BR112020008546A2 - construtos de oligonucleotídeo e usos dos mesmos - Google Patents

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Leonid Beigelman
Theodore Yun
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Abstract

A presente invenção se refere a agonistas do receptor do tipo Toll 9 (TLR9 = "Toll-Like Receptor 9") imunoestimuladores à base de oligodesoxinucleotídeo. São também descritas composições compreendendo os agonistas de TLR9, métodos para produzir os agonistas de TLR9, e métodos de uso dos agonistas de TLR9 para tratar doenças, distúrbios ou condições imunológicas, como infecções virais ou câncer.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "CONS- TRUTOS DE OLIGONUCLEOTÍDEO E USOS DOS MESMOS".
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[0001] Este pedido tem o direito de prioridade de acordo com o Tí- tulo 35 U.S.C. $8119 (e) para o pedido de patente provisório No. 62/580.924, depositado em 2 de novembro de 2017, cuja descrição está aqui incorporada a título de referência em sua totalidade. REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS SUBMETIDA ELE-
TRONICAMENTE
[0002] Este pedido contém uma listagem de sequências, que foi submetida eletronicamente via EFS-Web como uma listagem de se- quência formatada ASCII| com um nome de arquivo "688097 119U1 Se- quence Listing" com data de criação de 31 de outubro 2018, e tendo um tamanho de 11,3 kb. A listagem de sequências submetida via EFS-Web faz parte do relatório descritivo e está aqui incorporada a título de refe- rência em sua totalidade
CAMPO DA INVENÇÃO
[0003] A presente invenção refere-se a construtos de oligonucleotí- deo, composições que compreendem os construtos de oligonucleotí- deo, e a métodos de preparo dos construtos de oligonucleotídeo. Os construtos de oligonucleotídeo podem agir como moléculas imunomo- duladoras e, em particular, como agonistas do Receptor do tipo Toll 9 (TLR9) (TLR = "Toll-like Receptor"). Consequentemente, a presente in- venção também se refere aos métodos de uso dos construtos de oligo- nucleotídeo como agonistas de TLR9, sozinhos ou em combinação com outros agentes, para tratar ou evitar doenças em que a modulação da atividade do TLR9 seria benéfica, como doenças, distúrbios ou condi- ções imunológicas, infecções virais, e câncer.
ANTECEDENTES
[0004] Os receptores do tipo Toll (TLRs) são uma classe de proteí- nas do receptor de reconhecimento de padrão (PRR) que desempe- nham um papel chave na resposta imunológica inata. Os TLRs reconhe- cem padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs) de patóge- nos microbianos, como bactérias, fungos, parasitas e vírus, que podem ser distintos de moléculas hospedeiras. Os TLRs são proteínas trans- membrana que funcionam tipicamente como dímeros e são expressos por células envolvidas na resposta imunológica inata, incluindo células dendríticas apresentadoras de antígenos e macrófagos fagocíticos.
[0005] Há pelo menos dez membros da família de TLR humano, TLR1 a TLR10, e pelo menos doze membros da família de TLR murino, TLR1 a TLR9 e TLR11 a TLR1I3, cada um deles diferindo quanto aos tipos de antígenos que eles reconhecem. Por exemplo, TLR9 é um TLR de detecção de nucleotídeo que é ativado por dinucleotídeos de cito- sina-fosfato-guanosina (CpG) não metilados, nos quais a citosina está ligada a uma guanosina por uma ligação fosfodiéster ou fosforotioato, em DNA de fita simples ou de fita dupla, incluindo DNA viral.
[0006] A ativação de TLRs leva a uma série de eventos de sinaliza- ção resultando na produção de interferons do tipo | (IFNs), citocinas in- flamatórias e quimiocinas, e na indução de respostas imunológicas. Eventualmente, essa inflamação também ativa o sistema imune adap- tativo, que então resulta na depuração dos patógenos invasores e das células infectadas.
[0007] O TLR9 é expresso em células B e células dendríticas plas- macitoides do sistema imune. A ligação de DNA contendo CpG ao TLR9 inicia uma cascata de sinalização a jusante que leva à ativação dos fa- tores de transcrição NF-kKB, MAPK e IRF7, o que resulta, por fim, na indução de inflamação rápida, caracterizada pela maior expressão de várias interleucinas e citocinas (Yamamoto e Takeda, Gastroenterology Research and Practice, vol. 2010). Em particular, a estimulação do
TLRA9 por agonistas contendo CpG resulta no aumento da produção de IFN-a, TNF-a, IL-6 e/ou IL-1, dependendo da classe de CpG.
[0008] O vírus da hepatite B (HBVC) é um vírus com DNA dupla-fita (AdsDNA) que causa doenças que incluem hepatite B, fibrose, cirrose e carcinoma hepatocelular. Cerca de dois bilhões de pessoas estão infec- tadas com o HBV e quase 400 milhões de pessoas têm infecção por hepatite B crônica (HBV crônica), caracterizada pela persistência de partículas de vírus e subvírus no sangue por mais de 6 meses (Xu et al., 2014, Gastrointest Tumors, 1 (3): 135-145). O HBV crônico é atualmente tratado com IFN-a e análogos de nucleosídeos ou nucleotídeos, mas não há cura definitiva devido à persistência do DNA circular covalente- mente fechado (cccDNA) em hepatócitos infectados. O cccDNA retido desempenha uma função contínua como modelo para RNAs virais e no- vos vírions. Acredita-se que a indução de respostas de células B espe- cíficas contra vírus através da estimulação da via de sinalização de TLR9 em células B com o uso de oligodesoxirribonucleotídeos CpG sin- téticos (CPG ODNs) podem eliminar eficazmente hepatócitos portado- res de cccNA (Isogawa et al., 2005, J Virology 79 (11) 7269-7272).
[0009] Evidências substanciais indicam que a imunoterapia é uma abordagem viável e eficaz para o tratamento de vários tipos de câncer. Os ligantes que direcionam receptores do tipo Toll e outras vias de re- conhecimento inato representam uma potente estratégia para modular a imunidade inata para gerar imunidade antitumoral. Os agonistas de TLR estão atualmente sob investigação como adjuvantes de vacina em terapias anticâncer por sua capacidade em ativar células do sistema imune e promover inflamação (consulte, por exemplo, Kaczanowska et al., J Leukoc Biol. 2013 Jun; 93 (6): 847-863 e referências ali contidas). Por exemplo, foi relatado que, além de prolongar a sobrevivência de células T CD4* e suprimir a atividade Treg, OS ligantes de TLR9 aumen-
tam os números de células T CD4* e CD8* T mediante aumento da pro- dução de IL-2 e da expressão de IL-2R (/d. e referências ali citadas). Foi demonstrado que a estimulação de TLR9 com CpG-ODN em linhagens de células de neuroblastoma diminui a proliferação de células e au- menta a apoptose dependente de caspase, resultando no aumento de sobrevida de camundongos portadores de tumor (/d.). Entretanto, foi também relatado que o envolvimento de TLRs em células tumorais pode promover o crescimento tumoral, contribuindo para a manutenção de um ambiente cronicamente inflamado, induzindo a proliferação de célu- las cancerígenas e promovendo a sobrevivência celular. Por exemplo, foi relatado que células de câncer de mama humano e células de carci- noma gástrico humano expressando TLR9 têm maior capacidade inva- siva como resultado do aumento da secreção de MMP13 e COX-2 me- diante estimulação de TLR9 em cultura de tecido, enquanto no caso de glioma, apesar de suas propriedades indutoras de metástase, o TLR9 não teve qualquer efeito sobre a proliferação celular, destacando os di- versos efeitos que a sinalização de TLR9 pode ter sobre os diferentes tipos de células tumorais (/d.).
[0010] As estratégias usadas para facilitar a liberação in vivo de oli- gonucleotídeos terapêuticos incluem a modificação química do oligonu- cleotídeo, o uso de nanocarreadores lipídicos, a ligação do oligonucleo- tídeo a agentes de direcionamento de receptor, e o uso de moléculas pequenas para otimizar a eficácia do oligonucleotídeo. Entretanto, sis- temas de liberação de nanopartículas podem ter uma gama limitada de aplicações terapêuticas devido à sua incapacidade de acesso à maioria dos tecidos e preocupações potenciais com toxicidade. Além disso, ao contrário do RNA antissenso ou siRNA, os agonistas de oligonucleotí- deo contendo CpG funcionam por ligação direta ao TLR9. O impedi- mento estérico precisa ser evitado ao se projetar um conjugado dos ago- nistas de oligonucleotídeo contendo CpG com moléculas de liberação,
como colesterol.
[0011] Dessa forma, existe uma necessidade por agentes terapêu- ticos eficazes que possam efetivamente tratar ou prevenir doenças em que a modulação da atividade de TLR9 seria benéfica, como infecções por HBV crônicas e cânceres.
SUMÁRIO
[0012] A presente invenção satisfaz a necessidade de agentes te- rapêuticos eficazes que podem tratar ou prevenir efetivamente doenças nas quais a modulação da atividade do TLRO9 seria benéfica mediante o fornecimento de construtos baseados em oligodesoxinucleotídeo (ODN) que estimulam uma resposta imune através de ligação e ativação do TLRO9. A presente invenção é também direcionada ao uso desses cons- trutos de ODN, sozinhos ou em combinação com outros agentes, para o tratamento ou prevenção de doenças nas quais a modulação da ativi- dade do TLR9 seria benéfica, como doenças, distúrbios ou condições imunológicas, incluindo infecções virais ou cânceres.
[0013] Os construtos de ODN da presente invenção compreendem oligodesoxinucleotídeos de CpG conjugados, através de ligantes, a por- ções lipídicas.
[0014] O projeto dos construtos de ODN inclui, por exemplo, o nú- mero e posicionamento de motivos citosina-guanina (CpG) e suas liga- ções internucleotídicas, bem como a estrutura e localização de porções lipídicas e a presença ou ausência de um ligante. As porções lipídicas podem incluir moléculas de lipídio, como colesterol e tocoferol|, que são conjugadas ao construto de ODN. Além disso, os construtos de ODN compreendem ligações internucleotídicas fosfodiéster dentro de um ou mais motivos CpG do oligonucleotídeo.
[0015] De acordo com as modalidades da presente invenção, foi de- monstrado que os construtos de ODN alcançar um nível inesperado de biodisponibilidade e eficácia otimizadas como agonistas de TLR9. Sem se ater a uma teoria específica, a atividade agonista otimizada de TLR9 pode reduzir ou eliminar eficazmente hepatócitos portadores de cccDNA de HBV por estimulação da reexpressão de vírus latentes, ao mesmo tempo em que estimula o sistema imune a reconhecer os produtos vi- rais. Em particular, o sistema imune não reconhece o vírus HBV em seu estado latente e o baixo nível de inflamação induzido pelos construtos de ODN revelados pode causar o surgimento do vírus a partir daquela latência. A reexpressão do HBV resultante e a formação de produtos de expressão viral recém-formados são, então, reconhecidos pelo sistema imune ativado para controlar o vírus circulante e matar as células infec- tadas, eliminando eficazmente os hepatócitos portadores de cccDNA do HBV.
[0016] Os construtos de ODN revelados, de acordo com as modali- dades da presente invenção, podem também ser usados para tratar tu- mores, de preferência cânceres, como o câncer colorretal. Os constru- tos de CpG ODN revelados induzem a imunidade contra células tumo- rais in vivo e aumentam a sobrevida de camundongos portadores de tumor.
[0017] Em um aspecto geral, a presente invenção se refere a cons- trutos de CpG ODN que têm uma porção lipídica ligada a um CpG ODN através de um ligante. Em uma modalidade, o construto de CpG ODN tem uma Fórmula: Fórmula |: 5 M-L+—HCpG ODN]-L2-M,> 3', em que: cada um dentre M; e M> representa, independentemente, uma porção lipídica, de preferência, a porção lipídica compreende pelo menos um selecionado do grupo que consiste em colesterol, tocoferol|, um grupo palmitoíla, e um grupo estearila, opcionalmente um dentre M; e M> está ausente; cada um dentre L; e L2 representa, independentemente, um ligante, de preferência o ligante compreende pelo menos 10 átomos se- lecionados do grupo que consiste em carbono, nitrogênio, oxigênio, hi- drogênio, enxofre e fósforo, e L é ligado covalentemente ao CpG ODN através de uma ligação clivável, de preferência, por meio de uma ligação éster ou amida, opcionalmente um dentre L, e L> está ausente quando o respectivo M: ou M> está ausente; e de preferência, o CpG ODN compreende pelo menos um mo- tivo CpG que tem uma ligação internucleotídica fosfodiéster (po); opcionalmente, o construto de CpG ODN da fórmula (1) é adi- cionalmente covalentemente conjugado a uma porção de direciona- mento que é, de preferência, selecionada do grupo que consiste em ga- lactose N-acetilgalactosamina (GalNAc), fucose, manose, ácido siálico e ácido N-acetil neuramínico.
[0018] Em uma modalidade, a presente invenção se refere a um construto de CpG ODN tendo uma Fórmula: Fórmula (Ila): 8 M-LCpG ODN] 3', ou Fórmula (1Ib): 5 [CpG ODN]-L-M 3' em que: M representa uma porção lipídica, de preferência, a porção lipídica compreende pelo menos um selecionado do grupo que consiste em colesterol, tocoferol, um grupo palmitoíla, e um grupo estearila; L representa um ligante compreendendo pelo menos 10 áto- mos selecionados do grupo que consiste em carbono, nitrogênio, oxigê- nio, hidrogênio, enxofre e fósforo, e L é ligado covalentemente ao CpG ODN através de uma ligação clivável, de preferência, por meio de uma ligação éster ou amida; e CpG ODN compreende pelo menos um motivo CpG tendo uma ligação internucleotídica po (fosfodiéster), compreende, de prefe- rência, pelo menos dois, três ou quatro motivos CpG, tendo cada um a ligação internucleotídica po;
opcionalmente, o construto de CpG ODN da Fórmula (Ila) ou (Ilb) é adicionalmente covalentemente conjugado a uma porção de dire- cionamento, que é, de preferência, selecionada do grupo que consiste em galactose N-acetilgalactosamina (GalNAc), fucose, manose, ácido siálico e ácido N-acetil neuramínico.
[0019] Em uma modalidade, o ligante L na Fórmula (lla) ou (llb) compreende —((CH2)-O)m—X)n-, em que m é um número inteiro de 1 a 15, X é independentemente uma ligação fosfodiéster (po) ou fosforotio- ato (ps), e n é um número inteiro de 1 a 5.
[0020] Em uma outra modalidade, o ligante L na Fórmula (lla) ou (Ilb) está ligado à porção lipídica M através de uma ligação fosfodiéster (po) ou uma ligação fosforotioato (ps).
[0021] Em ainda outra modalidade, o ligante L na Fórmula (lla) ou (Ilb) está ligada ao CpG ODN por meio de uma ligação fosfodiéster (po) ou uma ligação fosforamidato, de preferência, uma ligação po.
[0022] Em um outro aspecto, a presente invenção se refere a um construto de ODN tendo uma estrutura de: Fórmula (Illa): 5 M—YH((CH2)2O)mn-X)n—Y2-[CpG ODN]—Y3-M2 3', ou Fórmula (Illb): 5' M2—Y3-[CpG ODN]-Y2—(((CH2)2O)Jn=WX)a—"Y1-M1 3' em que: M; representa uma porção lipídica, de preferência, a porção lipídica compreende pelo menos um selecionado do grupo que consiste em colesterol, tocoferol, um grupo palmitoíla, e um grupo estearila, M> representa uma porção lipídica, uma porção de direcio- namento, ou está ausente, Y1 é uma ligação ou um ligante, de preferência, etileno glicol que tem a Fórmula ((CH2)2O)., em que o é de 1 a 15, covalentemente ligado a (((CH2)2O)m—X)n por meio de uma ligação fosfodiéster (po), uma ligação fosforotioato (ps) ou uma união, X é independentemente uma união, uma ligação po ou uma ligação ps, cada um dentre Y2 e Y3 é independentemente uma ligação clivável, de preferência, compreende uma ligação éster ou amida, com mais preferência, compreende uma ligação po ou uma ligação fosfora- midato, com a máxima preferência, uma ligação po, desde que quando M, estiver ausente, Y;3 esteja ausente, CpG ODN compreende pelo menos um motivo CpG tendo uma ligação internucleotídica po (fosfodiéster), compreende, de prefe- rência, pelo menos dois, três ou quatro motivos CpG, tendo cada um a ligação internucleotídica po; m é um número inteiro de 1 a 15, e n é um número inteiro de 1 a 5.
[0023] Em uma modalidade, a presente invenção se refere a um construto de CpG ODN tendo uma Fórmula: Fórmula (IVa): 5' M-Y-(((CH2)2O)nWX)—Y2-[CpG ODN] 3', ou Fórmula (IVb): 5 [CpG ODNI-Y2H((CH2)-O)nWX)n— Y1-M 3' em que: M representa uma porção lipídica, de preferência, a porção lipídica compreende pelo menos um selecionado do grupo que consiste em colesterol, tocoferol, um grupo palmitoíla, e um grupo estearila, Y1 é uma ligação ou um ligante, de preferência, etileno glicol que tem a Fórmula ((CH2)2O)., em que o é de 1 a 15, covalentemente ligado a (((CH2)2O)nm—X)n por meio de uma ligação fosfodiéster (po), uma ligação fosforotioato (ps) ou uma união, X é independentemente uma união, uma ligação fosfodiéster (po) ou uma ligação fosforotioato (ps), Y2 é uma ligação clivável, de preferência, compreende uma ligação éster ou amida, com mais preferência, compreende uma ligação po ou uma ligação fosforamidato, com a máxima preferência, uma liga- ção po;
CpG ODN compreende pelo menos um motivo CpG tendo uma ligação internucleotídica po (fosfodiéster), compreende, de prefe- rência, pelo menos dois, três ou quatro motivos CpG, tendo cada um a ligação internucleotídica po; m é um número inteiro de 1 a 15, de preferência, 6; e n é um número inteiro de 1 a 5, de preferência, 2; opcionalmente, o construto de CpG ODN da Fórmula (IVa) ou (IVb) é adicionalmente covalentemente conjugado a uma porção de direcionamento, que é, de preferência, selecionada do grupo que con- siste em galactose, N-acetilgalactosamina (GalNAc), fucose, manose, ácido siálico e ácido N-acetil neuramínico.
[0024] De acordo com modalidades específicas, a porção lipídica representa um grupo colesterol, tocoferol ou palmitoíla.
[0025] De acordo com modalidades específicas, o CpPOG ODN em cada uma das Fórmulas (1) a (IVb) tem uma ou mais ligações internu- cleotídicas fosforotioato (ps). De acordo com um aspecto mais especí- fico, todas as ligações internucleotídicas do construto de ODN na Fór- mula (I) (ps) são ligações fosforotioato (ps). De acordo com um aspecto específico, pelo menos uma dentre as ligações internucleotídicas entre o C e o G de um dinucleotídeo CpG no construto de ODN é uma ligação internucleotídica fosforotioato (ps) estereodefinida. De acordo com um aspecto específico, pelo menos uma dentre as ligações internucleotídi- cas entre o C e o G de um dinucleotídeo CpG no CpG ODN é uma liga- ção internucleotídica fosfodiéster (po), e cada uma dentre as ligações internucleotídicas do CpG ODN restantes são ligações fosforotioato (ps). De acordo com um aspecto específico, o CpG ODN tem de 19 a 24 nucleotídeos de comprimento.
[0026] Em um outro aspecto geral, a presente invenção se refere a uma composição farmacêutica que compreende um construto de ODN da presente invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável.
[0027] Em um outro aspecto geral, a presente invenção se refere a um método de preparação de uma composição farmacêutica da pre- sente invenção que compreende combinar um construto de ODN da presente invenção com um veículo farmaceuticamente aceitável.
[0028] Em um outro aspecto geral, a presente invenção se refere a um método para estimular uma resposta imunológica em um indivíduo que precisa da mesma, que compreende administrar ao indivíduo uma composição farmacêutica da presente invenção.
[0029] Em um outro aspecto geral, a presente invenção se refere a um método para tratar uma doença em um indivíduo que precisa do mesmo, que compreende administrar ao indivíduo a composição farma- cêutica da presente invenção. De preferência, a doença é selecionada do grupo que consiste em doenças, distúrbios ou condições imunológi- cas, como infecções virais ou cânceres. Com mais preferência, a do- ença é uma infecção crônica por HBV ou um câncer do tipo tumor sólido.
[0030] Outros aspectos, as características e vantagens da presente invenção ficarão evidentes a partir da descrição a seguir, incluindo a descrição detalhada da presente invenção e suas modalidades prefe- renciais e as reivindicações em anexo.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0031] O sumário anteriormente mencionado, bem como a seguinte descrição detalhada da presente invenção, serão mais bem compreen- didos quando lidos em conjunto com os desenhos em anexo. Deve-se compreender que a presente invenção não se limita às modalidades precisas mostradas nos desenhos.
[0032] Nos desenhos:
[0033] A Figura 1 mostra a ativação de TLR9 de uma linhagem de células repórter, medida pelo nível OD630, através de agonistas TLR9 que têm motivos CpG ligados a fosfodiéster em várias posições;
[0034] A Figura 2 mostra a ativação de TLR9 de uma linhagem de células repórter, medida pelo nível OD630, através de construtos de ODN, de acordo com modalidades da presente invenção, compreen- dendo motivos CpG ligados a fosfodiéster conjugados a colesterol por um ligante clivável;
[0035] A Figura 3 mostra a ativação de TLR9 humano (painel es- querdo) e de camundongo (painel direito) em linhagens de células re- pórter, normalizadas para ODN2006, através de construtos de ODN, de acordo com modalidades da presente invenção;
[0036] A Figura 4 mostra a indução de citocinas in vivo em camun- dongos (IL-6, painel esquerdo; TNF-a, painel central; MIP-16, painel di- reito) através de construtos de ODN, de acordo com as modalidades da presente invenção, 4 h após a administração dos construtos de ODN;
[0037] A Figura 5 mostra um desenho esquemático de um experi- mento executado para analisar o efeito dos construtos de ODN, de acordo com modalidades da presente invenção, sobre a infecção por HBV em camundongos;
[0038] A Figura 6 mostra os níveis de DNA de HBV em camundon- gos mediante o tratamento com uma dose única (painel esquerdo) ou múltiplas doses (painel direito) de construtos de ODN, de acordo com as modalidades da presente invenção;
[0039] A Figura 7 mostra os níveis de HBsAg em camundongos me- diante o tratamento com uma dose única (painel esquerdo) ou múltiplas doses (painel direito) de construtos de ODN, de acordo com as modali- dades da presente invenção;
[0040] A Figura 8 mostra os níveis de HBeAg em camundongos me- diante o tratamento com uma dose única (painel esquerdo) ou múltiplas doses (painel direito) de construtos de ODN da presente invenção;
[0041] A Figura 9 mostra a indução de citocina in vivo (IL-12p40, painel esquerdo; IL-6, painel central; MIP-18, painel direito) em camun-
dongos por injeção subcutânea de construtos de ODN da presente in- venção;
[0042] A Figura 10 mostra a indução de citocina in vivo (IL-12p40, painel esquerdo; IL-6, painel central; MIP-18, painel direito) em camun- dongos por injeção subcutânea de um construto de ODN da presente invenção chamado de AGB8;
[0043] A Figura 11 mostra o nível de IgG específica para HBsAg no Dia 14 em camundongos dosados por via intravenosa (IV) ou subcutà- nea (SQ) com HBsAg e um construto de ODN;
[0044] A Figura 12 ilustra construtos de ODN exemplificadores, de acordo com modalidades da presente invenção;
[0045] A Figura 13A mostra os níveis de HBsAg, anticorpo anti-HBs e DNA de HBV em camundongos AAV-HBV mediante a administração subcutânea de AG9, um construto de ODN de acordo com uma modali- dade da presente invenção;
[0046] A Figura 13B mostra os níveis de HBsAg, anticorpo anti-HBs e DNA de HBV em camundongos AAV-HBV mediante administração in- travenosa de AG9;
[0047] A Figura 13C mostra os níveis de HBsAg, anticorpo anti-HBs e DNA de HBV em camundongos AAV-HBV mediante a administração intravenosa de AG19, um construto de ODN de acordo com uma moda- lidade da presente descrição;
[0048] A Figura 13D mostra os níveis de células T específicas para HBsAg em camundongos AAV-HBV mediante a administração de cons- trutos de ODN de acordo com modalidades da presente invenção;
[0049] A Figura 14 mostra um desenho esquemático de um estudo- piloto de eficácia com um construto de ODN, de acordo com modalida- des da presente invenção, com administração por via intratumoral (IT) e intravenosa (IV) em camundongos portadores de tumor MC-38 (modelo de câncer colorretal);
[0050] A Figura 15 mostra o volume do tumor em camundongos C57BL/6 naiíve implantados com células de carcinoma de cólon MC-38 após serem administrados por via intravenosa com quantidades cres- centes de construtos de ODN, de acordo com modalidades da presente invenção, em particular,
[0051] a Figura 15A mostra o volume do tumor nos camundongos administrados por via intravenosa com o construto de ODN AG1;
[0052] a Figura 15B mostra o volume do tumor nos camundongos administrados por via intravenosa com o construto de ODN AG9; e
[0053] a Figura 15C mostra o volume do tumor nos camundongos administrados por via intravenosa com o construto de ODN AG17;
[0054] A Figura 16 mostra um desenho esquemático de um estudo de Dose Máxima Tolerada (DMT)/eficácia com um construto de ODN, de acordo com uma modalidade da presente invenção em camundon- gos portadores de tumor MC-38;
[0055] A Figura 17 ilustra um esquema de síntese para construtos de ODN, de acordo com modalidades da presente invenção;
[0056] A Figura 18 mostra níveis de CD40 em células B purificadas a partir de esplenócitos de camundongo isolados de camundongos C57BL/6 e estimuladas com construtos de ODN, de acordo com moda- lidades da presente invenção;
[0057] A Figura 19 mostra a ativação de TLR9 humano em uma |li- nhagem de células repórter, normalizadas para ProMune, através de construtos de ODN, de acordo com modalidades da presente invenção;
[0058] A Figura 20 mostra a ativação de TLR9 de camundongo, nor- malizado para ODN1826, através de construtos de ODN, de acordo com modalidades da presente invenção;
[0059] A Figura 21A mostra que a administração subcutânea (SQ) de AG21 (AG9 conjugado com AlexaFluor 647) a camundongos resultou em acúmulo de oligo em nódulos linfáticos de drenagem dos camun- dongos, em comparação com AG20 (AG1 conjugado com AlexaFluor 647);
[0060] A Figura 21B mostra que a administração intravenosa (IV) de AG21 a camundongos resultou em acúmulo de oligo no baço dos ca- mundongos, em comparação com AG20;
[0061] A Figura 22A mostra que o tocoferol poderia facilitar a liga- ção de CpG ODN a proteínas séricas como albumina sérica bovina (BSA);
[0062] A Figura 22B demonstra que a conjugação de CpG ODN com palmitoíla facilitou a interação do ODN com proteínas séricas dentro do soro fetal bovino (SFB); e
[0063] A Figura 23 demonstra que a conjugação de tocoferol do CpG ODN conferiu a propriedade de formação de micelas ao ODN.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0064] Várias publicações, artigos e patentes são citados ou descri- tos em segundo plano e ao longo do relatório descritivo; cada uma des- sas referências está aqui incorporada por referência em sua totalidade. A discussão de documentos, atos, materiais, dispositivos, artigos ou si- milares que tenha sido incluída no presente relatório descritivo tem o propósito de fornecer contexto para a presente invenção. Tal discussão não é uma admissão de que qualquer um ou todos esses assuntos fa- çam parte da técnica anterior no que diz respeito a quaisquer invenções reveladas ou reivindicadas. Definições
[0065] Exceto onde definido em contrário, todos os termos técnicos e científicos usados na presente invenção têm o mesmo significado, conforme comumente compreendido pelo versado na técnica à qual a presente invenção pertence. De outro modo, certos termos utilizados na presente invenção têm os significados como definidos no relatório des- critivo. Todas as patentes, pedidos de patente publicados e publicações aqui citadas estão aqui incorporados por referência como se aqui fos- sem apresentados totalmente. Deve-se observar que, conforme usado na presente invenção e nas reivindicações em anexo, as formas no sin- gular "um/uma" e "o/a" incluem a referência no plural, salvo se o con- texto claramente indicar o contrário.
