TW201932596A - 寡核苷酸構築體及其用途 - Google Patents

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謝爾蓋 格里亞茲諾夫
雷歐尼德 貝傑曼
西奧多 雲
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Abstract

描述一種基於寡去氧核苷酸之免疫刺激Toll樣受體9(TLR9)促效劑。亦描述一種包含TLR9促效劑之組成物、製備TLR9促效劑之方法、及使用TLR9促效劑治療免疫疾病、病症、或病況(諸如病毒感染或癌症)之方法。

Description

寡核苷酸構築體及其用途 【相關申請案之交互參照】
本申請案根據35 U.S.C.§119(e)主張2017年11月2日申請之美國臨時專利申請案第62/580,924號的優先權，其所揭露之全文以引用方式併入本文中。
【電子提交序列表之參照】
本申請案含有序列表，該序列表已以ASCII格式序列表經由EFS-Web電子檔提交，檔案名稱為「688097_119U1 Sequence Listing」，創建日期2018年10月31日，檔案大小11.3KB。經EFS-Web提交之序列表係本說明書之一部分，其全文以引用方式併入本文中。
本揭露係關於一種寡核苷酸構築體、包含該寡核苷酸構築體的組成物、及製備該寡核苷酸構築體的方法。該寡核苷酸構築體可用作免疫調控分子，且特定言之，作為Toll樣受體9(TLR9)促效劑。因此，本揭露亦關於一種使用寡核苷酸構築體作為TLR9促效劑之方法，其可單獨或與其他製劑組合，用於治療或預防可因調控TLR9活性而受益的疾病，諸如免疫疾病、病症、或病況、病毒感染、與癌症。
Toll樣受體(TLR)係一種在先天免疫反應中扮演關鍵作用之模式辨識受體(PRR)蛋白質。TLR從微生物病原體(諸如細菌、 真菌、寄生蟲與病毒)辨識與病原體相關之分子模式(PAMP)，其可與宿主分子區分。TLR為跨膜蛋白質，通常呈二聚體發揮功能，並且由涉及先天性免疫反應之細胞表現，包括呈遞抗原之樹突細胞與吞噬細胞之巨噬細胞。
有至少十種人類TLR家族成員，TLR1至TLR10，及至少十二種鼠科TLR家族成員，TLR1至TLR9與TLR11至TLR13，其等之差異分別在於所辨識之抗原型態。例如，TLR9為由未甲基化之胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤(CpG)二核苷酸活化之核苷酸感測TLR，其中在單股或雙股DNA(包括病毒DNA)中，胞嘧啶利用磷酸二酯或硫代磷酸酯鍵聯連接鳥嘌呤。
TLR的活化導致一系列信號傳導事件，導致產生I型干擾素(IFN)、炎性細胞因子、與趨化因子，並誘導免疫反應。最終，此發炎亦活化後天免疫系統，其隨後導致清除入侵之病原體與受感染之細胞。
TLR9表現在免疫系統之B細胞及漿細胞樣樹突細胞中。含CpG之DNA與TLR9之結合會啟動下游信號傳導級聯，導致活化轉錄因子NF-κB、MAPK、與IRF7，最終導致誘導快速發炎，其特徵在於各種不同介白素與細胞因子提高表現(Yamamoto與Takeda,Gastroenterology Research and Practice,vol.2010)。特定言之，依據CpG類別而定，由含CpG之促效劑刺激TLR9會導致提高產生IFN-α、TNF-α、IL-6及/或IL-1。
B型肝炎病毒(HBV)係導致包括B型肝炎、纖維化、肝硬化、與肝細胞癌等疾病之雙股DNA(dsDNA)病毒。約有20億人感染HBV，近4億人患有慢性B型肝炎(慢性HBV)，其特徵在於血液中持續出現病毒與次病毒粒子超過6個月(Xu等人，2014,Gastrointest Tumors,1(3)：135-145)。慢性HBV目前使用IFN-α與核苷或核苷酸類似物治療，但由於在感染之肝細胞中持續存在共價閉合之環狀DNA(cccDNA)，因此無法終極治癒。存留的cccDNA作為病毒RNA與新病毒粒子的模板，持續發揮作用。據認為，利用合成之 CpG寡去氧核糖核苷酸(CpG ODN)，透過TLR9信號傳導途徑刺激B細胞，誘導病毒特異性B細胞反應，可以有效消除帶有cccDNA之肝細胞(Isogawa等人，2005,J.Virology 79(11)7269-72)。
大量證據顯示，免疫療法為治療多種癌症之一種可行且有效的方法。靶向Toll樣受體與其他先天辨識途徑之配體代表用於調控先天免疫性來產生抗腫瘤免疫性的有效策略。目前正探討以TLR促效劑作為疫苗佐劑時，於抗癌療法中活化免疫細胞及促進發炎之能力(參見例如Kaczanowska等人，J Leukoc Biol.2013 Jun；93(6)：847-863，及其中參考文獻)。例如，據報導，TLR9配體除了延長CD4+ T細胞存活及壓制TReg活性外，亦藉由加強IL-2產生及IL-2R表現而增加CD4+與CD8+ T細胞數目(如上述文獻，及其中參考文獻)。已顯示神經母細胞瘤細胞株上TLR9之CpG ODN刺激會降低細胞增殖及提高半胱天冬酶依賴性之細胞凋亡，從而提高荷瘤小鼠存活(如上述文獻)。然而，亦據報導，腫瘤細胞上TLR之接合會藉由造成維持慢性發炎環境、誘導癌細胞增殖、及促進細胞存活，而促進腫瘤生長。例如，據報導，表現TLR9的人類乳癌與胃癌細胞在組織培養中之TLR9刺激，會加強分泌MMP13與COX-2，造成增強的入侵能力，而在神經膠質瘤的情況下，儘管TLR9具有誘導轉移的性質，但對細胞增殖沒有影響，此突顯了TLR9信號傳導可對不同腫瘤細胞類型具有各種不同效應(如上述文獻)。
用於促進醫療性寡核苷酸之體內傳遞之策略包括寡核苷酸之化學修飾、使用脂質奈米載體、由寡核苷酸連接到受體靶向劑、及使用小分子來加強寡核苷酸之有效性。然而，由於其等無法到達大多數組織及其等之潛在毒性問題，奈米粒子傳遞系統可能具有有限之治療應用範圍。此外，與反義或siRNA不同，含CpG之寡核苷酸促效劑藉由直接結合TLR9來發揮功能。當設計含CpG之寡核苷酸促效劑與傳遞分子(諸如膽固醇)之接合物時，必須避免立體屏障。
因此，仍需要有效治療或預防可因調控TLR9活性而受益之疾病之有效醫療劑，諸如慢性HBV感染與癌症。
本揭露藉由提供一種可透過與TLR9結合並活化來刺激免疫反應之基於寡去氧核苷酸(ODN)之構築體，滿足了可有效治療或預防可因調控TLR9活性而受益之疾病之有效醫療劑之需求。本揭露亦有關一種此等ODN構築體之用途，其可單獨或與其他製劑組合，用於治療或預防可因調控TLR9活性而受益的疾病，諸如免疫疾病、病症、或病況，包括病毒感染或癌症。
本揭露ODN構築體包含透過連接基接合到脂質部分之CpG寡去氧核苷酸。
ODN構築體之設計包括例如胞嘧啶-鳥嘌呤(CpG)模體及其等之核苷酸間鍵聯(internucleotide linkage)之數目與位置，及脂質部分之結構與位置、及連接基之存在或不存在。脂質部分可包括與ODN構築體接合之脂質分子，諸如膽固醇與生育酚。此外，ODN構築體包含在寡核苷酸之一個或多個CpG模體內之磷酸二酯核苷酸間鍵聯。
根據本揭露實施例之ODN構築體已顯示達到作為TLR9促效劑之加強生物利用率與效力之意料不到的水準。雖然不希望受到任何特定理論的束縛，但增強之TLR9促效劑活性可藉由刺激潛浮病毒之再表現，同時刺激免疫系統辨識病毒產物，而有效減少或消除帶有HBV cccDNA之肝細胞。特定言之，免疫系統不會辨識在潛伏狀態之HBV病毒，且由本揭露ODN構築體誘導之低度發炎可以導致病毒從該潛浮期出現。然後即可透過活化之免疫系統辨識所造成之HBV再表現及新形成之病毒表現產物，以控制循環病毒，並殺死感染病毒的細胞，有效消除帶有HBV cccDNA之肝細胞。
根據本揭露實施例之本揭露ODN構築體亦可用於治療腫瘤，較佳係癌症，諸如結腸直腸癌。本揭露CpG ODN構築體誘導體內對抗腫瘤細胞之免疫力，並提高荷瘤小鼠之存活率。
在一個大致態樣中，本揭露係關於一種CpG ODN構築體，其具有透過連接基連接到CpG ODN之脂質部分。在一實施例中，CpG ODN構築體具有下式：式I：5’M1-L1-[CpG ODN]-L2-M2 3’，其中：各M1與M2獨立地代表脂質部分，較佳係該脂質部分包含至少一個選自由膽固醇、生育酚、棕櫚醯基、及硬脂基所組成之群組者，可選地M1及M2中之一者不存在；各L1與L2獨立地代表連接基，較佳係該連接基包含至少10個選自由碳、氮、氧、氫、硫、及磷所組成之群組的原子，且L係經由可切割鍵聯、較佳係經由酯或醯胺鍵與CpG ODN共價連接，可選地當各別的M1或M2不存在時，L1及L2中之一者不存在；且較佳地CpG ODN包含至少一個具有磷酸二酯(po)核苷酸間鍵聯之CpG模體；可選地，式(I)之CpG ODN構築體係進一步共價接合至靶向部分，其較佳係選自由半乳糖、N-乙醯半乳糖胺(GalNAc)、海藻糖、甘露糖、唾液酸、N-乙醯基神經胺酸所組成之群組。
在一個實施例中，本揭露係關於一種具有下式之CpG ODN構築體：式(IIa)：5’M-L-[CpG ODN]3’、或式(IIb)：5’[CpG ODN]-L-M 3’其中：M代表脂質部分，較佳係該脂質部分包含至少一個選自由膽固醇、生育酚、棕櫚醯基、及硬脂基所組成之群組者； L代表連接基，其包含至少10個選自由碳、氮、氧、氫、硫、與磷所組成之群組的原子，且L係經由可切割鍵聯、較佳係經由酯或醯胺鍵與CpG ODN共價連接；且CpG ODN包含至少一個具有po核苷酸間鍵聯之CpG模體，較佳地包含至少兩個、三個、或四個CpG模體，其等各具有po核苷酸間鍵聯；可選地，式(IIa)或(IIb)之CpG ODN構築體係進一步共價接合至靶向部分，其較佳係選自由半乳糖、N-乙醯半乳糖胺(GalNAc)、海藻糖、甘露糖、唾液酸、N-乙醯基神經胺酸所組成之群組。
在一實施例中，式(IIa)或(IIb)中之連接基L包含-(((CH2)2O)m-X)n-，其中m為1至15之整數，X獨立地係磷酸二酯(po)或硫代磷酸酯(ps)鍵聯，且n為1至5之整數。
在另一實施例中，式(IIa)或(IIb)中之連接基L透過磷酸二酯(po)鍵聯或硫代磷酸酯(ps)鍵聯連接至脂質部分M。
在又另一實施例中，式(IIa)或(IIb)中之連接基L係經由磷酸二酯(po)鍵聯或胺基磷酸酯鍵聯、較佳係經由po鍵聯連接至CpG ODN。
在另一態樣中，本揭露關於一種ODN構築體，其具有以下結構：式(HIa)：5’M1-Y1-(((CH2)2O)m-X)n-Y2-[CpG ODN]-Y3-M2 3’、或式(IIIb)：5’M2-Y3-[CpG ODN]-Y2-(((CH2)2O)m-X)n-Y1-M1 3’其中：M1代表脂質部分，較佳地該脂質部分包含至少一個選自由膽固醇、生育酚、棕櫚醯基、及硬脂基所組成之群組者；M2代表脂質部分、靶向部分、或不存在， Y1為鍵或連接基，較佳係具有式((CH2)2O)o之乙二醇，其中o為1-15，其係經由磷酸二酯(po)鍵聯、硫代磷酸酯(ps)鍵聯、或鍵共價連接至(((CH2)2O)m-X)n，X獨立地係鍵、po鍵聯、或ps鍵聯，各Y2及Y3獨立地係可切割鍵聯，較佳地包含酯或醯胺鍵，更佳地包含po鍵聯或胺基磷酸酯鍵聯，最佳的是po鍵聯，前提是當M2不存在時，Y3不存在，CpG ODN包含至少一個具有po核苷酸間鍵聯之CpG模體，較佳地包含至少兩個、三個、或四個CpG模體，其等各具有po核苷酸間鍵聯；m係1至15之整數；且n係1至5之整數。
在一個實施例中，本揭露係關於一種CpG ODN構築體，其具有下式：式(IVa)：5’M-Y1-(((CH2)2O)m-X)n-Y2-[CpG ODN]3’、或式(IVb)：5’[CpG ODN]-Y2-(((CH2)2O)m-X)n-Y1-M 3’其中：M代表脂質部分，較佳地該脂質部分包含至少一個選自由膽固醇、生育酚、棕櫚醯基、及硬脂基所組成之群組者；Y1為鍵或連接基，較佳係具有式((CH2)2O)o之乙二醇，其中o為1-15，其係經由磷酸二酯(po)鍵聯、硫代磷酸酯(ps)鍵聯、或鍵共價連接至(((CH2)2O)m-X)n，X獨立地係鍵、磷酸二酯(po)鍵聯、或硫代磷酸酯(ps)鍵聯，Y2為可切割鍵聯，較佳地包含酯或醯胺鍵，更佳地包含po鍵聯或胺基磷酸酯鍵聯，最佳的是po鍵聯； CpG ODN包含至少一個具有po核苷酸間鍵聯之CpG模體，較佳地包含至少兩個、三個、或四個CpG模體，其等各具有po核苷酸間鍵聯；m係1至15之整數，較佳的是6；且n係1至5之整數，較佳的是2；可選地，式(IVa)或(IVb)之CpG ODN構築體係進一步共價接合至靶向部分，其較佳係選自由半乳糖、N-乙醯半乳糖胺(GalNAc)、海藻糖、甘露糖、唾液酸、N-乙醯基神經胺酸所組成之群組。
根據具體實施例，脂質部分代表膽固醇、生育酚、或棕櫚醯基。
根據具體實施例，各式(I)至(IVb)之CpG ODN具有一個或多個硫代磷酸酯(ps)核苷酸間鍵聯。根據一更具體態樣，式(I)中ODN構築體之所有核苷酸間鍵聯均為硫代磷酸酯(ps)鍵聯。根據一具體態樣，ODN構築體中之CpG二核苷酸之C與G之間至少一個核苷酸間鍵聯為立體定向之硫代磷酸酯(ps)核苷酸間鍵聯。根據一具體態樣，CpG ODN構築體中之CpG二核苷酸之C與G之間至少一個核苷酸間鍵聯為磷酸二酯(po)核苷酸間鍵聯，且CpG ODN之其餘各核苷酸間鍵聯為硫代磷酸酯(ps)鍵聯。根據一具體態樣，CpG ODN具有19至24個核苷酸之長度。
在另一大致態樣中，本揭露係關於一種醫藥組成物，其包含本揭露ODN構築體及醫藥上可接受之載劑。
在另一大致態樣中，本揭露係關於一種製備本揭醫藥組成物之方法，其包含將本揭露ODN構築體與醫藥上可接受之載劑組合。
在另一大致態樣中，本揭露係關於一種刺激有需要之對象之免疫反應的方法，該方法包含向該對象投予本揭露之醫藥組成物。
在另一大致態樣中，本揭露係關於一種治療有需要之對象之疾病的方法，該方法包含向該對象投予本揭露之醫藥組成物。較 佳地該疾病選自由免疫疾病、病症、或病況所組成之群組，諸如病毒感染或癌症。更佳地該疾病為慢性HBV感染或實體腫瘤。
本揭露之其他態樣、特徵、及優點可自下文揭示內容(包括實施方式與其較佳實施例，以及隨附之申請專利範圍)中了解。
本揭露之前述發明內容及下文實施方式可在配合隨附之圖示時，更有利於理解。咸理解，本揭露並不受限於圖式中所示確切實施例。
在圖式中：圖1示出藉由在不同位置處具有磷酸二酯連接之CpG模體之TLR9促效劑對報導子細胞株之TLR9活化，由OD630結果所測定；圖2出示包含由磷酸二酯連接之CpG模體藉由可切割連接基接合膽固醇之根據本揭露實施例之ODN構築體對報導子細胞株之TLR9活化，由OD630結果所測定；圖3出示根據本揭露實施例之ODN構築體對人類(左圖)與小鼠(右圖)報導子細胞株之TLR9活化，標準化至ODN2006；圖4出示根據本揭露實施例之ODN構築體在投予ODN構築體後4h對小鼠之體內細胞因子誘導(IL-6左圖；TNF-α，中圖；MIP-1β，右圖)；圖5出示實驗進行流程圖，分析根據本揭露實施例之ODN構築體對小鼠之HBV感染的影響；圖6出示接受單次劑量(左圖)或多次劑量(右圖)之根據本揭露實施例之ODN構築體治療之小鼠之HBV DNA含量；圖7出示接受單次劑量(左圖)或多次劑量(右圖)之根據本揭露實施例之ODN構築體治療之小鼠之HBsAg含量；圖8示出接受單次劑量(左圖)或多次劑量(右圖)之根據本揭露實施例之ODN構築體治療之小鼠之HBeAg含量。 圖9示出接受皮下注射本揭露ODN構築體對小鼠之體內細胞因子誘導(IL-12p40，左圖；IL-6，中圖；MIP-1β，右圖)；圖10示出接受靜脈內注射本揭露ODN構築體(稱為AG8)對小鼠之體內細胞因子誘導(IL-12p40，左圖；IL-6，中圖；MIP-1β，右圖)；圖11示出接受靜脈內(IV)或皮下(SQ)投予HBsAg與ODN構築體之小鼠在第14天時之HBsAg特異性IgG含量；圖12繪示根據本揭露實施例之例示性ODN構築體；圖13A示出接受皮下投予AG9(係一種根據本揭露實施例之ODN構築體)之AAV-HBV小鼠之HBsAg、抗HBs抗體、與HBV DNA含量；圖13B示出接受靜脈內投予AG9之AAV-HBV小鼠之HBsAg、抗HBS抗體、與HBV DNA含量；圖13C示出接受靜脈內投予AG19(係一種根據本揭露實施例之ODN構築體)之AAV-HBV小鼠之HBsAg、抗HBs抗體、與HBV DNA含量；圖13D示出接受根據本揭露實施例之ODN構築體投予之AAV-HBV小鼠之HBsAg特異性T細胞含量；圖14出示在MC-38荷瘤小鼠(結直腸腸癌模型)中，使用根據本揭露實施例之ODN構築體經腫瘤內(IT)與靜脈內(IV)投予時之試驗性效力研究流程圖；圖15出示已植入MC-38結腸癌細胞之未經處理(naïve)之C57BL/6小鼠接受靜脈內投予遞增劑量之根據本揭露實施例之ODN構築體後之腫瘤體積，特定言之，圖15A出示接受靜脈內投予AG1 ODN構築體之小鼠之腫瘤體積；圖15B出示接受靜脈內投予AG9 ODN構築體之小鼠之腫瘤體積；及圖15C出示接受靜脈內投予AG17 ODN構築體之小鼠之腫瘤體積； 圖16出示MC-38荷瘤小鼠中，使用根據本揭露實施例之ODN構築體進行最大耐受劑量(MTD)/效力研究之流程圖；圖17繪示根據本揭露實施例之ODN構築體之合成流程圖；圖18出示從C57BL/6小鼠中單離且接受根據本揭露實施例之ODN構築體刺激之小鼠脾細胞，自其中所純化B細胞之CD40含量；圖19出示根據本揭露實施例之ODN構築體在報導子細胞株中，對人類TLR9之活化，標準化至ProMune；圖20示出根據本揭露實施例之ODN構築體之小鼠TLR9活化，標準化至ODN1826；圖21A出示對小鼠皮下(SQ)投予AG21(與AlexaFluor-647接合之AG9)，導致寡聚物累積在小鼠之引流淋巴結，與AG20(與AlexaFluor 647接合之AG1)比較；圖21B出示對小鼠經靜脈內(IV)投予AG21，導致寡聚物累積在小鼠之脾臟，與AG20比較；圖22A出示生育酚可以促進CpG ODN與血清蛋白質(諸如牛血清白蛋白(BSA))結合；圖22B證實CpG ODN與棕櫚醯基接合可促進ODN與胎牛血清(FBS)中之血清蛋白質之交互作用；及圖23證實CpG ODN與生育酚接合可賦與ODN形成膠束之性質。
