KR20230088412A - 단일 치환된 동종 2가 링커를 포함하는 다중접합체 - Google Patents

단일 치환된 동종 2가 링커를 포함하는 다중접합체 Download PDF

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KR20230088412A
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조나단 마일스 브라운
크리스틴 케이 에이치 뉴먼
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엠펙 엘에이, 엘.엘.씨.
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Abstract

다양한 실시양태는 한 말단이 치환기 X에 의해 치환된 동종 2가 공유 링커를 제공하며, 여기서 X는 핵산 외의 생물학적 모이어티를 포함한다.

Description

단일 치환된 동종 2가 링커를 포함하는 다중접합체
임의의 우선권 출원에 대한 참고에 의한 포함
본 출원과 함께 출원된 PCT 출원서에서 외국 또는 국내 우선권 주장이 확인된 임의의 그리고 모든 출원은 이로써 참고로 포함된다.
본 개시내용의 분야
본 개시내용은 단일 치환된 동종 2가 링커를 포함하는 신규 합성 중간체, 및 유전자 발현 조절, 생물학적 연구, 질병의 치료 또는 예방, 또는 새롭거나 변경된 표현형의 생성에 사용하기 위한 다중접합체 합성에서의 중간체의 용도에 관한 것이다.
생체접합체는 적어도 2개의 분자의 공유 결합을 포함하며, 이중 적어도 하나는 생체분자이다. 생체분자는 분자 및 세포 이벤트의 표지부착, 이미징, 및 추적, 표적 세포에 약물 전달에서와 진단 또는 치료제로서의 다양한 기능을 가지고 있다. 생체접합체의 비제한적 예는 단백질에 소분자(예를 들어, 비오틴)의 커플링, 단백질-단백질 접합체(예를 들어, 효소에 커플링된 항체), 항체 약물 접합체(ADC: antibody drug conjugate)(예를 들어, 세포독성 소분자에 접합된 단클론 항체), 방사성 면역접합체(예를 들어, 킬레이트제에 접합된 단클론 항체), 백신(예를 들어, 담체 단백질에 접합된 합텐), 나노입자 및 비세포독성 약물(예를 들어, 펩티드)에 접합된 항체, 원소 또는 이의 유도체에 접합된 생체분자(예를 들어, 산화철 나노입자에 접합된 TGF-β)를 포함한다.
생체접합체는 충분한 수율 및 순도로 공유 결합(접합)을 형성하는 과정에서 많은 것이 기인하는 개발 및 제조상의 문제를 제기한다. 예를 들어, 일부 조건하에서 치환기 A 및 B의 이종이량체를 형성하기 위한 동종 2가 링커의 사용은 동종이량체 및 이종이량체 종의 혼합물을 생성할 것이며, 이로부터 원하는 이종이량체의 단리는 치환기 A와 B가 크기 및/또는 전하가 비슷하면 어려울 수 있다. 이 문제는 치환기 A와 B의 이종이량체를 형성하기 위해 이종 2가 링커를 사용함으로써 해결될 수 있다. 그러나 예를 들어, 절단 가능한 결합이 요구되고 바람직한 절단 프로파일을 갖는 이종 2가 링커를 이용할 수 없는 경우; 또는 예를 들어 추가 접합 반응이 요구되는 경우(예를 들어, 3개의 치환기 A, B 및 C의 다중접합체를 형성하기 위해) 새로운 문제가 발생한다.
따라서, 바이오접합체 개발, 합성, 및 상업적 용도를 위한 비용 효과적인 규모 확장의 효율성을 개선하기 위한 새로운 방법 및 물질에 대한 요구가 있다.
본 개시내용의 요약
본 개시내용은 새로운 부류의 합성 중간체를 나타내는 화합물, 다중접합체를 합성하기 위한 합성 중간체의 사용 방법, 새로운 형태의 다중접합체, 및 예를 들어 유전 발현 감소, 생물학적 연구, 질병의 치료 또는 예방 및/또는 새롭거나 변경된 표현형 생성에 다중접합체를 사용하는 방법에 관한 것이다.
본 개시내용은 한 말단이 치환기 X로 치환된 동시에 다른 말단은 비치환된 채로 남아있는 동종 2가 공유 링커를 포함하는 합성 중간체("단일 치환된 공유 링커")를 제공하며, 여기서 X는 핵산 외의 생물학적 모이어티를 포함한다. 본 개시내용은 본 개시내용 전반에 걸쳐 제공된 동종 2가 공유 링커의 예를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 절단 가능하거나 절단 불가능한 모든 유형의 동종 2가 공유 링커에 적용 가능하다. 본 개시내용은 본 개시내용 전반에 걸쳐 제공된 비핵산 치환기의 예를 포함하지만 이에 제한되지 않는 치환기로서 모든 유형의 비핵산 생물학적 모이어티에 적용 가능하다.
본 개시내용은 단일 치환된 공유 링커의 형성을 실질적으로 선호하고 치환기 X의 이량체화를 실질적으로 방지하는 반응 조건하에서 동종 2가 공유 링커를 치환기 X에 커플링시키는 단계를 포함하는 단일 치환된 공유 링커를 합성하는 방법을 제공하며, 여기서 X는 핵산 외의 생물학적 모이어티이다.
본 개시내용은 또한 핵산 외의 생물학적 모이어티를 포함하는 제1 치환기 X 및 X와 동일하거나 상이한 제2 치환기 Y를 포함하는 다중접합체를 제공하며, 여기서 X 및 Y는 동종 2가 공유 링커에 의해 연결된다. 본 개시내용은 본 개시내용 전반에 걸쳐 제공되는 동종 2가 공유 링커의 예를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 절단 가능하거나 절단 불가능한 모든 유형의 동종 2가 공유 링커; 및 추가로, 본 개시내용 전반에 걸쳐 제공되는 치환기의 예를 포함하지만 이에 제한되지 않는, X의 경우 비핵산, Y의 경우 핵산 또는 비핵산인 치환기로서 모든 유형의 생물학적 모이어티에 적용 가능하다.
본 개시내용은 핵산 외의 생물학적 모이어티를 포함하는 제1 치환기 X 및 X와 동일하거나 상이한 제2 치환기 Y를 포함하는 다중접합체를 합성하는 방법을 제공하며, 여기서 X 및 Y는 X-Y 이량체의 형성을 실질적으로 선호하고 X-X 이량체 및 Y-Y 이량체의 형성을 실질적으로 방지하는 반응 조건하에 동종 2가 공유 링커에 의해 연결된다.
본 개시내용은 또한 생물학적 활성 치환기 X, Y, 및 Z를 포함하는 다중접합체를 제공하며, 치환기 X, Y, 및 Z는 동일하거나 상이할 수 있고, 각각이 공유 링커에 의해 서로 연결된다. 본 개시내용은 본 개시내용 전반에 걸쳐 제공되는 동종 2가 공유 링커의 예를 포함하지만 이에 제한되지는 않는, 절단 가능하거나 절단 불가능한 모든 유형의 동종 2가 공유 링커; 및 추가로, 본 개시내용 전반에 걸쳐 제공되는 치환기의 예를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 치환기 X, Y, 및 Z로서 모든 유형의 생물학적 모이어티에 적용 가능하다.
본 개시내용은 또한 생물학적 활성 치환기 X, Y, 및 Z를 포함하는 다중접합체를 합성하는 방법을 제공하며, 치환기 X, Y, 및 Z는 동일하거나 상이할 수 있고, 각각은 공유 링커에 의해 서로 연결된다.
본 개시내용은 또한 유전자 발현 조절, 생물학적 연구, 질병의 치료 또는 예방, 및/또는 새롭거나 변경된 유전자형 또는 표현형 생산에 개시된 합성 중간체 및 다중접합체를 사용하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 개시내용은 한 말단이 치환기 X에 의해 치환된 동종 2가 공유 링커를 포함하는 화합물(합성 중간체)을 제공하며, 여기서 X는 핵산 외의 생물학적 모이어티를 포함하고, 동종 2가 링커의 다른 말단은 비치환되고, 화합물은 적어도 75% 순수하다.
한 실시양태에서, 화합물은 구조 1을 포함한다:
X - R1 - R2 - A - R3 - B (구조 1)
여기서,
X는 핵산 외의 생물학적 모이어티를 포함하는 치환기이고;
R1은 포스포디에스테르, 티오포스포디에스테르, 설페이트, 아미드, 트리아졸, 헤테로아릴, 에스테르, 에테르, 티오에테르, 디설피드, 티오프로피오네이트, 아세탈, 글리콜을 포함하는 기이거나, 존재하지 않고;
R2는 스페이서 기이거나, 존재하지 않고;
A는 제1 친핵체와 제1 친전자체의 반응 생성물을 포함하는 기이고;
R3은 C2-C10 알킬, C2-C10 알콕시, C1-C10 아릴, C2-C10 알킬디티오, 아미드, 에테르, 티오에테르, 에스테르, 올리고뉴클레오티드, 올리고펩티드, 티오프로피오네이트, 또는 디설피드를 포함하는 기이고;
B는 제2 친핵체 또는 제2 친전자체를 포함하는 기이고, 여기서 제2 친핵체는 제1 친핵체와 동일하고, 제2 친전자체는 제1 친전자체와 동일하다.
한 실시양태에서, 스페이서 기 R2는 C2-C10 알킬, C2-C10 알콕시, 또는 C1-C10 아릴을 포함하거나, 존재하지 않는다.
한 실시양태에서, 기 A의 제1 친핵체 및 제1 친전자체는 (i) 티올 및 말레이미드(임의로 여기서 티올과 말레이미드의 반응 생성물은 숙신남산의 유도체임(예컨대, 말레이미드 고리 중 하나가 개방될 때)); (ii) 티올 및 비닐설폰; (iii) 티올 및 피리딜디설피드; (iv) 티올 및 요오도아세트아미드; (v) 티올 및 아크릴레이트; (vi) 아지드 및 알킨; 또는 (vii) 아민 및 카르복실을 포함한다.
한 실시양태에서, A는 티올과 말레이미드의 반응 생성물을 포함하는 기이고, 임의로 여기서 티올과 말레이미드의 반응 생성물은 숙신남산의 유도체이다.
한 실시양태에서, R3 기는 티오프로피오네이트, 디설피드, 올리고뉴클레오티드, 또는 올리고펩티드를 포함한다.
한 실시양태에서, 화합물은 구조 2 또는 이의 피롤리딘디온 개환 유도체를 포함하고, 임의로 구조 2의 피롤리딘디온 개환 유도체는 숙신남산의 유도체이다:
Figure pct00001
(구조 2)
여기서,
X는 핵산 외의 생물학적 모이어티를 포함하는 치환기이고;
R1은 포스포디에스테르, 티오포스포디에스테르, 설페이트, 아미드, 트리아졸, 헤테로아릴, 에스테르, 에테르, 티오에테르, 디설피드, 티오프로피오네이트, 아세탈, 글리콜을 포함하는 기이거나, 존재하지 않고;
R2는 스페이서 기이거나, 존재하지 않고;
S는 황이고;
N은 질소이고;
R3은 C2-C10 알킬, C2-C10 알콕시, C1-C10 아릴, C2-C10 알킬디티오, 아미드, 에테르, 티오에테르, 에스테르, 올리고뉴클레오티드, 올리고펩티드, 티오프로피오네이트, 또는 디설피드를 포함하는 기이다.
한 실시양태에서, 화합물은 하기 구조 2a(2개의 위치 이성질체를 나타냄)를 갖는 숙신남산의 유도체인 구조 2의 화합물의 피롤리딘디온 개환 유도체를 포함한다:
Figure pct00002
(구조 2a).
구조 2 또는 구조 2a를 포함하는 화합물의 한 실시양태에서, R2 스페이서 기는 C2-C10 알킬, C2-C10 알콕시, 또는 C1-C10 아릴을 포함한다.
구조 2 또는 구조 2a를 포함하는 화합물의 한 실시양태에서,
X는 펩티드 또는 단백질, 또는 이의 유도체이고;
R1 및 R2는 존재하지 않고;
R3은 티오프로피오네이트, 디설피드, 또는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 기이다.
구조 2 또는 구조 2a를 포함하는 화합물의 한 실시양태에서,
X는 유기금속 화합물 또는 이의 유도체이고;
R1은 에스테르기이고;
R2는 C2-C10 알킬을 포함하는 스페이서 기이고;
R3은 티오프로피오네이트, 디설피드, 올리고뉴클레오티드, 또는 올리고펩티드를 포함하는 기이다.
구조 2 또는 구조 2a를 포함하는 화합물의 한 실시양태에서,
X는 소분자 또는 이의 유도체이고;
R1은 에스테르기이고;
R2는 C2-C10 알킬을 포함하는 스페이서 기이고;
R3은 티오프로피오네이트, 디설피드, 올리고뉴클레오티드, 또는 올리고펩티드를 포함하는 기이다.
화합물의 한 실시양태에서, 동종 2가 공유 링커는 세포내 조건하에서 절단 가능한 링커를 포함한다.
구조 1 또는 구조 2를 포함하는 화합물의 한 실시양태에서, R3 기는 세포내 조건하에서 절단 가능한 링커를 포함한다.
화합물의 한 실시양태에서, 치환기 X는 펩티드, 단백질, 지질, 탄수화물, 카르복실산, 비타민, 스테로이드, 리그닌, 소분자, 유기금속 화합물, 또는 전술한 어느 하나의 유도체이다.
화합물의 한 실시양태에서, 치환기 X는 펩티드, 또는 펩티드의 유도체이다. 한 실시양태에서, 펩티드는 HIV-1TAT 단백질의 형질도입 도메인 또는 이의 유도체를 포함한다. 한 실시양태에서, 펩티드는 센티린을 포함한다. 한 실시양태에서, 펩티드는 속박된 펩티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 펩티드는 pHLIP 펩티드를 포함한다.
화합물의 한 실시양태에서, 치환기 X는 항체 또는 항체 단편, 또는 이의 유도체이다. 한 실시양태에서, 항체 단편은 단쇄 가변 단편 또는 이의 유도체를 포함한다.
화합물의 한 실시양태에서, 치환기 X는 탄수화물, 또는 탄수화물의 유도체이다.
화합물의 한 실시양태에서, 치환기 X는 지방산, 또는 지방산의 유도체이다.
화합물의 한 실시양태에서, 치환기 X는 비타민, 또는 비타민 유도체이다. 한 실시양태에서, 비타민은 토코페롤 또는 엽산, 또는 이의 유도체이다.
화합물의 한 실시양태에서, 치환기 X는 콜레스테롤 또는 이의 유도체이다.
화합물의 한 실시양태에서, 치환기 X는 (2S,2'S)-2,2'-(카르보닐디이미노)디펜탄디온산(DUPA) 또는 이의 유도체이다.
화합물의 한 실시양태에서, 치환기 X는 아니스아미드 또는 이의 유도체이다.
화합물의 한 실시양태에서, 치환기 X는 유기금속 화합물 또는 이의 유도체이다. 한 실시양태에서, 유기금속 화합물은 페로센 또는 이의 유도체이다.
화합물의 한 실시양태에서, 치환기 X는 소분자 또는 이의 유도체이다. 한 실시양태에서, 소분자는 치료 약물 분자이다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 소분자는 레날리도마이드 또는 이의 유도체이다.
한 실시양태에서, 화합물은 적어도 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% 순수하다.
본 개시내용은 단일 치환된 공유 링커의 형성을 실질적으로 선호하고 치환기 X의 이량체화를 실질적으로 방지하는 조건하에서 동종 2가 공유 링커를 치환기 X에 커플링시키는 단계를 포함하는 단일 치환된 공유 링커를 합성하는 방법을 제공하며, 여기서 X는 핵산 외의 생물학적 모이어티이다.
한 실시양태에서, 방법은 동종 2가 공유 링커와 반응성인 작용기를 포함하는 작용화된 치환기 X와 동종 2가 공유 링커를 반응시키는 단계를 추가로 포함한다. 이 방법의 한 실시양태에서, 작용화된 치환기 X는 구조 3을 포함하고:
X - R1 - R2 - A' (구조 3);
동종 2가 공유 링커는 구조 4를 포함하고:
A" - R3- B (구조 4);
X는 핵산 외의 생물학적 모이어티를 포함하는 치환기이고;
R1은 포스포디에스테르, 티오포스포디에스테르, 설페이트, 아미드, 트리아졸, 헤테로아릴, 에스테르, 에테르, 티오에테르, 디설피드, 티오프로피오네이트, 아세탈, 글리콜을 포함하는 기이거나, 존재하지 않고;
R2는 스페이서 기이거나, 존재하지 않고;
R3은 C2-C10 알킬, C2-C10 알콕시, C1-C10 아릴, C2-C10 알킬디티오, 아미드, 에테르, 티오에테르, 에스테르, 올리고뉴클레오티드, 올리고펩티드, 티오프로피오네이트, 또는 디설피드를 포함하는 기이고;
A' 및 A"는 함께 제1 친핵체 및 제1 친전자체를 포함하며, 이들은 함께 반응하여 A를 형성하고;
B는 제2 친핵체 또는 제2 친전자체를 포함하는 기이고, 여기서 제2 친핵체는 제1 친핵체와 동일하고, 제2 친전자체는 제1 친전자체와 동일하며;
생성된 화합물은 구조 1: X - R1 - R2 - A - R3 - B이다.
상기 방법의 대안적인 실시양태에서, 동종 2가 공유 링커는 작용화된 R2 말단기와 반응하여 중간체를 형성하고, 이어서 중간체의 작용화된 R2 말단기는 작용화된 R2 말단기와 반응성인 작용기를 포함하는 작용화된 치환기 X와 반응하여 R1을 형성하고; 여기서, R1은 포스포디에스테르, 티오포스포디에스테르, 설페이트, 아미드, 트리아졸, 헤테로아릴, 에스테르, 에테르, 티오에테르, 디설피드, 티오프로피오네이트, 아세탈, 또는 글리콜을 포함하는 기이고; R2는 스페이서 기이다. 이 방법의 실시양태에서, 동종 2가 공유 링커는 구조 4를 포함하고:
A"-R3-B (구조 4)
작용화된 R2 말단기는 구조 5를 포함하고:
R1'-R2-A' (구조 5)
작용화된 치환기 X는 구조 6을 포함하고:
X-R1" (구조 6);
X는 핵산 외의 생물학적 모이어티를 포함하는 치환기이고;
R1' 및 R1"은 반응하여 R1을 형성하는 작용기이고;
R1은 포스포디에스테르, 티오포스포디에스테르, 설페이트, 아미드, 트리아졸, 헤테로아릴, 에스테르, 에테르, 티오에테르, 디설피드, 티오프로피오네이트, 아세탈, 또는 글리콜을 포함하는 기이고;
R2는 스페이서 기이고;
R3은 C2-C10 알킬, C2-C10 알콕시, C1-C10 아릴, C2-C10 알킬디티오, 아미드, 에테르, 티오에테르, 에스테르, 올리고뉴클레오티드, 올리고펩티드, 티오프로피오네이트, 또는 디설피드를 포함하는 기이고;
A' 및 A"는 제1 친핵체 및 제1 친전자체를 포함하며, 이들은 반응하여 A를 형성하고;
B는 제2 친핵체 또는 제2 친전자체를 포함하는 기이고, 여기서 제2 친핵체는 제1 친핵체와 동일하고, 제2 친전자체는 제1 친전자체와 동일하며;
생성된 화합물은 구조 1: X - R1 - R2 - A - R3 - B이다.
상기 방법의 한 실시양태에서, 치환기 X와 동종 2가 공유 링커의 커플링은 화학량론적 과량의 동종 2가 공유 링커와 작용화된 치환기 X의 희석 용액에서 수행된다.
상기 방법의 한 실시양태에서, 치환기 X와 동종 2가 공유 링커의 커플링은 적어도 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 또는 100의 몰 과량의 동종 2가 공유 링커로 수행된다.
상기 방법의 한 실시양태에서, 치환기 X와 동종 2가 공유 링커의 커플링은 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 또는 100의 몰 과량의 동종 2가 공유 링커로 수행된다.
상기 방법의 한 실시양태에서, 치환기 X와 동종 2가 공유 링커의 커플링은 약 7, 6, 5, 또는 4 미만의 pH에서 수행된다.
상기 방법의 한 실시양태에서, 치환기 X와 동종 2가 공유 링커의 커플링은 약 7, 6, 5, 또는 4의 pH에서 수행된다.
상기 방법의 한 실시양태에서, 치환기 X와 동종 2가 공유 링커의 커플링은 물 및 수혼화성 유기 공용매를 포함하는 용액에서 수행된다. 한 실시양태에서, 수혼화성 유기 공용매는 DMF, NMP, DMSO, 알코올, 또는 아세토니트릴을 포함한다. 한 실시양태에서, 수혼화성 유기 공용매는 용액의 약 10, 15, 20, 25, 30, 40, 또는 50%(v/v)를 구성한다.
상기 방법의 한 실시양태에서, 치환기 X와 동종 2가 공유 링커의 커플링은 무수 유기 용매를 포함하는 용액에서 수행된다. 추가 실시양태에서, 무수 유기 용매는 디클로로메탄, DMF, DMSO, THF, 디옥산, 피리딘, 알코올, 또는 아세토니트릴을 포함한다.
상기 방법의 한 실시양태에서, 생성된 단일 치환된 공유 링커의 수율은 적어도 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100%이다.
상기 방법의 한 실시양태에서, 생성된 단일 치환된 공유 링커의 순도는 적어도 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100%이다.
한 실시양태에서, 본 개시내용은 구조 7을 포함하는 다중접합체를 제공한다:
X●Y (구조 7)
여기서,
X는 핵산 외의 생물학적 모이어티를 포함하는 제1 치환기이고;
Y는 X와 동일하거나 상이한 제2 치환기이고;
●는 X와 Y를 연결하는 공유 링커이며, 구조 8을 포함하며:
- R1 - R2 - A - R3 - A - R2 - R1 - (구조 8)
여기서,
각 R1은 독립적으로 포스포디에스테르, 티오포스포디에스테르, 설페이트, 아미드, 트리아졸, 헤테로아릴, 에스테르, 에테르, 티오에테르, 디설피드, 티오프로피오네이트, 아세탈, 글리콜을 포함하는 기이거나, 존재하지 않고;
각 R2는 독립적으로 스페이서 기이거나, 존재하지 않으며;
각 A는 동일하고, 친핵체와 친전자체의 반응 생성물을 포함하는 기이고;
R3은 C2-C10 알킬, C2-C10 알콕시, C1-C10 아릴, 아미드, C2-C10 알킬디티오, 아미드, 에테르, 티오에테르, 에스테르, 올리고뉴클레오티드, 올리고펩티드, 티오프로피오네이트, 또는 디설피드를 포함하는 기이다.
구조 7의 다중접합체의 한 실시양태에서, Y는 X와 상이하다.
구조 7의 다중접합체의 한 실시양태에서, X는 펩티드, 단백질, 지질, 탄수화물, 카르복실산, 비타민, 스테로이드, 리그닌, 소분자, 유기금속 화합물, 또는 전술한 어느 하나의 유도체이다.
구조 7의 다중접합체의 한 실시양태에서, Y는 핵산, 펩티드, 단백질, 지질, 탄수화물, 카르복실산, 비타민, 스테로이드, 리그닌, 소분자, 유기금속 화합물, 또는 전술한 어느 하나의 유도체이다.
구조 7의 다중접합체의 한 실시양태에서, X는 펩티드 또는 펩티드의 유도체이다. 추가 실시양태에서, X는 HIV-1TAT 단백질의 형질도입 도메인 또는 이의 유도체이다. 한 실시양태에서, 펩티드는 센티린을 포함한다. 한 실시양태에서, 펩티드는 속박된 펩티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 펩티드는 pHLIP 펩티드를 포함한다.
구조 7의 다중접합체의 한 실시양태에서, X는 항체 또는 항체 단편, 또는 이의 유도체이다. 추가 실시양태에서, X는 항체 단쇄 가변 단편 또는 이의 유도체이다.
구조 7의 다중접합체의 한 실시양태에서, X는 소분자 또는 이의 유도체이다. 추가 실시양태에서, 소분자는 치료 약물 분자이다. 예를 들어, 한 실시양태에서, X는 레날리도마이드 또는 이의 유도체이다.
구조 7의 다중접합체의 한 실시양태에서, X는 유기금속 화합물 또는 이의 유도체이다. 추가의 실시양태에서, X는 페로센 또는 이의 유도체이다.
구조 7의 다중접합체의 한 실시양태에서, Y는 핵산 또는 이의 유도체이다. 추가 실시양태에서, Y는 RNA 또는 이의 유도체이다. 또 다른 실시양태에서, Y는 siRNA, saRNA, 또는 miRNA, 또는 이들의 유도체이다.
