero detectable. Estos resultados refuerzan que la conjugación de tocoferol con el CpG ODN localiza efectivamente la ODN en los órganos linfoides secundarios, y más específicamente a regiones aisladas dentro del microambiente.
Para caracterizar los tipos celulares que se unen a AG21 en el bazo después de la inyección intravenosa, se recogieron bazos, se disociaron, después se tiñeron con anticuerpos marcados con fluorescencia dirigidos a marcadores celulares específicos para diferenciarlos. Usando citometría de flujo, se observó que las células dendríticas y los macrófagos, y en menor medida, las células B fueron todas positivas para AG21 (datos no mostrados). Los linfocitos T fueron negativos para AG21. Por lo tanto, las células que eran positivas para AG21 coincidieron con células que expresan TLR9. Este experimento demostró que la administración del CpG ODN conjugado con tocoferol, el conjugado preferiblemente dirigido a la localización en los órganos linfoides secundarios, y dentro de esos órganos, el conjugado fue absorbido preferiblemente por las células deseadas, es decir, células dendríticas, macrófagos y linfocitos B.
Ejemplo 18
La conjugación de agonistas de TLR en restos lipófilos mediante enlazadores escindibles facilita la unión a proteínas séricas tales como la albúmina
Es interesante observar un patrón de distribución sesgado de AG21 a algunos órganos tales como el hígado y el bazo, pero no a otros, tales como el riñón y el pulmón, ambos vascularizados. Se planteó la hipótesis de que el tocoferol podría facilitar la unión a proteínas séricas, y basado en la distribución de los receptores eliminadores, que determinarían la localización preferencial del CpG ODN conjugado con tocoferol. Se probó esta posibilidad in vitro. Se generaron análogos conjugados con FITC de AG1 y AG9. AG22 es un análogo de AG1 con FITC conjugado en el extremo 3'. Similarmente, AG23 es un análogo del conjugado de tocoferol AG9 con FITC conjugado en el extremo 3'. Los compuestos se cargaron en una HPLC, después se monitorizó la fluorescencia del FITC (Figura 22A). Los compuestos fueron solos o premezclados con BSA. Se observó que el AG23 conjugado con tocoferol, pero no AG22, tuvo un tiempo de retención idéntico al BSA cuando estaba presente. Este experimento demostró que el tocoferol podría facilitar la unión del CpG ODN a proteínas séricas tales como BSA. Este complejo pudo explicar en parte la distribución preferencial del CpG ODN conjugado con tocoferol a órganos linfoides secundarios y el hígado.
A continuación nos preguntamos si la capacidad de unirse a las proteínas séricas era una característica única de la conjugación de tocoferol. Se sintetizó un análogo del compuesto palmitoilado AG19. AG24 es un CpG ODN que se conjuga con palmitoilo mediante un enlazador escindible en el extremo 5' y conjugado con FITC en el extremo 3'. Se repitió el experimento anterior mezclando AG24 o AG22 a un suero bovino fetal (FBS) después analizando la mezcla por HPLC y se monitorizó el tiempo de retención del ODN por su señal fluorescente. Como se muestra en la Figura 22B, el tiempo de retención del AG24, pero no AG22 fue idéntico al FBS. Esto demostró que conjugar el CpG ODN con palmitoilo facilitó la interacción del ODN a proteínas séricas.
Ejemplo 19
La conjugación de agonistas de TLR al tocoferol mediante enlazadores escindibles facilita la autoformulación en estructuras de micelas
Debido a la naturaleza lipófila del tocoferol, también se probó la capacidad de la conjugación de tocoferol para facilitar la formación de micelas del CpG ODN. Al monitorizar el<a>G23 en la HPLC mediante el uso de la señal fluorescente FITC, se descubrió que en presencia de altas concentraciones (2 o 4 M) de urea que altera la formación de micelas, el tiempo de retención del AG23 alterado, mientras que el tiempo de retención del AG22 no se vio afectado (Figura 23). Estos resultados demostraron que la conjugación de tocoferol del CpG ODN impartió la propiedad de formación de micela en el ODN.

Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES Un constructo de CpG ODN que tiene una fórmula de (A) Fórmula (Ila): 5' M-L-[CpG ODN] 3', o Fórmula (IIb): 5' [CpG ODN]-L-M 3' en donde: M representa un resto lipídico, preferiblemente el resto lipídico comprende al menos un resto lipídico seleccionado del grupo que consiste en colesterol, tocoferol, un grupo palmitoilo y un grupo estearilo; L representa un enlazador que comprende al menos 1 átomo, opcionalmente 10-100 átomos, seleccionado del grupo que consiste en carbono, nitrógeno, oxígeno, hidrógeno, azufre y fósforo, en donde L se enlaza covalentemente al CpG ODN a través de un enlace escindible, preferiblemente a través de un éster o un enlace amida; y CpG ODN comprende al menos un motivo CpG que tiene un enlace internucleótido fosfodiéster (po), preferiblemente comprende al menos dos, tres o cuatro motivos CpG cada tiene uno el enlace internucleótido po; opcionalmente, el constructo de CpG ODN de la Fórmula (Ila) o (IIb) se conjuga covalentemente con un resto de direccionamiento, que se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en galactosa, N-acetilgalactosamina (GalNAc), fucosa, manosa, ácido siálico, ácido N-acetil neuramínico; o (B) Fórmula (IIIa): 5' M<1>-Y<1>-(((CH<2>)<2>O)m-X)n-Y<2>-[CpG ODN]-Y3-M<2>3', o Fórmula (IIIb): 5' M<2>-Y3-[CpG ODN]-Y<2>-(((CH<2>)<2>O)m-X)n-Y<1>-M<1>3' en donde: M<1>representa un resto lipídico, preferiblemente el resto lipídico comprende al menos uno seleccionado del grupo que consiste en colesterol, tocoferol, un grupo palmitoilo, y un grupo estearilo, M<2>representa un resto lipídico, un resto de direccionamiento, o está ausente, Y<1>es un enlace o un enlazador, preferiblemente etilenglicol que tiene la fórmula ((CH<2>)<2>O)o, en donde o es 1-15, enlazado covalentemente a (((CH<2>)<2>O)m-X)n a través de un enlace fosfodiéster (po), un enlace fosforotioato (ps) o un enlace, X es independientemente un enlace, un enlace po o un enlace ps, cada uno de Y<2>y Y<3>es independientemente un enlace escindible, preferiblemente comprende un éster o un enlace amida, con mayor preferencia comprende un enlace po o un enlace fosforamidato, con máxima preferencia un enlace po, siempre que cuando M<2>esté ausente, Y<3>esté ausente, CpG ODN comprende al menos un motivo CpG que tiene un enlace internucleótido po, preferiblemente comprende al menos dos, tres o cuatro motivos CpG cada uno tiene la unión internucleótida po; m es un número entero del 1 al 15, y n es un número entero del 1 al 5; y en donde CpG ODN comprende una secuencia de polinucleótidos que tiene al menos 90 % de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: (1)5' TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 3' (Id. de sec. n.°: 1); o (6)5' TCGTCGTTACGTAACGACGACGTT 3' (Id. de sec. n.°: 6).
  2. El constructo de ODN de la reivindicación 1, que tiene dicha (A).
  3. El constructo de ODN de la reivindicación 1, que tiene dicha (B).
  4. El constructo de ODN de la reivindicación 3, que tiene una fórmula de: Fórmula (IVa): 5' M-Y<1>-(((CH<2>)<2>O)m-X)n-Y<2>-[CpG ODN] 3', o Fórmula (IVb): 5' [CpG ODN]-Y<2>-(((CH<2>)<2>O)m-X)n- Y<1>-M 3' en donde: M representa un resto lipídico, preferiblemente el resto lipídico comprende al menos un resto lipídico seleccionado del grupo que consiste en colesterol, tocoferol, un grupo palmitoilo, y un grupo estearilo, Y<1>es un enlace o un enlazador, preferiblemente etilenglicol que tiene la fórmula ((CH<2>)<2>O)o, en donde o es 1-15, enlazado covalentemente a (((CH<2>)<2>O)m-X)n a través de un enlace fosfodiéster (po), un enlace fosforotioato (ps) o un enlace, X es independientemente un enlace, un enlace fosfodiéster (po) o un enlace fosforotioato (ps), Y<2>es un enlace escindible, preferiblemente comprende un éster o un enlace amida, con mayor preferencia comprende un enlace po o un enlace fosforamidato, con máxima preferencia un enlace po; CpG ODN comprende al menos un motivo CpG que tiene un enlace internucleótido po, preferiblemente comprende al menos dos, tres o cuatro motivos CpG cada uno tiene la unión internucleótida po; m es un número entero del 1 al 15, preferiblemente 6; y n es un número entero del 1 al 5, preferiblemente 2; opcionalmente, el constructo de CpG ODN de la Fórmula (IVa) o (IVb) se conjuga covalentemente con un resto de direccionamiento, que se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en galactosa, N-acetilgalactosamina (GalNAc), fucosa, manosa, ácido siálico, ácido N-acetil neuramínico.