各篇公開案、論文、及專利已於先前技術及整份說明書引用或描述；此等參考文獻之各者全文係以引用方式併入本文中。本說明書中所包括有關文件、作用、材料、裝置、物品、或其類似者的論述，目的在於提供關於本揭露之內容。此等論述並非承認，任一或所有此等情事形成了關於任何所揭示或請求之發明的先前技術部分。
定義
除非另有定義，否則本文所採用所有技術及科學用語均與本揭露所屬技術領域中具有通常知識者所共同理解的含義相同。在其他方面，在本文中所使用的某些用語具有如本說明書所定之意義。在本文中所引用的所有專利、已公開專利申請案及公開案係以引用方式併入，猶如全文說明於本文中。必須注意的是，本文及隨附之申請專利範圍中所使用之單數形式「一(a/an)」及「該(the)」皆包括複數指稱，除非上下文另有明確說明。
在整篇說明書與申請專利範圍中，除非上下文另有要求，否則用字「包含(comprise)」及其變化諸如「comprises及comprising」將被理解為隱含包括指定之整數或步驟或一組整數或步驟，但不排除任何其他整數或步驟或一組整數或步驟。當本文使用用語「包含」時，可改用用語「含有」或「包括」替代，或有時候在本文中使用用語「具有」。
當用於本文時，「由...組成(consisting of)」排除所請之元件中未指定之任何元件、步驟、或成分。當用於本文時，「基本上由...組成(consisting essentially of)」不排除不會實質影響申請專利範圍之基本及新穎特徵的材料或步驟。如本文在本發明態樣或實施例內容中使用任何上述用語「包含」、「含有」、「包括」與「具有」時，均可改用「由...組成」或「基本上由...組成」替代，來改變本揭露之範圍。
如本文中所使用，用語「TLR9」或「Toll樣受體9」，亦稱為CD289、UNQ5798、或PRO19605，係指可被未甲基化胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤(CpG)二核苷酸活化之核苷酸感測TLR。TLR9實例包括(但不限於)：由3922個核苷酸長度之mRNA轉錄本編碼之1032個胺基酸長度蛋白質的人類TLR9(NM_017442.3)。人類TLR9實例之胺基酸序列示於GenBank登錄號NP_059138.1。如本文中所使用，用語「TLR9」包括來自人類以外之其他物種之TLR9之同源物，諸如Macaca Fascicularis(食蟹獼猴)或Pan troglodytes(黑猩猩)。如 本文中所使用，用語「TLR9」包括包含突變之蛋白質，例如全長野生型TLR9之點突變、片段、插入、缺失、及剪接變體。用語「TLR9」亦涵蓋TLR9胺基酸序列之轉譯後修飾。
如本文中所使用，用語「促效劑」係指與一個或多個TLR結合並誘導受體介導之反應的分子。例如，促效劑可誘導、刺激、提高、活化、促進、增強、或上調受體活性。此等活性稱為「促效劑活性」。例如，TLR9促效劑可透過已結合之受體活化或提高細胞信號傳導。促效劑包括(但不限於)：核酸、小分子、蛋白質、碳水化合物、脂質、或與受體結合或交互作用之任何其他分子。促效劑可模擬天然受體配體之活性。促效劑可與此等天然受體配體在序列、構形、電荷、或其他特性方面呈一致性，使得其等能夠被受體辨識。這種辨識可導致細胞內之生理及/或生化變化，使得細胞與存在之促效劑反應，其方式即如同存在天然受體配體一般。如本文中所使用，用語「TLR9促效劑」係指具有TLR9促效劑作用之任何化合物。
如本文中所使用，用語「誘導」與「刺激」及其變化型式係指任何可以測得上升之細胞活性。TLR9介導之細胞活性之誘導可包括例如免疫細胞族群之活化、增殖或成熟，增加產生細胞因子及/或提高免疫功能之另一種指示劑。在某些實施例中，誘導免疫反應可以包括提高B細胞增殖、產生抗原特異性抗體、提高抗原特異性T細胞增殖、改善樹突細胞抗原呈遞和/或提高某些細胞因子、趨化因子、及共同刺激標記物之表現。
如本文中所使用，「脂質部分」係指含有親脂結構之部分。脂質部分，諸如烷基、脂肪酸、三酸甘油酯、二酸甘油酯、類固醇、鞘脂、糖脂、或磷脂。例如脂質部分可包括固醇(諸如膽固醇)、具有甲基化疏水側鏈之甲基化色滿醇(諸如生育酚)、或飽和脂肪酸(諸如棕櫚酸)或其酯。當脂質部分附接高親水性分子(諸如核酸)時，可實質增強血漿蛋白質結合性，結果延長親水性分子之循環半衰期。此外，與某些血漿蛋白質(諸如脂蛋白)結合時，已顯示可以在表現相應脂蛋白受體(例如LDL-受體、HDL-受體、或清除劑受體 SR-B1)之特定組織中提高吸收性。參見，例如Bijsterbosch,M.K等人，(2000)Nucleic Acids Res.28,2717-25；Wolfrum,C.等人，(2007)Nat Biotechnol 25：1149-57 25。
脂質部分亦可與靶向部分組合使用，以改善靶向傳遞策略之細胞轉運。靶向部分可以為直接或間接附接本揭露CpG ODN之任何合適部分或配體，其可主導ODN構築體到達體內標靶，諸如大分子(例如受體)、細胞(例如巨噬細胞、樹突細胞、肝細胞、腫瘤細胞)或其組分。因此，靶向部分可以包括任何合適之天然或合成分子，諸如脂質、脂肪酸衍生物、半乳糖、N-乙醯半乳糖胺(GalNAc)、海藻糖、甘露糖、唾液酸、N-乙醯基神經胺酸、抗體、脂質體、膠束、樹狀體、奈米球、奈米膠囊、肽、蛋白質、白蛋白、與激素。
如本文中所使用，用語「連接基(linker)」是指連結核苷酸(諸如CpG ODN之5'或3'末端核苷酸)與脂質部分或靶向部分之化學部分。用語「可切割連接基(cleavable linker)」係指一種連接基或其一部分，其在需要時，可在不會改變其所附接核苷酸或核酸分子之某些條件下進行切割，移除脂質部分或靶向部分。取決於鍵聯之性質，可在體外或體內進行切割，例如利用酸或鹼處理(例如利用腙處理)、利用酵素切割(例如利用核酸酶或蛋白酶)、藉由氧化或還原該鍵聯(例如二硫橋鍵)、採用光處理(例如採用光漂白)。根據具體實施例，連接基包含任何撓性可切割連接基。連接基包括(但不限於)例如共價鍵、經取代或未取代之烷基、經取代或未取代之雜烷基，諸如聚乙二醇(PEG)、一個、兩個或三個無鹼基與/或核糖醇基團、乙二醇部分、或肽。根據本揭露實施例，連接基係經由可切割鍵聯，諸如磷酸二酯(po)、胺基磷酸酯鍵聯(np)、或硫代磷酸酯(ps)鍵聯，較佳係經由酯或醯胺鍵，諸如po鍵聯或np鍵聯，最佳係po鍵聯，與CpG ODN共價連接。根據本揭露實施例，連接基包含具有式((CH2)2O)o之乙二醇，其中o為1至15，其係經由po、np或ps鍵聯與CpG ODN共價連接。
在一實施例中，該可切割鍵聯(諸如po鍵聯)可被磷酸二酯酶酵素切割，諸如例如環狀核苷酸磷酸二酯酶、磷脂酶C、磷脂酶D、自體刺激素(autotaxin)、鞘磷脂磷酸二酯酶、DNase、RNase、或限制性內切核酸酶。
根據本揭露實施例，連接基包含((CH2)2O)m，其中m為1至15之整數，諸如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。根據具體實施例，連接基包含一個或多個具有如下分子式之六乙二醇(HEG)部分：((CH2)2O)6。
在一實施例中，連接基包含一個或多個藉由一個或多個磷酸二酯(po)或硫代磷酸酯(ps)鍵聯連接之HEG部分。在一實施例中，連接基包含一個藉由po鍵聯連接CpG ODN之HEG部分。在一實施例中，連接基包含兩個HEG部分，其等藉由po鍵聯連接在一起，並經由po鍵聯連接至CpG ODN。
根據其他實施例，連接基包含可切割之二硫基。根據其他實施例，連接基包含蛋白酶可切割之肽，諸如例如肽連接基，其包含對腫瘤微環境具有特異性之蛋白酶(諸如uPA、豆莢蛋白(legumain)、間質蛋白酶(matriptase)、或組織蛋白酶(cathepsin))之可切割位點。
根據本發明實施例，脂質部分(M)，諸如膽固醇、生育酚、棕櫚醯基、或硬脂基，可透過連接基與CpG ODN共價連接。連接基可包含一個或多個連接基部分，諸如具有式((CH2)2O)m之乙二醇，其中m為1-15。在實施例中，m為6，且連接基部分為六乙二醇(HEG)。
根據本發明實施例，脂質部分(M)，諸如膽固醇、生育酚、棕櫚醯基、或硬脂基，可直接經由鍵或間接經由第二連接基(諸如包含具有式((CH2)2O)o之乙二醇之連接基，其中o為1-15)與HEG部分共價連接。第二連接基可經由鍵、磷酸二酯(po)鍵聯、胺基磷酸酯鍵聯(np)或硫代磷酸酯(ps)鍵聯與HEG共價連接。
每個連接基部分可獨立地藉由鍵聯(諸如選自由磷酸二酯(po)鍵聯、胺基磷酸酯鍵聯(np)、及硫代磷酸酯(ps)鍵聯所組成之群組的鍵聯)連接至其他連接基部分。連接基可以進一步透過可切割鍵聯(諸如選自由磷酸二酯(po)鍵聯、胺基磷酸酯鍵聯(np)、及硫代磷酸酯(ps)鍵聯所組成之群組的鍵聯)與CpG ODN連結。在實施例中，連接基在脂質部分與CpG ODN之間包含一個連接基部分。在實施例中，連接基在脂質部分與CpG ODN之間包含兩個連接基部分。在實施例中，每個連接基部分透過po鍵聯與至少一個其他連接基部分連結。在實施例中，每個連接基部分透過ps鍵聯與至少一個其他連接基部分連結。在實施例中，每個連接基部分透過np鍵聯與至少一個其他連接基部分連結。在實施例中，連接基部分經由第二連接基與脂質部分共價連接，諸如包含具有式((CH2)2O)o之乙二醇之連接基，其中o為1-15，且該第二連接基經由鍵、磷酸二酯(po)鍵聯、胺基磷酸酯鍵聯(np)、或硫代磷酸酯(ps)鍵聯與脂質部分共價連接。在實施例中，連接基包含兩個連接基部分，其利用脂質部分與CpG ODN之間的po鍵聯連結。在實施例中，連接基包含兩個連接基部分，其利用脂質部分與CpG ODN之間的ps鍵聯連結。在實施例中，連接基包含兩個連接基部分，其利用脂質部分與CpG ODN之間之np鍵聯連結。
脂質部分(M)可以透過鍵或鍵聯(諸如選自磷酸二酯(po)鍵聯、胺基磷酸酯鍵聯(np)、或硫代磷酸酯(ps)鍵聯所組成之群組的鍵聯)與連接基連結。如本文中所使用，「M-po(HEG)」或「(HEG)po-M」意指脂質部分M直接經由磷酸二酯(po)鍵聯或間接經由第二連接基與HEG部分共價連接，該第二連接基為諸如包含具有式((CH2)2O)o之乙二醇之連接基，其中o為1-15，且該第二連接基係經由磷酸二酯(po)鍵聯與HEG部分共價連接。例如，如本文中所使用，「Toco-ps(HEG)」可指生育酚基經由第二連接基(諸如具有式((CH2)2O)o之乙二醇，其中o為1-15)與CpG ODN共價連接，該第二連接基係經由磷酸二酯(po)鍵聯與HEG部分共價連接。
如本文中所使用，「M-ps(HEG)」或「(HEG)ps-M」意指脂質部分M直接經由硫代磷酸酯(ps)鍵聯或間接經由第二連接基與HEG部分共價連接，該第二連接基為諸如包含具有式((CH2)2O)o之乙二醇之連接基，其中o為1-15，且該第二連接基係經由硫代磷酸酯(ps)鍵聯與HEG部分共價連接。例如，如本文中所使用，「Toco-ps(HEG)」可指生育酚基經由第二連接基(諸如具有式((CH2)2O)o之乙二醇，其中o為1-15)與CpG ODN共價連接，該第二連接基係經由硫代磷酸酯(ps)鍵聯與HEG部分共價連接。
如本文中所使用，用語「CpG」或「CpG模體」意指含有未甲基化胞嘧啶-鳥嘌呤之二核苷酸序列(亦即，胞嘧啶(C)接著鳥嘌呤(G)，亦即5’-CG-3’)利用磷酸酯鍵或含磷主鏈(諸如磷酸二酯(po)鍵聯)連接。
如本文中所使用，「寡核苷酸」、「寡去氧核苷酸」、或「ODN」意指由複數個連接之核苷酸單元形成之多核苷酸。此等寡核苷酸可得自現有核酸來源，或者可利用合成方法產生。在一些實施例中，寡核苷酸各具有約5至約30個核苷酸殘基，較佳係約10至約25個核苷酸殘基，更佳係約19至約24個核苷酸殘基。在一實施例中，ODN含有19個核苷酸殘基。在一實施例中，ODN含有20個核苷酸殘基。在一實施例中，ODN含有21個核苷酸殘基。在一實施例中，ODN含有22個核苷酸殘基。在一實施例中，ODN含有23個核苷酸殘基。在一實施例中，ODN含有24個核苷酸殘基。本揭露之ODN可從現有核酸來源(例如基因組或cDNA)獲得，但較佳係合成(例如利用寡核苷酸合成產生)。
如本文中所使用，「核苷酸」包括任何天然或天然存在之核苷酸，其包括選自由腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)與尿嘧啶(U)、去氧核糖、及磷酸根基團所組成之群組的含氮鹼基。例示性核苷酸包括(但不限於)天然存在的核苷酸鹼基，例如腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、與胸腺嘧啶。
如本文中所使用，用語「CpG寡核苷酸」、「CpG寡去氧核苷酸」、與「CpG ODN」可互換使用，並且意指包含至少一個CpG模體之寡核苷酸。本揭露CpG ODN可以包括一種或更多種類別之CpG ODN，諸如A類、B類、C類或P類ODN，如Bode等人，2011,Expert Rev Vaccines,10(4)：499-511中所述。A類CpG ODN亦稱為D型，在5’及/或3'端含有含CpG之中心迴文型(palindromic)模體及聚-G模體。B類CpG ODN亦稱為K型，通常被全硫代磷酸酯主鏈完全穩定化，並在某些較佳鹼基內容中包括一個或多個CpG二核苷酸。C類CpG ODN通常被全硫代磷酸酯主鏈完全穩定化，並且包括中心迴文型CpG模體及其他CpG二核苷酸。P類CpG ODN通常被全硫代磷酸酯主鏈完全穩定化，並且包括兩個迴文序列及多個CpG二核苷酸。
如本文中所使用，用語「核苷酸間鍵聯」意指透過其糖連結兩個相鄰核苷酸之化學鍵聯，係由磷原子與相鄰核苷之間之帶電或中性基團組成。核苷酸間鍵聯實例包括磷酸二酯(po)、硫代磷酸酯(ps)、胺基磷酸酯(np)、二硫代磷酸酯(ps2)、甲基膦酸酯(mp)、與甲基硫代磷酸酯(rp)。硫代磷酸酯、胺基磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、與甲基硫代磷酸酯為穩定化核苷酸間鍵聯，而磷酸二酯係天然存在之核苷酸間鍵聯。
寡核苷酸硫代磷酸酯通常合成為Rp與Sp硫代磷酸酯鍵聯之隨機消旋混合物。然而，根據具體實施例，本揭露ODN構築體之硫代磷酸酯鍵聯含有Rp與Sp硫代磷酸酯鍵聯之混合物。根據具體實施例，ODN構築體之CpG ODN具有立體定向之ps核苷酸間鍵聯，亦即ps鍵聯為Rp或Sp，佔CpG ODN中所存在寡核苷酸分子之至少75%，諸如至少80%、或至少85%、或至少90%、或至少95%，諸如至少99%。
根據具體實施例，CpG ODN中之一至四個、較佳地三個或四個CpG二核苷酸各具有磷酸二酯(po)核苷酸間鍵聯，且CpG ODN之其餘各核苷酸間鍵聯為硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯。在實施例中， CpG ODN中之各CpG二核苷酸均具有磷酸二酯(po)核苷酸間鍵聯，且CpG ODN之其餘各核苷酸具有硫代磷酸酯(ps)核苷酸間鍵聯。
本文中所使用之用語「載劑(carrier)」係指任何賦形劑、稀釋劑、填充料、鹽、緩衝劑、穩定劑、助溶劑、油、脂質、含脂質囊泡、微球、脂質體包封、或其他所屬技術領域中已知用於醫藥配方之材料。將理解載劑、賦形劑或稀釋劑之特徵將取決於特定應用之投予途徑而定。如本文中所使用，用語「醫藥上可接受之載劑」係指不干擾根據本揭露組成物之有效性或根據本揭露組成物之生物活性之無毒性材料。根據具體實施例，依據本揭露，任何適用於基於CpG ODN之促效劑醫藥組成物之醫藥上可接受之載劑均可用於本揭露。
如本文中所使用，用語「對象(subject)」係指動物。根據具體實施例，對像是哺乳動物，包括非靈長類動物(例如，駱駝、驢、斑馬、奶牛、豬、馬、山羊、羊、貓、狗、大鼠、兔、天竺鼠、或小鼠)或靈長類動物(例如，猴子、黑猩猩、或人類)。在具體實施例中，該對象為人類。
如本文中所使用，用語「治療有效量(therapeutically effective amount)」係指活性成分或組分在對象中引起所欲生物或醫學反應之量。治療有效量可以憑經驗且以常規方式參考所述目的來判定。例如，可以可選地採用體外分析法協助判別最佳劑量範圍。具體有效劑量之選擇可以(例如經由臨床試驗)由所屬技術領域中具有通常知識者基於若干因素之考慮來判定，該等因素包括待治療或預防之疾病、所涉及之症狀、患者身體質量、患者免疫狀態、及具有通常知識者已知之其他因素。配方中所採用之精確劑量亦會取決於投予途徑、及疾病嚴重性，並且應根據執業醫師之判斷及各患者之情況來決定。可從體外或動物模型試驗系統推衍之劑量反應曲線外插得到有效劑量。
如本文中所使用，用語「治療(treat、treating及treatment)」皆意指改善或逆轉與可因調控TLR9活性而受益之疾病(諸如免疫疾病、病症、或病況)相關之至少一種可量測物理參數，該物理參數未必可在對象中覺察，但可以是可在對象中覺察的。用語 「治療」亦可指造成疾病、病症、或病況消退、預防疾病、病症、或病況進展、或至少延緩疾病、病症、或病況之進展。在一具體實施例中，「治療(treat、treating及treatment)」意指與可因調控TLR9活性而受益之疾病(諸如免疫疾病、病症、或病況，包括病毒感染或癌症)相關之一多種症狀之緩解、預防發展或發作、或縮短持續時間。在一具體實施例中，「治療」係指預防疾病、病症、或病況之復發。在一具體實施例中，「治療」係指增加具有疾病、病症、或病況之對象的存活。在一具體實施例中，「治療」係指排除對象之疾病、病症、或病況。
如本文中所使用，「可因調控TLR9活性而受益之疾病」包括其中可因刺激TLR9信號傳導而使對象受益之疾病。例如，其中可因調控TLR9活性而受益之疾病可包括免疫疾病、病症、或病況。根據具體實施例，待治療之疾病、病症、或病況為癌症、炎性疾病、病症、或病況、自體免疫疾病、病症、或病況、或由病原體引起之疾病、病症、或病況，諸如病毒感染。