[0066] Em todo este relatório descritivo e nas reivindicações a se- guir, salvo quando o contexto exigir o contrário, a palavra "compreen- dem", e variações como "compreende" e "compreendendo" serão en- tendidas para implicar na inclusão de um número inteiro ou etapa ou grupo de números inteiros ou etapas estabelecidos, mas não a exclusão de qualquer outro número inteiro ou etapa ou grupo de números inteiros ou etapas. Para uso na presente invenção, o termo "que compreende" pode ser substituído pelo termo "que contém" ou "que inclui" ou, às ve- zes, quando usado aqui, pelo termo "que tem".
[0067] Como usado aqui, a expressão "que consiste em" exclui qualquer elemento, etapa ou ingrediente não especificado no elemento de reivindicação. Quando usado aqui, a expressão "que consiste essen- cialmente em" não exclui materiais ou etapas que não afetam substan- cialmente as características básicas e inovadoras da reivindicação. Qualquer um dos termos anteriormente mencionados de "que compre- ende", "que inclui" e "que tem", quando usado aqui no contexto de um aspecto ou modalidade da invenção, pode ser substituído pelo termo "que consiste em" ou "que consiste essencialmente em" para variar os escopos da descrição.
[0068] Para uso na presente invenção, o termo "TLR9" ou "receptor tipo Toll 9", também conhecido como CD289, UNQ5798 ou PRO19605, se refere a um TLR detector de nucleotídeo que é ativado por dinucleo- tídeos de citosina-fosfato-guanina (CpG) não metilados. Exemplos de
TLR9 incluem, mas não se limitam a, um TLR9 humano que é uma pro- teína com 1032 aminoácidos de comprimento codificada por um trans- crito de MRNA com 3922 nucleotídeos de comprimento (NM 017442.3). A sequência de aminoácidos do TLR9 humano exemplificado está re- presentada com o nº de acesso GenBank NP 059138.1. Como usado aqui, o termo "TLR9" inclui homólogos de TLR9 de espécies diferentes da humana, como Macaca Fascicularis (macaco cynomolgus) ou Pan troglodytes (chimpanzé). Como usado aqui, o termo "TLR9" inclui prote- Ínas que compreendem mutações, por exemplo, mutações pontuais, fragmentos, inserções, deleções e variantes de splice (juncionais) de TLR9 tipo selvagem de comprimento total. O termo "TLR9" também abrange modificações pós-traducionais da sequência de aminoácidos de TLR9.
[0069] Para uso aqui, o termo "agonista" se refere a uma molécula que se liga a um ou mais TLRs e induz uma resposta mediada por re- ceptor. Por exemplo, um agonista pode induzir, estimular, aumentar, ati- var, facilitar, acentuar ou regular positivamente a atividade do receptor. Tais atividades são chamadas de "atividades agonísticas". Por exemplo, um agonista de TLR9 pode ativar ou aumentar a sinalização celular atra- vés do receptor ligado. Os agonistas incluem, mas não se limitam a áci- dos nucleicos, moléculas pequenas, proteínas, carboidratos, lipídios ou quaisquer outras moléculas que se ligam ou interagem com receptores. Os agonistas podem imitar a atividade de um ligante de receptor natural. Os agonistas podem ser homólogos a esses ligantes de receptores na- turais em termos de sequência, conformação, carga ou outras caracte- rísticas, de modo que eles possam ser reconhecidos pelos receptores. Esse reconhecimento pode resultar em alterações fisiológicas e/ou bio- químicas no interior da célula, de modo que a célula reage à presença do agonista da mesma maneira como se o ligante de receptor natural estivesse presente. Para uso na presente invenção, o termo "agonista de TLR9" se refere a qualquer composto que atua como um agonista de TLRO9.
[0070] Para uso na presente invenção, os termos "induzir" e "esti- mular" e suas variações se referem a qualquer aumento mensurável na atividade celular. A indução de uma atividade celular mediada por TLR9 pode incluir, por exemplo, a ativação, proliferação ou maturação de uma população de células do sistema imune, aumentando a produção de uma citocina e/ou de um outro indicador de função imune aumentada. Em certas modalidades, a indução de uma resposta imunológica pode incluir o aumento da proliferação de células B, a produção de anticorpos específicos para antígeno, aumento da proliferação de células T espe- cíficas para antígeno, melhora da apresentação de antígenos por célu- las dendríticas e/ou um aumento na expressão de certas citocinas, qui- miocinas e marcadores coestimuladores.
[0071] Como usado aqui, uma "porção lipídica" se refere a uma por- ção que contém uma estrutura lipofílica. Porções lipídicas, como um grupo alquila, um ácido graxo, um triglicerídeo, diglicerídeo, esteroide, esfingolipídeo, glicolipídeo ou um fosfolipídeo. Por exemplo, uma por- ção lipídica pode incluir um esterol como colesterol, um anel de croma- nol metilado com uma cadeia lateral hidrofóbica metilada como tocofe- rol, ou um ácido graxo saturado como ácido palmítico ou um éster do mesmo. As porções lipídicas, quando fixadas a moléculas altamente hi- drofílicas, como ácidos nucleicos, podem aumentar substancialmente a ligação a proteínas plasmáticas e, consequentemente, a meia-vida cir- culatória das moléculas hidrofílicas. Além disso, foi demonstrado que a ligação a certas proteínas plasmáticas, como lipoproteínas, aumenta a absorção em tecidos específicos que expressam os receptores para |li- poproteína correspondentes (por exemplo, receptor-LDL receptor-HDL ou o receptor sequestrante SR-B1). Consulte, por exemplo, Bijster- bosch, M. K,, et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28 (2717-25) Wolfrum, C.,
et al. (2007) Nat Biotechnol 25:1149—57 25.
[0072] Uma porção lipídica também pode ser usada em combinação com uma porção de direcionamento para melhorar o tráfego intracelular da abordagem de aplicação direcionada. A porção de direcionamento pode ser qualquer porção ou ligante adequado direta ou indiretamente fixado a um CpG ODN da presente invenção que pode direcionar o construto de ODN para alvos in vivo como macromoléculas (por exem- plo, receptores), células (por exemplo, macrófagos, células dendríticas, hepatócitos, células de tumor) ou seus componentes. Consequente- mente, uma porção de direcionamento pode incluir quaisquer moléculas de ocorrência natural ou sintéticas adequadas como lipídios, derivados de ácido de lipídio, galactose, N-acetilgalactosamina (GalNAc), fucose, manose, ácido siálico, ácido N-acetil neuramínico, anticorpos, liposso- mas, micelas, dendrímeros, nanoesferas, nanocápsulas, peptídeos, proteínas, albumina e hormônios.
[0073] Como usado aqui, o termo "ligante" se refere a uma porção química que une um nucleotídeo, como o nucleotídeo 5' ou 3' terminal de um CpG ODN, a uma porção lipídica ou a uma porção de direciona- mento. O termo "ligante clivável" se refere a um ligante ou porção do mesmo que é submetido a clivagem para remover a porção lipídica ou a porção de direcionamento do nucleotídeo quando desejado sob certas condições sem alterar o nucleotídeo ou a molécula de ácido nucleico ao qual ele está fixado. Dependendo da natureza da ligação, a clivagem pode ser executada in vitro ou in vivo, por exemplo, por tratamento com ácido ou base (por exemplo, de hidrazona), por clivagem enzimática (por exemplo, por nucleases ou proteases), por oxidação ou redução da ligação (por exemplo, de pontes de dissulfeto), por tratamento por luz (por exemplo, por fotobranqueamento). De acordo com modalidades es- pecíficas, o ligante compreende qualquer ligante clivável flexível. Os |li-
gantes incluem mas não se limitam a, por exemplo, uma ligação cova- lente, uma alquila substituída ou não substituída, uma heteroalquila substituída ou não substituída como polietileno glicol (PEG), um, dois, ou três grupos abásicos e/ou ribitol, porções etileno glicol, ou um peptí- deo. De acordo com modalidades da presente invenção, o ligante está covalentemente ligado ao CpG ODN através de uma ligação clivável, como uma ligação fosfodiéster (po), ligação fosforamidato (np) ou liga- ção fosforotioato (ps), de preferência por meio de uma ligação éster ou amida, com a máxima preferência, uma ligação po. De acordo com mo- dalidades da presente invenção, o ligante compreende etileno glicol tendo a fórmula ((CH2)2O)o, em que o é de 1 a 15, covalentemente ligado ao CpG ODN por meio de uma ligação po, np ou ps.
[0074] Em uma modalidade, a ligação clivável como uma ligação po é clivável por uma enzima fosfodiesterase, como, por exemplo, uma fos- fodiesterase de nucleotídeo cíclico, fosfolipases C, fosfolipases D, auto- taxina, esfingomielina fosfodiesterase, DNase, RNase, ou uma endonu- clease de restrição.
[0075] De acordo com modalidades da presente invenção, um li- gante compreende ((CH2) 2Om, em que m é um número inteiro de 1 a 15, como 1, 2, 3, 4,5,6,7,8,9,10, 11, 12,13, 14 ou 15. De acordo com modalidades específicas, o ligante compreende uma ou mais porções hexaetileno glicol tendo a seguinte fórmula molecular: ((CH2)2O)s.
[0076] Em uma modalidade, o ligante compreende uma ou mais porções HEG ligadas por um ou mais ligações fosfodiéster (po) ou fos- forotioato (ps). Em uma modalidade, o ligante compreende uma porção HEG ligada ao CpG ODN por meio de uma ligação po. Em uma moda- lidade, o ligante compreende duas porções HEG unidas por uma ligação po e ao CpG ODN por meio de uma ligação po.
[0077] De acordo com outras modalidades, o ligante compreende um grupo dissulfeto clivável. De acordo com outras modalidades, o li- gante compreende um peptídeo clivável por protease, como, por exem- plo, um ligante de peptídeo que compreende um sítio de clivagem para uma protease específica para um microambiente do tumor, como uPA, legumaína, matriptase, ou catepsina.
[0078] De acordo com modalidades da invenção, uma porção lipí- dica (M), como um colesterol, tocoferol, um grupo palmitoíla, ou um grupo estearila, pode ser covalentemente ligada ao CpG ODN através de um ligante. O ligante pode compreender uma ou mais porções ligan- tes como um etileno glicol tendo a fórmula ((CH2)-O)m onde mé de 1a
15. Em modalidades, m é 6 e a porção ligante é um hexaetileno glicol (HEG).
[0079] De acordo com modalidades da invenção, uma porção lipí- dica (M), como colesterol, tocoferol, um grupo palmitoíla, ou um grupo estearila, pode ser covalentemente ligada a um porção HEG direta- mente por meio de uma união, ou indiretamente por meio de um se- gundo ligante, como um ligante que compreende etileno glicol tendo a fórmula ((CH2)2O0), em que o é de 1 a 15. O segundo ligante pode ser covalentemente ligado ao HEG através de uma união, uma ligação fos- fodiéster (po), ligação fosforamidato (np) ou uma ligação fosforotioato (ps).
[0080] Cada porção ligante pode ser independentemente ligada às outras porções ligantes através de uma ligação, como uma ligação se- lecionada do grupo que consiste em ligação fosfodiéster (po), ligação fosforamidato (np) ou uma ligação fosforotioato (ps). O ligante pode ser adicionalmente unido ao CpG ODN através de uma ligação clivável como uma ligação clivável selecionada do grupo que consiste em uma ligação fosfodiéster (po), ligação fosforamidato (np) e uma ligação fos- forotioato (ps). Em modalidades, o ligante compreende uma porção |i- gante entre a porção lipídica e o CpG ODN. Em modalidades, o ligante compreende duas porções ligantes entre a porção lipídica e o CpG ODN. Em modalidades, cada porção ligante é unida a pelo menos uma outra porção ligante através de uma ligação po. Em modalidades, cada porção ligante é unida a pelo menos uma outra porção ligante através de uma ligação ps. Em modalidades, cada porção ligante é unida a pelo menos uma outra porção ligante através de uma ligação np. Em moda- lidades, a porção ligante é ligada covalentemente à porção lipídica, por meio de um segundo ligante, como um ligante que compreende etileno glicol tendo a fórmula ((CH2)2O), em que o é de 1 a 15, e o segundo ligante é covalentemente ligado à porção lipídica por meio de uma união, uma ligação fosfodiéster (po), ligação fosforamidato (np) ou uma ligação fosforotioato (ps). Em modalidades, o ligante compreende duas porções ligantes unidas por uma ligação po entre a porção lipídica e o CpG ODN. Em modalidades, o ligante compreende duas porções ligan- tes unidas por uma ligação ps entre a porção lipídica e o CpG ODN. Em modalidades, o ligante compreende duas porções ligantes unidas por uma ligação np entre a porção lipídica e o CpG ODN.
[0081] A porção lipídica (M) pode ser unida ao ligante através de uma união ou ligação como uma ligação selecionada do grupo que con- siste em ligação fosfodiéster (po), ligação fosforamidato (np) ou uma ligação fosforotioato (ps) Como usado aqui, "M-po(HEG)" ou "(HEG)po-M" significa que a porção de lipídio M é ligada covalente- mente à porção HEG diretamente por meio de uma ligação fosfodiéster (po), ou indiretamente por meio de um segundo ligante, como um ligante compreendendo etileno glicol que tem a fórmula ((CH2)2O)o, em que o é de 1 a 15, e o segundo ligante é covalentemente ligado à porção HEG através de uma ligação fosfodiéster (po). Por exemplo, para uso na pre- sente invenção, "Toco—ps(HEG)" pode se referir a um grupo tocoferol ligado covalentemente a CpG ODN por meio de um segundo conector, como etileno glicol tendo a fórmula ((CH2)2O)o, em que o é 1-15, que é ligado covalentemente a uma ligação fosfodiéster (po).
[0082] Como usado aqui, "M-ps(HEG)" ou "(HEG)ps—M" significa que a porção lipídica M é ligada covalentemente à porção HEG direta- mente por meio de uma ligação fosforotioato (ps), ou indiretamente por meio de um segundo ligante, como um ligante que compreende etileno glicol tendo a fórmula ((CH2)2O), em que o é de 1 a 15, e o segundo ligante é covalentemente ligado à porção HEG por meio de uma ligação fosforotioato (ps). Por exemplo, como usado aqui, "Toco-ps(HEG)" pode se referir a um grupo tocoferol ligado covalentemente a CpG ODN por meio de um segundo ligante, como etileno glicol tendo a fórmula ((CH2)2O)o, em que o é de 1 a 15, que é covalentemente ligado a uma porção HEG por meio de uma ligação fosforotioato (ps).
[0083] Como usado aqui, o termo "CpG" ou "motivo CpG" se refere a uma sequência de dinucleotídeo que contém citosina-guanina não me- tilada (isto é, uma citosina (C) seguida de uma guanina (G), isto é, 5'- CG-3') ligada por uma ligação fosfato ou cadeia principal contendo fós- foro, como uma ligação fosfodiéster (po).
[0084] Como usado aqui, "oligonucleotídeo", "oligodesoxinucleotí- deo" ou "ODN" se refere a um polinucleotídeo formado a partir de uma pluralidade de unidades de nucleotídeo ligadas. Tais oligonucleotídeos podem ser obtidos a partir de fontes de ácido nucleico existentes ou podem ser produzidos por métodos sintéticos. Em algumas modalida- des, os oligonucleotídeos têm, cada um, de cerca de 5 a cerca de 30 resíduos de nucleotídeo, de preferência de cerca de 10 a cerca de 25 resíduos de nucleotídeo, com mais preferência, de cerca de 19 a cerca de 24 resíduos de nucleotídeo. Em uma modalidade, o ODN contém 19 resíduos de nucleotídeo. Em uma modalidade, o ODN contém 20 resí- duos de nucleotídeo. Em uma modalidade, o ODN contém 21 resíduos de nucleotídeo. Em uma modalidade, o ODN contém 22 resíduos de nucleotídeo. Em uma modalidade, o ODN contém 23 resíduos de nucle- otídeo. Em uma modalidade, o ODN contém 24 resíduos de nucleotídeo. Os ODNs da presente descrição podem ser obtidos a partir de fontes de ácido nucleico existentes (por exemplo, genômico ou DNA) mas são, de preferência, sintéticos (por exemplo produzidos por síntese de oligonu- cleotídeos).
[0085] Como usado aqui, "nucleotídeo" inclui quaisquer nucleotí- deos nativos ou de ocorrência natural, que incluem uma base nitroge- nosa selecionada do grupo que consiste em adenina (A), timidina (T), citosina (C), guanina (G) e uracila (U), um açúcar desoxirribose, e um grupo fosfato. Os nucleotídeos exemplificadores incluem, mas não se limitam a, bases de nucleotídeos de ocorrência natural, por exemplo, adenina, guanina, citosina, uracila e timina.
[0086] Como usados aqui, os termos "oligonucleotídeo CpG", "oli- godesoxinucleotídeo CpG" e "CpG ODN'" são usados de forma inter- cambiável e se referem a um oligonucleotídeo que compreende pelo menos um motivo CpG. Os CpG ODNs da presente invenção podem incluir uma ou mais classes de CpG ODNs, como um ODN da classe A, classe B, classe C ou classe P, conforme descrito em Bode et al., 2011, Expert Rev Vaccines, 10(4): 499-511. Os CpG ODNs da Classe A, tam- bém chamados de tipo D, contêm um motivo palindrômico contendo CpG e motivos poli-G nas extremidades 5' e/ou 3. Os CpG ODNs da classe G, também chamados de tipo K, são tipicamente totalmente es- tabilizados por uma cadeia principal de fosforotioato completa e incluem um ou mais dinucleotídeos CpG dentro de certos contextos base prefe- renciais. Os CpG ODNs da classe C são tipicamente totalmente estabi- lizados por uma cadeia principal de fosforotioato completa e incluem um motivo CpG palindrômico central, bem como outros dinucleotídeos CpG. Os CpG ODNs da classe P são tipicamente totalmente estabilizados por uma cadeia principal de fosforotioato completa e incluem dois palíndro- mos e múltiplos dinucleotídeos CpG.
[0087] Como usado aqui, o termo "ligação internucleotídica" se re- fere a uma ligação química para unir dois nucleotídeos adjacentes atra- vés de seus açúcares que consiste em um átomo de fósforo e um grupo carregado ou neutro entre nucleosídeos adjacentes. Exemplos de liga- ções internucleotídicas incluem fosfodiéster (po), fosforotioato (ps), fos- foramidato (np), fosforoditioato (ps2), metilfosfonato (mp), e metilfosfo- rotioato (rp). Fosforotioato, fosforamidato, fosforoditioato, metilfosfonato e metilfosforotioato são ligações internucleotídicas estabilizantes, en- quanto o fosfodiéster é uma ligação internucleotídica de ocorrência na- tural.
[0088] Os fosforotioatos de oligonucleotídeos são sintetizados tipi- camente como uma mistura racêmica aleatória de ligações fosforotioato Rp e Sp. Entretanto, de acordo com modalidades específicas, as liga- ções fosforotioato dos construtos ODN revelados contêm uma mistura de ligações fosforotioato Rp e Sp. De acordo com modalidades especí- ficas, o CpoG ODN do construto de ODN tem uma ligação ps internucle- otídica estereodefinida, isto é, a ligação ps é Rp ou Sp em pelo menos 75%, como de pelo menos 80%, ou pelo menos 85%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos 95% como pelo menos 99%, das moléculas de oligonucleotídeo presentes no CpG ODN.
[0089] De acordo com modalidades específicas, de um a quatro, de preferência, três ou quatro, dos dinucleotídeos CpG no CpG ODN têm, cada um, uma ligação internucleotídica fosfodiéster (po), e cada uma dentre as ligações internucleotídicas restantes do CpG ODN são liga- ções internucleotídicas fosforotioato. Em modalidades, cada um dos di- nucleotídeos CpG no CpG ODN tem uma ligação internucleotídica fos- fodiéster (po), e cada um dos nucleotídeos restantes no CpG ODN tem uma ligação internucleotídica fosforotioato (ps).
[0090] Como usado na presente invenção, o termo "veículo" se re- fere a qualquer excipiente, diluente, carga, sal, tampão, estabilizador, solubilizador, óleo, lipídio, vesícula contendo lipídio, microesfera, encap- sulação em lipossomas ou outro material bem conhecido na técnica para uso em formulações farmacêuticas. Deve-se compreender que as características do veículo, excipiente ou diluente dependerão da via de administração para uma aplicação particular. Como usado aqui, o termo "veículo farmaceuticamente aceitável" se refere a um material atóxico que não interfere com a eficácia de uma composição, de acordo com a presente modalidade, ou com a atividade biológica de uma composição de acordo com a presente invenção. De acordo com modalidades espe- cíficas, em vista da presente invenção, qualquer veículo farmaceutica- mente aceitável adequado ao uso em uma composição farmacêutica agonista baseada CpG ODN pode ser usado na presente invenção.
[0091] Como usado aqui, o termo "indivíduo" se refere a um animal. De acordo com modalidades particulares, o indivíduo é um mamífero que inclui um não primata (por exemplo, um camelo, jumento, zebra, vaca, porco, cavalo, cabra, ovelha, gato, cachorro, rato, coelho, porqui- nho-da-índia ou camundongo) ou um primata (por exemplo, um macaco, chimpanzé ou ser humano). Em modalidades particulares, o indivíduo é um ser humano.
[0092] Como usado na presente invenção, o termo "quantidade te- rapeuticamente eficaz" se refere a uma quantidade de um ingrediente ou componente ativo que induz a resposta biológica ou medicinal dese- jada em um indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz pode ser determinada empiricamente e de maneira rotineira, em relação à finalidade declarada. Por exemplo, testes in vitro podem, opcional- mente, ser usados para ajudar a identificar faixas de dosagem ótimas. A seleção de uma determinada dose eficaz específica pode ser deter- minada (por exemplo, através de ensaios clínicos) pelos versados na técnica com base na consideração de vários fatores, incluindo a doença a ser tratada ou evitada, os sintomas envolvidos, a massa corpórea do paciente, o estado imune do paciente e outros fatores conhecidos pelo versado na técnica. A dose precisa a ser empregada na formulação tam- bém irá depender da via de administração e da gravidade da doença, e deve ser decidida de acordo com o julgamento do profissional e as cir- cunstâncias de cada paciente. As dosagens eficazes podem ser extra- poladas de curvas de resposta à dosagem, derivadas dos sistemas de teste de modelo animal ou in vitro.
[0093] Como usado aqui, os termos "tratar", "tratando" e "trata- mento" são destinados a se referir a uma melhora ou reversão de ao menos um parâmetro físico mensurável relacionado a uma doença na qual a modulação da atividade de TLR9 seria benéfica, como uma do- ença, distúrbio ou condição imunológica, que não é necessariamente discernível no indivíduo, mas que pode ser discernível no indivíduo. Os termos "tratar", "tratando" e "tratamento" também podem se referir a causar a regressão, evitar a progressão ou, pelo menos, diminuir a pro- gressão da doença, distúrbio ou condição. Em uma modalidade especí- fica, "tratar", "tratando" e "tratamento" se referem a um alívio, prevenção do desenvolvimento ou início, ou redução na duração de um ou mais sintomas associados à doença para a qual a modulação da atividade de TLRO9 seria benéfica, como uma doença, distúrbio ou condição imunoló- gica, incluindo uma infecção viral ou um câncer. Em uma modalidade particular, "tratar", "tratando" e "tratamento" referem-se à prevenção da recorrência da doença, distúrbio ou condição. Em uma modalidade par- ticular, "tratar", "tratando" e "tratamento" referem-se a um aumento na sobrevida de um indivíduo que tem a doença, distúrbio ou condição. Em uma modalidade particular, "tratar", "tratando" e "tratamento" referem- se à eliminação da doença, distúrbio ou condição no indivíduo.
