JP2023545418A - 一置換ホモ二価リンカーを含むマルチコンジュゲート - Google Patents

一置換ホモ二価リンカーを含むマルチコンジュゲート Download PDF

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Abstract

様々な態様により、一端が置換基Xによって置換されているホモ二価共有結合性リンカーが提供され、ここでXは核酸以外の生物学的部分を含む。

Description

任意の優先出願に対する参照による組み入れ
本出願と共に提出されたPCT Requestにおいて外国または国内優先権主張が特定されている、いずれかのおよび全ての出願は、参照により本明細書に組み入れられる。
開示の分野
本開示は、一置換ホモ二価リンカーを含む新規の合成中間体、および、遺伝子発現の調節、生物学的研究、病状の治療もしくは予防において、または新たなもしくは変化した表現型を生成するために使用するためのマルチコンジュゲートの合成における該中間体の使用に関する。
背景
バイオコンジュゲートは、少なくとも1つが生体分子である少なくとも2つの分子の共有結合性連結を含む。生体分子は、例えば、分子および細胞イベントの標識化、画像化および追跡、標的細胞への薬物送達において、ならびに診断用または治療用物質として、多種多様な機能を有する。バイオコンジュゲートの非限定的な例としては、タンパク質への低分子（例えば、ビオチン）のカップリング、タンパク質-タンパク質コンジュゲート（例えば、酵素にカップリングされた抗体）、抗体薬物コンジュゲート（ADC）（例えば、細胞傷害性低分子にコンジュゲートされたモノクローナル抗体）、ラジオイムノコンジュゲート（例えば、キレート剤にコンジュゲートされたモノクローナル抗体）、ワクチン（例えば、キャリアタンパク質にコンジュゲートされたハプテン）、ナノ粒子および非細胞傷害性薬（例えば、ペプチド）にコンジュゲートされた抗体、元素またはそれらの誘導体にコンジュゲートされた生体分子（例えば、酸化鉄ナノ粒子にコンジュゲートされたTGF-β）が挙げられる。
バイオコンジュゲートは、開発上および製造上の課題を抱えており、多くが、共有結合性連結（コンジュゲーション）を十分な収率および純度で形成する過程で生じる。例えば、いくつかの条件下で、置換基AとBのヘテロ二量体を形成するためにホモ二価リンカーを使用すると、ホモ二量体種とヘテロ二量体種の混合物が生じ、それから、所望のヘテロ二量体を単離することは、置換基AとBがサイズおよび／または電荷の点で類似している場合、困難となる場合がある。この問題は、置換基AとBのヘテロ二量体を形成するためにヘテロ二価リンカーを使用することによって対処できるが；例えば、切断可能な連結が所望され、望ましい切断プロファイルを有するヘテロ二価リンカーが利用できない場合；または、例えば、さらなるコンジュゲーション反応が所望される（例えば、3つの置換基A、BおよびCのマルチコンジュゲートを形成するために）場合、新たな問題が発生する。
それゆえ、バイオコンジュゲートの開発、合成、および商業的利用への費用効果の高いスケールアップの効率を改善するための、新たな方法および材料が必要とされている。
開示の概要
本開示は、新たな合成中間体クラスを代表する化合物、該合成中間体をマルチコンジュゲートの合成に使用する方法、新たな形態のマルチコンジュゲート、ならびに、該マルチコンジュゲートを、例えば、遺伝子発現の低減、生物学的研究、病状の治療もしくは予防において、および／または新たなもしくは変化した表現型を生成するために使用する方法に関する。
本開示は、一端が置換基Xによって置換されているがもう一端が未置換のままであるホモ二価共有結合性リンカー（「一置換共有結合性リンカー」）を含み、かつ、Xが、核酸以外の生物学的部分を含む、合成中間体を提供する。本開示は、本開示全体を通して提供されるホモ二価共有結合性リンカーの例を含むがそれらに限定されない、切断可能なまたは切断不可能な、あらゆるタイプのホモ二価共有結合性リンカーに適用可能である。本開示は、本開示全体を通して提供される非核酸置換基の例を含むがそれらに限定されない、置換基としてのあらゆるタイプの非核酸生物学的部分に適用可能である。
本開示は、一置換共有結合性リンカーの形成を実質的に優先しかつ置換基Xの二量体化を実質的に阻止する反応条件下で、ホモ二価共有結合性リンカーを置換基X（Xは、核酸以外の生物学的部分である）にカップリングする工程を含む、一置換共有結合性リンカーを合成するための方法を提供する。
本開示はまた、核酸以外の生物学的部分を含む第1の置換基Xと、Xと同じまたは異なる第2の置換基Yとを含む、マルチコンジュゲートであって、XとYとがホモ二価共有結合性リンカーによってつながれている、マルチコンジュゲートも提供する。本開示は、本開示全体を通して提供されるホモ二価共有結合性リンカーの例を含むがそれらに限定されない、切断可能なまたは切断不可能な、あらゆるタイプのホモ二価共有結合性リンカーに適用可能であり；さらに、本開示全体を通して提供される置換基の例を含むがそれらに限定されない、置換基（Xの場合は非核酸、かつ、Yの場合は核酸または非核酸）としてのあらゆるタイプの生物学的部分に適用可能である。
本開示は、核酸以外の生物学的部分を含む第1の置換基Xと、Xと同じまたは異なる第2の置換基Yとを含む、マルチコンジュゲートであって、XとYとがホモ二価共有結合性リンカーによってつながれている、マルチコンジュゲートを、X-Y二量体の形成を実質的に優先しかつX-X二量体およびY-Y二量体の形成を実質的に阻止する反応条件下で合成するための方法を提供する。
本開示はまた、各々が共有結合性リンカーによって互いにつながれた、同じであっても異なっていてもよい生物学的に活性な置換基X、Y、およびZを含む、マルチコンジュゲートも提供する。本開示は、本開示全体を通して提供されるホモ二価共有結合性リンカーの例を含むがそれらに限定されない、切断可能なまたは切断不可能な、あらゆるタイプのホモ二価共有結合性リンカーに適用可能であり；さらに、本開示全体を通して提供される置換基の例を含むがそれらに限定されない、置換基X、Y、およびZとしてのあらゆるタイプの生物学的部分に適用可能である。
本開示はまた、各々が共有結合性リンカーによって互いにつながれた、同じであっても異なっていてもよい生物学的に活性な置換基X、Y、およびZを含む、マルチコンジュゲートを合成するための方法も提供する。
本開示はまた、開示される合成中間体およびマルチコンジュゲートを、遺伝子発現の調節、生物学的研究、病状の治療もしくは予防において、および／または新たなもしくは変化した遺伝子型もしくは表現型を生成するために使用する方法も提供する。
ある態様では、本開示は、一端が置換基Xによって置換されているホモ二価共有結合性リンカーを含む化合物（合成中間体）であって、Xが核酸以外の生物学的部分を含み、ホモ二価リンカーのもう一端が未置換であり、かつ化合物が少なくとも75％純粋である、化合物を提供する。
ある態様では、化合物は、構造1：
X-R1-R2-A-R3-B（構造1）
を含み、
構造中：
Xは、核酸以外の生物学的部分を含む置換基であり；
R1は、ホスホジエステル、チオホスホジエステル、スルファート、アミド、トリアゾール、ヘテロアリール、エステル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、チオプロピオナート、アセタール、グリコールを含む基であるか、または存在せず；
R2は、スペーサー基であるか、または存在せず；
Aは、第1の求核剤と第1の求電子剤との反応生成物を含む基であり；
R3は、C2～C10アルキル、C2～C10アルコキシ、C1～C10アリール、C2～C10アルキルジチオ、アミド、エーテル、チオエーテル、エステル、オリゴヌクレオチド、オリゴペプチド、チオプロピオナート、またはジスルフィドを含む基であり；かつ
Bは、第2の求核剤または第2の求電子剤を含む基であり、第2の求核剤が第1の求核剤と同じであり、第2の求電子剤が第1の求電子剤と同じである。
ある態様では、スペーサー基R2は、C2～C10アルキル、C2～C10アルコキシ、もしくはC1～C10アリールを含むか、または存在しない。
ある態様では、基Aの第1の求核剤および第1の求電子剤は、（i）任意で、チオールとマレイミドとの反応生成物が、スクシンアミド酸の誘導体である（例えば、マレイミド環の1つが開環している場合の）、チオールおよびマレイミド；（ii）チオールおよびビニルスルホン；（iii）チオールおよびピリジルジスルフィド；（iv）チオールおよびヨードアセトアミド；（v）チオールおよびアクリレート；（vi）アジドおよびアルキン；または（vii）アミンおよびカルボキシルを含む。
ある態様では、Aは、チオールとマレイミドとの反応生成物を含む基であり、任意で、チオールとマレイミドとの反応生成物は、スクシンアミド酸の誘導体である。
ある態様では、R3基は、チオプロピオナート、ジスルフィド、オリゴヌクレオチド、またはオリゴペプチドを含む。
ある態様では、化合物は、構造2：
Figure 2023545418000001
またはそのピロリジンジオン開環誘導体を含み、任意で、構造2のピロリジンジオン開環誘導体は、スクシンアミド酸の誘導体であり、
構造中：
Xは、核酸以外の生物学的部分を含む置換基であり；
R1は、ホスホジエステル、チオホスホジエステル、スルファート、アミド、トリアゾール、ヘテロアリール、エステル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、チオプロピオナート、アセタール、グリコールを含む基であるか、または存在せず；
R2は、スペーサー基であるか、または存在せず；
Sは、硫黄であり；
Nは、窒素であり；かつ
R3は、C2～C10アルキル、C2～C10アルコキシ、C1～C10アリール、C2～C10アルキルジチオ、アミド、エーテル、チオエーテル、エステル、オリゴヌクレオチド、オリゴペプチド、チオプロピオナート、またはジスルフィドを含む基である。
ある態様では、化合物は、以下の構造2a（2つの位置異性体を表す）：
Figure 2023545418000002
を有するスクシンアミド酸の誘導体である構造2の化合物のピロリジンジオン開環誘導体を含む。
構造2または構造2aを含む化合物のある態様では、R2スペーサー基は、C2～C10アルキル、C2～C10アルコキシ、またはC1～C10アリールを含む。
構造2または構造2aを含む化合物のある態様では：
Xは、ペプチドもしくはタンパク質、またはそれらの誘導体であり；
R1およびR2は、存在せず；かつ
R3は、チオプロピオナート、ジスルフィド、またはオリゴヌクレオチドを含む基である。
構造2または構造2aを含む化合物のある態様では：
Xは、有機金属化合物またはその誘導体であり；
R1は、エステル基であり；
R2は、C2～C10アルキルを含むスペーサー基であり；かつ
R3は、チオプロピオナート、ジスルフィド、オリゴヌクレオチド、またはオリゴペプチドを含む基である。
構造2または構造2aを含む化合物のある態様では：
Xは、低分子またはその誘導体であり；
R1は、エステル基であり；
R2は、C2～C10アルキルを含むスペーサー基であり；かつ
R3は、チオプロピオナート、ジスルフィド、オリゴヌクレオチド、またはオリゴペプチドを含む基である。
化合物のある態様では、ホモ二価共有結合性リンカーは、細胞内条件下で切断可能なリンカーを含む。
構造1または構造2を含む化合物のある態様では、R3基は、細胞内条件下で切断可能なリンカーを含む。
化合物のある態様では、置換基Xは、ペプチド、タンパク質、脂質、炭水化物、カルボン酸、ビタミン、ステロイド、リグニン、低分子、有機金属化合物、または前述のいずれかの誘導体である。
化合物のある態様では、置換基Xは、ペプチドまたはペプチドの誘導体である。ある態様では、ペプチドは、HIV-1TATタンパク質の形質導入ドメインまたはその誘導体を含む。ある態様では、ペプチドは、セントリリン（Centryrin）を含む。ある態様では、ペプチドは、拘束性ペプチドを含む。ある態様では、ペプチドは、pHLIPペプチドを含む。
化合物のある態様では、置換基Xは、抗体もしくは抗体断片、またはそれらの誘導体である。ある態様では、抗体断片は、単鎖可変断片またはその誘導体を含む。
化合物のある態様では、置換基Xは、炭水化物または炭水化物の誘導体である。
化合物のある態様では、置換基Xは、脂肪酸または脂肪酸の誘導体である。
化合物のある態様では、置換基Xは、ビタミンまたはビタミンの誘導体である。ある態様では、ビタミンは、トコフェロールもしくはフォレート、またはそれらの誘導体である。
化合物のある態様では、置換基Xは、コレステロールまたはその誘導体である。
化合物のある態様では、置換基Xは、(2S,2'S)-2,2'-(カルボニルジイミノ)ジペンタン二酸（DUPA）またはその誘導体である。
化合物のある態様では、置換基Xは、アニサミドまたはその誘導体である。
化合物のある態様では、置換基Xは、有機金属化合物またはその誘導体である。ある態様では、有機金属化合物は、フェロセンまたはその誘導体である。
化合物のある態様では、置換基Xは、低分子またはその誘導体である。ある態様では、低分子は、治療薬分子である。例えば、ある態様では、低分子は、レナリドミドまたはその誘導体である。
ある態様では、化合物は、少なくとも80、85、90、95、96、97、98、99、または100％純粋である。
本開示は、一置換共有結合性リンカーの形成を実質的に優先しかつ置換基Xの二量体化を実質的に阻止する反応条件下で、ホモ二価共有結合性リンカーを置換基X（Xは、核酸以外の生物学的部分である）にカップリングする工程を含む、一置換共有結合性リンカーを合成するための方法を提供する。
ある態様では、該方法は、ホモ二価共有結合性リンカーと、ホモ二価共有結合性リンカーと反応性の官能基を含む官能化置換基Xとを反応させることをさらに含む。この方法のある態様では、官能化置換基Xは、構造3：
X-R1-R2-A'（構造3）
を含み；かつ
ホモ二価共有結合性リンカーは、構造4：
A''-R3-B（構造4）
を含み；かつ
Xは、核酸以外の生物学的部分を含む置換基であり；
R1は、ホスホジエステル、チオホスホジエステル、スルファート、アミド、トリアゾール、ヘテロアリール、エステル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、チオプロピオナート、アセタール、グリコールを含む基であるか、または存在せず；
R2は、スペーサー基であるか、または存在せず；
R3は、C2～C10アルキル、C2～C10アルコキシ、C1～C10アリール、C2～C10アルキルジチオ、アミド、エーテル、チオエーテル、エステル、オリゴヌクレオチド、オリゴペプチド、チオプロピオナート、またはジスルフィドを含む基であり；
A'およびA''は共に、一緒に反応してAを形成する第1の求核剤および第1の求電子剤を含み；かつ
Bは、第2の求核剤または第2の求電子剤を含む基であり、第2の求核剤が第1の求核剤と同じであり、第2の求電子剤が第1の求電子剤と同じであり；かつ
結果として得られる化合物は、構造1：X-R1-R2-A-R3-Bである。
該方法の代替態様では、ホモ二価共有結合性リンカーと官能化R2末端基とを反応させて中間体を形成し、次いで、該中間体の官能化R2末端基と、官能化R2末端基と反応性の官能基を含む官能化置換基Xとを反応させてR1を形成する；ここで、R1は、ホスホジエステル、チオホスホジエステル、スルファート、アミド、トリアゾール、ヘテロアリール、エステル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、チオプロピオナート、アセタール、またはグリコールを含む基であり；かつ、R2は、スペーサー基である。この方法のある態様では、ホモ二価共有結合性リンカーは、構造4：
A''-R3-B（構造4）
を含み、
官能化R2末端基は、構造5：
R1'-R2-A'（構造5）
を含み、
官能化置換基Xは、構造6：
X-R1''（構造6）
を含み；かつ
Xは、核酸以外の生物学的部分を含む置換基であり；
R1'およびR1''は、反応してR1を形成する官能基であり；
R1は、ホスホジエステル、チオホスホジエステル、スルファート、アミド、トリアゾール、ヘテロアリール、エステル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、チオプロピオナート、アセタール、またはグリコールを含む基であり；
R2は、スペーサー基であり；
R3は、C2～C10アルキル、C2～C10アルコキシ、C1～C10アリール、C2～C10アルキルジチオ、アミド、エーテル、チオエーテル、エステル、オリゴヌクレオチド、オリゴペプチド、チオプロピオナート、またはジスルフィドを含む基であり；かつ
A'およびA''は、反応してAを形成する第1の求核剤および第1の求電子剤を含み；
Bは、第2の求核剤または第2の求電子剤を含む基であり、第2の求核剤が第1の求核剤と同じであり、第2の求電子剤が第1の求電子剤と同じであり；かつ
結果として得られる化合物は、構造1：X-R1-R2-A-R3-Bである。
該方法のある態様では、置換基Xへのホモ二価共有結合性リンカーのカップリングは、官能化置換基Xと化学量論的過剰のホモ二価共有結合性リンカーとの希釈溶液中で行われる。
該方法のある態様では、置換基Xへのホモ二価共有結合性リンカーのカップリングは、少なくとも約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、または100のモル過剰のホモ二価共有結合性リンカーを用いて行われる。
該方法のある態様では、置換基Xへのホモ二価共有結合性リンカーのカップリングは、約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、または100のモル過剰のホモ二価共有結合性リンカーを用いて行われる。
該方法のある態様では、置換基Xへのホモ二価共有結合性リンカーのカップリングは、約7、6、5、または4を下回るpHで行われる。
該方法のある態様では、置換基Xへのホモ二価共有結合性リンカーのカップリングは、約7、6、5、または4のpHで行われる。
該方法のある態様では、置換基Xへのホモ二価共有結合性リンカーのカップリングは、水と水混和性の有機共溶媒とを含む溶液中で行われる。ある態様では、水混和性の有機共溶媒は、DMF、NMP、DMSO、アルコール、またはアセトニトリルを含む。ある態様では、水混和性の有機共溶媒は、溶液の約10、15、20、25、30、40、または50％（v/v）を構成する。
該方法のある態様では、置換基Xへのホモ二価共有結合性リンカーのカップリングは、無水有機溶媒を含む溶液中で行われる。さらなる態様では、無水有機溶媒は、ジクロロメタン、DMF、DMSO、THF、ジオキサン、ピリジン、アルコール、またはアセトニトリルを含む。
該方法のある態様では、結果として得られる一置換共有結合性リンカーの収率は、少なくとも75、80、85、90、95、96、97、98、99、または100％である。
該方法のある態様では、結果として得られる一置換共有結合性リンカーの純度は、少なくとも75、80、85、90、95、96、97、98、99、または100％である。
ある態様では、本開示は、構造7：
X●Y（構造7）
を含むマルチコンジュゲートを提供し、
構造中：
Xは、核酸以外の生物学的部分を含む第1の置換基であり；
Yは、Xと同じまたは異なる第2の置換基であり；かつ
●は、XとYとをつなぐ共有結合リンカーであり、構造8：
-R1-R2-A-R3-A-R2-R1-（構造8）
を含み、
構造中：
各R1は、独立に、ホスホジエステル、チオホスホジエステル、スルファート、アミド、トリアゾール、ヘテロアリール、エステル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、チオプロピオナート、アセタール、グリコールを含む基であるか、または存在せず；
各R2は、独立に、スペーサー基であるか、または存在せず；
各Aは、同じであり、求核剤と求電子剤との反応生成物を含む基であり；かつ
R3は、C2～C10アルキル、C2～C10アルコキシ、C1～C10アリール、アミド、C2～C10アルキルジチオ、アミド、エーテル、チオエーテル、エステル、オリゴヌクレオチド、オリゴペプチド、チオプロピオナート、またはジスルフィドを含む基である。
構造7のマルチコンジュゲートのある態様では、Yは、Xと異なる。
構造7のマルチコンジュゲートのある態様では、Xは、ペプチド、タンパク質、脂質、炭水化物、カルボン酸、ビタミン、ステロイド、リグニン、低分子、有機金属化合物、または前述のいずれかの誘導体である。
構造7のマルチコンジュゲートのある態様では、Yは、核酸、ペプチド、タンパク質、脂質、炭水化物、カルボン酸、ビタミン、ステロイド、リグニン、低分子、有機金属化合物、または前述のいずれかの誘導体である。
構造7のマルチコンジュゲートのある態様では、Xは、ペプチドまたはペプチドの誘導体である。さらなる態様では、Xは、HIV-1TATタンパク質の形質導入ドメインまたはその誘導体である。ある態様では、ペプチドは、セントリリンを含む。ある態様では、ペプチドは、拘束性ペプチドを含む。ある態様では、ペプチドは、pHLIPペプチドを含む。
構造7のマルチコンジュゲートのある態様では、Xは、抗体もしくは抗体断片、またはそれらの誘導体である。さらなる態様では、Xは、抗体単鎖可変断片またはその誘導体である。
構造7のマルチコンジュゲートのある態様では、Xは、低分子またはその誘導体である。さらなる態様では、低分子は、治療薬分子である。例えば、ある態様では、Xは、レナリドミドまたはその誘導体である。
構造7のマルチコンジュゲートのある態様では、Xは、有機金属化合物またはその誘導体である。さらなる態様では、Xは、フェロセンまたはその誘導体である。
構造7のマルチコンジュゲートのある態様では、Yは、核酸またはその誘導体である。さらなる態様では、Yは、RNAまたはその誘導体である。なおさらなる態様では、Yは、siRNA、saRNA、もしくはmiRNA、またはそれらの誘導体である。
構造7のマルチコンジュゲートのある態様では、XとYとをつなぐ共有結合性リンカーは、細胞内条件下で切断可能である。
ある態様では、構造7のマルチコンジュゲートは、少なくとも75、80、85、90、95、96、97、98、99、または100％純粋である。
ある態様では、本開示は、構造7：
X●Y（構造7）
のマルチコンジュゲートを合成するための方法を提供し、
構造中：
Xは、核酸以外の生物学的部分を含む第1の置換基であり；
Yは、Xと同じまたは異なる第2の置換基であり；かつ
●は、XとYとをつなぐ共有結合性リンカーであり；
該方法が、以下の工程：
（a）X-R4とホモ二価リンカー○とを反応させて、一置換生成物X-○を生成する工程であって、R4が、一置換生成物X-○を生成しかつXの二量体化を実質的に阻止する条件下で、○と反応可能な官能基である、工程；および
（b）X-○とR5-Yとを反応させる工程であって、R5が、○と反応可能な官能基であり、それによりX●Yを形成する、工程
を含む。
ある態様では、本開示は、構造7：
X●Y（構造7）
のマルチコンジュゲートを合成するための方法を提供し、
構造中：
Xは、核酸以外の生物学的部分を含む第1の置換基であり；
Yは、Xと同じまたは異なる第2の置換基であり；かつ
●は、XとYとをつなぐ共有結合性リンカーであり；
該方法が、以下の工程：
（a）R4-Yとホモ二価リンカー○とを反応させて、一置換生成物○-Yを生成する工程であって、R4が、一置換生成物○-Yを生成しかつYの二量体化を実質的に阻止する条件下で、○と反応可能な官能基である、工程；および
（b）○-YとX-R5とを反応させる工程であって、R5が、○と反応可能な官能基であり、それによりX●Yを形成する、工程
を含む。
構造7のマルチコンジュゲートを合成するための方法のある態様では、工程（a）は、X-R4に対して化学量論的過剰のホモ二価リンカー○を用いて行われる。
構造7のマルチコンジュゲートを合成するための方法のある態様では、工程（a）は、R4-Yに対して化学量論的過剰のホモ二価リンカー○を用いて行われる。
構造7のマルチコンジュゲートを合成するための方法のある態様では、工程（a）は、約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、または100のモル過剰のホモ二価リンカー○を用いて行われる。