根據具體實施例，病毒感染為RNA或DNA病毒，諸如腺病毒、巨細胞病毒、A型肝炎病毒(HAV)、嗜肝病毒(包括HBV、慢性HBV)、黃病毒(包括黃熱病毒(Yellow Fever virus))、肝炎病毒(包括C型肝炎病毒(HCV))、單純皰疹第1型與第2型、帶狀皰疹、人類皰疹病毒6、人類免疫缺乏症病毒(HIV)、人類乳突病毒(HPV)、A型流感病毒、B型流感病毒、麻疹、副流感病毒、瘟疫病毒、脊髓灰質炎病毒、痘病毒、鼻病毒、冠狀病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、造成出血熱之多種病毒家族，包括沙狀病毒(Arenaviruses)、布亞病毒(Bunyaviruses)與絲狀病毒(Filoviruses)，及一系列由RNA與DNA病毒引起之病毒性腦炎。
根據具體實施例，癌症或腫瘤為實體腫瘤或血癌。根據具體實施例，癌症或腫瘤為癌瘤、肉瘤、黑色素瘤、淋巴瘤、或白血病。根據具體實施例，癌症或腫瘤為癌瘤、肉瘤、白血病、或由病毒 引起之癌症。根據具體實施例，癌症為乳癌、結腸癌、膀胱癌、肺癌、前列腺癌、胃癌、或胰臟癌、或淋巴母細胞性或骨髓性白血病。
本文中所使用之在向對象投予二或更多種療法上下文中之用語「組合(in combination)」係指使用超過一種療法。本文所採用用語「組合」並不限制向對象投予療法之順序或此等給藥之間之時間。例如，第一療法(例如本文描述之組成物)可在向對象投予第二療法之前(例如5分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時、2小時、4小時、6小時、12小時、16小時、24小時、48小時、72小時、96小時、1週、2週、3週、4週、5週、6週、8週或12週以前)、之同時或之後(例如5分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時、2小時、4小時、6小時、12小時、16小時、24小時、48小時、72小時、96小時、1週、2週、3週、4週、5週、6週、8週或12週之後)投予。
ODN構築體
在一實施例中，CpG ODN構築體具有下式：式I：5’M1-L1-[CpG ODN]-L2-M2 3’，其中：各M1及M2獨立地代表脂質部分，較佳地該脂質部分包含至少一個選自由膽固醇、生育酚、棕櫚醯基、及硬脂基所組成之群組的脂質部分，可選地M1及M2中之一者不存在；各L1及L2獨立地代表連接基，較佳地該連接基包含至少10個選自由碳、氮、氧、氫、硫、及磷所組成之群組的原子，且L係經由可切割鍵聯、較佳係經由酯或醯胺鍵與CpG ODN共價連接，可選地當各別的M1或M2不存在時，L1及L2之一者不存在；且較佳地CpG ODN包含至少一個具有磷酸二酯(po)核苷酸間鍵聯之CpG模體。
在一個實施例中，本揭露係關於一種CpG ODN構築體，其具有下式：式(IIa)：5’M-L-[CpG ODN]3’、或式(IIb)：5’[CpG ODN]-L-M 3’其中：M代表脂質部分，較佳地該脂質部分包含至少一個選自由膽固醇、生育酚、棕櫚醯基、及硬脂基所組成之群組者；L代表連接基，其包含至少10個選自由碳、氮、氧、氫、硫、及磷所組成之群組的原子，且L係經由可切割鍵聯、較佳係經由酯或醯胺鍵與CpG ODN共價連接；且CpG ODN包含至少一個具有po核苷酸間鍵聯之CpG模體，較佳地包含至少兩個、三個、或四個CpG模體，其等各具有po核苷酸間鍵聯。
根據具體態樣，連接基L之長度包含選自由碳、氮、氧、氫、硫、及磷所組成之群組的5-100個原子，更佳係20-80個原子、20-40個原子、或30-60個原子。根據具體態樣，該連接基包含磷酸二酯(po)或硫代磷酸酯(ps)鍵聯，並包含((CH2)2O)m，其中m為1至15之整數，較佳係5至10，更佳係6。
在一實施例中，式(IIa)或(IIb)中之連接基L包含-(((CH2)2O)m-X)n-，其中m為1至15之整數，諸如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15，X獨立地係磷酸二酯(po)或硫代磷酸酯(ps)鍵聯，且n為1至5之整數，諸如1、2、3、4、或5。
在另一實施例中，式(IIa)或(IIb)中的連接基L透過磷酸二酯(po)鍵聯或硫代磷酸酯(ps)鍵聯連接至脂質部分M。
在又另一實施例中，式(IIa)或(IIb)中之連接基L係經由磷酸二酯(po)鍵聯或胺基磷酸酯鍵聯、較佳係經由po鍵聯與CpG ODN連接。
在一實施例中，L為-Y1-(((CH2)2O)m-X)n-Y2-；或L為-Y2-(((CH2)2O)m-X)n-Y1-，其中：Y1為鍵或連接基，較佳係具有式((CH2)2O)o之乙二醇，其中o為1-15，其係經由磷酸二酯(po)鍵聯、硫代磷酸酯(ps)鍵聯、或鍵與(((CH2)2O)m-X)n共價連接；Y2為可切割鍵聯，其包含酯或醯胺鍵；各X獨立地係鍵、po鍵聯、或ps鍵聯；m係1至15之整數；且n係1至5之整數。
在實施例中，Y2為po鍵聯或np鍵聯。
在另一態樣中，本揭露關於一種ODN構築體，其具有以下結構：式(IIIa)：5’M1-Y1-(((CH2)2O)m-X)n-Y2-[CpG ODN]-Y3-M2 3’、或式(IIIb)：5’M2-Y3-[CpG ODN]-Y2-(((CH2)2O)m-X)n-Y1-M1 3’其中：M1代表脂質部分，較佳地該脂質部分包含至少一個選自由膽固醇、生育酚、棕櫚醯基、及硬脂基所組成之群組者；M2代表脂質部分、靶向部分、或不存在，Y1為鍵或連接基，較佳係具有式((CH2)2O)o之乙二醇，其中o為1-15，其係經由磷酸二酯(po)鍵聯、硫代磷酸酯(ps)鍵聯、或鍵與(((CH2)2O)m-X)n共價連接，X獨立地係鍵、po鍵聯、或ps鍵聯，各Y2及Y3獨立地係可切割之鍵聯，較佳地包含酯或醯胺鍵，更佳地包含po鍵聯或胺基磷酸酯鍵聯，最佳的是po鍵聯，前提是當M2不存在時，Y3不存在， CpG ODN包含至少一個具有po核苷酸間鍵聯之CpG模體，較佳地包含至少兩個、三個、或四個CpG模體，其等各具有po核苷酸間鍵聯；m係1至15之整數；且n係1至5之整數。
在一個實施例中，本揭露係關於一種CpG ODN構築體，其具有下式：式(IVa)：5’M-Y1-(((CH2)2O)m-X)n-Y2-[CpG ODN]3’、或式(IVb)：5’[CpG ODN]-Y2-(((CH2)2O)m-X)n-Y1-M 3’其中：M代表脂質部分，較佳地該脂質部分包含至少一個選自由膽固醇、生育酚、棕櫚醯基、及硬脂基所組成之群組者；Y1為化學鍵或連接基，較佳係1-5個乙二醇部分，其係經由磷酸二酯(po)鍵聯、硫代磷酸酯(ps)鍵聯或鍵與(((CH2)2O)m-X)n共價連接，X獨立地係鍵、磷酸二酯(po)鍵聯、或硫代磷酸酯(ps)鍵聯，Y2為可切割鍵聯，較佳地包含酯或醯胺鍵，更佳地包含po鍵聯或胺基磷酸酯鍵聯，最佳的是po鍵聯；CpG ODN包含至少一個具有po核苷酸間鍵聯之CpG模體，較佳地包含至少兩個、三個、或四個CpG模體，其等各具有po核苷酸間鍵聯；m係1至15之整數，較佳的是6；且n係1至5之整數，較佳的是2；可選地，式(IVa)或(IVb)之CpG ODN構築體係進一步共價接合至靶向部分，其較佳係選自由半乳糖、N-乙醯半乳糖胺(GalNAc)、海藻糖、甘露糖、唾液酸、N-乙醯基神經胺酸所組成之群組。
根據一具體實施例，X獨立地係磷酸二酯(po)鍵聯、或不存在，Y為po鍵聯，m為6，n為2，且M代表包含生育酚或棕櫚醯基之脂質部分。
根據一具體實施例，ODN構築體具有選自由下列所組成之群組的結構：5’M-po(HEG)po(HEG)po-[CpG ODN]3’；5’M-ps(HEG)po(HEG)po-[CpG ODN]3’、5’M-ps(HEG)ps(HEG)po-[CpG ODN]3’、5’M-po(HEG)ps(HEG)po-[CpG ODN]3’、5’[CpG ODN]-po(HEG)po(HEG)po-M 3’、5’[CpG ODN]-po(HEG)ps(HEG)po-M 3’、5’[CpG ODN]-po(HEG)ps(HEG)ps-M 3’、及5’[CpG ODN]-po(HEG)po(HEG)ps-M 3’，其中：M代表脂質部分，其包含至少一個選自由膽固醇、生育酚、棕櫚醯基、及硬脂基所組成之群組者；po代表磷酸二酯鍵聯；HEG代表((CH2)2O)6；ps代表硫代磷酸酯鍵聯；且CpG ODN包含至少一個具有po核苷酸間鍵聯之CpG模體，較佳地包含至少兩個、三個、或四個CpG模體，其等各具有po核苷酸間鍵聯，其中M係直接經由po或ps鍵聯或間接經由第二連接基共價連接至(HEG)，該第二連接基係直接經由po或ps鍵聯連接至(HEG)。
根據一具體實施例，ODN構築體具有選自由下列所組成之群組的結構： 5’Toco-po(HEG)po(HEG)po-[CpG ODN]3’，其中Toco代表生育酚，5’Chol-po(HEG)po(HEG)po-[CpG ODN]3’，其中Chol代表膽固醇，5’Palm-po(HEG)po(HEG)po-[CpG ODN]3’，其中Palm代表棕櫚醯基，5’[CpG ODN]-po(HEG)ps-Chol 3’，其中Chol代表膽固醇，5’[CpG ODN]-po(HEG)ps-Toco 3’，其中Toco代表生育酚，及5’[CpG ODN]-po(HEG)ps-Palm 3’，其中Palm代表棕櫚醯基，其中：po代表磷酸二酯鍵聯；HEG代表((CH2)2O)6；ps代表硫代磷酸酯鍵聯；且CpG ODN包含至少一個具有po核苷酸間鍵聯之CpG模體，較佳地包含至少兩個、三個、或四個CpG模體，其等各具有po核苷酸間鍵聯，其中該生育酚、膽固醇、或棕櫚醯基係直接經由po或ps鍵聯或間接經由第二連接基共價連接至(HEG)，該第二連接基係直接經由po或ps鍵聯連接至(HEG)。
在一實施例中，CpG ODN含有許多個適於活化TLR9之CpG二核苷酸。在一實施例中，CpG ODN含有至少一個CpG二核苷酸。在一實施例中，CpG ODN含有至少兩個CpG二核苷酸。在一實施例中，CpG ODN含有至少三個CpG二核苷酸。在一實施例中，CpG ODN含有至少四個CpG二核苷酸。在一實施例中，CpG ODN含有一個CpG二核苷酸。在一實施例中，CpG ODN含有兩個CpG二核苷酸。在一實施例中，CpG ODN含有三個CpG二核苷酸。在一實施例中，CpG ODN含有四個CpG二核苷酸。
在一實施例中，CpG ODN之CpG二核苷酸位在CpG ODN內，以活化TLR9。在一實施例中，CpG ODN之第一CpG二核 苷酸與第二CpG二核苷酸分隔至少一個核苷酸。在一實施例中，CpG ODN之第一CpG二核苷酸與第二CpG二核苷酸分隔至少兩個核苷酸。在一實施例中，CpG ODN之第一CpG二核苷酸與第二CpG二核苷酸分隔至少三個核苷酸。在一實施例中，CpG ODN之第一CpG二核苷酸與第二CpG二核苷酸分隔至少四個核苷酸。在一實施例中，CpG ODN之第一CpG二核苷酸與第二CpG二核苷酸分隔至少五個核苷酸。在一實施例中，CpG ODN之第一CpG二核苷酸與第二CpG二核苷酸分隔至少六個核苷酸。在一實施例中，CpG ODN之第一CpG二核苷酸與第二CpG二核苷酸分隔一個核苷酸。在一實施例中，CpG ODN之第一CpG二核苷酸與第二CpG二核苷酸分隔兩個核苷酸。在一實施例中，CpG ODN之第一CpG二核苷酸與第二CpG二核苷酸分隔三個核苷酸。在一實施例中，CpG ODN之第一CpG二核苷酸與第二CpG二核苷酸分隔四個核苷酸。在一實施例中，CpG ODN之第一CpG二核苷酸與第二CpG二核苷酸分隔五個核苷酸。在一實施例中，CpG ODN之第一CpG二核苷酸與第二CpG二核苷酸分隔六個核苷酸。
在一實施例中，CpG二核苷酸與CpG ODN之3'端分隔至少一個核苷酸。在一實施例中，CpG二核苷酸與CpG ODN之3'端分隔至少兩個核苷酸。在一實施例中，CpG二核苷酸與CpG ODN之3'端分隔至少三個核苷酸。在一實施例中，CpG二核苷酸與CpG ODN之3'端分隔至少四個核苷酸。在一實施例中，CpG二核苷酸與CpG ODN之3'端分隔至少五個核苷酸。在一實施例中，CpG二核苷酸與CpG ODN之3'端分隔一個核苷酸。在一實施例中，CpG二核苷酸與CpG ODN之3'端分隔兩個核苷酸。在一實施例中，CpG二核苷酸與CpG ODN之3'端分隔三個核苷酸。在一實施例中，CpG二核苷酸與CpG ODN之3'端分隔四個核苷酸。在一實施例中，CpG二核苷酸與CpG ODN之3'端分隔五個核苷酸。
在一實施例中，CpG二核苷酸與CpG ODN之5'端分隔至少一個核苷酸。在一實施例中，CpG二核苷酸與CpG ODN之5'端分隔至少兩個核苷酸。在一實施例中，CpG二核苷酸與CpG ODN之 5'端分隔至少三個核苷酸。在一實施例中，CpG二核苷酸與CpG ODN之5'端分隔至少四個核苷酸。在一實施例中，CpG二核苷酸與CpG ODN之5'端分隔至少五個核苷酸。在一實施例中，CpG二核苷酸與CpG ODN之5'端分隔一個核苷酸。在一實施例中，CpG二核苷酸與CpG ODN之5'端分隔兩個核苷酸。在一實施例中，CpG二核苷酸與CpG ODN之5'端分隔三個核苷酸。在一實施例中，CpG二核苷酸與CpG ODN之5'端分隔四個核苷酸。在一實施例中，CpG二核苷酸與CpG ODN之5'端分隔五個核苷酸。
根據具體態樣，ODN構築體之CpG ODN具有硫代磷酸酯(ps)核苷酸間鍵聯。根據具體態樣，ODN構築體之CpG ODN具有立體定向之硫代磷酸酯(ps)核苷酸間鍵聯。根據具體態樣，ODN構築體之CpG ODN中之一至四個、較佳地三個或四個CpG二核苷酸各具有磷酸二酯(po)核苷酸間鍵聯，且CpG ODN之其餘各核苷酸間鍵聯為硫代磷酸酯(ps)核苷酸間鍵聯。根據其他具體態樣，CpG ODN中之兩個核苷酸間鍵聯各具有磷酸二酯(po)核苷酸間鍵聯，且CpG ODN中其餘各核苷酸間鍵聯為硫代磷酸酯(ps)鍵聯。根據其他具體態樣，CpG ODN中之三個核苷酸間鍵聯各具有磷酸二酯(po)核苷酸間鍵聯，且CpG ODN中其餘各核苷酸間鍵聯為硫代磷酸酯(ps)鍵聯。根據其他具體態樣，CpG ODN中之四個核苷酸間鍵聯為磷酸二酯(po)核苷酸間鍵聯，且CpG ODN中其餘各核苷酸間鍵聯為硫代磷酸酯(ps)鍵聯。根據其他具體態樣，CpG ODN中之五個或更多個核苷酸間鍵聯各具有磷酸二酯(po)核苷酸間鍵聯，且CpG ODN中其餘各核苷酸間鍵聯為硫代磷酸酯(ps)鍵聯。
根據一些實施例，本揭露ODN構築體包含TLR9促效劑，其包含CpG ODN，該CpG ODN包含、較佳地係由選自由下列所組成之群組的多核苷酸序列組成：5’TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 3’(SEQ ID NO：1)；5’GGGGGACGATCGTCGGGGGG 3’(SEQ ID NO：2)；5’GGGGTCAACGTTGAGGGGGG 3’(SEQ ID NO：3)； 5’TCCATGACGTTCCTGACGTT 3’(SEQ ID NO：4)；5’TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG 3’(SEQ ID NO：5)；5’TCGTCGTTACGTAACGACGACGTT 3’(SEQ ID NO：6)；及5’TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGT 3’(SEQ ID NO：7)。
根據一些實施例，本揭露ODN構築體包含TLR9促效劑，其包含CpG ODN，該CpG ODN包含、較佳地係由與SEQ ID NO：1-7中之一者具有或至少具有70%、75%、94%、93%、96%、97%、98%、99%、97%、98%、99%、97%、98%、99%、97%一致性之多核苷酸序列組成。
根據具體態樣，本揭露ODN構築體包含CpG ODN，該CpG ODN包含、較佳地係由選自由下列所組成之群組的多核苷酸序列組成： (1) (SEQ ID NO：8)； (2) (SEQ ID NO：9)； (3) (SEQ ID NO：10)； (4) (SEQ ID NO：11)； (5) (SEQ ID NO：12)； (6) (SEQ ID NO：13)； (7) (SEQ ID NO：14)； (8) (SEQ ID NO：15)； (9) (SEQ ID NO：16)； (10) (SEQ ID NO：17)； (11) (SEQ ID NO：18)； (12) (SEQ ID NO：19)； (13) (SEQ ID NO：20)； (14) (SEQ ID NO：21)； (15) (SEQ ID NO：22)； (16) (SEQ ID NO：23)； (17) (SEQ ID NO：24)； (18) (SEQ ID NO：25)；及 (19) (SEQ ID NO：26)； 其中： po代表磷酸二酯核苷酸間鍵聯；且ps代表硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯。
根據一些實施例，本揭露ODN構築體包含TLR9促效劑，其包含CpG ODN，該CpG ODN包含、較佳地係由與SEQ ID NO：8-26中之一者具有或至少具有70%、75%、94%、93%、93%、97%、98%、99%、97%、98%、99%、97%、98%、99%、97%、或此等數值之間任何百分比之一致性之多核苷酸序列組成。
根據具體態樣，本揭露ODN構築體包含選自由下列所組成之群組的結構： (1) (SEQ ID NO：27)； (2) (SEQ ID NO：28)； (3) (SEQ ID NO：29)； (4) (SEQ ID NO：30)； (5) (SEQ ID NO：31)； (6) (SEQ ID NO：32)； (7) (SEQ ID NO：33)； (8) (SEQ ID NO：34)； (9) (SEQ ID NO：35)； (10) (SEQ ID NO：36)； (11) (SEQ ID NO：37)； (12) (SEQ ID NO：38)； (13) (SEQ ID NO：39)； (14) (SEQ ID NO：40)； (15) (SEQ ID NO：41)； (16) (SEQ ID NO：42)； (17) (SEQ ID NO：43)； (18) (SEQ ID NO：44)； (19) (SEQ ID NO：45)； (20) (SEQ ID NO：46)； (21) (SEQ ID NO：47)； (22) (SEQ ID NO：48)； (23) (SEQ ID NO：49)； (24) (SEQ ID NO：50)； (25) (SEQ ID NO：51)； (26) (SEQ ID NO：52)； (27) (SEQ ID NO：53)； (28) (SEQ ID NO：54)； (29) (SEQ ID NO：55)； (30) (SEQ ID NO：56)； 其中：Chol代表膽固醇；Toco代表生育酚；Palmitoyl代表棕櫚醯基；HEG代表((CH2)2O)6；po代表磷酸二酯鍵聯；且ps代表硫代磷酸酯鍵聯。