[0094] Como usado aqui, uma "doença para a qual a modulação da atividade de TLRO9 seria benéfica" inclui doenças para as quais a esti- mulação da sinalização de TLR9 iria beneficiar o indivíduo. Por exemplo, uma doença para a qual a modulação da atividade de TLR9 seria bené- fica pode incluir doenças, distúrbios ou condições imunológicas. De acordo com modalidades específicas, a doença, distúrbio ou condição a ser tratada é um câncer, uma doença, distúrbio ou condição inflama- tória, uma doença, distúrbio ou condição autoimune, ou uma doença, distúrbio ou condição causada por um patógeno, como uma infecção viral.
[0095] De acordo com modalidades específicas, a infecção viral é um vírus RNA ou DNA como adenovírus, citomegalovírus, vírus da he- patite A (HAV), hepadnavírus incluindo HBV, HBV crônica, flavivírus in- cluindo vírus da febre amarela, hepacivírus incluindo o vírus da hepatite C (HCV), herpes simplex tipos 1 e 2, herpes zóster, herpes vírus hu- mano tipo 6, vírus da imunodeficiência humana (HIV), vírus do papiloma humano (HPV), vírus da influenza A, vírus da influenza B, sarampo, vií- rus de parainfluenza, pestivírus, poliovírus, poxvírus, rinovírus, corona- vírus, vírus sincicial respiratório (RSV), múltiplas famílias de vírus que causam febre hemorrágica, incluindo os Arenavírus, os Bunyavírus e Filovírus, e uma gama de encefalites virais causadas por vírus RNA e DNA.
[0096] De acordo com modalidades específicas, o câncer ou tumor é um tumor sólido ou câncer do sangue. De acordo com modalidades específicas, o câncer ou tumor é um carcinoma, sarcoma, melanoma, linfoma ou leucemia. De acordo com modalidades específicas, o câncer ou tumor é um carcinoma, sarcoma, leucemia ou um câncer causado por um vírus. De acordo com modalidades específicas, o câncer é um carcinoma mamário, de cólon, bexiga, pulmão, próstata, estômago ou pâncreas ou uma leucemia linfoblástica ou mieloide.
[0097] Como usado uso na presente invenção, o termo "em combi- nação", no contexto da administração de duas ou mais terapias a um indivíduo, se refere ao uso de mais de uma terapia. O uso do termo "em combinação" não restringe a ordem na qual as terapias são administra- das a um indivíduo ou o intervalo entre tais administrações. Por exem- plo, uma primeira terapia (por exemplo, uma composição aqui descrita) pode ser administrada antes de (por exemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 16 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas ou 12 sema- nas antes), concomitantemente com, ou posteriormente a (por exemplo, minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 16 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas ou 12 semanas depois) da administração de uma segunda te- rapia a um indivíduo. Construtos de ODN
[0098] Em uma modalidade, o construto de CpG ODN tem uma Fór- mula: Fórmula |: 8 M—-L+H[CpG ODN]-L2-M> 3', em que: cada um dentre M, e M> representa, independentemente, uma porção lipídica, de preferência, a porção lipídica compreende pelo menos uma porção lipídica selecionada do grupo que consiste em co- lesterol, tocoferol, um grupo palmitoíla, e um grupo estearila, opcional- mente um dentre M: e M> está ausente; cada um dentre L, e L2 representa, independentemente, um ligante, de preferência o ligante compreende pelo menos 10 átomos se- lecionados do grupo que consiste em carbono, nitrogênio, oxigênio, hi- drogênio, enxofre e fósforo, e L é ligado covalentemente ao CpG ODN através de uma ligação clivável, de preferência, por meio de uma ligação éster ou amida, opcionalmente um dentre L, e L> está ausente quando o respectivo M; ou M> está ausente; e de preferência, o CpG ODN compreende pelo menos um mo- tivo CpG que tem uma ligação internucleotídica fosfodiéster (po).
[0099] Em uma modalidade, a presente invenção se refere a um construto de CpG ODN tendo uma Fórmula: Fórmula (Ila): ' M-L-[CpG ODN] 3', ou Fórmula (1Ib): 5 [CpG ODN]-L-M 3' em que: M representa uma porção lipídica, de preferência, a porção lipídica compreende pelo menos um selecionado do grupo que consiste em colesterol, tocoferol, um grupo palmitoíla, e um grupo estearila; L representa um ligante que compreende pelo menos 10 áto- mos selecionados do grupo que consiste em carbono, nitrogênio, oxigê- nio, hidrogênio, enxofre e fósforo, e L é ligado covalentemente ao CpG ODN através de uma ligação clivável, de preferência, por meio de uma ligação éster ou amida; e o CpG ODN compreende pelo menos um motivo CpG tendo uma ligação internucleotídica po (fosfodiéster), que compreende, de preferência, pelo menos dois, três ou quatro motivos CpG, tendo cada um a ligação internucleotídica po.
[0100] De acordo com aspectos específicos, o ligante L compre- ende de 5 a 100 átomos, com mais preferência de 20 a 80 átomos, de 20 a 40 átomos, ou de 30 a 60 átomos de comprimento, selecionado do grupo que consiste em carbono, nitrogênio, oxigênio, hidrogênio, enxo- fre e fósforo. De acordo com aspectos específicos, o ligante compre- ende uma ligação fosfodiéster (po) ou fosforotioato (ps), e compreende ((CH2)2O)m, em que m é um número inteiro de 1 a 15, de preferência de a 10, com mais preferência 6.
[0101] Em uma modalidade, o ligante L na Fórmula (lla) ou (Ilb) compreende —((CH2)2O)m—X)n-, em que m é um número inteiro de 1 a 15, como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15, X é indepen- dentemente uma ligação fosfodiéster (po) ou fosforotioato (ps), e n é um número inteiro de 1 a 5, como 1, 2, 3,4, ou 5.
[0102] Em uma outra modalidade, o ligante L na Fórmula (lla) ou (Ilb) está ligado à porção lipídica M através de uma ligação fosfodiéster (po) ou uma ligação fosforotioato (ps).
[0103] Em ainda outra modalidade, o ligante L na Fórmula (lla) ou (Ilb) está ligada ao CpG ODN por meio de uma ligação fosfodiéster (po) ou uma ligação fosforamidato, de preferência, uma ligação po.
[0104] Em uma modalidade, L é -Y1-(((CH2)2O)n—X)n—Y2—; ou L é — Y(((CH2)2O)mX)nY1-, em que: Y1 é uma ligação ou um ligante, de preferência etileno glicol tendo a fórmula ((CH2)2O)o, em que o é de 1 a 15, covalentemente ligado a (((CH2)2O)m—X)n por meio de uma ligação fosfodiéster (po), uma liga- ção fosforotioato (ps) ou uma união; Y2 é uma ligação clivável que compreende uma ligação éster ou amida; cada X é independentemente uma união, uma ligação po ou uma ligação ps; m é um número inteiro de 1a 15; e n é um número inteiro de 1 a 5.
[0105] Em modalidades, Y2 é uma ligação po ou uma ligação np.
[0106] Em um outro aspecto, a presente invenção se refere a um construto de ODN tendo uma estrutura de: Fórmula (Illa): 5 M—YH((CH2)2O)m—X)n—Y2-[CpG ODN]—Y3-M2 3', ou Fórmula (Illb): 5' M2—Y3-[CpG ODN]-Y2H(((CH2)2O)nWX)a—"Y1-M: 3' em que:
M; representa uma porção lipídica, de preferência, a porção lipídica compreende pelo menos um selecionado do grupo que consiste em colesterol, tocoferol, um grupo palmitoíla, e um grupo estearila, M,> representa uma porção lipídica, uma porção de direcio- namento, ou está ausente, Y1 é uma ligação ou um ligante, de preferência, etileno glicol que tem a Fórmula ((CH2)2O)., em que o é de 1 a 15, covalentemente ligado a (((CH2), O)m—X)n por meio de uma ligação fosfodiéster (po), uma ligação fosforotioato (ps) ou uma união, X é independentemente uma união, uma ligação po ou uma ligação ps, cada um dentre Y> e Y;3 é independentemente uma ligação clivável, de preferência, compreende uma ligação éster ou amida, com mais preferência, compreende uma ligação po ou uma ligação fosfora- midato, com a máxima preferência, uma ligação po, desde que quando M, estiver ausente, Y;3 esteja ausente, o CpG ODN compreende pelo menos um motivo CpG tendo uma ligação internucleotídica po (fosfodiéster), compreende, de prefe- rência, pelo menos dois, três ou quatro motivos CpG, tendo cada um uma ligação internucleotídica po; m é um número inteiro de 1a 15,e n é um número inteiro de 1 a 5.
[0107] Em uma modalidade, a presente invenção se refere a um construto de CpG ODN tendo uma Fórmula: Fórmula (IVa): 5' M-Y-(((CH2)2O)mWX)—Y2-[CpG ODN] 3', ou Fórmula (IVb): 5' [CpG ODN]I-Y2—(((CH2)2O)m—=X)n— Y1-M 3º em que: M representa uma porção lipídica, de preferência, a porção lipídica compreende pelo menos um selecionado do grupo que consiste em colesterol, tocoferol, um grupo palmitoíla, e um grupo estearila,
Y1 é uma ligação ou um ligante, de preferência de 1 a 5 por- ções etileno glicol, covalentemente ligadas a (((CH2)=O)m—X)n por meio de uma ligação ou fosfodiéster (po), uma ligação fosforotioato (ps) ou uma união, X é independentemente uma união, uma ligação fosfodiéster (po) ou uma ligação fosforotioato (ps), Y2 é uma ligação clivável, de preferência, compreende uma ligação éster ou amida, com mais preferência, compreende uma ligação po ou uma ligação fosforamidato, com a máxima preferência, uma liga- ção po; CpG ODN compreende pelo menos um motivo CpG tendo uma ligação internucleotídica po (fosfodiéster), compreende, de prefe- rência, pelo menos dois, três ou quatro motivos CpG, tendo cada um a ligação internucleotídica po; m é um número inteiro de 1 a 15, de preferência, 6; e n é um número inteiro de 1 a 5, de preferência, 2; opcionalmente, o construto de CpG ODN da Fórmula (IVa) ou (IVb) é adicionalmente covalentemente conjugado a uma porção de direcionamento, que é, de preferência, selecionada do grupo que con- siste em galactose, N-acetilgalactosamina (GalNAc), fucose, manose, ácido siálico e ácido N-acetil neuramínico.
[0108] De acordo com uma modalidade específica, X é independen- temente uma ligação fosfodiéster (po) ou está ausente, Y é uma ligação po, m é 6, n é 2, M representa uma porção lipídica que compreende um grupo tocoferol ou um grupo palmitoíla.
[0109] De acordo com uma modalidade específica, o construto de ODN tem uma estrutura selecionada do grupo que consiste em: 5º M-po(HEG)po(HEG)poHCpG ODN] 3'; 5' M-ps(HEG)po(HEG)po[CpG ODN] 3', 5' M-ps(HEG)ps(HEG)po—[CpG ODN] 3',
5' M-po(HEG)ps(HEG)po-[CpG ODN] 3', 5' [CpG ODN]-po(HEG)po(HEG)po-M 3', 5' [CpG ODN]—-po(HEG)ps(HEG)po-M 3", 5' [CpG ODN]—-po(HEG)ps(HEG)ps-M 3', e 5' [CpG ODN]-po(HEG)po(HEG)ps—M 3', em que: M representa uma porção lipídica que compreende ao me- nos um selecionado do grupo que consiste em colesterol, tocoferol, um grupo palmitoíla, e um grupo estearila; po representa uma ligação fosfodiéster; HEG representa ((CH2)2O)s; ps representa uma ligação fosforotioato; e o CpG ODN compreende pelo menos um motivo CpG tendo uma ligação internucleotídica po (fosfodiéster), compreende, de prefe- rência, pelo menos dois, três ou quatro motivos CpG, tendo cada um a ligação internucleotídica po, em que M é ligado covalentemente a (HEG) diretamente por meio de uma ligação po ou ps, ou indiretamente por meio de um se- gundo ligante que é ligado a (HEG) diretamente por meio de uma liga- ção po ou ps.
[0110] De acordo com uma modalidade específica, o construto de ODN tem uma estrutura selecionada do grupo que consiste em: 5' Toco-po(HEG)po(HEG)po-[CpG ODN] 3', em que Toco representa tocoferol, 5' Chol-po(HEG)po(HEG)po—n[CpG ODN] 3', em que Cho! re- presenta colesterol, 5' Palm—po(HEG)po(HEG)po-[CpG ODN] 3', em que Palm representa um grupo palmitoíla, 5' [CpG ODN]-po(HEG)ps-Chol 3', em que Chol representa colesterol,
5' [CpG ODN]-po(HEG)ps—Toco 3', em que Toco representa tocoferol, e 5' [CpG ODN]-po(HEG)ps-Palm 3', em que Palm representa um grupo palmitoíla, em que: po representa uma ligação fosfodiéster; HEG representa ((CH2)2O)s; ps representa uma ligação fosforotioato; e o CpG ODN compreende pelo menos um motivo CpG tendo uma ligação internucleotídica po (fosfodiéster), compreende, de prefe- rência, pelo menos dois, três ou quatro motivos CpG, tendo cada um a ligação internucleotídica po, em que o tocoferol, o colesterol, ou o grupo palmitoíla é |i- gado covalentemente ao (HEG) diretamente por meio de uma ligação po ou ps, ou indiretamente por meio de um segundo ligante que é ligado a (HEG) diretamente por meio de uma ligação po ou ps.
[0111] Em uma modalidade, o CpG ODN contém um número de di- nucleotídeos CpG adequado para ativar o TLR9. Em uma modalidade, o CpG ODN contém pelo menos um dinucleotídeo CpG. Em uma mo- dalidade, o CpG ODN contém pelo menos dois dinucleotídeos CpG. Em uma modalidade, o CpG ODN contém pelo menos três dinucleotídeos CpG. Em uma modalidade, o CpG ODN contém pelo menos quatro di- nucleotídeos CpG. Em uma modalidade, o CpG ODN contém um dinu- cleotídeo CpG. Em uma modalidade, o CpG ODN contém dois dinucle- otídeos CpG. Em uma modalidade, o CpG ODN contém três dinucleotí- deos CpG. Em uma modalidade, o CpG ODN contém quatro dinucleotí- deos CpG.
[0112] Em uma modalidade, os dinucleotídeos CpG do CpG ODN são posicionados dentro do CpG ODN para ativar o TLR9. Em uma mo- dalidade, um primeiro dinucleotídeo CpG do CpG ODN está separado de um segundo dinucleotídeo CpG por pelo menos um nucleotídeo. Em uma modalidade, um primeiro dinucleotídeo CpG do CpG ODN está se- parado de um segundo dinucleotídeo CpG por pelo menos dois nucleo- tídeos. Em uma modalidade, um primeiro dinucleotídeo CpG do CpG ODN está separado de um segundo dinucleotídeo CpG por pelo menos três nucleotídeos. Em uma modalidade, um primeiro dinucleotídeo CpG do CpG ODN está separado de um segundo dinucleotídeo CpG por pelo menos quatro nucleotídeos. Em uma modalidade, um primeiro dinucle- otídeo CpG do CpG ODN está separado de um segundo dinucleotídeo CpG por pelo menos cinco nucleotídeos. Em uma modalidade, um pri- meiro dinucleotídeo CpG do CpG ODN está separado de um segundo dinucleotídeo CpG por pelo menos seis nucleotídeos. Em uma modali- dade, um primeiro dinucleotídeo CpG do CpG ODN está separado de um segundo dinucleotídeo CpG por um nucleotídeo. Em uma modali- dade, um primeiro dinucleotídeo CpG do CpG ODN está separado de um segundo dinucleotídeo CpG por dois nucleotídeos. Em uma modali- dade, um primeiro dinucleotídeo CpG do CpG ODN está separado de um segundo dinucleotídeo CpG por três nucleotídeos. Em uma modali- dade, um primeiro dinucleotídeo CpG do CpG ODN está separado de um segundo dinucleotídeo CpG por quatro nucleotídeos. Em uma mo- dalidade, um primeiro dinucleotídeo CpG do CpG ODN está separado de um segundo dinucleotídeo CpG por cinco nucleotídeos. Em uma mo- dalidade, um primeiro dinucleotídeo CpG do CpG ODN está separado de um segundo dinucleotídeo CpG por seis nucleotídeos.
[0113] Em uma modalidade, um dinucleotídeo CpG está separado da extremidade 3' do CpG ODN por pelo menos um nucleotídeo. Em uma modalidade, um dinucleotídeo CpG está separado da extremidade 3' do CpG ODN por pelo menos dois nucleotídeos. Em uma modalidade, um dinucleotídeo CpG está separado da extremidade 3' do CpG ODN por pelo menos três nucleotídeos. Em uma modalidade, um dinucleotí- deo CpG está separado da extremidade 3' do CpG ODN por pelo menos quatro nucleotídeos. Em uma modalidade, um dinucleotídeo CpG está separado da extremidade 3' do CpG ODN por pelo menos cinco nucle- otídeos. Em uma modalidade, um dinucleotídeo CpG está separado da extremidade 3' do CpG ODN por um nucleotídeo. Em uma modalidade, um dinucleotídeo CpG está separado da extremidade 3' do CpoG ODN por dois nucleotídeos. Em uma modalidade, um dinucleotídeo CpG está separado da extremidade 3' do CpG ODN por três nucleotídeos. Em uma modalidade, um dinucleotídeo CpG está separado da extremidade 3' do CpG ODN por quatro nucleotídeos. Em uma modalidade, um dinu- cleotídeo CpG está separado da extremidade 3' do CpG ODN por cinco nucleotídeos.
[0114] Em uma modalidade, um dinucleotídeo CpG está separado da extremidade 5' do CpG ODN por pelo menos um nucleotídeo. Em uma modalidade, um dinucleotídeo CpG está separado da extremidade 5' do CpG ODN por pelo menos dois nucleotídeos. Em uma modalidade, um dinucleotídeo CpG está separado da extremidade 5' do CpG ODN por pelo menos três nucleotídeos. Em uma modalidade, um dinucleotí- deo CpG está separado da extremidade 5' do CpG ODN por pelo menos quatro nucleotídeos. Em uma modalidade, um dinucleotídeo CpG está separado da extremidade 5' do CpG ODN por pelo menos cinco nucle- otídeos. Em uma modalidade, um dinucleotídeo CpG está separado da extremidade 5' do CpG ODN por um nucleotídeo. Em uma modalidade, um dinucleotídeo CpG está separado da extremidade 5' do CpG ODN por dois nucleotídeos. Em uma modalidade, dinucleotídeo CpG está se- parado da extremidade 5' do CpG ODN por três nucleotídeos. Em uma modalidade, um dinucleotídeo CpG está separado da extremidade 5' do CpG ODN por quatro nucleotídeos. Em uma modalidade, um dinucleo-
tídeo CpG está separado da extremidade 5' do CpG ODN por cinco nu- cleotídeos.
[0115] De acordo com aspectos específicos, o CpOG ODN do cons- truto de ODN tem uma ligação internucleotídica fosforotioato (ps). De acordo com aspectos específicos, o CpDOG ODN do construto de ODN tem uma ligação internucleotídica fosforotioato (ps) estereodefinida. De acordo com aspectos específicos, de um a quatro, de preferência, três ou quatro, dos dinucleotídeos CpG no CpG ODN do construto de ODN têm, cada um, uma ligação internucleotídica fosfodiéster (po), e cada uma dentre as ligações internucleotídicas restantes do CpG ODN são ligações internucleotídicas fosforotioato. De acordo com outros aspec- tos específicos, duas das ligações internucleotídicas no CpG ODN têm, cada uma, uma ligação internucleotídica fosfodiéster (po), e cada uma dentre as ligações internucleotídicas restantes do CpG ODN são liga- ções fosforotioato. De acordo com outros aspectos específicos, três das ligações internucleotídicas no CpG ODN têm, cada uma, uma ligação internucleotídica fosfodiéster (po), e cada uma dentre as ligações inter- nucleotídicas restantes do CpG ODN restantes são ligações internucle- otídicas fosforotioato (ps). De acordo com outros aspectos específicos, quatro das ligações internucleotídicas no CpG ODN têm, cada uma, uma ligação internucleotídica fosfodiéster (po), e cada uma das ligações internucleotídicas restantes do CpG ODN são ligações fosforotioato (ps). De acordo ainda com outros aspectos específicos, cinco ou mais das ligações internucleotídicas no CpG ODN têm, cada uma, uma liga- ção internucleotídica fosfodiéster (po), e cada uma dentre as ligações internucleotídicas restantes do CpG ODN são ligações fosforotioato (ps).
[0116] De acordo com algumas modalidades, um construto de ODN da presente invenção compreende um agonista de TLR9 que compre- ende um CpG ODN que compreende, de preferência consiste em uma sequência de polinucleotídeos selecionada do grupo que consiste em: 5' TEGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 3' (SEQ ID NO: 1); 5' GGEGGGACGATCGTCGGGGGG 3' (SEQ ID NO: 2); 5' GGEGGTCAACGTTGAGGGGGG 3' (SEQ ID NO: 3); 5' TECATGACGTTCCTGACGTT 3' (SEQ ID NO: 4); 5' TEGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG 3' (SEQ ID NO: 5); 5' TEGTCGTTACGTAACGACGACGTT 3' (SEQ ID NO: 6); e 5' TEGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGT 3' (SEQ ID NO: 7)
[0117] De acordo com algumas modalidades, um construto de ODN da presente invenção compreende um agonista de TLR9 compreen- dendo um CpG ODN que compreende, de preferência consiste em uma sequência de polinucleotídeos que é, ou é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica, ou qualquer porcentagem entre tais valores, a uma das SEQ ID NOs: 1 a 7.
[0118] De acordo com aspectos específicos, um construto de ODN da presente invenção compreende um CpG ODN que compreende, de preferência consiste em uma sequência de polinucleotídeos selecio- nada do grupo que consiste em: (1) 8º TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 8); (2) 5º ToposCpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 9); (3) 5º TopsCpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 10); (4) 5º TosCpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 11); (5) 59º TpsCpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 12);
(6) 5º TosCpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 13);
(7) 5º TposCpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 14);
(8) 5 TosCpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsApsCpsGpsTpsApsAp- sCpsGpsApsCpsGpsApsCpsGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 15);
(9) 5 TosCpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsApsCpsGpsTpsApsAp- sCpsGpsApsCpsGpsApsCpsGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 16);
(10) 5º TpsCpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsApsCpoGpsTpsAp- sApsCpsGpsApsCpsGpsApsCpsGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 17);
(11) 5º TpsCpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsApsCpoGpsTpsAp- sApsCpoGpsApsCpsGpsApsCpsGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 18);
(12) 5º TpsCpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsApsCpoGpsTpsAp- sApsCpoGpsApsCpoGpsApsCpsGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 19);
(13) 58 GpsGpsGpsGpsGpsApsCpoGpsApsTpsCpoG- psTpsCpoGpsGpsGps GpsGpsG 3' (SEQ ID NO: 20);
(14) 5º" GpsGpsGpsGpsTpsCpsApsApsCpoGpsTpsTpsGp- sApsGpsGpsGpsGpsGpsG 3' (SEQ ID NO: 21);
(15) D TpsCpsCpsApsTpsGpsApsCpsG- psTpsTpsCpsCpsTpsGpsApsCpsGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 22);
(16) 5 TpsCpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsCpsGpsG- psCpsGpsCpsGpsCpsGpsCpsCpsG 3' (SEQ ID NO: 23);
(17) 5 TosCpoGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsT 3' (SEQ ID NO: 24);
(18) 5 TosCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsT 3' (SEQ ID NO: 25); e
(19) 5 TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsG- psTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsT 3' (SEQ ID NO: 26); em que:
po representa uma ligação internucleotídica fosfodiéster; e ps representa uma ligação internucleotídica fosforotioato.
[0119] De acordo com algumas modalidades, um construto de ODN da presente invenção compreende um agonista de TLR9 compreen- dendo um CpG ODN que compreende, de preferência consiste em uma sequência de polinucleotídeos que é, ou é pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica, ou qualquer porcentagem entre tais valores, a uma das SEQ ID NOs: 8 a 26.