구조 7의 다중접합체의 한 실시양태에서, X와 Y를 연결하는 공유 링커는 세포내 조건하에서 절단 가능하다.
한 실시양태에서, 구조 7의 다중접합체는 적어도 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% 순수하다.
한 실시양태에서, 본 개시내용은 구조 7의 다중접합체를 합성하는 방법을 제공하며:
X●Y (구조 7)
여기서,
X는 핵산 외의 생물학적 모이어티를 포함하는 제1 치환기이고;
Y는 X와 동일하거나 상이한 제2 치환기이고;
●는 X와 Y를 연결하는 공유 링커이고;
상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(a) X-R4를 동종 2가 링커 ○와 반응시켜 단일 치환된 생성물 X-○를 생성하는 단계로서, R4는 단일 치환된 생성물 X-○를 생성하고 X의 이량체화를 실질적으로 방지하는 조건하에서 ○와 반응할 수 있는 작용기인 단계; 및
(b) X-○를 R5-Y와 반응시킴으로써 X●Y를 형성하는 단계로서, R5는 ○와 반응할 수 있는 작용기인 단계.
한 실시양태에서, 본 개시내용은 구조 7의 다중접합체를 합성하는 방법을 제공하며:
X●Y (구조 7)
여기서,
X는 핵산 외의 생물학적 모이어티를 포함하는 제1 치환기이고;
Y는 X와 동일하거나 상이한 제2 치환기이고;
●는 X와 Y를 연결하는 공유 링커이고;
상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(a) R4-Y를 동종 2가 링커 ○와 반응시켜 단일 치환된 생성물 ○-Y를 생성하는 단계로서, R4는 단일 치환된 생성물 ○-Y를 생성하고 Y의 이량체화를 실질적으로 방지하는 조건하에서 ○와 반응할 수 있는 작용기인 단계; 및
(b) ○-Y를 X-R5와 반응시킴으로써 X●Y를 형성하는 단계로서, R5는 ○와 반응할 수 있는 작용기인 단계.
구조 7의 다중접합체를 합성하는 방법의 한 실시양태에서, 단계 (a)는 X-R4에 비해 화학량론적 과량의 동종 2가 링커 ○로 수행된다.
구조 7의 다중접합체를 합성하는 방법의 한 실시양태에서, 단계 (a)는 R4-Y에 비해 화학량론적 과량의 동종 2가 링커 ○로 수행된다.
구조 7의 다중접합체를 합성하는 방법의 한 실시양태에서, 단계 (a)는 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 또는 100의 몰 과량의 동종 2가 링커 ○로 수행된다.
구조 7의 다중접합체를 합성하는 방법의 한 실시양태에서, 단계 (a)는 물 및 임의로 수혼화성 유기 공용매를 포함하는 용액에서 수행된다. 수혼화성 유기 공용매가 사용되는 추가 실시양태에서, 수혼화성 유기 공용매는 DMF, DMSO, THF, 디옥산, 피리딘, 알코올, 또는 아세토니트릴을 포함한다. 추가 실시양태에서, 수혼화성 유기 공용매는 용액의 약 10, 15, 20, 25, 30, 40, 또는 50%(v/v)를 구성한다.
전술한 합성 방법에 사용하기 위한 알코올은 C1-C10 알코올, C1-C7 알코올, 및 C1-C5 알코올을 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 각각의 경우 아미노, 3급 아미노 또는 설페이트와 같은 수혼화성 향상기로 임의로 치환된다.
구조 7의 다중접합체를 합성하는 방법의 한 실시양태에서, 단계 (a)는 약 7, 6, 5, 또는 4의 pH에서 수행된다.
구조 7의 다중접합체를 합성하는 방법의 한 실시양태에서, 단계 (a)는 무수 유기 용매를 포함하는 용액에서 수행된다. 추가 실시양태에서, 무수 유기 용매는 디클로로메탄, DMF, DMSO, THF, 디옥산, 피리딘, 알코올, 또는 아세토니트릴을 포함한다.
구조 7의 다중접합체를 합성하는 방법의 한 실시양태에서, X는 펩티드, 단백질, 지질, 탄수화물, 카르복실산, 비타민, 스테로이드, 리그닌, 소분자, 유기금속 화합물, 또는 전술한 어느 하나의 유도체이다.
구조 7의 다중접합체를 합성하는 방법의 한 실시양태에서, Y는 핵산, 펩티드, 단백질, 지질, 탄수화물, 카르복실산, 비타민, 스테로이드, 리그닌, 소분자, 또는 전술한 어느 하나의 유도체이다.
구조 7의 다중접합체를 합성하는 방법의 한 실시양태에서, X는 펩티드, 또는 펩티드의 유도체이다. 추가 실시양태에서, X는 HIV-1TAT 단백질의 형질도입 도메인 또는 이의 유도체이다. 한 실시양태에서, 펩티드는 센티린을 포함한다. 한 실시양태에서, 펩티드는 속박된 펩티드를 포함한다. 실시양태에서, 펩티드는 pHLIP 펩티드를 포함한다.
구조 7의 다중접합체를 합성하는 방법의 한 실시양태에서, X는 항체, 또는 이의 단편이다. 추가 실시양태에서, X는 단쇄 항체 가변 단편 또는 이의 유도체이다.
구조 7의 다중접합체를 합성하는 방법의 한 실시양태에서, X는 소분자 또는 이의 유도체이다. 추가 실시양태에서, 소분자는 치료 약물 분자이다. 예를 들어, 한 실시양태에서, X는 레날리도마이드 또는 이의 유도체이다.
구조 7의 다중접합체를 합성하는 방법의 한 실시양태에서, X는 유기금속 화합물 또는 이의 유도체이다. 추가의 실시양태에서, X는 페로센 또는 이의 유도체이다.
구조 7의 다중접합체를 합성하는 방법의 한 실시양태에서, Y는 핵산 또는 이의 유도체이다. 추가 실시양태에서, Y는 RNA 또는 이의 유도체이다. 또 다른 실시양태에서, Y는 siRNA, saRNA, 또는 miRNA이다.
구조 7의 다중접합체를 합성하는 방법의 한 실시양태에서, 공유 링커는 ● 세포내 조건하에서 절단 가능하다.
구조 7의 다중접합체를 합성하는 방법의 한 실시양태에서, X●Y의 수율은 적어도 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%이다.
구조 7의 다중접합체를 합성하는 방법의 한 실시양태에서, X●Y의 순도는 적어도 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%이다.
한 실시양태에서, 본 개시내용은 치환기 X, Y, 및 Z를 포함하는 다중접합체를 제공하며, 여기서 치환기 각각은 독립적으로 생물학적 모이어티이고 공유 링커 ●에 의해 또 다른 치환기에 연결되며, 여기서 다중접합체는 구조 9를 포함하며:
Figure pct00003
(구조 9)
여기서,
▲1, ▲2, ▲3, ▲4 및 ▲5 각각은 독립적으로 존재하지 않거나, 이들 각각의 치환기에 공유 결합된 생물학적 모이어티를 포함하고;
n은 0 이상의 정수이고;
구조 9에 존재하는 치환기 중 적어도 하나는 핵산이 아니다.
구조 9의 다중접합체의 한 실시양태에서, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이다.
구조 9의 다중접합체의 한 실시양태에서, 적어도 하나의 공유 링커 ●는 동종 2가 공유 링커이다.
구조 9의 다중접합체의 한 실시양태에서, X는 핵산이 아니다.
구조 9의 다중접합체의 한 실시양태에서, Y는 핵산이 아니다.
구조 9의 다중접합체의 한 실시양태에서, 적어도 ▲가 존재한다. 추가 실시양태에서, 존재하는 적어도 하나의 ▲는 표적화 리간드이다. 한 실시양태에서, 적어도 2개의 ▲가 존재하고 존재하는 2개의 ▲ 각각은 표적화 리간드이다. 한 실시양태에서, 적어도 2개의 ▲가 존재하고 존재하는 2개의 ▲ 각각은 동일한 표적화 리간드이다. 한 실시양태에서, ▲1 및 ▲5가 존재하고 동일한 표적화 리간드이다.
구조 9의 다중접합체의 한 실시양태에서, 적어도 하나의 공유 링커 ●는 황 함유 공유 링커이고; ▲1, ▲2, ▲3, ▲4 및 ▲5 중 적어도 하나는 황 함유 말단기 Q를 포함한다. 추가 실시양태에서, 황 함유 말단기 Q는 탈보호 조건하에서 탈보호 가능한 보호된 티올기를 포함하고; 황 함유 공유 링커 ●는 탈보호 조건하에서 안정하다. 또 다른 실시양태에서, 황 함유 공유 링커 ●는 탈보호 조건이 아닌 절단 조건하에서 절단 가능한 절단 가능한 기를 포함한다. 추가 실시양태에서, 황 함유 말단기 Q는 화학식 S-PG의 보호된 티올기를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 개시내용은 구조 10을 포함하는 다중접합체를 합성하는 방법을 제공하며:
Figure pct00004
(구조 10)
상기 방법은
단일 치환된 생성물(구조 10b)을 생성하고 구조 10a의 이량체화를 실질적으로 방지하는 조건하에서 구조 10a의 화합물을 동종 2가 링커와 반응시켜 구조 10b의 화합물을 형성하는 단계;
구조 10b의 화합물을 구조 10c의 화합물과 반응시켜 구조 10d의 화합물을 형성하는 단계;
구조 10d의 화합물을 탈보호하여 구조 10e의 화합물을 형성하는 단계; 및
구조 10e의 화합물을 구조 10f의 화합물과 반응시켜 구조 10을 형성하는 단계
를 포함하며, 다음과 같다:
Figure pct00005
여기서,
●는 공유 링커이고;
○는 동종 2가 링커이고;
R4는 구조 10b의 단일 치환된 생성물을 생성하고 구조 10a의 이량체화를 실질적으로 방지하는 조건하에서 동종 2가 링커 ○와 반응하도록 선택된 작용기이고;
R5는 동종 2가 링커 ○와 반응하도록 선택된 작용기이고;
S - PG는 구조 10b, 10c 및 10d 내의 임의의 공유 링커 ● 내에 존재하는 임의의 황 함유기와 상이한 황 함유기를 포함하는 보호된 티올기이고;
Q는 구조 10e의 -SH 기와 반응하여 공유 링커 ●를 형성하도록 선택된 반응성 기이고;
X, Y, 및 Z는 다중접합체의 치환기이고, 각각은 생물학적 모이어티이고;
Z', Z" 및 Z"'는 다중접합체의 치환기이고, 각각은 생물학적 모이어티이고;
▲1, ▲2, ▲3, ▲4 및 ▲5 각각은 독립적으로 존재하지 않거나, 이들 각각의 치환기에 공유 결합된 생물학적 모이어티를 포함하고;
▲3', ▲3", 및 ▲3"' 각각은 독립적으로 존재하지 않거나, 이들 각각의 치환기에 공유 결합된 생물학적 모이어티를 포함하고;
n 은 1 이상인 정수이고, 임의로 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이고;
n', n", 및 n"'은 각각 0 이상의 정수이며, 단 n' + n" + n"'의 합은 n이다.
구조 10을 포함하는 다중접합체를 합성하는 방법의 한 실시양태에서, 다중접합체에 존재하는 X, Y, 및 Z 중 적어도 하나는 핵산이 아니다.
본 개시내용은 개시된 다중접합체 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 개시내용은 의약의 제조에 사용하기 위한, 개시된 다중접합체를 제공한다.
본 개시내용은 본원에 개시된 다양한 다중접합체 중 어느 하나의 유효량의 투여를 포함하는 의학적 치료 또는 예방이 필요한 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 세포에서 하나 이상의 표적 유전자의 활성을 조절하는 방법으로서, 본원에 개시된 다양한 다중접합체 중 어느 하나를 세포에 도입하는 단계, 및 다중접합체가 세포에 진입하고, 표적 유전자 또는 유전자들의 활성이 조절되는 조건하에 세포를 유지하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 세포에서 다중접합체의 활성을 관찰하는 방법으로서, 본원에 개시된 다양한 다중접합체 중 어느 하나를 세포에 도입하는 단계, 및 다중접합체가 세포에 진입하고, 다중접합체의 활성이 관찰되는 조건하에 세포를 유지하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
이들 및 다른 실시양태는 아래에서 더 자세히 설명된다.
본 개시내용이 많은 다른 형태의 실시양태를 포함하지만, 본 개시내용은 기술의 원리의 예시로서 간주되어야 하고 본 개시내용을 예시된 실시양태에 제한하려는 의도는 아니라는 이해와 함께 몇몇 구체적인 실시양태가 본원에 상세히 설명될 것이다.
상세한 설명
본원에 언급된 모든 특허, 특허 출원, 및 간행물에 대한 개시내용은 본원에 기재되고 청구된 개시일 현재 당업자에게 공지된 최신 기술을 보다 완전하게 설명하기 위해 그 전체가 본 출원에 참고로 포함된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "약"이라는 용어는 대략의 보통의 통상적인 의미에 따라 사용된다. 예를 들어, "약 X"는 X의 값에 대한 측정 오차 내에 있는 유사한 양, 또는 X와 거의 동일하고 본질적으로 X와 동일한 성질을 갖는 양을 포함하여, 언급된 바와 같은 대략적인 값 X를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "단리된"은 다른 원하지 않는 물질로부터 분리된 화합물을 포함한다. 단리된 화합물은 실질적으로 순수한 상태로 합성될 수 있거나 조 반응 혼합물의 다른 성분의 잔류량을 포함하여 일정량의 불순물이 남아 있을 수 있는 것을 제외하고 조 반응 혼합물의 다른 성분으로부터 분리될 수 있다. 유사하게, "순수한" 또는 "실질적으로 순수한"은 의도된 용도(예를 들어, 약학 제제에서 또는 후속 화학 반응을 위한 물질로서)를 허용하기에 불순물이 충분히 없음을 의미한다. X% 순수는 예를 들어 HPLC와 같은 분석 방법에 의할 수 있는 관련 측정에 의해 화합물이 전체 조성의 X%라는 것을 의미한다.
생물학적 모이어티
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "생물학적 모이어티"는 당업자에 의해 이해되는 바와 같은 통상적인 의미를 갖는다. 이는 세포나 유기체로 전달될 때 생물학적으로 활성이거나 비활성인 화학 물질을 의미한다.
많은 경우에, 생물학적 모이어티는 그가 전달되는 세포 또는 유기체 내에서 생물학적 효과 또는 활성을 생성할 것이며, 종종 생물학적 효과 또는 활성이 검출 가능하거나 측정 가능하다. 다른 예에서, 생물학적 모이어티는 그가 전달되는 또 다른 생물학적 모이어티의 생물학적 효과 또는 활성을 증가시키거나 향상시키기 위해 선택될 수 있다. 또 다른 경우에, 생물학적 모이어티는 합성 중간체 또는 다중접합체를 합성하는 방법(하기 기재되는 바와 같음)에서 사용하기 위해 선택될 수 있다.
생물학적 모이어티의 예는 핵산, 아미노산, 펩티드, 단백질, 지질, 탄수화물, 카르복실산, 비타민, 스테로이드, 리그닌, 소분자, 유기금속 화합물, 또는 전술한 어느 하나의 유도체를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
본 개시내용의 일부 측면에서, 생물학적 모이어티는 핵산 외의 모이어티("비핵산 생물학적 모이어티")이다. 비핵산 생물학적 모이어티에는 아미노산, 펩티드, 단백질, 지질, 탄수화물, 카르복실산, 비타민, 스테로이드, 리그닌, 소분자(예를 들어, 소분자 치료 또는 약물 분자), 유기금속 화합물, 또는 전술한 어느 하나의 유도체가 포함된다.
본 개시내용의 일부 측면에서, 생물학적 모이어티는 세포 표면 수용체에 특이적인 리간드와 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 세포- 또는 조직-표적화 모이어티를 포함할 수 있다. 세포- 또는 조직-표적화 모이어티의 예는 인지질과 같은 친유성 모이어티; 앱타머(DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체); 항원 결합 펩티드 또는 단백질과 같은 펩티드 및 단백질; 소분자; 토코페롤 및 엽산과 같은 비타민; 기타 엽산 수용체 결합 리간드; N-아세틸갈락토사민(GalNAc) 및 만노스와 같은 탄수화물; 다른 만노스 수용체 결합 리간드; 콜레스테롤; 2-[3-(1,3-디카르복시프로필)-우레이도]펜탄디온산(DUPA)과 같은 카르복실산; 및 아니스아미드와 같은 벤즈아미드의 유도체를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
세포- 또는 조직-표적화 친유성 모이어티는 양이온성 기를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 일부 측면에서, 친유성 모이어티는 콜레스테롤, 비타민 E, 비타민 K, 비타민 A, 엽산, 또는 양이온성 염료(예를 들어, Cy3)를 포함한다. 기타 친유성 모이어티는 콜산, 아다만탄 아세트산, 1-피렌 부티르산, 디히드로테스토스테론, 1,3-비스-O(헥사데실)글리세롤, 게라닐옥시헥실기, 헥사데실글리세롤, 보르네올, 멘톨, 1,3-프로판디올, 헵타데실기, 팔미트산, 미리스트산, O3-(올레오일)리토콜산, O3-(올레오일)콜렌산, 디메톡시트리틸 또는 페녹사진을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
항원 결합 단백질의 예는 단클론 항체, 단쇄 가변 단편(ScFv) 또는 VHH 항원 결합 단백질을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
GalNAc 기반 생물학적 모이어티의 예는 모노-안테나 GalNAc, 디-안테나 GalNAc 및 트리-안테나 GalNAc를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
일부 또는 전부가 세포- 또는 조직-표적화 특성을 가질 수 있는 다른 생물학적 모이어티에는 콜레스테롤과 같은 지방산; 리토콜산(LCA); 에이코사펜타엔산(EPA); 도코사헥사엔산(DHA); 도코산산(DCA); 스테로이드; 세코스테로이드; 지질; 강글리오시드; 뉴클레오시드 유사체; 엔도칸나비노이드; 콜린, 비타민 A, 비타민 E, 레티노산 및 토코페릴과 같은 비타민; 및 전술한 어느 하나의 유도체가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
일부 또는 전부가 세포- 또는 조직-표적 특성을 가질 수 있는 다른 펩티드 기반 생물학적 모이어티는 APRPG, cNGR(CNGRCVSGCAGRC), F3(KDEPQRRSARLSAKPAPPKPEPKPKKAPAKK), CGKRK, 및/또는 iRGD(CRGDKGPDC)를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 본 개시내용의 범위 내의 다른 펩티드는 다음을 포함한다:
(a) 인간 테나신 C 단백질에서 유도되고 높은 선택성과 친화력으로 표적에 결합하도록 조작된 작은 단일 도메인 단백질인 센티린(Klein et al., Centyrin ligands for extrahepatic delivery of siRNA, Molecular Therapy Vol. 29 No 6 (June 2021) 및 Mahalingam et al., Evaluation of a Centyrin-Based Near-Infrared Probe for Fluorescence-Guided Surgery of Epidermal Growth Factor Receptor Positive Tumors, Bioconjugate Chem. 2017, 28, 11, 2865-2873 (September 25, 2017) 참조)(이들 각각은 그 전문이 본원에 참고로 포함됨);
(b) 문헌[Cary et al., Constrained Peptides in Drug Discovery and Development, J. Synth. Org. Chem., Jpn, xxx, Vol. 75 No. 11 (2017)(본원에 rm 전문이 참고로 포함됨)]에 기재된 바와 같은 거대 환형 및 스테이플 펩티드를 포함하는 속박된 펩티드; 및
(c) 문헌[Wyatt et al., Peptides of pHLIP family for targeted intracellular and extracellular delivery of cargo molecules to tumors, PNAS, vol. 115, no. 12, E2811-E2818 (2018)(본원에 그 전문이 참고로 포함됨)]에 기재된 바와 같이 세포의 표면에서 산도를 표적화하는 pH(저) 삽입 펩티드(pHLIP).
다양한 측면에서, 본 개시내용은 세포 핵에 연결되거나 통합되는 물질의 유입을 용이하게 하기 위해 핵 국소화 신호 또는 서열(NLS: nuclear localization signal or sequence)의 사용 및 통합을 제공한다. NLS는 일반적으로 아미노산 서열이며, 그 예는 약물 전달 분야에서 작용하는 것들로 알려져 있다.
본 개시내용의 일부 측면에서, 생물학적 모이어티는 엔도솜 탈출 모이어티(endosomal escape moiety)를 포함할 수 있으며, 이는 그가 함께 전달되는 다른 생물학적 활성 모이어티가 엔도솜 막을 파괴하는 것을 돕거나 가능하게 하거나 그렇지 않으면 세포내 전달 시 생물학적 모이어티가 내재화된(예컨대 엔도시토시스에 의해) 엔도솜 또는 다른 소기관을 탈출하도록 선택된다. 엔도솜 탈출 모이어티는 종종 지질 기반 또는 아미노산 기반이지만, 엔도솜을 파괴하여 화물을 방출하는 다른 화학 물질을 포함할 수 있다. EEM의 예에는 소수성 아미노산 R 기를 포함하는 모티프가 있는 단백질 및 펩티드, 클로로퀸, 및 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA2)이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 추가 EEM은 문헌[Lonn et al., Scientific Reports, 6: 32301, 2016]에 기재되어 있다.
세포- 및 조직-표적화 모이어티 및 EEM의 다른 예는 아래의 전달 구축물 및 제제라는 제목의 섹션에서 제공된다.
본 개시내용의 일부 측면에서, 생물학적 모이어티는 면역억제제 또는 면역자극제와 같은 면역조절제를 포함할 수 있다.
본 개시내용의 범위 내의 추가적인 생물학적 모이어티는 예를 들어 CRISPR/Cas 시스템, TALES, TALEN, 및 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN)에 관여하는 올리고뉴클레오티드, 폴리펩티드, 및 단백질과 같은 물질을 포함하는 임의의 공지된 유전자 편집 물질이다.
추가로, 본 개시내용의 범위 내의 생물학적 모이어티는 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "검출 가능한 표지"는 당업자가 이해하는 바와 같은 통상적인 의미를 갖는다. 형광 분광법과 같은 이미징 기술로 검출 가능한 다중 접합체의 치환기인 화학 기를 지칭한다. 예를 들어, 검출 가능한 표지는 에너지 흡수 후 정해진 파장에서 방사선을 방출하는 형광단을 포함하는 염료일 수 있다. 많은 적합한 형광 표지 또는 염료가 알려져 있다. 예를 들어 문헌[Welch et al. Chem. Eur. J. 5(3):951-960, 1999]은 단실 작용화된 형광 모이어티를 개시하고 문헌[Zhu et al. Cytometry 28:206-211, 1997]은 형광 표지 Cy3 및 Cy5의 사용을 기재한다. 다른 표지는 문헌[Prober et al. (Science 238:336-341, 1987); Connell et al. (BioTechniques 5(4):342-384, 1987), Ansorge et al. (Nucl. Acids Res. 15(11):4593-4602, 1987) 및 Smith et al. (Nature 321:674, 1986)]에 기재되어 있다. 시판되는 형광 표지의 예는 플루오레세인, 로다민(예컨대 TMR, 텍사스 레드 또는 Rox), 알렉사, 보디피, 아크리딘, 쿠마린, 피렌, 벤즈안트라센 및 시아닌(예컨대, Cy2 또는 Cy4)을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 검출 가능한 표지의 다른 형태는 양자점(Empodocles, et al., Nature 399:126-130, 1999), 금 나노입자(Reichert et al., Anal. Chem. 72:6025-6029, 2000), 마이크로비드(Lacoste et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 97(17):9461-9466, 2000)를 포함하는 미세입자, 및 질량 분석법에 의해 검출 가능한 태그를 포함한다. 검출 가능한 표지는 비오틴-스트렙타비딘 시스템과 같은 검출을 위한 다른 화합물과의 상호작용에 의존하는 다성분 표지일 수 있다.
본 개시내용의 많은 측면에서, 생물학적 모이어티는 RNA, DNA, 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는 올리고뉴클레오티드, 또는 인공 또는 비-천연 핵산 유사체를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥이다. 다양한 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 이중 가닥이다(예를 들어, 역평행 이중 가닥).
다양한 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 RNA, 예를 들어 안티센스 RNA(aRNA), CRISPR RNA(crRNA), 긴 비코딩 RNA(lncRNA), 마이크로RNA(miRNA), 피위-상호작용 RNA(piRNA), 작은 간섭 RNA(siRNA), 메신저 RNA(mRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 작은 활성화 RNA(saRNA), 또는 리보자임이다.