其中該生育酚、膽固醇、或棕櫚醯基係直接經由po或ps鍵聯或間接經由第二連接基共價連接至(HEG)，該第二連接基係直接經由po或ps鍵聯連接至(HEG)。
在一實施例中，該ODN構築體具有以下結構： 或其消旋性或對掌性結構，其中「寡核苷酸」代表對TLR9具有促效活性之CpG ODN。
在一實施例中，該ODN構築體具有以下結構： 或其消旋性或對掌性結構，其中「寡核苷酸」代表對TLR9具有促效活性之CpG ODN。
在一實施例中，CpG ODN含有SEQ ID NO：1，較佳地SEQ ID NO：8：
在一實施例中，CpG ODN含有以下結構：
根據具體態樣，本揭露ODN構築體可進一步接合至靶向部分。如本文中所使用，用語「靶向部分」係指適於傳遞其接合之促效劑至標靶細胞之任何部分。靶向部分實例包括例如碳水化合物、肽、蛋白質、小分子、脂質部分、或毒素，其可被細胞表面受體特異性辨識。適用之碳水化合物部分包括(但不限於)：半乳糖、N-乙醯半乳糖胺(GalNAc)、海藻糖、甘露糖、與唾液酸(N-乙醯神經胺酸)。根據具體實施例，靶向部分係與存在於所需之特定標靶細胞類型上之受體結合。該靶向部分有助於讓ODN構築體靶向所需要之標靶位點。一種改善靶向部分傳遞之方式為利用受體介導之內吞活性。這種吸收機制涉及與膜受體結合之ODN構築，藉由膜結構內陷或藉由傳遞系統與細胞膜融合，移動進入被膜包封的區域內部。此過程藉由特異性配體與受體結合後，活化細胞表面或膜受體來啟動。已知並且已經研究了許多受體介導性內吞系統，包括辨識糖類(諸如半乳糖、甘露糖、甘露糖-6-磷酸酯)、肽、與蛋白質(諸如轉鐵蛋白、去唾液酸糖蛋白、維生B12、胰島素、與表皮生長因子(EGF))者。去唾液酸糖蛋白受體(ASGP-R)是高容量受體，其在肝細胞上有豐富含量。ASGP-R對N-乙醯基-D-半乳糖胺(GalNAc)之親和力顯示比D-Gal高50倍。過去的工作已經顯示需要多價數才可以達到nM之親和力，同時糖之間的間距也很重要。甘露糖受體與D-甘露糖之高親和力代表另一對重要之基於碳水化合物之配體-受體對。甘露糖受體高度表現在特定細胞類型，諸如巨噬細胞及可能之樹突細胞。甘露糖接合物及甘露糖基化藥物載劑已成功用於將藥物分子靶向該等細胞。例如，參見Biessen等人(1996)J.Biol.Chem.271,28024-28030；Kinzel等人(2003)J.Peptide Sci.9,375-385；Barratt等人(1986)Biochim.Biophys.Acta 862,153-64；Diebold等人(2002)Somat.Cell Mol.Genetics 27,65-74。根據實施例，靶向部分係脂質部分。例如，生育酚可用作維生素E受體之靶向部分，且棕櫚醯基可用作LDL受體之靶向部分。
根據具體實施例，靶向部分係與存在於所需特定標靶細胞型態上之受體結合。
本揭露ODN構築體可直接接合或經由一個連接基間接接合至靶向部分。
合成
本揭露之ODN構築體可鑒於本揭露使用所屬技術領域中已知的方法製造。例如，根據本揭露使用之寡核糖核苷酸與寡核糖核苷可採用固相合成製備，參見例如「Oligonucleotide synthesis,a practical approach」，M.J.Gait編輯，IRL Press,1984；「Oligonucleotides and Analogues,A Practical Approach」，F.Eckstein編輯，IRL Press,1991(例如第1章，Modern machine-aided methods of ODN synthesis，第2章，Oligoribonucleotide synthesis，第4章，Phosphorothioate oligonucleotides，第5章，Synthesis of oligonucleotide phosphorodithioates)。其他特別適用之合成程序、試劑、阻斷基團、與反應條件係描述於Martin,P.,Helv.Chim.Acta,1995,78,486-504；Beaucage,S.L.與Iyer,R.P.,Tetrahedron,1992,48,2223-2311；及Beaucage,S.L.與Iyer,R.P.,Tetrahedron,1993,49,6123-6194，或其中提及的參考文獻。具有如，例如交替PO或PS鍵聯之混合主鏈之化合物可以依美國專利案第5,378,825號、第5,386,023號、第5,489,677號、及已公開之PCT申請案PCT/US92/04294與PCT/US92/04305(分別以WO 92/20822 WO與92/20823公開)之說明製備。
可用於製造本揭露ODN構築體之一項合成方案實例示於圖17，且描述於實例1。
醫藥組成物及治療方法
根據具體態樣，本揭露係關於一種誘導TLR9活性之ODN構築體。可藉由測量免疫細胞(例如外周血單核細胞(PBMC)，主要由淋巴細胞和單核細胞組成)或報導子細胞(例如表現TLR9之報導子構築體之HEK293細胞)與促效劑接觸之反應，在體外判定對 TLR9具有促效活性之ODN構築體對TLR9依賴性免疫反應之影響。亦可在動物注射促效劑之後，例如藉由測量細胞因子誘導，在體內判定對TLR9具有促效活性之ODN構築體對TLR9依賴性免疫反應之影響。在本文中描述例示性方法，例如在以下實例中。
本揭露ODN構築體可用於治療免疫疾病、病症、或病況，諸如病毒感染或癌症。
因此，在另一大致態樣中，本揭露係關於一種醫藥組成物，其包含本揭露ODN構築體及醫藥上可接受之載劑。
在另一大致態樣中，本揭露係關於一種刺激有需要之對象之免疫反應的方法，該方法包含向該對象投予包含本揭露ODN構築體及醫藥上可接受之載劑的醫藥組成物。
在另一大致態樣中，本揭露係關於一種為有需要之對象治療或減少疾病、病症、或病況(諸如免疫疾病、病症、或病況，諸如病毒感染或癌症)之症狀的方法，其包含向該對象投予本發明之醫藥組成物。
根據本揭露實施例，醫藥組成物包含醫療有效量之ODN構築體。如本文中提及ODN構築體所使用，醫療有效量係指對有需要之對象刺激免疫反應時之ODN構築體用量。亦如本文中提及ODN構築體所使用，醫療有效量意指達成治療免疫疾病、病症、或病況，諸如病毒感染或癌症；防止或減緩免疫疾病、病症、或病況，諸如病毒感染或癌症之進展；減少或完全緩解與免疫疾病、病症、或病況，諸如病毒感染或癌症相關之症狀時之ODN構築體用量。
根據具體實施例，治療有效量係指足以達成一、二、三、四、或更多個下列效應之療法之量：(i)減少或改善待治療之疾病、病症、或病況或與其相關之症狀的嚴重性；(ii)減少所欲治療之疾病、病症或病況或與其相關之症狀的期間；(iii)預防所欲治療之疾病、病症或病況或與其相關之症狀的進展；(iv)造成所欲治療之疾病、病症或病況或與其相關之症狀的消退；(v)預防所欲治療之疾病、病症或病況或與其相關之症狀的發展或發生；(vi)預防所欲治療之疾病、病症或病況 或與其相關之症狀的復發；(vii)減少具有所欲治療之疾病、病症或病況或與其相關之症狀的對象的住院；(viii)減少具有所欲治療之疾病、病症或病況或與其相關之症狀的對象的住院期長度；(ix)增加具有所欲治療之疾病、病症或病況或與其相關之症狀的對象的存活；(x)抑制或減少對象之所治療疾病、病症或病況或與其相關之症狀；及/或(xi)增強或改善另一種療法之預防或治療效應。
根據具體實施例，該待治療之疾病、病症、或病況係免疫疾病、病症、或病況。根據具體實施例，該待治療之疾病、病症、或病況是癌症、炎性疾病、病症、或病況、自體免疫性疾病、病症、或病況、或由病原體引起的疾病、病症、或病況，諸如病毒感染。根據具體實施例，癌症或腫瘤係由病毒、癌瘤、肉瘤、或白血病引起的癌症。根據具體實施例，癌症為乳癌、結腸癌、膀胱癌、肺癌、前列腺癌、胃癌、或胰臟癌、或淋巴母細胞性或骨髓性白血病。根據具體實施例，病毒感染為RNA或DNA病毒，諸如腺病毒、巨細胞病毒、A型肝炎病毒(HAV)、嗜肝病毒(包括HBV、慢性HBV)、黃病毒(包括黃熱病毒(Yellow Fever virus))、肝炎病毒(包括C型肝炎病毒(HCV))、單純皰疹第1型與第2型、帶狀皰疹、人類皰疹病毒6、人類免疫缺乏症病毒(HIV)、人類乳突病毒(HPV)、A型流感病毒、B型流感病毒、麻疹、副流感病毒、瘟疫病毒、脊髓灰質炎病毒、痘病毒、鼻病毒、冠狀病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、造成出血熱之多種病毒家族，包括沙狀病毒(Arenaviruses)、布亞病毒(Bunyaviruses)與絲狀病毒(Filoviruses)，及一系列由RNA與DNA病毒引起之病毒性腦炎。根據更具體實施例，待治療之疾病為HBV感染或慢性HBV感染。
慢性HBV之特徵較佳係在對象中可檢測到HBV存在超過6個月。更佳地，本文所提及之慢性HBV感染遵循疾病控制與預防中心(Centers for Disease Control and Prevention，CDC)所發布之定義，據此慢性HBV感染之特徵在於下列實驗室標準：(i)針對B型肝炎核心抗原之IgM抗體(IgM抗HBc)呈陰性，及針對B型肝炎表面 抗原(HBsAg)、B型肝炎e抗原(HBeAg)，或針對B型肝炎病毒DNA之核酸試驗呈陽性，或(ii)針對HBsAg或HBV DNA之核酸試驗呈陽性，或分隔至少6個月的兩次HBeAg呈陽性。
根據具體實施例，醫療有效量係指足以治療慢性HBV感染之醫療量。因此，醫療有效量係指足以達成下列一、二、三、四項、或更多項效應之醫療量：(i)減少或改善HBV感染或與其相關症狀之嚴重性；(ii)縮短HBV感染或與其相關症狀之持續時間；(iii)防止HBV感染或與其相關症狀之進展；(iv)導致HBV感染或與其相關症狀消退；(v)防止HBV感染或與其相關症狀發展或發作；(vi)防止HBV感染或與其相關症狀復發；(vii)減少患有HBV感染之對象住院；(viii)縮短患有HBV感染之對象之住院治療時間長度；(ix)延長患有HBV感染之對象存活；(x)消除對象之HBV感染；(xi)抑制或減少對象中之HBV複製；及/或(xii)增強或改善另一療法的(多種)疾病預防或治療效應。
根據具體實施例，醫療有效量係指足以達成下列一、二、三、或四項效應之量：(i)對象之B型肝炎表面抗原(HBsAg)量減少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或更多；(ii)對象之B型肝炎e抗原(HBeAg)量減少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或更多；(iii)對象之B型肝炎病毒DNA量減少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或更多；及/或(iv)對象之抗HBsAg抗體量減少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或更多。
根據具體實施例，醫療有效量係指足以治療癌症之醫療量。根據特定實施例，醫療有效量係指足以達成一、二、三、四、或更多項下列效應之療法之量：(i)減少或改善癌症或與其相關症狀之嚴重性；(ii)縮短癌症或與其相關症狀之持續時間；(iii)防止癌症或與其相關症狀之進展；(iv)導致癌症或與其相關症狀消退；(v)防止癌症或與其相關症狀發展或發作；(vi)防止癌症或與其相關症狀復發；(vii)減少患有癌症之對象住院；(viii)縮短患有癌症之對象住院治療時間長度； (ix)延長患有癌症之對象存活；(x)消除對象之癌症；及/或(xi)增強或改善另一種療法之預防或治療效應。
醫療有效量或劑量可根據各種不同因子變化，諸如給藥方式、標靶部位、對象之生理狀態(包括例如年齡、體重、健康)、對象係人類抑或動物、其他投予之藥物、及治療係預防性抑或醫療性。治療劑量經最佳地滴定以最佳化安全性及療效。
本揭露ODN構築體之醫療性用途之給藥模式可以為將該藥劑傳遞給宿主之任何合適途徑。例如，本文所述之組成物可經調配以適用於腸胃外投予，例如皮內、肌內、腹膜內、靜脈內、皮下、鼻內、或顱內投予，或者可將其投予至腦部或脊髓之腦脊髓液中。
根據具體實施例，本文所述之組成物係調配成適於依計畫之途徑給藥給對象。例如，本文所述之組成物可調配成適於經靜脈內、皮下、腫瘤內、或肌內給藥。根據較佳實施例，本文所述之組成物係調配成適於經靜脈內、皮下或腫瘤內給藥。
治療可依單次劑量療程、或多劑量療程給藥，其中治療的主要療程可以從1至10個單獨劑量開始，接著依維持及/或強化反應所需之後續時間間隔投予其他劑量，例如在1至4個月時投予第二劑量，且若需要時，於數個月後接著投予(多個)後續劑量。合適治療療程實例包括：(i)0、1個月及6個月，(ii)0、7天及1個月，(iii)0及1個月，(iv)0及6個月，或其他足以引發所期望降低疾病症狀或降低疾病嚴重性之所欲反應之療程。
根據具體實施例，用於治療免疫疾病、病症、或病況或病毒性疾病(諸如慢性HBV或癌症)之組成物可與有效治療相關疾病、病症、或病況的其他藥劑組合使用。此類藥劑實例包括(但不限於)：CAM、DAA、其他TLR、ASO/siRNA、檢查點抑制劑、其他化學治療劑、CAR-T。
在另一大致態樣中，本揭露係關於一種製造包含本揭露ODN構築體之醫藥組成物之方法，其包含將ODN構築體與醫藥上可接受之載劑混合，以得到醫藥組成物。
在另一大致態樣中，本揭露係關於一種為有需要之對象治療慢性HBV感染之方法，其包含向該對象投予包含本揭露ODN構築體之醫藥組成物。
在另一大致態樣中，本揭露係關於一種為有需要之對象治療腫瘤(較佳係癌症)之方法，其包含向該對象投予包含本揭露ODN構築體之醫藥組成物。
本申請案通篇引用之所有引用的參考文獻(包括文獻參考、公告之專利、公開之專利申請案、及同在審查中之專利申請案)之內容特此以引用方式明確地併入本文中。
實施例
本發明亦提供以下非限制性實施例。
實施例1為具有式I之ODN構築體：5’M1-L1-[CpG ODN]-L2-M2 3’，其中：各M1及M2獨立地代表脂質部分，較佳地該脂質部分包含至少一個選自由膽固醇、生育酚、棕櫚醯基、及硬脂基所組成之群組者，可選地M1及M2中之一者不存在；各L1及L2獨立地代表連接基，較佳地該連接基包含至少10個選自由碳、氮、氧、氫、硫、及磷所組成之群組的原子，且L係經由可切割鍵聯、較佳係經由酯或醯胺鍵與CpG ODN共價連接，可選地當各別的M1或M2不存在時，L1及L2中之一者不存在；且較佳地CpG ODN包含至少一個具有磷酸二酯(po)核苷酸間鍵聯之CpG模體；可選地，式(I)之CpG ODN構築體係進一步共價接合至靶向部分，其較佳係選自由半乳糖、N-乙醯半乳糖胺(GalNAc)、海藻糖、甘露糖、唾液酸、N-乙醯基神經胺酸所組成之群組。
實施例2為具有下式之CpG ODN構築體：式(IIa)：5’M-L-[CpG ODN]3’、或式(IIb)：5’[CpG ODN]-L-M 3’其中：M代表脂質部分，較佳地該脂質部分包含至少一個選自由膽固醇、生育酚、棕櫚醯基、及硬脂基所組成之群組者；L代表連接基，其包含至少1個選自由碳、氮、氧、氫、硫、及磷所組成之群組的原子，且L係經由可切割鍵聯、較佳係經由酯或醯胺鍵與CpG ODN共價連接；且CpG ODN包含至少一個具有po核苷酸間鍵聯之CpG模體，較佳地包含至少兩個、三個、或四個CpG模體，其等各具有po核苷酸間鍵聯；可選地，式(IIa)或(IIb)之CpG ODN構築體係進一步共價接合至靶向部分，其較佳係選自由半乳糖、N-乙醯半乳糖胺(GalNAc)、海藻糖、甘露糖、唾液酸、N-乙醯基神經胺酸所組成之群組。
實施例2a為實施例1或2之ODN構築體，其中該連接基包含10至100個選自由碳、氮、氧、氫、硫、及磷所組成之群組的原子。
實施例2b為實施例2a之ODN構築體，其中該連接基包含20至100個選自由碳、氮、氧、氫、硫、及磷所組成之群組的原子。
實施例2c為實施例2a之ODN構築體，其中該連接基包含30至100個選自由碳、氮、氧、氫、硫、及磷所組成之群組的原子。
實施例2d為實施例2a之ODN構築體，其中該連接基包含40至100個選自由碳、氮、氧、氫、硫、及磷所組成之群組的原子。
實施例2e為實施例2a之ODN構築體，其中該連接基包含50至100個選自由碳、氮、氧、氫、硫、及磷所組成之群組的原子。
實施例2f為實施例2a之ODN構築體，其中該連接基包含60至100個選自由碳、氮、氧、氫、硫、及磷所組成之群組的原子。
實施例2g為實施例2a之ODN構築體，其中該連接基包含70至100個選自由碳、氮、氧、氫、硫、及磷所組成之群組的原子。
實施例2h為實施例2a之ODN構築體，其中該連接基包含80至100個選自由碳、氮、氧、氫、硫、及磷所組成之群組的原子。
實施例3為實施例1或2之ODN構築體，其中該連接基包含((CH2)2O)m，其中m為1至15之整數，諸如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。
實施例4為實施例3之ODN構築體，其中該連接基包含(((CH2)2O)m-X)n，其中n為1至5之整數，諸如1、12、3、4、或5，且X獨立地係磷酸二酯(po)或硫代磷酸酯(ps)鍵聯。
實施例4a為實施例4之ODN構築體，其中該連接基包含(((CH2)2O)6-X)n。
實施例4b為實施例4a之ODN構築體，其中該連接基包含((CH2)2O)6-po。