[0120] De acordo com aspectos específicos, um construto de ODN da presente invenção compreende uma estrutura selecionada do grupo que consistem em: (1) 5 Toco-po(HEG)po(HEG)po-TpsCpoGpsTpsCpoG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 27); (2) & Toco-po(HEG)po(HEG)po-TpsCpsGpsTpsCpoG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 28); (3) 59º TposCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsT-(HEG)po(HEG)po-Toco 3' (SEQ ID NO: 29); (4) 5º TpsCpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsT-(HEG)po(HEG)po-Toco 3' (SEQ ID NO: 30); (5) 5' Chol po (heg) po (heg) po TpsCpoGpsTpsCpoG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsT 3' (SEQ ID No: 31); (6) 5' Chol po (heg) po (heg) poTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsG- psTpsTpsGpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsT 3' (SEQ ID No: 32); (7) 5' Chol po (heg) po (heg) po TpsCpoGpsTpsCpsG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsGpsTpsCpsGpsGpsTpsCpsGpsTpsT 3' (SEQ
ID No: 33);
(8) 5' Chol po (heg) po (heg) po TpsCpoGpsTpsCpoG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsGpsTpsCpsGpsGpsTpsCpsGpsTpsT 3' (SEQ ID No: 34);
(9) 58 Chol-po(HEG)po(HEG)po-TpsCpoGpsTpsCpoG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 35);
(10) & Chol-po(HEG)po(HEG)po-TpsCpoGpsTpsCpoG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 36);
(11) 5º TpsCpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTps-(HEG)po(HEG)po-Chol 3 (SEQ ID NO: 37);
(12) 5 TosCpoGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTps-(HEG)po(HEG)po-Chol 3 (SEQ ID NO: 38);
(13) 9 TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTps-(HEG)po(HEG)po-Chol 3 (SEQ ID NO: 39);
(14) 5 TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsG- psTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTps- (HEG)po(HEG)po-Chol 3' (SEQ ID NO: 40);
(15) 5 TpsCpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTps-(HEG)po(HEG)po-Toco 3 (SEQ ID NO: 41);
(16) 5' Toco-po(HEG)po(HEG)po-TpsCpoGpsTpsCpoG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 42);
(17) 5 TosCpoGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTps-(HEG)po(HEG)po-Toco 3
(SEQ ID NO: 43);
(18) 5 TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTps-(HEG)po(HEG)po-Toco 3 (SEQ ID NO: 44);
(19) 5 TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsG- psTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTps- (HEG)po(HEG)po-Toco 3' (SEQ ID NO: 45);
(20) 5 TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsG- psTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTps- (HEG)po(HEG)po-Toco 3' (SEQ ID NO: 46);
(21) 5 Toco-po(HEG)po(HEG)po-TpsCpsGpsTpsCpsG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 47);
(22) 5' Toco-po(HEG)po(HEG)po-TpsCpoGpsTpsCpsG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 48);
(23) 5& Toco-po(HEG)po(HEG)po-TpsCpoGpsTpsCpoG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 49);
(24) 5 Toco-po(HEG)po(HEG)po-TpsCpoGpsTpsCpoG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 50);
(25) 5'-TpsCpoGpsTpsCGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGps TpsTps-HEGps-Chol 3' (SEQ ID NO: 51);
(26) 5- TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsG- psTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTps (HEG)po(HEG)po-Chol 3' (SEQ ID NO: 52);
(27) 5-GpsGpsGpsGpsTpsCpsApsApsCpoGpsTpsTpsGp- sApsGpsGpsGpsGpsGpsGps-HEGps-Chol 3' (SEQ ID NO: 53);
(28) 5-TpsCpsCpsApsTpsGpsApsCpsGpsTpsTpsCpsCpsTpsG- psApsCpsGpsTpsTps-HEGps-Chol 3' (SEQ ID NO: 54); (29) 5-TpsCpsCpsApsTpsGpsApsCpsGpsTpsTpsCpsCpsTpsG- psApsCpsGpsTpsTps-HEGps-Toco 3' (SEQ ID NO: 55); (30) 5 Palmitoíila-po(HEG)po(HEG)po-TpsCpoG- psTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsG- psTpsCpoGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 56); em que: Chol representa colesterol; Toco representa tocoferol; Palmitoíla representa um grupo palmitoíla; HEG representa ((CH2)2O)s; po representa uma ligação fosfodiéster; e ps representa uma ligação fosforotioato.
em que o tocoferol, o colesterol, ou o grupo palmitoíla é li- gado covalentemente ao (HEG) diretamente por meio de uma ligação po ou ps, ou indiretamente por meio de um segundo ligante que é ligado a (HEG) diretamente por meio de uma ligação po ou ps.
[0121] Em uma modalidade, o construto de ODN tem a seguinte es- trutura: LAI ÇA " v o é [Guesa | ' o ÃO o NNIGIAO, São PuGDINcEN ou uma quiralidade racêmica ou alternativa do mesmo, em que "Oligo- nucleotídeos" representam um CpG ODN que tem uma atividade ago- nística para o TLRO9.
[0122] Em uma modalidade, o construto de ODN tem a seguinte es- trutura: 1 LIAN BE ADIA ADA :
ou uma quiralidade racêmica ou alternativa do mesmo, em que "Oligo- nucleotídeos" representam um CpG ODN que tem uma atividade ago- nística para o TLRO9.
[0123] Em uma modalidade, CpG ODN contém a SEQ ID NO:1, de preferência, a SEQ ID NO:8: TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsT 3.
[0124] Em uma modalidade, CpG ODN contém a seguinte estrutura:
AS SALA AGAGAGLAGLADA SO WADO “ SAL AGAGAGLADA SAGA
[0125] De acordo com aspectos específicos, um construto de ODN da presente invenção pode ser adicionalmente conjugado a uma porção de direcionamento. Como usado aqui, o termo "porção de direciona- mento" se refere a qualquer porção adequada para a aplicação de seu agonista conjugado a células alvo. Exemplos de porções de direciona- mento incluem, por exemplo, um carboidrato, um peptídeo, uma prote- Ína, uma molécula pequena, uma porção lipídica, ou uma toxina, que é especificamente reconhecida por um receptor de superfície celular. As porções de carboidrato úteis incluem, mas não se limitam a, galactose, N-acetilgalactosamina (GalNAc), fucose, manose e ácido siálico (ácido N-acetil neuramínico). De acordo com modalidades específicas, a por- ção de direcionamento se liga a receptores presentes nos tipos de célula alvo específicos de interesse. A porção de direcionamento auxilia no direcionamento do construto de ODN para o sítio alvo necessário. Uma das formas pela qual uma porção de direcionamento pode melhorar a liberação é através da atividade endocitótica mediada por receptor.
Esse mecanismo de absorção envolve o movimento do construto de ODN ligado aos receptores de membrana para o interior de uma área que é envelopada pela membrana por meio de invaginação da estrutura de membrana ou por fusão do sistema de liberação com a membrana celular.
Esse processo é iniciado através da ativação de um receptor de superfície celular ou de membrana após a ligação de um ligante espe- cífico ao receptor.
Muitos sistemas endocitóticos mediados por recepto- res são conhecidos e foram estudados, incluindo aqueles que reconhe- cem açúcares como galactose, manose, manose-6-fosfato, peptídeos e proteínas como transferrina, asialoglicoproteína, vitamina B12, insulina e fator de crescimento epidérmico (EGF). O receptor de asialoglicopro- teína (ASGP-R) é um receptor de alta capacidade, que é altamente abundante em hepatócitos.
O ASGP-R mostra uma afinidade 50 vezes maior pela N-acetil-D-galactosilamina (GalNAc) do que pela D-Gal.
Tra- balhos anteriores mostraram que a multivalência é necessária para al- cançar afinidade nM, sendo também crucial o espaçamento entre os açúcares.
O receptor de manose, com sua alta afinidade pela D-manose representa um outro par importante de ligante-receptor à base de car- boidrato.
O receptor de manose é altamente expresso em tipos especí- ficos de células como macrófagos e, possivelmente, células dendríticas, conjugados de manose, bem como veículos de fármacos manosilados foram usados com sucesso para direcionar moléculas de fármaco para aquelas células.
Para Exemplos, consulte Biessen et al. (1996) J.
Biol.
Chem. 271 (28024-28030) Kinzel et al. (2003) J.
Peptide Sci. 9, 375- 385; Barratt et al. (1986) Biochim.
Biophys.
Acta 862, 153-64; Diebold et al. (2002) Somat.
Cell Mol.
Genetics 27, 65-74. De acordo com mo- dalidades, a porção de direcionamento é uma porção lipídica.
Por exem- plo, o tocoferol pode servir como uma porção de direcionamento para receptores de vitamina E, e um grupo palmitoíla pode servir como uma porção de direcionamento para receptores de LDL.
[0126] De acordo com modalidades específicas, a porção de direci- onamento se liga a receptores presentes nos tipos de célula alvo espe- cíficos de interesse
[0127] Um construto de ODN da presente invenção pode ser conju- gado a uma porção de direcionamento direta ou indiretamente por meio de um ligante. Síntese
[0128] Os construtos de ODN da presente invenção podem ser pro- duzidos com o uso de métodos conhecidos na técnica em vista da pre- sente invenção. Por exemplo, os oligorribonucleotídeos e os oligorribo- nucleosídeos usados de acordo com a presente invenção podem ser produzidos com a síntese em fase sólida, consulte por exemplo "Oligo- nucleotide synthesis, a practical approach", Ed. M. J. Gait, IRL Press, 1984; "Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach", Ed. F. Eckstein, IRL Press, 1991 (por exemplo, Capítulo 1, Modern machine- aided methods of ODN synthesis, Capítulo 2, Oligoribonucleotide synthesis, Capítulo 4, Phosphorothioate oligonucleotides, Capítulo 5, Synthesis of oligonucleotide phosphorodithioates). Outros procedimen- tos sintéticos, reagentes, grupos de bloqueio e condições de reação par- ticularmente úteis são descritos em Martin, P., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504; Beaucage, S. L. e Iyer, R. P., Tetrahedron, 1992, 48, 2223- 2311 e Beaucage, S. L. e Iyer, R. P., Tetrahedron, 1993, 49, 6123-6194, ou referências ali mencionadas. Compostos de cadeia principal mista que têm, por exemplo, ligações PO ou PS alternadas, podem ser pre- parados como descrito nas patentes US nºs 5.378.825, 5.386.023,
5.489.677 e nos pedidos PCT publicados PCT/US92/04294 e PCT/US92/04305 (publicados como WO 92/20822 e WO 92/20823, res- pectivamente).
[0129] Um exemplo de um esquema de síntese que pode ser usado para produzir os construtos da presente invenção é ilustrado na Figura 17 e descrito no Exemplo 1. Composições farmacêuticas e métodos de tratamento
[0130] De acordo com aspectos específicos, a presente invenção se refere a um construto de ODN que induz a atividade de TLR9. O efeito de um construto de ODN com atividade agonística para TLR9 so- bre uma resposta imunológica dependente de TLR pode ser determi- nado in vitro mediante a medição de uma resposta de células do sistema imune (por exemplo, células mononucleares de sangue periférico (CMSPs) (PBMCs = "Peripheral Blood Mononuclear Cells") consistindo essencialmente em linfócitos e monócitos) ou células repórter (por exemplo, células HEK293 que expressam um construto repórter para TLRO9) colocados em contato com o agonista. O efeito de um construto de ODN com atividade agonística para TLR9 sobre uma resposta imu- nológica dependente de TLR pode também ser determinado in vivo, por exemplo, mediante a medição de indução de citocina em um animal após injeção com o agonista. Métodos exemplificadores são aqui des- critos, por exemplo nos Exemplos abaixo.
[0131] Os construtos de ODN da presente invenção podem ser usa- dos para tratar doenças, distúrbios ou condições imunológicas, como infecções virais ou câncer.
[0132] Assim, em um outro aspecto geral, a presente invenção se refere a uma composição farmacêutica que compreende um construto de ODN da presente invenção e um veículo farmaceuticamente aceitá- vel.
[0133] Em um outro aspecto geral, a presente invenção se refere a um método para estimular uma resposta imunológica em um indivíduo que precisa da mesma, que compreende administrar ao indivíduo uma composição farmacêutica que compreende um construto de ODN da presente invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável.
[0134] Em um outro aspecto geral, a presente invenção se refere a um método para tratar ou reduzir os sintomas de uma doença, distúrbio ou condição, como uma doença, distúrbio ou condição imunológica, como uma infecção viral ou câncer, em um indivíduo que precisa do mesmo, que compreende administrar ao indivíduo uma composição far- macêutica da presente invenção.
[0135] De acordo com modalidades da presente invenção, a com- posição farmacêutica compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um construto de ODN. Como usado aqui com referência aos construtos ODN, uma quantidade terapeuticamente eficaz significa uma quantidade de um construto de ODN que estimula uma resposta imuno- lógica em um indivíduo que precisa da mesma. Também como usado aqui com referência a um construto de ODN, uma quantidade terapeu- ticamente eficaz significa uma quantidade de um construto de ODN que resulta no tratamento de uma doença, distúrbio ou condição imunoló- gica, como uma infecção viral ou cânceres; evita ou retarda a progres- são da doença, distúrbio ou condição imunológica, como uma infecção viral ou câncer; reduz ou alivia completamente os sintomas associados à doença, distúrbio ou condição imunológica do sistema imune.
[0136] De acordo com as modalidades particulares, uma quanti- dade terapeuticamente eficaz se refere à quantidade de terapia que é suficiente para alcançar um, dois, três, quatro ou mais dos seguintes efeitos: (i) reduzir ou melhorar a gravidade da doença, distúrbio ou con- dição a ser tratado, ou um sintoma associado ao mesmo; (ii) reduzir a duração da doença, distúrbio ou condição a ser tratado, ou um sintoma associado ao mesmo; (iii) evitar a progressão da doença, distúrbio ou condição a ser tratado, ou um sintoma associado ao mesmo; (iv) causar a regressão da doença, distúrbio ou condição a ser tratado, ou um sin- toma associado ao mesmo; (v) evitar o desenvolvimento ou o início da doença, distúrbio ou condição a ser tratado, ou um sintoma associado ao mesmo; (vi) evitar a recorrência da doença, distúrbio ou condição a ser tratado, ou um sintoma associado ao mesmo; (vii) reduzir a hospita- lização de um indivíduo que tem a doença, distúrbio ou condição a ser tratado, ou um sintoma associado ao mesmo; (viii) reduzir o período de hospitalização de um indivíduo que tem a doença, distúrbio ou condição a ser tratado, ou um sintoma associado ao mesmo; (ix) aumentar a so- brevida de um indivíduo com a doença, distúrbio ou condição a ser tra- tado, ou um sintoma associado ao mesmo; (x) inibir ou reduzir a doença, distúrbio ou condição a ser tratada, ou um sintoma associado ao mesmo em um indivíduo; e/ou (xi) aumentar ou melhorar o efeito profilático ou terapêutico (ou os efeitos profiláticos ou terapêuticos) de uma outra te- rapia.
[0137] De acordo com modalidades específicas, a doença, distúrbio ou condição a ser tratada é uma doença, distúrbio ou condição imuno- lógica. De acordo com modalidades específicas, a doença, distúrbio ou condição a ser tratada é um câncer, uma doença, distúrbio ou condição inflamatória, uma doença, distúrbio ou condição autoimune, ou uma do- ença, distúrbio ou condição causada por um patógeno, como uma infec- ção viral. De acordo com modalidades específicas, o câncer ou tumor é um câncer causado por um vírus, carcinoma, sarcoma ou uma leucemia. De acordo com modalidades específicas, o câncer é um carcinoma ma- mário, de cólon, bexiga, pulmão, próstata, estômago ou pâncreas ou uma leucemia linfoblástica ou mieloide. De acordo com modalidades es- pecíficas, a infecção viral é um vírus RNA ou DNA como adenovírus, citomegalovírus, vírus da hepatite A (HAV), hepadnavírus incluindo HBV, HBV crônica, flavivírus incluindo vírus da febre amarela, hepaciví- rus incluindo o vírus da hepatite C (HCV), herpes simplex tipos 1 e 2, herpes zóster, herpes vírus humano tipo 6, vírus da imunodeficiência humana (HIV), vírus do papiloma humano (HPV), vírus da influenza A,
vírus da influenza B, sarampo, vírus de parainfluenza, pestivírus, polio- vírus, poxvírus, rinovírus, coronavírus, vírus sincicial respiratório (RSV), múltiplas famílias de vírus que causam febre hemorrágica, incluindo os Arenavírus, os Bunyavírus e Filovírus, e uma gama de encefalites virais causadas por vírus RNA e DNA. De acordo com modalidades mais es- pecíficas, a doença a ser tratada é infecção por HBV ou infecção crônica por HBV.
[0138] A infecção crônica por HBV é caracterizada pela presença detectável de HBV em um indivíduo por mais de 6 meses. Com mais preferência, uma infecção crônica por HBV mencionada neste docu- mento segue a definição publicada pelo Centers for Disease Control and Prevention (CDC), segundo o qual uma infecção crônica por HBV é ca- racterizada pelos seguintes critérios laboratoriais: (i) negativo para anti- corpos IgM contra o antígeno de núcleo ("core") da hepatite B (IQM anti- HBc) e positivo para o antígeno de superfície da hepatite B (HBsAg), hepatite B e antígeno (HBeAg), ou teste de ácido nucleico para o DNA do vírus da hepatite B, ou (ii) positivo para HBsAg ou teste de ácido nucleico para DNA de HBV, ou positivo para HBeAg duas vezes com intervalos de pelo menos 6 meses.
[0139] De acordo com modalidades específicas, uma quantidade te- rapeuticamente eficaz se refere à quantidade de uma terapia que é su- ficiente para tratar uma infecção crônica por HBV. Consequentemente, uma quantidade terapeuticamente eficaz se refere à quantidade de te- rapia que é suficiente para alcançar um, dois, três, quatro ou mais dos seguintes efeitos: (i) reduzir ou melhorar a gravidade de uma infecção por HBV ou um sintoma associado à mesma; (ii) reduzir a duração de uma infecção por HBV ou sintoma associado à mesma; (ili) evitar a pro- gressão de uma infecção por HBV ou sintoma associado à mesma; (iv) causar regressão de uma infecção por HBV ou sintoma associado à mesma; (v) evitar o desenvolvimento ou início de uma infecção por HBV,
ou sintoma associado à mesma; (vi) evitar a recorrência de uma infec- ção por HBV ou sintoma associado à mesma; (vii) reduzir a hospitaliza- ção de um indivíduo que tem uma infecção por HBV; (viii) reduzir o tempo de hospitalização de um indivíduo que tem uma infecção por HBV; (ix) aumentar a sobrevida de um indivíduo com uma infecção por HBV; (x) eliminar de uma infecção por HBV em um indivíduo; (xi) inibir ou reduzir a replicação do HBV em um indivíduo; e/ou (xii) aumentar ou melhorar o efeito profilático ou terapêutico (ou os efeitos profiláticos e terapêuticos) de outra terapia.
[0140] De acordo com modalidades específicas, uma quantidade te- rapeuticamente eficaz se refere à quantidade de uma terapia que é su- ficiente para alcançar um, dois, três, quatro ou mais dos seguintes efei- tos: (i) reduzir a quantidade de antígeno de superfície de hepatite B (HBsAg) no indivíduo em 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou mais; (ii) reduzir a quantidade de antígeno e de hepatite B (HBeAg) no indivíduo em 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou mais; (iii) reduzir a quantidade de DNA do vírus da hepatite B no indivíduo em 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou mais; e/ou (iv) reduzir a quantidade de anticorpos anti- HBsAg no indivíduo em 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou mais.
[0141] De acordo com modalidades específicas, uma quantidade te- rapeuticamente eficaz se refere à quantidade de uma terapia que é su- ficiente para tratar um câncer. Consequentemente, uma quantidade te- rapeuticamente eficaz se refere à quantidade de terapia que é suficiente para alcançar um, dois, três, quatro ou mais dos seguintes efeitos: (i) reduzir ou melhorar a gravidade de um câncer ou um sintoma associado ao mesmo; (ii) reduzir a duração de um câncer ou sintoma associado ao mesmo; (iii) prevenir a progressão de um câncer ou sintoma associado ao mesmo; (iv) causar a regressão de um câncer ou sintoma associado ao mesmo; (v) evitar o desenvolvimento ou o início de um câncer, ou sintoma associado ao mesmo; (vi) evitar a recorrência de um câncer ou sintoma associado ao mesmo; (vii) reduzir a hospitalização de um indi- víduo que tem um câncer; (viii) reduzir o tempo de hospitalização de um indivíduo que tem um câncer; (ix) aumentar a sobrevida de um indivíduo com um câncer; (x) eliminar um câncer em um indivíduo; e/ou (xi) au- mentar ou melhorar o efeito profilático ou terapêutico (ou os efeitos pro- filáticos ou terapêuticos) de uma outra terapia.
[0142] A quantidade ou a dosagem terapeuticamente eficaz pode variar de acordo com vários fatores, como os meios de administração, o sítio alvo, o estado fisiológico do indivíduo (incluindo, por exemplo, idade, peso corporal, saúde), se o indivíduo é um ser humano ou um animal, outros medicamentos administrados, e se o tratamento é profi- lático ou terapêutico. As dosagens de tratamento são idealmente titula- das para otimizar a segurança e a eficácia.
[0143] O modo de administração para uso terapêutico dos constru- tos de ODN da presente invenção pode ser qualquer via adequada que libere o agente ao hospedeiro. Por exemplo, as composições descritas na presente invenção podem ser formuladas de modo a serem adequa- das para a administração parenteral, por exemplo, por administração intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutânea, intranasal ou intracraniana, ou elas podem ser administradas no fluido cerebroespinhal do cérebro ou na espinha dorsal.
[0144] De acordo com modalidades particulares, as composições descritas na presente invenção são formuladas para serem adequadas para a via de administração tencionada a um indivíduo. Por exemplo, as composições aqui descritas podem ser formuladas para serem adequa- das para administração intravenosa, subcutânea, intratumoral ou intra- muscular. De acordo com modalidades preferenciais, as composições descritas aqui são formuladas para serem adequadas para administra- ção intravenosa, subcutânea ou intratumoral.
[0145] O tratamento pode ser administrado em um cronograma de dose única, ou como um cronograma de múltiplas doses em que um curso primário de tratamento pode ser com 1 a 10 doses separadas, seguidas de outras doses administradas em intervalos de tempo subse- quentes necessários para manter e/ou reforçar a resposta, por exemplo, de 1 a 4 meses para uma segunda dose e, se necessário, uma ou mais doses subsequentes após vários meses. Exemplos de cronogramas de tratamento adequados incluem: (i) O, 1 mês e 6 meses, (ii) 0, 7 dias e 1 mês, (ili) O e 1 mês, (iv) O e 6 meses, ou outros cronogramas suficientes para induzir as respostas desejadas esperadas para reduzir os sintomas ou a gravidade da doença.
[0146] De acordo com modalidades específicas, uma composição usada no tratamento de uma doença, distúrbio ou condição imunológica, ou uma doença viral, como HBV crônica, ou um câncer, pode ser usada em combinação com outros agentes que sejam eficazes para o trata- mento das doenças, distúrbios ou condições relacionadas. Exemplos de tais agentes incluem, mas não se limitam a, CAMs, DAAs, outros TLRs, ASO/siRNA, inibidores de pontos de controle ("checkpoints"), outros qui- mioterápicos, CAR-T.
[0147] Em um outro aspecto geral, a presente invenção se refere a um método para produzir uma composição farmacêutica que compre- ende um construto de ODN da presente invenção, que compreende combinar um construto de ODN com um veículo farmaceuticamente aceitável para obter uma composição farmacêutica.
[0148] Em um outro aspecto geral, a presente invenção se refere a um método para tratar infecção crônica por HBV em um indivíduo que precisa do mesmo, que compreende administrar ao indivíduo uma com-
posição farmacêutica que compreende um construto de ODN da pre- sente invenção.
[0149] Em um outro aspecto geral, a presente invenção se refere a um método para tratar um tumor, de preferência, um câncer, em um indivíduo que precisa do mesmo, que compreende administrar ao indi- víduo uma composição farmacêutica que compreende um construto de ODN da presente invenção.
[0150] O conteúdo de todas as referências citadas (incluindo refe- rências da literatura, patentes concedidas, pedidos de patente publica- dos, e todos os pedidos de patentes copendentes) ao longo deste pe- dido estão aqui expressamente incorporadas a título de referência. Modalidades
[0151] A presente invenção também fornece as seguintes modali- dades não limitadoras.
[0152] A modalidade 1 é um construto de ODN que tem a fórmula da Fórmula |: 5' ML [CpG ODN]-L2-M> 3', em que: cada um dentre M: e M> representa, independentemente, uma porção lipídica, de preferência, a porção lipídica compreende pelo menos um selecionado do grupo que consiste em colesterol, tocoferol|, um grupo palmitoíla, e um grupo estearila, opcionalmente um dentre M: e M> está ausente; cada um dentre L; e L2 representa, independentemente, um ligante, de preferência o ligante compreende pelo menos 10 átomos se- lecionados do grupo que consiste em carbono, nitrogênio, oxigênio, hi- drogênio, enxofre e fósforo, e L é ligado covalentemente ao CpG ODN através de uma ligação clivável, de preferência, por meio de uma ligação éster ou amida, opcionalmente um dentre L, e L2> está ausente quando o respectivo M: ou M, está ausente; e de preferência, o CpG ODN compreende pelo menos um mo- tivo CpG que tem uma ligação internucleotídica fosfodiéster (po); opcionalmente, o construto de CpG ODN da fórmula (1) é adi- cionalmente covalentemente conjugado a uma porção de direciona- mento que é, de preferência, selecionada do grupo que consiste em ga- lactose N-acetilgalactosamina (GalNAc), fucose, manose, ácido siálico e ácido N-acetil neuramínico.
[0153] A modalidade 2 é um construto de CpG ODN que tem a fór- mula: Fórmula (lla): M-LH[CpG ODN] 3', ou Fórmula (Ilb): 5' [CpG ODN]-L-M 3' em que: M representa uma porção lipídica, de preferência, a porção lipídica compreende pelo menos um selecionado do grupo que consiste em colesterol, tocoferol, um grupo palmitoíla, e um grupo estearila; L representa um ligante que compreende pelo menos 1 átomo selecionado do grupo que consiste em carbono, nitrogênio, oxi- gênio, hidrogênio, enxofre e fósforo, e L é ligado covalentemente ao CpG ODN através de uma ligação clivável, de preferência por meio de uma ligação éster ou amida; e CpG ODN compreende pelo menos um motivo CpG tendo uma ligação internucleotídica po (fosfodiéster), compreende, de prefe- rência, pelo menos dois, três ou quatro motivos CpG, tendo cada um a ligação internucleotídica po; opcionalmente, o construto de CpG ODN da Fórmula (lla) ou (Ilb) é adicionalmente covalentemente conjugado a uma porção de dire- cionamento, que é, de preferência, selecionada do grupo que consiste em galactose N-acetilgalactosamina (GalNAc), fucose, manose, ácido siálico e ácido N-acetil neuramínico.
[0154] A modalidade 2a é o construto de ODN da modalidade 1 ou
2, em que o ligante compreende de 10 a 100 átomos selecionados do grupo que consiste em carbono, nitrogênio, oxigênio, hidrogênio, enxo- fre e fósforo.
[0155] A modalidade 2b é o construto de ODN da modalidade 2a, em que o ligante compreende de 20 a 100 átomos selecionados do grupo que consiste em carbono, nitrogênio, oxigênio, hidrogênio, enxo- fre e fósforo.
[0156] A modalidade 2c é o construto de ODN da modalidade 2a, em que o ligante compreende de 30 a 100 átomos selecionados do grupo que consiste em carbono, nitrogênio, oxigênio, hidrogênio, enxo- fre e fósforo.
[0157] A modalidade 2d é o construto de ODN da modalidade 2a, em que o ligante compreende de 40 a 100 átomos selecionados do grupo que consiste em carbono, nitrogênio, oxigênio, hidrogênio, enxo- fre e fósforo.