다양한 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA 앱타머이다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 CRISPR 가이드 RNA, 또는 생체 내, 시험관 내, 또는 생체 외에서 Cas 뉴클레아제와 리보핵복합체(RNP)를 형성하는 것과 연관되거나 이에 필수적인 기타 RNA, 또는 예를 들어 야생형 Cas 뉴클레아제, 또는 야생형 Cas의 임의의 공지된 변형, 예컨대 닉카아제 및 데드 Cas(dCas)를 포함하는 Cas 뉴클레아제와 게놈 편집 또는 조작 기능을 수행하는 것과 관련되거나 이에 필수적인 기타 RNA이다. CRISPR-Cas 시스템은 예를 들어 미국 특허 제8,771,945호; Jinek et al., Science, 337(6096): 816-821 (2012), 및 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2013/17677에 기재되어 있다.
다양한 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 15-30, 17-27, 19-26, 20-25, 40-50, 40-150, 100-300, 1000-2000, 또는 최대 10000개 뉴틀레오티드 길이이다.
다양한 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 이중 가닥이고 상보적이다. 상보성은 100% 상보적이거나 올리고뉴클레오티드가 100% 미만 상보적이더라도 관련 조건(예를 들어, 생리학적 관련 조건) 하에서 혼성화되고 이중 가닥으로 남아 있는 경우 100% 미만 상보적일 수 있다. 예를 들어, 이중 가닥 올리고뉴클레오티드는 적어도 약 80%, 85%, 90%, 또는 95% 상보적일 수 있다. 일부 실시양태에서, 이중 가닥 올리고뉴클레오티드는 평활 말단(대칭 올리고뉴클레오티드)이다. 일부 실시양태에서, 이중 가닥 올리고뉴클레오티드는 한 가닥에 말단 돌출부(예를 들어, 2-5개의 돌출 뉴클레오티드) 또는 이의 각 가닥에 말단 돌출부(각각의 경우, 비대칭 올리고뉴클레오티드)를 갖는다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 DNA, 예를 들어 안티센스 DNA(aDNA)(예를 들어, 안타고미르) 또는 안티센스 갭머이다. 갭머 및 멀티머를 포함하는 aDNA의 예는 예를 들어 문헌[Subramanian et al., Nucleic Acids Res, 43(19): 9123-9132 (2015)] 및 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2013/040429에 기재되어 있다. 안타고미르의 예는 예를 들어 미국 특허 제7,232,806호에 기재되어 있다.
다양한 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 올리고뉴클레오티드는 화학적 변형을 추가로 포함한다. 화학적 변형은 변형된 뉴클레오시드, 변형된 백본, 변형된 당, 및/또는 변형된 말단을 포함할 수 있다.
변형은 포스포로티오에이트, 거울상이성질체 풍부 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 메틸 및 기타 알킬 포스포네이트(3'알킬렌 포스포네이트 포함) 및 거울상이성질체 풍부 포스포네이트, 포스피네이트, 포스포르아미데이트(3'-아미노 포스포르아미데이트 및 아미노알킬포스포르아미데이트 포함), 티오노포스포르아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 및 정상적인 3'-5' 연결을 갖는 보라노포스페이트, 이들의 2'-5' 연결된 유사체, 및 뉴클레오시드 단위의 인접한 쌍이 3'-5'에서 5'-3'로 또는 2'-5'에서 5'-2'로 연결되는 역 극성을 갖는 것들을 포함하지만 이에 제한되지 않는 인 함유 결합을 포함할 수 있다.
다양한 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 포스포로티오에이트 기를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 5' 말단에 1 내지 3개의 포스포로티오에이트 기를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 3' 말단에 1 내지 3개의 포스포로티오에이트 기를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 5' 말단 및 3' 말단에서 1 내지 3개의 포스포로티오에이트 기를 포함할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 다중접합체에 함유된 각각의 올리고뉴클레오티드는 1-10개의 총 포스포로티오에이트 기를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 각각의 올리고뉴클레오티드는 10개 미만, 9개 미만, 8개 미만, 7개 미만, 6개 미만, 5개 미만, 4개 미만, 또는 3개 미만의 총 포스포로티오에이트 기를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 다중접합체에 함유된 올리고뉴클레오티드는 더 많은 포스포로티오에이트 기를 갖는 단량체 형태의 동일한 올리고뉴클레오티드에 비해 더 적은 포스포로티오에이트 기로 증가된 생체 내 활성을 가질 수 있다.
올리고뉴클레오티드는 예를 들어 시험관 내 및 생체 내에서 개선된 효능 및 안정성을 포함하는 다양한 효과를 생성하기 위해 당업계에 공지된 다양한 전략을 사용하여 변형될 수 있다. 이러한 전략 중에는 인공 핵산, 예를 들어 2'-O-메틸-치환된 RNA; 2'-플루오로-2'데옥시 RNA, 펩티드 핵산(PNA); 모르폴리노; 잠금 핵산(LNA); 잠금해제 핵산(UNA); 가교 핵산(BNA); 글리콜 핵산(GNA); 및 트레오스 핵산(TNA); 또는 보다 일반적으로, 핵산 유사체, 예를 들어 자연 발생 RNA 및 DNA와 구조적으로 유사하지만 자연 발생 분자의 인산염 백본, 당 또는 핵염기 부분 중 하나 이상에서 변경된 이환식 및 삼환식 뉴클레오시드 유사체가 있다. 전형적으로, 유사체 핵염기는 무엇보다도 서로 다른 염기 쌍 형성 및 염기 스태킹 특성을 부여한다. 예에는 4개의 모든 표준 염기와 쌍을 이룰 수 있는 범용 염기가 포함된다. 인산염-당 백본 유사체의 예는 PNA를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 모르폴리노 기반 올리고머 화합물은 문헌[Braasch et al., Biochemistry, 41(14): 4503-4510 (2002)] 및 미국 특허 제5,539,082호; 제5,714,331호; 제5,719,262호; 및 제5,034,506호에 기재되어 있다.
본원에 기재된 제조 방법에서, 일부 올리고뉴클레오티드는 화학 작용기로 치환에 의해 말단에서 변형된다. 치환은 올리고뉴클레오티드의 3' 또는 5' 말단에서 수행될 수 있으며, 단량체의 센스 및 안티센스 가닥 모두의 3' 말단에서 수행될 수 있으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다. 화학적 작용기는 예를 들어 설프히드릴기(-SH), 카르복실기(-COOH), 아민기(-NH2), 히드록시기(-OH), 포르밀기(-CHO), 카르보닐기(-CO-), 에테르기(-O-), 에스테르기(-COO-), 니트로기(-NO2), 아지드기(-N3), 또는 술폰산기(-SO3H)를 포함할 수 있다.
올리고뉴클레오티드는 추가로 또는 대안적으로 핵염기(당 업계에서 단순히 "염기"라고 함) 변형 또는 치환을 포함하도록 변형될 수 있다. 변형된 핵염기는 천연 핵산에서 드물게 또는 일시적으로만 발견되는 핵염기, 예를 들어 하이포크산틴, 6-메틸아데닌, 5-Me 피리미딘, 5-메틸시토신(5-메틸-2' 데옥시시토신으로도 지칭되고 당업계에서 종종 5-Me-C으로 지칭됨), 5-히드록시메틸시토신(HMC), 글리코실 HMC 및 겐토비오실 HMC, 및 합성 핵염기, 예를 들어 2-아미노아데닌, 2-(메틸아미노)아데닌, 2-(이미다졸릴알킬)아데닌, 2-(아미노알킬아미노)아데닌 또는 다른 헤테로치환된 알킬아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 5-브로모우라실, 5-히드록시메틸우라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌, N6(6-아미노헥실)아데닌, 및 2,6-디아미노퓨린을 포함한다[Kornberg, A., DNA Replication, W. H. Freeman & Co., San Francisco, pp 75-77 (1980); Gebeyehu et al., Nucl. Acids Res, 15: 4513 (1997)]. 당업계에 공지된 "범용" 염기, 예를 들어 이노신 또는 슈도우리딘이 또한 포함될 수 있다. 5-Me-C 치환은 핵산 이중체 안정성을 0.6-1.2℃ 증가시킬 수 있고[(Sanghvi, Y. S., in Crooke, S. T. and Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, pp 276-278 (1993)] 염기 치환의 측면이다. 변형된 핵염기는 다른 합성 및 천연 핵염기, 예컨대 5-메틸시토신(5-me-C), 5-히드록시메틸 시토신, 크산틴, 하이포크산틴, 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-메틸 및 기타 알킬 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 기타 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-할로우라실 및 시토신, 5-프로피닐 우라실 및 시토신, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실(슈도 우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-히드록실 및 기타 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-브로모와 같은 5-할로, 5-트리플루오로메틸 및 기타 5-치환된 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌, 및 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌을 포함할 수 있다. 핵산 말단의 히드록시 기(―OH)는 설프히드릴기(-SH), 카르복실기(-COOH), 아민기(-NH2)와 같은 작용기로 치환될 수 있다. 치환은 3' 말단 또는 5' 말단에서 수행될 수 있다.
생물학적 모이어티의 추가 예는 WO2016/205410, WO2018/145086, 및 WO 2020/180897에 기재되어 있으며, 이들 각각은 본원에 참고로 포함된다.
다중접합체
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "다중접합체"는 당업자에 의해 이해되는 바와 같은 통상적인 의미를 갖는다. 이는 공유 링커에 의해 서로 연결된 2개 이상의 치환기를 포함하는 화합물을 지칭하며, 여기서 각각의 치환기는 독립적으로 생물학적 모이어티이다.
다중 접합체의 예는 소분자(예를 들어, 비오틴) 접합 단백질, 단백질-단백질 접합체(예를 들어, 효소에 커플링된 항체), 일반적으로 항체 약물 접합체(ADC)로 알려진 접합체(예를 들어, 세포독성 소분자에 접합된 단클론 항체), 방사성 면역접합체(예를 들어, 킬레이트제에 접합된 단클론 항체), 백신(예를 들어, 담체 단백질에 접합된 합텐), 나노입자 및 비세포독성 약물(예를 들어, 펩티드)에 접합된 항체, 원소 또는 이의 유도체에 접합된 생체분자(예를 들어, 산화철 나노입자에 접합된 TGF-β), 및 본원에 기재된 바와 같은 기타를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
공유 링커
본 개시내용의 다양한 측면 및 실시양태에서, 다중 생물학적 모이어티는 공유적으로 연결되어 다중접합체를 형성한다. 개시내용 및 청구범위 전체에 걸쳐 달리 명시되지 않는 한, "●"를 포함하지만 이에 제한되지 않는 모든 표시에서 공유 링커는 임의로 □-●-□, ●-□에서와 같이 공유 결합의 한쪽 또는 양쪽에 스페이서 기 □를 포함할 수 있다.
공유 링커는 절단 가능하거나 절단 불가능할 수 있다. 절단 가능한 링커는 생물학적 모이어티의 기능적 전달을 용이하게 하기 위해 투여 시, 전달 시 절단하는 동안, 또는 세포내 조건하에서 안정성을 유지하도록 선택되거나 설계될 수 있다. 본원에 제공된 공유 링커의 예 이외에, 당업자는 그의 조성, 합성 및 용도를 포함하여 매우 다양한 공유 링커가 당업계에 공지되어 있고 본 개시내용과 일치하는 용도로 조정될 수 있음을 인지할 것이다.
뉴클레오티드 링커는 예를 들어 우리딘-우리딘-우리딘(UUU), 엔도뉴클레아제 절단 가능한 링커 dCdA, 및 dTdTdTdT와 같은 핵산 서열을 포함하는 공유 링커 부류의 한 예이다. 뉴클레오티드 링커는 서열이 다른 지정된 기능을 전혀 수행하지 않도록 선택된 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함한다. 본 개시내용의 다양한 측면에서, 공유 링커는 2-6개 뉴클레오티드 길이인 뉴클레오티드 링커를 포함할 수 있다.
본 개시내용의 다양한 측면에서, 공유 링커는 친핵성 및 친전자성 기의 반응 생성물을 포함한다. 예를 들어, 공유 링커는 티올과 말레이미드, 티올과 비닐설폰, 티올과 피리딜디설피드, 티올과 요오도아세트아미드, 티올과 아크릴레이트, 아지드와 알킨, 또는 아민과 카르복실기의 반응 생성물을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 이들 기 중 하나는 예를 들어 다중접합체의 치환기에 연결되고(예를 들어, 치환기 상의 티올(-SH) 작용화) 다른 기는 궁극적으로 2개의 올리고뉴클레오티드를 연결하는 제2 분자(예를 들어, 연결제) 상에 존재한다(예를 들어, DTME에서 말레이미드).
티올과 말레이미드의 반응 생성물을 포함하는 공유 링커는 DTME(디티오비스말레이미도에탄), BM(PEG)2(1,8-비스(말레이미도)디에틸렌 글리콜), BM(PEG)3(1,11-비스말레이미도-트리에틸렌글리콜), BMOE(비스말레이미도에탄), BMH(비스말레이미도헥산), 또는 BMB(1,4-비스말레이미도부탄)을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. DTME는 시토졸의 환원제 환경에서 세포 내에서 절단 가능한 내부 이황화물을 함유하고 있다는 점에서 유리하다.
본 개시내용의 다양한 예 및 측면에서, 공유 링커는 2가이며, 이는 생물학적 모이어티와의 반응을 위한 2개의 부위를 갖는다는 것을 의미한다. "동종 2가" 공유 링커는 2개의 반응성 부위가 동일한 링커를 의미한다(예를 들어, 디티오-비스-말레이미도에탄[DTME]에서 2개의 말레이미드). 당업자는 다양한 동종 2가 공유 링커가 본 개시내용과 일치하는 용도로 조정될 수 있음을 인지할 것이다.
기타 절단 가능한 동종 2가 공유 링커는 구조 11을 포함하는 화합물을 포함하지만 이에 제한되지는 않으며:
X-R-[p(Np)a-Rp(Np)b-Rp(Np)c-Rp(Np)d]-R-X (구조 11)
여기서 각각의 X는 독립적으로 작용기이고; 각 R은 독립적으로 스페이서 기이거나 존재하지 않으며; 각 p는 독립적으로 인산의 유도체이거나 존재하지 않되, 단 구조 11은 적어도 하나의 p를 포함하고; 각 N은 독립적으로 뉴클레오시드이거나 존재하지 않으며; a, b, c 및 d 각각은 독립적으로 0에서 4까지 범위의 정수이며, 단 a+b+c+d의 합은 1 이상이어야 한다. 한 실시양태에서, 구조 11은 적어도 하나의 뉴클레오시드 N을 함유해야 한다. 한 실시양태에서, a+b+c+d의 합은 2 이상이어야 한다.
다른 절단가능한 동종 2가 공유 링커는 양 말단에 동일한 작용기를 포함하는 화합물을 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 여기서 상기 작용기는 적어도 하나의 아미드 결합을 포함하는 공유 링커에 의해 연결된다. 한 실시양태에서, 화합물은 구조 12를 포함한다:
(X---)-
Figure pct00006
-(---X) 구조 12
여기서,
(X---) 및 (---X)는 스페이서 기, --에 연결된 작용기 X를 나타내고;
Figure pct00007
는 적어도 하나의 아미드 결합을 포함하는 화합물의 부분이다.
예를 들어, 한 실시양태는 양 말단에 동일한 작용기를 포함하는 동종 2가 링커 화합물을 제공하며, 여기서 상기 작용기는 적어도 하나의 아미드 결합을 포함하는 공유 링커에 의해 연결되고, 여기서 화합물은 구조 12a를 포함한다:
(X---)[R-Aa-Bb-Cc-Dd-R'](---X) 구조 12a
여기서,
(X---) 및 (---X)는 스페이서 기, ---에 연결된 작용기 X를 나타내고;
R은 H이거나 존재하지 않는다;
R'은 OH이거나 존재하지 않고;
a, b, c, 및 d 각각은 독립적으로 0 또는 1이며, 단 a + b + c + d의 합은 2 이상이고;
A, B, C 및 D 각각은 독립적으로 구조 12b를 포함한다:
Figure pct00008
(구조 12b)
여기서,
w, x, y, 및 z 각각은 독립적으로 0 또는 1이며, 단 w + x + y + z의 합은 1 이상이고;
각 ▲는 독립적으로 H, H2, 알킬, 알콕시, 알킬 카르복시, 알킬 카르복사미드, 알킬 아미노, 알킬 설페이트, 아릴, 아릴 카르복시, 아릴 카르복사미드, 아릴 아미노, 아릴 설페이트이거나 존재하지 않고;
Figure pct00009
,
Figure pct00010
,
Figure pct00011
,
Figure pct00012
, 및
Figure pct00013
각각은 독립적으로 존재하거나 존재하지 않고, 존재하는 경우 다음과 같은 시클릭 기의 말단을 나타낸다:
Figure pct00014
는 말단으로서
Figure pct00015
에서 N을 나타내고;
Figure pct00016
는 말단으로서
Figure pct00017
에서 C를 나타내고;
Figure pct00018
는 말단으로서
Figure pct00019
에서 C를 나타내고;
Figure pct00020
는 말단으로서
Figure pct00021
에서 C를 나타내고;
Figure pct00022
는 말단으로서
Figure pct00023
에서 C를 나타내고;
단, 각 구조 12b는 독립적으로 0, 1, 또는 2개의 시클릭 기를 함유하고 각 시클릭 기의 말단은 다음으로부터 선택되고:
제1 말단으로
Figure pct00024
및 제2 말단으로
Figure pct00025
,
Figure pct00026
,
Figure pct00027
, 또는
Figure pct00028
;
제1 말단으로
Figure pct00029
및 제2 말단으로
Figure pct00030
,
Figure pct00031
, 또는
Figure pct00032
;
제1 말단으로
Figure pct00033
및 제2 말단으로
Figure pct00034
또는
Figure pct00035
; 또는
제1 말단으로
Figure pct00036
및 제2 말단으로서
Figure pct00037
;
단,
Figure pct00038
가 존재하면, ◐는 존재하지 않고;
Figure pct00039
가 존재하면, ◑는 존재하지 않고;
Figure pct00040
가 존재하면,
Figure pct00041
는 존재하지 않고;
Figure pct00042
가 존재하면,
Figure pct00043
는 존재하지 않고;
구조 12b에 존재하는 각 시클릭 기는 각각의 말단 이외에 말단 사이에 중간 부분, Y를 추가로 포함하고; 각 Y는 독립적으로 알킬, 알콕시, 알킬 카르복시, 알킬 카르복사미드, 알킬 아미노, 또는 알킬 설페이트이고;
◐, ◑,
Figure pct00044
, 및
Figure pct00045
각각은 독립적으로 존재하거나 존재하지 않고, 존재하는 경우 H, OH, 알킬, 알킬 카르복시, 알킬 카르복사미드, 알킬 아미노, 알콕시, 티오알킬, 알킬티오알킬, 아릴, 또는 헤테로아릴이고;
◐, ◑,
Figure pct00046
, 및
Figure pct00047
각각은 존재하는 경우, 임의로 스페이서 기, ---에 연결된 작용기, X를 나타내는 (---X)에 결합되고;
각 ▼는 독립적으로 OH, 알킬, 알콕시, 알킬 카르복시, 알킬 카르복사미드, 알킬 아미노, 알킬 설페이트, 아릴, 아릴 카르복시, 아릴 카르복사미드, 아릴 아미노, 아릴 설페이트이거나, 존재하지 않고;
단, 생성된 구조 12a는 동종 2가 링커 화합물인 화합물을 유지하면서 스페이서 기 ---를 통해 화합물에 연결된 2개의 작용기 X만을 포함한다.
본 개시내용의 다양한 측면에서, 공유 링커는 이황화 결합 또는 구조 13의 화합물을 포함할 수 있다:
Figure pct00048
여기서 S는 공유 결합 또는 링커에 의해 치환기에 부착되고; 각 R1은 독립적으로 C2-C10 알킬, C2-C10 알콕시, C1-C10 아릴 기이고; R2는 티오프로피오네이트 또는 디설피드 기이고; 각 X는 독립적으로 다음으로부터 선택된다:
Figure pct00049
후자의 구조는 숙신남산의 유도체의 2개의 "개환" 위치 이성질체를 나타낸다.
특정 실시양태에서, 구조 13의 화합물은
Figure pct00050
이며, 여기서 S는 공유 결합 또는 링커에 의해 치환기에 부착된다.
특정 실시양태에서, 구조 13의 화합물은
Figure pct00051
이며, 여기서 양쪽 고리는 개방되어 있고(도시된 바와 같이, 다양한 위치 이성질체를 나타냄), 여기서 각각의 S는 각각의 개환 구조상의 알파 탄소 원자 중 하나에 결합되고, S는 공유 결합 또는 링커에 의해 치환기에 부착된다.
특정 실시양태에서, 구조 13의 화합물은
Figure pct00052
이며, 여기서 하나의 고리가 개방되고(도시된 바와 같이, 둘 모두 위치 이성질체를 나타냄), 여기서 S는 각각의 개환 구조상의 알파 탄소 원자 중 하나에 결합되고, S는 공유 결합에 의해 또는 링커에 의해 치환기에 부착된다.
다양한 실시양태에서, 구조 13의 공유 링커는 구조 14의 공유 결합 전구체로부터 형성되고:
Figure pct00053
여기서 각 R1은 독립적으로 C2-C10 알킬, C2-C10 알콕시, 또는 C1-C10 아릴기이고; R2는 티오프로피오네이트 또는 디설피드 기이다.
본 개시내용의 다양한 측면에서, 다중접합체 내의 2개 이상의 링커는 예를 들어 생체 절단 가능한 결합을 포함하는 직교 유형의 결합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 2개의 직교 생체 절단 가능한 결합은 한편으로는 핵산 또는 올리고펩티드 링커를 포함할 수 있고, 다른 한편으로는 친핵체와 친전자체(예를 들어, 티올과 말레이미드)의 반응 생성물을 포함하는 링커를 포함할 수 있다.
본 개시내용의 다양한 측면에서, 공유 링커는 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리비닐피롤리돈 및 폴리옥사졸린과 같은 비이온성 친수성 중합체, 또는 PLGA 및 PLA와 같은 소수성 중합체를 포함할 수 있다.
공유 결합을 위한 매개체로서 사용되는 중합체 연결제는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 플루로닉, 폴리비닐피롤리돈, 폴리옥사졸린, 또는 이들의 공중합체를 포함하는 비이온성 친수성 중합체; 또는 폴리-L-락트산, 폴리-D-락트산, 폴리-D,L-락트산, 폴리-글리콜산, 폴리-D-락트산-코-글리콜산, 폴리-L-락트산-코-글리콜산, 폴리-D,L-락트산-코-글리콜산, 폴리카프로락톤, 폴리발레로락톤, 폴리히드록시부티레이트, 폴리히드록시발레레이트, 또는 이들의 공중합체를 포함하는 하나 이상의 생체 절단 가능한 폴리에스테르 중합체를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
연결제는 약 100 내지 10,000 달톤의 분자량을 가질 수 있다. 이러한 연결제의 예는 디티오-비스-말레이미도에탄(DTME), 1,8-비스-말레이미도디에틸렌글리콜(BM(PEG)2), 트리스-(2-말레이미도에틸)-아민(TMEA), 트리-숙신이미딜 아미노트리아세테이트(TSAT), 3-arm-폴리(에틸렌 글리콜)(3-arm PEG), 말레이미드, N-히드록시숙신이미드(NHS), 비닐설폰, 요오도아세틸, 니트로페닐 아지드, 이소시아네이트, 피리딜디설피드, 히드라지드, 및 히드록시페닐 아지드를 포함한다.
절단 가능한 결합 또는 절단 불가능한 결합을 포함하는 연결제가 본원에서 사용될 수 있고, 실제로 일부 경우에 동일한 다중접합체에서 함께 사용될 수 있다. 절단 불가능한 결합을 포함하는 연결제는 아미드 결합 또는 우레탄 결합을 포함하는 것을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 절단 가능한 결합을 포함하는 연결제는 산 절단 가능한 결합(예를 들어, 에스테르, 히드라존, 또는 아세탈의 공유 결합), 환원제 절단 가능한 결합(예를 들어, 디설피드 결합), 생체 절단 가능한 결합, 또는 효소 절단 가능한 결합(예를 들어, 핵산 기반 링커 또는 올리고펩티드 기반 링커)을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 경우에, 절단 가능한 공유 링커는 세포내 조건하에서 절단 가능하다. 추가로, 약물 접합에 이용 가능한 임의의 연결제는 본 발명의 전술한 측면에서 제한 없이 사용될 수 있다.