構造7のマルチコンジュゲートを合成するための方法のある態様では、工程（a）は、水と、任意で、水混和性の有機共溶媒とを含む溶液中で行われる。さらなる態様では、水混和性の有機共溶媒が使用される場合、水混和性の有機共溶媒は、DMF、DMSO、THF、ジオキサン、ピリジン、アルコール、またはアセトニトリルを含む。さらなる態様では、水混和性の有機共溶媒は、溶液の約10、15、20、25、30、40、または50％（v/v）を構成する。
上述した合成の方法において使用するためのアルコールとしては、C1～C10アルコール、C1～C7アルコール、およびC1～C5アルコールが挙げられるが、それらに限定されず、いずれの場合も、アミノ、第3級アミノまたはスルファートなどの水混和性増強基で置換されていてもよい。
構造7のマルチコンジュゲートを合成するための方法のある態様では、工程（a）は、約7、6、5、または4のpHで行われる。
構造7のマルチコンジュゲートを合成するための方法のある態様では、工程（a）は、無水有機溶媒を含む溶液中で行われる。さらなる態様では、無水有機溶媒は、ジクロロメタン、DMF、DMSO、THF、ジオキサン、ピリジン、アルコール、またはアセトニトリルを含む。
構造7のマルチコンジュゲートを合成するための方法のある態様では、Xは、ペプチド、タンパク質、脂質、炭水化物、カルボン酸、ビタミン、ステロイド、リグニン、低分子、有機金属化合物、または前述のいずれかの誘導体である。
構造7のマルチコンジュゲートを合成するための方法のある態様では、Yは、核酸、ペプチド、タンパク質、脂質、炭水化物、カルボン酸、ビタミン、ステロイド、リグニン、低分子、または前述のいずれかの誘導体である。
構造7のマルチコンジュゲートを合成するための方法のある態様では、Xは、ペプチドまたはペプチドの誘導体である。さらなる態様では、Xは、HIV-1TATタンパク質の形質導入ドメインまたはその誘導体である。ある態様では、ペプチドは、セントリリンを含む。ある態様では、ペプチドは、拘束性ペプチドを含む。ある態様では、ペプチドは、pHLIPペプチドを含む。
構造7のマルチコンジュゲートを合成するための方法のある態様では、Xは、抗体またはその断片である。さらなる態様では、Xは、単鎖抗体可変断片またはその誘導体である。
構造7のマルチコンジュゲートを合成するための方法のある態様では、Xは、低分子またはその誘導体である。さらなる態様では、低分子は、治療薬分子である。例えば、ある態様では、Xは、レナリドミドまたはその誘導体である。
構造7のマルチコンジュゲートを合成するための方法のある態様では、Xは、有機金属化合物またはその誘導体である。さらなる態様では、Xは、フェロセンまたはその誘導体である。
構造7のマルチコンジュゲートを合成するための方法のある態様では、Yは、核酸またはその誘導体である。さらなる態様では、Yは、RNAまたはその誘導体である。なおさらなる態様では、Yは、siRNA、saRNA、またはmiRNAである。
構造7のマルチコンジュゲートを合成するための方法のある態様では、共有結合性リンカー●は、細胞内条件下で切断可能である。
構造7のマルチコンジュゲートを合成するための方法のある態様では、X●Yの収率は、少なくとも75、80、85、90、95、96、97、98、99、または100％である。
構造7の化合物を合成するための方法のある態様では、X●Yの純度は、少なくとも75、80、85、90、95、96、97、98、99、または100％である。
ある態様では、本開示は、置換基X、Y、およびZを含むマルチコンジュゲートを提供し、置換基の各々が、独立に、生物学的部分であり、かつ共有結合性リンカー●によって別の置換基につながれており；該マルチコンジュゲートが構造9：
Figure 2023545418000003
を含み、
構造中：
▲1、▲2、▲3、▲4、および▲5の各々は、独立に、存在しないか、またはそのそれぞれの置換基に共有結合で連結された生物学的部分を含み；
nは、ゼロ以上の整数であり；かつ
構造9中に存在する置換基の少なくとも1つは、核酸ではない。
構造9のマルチコンジュゲートのある態様では、nは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10である。
構造9のマルチコンジュゲートのある態様では、少なくとも1つの共有結合性リンカー●は、ホモ二価共有結合性リンカーである。
構造9のマルチコンジュゲートのある態様では、Xは、核酸ではない。
構造9のマルチコンジュゲートのある態様では、Yは、核酸ではない。
構造9のマルチコンジュゲートのある態様では、少なくとも▲が存在する。さらなる態様では、存在する少なくとも1つの▲は、標的化リガンドである。ある態様では、少なくとも2つの▲が存在し、存在する2つの▲の各々は、標的化リガンドである。ある態様では、少なくとも2つの▲が存在し、存在する2つの▲の各々は、同じ標的化リガンドである。ある態様では、▲1および▲5が存在し、これらは同じ標的化リガンドである。
構造9のマルチコンジュゲートのある態様では、少なくとも1つの共有結合性リンカー●は、硫黄含有共有結合性リンカーであり；かつ、▲1、▲2、▲3、▲4、および▲5の少なくとも1つは、硫黄含有末端基Qを含む。さらなる態様では、硫黄含有末端基Qは、脱保護条件下で脱保護可能な保護チオール基を含み；かつ、硫黄含有共有結合性リンカー●は、脱保護条件下で安定である。別の態様では、硫黄含有共有結合性リンカー●は、脱保護条件ではない切断条件下で切断可能な切断可能基を含む。さらなる態様では、硫黄含有末端基Qは、式S-PGの保護チオール基を含む。
ある態様では、本開示は、構造10：
Figure 2023545418000004
を含むマルチコンジュゲートを合成するための方法を提供し、該方法が、
構造10aの化合物とホモ二価リンカーとを、一置換生成物（構造10b）を生成しかつ構造10aの二量体化を実質的に阻止する条件下で反応させて、構造10bの化合物を形成すること；
構造10bの化合物と構造10cの化合物とを反応させて、構造10dの化合物を形成すること；
構造10dの化合物を脱保護して、構造10eの化合物を形成すること；および
構造10eの化合物と構造10fの化合物とを反応させて、構造10を形成すること
を次のとおり：
Figure 2023545418000005
含み、
構造中：
●は、共有結合性リンカーであり；
○は、ホモ二価リンカーであり；
R4は、構造10bの一置換生成物を生成しかつ構造10aの二量体化を実質的に阻止する条件下でホモ二価リンカー○と反応するように選択された官能基であり；
R5は、ホモ二価リンカー○と反応するように選択された官能基であり；
S-PGは、構造10b、10c、および10d内の共有結合性リンカー●のいずれかに存在するどの硫黄含有基とも異なる硫黄含有基を含む保護チオール基であり；
Qは、構造10eの-SH基と反応して共有結合性リンカー●を形成するように選択された反応性基であり；
X、Y、およびZは、マルチコンジュゲートの置換基であり、かつ各々が、生物学的部分であり；
Z'、Z''、およびZ'''は、マルチコンジュゲートの置換基であり、かつ各々が、生物学的部分であり；
▲1、▲2、▲3、▲4、および▲5の各々は、独立に、存在しないか、またはそのそれぞれの置換基に共有結合で連結された生物学的部分を含み；
▲3'、▲3''、および▲3'''の各々は、独立に、存在しないか、またはそのそれぞれの置換基に共有結合で連結された生物学的部分を含み；
nは、1以上の整数であり、任意で、nは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10であり；かつ
n'、n''、およびn'''は、各々、ゼロ以上の整数であるが、ただし、n'+n''+n'''の合計が、nであるとする。
構造10を含むマルチコンジュゲートを合成するための方法のある態様では、マルチコンジュゲート中に存在するX、Y、およびZの少なくとも1つは、核酸ではない。
本開示は、開示されるマルチコンジュゲートと薬学的に許容される賦形剤とを含む組成物を提供する。
本開示は、医薬の製造において使用するための開示のマルチコンジュゲートを提供する。
本開示は、本明細書に開示される様々なマルチコンジュゲートのいずれかの有効量の投与を含む、医学的治療または予防を必要とする対象を治療するための方法を提供する。
本開示は、細胞における1つまたは複数の標的遺伝子の活性を調節するための方法であって、本明細書に開示される様々なマルチコンジュゲートのいずれかを細胞に導入すること、および、マルチコンジュゲートが細胞に侵入しかつ1つまたは複数の標的遺伝子の活性が調節される条件下で、細胞を維持することを含む、方法を提供する。
本開示は、細胞におけるマルチコンジュゲートの活性を観察するための方法であって、本明細書に開示される様々なマルチコンジュゲートのいずれかを細胞に導入すること、および、マルチコンジュゲートが細胞に侵入しかつマルチコンジュゲートの活性が観察される条件下で、細胞を維持することを含む、方法を提供する。
これらのおよび他の態様は、以下でより詳しく説明する。
本開示は、多くの異なる形態の態様を含むものの、本明細書においては、本開示が、技術の原理の例示と見なされるべきであり、本開示が、例証される態様に限定されることを意図していないという理解の下で、詳細ないくつかの具体的な態様が説明されよう。
詳細な説明
本明細書において言及される任意の特許、特許出願、および刊行物の開示は、本明細書において記載および請求されている開示の日付における当業者に公知の技術分野の状況をさらに十分に記載するために、それらの全体が参照により本出願に組み入れられる。
本明細書において使用される場合、「約」という用語は、おおよそのその平易かつ通常の意味に従って使用される。例えば、「約X」は、Xの値の測定誤差内の類似した量、または、Xとおおよそ同じであり、Xと本質的に同じ性質を有する量を含め、記載されているような値Xをおおよそ包含する。
本明細書において使用される場合、「単離された」という用語は、他の不要な物質から分離されている化合物を含む。単離された化合物は、実質的に純粋な状態で合成できるか、または粗反応混合物の他の成分から分離することができるが、粗反応混合物の他の成分の残存量を含め不純物のいくらかの量が残留する可能性がある場合は除く。同様に、「純粋な」または「実質的に純粋な」は、その意図する用途（例えば、薬学的製剤内での、または後続の化学反応のための材料としての）を可能にするのに十分に不純物を含有しないことを意味する。X％純粋とは、例えばHPLCなどの分析法であり得る適切な手段により、化合物が組成物全体のX％であることを意味する。
生物学的部分
本明細書において使用される場合、「生物学的部分」という用語は、当業者によって理解されるようなその通常の意味を有する。その用語は、細胞または生物に送達されたときに生物学的に活性または不活性である化学実体のことを指す。
多くの場合に、生物学的部分は、それが送達された細胞または生物内で生物学的効果または活性をもたらし；かつ、生物学的効果または活性は、検出可能または測定可能であることが多い。他の場合では、生物学的部分は、それと共に送達された別の生物学的部分の生物学的効果または活性を強化または増強するように選択され得る。さらに他の場合では、生物学的部分は、後述するような合成中間体またはマルチコンジュゲートを合成するための方法において使用するために選択され得る。
生物学的部分の例としては、核酸、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、脂質、炭水化物、カルボン酸、ビタミン、ステロイド、リグニン、低分子、有機金属化合物、または前述のいずれかの誘導体が挙げられるが、それらに限定されない。
本開示のいくつかの局面では、生物学的部分は、核酸以外の部分（「非核酸生物学的部分」）である。非核酸生物学的部分としては、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、脂質、炭水化物、カルボン酸、ビタミン、ステロイド、リグニン、低分子（例えば、低分子治療薬もしくは薬物分子）、有機金属化合物、または前述のいずれかの誘導体が挙げられるが、それらに限定されない。
本開示のいくつかの局面では、生物学的部分は、細胞または組織を標的とする部分、例えば限定されないが、所与の細胞表面受容体に特異的なリガンドを含み得る。細胞または組織を標的とする部分の例としては、脂溶性部分、例えば、リン脂質；アプタマー（DNAもしくはRNA、またはそれらの誘導体の）；ペプチドおよびタンパク質、例えば、抗原結合ペプチドまたはタンパク質；低分子；ビタミン、例えば、トコフェロールおよびフォレート；他の葉酸受容体結合リガンド；炭水化物、例えば、N-アセチルガラクトサミン（GalNAc）およびマンノース；他のマンノース受容体結合リガンド；コレステロール；カルボン酸、例えば、2-[3-(1,3-ジカルボキシプロピル)-ウレイド]ペンタン二酸（DUPA）；ならびに、ベンズアミドの誘導体、例えばアニサミドが挙げられるが、それらに限定されない。
細胞または組織を標的とする脂溶性部分は、カチオン性基を含み得る。本開示のいくつかの局面では、脂溶性部分は、コレステロール、ビタミンE、ビタミンK、ビタミンA、葉酸、またはカチオン性色素（例えば、Cy3）を含む。他の脂溶性部分としては、コール酸、アダマンタン酢酸、1-ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、1,3-ビス-O(ヘキサデシル)グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、1,3-プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、O3-(オレオイル)リトコール酸、O3-(オレオイル)コレン酸（cholenic acid）、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジンが挙げられるが、それらに限定されない。
抗原結合タンパク質の例としては、モノクローナル抗体、単鎖可変断片（ScFv）またはVHH抗原結合タンパク質が挙げられるが、それらに限定されない。
GalNAcベースの生物学的部分の例としては、単分岐GalNAc、二分岐GalNAc、および三分岐GalNAcが挙げられるが、それらに限定されない。
その一部または全部が細胞または組織を標的とする特性を有し得る他の生物学的部分としては、脂肪酸、例えば、コレステロール；リトコール酸（LCA）；エイコサペンタエン酸（EPA）；ドコサヘキサエン酸（DHA）；ドコサン酸（DCA）；ステロイド；セコステロイド；脂質；ガングリオシド類；ヌクレオシド類似体；エンドカンナビノイド類；ビタミン、例えば、コリン、ビタミンA、ビタミンE、レチノイン酸およびトコフェリル；ならびに前述のいずれかの誘導体が挙げられるが、それらに限定されない。
その一部または全部が細胞または組織を標的とする特性を有し得る他のペプチドベースの生物学的部分としては、
Figure 2023545418000006
が挙げられるが、それらに限定されない。本開示の範囲内の他のペプチドとしては、以下が挙げられる：
（a）ヒトテネイシンCタンパク質に由来し、標的に高選択性および親和性で結合するように操作された小さな単一ドメインタンパク質であるセンチリン（Klein et al., Centyrin ligands for extrahepatic delivery of siRNA, MOLECULAR THERAPY Vol. 29 No 6（June 2021）およびMahalingam et al., Evaluation of a Centyrin-Based Near-Infrared Probe for Fluorescence-Guided Surgery of Epidermal Growth Factor Receptor Positive Tumors, BIOCONJUGATE CHEM. 2017, 28, 11, 2865-2873（September 25, 2017）を参照のこと）（その各々は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）；
（b）Cary et al., Constrained Peptides in Drug Discovery and Development, J. SYNTH. ORG. CHEM., JPN, xxx, Vol. 75 No. 11（2017）（その全体が参照により本明細書に組み入れられる）に記載されているような、大環状およびステープルペプチドを含む拘束性ペプチド；および
（c）Wyatt et al., Peptides of pHLIP family for targeted intracellular and extracellular delivery of cargo molecules to tumors, PNAS, vol. 115, no. 12, E2811-E2818（2018）（その全体が参照により本明細書に組み入れられる）に記載されているような、細胞の表面で酸性度を標的とするpH（低）挿入ペプチド（pHLIP）。
様々な局面では、本開示は、連結または組み込まれている物質の細胞核への移入を容易にするための核局在化シグナルまたは配列（NLS）の使用および組み込みを提供する。NLSは、典型的には、アミノ酸配列であり、その例は、薬物送達の分野で働く者に公知である。
本開示のいくつかの局面では、生物学的部分は、エンドソーム脱出部分（EEM）を含んでよく、これは、細胞内送達時に、共に送達される他の生物学的に活性な部分が、エンドソーム膜を破壊することまたはそうでなければ生物学的部分が（例えば、エンドサイトーシスによって）内在化しているエンドソームもしくは他の細胞小器官を脱出することを支援または可能にするように選択される。エンドソーム脱出部分は、しばしば、脂質ベースまたはアミノ酸ベースであるが、エンドソームを破壊してそのカーゴを放出する他の化学実体を含み得る。EEMの例としては、クロロキン、疎水性アミノ酸R基を含有するモチーフを有するペプチドおよびタンパク質、ならびにインフルエンザウイルスヘマグルチニン（HA2）が挙げられるが、それらに限定されない。さらなるEEMは、Lonn et al., Scientific Reports, 6: 32301, 2016に記載されている。
細胞および組織を標的とする部分ならびにEEMの他の例は、以下の送達構築物および製剤という表題のセクションに提供する。
本開示のいくつかの局面では、生物学的部分は、免疫抑制剤または免疫刺激剤などの免疫調節剤を含み得る。
本開示の範囲内の追加の生物学的部分は、例えば、CRISPR/Casシステム、TALES、TALENおよびジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）に関与するオリゴヌクレオチド、ポリペプチドおよびタンパク質などの物質を含む、公知の遺伝子編集物質のいずれかである。
さらに、本開示の範囲内の生物学的部分は、検出可能ラベルを含み得る。本明細書において使用される場合、「検出可能ラベル」は、当業者によって理解されるようなその通常の意味を有する。その用語は、マルチコンジュゲートの置換基であり、かつ、蛍光分光法などの画像化技術によって検出可能である、化学基のことを指す。例えば、検出可能ラベルは、エネルギーの吸収後に規定の波長で放射線を放出するフルオロフォアを含む色素であり得る。多くの好適な蛍光ラベルまたは色素が公知である。例えば、Welchら（Chem. Eur. J. 5(3):951-960, 1999）は、ダンシル官能化蛍光部分を開示しており、Zhuら（Cytometry 28:206-211, 1997）は、蛍光ラベルCy3およびCy5の使用を記載している。他のラベルは、Proberら（Science 238:336-341, 1987）；Connellら（BioTechniques 5(4):342-384, 1987）、Ansorgeら（Nucl. Acids Res. 15(11):4593-4602, 1987）およびSmithら（Nature 321:674, 1986）に記載されている。市販の蛍光ラベルの例としては、フルオレセイン、ローダミン（例えば、TMR、テキサスレッドまたはRox）、アレクサ、ボディピー、アクリジン、クマリン、ピレン、ベンズアントラセンおよびシアニン（例えば、Cy2またはCy4）が挙げられるが、それらに限定されない。他の形態の検出可能ラベルとしては、量子ドット（Empodocles, et al., Nature 399:126-130, 1999）、金ナノ粒子（Reichert et al., Anal. Chem. 72:6025-6029, 2000）、マイクロビーズ（Lacoste et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 97(17):9461-9466, 2000）、および質量分析法によって検出可能なタグを含む、マイクロ粒子が挙げられる。検出可能ラベルは、ビオチン-ストレプトアビジン系など、検出を別の化合物との相互作用に依存する多成分ラベルであり得る。
本開示の多くの局面では、生物学的部分は、RNA、DNA、その組み合わせを含むがそれらに限定されない、または人工もしくは非天然の核酸類似体を含む、オリゴヌクレオチドを含み得る。様々な態様では、オリゴヌクレオチドは、一本鎖である。様々な態様では、オリゴヌクレオチドは、二本鎖（例えば、逆平行二本鎖）である。
様々な態様では、オリゴヌクレオチドは、RNA、例えば、アンチセンスRNA（aRNA）、CRISPR RNA（crRNA）、長鎖ノンコーディングRNA（lncRNA）、マイクロRNA（miRNA）、piwi干渉RNA（piRNA）、低分子干渉RNA（siRNA）、メッセンジャーRNA（mRNA）、短ヘアピンRNA（shRNA）、低分子活性化（saRNA）、またはリボザイムである。
様々な態様では、オリゴヌクレオチドは、DNAまたはRNAアプタマーである。
いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドは、CRISPRガイドRNA、あるいは、インビボ、インビトロもしくはエクスビボでCasヌクレアーゼとのリボヌクレオ複合体（RNP）の形成に関連するもしくはそれに必須である、またはCasヌクレアーゼ（例えば、野生型Casヌクレアーゼまたはニッカーゼおよびデッド（dead）Cas（dCas）などの野生型Casの公知の修飾物のいずれかを含む）を用いたゲノム編集の実施もしくは機能の操作に関連するもしくはそれに必須である、他のRNAである。CRISPR-Casシステムは、例えば、米国特許第8,771,945号；Jinek et al., Science, 337(6096): 816-821 (2012)、および国際特許出願公報WO 2013/176772号に記載されている。
様々な態様では、オリゴヌクレオチドは、15～30、17～27、19～26、20～25、40～50、40～150、100～300、1000～2000、または最大10000ヌクレオチド長である。
様々な態様では、オリゴヌクレオチドは、二本鎖であり、かつ相補的である。相補性は、100％相補的であることができ、または、オリゴヌクレオチドがそれでもなお適切な条件（例えば、生理学的に適切な条件）下でハイブリダイズして二本鎖のまま留まる場合には、100％未満相補的であることができる。例えば、二本鎖オリゴヌクレオチドは、少なくとも約80％、85％、90％、または95％相補的であることができる。いくつかの態様では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、平滑末端型（対称オリゴヌクレオチド）である。いくつかの態様では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、一方の鎖上に末端オーバーハングを有する（例えば、2～5のオーバーハングヌクレオチド）、またはその鎖の各々に末端オーバーハングを有する（いずれの場合も、非対称オリゴヌクレオチド）。
いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドは、DNA、例えば、アンチセンスDNA（aDNA）（例えば、アンタゴミル）またはアンチセンスギャップマーである。ギャップマーおよびマルチマーを含むaDNAの例は、例えば、Subramanian et al., Nucleic Acids Res, 43(19): 9123-9132 (2015)および国際特許出願公報WO 2013/040429号に記載されている。アンタゴミルの例は、例えば、米国特許第7,232,806号に記載されている。
様々な態様では、本開示に係るオリゴヌクレオチドは、化学修飾をさらに含む。化学修飾は、修飾されたヌクレオシド、修飾された骨格、修飾された糖、および／または修飾された末端を含むことができる。
修飾は、リン含有連結を含み得、これらの連結としては、ホスホロチオアート、鏡像異性的に濃縮されたホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、3'アルキレンホスホナートおよび鏡像異性的に濃縮されたホスホナートを含むメチルおよび他のアルキルホスホナート、ホスフィナート、3'-アミノホスホロアミダートおよびアミノアルキルホスホロアミダートを含むホスホロアミダート、チオノホスホロアミダート、チオノアルキルホスホナート、チオノアルキルホスホトリエステル、ならびに通常の3'-5'連結を有するボラノホスファート、これらの2'-5'連結類似体、ならびにヌクレオシド単位の隣接ペアが3'-5'から5'-3'へまたは2'-5'から5'-2'へ連結している逆の極性を有するものが挙げられるが、それらに限定されない。
様々な態様では、オリゴヌクレオチドは、1個または複数個のホスホロチオアート基を含み得る。オリゴヌクレオチドは、5'端に1～3個のホスホロチオアート基を含み得る。オリゴヌクレオチドは、3'端に1～3個のホスホロチオアート基を含み得る。オリゴヌクレオチドは、5'端および3'端に1～3個のホスホロチオアート基を含み得る。様々な態様では、マルチコンジュゲートに含有される各オリゴヌクレオチドは、1～10個の総ホスホロチオアート基を含み得る。ある特定の態様では、各オリゴヌクレオチドは、10個未満、9個未満、8個未満、7個未満、6個未満、5個未満、4個未満、または3個未満の総ホスホロチオアート基を含み得る。ある特定の態様では、マルチコンジュゲートに含有されるオリゴヌクレオチドは、より多いホスホロチオアート基を有する単量体形態の同じオリゴヌクレオチドと比べて、より少ないホスホロチオアート基で増加したインビボ活性を保有し得る。
オリゴヌクレオチドは、例えば、インビトロおよびインビボでの改善された効力および安定性を含めた多種多様な効果をもたらすために、当技術分野において公知の様々な戦略を使用して修飾され得る。これらの戦略の中には、人工核酸、例えば、2'-O-メチル-置換RNA；2'-フルオロ-2'デオキシRNA、ペプチド核酸（PNA）；モルホリノ；ロックド核酸（LNA）；アンロックド核酸（UNA）；架橋核酸（BNA）；グリコール核酸（GNA）；およびトレオース核酸（TNA）；またはより一般的には、天然に存在するRNAおよびDNAと構造的に類似するが、天然に存在する分子のリン酸骨格、糖、または核酸塩基部分の1つまたは複数において変更を有する、核酸類似体、例えば、二環式および三環式ヌクレオシド類似体がある。典型的には、類似体核酸塩基は、中でも、異なる塩基対合および塩基スタッキング特性を付与する。例としては、4種類の正規の塩基のすべてと対合することができるユニバーサル塩基が挙げられる。リン酸-糖骨格類似体の例としては、PNAが挙げられるが、それに限定されない。モルホリノベースのオリゴマー化合物は、Braasch et al., Biochemistry, 41(14): 4503-4510 (2002)、ならびに米国特許第5,539,082号；第5,714,331号；第5,719,262号；および第5,034,506号に記載されている。
本明細書に記載される製造法において、オリゴヌクレオチドのいくつかは、化学官能基での置換によって末端が修飾される。置換は、オリゴヌクレオチドの3'または5'端で実施することができ、かつ、単量体のセンス鎖とアンチセンス鎖の両方の3'端で実施されてもよいが、常にそれに限定されるわけではない。化学官能基には、例えば、スルフヒドリル基（-SH）、カルボキシル基（-COOH）、アミン基（-NH2）、ヒドロキシ基（-OH）、ホルミル基（-CHO）、カルボニル基（-CO-）、エーテル基（-O-）、エステル基（-COO-）、ニトロ基（-NO2）、アジド基（-N3）、またはスルホン酸基（-SO3H）が含まれ得る。
オリゴヌクレオチドは、追加的にまたは代替的に、核酸塩基（当技術分野において単に「塩基」と称される）修飾または置換を含むように修飾され得る。修飾された核酸塩基には、天然核酸においてまれにまたは一時的にだけ見いだされる核酸塩基、例えば、ヒポキサンチン、6-メチルアデニン、5-Meピリミジン類、5-メチルシトシン（5-メチル-2'デオキシシトシンとも称され、当技術分野においてしばしば5-Me-Cと称される）、5-ヒドロキシメチルシトシン（HMC）、グリコシルHMCおよびゲントビオシルHMC、ならびに合成核酸塩基、例えば、2-アミノアデニン、2-(メチルアミノ)アデニン、2-(イミダゾリルアルキル)アデニン、2-(アミノアルキルアミノ)アデニンまたは他のヘテロ置換アルキルアデニン、2-チオウラシル、2-チオチミン、5-ブロモウラシル、5-ヒドロキシメチルウラシル、8-アザグアニン、7-デアザグアニン、N6(6-アミノヘキシル)アデニン、および2,6-ジアミノプリンが含まれる。Kornberg, A., DNA Replication, W. H. Freeman & Co., San Francisco, pp 75-77 (1980)；Gebeyehu et al., Nucl. Acids Res, 15: 4513 (1997)。また、当技術分野において公知の「ユニバーサル」塩基、例えば、イノシンまたはシュードウリジンを含むこともできる。5-Me-C置換は、核酸二重鎖安定性を0.6～1.2℃増大させることができ（Sanghvi, Y. S., in Crooke, S. T. and Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, pp 276-278 (1993)）、これらは、塩基置換の局面である。修飾された核酸塩基は、5-メチルシトシン（5-me-C）、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの6-メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの2-プロピルおよび他のアルキル誘導体、2-チオウラシル、2-チオチミンおよび2-チオシトシン、5-ハロウラシルおよびシトシン、5-プロピニルウラシルおよびシトシン、6-アゾウラシル、シトシンおよびチミン、5-ウラシル（シュード-ウラシル）、4-チオウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオール、8-チオアルキル、8-ヒドロキシルおよび他の8-置換アデニンおよびグアニン、5-ハロ、例えば、5-ブロモ、5-トリフルオロメチルおよび他の5-置換ウラシルおよびシトシン、7-メチルクアニン（methylquanine）および7-メチルアデニン、8-アザグアニンおよび8-アザアデニン、7-デアザグアニンおよび7-デアザアデニン、ならびに3-デアザグアニンおよび3-デアザアデニンなどの、他の合成および天然の核酸塩基を含むことができる。核酸の末端でヒドロキシ基（-OH）を、スルフヒドリル基（-SH）、カルボキシル基（-COOH）またはアミン基（-NH2）などの官能基で置換することができる。置換は、3’端または5’端で実施することができる。
生物学的部分のさらなる例は、WO2016/205410、WO2018/145086、およびWO 2020/180897に記載されており、その各々は、参照により本明細書に組み入れられる。
マルチコンジュゲート
本明細書において使用される場合、「マルチコンジュゲート」という用語は、当業者によって理解されるようなその通常の意味を有する。その用語は、共有結合性リンカーによって互いにつながれた2つ以上の置換基を含む化合物のことを指し、置換基の各々は、独立に、生物学的部分である。
マルチコンジュゲートの例としては、低分子（例えば、ビオチン）コンジュゲートタンパク質、タンパク質-タンパク質コンジュゲート（例えば、酵素にカップリングされた抗体）、抗体薬物コンジュゲート（ADC）として一般的に知られているコンジュゲート（例えば、細胞傷害性低分子にコンジュゲートされたモノクローナル抗体）、ラジオイムノコンジュゲート（例えば、キレート剤にコンジュゲートされたモノクローナル抗体）、ワクチン（例えば、キャリアタンパク質にコンジュゲートされたハプテン）、ナノ粒子および非細胞傷害性薬（例えば、ペプチド）にコンジュゲートされた抗体、元素またはそれらの誘導体にコンジュゲートされた生体分子（例えば、酸化鉄ナノ粒子にコンジュゲートされたTGF-β）、および本明細書に記載されるような他のものが挙げられるが、それらに限定されない。
共有結合性リンカー
本開示の様々な局面および態様では、マルチコンジュゲートを形成するために複数の生物学的部分が共有結合で連結される。本開示および特許請求の範囲を通して、「●」を含むがそれらに限定されないその表示のすべての共有結合性リンカーは、別途明記しない限り、□-●、□-●-□、または●-□のように、共有結合性連結の片側または両側にスペーサー基□を任意で含み得る。
共有結合性リンカーは、切断可能であっても、切断不可能であってもよい。切断可能なリンカーは、投与された際には安定性を維持しつつ、送達された際または細胞内条件下では切断されて生物学的部分の機能的送達を容易にするように、選択または設計され得る。本明細書に提供される共有結合性リンカーの例に加え、当業者は、広範な共有結合性リンカーが、それらの組成物、合成および使用を含め、当技術分野において公知であり、本開示に沿った用途に適合され得ることを認識するだろう。
ヌクレオチドリンカーは、例えば、ウリジン-ウリジン-ウリジン（UUU）、エンドヌクレアーゼで切断可能なリンカーdCdA、およびdTdTdTdTなどの核酸配列を含む、共有結合性リンカーのクラスの一例である。ヌクレオチドリンカーは、その配列が任意の他の指定された機能を果たさないように選択された1つまたは複数のヌクレオチドを含有する。本開示の様々な局面では、共有結合性リンカーは、2～6ヌクレオチド長のヌクレオチドリンカーを含むことができる。
本開示の様々な局面では、共有結合性リンカーは、求核基と求電子基との反応生成物を含む。例えば、共有結合性リンカーは、チオールとマレイミド、チオールとビニルスルホン、チオールとピリジルジスルフィド、チオールとヨードアセトアミド、チオールとアクリレート、アジドとアルキン、またはアミン基とカルボキシル基との反応生成物を含むことができる。本明細書に記載されるように、これらの基の一方が、例えば、マルチコンジュゲートの置換基に接続され（例えば、置換基上のチオール（-SH）官能化）、もう一方の基が、最終的に2つのオリゴヌクレオチドを連結する第2の分子（例えば、連結剤）上に存在する（例えば、DTME中のマレイミド）。
チオールとマレイミドとの反応生成物を含む共有結合性リンカーとしては、DTME（ジチオビスマレイミドエタン）、BM(PEG)2（1,8-ビス(マレイミド)ジエチレングリコール）、BM(PEG)3（1,11-ビスマレイミド-トリエチレングリコール）、BMOE（ビスマレイミドエタン）、BMH（ビスマレイミドヘキサン）、またはBMB（1,4-ビスマレイミドブタン）が挙げられるが、それらに限定されない。DTMEは、細胞質ゾルの還元剤環境で細胞内切断可能な内部ジスルフィドを含有するという点で有利である。
本開示の様々な例および局面では、共有結合性リンカーは、二価であり、このことは、共有結合性リンカーが、生物学的部分との反応のために2つの部位を有することを意味する。「ホモ二価」共有結合性リンカーは、2つの反応性部位が同じであるリンカー（例えば、ジチオ-ビス-マレイミドエタン［DTME］中の2つのマレイミド）のことを指す。当業者は、多種多様なホモ二価共有結合性リンカーが、本開示に沿った用途に適合され得ることを認識するだろう。
他の切断可能なホモ二価共有結合性リンカーとしては、構造11：
X-R-[p（Np）a-Rp（Np）b-Rp（Np）c-Rp（Np）d]-R-X（構造11）
を含む化合物が挙げられるが、それらに限定されず、
構造中、各Xは、独立に、官能基であり；各Rは、独立に、スペーサー基であるかまたは存在せず；各pは、独立に、リン酸の誘導体であるかまたは存在せず、ただし、構造11が少なくとも1つのpを含有しなければならないものとし；各Nは、独立に、ヌクレオシドであるかまたは存在せず；かつ、a、b、c、およびdの各々は、独立に、0～4（各数値を含む）の範囲内の整数であるが、ただし、a＋b＋c＋dの合計が1以上でなければならないものとする。ある態様では、構造11は、少なくとも1つのヌクレオシドNを含有しなければならない。ある態様では、a＋b＋c＋dの合計は、2以上でなければならない。
他の切断可能なホモ二価共有結合性リンカーとしては、同一の官能基をいずれかの端に含む化合物であって、前記官能基が少なくとも1つのアミド結合を含む共有結合性リンカーによってつながれている化合物が挙げられるが、それに限定されない。ある態様では、化合物は、構造12：
Figure 2023545418000007
を含み、
構造中、
（X---）および（---X）は、スペーサー基--に連結された官能基Xの表示であり；かつ
Figure 2023545418000008
は、少なくとも1つのアミド結合を含む化合物の領域である。
例えば、ある態様は、少なくとも1つのアミド結合を含む共有結合性リンカーによってつながれている同一の官能基をいずれかの端に含むホモ二価リンカー化合物を提供し、該化合物が構造12a：
（X---）[R-Aa-Bb-Cc-Dd-R']（---X）構造12a
を含み、
構造中：
（X---）および（---X）は、スペーサー基---に連結された官能基Xの表示であり；
Rは、Hであるか、または存在せず；
R'は、OHであるか、または存在せず；
a、b、c、およびdの各々は、独立に、0または1であるが、ただし、a＋b＋c＋dの合計が2以上とし；かつ
A、B、CおよびDの各々は、独立に、構造12b：
Figure 2023545418000009
を含み、
構造中：
w、x、y、およびzの各々は、独立に、0または1であるが、ただし、w＋x＋y＋zの合計が1以上とし；
各▲は、独立に、H、H2、アルキル、アルコキシ、アルキルカルボキシ、アルキルカルボキサミド、アルキルアミノ、アルキルスルファート、アリール、アリールカルボキシ、アリールカルボキサミド、アリールアミノ、アリールスルファートであるか、または存在せず；
Figure 2023545418000010
の各々は、独立に、存在するかまたは存在せず、存在するならば、環式基の末端を以下のように指定し：
Figure 2023545418000011
は、
Figure 2023545418000012
中のNを末端に指定し；
Figure 2023545418000013
は、
Figure 2023545418000014
中のCを末端に指定し；
Figure 2023545418000015
は、
Figure 2023545418000016
中のCを末端に指定し；
Figure 2023545418000017
は、
Figure 2023545418000018
中のCを末端に指定し；かつ
Figure 2023545418000019
は、
Figure 2023545418000020
中のCを末端に指定し；
ただし、各構造12bは、独立に、ゼロ、1つまたは2つの環式基を含有し、各環式基の末端は、以下：
第1の末端としての
Figure 2023545418000021
および第2の末端としての
Figure 2023545418000022
；
第1の末端としての
Figure 2023545418000023
および第2の末端としての
Figure 2023545418000024
；
第1の末端としての
Figure 2023545418000025
および第2の末端としての
Figure 2023545418000026
；または
第1の末端としての
Figure 2023545418000027
および第2の末端としての
Figure 2023545418000028
から選択されるとし、ただし、さらに、
Figure 2023545418000029
が存在するならば、
Figure 2023545418000030
は、存在せず；
Figure 2023545418000031
が存在するならば、
Figure 2023545418000032
は、存在せず；
Figure 2023545418000033
が存在するならば、
Figure 2023545418000034
は、存在せず；
Figure 2023545418000035
が存在するならば、
Figure 2023545418000036
は、存在せず；
構造12b中に存在する各環式基は、そのそれぞれの末端に加えて、末端Y間に中間部をさらに含み；かつ、各Yは、独立に、アルキル、アルコキシ、アルキルカルボキシ、アルキルカルボキサミド、アルキルアミノ、またはアルキルスルファートであり；
Figure 2023545418000037
の各々は、独立に、存在するかまたは存在せず、存在するならば、H、OH、アルキル、アルキルカルボキシ、アルキルカルボキサミド、アルキルアミノ、アルコキシ、チオアルキル、アルキルチオアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり；
Figure 2023545418000038
の各々は、存在する場合、スペーサー基---に連結された官能基Xの表示である（---X）に任意で結合しており；
各▼は、独立に、OH、アルキル、アルコキシ、アルキルカルボキシ、アルキルカルボキサミド、アルキルアミノ、アルキルスルファート、アリール、アリールカルボキシ、アリールカルボキサミド、アリールアミノ、アリールスルファートであるか、または存在せず；かつ
ただし、結果として得られる構造12aは、化合物がホモ二価リンカー化合物であることに従って、スペーサー基---を介して化合物に連結された官能基Xを2つだけ含有するとする。
本開示の様々な局面では、共有結合性リンカーは、ジスルフィド結合または構造13：
Figure 2023545418000039
の化合物を含むことができ、
構造中、Sは、共有結合によってまたはリンカーによって置換基に付着しており；各R1は、独立に、C2～C10アルキル、C2～C10アルコキシ、C1～C10アリール基であり；R2は、チオプロピオナートまたはジスルフィド基であり；かつ、各Xは、独立に、
Figure 2023545418000040
から選択され、後者の構造は、スクシンアミド酸の誘導体である2つの「開環」位置異性体を表す。
ある特定の態様では、構造13の化合物は、
Figure 2023545418000041
であり、
構造中、Sは、共有結合によってまたはリンカーによって置換基に付着している。
ある特定の態様では、構造13の化合物は、
Figure 2023545418000042
であり、
構造中、両方の環が開環しており（示しているように、様々な位置異性体を表す）、各Sは、それぞれの開環構造上のアルファ炭素原子のいずれかに結合しており、かつ、Sは、共有結合によってまたはリンカーによって置換基に付着している。
ある特定の態様では、構造13の化合物は、
Figure 2023545418000043
であり、
構造中、1つの環が開環しており（示しているように、両位置異性体を表す）、Sは、それぞれの開環構造上のアルファ炭素原子のいずれかに結合しており、かつ、Sは、共有結合によってまたはリンカーによって置換基に付着している。
様々な態様では、構造13の共有結合性リンカーは、構造14：
Figure 2023545418000044
の共有結合連結前駆体から形成され、
構造中、各R1は、独立に、C2～C10アルキル、C2～C10アルコキシ、またはC1～C10アリール基であり；かつ、R2は、チオプロピオナートまたはジスルフィド基である。
本開示の様々な局面では、マルチコンジュゲート内の2つ以上のリンカーは、例えば生体切断可能な連結を含む、直交型の連結を含むことができる。例えば、2つの直交する生体切断可能な連結は、一方に核酸またはオリゴペプチドリンカーを、他方に求核剤と求電子剤（例えば、チオールとマレイミド）との反応生成物を含むリンカーを含むことができる。
本開示の様々な局面では、共有結合性リンカーは、ポリエチレングリコール（PEG）、ポリビニルピロリドンおよびポリオキサゾリンなどの非イオン性親水性ポリマー、またはPLGAおよびPLAなどの疎水性ポリマーを含み得る。
共有結合のメディエーターとして使用されるポリマー連結剤としては、ポリエチレングリコール（PEG）、プルロニック、ポリビニルピロリドン、ポリオキサゾリンもしくはそれらのコーポリマーを含む、非イオン性親水性ポリマー；または、ポリ-L-乳酸、ポリ-D-乳酸、ポリ-D,L-乳酸、ポリ-グリコール酸、ポリ-D-乳酸-コ-グリコール酸、ポリ-L-乳酸-コ-グリコール酸、ポリ-D,L-乳酸-コ-グリコール酸、ポリカプロラクトン、ポリバレロラクトン、ポリヒドロキシブチラート、ポリヒドロキシバレラートもしくはそれらのコーポリマーを含む、1つもしくは複数の生体切断可能なポリエステルポリマーが挙げられるが、それらに限定されない。
連結剤は、約100～10,000ダルトンの分子量を有し得る。そのような連結剤の例としては、ジチオ-ビス-マレイミドエタン（DTME）、1,8-ビス-マレイミドジエチレングリコール（BM(PEG)2）、トリス-(2-マレイミドエチル)-アミン（TMEA）、トリ-スクシンイミジルアミノトリアセタート（TSAT）、3-アーム-ポリ(エチレングリコール)（3-アームPEG）、マレイミド、N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）、ビニルスルホン、ヨードアセチル、ニトロフェニルアジド、イソシアナート、ピリジルジスルフィド、ヒドラジド、およびヒドロキシフェニルアジドが挙げられる。
切断可能な結合または切断不可能な結合を含む連結剤が本明細書において使用され得るが、実際には、いくつかの場合では、同じマルチコンジュゲートにおいて一緒に使用され得る。切断不可能な結合を含む連結剤としては、アミド結合またはウレタン結合を含むものが挙げられるが、それらに限定されない。切断可能な結合を含む連結剤としては、酸で切断可能な結合（例えば、エステル、ヒドラゾン、またはアセタールの共有結合）、還元剤で切断可能な結合（例えば、ジスルフィド結合）、生体切断可能な結合、または酵素で切断可能な結合（例えば、核酸ベースのリンカーまたはオリゴペプチドベースのリンカー）を含むものが挙げられるが、それらに限定されない。いくつかの場合では、切断可能な共有結合性リンカーは、細胞内条件下で切断可能である。加えて、薬物コンジュゲーションに利用可能な任意の連結剤を、非限定的に、本発明の前述の局面において使用することができる。
さらに、官能基と連結剤の組み合わせは、以下を含み得る：（a）官能基がアミノまたはチオールである場合、連結剤は、スクシンイミジル3-(2-ピリジルジチオ)プロピオナート、またはスクシンイミジル6-([3（2-ピリジルジチオ)プロピオアミド]ヘキサノアートであり得；（b）官能基がアミノである場合、連結剤は、3,3'ジチオジプロピオン酸ジ-(N-スクシンイミジルエステル)、ジチオ-ビス(エチル1H-イミダゾール-1-カルボキシラート)、またはジチオ-ビス(エチル1H-イミダゾール-1-カルボキシラート)であり得；（c）官能基がアミノまたはアルキンである場合、連結剤は、スルホ-N-スクシンイミジル3-[[2-(p-アジドサリチルアミド)エチル]-1,3'-ジチオ]プロピオナートであり得；かつ、（d）官能基がチオールである場合、連結剤は、ジチオ-ビス-マレイミドエタン（DTME）、1,8-ビス-マレイミドジエチレングリコール（BM(PEG)2）、またはジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオナート)（DTSSP）であり得る。