  5. El constructo de ODN de la reivindicación 4, que tiene un constructo de fórmula seleccionado del grupo que consiste en: 5' M-po(HEG)po(HEG)po-[CpG ODN] 3'; 5' M-ps(HEG)po(HEG)po-[CpG ODN] 3', 5' M-ps(HEG)ps(HEG)po-[CpG ODN] 3', 5' M-po(HEG)ps(HEG)po-[CpG ODN] 3', 5' [CpG ODN]-po(HEG)po(HEG)po-M 3', 5' [CpG ODN]-po(HEG)ps(HEG)po-M 3', 5' [CpG ODN]-po(HEG)ps(HEG)ps-M 3', y 5' [CpG ODN]-po(HEG)po(HEG)ps-M 3', en donde: M representa un resto lipídico que comprende al menos uno seleccionado del grupo que consiste en colesterol, tocoferol, un grupo palmitoilo, y un grupo estearilo; po representa un enlace fosfodiéster; HEG representa ((CH<2>)<2>O) 6; ps representa un enlace fosforotioato; y el CpG ODN comprende al menos un motivo CpG que tiene un enlace internucleótido po, preferiblemente comprende al menos dos, tres o cuatro motivos CpG que tienen cada uno el enlace internucleótido po, en donde M se enlaza covalentemente a (HEG) directamente a través de un enlace po o ps, o indirectamente a través de un segundo enlazador que se enlaza a (HEG) directamente a través de un enlace po o ps.
  6. El constructo de ODN de la reivindicación 4, que tiene una fórmula seleccionada del grupo que consiste en: 5' Toco-po(HEG)po(HEG)po-[CpG ODN] 3', en donde Toco representa tocoferol, 5' Col-po(HEG)po(HEG)po-[CpG ODN] 3', en donde Col representa colesterol, 5' Palma-po(HEG)po(HEG)po-[CpG ODN] 3', en donde Palma representa un grupo palmitoilo, 5' [CpG ODN]-po(HEG)ps-Col 3', en donde Col representa colesterol, 5' [CpG ODN]-po(HEG)ps-Toco 3', en donde Toco representa tocoferol, y 5' [CpG ODN]-po(HEG)ps-Palma 3', en donde Palma representa un grupo palmitoilo, en donde: po representa un enlace fosfodiéster; HEG representa ((CH<2>)<2>O) 6; ps representa un enlace fosforotioato; y el CpG ODN comprende al menos un motivo CpG que tiene un enlace internucleótido po, preferiblemente comprende al menos dos, tres o cuatro motivos CpG que tienen cada uno el enlace internucleótido po, en donde el tocoferol, el colesterol, o el grupo palmitoilo se enlaza covalentemente al (HEG) directamente a través de un enlace po o ps, o indirectamente a través de un segundo enlazador que se enlaza a (HEG) directamente a través de un enlace po o ps.
  7. El constructo de ODN de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el CpG ODN tiene un enlace internucleótido fosforotioato (ps).
  8. El constructo de ODN de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde dos a cuatro de los dinucleótidos CpG en el CpG ODN tienen cada uno un enlace internucleótido fosfodiéster (po).
