TWI680767B - 用於增強的細胞攝取之化合物及方法 - Google Patents

用於增強的細胞攝取之化合物及方法 Download PDF

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Abstract

在此描述了與靶RNA互補的共軛的經修飾之寡核苷酸。該共軛物促進該經修飾之寡核苷酸之細胞攝取，從而引起提高之效力。

Description

用於增強的細胞攝取之化合物及方法
在此提供了用於經修飾之寡核苷酸之增強的細胞攝取之化合物及方法。
用於治療性調節RNA功能之策略經常使用反義寡核苷酸，該等反義寡核苷酸被設計成藉由沃森-克裡克鹼基配對結合RNA靶並且一旦結合靶，則調節它的功能。此類反義寡核苷酸進行了化學修飾成以向該等寡核苷酸賦予希望的藥物動力學及藥效學特性。經修飾之寡核苷酸可以藉由各種機理調節靶RNA，包括涉及該經修飾之寡核苷酸結合該靶RNA並且干擾它的功能而不促進該RNA降解的機理(例如，空間位阻)，以及藉由酶如RNA酶H或阿爾古(Argonaute)2之活性在結合該經修飾之寡核苷酸之後促進該RNA降解之機理。許多類型的RNA可以被選擇作為經修飾之寡核苷酸的靶，包括信使RNA、前信使RNA以及非編碼RNA(如微小RNA)。
微小RNA(MicroRNA或microRNA))(又稱為“成熟微小RNA”)係在植物和動物的基因組中編碼之小型(長度為大約18至24個核苷酸)非編碼RNA分子。在某些情況下，高度保守的內源性表現的微小RNA藉由結合 特定mRNA的3'-非翻譯區(3'-UTR)來調節基因的表現。已在植物和動物中鑒定出了多於1000種不同的微小RNA。某些成熟微小RNA似乎起源於長的內源性初級微小RNA轉錄物(又稱為初級微小RNA、pri-mir、pri-miR或初級先質微小RNA)，該等長的內源性初級微小RNA轉錄物通常長度為數百個核苷酸(李(Lee)等人，歐洲分子生物學雜誌(EMBO J.),2002,21(17),4663-4670)。
在此提供了包含共價連接至共軛部分的經修飾之寡核苷酸之化合物。在某些實施方式中，一化合物具有結構Ln-接頭-X-MO，其中每個L獨立地是配位基，並且n係從1至10；X係磷酸二酯鍵或硫代磷酸酯鍵；並且MO係經修飾之寡核苷酸。
在某些實施方式中，一化合物具有結構Ln-接頭-X1-Nm-X2-MO，其中每個L獨立地是配位基，並且n係從1至10；每個N獨立地是經修飾或未經修飾之核苷，並且m係從1至5；X1和X2各自獨立地是磷酸二酯鍵或硫代磷酸酯鍵；並且MO係經修飾之寡核苷酸。
在某些實施方式中，一化合物具有結構Ln-接頭-X-Nm-Y-MO，其中每個L獨立地是配位基，並且n係從1至10；每個N獨立地是經修飾或未經修飾之核苷，並且m係從1至5；X係磷酸二酯鍵或硫代磷酸酯鍵；Y係磷酸二酯鍵；並且MO係經修飾之寡核苷酸。
在某些實施方式中，一化合物具有結構Ln-接頭-Y-Nm-Y-MO，其中每個 L獨立地是配位基，並且n係從1至10；每個N獨立地是經修飾或未經修飾之核苷，並且m係從1至5；每個Y係磷酸二酯鍵；並且MO係經修飾之寡核苷酸。
在某些實施方式中，如果n大於1，則Ln-接頭具有以下結構：
Figure 103115652-A0202-12-0003-84
其中每個L獨立地是配位基；n係從1至10；S係骨架；並且Q’和Q”獨立地是連接基團。
在某些實施方式中，Q’和Q”各自獨立地選自：肽、醚、聚乙二醇、烷基、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基、取代的C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧基、胺基、醯胺基、吡咯啶、8-胺基-3,6-二氧雜辛酸(ADO)、4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸琥珀醯亞胺酯以及6-胺基己酸。
在某些實施方式中，一骨架將2、3、4或5個配位基連接至經修飾之寡核苷酸上。在某些實施方式中，一骨架將3個配位基連接至經修飾之寡核苷酸上。
在某些實施方式中，一化合物具有以下結構：
Figure 103115652-A0202-12-0003-2
其中： B選自-O-、-S-、-N(RN)-、-Z-P(Z’)(Z”)O-、-Z-P(Z’)(Z”)O-Nm-X-以及-Z-P(Z’)(Z”)O-Nm-Y-；MO係經修飾之寡核苷酸；RN選自H、甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基以及苯甲基；Z、Z’和Z”各自獨立地選自O和S；每個N獨立地是經修飾或未經修飾之核苷；m係從1至5；X選自磷酸二酯鍵和硫代磷酸酯鍵；Y係磷酸二酯鍵；並且波形線表明連接至該接頭和一個或多個配位基的其餘部分。
在某些實施方式中，X係磷酸二酯鍵。
在某些實施方式中，n係從1至5、1至4、1至3、或1至2。在某些實施方式中，n係3。
在某些實施方式中，至少一個配位基係碳水化合物。
在某些實施方式中，至少一個配位基選自：甘露糖、葡萄糖、半乳糖、核糖、阿拉伯糖、果糖、岩藻糖、木糖、D-甘露糖、L-甘露糖、D-半乳糖、L-半乳糖、D-葡萄糖、L-葡萄糖、D-核糖、L-核糖、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-果糖、L-果糖、D-岩藻糖、L-岩藻糖、D-木糖、L-木糖、α-D-呋喃甘露糖、β-D-呋喃甘露糖、α-D-哌喃甘露糖、β-D-哌喃甘露糖、α-D-呋喃葡萄糖、β-D-呋喃葡萄糖、α-D-哌喃葡萄糖、β-D-哌喃葡萄糖、α-D-呋喃半乳糖、 β-D-呋喃半乳糖、α-D-哌喃半乳糖、β-D-哌喃半乳糖、α-D-呋喃核糖、β-D-呋喃核糖、α-D-哌喃核糖、β-D-哌喃核糖、α-D-呋喃果糖、α-D-哌喃果糖、葡糖胺、半乳糖胺、唾液酸、N-乙醯基半乳糖胺。