本明細書に提供される合成中間体およびマルチコンジュゲートを調製および合成するための様々な方法において、官能基の活性化を伴う工程があり得る。官能基の活性化において使用できる化合物としては、1-エチル-3,3-ジメチルアミノプロピルカルボジイミド、イミダゾール、N-ヒドロキシスクシンイミド、ジクロロヘキシルカルボジイミド、N-ベータ-マレイミドプロピオン酸、N-ベータ-マレイミドプロピルスクシンイミドエステルまたはN-スクシンイミジル3-(2-ピリジルジチオ)プロピオナートが挙げられるが、それらに限定されない。
共有結合性リンカーならびにそれらを製造および使用する方法のさらなる例は、WO2016/205410、WO2018/145086、およびWO 2020/180897に記載されており、その各々は、参照により本明細書に組み入れられる。
一置換共有結合性リンカー
本開示は、一端が置換基Xによって置換されているがもう一端が未置換のままであるホモ二価共有結合性リンカー（「一置換共有結合性リンカー」）を含み、かつ、Xが、核酸以外の生物学的部分を含む、化合物（合成中間体）に関する。一置換共有結合性リンカーは、例えば、後述するような多種多様なマルチコンジュゲートを製造する方法における合成中間体として使用され得る。
本明細書に記載されるホモ二価共有結合性リンカーを含むがそれらに限定されない、多種多様なホモ二価リンカーが、当業者に公知であり、本開示に適用可能である。
本明細書に記載される非核酸生物学的部分を含むがそれらに限定されない、多種多様な核酸以外の生物学的部分が、当業者に公知であり、置換基Xとして本開示に適用可能である。
本開示の一局面では、化合物は、一端が置換基Xによって置換されているホモ二価共有結合性リンカーを含み、Xは、核酸以外の生物学的部分を含み、ホモ二価リンカーのもう一端が未置換であり、化合物は、少なくとも75％純粋である。本開示のいくつかの局面では、化合物は、少なくとも80、85、90、95、96、97、98、99、または100％純粋である。いくつかの局面では、化合物は、約85％～95％純粋である。本開示のいくつかの局面では、化合物の調製物は、75％以上純粋；85％以上純粋；および95％以上純粋であることができる。
本開示の別の局面では、化合物は、構造1：
X-R1-R2-A-R3-B（構造1）
を含み、
構造中：
Xは、核酸以外の生物学的部分を含む置換基であり；
R1は、ホスホジエステル、チオホスホジエステル、スルファート、アミド、トリアゾール、ヘテロアリール、エステル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、チオプロピオナート、アセタール、グリコールを含む基であるか、または存在せず；
R2は、スペーサー基であるか、または存在せず；
Aは、第1の求核剤と第1の求電子剤との反応生成物を含む基であり；
R3は、C2～C10アルキル、C2～C10アルコキシ、C1～C10アリール、C2～C10アルキルジチオ、アミド、エーテル、チオエーテル、エステル、オリゴヌクレオチド、オリゴペプチド、チオプロピオナート、またはジスルフィドを含む基であり；かつ
Bは、第2の求核剤または第2の求電子剤を含む基であり、第2の求核剤が第1の求核剤と同じであり、第2の求電子剤が第1の求電子剤と同じである。
化合物のいくつかの態様では、スペーサー基R2は、C2～C10アルキル、C2～C10アルコキシ、もしくはC1～C10アリールを含むか、または存在しない。
化合物のいくつかの態様では、基Aの第1の求核剤および第1の求電子剤は、（i）任意で、チオールとマレイミドとの反応生成物が、スクシンアミド酸の誘導体である（例えば、マレイミド環の1つが開環している場合の）、チオールおよびマレイミド；（ii）チオールおよびビニルスルホン；（iii）チオールおよびピリジルジスルフィド；（iv）チオールおよびヨードアセトアミド；（v）チオールおよびアクリレート；（vi）アジドおよびアルキン；または（vii）アミンおよびカルボキシルを含む。
化合物のいくつかの態様では、Aは、チオールとマレイミドとの反応生成物を含む基であり、任意で、チオールとマレイミドとの反応生成物は、スクシンアミド酸の誘導体である。
化合物のいくつかの態様では、R3基は、チオプロピオナートまたはジスルフィドを含む。
本開示の別の局面では、化合物は、構造2または構造2a（2つの位置異性体を表す）：
Figure 2023545418000045
を含み、
構造中：
Xは、核酸以外の生物学的部分を含む置換基であり；
R1は、ホスホジエステル、チオホスホジエステル、スルファート、アミド、トリアゾール、ヘテロアリール、エステル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、チオプロピオナート、アセタール、グリコールを含む基であるか、または存在せず；
R2は、スペーサー基であるか、または存在せず；
Sは、硫黄であり；
Nは、窒素であり；かつ
R3は、C2～C10アルキル、C2～C10アルコキシ、C1～C10アリール、C2～C10アルキルジチオ、アミド、エーテル、チオエーテル、エステル、オリゴヌクレオチド、オリゴペプチド、チオプロピオナート、またはジスルフィドを含む基である。
構造2を含む化合物のある態様では、R2スペーサー基は、C2～C10アルキル、C2～C10アルコキシ、またはC1～C10アリールを含む。
構造2を含む化合物のある態様では：
Xは、ペプチドもしくはタンパク質、またはそれらの誘導体であり；
R1およびR2は、存在せず；かつ
R3は、ジスルフィドを含む基である。
構造2を含む化合物のある態様では：
Xは、有機金属化合物またはその誘導体であり；
R1は、エステル基であり；
R2は、C2～C10アルキルを含むスペーサー基であり；かつ
R3は、ジスルフィドを含む基である。
構造2を含む化合物のある態様では：
Xは、低分子またはその誘導体、例えば、低分子治療薬であり；
R1は、エステル基であり；
R2は、C2～C10アルキルを含むスペーサー基であり；かつ
R3は、ジスルフィドを含む基である。
化合物のある態様では、ホモ二価共有結合性リンカーは、細胞内条件下で切断可能なリンカーを含む。
構造1または構造2を含む化合物のある態様では、R3基は、細胞内条件下で切断可能なリンカーを含む。
化合物のある態様では、置換基Xは、ペプチド、タンパク質、脂質、炭水化物、カルボン酸、ビタミン、ステロイド、リグニン、低分子、有機金属化合物、または前述のいずれかの誘導体である。
化合物のある態様では、置換基Xは、（a）ペプチドまたはペプチドの誘導体（多くのものの中で一例は、HIV-1TATタンパク質の形質導入ドメインである）；（b）抗体もしくは抗体断片、またはそれらの誘導体（その一例は、単鎖可変断片である）；（c）炭水化物または炭水化物の誘導体；（d）脂肪酸または脂肪酸の誘導体；（e）ビタミンまたはビタミンの誘導体（その例としては、トコフェロールまたはフォレートが挙げられるが、それらに限定されない）；（f）コレステロールまたはその誘導体；（g）カルボン酸またはその誘導体（その一例は、(2S,2'S)-2,2'-(カルボニルジイミノ)ジペンタン二酸（DUPA）である）；（h）アニサミドまたはその誘導体；（i）有機金属化合物またはその誘導体（一例は、フェロセンである）；（j）低分子またはその誘導体（一例は、レナリドミドである）である。
一置換共有結合性リンカーを合成するための方法
本開示は、一置換共有結合性リンカーの形成を実質的に優先しかつ置換基Xの二量体化を実質的に阻止する反応条件下で、ホモ二価共有結合性リンカーを置換基X（Xは、核酸以外の生物学的部分である）にカップリングする工程を含む、一置換共有結合性リンカーを合成するための方法を提供する。
本開示のいくつかの局面では、該方法は、ホモ二価共有結合性リンカーと、ホモ二価共有結合性リンカーと反応性の官能基を含む官能化置換基Xとを反応させることをさらに含む。この方法のある態様では、官能化置換基Xは、構造3：
X-R1-R2-A'（構造3）
を含み；かつ
ホモ二価共有結合性リンカーは、構造4：
A''-R3-B（構造4）
を含み；かつ
Xは、核酸以外の生物学的部分を含む置換基であり；
R1は、ホスホジエステル、チオホスホジエステル、スルファート、アミド、トリアゾール、ヘテロアリール、エステル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、チオプロピオナート、アセタール、グリコールを含む基であるか、または存在せず；
R2は、スペーサー基であるか、または存在せず；
R3は、C2～C10アルキル、C2～C10アルコキシ、C1～C10アリール、C2～C10アルキルジチオ、アミド、エーテル、チオエーテル、エステル、オリゴヌクレオチド、オリゴペプチド、チオプロピオナート、またはジスルフィドを含む基であり；
A'およびA''は共に、一緒に反応してAを形成する第1の求核剤および第1の求電子剤を含み；かつ
Bは、第2の求核剤または第2の求電子剤を含む基であり、第2の求核剤が第1の求核剤と同じであり、第2の求電子剤が第1の求電子剤と同じであり；かつ
結果として得られる化合物は、構造1：X-R1-R2-A-R3-Bである。
本開示の他の局面では、ホモ二価共有結合性リンカーと官能化R2末端基とを反応させて中間体を形成し、次いで、該中間体の官能化R2末端基と、官能化R2末端基と反応性の官能基を含む官能化置換基Xとを反応させてR1を形成する；ここで、R1は、ホスホジエステル、チオホスホジエステル、スルファート、アミド、トリアゾール、ヘテロアリール、エステル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、チオプロピオナート、アセタール、またはグリコールを含む基であり；かつ、R2は、スペーサー基である。この方法のある態様では、ホモ二価共有結合性リンカーは、構造4：
A''-R3-B（構造4）
を含み、
官能化R2末端基は、構造5：
R1'-R2-A'（構造5）
を含み、
官能化置換基Xは、構造6：
X-R1''（構造6）
を含み；かつ
Xは、核酸以外の生物学的部分を含む置換基であり；
R1'およびR1''は、反応してR1を形成する官能基であり；
R1は、ホスホジエステル、チオホスホジエステル、スルファート、アミド、トリアゾール、ヘテロアリール、エステル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、チオプロピオナート、アセタール、またはグリコールを含む基であり；
R2は、スペーサー基であり；
R3は、C2～C10アルキル、C2～C10アルコキシ、C1～C10アリール、C2～C10アルキルジチオ、アミド、エーテル、チオエーテル、エステル、オリゴヌクレオチド、オリゴペプチド、チオプロピオナート、またはジスルフィドを含む基であり；かつ
A'およびA''は共に、反応してAを形成する第1の求核剤および第1の求電子剤を含み；
Bは、第2の求核剤または第2の求電子剤を含む基であり、第2の求核剤が第1の求核剤と同じであり、第2の求電子剤が第1の求電子剤と同じであり；かつ
結果として得られる化合物は、構造1：X-R1-R2-A-R3-Bである。
該方法のある態様では、置換基Xへのホモ二価共有結合性リンカーのカップリングは、官能化置換基Xと化学量論的過剰のホモ二価共有結合性リンカーとの希釈溶液中で行われる。
該方法のある態様では、置換基Xへのホモ二価共有結合性リンカーのカップリングは、少なくとも約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、または100のモル過剰のホモ二価共有結合性リンカーを用いて行われる。
該方法のある態様では、置換基Xへのホモ二価共有結合性リンカーのカップリングは、約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、または100のモル過剰のホモ二価共有結合性リンカーを用いて行われる。
該方法のある態様では、置換基Xへのホモ二価共有結合性リンカーのカップリングは、水と水混和性の有機共溶媒とを含む溶液中で行われる。ある態様では、水混和性の有機共溶媒は、DMF、NMP、DMSO、アルコール、またはアセトニトリルを含む。ある態様では、水混和性の有機共溶媒は、溶液の約10、15、20、25、30、40、または50％（v/v）を構成する。
上述した合成の方法において使用するためのアルコールとしては、C1～C10アルコール、C1～C7アルコール、およびC1～C5アルコールが挙げられるが、それらに限定されず、いずれの場合も、アミノ、第3級アミノまたはスルファートなどの水混和性基で置換されていてもよい。
該方法のある態様では、置換基Xへのホモ二価共有結合性リンカーのカップリングは、約7、6、5、または4を下回るpHで行われる。
該方法のある態様では、置換基Xへのホモ二価共有結合性リンカーのカップリングは、約7、6、5、または4のpHで行われる。
該方法のある態様では、置換基Xへのホモ二価共有結合性リンカーのカップリングは、無水有機溶媒を含む溶液中で行われる。さらなる態様では、無水有機溶媒は、ジクロロメタン、DMF、DMSO、THF、ジオキサン、ピリジン、アルコール、またはアセトニトリルを含む。
該方法のある態様では、結果として得られる一置換共有結合性リンカーの収率は、少なくとも75、80、85、90、95、96、97、98、99、または100％である。
該方法のある態様では、結果として得られる一置換共有結合性リンカーの純度は、少なくとも75、80、85、90、95、96、97、98、99、または100％である。いくつかの態様では、化合物は、約85％～95％純粋である。いくつかの態様では、化合物の調製物は、75％以上純粋；85％以上純粋；および95％以上純粋であることができる。
二量体型マルチコンジュゲート
本開示は、核酸以外の生物学的部分を含む第1の置換基Xと、Xと同じまたは異なる第2の置換基Yとを含む、マルチコンジュゲートであって、XとYとがホモ二価共有結合性リンカーによってつながれている、マルチコンジュゲート（「二量体型マルチコンジュゲート」）に関する。本開示は、本明細書に提供されるホモ二価共有結合性リンカーの例を含むがそれらに限定されない、切断可能なまたは切断不可能な、あらゆるタイプのホモ二価共有結合性リンカーに適用可能であり；さらに、本明細書に提供される置換基の様々な例を含むがそれらに限定されない、二量体型マルチコンジュゲートの置換基（Xの場合は非核酸、かつ、Yの場合は核酸または非核酸）としてのあらゆるタイプの生物学的部分に適用可能である。
本開示のいくつかの局面では、マルチコンジュゲートは、構造7：
X●Y（構造7）
を含み、
構造中：
Xは、核酸以外の生物学的部分を含む第1の置換基であり；
Yは、Xと同じまたは異なる第2の置換基であり；かつ
●は、XとYとをつなぐ共有結合性リンカーであり、構造8：
-R1-R2-A-R3-A-R2-R1-（構造8）
を含み、
構造中：
各R1は、独立に、ホスホジエステル、チオホスホジエステル、スルファート、アミド、トリアゾール、ヘテロアリール、エステル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、チオプロピオナート、アセタール、グリコールを含む基であるか、または存在せず；
各R2は、独立に、スペーサー基であるか、または存在せず；
各Aは、同じであり、求核剤と求電子剤との反応生成物を含む基であり；
R3は、C2～C10アルキル、C2～C10アルコキシ、C1～C10アリール、C2～C10アルキルジチオ、アミド、エーテル、チオエーテル、エステル、オリゴヌクレオチド、オリゴペプチド、チオプロピオナート、またはジスルフィドを含む基である。
マルチコンジュゲートのある態様では、Yは、Xと異なる。
マルチコンジュゲートのある態様では、Xは、ペプチド、タンパク質、脂質、炭水化物、カルボン酸、ビタミン、ステロイド、リグニン、低分子、有機金属化合物、または前述のいずれかの誘導体である。
マルチコンジュゲートのある態様では、Yは、核酸、ペプチド、タンパク質、脂質、炭水化物、カルボン酸、ビタミン、ステロイド、リグニン、低分子、有機金属化合物、または前述のいずれかの誘導体である。
マルチコンジュゲートの様々な態様では、Xは、（a）ペプチドまたはペプチドの誘導体（その一例は、HIV-1TATタンパク質の形質導入ドメインである）；（b）抗体もしくは抗体断片、またはそれらの誘導体（その一例は、抗体単鎖可変断片である）；（c）低分子またはその誘導体、例えば低分子治療薬（その一例は、レナリドミドである）；（d）有機金属化合物またはその誘導体（その一例は、フェロセンである）である。
マルチコンジュゲートの様々な態様では、Yは、核酸またはその誘導体である。さらなる態様では、Yは、（a）RNA（その例としては、siRNA、saRNA、またはmiRNAが挙げられるが、それらに限定されない）；（b）アンチセンスオリゴヌクレオチド（その例としては、アンチセンスDNAおよびギャップマーが挙げられる）；（c）DNAもしくはRNAアプタマー、または（d）前述のいずれかの誘導体である。
マルチコンジュゲートのある態様では、XとYとをつなぐホモ二価共有結合性リンカーは、細胞内条件下で切断可能であり、本明細書に開示されるまたはそうでなければ当業者に公知である切断可能なホモ二価共有結合性リンカーのいずれかを含み得る。
ある態様では、マルチコンジュゲートは、少なくとも75、80、85、90、95、96、97、98、99、または100％純粋である。いくつかの局面では、マルチコンジュゲートは、約85％～95％純粋である。いくつかの態様では、マルチコンジュゲートの調製物は、75％以上純粋；85％以上純粋；および95％以上純粋であることができる。
二量体型マルチコンジュゲートを合成するための方法
本開示は、核酸以外の生物学的部分を含む第1の置換基Xと、Xと同じまたは異なる第2の置換基Yとを含む、マルチコンジュゲートであって、XとYとがホモ二価共有結合性リンカーによってつながれている、マルチコンジュゲート（二量体型マルチコンジュゲート）を、X●Y二量体の形成を実質的に優先しかつX●X二量体およびY●Y二量体の形成を実質的に阻止する反応条件下で合成するための方法を提供する。
ある態様では、本開示は、構造7：
X●Y（構造7）
のマルチコンジュゲートを合成するための方法を提供し、
構造中：
Xは、核酸以外の生物学的部分を含む第1の置換基であり；
Yは、Xと同じまたは異なる第2の置換基であり；かつ
●は、XとYとをつなぐ共有結合性リンカーであり、
該方法が、以下の工程：
（a）X-R4とホモ二価リンカー○とを反応させて、一置換生成物X-○を生成する工程であって、R4が、一置換生成物X-○を生成しかつXの二量体化を実質的に阻止する条件下で、○と反応可能な官能基である、工程；および
（b）X-○とR5-Yとを反応させる工程であって、R5が、○と反応可能な官能基であり、それによりX●Yを形成する、工程
を含む。
別の態様では、本開示は、構造7：
X●Y（構造7）
のマルチコンジュゲートを合成するための方法を提供し、
構造中：
Xは、核酸以外の生物学的部分を含む第1の置換基であり；
Yは、Xと同じまたは異なる第2の置換基であり；かつ
●は、XとYとをつなぐ共有結合性リンカーであり；
該方法が、以下の工程：
（a）R4-Yとホモ二価リンカー○とを反応させて、一置換生成物○-Yを生成する工程であって、R4が、一置換生成物○-Yを生成しかつYの二量体化を実質的に阻止する条件下で、○と反応可能な官能基である、工程；および
（b）○-YとX-R5とを反応させる工程であって、R5が、○と反応可能な官能基であり、それによりX●Yを形成する、工程
を含む。
構造7のマルチコンジュゲートを合成するための方法のある態様では、工程（a）は、X-R4に対して化学量論的過剰のホモ二価リンカー○を用いて行われる。
構造7のマルチコンジュゲートを合成するための方法のある態様では、工程（a）は、R4-Yに対して化学量論的過剰のホモ二価リンカー○を用いて行われる。
構造7のマルチコンジュゲートを合成するための方法のある態様では、工程（a）は、約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、または100のモル過剰のホモ二価リンカー○を用いて行われる。
構造7のマルチコンジュゲートを合成するための方法のある態様では、工程（a）は、水と、任意で、水混和性の有機共溶媒とを含む溶液中で行われる。さらなる態様では、水混和性の有機共溶媒が使用される場合、水混和性の有機共溶媒は、DMF、DMSO、THF、ジオキサン、ピリジン、アルコール、またはアセトニトリルを含む。さらなる態様では、水混和性の有機共溶媒は、溶液の約10、15、20、25、30、40、または50％（v/v）を構成する。
上述した合成の方法において使用するためのアルコールとしては、C1～C10アルコール、C1～C7アルコール、およびC1～C5アルコールが挙げられるが、それらに限定されず、いずれの場合も、アミノ、第3級アミノまたはスルファートなどの水混和性増強基で置換されていてもよい。
構造7のマルチコンジュゲートを合成するための方法のある態様では、工程（a）は、約7、6、5、または4のpHで行われる。
構造7のマルチコンジュゲートを合成するための方法のある態様では、工程（a）は、無水有機溶媒を含む溶液中で行われる。さらなる態様では、無水有機溶媒は、ジクロロメタン、DMF、DMSO、THF、ジオキサン、ピリジン、アルコール、またはアセトニトリルを含む。
上記方法のある態様では：（a）二量体型マルチコンジュゲートの収率は、少なくとも75、80、85、90、95、96、97、98、99、または100％であり；かつ／または（b）二量体型マルチコンジュゲートの純度は、少なくとも75、80、85、90、95、96、97、98、99、または100％である。いくつかの態様では、マルチコンジュゲートは、約85％～95％純粋である。いくつかの態様では、マルチコンジュゲートの調製物は、75％以上純粋；85％以上純粋；および95％以上純粋であることができる。
より大きなマルチコンジュゲート
本開示はまた、各々が生物学的部分であり、同じであっても異なっていてもよく、かつ、各々が共有結合性リンカーによって互いにつながれている、少なくとも3つの置換基を含む、より大きなマルチコンジュゲートであって；少なくとも1つの置換基が、核酸ではない（非核酸置換基）、マルチコンジュゲートにも関する。本開示は、本明細書に提供される共有結合性リンカーの例を含むがそれらに限定されない、当業者に公知の切断可能なまたは切断不可能な、あらゆるタイプの共有結合性リンカーに適用可能であり；さらに、本明細書に提供される置換基の様々な例を含むがそれらに限定されない、マルチコンジュゲートの置換基としてのあらゆるタイプの生物学的部分に適用可能である。
様々な態様では、マルチコンジュゲートは、（a）2つ以上の置換基；（b）2、3、4、5、6、7、8、9、または10個の置換基を含む。
様々な態様では、マルチコンジュゲートは、（a）異なる少なくとも2つの置換基；（b）同じである少なくとも2つの置換基を含む。
いくつかの態様では、（a）マルチコンジュゲート中の置換基のすべてが異なるか；または（b）マルチコンジュゲート中の置換基のすべてが同じである。
このマルチコンジュゲートのある態様では、本開示は、置換基X、Y、およびZを含むマルチコンジュゲートを提供し、置換基の各々が、独立に、生物学的部分であり、かつ共有結合性リンカー●によって別の置換基につながれており；該マルチコンジュゲートが、構造9：
Figure 2023545418000046
を含み、
構造中：
▲1、▲2、▲3、▲4、および▲5の各々は、独立に、存在しないか、またはそのそれぞれの置換基に共有結合で連結された生物学的部分を含み；
nは、ゼロ以上の整数であり；かつ
構造9中に存在する置換基の少なくとも1つは、核酸ではない。
構造9のマルチコンジュゲートのいくつかの態様では、nは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10である。
構造9のマルチコンジュゲートのいくつかの態様では、Xは、核酸ではない。いくつかの態様では、Yは、核酸ではない。いくつかの態様では、Zは、その繰り返しのいずれにおいても、核酸ではない。