  9. El constructo de ODN de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el CpG ODN comprende una secuencia polinucleótida seleccionada del grupo que consiste en: (1) 5’ TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGps TpsT 3’ (Id. de sec. n.°: 8); (2) 5’ TpsCpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGps TpsT 3’ (Id. de sec. n.°: 9 ) ; ....................................................................................... (3) 5’ TpsCpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGps TpsT 3’ (Id. desee. n.°: 1 0 ) ; .................................. (4) 5’ TpsCpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGps TpsT 3’ (Id. desee. n.°: 11); ...................................................... (5) 5’ TpsCpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGps TpsT 3’ (Id. de sec. n.°: 12); (6) 5 ’ TpsC psG psTpsC psG psTpsTpsTpsTpsG psTpsC poG psTpsTpsTpsTpsG psTpsC poG ps TpsT 3 ’ (Id. de sec. n.°: 13); (7) 5’ TpsCpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGps T psT 3’ (Id. desee. n.°: 14); (8) 5’ TpsCpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsApsCpsGpsTpsApsApsCpsGpsApsCpsGpsApsCpsGp sTpsT 3’ (Id. de sec. n.°: 15); (9) 5’ TpsCpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsApsCpsGpsTpsApsApsCpsGpsApsCpsGpsApsCpsGp sTpsT 3’ (Id. de sec. n.°: 16); (10) 5’ TpsCpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsApsCpoGpsTpsApsApsCpsGpsApsCpsGpsApsCpsG psTpsT 3’ (Id. de sec. n.°: 17); (11) 5’ TpsCpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsApsCpoGpsTpsApsApsCpoGpsApsCpsGpsApsCpsG psTpsT 3’(Id. de sec. n.°: 18); y (12) 5’ T psCpsGpsT psCpoGpsTpsT psApsCpoGpsTps Aps ApsCpoGpsApsCpoGpsApsCpsG psTpsT 3’ (Id. de sec. n.°: 19); en donde: po representa un enlace intemucleótido fosfodiéster; y ps representa un enlace intemucleótido fosforotioato.
  10. El constructo de ODN de la reivindicación 2, que tiene la estructura de: (1) 5’ Toco-po(HEG)po(HEG)po-TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpo G psTpsT3’ (Id. de sec. n.°: 27); ‘ ’ ' (2) 5’ Toco-po(HEG)po(HEG)po-TpsCpsGpsT psCpoGpsTpsTpsT psT psGpsT psCpoGpsTpsTpsT psT psGpsTpsCps GpsTpsT 3’(Id. de sec. n.°: 28); (3) 5’ TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpo GpsTpsT-(HEG)po(HEG)po-Toco 3’ (Id. de sec. n.°: 29); (4) 5’ TpsCpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCps GpsTpsT-(HEG)po(HEG)po-Toco 3’ (Id. de sec. n.°: 30); (5) 5’ Chol-po(HEG)po(HEG)po-TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpo GpsTpsT 3’ (Id. de sec. n.°: 31); (6) 5’ Cholpo(HEG)po(HEG)poTpsCpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTp sTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsT 3’ (Id. de sec. n.°: 32); (7) 5’ Chol-po(HEG)po(HEG)po-T psCpoGpsT psCpsGpsTpsTpsTpsT psGpsT psCpsGpsT psT psT psTpsGpsT psCps GpsTpsT 3’(Id. de sec. n.°: 33); (8) 5’ Chol-po(HEG)po(HEG)po-TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCps GpsTpsT 3’(Id. de sec. n.°; 34); (9) 5’ Chol-po(HEG)po(HEG)po-TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCps GpsTpsT 3’ (Id. de sec. n.°: 35); (10) 5’ Chol-po(HEG)po(HEG)po-TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpo GpsTpsT 3’(Id. desee. n.°: 36); ' ' ' ‘ ' (11) 5 ’ TpsC psG psTpsC psG psTpsTpsTpsTpsG psTpsC psG psTpsTpsTpsTpsG psTpsC ps G psTpsTps-(H EG )po(H EG )po-C hol 3 ’ (Id. de sec. n.°: 37); (12) 5’ T psCpoGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsT psGpsTpsCpsGpsT psT psT psTpsGpsTpsCps GpsTpsTps-(HEG)po(HEG)po-Chol 3’ (Id. de sec. n.°: 38); (13) 5’ TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCps GpsTpsTps-(HEG)po(HEG)po-Chol 3 ’ (Id. de sec. n.°: 39); (14) 5’ TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpo GpsTpsTps-(HEG)po(HEG)po-Chol 3’ (Id. de sec. n.