在某些實施方式中，至少一個配位基選自：N-乙醯基半乳糖胺、半乳糖、半乳糖胺、N-甲醯基半乳糖胺、N-丙醯基-半乳糖胺、N-正丁醯基半乳糖胺以及N-異丁醯基-半乳糖胺。
在某些實施方式中，每個配位基都是N-乙醯基半乳糖胺。
在某些實施方式中，一化合物具有以下結構：
Figure 103115652-A0202-12-0005-3
其中每個N獨立地是經修飾或未經修飾之核苷，並且m係從1至5；X1和X2各自獨立地是磷酸二酯鍵或硫代磷酸酯鍵；並且MO係經修飾之寡核苷酸。
在某些實施方式中，X1和X2中的至少一個係磷酸二酯鍵。在某些實施方式中，X1和X2各自是磷酸二酯鍵。
在某些實施方式中，m係1。在某些實施方式中，m係2。在某些實施方式中，m係2、3、4或5。在某些實施方式中，m係3、4或5。在某些實施 方式中，當m大於1時，Nm的每個經修飾或未經修飾之核苷都可以藉由磷酸二酯核苷間鍵聯或硫代磷酸酯核苷間鍵聯連接至Nm的相鄰的經修飾或未經修飾之核苷上。
在某些實施方式中，Nm係N’pN”，其中每個N’獨立地是經修飾或未經修飾之核苷，並且p係從0至4；並且N”係包含未經修飾之糖部分之核苷。在某些實施方式中，p係0。在某些實施方式中，p係1、2、3或4。
在某些實施方式中，每個N’包含未經修飾之糖部分。在某些實施方式中，每個未經修飾之糖部分獨立地是β-D-核糖或β-D-去氧核糖。在某些實施方式中，N”包含嘌呤核鹼基。在某些實施方式中，至少一個N’包含嘌呤核鹼基。在某些實施方式中，每個嘌呤核鹼基獨立地選自：腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤以及7-甲基鳥嘌呤。在某些實施方式中，N”係β-D-去氧核糖腺苷或β-D-去氧核糖鳥苷。
在某些實施方式中，在p係1、2、3或4的情況下，至少一個N’包含嘧啶核鹼基。在某些實施方式中，N”包含嘧啶核鹼基。在某些實施方式中，每個嘧啶核鹼基獨立地選自：胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶以及5,6-二氫尿嘧啶。
在某些實施方式中，p係1,N’和N”各自是β-D-去氧核糖腺苷，並且N’和N”藉由磷酸二酯核苷間鍵聯連接。在某些實施方式中，p係1,N’和N”各自是β-D-去氧核糖腺苷，並且N’和N”藉由磷酸二酯核苷間鍵聯連接。在某些實施方式中，p係1,N’和N”各自是β-D-去氧核糖腺苷，並且N’和N”藉由 硫代磷酸酯核苷間鍵聯連接。
在此描述的任何該等實施方式中，每個N的糖部分獨立地選自：β-D-核糖、β-D-去氧核糖、2’-O-甲氧基糖、2’-O-甲基糖、2’-氟糖以及雙環糖部分。 在某些實施方式中，每個雙環糖部分獨立地選自cEt糖部分、LNA糖部分以及ENA糖部分。在某些實施方式中，cEt糖部分係S-cEt糖部分。在某些實施方式中，cEt糖部分係R-cEt糖部分。在此描述的任何實施方式中，每個N的糖部分獨立地選自β-D-核糖、β-D-去氧核糖以及2’-氟糖。
在此提供的任何實施方式中，一化合物包含具有與靶RNA互補的核鹼基序列的經修飾之寡核苷酸。在某些實施方式中，該靶RNA係微小RNA。在某些實施方式中，該靶RNA係信使RNA。在某些實施方式中，該靶RNA係前信使RNA。在某些實施方式中，該靶RNA係長的非編碼RNA。在某些實施方式中，該經修飾之寡核苷酸與第二修飾之寡核苷酸雜交，其中該第二修飾之寡核苷酸的核鹼基序列與該經修飾之寡核苷酸的核鹼基序列互補。在某些實施方式中，該靶RNA係人靶RNA。
在某些實施方式中，該經修飾之寡核苷酸的核鹼基序列與該靶RNA之核鹼基序列至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%互補。
在某些實施方式中，該經修飾之寡核苷酸的核鹼基序列與微小RNA的核鹼基序列部分相同。在某些實施方式中，該經修飾之寡核苷酸的核鹼基序列與該微小RNA的核鹼基序列至少90%、至少95%或100%相同。
在某些實施方式中，該微小RNA係人微小RNA。
在某些實施方式中，該經修飾之寡核苷酸由7至10個、7至12個、8至25個、12至25個、15至25個、15至22個、或17至22個連接之核苷組成。
在某些實施方式中，該經修飾之寡核苷酸包含具有經修飾之糖部分的至少一個核苷。在某些實施方式中，該經修飾之寡核苷酸的每個核苷都包含經修飾之糖部分。在某些實施方式中，該經修飾之寡核苷酸包含具有經修飾之糖部分的多個核苷和具有未經修飾之糖部分的多個核苷。在某些實施方式中，每個經修飾之糖部分都是相同的經修飾之糖部分。在某些實施方式中，每個經修飾之糖部分獨立地選自：2’-O-甲基糖部分、2’-O-甲氧基乙基糖部分、2’-氟糖部分以及雙環糖部分。在某些實施方式中，每個雙環糖部分獨立地選自cEt糖部分和LNA糖部分。在某些實施方式中，每個未經修飾之糖部分獨立地選自β-D-去氧核糖和β-D-核糖。在某些實施方式中，該經修飾之寡核苷酸包含多個非雙環核苷和多個雙環核苷。在某些實施方式中，每個非雙環核苷都具有相同類型的糖部分。在某些實施方式中，至少兩個非雙環核苷包含彼此不同的糖部分。在某些實施方式中，每個非雙環核苷獨立地選自β-D-去氧核糖核苷、β-D-核糖核苷、2’-O-甲基核苷、2’-O-甲氧基乙基核苷以及2’-氟核苷。在某些實施方式中，每個雙環核苷都具有相同類型的糖部分。在某些實施方式中，至少兩個雙環核苷具有彼此不同之糖部分。在某些實施方式中，每個雙環核苷獨立地選自cEt核苷和LNA核苷以及ENA核苷。在某些 實施方式中，每個cEt核苷都是S-cEt核苷。