構造9のマルチコンジュゲートのある態様では、少なくとも1つの共有結合性リンカー●は、ホモ二価共有結合性リンカーである。
構造9のマルチコンジュゲートのある態様では、少なくとも1つの▲が存在する。いくつかの態様では、少なくとも1つの▲は、標的化部分である。いくつかの態様では、少なくとも1つの▲は、エンドソーム脱出部分である。いくつかの態様では、マルチコンジュゲートは、少なくとも1つの標的化部分と少なくとも1つのエンドソーム脱出部分とを含む。いくつかの態様では、少なくとも1つの▲は、検出可能ラベルである。いくつかの態様では、マルチコンジュゲートは、少なくとも1つの標的化部分と、エンドソーム脱出部分と、検出可能ラベルとを含む。
構造9のマルチコンジュゲートのある態様では、マルチコンジュゲートの少なくとも1つの末端は、▲に共有結合される。いくつかの態様では、マルチコンジュゲートの少なくとも1つの内部置換基は、▲に共有結合される。いくつかの態様では、マルチコンジュゲートの少なくとも1つの末端は、▲に共有結合され、マルチコンジュゲートの少なくとも1つの内部置換基は、▲に共有結合される。いくつかの態様では、マルチコンジュゲートの末端の各々は、▲に共有結合され、マルチコンジュゲートの内部置換基の各々は、▲に共有結合される。
いくつかの態様では、マルチコンジュゲート中に存在する▲の少なくとも1つは、マルチコンジュゲート中に存在する他のいずれの▲とも異なる。いくつかの態様では、マルチコンジュゲート中に存在する▲のすべてが同じである。いくつかの態様では、マルチコンジュゲート中に存在する▲のすべてが異なる。
構造9のマルチコンジュゲートのある態様では、少なくとも1つの共有結合性リンカー●は、硫黄含有共有結合性リンカーであり；かつ、▲1、▲2、▲3、▲4、および▲5の少なくとも1つは、硫黄含有末端基Qを含む。さらなる態様では、硫黄含有末端基Qは、脱保護条件下で脱保護可能な保護チオール基を含み；かつ、硫黄含有共有結合性リンカー●は、脱保護条件下で安定である。別の態様では、硫黄含有共有結合性リンカー●は、脱保護条件ではない切断条件下で切断可能な切断可能基を含む。さらなる態様では、硫黄含有末端基Qは、保護チオールを含む。
少なくとも1つの置換基が非核酸置換基であるより大きなマルチコンジュゲートの様々な態様では、核酸を含む2つ以上の連続した置換基のストレッチがあり得；かつ、このストレッチは、本明細書において、マルチコンジュゲートの「多量体オリゴヌクレオチド成分」と称される。いくつかのマルチコンジュゲートは、そのような多量体オリゴヌクレオチド成分を1個超含有し得る。
したがって、マルチコンジュゲートの多量体オリゴヌクレオチド成分は、共有結合性リンカーによって一緒につながれた2つ以上のオリゴヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、一本鎖であっても二本鎖であってもよく；かつ、成分中のオリゴヌクレオチドは、同じであってもよく（ホモ多量体）、異なっていてもよい（ヘテロ多量体）。マルチコンジュゲートの多量体オリゴヌクレオチド成分を構成し得るオリゴヌクレオチドの例としては、siRNA、saRNA、miRNA、DNAまたはRNAアプタマー、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられるが、それらに限定されない。いくつかの態様では、各オリゴヌクレオチドは、15～30、17～27、19～26、または20～25ヌクレオチド長である。
マルチコンジュゲートの多量体オリゴヌクレオチド成分の単純な態様は、5'から3'へ、3'から3'へ、または5'から5'へ配向された、2つのオリゴヌクレオチドの二量体であり；その各々は、一本鎖であっても二本鎖であってもよく；かつ、各オリゴヌクレオチドの配列は、同じであっても異なっていてもよい。
本開示のこの局面の他の態様では、マルチコンジュゲートの多量体オリゴヌクレオチド成分は、構造15：
Figure 2023545418000047
を含み、
構造中、オリゴヌクレオチドサブユニット
Figure 2023545418000048
の各々は、独立に、一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドであり；サブユニット
Figure 2023545418000049
の各々は、共有結合性リンカー●によって別のサブユニットにつながれており；サブユニット
Figure 2023545418000050
の少なくとも1つは、その3’末端につながれた共有結合性リンカー●の一方およびその5’末端につながれた共有結合性リンカーのもう一方を有する鎖を含み、かつ、nは、≧0の整数である。
本開示のこの局面の他の態様では、マルチコンジュゲートの多量体オリゴヌクレオチド成分内の各オリゴヌクレオチドサブユニット
Figure 2023545418000051
は、二本鎖オリゴヌクレオチド
Figure 2023545418000052
であり、各共有結合性リンカー●は、構造16：
Figure 2023545418000053
のように、同じ鎖上にあり、
構造中、dは、≧0の整数である。
本開示のこの局面の他の態様では、マルチコンジュゲートの多量体オリゴヌクレオチド成分内の各オリゴヌクレオチドサブユニット
Figure 2023545418000054
は、一本鎖オリゴヌクレオチド
Figure 2023545418000055
であり、各共有結合性リンカー●は、同じ鎖上にあり、例えば限定されないが、構造34：
Figure 2023545418000056
の多量体オリゴヌクレオチドである。そのような一態様では、少なくとも1つの一本鎖オリゴヌクレオチド
Figure 2023545418000057
は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。別の態様では、各一本鎖オリゴヌクレオチド
Figure 2023545418000058
は、独立に、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
本開示のこの局面の他の態様では、多量体オリゴヌクレオチド成分は、構造17または構造18：
Figure 2023545418000059
を含み、
構造中、各
Figure 2023545418000060
は、二本鎖オリゴヌクレオチドであり、各●は、隣接する二本鎖オリゴヌクレオチドをつなぐ共有結合性リンカーであり、fは、≧1の整数であり、gは、≧0の整数である。
本開示のこの局面の別の態様では、マルチコンジュゲートの多量体オリゴヌクレオチド成分は、構造19、20、21、または22：
Figure 2023545418000061
による化合物を含み、
構造中、各
Figure 2023545418000062
は、二本鎖オリゴヌクレオチドであり、
各
Figure 2023545418000063
は、一本鎖オリゴヌクレオチドであり、
各●は、隣接する一本鎖オリゴヌクレオチドの一本鎖をつなぐ共有結合性リンカーであり、mは、≧1の整数であり、nは、≧0の整数である。
本開示のこの局面の別の態様では、マルチコンジュゲートの多量体オリゴヌクレオチド成分は、共有結合性リンカー●の少なくとも1つが3つ以上のオリゴヌクレオチドサブユニット
Figure 2023545418000064
をつなぐ、分岐構造を含む。構造23は、分岐構造：
Figure 2023545418000065
を含む多量体オリゴヌクレオチド成分の一例を提供する。
本開示のこの局面のさらに別の態様では、マルチコンジュゲートの多量体オリゴヌクレオチド成分は、構造24：
Figure 2023545418000066
のような、分割鎖を含むオリゴヌクレオチドサブユニットを含み、
構造中、各
Figure 2023545418000067
は、部分的一本鎖オリゴヌクレオチドであり；かつ
Figure 2023545418000068
は、部分的一本鎖オリゴヌクレオチドにアニーリングする相補鎖である。
本開示のこの局面のいくつかの態様では、マルチコンジュゲートの多量体オリゴヌクレオチド成分内の各オリゴヌクレオチドサブユニットは、独立に、5個未満のホスホロチオアート基；または4個未満のホスホロチオアート基；または3個未満のホスホロチオアート基を含有する。
本開示のこの局面のいくつかの態様では、オリゴヌクレオチドサブユニット内のヌクレオチド75％未満が化学修飾されるか；またはオリゴヌクレオチドサブユニット内のヌクレオチドの80％未満が化学修飾される。
本開示のこの局面のいくつかの態様では、マルチコンジュゲートのオリゴヌクレオチド成分内の少なくとも1つのオリゴヌクレオチドサブユニットは、別のサブユニットと異なる。別の態様では、オリゴヌクレオチド成分内のオリゴヌクレオチドサブユニットのすべてが互いに異なる。
本開示のこの局面のいくつかの態様では、マルチコンジュゲートのオリゴヌクレオチド成分内の少なくとも2つのオリゴヌクレオチドサブユニットは、共有結合性リンカーによって第1のサブユニットの3'端と第2のサブユニットの5'端との間でつながれるか；または、共有結合性リンカーによって第1のサブユニットの5'端と第2のサブユニットの3'端との間でつながれるか；または、共有結合性リンカーによって第1のサブユニットの5'端と第2のサブユニットの5'端との間でつながれる。
本開示のこの局面のいくつかの態様では、マルチコンジュゲートのオリゴヌクレオチド成分内のすべての二本鎖オリゴヌクレオチドサブユニットは、平滑末端型（すなわち、対称）である；言い換えれば、いずれもオーバーハングヌクレオチドを有する鎖（すなわち、非対称）を含有しない。
本開示のこの局面のいくつかの態様では、マルチコンジュゲートの多量体オリゴヌクレオチド成分は、1つまたは複数の化学修飾されたヌクレオチドを含むが、3つの連続ヌクレオチド上に3つの同一の化学修飾を含有しない。
いくつかの態様では、多量体オリゴヌクレオチド成分は、センス鎖およびアンチセンス鎖を有する二本鎖サブユニット
Figure 2023545418000069
を含まず、センス鎖およびアンチセンス鎖は、構造F：
センス鎖：5' np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3'
アンチセンス：3' np'-Na'-(X'X'X')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(Z'Z'Z')l-Na'-nq' 5'
を含み、
構造中、i、j、k、およびlは、各々独立に、0または1であり；p、p'、q、およびq'は、各々独立に、0～6であり；各NaおよびNa'は、独立に、0～25個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも2つの異なる修飾ヌクレオチドを含み；各NbおよびNb'は、独立に、0～10個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；各np'、np、nq'、およびnqは、独立に、オーバーハングヌクレオチドを表すかまたは存在しなくてもよく；かつ、XXX、YYY、ZZZ、X'X'X'、Y'Y'Y'、およびZ'Z'Z'は、各々独立に、3つの連続ヌクレオチド上の3つの同一修飾の1つのモチーフを表す。X、Y、およびZの各々は、互いに同じであっても異なっていてもよい。
いくつかの態様では、多量体オリゴヌクレオチド成分は、センス鎖およびアンチセンス鎖を有する二本鎖サブユニット
Figure 2023545418000070
を含まず、センス鎖およびアンチセンス鎖は、構造F1：
5' np-Na-YYY-Na-nq 3'
3' np'-Na'-Y'Y'Y'-Na'-nq' 5'
を含み、
構造中、各Naは、独立に、2～20、2～15、または2～10個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
いくつかの態様では、多量体オリゴヌクレオチドは、センス鎖およびアンチセンス鎖を有する二本鎖サブユニット
Figure 2023545418000071
を含まず、センス鎖およびアンチセンス鎖は、構造F2：
5' np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3'
3' np'-Na'-Y'Y'Y'-Nb'-Z'Z'Z'-Na'-nq' 5'
を含み、各Nbは、独立に、1～10、1～7、1～5または1～4個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Naは、独立に、2～20、2～15、または2～10個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。X、Y、およびZの各々は、互いに同じであっても異なっていてもよい。
いくつかの態様では、多量体オリゴヌクレオチド成分は、センス鎖およびアンチセンス鎖を有する二本鎖サブユニット
Figure 2023545418000072
を含まず、センス鎖およびアンチセンス鎖は、構造F3：
5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 3'
3' np'-Na'-X'X'X'-Nb'-Y'Y'Y'-Na'-nq' 5'
を含み、
構造中、Nb、Nb'は、独立に、0～10、0～7、0～10、0～7、0～5、0～4、0～2または0個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Naは、独立に、2～20、2～15、または2～10個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。X、Y、およびZの各々は、互いに同じであっても異なっていてもよい。
いくつかの態様では、多量体オリゴヌクレオチド成分は、センス鎖およびアンチセンス鎖を有する二本鎖サブユニット
Figure 2023545418000073
を含まず、センス鎖およびアンチセンス鎖は、構造F4：
5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3'
3' np'-Na'-X'X'X'-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-Z'Z'Z'-Na'-nq' 5'
を含み、
構造中、Nb、Nb'は、独立に、0～10、0～7、0～10、0～7、0～5、0～4、0～2または0個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Na、Na'は、独立に、2～20、2～15、または2～10個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。Na、Na'、NbおよびNb'の各々は、独立に、代替パターンの修飾を含む。X、Y、およびZの各々は、互いに同じであっても異なっていてもよい。
いくつかの態様では、多量体オリゴヌクレオチド成分は、センス鎖およびアンチセンス鎖を有する二本鎖サブユニット
Figure 2023545418000074
を含まず、センス鎖およびアンチセンス鎖は、構造F5：
5'-Na-Y Y Y-Na-3'
3' np'-Na'-Y' Y' Y'-Na' 5'
を含み、
構造中：
np'は、2ヌクレオチドオーバーハングであり、np'内の各ヌクレオチドは、ホスホロチオアート連結を介して隣接ヌクレオチドに連結され；
各NaおよびNa'は、独立に、修飾されたまたは未修飾のまたはそれらの組み合わせのいずれかである0～25個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも2つの異なる修飾ヌクレオチドを含み；
YYYおよびY'Y'Y'は、各々独立に、3つの連続ヌクレオチド上の3つの同一修飾の1つのモチーフを表す。
いくつかの態様では、多量体オリゴヌクレオチド成分は、US 10,612,024；US 2017/0275626 A1；US 2017/0369872 A1；WO 2019/036612 A1においてこれらの公報に開示されている様々な態様のいずれかの式（I）によって表される二本鎖サブユニットを含まず、その各々は、それらの全体が本明細書に組み入れられる。
いくつかの態様では、多量体オリゴヌクレオチド成分は、3つ以上のオリゴヌクレオチドをカップリングする分岐連結を含まない。
本開示の範囲内の多量体オリゴヌクレオチドおよび多量体オリゴヌクレオチドを合成するための方法のさらなる例は、米国特許9,644,209および10,597,659；WO 2016/205410 A2；WO 2018/145086 A1；およびWO 2020/180897に開示されており、その各々は、それらの全体が本明細書に組み入れられる。
上で述べたように、マルチコンジュゲートのすべてにおける共有結合性リンカー（そのいくつかは、「●」として表される）は、□-●、□-●-□、または●-□のように、共有結合性連結の片側または両側にスペーサー基□を任意で含み得る。
さらに、マルチコンジュゲート中の共有結合性リンカーは、切断可能であっても、切断不可能であってもよい。切断可能なリンカーは、投与された際には安定性を維持しつつ、送達された際または細胞内条件下では切断されて生物学的部分の機能的送達を容易にするように、選択または設計され得る。本開示全体を通して提供される共有結合性リンカーの例に加え、当業者は、広範な共有結合性リンカーが、それらの組成物、合成および使用を含め、当技術分野において公知であり、本開示に沿った用途に適合され得ることを認識するだろう。
より大きなマルチコンジュゲートのいくつかの態様では、各共有結合性リンカーは、同じである。いくつかの態様では、共有結合性リンカーのすべてが異なる。いくつかの態様では、共有結合性リンカーの少なくとも1つは、別の共有結合性リンカーと異なる。
いくつかの態様では、各共有結合性リンカーは、マルチコンジュゲートの2つの置換基をつなぐ。いくつかの態様では、少なくとも1つの共有結合性リンカーは、マルチコンジュゲートの3つ以上の置換基をつなぐ。
より大きなマルチコンジュゲートを合成するための方法
本開示はまた、各々が共有結合性リンカーによって互いにつながれた、同じであっても異なっていてもよい生物学的に活性な置換基X、Y、およびZを含む、マルチコンジュゲートを合成するための方法も提供する。
構造10：
Figure 2023545418000075
を含むマルチコンジュゲートを合成するための方法であって、
構造10aの化合物とホモ二価リンカーとを、一置換生成物（構造10b）を生成しかつ構造10aの二量体化を実質的に阻止する条件下で反応させて、構造10bの化合物を形成すること；
構造10bの化合物と構造10cの化合物とを反応させて、構造10dの化合物を形成すること；
構造10dの化合物を脱保護して、構造10eの化合物を形成すること；および
構造10eの化合物と構造10fの化合物とを反応させて、構造10を形成すること
を次のとおり：
Figure 2023545418000076
含み、
構造中：
●は、共有結合性リンカーであり；
○は、ホモ二価リンカーであり；
R4は、構造10bの一置換生成物を生成しかつ構造10aの二量体化を実質的に阻止する条件下でホモ二価リンカー○と反応するように選択された官能基であり；
R5は、ホモ二価リンカー○と反応するように選択された官能基であり；
S-PGは、構造10b、10c、および10d内の共有結合性リンカー●のいずれかに存在するどの硫黄含有基とも異なる硫黄含有基を含む保護チオール基であり；
Qは、構造10eの-SH基と反応して共有結合性リンカー●を形成するように選択された反応性基であり；
X、Y、およびZは、マルチコンジュゲートの置換基であり、かつ各々が、生物学的部分であり；
Z'、Z''、およびZ'''は、マルチコンジュゲートの置換基であり、かつ各々が、生物学的部分であり；
▲1、▲2、▲3、▲4、および▲5の各々は、独立に、存在しないか、またはそのそれぞれの置換基に共有結合で連結された生物学的部分を含み；
▲3'、▲3''、および▲3'''の各々は、独立に、存在しないか、またはそのそれぞれの置換基に共有結合で連結された生物学的部分を含み；
nは、1以上の整数であり、任意で、nは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10であり；かつ
n'、n''、およびn'''は、各々、ゼロ以上の整数であるが、ただし、n'+n''+n'''の合計が、nであるとする、
方法。
開示される化合物およびマルチコンジュゲートを使用するための方法
本開示はまた、開示されるマルチコンジュゲートおよび合成中間体を、遺伝子発現の調節、生物学的研究、病状の治療もしくは予防において、および／または新たなもしくは変化した遺伝子型もしくは表現型を生成するために使用する方法も提供する。
マルチコンジュゲートの薬物動態学特性および薬力学特性
血流中の薬物の生物学的利用能は、標的細胞の取り込みと腎クリアランスとの間のバランスとして特徴付けることができる。実用的な観点から、インビボ循環半減期および／またはインビボ活性は、それらが容易に定量かつ測定できることから、かつ、それらの改善（例えば、増加）が改善された薬力学および／または薬物動態学と相関し得ることから、腎クリアランス／糸球体濾過の良好なプロキシである。
治療用物質（TA）の血中取り込み速度は、多数の因子の関数であり、次のように表すことができる：取り込み速度＝f｛（TA濃度）×（血流量）×（受容体コピー数／細胞）×（細胞の数）×（平衡解離定数Kd）×（内在化速度）｝。所与のリガンド／受容体ペアについて、コピー数、Kd、細胞の数および内在化速度は、一定であろう。これは、GalNAcリガンド系が肝細胞に対してそのように有効であるかの理由を説明することができ、それは、高コピー数で存在しかつ高い内在化速度を有するASGP受容体を標的とするからである。いくつかのASGP/GalNAcバリアントのKdはナノモル範囲にあり、内在化速度は非常に速い。
しかしながら、有効な標的化は、治療用物質の濃度にも依存し、これは、血流からのクリアランスのために時間と共に急速に減少する。治療用物質（TA）のクリアランス速度は、次のように表すことができる：クリアランス速度＝f｛（血流量）×（腎濾過量）×（他のクリアランス機構）｝。結果として生じる時間tでのTAの濃度は、次のように表すことができる：（ONT濃度）t＝f｛（初期濃度）－（クリアランス速度×t）｝。
ヒトでは、クリアランスは、主に、腎臓の糸球体濾過による。一般に、約45kD未満の分子は、約30分の半減期を有する。マウスでは、クリアランス速度はさらにより速く、循環半減期は、約5分である。いかなる特定の理論によっても束縛されることを望むものではないが、本開示は、特別に構成されたマルチコンジュゲート（例えば、特定の組成、サイズ、重量など）を使用して糸球体濾過を低減させることができ、より低いクリアランス速度を導き、結果として、所与の時間tで治療用物質のより高い循環中濃度（例えば、増加した血清半減期、より高い全体の取り込み、およびより高い活性）をもたらすことができると考えられる。
ここでも、いかなる特定の理論によっても束縛されることを望むものではないが、実際の糸球体濾過量は、直接測定することが難しい場合がある。例えば、糸球体毛細血管を通過する化合物は、尿細管上皮細胞などの細胞によって容易に吸収され、これは、治療用物質またはそれらの代謝物をかなりの時間にわたり保持することができる（例えば、Henry, S. P. et al; Toxicology, 301, 13-20 (2012) および van de Water, F.M et al; Drug metabolism and Disposition, 34, No 8, 1393-1397 (2006)を参照のこと）。加えて、吸収された化合物は、分解産物へと代謝されることができ、これは、次いで、尿に排出される。したがって、治療用物質の指定の時点での濃度（例えば、尿中）は、必ずしも糸球体濾過量を表すものではない可能性がある。しかしながら、糸球体濾過に関連しかつ直接測定可能である血清半減期は、糸球体濾過の好適なプロキシと考えられ得る。
以下の表1は、成分の循環半減期（t1/2）の増加が、結果として生じる時間tでの成分濃度に対して劇的な効果を有し得ることを示す。
（表１）時間tでの濃度に対する循環半減期（t1/2）の増加の効果