實施例4c為實施例4a之ODN構築體，其中該連接基包含((CH2)2O)6-po-((CH2)2O)6-po。
實施例4d為實施例4a之ODN構築體，其中該連接基包含((CH2)2O)6-ps-((CH2)2O)6-po。
實施例5為一種CpG ODN構築體，其具有以下結構：式(IIIa)：5’M1-Y1-(((CH2)2O)m-X)n-Y2-[CpG ODN]-Y3-M2 3’、或 式(IIIb)：5’M2-Y3-[CpG ODN]-Y2-(((CH2)2O)m-X)n-Y1-M1 3’其中：M1代表脂質部分，較佳地該脂質部分包含至少一個選自由膽固醇、生育酚、棕櫚醯基、及硬脂基所組成之群組者；M2代表脂質部分、靶向部分、或不存在，Y1為鍵或連接基，較佳係具有式((CH2)2O)o之乙二醇，其中o為1-15，其係經由磷酸二酯(po)鍵聯、硫代磷酸酯(ps)鍵聯、或鍵與(((CH2)2O)m-X)n共價連接，X獨立地係鍵、po鍵聯、或ps鍵聯，各Y2及Y3獨立地係可切割鍵聯，較佳地包含酯或醯胺鍵，更佳地包含po鍵聯或胺基磷酸酯鍵聯，最佳的是po鍵聯，前提是當M2不存在時，Y3不存在，CpG ODN包含至少一個具有po核苷酸間鍵聯之CpG模體，較佳地包含至少兩個、三個、或四個CpG模體，其等各具有po核苷酸間鍵聯；m係1至15之整數；且n係1至5之整數。
實施例6為實施例5之ODN構築體，其中M2為靶向體。
實施例6a為實施例6之ODN構築體，其中M2係選自由半乳糖、N-乙醯半乳糖胺(GalNAc)、海藻糖、甘露糖、唾液酸、N-乙醯基神經胺酸所組成之群組的靶向體。
實施例6b為實施例5之ODN構築體，其中M2與Y3均不存在。
實施例7為具有下式之CpG ODN構築體：式(IVa)：5’M-Y1-(((CH2)2O)m-X)n-Y2-[CpG ODN]3’、或式(IVb)：5’[CpG ODN]-Y2-(((CH2)2O)m-X)n-Y1-M 3’ 其中：M代表脂質部分，較佳地該脂質部分包含至少一個選自由膽固醇、生育酚、棕櫚醯基、及硬脂基所組成之群組者；Y1為鍵或連接基，較佳係具有式((CH2)2O)o之乙二醇，其中o為1-15，其係經由磷酸二酯(po)鍵聯、硫代磷酸酯(ps)鍵聯、或鍵與(((CH2)2O)m-X)n共價連接，X獨立地係鍵、磷酸二酯(po)鍵聯、或硫代磷酸酯(ps)鍵聯，Y2為可切割鍵聯，較佳地包含酯或醯胺鍵，更佳地包含po鍵聯或胺基磷酸酯鍵聯，最佳的是po鍵聯；CpG ODN包含至少一個具有po核苷酸間鍵聯之CpG模體，較佳地包含至少兩個、三個、或四個CpG模體，其等各具有po核苷酸間鍵聯；m係1至15之整數，較佳的是6；且n係1至5之整數，較佳的是2；可選地，式(IVa)或(IVb)之CpG ODN構築體係進一步共價接合至靶向部分，其較佳係選自由半乳糖、N-乙醯半乳糖胺(GalNAc)、海藻糖、甘露糖、唾液酸、N-乙醯基神經胺酸所組成之群組。
實施例8為實施例5至7中任一項之ODN構築體，其中Y2包含酯鍵。
實施例8a為實施例8之ODN構築體，其中Y2為磷酸二酯(po)鍵聯。
實施例8b為實施例5至7中任一項之ODN構築體，其中Y2包含醯胺鍵。
實施例8c為實施例8b之ODN構築體，其中Y2為胺基磷酸酯鍵聯。
實施例9為實施例5至8中任何一項之ODN構築體，其中Y1包含具有式((CH2)2O)o之乙二醇，其中o為1-15，其係經由一個鍵共價連接至(((CH2)2O)m-X)n。
實施例9a為實施例9之ODN構築體，其中Y1包含具有式((CH2)2O)o之乙二醇，其中o為1-15，其係經由po鍵聯共價連接至(((CH2)2O)m-X)n。
實施例9b為實施例9之ODN構築體，其中Y1包含具有式((CH2)2O)之乙二醇，其中o為1-15，其係經由ps鍵聯共價連接至(((CH2)2O)m-X)。
實施例10為實施例4至9b中任一項之ODN構築體，其中m為1至15的整數。
實施例10a為實施例10之ODN構築體，其中m為1。
實施例10b為實施例10之ODN構築體，其中m為2。
實施例10c為實施例10之ODN構築體，其中m為3。
實施例10d為實施例10之ODN構築體，其中m為4。
實施例10e為實施例10之ODN構築體，其中m為5。
實施例10f為實施例10之ODN構築體，其中m為6。
實施例10g為實施例10之ODN構築體，其中m為7。
實施例10h為實施例10之ODN構築體，其中m為8。
實施例10i為實施例10之ODN構築體，其中m為9。
實施例10j為實施例10之ODN構築體，其中m為10。
實施例10k為實施例10之ODN構築體，其中m為11。
實施例10l為實施例10之ODN構築體，其中m為12。
實施例10m為實施例10之ODN構築體，其中m為11。
實施例10n為實施例10之ODN構築體，其中m為14。
實施例10o為實施例10之ODN構築體，其中m為15。
實施例11為實施例4至100中任一項之ODN構築體，其中n為1至5之整數。
實施例11a為實施例11之ODN構築體，其中n為1。
實施例11b為實施例11之ODN構築體，其中n為2。
實施例11c為實施例11之ODN構築體，其中n為3。
實施例11d為實施例11之ODN構築體，其中n為4。
實施例11e為實施例11之ODN構築體，其中n為5。
實施例12為實施例4至10及11中任一項之ODN構築體，其中m為6，且n為2。
實施例13為一種ODN構築體，其具有選自由下列所組成之群組的結構：5’M-po(HEG)po(HEG)po-[CpG ODN]3’；5’M-ps(HEG)po(HEG)po-[CpG ODN]3’、5’M-ps(HEG)ps(HEG)po-[CpG ODN]3’、5’M-po(HEG)ps(HEG)po-[CpG ODN]3’、5’[CpG ODN]-po(HEG)po(HEG)po-M 3’、5’[CpG ODN]-po(HEG)ps(HEG)po-M 3’、5’[CpG ODN]-po(HEG)ps(HEG)ps-M 3’、及5’[CpG ODN]-po(HEG)po(HEG)ps-M 3’，其中：M代表脂質部分，其包含至少一個選自由膽固醇、生育酚、棕櫚醯基、及硬脂基所組成之群組者；po代表磷酸二酯鍵聯；HEG代表((CH2)2O)6；ps代表硫代磷酸酯鍵聯；且CpG ODN包含至少一個具有po核苷酸間鍵聯之CpG模體，較佳地包含至少兩個、三個、或四個CpG模體，其等各具有po核苷酸間鍵聯，其中M係直接經由po或ps鍵聯或間接經由第二連接基共價連接至(HEG)，該第二連接基係直接經由po或ps鍵聯連接至(HEG)。
實施例14為實施例1至13中任一項之ODN構築體，其中該脂質部分為膽固醇。
實施例14a為實施例1至13中任一項之ODN構築體，其中該脂質部分為生育酚。
實施例14b為實施例1至13中任一項之ODN構築體，其中該脂質部分為棕櫚醯基。
實施例14c為實施例1至13中任一項之ODN構築體，其中該脂質部分為硬脂基。
實施例15為一種ODN構築體，其具有選自由下列所組成之群組的結構：5’Toco-po(HEG)po(HEG)po-[CpG ODN]3’，其中Toco代表生育酚，5’Chol-po(HEG)po(HEG)po-[CpG ODN]3’，其中Chol代表膽固醇，5’Palm-po(HEG)po(HEG)po-[CpG ODN]3’，其中Palm代表棕櫚醯基，5’[CpG ODN]-po(HEG)ps-Chol 3’，其中Chol代表膽固醇，5’[CpG ODN]-po(HEG)ps-Toco 3，，其中Toco代表生育酚，及5’[CpG ODN]-po(HEG)ps-Palm 3’，其中Palm代表棕櫚醯基，其中：po代表磷酸二酯鍵聯；HEG代表((CH2)2O)6；ps代表硫代磷酸酯鍵聯；且CpG ODN包含至少一個具有po核苷酸間鍵聯之CpG模體，較佳地包含至少兩個、三個、或四個CpG模體，其等各具有po核苷酸間鍵聯，其中該生育酚、膽固醇、或棕櫚醯基係直接經由po或ps鍵聯或間接經由第二連接基共價連接至(HEG)，該第二連接基係直接經由po或ps鍵聯連接至(HEG)。
實施例15a為實施例15之ODN構築體，其中該生育酚、膽固醇、或棕櫚醯基係共價該第二連接基，且該第二連接基係直接經由po或ps鍵聯與(HEG)共價連接。
實施例16為一種ODN構築體，其具有以下結構： 或其消旋物或對掌性物，其中「寡核苷酸」代表包含至少一個具有po核苷酸間鍵聯之CpG模體，較佳地包含至少兩個、三個或四個CpG模體，其各具有po核苷酸間鍵聯，可選地ODN構築體係直接或經由連接基進一步接合至靶向部分。
實施例16a為一種ODN構築體，其具有以下結構： 或其消旋物或對掌性物，其中「寡核苷酸」代表包含至少一個具有po核苷酸間鍵聯之CpG模體，較佳地包含至少兩個、三個或四個CpG模體，其各具有po核苷酸間鍵聯，可選地ODN構築體係直接或經由連接基進一步接合至靶向部分。
實施例16b為一種ODN構築體，其具有以下結構： 或其消旋物或對掌性物。
實施例16c為一種ODN構築體，其具有以下結構：
實施例16d為具有以下結構試之ODN構築體： 或其消旋物或對掌性物。
實施例17為實施例1至16中任一項之ODN構築體，其中CpG ODN具有硫代磷酸酯(ps)核苷酸間鍵聯。
實施例18為實施例1至17中任一項之ODN構築體，其中CpG ODN具有立體定向之硫代磷酸酯(ps)核苷酸間鍵聯。
實施例19為實施例1至18中任一項之ODN構築體，其中CpG ODN中之一至四個CpG二核苷酸各具有磷酸二酯(po)核苷酸間鍵聯。
實施例19a為實施例19之ODN構築體，其中CpG ODN包含至少兩個CpG模體，其等各具有po核苷酸間鍵聯。
實施例19b為實施例19之ODN構築體，其中CpG ODN包含至少三個CpG模體，其等各具有po核苷酸間鍵聯。
實施例19c為實施例19之ODN構築體，其中CpG ODN包含至少四個CpG模體，其等各具有po核苷酸間鍵聯。
實施例20為實施例19至19c中任一項之ODN構築體，其中CpG ODN之其餘各核苷酸間鍵聯為硫代磷酸酯(ps)核苷酸間鍵聯。
實施例21為實施例1至20中任一項之ODN構築體，其中該CpG ODN包含、較佳地係由選自由下列所組成之群組的多核苷酸序列組成：(1)5’TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 3’(SEQ ID NO：1)；(2)5’GGGGGACGATCGTCGGGGGG 3’(SEQ ID NO：2)；(3)5’GGGGTCAACGTTGAGGGGGG 3’(SEQ ID NO：3)；(4)5’TCCATGACGTTCCTGACGTT 3’(SEQ ID NO：4)；(5)5’TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG 3’(SEQ ID NO：5)；(6)5’TCGTCGTTACGTAACGACGACGTT 3’(SEQ ID NO：6)；及(7)5’TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGT 3’(SEQ ID NO：7)。
實施例21a為實施例21之ODN構築體，其中該CpG ODN包含、較佳地係由與SEQ ID NO：1-7中之一者具有或至少具有70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性之多核苷酸序列組成。
實施例22為實施例1至21中任一項之ODN構築體，其中該CpG ODN包含、較佳地係由選自由下列所組成之群組的多核苷酸序列組成： (1) (SEQ ID NO：8)； (2) (SEQ ID NO：9)； (3) (SEQ ID NO：10)； (4) (SEQ ID NO：11)； (5) (SEQ ID NO：12)； (6) (SEQ ID NO：13)； (7) (SEQ ID NO：14)； (8) (SEQ ID NO：15)； (9) (SEQ ID NO：16)； (10) (SEQ ID NO：17)； (11) (SEQ ID NO：18)； (12) (SEQ ID NO：19)； (13) (SEQ ID NO：20)； (14) (SEQ ID NO：21)； (15) (SEQ ID NO：22)； (16) (SEQ ID NO：23)； (17) (SEQ ID NO：24)； (18) (SEQ ID NO：25)；及 (19) (SEQ ID NO：26)； 其中：po代表磷酸二酯核苷酸間鍵聯；且ps代表硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯。
實施例22a為實施例22之ODN構築體，其中該CpG ODN包含、較佳地係由與SEQ ID NO：8-26中之一者具有或至少具有70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性之多核苷酸序列組成。
實施例23為一種ODN構築體，其具有以下結構： (1) (SEQ ID NO：27)； (2) (SEQ ID NO：28)； (3) (SEQ ID NO：29)； (4) (SEQ ID NO：30)； (5) (SEQ ID NO：31)； (6) (SEQ ID NO：32)； (7) (SEQ ID NO：33)； (8) (SEQ ID NO：34)； (9) (SEQ ID NO：35)； (10) (SEQ ID NO：36)； (11) (SEQ ID NO：37)； (12) (SEQ ID NO：38)； (13) (SEQ ID NO：39)； (14) (SEQ ID NO：40)； (15) (SEQ ID NO：41)； (16) (SEQ ID NO：42)； (17) (SEQ ID NO：43)； (18) (SEQ ID NO：44)； (19) (SEQ ID NO：45)； (20) (SEQ ID NO：46)； (21) (SEQ ID NO：47)； (22) (SEQ ID NO：48)； (23) (SEQ ID NO：49)； (24) (SEQ ID NO：50)； (25) (SEQ ID NO：51)； (26) (SEQ ID NO：52)； (27) (SEQ ID NO：53)； (28) (SEQ ID NO：54)； (29) (SEQ ID NO：55)； (30) (SEQ ID NO：56)； 其中：Chol代表膽固醇；Toco代表生育酚；Palmitoyl代表棕櫚醯基；HEG代表((CH2)2O)6；po代表磷酸二酯鍵聯；且ps代表硫代磷酸酯鍵聯，其中該生育酚、膽固醇、或棕櫚醯基係直接經由po或ps鍵聯或間接經由第二連接基共價連接至(HEG)，該第二連接基係直接經由po或ps鍵聯連接至(HEG)。
實施例23a為實施例23之ODN構築體，其中該生育酚、膽固醇、或棕櫚醯基係與第二連接基共價連接，且該第二連接基係直接經由po或ps鍵聯與(HEG)共價連接。
實施例23b為實施例23之ODN構築體，其具有以下結構：
實施例23c為實施例23之ODN構築體，其具有以下結構：
實施例23d為實施例23之ODN構築體，其具有以下結構：
實施例24係一種醫藥組成物，其包含如實施例1至23c中任一項之ODN構築體及醫藥上可接受之載劑。
實施例25係一種製備醫藥組成物之方法，其包含將實施例1至23c中任一項之ODN構築體與醫藥上可接受的載劑組合。
實施例26係一種刺激有需要之對象之免疫反應的方法，該方法包含向該對象投予實施例24之醫藥組成物。
實施例27係一種治療有需要之對象之疾病的方法，該方法包含向該對象投予實施例24之醫藥組成物，其中該疾病係選自由B型肝炎病毒(HBV)及癌症所組成之群組。
實施例28係一種包含CpG ODN之ODN構築體，其中CpG ODN中之至少一個CpG二核苷酸具有立體定向之硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯。
實施例29為實施例28之ODN構築體，其中CpG ODN中之二至四個CpG二核苷酸各具有立體定向之硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯。
實施例30為實施例28或29之ODN構築體，其包含CpG ODN，該CpG ODN包含選自由下列所組成之群組的多核苷酸序列：(1)5’TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 3’(SEQ ID NO：1)；(2)5’GGGGGACGATCGTCGGGGGG 3’(SEQ ID NO：2)；(3)5’GGGGTCAACGTTGAGGGGGG 3’(SEQ ID NO：3)；(4)5’TCCATGACGTTCCTGACGTT 3’(SEQ ID NO：4)；(5)5’TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG 3’(SEQ ID NO：5)；(6)5’TCGTCGTTACGTAACGACGACGTT 3’(SEQ ID NO：6)；及(7)5’TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGT 3’(SEQ ID NO：7)。
實施例31為一種ODN構築體，其具有式I(s)之式：5’M1-L1-[CpG ODN]-L2-M2 3’，其中：各M1及M2獨立地代表脂質部分，較佳地該脂質部分包含至少一個選自由膽固醇、生育酚、棕櫚醯基、及硬脂基所組成之群組者，可選地M1及M2中之一者不存在；各L1及L2獨立地代表連接基，較佳地該連接基包含至少10個選自由碳、氮、氧、氫、硫、及磷所組成之群組的原子，且L係經由可切割鍵聯、較佳係經由酯或醯胺鍵與CpG ODN共價連接，可選地當各別的M1或M2不存在時，L1及L2中之一者不存在；且CpG ODN代表請求項第28至30項中任一項之CpG ODN；可選地，式(I)之CpG ODN構築體係進一步共價接合至靶向部分，其較佳係選自由半乳糖、N-乙醯半乳糖胺(GalNAc)、海藻糖、甘露糖、唾液酸、N-乙醯基神經胺酸所組成之群組。