추가로, 작용기와 연결제의 조합은 다음을 포함할 수 있다: (a) 작용기가 아미노 또는 티올인 경우, 연결제는 숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트, 또는 숙신이미딜 6-([3(2-피리딜디티오)프로피오아미도]헥사노에이트일 수 있고; (b) 작용기가 아미노인 경우, 연결제는 3,3'디티오디프로피온산 디-(N-숙신이미딜 에스테르), 디티오-비스(에틸 1H-이미다졸-1-카르복실레이트), 또는 디티오-비스(에틸 1H-이미다졸-1-카르복실레이트)일 수 있고; (c) 작용기가 아미노 또는 알킨인 경우, 연결제는 설포-N-숙신이미딜3-[[2-(p-아지도살리실아미도)에틸]-1,3'-디티오]프로피오네이트일 수 있고; (d) 작용기가 티올인 경우, 연결제는 디티오-비스-말레이미도에탄(DTME), 1,8-비스-말레이미도디에틸렌글리콜(BM(PEG)2), 또는 디티오비스(설포숙신이미딜 프로피오네이트)(DTSSP)일 수 있다.
본원에 제공된 합성 중간체 및 다중접합체를 제조 및 합성하는 다양한 방법에서, 작용기의 활성화를 수반하는 단계가 있을 수 있다. 작용기의 활성화에 사용될 수 있는 화합물은 1-에틸-3,3-디메틸아미노프로필 카르보디이미드, 이미다졸, N-히드록시숙신이미드, 디클로로헥실카르보디이미드, N-베타-말레이미도프로피온산, N-베타-말레이미도프로필 숙신이미드 에스테르 또는 N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
공유 링커의 추가 예 및 이들의 제조 및 사용 방법은 WO2016/205410, WO2018/145086, 및 WO 2020/180897에 기재되어 있으며, 이들 각각은 본원에 참고로 포함된다.
단일 치환된 공유 링커
본 개시내용은 한쪽 말단이 치환기 X에 의해 치환되고 다른 쪽 말단이 비치환된 채로 남아 있는 동종 2가 공유 링커("단일 치환된 공유 링커")를 포함하는 화합물(합성 중간체)에 관한 것이며, 여기서 X는 핵산 외의 생물학적 모이어티를 포함한다. 단일 치환된 공유 링커는 예를 들어, 하기 기재된 바와 같은 다양한 다중접합체를 제조하는 방법에서 합성 중간체로서 사용될 수 있다.
본원에 기재된 동종 2가 공유 링커를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 동종 2가 링커가 당업자에게 공지되어 있고 본 개시내용에 적용 가능하다.
핵산 외의 다양한 생물학적 모이어티는 당업자에게 공지되어 있고 본원에 기재된 비핵산 생물학적 모이어티를 포함하지만 이에 제한되지 않는 치환기 X로서 본 개시내용에 적용 가능하다.
본 개시내용의 한 측면에서, 화합물은 한쪽 말단이 치환기 X에 의해 치환된 동종 2가 공유 링커를 포함하고, 여기서 X는 핵산 외의 생물학적 모이어티를 포함하고, 동종 2가 링커의 다른 쪽 말단은 비치환되고, 화합물은 적어도 75% 순수하다. 본 개시내용의 일부 측면에서, 화합물은 적어도 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% 순수하다. 일부 측면에서, 화합물은 약 85% 내지 95% 순수하다. 본 개시내용의 일부 측면에서, 화합물의 제제는 75% 이상 순수; 85% 이상 순수; 95% 이상 순수할 수 있다.
본 개시내용의 또 다른 측면에서 화합물은 구조 1을 포함한다:
X - R1 - R2 - A - R3 - B (구조 1)
여기서,
X는 핵산 외의 생물학적 모이어티를 포함하는 치환기이고;
R1은 포스포디에스테르, 티오포스포디에스테르, 설페이트, 아미드, 트리아졸, 헤테로아릴, 에스테르, 에테르, 티오에테르, 디설피드, 티오프로피오네이트, 아세탈, 글리콜을 포함하는 기이거나, 존재하지 않고;
R2는 스페이서 기이거나, 존재하지 않고;
A는 제1 친핵체와 제1 친전자체의 반응 생성물을 포함하는 기이고;
R3은 C2-C10 알킬, C2-C10 알콕시, C1-C10 아릴, C2-C10 알킬디티오, 아미드, 에테르, 티오에테르, 에스테르, 올리고뉴클레오티드, 올리고펩티드, 티오프로피오네이트, 또는 디설피드를 포함하는 기고;
B는 제2 친핵체 또는 제2 친전자체를 포함하는 기이고, 여기서 제2 친핵체는 제1 친핵체와 동일하고, 제2 친전자체는 제1 친전자체와 동일하다.
화합물의 일부 실시양태에서, 스페이서 기 R2는 C2-C10 알킬, C2-C10 알콕시, 또는 C1-C10 아릴을 포함하거나, 존재하지 않는다.
화합물의 일부 실시양태에서, 기 A의 제1 친핵체 및 제1 친전자체는 (i) 티올 및 말레이미드(임의로 여기서 티올과 말레이미드의 반응 생성물은 숙신남산의 유도체임(예를 들어, 말레이미드 고리 중 하나가 개방될 때)); (ii) 티올 및 비닐설폰; (iii) 티올 및 피리딜디설피드; (iv) 티올 및 요오도아세트아미드; (v) 티올 및 아크릴레이트; (vi) 아지드 및 알킨; 또는 (vii) 아민 및 카르복실을 포함한다.
화합물의 일부 실시양태에서, A는 티올과 말레이미드의 반응 생성물을 포함하는 기이고, 임의로 여기서 티올과 말레이미드의 반응 생성물은 숙신남산의 유도체이다.
화합물의 일부 실시양태에서, R3 기는 티오프로피오네이트 또는 디설피드를 포함한다.
본 개시내용의 또 다른 측면에서, 화합물은 구조 2 또는 구조 2a(2개의 위치 이성질체를 나타냄)를 포함한다:
Figure pct00054
(구조 2)
Figure pct00055
(구조 2a)
여기서,
X는 핵산 외의 생물학적 모이어티를 포함하는 치환기이고;
R1은 포스포디에스테르, 티오포스포디에스테르, 설페이트, 아미드, 트리아졸, 헤테로아릴, 에스테르, 에테르, 티오에테르, 디설피드, 티오프로피오네이트, 아세탈, 글리콜을 포함하는 기이거나, 존재하지 않고;
R2는 스페이서 기이거나, 존재하지 않고;
S는 황이고;
N은 질소이고;
R3은 C2-C10 알킬, C2-C10 알콕시, C1-C10 아릴, C2-C10 알킬디티오, 아미드, 에테르, 티오에테르, 에스테르, 올리고뉴클레오티드, 올리고펩티드, 티오프로피오네이트, 또는 디설피드를 포함하는 기이다.
구조 2를 포함하는 화합물의 한 실시양태에서, R2 스페이서 기는 C2-C10 알킬, C2-C10 알콕시, 또는 C1-C10 아릴을 포함한다.
구조 2를 포함하는 화합물의 한 실시양태에서:
X는 펩티드 또는 단백질, 또는 이의 유도체이고;
R1 및 R2는 존재하지 않고;
R3은 디설피드를 포함하는 기이다.
구조 2를 포함하는 화합물의 한 실시양태에서:
X는 유기금속 화합물 또는 이의 유도체이고;
R1은 에스테르기이고;
R2는 C2-C10 알킬을 포함하는 스페이서 기이고;
R3은 디설피드를 포함하는 기이다.
구조 2를 포함하는 화합물의 한 실시양태에서:
X는 소분자 또는 이의 유도체, 예컨대 소분자 치료 약물이고;
R1은 에스테르기이고;
R2는 C2-C10 알킬을 포함하는 스페이서 기이고;
R3은 디설피드를 포함하는 기이다.
화합물의 한 실시양태에서, 동종 2가 공유 링커는 세포내 조건하에서 절단 가능한 링커를 포함한다.
구조 1 또는 구조 2를 포함하는 화합물의 한 실시양태에서, R3 기는 세포내 조건하에서 절단 가능한 링커를 포함한다.
화합물의 한 실시양태에서, 치환기 X는 펩티드, 단백질, 지질, 탄수화물, 카르복실산, 비타민, 스테로이드, 리그닌, 소분자, 유기금속 화합물, 또는 전술한 어느 하나의 유도체이다.
화합물의 한 실시양태에서, 치환기 X는 (a) 펩티드, 또는 펩티드의 유도체(많은 것 중 하나의 예가 HIV-1TAT 단백질의 형질도입 도메인임); (b) 항체 또는 항체 단편, 또는 이의 유도체(그 일례는 단쇄 가변 단편); (c) 탄수화물, 또는 탄수화물의 유도체; (d) 지방산, 또는 지방산의 유도체; (e) 비타민, 또는 비타민의 유도체(그 예로는 토코페롤 또는 엽산이 포함되지만 이에 제한되지 않음); (f) 콜레스테롤 또는 이의 유도체; (g) 카르복실산 또는 이의 유도체(그 일례는 (2S,2'S)-2,2'-(카르보닐디이미노)디펜탄디온산(DUPA)임); (h) 아니스아미드 또는 이의 유도체; (i) 유기금속 화합물 또는 이의 유도체(한 예는 페로센); (j) 소분자 또는 이의 유도체(한 예는 레날리도마이드)이다.
단일 치환된 공유 링커를 합성하는 방법
본 개시내용은 단일 치환된 공유 링커의 형성을 실질적으로 선호하고 치환기 X의 이량체화를 실질적으로 방지하는 반응 조건하에서 동종 2가 공유 링커를 치환기 X에 커플링시키는 단계를 포함하는 단일 치환된 공유 링커를 합성하는 방법을 제공하며, 여기서 X는 핵산이 아닌 생물학적 모이어티이다.
본 개시내용의 일부 측면에서, 상기 방법은 동종 2가 공유 링커와 반응성인 작용기를 포함하는 작용화된 치환기 X와 동종 2가 공유 링커를 반응시키는 단계를 추가로 포함한다. 이 방법의 한 실시양태에서, 작용화된 치환기 X는 구조 3을 포함하고:
X - R1 - R2 - A' (구조 3);
동종 2가 공유 링커는 구조 4를 포함하고:
A" - R3- B (구조 4);
X는 핵산 외의 생물학적 모이어티를 포함하는 치환기이고;
R1은 포스포디에스테르, 티오포스포디에스테르, 설페이트, 아미드, 트리아졸, 헤테로아릴, 에스테르, 에테르, 티오에테르, 디설피드, 티오프로피오네이트, 아세탈, 글리콜을 포함하는 기이거나, 존재하지 않고;
R2는 스페이서 기이거나, 존재하지 않고;
R3은 C2-C10 알킬, C2-C10 알콕시, C1-C10 아릴, C2-C10 알킬디티오, 아미드, 에테르, 티오에테르, 에스테르, 올리고뉴클레오티드, 올리고펩티드, 티오프로피오네이트, 또는 디설피드를 포함하는 기이고;
A' 및 A"는 함께 제1 친핵체 및 제1 친전자체를 포함하며, 이들은 함께 반응하여 A를 형성하고;
B는 제2 친핵체 또는 제2 친전자체를 포함하는 기이고, 여기서 제2 친핵체는 제1 친핵체와 동일하고, 제2 친전자체는 제1 친전자체와 동일하며;
생성된 화합물은 구조 1: X - R1 - R2 - A - R3 - B이다.
본 개시내용의 다른 측면에서, 동종 2가 공유 링커는 작용화된 R2 말단기와 반응하여 중간체를 형성하고, 이어서 중간체의 작용화된 R2 말단기는 작용화된 R2 말단기와 반응성인 작용기를 포함하는 작용화된 치환기 X와 반응하여 R1을 형성하고; 여기서, R1은 포스포디에스테르, 티오포스포디에스테르, 설페이트, 아미드, 트리아졸, 헤테로아릴, 에스테르, 에테르, 티오에테르, 디설피드, 티오프로피오네이트, 아세탈, 또는 글리콜을 포함하는 기이고; R2는 스페이서 기이다. 이 방법의 한 실시양태에서, 동종 2가 공유 링커는 구조 4를 포함하고:
A"-R3-B (구조 4)
작용화된 R2 말단기는 구조 5를 포함하고:
R1'-R2-A' (구조 5)
작용화된 치환기 X는 구조 6을 포함하고:
X-R1" (구조 6);
X는 핵산 외의 생물학적 모이어티를 포함하는 치환기이고;
R1' 및 R1"은 반응하여 R1을 형성하는 작용기이고;
R1은 포스포디에스테르, 티오포스포디에스테르, 설페이트, 아미드, 트리아졸, 헤테로아릴, 에스테르, 에테르, 티오에테르, 디설피드, 티오프로피오네이트, 아세탈, 또는 글리콜을 포함하는 기이고;
R2는 스페이서 기이고;
R3은 C2-C10 알킬, C2-C10 알콕시, C1-C10 아릴, C2-C10 알킬디티오, 아미드, 에테르, 티오에테르, 에스테르, 올리고뉴클레오티드, 올리고펩티드, 티오프로피오네이트, 또는 디설피드를 포함하는 기이고;
A' 및 A"는 함께 제1 친핵체 및 제1 친전자체를 포함하며, 이들은 반응하여 A를 형성하고;
B는 제2 친핵체 또는 제2 친전자체를 포함하는 기이고, 여기서 제2 친핵체는 제1 친핵체와 동일하고, 제2 친전자체는 제1 친전자체와 동일하며;
생성된 화합물은 구조 1: X - R1 - R2 - A - R3 - B이다.
상기 방법의 한 실시양태에서, 치환기 X와 동종 2가 공유 링커의 커플링은 화학량론적 과량의 동종 2가 공유 링커와 작용화된 치환기 X의 희석 용액에서 수행된다.
상기 방법의 한 실시양태에서, 치환기 X와 동종 2가 공유 링커의 커플링은 적어도 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 또는 100의 몰 과량의 동종 2가 공유 링커로 수행된다.
상기 방법의 한 실시양태에서, 치환기 X와 동종 2가 공유 링커의 커플링은 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 또는 100의 몰 과량의 동종 2가 공유 링커로 수행된다.
상기 방법의 한 실시양태에서, 치환기 X와 동종 2가 공유 링커의 커플링은 물 및 수혼화성 유기 공용매를 포함하는 용액에서 수행된다. 한 실시양태에서, 수혼화성 유기 공용매는 DMF, NMP, DMSO, 알코올, 또는 아세토니트릴을 포함한다. 한 실시양태에서, 수혼화성 유기 공용매는 용액의 약 10, 15, 20, 25, 30, 40, 또는 50%(v/v)를 구성한다.
상기한 합성 방법에 사용하기 위한 알코올은 C1-C10 알코올, C1-C7 알코올, 및 C1-C5 알코올을 포함하지만 이에 제한되지는 않으며, 각 경우에 아미노, 3급 아미노, 또는 설페이트와 같은 수혼화성 기로 임의로 치환된다.
상기 방법의 한 실시양태에서, 치환기 X와 동종 2가 공유 링커의 커플링은 약 7, 6, 5, 또는 4 미만의 pH에서 수행된다.
상기 방법의 한 실시양태에서, 치환기 X와 동종 2가 공유 링커의 커플링은 약 7, 6, 5, 또는 4의 pH에서 수행된다.
상기 방법의 한 실시양태에서, 치환기 X와 동종 2가 공유 링커의 커플링은 무수 유기 용매를 포함하는 용액에서 수행된다. 추가 실시양태에서, 무수 유기 용매는 디클로로메탄, DMF, DMSO, THF, 디옥산, 피리딘, 알코올, 또는 아세토니트릴을 포함한다.
상기 방법의 한 실시양태에서, 생성되는 단일 치환된 공유 링커의 수율은 적어도 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100%이다.
상기 방법의 한 실시양태에서, 생성되는 단일 치환된 공유 링커의 순도는 적어도 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100%이다. 일부 실시양태에서, 화합물은 약 85% 내지 95% 순수하다. 일부 실시양태에서, 화합물의 제제는 75% 이상 순수; 85% 이상 순수; 순도 95% 이상 순수할 수 있다.
이량체 다중접합체
본 발명은 핵산 외의 생물학적 모이어티를 포함하는 제1 치환기 X 및 X와 동일하거나 상이한 제2 치환기 Y를 포함하는 다중 접합체에 관한 것이며, 여기서 X 및 Y는 동종 2가 공유 링커에 의해 연결된다("이량체 다중접합체"). 본 개시내용은 본원에 제공된 동종 2가 공유 링커의 예를 포함하지만 이에 제한되지 않는 절단 가능한 또는 절단 불가능한 모든 유형의 동종 2가 공유 링커; 및 또한 본원에 제공된 치환기의 다양한 예를 포함하지만 이에 제한되지 않는, X의 경우 비핵산, Y의 경우 핵산 또는 비핵산인 이량체 다중접합체의 치환기로서 모든 유형의 생물학적 모이어티에 적용 가능하다.
본 개시내용의 일부 측면에서, 다중접합체는 구조 7을 포함한다:
X●Y (구조 7)
여기서,
X는 핵산 외의 생물학적 모이어티를 포함하는 제1 치환기이고;
Y는 X와 동일하거나 상이한 제2 치환기이고;
●는 X와 Y를 연결하는 공유 링커이며 구조 8을 포함한다:
- R1 - R2 - A - R3 - A - R2 - R1 - (구조 8)
여기서,
각 R1은 독립적으로 포스포디에스테르, 티오포스포디에스테르, 설페이트, 아미드, 트리아졸, 헤테로아릴, 에스테르, 에테르, 티오에테르, 디설피드, 티오프로피오네이트, 아세탈, 글리콜을 포함하는 기이거나, 존재하지 않고;
각 R2는 독립적으로 스페이서 기이거나, 존재하지 않으며;
각 A는 동일하고, 친핵체와 친전자체의 반응 생성물을 포함하는 기이고;
R3은 C2-C10 알킬, C2-C10 알콕시, C1-C10 아릴, C2-C10 알킬디티오, 아미드, 에테르, 티오에테르, 에스테르, 올리고뉴클레오티드, 올리고펩티드, 티오프로피오네이트, 또는 디설피드를 포함하는 기이다.
다중접합체의 한 실시양태에서, Y는 X와 상이하다.
다중접합체의 한 실시양태에서, X는 펩티드, 단백질, 지질, 탄수화물, 카르복실산, 비타민, 스테로이드, 리그닌, 소분자, 유기금속 화합물, 또는 전술한 어느 하나의 유도체이다.
다중접합체의 한 실시양태에서, Y는 핵산, 펩티드, 단백질, 지질, 탄수화물, 카르복실산, 비타민, 스테로이드, 리그닌, 소분자, 유기금속 화합물, 또는 전술한 어느 하나의 유도체이다.
다중접합체의 다양한 실시형태에서, X는 (a) 펩티드 또는 펩티드의 유도체(그 일례는 HIV-1TAT 단백질의 형질도입 도메인); (b) 항체 또는 항체 단편, 또는 이의 유도체(그 일례는 항체 단쇄 가변 단편); (c) 소분자 또는 이의 유도체, 예를 들어 소분자 치료 약물(그 일례는 레날리도마이드); (d) 유기금속 화합물 또는 이의 유도체(그 일례는 페로센)이다.
다중접합체의 다양한 실시양태에서, Y는 핵산 또는 이의 유도체이다. 추가 실시양태에서, Y는 (a) RNA(그 예는 siRNA, saRNA, 또는 miRNA를 포함하지만 이에 제한되지 않음); (b) 안티센스 올리고뉴클레오티드(그 예는 안티센스 DNA 및 갭머를 포함함); (c) DNA 또는 RNA 앱타머, 또는 (d) 전술한 어느 하나의 유도체이다.
다중 접합체의 한 실시양태에서, X와 Y를 연결하는 동종 2가 공유 링커는 세포내 조건하에서 절단 가능하고 본원에 개시되거나 달리 당업자에게 공지된 임의의 절단 가능한 동종 2가 공유 링커를 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 다중접합체는 적어도 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% 순수하다. 일부 측면에서, 다중접합체는 약 85% 내지 95% 순수하다. 일부 실시양태에서, 다중접합체의 제제는 75% 이상 순수; 85% 이상 순수; 95% 이상 순수할 수 있다.
이량체 다중접합체를 합성하는 방법
본 개시내용은 핵산 외의 생물학적 모이어티를 포함하는 제1 치환기 X 및 X와 동일하거나 상이한 제2 치환기 Y를 포함하는 다중접합체를 합성하는 방법을 제공하며, 여기서 X 및 Y는 X●Y 이량체의 형성을 실질적으로 선호하고 X●X 이량체 및 Y●Y 이량체의 형성을 실질적으로 방지하는 반응 조건하에서 동종 2가 공유 링커에 의해 연결된다(이량체 다중 접합체).
한 실시양태에서, 본 개시내용은 구조 7의 다중접합체를 합성하는 방법을 제공하며:
X●Y (구조 7)
여기서,
X는 핵산 외의 생물학적 모이어티를 포함하는 제1 치환기이고;
Y는 X와 동일하거나 상이한 제2 치환기이고;
●는 X와 Y를 연결하는 공유 링커이며;
상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(a) X-R4를 동종 2가 링커 ○와 반응시켜 단일 치환된 생성물 X-○를 생성하는 단계로서, R4는 단일 치환된 생성물 X-○를 생성하고 X의 이량체화를 실질적으로 방지하는 조건하에서 ○와 반응할 수 있는 작용기인 단계; 및
(b) X-○를 R5-Y와 반응시킴으로써 X●Y를 형성하는 단계로서, R5는 ○와 반응할 수 있는 작용기인 단계.
또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 구조 7의 다중접합체를 합성하는 방법을 제공하며:
X●Y (구조 7)
여기서,
X는 핵산 외의 생물학적 모이어티를 포함하는 제1 치환기이고;
Y는 X와 동일하거나 상이한 제2 치환기이고;
●는 X와 Y를 연결하는 공유 링커이며;
상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(a) R4-Y를 동종 2가 링커 ○와 반응시켜 단일 치환된 생성물 ○-Y를 생성하는 단계로서, R4는 단일 치환된 생성물 ○-Y를 생성하고 Y의 이량체화를 실질적으로 방지하는 조건하에서 ○와 반응할 수 있는 작용기인 단계; 및
(b) ○-Y를 X-R5와 반응시킴으로써 X●Y를 형성하는 단계로서, R5는 ○와 반응할 수 있는 작용기인 단계.
구조 7의 다중접합체를 합성하는 방법의 한 실시양태에서, 단계 (a)는 X-R4에 비해 화학량론적 과량의 동종 2가 링커 ○로 수행된다.
구조 7의 다중접합체를 합성하는 방법의 한 실시양태에서, 단계 (a)는 R4-Y에 비해 화학량론적 과량의 동종 2가 링커 ○로 수행된다.
구조 7의 다중접합체를 합성하는 방법의 한 실시양태에서, 단계 (a)는 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 또는 100의 몰 과량의 동종 2가 링커 ○로 수행된다.
구조 7의 다중접합체를 합성하는 방법의 한 실시양태에서, 단계 (a)는 물 및 임의로 수혼화성 유기 공용매를 포함하는 용액에서 수행된다. 수혼화성 유기 공용매가 사용되는 추가 실시양태에서, 수혼화성 유기 공용매는 DMF, DMSO, THF, 디옥산, 피리딘, 알코올, 또는 아세토니트릴을 포함한다. 추가 실시양태에서, 수혼화성 유기 공용매는 용액의 약 10, 15, 20, 25, 30, 40, 또는 50%(v/v)를 구성한다.
전술한 합성 방법에 사용하기 위한 알코올은 C1-C10 알코올, C1-C7 알코올, 및 C1-C5 알코올을 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 각 경우에 아미노, 3급 아미노 또는 설페이트와 같은 수혼화성 향상기로 임의로 치환된다.
구조 7의 다중접합체를 합성하는 방법의 한 실시양태에서, 단계 (a)는 약 7, 6, 5, 또는 4의 pH에서 수행된다.
구조 7의 다중접합체를 합성하는 방법의 한 실시양태에서, 단계 (a)는 무수 유기 용매를 포함하는 용액에서 수행된다. 추가 실시양태에서, 무수 유기 용매는 디클로로메탄, DMF, DMSO, THF, 디옥산, 피리딘, 알코올, 또는 아세토니트릴을 포함한다.
전술한 방법의 실시양태에서: (a) 이량체 다중접합체의 수율은 적어도 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%이고/거나; (b) 이량체 다중접합체의 순도는 적어도 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%이다. 일부 실시양태에서, 다중접합체는 약 85% 내지 95% 순수하다. 일부 실시양태에서, 다중접합체의 제제는 75% 이상 순수; 85% 이상 순수; 95% 이상 순수할 수 있다.