°: 40); (15) 5’ TpsCpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCps GpsTpsTps-(HEG)po(HEG)po-Toco 3’ (Id. de sec. n.°: 41); (16) 5’ Toco-po(HEG)po(HEG)po-TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpo GpsTpsT 3’(Id. de sec. n.°: 42); (17) 5’ T psCpoGpsTpsCpsGpsTpsT psTpsTpsGpsTpsCpsGpsT psTpsTpsTpsGpsTpsCps GpsTpsTps-(HEG)po(HEG)po-Toco 3’ (Id. de sec. n.°: 43); (18) 5’ TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCps GpsTpsTps-(HEG)po(HEG)po-Toco 3’ (Id. de sec. n.°: 44); (19) 5’ TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCps GpsTpsTps-(HEG)po(HEG)po-Toco 3’ (Id. de sec. n.°: 45); (20) 5 ’ TpsC poG psTpsC poG psTpsTpsTpsTpsG psTpsC poG psTpsTpsTpsTpsG psTpsC po G psTpsTps-(H EG )po(H EG )po-Toco 3 ’ (Id. de sec. n.°: 46); (21) 5’ Toco-po(HEG)po(HEG)po-TpsCpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCps GpsTpsT 3 ’(Id. de sec. n.°: 47); (22) 5’ Toco-po(HEG)po(HEG)po-T psCpoGpsT psCpsGpsTpsT psTpsT psGpsT psCpsGpsTpsTpsT psTpsGpsT psCps GpsTpsT 3’ (Id. de sec. n.°: 48); (23) 5’ Toco-po(HEG)po(HEG)po-TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCps GpsTpsT 3’ (Id. de sec. n.°: 49); (24) 5’ Toco-po(HEG)po(HEG)po-T psCpoGpsT psCpoGpsT psT psT psT psGpsT psCpoGpsT psTpsTpsT psGpsTpsCps GpsTpsT 3’ (Id. de sec. n.°: 50); (25) 5 ’-TpsCpoGpsTpsCGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGps TpsTps-HEGps-Chol 3 ’(Id. desee. n.°: 51); (26) 5’-TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCps GpsTpsTps (HEG)po(HEG)po-Chol 3’ (Id. de sec. n.°: 52); (30) 5’ Palmitoyl-po(HEG)po(HEG)po-TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpo GpsTpsT 3’ (Id. de sec. n.°: 56); en donde: Col representa colesterol; Toco representa tocoferol; palmitoilo representa un grupo palmitoilo; HEG representa ((CH<2>)<2>O) 6; po representa un enlace fosfodiéster; y ps representa un enlace fosforotioato, en donde el tocoferol, el colesterol, o el grupo palmitoilo se enlaza covalentemente al (HEG) directamente a través de un enlace po o ps, o indirectamente a través de un segundo enlazador que se enlaza a (HEG) directamente a través de un enlace po o ps.
  11. 11. El constructo de ODN de la reivindicación 1, que tiene la estructura de: (a)
    o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde los oligonucleótidos representan dicho CpG ODN, opcionalmente: (i) en donde el CpG ODN contiene Id. de sec. n.°: 1, opcionalmente en donde el CpG ODN consiste en 5' T psCpoGpsT psCpoGpsT psT psT psT psGpsT psCpoGpsT psT psT psT psGpsT psCpoGpsT psT -3'; o (ii) que tiene la siguiente estructura:
    o
  12. 12. Una composición farmacéutica que comprende el constructo de ODN de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y un portador farmacéuticamente aceptable.
  13. 13. Un método para preparar una composición farmacéutica, que comprende combinar el constructo de ODN de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 con un portador farmacéuticamente aceptable.
  14. 14. El constructo de ODN de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, o la composición farmacéutica de la reivindicación 12, para su uso en un método para estimular una respuesta inmunitaria en un sujeto que necesita del mismo.
  15. 15. El constructo de ODN de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11 o la composición farmacéutica de la reivindicación 12, para su uso en un método para tratar cáncer, enfermedad inflamatoria, enfermedad autoinmune o infección viral, más particularmente infección viral de ARN o ADN, más particularmente infección por virus de la Hepatitis B (VHB) o virus de la Hepatitis B crónica (VHB).
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