實施例32為一種CpG ODN構築體，其具有下式：式(IIa)(s)：5’M-L-[CpG ODN]3’、或式(IIb)(s)：5’[CpG ODN]-L-M 3’其中：M代表脂質部分，較佳地該脂質部分包含至少一個選自由膽固醇、生育酚、棕櫚醯基、及硬脂基所組成之群組者；L代表連接基，其包含至少1個選自由碳、氮、氧、氫、硫、及磷所組成之群組的原子，且L係經由可切割鍵聯、較佳係經由酯或醯胺鍵與CpG ODN共價連接；且CpG ODN代表實施例28至30中任一項之CpG ODN； 可選地，式(IIa)或(IIb)之CpG ODN構築體係進一步共價接合至靶向部分，其較佳係選自由半乳糖、N-乙醯半乳糖胺(GalNAc)、海藻糖、甘露糖、唾液酸、N-乙醯基神經胺酸所組成之群組。
實施例33為一種CpG ODN構築體，其具有以下結構：式(IIIa)(s)：5’M1-Y1-(((CH2)2O)m-X)n-Y2-[CpG ODN]-Y3-M2 3’、或式(IIIb)(s)：5’M2-Y3-[CpG ODN]-Y2-(((CH2)2O)m-X)n-Y1-M1 3’其中：M1代表脂質部分，較佳地該脂質部分包含至少一個選自由膽固醇、生育酚、棕櫚醯基、及硬脂基所組成之群組者；M2代表脂質部分、靶向部分、或不存在，Y1為鍵或連接基，較佳係具有式((CH2)2O)o之乙二醇，其中o為1-15，其係經由磷酸二酯(po)鍵聯、硫代磷酸酯(ps)鍵聯、或鍵與(((CH2)2O)m-X)n共價連接，X獨立地係鍵、po鍵聯、或ps鍵聯，各Y2及Y3獨立地係可切割鍵聯，較佳地包含酯或醯胺鍵，更佳地po鍵聯或胺基磷酸酯鍵聯，最佳的是po鍵聯，前提是當M2不存在時，Y3不存在，CpG ODN代表實施例28至30中任一項之CpG ODN；m係1至15之整數；且n係1至5之整數。
實施例34為一種CpG ODN構築體，其具有下式：式(IVa)(s)：5’M-Y1-(((CH2)2O)m-X)n-Y2-[CpG ODN]3’、或式(IVb)(s)：5’[CpG ODN]-Y2-(((CH2)2O)m-X)n-Y1-M 3’其中： M代表脂質部分，較佳地該脂質部分包含至少一個選自由固醇、生育酚、棕櫚醯基、及硬脂基所組成之群組者；Y1為鍵或連接基，較佳係具有式((CH2)2O)o之乙二醇，其中o為1-15，其係經由磷酸二酯(po)鍵聯、硫代磷酸酯(ps)鍵聯、或鍵與(((CH2)2O)m-X)n共價連接，X獨立地係鍵、磷酸二酯(po)鍵聯、或硫代磷酸酯(ps)鍵聯，Y2為可切割鍵聯，較佳地包含酯或醯胺鍵，更佳地包含po鍵聯或胺基磷酸酯鍵聯，最佳的是po鍵聯；CpG ODN為實施例28至30中任一項之CpG ODN；n係1至5之整數，較佳的是2；可選地，式(IVa)或(IVb)之CpG ODN構築體係進一步共價接合至靶向部分，其較佳係選自由半乳糖、N-乙醯半乳糖胺(GalNAc)、海藻糖、甘露糖、唾液酸、N-乙醯基神經胺酸所組成之群組。
實施例35為一種醫藥組成物，其包含實施例28至34中任一項之ODN構築體。
實施例36係一種製備醫藥組成物之方法，其包含將實施例28至24中任一項之ODN構築體與醫藥上可接受的載劑組合。
實施例37係一種刺激有需要之對象之免疫反應的方法，該方法包含向該對象投予實施例35之醫藥組成物。
實施例37a為實施例37之方法，其中該對象需要治療HBV感染。
實施例37b為實施例37之方法，其中該對象需要治療癌症。
實施例37c為實施例37之方法，其中該對象需要治療結腸直腸癌。
實施例38係一種治療有需要之對象之癌症的方法，該方法包含向該對象投予實施例35之醫藥組成物。
實施例38a為實施例38之方法，其中該癌症為胃腸癌。
實施例38b為實施例38之方法，其中該癌症為結腸直腸癌。
實施例39係一種治療有需要之對象之HBV感染的方法，該方法包含向該對象投予實施例35之醫藥組成物。
實施例39a為實施例39之方法，其中該治療法造成該對象中HBV DNA拷貝數減少。
實施例39b係實施例39或39a之方法，其中該治療法造成該對象中針對B型肝炎表面抗原(HBSAg)之特異性抗體效價提高。
實施例39c係實施例39至39b中任一項之方法，其中該治療法造成B型肝炎表面抗原(HBSAg)特異性T細胞增加。
實例
下列本揭露實例進一步說明本揭露之性質。應了解，下列實例不會限制本揭露，且本揭露之範圍係由隨附之申請專利範圍決定。
除非另外指明，否則下列實例使用的實驗方法均為常用方法。除非另外指明，否則下列實例使用的試劑均購自常見之試劑供應商。
實例1 AG9之合成
AG9：化學式：C298H420N70O164P26S19，分子量：9021.42
使用圖17中所示之合成方案合成AG9。更特定言之，利用固相合成技術及自動化合成器合成AG9。該合成方法是依218umol規模進行兩次，總規模為436umol。使用固定之6.3ml管柱(GE healthcare)進行合成。使用OligoPilot 100合成該化合物。用於此合成之固態擔體為~303μmol/g載量之Unylinker NittoPhase擔體。該合成係藉由專門設計用於製備AG9之4步驟迭代方法來進行。該四步驟包括去三苯甲基化(detritylation)、偶聯、硫化、及封端，並使用特定亞醯胺重複16次循環，產生所欲產物。在每個步驟之後，執行適當之乙腈洗滌，以防止非所要之反應。固態擔體之去三苯甲基化係利用於甲苯中之3%二氯乙酸進行，並在436nm下監測。在加至管柱中之前，先由40%(體積比)之0.1M亞醯胺溶液與60%活化劑於線上混合，進行偶聯。每次偶聯反應添加共2.5當量之亞醯胺。在活化劑/亞醯胺混合物裝載至管柱上之後，用於DNA之偶聯混合物係經由循環迴路循環5分鐘。將α-生育酚亞磷醯胺溶解於10% DMF之乙腈溶液中。HEG連接基與α-生育酚亞磷醯胺係採用10分鐘之延長偶聯。為了確保高偶聯效率，在製備之後，亞醯胺與活化劑溶液仍留在分子篩上至少4-6小時。第三步驟硫化係藉由添加1.2份管柱體積的0.2M苯基乙醯基二硫化物(PADS)於二甲基吡啶：乙腈(1：1)中之溶液進行。讓該溶 液先熟成至少12小時後，再用於合成。採用2.0 CV及2.0分鐘接觸時間來進行硫醇化。進行氧化時，使用於吡啶/水溶液90/10中之0.05M碘。在延長循環之最後一個步驟中，添加一半管柱體積之三種封端試劑混合物(封端A：封端B1：封端B2；50/25/25；v/v/v)進行封端。
在合成全長度AG9序列後，使用2.0 CV的於乙腈中之20%二乙胺(DEA)洗滌擔體。此步驟可以在產物仍附接在擔體上的同時，從產物中移除β氰乙基保護基。
取0.7g的UnylinkerTM樹脂填充至Akta 6.3mL管柱中，並且將管柱置於管柱位置1中。流動通過管柱，並利用流量試驗檢查可能的洩漏。
合成之寡核苷酸係使用濃縮氫氧化銨進行切割及去保護。添加氫氧化銨(~60ml)至已結合在固態擔體上之寡核苷酸中，並且輕輕攪拌直至完全勻散為止。所得混合物在55℃下振盪約16小時。經過指定時間後，通過燒結玻璃過濾器過濾，從固態擔體中分離含產物之溶液。然後使用50：50(v/v)乙醇：H2O溶液洗滌(3×20ml)過濾器中之固態擔體。取出小等份之粗製寡核苷酸溶液用於質譜、HPLC、與UV分析。
採用Akta Pur HPLC系統(GE Healthcare)與Luna C8 phenomenox管柱250*21.2(內直徑21.2cm)進行逆相層析法純化。
純化試劑和供應商列表
在添加樣本之後，管柱使用2份管柱體積(CV)洗提液A平衡。該梯度之組成為在2.0 CV期間傳遞之8%洗提液B的初始區段，以洗除管柱中任何未結合的樣本，然後梯度係在6.0 CV之期間，從8%至50%洗提液B運行。在無菌50ml小瓶中收集流份，然後採用HPLC分析。
純化條件
一旦完成流份數據後，即製備模擬集合物。模擬集合物含有超過75% FLP之所有流份。分析後，集合此等流份，經過超濾法去鹽。
利用RP HPLC分析粗產物、流份、模擬集合物、集合物、去鹽產物、與終產物。亦採用LCMS分析粗產物與終產物。方法如下：AG9之RP-HPLC分析
AG9之ESI/MS分析
已與各點保持分離之每一批次純化合成所選擇之集合物係合併在一起進行超濾。合併之集合物使用共三個0.1m2 PES膜(Pall Corp)之超濾法，進行濃縮及去鹽。將集合物濃縮至約2升體積，此時開始滲濾。持續滲濾至滲透物之電導率小於或等於50μS/cm。
使用VirTis SP Scientific Bench Top Pro冷凍乾燥機系統進行凍乾。由濃縮溶液通過0.2微米過濾器過濾，然後均勻分配至50ml小瓶中，並凍乾。終產物經過QC採樣，並準備用於體內試驗。
實例2 TLR9活化分析法
HEK293報導子分析法
HEK-Blue hTLR9與HEK-Blue mTLR9細胞株為已經過報導子構築體NF-kB-SEAP(分泌之胚胎鹼性磷酸酶)穩定轉染，且係人類TLR9或小鼠TLR9之細胞株商品(Invivogen,San Diego,CA)。
在開始分析前24小時，在96孔平底盤中塗佈一層次匯合之細胞。分析當天，將滴定濃度之待分析化合物加到細胞中，並且將培養物培養整夜。在此等細胞中，化合物活化受體TLR9之能力係與上清液中報導子分子SEAP之濃度成比例。SEAP濃度可利用比色分析法判定，其中添加受質QUANTI-Blue(Invivogen)至培養物上清液中3小時。使用分光光度計在OD630 nm下檢測經切割之受質，並且比較相對濃度。
PBMC分析法
採用ficoll梯度離心法，從全血中分離PBMC。取1×106個PBMC接種至96孔培養皿底部，並且添加滴定濃度之待分析化合物至細胞中。培養物培養48小時，在此期間誘導細胞標靶表現細胞因子。在上清液中取樣測定細胞因子含量，使用Luminex分析法檢測各個細胞因子。此外，採集PBMC並使用針對個別受體之螢光染料接合抗體染色。使用流式細胞計測量表現程度。
PHH細胞分析法
培養初代人類肝細胞，並感染B型肝炎病毒。感染後第4天，將培養基換成來自經過化合物處理之PBMC之培養基(參見上文)。進一步培養4天後(感染後第8天)，更換培養基，並且測量上清液之HBsAg產量。4天後(感染後第12天)，再次測量上清液之HBsAg產量。
體內細胞因子誘導
由C57BL/6小鼠接受皮下注射或靜脈注射待分析之化合物。四小時後，採用下頜下靜脈穿刺為小鼠抽血。使用Luminex分析法測量血清細胞因子。
AAV-HBV模型
用AAV-HBV粒子感染C57BL/6小鼠。感染後約1個月，小鼠接受皮下注射或靜脈內注射待分析之化合物。兩週一次(每兩週)重複投予化合物一段指定時間，通常超過8周。每週為小鼠抽血。測定各個不同終點之血清，諸如循環HBsAg、HBV DNA與抗HBs Ab。
MC38腫瘤模型
對C57/BL6小鼠皮下植入0.5×106個MC38結腸癌細胞，並且監測腫瘤生長。當平均腫瘤體積達到100-200mm3(約植入後12天)時，開始給藥。每3-4天監測腫瘤大小。
ELISpot過程
從經過處理且在預定時間點(在最終劑量後大約1個月)殺死之小鼠中單離新鮮脾細胞。脾臟細胞依2×105個細胞/孔之濃度，以三重覆加至微量滴定板之孔中。在各孔中添加來自核心與表面之各個已知HBV抗原決定基及來自HBV共同序列B、C與D之15聚體重疊肽(11個胺基酸重疊)，最終濃度為2μg/ml。根據製造商說明書，由細胞培養不同時間，然後利用小鼠FN-γ ELISpot套組(Mabtech 3321-2A)顯示活化之細胞。利用CTLFluoroSpot分析儀定量活化之細胞。
IVIS成像
進行體內成像時，使用7至8週C57Bl/6雄性小鼠。採 用靜脈內或皮下途徑注射標記AF647之CpG寡核苷酸(AG20與AG21)(20nmol，總體積100μl)。注射後24小時，殺死動物，切下脾臟、引流淋巴結、肝臟、腎臟與肺部。器官使用IVIS(Ami HTX)顯影。收集影像集(激發光：605，發射光：670，f 5，10秒)。使用Spectral Instruments Imaging軟體Aura取得並定量螢光成像數據集。使用感興趣區域工具(Region of Interest tool)來測量每個器官之輻射效率。
免疫螢光
採用7-8週大之C57Bl/6雄性小鼠。採用靜脈內或皮下途徑注射標記AF647之CpG寡核苷酸(AG20與AG21)(20nmol，總體積100μl)。注射後24小時，殺死動物，切下脾臟、引流淋巴結、肝臟、腎臟與肺部。器官於福馬林中固定，然後採用標準程序在切片機上切片。在經過福馬林固定之石蠟封埋(FFPE)小鼠淋巴結與脾臟上，使用Leica Bond自動化免疫染色計進行免疫螢光染色。使用Leica Bon抗原決定基修復緩衝液2(Leica Bon Epitope Retrieval Buffer 2)(EDTA溶液，pH9.0)修復熱誘導之抗原20分鐘。由初級抗體(大鼠抗CD45R(B220)(RA3-6B2)、eFluor 570抗體、及兔子抗CD3抗體)培養整夜，進行染色。施加二級抗體山羊抗兔子IgG Alexa Fluor Plus 488，使用含DAPI之Fluprogel II安裝玻片，用於檢視核。
HPLC及血清蛋白質結合性
採用同時配備UV與螢光檢測器之Ultimate-3000 HPLC系統進行分析。在含20mM KCL之1X PBS中製備寡核苷酸、蛋白質、與寡核苷酸-蛋白質混合物之樣本，並且採用粒徑排阻層析法分析。進行膠束形成分析法時，於2M或4M脲或PBS中製備寡核苷酸溶液。樣本注射至Superdex 75 Increase(GE Healthcare)。層析法採用之移動相為含20mM.KCL之1X PBS，0.075ml/min，並且將粒徑排阻管柱保持在室溫下。在260、280、與500nm下記錄UV光譜 圖。採用螢光檢測器，在490nm激發波長及530nm發射波長下得到光譜圖。
實例3 在CpG ODN中加強活性之磷酸二酯
基於文獻，原型5’-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3’(ODN2006)可刺激表現TLR9之人類與小鼠細胞。此序列具有一個硫代磷酸酯(ps)主鏈，用於體內穩定性。ODN2006(5’-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3’)之CpG模體上之ps鍵聯被磷酸二酯(po)鍵聯置換，並評估TLR9活化。圖1中所示結果證實，CpG模體上3或4個ps鍵聯被po鍵聯置換時，會造成對TLR9具有促效活性之高活性ODN構築體。ODN2006中所有四個CpG模體之ps鍵聯均被po鍵聯置換的型式(AG1)具有之EC50值比ODN2006降低2-3倍，且最大活性比ODN2006高20-35%。有3個CpG模體之ps鍵聯被po鍵聯置換之AG2和AG3中，觀察到類似AG1之活性。此實驗證實，在CpG模體主鏈上改用po替代，會增強寡核苷酸之促效性質。
實例4 與CpG ODN之直接膽固醇鍵聯破壞活性
由寡核苷酸接合至可能造成寡核苷酸分佈差異之各種不同部分。例如，咸信膽固醇與生育酚為定位在肝臟之親脂性分子。當膽固醇與生育酚直接接合CpG ODN之5'或3'端時，所得分子不會活化表現TLR9之細胞(未示出數據)。此等實驗證實，由化合物直接接合在寡核苷酸末端上，會影響其促效TLR9之能力。
實例5 經由可切割連接基間接接合膽固醇之CpG ODN增強活性
由於可能出現立體效應，由親脂性部分接合鄰接之寡核 苷酸可能破壞分子結合TLR9受體之能力。為了探討這種可能性，由膽固醇作為靶向部分，使用可切割連接基接合對TLR9具有促效活性之ODN構築體(本文中亦稱為TLR9促效劑)，並且評估TLR9活化。圖2中所示結果顯示，靶向部分經由可切割連接基接合TLR9促效劑，可以保留其促效活性。
例如，使用可切割連接基分隔膽固醇與AG1之CpG ODN，設計一種TLR9促效劑，稱為AG8。AG8之連接基為(HEG)po(HEG)po-。當HEK-Blue hTLR9細胞受到AG8刺激時，會比未接合之母體AG1加強活性。AG8具有之EC50值比AG1降低2-3倍，比ODN2006降低超過9倍。AG8之最大活性比AG1高約10%，比ODN2006高約50%。我們測試了AG1之類似物，其係依AG8之相同方式與膽固醇連接。AB4、AG5、AG6、與AG7中(分別)0、1、2、與3個CpG模體之ps被po置換。如圖2所示，具有po鍵聯之CpG模體數目越高，活性越大。AG4具有完全ps主鏈，並且經由間接連接基與膽固醇接合。AG5類似AG4，但有1個CpG模體被po鍵聯置換。這兩種化合物在HEK-Blue hTLR9細胞分析法中具有類似活性，其EC50為6.4-10nM。AG6與AG7分別有2個和3個CpG模體被po鍵聯置換，且其EC50分別為約4.5nM與2.6nM。此實驗證實，透過可切割連接基間接接合靶向部分，可以保留藥效基團之活性。
實例6 經由可切割連接基間接接合生育酚之CpG ODN增強活性
為了測試接合策略之多功能性，使用可切割連接基接合生育酚與TLR9促效劑。例如，使用可切割連接基分隔生育酚與AG1之寡核苷酸，設計成一種TLR9促效劑，稱為AG9，其合成係描述於以上實例1。AG9之連接基為(HEG)po(HEG)po-。當HEK-Blue hTLR9細胞受到AG9刺激時，其活性相當於膽固醇接合物AG8之活性(未出示數據)。此等實驗證實，可以在CpG ODN上接合不同靶向部分，且CpG ODN仍可保持活性。
實例7 使用可切割連接基間接接合在CpG ODN之5'或3'端上造成同等活性
為了測試接合部分之極性，使用可切割連接基，將膽固醇或生育酚接合在TLR9 ODN之3'端。例如，使用可切割連接基-po(HEG)po(HEG)分隔膽固醇與AG1之寡核苷酸之3'端，設計一種TLR9促效劑，稱為AG10，及使用可切割連接基-po(HEG)po(HEG)分隔生育酚與AG1之寡核苷酸之3'端，設計一種TLR9促效劑，稱為AG11。接合物之活性係採用HEK-BLUE hTLR9分析。如圖3所示，分別由膽固醇間接接合在CpG ODN之5'-或3'-端之AG8與AG10具有同等活性。