[0158] A modalidade 2e é o construto de ODN da Modalidade 2a, em que o ligante compreende de 50 a 100 átomos selecionados do grupo que consiste em carbono, nitrogênio, oxigênio, hidrogênio, enxo- fre e fósforo.
[0159] A modalidade 2f é o construto de ODN da modalidade 2a, em que o ligante compreende de 60 a 100 átomos selecionados do grupo que consiste em carbono, nitrogênio, oxigênio, hidrogênio, enxo- fre e fósforo.
[0160] A modalidade 2g é o construto de ODN da modalidade 2a, em que o ligante compreende de 70 a 100 átomos selecionados do grupo que consiste em carbono, nitrogênio, oxigênio, hidrogênio, enxo- fre e fósforo.
[0161] A modalidade 2 h é o construto de ODN da modalidade 2a, em que o ligante compreende de 80 a 100 átomos selecionados do grupo que consiste em carbono, nitrogênio, oxigênio, hidrogênio, enxo- fre e fósforo.
[0162] A modalidade 3 é o construto de ODN da modalidade 1 ou 2, em que o ligante compreende ((CH2)2O)m, em que m é um número in- teiro de 1 a 15, como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15.
[0163] A modalidade 4 é o construto de ODN da modalidade 3, em que o ligante compreende (((CH2)2O)m—X)n, em que n é um número in- teiro de 1 a 5, como 1, 2, 3, 4, ou 5, e X é independentemente uma ligação fosfodiéster (po) ou fosforotioato (ps).
[0164] A modalidade 4a é o construto de ODN da modalidade 4, em que o ligante compreende ((CH2)2O0)s—-X)n.
[0165] A modalidade 4b é o construto de ODN da modalidade 4a, em que o ligante compreende ((CH2)2O)s—po.
[0166] A modalidade 4c é o construto de ODN da modalidade 4a, em que o ligante compreende ((CH2)2O)s—po-((CH2)2O)s—po.
[0167] A modalidade 4d é o construto de ODN da modalidade 4a, em que o ligante compreende ((CH2)2O)s—ps-((CH2)2O)s—-po.
[0168] A modalidade 5 é um construto de CpG ODN que tem a es- trutura: Fórmula (Illa): 5' MY -H((CH2)2O)m-X)n—Y2-[CpG ODN]-Y3-M>2 3', ou Fórmula (Illb): 5' M2—Y3-[CpG ODN]-Y2-(((CH2)2O)In=WX)a—"Y1-M1 3' em que: M: representa uma porção lipídica, de preferência, a porção lipídica compreende pelo menos um selecionado do grupo que consiste em colesterol, tocoferol, um grupo palmitoíla, e um grupo estearila, M> representa uma porção lipídica, uma porção de direcio- namento, ou está ausente, Y1 é uma ligação ou um ligante, de preferência, etileno glicol que tem a Fórmula ((CH2)2O)., em que o é de 1 a 15, covalentemente ligado a (((CH2)2O)m—=X)n por meio de uma ligação fosfodiéster (po), uma ligação fosforotioato (ps) ou uma união, X é independentemente uma união, uma ligação po ou uma ligação ps, cada um dentre Y2 e Y;3 é independentemente uma ligação clivável, de preferência, compreende uma ligação éster ou amida, com mais preferência, compreende uma ligação po ou uma ligação fosfora- midato, com a máxima preferência, uma ligação po, desde que quando M,> estiver ausente, Y; esteja ausente, CpG ODN compreende pelo menos um motivo CpG tendo uma ligação internucleotídica po (fosfodiéster), compreende, de prefe- rência, pelo menos dois, três ou quatro motivos CpG, tendo cada um a ligação internucleotídica po; m é um número inteiro de 1a 15,e n é um número inteiro de 1 a 5.
[0169] A modalidade 6 é o construto de ODN da modalidade 5, em que M2 é um direcionamento.
[0170] A modalidade 6a é o construto de ODN da modalidade 6, em que M2 é o direcionamento selecionado do grupo que consiste em ga- lactose, N-acetilgalactosamina (GalNAc), fucose, manose, ácido siálico e ácido N-acetil neuramínico.
[0171] A modalidade 6b é o construto de ODN da modalidade 5, em que M2 e Y; estão ausentes.
[0172] A modalidade 7 é um construto de CpG ODN que tem a fór- mula: Fórmula (IVa): 5 MY -(((CH2)2O)m—WX)n—Y2-[CpG ODN] 3', ou Fórmula (IVb): 5' [CpG ODN]I-Y2—(((CH2)2O)m—WX)n— Y1-M 3º em que: M representa uma porção lipídica, de preferência, a porção lipídica compreende pelo menos um selecionado do grupo que consiste em colesterol, tocoferol, um grupo palmitoíla, e um grupo estearila,
Y1 é uma ligação ou um ligante, de preferência, etileno glicol que tem a Fórmula ((CH2)2O)., em que o é de 1 a 15, covalentemente ligado a (((CH2)2O)m—X)n por meio de uma ligação fosfodiéster (po), uma ligação fosforotioato (ps) ou uma união, X é independentemente uma união, uma ligação fosfodiéster (po) ou uma ligação fosforotioato (ps), Y2 é uma ligação clivável, de preferência, compreende uma ligação éster ou amida, com mais preferência, compreende uma ligação po ou uma ligação fosforamidato, com a máxima preferência, uma liga- ção po; CpG ODN compreende pelo menos um motivo CpG tendo uma ligação internucleotídica po (fosfodiéster), compreende, de prefe- rência, pelo menos dois, três ou quatro motivos CpG, tendo cada um a ligação internucleotídica po; m é um número inteiro de 1 a 15, de preferência, 6; e n é um número inteiro de 1 a 5, de preferência, 2; opcionalmente, o construto de CpG ODN da Fórmula (IVa) ou (IVb) é adicionalmente covalentemente conjugado a uma porção de direcionamento, que é, de preferência, selecionada do grupo que con- siste em galactose, N-acetilgalactosamina (GalNAc), fucose, manose, ácido siálico e ácido N-acetil neuramínico.
[0173] A modalidade 8 é o construto de ODN de qualquer uma das modalidades 5 a 7, em que Y> compreende uma ligação éster.
[0174] A modalidade 8a é o construto de ODN da modalidade 8, em que Y> é uma ligação fosfodiéster (po).
[0175] A modalidade 8b é o construto de ODN de qualquer uma das modalidades 5 a 7, em que Y2 compreende uma ligação amida.
[0176] A modalidade 8c é o construto de ODN da modalidade 8b, em que Y,> é uma ligação fosforamidato.
[0177] A modalidade 9 é o construto de ODN de qualquer uma das modalidades 5 a 8c, em que Y, compreende etileno glicol que tem a fórmula ((CH2)2O)., em que o é de 1 a 15, covalentemente ligado a (((CH2)2O )n—X)n por meio de uma ligação.
[0178] A modalidade 9a é o construto de ODN da modalidade 9, em que Y: compreende etileno glicol que tem a fórmula ((CH2)2O)o, em que o é de 1 a 15, covalentemente ligado a (((CH2)2O)m—X)n por meio de uma ligação po.
[0179] A modalidade 9b é o construto de ODN da modalidade 9, em que Y, compreende etileno glicol que tem a fórmula ((CH2)2O)., em que o é de 1 a 15, covalentemente ligado a (((CH2)-O)m—X)n por meio de uma ligação ps.
[0180] A modalidade 10 é o construto de ODN de qualquer uma das modalidades 4 a 9b, em que m é um número inteiro de 1 a 15.
[0181] A modalidade 10a é o construto de ODN da modalidade 10, em que m é 1.
[0182] A modalidade 10b é o construto de ODN da modalidade 10, em que mé 2.
[0183] A modalidade 10c é o construto de ODN da modalidade 10, em que m é 3.
[0184] A modalidade 10d é o construto de ODN da modalidade 10, em que mé 4.
[0185] A modalidade 10e é o construto de ODN da modalidade 10, em que mé 5.
[0186] A modalidade 10f é o construto de ODN da modalidade 10, em que mé 6.
[0187] A modalidade 10g é o construto de ODN da modalidade 10, em que m é 7.
[0188] A modalidade 10h é o construto de ODN da modalidade 10, em que m é 8.
[0189] A modalidade 10i é o construto de ODN da modalidade 10,
em que mé 9.
[0190] A modalidade 10j é o construto de ODN da modalidade 10, em que m é 10.
[0191] A modalidade 10Kk é o construto de ODN da modalidade 10, em que m é 11.
[0192] A modalidade 10I é o construto de ODN da modalidade 10, em que m é 12.
[0193] A modalidade 10m é o construto de ODN da modalidade 10, em que m é 11.
[0194] A modalidade 10n é o construto de ODN da modalidade 10, em que m é 14.
[0195] A modalidade 100 é o construto de ODN da modalidade 10, em que m é 15.
[0196] A modalidade 11 é o construto de ODN de qualquer uma das modalidades 4 a 100, em que n é um número inteiro de 1a 5.
[0197] A modalidade 11a é o construto de ODN da modalidade 11, em que né 1.
[0198] A modalidade 11b é o construto de ODN da modalidade 11 em que né 2.
[0199] A modalidade 11c é o construto de ODN da modalidade 11 em que né 3.
[0200] A modalidade 11d é o construto de ODN da modalidade 11, em que né 4.
[0201] A modalidade 11e é o construto de ODN da modalidade 11 em que né 5.
[0202] A modalidade 12 é o construto de ODN de qualquer uma das modalidades 4 a 10 e 11,emquemé6ené?.
[0203] A modalidade 13 é um construto de ODN que tem uma es- trutura selecionada do grupo que consiste em: 5' M-po(HEG)po(HEG)po-[CpG ODN] 3';
5' M-ps(HEG)po(HEG)po-[CpG ODN] 3', 5' M-ps(HEG)ps(HEG)poHCpG ODN] 3', 5' M-po(HEG)ps(HEG)po-[CpG ODN] 3, 5' [CpG ODN]—-po(HEG)po(HEG)po-M 3', 5' [CpG ODN]-po(HEG)ps(HEG)po—M 3', 5' [CpG ODN]-po(HEG)ps(HEG)ps—M 3', e 5' [CpG ODN]-po(HEG)po(HEG)ps-M 3", em que: M representa uma porção lipídica que compreende ao me- nos um selecionado do grupo que consiste em colesterol, tocoferol, um grupo palmitoíla, e um grupo estearila; po representa uma ligação fosfodiéster; HEG representa ((CH2)2O)s; ps representa uma ligação fosforotioato; e o CpG ODN compreende pelo menos um motivo CpG tendo uma ligação internucleotídica po (fosfodiéster), compreende, de prefe- rência, pelo menos dois, três ou quatro motivos CpG, tendo cada um a ligação internucleotídica po, em que M é ligado covalentemente a (HEG) diretamente por meio de uma ligação po ou ps, ou indiretamente por meio de um se- gundo ligante que é ligado a (HEG) diretamente por meio de uma liga- ção po ou ps.
[0204] A modalidade 14 é o construto de ODN de qualquer uma das modalidades 1 a 13, em que a porção lipídica é colesterol.
[0205] A modalidade 14a é o construto de ODN de qualquer uma das modalidades 1 a 13, em que a porção lipídica é tocoferol.
[0206] A modalidade 14b é o construto de ODN de qualquer uma das modalidades 1 a 13, em que a porção lipídica é um grupo palmitoíla.
[0207] A modalidade 14c é o construto de ODN de qualquer uma das modalidades 1 a 13, em que a porção lipídica é um grupo estearila.
[0208] A modalidade 15 é um construto de ODN que tem uma es- trutura selecionada do grupo que consiste em: 5' Toco-po(HEG)po(HEG)po-[CpG ODN] 3', em que Toco representa tocoferol, 5' Chol-po(HEG)po(HEG)po—[CpG ODN] 3', em que Cho! re- presenta colesterol, 5' Palm-—po(HEG)po(HEG)po-[CpG ODN] 3', em que Palm representa um grupo palmitoíla, 5' [CpG ODN]-po(HEG)ps-Chol 3', em que Chol representa colesterol, 5' [CpG ODN]-po(HEG)ps—Toco 3', em que Toco representa tocoferol, e 5' [CpG ODN]—-po(HEG)ps-Palm 3', em que Palm representa um grupo palmitoíla, em que: po representa uma ligação fosfodiéster; HEG representa ((CH2)2O)s; ps representa uma ligação fosforotioato; e o CpG ODN compreende pelo menos um motivo CpG tendo uma ligação internucleotídica po (fosfodiéster), compreende, de prefe- rência, pelo menos dois, três ou quatro motivos CpG, tendo cada um a ligação internucleotídica po, em que o tocoferol, o colesterol, ou o grupo palmitoíla é |i- gado covalentemente ao (HEG) diretamente por meio de uma ligação po ou ps, ou indiretamente por meio de um segundo ligante que é ligado a (HEG) diretamente por meio de uma ligação po ou ps.
[0209] A modalidade 15a é o construto de ODN da modalidade 15, em que o tocoferol, o colesterol, ou o grupo palmitoíla é covalentemente o segundo ligante e o segundo ligante é covalentemente ligado ao (HEG) diretamente por meio da ligação po ou ps.
[0210] A modalidade 16 é um construto de ODN que tem a seguinte estrutura: ou uma quiralidade racêmica ou alternativa do mesmo, em que "Oligo- nucleotídeos" representa um CpG ODN que compreende pelo menos um motivo CpG que tem uma ligação internucleotídica po, compreen- dendo, de preferência, pelo menos dois, três ou quatro motivos CpG, tendo cada um a ligação internucleotídica po, opcionalmente, o cons- truto de ODN é adicionalmente conjugado a uma porção de direciona- mento, diretamente ou por meio de um ligante.
[0211] A modalidade 16a é um construto de ODN tendo a seguinte estrutura: a ou uma quiralidade racêmica ou alternativa do mesmo, em que "Oligo- nucleotídeos" representa um CpG ODN que compreende pelo menos um motivo CpG que tem uma ligação internucleotídica po, compreen- dendo, de preferência, pelo menos dois, três ou quatro motivos CpG, tendo cada um a ligação internucleotídica po, opcionalmente, o cons- truto de ODN é adicionalmente conjugado a uma porção de direciona- mento, diretamente ou por meio de um ligante.
[0212] A modalidade 16b é um construto de ODN que tem a se- guinte estrutura:
Nas | | Lda AO MA A, A SC x so TS õ Ts ' TS wo” TS õ Ts ' Ts : vs v bes ' ES “o bo) NS
A A NA A Í NO A A A A RA
NOEL TO VE o o o o o o o nn
A ÁN A A A A AN A A ÍN A A
CELA TEA ou uma quiralidade racêmica ou alternativa do mesmo.
[0213] A modalidade 16c é um construto de ODN que tem a se- guinte estrutura: ; À AA PSA 7 Í ARA A OO AAA, hm [ooo e RA AO O eo O Ns A
NL OE OE NA E | A AR AA A ARAL AR AR AR ARAL)
PELE LEL ELA e A e de de Ai dA A A
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[0214] A modalidade 16d é um construto de ODN que tem a se- guinte estrutura:
PA Ja A a, A | OD Do | do o A AA Ho Ho A A o o A Y Ss OE E Ms Ss "e SF “% Sd Í, S$ / " Ss e x GS ” SE Ss Y
FAFE ASSADAS ou uma quiralidade racêmica ou alternativa do mesmo.
[0215] A modalidade 17 é o construto de ODN de qualquer uma das modalidades 1 a 16, em que o CpG ODN tem uma ligação internucleo- tídica fosforotioato (ps).
[0216] A modalidade 18 é o construto de ODN de qualquer uma das modalidades 1 a 17, em que o CpG ODN tem uma ligação internucleo- tídica fosforotioato (ps) estereodefinida.
[0217] A modalidade 19 é o construto de ODN de qualquer uma das modalidades 1 a 18, em que um a quatro dos dinucleotídeos CpG no CpG ODN tem, cada um, uma ligação internucleotídica fosfodiéster (po).
[0218] A modalidade 19a é o construto de ODN da modalidade 19, em que o CpG ODN compreende pelo menos dois motivos CpG, tendo, cada um, uma ligação internucleotídica po.
[0219] A modalidade 19b é o construto de ODN da modalidade 19, em que o CpG ODN compreende pelo menos três motivos CpG, tendo, cada um, uma ligação internucleotídica po.
[0220] A modalidade 19c é o construto de ODN da modalidade 19, em que o CpG ODN compreende pelo menos quatro motivos CpG,
tendo, cada um, uma ligação internucleotídica po.
[0221] A modalidade 20 é o construto de ODN de qualquer uma das modalidades 19 a 19c, em que cada uma dentre as ligações internucle- otídicas restantes do CpG ODN são ligações internucleotídicas fosforo- tioato (ps).
[0222] A modalidade 21 é o construto de ODN de qualquer uma das modalidades 1 a 20, em que o CpG ODN compreende, de preferência consiste em, uma sequência de polinucleotídeo selecionada do grupo que consiste em: (1) 8 TEGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 3' (SEQ ID NO: 1) (2) º GGGGGACGATCGTCGGGGGG 3' (SEQ ID NO: 2); (3) 5º GGGGTCAACGTTGAGGGGGG 3' (SEQ ID NO: 3); (4) TOCATGACGTTCCTGACGTT 3' (SEQ ID NO: 4); (5) 5º TEGTCEGTTTTCGGCGCGCGCCG 3' (SEQ ID NO: 5); (6) TEGTCGTTACGTAACGACGACGTT 3' (SEQ ID NO: 6) e (7) 8º TEGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGT 3' (SEQ ID NO: 7)
[0223] A modalidade 21a é o construto de ODN da modalidade 21, em que o CpG ODN compreende, de preferência consiste em, uma se- quência de polinucleotídeos que é, ou é pelo menos, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma das SEQ ID NOs: 1 a 7.
[0224] A modalidade 22 é o construto de ODN de qualquer uma das modalidades 1 a 21, em que o CpG ODN compreende, de preferência consiste em, uma sequência de polinucleotídeo selecionada do grupo que consiste em: (1) 9º TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 8);
(2) 5º TopsCpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 9);
(3) 5º TposCpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 10);
(4) 5º TosCpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 11);
(5) 5º TpsCpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 12);
(6) 5º TosCpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 13);
(7) 58 TpsCpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 14);
(8) 5º TosCpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsApsCpsGpsTpsApsAp- sCpsGpsApsCpsGpsApsCpsGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 15);
(9) 9 TosCpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsApsCpsGpsTpsApsAp- sCpsGpsApsCpsGpsApsCpsGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 16);
(10) 5º TpsCpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsApsCpoGpsTpsAp- sApsCpsGpsApsCpsGpsApsCpsGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 17);
(11) 5º TpsCpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsApsCpoGpsTpsAp- sApsCpoGpsApsCpsGpsApsCpsGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 18);
(12) 5º TpsCpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsApsCpoGpsTpsAp- sApsCpoGpsApsCpoGpsApsCpsGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 19);
(183) 58 GpsGpsGpsGpsGpsApsCpoGpsApsTpsCpoG- psTpsCpoGpsGpsGps GpsGpsG 3' (SEQ ID NO: 20);
(14) 5º" GpsGpsGpsGpsTpsCpsApsApsCpoGpsTpsTpsGp- sApsGpsGpsGpsGpsGpsG 3' (SEQ ID NO: 21);
(15) 5 TpsCpsCpsApsTpsGpsApsCpsG- psTpsTpsCpsCpsTpsGpsApsCpsGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 22);
(16) 5" TpsCpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsCpsGpsG- psCpsGpsCpsGpsCpsGpsCpsCpsG 3' (SEQ ID NO: 23);
(17) 5 TosCpoGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsT 3' (SEQ ID NO: 24); (18) 5 TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsT 3' (SEQ ID NO: 25); e (19) 5 TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsG- psTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsT 3' (SEQ ID NO: 26); em que: po representa uma ligação internucleotídica fosfodiéster; e ps representa uma ligação internucleotídica fosforotioato.
[0225] A modalidade 22a é o construto de ODN da modalidade 22, em que o CpG ODN compreende, de preferência consiste em, uma se- quência de polinucleotídeos que é, ou é pelo menos, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma das SEQ ID NOs: 8 a 26.
[0226] A modalidade 23 é um construto de ODN, que tem a estru- tura de: (1) 5 Toco-po(HEG)po(HEG)po-TpsCpoGpsTpsCpoG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 27); (2) & Toco-po(HEG)po(HEG)po-TpsCpsGpsTpsCpoG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 28); (3) 59º TposCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsT-(HEG)po(HEG)po-Toco 3' (SEQ ID NO: 29); (4) 5º TpsCpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsT-(HEG)po(HEG)po-Toco 3' (SEQ ID NO: 30); (56) 5 Chol-po(HEG)po(HEG)po-TpsCpoGpsTpsCpoG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsT
3' (SEQ ID NO: 31);
(6) 5 Chol-po(HEG)po(HEG)poTpsCpsGpsTpsCpsG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 32);
(7) & Chol-po(HEG)po(HEG)po-TpsCpoGpsTpsCpsG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 33);
(8) 5 Chol-po(HEG)po(HEG)po-TpsCpoGpsTpsCpoG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 34);
(9) & Chol-po(HEG)po(HEG)po-TpsCpoGpsTpsCpoG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 35);
(10) 5 Chol-po(HEG)po(HEG)po-TpsCpoGpsTpsCpoG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 36);
(11) 5 TosCpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTps-(HEG)po(HEG)po-Chol 3 (SEQ ID NO: 37);
(12) 5 TosCpoGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTps-(HEG)po(HEG)po-Chol 3 (SEQ ID NO: 38);
(13) 9 TosCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTps-(HEG)po(HEG)po-Chol 3 (SEQ ID NO: 39);
(14) 5 TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsG- psTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTps- (HEG)po(HEG)po-Chol 3' (SEQ ID NO: 40);
(15) 5 TpsCpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTps-(HEG)po(HEG)po-Toco 3
(SEQ ID NO: 41);
(16) 5&' Toco-po(HEG)po(HEG)po-TpsCpoGpsTpsCpoG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 42);
(17) 5 TosCpoGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTps-(HEG)po(HEG)po-Toco 3 (SEQ ID NO: 43);
(18) 5 TopsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTps-(HEG)po(HEG)po-Toco 3 (SEQ ID NO: 44);
(19) 5 TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsG- psTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTps- (HEG)po(HEG)po-Toco 3' (SEQ ID NO: 45);
(20) D TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsG- psTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTps- (HEG)po(HEG)po-Toco 3' (SEQ ID NO: 46);
(21) 5' Toco-po(HEG)po(HEG)po-TpsCpsGpsTpsCpsG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 47);
(22) 5' Toco-po(HEG)po(HEG)po-TpsCpoGpsTpsCpsG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 48);
(23) 5' Toco-po(HEG)po(HEG)po-TpsCpoGpsTpsCpoG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 49);
(24) 5' Toco-po(HEG)po(HEG)po-TpsCpoGpsTpsCpoG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 50);
(25) 5'-TpsCpoGpsTpsCGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGps TpsTps-HEGps-Chol 3' (SEQ ID NO:
51); (26) 5- TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsG- psTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTps (HEG)po(HEG)po-Chol 3' (SEQ ID NO: 52); (27) 5-GpsGpsGpsGpsTpsCpsApsApsCpoGpsTpsTpsGp- sApsGpsGpsGpsGpsGpsGps-HEGps-Chol 3' (SEQ ID NO: 53); (28) 5'-TpsCpsCpsApsTpsGpsApsCpsG- psTpsTpsCpsCpsTpsGpsApsCpsGpsTpsTps-HEGps-Chol 3' (SEQ ID NO: 54); (29) 5'-TpsCpsCpsApsTpsGpsApsCpsG- psTpsTpsCpsCpsTpsGpsApsCpsGpsTpsTps-HEGps-Toco 3' (SEQ ID NO: 55); (30) 5 Palmitoíla-po(HEG)po(HEG)po-TpsCpoG- psTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsG- psTpsCpoGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 56); em que: Chol representa colesterol; Toco representa tocoferol; Palmitoíla representa um grupo palmitoíla; HEG representa ((CH>2)2O)s; po representa uma ligação fosfodiéster; e p representa uma ligação fosforotioato, em que o tocoferol, o colesterol, ou o grupo palmitoíla é |i- gado covalentemente ao (HEG) diretamente por meio de uma ligação po ou ps, ou indiretamente por meio de um segundo ligante que é ligado a (HEG) diretamente por meio de uma ligação po ou ps.
[0227] A modalidade 23a é o construto de ODN da modalidade 23, em que o tocoferol, o colesterol, ou o grupo palmitoíla é covalentemente o segundo ligante e o segundo ligante é covalentemente ligado ao (HEG) diretamente por meio da ligação po ou ps.
[0228] A modalidade 23b é o construto de ODN da modalidade 23, que tem a estrutura: AÊ. ASSADA A ISASNDAOA vf in grs rent E Je kN | Le sb oral lona rela oleosa rala lara
RR OQ Q RT OQ RL RR OQ RL Q Q " % 1 t 1º $ NA Ra: eo sf ão laço io E A
[0229] A modalidade 23c é o construto de ODN da modalidade 23, que tem a estrutura:
Y AGRADA AAA AAA Ho E qo or | Ás Á Ás PÁ ex, pÁ, ”» o Ás Ár, pÁo Ás y
ALFA AFA A TC CA tb TCC CX VIC (CC
CLA A EL ÇA A
[0230] A modalidade 23d é o construto de ODN da modalidade 23, que tem a estrutura:
g N a A ao 7 AA A a A Y dx gx dó x NÃO dó di dy x gx Ss SA
A A EIA A EN A A A A
XT LAH A k gd Hx Ss dó SI Si sx AS SO A Sd SI 4 eo dA A A AA ARO Ao ADO EEE E os
[0231] A modalidade 24 é uma composição farmacêutica que com- preende um construto de ODN de qualquer uma das modalidades 1 a 23c, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
[0232] A modalidade 25 é um método para preparar uma composi- ção farmacêutica, que compreende combinar um construto de ODN, de qualquer uma das modalidades 1 a 23c, com um veículo farmaceutica- mente aceitável.