더 큰 다중 접합체
본 개시내용은 또한 적어도 3개의 치환기를 포함하는 더 큰 다중 접합체에 관한 것이며, 이들 치환기 각각은 생물학적 모이어티이고 동일하거나 상이할 수 있으며, 이들 치환기 각각은 공유 링커에 의해 서로 연결되며; 여기서 적어도 하나의 치환기는 핵산이 아니다(비핵산 치환기). 본 개시내용은 본원에 제공된 동종 2가 공유 링커의 예를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 당업자에게 공지된, 절단 가능한 또는 절단 불가능한 모든 유형의 공유 링커; 및 또한 본원에 제공된 치환기의 다양한 예를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 다중접합체의 치환기로서 모든 유형의 생물학적 모이어티에 적용 가능하다.
다양한 실시양태에서, 다중접합체는 (a) 2개 이상의 치환기; (b) 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 ,또는 10개의 치환기를 포함한다.
다양한 실시양태에서, 다중접합체는 (a) 상이한 적어도 2개의 치환기; (b) 동일한 적어도 2개의 치환기를 포함한다.
일부 실시양태에서, (a) 다중접합체 내의 모든 치환기는 상이하거나; (b) 다중접합체 내의 모든 치환기는 동일하다.
이 다중접합체의 한 실시양태에서, 본 개시내용은 치환기 X, Y, 및 Z를 포함하는 다중접합체를 제공하며, 여기서 치환기 각각은 독립적으로 생물학적 모이어티이고 공유 링커 ●에 의해 또 다른 치환기에 연결되며; 여기서 다중접합체는 구조 9를 포함한다:
Figure pct00056
(구조 9)
여기서,
▲1, ▲2, ▲3, ▲4 및 ▲5 각각은 독립적으로 존재하지 않거나, 이들 각각의 치환기에 공유 결합된 생물학적 모이어티를 포함하고;
n은 0 이상의 정수이고;
구조 9에 존재하는 치환기 중 적어도 하나는 핵산이 아니다.
구조 9의 다중접합체의 일부 실시양태에서, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이다.
구조 9의 다중접합체의 일부 실시양태에서, X는 핵산이 아니다. 일부 실시양태에서, Y는 핵산이 아니다. 일부 실시양태에서, Z는 그의 반복 중 어느 하나에서 핵산이 아니다.
구조 9의 다중접합체의 한 실시양태에서, 적어도 하나의 공유 링커 ●는 동종 2가 공유 링커이다.
구조 9의 다중접합체의 한 실시양태에서, 적어도 하나의 ▲가 존재한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 ▲는 표적화 모이어티이다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 ▲는 엔도솜 탈출 모이어티이다. 일부 실시양태에서, 다중접합체는 적어도 하나의 표적화 모이어티 및 적어도 하나의 엔도솜 탈출 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 ▲는 검출 가능한 표지이다. 일부 실시양태에서, 다중접합체는 적어도 하나의 표적화 모이어티, 엔도솜 탈출 모이어티, 및 검출 가능한 표지를 포함한다.
구조 9의 다중접합체의 한 실시양태에서, 다중접합체의 적어도 하나의 말단은 ▲에 공유 결합된다. 일부 실시양태에서, 다중접합체의 적어도 하나의 내부 치환기는 ▲에 공유 결합된다. 일부 실시양태에서, 다중접합체의 적어도 하나의 말단은 ▲에 공유 결합되고 다중접합체의 적어도 하나의 내부 치환기는 ▲에 공유 결합된다. 일부 실시양태에서, 다중접합체의 말단 각각은 ▲에 공유 결합되고 다중접합체의 내부 치환기 각각은 ▲에 공유 결합된다.
일부 실시양태에서, 다중접합체에 존재하는 ▲ 중 적어도 하나는 다중접합체에 존재하는 임의의 다른 ▲와 상이하다. 일부 실시양태에서, 다중접합체에 존재하는 모든 ▲는 동일하다. 일부 실시양태에서, 다중접합체에 존재하는 모든 ▲는 상이하다.
구조 9의 다중접합체의 한 실시양태에서, 적어도 하나의 공유 링커 ●는 황 함유 공유 링커이고; ▲1, ▲2, ▲3, ▲4 및 ▲5 중 적어도 하나는 황 함유 말단기 Q를 포함한다. 추가 실시양태에서, 황 함유 말단기 Q는 탈보호 조건하에서 탈보호 가능한 탈보호 기를 포함하고; 황 함유 공유 링커 ●는 탈보호 조건하에서 안정하다. 또 다른 실시양태에서, 황 함유 공유 링커 ●는 탈보호 조건이 아닌 절단 조건하에서 절단 가능한 절단 가능한 기를 포함한다. 추가 실시양태에서, 황 함유 말단기 Q는 보호된 티올을 포함한다.
적어도 하나의 치환기가 비핵산 치환기인 더 큰 다중접합체의 다양한 실시양태에서, 핵산을 포함하는 2개 이상의 연속 치환기의 스트레치가 있을 수 있으며; 이 스트레치는 본원에서 다중접합체의 "다량체 올리고뉴클레오티드 성분"으로 지칭된다. 일부 다중접합체는 이러한 다량체 올리고뉴클레오티드 성분을 하나 초과 포함할 수 있다.
따라서 다중접합체의 다량체 올리고뉴클레오티드 성분은 공유 링커에 의해 함께 연결된 2개 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있으며; 성분 내 올리고뉴클레오티드는 동일하거나(동종다량체) 상이할 수 있다(이종다량체). 다중접합체의 다량체 올리고뉴클레오티드 성분을 구성할 수 있는 올리고뉴클레오티드의 예는 siRNA, saRNA, miRNA, DNA 또는 RNA 앱타머, 및 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 각 올리고뉴클레오티드는 15-30, 17-27, 19-26, 또는 20-25개 뉴클레오티드 길이이다.
다중접합체의 다량체 올리고뉴클레오티드 성분의 간단한 실시양태는 5'에서 3'으로, 3'에서 3'으로, 또는 5'에서 5'로 배향된 2개의 올리고뉴클레오티드의 이량체이고; 이들 각각은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있으며; 각 올리고뉴클레오티드의 서열은 동일하거나 상이할 수 있다.
본 개시내용의 이러한 측면의 다른 실시양태에서, 다중접합체의 다량체 올리고뉴클레오티드 성분은 구조 15를 포함한다:
Figure pct00057
(구조 15)
여기서 올리고뉴클레오티드 서브유닛
Figure pct00058
각각은 독립적으로 단일 또는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드이고; 서브유닛
Figure pct00059
각각은 공유 링커 ●에 의해 다른 서브유닛에 연결되며; 여기서 서브유닛
Figure pct00060
중 적어도 하나는 3' 말단에 연결된 공유 링커 ● 중 하나와 5' 말단에 연결된 다른 공유 링커를 갖는 가닥을 포함하고, n은 정수 ≥ 0이다.
본 개시내용의 이러한 측면의 다른 실시양태에서, 다중접합체의 다량체 올리고뉴클레오티드 성분 내의 각 올리고뉴클레오티드 서브유닛
Figure pct00061
은 이중 가닥 올리고뉴클레오티드
Figure pct00062
이고, 각 공유 링커 ●는 구조 16에서와 동일한 가닥 상에 있다:
Figure pct00063
(구조 16),
여기서 d는 정수 ≥ 0이다.
본 개시내용의 이러한 측면의 다른 실시양태에서, 다중접합체의 다량체 올리고뉴클레오티드 성분 내의 각 올리고뉴클레오티드 서브유닛
Figure pct00064
은 단일 가닥 올리고뉴클레오티드
Figure pct00065
이고, 각 공유 링커 ●는 예를 들어 구조식 34:
Figure pct00066
의 다량체 올리고뉴클레오티드(그러나 이에 제한되지 않음) 동일한 가닥 상에 있다. 이러한 한 실시양태에서, 적어도 하나의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드
Figure pct00067
는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다. 다른 실시양태에서, 각 단일 가닥 올리고뉴클레오티드
Figure pct00068
는 독립적으로 안티센스 올리고뉴클레오티드이다.
본 개시내용의 이러한 측면의 다른 실시양태에서, 다량체 올리고뉴클레오티드 성분은 구조 17 또는 구조 18을 포함한다:
Figure pct00069
(구조 17);
Figure pct00070
(구조 18);
여기서 각각의
Figure pct00071
은 이중 가닥 올리고뉴클레오티드이고, 각 ●은 인접한 이중 가닥 올리고뉴클레오티드를 연결하는 공유 링커이고, f는 정수 ≥ 1이고, g는 정수 ≥ 0이다.
본 개시내용의 이러한 측면의 또 다른 실시양태에서, 다중접합체의 다량체 올리고뉴클레오티드 성분은 구조식 19, 20, 21, 또는 22에 따른 화합물을 포함한다:
Figure pct00072
(구조 19)
Figure pct00073
(구조 20)
Figure pct00074
(구조 21)
Figure pct00075
(구조 22)
여기서,
각
Figure pct00076
은 이중 가닥 올리고뉴클레오티드이고,
각
Figure pct00077
은 단일 가닥 올리고뉴클레오티드이고,
각 ●은 인접한 단일 가닥 올리고뉴클레오티드의 단일 가닥을 연결하는 공유 링커이고, m은 정수 ≥ 1이고 n은 정수 ≥ 0이다.
본 개시내용의 이러한 측면의 또 다른 실시양태에서, 다중접합체의 다량체 올리고뉴클레오티드 성분은 공유 링커 ● 중 적어도 하나가 3개 이상의 올리고뉴클레오티드 서브유닛
Figure pct00078
을 연결하는 분지형 구조를 포함한다. 구조 23은 분지형 구조를 포함하는 다량체 올리고뉴클레오티드 성분의 한 예를 제공한다:
Figure pct00079
(구조 23).
본 개시내용의 이러한 측면의 또 다른 실시양태에서, 다중접합체의 다량체성 올리고뉴클레오티드 성분은 구조 24에서와 같이 분할 가닥을 포함하는 올리고뉴클레오티드 서브유닛을 포함한다:
Figure pct00080
(구조 24)
여기서,
각
Figure pct00081
는 부분 단일 가닥 올리고뉴클레오티드이고;
Figure pct00082
는 부분 단일 가닥 올리고뉴클레오티드에 어닐링된 상보적 가닥이다.
본 개시내용의 이러한 측면의 일부 실시양태에서, 다중접합체의 다량체 올리고뉴클레오티드 성분 내의 각 올리고뉴클레오티드 서브유닛은 독립적으로 5개 미만의 포스포로티오에이트 기; 또는 4개 미만의 포스포로티오에이트 기; 또는 3개 미만의 포스포로티오에이트 기를 함유한다.
본 개시내용의 이러한 측면의 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 서브유닛 내의 뉴클레오티드의 75% 미만이 화학적으로 변형되거나; 올리고뉴클레오티드 서브유닛 내의 뉴클레오티드의 80% 미만이 화학적으로 변형된다.
본 개시내용의 이러한 측면의 일부 실시양태에서, 다중접합체의 올리고뉴클레오티드 성분 내의 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 서브유닛은 또 다른 서브유닛과 상이하다. 또 다른 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 성분 내의 모든 올리고뉴클레오티드 서브유닛은 서로 상이하다.
본 개시내용의 이러한 측면의 일부 실시양태에서, 다중접합체의 올리고뉴클레오티드 성분 내의 적어도 2개의 올리고뉴클레오티드 서브유닛은 제1 서브유닛의 3' 말단과 제2 서브유닛의 5' 말단 사이에 공유 링커에 의해 연결되거나; 제1 서브유닛의 5' 말단과 제2 서브유닛의 3' 말단 사이에 공유 링커에 의해 연결되거나; 제1 서브유닛의 5' 말단과 제2 서브유닛의 5' 말단 사이의 공유 링커에 의해 연결된다.
본 개시내용의 이러한 측면의 일부 실시양태에서, 다중접합체의 올리고뉴클레오티드 성분 내의 모든 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 서브유닛은 평활 말단이고(즉, 대칭적); 즉, 돌출된 뉴클레오티드가 있는 가닥을 함유하지 않는다(즉, 비대칭).
본 개시내용의 이러한 측면의 일부 실시양태에서, 다중접합체의 다량체 올리고뉴클레오티드 성분은 하나 이상의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함하지만 3개의 연속 뉴클레오티드 상에 3개의 동일한 화학적 변형을 함유하지 않는다.
일부 실시양태에서, 다량체 올리고뉴클레오티드 성분은 센스 및 안티센스 가닥을 갖는 이중 가닥 서브유닛
Figure pct00083
을 포함하지 않으며, 여기서 센스 및 안티센스 가닥은 구조 F를 포함한다:
센스 가닥: 5' np - Na - (XXX)i - Nb - YYY - Nb - (ZZZ)j - Na - nq 3'
안티센스: 3' np' - Na' - (X'X'X')k - Nb' - Y'Y'Y' - Nb' - (Z'Z'Z')l - Na' - nq' 5'
여기서 i, j, k 및 l은 각각 독립적으로 0 또는 1이고; p, p', q 및 q'는 각각 독립적으로 0-6이고; 각각의 Na 및 Na'는 독립적으로 0-25개의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내고, 각 서열은 적어도 2개의 상이하게 변형된 뉴클레오티드를 포함하고; 각 Nb 및 Nb'는 독립적으로 0-10개의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내고; 각 np', np, nq' 및 nq는 독립적으로 돌출 뉴클레오티드를 나타내거나 존재하지 않을 수 있으며; XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y' 및 Z'Z'Z'는 각각 독립적으로 3개의 연속 뉴클레오티드에 3개의 동일한 변형이 있는 하나의 모티프를 나타낸다. X, Y, 및 Z 각각은 서로 동일하거나 상이할 수 있다.
일부 실시양태에서, 다량체 올리고뉴클레오티드 성분은 센스 및 안티센스 가닥을 갖는 이중 가닥 서브유닛
Figure pct00084
을 포함하지 않으며, 여기서 센스 및 안티센스 가닥은 구조 F1을 포함한다:
5' np - Na - YYY - Na - nq 3'
3' np' - Na' - Y'Y'Y' - Na' - nq' 5'
여기서 각 Na는 독립적으로 2-20, 2-15, 또는 2-10개의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 다량체 올리고뉴클레오티드는 센스 및 안티센스 가닥을 갖는 이중 가닥 서브유닛
Figure pct00085
을 포함하지 않으며, 여기서 센스 및 안티센스 가닥은 구조 F2를 포함한다:
5' np - Na - YYY - Nb - ZZZ - Na - nq 3'
3' np' - Na' - Y'Y'Y' - Nb' - Z'Z'Z' - Na' - nq' 5'
각 Nb는 독립적으로 1-10, 1-7, 1-5, 또는 1-4개의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 각 Na는 독립적으로 2-20, 2-15, 또는 2-10개의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다. X, Y, 및 Z는 각각 서로 동일하거나 상이할 수 있다.
일부 실시양태에서, 다량체 올리고뉴클레오티드 성분은 센스 및 안티센스 가닥을 갖는 이중 가닥 서브유닛
Figure pct00086
을 포함하지 않으며, 여기서 센스 및 안티센스 가닥은 구조 F3을 포함한다:
5' np - Na - XXX - Nb - YYY - Na - nq 3'
3' np' - Na' - X'X'X' - Nb' - Y'Y'Y' - Na' - nq' 5'
각 Nb, Nb'는 독립적으로 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 또는 0개의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 각 Na는 독립적으로 2-20, 2-15 또는 2-10개의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다. X, Y, 및 Z는 각각 서로 동일하거나 상이할 수 있다.
일부 실시양태에서, 다량체 올리고뉴클레오티드 성분은 센스 및 안티센스 가닥을 갖는 이중 가닥 서브유닛
Figure pct00087
을 포함하지 않으며, 여기서 센스 및 안티센스 가닥은 구조 F4를 포함한다:
5' np - Na - XXX - Nb - YYY - Nb - ZZZ - Na - nq 3'
3' np' - Na' - X'X'X' - Nb' - Y'Y'Y' - Nb' - Z'Z'Z' - Na' - nq' 5'
각 Nb, Nb'는 독립적으로 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 또는 0개의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 각 Na, Na'는 독립적으로 2-20, 2-15 또는 2-10개의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다. Na, Na', Nb 및 Nb' 각각은 독립적으로 교대 패턴의 변형을 포함한다. X, Y, 및 Z는 각각 서로 동일하거나 상이할 수 있다.
일부 실시양태에서, 다량체 올리고뉴클레오티드 성분은 센스 및 안티센스 가닥을 갖는 이중 가닥 서브유닛
Figure pct00088
을 포함하지 않으며, 여기서 센스 및 안티센스 가닥은 구조 F5를 포함한다:
5' -Na - Y Y Y - Na - 3'
3' np' -Na' -Y' Y' Y' -Na' 5'
여기서,
np'는 2-뉴클레오티드 돌출이고 np' 내의 각 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 연결을 통해 이웃하는 뉴클레오티드에 연결되며;
각 Na 및 Na'는 독립적으로 변형 또는 비변형 또는 이들의 조합인 0-25개의 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내고, 각 서열은 적어도 2개의 상이하게 변형된 뉴클레오티드를 포함하고;
YYY 및 Y'Y'Y'는 각각 독립적으로 3개의 연속 뉴클레오티드에 3개의 동일한 변형의 하나의 모티프를 나타낸다.
일부 실시양태에서, 다량체 올리고뉴클레오티드 성분은 US 10,612,024; US 2017/0275626 A1; US 2017/0369872 A1; WO 2019/036612 A1에서 이들 공보(이들 각각은 그 전체가 본원에 포함됨)에 개시된 임의의 다양한 실시양태에서 화학식 (I)로 표시되는 이중 가닥 서브유닛을 포함하지 않는다.
일부 실시양태에서, 다량체 올리고뉴클레오티드 성분은 3개 이상의 올리고뉴클레오티드를 커플링하는 분지형 연결을 포함하지 않는다.
본 개시내용의 범위 내에서 다량체 올리고뉴클레오티드 및 다량체 올리고뉴클레오티드를 합성하는 방법의 추가 예는 미국 특허 9,644,209 및 10,597,659; WO 2016/205410 A2; WO 2018/145086 A1; 및 WO 2020/180897에 개시되어 있으며, 이들 각각은 그 전문이 본원에 포함된다.
상기 기재된 바와 같이, 일부가 "●"로 표시되는 모든 다중접합체에서의 공유 링커는 임의로 □-●, □-●-□ 또는 ●-□에서와 같이 공유 결합의 한쪽 또는 양쪽에 스페이서 기 □를 포함할 수 있다.
추가로, 다중접합체 내의 공유 링커는 절단 가능하거나 절단 불가능할 수 있다. 절단 가능한 링커는 생물학적 모이어티의 기능적 전달을 용이하게 하기 위해 투여 시, 전달 시 절단하는 동안, 또는 세포내 조건하에서 안정성을 유지하도록 선택되거나 설계될 수 있다. 본 개시내용 전반에 걸쳐 제공되는 공유 링커의 예 이외에, 당업자는 그의 조성, 합성 및 용도를 포함하여 매우 다양한 공유 링커가 당업계에 공지되어 있고 본 개시내용과 일치하는 용도로 조정될 수 있음을 인식할 것이다.
더 큰 다중접합체의 일부 실시양태에서, 각각의 공유 링커는 동일하다. 일부 실시양태에서, 모든 공유 링커는 상이하다. 일부 실시양태에서, 공유 링커 중 적어도 하나는 다른 공유 링커와 상이하다.
일부 실시양태에서, 각각의 공유 링커는 다중접합체의 2개의 치환기를 연결한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 공유 링커는 다중접합체의 3개 이상의 치환기를 연결한다.
더 큰 다중접합체를 합성하는 방법
본 개시내용은 또한 생물학적 활성 치환기 X, Y, 및 Z를 포함하는 다중접합체를 합성하는 방법을 제공하며, 이 치환기는 동일하거나 상이할 수 있고, 각각은 공유 링커에 의해 서로 연결된다.
구조 10을 포함하는 다중접합체를 합성하는 방법으로서,
Figure pct00089
(구조 10)
상기 방법은
구조 10a의 화합물을 동종 2가 링커와 반응시켜 단일 치환된 생성물(구조 10b)를 생성하고 구조 10a의 이량체화를 실질적으로 방지하는 조건하에서 구조 10b의 화합물을 형성하는 단계;
구조 10b의 화합물을 구조 10c의 화합물과 반응시켜 구조 10d의 화합물을 형성하는 단계;
구조 10d의 화합물을 탈보호하여 구조 10e의 화합물을 형성하는 단계; 및
구조 10e의 화합물을 구조 10f의 화합물과 반응시켜 구조 10을 형성하는 단계
를 포함하며, 다음과 같다:
Figure pct00090
Figure pct00091
여기서,
●는 공유 링커이고;
○는 동종 2가 링커이고;
R4는 구조 10b의 단일 치환된 생성물을 생성하고 구조 10a의 이량체화를 실질적으로 방지하는 조건하에서 동종 2가 링커 ○와 반응하도록 선택된 작용기이고;
R5는 동종 2가 링커 ○와 반응하도록 선택된 작용기이고;
S - PG는 10b, 10c 및 10d 내의 임의의 공유 링커 ● 내에 존재하는 임의의 황 함유기와 상이한 황 함유기를 포함하는 보호된 티올 기이고;
Q는 구조 10e의 -SH 기와 반응하여 공유 링커 ●를 형성하도록 선택된 반응성 기이고;
X, Y, 및 Z는 다중접합체의 치환기고, 각각은 생물학적 모이어티이고;
Z', Z" 및 Z"'는 다중접합체의 치환기이고, 각각은 생물학적 모이어티이고;
▲1, ▲2, ▲3, ▲4 및 ▲5 각각은 독립적으로 존재하지 않거나, 이들 각각의 치환기에 공유 결합된 생물학적 모이어티를 포함하고;
▲3', ▲3", 및 ▲3"' 각각은 독립적으로 존재하지 않거나, 이들 각각의 치환기에 공유 결합된 생물학적 모이어티를 포함하고;
n 은 1 이상인 정수이고 임의로 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이고;
n', n", 및 n"'은 각각 0 이상의 정수이며, 단 n' + n" + n"'의 합은 n이다.
개시된 화합물 및 다중 접합체를 사용하는 방법
본 개시내용은 또한 유전자 발현 조절, 생물학적 연구, 질병의 치료 또는 예방, 및/또는 새롭거나 변경된 유전자형 또는 표현형의 생성에 있어서 개시된 다중접합체 및 합성 중간체를 사용하는 방법을 제공한다.
다중 접합체의 약동학적 및 약력학적 특성
혈류에서 약물의 생체이용률은 표적 세포 흡수 대 신장 청소 사이의 균형으로 특징지어질 수 있다. 실제적인 관점에서, 생체 내 순환 반감기 및/또는 생체 내 활성은 쉽게 정량화 및 측정할 수 있고 개선(예를 들어, 증가)이 개선된 약력학 및/또는 또는 약동학과 관련이 있을 수 있기 때문에 신장 청소/사구체 여과에 대한 좋은 대용물이다.
혈액 내 치료제(TA)의 흡수 속도는 여러 인자의 함수로서, 다음과 같이 표현될 수 있다: 흡수 속도 = f {(TA 농도) x (혈류 속도) x (수용체 복제본 수/세포) x (세포 수) x (평형 해리 상수 Kd) x (내재화율)}. 주어진 리간드/수용체 쌍에 대해, 복제본 수, Kd, 세포 수 및 내재화율은 일정할 것이다. 이는 GalNAc 리간드 시스템이 간세포에 매우 효과적인 이유를 설명할 수 있다 - 이는 높은 복제본 수로 존재하고 내재화율이 높은 ASGP 수용체를 표적화한다. 일부 ASGP/GalNAc 변이체의 Kd는 나노몰 범위에 있으며 내재화율이 매우 높다.
그러나 효과적인 표적화는 또한 치료제의 농도에 의존하며, 이는 혈류로부터의 제거로 인해 시간이 지남에 따라 급격히 감소한다. 치료제(TA)의 청소율은 다음과 같이 나타낼 수 있다: 청소율 = f {(혈류 속도) x (신장 여과율) x (기타 청소 메커니즘)}. 시간 t에서의 TA의 결과 농도는 다음과 같이 나타낼 수 있다. (ONT 농도)t = f{(초기 농도) - (청소율 x t)}.
인간에서, 청소율은 주로 신장의 사구체 여과로 인한 것이다. 일반적으로 약 45 kD 미만의 분자는 반감기가 약 30분이다. 마우스에서, 청소율이 훨씬 빨라 순환 반감기가 약 5분이다. 어떠한 특정 이론에 얽매이고자 하지 않고, 본 개시내용은 특별히 구성된 다중접합체(예를 들어, 특정 조성, 크기, 중량 등)를 사용하여 사구체 여과를 감소시킬 수 있고, 이는 청소율을 낮추고, 결과적으로 주어진 시간 t에서 순환하는 치료제(들)의 더 높은 농도(예를 들어, 증가된 혈청 반감기, 더 높은 전체 흡수 및 더 높은 활성)를 초래한다고 생각된다.