值得注意的是，在HEK-BLUE hTLR9細胞中，AG10與AG11分別與其5’對應接合物AG8與AG9具有類似活性。然而，其等對HEK-BLUE mTLR9細胞沒有活性，表示接合物之極性對小鼠TLR9受體之辨識力具有重要性，但對人類TLR9受體則無(AG8與AG10示於圖3，未出示AG9與AG11之數據)。
為了測試連接基內切割位點之影響，合成AG9之類似物，其中磷酸二酯切割位點改換為抗切割之硫代磷酸酯鍵結。如圖12所示，AG12在寡核苷酸與連接基之間、生育酚部分與連接基之間、及連接基之HEG分子之間，改用不可切割之硫代磷酸酯鍵聯置換可切割之磷酸二酯鍵聯。咸認為，此分子不會被有效切割，且完整分子將與TLR9相互作用。AG13具有不可切割之硫代磷酸酯連接基，置換了連接基與寡核苷酸之間之可切割磷酸二酯鍵聯。咸認為在切割後，一部份連接基保持與寡核苷酸結合。AG14具有不可切割之硫代磷酸酯連接基，置換了連接基與生育酚之間之可切割磷酸二酯鍵聯。咸認為在切割後，移除生育酚，且整個連接基仍保持與寡核苷酸結合。AG16為AG1之變體，其經由硫代磷酸酯鍵與生育酚接合。AG15為AG1之變體，其經由硫代磷酸酯鍵與生育酚接合，且在鹼基21與22之間具有硫代磷酸酯鍵聯。
所有保留連接基及/或生育酚之任何部分之類似物均在HEK-Blue報導子分析法中具有降低之活性，如圖19和20所示。特定言之，已顯示，由靶向部分(諸如生育酚)直接接合寡核苷酸(如由構築體AG15與AG16所代表)會破壞寡核苷酸之TLR9促效劑活性(未出示數據)。經由可切割連接基接合寡核苷酸與生育酚時，保留了寡核苷酸之TLR9促效劑活性，且當生育酚及連接體兩者都被切割時，可得到最佳活性(圖19)。數據顯示，一旦被細胞吞噬，ODN即從連接基與靶向部分切割而釋出，並需要此釋出來達成完全活性。藉由此方法，由膽固醇或棕櫚酸與寡核苷酸接合，可得到類似結果。該等結果顯示，任何分子(諸如肽、蛋白質、毒素、有機或無機分子，等等)可以採用此可切割連接基之策略，與寡核苷酸接合。
使用HEK-Blue mTLR9報導子細胞，已發現AG9亦可在報導子細胞中活化小鼠TLR9，並達到類似未接合之母體AG1之活性，並優於ProMune(一種未修飾之全含硫代磷酸酯之ODN2006)之活性，此表示AG9可用於小鼠體內模型(圖20)。結果顯示，在根據本揭露實施例之TLR9促效劑中，以可切割連接基較佳，以優化其TLR9刺激能力。
實例8 TLR9促效劑之體內分析
小鼠接受皮下注射7.6-10.8mg/kg之TLR9促效劑AG8與AG10，並在4小時後抽血。AG8係在寡核苷酸之5'端接合膽固醇及可切割連接基，及AG10係在寡核苷酸之3'端接合膽固醇及可切割連接基。使用Luminex分析法分析所收集樣本之細胞因子含量。圖4中所示結果顯示，TLR9促效劑在體內誘導產生細胞因子。此等實驗顯示，如於體外使用HEK-BLUE mTLR9細胞報導子分析法所觀察，連接基與膽固醇之極性在AG10對TLR9之促效能力上具有重要性。雖然AG10在體內之活性很低，但AG8在給藥後，會誘導促炎性細胞因子，諸如IL-6、TNFa與MIP-1b。值得注意的是，細胞因子之 產量平均高於對照之ODN2006，並與ODN1826相當。因此，由膽固醇接合之CpG ODN在體內具有活性。
實例9 TLR9促效劑對感染AAV-HBV小鼠之效應分析
用於分析TLR9促效劑對小鼠之HBV感染之影響的實驗流程圖示於圖5。
已注射AAV-HBV病毒之小鼠在第-28天接受媒劑或TLR9促效劑給藥，並評估HBV指示劑含量。在第0天對小鼠投予單次劑量，或在第7天、21天、35天、與49天投予多次劑量。作為基準點，一組小鼠接受口服給藥GS9620，其係TLR7之小分子促效劑。評估所有小鼠之HBV DNA(參見圖6)、HBsAg(HBV之表面抗原；參見圖7)、與HBeAg(HBV之套膜抗原；參見圖8)含量。結果顯示，投予TLR9促效劑可以在接受投予AAV-HBV之小鼠中成功壓制HBV DNA、HBsAg、與HBeAg。
評估接受皮下注射TLR9促效劑AG8之小鼠所誘導的細胞因子產量。圖9結果顯示，不會產生誘導位點反應之3nmol TLR9促效劑AG8所誘導之細胞因子量類似TLR9促效劑AG10。
評估接受靜脈內(IV)注射TLR9促效劑AG8之小鼠所誘導的細胞因子產量。圖10結果顯示15nmol TLR9促效劑AG8誘導之細胞因子量。亦分析接受IV注射之小鼠之HBV病毒負荷。如圖11所示，經IV投予AG8會降低HBV病毒負荷。
此等實驗證實，投予單次劑量或依QOW投予8周之AG8可壓制病毒負荷。
實例10 TLR9促效劑誘導差異細胞因子分佈
向未經處理之C57BL/6小鼠分別注射TLR9促效劑AG1、AG8、及AG9。在注射後4小時取血清樣本，並採用Luminex分析法測定細胞因子。
如圖9中結果所示，AG8與AG9二者均在誘導細胞因子IL-12p40、IL-6、與M1P1b上具有提高之活性，且此二者所活化之細胞因子型態均不同於母體AG1之型態(未示出數據)。亦在其他細胞因子，例如IL-12p70、IL-10、G-CSF、IFN-g、IFN-a、TNF-a觀察到類似之誘導型態(未示出數據)。細胞因子誘導性係劑量依賴性(圖10)。
實例11 AG9比AG1誘導更高量α-HBsAg
小鼠經皮下或靜脈內接受10μg重組HBsAg與30nmol AG1或AG9之組合，進行免疫。七天後，為小鼠抽血，採用ELISA定量HBsAg特異性抗體之血清濃度。
如圖11中所示，當經皮下給藥時，接受AG1(0.332 AU)與AG9(0.551 AU)給藥之小鼠之間之α-HBsAg含量平均上升1.65倍。當經靜脈內給藥時，AG9所誘導HBsAg特異性抗體量(1.41 AU)比AG1所誘導抗體量(0.59 AU)增加2.5倍(p<0.009)。此表示，生育酚接合寡核苷酸時，可加強免疫刺激活性，以擴增免疫過程。此外，經靜脈內投予接合生育酚之CpG ODN時，其在誘導體液反應上比經皮下投予時更有效，或比經靜脈內投予非接合母體AG1時更有效。此結果表示，生育酚影響CpG ODN之生物分佈性，從而加強對體液反應之活性。
實例12 TLR促效劑經由可切割連接基接合親脂性部分使AVV-HBV小鼠達到功能性治癒
用AAV-HBV感染未經處理之C57BL/6小鼠。一旦確定感染，即讓小鼠每兩週接受靜脈內或皮下投予15或30nmol之生育酚接合物AG9或母體AG1。
儘管已感染之小鼠接受皮下投予這兩種化合物其中之一會暫時減少循環HBV DNA或HBsAg，但其含量在兩週後即回升(圖13A與B)。
測定使循環HBV DNA與HBsAg降低至低於定量程度以下之能力，測得以15nmol AG9經靜脈內重覆給藥時，比投予母體AG1時更有效。此外，在治療期之後，監測小鼠之病毒回升。接受AG9處理之小鼠達成持久之反應，在給藥後1個月觀察到穩定壓制HBsAg及最小回升程度之HBV DNA(圖13A與B)。此伴隨在大多數小鼠中誘導α-HBsAg Ab，且在有些小鼠中誘導HBsAg特異性CTL。反之，接受母體AG1處理之3/5小鼠達成持久反應，並且伴隨α-HBsAg Ab血清轉化並發展出HBsAg特異性CTLd。2/5 AG1處理之小鼠沒有血清轉化。靜脈內給藥似乎比皮下給藥更有效。
α-HBsAg Ab之分析顯示，接受AG9處理之小鼠中，出現血清轉化的隻數高於接受母體AG1處理之小鼠，且平均具有較高之α-HBsAg Ab循環濃度。此等結果顯示，在感染AAV-HBV小鼠中，接合生育酚之CpG寡核苷酸AG9產生功能性治癒之能力大於未接合之母體AG1。
為了測試增強之效力是否可應用於其他親脂性部分，我們合成了AG19，其中改用棕櫚醯基替代生育酚。在HEK-hTLR9株之體外實驗中證實，AG19具有類似AG9之活性(未出示數據)。我們使用AG19，在感染AAV-HBV小鼠中如上述重覆該給藥療程。小鼠每2週接受皮下或靜脈內給藥15nmol化合物連續14週。當經靜脈內給藥時(圖13C)，AG19在降低循環HBsAg與HBV DNA上，與AG9一樣有效。在治療期後，HBsAg量保持低於定量限值，且持續穩定壓制HBV-DNA量。與AG9處理組小鼠相似，在壓制病毒負荷的同時，亦強力誘導α-HBsAg Ab。
研究結束時，我們藉由ELISpot測定HBV特異性CTL反應。我們定量對來自HBsAg之肽有反應之CTL數量，並發現接受AG9與AG19處理之小鼠比PBS或母體AG1處理組小鼠具有顯著較多α-HBs CTL(圖13D)。因此，由CpG ODNs接合親脂部分(諸如生育酚或棕櫚醯基)會增強ODN之促效性質。即使停止藥物後，仍會產生壓制病毒負荷之HBV特異性體液與細胞反應。依據定義，在感染HBV之對象中，AG9與AG19能夠建立功能性治癒。
實例13 AG9在MC-38腫瘤模型中達成完全消退腫瘤及控制腫瘤
在未經處理之C57BL/6小鼠中植入MC-38結腸癌細胞，並監測腫瘤大小。確定感染後，即讓小鼠經腫瘤內或靜脈內接受遞增劑量之生育酚接合物AG9或母體AG1。亦測試AG14，係另一種具有如下序列之CpG ODN： 所採用劑量分別為40μg、120μg、與360μg，分別相當於1.6mpk、4.8mpk、與14.4mpk。當小鼠接受腫瘤內處理時，歷經10天(植入後d12、d15、d19、與d22)投予4次劑量。當小鼠接受靜脈內給藥時，相隔7天(植入後d12，d19)投予2次劑量。每3天監測腫瘤生長。有關該研究之更多資訊，請參見圖14。
腫瘤內投予AG1或AG9具有同等效力(未出示數據)。在各組之40μg劑量中，有一隻小鼠之腫瘤完全消退，其餘小鼠之腫瘤則延遲生長。在各組之120μg劑量中，有三隻小鼠之腫瘤完全消退，兩隻之腫瘤則延遲生長。在360μg AG1劑量中，有三隻小鼠完全消退，一隻之腫瘤延遲生長。在360μg AG9劑量中，有兩隻小鼠完全消退，其餘小鼠具有腫瘤停滯。
如圖15結果所示，當經靜脈內給藥時，AG9之效力高於AG1與AG14。在各組之40μg劑量下，三隻接受AG9處理之小鼠的腫瘤生長延遲，而兩隻接受AG1處理之小鼠延遲腫瘤生長。在120μg劑量中，三隻接受AG9處理之小鼠的腫瘤完全消退，而其他兩隻小鼠則延遲腫瘤生長。AG1處理組中有一隻小鼠的腫瘤完全消退，而其他四隻小鼠則延遲腫瘤生長。在360μg最高劑量下，所有接受AG9之小鼠的腫瘤均完全消退。接受AG9處理之小鼠中甚至在小鼠在初次植入腫瘤後第40天再度接受MC-38腫瘤細胞攻毒後，仍沒有觀察到腫瘤吸收或生長。接受AG1之小鼠中，五隻小鼠中有四隻的腫瘤完全消退，一隻具有延遲腫瘤生長。此等數據證實，投予CpG ODN於體內活化TLR9，具有治療癌症的治療效益。此外，由生育酚利用可切割連接基接合CpG ODN時，可增強其治療效益。在MC38中，AG9會刺激免疫反應，導致腫瘤清除及防止腫瘤再移植之記憶反應。使用AG9調控免疫，能夠活化抗腫瘤反應，允許形成記憶反應，提供保護，以防止腫瘤之任何進一步復發。
實例14 AG9之MTD/效力研究
在未經處理之C57BL/6小鼠中植入MC-38結腸癌細胞，並監測腫瘤大小。確定腫瘤後，例如具有平均腫瘤體積100-200mm3時，即讓小鼠經腫瘤內或靜脈內接受投予遞增劑量之生育酚接合物AG9或母體AG1(圖16)。小鼠每週一次經靜脈內給藥歷時兩週(qwk x 2)，例如在第12天及第19天，或於第12天經腫瘤內給藥一次(qd x 1)。
該研究之主要目的在於判定MC-38荷瘤小鼠中接受AG9給藥qwk x 2時之最大耐受劑量(MTD)。該研究之次要目的在於判定AG9給藥qwk x 2時對腫瘤之效力。
組(qwk x 2及qd x 1，n=5/組)及劑量如下：
監測小鼠及腫瘤生長。
實例15 其他腫瘤模型
在前列腺癌之CT26腫瘤小鼠模型中測試AG9。在BALB/C小鼠脅腹皮下植入3×105個CT26腫瘤細胞，每3至4天監測腫瘤生長。當平均腫瘤體積達到75-125mm3(約植入後12天)時，開始給藥。在小鼠中植入兩劑，Q1W，40nmol之AG1或AG9。監測40天後，所有8隻接受AG9給藥之小鼠均沒有腫瘤。反之，7/8接受AG1之小鼠或8/8接受PBS之小鼠有腫瘤，並且當腫瘤體積超過1000mm3時安樂死。
在A20腫瘤小鼠淋巴瘤模型中測試AG9。在BALB/C小鼠脅腹皮下植入1×106個A20淋巴瘤腫瘤細胞，每3至4天監測腫瘤生長。當平均腫瘤體積達到75-125mm3(約植入後19天)時，開始給藥。對小鼠投予兩次劑量，Q1W，40nmol AG9。監測小鼠60天。監控期結束時，50%小鼠沒有腫瘤。其他5個對象中，腫瘤延遲生長。2/10小鼠承受約300mm3腫瘤負荷，且在約第30天安樂死。一隻小鼠在約第40天承受約1000mm3腫瘤負荷。一隻小鼠承受約300mm3腫瘤負荷，且在第50天安樂死。一隻小鼠承受約1000mm3腫瘤負荷，且在第50天安樂死。反之，8/8 PBS處理組小鼠在第20天之前承受超過1500mm3腫瘤負荷，且安樂死。
總之，此等實驗證實，本揭露ODN構築體(諸如AG9)在治療各種癌症(諸如結腸直腸癌、前列腺癌與淋巴瘤)上之效力。
實例16 B-細胞分析法
從C57BL/6小鼠中單離小鼠脾細胞，然後使用MACS磁珠細胞分離管柱，依據製造商流程純化B細胞。在37℃下，使用指定濃度之寡核苷酸刺激1×106個B細胞48小時。然後使用針對活化標記物之特異性抗體(諸如CD40細胞)染色30分鐘，然後使用FACS緩衝液(PBS+3% FBS)洗滌三次。細胞隨後依據標準方法，採用流式細胞計分析。採用平均螢光強度定量標記物之表面強度。此分析法之結果示於圖18。我們比較AG9與其母體AG1，及AG18(係由生育酚利用間接連接基接合AG17)與其母體AG17。小鼠B細胞對所有測試之促效劑有反應，並且在以依賴劑量之方式受到促效劑刺激時，觀察到CD40上調。值得注意的是，在0.016μM之生育酚接合ODN AG9與AG18下，比其等之各個非接合母體AG1及AG17更有效。此實驗證實，可由接合生育酚之ODN直接刺激B細胞，且接合生育酚可以增強促效劑活性。
實例17 經由可切割連接基接合TLR促效劑與生育酚有利於次級淋巴器官內特定區域之體內生物分佈性
為了判定生育酚接合是否會影響CpG ODN之體內生物分佈性質，向小鼠皮下或靜脈內注射AG21(其係與AlexaFluor-647接合之AG9類似物)或AG20(其係與AlexaFluor 647接合之AG1類似物)。注射後24小時，切下脾臟、引流淋巴結、肝臟、腎臟與肺部，並使用IVIS成像器成像。如圖21A所示，當經皮下注射AG21時，其侷限在引流淋巴結，與AG20對照。當定量時，AG21之定位與AG20之差異超過2倍。圖21B中，在IV注射任一化合物後24h， 定量脾臟。在IV給藥後，生育酚影響化合物之生物分佈，並且使用IVIS可以在脾臟、肝臟、與腎臟(程度稍差)中看到大部份AG21，但看不到AG20(未示出數據)。在脾臟中，AG21定點含量比AG20提高將近10倍。在皮下或靜脈內給藥後，AG21定位在次級淋巴器官(諸如引流淋巴結或脾臟)，其係活化免疫細胞之位置。此等實驗證實，接合生育酚顯著影響其生物分佈性。
為了看到AG21在次級淋巴器官內之分佈，我們重覆實驗，將淋巴結與脾臟封埋在石蠟內，經過切片，並利用免疫螢光觀察ODN定位。使用針對T細胞或B細胞之抗體對組織染色。皮下注射後，我們在淋巴結之B細胞濾泡區內觀察到深度AG21染色(未出示數據)。值得注意的是，在靜脈內注射後，我們在濾泡外區域內觀察到深度AG21染色。在一隻AG1處理組小鼠中，我們觀察到弱但可檢測之ODN染色。此等結果再度證實接合生育酚之CpG ODN可以有效地將ODN定位在次級淋巴器官中，更明確言之，定位在微環境內之獨立區中。
為了表徵在靜脈內注射後結合脾臟中AG21之細胞型態，我們採集了脾臟，解離，然後使用針對特定細胞標記物且標記螢光之抗體染色，以便區分。使用流式細胞計，我們觀察到樹突細胞與巨噬細胞，及較小程度上之B細胞，均對AG21呈陽性反應(未示出數據)。T細胞對AG21呈陰性反應。因此，對AG21呈陽性反應之細胞即為表現TLR9之細胞。此實驗證實，投予接合生育酚之CpG ODN時，該接合物優先導向定位在二級淋巴器官，並且在該等器官內，該接合物優先被所欲之細胞(亦即樹突細胞、巨噬細胞、與B細胞)吸收。
實例18 經由可切割連接基接合TLR促效劑與親脂部分促進與諸如白蛋白之血清蛋白質之結合
有趣的是，在某些器官(諸如肝臟與脾臟，但不在其他器官，諸如均為血管化之腎臟與肺臟)中觀察到AG21出現偏斜分佈型態。我們推測生育酚可能促進與血清蛋白質結合，並且依據清除劑受體之分佈，將可判定接合生育酚之CpG ODN之優先定位。我們在體外測試此可能性。製造AG1與AG9之FITC接合類似物。AG22為AG1在3'端接合FITC之類似物。同樣地，AG23為AG9在3'端接合FITC之類似物。添加化合物至HPLC上，然後監測來自FIT之的螢光(圖22A)。化合物係單獨使用或與BSA預混。我們觀察到該接合生育酚之AG23，但不是AG22，具有與存在之BSA相同之滯留時間。此實驗證實，生育酚可能促進CpG ODN與血清蛋白質(諸如BSA)結合。此複合物可以部分解釋接合生育酚之CpG ODN在次級淋巴器官及肝臟中之優先分佈。
接下來，我們想知道結合血清蛋白質之能力是否為接合生育酚之獨特特性。我們合成一種棕櫚醯基化化合物AG19之類似物。AG24為在5'端經由可切割連接基接合棕櫚醯基及在3'端接合FITC之CpG ODN。我們重覆上述實驗，混合AG24或AG22與胎牛血清(FBS)，然後經過HPLC分析該混合物，並利用其螢光信號監測ODN之滯留時間。如圖22B所示，AG24之滯留時間與FBS相同，但AG22則不同。此證實，由CpG ODN與棕櫚醯基接合可促進ODN與血清蛋白質之交互作用。
實例19 經由可切割連接基接合TLR促效劑與生育酚可促進自行調配進入膠束結構中
由於生育酚之親脂性性質，我們亦測試生育酚接合物促進CpG ODN形成膠束之能力。採用FITC螢光信號，在HPLC上監測AG23，我們發現，在破壞膠束形成之高濃度(2或4M)脲存在下，改變了AG23之滯留時間，而AG22之滯留時間則不受影響(圖23)。此等結果證實，與生育酚接合之CpG ODN賦予ODN形成膠束之性質。
雖然本揭露已參照其特定實施例詳細描述，對於所屬技術領域中具有通常知識者而言將係顯而易見的是，可在未悖離本揭露之精神及範疇下進行各種變更及修飾。
<110> Alios BioPharma,Inc.