[0233] A modalidade 26 é um método para estimular uma resposta imune em um indivíduo que precisa da mesma, que compreende admi- nistrar ao indivíduo a composição farmacêutica da modalidade 24.
[0234] A modalidade 27 é um método para tratar uma doença em um indivíduo que precisa do mesmo, que compreende administrar ao indivíduo a composição farmacêutica da modalidade 24, em que a do- ença é selecionada do grupo que consiste em vírus da Hepatite B (HBV) e câncer.
[0235] A modalidade 28 é um construto de ODN que compreende um CpG ODN, em que pelo menos um dos dinucleotídeos CpG no CpG ODN tem uma ligação internucleotídica fosforotioato estereodefinida.
[0236] A modalidade 29 é o construto de ODN da modalidade 28, em que dois a quatro dos dinucleotídeos CpG no CpG ODN têm, cada um, uma ligação internucleotídica fosforotioato estereodefinida.
[0237] A modalidade 30 é o construto de ODN da modalidade 28 ou 29, compreendendo um CpG ODN que compreende uma sequência de polinucleotídeos selecionada do grupo que consiste em: (1) 8 TEGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 3' (SEQ ID NO: 1); (2) º GGGGGACGATCGTCGGGGGG 3' (SEQ ID NO: 2); (3) º GGGGTCAACGTTGAGGGGGG 3' (SEQ ID NO: 3); (4) º TCCATGACGTTCCTGACGTT 3' (SEQ ID NO: 4); (5) 5 TEGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG 3' (SEQ ID NO: 5); (6) TEGTCGTTACGTAACGACGACGTT 3' (SEQ ID NO: 6) e (7) TEGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGT 3' (SEQ ID NO: 7)
[0238] A modalidade 31 é um construto de ODN que tem a fórmula da Fórmula Il(s): 5' M-LHCpG ODN]-L2-M2 3', em que: cada um dentre M: e M> representa, independentemente, uma porção lipídica, de preferência, a porção lipídica compreende pelo menos um selecionado do grupo que consiste em colesterol, tocoferol|, um grupo palmitoíla, e um grupo estearila, opcionalmente um dentre M; e M> está ausente; cada um dentre L, e L2 representa, independentemente, um ligante, de preferência o ligante compreende pelo menos 10 átomos se- lecionados do grupo que consiste em carbono, nitrogênio, oxigênio, hi- drogênio, enxofre e fósforo, e L é ligado covalentemente ao CpG ODN através de uma ligação clivável, de preferência, por meio de uma ligação éster ou amida, opcionalmente um dentre L, e L> está ausente quando o respectivo M: ou M> está ausente; e CpG ODN representa o CpG ODN como definido em qual- quer uma das modalidades 28 a 30; opcionalmente, o construto de CpG ODN da fórmula (1) é adi- cionalmente covalentemente conjugado a uma porção de direciona- mento que é, de preferência, selecionada do grupo que consiste em ga- lactose N-acetilgalactosamina (GalNAc), fucose, manose, ácido siálico e ácido N-acetil neuramínico.
[0239] A modalidade 32 é um construto de CpG ODN que tem a fórmula: Fórmula (lla)(s): 5 M-LHCpG ODN] 3', ou Fórmula (IIb)(s): 5' [CpG ODN]I-L-M 3' em que: M representa uma porção lipídica, de preferência, a porção lipídica compreende pelo menos um selecionado do grupo que consiste em colesterol, tocoferol, um grupo palmitoíla, e um grupo estearila; L representa um ligante que compreende pelo menos 1 átomo selecionado do grupo que consiste em carbono, nitrogênio, oxi- gênio, hidrogênio, enxofre e fósforo, e L é ligado covalentemente ao CpG ODN através de uma ligação clivável, de preferência por meio de uma ligação éster ou amida; e CpG ODN representa o CpG ODN de qualquer uma das mo- dalidades 28 a 30; opcionalmente, o construto de CpG ODN da Fórmula (Ila) ou (Ilb) é adicionalmente covalentemente conjugado a uma porção de dire- cionamento, que é, de preferência, selecionada do grupo que consiste em galactose N-acetilgalactosamina (GalNAc), fucose, manose, ácido siálico e ácido N-acetil neuramínico.
[0240] A modalidade 33 é um construto de CpG ODN que tem uma estrutura de:
Fórmula (Illa)(s): 5' M—Y-(((CH2)2O)Jm—=X)n=Y2-[CpG ODN]—-Y3-M>2 3', ou Fórmula (Illb)(s): 5' M2—Y3-[CpG ODN]I-Y2—(((CH2)2O)Jm=WX)n—"Y 1-M1 3' em que: M; representa uma porção lipídica, de preferência, a porção lipídica compreende pelo menos um selecionado do grupo que consiste em colesterol, tocoferol, um grupo palmitoíla, e um grupo estearila, M> representa uma porção lipídica, uma porção de direcio- namento, ou está ausente, Y1 é uma ligação ou um ligante, de preferência, etileno glicol! que tem a Fórmula ((CH>2)2O)., em que o é de 1 a 15, covalentemente ligado a (((CH2), O)m—X)n por meio de uma ligação fosfodiéster (po), uma ligação fosforotioato (ps) ou uma união, X é independentemente uma união, uma ligação po ou uma ligação ps, cada um dentre Y> e Y3 é independentemente uma ligação clivável, de preferência, compreende um éster ou uma ligação amida, com mais preferência é uma ligação po ou uma ligação fosforamidato, com a máxima preferência, uma ligação po, desde que quando M, esti- ver ausente, Y; esteja ausente, CpG ODN representa o CpG ODN de qualquer uma das mo- dalidades 28 a 30; m é um número inteiro de 1a 15,e n é um número inteiro de 1 a 5.
[0241] A modalidade 34 é um construto de CpG ODN que tem a fórmula: Fórmula (IVa)(s): 5 M-Y1-(((CH2)2O)m—=X).—Y2-[CpG ODN] 3', ou Fórmula (IVb)(s): 5º [CpG ODNI-YH((CH2).O)m—WX)n— Y1—M 3' em que: M representa uma porção lipídica, de preferência, a porção lipídica compreende pelo menos um selecionado do grupo que consiste em colesterol, tocoferol, um grupo palmitoíla, e um grupo estearila, Y1 é uma ligação ou um ligante, de preferência, etileno glico!l que tem a Fórmula ((CH2)2O)., em que o é de 1 a 15, covalentemente ligado a (((CH2)2O)m—=X)n por meio de uma ligação fosfodiéster (po), uma ligação fosforotioato (ps) ou uma união, X é independentemente uma união, uma ligação fosfodiéster (po) ou uma ligação fosforotioato (ps), Y2 é uma ligação clivável, de preferência, compreende uma ligação éster ou amida, com mais preferência, compreende uma ligação po ou uma ligação fosforamidato, com a máxima preferência, uma liga- ção po; CpG ODN representa o CpG ODN de qualquer uma das mo- dalidades 28 a 30 n é um número inteiro de 1 a 5, de preferência, 2; opcionalmente, o construto de CpG ODN da Fórmula (IVa) ou (IVb) é adicionalmente covalentemente conjugado a uma porção de direcionamento, que é, de preferência, selecionada do grupo que con- siste em galactose, N-acetilgalactosamina (GalNAc), fucose, manose, ácido siálico e ácido N-acetil neuramínico.
[0242] A modalidade 35 é uma composição farmacêutica que com- preende o construto de ODN de qualquer uma das modalidades 28 a
34.
[0243] A modalidade 36 é um método para preparar uma composi- ção farmacêutica, que compreende combinar o construto de ODN, de qualquer uma das modalidades 28 a 24, com um veículo farmaceutica- mente aceitável.
[0244] A modalidade 37 é um método para estimular uma resposta imune em um indivíduo que precisa da mesma, que compreende admi- nistrar ao indivíduo a composição farmacêutica da modalidade 35.
[0245] A modalidade 37a é o método da modalidade 37, em que o indivíduo precisa de tratamento de uma infecção por HBV.
[0246] A modalidade 37b é o método da modalidade 37, em que o indivíduo precisa de tratamento de um câncer.
[0247] A modalidade 37c é o método da modalidade 37, em que o indivíduo precisa de tratamento de um câncer colorretal.
[0248] A modalidade 38 é um método de tratamento de um câncer em um indivíduo que precisa do mesmo, que compreende administrar ao indivíduo a composição farmacêutica da modalidade 35.
[0249] A modalidade 38a é o método da modalidade 38, em que o câncer é um câncer gastrointestinal.
[0250] A modalidade 38b é o método da modalidade 38, em que o câncer é um câncer colorretal.
[0251] A modalidade 39 é um método de tratamento de uma infec- ção por HBV em um indivíduo que precisa do mesmo, que compreende administrar ao indivíduo a composição farmacêutica da modalidade 35.
[0252] A modalidade 39a é o método da modalidade 39, em que o tratamento resulta em uma redução dos números de cópia do DNA de HBV no indivíduo.
[0253] A modalidade 39b é o método da modalidade 39 ou 39a, em que o tratamento resulta em um aumento no título de anticorpos espe- cíficos para o antígeno de superfície de hepatite B (HBSAg) no indiví- duo.
[0254] A modalidade 39c é o método de qualquer uma das modali- dades 39 a 39b, em que o tratamento resulta em um aumento de células T específicas para o antígeno de superfície de hepatite B (HBSAg). Exemplos
[0255] Os exemplos a seguir da presente invenção servem para adi- cionalmente ilustrar a natureza da presente invenção. Deve-se compre- ender que os exemplos a seguir não limitam a presente invenção e que o escopo da presente invenção é determinado pelas reivindicações em anexo.
[0256] Os métodos experimentais usados nos Exemplos a seguir, salvo indicação em contrário, são todos métodos comuns. Os reagentes usados nas modalidades a seguir, salvo indicação em contrário, são to- dos adquiridos junto a fornecedores de reagentes comuns. Exemplo 1 Síntese de AG9
[0257] AG9: Fórmula química: C298H420N70O0164P26S19, peso molecular: 9021,42 (5"- Toco-(po)-HEG(po)-HEG(po)-TpsCGpsTpsCG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCGpsTpsT-3')
LIS OO | sb o, dah lote É ko ” , de E ali sto plana nl nn nal lona na
[0258] O AGZ9 foi sintetizado com o uso de um esquema de síntese ilustrado na Figura 17. Mais especificamente, a síntese de AG9 foi rea- lizada com o uso de tecnologia de síntese em fase sólida e um sinteti- zador automatizado. A síntese foi realizada duas vezes em uma escala de 218 umol para obter uma escala total de 436 umol. A síntese foi rea- lizada com o uso de uma coluna fixa de 6,3 ml (GE Healthcare). O Oli- goPilot 100 foi usado para a síntese do composto. O suporte Unylinker NittoPhase com uma carga de -303 umol/g foi o suporte sólido usado para essa síntese. A síntese foi realizada através da execução de um método iterativo de 4 etapas especificamente concebido para a produ- ção de AG9. As quatro etapas incluem detritilação, acoplamento, sulfu- rização, e terminação ("capping"), e foram repetidas por 16 ciclos com o uso de amiditas específicas para produzir o produto desejado. Após cada etapa, foi realizada uma lavagem adequada da acetonitrila para evitar reações indesejáveis. A detritilação do suporte sólido foi realizada com o uso de 3% ácido dicloroacético em tolueno e monitorada a 436 nm. O acoplamento foi conduzido misturando-se 40% (em volume) de solução de amidita a 0,1 M com 60% do ativador em linha antes da adi- ção à coluna. O total foi de 2,5 equivalentes de amidita adicionados por acoplamento. Após carregar a mistura de ativador/amidita sobre a co- luna, a mistura de acoplamento foi circulada por meio de um circuito de reciclagem por 5 minutos para DNA. As a-tocoferol fosforamiditas foram dissolvidas em 10% DMF em acetonitrila. Um acoplamento estendido de 10 minutos foi usado para o ligante HEG e as a-tocoferol fosforami- ditas. Para assegurar alta eficiência de acoplamento, as soluções de amidita e ativador permaneceram sobre peneiras moleculares por pelo menos 4 a 6 horas após a preparação. A terceira etapa, sulfurização, foi realizada mediante adição de 1,2 volumes de coluna de uma solução de 0,2 M de dissulfeto de fenil acetila (PADS) em lutidina:acetonitrila (1:1). A solução foi deixada envelhecer por pelo menos 12 horas antes do uso na síntese. Foi permitido um tempo de contato de 2,0 minutos com 2,0 CV para tiolação. Para a oxidação, iodo a 0,05 M em piridina/água 90/10 foi usado. A última etapa no ciclo de alongamento, capeamento, foi con- duzida mediante adição de metade do volume da coluna de uma mistura de três reagentes de capeamento (Terminação A: Capeamento B1: Ca- peamento B2; 50/25/25; v/v/v).
[0259] Após a sequência AG9 de comprimento total ser sintetizada,
o suporte foi lavado com 2,0 CV de 20% de Dietilamina (DEA) em ace- tonitrila. Essa etapa possibilitou a remoção de grupos protetores beta cianoetila do produto enquanto o produto ainda estava fixado ao su- porte. Tabela 1 - Lista de reagentes para síntese e fornecedores LL FNT | imo [O Solução de capeamento À BIO224-1005 | asneira Solução de capeamento B1 Novabiochem BIO347-0505 o ama ca sia vv Solução de capeamento B2 Novabiochem BIO349-0505 | ssa amava O pENTPADS ESTES Se eras mma Aeon af e [Solução de ativador: 0,3 M5-benzilmercaptotetrazo! (BTT) em aceto-| Novabiochem BIO166-1005 Rs uu dd
[0260] 0,7 g de resina Unylinker'" foi colocado na coluna Akta de 6,3 mL e a coluna foi colocada em sua posição 1. A passagem de fluxo pela coluna e potenciais vazamentos da coluna foram verificados pelo teste de fluxo.
[0261] A clivagem e desproteção do oligonucleotídeo sintetizado fo- ram realizadas com o uso de hidróxido de amônio concentrado. O hidró- xido de amônio (-60 ml) foi adicionado ao oligonucleotídeo ligado ao suporte sólido e cuidadosamente agitado até que o suporte estivesse bem disperso. A mistura foi agitada a 55ºC por aproximadamente 16 horas. Decorrido o tempo estabelecido, o suporte sólido foi separado do produto contendo a solução mediante filtração em filtro de vidro sinteri- zado. O suporte sólido no filtro foi, então, lavado (3 x 20 ml) com uma solução de 50:50 (v/v) de etanol: H2O. Uma pequena alíquota da solu- ção bruta de oligonucleotídeo foi removida para análise espectral de massa, HPLC e UV.
[0262] A purificação foi realizada com o uso de cromatografia de fase reversa em um sistema de HPLC Akta Pur (GE Healthcare) e uma coluna Luna C8 Phenomenox 250*21,2 com um diâmetro interno de 21,2 cm. Lista de reagentes de purificação e fornecedores | — acetato de sódio a 20 mM, 10% AcCN feluente AU O agem temee jUCSOOCOOS
[0263] Após carregamento da amostra, a coluna foi equilibrada para 2 volumes de coluna (CV) de Eluente A. O gradiente consistiu em um segmento inicial no qual 8% de eluente B foi liberado sobre 2,0 CV para remover por dissolução qualquer amostra não ligada da coluna e, então, o gradiente foi alterado de 8% para 50% de Eluente B sobre uma exten- são de 6,0 CV. As frações foram coletadas em frascos estéreis de 50 mL e, então, analisadas por HPLC. Condições de purificação Coluna Coluna Luna C8 Phenomenox, 21,2 cm de diâmetro
Eluente À 20 mM de NaOAc, 10% AcCCN Eluente B AcCN JOEL | TIA [aperta de sags Vazão de carregamento 30 ml/min
[0264] Uma vez concluídos os dados de fração, foram preparados grupos simulados. Os grupos simulados continham todas as frações maiores que 75% FLP. Após a análise, essas mesmas frações foram agrupadas para dessalinização por ultrafiltração.
[0265] O produto bruto, frações, grupos simulados, grupos, produto dessalinizado e produto final foram analisados por RP-HPLC. O produto bruto e o produto final também foram analisados por LCMS. Os métodos foram os seguintes: Análise de AG9 por RP-HPLC Análise de AG9 por ESI/MS
[0266] Os grupos selecionados para cada lote de síntese purificado, que tinham permanecido separados até aquele ponto, foram combina- dos para a ultrafiltração. Os grupos combinados foram submetidos a concentração e dessalinização mediante o uso de ultrafiltração com um total de três membranas PES de 0,1 m? (Pall Corp). Os grupos foram concentrados até aproximadamente 2 litros e nesse ponto a dialfiltração foi iniciada. A diafiltração prosseguiu até que a condutividade do perme- ado fosse menor que ou igual a 50 uS/cm.
[0267] A liofilização foi realizada com o uso de um sistema de liofili- zação VirTis SP Scientific Bench Top Pro. A solução concentrada foi filtrada através de um filtro de 0,2 mícron e, então, distribuída de ma- neira uniforme em frascos de 50 ml e liofilizada. O produto final foi amos- trado por QC e preparado para testes in vivo.
Exemplo 2 Ensaios de ativação de TLR9 Ensaio de células repórter HEK293
[0268] As linhagens celulares hTLR9 HEK-Blue e MTLR9 HEK-Blue são linhagens celulares comerciais (Invivogen, San Diego, CA, EUA) que são transfectadas de maneira estável com um construto repórter NF-Kb-SEAP (fosfatase alcalina embrionária secretada), e TLR9 hu- mano ou TLR9 de camundongo.
[0269] 24 horas antes do início do ensaio, uma camada subconflu- ente de células foi colocada em uma placa de fundo plano com 96 po- ços. No dia do ensaio, as concentrações de titulação do composto a ser analisado são adicionadas às células e as culturas são incubadas de um dia para o outro. Nessas células, a capacidade de o composto ativar o receptor TLR9 é proporcional à concentração da molécula repórter, SEAP, no sobrenadante. A concentração de SEAP pode ser determi- nada por um ensaio colorimétrico no qual o substrato QUANTI-Blue (In- vivogen) é adicionado ao sobrenadante de cultura durante 3 horas. O substrato clivado é detectado com o uso de um espectrofotômetro a OD630 nm, e as concentrações relativas são comparadas. Ensaio de CMSPs
[0270] As CMSPs são isoladas do sangue total por centrifugação em gradiente de Ficoll. 1 x 10º CMSPs são semeadas no fundo das pla- cas de cultura com 96 poços, e as concentrações de titulação do com- posto a ser analisado são adicionadas às células. As culturas são incu- badas por 48 horas, período durante o qual os alvos celulares são indu- zidos a expressar citocinas. Os níveis de citocina são medidos por amostragem do sobrenadante e detecção de citocinas individuais com o uso de um ensaio Luminex. Além disso, as CMSPs são colhidas e coradas com o uso de anticorpos conjugados com fluorocromo direcio- nados a receptores individuais. Os níveis de expressão são medidos com o uso de um citômetro de fluxo. Ensaio de células PHH
[0271] Hepatócitos humanos primários são cultivados e infectados com hepatite B. No dia 4 após a infecção, o meio é trocado pelo meio de CMSPs tratadas com o composto (ver acima). Após 4 dias de incu- bação adicional (dia 8 após a infecção), o meio é trocado e o sobrena- dante medido para determinar a produção de HBsAg. Após mais 4 dias (dia 12 após a infecção), o sobrenadante é novamente medido para de- terminar a produção de HBsAg. Indução de citocinas in vivo
[0272] Camundongos C57BL/6 são injetados por via subcutânea ou intravenosa com o composto a ser analisado. Quatro horas depois, os camundongos são sangrados por punção da veia submandibular. As ci- tocinas séricas são medidas com o uso de um ensaio Luminex. Modelo AAV-HBV
[0273] Os camundongos C57BL/6 são infectados com partículas de AAV-HBV. Aproximadamente 1 mês após a infecção, os camundongos são injetados por via subcutânea ou intravenosa com o composto a ser analisado. A dosagem do composto é repetida quinzenalmente (a cada duas semanas) por um período de tempo especificado, tipicamente du- rante 8 semanas. Os camundongos são sangrados semanalmente. O soro é medido para vários pontos finais do teste, como HBsAg, DNA de HBV e anticorpos anti-HBs circulantes. Modelo de tumor MC38
[0274] Camundongos C57/BL6 foram implantados subcutanea- mente com 0,5 x 10º células MC38 de carcinoma de cólon e o cresci- mento tumoral foi monitorado. Quando o volume tumoral médio atinge 100 a 200 mm? (aproximadamente 12 dias após a implantação), a do- sagem é iniciada. O tamanho do tumor é monitorado a cada 3 a 4 dias. Procedimento ELISpot
[0275] Células de baço frescas foram isoladas de camundongos tra- tados que foram sacrificados em pontos predeterminados no tempo, aproximadamente 1 mês após a dose final. Os esplenócitos foram ali- quotados em triplicata em poços de placas de microtitulação a uma con- centração de 2 x 10º células/poço. Epítopos de HBV de núcleo e super- fície individuais conhecidos e peptídeos de 15 mer em sobreposição do consenso B, C e D de HBV (sobreposição de 11 aminoácidos) foram adicionados aos poços a uma concentração final de 2 ug/ml. As células foram incubadas por diferentes períodos de tempo e, então, as células ativadas foram reveladas pelo kit ELISpot Mouse IFN-y (Mabtech 3321- 2A), de acordo com as instruções do fabricante. As células ativadas fo- ram quantificadas pelo analisador de CTL-FluoroSpot.
Imageamento IVIS
[0276] Para imageamento in vivo, foram usados camundongos ma- cho da linhagem C57BI/6 de 7 a 8 semanas. Os oligonucleotídeos CpG marcados com AF647 (AG20 e AG21) foram injetados por via intrave- nosa ou subcutânea (20 nmol em volume total de 100 ul). 24 horas após a injeção, os animais foram sacrificados e o baço, nódulos linfáticos de drenagem, fígado, rins e pulmões foram excisados. Os órgãos foram imageados com o uso de IVIS (Ami HTX). Conjuntos de imagens (Ex: 605, Em: 670, f 5, 10 seg) foram coletados. O software Aura da Spectral Instruments Imaging foi usado para capturar e quantificar conjuntos de dados de imageamento por fluorescência. Uma ferramenta de Região de Interesse foi usada para medir a eficiência de radiante de cada órgão. Imunofluorescência
[0277] Camundongos macho C57BI/6 entre 7 a 8 semanas foram usados. Os oligonucleotídeos CpG marcados com AF647 (AG20 e AG21) foram injetados por via intravenosa ou subcutânea (20 nmol em volume total de 100 ul). 24 horas após a injeção, os animais foram sa-
crificados e o baço, nódulos linfáticos de drenagem, fígado, rins e pul- mões foram excisados. Os órgãos foram fixados em formalina, então cortados em um micrótomo usando procedimentos padrão. A coloração para imunofluorescência foi realizada com o uso de um aparelho de imu- nocoloração automatizado Leica Bond em nódulo linfático e baço de ca- mundongo fixados em formalina e embebidos em parafina (FFPE). À recuperação antigênica induzida por calor foi realizada com o uso do tampão de recuperação do epítopo Leica Bon 2 (solução de EDTA, pH 9,0) durante 20 minutos. A coloração foi executada com uma incubação de um dia para o outro para anticorpos primários, um anti-CD45R (B220) de rato (RA3-6B2), anticorpo eFluor 570 e anticorpo anti-CD3 de coelho. Um anticorpo secundário, IgG de coelho anti-cabra Alexa Fluor Plus 488 foi aplicado e lâminas foram montadas com DAPI em Fluprogel || para visualização nuclear. HPLC e ligação a proteínas séricas
[0278] Um sistema de HPLC Ultimate-3000 equipado com detecto- res de UV e fluorescência foi usado para a análise. Amostras de oligo- nucleotídeos, proteínas e misturas de oligonucleotídeo — proteína foram preparadas em 1X STF (salina tamponada com fosfato) com 20 mM KCL e analisadas por cromatografia de exclusão de tamanho. Para en- saios de formação de micelas, os oligonucleotídeos foram preparados em uma solução de ureia 2M ou 4M ou STF. As amostras foram injeta- das em uma coluna Superdex Increase 75 (GE Healthcare). Uma fase móvel de 1X STF com 20 mM. KCL a 0,075 ml/min foi usado para a cromatografia e a coluna de exclusão de tamanho foi mantida à tempe- ratura ambiente. Cromatogramas de UV foram registrados a 260, 280 e 500 nm. O comprimento de onda de excitação de 490 nm e o compri- mento de onda de emissão de 530 nm foram usados para obter croma- togramas pelo detector de fluorescência. Exemplo 3
Fosfodiésteres em uma atividade potencializada por CpG ODN
[0279] Com base na literatura, o 9-TCGTCGTTTTGTCGTTTTG- TCGTT-3' prototípico (ODN2006) pode estimular células humanas e de camundongo que expressam TLR9. Essa sequência tem uma cadeia principal de fosforotioato (ps) para estabilidade in vivo. As ligações ps nos motivos CpG de ODN2006 (5-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT- 3') foram substituídas por ligações fosfodiéster (po), e a ativação de TLRS9 foi avaliada. Os resultados mostrados na Figura 1, demonstram que a substituição de 3 ou 4 das ligações ps dos motivos CpG por liga- ções po resultou em construtos ODN altamente ativos tendo atividade agonística para TLR9. A versão de ODN2006, que tem todas as quatro ligações ps dos motivos CpG substituídas por ligações po (AG1), tem um valor EC50 2 a 3 vezes menor que o de ODN2006, e uma atividade máxima 20 a 35% maior que a de ODN2006. Uma atividade similar a AG1 foi observada em AG2 e AG3 que têm 3 ligações ps dos motivos CpG substituídas por ligações po. Esse experimento demonstra que a substituição de po na cadeia principal dos motivos CpG intensifica as propriedades agonísticas do oligonucleotídeo. Exemplo 4 Ligação direta de colesterol a uma atividade a uma atividade anulada por CpG ODN
[0280] Os oligonucleotídeos foram conjugados a várias porções que possibilitariam a distribuição diferencial do oligo. Por exemplo, acredita- se que o colesterol e o tocoferol sejam moléculas lipofílicas que se con- centram no fígado. Quando o colesterol! e o tocofero! foram diretamente conjugados à extremidade 5' ou 3' do CpG ODN, a molécula resultante não ativou as células que expressam o TLR9 (dados não mostrados). Esses experimentos demonstraram que a conjugação direta de um com- posto na extremidade do oligonucleotídeo poderia afetar sua capaci- dade de agonizar o TLR9.