Figure 2023545418000077
値は、時間tでの初期用量の％として示される。
したがって、成分の半減期の2倍の増加は、2時間でのその残留濃度を4倍増加させる。半減期の4倍の増加は、残留濃度のさらにより劇的な改善を導き、2時間および4時間で、それぞれ、8倍および60倍超である。
本明細書に開示されるマルチコンジュゲートは、腎臓および／または他のクリアランス経路によるマルチコンジュゲートの減少したクリアランスをもたらす分子量および／またはサイズおよび／または構造を有するように構成され得る。この構成戦略はまた、対象に投与された際に、単量体形態で投与された際の循環半減期および同じ置換基の生物活性と比べて、マルチコンジュゲートの増加した循環半減期および／またはマルチコンジュゲート内の1つもしくは複数の置換基の増加した生物活性ももたらし得る。
マルチコンジュゲート中のsiRNA置換基の場合、例えば、増加した生物活性は、マルチコンジュゲートの投与後のsiRNAの標的タンパク質またはmRNAのレベルが、対応する単量体siRNAオリゴヌクレオチドの投与後に測定された場合の同じタンパク質またはmRNAのレベルと比べてより低いことが測定されることによって表され得る。
本開示の様々な局面では、インビボ循環半減期または血清半減期は、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、500、または1,000倍増加する。様々な局面では、生物活性の増加は、tmaxでの生物活性の比として測定される。様々な態様では、生物活性は、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、500、または1,000倍増加する。その対応する単量体形態と比較した場合の多量体中の置換基の少なくとも1つの生物活性の相対増加は、2～10倍以上高い範囲にあり得、例えば、相対増加は、対応する単量体のものの2倍、5倍、10倍、またはそれ以上の倍数であり得る。一態様では、これらの増加は、マウスで観察される。別の態様では、これらの増加は、ヒトで観察される。
本開示のいくつかの局面では、マルチコンジュゲートは、少なくとも約45kDの分子量、または約45kD～60kDの範囲の分子量を有するように構成される。
ある態様では、マルチコンジュゲート内の血清半減期および／またはその1つもしくは複数の置換基の生物活性の増加は、マルチコンジュゲート中のホスホロチオアート含量に依存しない。
さらなる局面では、マルチコンジュゲートは、皮下（SC）投与を介して対象に投与された際に、置換基の1つまたは複数の単量体形態と比べて低下したSC組織からの放出速度を有し得る。マルチコンジュゲートのSC投与と増加した血清半減期の局面が組み合わさると、マルチコンジュゲートのSC組織からの低下した放出速度が、低下した腎臓による全身クリアランスと合わさって、生物活性に対して相乗効果が生じ、それにより、単量体等価物と比べてマルチコンジュゲートの細胞送達および内在化の潜在時間をさらに増加させ、かつ、それにより、その単量体等価物と比べてマルチコンジュゲート中の少なくとも1つの置換基の生物活性をさらに増加させ得る。
細胞または組織を標的とする部分と組み合わせると、同じ活性物質の2つ以上の置換基を含むマルチコンジュゲートは、活性物質の単量体等価物よりも多くの細胞または組織結合イベント当たりのペイロードを送達することができる。マルチコンジュゲートはまた、標的化部分の2つ以上のコピーを含むこともできる。同じく、マルチコンジュゲートは、追加で、機能的送達または細胞内放出を促進するなどの他の目的のために設計された他の生物学的部分を含むことができる。組み合わさって、これらの効果は、治療用物質の取り込みおよび生物活性の劇的な増加を導くことができる。これは、所与のリガンド／受容体ペアの受容体コピー数、Kd、標的細胞の数および内在化速度のいくつかの組み合わせが最適に満たない場合に、特に有利であり得る。
ある特定のポリマー連結剤およびマルチコンジュゲート置換基、例えばポリエチレングリコール（PEG）は、ある特定の薬物の循環半減期を増加させるのに有用であり得る。そのようなアプローチは、治療用物質を「希釈する」（例えば、単位質量当たりの活性物質がより少ない）などの欠点を有し得る。本開示は、いくつかの局面では、そのようなアプローチと区別される。例えば、様々な態様では、マルチコンジュゲートは、PEGまたは類似の構成成分を含まない。様々な態様では、マルチコンジュゲートは、ポリエーテル化合物を含まない。様々な態様では、マルチコンジュゲートは、いくつかの場合では、オリゴヌクレオチド以外のポリマーを含まない。
ナノ粒子、例えば、脂質ナノ粒子（LNP）は、ある特定の薬物の循環半減期を増加させようと使用されてきた。そのようなアプローチは、増加した毒性（例えば、カチオン性脂質からの）などの欠点を有し得る。本開示は、そのようなアプローチから区別することができる。例えば、本開示の様々な局面では、マルチコンジュゲートは、ナノ粒子中に製剤化されない。
加えて、ホスホロチオアート基も、ある特定の薬物の循環半減期を増加させるために使用されてきた。そのようなアプローチは、より低い活性などの欠点を有し得る。本開示は、そのようなアプローチから区別することができる。例えば、本開示の様々な局面では、マルチコンジュゲートは、ホスホロチオアートを含まないか、または当分野において公知の類似のマルチコンジュゲートと比較してより少ない数のホスホロチオアートを含有する。
したがって、本明細書に開示されるマルチコンジュゲートは、（a）マルチコンジュゲートのインビボ循環半減期が、個々の単量体置換基の1つもしくは複数のものと比べて増加するように、かつ／または（b）マルチコンジュゲートの生物活性が、1つもしくは複数の個々の単量体置換基のものと比べて増加するように、分子サイズ、重量および／または構造に関して構成され得る。
治療の方法および投与の方法
様々な局面では、本開示は、本開示のマルチコンジュゲートの有効量を対象に投与する、疾患または障害の予防または改善を望む対象を治療する方法を提供する。そのような方法では、マルチコンジュゲートは、一緒に共有結合で連結された2つ以上の置換基を含み、各置換基は生物学的部分を含み、少なくとも1つの置換基は、核酸ではない（すなわち、「非核酸置換基」である）。
いくつかの治療の方法では、マルチコンジュゲートは、3つ以上の置換基を有するか；またはマルチコンジュゲートは、3、4、5、6、7、8、9、10、11または12個の置換基を有する。
いくつかの治療の方法では、マルチコンジュゲートは、ホモ二価共有結合性リンカーである少なくとも1つの共有結合性リンカーを有する。
いくつかの治療の方法では、マルチコンジュゲートは、細胞内条件下で切断可能である少なくとも1つの共有結合性リンカーを含む。いくつかの方法では、マルチコンジュゲートは、本明細書に開示されるまたはそうでなければ当業者に公知である切断可能なホモ二価共有結合性リンカーのいずれかを含み得る。
非核酸置換基の例としては、ペプチド、タンパク質、脂質、炭水化物、カルボン酸、ビタミン、ステロイド、リグニン、低分子、有機金属化合物、または前述のいずれかの誘導体が挙げられるが、それらに限定されない。
核酸置換基の例としては、その天然および合成誘導体を含めた、二本鎖または一本鎖のDNAおよびRNAが挙げられるが、それらに限定されない。いくつかの場合では、マルチコンジュゲート中の1つまたは複数の置換基は、siRNA、saRNA、またはmiRNAを含む。いくつかの場合では、マルチコンジュゲート中の1つまたは複数の置換基は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの場合では、マルチコンジュゲート中の1つまたは複数の置換基は、DNAまたはRNAアプタマーを含む。
いくつかの治療の方法では、マルチコンジュゲートは、マルチコンジュゲートの血清半減期および／またはマルチコンジュゲートの1つもしくは複数の置換基のインビボ活性が、いずれの場合も単量体形態で投与された際の血清半減期または同じ置換基のインビボ活性と比べて増加するように構成された、分子量および／またはサイズを有する。
本明細書に記載されるいくつかの治療の方法では、マルチコンジュゲートは、マルチコンジュゲートの腎臓によるクリアランスが減少するように構成された分子量および／またはサイズを有する。いくつかの態様では、マルチコンジュゲートの減少した腎臓によるクリアランスは、減少した糸球体濾過の結果であり得る。
そのような方法の一態様では、マルチコンジュゲートの減少した腎臓によるクリアランスは、マルチコンジュゲートを対象に投与した後のマルチコンジュゲートのインビボ循環半減期を測定することによって決定される。
別の態様では、マルチコンジュゲートの減少した腎臓によるクリアランスは、マルチコンジュゲートの血清濃度が所定の値まで減少するのに必要な時間を測定することによって決定される。所定の値は、投与された用量の90％、80％、70％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、または1％であることができる。
別の態様では、減少した腎臓によるクリアランスは、マルチコンジュゲートを対象に投与した後の所定の時間でのマルチコンジュゲートの血清濃度を測定することによって決定される。
別の態様では、減少した腎臓によるクリアランスは、マルチコンジュゲートを対象に投与した後の経時的なマルチコンジュゲートの血清濃度を表すグラフの曲線下面積を測定することによって決定される。
本明細書に記載されるいくつかの治療の方法では、マルチコンジュゲートの減少したクリアランスは、マルチコンジュゲートが投与された対象においてマルチコンジュゲートの増加したインビボ生物学的利用能をもたらす。例えば、一態様では、マルチコンジュゲートの増加した生物学的利用能は、マルチコンジュゲートのインビボの細胞取り込みの増加をもたらす。別の態様では、マルチコンジュゲートの増加した生物学的利用能は、マルチコンジュゲートのインビボの治療指数／比の増加をもたらす。さらに別の態様では、マルチコンジュゲートの増加した生物学的利用能は、置換基の対応する単量体形態と比べて、マルチコンジュゲートの少なくとも1つの置換基のインビボ生物活性の増加をもたらす。かつ、実際に、これらの態様の各々は、対象を治療する方法におけるマルチコンジュゲートの投与の結果として、単独で生じても、1つまたは複数の追加の態様と一緒に生じてもよい。
これらの方法の一局面では、マルチコンジュゲートの減少した腎臓によるクリアランスに関係する測定されたパラメーター、例えば、マルチコンジュゲートの血清半減期は、単量体、二量体、三量体およびより多い数のマルチコンジュゲートにおける置換基の数に対してS字形相関を有する。
これらの方法の一局面では、マルチコンジュゲートについての測定されたパラメーター、および単量体置換基で始まるその置換基の各々は、プロットしたときにS字形曲線を画定する。
本開示はさらに、それを必要とする対象に多量体オリゴヌクレオチドを投与する方法であって、マルチコンジュゲートに含有される置換基の数がmであり、mが、マルチコンジュゲートの血清半減期および／またはその1つもしくは複数の置換基のインビボ活性が単量体形態で投与された際の血清半減期および／または同じ置換基のインビボ活性と比べて増加するように構成された分子量および／またはサイズをマルチコンジュゲートが有することが可能となるように選択された整数である、方法を提供する。様々な局面では、mは、≧2、≧3、≧4、≧4かつ≦17、≧4かつ≦8、または3、4、5、6、7、もしくは8である。
本明細書に開示される投与のいくつかの方法では、患者に投与されるマルチコンジュゲートの分子量は、少なくとも約45kD、または約45kD～60kDの範囲にある。
一局面では、本開示は、それを必要とする対象に本開示に係るマルチコンジュゲートの有効量を投与することを含む、標的化リガンド結合イベント当たり2つ以上の治療用物質を細胞に送達するための方法であって、マルチコンジュゲートが標的化リガンドを含む、方法を提供する。
一局面では、本開示は、それを必要とする対象に本開示に係るマルチコンジュゲートの有効量を投与することを含む、所定の化学量論比の2つ以上の治療用物質を細胞に送達するための方法であって、マルチコンジュゲートが、所定の化学量論比の2つ以上の治療用物質を含む、方法を提供する。
本明細書に記載される方法または治療および投与の方法の様々な態様では、投与されるマルチコンジュゲートは、少なくとも75、80、85、90、95、96、97、98、99、または100％純粋である。いくつかの局面では、マルチコンジュゲートは、約85％～95％純粋である。いくつかの態様では、マルチコンジュゲートの調製物は、75％以上純粋；85％以上純粋；および95％以上純粋であることができる。
遺伝性またはがん遺伝性の疾患を治療するための方法および遺伝子発現を調節するための方法
本開示は、開示されるマルチコンジュゲートを、遺伝子発現を調節することによって、例えば、遺伝子発現をアップレギュレーション、もしくはダウンレギュレーションもしくはサイレンシングすることによって、またはmRNAスプライシングに影響を与えることによって対処され得る疾患または障害の治療に使用するための方法を提供する。この性質を持つ多種多様な疾患および障害が公知であり、その病態に対処するために選択または開発され得る生物学的部分も同じく公知である。本開示の教示は、当業者が、そのような病態の医学的もしくは獣医学的治療のために、または基礎研究、農業、診断および畜産などの他の分野において遺伝子発現を調節するために、マルチコンジュゲートを設計および開発できるようにする役目を果たすだろう。複数の治療標的または他の標的が影響を受けることが所望される場合、本開示のマルチコンジュゲートは、単一の化学実体で多重標的化を達成可能にする。
一局面では、本開示は、遺伝子発現を調節することから恩恵を受けるだろう疾患または障害を有する対象を治療するための方法であって、本開示に係るマルチコンジュゲートの有効量を対象に投与することを含む、方法を提供する。
一局面では、本開示は、それを必要とする対象に本開示に係るマルチコンジュゲートの有効量を投与することを含む、標的遺伝子の遺伝子発現を調節するための方法を提供する。そのような治療的態様では、マルチコンジュゲートは、遺伝子発現を調節する少なくとも1つの置換基、例えば限定されないが、siRNA、miRNA、saRNA、またはアンチセンスオリゴヌクレオチド、CRISPRヌクレアーゼ、crRNA、および前述のいずれかの誘導体を含むだろう。
同様に、本開示は、それを必要とする対象に本開示に係るマルチコンジュゲートの有効量を投与することを含む、2つ以上の標的遺伝子の発現を調節するための方法であって、マルチコンジュゲートが、2つ以上の標的遺伝子において遺伝子発現を調節する置換基、例えば限定されないが、siRNA、miRNA、saRNA、またはアンチセンスオリゴヌクレオチド、CRISPRヌクレアーゼ、crRNA、および前述のいずれかの誘導体を含む、方法を提供する。マルチコンジュゲートは、2つ、3つ、4つ、またはそれ以上の遺伝子を標的とする置換基を含むことができる。
本開示の前述の局面のすべてで、マルチコンジュゲートは、遺伝子発現を改変する1つまたは複数の置換基に加えて、免疫刺激または抑制、チェックポイント阻害および炎症軽減を含むがそれらに限定されない他の治療効果をもたらす他の置換基を含み得る。複数の治療効果をもたらす置換基を含むマルチコンジュゲートは、がん、自己免疫疾患および神経障害などの複雑な疾患および病態の治療を進展させるのに役立つだろう。
対象
開示される治療の方法および本明細書に開示される投与の方法から恩恵を受け得る対象としては、霊長類、齧歯類および農業用動物などの哺乳動物が挙げられるが、それらに限定されない。霊長類対象の例としては、ヒト、チンパンジーおよびマカクが挙げられるが、それらに限定されない。齧歯類対象の例としては、マウスおよびラットが挙げられるが、それらに限定されない。農業用動物対象の例としては、ウシ、ヒツジ、子ヒツジ、ニワトリおよびブタが挙げられるが、それらに限定されない。
マウス糸球体濾過量（GFR）は、約0.15ml/分～0.25ml/分であり得る。ヒトGFRは、約1.8ml/分/kgであり得る（Mahmood I: (1998) Interspecies scaling of renally secreted drugs. Life Sci 63:2365-2371）。
マウスは、約1.46mlの血液を有し得る。それゆえ、マウスにおける総血液量の糸球体濾過のための時間は、約7.3分（1.46/0.2）であり得る。ヒトは、約5リットルの血液および約70kgの体重を有し得る。それゆえ、ヒトにおける総血液量の糸球体濾過のための時間は、約39.7分［5000/126(1.8*70)］であり得る。
当業者は、異なる種が、少なくとも上記の理由で、糸球体濾過による異なるクリアランス速度を有し得ることを認識するであろう。当業者は、ヒトの時間とマウスの時間との間の糸球体濾過によるクリアランス速度の比が、約1：5または1：6であり得ると推察することができる。言い換えれば、ヒトによるある特定の物質のクリアランス速度は、マウスの速度よりも5～6倍遅い場合がある。
一局面では、本開示は、それを必要とする対象にマルチコンジュゲートを送達する方法であって、インビボ循環半減期が、多量体オリゴヌクレオチドを対象に送達した後30分～120分の間に測定される、方法を提供する。
一局面では、本開示は、それを必要とする対象にマルチコンジュゲートを送達する方法であって、所定の時間が、マルチコンジュゲートを対象に送達した後30分～120分の間である、方法を提供する。
一局面では、本開示は、それを必要とする対象にマルチコンジュゲートを送達する方法であって、曲線下面積が、マルチコンジュゲートを対象に投与した後x～y分の間のマルチコンジュゲートの血清濃度に基づいて算出される、方法を提供する。いくつかの態様では、xは、1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、75、90、120、180、240、または300分であることができ、yは、90、120、180、240、300、360、420、480、540、600、720、840、960、1080、1200、1320、1440、または1600分であることができる。例えば、時間範囲は、約30分～120分、約1分～1600分、または約300分～600分であることができる。
一局面では、本開示は、ナノ粒子（NP）または脂質ナノ粒子（LNP）中に製剤化されていない、マルチコンジュゲートまたはマルチコンジュゲートのインビボ循環半減期を増加させるための方法を提供する。
一局面では、本開示は、内因性血清タンパク質との凝集に依存しない、マルチコンジュゲートまたはマルチコンジュゲートのインビボ循環半減期を増加させるための方法を提供する。
この、および他の態様では、本開示のマルチコンジュゲートは、薬学的組成物の形態で、送達ビヒクル中で、または標的化リガンドにカップリングさせて投与することができる。
薬学的組成物
様々な局面では、本開示は、本明細書に記載されるマルチコンジュゲートのいずれか1つまたは複数を含む薬学的組成物を提供する。本明細書において使用される場合、薬学的組成物は、疾患を予防、診断、緩和、治療または治癒するために使用することができる、食物以外の活性物質を含む。同様に、本開示に係る様々なマルチコンジュゲートは、医薬として使用するためのおよび／または医薬の製造において使用するための態様を含むとして理解されるべきである。
薬学的組成物は、本開示に係るマルチコンジュゲートと薬学的に許容される賦形剤とを含むことができる。本明細書において使用される場合、賦形剤は、活性成分と共同で製剤化される天然物質または合成物質であることができる。賦形剤は、長期安定化、体積の増大（例えば、増量剤、充填剤、または希釈剤）の目的で、または薬物吸収の促進、粘性の低下もしくは溶解性の増強など、最終剤形において活性成分に対して治療上の増強を付与するために含めることができる。賦形剤はまた、製造および配送において、例えば、活性成分の取り扱いを助けるため、かつ／または有効期間安定性を延長させる（例えば、変性または凝集を防止することによって）ために有用であり得る。当業者により理解されるように、適切な賦形剤の選択は、投与の経路、剤形および活性成分を含む様々な要因に左右され得る。
マルチコンジュゲートは、局所または全身を含むがそれらに限定されない多種多様な手法で投与可能であり、したがって、本開示の薬学的組成物は、それに応じて変動し得る。投与は、任意の特定の送達経路、系または技法に限定されることはなく、非限定的に、非経口（皮下、静脈内、髄内、関節内、筋肉内、腹腔内、眼内、またはCNS注射を含む）、直腸、局所、経皮、経口、または吸入（鼻腔内に、または、例えば、噴霧器によって肺へ）によるものを含むことができる。個体への投与は、単回用量でもしくは反復投与で、かつ、多種多様な生理学的に許容される塩形態のいずれかで、ならびに／または薬学的組成物の一部としての許容される薬学的担体および／もしくは添加物と共に行われてよい。生理学的に許容される製剤、ならびに標準的な薬学的製剤の技法、投与量および賦形剤は、当業者に周知である（例えば、Physicians' Desk Reference (PDR（登録商標）) 2005, 59th ed., Medical Economics Company, 2004；および Remington: The Science and Practice of Pharmacy, eds. Gennado et al. 21th ed., Lippincott, Williams & Wilkins, 2005を参照のこと）。
薬学的組成物は、本開示に係るマルチコンジュゲートの有効量を含む。本明細書において使用される場合、「有効量」は、特定の目的の達成をもたらす濃度または量、例えば、生物学的効果を引き起こす（例えば、プラセボと比較して）のに適した量であることができる。有効量が「治療有効量」である場合、それは、治療的使用に適した量、例えば、疾患を予防、診断、緩和、治療または治癒するのに十分な量であることができる。有効量は、当技術分野において公知の方法によって決定することができる。例えば、治療有効量は、例えばヒト臨床試験によって、経験的に決定することができる。有効量は、当技術分野において公知の換算係数を使用して、1つの動物（例えば、マウス、ラット、サル、ブタ、イヌ）から別の動物（例えば、ヒト）での使用のために外挿することもできる。例えば、Freireich et al., Cancer Chemother Reports 50(4):219-244 (1966)を参照されたい。
送達構築物および製剤
当業者により理解されるように、生物学的標的または作用機序にかかわらず、治療用マルチコンジュゲートは、生物（例えば、治療を必要とする動物、例えばヒト）の標的細胞または組織に到達するために一連の生理学的な障害を克服しなければならない。治療用マルチコンジュゲートは、一般に、すべて望ましくない免疫応答を誘発することなく、血流におけるクリアランスを回避し、標的の細胞型に侵入し、細胞質に侵入し、時に、核に侵入しなければならない。様々な局面では、本開示は、細胞および組織標的への直接送達のためのマルチコンジュゲートを提供する。あるいは、本開示は、送達ビヒクル中に製剤化されたマルチコンジュゲートを提供する。
直接送達の戦略では、マルチコンジュゲートは、ほとんどの場合、これらが、血清ヌクレアーゼおよび他の因子による分解に耐えることができるような、かつ自然免疫応答の誘発を回避することができるような、安定化、通常は、置換基の化学修飾の形態での安定化を必要とするだろう。化学的安定化の戦略は、当業者に公知であり、本明細書に開示されるマルチコンジュゲートとの関連で容易に使用または適合され得る。あるいは、送達ビヒクル中、または脂質ナノ粒子（LNP）、エクソソーム、微小小胞体もしくはウイルスベクターなどの製剤中に製剤化される場合、マルチコンジュゲートは、送達ビヒクルによって分解および免疫活性から保護またはマスクされ得るので、化学修飾なしで、または最小限の修飾で送達され得る。送達ビヒクルおよび製剤は、当業者に公知であり、本明細書に開示されるマルチコンジュゲートとの関連で容易に使用または適合され得る。