在某些實施方式中，該經修飾之寡核苷酸的至少一個鍵聯係經修飾之核苷間鍵聯。在某些實施方式中，該經修飾之寡核苷酸的每個核苷間鍵聯都是經修飾之核苷間鍵聯。在某些實施方式中，經修飾之核苷間鍵聯係硫代磷酸酯核苷間鍵聯。
在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸包含經修飾之核鹼基。
在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸包含5-甲基胞嘧啶。在某些實施方式中，該經修飾之寡核苷酸的每個胞嘧啶都是5-甲基胞嘧啶。
在此提供了包括使細胞與在此提供的任何該等化合物相接觸之方法。在某些實施方式中，該細胞係在體內。在某些實施方式中，該細胞係在體外。在某些實施方式中，該細胞係肝臟細胞。在某些實施方式中，該細胞係肝細胞。
在此提供了包括提高經修飾之寡核苷酸的效力之方法，該方法包括a.形成具有結構Ln-接頭-X-Nm-X-MO之化合物，其中每個L獨立地是配位基，並且n係從1至10；每個N獨立地是經修飾或未經修飾之核苷，並且m係從1至5；每個X獨立地是磷酸二酯鍵或硫代磷酸酯鍵；並且MO係經修飾之寡核苷酸；並且b.從而相對於未共軛的經修飾之寡核苷酸，提高該經修飾之寡核苷酸之效力。
在此提供了一種製備具有以下結構的化合物之方法：
Figure 103115652-A0202-12-0010-4
其中每個N獨立地是經修飾或未經修飾之核苷，並且m係從1至5；X1和X2各自獨立地是磷酸二酯鍵或硫代磷酸酯鍵；並且MO係經修飾之寡核苷酸，該方法包括以下步驟：提供含有如在化學式IV中所示的共軛物之固體載體；
Figure 103115652-A0202-12-0010-5
在有效產生反應性羥基的條件下將DMT基團去保護；進行順次的亞磷醯胺偶合步驟以形成Nm；進行順次的亞磷醯胺偶合步驟以形成該經修飾之寡核苷酸；並且使該共軛的經修飾之寡核苷酸從該固體載體上釋放。
在此提供了包括向受試者施用在此提供的化合物之方法。在某些實施方 式中，該受試者係人。在某些實施方式中，該化合物存在於藥物組合物中。在某些實施方式中，該受試者患有與存在於肝臟細胞中的靶RNA相關的疾病。
在此提供的任何化合物可以用於治療中。
圖1.包含三個GalNAc配位基的共軛部分之結構。
圖2A、2B和2C.共軛的經修飾之寡核苷酸結構。
圖3A和3B. GalNAc共軛的抗miR-122修飾之寡核苷酸之體內效力。
圖4A和4B. GalNAc共軛的抗miR-122修飾之寡核苷酸之體內效力。
圖5A、5B和5C. GalNAc共軛的抗miR-122修飾之寡核苷酸之體內效力。
圖6A和6B. GalNAc共軛的抗miR-122修飾之寡核苷酸之體內效力。
圖7A和7B. GalNAc共軛的抗miR-122經修飾之寡核苷酸之體內效力。
圖8A和8B. GalNAc共軛的抗miR-122經修飾之寡核苷酸之體內效力。
圖9A和9B. GalNAc共軛的抗miR-21經修飾之寡核苷酸之肝臟濃度。
除非以另外方式定義，否則在此使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬領域之普通技術人員的通常理解相同的含義。除非提供了具體定義，否則與在此描述的分析化學、合成有機化學以及醫學和藥物化學結合使用之 術語以及其程序和技術係本領域中熟知並且通常使用的。針對在此的術語存在多個定義的情況下，此部分中的定義優先。化學合成、化學分析、藥物製備、配製和遞送以及治療受試者可以使用標準技術。某些技術和程序可以例如在桑薇(Sangvi)和科克(Cook)編輯的“反義研究中的碳水化合物修飾(Carbohydrate Modifications in Antisense Research)”，美國化學學會(American Chemical Society)，華盛頓哥倫比亞特區(Washington D.C.),1994；和“雷明頓的藥物科學(Remington's Pharmaceutical Sciences)，”麥克出版有限公司(Mack Publishing Co.)，伊斯頓(Easton)，賓夕法尼亞州(Pa.)，第18版，1990中找到；並且出於任何目的，該等參考文件特此藉由引用結合。在允許的情況下，貫穿在此的整個揭露內容所涉及的所有的專利、專利申請、公佈的申請和出版物、GENBANK序列、網站以及其他公開的材料，除非另外指出，否則藉由引用以其全部內容結合。應當理解，在提及URL或其他此類識別符或位址的情況下，此類識別字會變化，並且網際網路上的具體資訊也會運行命令，但是等效資訊可以藉由搜索網際網路來找到。如此提及證明了此種資訊之可用性和公眾傳播。
在揭露和描述本發明的該等組合物和方法之前，應當理解在此使用的術語僅是出於描述具體實施方式之目的而不欲具有限制性。必須指出，如在說明書和所附申請專利範圍中所使用，單數形式“一個/一種(a/an)”和“該(the)”包括複數個指示物，除非上下文另外清楚地指明。
定義
“靶核酸”意指寡核苷酸被設計成與其進行雜交之核酸。
“靶RNA”意指寡核苷酸與其互補的RNA。
“靶向”意指將與靶核酸雜交的核鹼基序列之設計和選擇過程。