Exemplo 5 Colesterol indiretamente conjugado por meio de um ligante clivável a uma atividade potenciada por CpoG ODN
[0281] Devido aos possíveis efeitos estéricos, a conjugação de uma porção lipofílica proximal ao oligonucleotídeo pode ter anulado a capa- cidade de a molécula se ligar ao receptor de TLR9. Para explorar essa possibilidade, o colesterol foi conjugado a construtos de ODN que ti- nham atividade agonística para TLR9, também chamados aqui de ago- nistas de TLR9, como uma porção de direcionamento usando um ligante clivável, e a ativação de TLR9 foi avaliada. Os resultados, mostrados na Figura 2, indicam que a conjugação de uma porção de direcionamento aos agonistas de TLR9 através de um ligante clivável preserva sua ati- vidade agonística.
[0282] Por exemplo, um agonista de TLR9 chamado de AG8 foi pro- jetado com o uso de um ligante clivável para separar o colesterol do CpG ODN de AG1. O ligante para AG8 era (HEG)po(HEG)po-. Quando as células hNTLR9 HEK-Blue foram estimuladas com AGB8, a atividade foi potencializada em relação ao original não conjugado, AG1. O AG8 apre- sentou um valor de EC50 2 a 3 vezes menor do que o do AG1, e mais de 9 vezes menor do que o ODN2006. A atividade máxima de AG8 foi aproximadamente 10% maior que a de AG1, e aproximadamente 50% maior que a do ODN2006. Foram testados análogos de AG1 que foram ligados ao colesterol da mesma maneira que AG8. AB4, AG5, AG6 e AG7 têm O, 1,2 e 3 (respectivamente), ps dos motivos CpG substituídas por po. Conforme mostrado na Figura 2, quanto maior o número de mo- tivos CpG com ligações po maior é a atividade. O AG4 tem uma cadeia principal ps completa e é conjugado ao colesterol através de um ligante indireto. O AG5 é similar a AGA4, mas tem um 1 motivo CpG substituído por uma ligação po. Esses dois compostos têm atividade similar no en- saio celular de hTLR9 KEK-Blue, com seu EC50 sendo de 6,4 a 10 nM.
AG6 e AG7 têm 2 e 3 motivos CpG substituídos por ligações po, e seus EC50 foram de aproximadamente 4,5 nM e 2,6 nM, respectivamente. Esse experimento demonstrou que ao se conjugar uma porção de dire- cionamento indiretamente através de um ligante clivável, a atividade do farmacóforo é preservada. Exemplo 6 Tocoferol indiretamente conjugado por meio de um ligante clivável re- sulta em atividade potencializada por CpG ODN
[0283] Para testar a versatilidade da estratégia de conjugação, o to- coferol foi conjugado a um agonista de TLR9 com o uso de um ligante clivável. Por exemplo, o agonista de TLR9 chamado de AG9, cuja sín- tese é descrita no Exemplo 1 acima, foi projetado com o uso de um |i- gante clivável para separar tocoferol do oligonucleotídeo de AG1. O li- gante para AG9 foi o (HEG)po(HEG)po-. Quando as células hTLR9 HEK-Blue foram estimuladas com AG9, a atividade foi equivalente à do AGB8 conjugado ao colesterol (dados não mostrados). Esses experimen- tos demonstraram que diferentes porções de direcionamento poderiam ser conjugadas ao CpG ODN, e que o CpG ODN poderia reter a ativi- dade. Exemplo 7 Conjugação indireta com o uso de um ligante clivável na extremidade 5' ou 3' de um CpG ODN resultou em atividade equivalente
[0284] Para testar a polaridade da porção conjugada, o colesterol ou tocoferol foi conjugado à extremidade 3' de um ODN de TLR9 com o uso de um ligante clivável. Por exemplo, um agonista de TLR9 chamado de AG10 foi projetado com o uso de um ligante clivável, - po(HEG)po(HEG), para separar o colesterol da extremidade 3' do oligo- nucleotídeo de AG1, e um agonista de TLR9 chamado de AG11 foi pro- jetado com o uso de um ligante clivável, -po(HEG)po(HEG), para sepa-
rar o tocoferol da extremidade 3' do oligonucleotídeo de AG1. A ativi- dade dos conjugados foi analisada com o uso do hTLR9 HEK-Blue. Con- forme mostrado na Figura 3, AG8 e AG10, que tinham um colesterol indiretamente conjugado às extremidades 5' ou 3' do CpG ODN respec- tivamente, apresentaram atividade equivalente.
[0285] Curiosamente, em células hTLR9 HEK-Blue, AG10 e AG11 apresentaram atividade similar a de seus homólogos conjugados na ex- tremidade 5' AG8 e AG9, respectivamente. Entretanto, eles não se mos- traram ativos em células MTLR9 HEK-Blue, indicando que a polaridade do conjugado é importante para o reconhecimento pelo receptor de TLR9 de camundongo mas não pelo receptor de TLR9 humano (AG8 e AG10 são mostrados na Figura 3, dados não mostrado para AG9 e AG11).
[0286] Para testar os efeitos dos sítios de clivagem dentro do li- gante, análogos de AG9 foram sintetizados nos quais os sítios de cliva- gem de fosfodiéster foram substituídos por ligações fosforotioato que são resistentes à clivagem. Conforme ilustrado na Figura 12, o AG1I2 tem ligações fosforotioato não cliváveis substituindo as ligações fosfodi- éster cliváveis entre o oligo e o ligante, entre a porção de tocoferol e o ligante, e entre as moléculas de HEG do ligante. Acredita-se que essa molécula não pode ser clivada com eficiência e que a molécula completa irá interagir com o TLR9. O AG13 tem ligantes fosforotioato não cliváveis que substituem as ligações fosfodiéster cliváveis entre o ligante e o oligo. Acredita-se que após a clivagem, parte do ligante permaneça |i- gada ao oligo. O AG14 tem ligantes fosforotioato não cliváveis que subs- tituem as ligações fosfodiéster cliváveis entre o ligante e o tocoferol. Acredita-se que após a clivagem, o tocoferol é removido e todo o ligante permanece ligado ao oligo. O AG16 é uma variante de AG1 que é con- jugada a tocoferol por meio de uma ligação fosforotioato. O AG15 é uma variante de AG1 que é conjugada ao tocoferol por meio de uma ligação fosforotioato e que tem uma ligação fosforotioato entre as bases 21 e
22.
[0287] Todos os análogos que retiveram qualquer porção do ligante e/ou de tocoferol apresentaram atividade reduzida no ensaio de células repórter HEK-Blue, conforme mostrado nas Figuras 19 e 20. Em parti- cular, foi demonstrado que a conjugação direta de uma porção de dire- cionamento (como tocoferol) com um oligo, conforme representado pe- los construtos AG15 e AG16, anulou a atividade agonista de TLR9 (da- dos não mostrados). A conjugação do oligo ao tocoferol através de um ligante clivável preservou a atividade agonista de TLR9 do oligo, e a atividade ideal foi obtida quando tanto o tocoferol como o ligante foram clivados (Figura 19). Os dados sugerem que após sofrer endocitose pela célula, o ODN é liberado por clivagem do ligante e da porção de direci- onamento, e que essa liberação é necessária para uma atividade total. Resultados similares foram obtidos com colesterol ou ácido palmítico foram conjugados ao oligo por este método. Os resultados sugerem que qualquer molécula, como um peptídeo, proteína, toxina, molécula orgâ- nica ou inorgânica, etc., pode ser conjugada ao oligo com o uso dessa estratégia de ligante clivável.
[0288] Com o uso de células repórter MTLR9 HEK-Blue, descobriu- se que o AG9 também ativou o TLR9 de camundongo e alcançou ativi- dade similar ao AG1 original não conjugado e superior a ProMune, um ODNZ2006 contendo um fosforotioato completo não modificado, nas cé- lulas repórter, indicando que o AG9 poderia ser usado em modelos ca- mundongo in vivo (Figura 20). Os resultados indicam que em um ago- nista de TLR9, de acordo com uma modalidade da presente invenção, um ligante clivável é preferencial para otimizar sua capacidade estimu- ladora de TLR9. Exemplo 8 Análise in vivo de agonistas de TLR9
[0289] Camundongos foram injetados por via subcutânea com 7,6 a 10,8 mg/kg dos agonistas de TLR9 AG8 e AG10 e sangrados 4 horas mais tarde. O AG8 é conjugado a colesterol e a um ligante clivável na extremidade 5' do oligo, e o AG10 é conjugado a colesterol e a um |li- gante clivável na extremidade 3' do oligo. As amostras coletadas foram analisadas quanto aos níveis de citocina com o uso de um ensaio Lumi- nex. Os resultados mostrados na Figura 4 indicam que os agonistas de TLR9 induziram a produção de citocina in vivo. Esses experimentos in- dicaram que, conforme observado in vitro com o ensaio de células re- pórter MTLR9 HEK-Blue, a polaridade do ligante e do colesterol! foi im- portante na capacidade de o AG10 agonizar TLR9. Embora o AG10 ti- vesse pouca atividade in vivo, o AG8 poderia induzir citocinas pró-infla- matórias como IL-6, TNFa e MIP-1b após a dosagem. De forma notável, os níveis de citocinas produzidos foram, em média, mais altos que os de ODN2006 de controle, e similares aos de ODN1826. Dessa forma, o CpG ODN conjugado a colesterol é ativo in vivo. Exemplo 9 Análise do efeito de agonistas de TLR9 sobre camundongos infecta- dos por AAV-HBV
[0290] Um desenho esquemático de um experimento executado para analisar o efeito de agonistas de TLR9 sobre infecção por HBV em camundongos é mostrado na Figura 5.
[0291] Os camundongos que foram injetados com o vírus AAV-HBV no Dia 28 foram dosados com veículo ou agonistas de TLR9 e avaliados quanto aos níveis de indicadores de HBV. Os camundongos receberam uma dose única no Dia O ou múltiplas doses nos Dias 7, 21, 35 e 49. Como referência, um grupo de camundongos foi dosado por via oral com GS9620, um agonista de molécula pequena de TLR7. Todos os camundongos foram avaliados quanto ao nível de DNA de HBV (con- sulte a Figura 6), HBSaG (o antígeno de superfície de HBV; consulte a
Figura 7), e HBeAg (o antígeno de envelope do HBV; consulte a Figura 8). Os resultados indicaram que a administração dos agonistas de TLR9 suprimiu com sucesso o DNA de HBV, HBsAg e o HBeAg em camun- dongos administrados com AAV-HBV.
[0292] Os camundongos que foram injetados por via subcutânea com o agonista AG8 de TLR9 foram avaliados quanto à produção de citocina induzida. Os resultados, mostrados na Figura 9, indicam que 3 nmol do agonista AG8 de TLR9, que não produziram reações no sítio de indução, induziram níveis de citocina similares ao do agonista AG10 de TLR9.
[0293] Os camundongos que foram injetados por via intravenosa (IV) com o agonista AG8 de TLR9 foram avaliados quanto à produção de citocina induzida. Os resultados, mostrados na Figura 10, indicam que 15 nmol do agonista AG8 de TLR9 induziram níveis de citocina. Os camundongos injetados por via IV também foram analisados quanto à carga viral de HBV. Conforme mostrado na Figura 11, a dosagem |V com AG8 reduziu a carga viral de HBV.
[0294] Esses experimentos demonstraram que o AG8, seja como uma dose única, ou administrado a cada duas semanas durante 8 se- manas poderia suprimir a carga viral. Exemplo 10 Agonistas de TLR9 induziram um perfil de citocinas diferencial
[0295] Camundongos C57BL/6 naive foram injetados com os ago- nistas AG1, AG8 e AG9 de TLR9, respectivamente. O soro foi amos- trado 4 horas após a injeção e medido para determinação de citocinas através de um ensaio Luminex.
[0296] Conforme mostrado pelos resultados na Figura 9, tanto o AG8 como o AG9 apresentaram aumento de atividade na indução de citocinas IL-12p40, IL-6 e M1P1b, e ambos ativaram um perfil de citocina diferente daquele da molécula original, AG1 (dados não mostrados). Um padrão similar de indução também foi observado para outras citocinas, por exemplo, IL-12p70, I1L-10, G-CSF, IFN-g, IFN-a, TNF-a (dados não mostrados). A indução de citocina foi dependente da dosagem (Figura 10). Exemplo 11 AG9 induz níveis mais altos de a-HBsAg do que o AG1
[0297] Os camundongos foram imunizados por via subcutânea ou intravenosa com 10 ug de HBsAg recombinante em combinação com nmol de AG1 ou AG9. Sete dias depois, os camundongos foram san- grados e as concentrações séricas de anticorpos específicos para HBsAg foram quantificadas por ELISA.
[0298] Conforme mostrado na Figura 11, com a administração por via subcutânea houve, em média, um aumento de 1,65 vezes nos níveis de a-HBsAg entre camundongos administrados com AG1 (0,332 AU) e AG9 (0,551 AU). Com a administração por via intravenosa, a quantidade de anticorpos específicos para HBsAg induzidos por AG9 (1,41 AU) foi 2,5 vezes maior que a quantidade de anticorpos induzidos por AG1 (0,59 AU) (p<0,009). Isso sugere que a conjugação de tocoferol no oli- gonucleotídeo aumenta a atividade imunoestimuladora para amplificar o processo de imunização. Além disso, a administração intravenosa do CpG ODN conjugado a tocoferol foi muito mais eficaz em induzir uma resposta humoral do que a administração subcutânea, ou a administra- ção intravenosa do original não conjugado, AG1. Este resultado sugere que o tocoferol afeta a biodistribuição do CpG ODN que resulta em ati- vidade intensificada na resposta humoral. Exemplo 12 Conjugação de agonistas de TLR a porções lipofílicas através de ligan- tes cliváveis alcançou curas funcionais em camundongos infectados por AVV-HBV
[0299] Camundongos C57BL/6 naíve foram infectados com AAV-
HBV. Uma vez estabelecida a infecção, os camundongos foram dosa- dos por via intravenosa ou subcutânea a cada duas semanas, com 15 ou 30 nmol do conjugado de tocoferol AG9 ou do original, AG1.
[0300] Embora os camundongos infectados respondessem à admi- nistração por via subcutânea de qualquer um dos compostos, uma re- dução nos níveis de DNA de HBV ou HBsAg circulantes foi transitória, e Os níveis se recuperaram após duas semanas (Figura 13 A&B).
[0301] A administração intravenosa repetida de 15 nmol de AG9 foi mais potente do que a do original AG1, conforme medido pela capaci- dade de reduzir os níveis de DNA de HBV e HBsAg circulantes para valores inferiores ao nível mais baixo de quantificação. Além disso, após o período de tratamento, os camundongos foram monitorados quanto à recuperação viral. Os camundongos tratados com AG9 obtiveram uma resposta duradoura, com supressão estável de HBsAg e recuperação mínima dos níveis de DNA de HBV observada 1 mês após a dose (Fi- gura 13 A&B). Isso foi acompanhado pela indução de anticorpos para a-HBsAg na maioria dos camundongos, e pela indução de CTLs (linfó- citos T citotóxicos) específicos para HBsAg em alguns camundongos. Em contrapartida, 3/5 camundongos tratados com o original, AG1, obti- veram uma resposta duradoura, acompanhada de soroconversão de anticorpo para a-HBsAg e desenvolvimento de CTLs específicos para HBsAg. 2/5 camundongos tratados com AG1 não apresentaram soro- conversão. A administração intravenosa pareceu ser mais eficaz do que a administração subcutânea.
[0302] A análise do anticorpo para a-HBsAg revelou que mais ca- mundongos tratados com AG9 apresentaram soroconversão e, em mé- dia, tiveram maiores concentrações circulantes de anticorpo para a- HBsAg em comparação com os camundongos tratados com o original, AG1. Esses resultados demonstram que o oligonucleotídeo CpG conju-
gado com tocoferol AG9 tinha maior capacidade de produzir curas fun- cionais em camundongos infectados por AAV-HBV do que o original não conjugado, AG1.
[0303] Para testar se a eficácia intensificada poderia se aplicar a outras porções lipofílicas, sintetizou-se o AG19 no qual foi substituído tocoferol| por palmitoíla. Experimentos in vitro na lihhagem HEK-hTLR9 confirmaram que o AG19 tinha atividade similar ao AG9 (dados não mostrados). Repetiu-se o regime de dosagem em camundongos infec- tados por AAV-HBV como antes, com AG19. Os camundongos foram dosados por via subcutânea ou intravenosa a cada 2 semanas durante 14 semanas com 15 nmol de composto. Quando administrado por via intravenosa (Figura 13C), o AG19 foi tão eficaz quanto o AG9 na redu- ção dos níveis de HBsAg e DNA de HBV circulantes. Após o período de tratamento, os níveis de HBsSAg permaneceram abaixo do limite de quantificação, e os níveis de DNA de HBV foram suprimidos de modo estável. De modo similar aos camundongos tratados com AG9, a su- pressão da carga viral foi acompanhada por uma indução robusta de anticorpo para a-HBsAg.
[0304] No final do estudo, mediu-se a resposta de CTL específica para HBV através de ELISpot. Qualificou-se o número de CTLs respon- sivos a peptídeos de HBsAg e descobriu-se que os camundongos que eram tratados com AG9 e AG19 tinham números significativamente mai- ores de CTL para a-HBs, em comparação com camundongos tratados com STF ou AG1 original (Figura 13D). Dessa forma a conjugação de CpG ODNs a porções lipofílicas, como tocoferol ou palmitoíla, acentuou as propriedades agonísticas do ODN. Foram geradas respostas humo- rais e celulares específicas para HBV que suprimiram a carga viral mesmo após a retirada do fármaco. Por definição, AG9 e AG19 foram capazes de estabelecer uma cura funcional no indivíduo infectado por HBV.
Exemplo 13 AG9 alcança regressão tumoral completa e controle do tumor no mo- delo de tumor MC-38
[0305] Camundongos C57BL/6 naive foram implantados com célu- las MC-38 de carcinoma de cólon e o tamanho do tumor foi monitorado. Após o tumor ser estabelecido, os camundongos foram dosados por via intratumoral ou intravenosa com quantidades crescentes do conjugado de tocoferol AG9 ou do AG1 original. AG14, um outro CpG ODN tendo a sequência de TpsCpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsApsCpsGpsTpsApsAp- sCpsGpsApsCpsGpsApsCpsGpsTpsT, também foi testado. As doses usadas foram de 40 ug, 120 ug e 360 ug, correspondendo a 1,6 mpk, 4,8 mpk e 14,4 mpk, respectivamente. Quando os camundongos foram tratados por via intratumoral, eles rece- beram 4 doses durante 10 dias (d12, d15, d19 e d22 após a implanta- ção). Quando os camundongos foram dosados por via intravenosa, eles receberam 2 doses, com intervalo de 7 dias (d12, d19 após a implanta- ção). O crescimento tumoral foi monitorado a cada 3 dias. Consulte a Figura 14 para obter informações adicionais sobre o estudo.
[0306] A dosagem intratumoral de AG1 ou AG9 teve eficácia equi- valente (dados não mostrados). Na dose de 40 ug de cada grupo, um camundongo teve regressão completa do tumor, e os camundongos res- tantes apresentaram retardo no crescimento tumoral. Na dose de 120 ug de cada grupo, três camundongos tiveram regressão completa do tumor, e dois apresentaram retardo no crescimento tumoral. Na dose de 360 ug de AG1, três camundongos tiveram regressão completa e um camundongo apresentou retardo no crescimento tumoral. Na dose de 360 ug de AG9, dois camundongos tiveram regressão completa e os camundongos restantes tiveram estase do tumor.
[0307] Conforme mostrado pelos resultados na Figura 15, quando administrado por via intravenosa, o AG9 foi mais eficaz que o AG1 e o AG14. Na dose de 40 ug de cada grupo, três camundongos tratados com AG9 apresentaram retardo no crescimento tumoral, ao passo que dois camundongos tratados com AG1 apresentaram retardo no cresci- mento tumoral. Na dose de 120 ug, três camundongos tratados com AG9 tiveram regressão completa do tumor e os outros dois camundon- gos apresentaram retardo no crescimento tumoral. Um camundongo no grupo tratado com AG1 teve regressão completa do tumor e os outros quatro camundongos apresentaram retardo no crescimento tumoral. Na dose mais alta de 360 ug, todos os camundongos que receberam AG9 tiveram regressão completa do tumor. Em camundongos tratados com AG9, não se observou qualquer absorção ou crescimento tumoral mesmo após os camundongos serem novamente desafiados com célu- las tumorais MC-38 no dia 40 após a implantação do tumor inicial. Dos camundongos que receberam AG1, quatro dos cinco camundongos ti- veram regressão completa do tumor e um deles apresentou retardo no crescimento tumoral. Esses dados demonstram que a administração de CpG ODNs para ativar TLR9 in vivo tem benefícios terapêuticos no tra- tamento de câncer. Além disso, a conjugação de tocoferol por um ligante clivável ao CpG ODN pode intensificar seu benefício terapêutico. No contexto do MC38, o AG9 estimulou a resposta imunológica que resul- tou na depuração tumoral e uma resposta de memória que impediu a reimplantação do tumor. A imunomodulação com o uso de AG9 foi ca- paz de ativar uma resposta antitumoral e possibilitou a formação de uma memória de resposta que forneceu proteção contra quaisquer outras re- corrências do tumor. Exemplo 14 Estudo de DMT/eficácia com AG9
[0308] Camundongos C57BL/6 naive foram implantados com célu- las MC-38 de carcinoma de cólon e o tamanho do tumor foi monitorado.
Após o tumor ser estabelecido, por exemplo, com um volume tumoral médio de 100 a 200 mm?, os camundongos são dosados por via intra- tumoral ou intravenosa com quantidades crescentes de conjugado de tocoferol AG9 ou do AG1 parental (Figura 16). Os camundongos são dosados por via intravenosa uma vez por semana durante duas sema- nas (qwk x 2), por exemplo, no dia 12 e no dia 19, ou dosados uma vez por via intratumoral (diariamente (qd) x 1) no dia 12.
[0309] O objetivo principal do estudo é determinar a dose máxima tolerada (DMT) de AG9, dosado uma vez por semana x 2, em camun- dongos portadores de tumor MC-38. O objetivo secundário do estudo é determinar a eficácia de AG9, dosado uma vez por semana x 2, em tu- mores.
[0310] Os grupos (uma vez por semana (qwk) x 2 e diariamente (qd) x 1, n=5/grupo) e dose são os seguintes: “emu n Composto .Doseímptly Grupo n Composto — Dose(mpk) IA Velmb o E 2 10 AG9 16 7 5 CPG7909 14 " 3 10 AG9 4,8 8 5 CPG7909 41 $ 4 10 AG9 14,4 9 5 CPG7909 12,3 & 5 5 AG9 28,9 10 5 CPG7909 24,6 z 6 5 AG9 43,3 EE 5 CPG7909 36,9 " 12 3 Veículo 8 13 3 AG9 16 Ss 14 3 Exec) 48 28 5 3 AG9 144
[0311] Os camundongos e o crescimento tumoral são monitorados. Exemplo 15 Outros modelos de tumor
[0312] O AG9 foi testado no modelo camundongo de tumor CT26 de câncer de próstata. Camundongos da linhagem BALB/C foram im- plantados por via subcutânea com 3x10º células de tumor CT26 no flanco e o crescimento tumoral foi monitorado a cada 3 a 4 dias. Quando o volume tumoral médio atinge 75 a 125 mm? (aproximadamente 12 dias após a implantação), a dosagem é iniciada. Os camundongos foram im- plantados com duas doses, uma vez por semana (Q1W), de 40 nmol de
AG1 ou AG9. Após 40 dias de monitoramento, todos os 8 camundongos dosados com AG9 estavam livres de tumor. Em contrapartida, 7/8 ca- mundongos que receberam AG1 ou 8/8 camundongos que receberam STF apresentaram tumores e foram submetidos à eutanásia quando os volumes tumorais excederam 1000 mm?º.
[0313] O AG9 foi testado no modelo de camundongo de tumor A20 de linfoma. Camundongos BALB/C foram implantados por via subcutâ- nea com 1x10º células tumorais de linfoma AZO0 no flanco e o cresci- mento tumoral foi monitorado a cada 3 a 4 dias. Quando o volume tu- moral médio atinge 75 a 125 mm? (aproximadamente 19 dias após a implantação), a dosagem é iniciada. Os camundongos receberam duas doses, uma vez por semana (Q1W), de 40 nmol de AG9. Os camundon- gos foram monitorados durante 60 dias. Ao final do período de monito- ramento, 50% dos camundongos estavam livres do tumor. Nos outros 5 indivíduos, houve retardo no crescimento tumoral. 2/10 camundongos experimentaram uma carga tumoral de aproximadamente 300 mm? e foram submetidos à eutanásia por volta do dia 30. Um camundongo ex- perimentou uma carga tumoral de aproximadamente 1000 mm? por volta do dia 40. Um camundongo experimentou uma carga tumoral de apro- ximadamente 300 mm? e foi submetido à eutanásia por volta do dia 50. Um camundongo experimentou uma carga tumoral de aproximada- mente 1000 mm? e foi submetido à eutanásia por volta do dia 50. Em contrapartida, 8/8 camundongos tratados com STF experimentaram car- gas tumorais superiores a 1500 mm? antes do Dia 20 e foram submeti- dos à eutanásia.