本開示のいくつかの局面では、マルチコンジュゲートは、送達ビヒクル中に製剤化する必要なく、標的化部分、例えば、標的細胞または組織への直接送達のための細胞または組織標的化リガンドを備える。他の態様では、マルチコンジュゲートが送達ビヒクル中に製剤化される場合、送達ビヒクルが、細胞または組織を標的とする部分を備え得る。本開示との関連で使用するのに好適な標的化部分の例としては、脂溶性部分（例えば、リン脂質）；アプタマー；ペプチドまたはタンパク質（例えば、アルギニン-グリシン-アスパラギン酸［RGD］、トランスフェリン、モノクローナル抗体もしくはその断片、例えば単鎖可変断片（ScFv）、もしくはVHH抗原結合タンパク質）；細胞成長因子、低分子、ビタミン（例えば、フォレート、トコフェロール）、炭水化物（例えば、単糖類および多糖類、N-アセチルガラクトサミン［GalNAc］、ガラクトース、マンノース）；コレステロール；グルタミン酸尿素（例えば、2-[3-(1,3-ジカルボキシプロピル)-ウレイド]ペンタン二酸［DUPA］）、ベンズアミド誘導体（例えば、アニサミド）；ならびに前述のいずれかの誘導体が挙げられるが、それらに限定されない。いくつかの態様では、GalNac標的化部分は、単分岐GalNAc、二分岐GalNAc、または三分岐GalNAcであり得る。
脂溶性部分は、カチオン性基を含むリガンドであり得る。ある特定の態様では、脂溶性部分は、コレステロール、ビタミンE、ビタミンK、ビタミンA、葉酸、またはカチオン性色素（例えば、Cy3）である。他の脂溶性部分は、コール酸、アダマンタン酢酸、1-ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、1,3-ビス-O(ヘキサデシル)グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、1,3-プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、O3-(オレオイル)リトコール酸、O3-(オレオイル)コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジンを含む。
標的化部分は、脂肪酸、例えば、コレステロール、リトコール酸（LCA）、エイコサペンタエン酸（EPA）、ドコサヘキサエン酸（DHA）、およびドコサン酸（DCA）、ステロイド、セコステロイド、脂質、ガングリオシドもしくはヌクレオシド類似体、エンドカンナビノイド、ならびに／または、ビタミン、例えばコリン、ビタミンA、ビタミンE、およびそれらの誘導体もしくは代謝物、またはビタミン、例えばレチノイン酸およびコハク酸アルファ-トコフェリルであり得る。
標的化部分は、本開示の教示に加え、共有結合、アミド結合もしくはエステル結合、またはビオチン-ストレプトアビジンもしくは金属-リガンド錯体などの非共有結合を介するものを含むがそれらに限定されない当技術分野において公知の他の技法も使用して、マルチコンジュゲートに組み込まれ得る。
標的化部分は、マルチコンジュゲートに、末端位置で、またはいくつかの場合では、内部位置で結合させることができる。いくつかの態様では、例えば、標的化部分がマルチコンジュゲートの各末端でコンジュゲートされる場合、2つの標的化部分がマルチコンジュゲートに組み込まれる。所望であれば、内部および末端の両方の多種多様な位置で、2つ超の標的化部分がマルチコンジュゲートに組み込まれ得る。
様々な局面では、本開示は、細胞によってエンドサイトーシスされているマルチコンジュゲートのエンドソーム脱出を容易にするための、エンドソーム脱出部分（EEM）の使用および組み込みを提供する。エンドソーム脱出部分は、一般に、脂質ベースまたはアミノ酸ベースであるが、エンドソームを破壊してマルチコンジュゲートまたはその代謝物を放出する他の化学実体を含み得る。EEMの例としては、クロロキン、疎水性アミノ酸R基を含有するモチーフを有するペプチドおよびタンパク質、ならびにインフルエンザウイルスヘマグルチニン（HA2）が挙げられるが、それらに限定されない。さらなるEEMは、Lonn et al., Scientific Reports, 6: 32301, 2016に記載されている。
様々な局面では、本開示は、マルチコンジュゲートが送達された細胞の核にマルチコンジュゲートまたはその一部分（例えば、リンカーの切断によって遊離するマルチコンジュゲートの置換基）を移入するのを容易にするための、核局在化シグナルまたは配列（NLS）の使用および組み込みを提供する。NLSは、典型的には、アミノ酸配列であり、その例は、薬物送達の分野で働く者に公知である。
インビボ送達の障害を克服するために数多くの薬物送達ビヒクルが設計されてきた。これらのビヒクルは、治療用RNA、低分子薬、タンパク質薬、および他の治療用分子を送達するために使用されている。薬物送達ビヒクルは、糖、脂質、脂質様材料、タンパク質、ポリマー、ペプチド、金属、ヒドロゲル、コンジュゲート、およびペプチドのような多様な材料から作製されている。多くの薬物送達ビヒクルは、これらの群の組み合わせに由来する局面を組み入れ、例えば、いくつかの薬物送達ビヒクルは、糖と脂質とを組み合わせることができる。いくつかの他の例では、薬物を、細胞を模倣するよう意図された「細胞様」材料に直接隠すことができる一方で、他の場合では、薬物を、細胞それ自体の内部に、またはその上に置くことができる。薬物送達ビヒクルは、pH変化、生体分子濃度、磁場、および熱などの刺激に応答して薬物を放出するように設計することができる。
本開示のいくつかの局面では、細胞内送達のためのナノ粒子を形成するために、マルチコンジュゲートを担体材料中にカプセル化することができる。公知の担体材料は、カチオン性ポリマー、脂質もしくはペプチド、またはその化学類似体を含む。Jeong et al., BIOCONJUGATE CHEM., Vol. 20, No. 1, pp. 5-14 (2009)。カチオン性脂質の例としては、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン、コレステロールジオレイルホスファチジルコリン、N-[1-(2,3-ジオレオイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド（DOTMA）、1,2-ジオレオイルオキシ-3-(トリメチルアンモニオ)プロパン（DOTAP）、1,2-ジオレオイル-3-(4'-トリメチル-アンモニオ)ブタノイル-sn-グリセロール（DOTB）、1,2-ジアシル-3-ジメチルアンモニウム-プロパン（DAP）、1,2-ジアシル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン（TAP）、1,2-ジアシル-sn-グリセロール-3-エチルホスホコリン、3 ベータ-[N-(N',N'-ジメチルアミノエタン)-カルバモイル]コレステロール（DC-コレステロール）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（DDAB）、およびそれらのコーポリマーが挙げられる。カチオン性ポリマーの例としては、ポリエチレンイミン、ポリアミン、ポリビニルアミン、ポリ（アルキルアミン塩酸塩）、ポリアミドアミンデンドリマー、ジエチルアミノエチル-デキストラン、ポリビニルピロリドン、キチン、キトサン、およびポリ(2-ジメチルアミノ)エチルメタクリレートが挙げられる。一態様では、担体は、1つまたは複数のアシル化アミンを含有し、その特性は、他の公知の担体材料と比較してインビボでの使用により好適であり得る。
本開示の一局面では、担体は、カチオン性ペプチド、例えば、KALA（カチオン性融合性ペプチド）、ポリリジン、ポリグルタミン酸またはプロタミンである。別の局面では、担体は、カチオン性脂質、例えば、ジオレイルホスファチジルエタノールアミンまたはコレステロールジオレイルホスファチジルコリンである。別の局面では、担体は、カチオン性ポリマー、例えば、ポリエチレンイミン、ポリアミン、またはポリビニルアミンである。
送達製剤における重要な進歩は、ヘルパー成分が製剤化の効率に影響を及ぼす様式の理解の向上である。ヘルパー成分は、当初の薬物送達系に加えられた化学構造を含むことができる。しばしば、ヘルパー成分は、粒子の安定性または特定の器官への送達を改善することができる。例えば、ナノ粒子は、脂質から作ることができるが、これらの脂質ナノ粒子によって媒介される送達は、親水性ポリマーおよび／または疎水性分子の存在によって影響を受け得る。ナノ粒子送達に影響を及ぼす1つの重要な親水性ポリマーは、ポリ(エチレングリコール)である。他の親水性ポリマーは、非イオン性界面活性剤を含む。ナノ粒子送達に影響を及ぼす疎水性分子は、コレステロール、1-2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DSPC）、1-2-ジ-O-オクタデセニル-3-トリメチルアンモニウムプロパン（DOTMA）、1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン（DOTAP）、および他のものを含む。
本開示のいくつかの局面では、マルチコンジュゲートをエクソソーム中にカプセル化することができる。エクソソームは、血液、尿、および細胞培養物の培養培地を含む生物体液中に存在する、30～100nmの直径を有する細胞由来の小胞である。エクソソームは、合成エクソソームおよびエクソソーム模倣体を含め、当技術分野の技能に従って薬物送達での使用に適合させることができる。例えば、"A comprehensive overview of exosomes as drug delivery vehicles - endogenous nanocarriers for targeted cancer therapy" Biochim Biophys Acta. 1846(1):75-87 (2014)；"Exosomes as therapeutic drug carriers and delivery vehicles across biological membranes: current perspectives and future challenges" Acta Pharmaceutica Sinica B, Available online 8 March 2016 (In Press)；および "Exosome mimetics: a novel class of drug delivery systems" International Journal of Nanomedicine, 7: 1525-1541 (2012)を参照されたい。
本開示のいくつかの局面では、マルチコンジュゲートを微小小胞体中にカプセル化することができる。微小小胞体（時に、循環微小小胞体、またはマイクロ粒子と呼ばれる）は、ほぼすべての細胞型から脱粒した100nm～1000nmの範囲の形質膜の断片であり、エクソソームとして公知であるより小さな細胞内で生成された細胞外小胞とは別個である。微小小胞体は、細胞間コミュニケーションにおいて役割を果たし、細胞間でmRNA、miRNA、およびタンパク質を輸送することができる。微小小胞体は、合成微小小胞体および微小小胞体模倣体を含め、当技術分野の技能に従って薬物送達での使用に適合させることができる。例えば、"Microvesicle- and exosome-mediated drug delivery enhances the cytotoxicity of Paclitaxel in autologous prostate cancer cells" Journal of Controlled Release, 220: 727-737 (2015)；"Therapeutic Uses of Exosomes" J Circ Biomark, 1:0 (2013)を参照されたい。
本開示のいくつかの局面では、マルチコンジュゲートを、ウイルスベクターを使用して送達することができる。ウイルスベクターは、細胞中に遺伝物質を送達するために分子生物学者によって通常使用されるツールである。このプロセスは、生きている生物体内（インビボ）または細胞培養物（インビトロ）において実施することができる。ウイルスベクターは、当技術分野の技能に従って薬物送達での使用に適合させることができる。例えば、"Viruses as nanomaterials for drug delivery" Methods Mol Biol, 26: 207-21 (2011)；"Viral and nonviral delivery systems for gene delivery" Adv Biomed Res, 1:27 (2012)；および "Biological Gene Delivery Vehicles: Beyond Viral Vectors" Molecular Therapy, 17(5): 767-777 (2009)を参照されたい。
当業者は、公知の送達製剤、ビヒクルおよび標的化部分を本開示に従って使用に一般的に適合させることができることを認識するだろう。関連する教示および例は、米国特許9,644,209および10,597,659；WO 2016/205410 A2；WO 2018/145086 A1；およびWO 2020/180897に開示されており、その各々は、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。
オリゴヌクレオチド合成、アニーリング条件、脂質ナノ粒子の製剤化および特性決定、官能化オリゴヌクレオチドの調製、オリゴヌクレオチドで一置換されたDTMEの調製、多量体オリゴヌクレオチドの合成および製剤化（細胞を標的とする部分を前記多量体オリゴヌクレオチドに付着させることを含む）、動物実験のプロトコル（血清半減期の測定および遺伝子ノックダウンを含む）についての一般手順は、WO2016/205410、WO2018/145086、およびWO 2020/180897に詳述されており、その各々は、参照により本明細書に組み入れられる。
以下の実施例は、例証となるものであって、制限となるものではない。技術の多くのバリエーションが、本開示を検討した際に当業者に明らかになるであろう。それゆえ、技術の範囲は、実施例に関することなく決定されるべきであるが、その代わりに、添付の特許請求の範囲に関して、等価物のそれらの完全な範囲と共に決定されるべきである。
ペプチド化合物
実施例1：ペプチドでのDTMEの一置換
HIV-1TATタンパク質の形質導入ドメイン（YGRKKRRQRRR）は、C末端システイン残基との固相合成によって調製する。精製後、最終生成物をジメチルホルムアミド水溶液に溶解させ、40倍過剰のジチオビスマレイミドエタン（DTME）で処理し、かつ、得られた混合物を室温でかき混ぜる。反応が完了次第、所望のDTME-モノ-ペプチド生成物を分取イオン交換クロマトグラフィーにより単離する。
実施例2：ペプチドでのヌクレオチドベースのホモ二価リンカーの一置換
C末端システイン残基との固相合成（実施例1の通り）によって調製したHIV-1TATタンパク質の形質導入ドメイン（YGRKKRRQRRR）をジメチルホルムアミド水溶液に溶解させ、40倍過剰の5'-O-マレイミドエチル-チミジリルチミジン-3'-O-エチルマレイミド（MTTM）で処理し、かつ、得られた混合物を室温でかき混ぜる。反応が完了次第、所望のMTTM-モノ-ペプチド生成物を分取イオン交換クロマトグラフィーにより単離する。
実施例3：ペプチド-siRNAコンジュゲート
実施例1で調製したDTME-モノ-（YGRKKRRQRRR）ペプチド生成物を水に溶解させ、トランスサイレチン（TTR）mRNAを標的とする末端チオール化siRNAで処理する。得られたペプチド-DTME-TTRコンジュゲートをクロマトグラフィーにより単離して精製する。
有機金属化合物
実施例4：有機金属化合物でのDTMEの一置換
6-メルカプトヘキサン酸をアセトニトリル水溶液に溶解させ、40倍過剰のDTMEで処理する。得られたDTME-モノ-チオヘキサン酸生成物を分取hplcにより単離し、無水テトラヒドロフランに溶解させる。ジシクロヘキシルカルボジイミドを加え、混合物を1時間撹拌する。フェロセニルメチルアルコールを加え、全体を室温で2～3時間撹拌する。後処理後、所望のフェロセニルメチルDTME-モノ-チオヘキサノアートをシリカゲルクロマトグラフィーにより単離する。
実施例5：有機金属化合物でのヌクレオチドベースのホモ二価リンカーの一置換
6-メルカプトヘキサン酸をジメチルホルムアミド水溶液に溶解させ、40倍過剰のMTTMで処理する。得られたMTTM-モノ-チオヘキサン酸生成物を分取hplcにより単離し、無水テトラヒドロフランに溶解させる。ジシクロヘキシルカルボジイミドを加え、混合物を1時間撹拌する。フェロセニルメチルアルコールを加え、全体を室温で2～3時間撹拌する。後処理後、所望のフェロセニルメチルMTTM-モノ-チオヘキサノアートをシリカゲルクロマトグラフィーにより単離する。
実施例6：有機金属化合物でのペプチドベースのホモ二価リンカーの一置換
6-メルカプトヘキサン酸をジメチルホルムアミド水溶液に溶解させ、40倍過剰のN,N,ビス-(6-マレイミドヘキサノイル)グリシン-リジン（MGKM）で処理する。得られたMGKM-モノ-チオヘキサン酸生成物を分取hplcにより単離し、無水テトラヒドロフランに溶解させる。ジシクロヘキシルカルボジイミドを加え、混合物を1時間撹拌する。フェロセニルメチルアルコールを加え、全体を室温で2～3時間撹拌する。後処理後、所望のフェロセニルメチルMGKM-モノ-チオヘキサノアートをシリカゲルクロマトグラフィーにより単離する。
実施例7：ペプチド-有機金属コンジュゲート
実施例1でのC末端システイン残基との固相合成によって調製したHIV-1TATタンパク質の形質導入ドメイン（YGRKKRRQRRR）をジメチルホルムアミドに溶解させ、実施例6で調製したフェロセニルメチルMGKM-モノ-チオヘキサノアート誘導体で処理する。得られたペプチド-MGKM-チオヘキサノアートをクロマトグラフィーにより単離する。
抗体化合物
実施例8：抗体断片でのDTMEの一置換
遊離システインを担持する抗体単鎖FV断片を大腸菌（E. Coli）で発現させる（Kipriyanov, SM et al; Molecular Immunology, 31, No 14, 1047-1058 (1994)）。抗体をジメチルホルムアミド水溶液に溶解させ、40倍過剰のジチオビスマレイミドエタン（DTME）で処理し、かつ、得られた混合物を室温でかき混ぜる。反応が完了次第、所望のDTME-モノ-抗体生成物を分取イオン交換クロマトグラフィーにより単離する。
実施例9：抗体断片でのヌクレオチドベースのホモ二価リンカーの一置換
実施例8で調製した遊離システインを担持する抗体単鎖FV断片をジメチルホルムアミド水溶液に溶解させ、40倍過剰のMTTMで処理し、かつ、得られた混合物を室温でかき混ぜる。反応が完了次第、所望のMTTM-モノ-単鎖FV生成物を分取クロマトグラフィーにより単離する。
実施例10：抗体断片-siRNAコンジュゲート
実施例8で生成したDTME-モノ-単鎖FV生成物を水に溶解させ、筋強直性ジストロフィータンパク質キナーゼ（DMPK）mRNAを標的とする末端チオール化siRNAで処理する。得られたFV-DTME-TTRコンジュゲートをクロマトグラフィーにより単離して精製する。
低分子化合物
実施例11：低分子でのDTMEの一置換
6-メルカプトヘキサン酸をアセトニトリル水溶液に溶解させ、40倍過剰のDTMEで処理する。得られたDTME-モノ-チオヘキサン酸生成物を分取hplcにより単離し、無水ジメチルホルムアミドに溶解させる。N-ヒドロキシスクシンイミドを加え、混合物を1時間撹拌する。レナリドミドを加え、全体を室温で2～3時間撹拌する。後処理後、所望のDTME-モノ-チオヘキサミド-レナリドミドをシリカゲルクロマトグラフィーにより単離する。
実施例12：低分子でのヌクレオチドベースのホモ二価リンカーの一置換
6-メルカプトヘキサン酸をジメチルホルムアミド水溶液に溶解させ、40倍過剰のMTTMで処理する。得られたMTTM-モノ-チオヘキサン酸生成物を分取hplcにより単離し、無水ジメチルホルムアミドに溶解させる。N-ヒドロキシスクシンイミドを加え、混合物を1時間撹拌する。レナリドミドを加え、全体を室温で2～3時間撹拌する。後処理後、所望のMTTM-モノ-チオヘキサミド-レナリドミドをシリカゲルクロマトグラフィーにより単離する。
実施例13：抗体断片-低分子コンジュゲート
実施例8で調製した遊離システインを担持する抗体単鎖FV断片をジメチルホルムアミド水溶液に溶解させ、実施例12で調製したMTTM-モノ-チオヘキサミド-レナリドミドの溶液に加える。反応が完了次第、所望の単鎖FV-MTTM-チオヘキサミド-レナリドミド生成物を分取クロマトグラフィーにより単離する。

Claims (109)

  1. 一端が置換基Xによって置換されているホモ二価共有結合性リンカーを含む化合物であって、Xが核酸以外の生物学的部分を含み、ホモ二価リンカーのもう一端が未置換であり、かつ化合物が少なくとも75％純粋である、化合物。
  2. 構造1：
    X-R1-R2-A-R3-B（構造1）
    を含み、
    構造中：
    Xは、核酸以外の生物学的部分を含む置換基であり；
    R1は、ホスホジエステル、チオホスホジエステル、スルファート、アミド、トリアゾール、ヘテロアリール、エステル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、チオプロピオナート、アセタール、グリコールを含む基であるか、または存在せず；
    R2は、スペーサー基であるか、または存在せず；
    Aは、第1の求核剤と第1の求電子剤との反応生成物を含む基であり；
    R3は、C2～C10アルキル、C2～C10アルコキシ、C1～C10アリール、C2～C10アルキルジチオ、アミド、エーテル、チオエーテル、エステル、オリゴヌクレオチド、オリゴペプチド、チオプロピオナート、またはジスルフィドを含む基であり；かつ
    Bは、第2の求核剤または第2の求電子剤を含む基であり、第2の求核剤が第1の求核剤と同じであり、第2の求電子剤が第1の求電子剤と同じである、
    請求項1記載の化合物。
  3. R2が、C2～C10アルキル、C2～C10アルコキシ、もしくはC1～C10アリールを含むか、または存在しない、請求項2記載の化合物。
  4. Aの第1の求核剤および第1の求電子剤が、（i）任意で、チオールとマレイミドとの反応生成物が、スクシンアミド酸の誘導体である、チオールおよびマレイミド；（ii）チオールおよびビニルスルホン；（iii）チオールおよびピリジルジスルフィド；（iv）チオールおよびヨードアセトアミド；（v）チオールおよびアクリレート；（vi）アジドおよびアルキン；または（vii）アミンおよびカルボキシルを含む、請求項2または3のいずれか一項記載の化合物。
  5. Aが、チオールとマレイミドとの反応生成物を含む基であり、任意で、チオールとマレイミドとの反応生成物が、スクシンアミド酸の誘導体である、請求項2～4のいずれか一項記載の化合物。
  6. R3が、チオプロピオナートまたはジスルフィド、オリゴヌクレオチド、またはオリゴペプチドを含む基である、請求項2～5のいずれか一項記載の化合物。
  7. 構造2：
    Figure 2023545418000078
    またはそのピロリジンジオン開環誘導体を含み、任意で、構造2のピロリジンジオン開環誘導体が、スクシンアミド酸の誘導体である、請求項2記載の化合物。
  8. R2が、C2～C10アルキル、C2～C10アルコキシ、またはC1～C10アリールを含むスペーサー基である、請求項7記載の化合物。
  9. Xが、ペプチドもしくはタンパク質、またはそれらの誘導体であり；
    R1およびR2が、存在せず；かつ
    R3が、チオプロピオナート、ジスルフィド、またはオリゴヌクレオチドを含む基である、
    請求項7記載の化合物。
  10. Xが、有機金属化合物またはその誘導体であり；
    R1が、エステル基であり；
    R2が、C2～C10アルキルを含むスペーサー基であり；かつ
    R3が、チオプロピオナート、ジスルフィド、オリゴヌクレオチド、またはオリゴペプチドを含む基である、
    請求項7記載の化合物。
  11. Xが、低分子またはその誘導体であり；