“對......靶向”意指具有將允許與靶核酸雜交之核鹼基序列。
“靶接合”意指寡核苷酸與它所互補的微小RNA以改變該微小RNA的活性、表現或水平的方式相互作用。在某些實施方式中，靶接合意指抗miR與它所互補的微小RNA相互作用以使得該微小RNA的活性被抑制。
“調節”意指干擾功能、量或活性。在某些實施方式中，調節意指功能、量或活性增加。在某些實施方式中，調節意指功能、量或活性減少。
“表現”意指基因之編碼資訊轉變成存在於細胞中並且在細胞中起作用的結構所借助之任何功能和步驟。
“5’靶位點”意指與特定寡核苷酸的最3’端核鹼基互補的靶核酸之核鹼基。
“3’靶位點”意指與特定寡核苷酸的最5’端核鹼基互補的靶核酸之核鹼基。
“區”意指核酸內的連接的核苷的一部分。在某些實施方式中，寡核苷酸具有與靶核酸的區互補之核鹼基序列。例如，在某些實施方式中，寡核苷酸與微小RNA莖環序列的區互補。在某些實施方式中，寡核苷酸與微小RNA莖環序列的區完全互補。
“區段”意指區的較小或子部分。
“微小RNA”意指長度介於18與25個之間的核鹼基的內源性非編碼RNA，該內源性非編碼RNA係由酶Dicer裂解先質微小RNA的產物。成熟的微小RNA之實例可在稱為miRBase(http：//microrna.sanger.ac.uk/)的微小RNA數據庫中找到。在某些實施方式中，微小RNA縮寫為“微小RNA”或“miR”。
“先質微小RNA”或“先質miR”意指具有髮夾結構之非編碼RNA，該非編碼RNA係由稱為Drosha的雙股RNA特異性核糖核酸酶裂解先質miR的產物。
“莖環序列”意指具有髮夾結構並且含有成熟微小RNA序列之RNA。先質微小RNA序列和莖環序列可以重疊。莖環序列的實例可在稱為miRBase(http：//microrna.sanger.ac.uk/)的微小RNA數據庫中找到。
“初級微小RNA”或“初級miR”意指具有髮夾結構的非編碼RNA，該非編碼RNA係雙股RNA特異性核糖核酸酶Drosha之底物。
“微小RNA先質”意指起源于基因組DNA並且包含含有一個或多個微小RNA序列非編碼結構RNA之轉錄物。例如，在某些實施方式中，微小RNA先質係先質微小RNA。在某些實施方式中，微小RNA先質係初級微小RNA。
“微小RNA調節的轉錄物”意指由微小RNA調節之轉錄物。
“單順反子轉錄物”意指含有單個微小RNA序列之微小RNA先質。
“多順反子轉錄物”意指含有兩個或更多個微小RNA序列之微小RNA先 質。
“種子序列”意指包含成熟微小RNA序列的5’-末端的核鹼基1至9的6至8個連續核鹼基之核鹼基序列。
“種子匹配序列”意指與種子序列互補並且長度與該種子序列相同之核鹼基序列。
“抗miR”意指具有與微小RNA互補的核鹼基序列之寡核苷酸。在某些實施方式中，抗miR係經修飾之寡核苷酸。
“抗miR-X”(其中“miR-X”表示一種具體微小RNA)意指具有與miR-X互補的核鹼基序列之寡核苷酸。在某些實施方式中，抗miR-X與miR-X完全互補。在某些實施方式中，抗miR-X與miR-X至少80%、至少85%、至少90%或至少95%互補。在某些實施方式中，抗miR-X係經修飾之寡核苷酸。
“完全經修飾之寡核苷酸”意指每個核鹼基、每種糖和/或每個核苷間鍵聯都被修飾。
“均一經修飾之寡核苷酸”意指每個核鹼基、每種糖和/或每個核苷間鍵聯在整個該經修飾之寡核苷酸中具有相同之修飾。
“缺口體(Gapmer)”意指在連接的核苷的兩個外部區之間安置有連接的β-D-去氧核糖核苷的內部區的經修飾之寡核苷酸，其中每個外部區的每個核苷都包含經修飾之糖部分。該等β-D-去氧核糖核苷可以具有或可以不具有經修飾之核鹼基。
“缺口”係位於該等外部區之間的缺口體之內部區。
“翼”係與缺口體的內部區的5’或3’末端相鄰的缺口體之外部區。
“對稱缺口體”意指每個外部區的每個核苷都包含相同的糖修飾。
“不對稱缺口體”意指一個外部區的每個核苷都包含第一糖修飾，並且另一個外部區的每個核苷都包含第二糖修飾。
“核鹼基序列”意指無關任何糖、鍵聯和/或核鹼基修飾，典型地以5’至3’方向列出的低聚化合物或核酸中的連續核鹼基的順序。
“連續核鹼基”意指在核酸中彼此緊鄰的核鹼基。
“核鹼基互補性”意指兩個核鹼基經由氫鍵結非共價配對的能力。
“互補”意指一種核酸能夠與另一種核酸或寡核苷酸雜交。在某些實施方式中，互補係指寡核苷酸能夠與靶核酸雜交。
“完全互補”意指寡核苷酸的每個核鹼基能夠與靶核酸中的每個對應位置上的核鹼基配對。在某些實施方式中，寡核苷酸與微小RNA完全互補，即，該寡核苷酸的每個核鹼基與該微小RNA中的對應位置上的核鹼基互補。在某些實施方式中，每個核鹼基與微小RNA莖環序列的區內的核鹼基具有互補性的寡核苷酸與該微小RNA莖環序列完全互補。
“互補性百分比”意指寡核苷酸中與靶核酸的等長部分互補的核鹼基百分比。藉由將該寡核苷酸中與該靶核酸中的對應位置上的核鹼基互補的核鹼基數除以該寡核苷酸中的核鹼基總數來計算互補性百分比。
“同一性百分比”意指第一核酸中與第二核酸中的對應位置上的核鹼基相同之核鹼基數除以該第一核酸中之核鹼基總數。在某些實施方式中，該第一 核酸係微小RNA並且該第二核酸係微小RNA。在某些實施方式中，該第一核酸係寡核苷酸並且該第二核酸係寡核苷酸。
“雜交”意指藉由核鹼基互補性發生的互補核酸之退火。
“錯配”意指第一核酸中不能夠與第二核酸的對應位置上的核鹼基發生配對之鹼基。
在核鹼基序列背景下的“相同”意指無關糖、鍵聯和/或核鹼基修飾和無關存在的任何嘧啶的甲基狀態，具有相同的核鹼基序列。