<120> 寡核苷酸構築體及其用途
<130> ALP0043WOPCT1
<150> US62/580,924
<151> 2017-11-02
<160> 56
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 2
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 3
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成寡核苷酸
<400> 4
<210> 5
<211> 22
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 5
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 6
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 7
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 8
<210> 9
<211> 24
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 9
<210> 10
<211> 24
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 10
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 11
<210> 12
<211> 24
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 12
<210> 13
<211> 24
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 13
<210> 14
<211> 24
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 14
<210> 15
<211> 24
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 15
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 16
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成寡核苷酸
<400> 17
<210> 18
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<212> DNA
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<223> 合成寡核苷酸
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<223> 合成寡核苷酸
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<223> 合成寡核苷酸
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<223> 合成寡核苷酸
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<223> 合成寡核苷酸
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<223> 合成寡核苷酸
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<223> 合成寡核苷酸
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<223> 合成寡核苷酸
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<212> DNA
<213> 人工序列
<200>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 35
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成寡核苷酸
<400> 36
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成寡核苷酸
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成寡核苷酸
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<213> 人工序列
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<223> 合成寡核苷酸
<400> 39
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成寡核苷酸
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<212> DNA
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<223> 合成寡核苷酸
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<223> 合成寡核苷酸
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<223> 合成寡核苷酸
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成寡核苷酸
<400> 44
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<212> DNA
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<223> 合成寡核苷酸
<400> 45
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成寡核苷酸
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<223> 合成寡核苷酸
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<223> 合成寡核苷酸
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<400> 53
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<400> 55
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<223> 合成寡核苷酸
<400> 56

Claims (20)

  1. 一種CpG ODN構築體，其具有下式：式(IIa)：5’M-L-[CpG ODN]3’、或式(IIb)：5’[CpG ODN]-L-M 3’其中：M代表脂質部分，較佳地該脂質部分包含至少一個選自由膽固醇、生育酚、棕櫚醯基、及硬脂基所組成之群組的脂質部分；L代表連接基，其包含10至100個選自由碳、氮、氧、氫、硫、及磷所組成之群組的原子，其中L係經由可切割鍵聯、較佳地係經由酯或醯胺鍵與該CpG ODN共價連接；且CpG ODN包含至少一個具有po核苷酸間鍵聯(internucleotide linkage)之CpG模體，較佳地包含至少兩個、三個、或四個CpG模體，該等CpG模體各具有該po核苷酸間鍵聯；可選地，式(IIa)或(IIb)之該CpG ODN構築體係進一步共價接合至靶向部分，該靶向部分較佳係選自由半乳糖、N-乙醯半乳糖胺(GalNAc)、海藻糖、甘露糖、唾液酸、N-乙醯基神經胺酸所組成之群組。
  2. 一種CpG ODN構築體，其具有以下結構：式(IIIa)：5’M1-Y1-(((CH2)2O)m-X)n-Y2-[CpG ODN]-Y3-M2 3’、或式(IIIb)：5’M2-Y3-[CpG ODN]-Y2-(((CH2)2O)m-X)n-Y1-M1 3’其中：M1代表脂質部分，較佳地該脂質部分包含至少一個選自由膽固醇、生育酚、棕櫚醯基、及硬脂基所組成之群組者；M2代表脂質部分、靶向部分、或不存在， Y1為鍵或連接基，較佳係具有式((CH2)2O)o之乙二醇，其中o為1至15，其係經由磷酸二酯(po)鍵聯、硫代磷酸酯(ps)鍵聯、或鍵與(((CH2)2O)m-X)n共價連接，X獨立地係鍵、po鍵聯、或ps鍵聯，各Y2及Y3獨立地係可切割鍵聯，較佳地包含酯或醯胺鍵，更佳地包含po鍵聯或胺基磷酸酯鍵聯，最佳的是po鍵聯，前提是當M2不存在時，Y3不存在，CpG ODN包含至少一個具有po核苷酸間鍵聯之CpG模體，較佳地包含至少兩個、三個、或四個CpG模體，該等CpG模體各具有該po核苷酸間鍵聯；m係1至15之整數，且n係1至5之整數。
  3. 如請求項2所述之ODN構築體，其具有下式：式(IVa)：5’M-Y1-(((CH2)2O)m-X)n-Y2-[CpG ODN]3’、或式(IVb)：5’[CpG ODN]-Y2-(((CH2)2O)m-X)n-Y1-M 3’其中：M代表脂質部分，較佳地該脂質部分包含至少一個選自由膽固醇、生育酚、棕櫚醯基、及硬脂基所組成之群組的脂質部分，Y1為鍵或連接基，較佳係具有式((CH2)2O)o之乙二醇，其中o為1至15，其係經由磷酸二酯(po)鍵聯、硫代磷酸酯(ps)鍵聯、或鍵與(((CH2)2O)m-X)n共價連接，X獨立地係鍵、磷酸二酯(po)鍵聯、或硫代磷酸酯(ps)鍵聯，Y2為可切割鍵聯，較佳地包含酯或醯胺鍵，更佳地包含po鍵聯或胺基磷酸酯鍵聯，最佳的是po鍵聯；CpG ODN包含至少一個具有po核苷酸間鍵聯之CpG模體，較佳地包含至少兩個、三個、或四個CpG模體，該等CpG模體各具有該po核苷酸間鍵聯； m係1至15之整數，較佳的是6；且n係1至5之整數，較佳的是2；可選地，式(IVa)或(IVb)之該CpG ODN構築體係進一步共價接合至靶向部分，該靶向部分較佳係選自由半乳糖、N-乙醯半乳糖胺(GalNAc)、海藻糖、甘露糖、唾液酸、N-乙醯基神經胺酸所組成之群組。
  4. 如請求項3所述之ODN構築體，其具有選自由下列所組成之群組的式構築體：5’M-po(HEG)po(HEG)po-[CpG ODN]3’；5’M-ps(HEG)po(HEG)po-[CpG ODN]3’、5’M-ps(HEG)ps(HEG)po-[CpG ODN]3’、5’M-po(HEG)ps(HEG)po-[CpG ODN]3’、5’[CpG ODN]-po(HEG)po(HEG)po-M 3’、5’[CpG ODN]-po(HEG)ps(HEG)po-M 3’、5’[CpG ODN]-po(HEG)ps(HEG)ps-M 3’、及5’[CpG ODN]-po(HEG)po(HEG)ps-M 3’，其中：M代表脂質部分，該脂質部分包含至少一個選自由膽固醇、生育酚、棕櫚醯基、及硬脂基所組成之群組者；po代表磷酸二酯鍵聯；HEG代表((CH2)2O)6；ps代表硫代磷酸酯鍵聯；且CpG ODN包含至少一個具有po核苷酸間鍵聯之CpG模體，較佳地包含至少兩個、三個、或四個CpG模體，該等CpG模體各具有該po核苷酸間鍵聯，其中M係直接經由po或ps鍵聯、或間接經由第二連接基共價連接至(HEG)，該第二連接基係直接經由po或ps鍵聯連接至(HEG)。
  5. 如請求項3所述之ODN構築體，其具有選自由下列所組成之群組的式：5’Toco-po(HEG)po(HEG)po-[CpG ODN]3’，其中Toco代表生育酚，5’Chol-po(HEG)po(HEG)po-[CpG ODN]3’，其中Chol代表膽固醇，5’Palm-po(HEG)po(HEG)po-[CpG ODN]3’，其中Palm代表棕櫚醯基，5’[CpG ODN]-po(HEG)ps-Chol 3’，其中Chol代表膽固醇，5’[CpG ODN]-po(HEG)ps-Toco 3’，其中Toco代表生育酚，及5’[CpG ODN]-po(HEG)ps-Palm 3’，其中Palm代表棕櫚醯基，其中：po代表磷酸二酯鍵聯；HEG代表((CH2)2O)6；ps代表硫代磷酸酯鍵聯；且CpG ODN包含至少一個具有po核苷酸間鍵聯之CpG模體，較佳地包含至少兩個、三個、或四個CpG模體，該等CpG模體各具有該po核苷酸間鍵聯，其中該生育酚、該膽固醇、或該棕櫚醯基係直接經由po或ps鍵聯、或間接經由第二連接基共價連接至該(HEG)，該第二連接基係直接經由po或ps鍵聯連接至(HEG)。
  6. 如請求項1至5中任一項所述之ODN構築體，其中該CpG ODN具有硫代磷酸酯(ps)核苷酸間鍵聯。
  7. 如請求項1至6中任一項所述之ODN構築體，其中該CpG ODN中該等CpG二核苷酸之二至四者各具有磷酸二酯(po)核苷酸間鍵聯。
  8. 如請求項1至7中任一項所述之ODN構築體，其中該CpG ODN包含選自由下列所組成之群組的多核苷酸序列：(1)5’TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 3’(SEQ ID NO：1)； (2)5’GGGGGACGATCGTCGGGGGG 3’(SEQ ID NO：2)；(3)5’GGGGTCAACGTTGAGGGGGG 3’(SEQ ID NO：3)；(4)5’TCCATGACGTTCCTGACGTT 3’(SEQ ID NO：4)；(5)5’TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG 3’(SEQ ID NO：5)；(6)5’TCGTCGTTACGTAACGACGACGTT 3’(SEQ ID NO：6)；及(7)5’TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGT 3’(SEQ ID NO：7)。
  9. 如請求項1至8中任一項所述之ODN構築體，其中該CpG ODN包含選自由下列所組成之群組的多核苷酸序列： (1) (SEQ ID NO：8)； (2) (SEQ ID NO：9)； (3) (SEQ ID NO：10)； (4) (SEQ ID NO：11)； (5) (SEQ ID NO：12)； (6) (SEQ ID NO：13)； (7) (SEQ ID NO：14)； (8) (SEQ ID NO：15)； (9) (SEQ ID NO：16)； (10) (SEQ ID NO：17)； (11) (SEQ ID NO：18)； (12) (SEQ ID NO：19)； (13) (SEQ ID NO：20)； (14) (SEQ ID NO：21)； (15) (SEQ ID NO：22)； (16) (SEQ ID NO：23)； (17) (SEQ ID NO：24)； (18) (SEQ ID NO：25)；及 (19) (SEQ ID NO：26)； 其中：po代表磷酸二酯核苷酸間鍵聯；且ps代表硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯。
  10. 如請求項1所述之ODN構築體，其具有以下結構： (1) (SEQ ID NO：27)； (2) (SEQ ID NO：28)； (3) (SEQ ID NO：29)； (4) (SEQ ID NO：30)； (5) (SEQ ID NO：31)； (6) (SEQ ID NO：32)； (7) (SEQ ID NO：33)； (8) (SEQ ID NO：34)； (9) (SEQ ID NO：35)； (10) (SEQ ID NO：36)； (11) (SEQ ID NO：37)； (12) (SEQ ID NO：38)； (13) (SEQ ID NO：39)； (14) (SEQ ID NO：40)； (15) (SEQ ID NO：41)； (16) (SEQ ID NO：42)； (17) (SEQ ID NO：43)； (18) (SEQ ID NO：44)； (19) (SEQ ID NO：45)； (20) (SEQ ID NO：46)； (21) (SEQ ID NO：47)； (22) (SEQ ID NO：48)； (23) (SEQ ID NO：49)； (24) (SEQ ID NO：50)； (25) (SEQ ID NO：51)； (26) (SEQ ID NO：52)； (27) (SEQ ID NO：53)； (28) (SEQ ID NO：54)； (29) (SEQ ID NO：55)； (30) (SEQ ID NO：56)； 其中：Chol代表膽固醇；Toco代表生育酚；Palmitoyl代表棕櫚醯基；HEG代表((CH2)2O)6；po代表磷酸二酯鍵聯；且ps代表硫代磷酸酯鍵聯， 其中該生育酚、該膽固醇、或該棕櫚醯基係直接經由po或ps鍵聯、或間接經由第二連接基共價連接至該(HEG)，該第二連接基係直接經由po或ps鍵聯連接至(HEG)。
  11. 一種CpG ODN構築體，其具有下式：式(IIa)(s)：5’M-L-[CpG ODN]3’、或式(IIb)(s)：5’[CpG ODN]-L-M 3’其中：M代表脂質部分，較佳地該脂質部分包含至少一個選自由膽固醇、生育酚、棕櫚醯基、及硬脂基所組成之群組的脂質部分；L代表連接基，其包含至少1個選自由碳、氮、氧、氫、硫、及磷所組成之群組的原子，且L係經由可切割鍵聯、較佳地係經由酯或醯胺鍵與該CpG ODN共價連接；且CpG ODN代表如請求項12至14中任一項所述之CpG ODN；可選地，式(IIa)或(IIb)之該CpG ODN構築體係進一步共價接合至靶向部分，該靶向部分較佳係選自由半乳糖、N-乙醯半乳糖胺(GalNAc)、海藻糖、甘露糖、唾液酸、N-乙醯基神經胺酸所組成之群組。
  12. 一種ODN構築體，其具有以下結構： 或其醫藥上可接受之鹽，其中該等寡核苷酸代表CpG ODN，該CpG ODN包含至少一個具有po核苷酸間鍵聯之CpG模體，較佳地包含至少兩個、三個、或四個CpG模體，該等CpG模體各具有該po核苷酸間鍵聯。
  13. 如請求項12所述之ODN構築體，其中該CpG ODN含有SEQ ID NO：1。
  14. 如請求項13所述之ODN構築體，其中該CpG ODN係由以下組成5’TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsT-3’。
  15. 如請求項12所述之ODN構築體，其具有以下結構：
  16. 一種ODN構築體，其具有以下結構：
  17. 一種醫藥組成物，其包含如請求項1至16中任一項所述之ODN構築體及醫藥上可接受之載劑。
  18. 一種製備醫藥組成物之方法，其包含將如請求項1至16中任一項所述之ODN構築體與醫藥上可接受之載劑組合。
  19. 一種如請求項17所述之醫藥組成物於製造刺激有需要之對象之免疫反應的藥物之用途。
  20. 一種如請求項17所述之醫藥組成物於製造治療有需要之對象之疾病的藥物之用途，其中該疾病係選自由B型肝炎病毒(HBV)及癌症所組成之群組。
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Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018209270A1 (en) 2017-05-11 2018-11-15 Northwestern University Adoptive cell therapy using spherical nucleic acids (snas)
AU2020310853A1 (en) 2019-07-05 2022-01-27 Tambo, Inc. Trans-cyclooctene bioorthogonal agents and uses in cancer and immunotherapy
WO2021064614A1 (en) * 2019-09-30 2021-04-08 Janssen Biopharma, Inc. Toll-like receptor 7 and/or 8 agonists and uses thereof
JP2023537066A (ja) 2020-08-07 2023-08-30 タンボ・インコーポレイテッド トランス－シクロオクテン生体直交型薬剤並びに癌及び免疫療法における使用
WO2022034555A1 (en) * 2020-08-13 2022-02-17 Janssen Biopharma, Inc. Polynucleotide constructs and uses thereof
CN113499433B (zh) * 2021-06-21 2022-03-18 复旦大学 一种具有抗肿瘤活性的GalNAc/CpG脂质体疫苗、制备方法及应用
CN114573652A (zh) * 2022-03-15 2022-06-03 通用生物(滁州)有限公司 药用核酸合成工艺
CN114591387A (zh) * 2022-03-21 2022-06-07 通用生物(滁州)有限公司 一种药用核酸合成后的胺洗工艺
WO2024110843A1 (en) * 2022-11-21 2024-05-30 Segena Corporation S.A. Enhancing oligonucleotide immunomodulatory activity through dianophore long-lasting modification: methods and applications

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5378825A (en) 1990-07-27 1995-01-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5386023A (en) 1990-07-27 1995-01-31 Isis Pharmaceuticals Backbone modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through reductive coupling
US5489677A (en) 1990-07-27 1996-02-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms
US10100316B2 (en) * 2002-11-21 2018-10-16 Archemix Llc Aptamers comprising CPG motifs
WO2005030259A2 (en) * 2003-09-25 2005-04-07 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid-lipophilic conjugates
DE102006007433A1 (de) * 2006-02-17 2007-08-23 Curevac Gmbh Adjuvanz in Form einer Lipid-modifizierten Nukleinsäure
KR20100050443A (ko) * 2007-05-31 2010-05-13 안테리오스, 인코퍼레이티드 핵산 나노입자 및 이의 용도
DE102009039097B3 (de) 2009-08-27 2010-11-25 Siemens Aktiengesellschaft Verfahren zum Übertragen von Daten in einem Sensornetzwerk, Sensorknoten und Zentral-Rechner
US8315599B2 (en) 2010-07-09 2012-11-20 Telecommunication Systems, Inc. Location privacy selector
JP6375289B2 (ja) * 2012-04-05 2018-08-15 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー 免疫刺激組成物およびその使用方法
WO2013162828A1 (en) * 2012-04-27 2013-10-31 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Use of cpg oligonucleotides co-formulated with an antibiotic to accelarate wound healing
JP6527516B2 (ja) * 2013-12-03 2019-06-05 ノースウェスタン ユニバーシティ リポソーム粒子、前述のものを作製する方法及びその使用
JP6581604B2 (ja) * 2014-06-04 2019-09-25 イグジキュア, インコーポレーテッドExicure, Inc. 予防的または治療的適用のためのリポソーム球状核酸による免疫調節物質の多価送達
BR112019019177B8 (pt) * 2017-03-29 2022-09-13 Shionogi & Co Composição farmacêutica compreendendo derivados de ácido nucleico tendo atividade imunoestimuladora

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