또한, 어떠한 특정 이론에 얽매이고자 하지 않고, 실제 사구체 여과율은 직접 측정하기 어려울 수 있다. 예를 들어, 사구체 모세혈관을 통과하는 화합물은 관형 상피 세포와 같은 세포에 의해 쉽게 흡수되며, 이는 상당한 기간 동안 치료제 또는 그의 대사산물을 보유할 수 있다(예를 들어, Henry, S. P. et al; Toxicology, 301, 13-20(2012) 및 van de Water, F.M et al; Drug metabolism and Disposition, 34, No 8, 1393-1397 (2006) 참조). 또한, 흡수된 화합물은 분해 산물로 대사된 후 소변으로 배설될 수 있다. 따라서, 특정 시점에서 치료제의 농도(예를 들어, 소변 내)가 반드시 사구체 여과율을 나타내지 않을 수 있다. 그러나 사구체 여과와 관련이 있고 직접 측정할 수 있는 혈청 반감기는 사구체 여과의 적절한 대용물로 간주될 수 있다.
하기 표 1은 성분의 순환 반감기(t1/2)를 증가시키는 것이 시간 t에서 성분의 결과적인 농도에 대해 가질 수 있는 극적인 효과를 보여준다:
Figure pct00092
따라서, 성분의 반감기를 2배 증가시키는 것은 2시간에서 그의 잔류 농도를 4배 증가시킨다. 반감기를 4배 늘리면 잔류 농도가 훨씬 더 극적으로 개선된다 - 2시간과 4시간에 각각 8배, 60배 이상.
본원에 개시된 다중접합체는 신장 및/또는 다른 청소 경로에 의한 다중접합체의 청소를 감소시킬 분자량 및/또는 크기 및/또는 구조를 갖도록 구성될 수 있다. 이러한 구성 전략은 또한 각 경우에 단량체 형태로 투여될 때 동일한 치환기의 순환 반감기 및 생체활성 각각에 비해 대상체에게 투여될 때 다중접합체의 증가된 순환 반감기 및/또는 다중접합체 내의 하나 이상의 치환기의 증가된 생체활성을 초래할 수 있다.
다중접합체에서 siRNA 치환기의 경우, 예를 들어, 증가된 생체활성은 상응하는 단량체 siRNA 올리고뉴클레오티드의 투여 후 측정될 때 동일한 단백질 또는 mRNA의 수준에 비해 다중접합체의 투여 후 siRNA의 표적 단백질 또는 mRNA의 더 낮은 수준의 측정으로 나타날 수 있다.
본 개시내용의 다양한 측면에서, 생체 내 순환 반감기 또는 혈청 반감기는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 500, 또는 1,000배 증가한다. 다양한 측면에서, 생체활성의 증가는 tmax에서 생체활성의 비율로 측정된다. 다양한 실시양태에서, 생체활성은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 500, 또는 1,000배 증가한다. 상응하는 단량체 형태와 비교하여 다량체 내의 치환기 중 적어도 하나의 생체활성의 상대적인 증가는 2-10배 이상의 범위에 있을 수 있고; 예를 들어, 상대적인 증가는 상응하는 단량체의 2, 5, 10배 또는 그 이상일 수 있다. 한 실시양태에서, 이러한 증가는 마우스에서 관찰된다. 또 다른 실시양태에서, 이러한 증가는 인간에서 관찰된다.
본 개시내용의 일부 측면에서, 다중접합체는 약 45 kD 이상의 분자량, 또는 약 45 kD 내지 60 kD 범위의 분자량을 갖도록 구성된다.
한 실시양태에서, 다중접합체 내의 하나 이상의 치환기의 혈청 반감기 및/또는 생체활성의 증가는 다중접합체 내의 포스포로티오에이트 함량과 무관하다.
추가 측면에서, 다중접합체는 피하(SC) 투여를 통해 대상체에게 투여될 때 하나 이상의 치환기의 단량체 형태에 비해 SC 조직으로부터 감소된 방출 속도를 가질 수 있다. SC 투여 측면과 다중접합체의 증가된 혈청 반감기가 결합되면, 신장을 통한 전신 청소율 감소와 커플링된 다중접합체의 SC 조직으로부터의 방출 속도 감소로 인해 생체활성에 상승효과가 있을 수 있으며, 그에 따라 단량체 등가물에 비해 다중접합체의 세포 전달 및 내재화에 대한 시간 경과에 따른 가능성을 추가로 증가시키고, 단량체 등가물에 비해 다중접합체에서 적어도 하나의 치환기의 생체활성을 추가로 증가시킨다.
세포- 또는 조직-표적 모이어티와 조합될 때, 동일한 활성제의 2개 이상의 치환기를 포함하는 다중접합체는 활성제의 단량체 등가물보다 세포 또는 조직 결합 이벤트당 더 높은 페이로드를 전달할 수 있다. 다중접합체는 또한 표적화 모이어티의 2개 이상의 복제본을 포함할 수 있다. 마찬가지로, 다중접합체는 기능 전달 또는 세포내 방출을 촉진하는 것과 같은 다른 목적을 위해 설계된 다른 생물학적 모이어티를 추가로 포함할 수 있다. 조합하여, 이러한 효과는 치료제의 흡수 및 생체활성을 극적으로 증가시킬 수 있다. 이는 수용체 복제본 수, Kd, 표적 세포의 수 및 주어진 리간드/수용체 쌍의 내재화율의 일부 조합이 차선인 경우에 유리할 수 있다.
특정 중합체 연결제 및 다중접합체 치환기, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG)은 특정 약물의 순환 반감기를 증가시키는 데 유용할 수 있다. 이러한 접근법은 치료제를 "희석"시키는 것(예를 들어, 단위 질량당 더 적은 활성 제제)을 포함하는 단점을 가질 수 있다. 본 개시내용은 일부 측면에서 그러한 접근법과 구별된다. 예를 들어, 다양한 실시양태에서, 다중접합체는 PEG 또는 유사 성분을 포함하지 않는다. 다양한 실시양태에서, 다중접합체는 폴리에테르 화합물을 포함하지 않는다. 다양한 실시양태에서, 다중접합체는 일부 경우에 올리고뉴클레오티드 외의 중합체를 포함하지 않는다.
지질 나노입자(LNP)와 같은 나노입자는 특정 약물의 순환 반감기를 증가시키려는 시도에 사용되었다. 이러한 접근 방식은 독성 증가(예를 들어, 양이온성 지질로부터)를 비롯한 단점이 있을 수 있다. 본 개시내용은 이러한 접근법과 구별될 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 다양한 측면에서, 다중접합체는 나노입자에 제제화되지 않는다.
또한, 특정 약물의 순환 반감기를 증가시키기 위해 포스포로티오에이트 기가 사용되어 왔다. 이러한 접근 방식은 낮은 활성을 비롯한 단점이 있을 수 있다. 본 개시내용은 이러한 접근법과 구별될 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 다양한 측면에서, 다중접합체는 포스포로티오에이트를 포함하지 않거나 당업계에 공지된 유사한 다중접합체와 비교하여 더 적은 수의 포스포로티오에이트를 함유한다.
따라서, 본원에 개시된 다중접합체는 분자 크기, 중량 및/또는 구조 면에서 (a) 하나 이상의 개별 단량체 치환기 다중접합체에 비해 다중접합체의 생체 내 순환 반감기를 증가시키기 위해 (b) 하나 이상의 개별 단량체 치환기에 비해 다중접합체의 생체활성을 증가시키기 위해 구성될 수 있다.
치료 방법 및 투여 방법
다양한 측면에서, 본 개시내용은 유효량의 본 개시내용의 다중접합체를 대상체에게 투여하여 질환 또는 장애의 예방 또는 개선을 원하는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 이러한 방법에서, 다중 접합체는 함께 공유 결합된 2개 이상의 치환기를 포함하고, 각각의 치환기는 생물학적 모이어티를 포함하며, 여기서 적어도 하나의 치환기는 핵산이 아니다(즉, "비핵산 치환기"이다).
일부 치료 방법에서, 다중접합체는 3개 이상의 치환기를 갖거나; 다중접합체는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 치환기를 갖는다.
일부 치료 방법에서, 다중접합체는 동종 2가 공유 링커인 적어도 하나의 공유 링커를 갖는다.
일부 치료 방법에서, 다중접합체는 세포내 조건하에서 절단 가능한 적어도 하나의 공유 링커를 포함한다. 일부 방법에서, 다중접합체는 본원에 개시되거나 달리 당업자에게 공지된 임의의 절단 가능한 동종 2가 공유 링커를 포함할 수 있다.
비핵산 치환기의 예는 펩티드, 단백질, 지질, 탄수화물, 카르복실산, 비타민, 스테로이드, 리그닌, 소분자, 유기금속 화합물, 또는 전술한 어느 하나의 유도체를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
핵산 치환기의 예는 천연 및 합성 유도체를 포함하여 이중 가닥 또는 단일 가닥의 DNA 및 RNA를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 경우에, 다중접합체 내의 하나 이상의 치환기는 siRNA, saRNA, 또는 miRNA를 포함한다. 일부 경우에, 다중접합체에서 하나 이상의 치환기는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우에, 다중접합체에서 하나 이상의 치환기는 DNA 또는 RNA 앱타머를 포함한다.
일부 치료 방법에서, 다중접합체는 각각의 경우 단량체 형태로 투여될 때 혈청 반감기 또는 동일한 치환기의 생체 내 활성에 비해 다중접합체의 혈청 반감기 및/또는 다중접합체의 하나 이상의 치환기의 생체 내 활성을 증가시키도록 구성된 분자량 및/또는 크기를 갖는다.
본원에 기재된 일부 치료 방법에서, 다중접합체는 신장을 통한 다중접합체의 청소율을 감소시키도록 구성된 분자량 및/또는 크기를 갖는다. 일부 실시양태에서, 신장을 통한 다중접합체의 청소율 감소는 사구체 여과율 감소의 결과일 수 있다.
이러한 방법의 한 실시양태에서, 신장을 통한 다중접합체의 청소율 감소는 대상체에게 다중접합체를 투여한 후 다중접합체의 생체 내 순환 반감기를 측정함으로써 결정된다.
또 다른 실시양태에서, 신장을 통한 다중접합체의 청소율 감소는 다중접합체의 혈청 농도가 미리 결정된 값으로 감소하는 데 필요한 시간을 측정함으로써 결정된다. 미리 결정된 값은 투여 용량의 90%, 80%, 70%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1%일 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 신장을 통한 청소율 감소는 대상체에게 다중접합체를 투여한 후 미리 결정된 시간에 다중접합체의 혈청 농도를 측정함으로써 결정된다.
또 다른 실시양태에서, 신장을 통한 감소된 청소율은 대상체에게 다중접합체를 투여한 후 시간 경과에 따른 다중접합체의 혈청 농도를 나타내는 그래프의 곡선 하 면적을 측정함으로써 결정된다.
본원에 기재된 일부 치료 방법에서, 다중접합체의 청소율 감소는 그가 투여되는 대상체에서 다중접합체의 생체 내 생체이용률을 증가시킨다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 다중접합체의 생체이용률 증가는 다중접합체의 생체 내 세포 흡수를 증가시킨다. 또 다른 실시양태에서, 다중접합체의 생체이용률 증가는 다중접합체의 생체 내 치료 지수/비율을 증가시킨다. 또 다른 실시양태에서, 다중접합체의 생체이용률 증가는 치환기의 상응하는 단량체 형태에 비해 다중접합체의 적어도 하나의 치환기의 생체 내 생체활성을 증가시킨다. 그리고 실제로, 이들 각각의 실시양태는 대상체를 치료하는 방법에서 다중접합체를 투여한 결과 단독으로 또는 하나 이상의 추가 실시양태와 함께 발생할 수 있다.
이들 방법의 한 측면에서, 신장을 통한 다중접합체의 청소율 감소와 관련된 측정된 매개변수, 예를 들어 다중접합체의 혈청 반감기는 단량체, 이량체, 삼량체 및 더 많은 수의 다중접합체에서 치환기의 수와 관련하여 S자형 관계를 갖는다.
이들 방법의 한 양태에서, 다중접합체 및 단량체 치환기로 시작하는 각각의 그의 치환기에 대한 측정된 매개변수는 플롯될 때 S자형 곡선을 정의한다.
본 개시내용은 다량체 올리고뉴클레오티드를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 방법을 추가로 제공하며, 여기서 다중접합체에 함유된 치환기의 수는 m이고, m은 다중접합체가 단량체 형태로 투여될 때 혈청 반감기 및/또는 동일한 치환기의 생체 내 활성에 비해 혈청 반감기 및/또는 다중접합체 내의 하나 이상의 치환기의 생체 내 활성을 증가시키도록 구성된 분자량 및/또는 크기를 갖는 것이 가능하도록 선택된 정수이다. 다양한 측면에서, m은 ≥2, ≥3, ≥4, ≥4 및 ≤17, ≥4 및 ≤8, 또는 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8이다.
본원에 개시된 일부 투여 방법에서, 환자에게 투여되는 다중접합체의 분자량은 적어도 약 45 kD, 또는 약 45 kD 내지 60 kD 범위이다.
한 측면에서, 본 개시내용은 유효량의 본 개시내용에 따른 다중접합체를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 표적화 리간드 결합 이벤트당 2개 이상의 치료제를 세포에 전달하는 방법을 제공하며, 여기서 다중접합체는 표적화 리간드를 포함한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 유효량의 본 개시내용에 따른 다중접합체를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 미리 결정된 화학량론적 비의 2개 이상의 치료제를 세포에 전달하는 방법을 제공하며, 여기서 다중접합체는 미리 결정된 화학량론적 비의 2개 이상의 치료제를 포함한다.
본원에 기재된 방법 또는 치료 및 투여 방법의 다양한 실시양태에서, 투여되는 다중접합체는 적어도 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 순수하다. 일부 측면에서, 다중접합체는 약 85% 내지 95% 순수하다. 일부 실시양태에서, 다중접합체의 제제는 75% 이상 순수; 85% 이상 순수; 95% 이상 순수할 수 있다.
유전적 또는 발암성 질환의 치료 방법 및 유전자 발현의 조절 방법
본 개시내용은 유전자 발현을 조절함으로써, 예를 들어 유전자 발현을 상향 조절하거나 하향 조절하거나 침묵시킴으로써, 또는 mRNA스플라이싱에 영향을 미침으로써 해결될 수 있는 질환 또는 장애의 치료를 위해 개시된 다중접합체를 사용하는 방법을 제공한다. 이러한 성질의 매우 다양한 질환 및 장애가 알려져 있으며, 따라서 병태를 다루기 위한 생물학적 모이어티가 선택되거나 개발될 수 있다. 본 개시내용의 교시는 이러한 병태의 의학적 또는 수의학적 치료를 위해, 또는 기초 연구, 농업, 진단 및 축산업과 같은 다른 분야에서 유전자 발현을 조절하기 위해 당업자가 다중접합체를 설계하고 개발할 수 있도록 하는 역할을 할 것이다. 다수의 치료 또는 다른 표적이 영향을 받는 것이 바람직한 경우, 본 개시내용의 다중접합체는 단일 화학적 물질로 다중 표적화를 달성할 수 있게 한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 유전자 발현을 조절함으로써 이익을 얻을 질환 또는 장애를 갖는 대상체를 치료하는 방법으로서, 유효량의 본 개시내용에 따른 다중접합체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 유효량의 본 개시내용에 따른 다중접합체를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 표적 유전자의 유전자 발현을 조절하는 방법을 제공한다. 이러한 치료적 실시양태에서, 다중접합체는 유전자 발현을 조절하는 적어도 하나의 치환기, 예를 들어 siRNA, miRNA, saRNA, 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드, CRISPR 뉴클레아제, crRNA 및 전술한 어느 하나의 유도체(그러나 이에 제한되지는 않음)를 포함할 것이다.
유사하게, 본 개시내용은 유효량의 본 개시내용에 따른 다중접합체를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 2개 이상의 표적 유전자의 발현을 조절하는 방법을 제공하며, 여기서 다중접합체는 2개 이상의 표적 유전자를 조절하는 치환기, 예를 들어 siRNA, miRNA, saRNA, 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드, CRISPR 뉴클레아제, crRNA 및 전술한 어느 하나의 유도체(그러나 이에 제한되지는 않음)를 포함한다. 다중접합체는 2개, 3개, 4개 또는 그 이상의 유전자를 표적화하는 치환기를 포함할 수 있다.
본 개시내용의 상기 모든 측면에서, 다중접합체는 유전자 발현을 변형시키는 하나 이상의 치환기 이외에, 면역 자극 또는 억제, 체크 포인트 억제, 및 염증 감소를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다른 치료 효과를 생성하는 다른 치환기를 포함할 수 있다. 다중 치료 효과를 제공하는 치환기를 포함하는 다중접합체는 암, 자가면역 및 신경 장애와 같은 복합 질환 및 병태에 대한 치료를 발전시키는 역할을 할 것이다.
대상체
개시된 치료 방법 및 본원에 개시된 투여 방법으로부터 이익을 얻을 수 있는 대상체는 영장류, 설치류, 및 농경 동물과 같은 포유동물을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 영장류 대상체의 예에는 인간, 침팬지, 및 마카크가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 설치류 대상체의 예는 마우스 및 래트를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 농업 동물 대상체의 예는 소, 양, 램, 닭, 및 돼지를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
마우스 사구체 여과율(GFR: glomerular filtration rate)은 약 0.15 ml/분 - 0.25 ml/분일 수 있다. 인간 GFR은 약 1.8 ml/분/kg일 수 있다 (Mahmood I: (1998) Interspecies scaling of renally secreted drugs. Life Sci 63:2365-2371).
마우스는 약 1.46 ml의 혈액을 가질 수 있다. 따라서, 마우스에서 총 혈액량의 사구체 여과 시간은 약 7.3분(1.46/0.2)일 수 있다. 인간은 약 5리터의 혈액을 가질 수 있으며 체중은 약 70kg이다. 따라서, 인간의 총 혈액량의 사구체 여과 시간은 약 39.7분[5000/126(1.8*70)]일 수 있다.
당업자는 상이한 종들이 적어도 상기 이유 때문에 사구체 여과에 의한 상이한 청소율을 가질 수 있음을 인식할 것이다. 당업자는 인간과 마우스 시간 사이의 사구체 여과에 의한 청소율 비율이 약 1:5 또는 1:6일 수 있음을 추론할 수 있다. 즉, 인간에 의한 특정 물질의 청소율은 마우스보다 5-6배 느릴 수 있다.
한 측면에서, 본 개시내용은 다중접합체를 이를 필요로 하는 대상체에게 전달하는 방법을 제공하며, 여기서 생체 내 순환 반감기는 다량체 올리고뉴클레오티드를 대상체에게 전달한 후 30분 내지 120분 사이에 측정된다.
한 측면에서, 본 개시내용은 다중접합체를 이를 필요로 하는 대상체에게 전달하는 방법을 제공하며, 여기서 미리 결정된 시간은 다중접합체를 대상체에게 전달한 후 30분 내지 120분이다.
한 측면에서, 본 개시내용은 다중접합체를 이를 필요로 하는 대상체에게 전달하는 방법을 제공하며, 여기서 곡선 하 면적은 다중접합체를 대상체에게 투여한 후 x분 내지 y분 사이에 다중접합체의 혈청 농도를 기준으로 계산된다. 일부 실시양태에서, x는 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 75, 90, 120, 180, 240, 또는 300분일 수 있고 y는 90, 120, 180, 240, 300, 360, 420, 480, 540, 600, 720, 840, 960, 1080, 1200, 1320, 1440, 또는 1600분일 수 있다. 예를 들어, 시간 범위는 약 30분 - 120분, 약 1분 - 1600분, 또는 약 300분 - 600분일 수 있다.
한 측면에서, 본 개시내용은 다중접합체 또는 다중접합체의 생체 내 순환 반감기를 증가시키는 방법을 제공하며, 여기서 다중접합체는 나노입자(NP) 또는 지질 나노입자(LNP)에 제제화되지 않는다.
한 측면에서, 본 개시내용은 다중 접합체 또는 내인성 혈청 단백질과 다중 접합체의 응집에 의존하지 않는 다중 접합체의 생체 내 순환 반감기를 증가시키는 방법을 제공한다.
이것과 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 다중접합체는 약학 조성물의 형태로, 전달 비히클로 투여될 수 있거나, 표적화 리간드에 커플링될 수 있다.
약학 조성물
다양한 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 다중접합체 중 임의의 하나 이상을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 약학 조성물은 질환을 예방, 진단, 완화, 치료, 또는 치유하기 위해 사용될 수 있는 식품 외의 활성제를 포함한다. 유사하게, 본 개시내용에 따른 다양한 다중접합체는 의약으로서 사용하기 위한 및/또는 의약 제조에 사용하기 위한 실시양태를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
약학 조성물은 본 개시내용에 따른 다중접합체 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 부형제는 활성 성분과 함께 제제화되는 천연 또는 합성 물질일 수 있다. 부형제는 장기 안정화, 부피 증가(예를 들어, 증량제, 충전제, 또는 희석제), 또는 최종 제형의 활성 성분에 대한 치료 향상의 부여, 예컨대 약물 흡수 촉진, 점도 감소, 또는 용해도 향상을 위해 포함될 수 있다. 또한, 부형제는 예를 들어 활성 성분의 취급을 돕기 위해 및/또는 저장 수명 안정성을 연장하기 위해(예를 들어, 변성 또는 응집을 방지함으로써) 제조 및 유통에 유용할 수 있다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 적절한 부형제의 선택은 투여 경로, 제형, 및 활성 성분(들)을 포함하는 다양한 인자에 따라 달라질 수 있다.
다중접합체는 국부 또는 전신을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 방식으로 투여될 수 있으며, 따라서 본 개시내용의 약학 조성물은 그에 따라 달라질 수 있다. 투여는 임의의 특정 전달 경로, 시스템, 또는 기술에 제한되지 않으며 비경구(피하, 정맥 내, 골수 내, 관절 내, 근육 내, 복강 내, 안구 내, 또는 CNS 주사 포함), 직장, 국소, 경피, 경구, 또는 흡입(비강 내로 또는 예를 들어 분무기를 통해 폐로)를 제한 없이 포함할 수 있다. 개체에 대한 투여는 단일 용량 또는 반복 투여로, 임의의 다양한 생리학적으로 허용되는 염 형태로, 및/또는 허용 가능한 약학 담체 및/또는 약학 조성물의 일부로서 첨가제와 함께 발생할 수 있다. 생리학적으로 허용되는 제제 및 표준 약학 제제화 기술, 투여량, 및 부형제는 당업자에게 잘 알려져 있다(예를 들어, Physicians' Desk Reference (PDR®) 2005, 59th ed., Medical Economics Company, 2004; 및 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, eds. Gennado et al. 21th ed., Lippincott, Williams & Wilkins, 2005 참조).
약학 조성물은 유효량의 본 개시내용에 따른 다중접합체를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "유효량"은 특정 목적을 달성하게 하는 농도 또는 양, 예를 들어 위약과 비교하여, 예를 들어 생물학적 효과를 유발하기에 적절한 양일 수 있다. 유효량이 "치료 유효량"인 경우, 이는 치료 용도에 적절한 양, 예를 들어 질환을 예방, 진단, 완화, 치료, 또는 치유하기에 충분한 양일 수 있다. 유효량은 당업계에 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 치료 유효량은 예를 들어 인간 임상 시험에 의해 경험적으로 결정될 수 있다. 또한, 유효량은 당업계에 공지된 전환 인자를 사용하여 다른 동물(예를 들어, 인간)에서 사용하기 위해 한 동물(예를 들어, 마우스, 래트, 원숭이, 돼지, 개)로부터 외삽될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Freireich et al., Cancer Chemother Reports 50(4):219-244 (1966)]을 참조한다.
전달 구축물 및 제제
당업자가 이해하는 바와 같이, 생물학적 표적 또는 작용 메카니즘에 상관없이, 치료용 다중접합체는 유기체(예를 들어, 치료를 필요로 하는 인간과 같은 동물)에서 표적 세포 또는 조직에 접근하기 위해 일련의 생리학적 장애물을 극복해야만 한다. 치료용 다중접합체는 일반적으로 모두 바람직하지 않은 면역 반응을 유발하지 않으면서 혈류에서 청소를 피하고, 표적 세포 유형에 들어가고, 세포질에 들어가고, 때로는 핵에 들어가야 한다. 다양한 측면에서, 본 개시내용은 세포 및 조직 표적으로의 직접 전달을 위한 다중접합체를 제공한다. 대안적으로, 본 개시내용은 전달 비히클에 제제화된 다중접합체를 제공한다.