“低聚化合物”意指包含多個連接的單體亞單元的化合物。低聚化合物包括寡核苷酸。
“寡核苷酸”意指包含多個連接之核苷的化合物，該等連接的核苷可以各自獨立地是經修飾或未經修飾的。
“天然存在的核苷間鍵聯”意指核苷之間的3’至5’磷酸二酯鍵。
“核苷間鍵聯”意指相鄰核苷之間之共價鍵。
“連接的核苷”意指藉由共價鍵聯接之核苷。
“核鹼基”意指能夠與另一個核鹼基非共價配對之雜環部分。
“核苷”意指連接至糖部分之核鹼基。
“核苷酸”意指具有共價連接至核苷的糖部分的磷酸酯基團之核苷。
“包含由許多連接之核苷組成的經修飾之寡核苷酸之化合物”意指包括具有指定數目的連接的核苷的經修飾之寡核苷酸之化合物。因此，該化合物可以包括另外的取代基或共軛物。除非另外指明，否則該化合物不包括超出該 經修飾之寡核苷酸的核苷的任何另外核苷。
“經修飾之寡核苷酸”意指相對于天然存在的末端、糖、核鹼基和/或核苷間鍵聯具有一個或多個經修飾之寡核苷酸。經修飾之寡核苷酸可以包含未經修飾之核苷。
“單股經修飾之寡核苷酸”意指不與互補股雜交的經修飾之寡核苷酸。
“經修飾之核苷”意指與天然存在的核苷相比具有任何變化的核苷。經修飾之核苷可以具有經修飾之糖和未經修飾之核鹼基。經修飾之核苷可以具有經修飾之糖和經修飾之核鹼基。經修飾之核苷可以具有天然糖和經修飾之核鹼基。
“2’-修飾之核苷”意指當位置係在2-去氧核糖或核糖中編號時，包含在等效於呋喃糖基環的2’位置的位置上具有任何經修飾之糖之核苷。應當理解，2’-修飾之核苷包括但不限於包含雙環糖部分的核苷。
“經修飾之核苷間鍵聯”意指與天然存在的核苷間鍵聯相比的任何變化。
“硫代磷酸酯核苷間鍵聯”意指其中非橋聯原子之一係硫原子的核苷之間的鍵聯。
“硫代磷酸酯鍵”意指具有與硫代磷酸酯核苷間鍵聯例如-OP(O)(S)O-相同的結構的兩個化學部分之間之鍵聯。
“磷酸二酯鍵”意指具有與磷酸二酯核苷間鍵聯例如-OP(O)2O-相同的結構的兩個化學部分之間之鍵聯。
“未經修飾之核鹼基”意指RNA或DNA的天然存在的雜環鹼基：嘌呤鹼 基腺嘌呤(A)和鳥嘌呤(G)；以及嘧啶鹼基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)(包括5-甲基胞嘧啶)和尿嘧啶(U)。
“5-甲基胞嘧啶”意指包含連接至5位置上的甲基的胞嘧啶。
“經修飾之核鹼基”意指不是未經修飾之核鹼基之任何核鹼基。
“呋喃糖基”意指包含由四個碳原子和一個氧原子組成的5員環結構。
“天然存在的呋喃糖基”意指如在天然存在的RNA中發現的呋喃核糖基或如在天然存在的DNA中發現的呋喃去氧核糖基。
“糖部分”意指天然存在的呋喃糖基或修飾的糖部分。
“經修飾之糖部分”意指取代的糖部分或糖替代物。
“取代的糖部分”意指不是天然存在的呋喃糖基的呋喃糖基。取代的糖部分包括但不限於在天然存在的呋喃糖基的2’-位置、5’-位置和/或4’-位置上包含經修飾之糖部分。某些取代的糖部分係雙環糖部分。
“糖替代物”意指不包含呋喃糖基並且能夠替代核苷的天然存在的呋喃糖基的結構，這樣使得所得到的核苷能夠(1)結合到寡核苷酸中並且(2)與互補核苷雜交。此類結構包括該呋喃糖基的相對簡單的變化，如環包含不同的原子數(例如，4員環、6員環或7員環)；該呋喃糖基的氧置換為非氧原子(例如，碳、硫或氮)；或原子數變化和氧置換這兩者。此類結構還可以包含與針對取代的糖部分所描述的那些取代相對應的取代(例如，6元碳環雙環糖替代物可隨意地包含另外的取代基)。糖替代物還包括更複雜的糖置換(例如，肽核酸的非環體系)。糖替代物包括但不限於嗎啉化合物、環己烯 化合物和環己六醇化合物。
“β-D-去氧核糖”意指天然存在之DNA糖部分。
“β-D-核糖”意指天然存在之RNA糖部分。
“2’-O-甲基糖”或“2’-OMe糖”意指在2’位置上具有O-甲基修飾之糖。
“2’-O-甲氧基乙基糖”或“2’-MOE糖”意指在2’位置上具有O-甲氧基乙基修飾之糖。
“2’-O-氟基”或“2’-F”意指在2’位置上具有氟基修飾之糖。
“雙環糖部分”意指包含4至7員環的經修飾之糖部分(包括但不限於呋喃糖基)，該經修飾之糖部分包含連接該4至7員環的兩個原子的橋聯以形成第二環，從而產生雙環結構。在某些實施方式中，該4至7員環係糖環。在某些實施方式中，該4至7員環係呋喃糖基。在某些此類實施方式中，該橋聯連接該呋喃糖基的2’-碳和4’-碳。非限制的示例性雙環糖部分包括LNA、ENA、cEt、S-cEt和R-cEt。
“鎖核酸(LNA)糖部分”意指在4’呋喃糖環原子與2’呋喃糖環原子之間包含(CH2)-O橋聯的取代之糖部分。
“ENA糖部分”意指在4’呋喃糖環原子與2’呋喃糖環原子之間包含(CH2)2-O橋聯的取代之糖部分。
“約束乙基(cEt)糖部分”意指在4'呋喃糖環原子與2'呋喃糖環原子之間包含CH(CH3)-O橋聯的取代之糖部分。在某些實施方式中，該CH(CH3)-O橋聯約束為S方向。在某些實施方式中，該CH(CH3)-O橋聯約束為R方向。
“S-cEt糖部分”意指在4'呋喃糖環原子與2'呋喃糖環原子之間包含S-約束的CH(CH3)-O橋聯的取代之糖部分。
“R-cEt糖部分”意指在4'呋喃糖環原子與2'呋喃糖環原子之間包含R-約束的CH(CH3)-O橋聯的取代之糖部分。
“2’-O-甲基核苷”意指具有2’-O-甲基糖修飾的經修飾之核苷。
“2’-O-甲氧基乙基核苷”意指具有2’-O-甲氧基乙基糖修飾的經修飾之核苷。2’-O-甲氧基乙基核苷可以包含經修飾或未經修飾之核鹼基。
“2’-氟核苷”意指具有2’-氟基糖修飾的經修飾之核苷。2’-氟核苷可以包含經修飾或未經修飾之核鹼基。