    R1が、エステル基であり；
    R2が、C2～C10アルキルを含むスペーサー基であり；かつ
    R3が、チオプロピオナート、ジスルフィド、オリゴヌクレオチド、またはオリゴペプチドを含む基である、
    請求項7記載の化合物。
  12. ホモ二価共有結合性リンカーが、細胞内条件下で切断可能なリンカーを含む、請求項1記載の化合物。
  13. R3基が、細胞内条件下で切断可能なリンカーを含む、請求項2～11のいずれか一項記載の化合物。
  14. 置換基Xが、ペプチド、タンパク質、脂質、炭水化物、カルボン酸、ビタミン、ステロイド、リグニン、低分子、有機金属化合物、または前述のいずれかの誘導体である、請求項1～8のいずれか一項記載の化合物。
  15. 置換基Xが、ペプチドまたはその誘導体である、請求項14記載の化合物。
  16. ペプチドが、HIV-1TATタンパク質の形質導入ドメイン、センチリン（Centyrin）、拘束性ペプチド、pHLIPペプチド、またはそれらの誘導体である、請求項14記載の化合物。
  17. 置換基Xが、抗体もしくは抗体断片、またはそれらの誘導体である、請求項14記載の化合物。
  18. 抗体断片が、単鎖可変断片またはその誘導体である、請求項17記載の化合物。
  19. 置換基Xが、炭水化物またはその誘導体である、請求項14記載の化合物。
  20. 置換基Xが、脂肪酸またはその誘導体である、請求項14記載の化合物。
  21. 置換基Xが、ビタミンまたはその誘導体である、請求項14記載の化合物。
  22. 置換基Xが、トコフェロールもしくはフォレート、またはそれらの誘導体である、請求項21記載の化合物。
  23. 置換基Xが、コレステロールまたはその誘導体である、請求項14記載の化合物。
  24. 置換基Xが、(2S,2'S)-2,2'-(カルボニルジイミノ)ジペンタン二酸（DUPA）またはその誘導体である、請求項14記載の化合物。
  25. 置換基Xが、アニサミドまたはその誘導体である、請求項14記載の化合物。
  26. 置換基Xが、有機金属化合物またはその誘導体である、請求項14記載の化合物。
  27. 有機金属化合物が、フェロセンまたはその誘導体である、請求項26記載の化合物。
  28. 置換基Xが、低分子またはその誘導体である、請求項14記載の化合物。
  29. 低分子が、レナリドミドまたはその誘導体である、請求項28記載の化合物。
  30. 少なくとも80、85、90、95、96、97、98、99、または100％純粋である、請求項1～29のいずれか一項記載の化合物。
  31. 請求項1～30のいずれか一項記載の化合物を合成するための方法であって、該化合物の形成を実質的に優先しかつ置換基Xの二量体化を実質的に阻止する反応条件下で、ホモ二価共有結合性リンカーを置換基Xにカップリングすることを含む、方法。
  32. ホモ二価共有結合性リンカーと、ホモ二価共有結合性リンカーと反応性の官能基を含む官能化置換基Xとを反応させることをさらに含む、請求項31記載の方法。
  33. 官能化置換基Xが、構造3：
    X-R1-R2-A'（構造3）
    を含み；かつ
    ホモ二価共有結合性リンカーが、構造4：
    A''-R3-B（構造4）
    を含み、
    構造中：
    Xが、核酸以外の生物学的部分を含む置換基であり；
    R1が、ホスホジエステル、チオホスホジエステル、スルファート、アミド、トリアゾール、ヘテロアリール、エステル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、チオプロピオナート、アセタール、グリコールを含む基であるか、または存在せず；
    R2が、スペーサー基であるか、または存在せず；
    R3が、C2～C10アルキル、C2～C10アルコキシ、C1～C10アリール、C2～C10アルキルジチオ、アミド、エーテル、チオエーテル、エステル、オリゴヌクレオチド、オリゴペプチド、チオプロピオナート、またはジスルフィドを含む基であり；
    A'およびA''が共に、一緒に反応してAを形成する第1の求核剤および第1の求電子剤を含み；かつ
    Bが、第2の求核剤または第2の求電子剤を含む基であり、第2の求核剤が第1の求核剤と同じであり、かつ第2の求電子剤が第1の求電子剤と同じであり；かつ
    結果として得られる化合物が、構造1：X-R1-R2-A-R3-Bである、
    請求項32記載の方法。
  34. ホモ二価共有結合性リンカーと官能化R2末端基とを反応させて中間体を形成し、次いで、該中間体の官能化R2末端基と、官能化R2末端基と反応性の官能基を含む官能化置換基Xとを反応させてR1を形成することをさらに含み；ここで：
    R1が、ホスホジエステル、チオホスホジエステル、スルファート、アミド、トリアゾール、ヘテロアリール、エステル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、チオプロピオナート、アセタール、またはグリコールを含む基であり；かつ
    R2が、スペーサー基である、
    請求項31記載の方法。
  35. ホモ二価共有結合性リンカーが、構造4：
    A''-R3-B（構造4）
    を含み、
    官能化R2末端基が、構造5：
    R1'-R2-A'（構造5）
    を含み、
    官能化置換基Xが、構造6：
    X-R1''（構造6）
    を含み、
    構造中：
    Xが、核酸以外の生物学的部分を含む置換基であり；
    R1'およびR1''が、反応してR1を形成する官能基であり；
    R1が、ホスホジエステル、チオホスホジエステル、スルファート、アミド、トリアゾール、ヘテロアリール、エステル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、チオプロピオナート、アセタール、またはグリコールを含む基であり；
    R2が、スペーサー基であり；
    R3が、C2～C10アルキル、C2～C10アルコキシ、C1～C10アリール、C2～C10アルキルジチオ、アミド、エーテル、チオエーテル、エステル、オリゴヌクレオチド、オリゴペプチド、チオプロピオナート、またはジスルフィドを含む基であり；かつ
    A'およびA''が共に、反応してAを形成する第1の求核剤および第1の求電子剤を含み；
    Bが、第2の求核剤または第2の求電子剤を含む基であり、第2の求核剤が第1の求核剤と同じであり、かつ第2の求電子剤が第1の求電子剤と同じであり；かつ
    結果として得られる化合物が、構造1：X-R1-R2-A-R3-Bである、
    請求項34記載の方法。
  36. 置換基Xへのホモ二価共有結合性リンカーのカップリングが、官能化置換基Xと化学量論的過剰のホモ二価共有結合性リンカーとの希釈溶液中で行われる、請求項31～35のいずれか一項記載の方法。
  37. 置換基Xへのホモ二価共有結合性リンカーのカップリングが、少なくとも約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、または100のモル過剰のホモ二価共有結合性リンカーを用いて行われる、請求項31～35のいずれか一項記載の方法。
  38. 置換基Xへのホモ二価共有結合性リンカーのカップリングが、約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、または100のモル過剰のホモ二価共有結合性リンカーを用いて行われる、請求項37記載の方法。
  39. 置換基Xへのホモ二価共有結合性リンカーのカップリングが、約7、6、5、または4を下回るpHで行われる、請求項31～38のいずれか一項記載の方法。
  40. 置換基Xへのホモ二価共有結合性リンカーのカップリングが、約7、6、5、または4のpHで行われる、請求項31～38のいずれか一項記載の方法。
  41. 置換基Xへのホモ二価共有結合性リンカーのカップリングが、水と水混和性の有機共溶媒とを含む溶液中で行われる、請求項31～40のいずれか一項記載の方法。
  42. 水混和性の有機共溶媒が、DMF、NMP、DMSO、アルコール、またはアセトニトリルを含む、請求項41記載の方法。
  43. 水混和性の有機共溶媒が、アセトニトリルを含む、請求項42記載の方法。
  44. 水混和性の有機共溶媒が、溶液の約10、15、20、25、30、40、または50％（v/v）を構成する、請求項41～42のいずれか一項記載の方法。
  45. 置換基Xへのホモ二価共有結合性リンカーのカップリングが、無水有機溶媒を含む溶液中で行われる、請求項31～38のいずれか一項記載の方法。
  46. 無水有機溶媒が、ジクロロメタン、DMF、DMSO、THF、ジオキサン、ピリジン、アルコール、またはアセトニトリルを含む、請求項45記載の方法。
  47. 化合物の収率が、少なくとも75、80、85、90、95、96、97、98、99、または100％である、請求項31～46のいずれか一項記載の方法。
  48. 化合物の純度が、少なくとも80、85、90、95、96、97、98、99、または100％である、請求項31～46のいずれか一項記載の方法。
  49. 構造7：
    X●Y（構造7）
    を含むマルチコンジュゲートであって、
    構造中：
    Xは、核酸以外の生物学的部分を含む第1の置換基であり；
    Yは、Xと同じまたは異なる第2の置換基であり；かつ
    ●は、XとYとをつなぐ共有結合性リンカーであり、構造8：
    -R1-R2-A-R3-A-R2-R1-（構造8）
    を含み、
    構造中：
    各R1は、独立に、ホスホジエステル、チオホスホジエステル、スルファート、アミド、トリアゾール、ヘテロアリール、エステル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、チオプロピオナート、アセタール、グリコールを含む基であるか、または存在せず；
    各R2は、独立に、スペーサー基であるか、または存在せず；
    各Aは、同じであり、求核剤と求電子剤との反応生成物を含む基であり；かつ
    R3は、C2～C10アルキル、C2～C10アルコキシ、C1～C10アリール、C2～C10アルキルジチオ、アミド、エーテル、チオエーテル、エステル、オリゴヌクレオチド、オリゴペプチド、チオプロピオナート、またはジスルフィドを含む基である、
    マルチコンジュゲート。
  50. Yが、Xと異なる、請求項49記載のマルチコンジュゲート。
  51. Xが、ペプチド、タンパク質、脂質、炭水化物、カルボン酸、ビタミン、ステロイド、リグニン、低分子、有機金属化合物、または前述のいずれかの誘導体である、請求項49または50記載のマルチコンジュゲート。
  52. Yが、核酸、ペプチド、タンパク質、脂質、炭水化物、カルボン酸、ビタミン、ステロイド、リグニン、低分子、有機金属化合物、または前述のいずれかの誘導体である、請求項49～52のいずれか一項記載のマルチコンジュゲート。
  53. Xが、ペプチド、抗体（もしくはその断片）、低分子、有機金属化合物、または前述のいずれかの誘導体である、請求項49～52のいずれか一項記載のマルチコンジュゲート。
  54. ペプチドが、HIV-1TATタンパク質の形質導入ドメイン、センチリン、拘束性ペプチド、pHLIPペプチド、またはそれらの誘導体である、請求項53記載のマルチコンジュゲート。
  55. 抗体断片が、単鎖可変断片またはその誘導体である、請求項53記載のマルチコンジュゲート。
  56. 低分子が、レナリドミドまたはその誘導体である、請求項53記載のマルチコンジュゲート。
  57. 有機金属化合物が、フェロセンまたはその誘導体である、請求項53記載のマルチコンジュゲート。
  58. Yが、核酸またはその誘導体である、請求項49～57のいずれか一項記載のマルチコンジュゲート。
  59. Yが、RNAまたはその誘導体である、請求項58記載のマルチコンジュゲート。
  60. Yが、siRNA、saRNA、もしくはmiRNA、またはそれらの誘導体である、請求項59記載のマルチコンジュゲート。
  61. Yが、siRNAまたはその誘導体である、請求項60記載のマルチコンジュゲート。
  62. R3が、細胞内条件下で切断可能である、請求項49～61のいずれか一項記載のマルチコンジュゲート。
  63. 少なくとも75、80、85、90、95、96、97、98、99、または100％純粋である、請求項49～62のいずれか一項記載のマルチコンジュゲート。
  64. 構造7：
    X●Y（構造7）
    のマルチコンジュゲートを合成するための方法であって、
    構造中：
    Xは、核酸以外の生物学的部分を含む第1の置換基であり；
    Yは、Xと同じまたは異なる第2の置換基であり；かつ
    ●は、XとYとをつなぐ共有結合性リンカーであり；
    該方法が、以下の工程：
    （a）X-R4とホモ二価リンカー○とを反応させて、一置換生成物X-○を生成する工程であって、R4が、一置換生成物X-○を生成しかつXの二量体化を実質的に阻止する条件下で、○と反応可能な官能基である、工程；および
    （b）X-○とR5-Yとを反応させる工程であって、R5が、○と反応可能な官能基であり、それによりX●Yを形成する、工程
    を含む、方法。
  65. 構造7：
    X●Y（構造7）
    のマルチコンジュゲートを合成するための方法であって、
    構造中：
    Xは、核酸以外の生物学的部分を含む第1の置換基であり；
    Yは、Xと同じまたは異なる第2の置換基であり；かつ
    ●は、XとYとをつなぐ共有結合性リンカーであり；
    該方法が、以下の工程：
    （a）R4-Yとホモ二価リンカー○とを反応させて、一置換生成物○-Yを生成する工程であって、R4が、一置換生成物○-Yを生成しかつYの二量体化を実質的に阻止する条件下で、○と反応可能な官能基である、工程；および
    （b）○-YとX-R5とを反応させる工程であって、R5が、○と反応可能な官能基であり、それによりX●Yを形成する、工程
    を含む、方法。
  66. 工程（a）が、X-R4に対して化学量論的過剰のホモ二価リンカー○を用いて行われる、請求項64記載の方法。
  67. 工程（a）が、R4-Yに対して化学量論的過剰のホモ二価リンカー○を用いて行われる、請求項65記載の方法。
  68. 工程（a）が、約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、または100のモル過剰のホモ二価リンカー○を用いて行われる、請求項64または65記載の方法。
  69. 工程（a）が、水と、任意で、水混和性の有機共溶媒とを含む溶液中で行われる、請求項64～68のいずれか一項記載の方法。
  70. 工程（a）が、約7、6、5、または4のpHで行われる、請求項69記載の方法。
  71. 水混和性の有機共溶媒が、DMF、DMSO、THF、ジオキサン、ピリジン、アルコール、またはアセトニトリルを含む、請求項69記載の方法。
  72. 水混和性の有機共溶媒が、アセトニトリルを含む、請求項71記載の方法。
  73. 水混和性の有機共溶媒が、溶液の約10、15、20、25、30、40、または50％（v/v）を構成する、請求項69～72のいずれか一項記載の方法。
  74. 工程（a）が、無水有機溶媒を含む溶液中で行われる、請求項64または65記載の方法。
  75. 無水有機溶媒が、ジクロロメタン、DMF、DMSO、THF、ジオキサン、ピリジン、アルコール、またはアセトニトリルを含む、請求項74記載の方法。
  76. 無水有機溶媒が、ジオキサンを含む、請求項75記載の方法。
  77. 無水有機溶媒が、DMFを含む、請求項75記載の方法。
  78. 無水有機溶媒が、ピリジンを含む、請求項75記載の方法。
  79. Xが、ペプチド、タンパク質、脂質、炭水化物、カルボン酸、ビタミン、ステロイド、リグニン、低分子、有機金属化合物、または前述のいずれかの誘導体である、請求項64～78のいずれか一項記載の方法。
  80. Yが、核酸、ペプチド、タンパク質、脂質、炭水化物、カルボン酸、ビタミン、ステロイド、リグニン、低分子、または前述のいずれかの誘導体である、請求項64～77のいずれか一項記載の方法。
  81. Xが、ペプチド、抗体（もしくはその断片）、低分子、有機金属化合物、または前述のいずれかの誘導体である、請求項64～80のいずれか一項記載の方法。
  82. ペプチドが、HIV-1TATタンパク質の形質導入ドメイン、センチリン、拘束性ペプチド、pHLIPペプチド、またはそれらの誘導体である、請求項81記載の方法。
  83. 抗体断片が、単鎖可変断片またはその誘導体である、請求項81記載の方法。
  84. 低分子が、レナリドミドまたはその誘導体である、請求項81記載の方法。
  85. 有機金属化合物が、フェロセンまたはその誘導体である、請求項81記載の方法。
  86. Yが、核酸またはその誘導体である、請求項64～85のいずれか一項記載の方法。
  87. Yが、RNAまたはその誘導体である、請求項86記載の方法。
  88. Yが、siRNA、saRNA、もしくはmiRNA、またはそれらの誘導体である、請求項87記載の方法。
  89. Yが、siRNAまたはその誘導体である、請求項88記載の方法。
  90. 共有結合性リンカー●が、細胞内条件下で切断可能である、請求項64～89のいずれか一項記載の方法。
  91. マルチコンジュゲートX●Yの収率が、少なくとも75、80、85、90、95、96、97、98、99、または100％である、請求項64～90のいずれか一項記載の方法。
  92. マルチコンジュゲートX●Yの純度が、少なくとも75、80、85、90、95、96、97、98、99、または100％である、請求項64～91のいずれか一項記載の方法。
  93. 置換基X、Y、およびZを含むマルチコンジュゲートであって、
    置換基の各々が、独立に、生物学的部分であり、かつ共有結合性リンカー●によって別の置換基につながれており；
    該マルチコンジュゲートが構造9：
    Figure 2023545418000079
    を含み、
    構造中：
    ▲1、▲2、▲3、▲4、および▲5の各々は、独立に、存在しないか、またはそのそれぞれの置換基に共有結合で連結された生物学的部分を含み；
    nは、ゼロ以上の整数であり；かつ
    構造9中に存在する置換基の少なくとも1つは、核酸ではない、
    マルチコンジュゲート。
  94. nが、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10である、請求項93記載のマルチコンジュゲート。
  95. 少なくとも1つの共有結合性リンカー●が、ホモ二価共有結合性リンカーである、請求項93または94記載のマルチコンジュゲート。
  96. Xが、核酸ではない、請求項93～95のいずれか一項記載のマルチコンジュゲート。
  97. Yが、核酸ではない、請求項93～96のいずれか一項記載のマルチコンジュゲート。
  98. 少なくとも1つの▲が存在する、請求項93～97のいずれか一項記載のマルチコンジュゲート。
  99. 存在する少なくとも1つの▲が、標的化リガンドであるか；または、少なくとも2つの▲が存在し、存在する少なくとも2つの▲の各々が標的化リガンドであるか；または、少なくとも2つの▲が存在し、存在する少なくとも2つの▲の各々が同じ標的化リガンドであるか；または、▲1および▲5が存在し、これらが同じ標的化リガンドである、請求項98記載のマルチコンジュゲート。
  100. 少なくとも1つの共有結合性リンカー●が、硫黄含有共有結合性リンカーであり；かつ、▲1、▲2、▲3、▲4、および▲5の少なくとも1つが、硫黄含有末端基Qを含む、請求項93～99のいずれか一項記載のマルチコンジュゲート。
  101. 硫黄含有末端基Qが、脱保護条件下で脱保護可能な保護チオール基を含み；かつ、硫黄含有共有結合性リンカー●が、脱保護条件下で安定である、請求項100記載のマルチコンジュゲート。
  102. 硫黄含有共有結合性リンカー●が、脱保護条件ではない切断条件下で切断可能な切断可能基を含む、請求項100または101記載のマルチコンジュゲート。
  103. 硫黄含有末端基Qが、式S-PGの保護チオール基を含む、請求項100～102のいずれか一項記載のマルチコンジュゲート。
  104. 構造10：
    Figure 2023545418000080
    を含むマルチコンジュゲートを合成するための方法であって、
    構造10aの化合物とホモ二価リンカーとを、一置換生成物（構造10b）を生成しかつ構造10aの二量体化を実質的に阻止する条件下で反応させて、構造10bの化合物を形成すること；
    構造10bの化合物と構造10cの化合物とを反応させて、構造10dの化合物を形成すること；
    構造10dの化合物を脱保護して、構造10eの化合物を形成すること；および
    構造10eの化合物と構造10fの化合物とを反応させて、構造10を形成すること
    を次のとおり：
    Figure 2023545418000081
    含み、
    構造中：
    ●は、共有結合性リンカーであり；
    ○は、ホモ二価リンカーであり；
    R4は、構造10bの一置換生成物を生成しかつ構造10aの二量体化を実質的に阻止する条件下でホモ二価リンカー○と反応するように選択された官能基であり；
    R5は、ホモ二価リンカー○と反応するように選択された官能基であり；
    S-PGは、構造10b、10c、および10d内の共有結合性リンカー●のいずれかに存在するどの硫黄含有基とも異なる硫黄含有基を含む保護チオール基であり；
    Qは、構造10eの-SH基と反応して共有結合性リンカー●を形成するように選択された反応性基であり；
    X、Y、およびZは、マルチコンジュゲートの置換基であり、かつ各々が、生物学的部分であり；任意で、マルチコンジュゲート中に存在するX、Y、およびZの少なくとも1つは、核酸ではなく；
    Z'、Z''、およびZ'''は、マルチコンジュゲートの置換基であり、かつ各々が、生物学的部分であり；
    ▲1、▲2、▲3、▲4、および▲5の各々は、独立に、存在しないか、またはそのそれぞれの置換基に共有結合で連結された生物学的部分を含み；
    ▲3'、▲3''、および▲3'''の各々は、独立に、存在しないか、またはそのそれぞれの置換基に共有結合で連結された生物学的部分を含み；
    nは、1以上の整数であり、任意で、nは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10であり；かつ
    n'、n''、およびn'''は、各々、ゼロ以上の整数であるが、ただし、n'+n''+n'''の合計が、nであるとする、
    方法。
  105. 請求項49～63または93～103のいずれか一項記載のマルチコンジュゲートと薬学的に許容される賦形剤とを含む、組成物。
  106. 医薬の製造において使用するための、請求項49～63または93～103のいずれか一項記載のマルチコンジュゲートを含む、組成物。
  107. 請求項49～63もしくは93～103のいずれか一項記載のマルチコンジュゲートまたは請求項105記載の組成物の有効量を対象に投与することを含む、対象を治療するための方法。
  108. 細胞における1つまたは複数の標的遺伝子の活性を調節する方法であって、請求項49～63または93～100のいずれか一項記載のマルチコンジュゲートを細胞に導入すること、および、マルチコンジュゲートが細胞に侵入しかつ1つまたは複数の標的遺伝子の活性が調節される条件下で、細胞を維持することを含む、方法。
  109. 細胞におけるマルチコンジュゲートの活性を観察する方法であって、請求項49～63または93～100のいずれか一項記載のマルチコンジュゲートを細胞に導入すること、および、マルチコンジュゲートが細胞に侵入しかつマルチコンジュゲートの活性が観察される条件下で、細胞を維持することを含む、方法。
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