직접 전달 전략에서, 다중접합체는 대부분의 경우에 혈청 뉴클레아제 및 기타 인자에 의한 분해를 견디고 선천적 면역 반응의 촉발을 피할 수 있도록 하기 위해 일반적으로 치환기의 화학적 변형 형태로 안정화를 필요로 할 것이다. 화학적 안정화 전략은 당업자에게 공지되어 있고 본원에 개시된 다중접합체와 관련하여 용이하게 사용되거나 개조될 수 있다. 대안적으로, 지질 나노입자(LNP), 엑소좀, 미세소포, 또는 바이러스 벡터와 같은 전달 비히클 또는 제제로 제제화될 때, 다중접합체는 전달 비히클에 의한 분해 및 면역 활성으로부터 보호되거나 차폐될 수 있으므로 화학적 변형 없이 또는 최소한의 변형으로 전달될 수 있다. 전달 비히클 및 제제는 당업자에게 공지되어 있고 본원에 개시된 다중접합체와 관련하여 용이하게 사용되거나 개조될 수 있다.
본 개시내용의 일부 측면에서, 다중접합체는 전달 비히클에 제제화할 필요 없이 표적 세포 또는 조직에 직접 전달하기 위한 세포- 또는 조직-표적화 리간드와 같은 표적화 모이어티가 구비되어 있다. 다른 실시양태에서, 다중 접합체가 전달 비히클에 제제화되는 경우, 전달 비히클은 세포- 또는 조직-표적 모이어티가 구비될 수 있다. 본 개시내용과 관련하여 사용하기에 적합한 표적화 모이어티의 예는 친유성 모이어티(예를 들어, 인지질); 앱타머; 펩티드 또는 단백질(예를 들어, 아르기닌-글리신-아스파르트산[RGD], 트랜스페린, 단클론 항체 또는 이의 단편, 예컨대 단쇄 가변 단편(ScFv), 또는 VHH 항원 결합 단백질); 세포 성장 인자, 소분자, 비타민(예를 들어, 엽산, 토코페롤), 탄수화물(예를 들어, 단당류 및 다당류, N-아세틸갈락토사민[GalNAc], 갈락토스, 만노스); 콜레스테롤; 글루타메이트 우레아(예를 들어, 2-[3-(1,3-디카르복시프로필)-우레이도]펜탄디온산[DUPA]), 벤즈아미드 유도체(예를 들어, 아니스아미드); 및 전술한 어느 하나의 유도체를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, GalNac 표적화 모이어티는 모노-안테나 GalNAc, 디-안테나 GalNAc, 또는 트리-안테나 GalNAc일 수 있다.
친유성 모이어티는 양이온성 기를 포함하는 리간드일 수 있다. 특정 실시양태에서, 친유성 모이어티는 콜레스테롤, 비타민 E, 비타민 K, 비타민 A, 엽산, 또는 양이온성 염료(예를 들어, Cy3)이다. 다른 친유성 모이어티는 콜산, 아다만탄 아세트산, 1-피렌 부티르산, 디히드로테스토스테론, 1,3-비스-O(헥사데실)글리세롤, 게라닐옥시헥실 기, 헥사데실글리세롤, 보르네올, 멘톨, 1,3-프로판디올, 헵타데실 기, 팔미트산, 미리스트산, O3-(올레오일)리토콜산, O3-(올레오일)콜렌산, 디메톡시트리틸, 또는 페녹사진을 포함한다.
표적화 모이어티는 지방산, 예컨대 콜레스테롤, 리토콜산(LCA), 에이코사펜타엔산(EPA), 도코사헥사엔산(DHA), 및 도코산산(DCA), 스테로이드, 세코스테로이드, 지질, 강글리오시드 또는 뉴클레오시드 유사체, 엔도칸나비노이드, 및/또는 콜린, 비타민 A, 비타민 E, 및 이들의 유도체 또는 대사산물과 같은 비타민, 또는 레티노산 및 알파-토코페릴 숙시네이트와 같은 비타민일 수 있다.
표적화 모이어티는 본 개시내용의 교시, 뿐만 아니라 공유 결합, 아미드 결합, 또는 에스테르 결합을 포함하지만 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 다른 기술을 사용하여, 또는 비오틴-스트렙타비딘 또는 금속-리간드 복합체와 같은 비공유 결합을 통해 다중접합체에 통합될 수 있다.
표적화 모이어티는 말단 위치에서, 또는 일부 경우에는 내부 위치에서 다중접합체에 결합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 2개의 표적화 모이어티가 다중접합체에 통합되는데, 예를 들어 여기서 표적화 모이어티는 다중접합체의 각각의 말단에서 접합된다. 2개 초과의 표적화 모이어티는 원하는 경우 내부 및 말단 모두의 다양한 위치에서 다중접합체 내로 통합될 수 있다.
다양한 측면에서, 본 개시내용은 세포에 의해 엔도시토시스된 다중접합체의 엔도솜 탈출을 용이하게 하는 엔도솜 탈출 모이어티(EEM)의 사용 및 통합을 제공한다. 엔도솜 탈출 모이어티는 일반적으로 지질 기반 또는 아미노산 기반이지만, 엔도솜이 다중접합체 또는 이의 대사물질을 방출하는 것을 방해하는 다른 화학 물질을 포함할 수 있다. EEM의 예에는 소수성 아미노산 R 기를 포함하는 모티프가 있는 단백질. 펩티드, 및 클로로퀸, 및 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA2)이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 추가 EEM은 문헌[Lonn et al., Scientific Reports, 6: 32301, 2016]에 기재되어 있다.
다양한 측면에서, 본 개시내용은 다중접합체가 전달된 세포의 핵에 다중접합체, 이의 일부(예를 들어, 링커의 절단에 의해 유리되는 다중접합체의 치환기)의 유입을 용이하게 하기 위해 핵 국소화 신호 또는 서열(NLS)의 사용 및 통합을 제공한다. NLS는 일반적으로 아미노산 서열이며, 그 예는 약물 전달 분야에서 작용하는 것들로 알려져 있다.
생체 내 전달의 장애물을 극복하기 위해 수많은 약물 전달 비히클이 설계되었다. 이러한 비히클은 치료용 RNA, 소분자 약물, 단백질 약물, 및 기타 치료용 분자를 전달하는 데 사용되었다. 약물 전달 비히클은 당, 지질, 지질 유사 물질, 단백질, 중합체, 펩티드, 금속, 하이드로겔, 접합체, 및 펩티드와 같은 다양한 물질로 만들어졌다. 많은 약물 전달 비히클은 이러한 군의 조합의 측면을 포함하며, 예를 들어 일부 약물 전달 비히클은 당과 지질을 결합할 수 있다. 일부 다른 예에서, 약물은 세포를 모방하기 위한 "세포 유사" 물질에 직접적으로 숨겨질 수 있는 반면, 다른 경우에 약물은 세포 자체 내에 또는 위에 삽입될 수 있다. 약물 전달 비히클은 pH 변화, 생체 분자 농도, 자기장, 및 열과 같은 자극에 반응하여 약물을 방출하도록 설계될 수 있다.
본 개시내용의 일부 측면에서, 다중 접합체는 세포내 전달을 위한 나노입자를 형성하기 위해 담체 물질에 캡슐화될 수 있다. 공지된 담체 물질은 양이온성 중합체, 지질 또는 펩티드, 또는 이들의 화학적 유사체를 포함한다(Jeong et al., BIOCONJUGATE CHEM., Vol. 20, No. 1, pp. 5-14 (2009)). 양이온성 지질의 예는 디올레일 포스파티딜에탄올아민, 콜레스테롤 디올레일 포스파티딜콜린, N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA), 1,2-디올레오일옥시-3-(트리메틸암모니오)프로판(DOTAP), 1,2-디올레오일-3-(4'-트리메틸-암모니오)부타노일-sn-글리세롤(DOTB), 1,2-디아실-3-디메틸암모늄-프로판(DAP), 1,2-디아실-3-트리메틸암모늄-프로판(TAP), 1,2-디아실-sn-글리세롤-3-에틸포스포콜린, 3 베타-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)-카바모일]콜레스테롤(DC-콜레스테롤), 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드(DDAB), 및 이들의 공중합체를 포함한다. 양이온성 중합체의 예는 폴리에틸렌이민, 폴리아민, 폴리비닐아민, 폴리(알킬아민 히드로클로라이드), 폴리아미도아민 덴드리머, 디에틸아미노에틸-덱스트란, 폴리비닐피롤리돈, 키틴, 키토산, 및 폴리(2-디메틸아미노)에틸 메타크릴레이트를 포함한다. 한 실시양태에서, 담체는 하나 이상의 아실화 아민을 함유하며, 그의 특성은 다른 공지된 담체 물질과 비교하여 생체 내 사용에 더 적합할 수 있다.
본 개시내용의 한 측면에서, 담체는 양이온성 펩티드, 예를 들어 KALA(양이온성 융합성(fusogenic) 펩티드), 폴리리신, 폴리글루탐산 또는 프로타민이다. 또 다른 측면에서, 담체는 양이온성 지질, 예를 들어 디올레일 포스파티딜에탄올아민 또는 콜레스테롤 디올레일 포스파티딜콜린이다. 또 다른 측면에서, 담체는 양이온성 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌이민, 폴리아민, 또는 폴리비닐아민이다.
전달 제제의 상당한 진보는 헬퍼 성분이 제제의 효율에 영향을 미치는 방식에 대한 이해를 증가시켰다. 헬퍼 성분에는 기본 약물 전달 시스템에 추가된 화학 구조가 포함될 수 있다. 종종, 헬퍼 성분은 입자 안정성 또는 특정 기관으로의 전달을 향상시킬 수 있다. 예를 들어, 나노입자는 지질로 만들어질 수 있지만, 이러한 지질 나노입자에 의해 매개되는 전달은 친수성 중합체 및/또는 소수성 분자의 존재에 의해 영향을 받을 수 있다. 나노입자 전달에 영향을 미치는 중요한 한 친수성 중합체는 폴리(에틸렌 글리콜)이다. 다른 친수성 중합체에는 비이온성 계면활성제가 포함된다. 나노입자 전달에 영향을 미치는 소수성 분자에는 콜레스테롤, 1-2-디스테로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 1-2-디-O-옥타데세닐-3-트리메틸암모늄 프로판(DOTMA), 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP) 등이 포함된다.
본 개시내용의 일부 측면에서, 다중접합체는 엑소좀에 캡슐화될 수 있다. 엑소좀은 혈액, 소변, 및 세포 배양물의 배양된 배지를 포함하는 생물학적 유체에 존재하는 직경 30 내지 100 nm의 세포 유래 소포이다. 합성 엑소좀 및 엑소좀 모방체를 포함하는 엑소좀은 당업계의 기술에 따라 약물 전달에 사용하기 위해 개조될 수 있다. 예를 들어, 문헌["A comprehensive overview of exosomes as drug delivery vehicles - endogenous nanocarriers for targeted cancer therapy" Biochim Biophys Acta. 1846(1):75-87 (2014); "Exosomes as therapeutic drug carriers and delivery vehicles across biological membranes: current perspectives and future challenges" Acta Pharmaceutica Sinica B, Available online 8 March 2016 (In Press); 및 "Exosome mimetics: a novel class of drug delivery systems" International Journal of Nanomedicine, 7: 1525-1541 (2012)]을 참조한다.
본 개시내용의 일부 측면에서, 다중접합체는 미세소포체에 캡슐화될 수 있다. 미세소포체(때때로 순환 미세소포체 또는 미세입자라고도 함)는 거의 모든 세포 유형으로부터 떨어져 나오는 100 nm 내지 1000 nm 범위의 원형질막 단편이며 엑소좀으로 알려진, 더 작은 세포 내에서 생성되는 세포 외 소포와 구별된다. 미세소포체는 세포간 통신에서 역할을 하며 세포 간에 mRNA, miRNA, 및 단백질을 운반할 수 있다. 합성 미세소포체 및 미세소포체 모방체를 포함하는 미세소포체는 당업계의 기술에 따라 약물 전달에 사용하기 위해 개조될 수 있다. 예를 들어, 문헌["Microvesicle- and exosome-mediated drug delivery enhances the cytotoxicity of Paclitaxel in autologous prostate cancer cells" Journal of Controlled Release, 220: 727-737 (2015); "Therapeutic Uses of Exosomes" J Circ Biomark, 1:0 (2013)]을 참조한다.
본 개시내용의 일부 측면에서, 다중접합체는 바이러스 벡터를 사용하여 전달될 수 있다. 바이러스 벡터는 유전 물질을 세포에 전달하기 위해 분자 생물학자들이 일반적으로 사용하는 도구이다. 이 과정은 살아있는 유기체 내부(생체 내) 또는 세포 배양(시험관 내)에서 수행될 수 있다. 바이러스 벡터는 당업계의 기술에 따라 약물 전달에 사용하기 위해 개조될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Viruses as nanomaterials for drug delivery" Methods Mol Biol, 26: 207-21 (2011); "Viral and nonviral delivery systems for gene delivery" Adv Biomed Res, 1:27 (2012); and "Biological Gene Delivery Vehicles: Beyond Viral Vectors" Molecular Therapy, 17(5): 767-777 (2009)]을 참조한다.
당업자는 공지된 전달 제제, 비히클 및 표적화 모이어티가 일반적으로 본 개시내용에 따른 사용을 위해 개조될 수 있음을 인식할 것이다. 관련 교시 및 예는 미국 특허 9,644,209 및 10,597,659; WO 2016/205410 A2; WO 2018/145086 A1; 및 WO 2020/180897에 개시되어 있으며, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
올리고뉴클레오티드 합성, 어닐링 조건, 지질 나노입자 제제화 및 특성화, 작용화된 올리고뉴클레오티드의 제조, 올리고뉴클레오티드로 단일 치환된 DTME의 제조, 다량체 올리고뉴클레오티드에 표적화 모이어티의 부착을 포함하여 다량체 올리고뉴클레오티드의 합성 및 제제화를 위한 일반 절차, 혈청 반감기 및 유전자 녹다운의 측정을 포함하는 동물 실험을 위한 프로토콜은 WO2016/205410, WO2018/145086, 및 WO 2020/180897에 상세히 기술되어 있으며, 이들 각각은 본원에 참고로 포함된다.
하기 실시예는 예시적이며 제한적이지 않다. 본 개시내용을 검토하면 기술의 많은 변형이 당업자에게 명백해질 것이다. 따라서, 기술의 범위는 실시예를 참조하여 결정되는 것이 아니라 첨부된 청구범위와 그 균등물 전체 범위를 참조하여 결정되어야 한다.
실시예
펩티드 화합물
실시예 1: 펩티드로의 DTME의 단일 치환
C-말단 시스테인 잔기를 사용한 고체상 합성에 의해 HIV-1TAT 단백질의 형질도입 도메인(YGRKKRRQRRR)을 제조한다. 정제 후 최종 생성물을 수성 디메틸포름아미드에 용해하고 40배 과량의 디티오비스말레이미도에탄(DTME)으로 처리하고 생성된 혼합물을 실온에서 교반한다. 반응이 완료되면 원하는 DTME-모노-펩티드 생성물을 분취용 이온 교환 크로마토그래피에 의해 단리한다.
실시예 2: 펩티드로의 뉴클레오티드 기반 동종 2가 링커의 단일 치환
C-말단 시스테인 잔기를 사용한 고체상 합성에 의해 제조된 HIV-1TAT 단백질(YGRKKRRQRRR)의 형질도입 도메인(실시예 1에서와 같음)을 수성 디메틸포름아미드에 용해하고 40배 과량의 5'-O-말레이미도에틸-티미딜릴티미딘-3'-O-에틸말레이미드(MTTM)로 처리하고 생성된 혼합물을 실온에서 교반한다. 반응이 완료되면 원하는 MTTM-모노-펩티드 생성물을 분취용 이온 교환 크로마토그래피에 의해 단리한다.
실시예 3: 펩티드- siRNA 접합체
실시예 1에서 제조된 DTME-모노-(YGRKKRRQRRR) 펩티드 생성물을 물에 용해하고 트랜스티레틴(TTR) mRNA를 표적화하는 말단 티올화된 siRNA로 처리한다. 생성된 펩티드-DTME-TTR 접합체를 크로마토그래피에 의해 단리하고 정제한다.
유기금속 화합물
실시예 4: 유기금속 화합물로의 DTME의 단일 치환
6-메르캅토헥산산을 수성 아세토니트릴에 용해하고 40배 과량의 DTME로 처리한다. 생성된 DTME-모노-티오헥산산 생성물을 분취용 HPLC로 단리하고 무수 테트라히드로푸란에 용해한다. 디시클로헥실 카르보디이미드를 첨가하고 혼합물을 1시간 동안 교반한다. 페로세닐메틸 알코올을 첨가하고 전체를 실온에서 2~3시간 동안 교반한다. 워크업(workup) 후, 원하는 페로세닐메틸 DTME-모노-티오헥사노에이트를 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 단리한다.
실시예 5: 유기금속 화합물로의 뉴클레오티드 기반 동종 2가 링커의 단일 치환
6-메르캅토헥산산을 수성 디메틸포름아미드에 용해하고 40배 과량의 MTTM으로 처리한다. 생성된 MTTM-모노-티오헥산산 생성물을 분취용 HPLC에 의해 단리하고 무수 테트라히드로푸란에 용해한다. 디시클로헥실 카르보디이미드를 첨가하고 혼합물을 1시간 동안 교반한다. 페로세닐메틸 알코올을 첨가하고 전체를 실온에서 2~3시간 동안 교반한다. 워크업 후, 원하는 페로세닐메틸 MTTM-모노-티오헥사노에이트를 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 단리한다.
실시예 6: 유기금속 화합물로의 펩티드 기반 동종 2가 링커의 단일 치환
6-메르캅토헥산산을 수성 디메틸포름아미드에 용해하고 40배 과량의 N,N, 비스-(6-말레이미도헥사노일) 글리신-리신(MGKM)으로 처리한다. 생성된 MGKM-모노-티오헥산산 생성물을 분취용 HPLC에 의해 단리하고 무수 테트라히드로푸란에 용해한다. 디시클로헥실 카르보디이미드를 첨가하고 혼합물을 1시간 동안 교반한다. 페로세닐메틸 알코올을 첨가하고 전체를 실온에서 2~3시간 동안 교반한다. 워크업 후, 원하는 페로세닐메틸 MGKM-모노-티오헥사노에이트를 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 단리한다.
실시예 7: 펩티드-유기금속 접합체
실시예 1에서 C-말단 시스테인 잔기를 사용한 고체상 합성에 의해 제조된 HIV-1TAT 단백질의 형질도입 도메인(YGRKKRRQRRR)을 디메틸포름아미드에 용해하고 실시예 6에서 제조된 페로세닐메틸 MGKM-모노-티오헥사노에이트 유도체로 처리한다. 생성된 펩티드-MGKM-티오헥사노에이트를 크로마토그래피에 의해 단리한다.
항체 화합물
실시예 8: 항체 단편으로의 DTME의 단일 치환
유리 시스테인을 보유하는 항체 단쇄 FV 단편을 이. 콜라이(E. Coli)에서 발현시킨다(Kipriyanov, SM et al; Molecular Immunology, 31, No 14, 1047-1058 (1994)). 항체를 수성 디메틸포름아미드에 용해하고 40배 과량의 디티오비스말레이미도에탄(DTME)으로 처리하고 생성된 혼합물을 실온에서 교반한다. 반응이 완료되면 원하는 DTME-모노-항체 생성물을 분취용 이온 교환 크로마토그래피에 의해 단리한다.
실시예 9: 항체 단편으로의 뉴클레오티드 기반 동종 2가 링커의 단일 치환
실시예 8에서 제조된 유리 시스테인을 보유하는 항체 단쇄 FV 단편을 수성 디메틸포름아미드에 용해하고 40배 과량의 MTTM으로 처리하고 생성된 혼합물을 실온에서 교반한다. 반응이 완료되면 원하는 MTTM-모노-단쇄 FV 생성물을 분취용 크로마토그래피에 의해 단리한다.
실시예 10: 항체 단편- siRNA 접합체
실시예 8에서 생성된 DTME-모노-단쇄 FV 생성물을 물에 용해하고 근긴장성 이영양증 단백질 키나아제(DMPK) mRNA를 표적화하는 말단 티올화된 siRNA로 처리한다. 생성된 FV-DTME-TTR 접합체를 단리하고 크로마토그래피에 의해 정제한다.
소분자 화합물
실시예 11: 소분자로의 DTME의 단일 치환
6-메르캅토헥산산을 수성 아세토니트릴에 용해하고 40배 과량의 DTME로 처리한다. 생성된 DTME-모노-티오헥산산 생성물을 분취용 HPLC에 의해 단리하고 무수 디메틸포름아미드에 용해한다. N-히드록시숙신이미드를 첨가하고 혼합물을 1시간 동안 교반한다. 레날리도마이드를 첨가하고 전체를 실온에서 2-3시간 동안 교반한다. 워크업 후, 원하는 DTME-모노-티오헥사미도-레날리도마이드를 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 단리한다.
실시예 12: 소분자로의 뉴클레오티드 기반 동종 2가 링커의 단일 치환
6-메르캅토헥산산을 수성 디메틸포름아미드에 용해하고 40배 과량의 MTTM으로 처리한다. 생성된 MTTM-모노-티오헥산산 생성물을 분취용 HPLC에 의해 단리하고 무수 디메틸포름아미드에 용해한다. N-히드록시숙신이미드를 첨가하고 혼합물을 1시간 동안 교반한다. 레날리도마이드를 첨가하고 전체를 실온에서 2-3시간 동안 교반한다. 워크업 후, 원하는 MTTM-모노-티오헥사미도-레날리도마이드를 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 단리한다.
실시예 13: 항체 단편- 소분자 접합체
실시예 8에서 제조된 유리 시스테인을 보유하는 항체 단쇄 FV 단편을 수성 디메틸포름아미드에 용해하고 실시예 12에서 제조된 MTTM-모노-티오헥사미도-레날리도마이드 용액에 첨가한다. 반응 완료되면 원하는 단쇄 FV-MTTM-티오헥사미도-레날리도마이드 생성물을 분취용 크로마토그래피에 의해 단리한다.

Claims (109)

  1. 한 말단이 치환기 X에 의해 치환된 동종 2가(homo-bivalent) 공유 링커를 포함하는 화합물로서, X는 핵산 외의 생물학적 모이어티를 포함하고, 동종 2가 링커의 다른 말단은 비치환되고, 상기 화합물은 적어도 75% 순수한 화합물.
  2. 제1항에 있어서, 구조 1을 포함하는 화합물:
    X - R1 - R2 - A - R3 - B (구조 1)
    여기서,
    X는 핵산 외의 생물학적 모이어티를 포함하는 치환기이고;
    R1은 포스포디에스테르, 티오포스포디에스테르, 설페이트, 아미드, 트리아졸, 헤테로아릴, 에스테르, 에테르, 티오에테르, 디설피드, 티오프로피오네이트, 아세탈, 글리콜을 포함하는 기이거나, 존재하지 않고;
    R2는 스페이서 기이거나, 존재하지 않고;
    A는 제1 친핵체와 제1 친전자체의 반응 생성물을 포함하는 기이고;
    R3은 C2-C10 알킬, C2-C10 알콕시, C1-C10 아릴, C2-C10 알킬디티오, 아미드, 에테르, 티오에테르, 에스테르, 올리고뉴클레오티드, 올리고펩티드, 티오프로피오네이트, 또는 디설피드를 포함하는 기이고;
    B는 제2 친핵체 또는 제2 친전자체를 포함하는 기이고, 여기서 제2 친핵체는 제1 친핵체와 동일하고, 제2 친전자체는 제1 친전자체와 동일하다.
  3. 제2항에 있어서, R2는 C2-C10 알킬, C2-C10 알콕시, 또는 C1-C10 아릴을 포함하거나, 존재하지 않는 것인 화합물.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, A의 제1 친핵체 및 제1 친전자체는 (i) 티올 및 말레이미드(임의로 여기서 티올과 말레이미드의 반응 생성물은 숙신남산의 유도체임); (ii) 티올 및 비닐설폰; (iii) 티올 및 피리딜디설피드; (iv) 티올 및 요오도아세트아미드; (v) 티올 및 아크릴레이트; (vi) 아지드 및 알킨; 또는 (vii) 아민 및 카르복실을 포함하는 것인 화합물.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, A는 티올과 말레이미드의 반응 생성물을 포함하는 기이고, 임의로 티올과 말레이미드의 반응 생성물은 숙신남산의 유도체인 화합물.
  6. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, R3은 티오프로피오네이트 또는 디설피드, 올리고뉴클레오티드, 또는 올리고펩티드를 포함하는 기인 화합물.