“雙環核苷”意指具有雙環糖部分的經修飾之核苷。雙環核苷可以具有經飾或未經修飾之核鹼基。
“cEt核苷”意指包含cEt糖部分的核苷。cEt核苷可以包含經修飾或未經修飾之核鹼基。
“S-cEt核苷”意指包含S-cEt糖部分之核苷。
“R-cEt核苷”意指包含R-cEt糖部分之核苷。
“非雙環核苷”意指具有除雙環糖以外的糖之核苷。在某些實施方式中，非雙環核苷包含天然存在的糖。在某些實施方式中，非雙環核苷包含經修飾之糖。在某些實施方式中，非雙環核苷係β-D-去氧核糖核苷。在某些實施方式中，非雙環核苷係2’-O-甲氧基乙基核苷。
“β-D-去氧核糖核苷”意指天然存在的DNA核苷。
“β-D-核糖核苷”意指天然存在的RNA核苷。
“LNA核苷”意指包含LNA糖部分的核苷。
“ENA核苷”意指包含ENA糖部分的核苷。
“基序”意指寡核苷酸中的經修飾和/或未經修飾之核鹼基、糖和/或核苷間鍵聯的型態。在某些實施方式中，基序係核苷型態。
“核苷型態”意指在寡核苷酸或其區中的核苷修飾之型態。核苷型態係描述核苷修飾在寡核苷酸中的排列之基序。
“穩定性修飾”意指在核酸酶存在下，相對於藉由由磷酸二酯核苷間鍵聯連接的2’-去氧核苷提供的穩定性，為經修飾之寡核苷酸提供增強的穩定性的對核苷之修飾。例如，在某些實施方式中，穩定性修飾係穩定性核苷修飾。在某些實施方式中，穩定性修飾係核苷間鍵聯修飾。
“穩定性核苷”意指相對於2’-去氧核苷提供的核酸酶穩定性，被修飾以對寡核苷酸提供增強的核酸酶穩定性的核苷。在一個實施方式中，穩定性核苷係2’-修飾的核苷。
“穩定性核苷間鍵聯”意指相對於磷酸二酯核苷間鍵聯提供的核苷酶穩定性，為寡核苷酸提供提高的核酸酶穩定性的核苷間鍵聯。在一個實施方式中，穩定性核苷間鍵聯係硫代磷酸酯核苷間鍵聯。
如在此所使用的“連接基團”係指經由一個或多個共價鍵將第一化學實體連接至第二化學實體之原子或原子團。
如在此所使用的“接頭”係指經由一個或多個共價鍵將一個或多個配位基 連接至經修飾或未經修飾之核苷之原子或原子團。該經修飾或未經修飾之核苷可以是如在此所描述的經修飾之寡核苷酸之部分，或可以藉由磷酸二酯或硫代磷酸酯鍵連接至經修飾之寡核苷酸。在一些實施方式中，該接頭將一個或多個配位基連接至經修飾之寡核苷酸之3’末端。在一些實施方式中，該接頭將一個或多個配位基連接至經修飾之寡核苷酸之5’末端。在一些實施方式中，該接頭將一個或多個配位基連接至經修飾或未經修飾之核苷，該經修飾或未經修飾之核苷被連接至經修飾之寡核苷酸之3’末端。在一些實施方式中，該接頭將一個或多個配位基連接至經修飾或未經修飾之核苷，該經修飾或未經修飾之核苷被連接至經修飾之寡核苷酸之5’末端。當該接頭將一個或多個配位基連接至經修飾之寡核苷酸之3’末端或被連接至經修飾之寡核苷酸之3’末端的經修飾或未經修飾之核苷時，在一些實施方式中，該接頭的連接點可以是經修飾或未經修飾之糖部分之3’碳。當該接頭將一個或多個配位基連接至經修飾之寡核苷酸之5’末端或被連接至經修飾之寡核苷酸之5’末端的經修飾或未經修飾之核苷時，在一些實施方式中，該接頭的連接點可以是經修飾或未經修飾之糖部分之5’碳。
“受試者”意指選擇用於治療或療法的人或非人動物。
“有需要的受試者”意指其中受試者被鑒定為有療法或治療需要之狀態。
“疑似患有的受試者”意指展現出疾病的一個或多個臨床指標之受試者。
“施用”意指向受試者提供藥劑或組合物，並且包括但不限於由醫學專家施用和自施用。
“腸胃外施用”意指藉由注射或輸注施用。
腸胃外施用包括但不限於皮下施用、靜脈內施用或肌肉內施用。
“皮下施用”意指在皮膚下方施用。
“靜脈內施用”意指施用進入靜脈中。
“心臟內施用”意指施用進入心臟中。在某些實施方式中，心臟內施用憑藉導管進行。在某些實施方式中，心臟內施用憑藉開放性心臟手術進行。
“肺部施用”意指向肺施用。
“同時施用”係指以任何方式共同施用兩種藥劑，其中這兩種藥劑之藥理學作用同時在患者中顯現。同時施用不要求以單一的藥物組合物、以相同劑型或藉由相同的施用途徑來施用兩種藥劑。這兩種藥劑之作用本身不需要同時顯現出來。該等作用僅需要一段時間重疊並且不需要共延。
“持續時間”意指活性或事件持續的一段時間。在某些實施方式中，治療之持續時間係施用藥劑或藥物組合物之劑量之一段時間。
“療法”意指疾病治療方法。在某些實施方式中，療法包括但不限於化學療法、放射療法或施用藥劑。
“治療”意指施加用於治癒或改善疾病的一種或多種特定程序。在某些實施方式中，該特定程序係施用一種或多種藥劑。
“改善”意指減輕病狀或疾病的至少一個指標之嚴重性。在某些實施方式中，改善包括延緩或減慢病狀或疾病的一個或多個指標之進展。可以藉由熟習該項技術者已知的主觀測量或客觀測量來確定指標之嚴重性。
“處於發展之風險”意指受試者易於發展病狀或疾病之狀態。在某些實施方式中，處於發展病狀或疾病的風險之受試者展現出該病狀或疾病的一種或多種症狀，但是沒有展現出診斷患有該病狀或疾病的足夠數量之症狀。在某些實施方式中，處於發展病狀或疾病的風險的一受試者展現出該病狀或疾病的一種或多種症狀，但達到診斷該病狀或疾病所要求的較低程度。
“預防發作”意指在處於發展該疾病或病狀的危險的受試者中預防病狀或疾病的發展。在某些實施方式中，處於發展該疾病或病狀的風險的受試者接受與已經患有該疾病或病狀的受試者所接受的治療類似之治療。
“延緩發作”意指在處於發展該疾病或病狀的風險的受試者中延緩病狀或疾病之發展。在某些實施方式中，處於發展該疾病或病狀的風險的受試者接受與已經患有該疾病或病狀之受試者所接受的治療類似之治療。
“治療劑”意指用於治癒、改善或預防疾病之藥劑。