[0314] Em resumo, esses experimentos demonstram a eficácia dos construtos de ODN revelados como o AG9 para tratar vários cânceres como carcinoma colorretal, câncer de próstata e linfoma. Exemplo 16 Ensaio de célula B
[0315] Esplenócitos de camundongo foram isolados de camundon- gos da linhagem C57BL/6 e, então, as células B foram purificadas com O uso de uma coluna de separação de células por microesferas magné- ticas MACS, seguindo o protocolo do fabricante. 1 x 10º células B foram estimuladas com a concentração indicada de oligonucleotídeo a 37ºC por 48 horas. As células foram, então, coradas com anticorpos especí- ficos para marcadores de ativação, como CD40 por 30 minutos e, então, lavadas três vezes com tampão FACS (STF + 3% SFB). As células fo- ram, então, analisadas por citometria de fluxo seguindo os métodos pa- drão. A intensidade de superfície dos marcadores foi quantificada atra- vés de intensidade de fluorescência média. Os resultados desse ensaio são apresentados na Figura 18. Comparou-se o AG9 e seu AG1 original, e o AG18, um tocoferol conjugado através de ligante indireto, ao AG17, e seu AG17 original. As células B de camundongo foram responsivas a todos os agonistas testados, e a regulação positiva de CD40 foi obser- vada após a estimulação pelos agonistas de forma dose-dependente. De forma notável, em 0,016 uM, os AG9 e AG18 de ODN conjugado a tocofero| foram mais potentes que seus respectivos homólogos não con- jugados, AG1 e AG17. Esse experimento demonstrou que as células B podiam ser diretamente estimuladas pelos ODNs conjugados a tocofe- rol, e que a conjugação ao tocofero! potencializou a atividade agonística. Exemplo 17 A conjugação de agonistas de TLR ao tocoferol através de ligantes cli- váveis facilita a biodistribuição in vivo a regiões específicas dentro de órgãos linfoides secundários
[0316] Para determinar se a conjugação ao tocoferol| afetaria as pro- priedades de biodistribuição in vivo do CpG ODN, os camundongos fo- ram injetados com AG21 (que é um análogo de AG9 conjugado a Ale- xaFluor 647) ou AG20 (que é um análogo de AG1 conjugado a Alexa- Fluor 647) por via subcutânea ou intravenosa. 24 horas após a injeção,
baço, nódulos linfáticos de drenagem, fígado, rins e pulmões foram ex- cisados e imageados com o imageador IVIS. Conforme mostrado na Fi- gura 21A, quando AG21 foi injetado por via subcutânea, ele se concen- trou no nódulo linfático de drenagem em comparação com AG20. Quando quantificada, havia mais de 2 vezes a diferença entre a concen- tração de AG21 e a do AG20. Na Figura 21B, os baços foram quantifi- cados 24 horas após a injeção intravenosa de qualquer um dos com- postos. Após administração intravenosa, o tocoferol afetou a biodistri- buição do composto e com o uso de IVIS a maior parte do AG21, mas não do AG20, foi visualizada no baço, fígado e, em menor extensão, no rim (dados não mostrados). No baço, houve um aumento de quase 10 vezes na quantidade de concentração de AG21 em comparação com AGZ2O0. Após administração subcutânea ou intravenosa, o AG21 concen- trou-se em órgãos linfoides secundários, como os nódulos linfáticos de drenagem ou baço, onde está posicionado para ativar células do sis- tema imune. Esses experimentos demonstram que a conjugação de to- coferol afeta drasticamente a sua biodistribuição.
[0317] Para visualizar a distribuição de AG21 dentro dos órgãos lin- foides secundários, repetiu-se o experimento, embeberam-se os nódu- los linfáticos e o baço em parafina, seccionaram-se os mesmos, e visu- alizou-se a concentração de ODN por imunofluorescência. Os tecidos foram corados com anticorpos dirigidos contra células T ou células B. Após injeção subcutânea foi observada intensa coloração de AG21 den- tro da região folicular da célula B do nódulo linfático (dados não mostra- dos). Curiosamente, após injeção intravenosa, foi observada intensa co- loração de AG21 nas regiões extrafoliculares. Em camundongos trata- dos com AG1, foi observada coloração de ODN fraca mas detectável. Esses resultados reafirmam que a conjugação de tocofero|l ao CpG ODN concentra o ODN eficazmente nos órgãos linfoides secundários e, mais especificamente, em regiões isoladas dentro do microambiente.
[0318] Para caracterizar os tipos de células que se ligaram a AG21 no baço após injeção intravenosa, foram colhidos os baços, foram dis- sociados os mesmos e, então, foram corados com anticorpos marcados fluorescentemente dirigidos a marcadores celulares específicos para di- ferenciá-los. Com o uso de citometria de fluxo, observou-se que as cé- lulas dendríticas e macrófagos, e em menor proporção, as células B fo- ram todas positivas para AG21 (dados não mostrados). As células T foram negativas para AG21. Dessa forma, as células que foram positi- vas para AG21 coincidiram com células que expressam o TLR9. Esse experimento demonstrou que a administração do CpG ODN conjugado a tocoferol, sendo o conjugado, de preferência, dirigido aos órgãos lin- foides secundários e dentro desses órgãos, o conjugado foi captado, de preferência, pelas células desejadas, ou seja, células dendríticas, ma- crófagos e células B. Exemplo 18 A conjugação de agonistas TLR a porções lipofílicas através de ligan- tes cliváveis facilita a ligação às proteínas séricas como albumina.
[0319] Foi interessante observar um padrão de distribuição assimé- trico de AG21 para alguns órgãos como o fígado e o baço, mas não para outros, como os rins e o pulmão, ambos vascularizados. A hipótese é que o tocofero| poderia facilitar a ligação a proteínas séricas e, com base na distribuição de receptores sequestrantes, isso determinaria a locali- zação preferencial do CpG ODN conjugado ao tocoferol. Foi testada essa possibilidade in vitro. Análogos de AG1 e AG9 conjugados a FITC foram gerados. O AG22 é um análogo de AG1 com FITC conjugado na extremidade 3'. De modo similar, o AG23 é um análogo do conjugado de tocoferol AG9 com FITC conjugado na extremidade 3º. Os compostos foram carregados em HPLC, sendo então monitorada a fluorescência do FITC (Figura 22A). Os compostos foram usados sozinhos ou pré- misturados com BSA (albumina sérica bovina). Observou-se que o
AG23 conjugado a tocoferol, mas não o AG22, teve um tempo de reten- ção idêntico ao da BSA, quando presente. Esse experimento demons- trou que o tocoferol poderia facilitar a ligação do CpG ODN a proteínas séricas como a BSA. Esse complexo poderia explicar, em parte, a dis- tribuição preferencial do CpG ODN conjugado a tocoferol a órgãos lin- foides secundários e ao fígado.
[0320] Cogitou-se em seguida se a capacidade de ligação a proteí- nas séricas era uma característica exclusiva da conjugação de tocoferol. Foi sintetizado um análogo do composto palmitoilado AG19. O AG24 é um CpG ODN que é conjugado a palmitoíla através de um ligante clivá- vel na extremidade 5' e conjugado a FITC na extremidade 3". Repetiu- se o experimento acima misturando AG24 ou AG2? a soro fetal bovino (SFB) e, então, analisou-se a mistura através de HPLC e monitorou-se o tempo de retenção do ODN pelo seu sinal fluorescente. Conforme mostrado na Figura 22B, o tempo de retenção de AG24, mas não de AG22, foi idêntico ao de SFB. Isso demonstrou que a conjugação de CpG ODN a palmitoíla facilitou a interação do ODN às proteínas séricas. Exemplo 19 A conjugação de agonistas de TLR ao tocoferol através de ligantes cli- váveis facilita a autoformulação em estruturas micelares
[0321] Devido à natureza lipofílica do tocoferol, também foi testada a capacidade de conjugação ao tocoferol de facilitar a formação de mi- celas do CpG ODN. Ao monitorar o AG23 na HPLC com o uso do sinal fluorescente de FITC, descobriu-se que na presença de altas concen- trações (2 ou 4 M) de ureia, que interrompe a formação de micelas, o tempo de retenção de AG23 foi alterado, ao passo que o tempo de re- tenção do AG22 não foi afetado (Figura 23). Esses resultados demons- traram que a conjugação de tocoferol do CpG ODN conferiu a proprie- dade de formação de micelas ao ODN.
[0322] Embora a presente invenção tenha sido descrita em detalhes e com referência a modalidades específicas da mesma, ficará evidente para o versado na técnica que várias alterações e modificações podem ser feitas sem que se afaste do espírito e do escopo da presente inven- ção.

Claims (20)

REIVINDICAÇÕES
1. Construto de CpG ODN, caracterizado por ter a fórmula: Fórmula (Ila): 5' M-L-[CpG ODN] 3', ou Fórmula (IIb): 5 [CpG ODN]-L-M 3' em que: M representa uma porção lipídica, de preferência, a porção lipídica compreende pelo menos uma porção lipídica selecionada do grupo que consiste em colesterol, tocoferol, um grupo palmitoíla, e um grupo estearila; L representa um ligante que compreende de 10 a 100 áto- mos selecionados do grupo que consiste em carbono, nitrogênio, oxigê- nio, hidrogênio, enxofre e fósforo, em que L é ligado covalentemente ao CpG ODN através de uma ligação clivável, de preferência, por meio de uma ligação éster ou amida; e CpG ODN compreende pelo menos um motivo CpG tendo uma ligação internucleotídica po (fosfodiéster), compreende, de prefe- rência, pelo menos dois, três ou quatro motivos CpG, tendo cada um a ligação internucleotídica po; opcionalmente, o construto de CpG ODN da Fórmula (Ila) ou (Ilb) é adicionalmente covalentemente conjugado a uma porção de dire- cionamento, que é, de preferência, selecionada do grupo que consiste em galactose N-acetilgalactosamina (GalNAc), fucose, manose, ácido siálico e ácido N-acetil neuramínico.
2. Construto de CpG ODN, caracterizado por ter a estrutura: Fórmula (Illa): 5 M—YH((CH2)2O)n—"X)n—Y2-[CpG ODN]—Y3-M>2 3', ou Fórmula (Illb): 5º M2—Y3-[CpG ODN]-Y2-(((CH2)2O)m=X)—"Y 1—M:1 3' em que: M: representa uma porção lipídica, de preferência, a porção lipídica compreende pelo menos um selecionado do grupo que consiste em colesterol, tocoferol, um grupo palmitoíla, e um grupo estearila,
M> representa uma porção lipídica, uma porção de direcio- namento, ou está ausente, Y1 é uma ligação ou um ligante, de preferência, etileno glico!l que tem a Fórmula ((CH2)2O)., em que o é de 1 a 15, covalentemente ligado a (((CH2)2O)m—=X)n por meio de uma ligação fosfodiéster (po), uma ligação fosforotioato (ps) ou uma união, X é independentemente uma união, uma ligação po ou uma ligação ps, cada um dentre Y2 e Y;3 é independentemente uma ligação clivável, de preferência, compreende uma ligação éster ou amida, com mais preferência, compreende uma ligação po ou uma ligação fosfora- midato, com a máxima preferência, uma ligação po, desde que quando M, estiver ausente, Y; esteja ausente, CpG ODN compreende pelo menos um motivo CpG tendo uma ligação internucleotídica po (fosfodiéster), compreende, de prefe- rência, pelo menos dois, três ou quatro motivos CpG, tendo cada um a ligação internucleotídica po; m é um número inteiro de 1a 15,e n é um número inteiro de 1 a 5.
3. Construto de ODN, de acordo com a reivindicação 2, ca- racterizado por ter a Fórmula: Fórmula (IVa): 5 M-Y+—(((CH2)2O)m—=X).—Y2-[CpG ODN] 3', ou Fórmula (IVb): 8º [CpG ODN]I-Y2—(((CH2)2O)mn—WX)n— Y1-M 3º em que: M representa uma porção lipídica, de preferência a porção lipídica compreende pelo menos uma porção lipídica selecionada do grupo que consiste em colesterol, tocofero|, um grupo palmitoíla e um grupo estearila, Y1 é uma ligação ou um ligante, de preferência, etileno glicol que tem a Fórmula ((CH2)2O)o, em que o é de 1 a 15, covalentemente ligado a (((CH2)2O)m—=X)n por meio de uma ligação fosfodiéster (po), uma ligação fosforotioato (ps) ou uma união, X é independentemente uma união, uma ligação fosfodiéster (po) ou uma ligação fosforotioato (ps), Y2 é uma ligação clivável, de preferência, compreende uma ligação éster ou amida, com mais preferência, compreende uma ligação po ou uma ligação fosforamidato, com a máxima preferência, uma liga- ção po; CpG ODN compreende pelo menos um motivo CpG tendo uma ligação internucleotídica po (fosfodiéster), compreende, de prefe- rência, pelo menos dois, três ou quatro motivos CpG, tendo cada um a ligação internucleotídica po; m é um número inteiro de 1 a 15, de preferência, 6; e n é um número inteiro de 1 a 5, de preferência, 2; opcionalmente, o construto de CpG ODN da Fórmula (IVa) ou (IVb) é adicionalmente covalentemente conjugado a uma porção de direcionamento, que é, de preferência, selecionada do grupo que con- siste em galactose, N-acetilgalactosamina (GalNAc), fucose, manose, ácido siálico e ácido N-acetil neuramínico.
4. Construto de ODN, de acordo com a reivindicação 3, ca- racterizado por ter uma fórmula selecionada do grupo que consiste em: 5' M-po(HEG)po(HEG)po-[CpG ODN] 3'; 5' M-ps(HEG)po(HEG)po-[CpG ODN] 3', 5' M-ps(HEG)ps(HEG)po[CpG ODN] 3', 5' M-po(HEG)ps(HEG)po—[CpG ODN] 3', 5' [CpG ODN]—-po(HEG)po(HEG)po-M 3', 5' [CpG ODN]—-po(HEG)ps(HEG)po-M 3", 5' [CpG ODN]-po(HEG)ps(HEG)ps—-M 3', e 5' [CpG ODN]-po(HEG)po(HEG)ps-M 3', em que:
M representa uma porção lipídica que compreende ao me- nos um selecionado do grupo que consiste em colesterol, tocoferol, um grupo palmitoíla, e um grupo estearila; po representa uma ligação fosfodiéster; HEG representa ((CH>2)2O)s; ps representa uma ligação fosforotioato; e o CpG ODN compreende pelo menos um motivo CpG tendo uma ligação internucleotídica po (fosfodiéster), compreende, de prefe- rência, pelo menos dois, três ou quatro motivos CpG, tendo cada um a ligação internucleotídica po, em que M é ligado covalentemente a (HEG) diretamente por meio de uma ligação po ou ps, ou indiretamente por meio de um se- gundo ligante que é ligado a (HEG) diretamente por meio de uma liga- ção po ou ps.
5. Construto de ODN, de acordo com a reivindicação 3, ca- racterizado por ter uma fórmula selecionada do grupo que consiste em: 5' Toco-po(HEG)po(HEG)po-[CpG ODN] 3', em que Toco representa tocoferol, 5' Chol-po(HEG)po(HEG)poHCpG ODN] 3', em que Cho! re- presenta colesterol, 5' Palm—po(HEG)po(HEG)po-[CpG ODN] 3', em que Palm representa um grupo palmitoíla, 5' [CpG ODN]-po(HEG)ps-Chol 3', em que Chol representa colesterol, 5' [CpG ODN]-po(HEG)ps—Toco 3', em que Toco representa tocoferol, e 5' [CpG ODN]-po(HEG)ps-Palm 3', em que Palm representa um grupo palmitoíla, em que: po representa uma ligação fosfodiéster;
HEG representa ((CH>2)2O)s; ps representa uma ligação fosforotioato; e o CpG ODN compreende pelo menos um motivo CpG tendo uma ligação internucleotídica po (fosfodiéster), compreende, de prefe- rência, pelo menos dois, três ou quatro motivos CpG, tendo cada um a ligação internucleotídica po, em que o tocoferol, o colesterol, ou o grupo palmitoíla é li- gado covalentemente ao (HEG) diretamente por meio de uma ligação po ou ps, ou indiretamente por meio de um segundo ligante que é ligado a (HEG) diretamente por meio de uma ligação po ou ps.
6. Construto de ODN, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 5, caracterizado pelo CpG ODN ter uma ligação inter- nucleotídica fosforotioato (ps).
7. Construto de ODN, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 6, caracterizado por dois a quatro dos dinucleotídeos CpG no CpG ODN terem, cada um, uma ligação internucleotídica fosfo- diéster (po).
8. Construto de ODN, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 7, caracterizado pelo CpG ODN compreender uma se- quência de polinucleotídeo selecionada do grupo que consiste em: (1) 8 TOEGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 3' (SEQ ID NO: 1); (2) º GGGGGACGATCGTCGGGGGG 3' (SEQ ID NO: 2); (3) º GGGGTCAACGTTGAGGGGGG 3' (SEQ ID NO: 3); (4) º TOCATGACGTTCCTGACGTT 3' (SEQ ID NO: 4); (5) 5 TEGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG 3' (SEQ ID NO: 5); (6) TEGTCGTTACGTAACGACGACGTT 3' (SEQ ID NO: 6) e (7) º TEGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGT 3' (SEQ ID NO: 7)
9. Construto de ODN, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 8, caracterizado pelo CpG ODN compreender uma se- quência de polinucleotídeo selecionada do grupo que consiste em:
(1) 59º TposCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 8);
(2) 5º TopsCpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 9);
(3) 5º TpsCpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 10);
(4) 5º TosCpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 11);
(5) 5º TpsCpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 12);
(6) 5º TosCpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 13);
(7) 8º TpsCpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 14);
(8) 5º TosCpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsApsCpsGpsTpsApsAp- sCpsGpsApsCpsGpsApsCpsGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 15);
(9) 5 TosCpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsApsCpsGpsTpsApsAp- sCpsGpsApsCpsGpsApsCpsGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 16);
(10) 5º TpsCpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsApsCpoGpsTpsAp- sApsCpsGpsApsCpsGpsApsCpsGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 17);
(11) 5º TpsCpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsApsCpoGpsTpsAp- sApsCpoGpsApsCpsGpsApsCpsGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 18);
(12) 5º TpsCpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsApsCpoGpsTpsAp- sApsCpoGpsApsCpoGpsApsCpsGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 19);
(183) & GpsGpsGpsGpsGpsApsCpoGpsApsTpsCpoG- psTpsCpoGpsGpsGps GpsGpsG 3' (SEQ ID NO: 20);
(14) 5º" GpsGpsGpsGpsTpsCpsApsApsCpoGpsTpsTpsGp- sApsGpsGpsGpsGpsGpsG 3' (SEQ ID NO: 21); (15) 5 TpsCpsCpsApsTpsGpsApsCpsG- psTpsTpsCpsCpsTpsGpsApsCpsGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 22); (16) 5' TpsCpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsCpsGpsG- psCpsGpsCpsGpsCpsGpsCpsCpsG 3' (SEQ ID NO: 23); (17) 5 TosCpoGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsT 3' (SEQ ID NO: 24); (18) 5 TposCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsT 3' (SEQ ID NO: 25); e (19) 5 TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsG- psTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsT 3' (SEQ ID NO: 26); em que: po representa uma ligação internucleotídica fosfodiéster; e ps representa uma ligação internucleotídica fosforotioato.
10. Construto de ODN, de acordo com a reivindicação 1, ca- racterizado por ter a estrutura de: (1) 5 Toco-po(HEG)po(HEG)po-TpsCpoGpsTpsCpoG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 27); (2) & Toco-po(HEG)po(HEG)po-TpsCpsGpsTpsCpoG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 28); (3) 59º TposCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsT-(HEG)po(HEG)po-Toco 3' (SEQ ID NO: 29); (4) 5º TposCpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsT-(HEG)po(HEG)po-Toco 3' (SEQ ID NO: 30);
(6) 58 Chol-po(HEG)po(HEG)po-TpsCpoGpsTpsCpoG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 31);
(6) & Chol-po(HEG)po(HEG)poTpsCpsGpsTpsCpsG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 32);
(7) 858 Chol-po(HEG)po(HEG)po-TpsCpoGpsTpsCpsG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 33);
(8) 5 Chol-po(HEG)po(HEG)po-TpsCpoGpsTpsCpoG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 34);
(9) 58 Chol-po(HEG)po(HEG)po-TpsCpoGpsTpsCpoG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 35);
(10) 5 Chol-po(HEG)po(HEG)po-TpsCpoGpsTpsCpoG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 36);
(11) 5º TpsCpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTps-(HEG)po(HEG)po-Chol 3 (SEQ ID NO: 37);
(12) 5 TposCpoGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTps-(HEG)po(HEG)po-Chol 3 (SEQ ID NO: 38);
(13) 9 TosCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTps-(HEG)po(HEG)po-Chol 3 (SEQ ID NO: 39);
(14) 5 TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsG- psTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTps- (HEG)po(HEG)po-Chol 3' (SEQ ID NO: 40);
(15) 5 TpsCpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTps-(HEG)po(HEG)po-Toco 3 (SEQ ID NO: 41);
(16) 5º Toco-po(HEG)po(HEG)po-TpsCpoGpsTpsCpoG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 42);
(17) 5 TosCpoGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTps-(HEG)po(HEG)po-Toco 3 (SEQ ID NO: 43);
(18) 5 TosCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTps-(HEG)po(HEG)po-Toco 3 (SEQ ID NO: 44);
(19) 5 TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsG- psTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTps- (HEG)po(HEG)po-Toco 3' (SEQ ID NO: 45);
(20) 5 TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsG- psTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTps- (HEG)po(HEG)po-Toco 3' (SEQ ID NO: 46);
(21) 5& Toco-po(HEG)po(HEG)po-TpsCpsGpsTpsCpsG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 47);
(22) 5' Toco-po(HEG)po(HEG)po-TpsCpoGpsTpsCpsG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 48);
(23) 5 Toco-po(HEG)po(HEG)po-TpsCpoGpsTpsCpoG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 49);
(24) 5 Toco-po(HEG)po(HEG)po-TpsCpoGpsTpsCpoG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 50);
(25) 5'-TpsCpoGpsTpsCGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGps TpsTps-HEGps-Chol 3' (SEQ ID NO: 51); (26) 5- TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsG- psTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpsGpsTpsTps (HEG)po(HEG)po-Chol 3' (SEQ ID NO: 52); (27) 5-GpsGpsGpsGpsTpsCpsApsApsCpoGpsTpsTpsGp- sApsGpsGpsGpsGpsGpsGps-HEGps-Chol 3' (SEQ ID NO: 53); (28) 5-TpsCpsCpsApsTpsGpsApsCpsGpsTpsTpsCpsCpsTpsGp- sApsCpsGpsTpsTps-HEGps-Chol 3' (SEQ ID NO: 54); (29) 5-TpsCpsCpsApsTpsGpsApsCpsGpsTpsTpsCpsCpsTpsG- psApsCpsGpsTpsTps-HEGps-Toco 3' (SEQ ID NO: 55); (30) 5 Palmitoíla-po(HEG)po(HEG)po-TpsCpoG- psTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsG- psTpsCpoGpsTpsT 3' (SEQ ID NO: 56); em que: Chol representa colesterol; Toco representa tocoferol; Palmitoíla representa um grupo palmitoíla; HEG representa ((CH>2)2O)s; po representa uma ligação fosfodiéster; e ps representa uma ligação fosforotioato, em que o tocoferol, o colesterol, ou o grupo palmitoíla é li- gado covalentemente ao (HEG) diretamente por meio de uma ligação po ou ps, ou indiretamente por meio de um segundo ligante que é ligado a (HEG) diretamente por meio de uma ligação po ou ps.
11. Construto de CpG ODN, caracterizado por ter a fórmula: Fórmula (Ila)(s): 5' M-LACpG ODN] 3', ou Fórmula (IIb)(s): 5 [CpG ODN-L-M 3' em que:
M representa uma porção lipídica, de preferência, a porção lipídica compreende pelo menos uma porção lipídica selecionada do grupo que consiste em colesterol, tocoferol, um grupo palmitoíla, e um grupo estearila; L representa um ligante que compreende pelo menos 1 átomo selecionado do grupo que consiste em carbono, nitrogênio, oxi- gênio, hidrogênio, enxofre e fósforo, e L é ligado covalentemente ao CpG ODN através de uma ligação clivável, de preferência por meio de uma ligação éster ou amida; e CpG ODN representa o CpG ODN, como definido em qual- quer uma das reivindicações 12 a 14; opcionalmente, o construto de CpG ODN da Fórmula (lla) ou (Ilb) é adicionalmente covalentemente conjugado a uma porção de dire- cionamento, que é, de preferência, selecionada do grupo que consiste em galactose N-acetilgalactosamina (GalNAc), fucose, manose, ácido siálico e ácido N-acetil neuramínico.
12. Construto de ODN, caracterizado por ter a estrutura:
T ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que os oligonucleotídeos representam um CpG ODN que compreende pelo menos um motivo CpG que tem uma ligação internucleotídica po, de preferência compreende pelo menos dois, três ou quatro motivos CpG tendo, cada um, a ligação internucleotídica po.
13. Construto de ODN, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo CpG ODN conter a SEQ ID NO:1.
14. Construto de ODN, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo CpG ODN consistir em FS) TpsCpoGpsTpsCpoGpsTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoG- psTpsTpsTpsTpsGpsTpsCpoGpsTpsT-3".
15. Construto de ODN, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por ter a seguinte estrutura: pers ' Lek ko ED edad Fo sb sbt do sb raasho ea Sib nb aah, Parar o ara ala] erga era
16. Construto de ODN, caracterizado por ter a estrutura: AA Aa 1 |
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17. Composição farmacêutica, caracterizada por compreen- der o construto de ODN, como definido em qualquer uma das reivindi- cações 1 a 16, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
18. Método de preparação de uma composição farmacêu- tica, caracterizado por compreender combinar o construto de ODN,
como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 16, com um ve- ículo farmaceuticamente aceitável.
19. Método para estimulação de uma resposta imune em um indivíduo que precisa da mesma, caracterizado por compreender admi- nistrar ao indivíduo a composição farmacêutica, como definida na rei- vindicação 17.
20. Método para tratamento de uma doença em um indivíduo que precisa do mesmo, caracterizado por compreender administrar ao indivíduo a composição farmacêutica, como definida na reivindicação 17, em que a doença é selecionada do grupo que consiste em vírus da Hepatite B (HBV) e câncer.
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