  7. 제2항에 있어서, 화합물은 구조 2 또는 이의 피롤리딘디온 개환 유도체를 포함하고, 임의로 구조 2의 피롤리딘디온 개환 유도체는 숙신남산의 유도체인 화합물:
    Figure pct00093
    (구조 2).
  8. 제7항에 있어서, R2는 C2-C10 알킬, C2-C10 알콕시, 또는 C1-C10 아릴을 포함하는 스페이서 기인 화합물.
  9. 제7항에 있어서,
    X는 펩티드 또는 단백질, 또는 이의 유도체이고;
    R1 및 R2는 존재하지 않고;
    R3은 티오프로피오네이트, 디설피드, 또는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 기인 화합물.
  10. 제7항에 있어서,
    X는 유기금속 화합물 또는 이의 유도체이고;
    R1은 에스테르기이고;
    R2는 C2-C10 알킬을 포함하는 스페이서 기이고;
    R3은 티오프로피오네이트, 디설피드, 올리고뉴클레오티드, 또는 올리고펩티드를 포함하는 기인 화합물.
  11. 제7항에 있어서,
    X는 소분자 또는 이의 유도체이고;
    R1은 에스테르기이고;
    R2는 C2-C10 알킬을 포함하는 스페이서 기이고;
    R3은 티오프로피오네이트, 디설피드, 올리고뉴클레오티드, 또는 올리고펩티드를 포함하는 기인 화합물.
  12. 제1항에 있어서, 동종 2가 공유 링커는 세포내 조건하에서 절단 가능한 링커를 포함하는 것인 화합물.
  13. 제2항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, R3 기는 세포내 조건하에서 절단 가능한 링커를 포함하는 것인 화합물.
  14. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 치환기 X는 펩티드, 단백질, 지질, 탄수화물, 카르복실산, 비타민, 스테로이드, 리그닌, 소분자, 유기금속 화합물, 또는 전술한 어느 하나의 유도체인 화합물.
  15. 제14항에 있어서, 치환기 X는 펩티드 또는 이의 유도체인 화합물.
  16. 제14항에 있어서, 펩티드는 HIV-1TAT 단백질의 형질도입 도메인, 센티린(Centyrin), 속박된(constrained) 펩티드, pHLIP 펩티드, 또는 이들의 유도체인 화합물.
  17. 제14항에 있어서, 치환기 X는 항체 또는 항체 단편, 또는 이의 유도체인 화합물.
  18. 제17항에 있어서, 항체 단편은 단쇄 가변 단편 또는 이의 유도체인 화합물.
  19. 제14항에 있어서, 치환기 X는 탄수화물 또는 이의 유도체인 화합물.
  20. 제14항에 있어서, 치환기 X는 지방산 또는 이의 유도체인 화합물.
  21. 제14항에 있어서, 치환기 X는 비타민 또는 이의 유도체인 화합물.
  22. 제21항에 있어서, 치환기 X는 토코페롤 또는 엽산, 또는 이의 유도체인 화합물.
  23. 제14항에 있어서, 치환기 X는 콜레스테롤 또는 이의 유도체인 화합물.
  24. 제14항에 있어서, 치환기 X는 (2S,2'S)-2,2'-(카르보닐디이미노)디펜탄디온산(DUPA) 또는 이의 유도체인 화합물.
  25. 제14항에 있어서, 치환기 X는 아니스아미드 또는 이의 유도체인 화합물.
  26. 제14항에 있어서, 치환기 X는 유기금속 화합물 또는 이의 유도체인 화합물.
  27. 제26항에 있어서, 유기금속 화합물은 페로센 또는 이의 유도체인 화합물.
  28. 제14항에 있어서, 치환기 X는 소분자 또는 이의 유도체인 화합물.
  29. 제28항에 있어서, 소분자는 레날리도마이드 또는 이의 유도체인 화합물.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물은 적어도 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% 순수한 화합물.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 따른 화합물을 합성하는 방법으로서, 화합물의 형성을 실질적으로 선호하고 치환기 X의 이량체화를 실질적으로 방지하는 반응 조건하에서 동종 2가 공유 링커를 치환기 X에 커플링시키는 단계를 포함하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 동종 2가 공유 링커를, 동종 2가 공유 링커와 반응성인 작용기를 포함하는 작용화된 치환기 X와 반응시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  33. 제32항에 있어서,
    작용화된 치환기 X는 구조 3을 포함하고:
    X - R1 - R2 - A' (구조 3);
    동종 2가 공유 링커는 구조 4를 포함하고:
    A" - R3- B (구조 4);
    여기서,
    X는 핵산 외의 생물학적 모이어티를 포함하는 치환기이고;
    R1은 포스포디에스테르, 티오포스포디에스테르, 설페이트, 아미드, 트리아졸, 헤테로아릴, 에스테르, 에테르, 티오에테르, 디설피드, 티오프로피오네이트, 아세탈, 글리콜을 포함하는 기이거나, 존재하지 않고;
    R2는 스페이서 기이거나, 존재하지 않고;
    R3은 C2-C10 알킬, C2-C10 알콕시, C1-C10 아릴, C2-C10 알킬디티오, 아미드, 에테르, 티오에테르, 에스테르, 올리고뉴클레오티드, 올리고펩티드, 티오프로피오네이트, 또는 디설피드를 포함하는 기이고;
    A' 및 A"는 함께 제1 친핵체 및 제1 친전자체를 포함하며, 이들은 함께 반응하여 A를 형성하며;
    B는 제2 친핵체 또는 제2 친전자체를 포함하는 기이고, 여기서 제2 친핵체는 제1 친핵체와 동일하고, 제2 친전자체는 제1 친전자체와 동일하며;
    생성된 화합물은 구조 1: X - R1 - R2 - A - R3 - B인
    방법.
  34. 제31항에 있어서, 방법은 동종 2가 공유 링커를 작용화된 R2 말단기와 반응시켜 중간체를 형성하는 단계, 및 이어서 중간체의 작용화된 R2 말단기를, 작용화된 R2 말단기와 반응성인 작용기를 포함하는 작용화된 치환기 X와 반응시켜 R1을 형성하는 단계를 포함하고; 여기서,
    R1은 포스포디에스테르, 티오포스포디에스테르, 설페이트, 아미드, 트리아졸, 헤테로아릴, 에스테르, 에테르, 티오에테르, 디설피드, 티오프로피오네이트, 아세탈, 또는 글리콜을 포함하는 기이고;
    R2는 스페이서 기인
    방법.
  35. 제34항에 있어서,
    동종 2가 공유 링커는 구조 4를 포함하고:
    A"-R3-B (구조 4)
    작용화된 R2 말단기는 구조 5를 포함하고:
    R1'-R2-A' (구조 5)
    작용화된 치환기 X는 구조 6을 포함하고:
    X-R1" (구조 6)
    여기서,
    X는 핵산 외의 생물학적 모이어티를 포함하는 치환기이고;
    R1' 및 R1"은 반응하여 R1을 형성하는 작용기이고;
    R1은 포스포디에스테르, 티오포스포디에스테르, 설페이트, 아미드, 트리아졸, 헤테로아릴, 에스테르, 에테르, 티오에테르, 디설피드, 티오프로피오네이트, 아세탈, 또는 글리콜을 포함하는 기이고;
    R2는 스페이서 기이고;
    R3은 C2-C10 알킬, C2-C10 알콕시, C1-C10 아릴, C2-C10 알킬디티오, 아미드, 에테르, 티오에테르, 에스테르, 올리고뉴클레오티드, 올리고펩티드, 티오프로피오네이트, 또는 디설피드를 포함하는 기이고;
    A' 및 A"는 함께 제1 친핵체 및 제1 친전자체를 포함하며, 이들은 반응하여 A를 형성하고;
    B는 제2 친핵체 또는 제2 친전자체를 포함하는 기이고, 여기서 제2 친핵체는 제1 친핵체와 동일하고, 제2 친전자체는 제1 친전자체와 동일하며;
    생성된 화합물은 구조 1: X - R1 - R2 - A - R3 - B인
    방법.
  36. 제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 치환기 X와 동종 2가 공유 링커의 커플링은 화학량론적 과량의 동종 2가 공유 링커와 작용화된 치환기 X의 희석 용액에서 수행되는 것인 방법.
  37. 제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 치환기 X와 동종 2가 공유 링커의 커플링은 적어도 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 또는 100의 몰 과량의 동종 2가 공유 링커로 수행되는 것인 방법.
  38. 제37항에 있어서, 치환기 X와 동종 2가 공유 링커의 커플링은 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 또는 100의 몰 과량의 동종 2가 공유 링커로 수행되는 것인 방법.
  39. 제31항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 치환기 X와 동종 2가 공유 링커의 커플링은 약 7, 6, 5, 또는 4 미만의 pH에서 수행되는 것인 방법.
  40. 제31항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 치환기 X와 동종 2가 공유 링커의 커플링은 약 7, 6, 5, 또는 4의 pH에서 수행되는 것인 방법.
  41. 제31항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 치환기 X와 동종 2가 공유 링커의 커플링은 물 및 수혼화성 유기 공용매를 포함하는 용액에서 수행되는 것인 방법.
  42. 제41항에 있어서, 수혼화성 유기 공용매는 DMF, NMP, DMSO, 알코올, 또는 아세토니트릴을 포함하는 것인 방법.
  43. 제42항에 있어서, 수혼화성 유기 공용매는 아세토니트릴을 포함하는 것인 방법.
  44. 제41항 또는 제42항에 있어서, 수혼화성 유기 공용매는 용액의 약 10, 15, 20, 25, 30, 40, 또는 50%(v/v)를 구성하는 것인 방법.
  45. 제31항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 치환기 X와 동종 2가 공유 링커의 커플링은 무수 유기 용매를 포함하는 용액에서 수행되는 것인 방법.
  46. 제45항에 있어서, 무수 유기 용매는 디클로로메탄, DMF, DMSO, THF, 디옥산, 피리딘, 알코올, 또는 아세토니트릴을 포함하는 것인 방법.
  47. 제31항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물의 수율은 적어도 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100%인 방법.
  48. 제31항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물의 순도는 적어도 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100%인 방법.
  49. 구조 7을 포함하는 다중접합체(multi-conjugate):
    X●Y (구조 7)
    여기서,
    X는 핵산 외의 생물학적 모이어티를 포함하는 제1 치환기이고;
    Y는 X와 동일하거나 상이한 제2 치환기이고;
    ●는 X와 Y를 연결하는 공유 링커이며, 구조 8을 포함하며:
    - R1 - R2 - A - R3 - A - R2 - R1 - (구조 8)
    여기서,
    각 R1은 독립적으로 포스포디에스테르, 티오포스포디에스테르, 설페이트, 아미드, 트리아졸, 헤테로아릴, 에스테르, 에테르, 티오에테르, 디설피드, 티오프로피오네이트, 아세탈, 글리콜을 포함하는 기이거나, 존재하지 않고;
    각 R2는 독립적으로 스페이서 기이거나, 존재하지 않으며;
    각 A는 동일하고, 친핵체와 친전자체의 반응 생성물을 포함하는 기이고;
    R3은 C2-C10 알킬, C2-C10 알콕시, C1-C10 아릴, C2-C10 알킬디티오, 아미드, 에테르, 티오에테르, 에스테르, 올리고뉴클레오티드, 올리고펩티드, 티오프로피오네이트, 또는 디설피드를 포함하는 기이다.
  50. 제49항에 있어서, Y는 X와 상이한 것인 다중접합체.
  51. 제49항 또는 제50항에 있어서, X는 펩티드, 단백질, 지질, 탄수화물, 카르복실산, 비타민, 스테로이드, 리그닌, 소분자, 유기금속 화합물, 또는 전술한 어느 하나의 유도체인 다중접합체.
  52. 제49항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, Y는 핵산, 펩티드, 단백질, 지질, 탄수화물, 카르복실산, 비타민, 스테로이드, 리그닌, 소분자, 유기금속 화합물, 또는 전술한 어느 하나의 유도체인 다중접합체.
  53. 제49항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, X는 펩티드, 항체(또는 이의 단편), 소분자, 유기금속 화합물, 또는 전술한 어느 하나의 유도체인 다중접합체.
  54. 제53항에 있어서, 펩티드는 HIV-1TAT 단백질의 형질도입 도메인, 센티린, 속박된 펩티드, pHLIP 펩티드, 또는 이들의 유도체인 다중접합체.
  55. 제53항에 있어서, 항체 단편은 단쇄 가변 단편 또는 이의 유도체인 다중접합체.
  56. 제53항에 있어서, 소분자는 레날리도마이드 또는 이의 유도체인 다중접합체.
  57. 제53항에 있어서, 유기금속 화합물은 페로센 또는 이의 유도체인 다중접합체.
  58. 제49항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, Y는 핵산 또는 이의 유도체인 다중접합체.
  59. 제58항에 있어서, Y는 RNA 또는 이의 유도체인 다중접합체.
  60. 제59항에 있어서, Y는 siRNA, saRNA, 또는 miRNA, 또는 이들의 유도체인 다중접합체.
  61. 제60항에 있어서, Y는 siRNA 또는 이의 유도체인 다중접합체.
  62. 제49항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, R3은 세포내 조건하에서 절단 가능한 것인 다중접합체.
  63. 제49항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 다중접합체는 적어도 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% 순수한 다중접합체.
  64. 구조 7의 다중접합체를 합성하는 방법으로서,
    X●Y (구조 7)
    여기서,
    X는 핵산 외의 생물학적 모이어티를 포함하는 제1 치환기이고;
    Y는 X와 동일하거나 상이한 제2 치환기이고;
    ●는 X와 Y를 연결하는 공유 링커이고;
    다음의 단계를 포함하는 방법:
    (a) X-R4를 동종 2가 링커 ○와 반응시켜 단일 치환된 생성물 X-○를 생성하는 단계로서, R4는 단일 치환된 생성물 X-○를 생성하고 X의 이량체화를 실질적으로 방지하는 조건하에서 ○와 반응할 수 있는 작용기인 단계; 및
    (b) X-○를 R5-Y와 반응시킴으로써 X●Y를 형성하는 단계로서, R5는 ○와 반응할 수 있는 작용기인 단계.
  65. 구조 7의 다중접합체를 합성하는 방법으로서,
    X●Y (구조 7)
    여기서,
    X는 핵산 외의 생물학적 모이어티를 포함하는 제1 치환기이고;
    Y는 X와 동일하거나 상이한 제2 치환기이고;
    ●는 X와 Y를 연결하는 공유 링커이고;
    다음의 단계를 포함하는 방법:
    (a) R4-Y를 동종 2가 링커 ○와 반응시켜 단일 치환된 생성물 ○-Y를 생성하는 단계로서, R4는 단일 치환된 생성물 ○-Y를 생성하고 Y의 이량체화를 실질적으로 방지하는 조건하에서 ○와 반응할 수 있는 작용기인 단계; 및
    (b) ○-Y를 X-R5와 반응시킴으로써 X●Y를 형성하는 단계로서, R5는 ○와 반응할 수 있는 작용기인 단계.
  66. 제64항에 있어서, 단계 (a)는 X-R4에 비해 화학량론적 과량의 동종 2가 링커 ○로 수행되는 것인 방법.
  67. 제65항에 있어서, 단계 (a)는 R4-Y에 비해 화학량론적 과량의 동종 2가 링커 ○로 수행되는 것인 방법.
  68. 제64항 또는 제65항에 있어서, 단계 (a)는 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 또는 100의 몰 과량의 동종 2가 링커 ○로 수행되는 것인 방법.
  69. 제64항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)는 물 및 임의로 수혼화성 유기 공용매를 포함하는 용액에서 수행되는 것인 방법.
  70. 제69항에 있어서, 단계 (a)는 약 7, 6, 5, 또는 4의 pH에서 수행되는 것인 방법.
  71. 제69항에 있어서, 수혼화성 유기 공용매는 DMF, DMSO, THF, 디옥산, 피리딘, 알코올, 또는 아세토니트릴을 포함하는 것인 방법.
  72. 제71항에 있어서, 수혼화성 유기 공용매는 아세토니트릴을 포함하는 것인 방법.
  73. 제69항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 수혼화성 유기 공용매는 용액의 약 10, 15, 20, 25, 30, 40, 또는 50%(v/v)를 구성하는 것인 방법.
  74. 제64항 또는 제65항에 있어서, 단계 (a)는 무수 유기 용매를 포함하는 용액에서 수행되는 것인 방법.
  75. 제74항에 있어서, 무수 유기 용매는 디클로로메탄, DMF, DMSO, THF, 디옥산, 피리딘, 알코올, 또는 아세토니트릴을 포함하는 것인 방법.
  76. 제75항에 있어서, 무수 유기 용매는 디옥산을 포함하는 것인 방법.
  77. 제75항에 있어서, 무수 유기 용매는 DMF를 포함하는 것인 방법.
  78. 제75항에 있어서, 무수 유기 용매는 피리딘을 포함하는 것인 방법.
  79. 제64항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, X는 펩티드, 단백질, 지질, 탄수화물, 카르복실산, 비타민, 스테로이드, 리그닌, 소분자, 유기금속 화합물, 또는 전술한 어느 하나의 유도체인 방법.
  80. 제64항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, Y는 핵산, 펩티드, 단백질, 지질, 탄수화물, 카르복실산, 비타민, 스테로이드, 리그닌, 소분자, 또는 전술한 어느 하나의 유도체인 방법.
  81. 제64항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, X는 펩티드, 항체(또는 이의 단편), 소분자, 유기금속 화합물, 또는 전술한 어느 하나의 유도체인 방법.
  82. 제81항에 있어서, 펩티드는 HIV-1TAT 단백질의 형질도입 도메인, 센티린, 속박된 펩티드, pHLIP 펩티드, 또는 이들의 유도체인 방법.
  83. 제81항에 있어서, 항체 단편은 단쇄 가변 단편 또는 이의 유도체인 방법.
  84. 제81항에 있어서, 소분자는 레날리도마이드 또는 이의 유도체인 방법.
  85. 제81항에 있어서, 유기금속 화합물은 페로센 또는 이의 유도체인 방법.
  86. 제64항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, Y는 핵산 또는 이의 유도체인 방법.
  87. 제86항에 있어서, Y는 RNA 또는 이의 유도체인 방법.
  88. 제87항에 있어서, Y는 siRNA, saRNA, 또는 miRNA, 또는 이들의 유도체인 방법.
  89. 제88항에 있어서, Y는 siRNA 또는 이의 유도체인 방법.
  90. 제64항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 공유 링커 ●는 세포내 조건하에서 절단 가능한 것인 방법.
  91. 제64항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 다중 접합체 X●Y의 수율은 적어도 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%인 방법.
  92. 제64항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 다중접합체 X●Y의 순도는 적어도 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%인 방법.
  93. 치환기 X, Y, 및 Z를 포함하는 다중접합체로서, 치환기 각각은 독립적으로 생물학적 모이어티이고, 공유 링커 ●에 의해 또 다른 치환기에 연결되며, 상기 다중접합체는 구조 9를 포함하는 다중접합체:
    Figure pct00094
    (구조 9)
    여기서,
    ▲1, ▲2, ▲3, ▲4 및 ▲5 각각은 독립적으로 존재하지 않거나, 이들 각각의 치환기에 공유 결합된 생물학적 모이어티를 포함하고;
    n은 0 이상의 정수이고;
    구조 9에 존재하는 치환기 중 적어도 하나는 핵산이 아니다.
  94. 제93항에 있어서, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10인 다중접합체.
  95. 제93항 또는 제94항에 있어서, 적어도 하나의 공유 링커 ●는 동종 2가 공유 링커인 다중접합체.
  96. 제93항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, X는 핵산이 아닌 것인 다중접합체.
  97. 제93항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, Y는 핵산이 아닌 것인 다중접합체.
  98. 제93항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 ▲가 존재하는 것인 다중접합체.
  99. 제98항에 있어서, 존재하는 적어도 하나의 ▲는 표적화 리간드이거나; 적어도 2개의 ▲가 존재하고 존재하는 적어도 2개의 ▲ 각각은 표적화 리간드이거나; 적어도 2개의 ▲가 존재하고 존재하는 적어도 2개의 ▲ 각각은 동일한 표적화 리간드이거나; ▲1 및 ▲5가 존재하고 동일한 표적화 리간드인 다중접합체.
  100. 제93항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 공유 링커 ●는 황 함유 공유 링커이고; ▲1, ▲2, ▲3, ▲4 및 ▲5 중 적어도 하나는 황 함유 말단기 Q를 포함하는 것인 다중접합체.
  101. 제100항에 있어서, 황 함유 말단기 Q는 탈보호 조건하에서 탈보호 가능한 보호된 티올기를 포함하고; 황 함유 공유 링커 ●는 탈보호 조건하에서 안정한 것인 다중접합체.
  102. 제100항 또는 제101항에 있어서, 황 함유 공유 링커 ●는 탈보호 조건이 아닌 절단 조건하에서 절단 가능한 절단 가능한 기를 포함하는 것인 다중접합체.
  103. 제100항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 황 함유 말단기 Q는 화학식 S-PG의 보호된 티올기를 포함하는 것인 다중접합체.
  104. 구조 10을 포함하는 다중접합체를 합성하는 방법으로서,
    Figure pct00095
    (구조 10)
    단일 치환된 생성물(구조 10b)을 생성하고 구조 10a의 이량체화를 실질적으로 방지하는 조건하에서 구조 10a의 화합물을 동종 2가 링커와 반응시켜 구조 10b의 화합물을 형성하는 단계;
    구조 10b의 화합물을 구조 10c의 화합물과 반응시켜 구조 10d의 화합물을 형성하는 단계;
    구조 10d의 화합물을 탈보호하여 구조 10e의 화합물을 형성하는 단계; 및
    구조 10e의 화합물을 구조 10f의 화합물과 반응시켜 구조 10을 형성하는 단계
    를 포함하며, 다음과 같은 것인 방법:
    Figure pct00096

    여기서,
    ●는 공유 링커이고;
    ○는 동종 2가 링커이고;
    R4는 구조 10b의 단일 치환된 생성물을 생성하고 구조 10a의 이량체화를 실질적으로 방지하는 조건하에서 동종 2가 링커 ○와 반응하도록 선택된 작용기이고;
    R5는 동종 2가 링커 ○와 반응하도록 선택된 작용기이고;
    S - PG는 구조 10b, 10c 및 10d 내의 임의의 공유 링커 ● 내에 존재하는 임의의 황 함유기와 상이한 황 함유기를 포함하는 보호된 티올기이고;
    Q는 구조 10e의 -SH 기와 반응하여 공유 링커 ●를 형성하도록 선택된 반응성 기이고;
    X, Y, 및 Z는 다중접합체의 치환기이고, 각각은 생물학적 모이어티이고; 임의로 다중접합체에 존재하는 X, Y, 및 Z 중 적어도 하나는 핵산이 아니고;
    Z', Z" 및 Z"'는 다중접합체의 치환기이고, 각각은 생물학적 모이어티이고;
    ▲1, ▲2, ▲3, ▲4 및 ▲5 각각은 독립적으로 존재하지 않거나, 이들 각각의 치환기에 공유 결합된 생물학적 모이어티를 포함하고;
    ▲3', ▲3", 및 ▲3"' 각각은 독립적으로 존재하지 않거나, 이들 각각의 치환기에 공유 결합된 생물학적 모이어티를 포함하고;
    n 은 1 이상인 정수이고, 임의로 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이고;
    n', n", 및 n"'은 각각 0 이상의 정수이며, 단 n' + n" + n"'의 합은 n이다.
  105. 제49항 내지 제63항 및 제93항 내지 제103항 중 어느 한 항의 다중 접합체 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 조성물.
  106. 의약의 제조에 사용하기 위한, 제49항 내지 제63항 및 제93항 내지 제103항 중 어느 한 항의 다중접합체를 포함하는 조성물.
  107. 제49항 내지 제63항 및 제93항 내지 제103항 중 어느 한 항의 다중접합체 또는 제105항의 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체를 치료하는 방법.
  108. 세포에서 하나 이상의 표적 유전자의 활성을 조절하는 방법으로서, 제49항 내지 제63항 및 제93항 내지 제100항 중 어느 한 항에 따른 다중접합체를 세포에 도입하는 단계, 및 다중접합체가 세포에 진입하고 표적 유전자 또는 유전자들의 활성이 조절되는 조건하에 세포를 유지하는 단계를 포함하는 방법.
  109. 세포에서 다중접합체의 활성을 관찰하는 방법으로서, 제49항 내지 제63항 및 제93항 내지 제100항 중 어느 한 항에 따른 다중접합체를 세포에 도입하는 단계, 및 다중접합체가 세포에 진입하고 다중접합체의 활성이 관찰되는 조건하에 세포를 유지하는 단계를 포함하는 방법.
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