“劑量”意指在單次施用中提供的藥劑之指定量。在某些實施方式中，劑量可以兩個或更多個大丸劑、片劑或注射劑形式施用。例如，在某些實施方式中，在希望皮下施用情況下，所希望之劑量要求不是藉由單次注射容易地提供之體積。在此類實施方式中，可以使用兩次或更多次注射達到所希望之劑量。在某些實施方式中，劑量可以兩次或更多次注射施用以使個體體內之注射部位反應減到最小。
“劑量單位”意指提供藥劑之形式。在某些實施方式中，劑量單位係含有凍乾之寡核苷酸之小瓶。在某些實施方式中，劑量單位係含有復原之寡核苷 酸之小瓶。
“治療有效量”係指對動物提供治療益處的藥劑之量。
“藥物組合物”意指包括藥劑的適合用於向個體施用的物質之混合物。例如，藥物組合物可以包含無菌水溶液。
“藥劑”意指當向受試者施用時提供治療作用的物質。
“活性藥物成分”意指藥物組合物中提供希望的作用的物質。
“改善的肝臟功能”意指趨向于正常限制之肝臟功能變化。在某些實施方式中，藉由測量存在於受試者的血液中的分子來評價肝臟功能。例如，在某些實施方式中，藉由血液肝轉胺酶水平降低來測量改善之肝功能。
“可接受之安全性特徵”意指處於臨床上可接受的限制之內的副作用之型態。
“副作用”意指除希望的作用以外的可歸因於治療之生理反應。在某些實施方式中，副作用包括但不限於：注射部位反應、肝功能測試異常、腎功能異常、肝毒性、腎毒性、中樞神經系統異常以及肌病。此類副作用可以被直接或間接檢測。例如，血清中的轉胺酶水平增加可以表明肝毒性或肝功能異常。例如，膽紅素增加可以表明肝毒性或肝功能異常。
“注射部位反應”意指在個體之注射部位處的皮膚之炎症或異常發紅。
“受試者依從性”意指受試者對建議或規定的療法之順從性。
“遵從”意指受試者對建議的療法順從。
“建議的療法”意指醫學專家針對治療、改善或預防疾病所建議之治療。
綜述
經修飾之寡核苷酸之活性基於在經修飾之寡核苷酸與它的靶RNA之間發生並且產生希望的藥理學端點之特定雜交事件。為了這個事件發生，必須進行某些藥物動力學過程，例如將完整的藥物遞送至靶細胞或組織，並且使該經修飾之寡核苷酸進入到含有該靶RNA的細胞中。經修飾之寡核苷酸可以被共軛至改進向該靶細胞或組織的遞送和/或該寡核苷酸的細胞攝取的一個或多個部分，最終產生增強的效力。例如，可以藉由使用作為細胞表面受體的配位基的共軛物來實現化合物之細胞攝取增加。共軛至外源分子(例如，藥物)之配位基與它的細胞表面受體結合導致受體介導的該共軛分子的內吞作用，從而促進該外源分子的跨膜轉運。例如，可以藉由將包含碳水化合物部分之共軛物共價連接至經修飾之寡核苷酸上來實現向肝細胞之靶向遞送。當存在於肝細胞表面上的去唾液酸糖蛋白受體識別並結合該碳水化合物部分時，該共軛的經修飾之寡核苷酸轉運穿過細胞膜進入肝細胞中。藉由以這種方式改進遞送，可以增強該經修飾之寡核苷酸之效力，因為僅需要較低劑量化合物來實現希望之藥理學端點。
在此描述的某些共軛物具有以下優點：向靶細胞類型提供改進的遞送並且還在體內可裂解以在體內施用時產生未共軛的經修飾之寡核苷酸。如上所述，可以藉由使用共軛部分來增強向特定組織或細胞類型體內靶向。然而，一旦該共軛的經修飾之寡核苷酸到達它的作用位點，存在所有或部分之共價連接之共軛部分可能改變某些共軛的經修飾之寡核苷酸的活性或可能影響理 解該經修飾之寡核苷酸之某些藥物動力學特性(如在靶細胞中的半衰期)所要求之分析。因此，可能需要施用包含連接至共軛部分上的經修飾之寡核苷酸的化合物，該經修飾之寡核苷酸足夠穩定以提高細胞攝取而且一旦該化合物被靶細胞內化，則允許該共軛部分裂解。因此，在此提供了包含連接至可裂解的共軛部分的經修飾之寡核苷酸之化合物，該等化合物提高了該經修飾之寡核苷酸的效力並且允許該經修飾之寡核苷酸以其未共軛的形式部分或完全釋放。
某些共軛化合物
在某些實施方式中，在此提供的一化合物包含連接至經修飾之寡核苷酸的5’末端或3’末端上之共軛部分。在某些實施方式中，該化合物包含連接至經修飾之寡核苷酸之3’末端上之共軛部分。在某些實施方式中，該化合物包含連接至經修飾之寡核苷酸之5’末端上之共軛部分。在某些實施方式中，該化合物包含連接至該經修飾之寡核苷酸之3’末端上之第一共軛部分和連接至經修飾之寡核苷酸之5’末端上之第二共軛部分。
在某些實施方式中，共軛部分包含選自以下的至少一個配位基：碳水化合物、膽固醇、脂質、磷脂、抗體、脂蛋白、激素、肽、維生素、類固醇或陽離子性脂質。
配位基可以藉由任何適合的接頭共價連接至經修飾之寡核苷酸上。各種接頭係本領域中已知的，並且例如在PCT公開號WO 2013/033230和美國專利號8,106,022 B2中描述了某些非限制的示例性接頭。在一些實施方式中， 可以選擇在體內對酶裂解有抗性的接頭。在一些實施方式中，可以選擇在體內對水解裂解有抗性的接頭。在一些實施方式中，可以選擇將在體內經受酶裂解的接頭。在一些實施方式中，可以選擇將在體內經受水解裂解的接頭。
在某些實施方式中，包含在此描述的共軛的經修飾之寡核苷酸的化合物具有以下結構：L-X1-Nm-X2-MO； 其中每個L係配位基；每個N獨立地是經修飾或未經修飾之核苷，並且m係從1至5；X1和X2各自獨立地是磷酸二酯鍵或硫代磷酸酯鍵；並且MO係經修飾之寡核苷酸。在某些實施方式中，m係1。在某些實施方式中，m係2。在某些實施方式中，m係2、3、4或5。在某些實施方式中，m係3、4或5。在某些實施方式中，當m大於1時，Nm的每個經修飾或未經修飾之核苷可以藉由磷酸二酯核苷間鍵聯或硫代磷酸酯核苷間鍵聯連接至Nm的相鄰的經修飾或未經修飾之核苷上。在某些實施方式中，m係1並且X1和X2各自是磷酸二酯。
在某些實施方式中，包含在此描述的共軛的經修飾之寡核苷酸的化合物具有結構A：Ln-接頭-MO；其中每個L獨立地是配位基並且n係從1至10；並且MO係經修飾之寡核苷酸。
在某些實施方式中，包含在此描述的共軛的經修飾之寡核苷酸的化合物 具有結構B：Ln-接頭-X1-Nm-X2-MO；其中每個L獨立地是配位基並且n係從1至10；每個N獨立地是經修飾或未經修飾之核苷，並且m係從1至5；X1和X2各自獨立地是磷酸二酯鍵或硫代磷酸酯鍵；並且MO係經修飾之寡核苷酸。在某些實施方式中，m係1。在某些實施方式中，m係2。在某些實施方式中，m係3、4或5。在某些實施方式中，m係2、3、4或5。在某些實施方式中，當m係大於1時，Nm的每個經修飾或未經修飾之核苷都可以藉由磷酸二酯核苷間鍵聯或硫代磷酸酯核苷間鍵聯連接至Nm的相鄰的經修飾或未經修飾之核苷上。
在某些實施方式中，包含在此描述的共軛的經修飾之寡核苷酸之化合物具有結構C：Ln-接頭-X-Nm-Y-MO；其中每個L獨立地是配位基並且n係從1至10；每個N獨立地是經修飾或未經修飾之核苷，並且m係從1至5；X係磷酸二酯鍵或硫代磷酸酯鍵；Y係磷酸二酯鍵；並且MO係經修飾之寡核苷酸。在某些實施方式中，m係1。在某些實施方式中，m係2。在某些實施方式中，m係3、4或5。在某些實施方式中，m係2、3、4或5。在某些實施方式中，當m大於1時，Nm的每個經修飾或未經修飾之核苷都可以藉由磷酸二酯核苷間鍵聯或硫代磷酸酯核苷間鍵聯連接至Nm的相鄰的經修飾或未經修飾之核苷上。
在某些實施方式中，包含在此描述的共軛的經修飾之寡核苷酸之化合物 具有結構D：Ln-接頭-Y-Nm-Y-MO；其中每個L獨立地是配位基並且n係從1至10；每個N獨立地是經修飾或未經修飾之核苷，並且m係從1至5；每個Y係磷酸二酯鍵；並且MO係經修飾之寡核苷酸。在某些實施方式中，m係1。在某些實施方式中，m係2。在某些實施方式中，m係3、4或5。在某些實施方式中，m係2、3、4或5。在某些實施方式中，當m大於1時，Nm的每個經修飾或未經修飾之核苷可以藉由磷酸二酯核苷間鍵聯或硫代磷酸酯核苷間鍵聯連接至Nm的相鄰的經修飾或未經修飾之核苷上。
在某些實施方式中，當n大於1時，該接頭包含能夠將多於一個L連接至該化合物的其餘部分上(即，連接至該經修飾之寡核苷酸(MO)上、連接至X1-Nm-X2-MO上、連接至X-Nm-Y-MO上，等等)的骨架。在一些此類實施方式中，該化合物(如結構A、結構B、結構C或結構D的化合物)的Ln-接頭部分包含結構E：
Figure 103115652-A0202-12-0031-83
其中每個L獨立地是配位基；n係從1至10；S係骨架；並且Q’和Q”獨立地是連接基團。
在一些實施方式中，每個Q’和Q”獨立地選自：肽、醚、聚乙二醇、烷基、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基、取代的C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧基、胺基、 醯胺基、吡咯啶、8-胺基-3,6-二氧雜辛酸(ADO)、4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸琥珀醯亞胺酯以及6-胺基己酸。
在一些實施方式中，一骨架能夠將2、3、4或5個配位基連接至經修飾之寡核苷酸上。在一些實施方式中，一骨架能夠將3個配位基連接至經修飾之寡核苷酸上。
一非限制性之示例性結構E係結構E(i)：
Figure 103115652-A0202-12-0032-6
其中L1、L2和L3各自獨立地是配位基；Q’1、Q’2、Q’3和Q”各自獨立地是連接基團；並且R1、R2、R3和R4各自獨立地選自H、C1-C6烷基和取代的C1-C6烷基。
在一些實施方式中，Q’1、Q’2、Q’3和Q”各自獨立地選自：肽、醚、聚乙二醇、烷基、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基、取代的C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧基、胺基、醯胺基、吡咯啶、8-胺基-3,6-二氧雜辛酸(ADO)、4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸琥珀醯亞胺酯以及6-胺基己酸。在一些實施方式中，R1、R2、R3和R4各自獨立地選自：H、甲基、乙基、丙基、異丙基以及 丁基。在一些實施方式中，R1、R2、R3和R4各自選自H和甲基。
另一種非限制性之示例性結構E係結構E(ii)：
Figure 103115652-A0202-12-0033-7
其中L1、L2和L3各自獨立地是配位基；Q’1、Q’2、Q’3和Q”各自獨立地是連接基團；並且R1選自H、C1-C6烷基和取代的C1-C6烷基。
在一些實施方式中，Q’1、Q’2、Q’3和Q”各自獨立地選自：肽、醚、聚乙二醇、烷基、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基、取代的C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧基、胺基、醯胺基、吡咯啶、8-胺基-3,6-二氧雜辛酸(ADO)、4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸琥珀醯亞胺酯以及6-胺基己酸。在一些實施方式中，R1選自H、甲基、乙基、丙基、異丙基以及丁基。在一些實施方式中，R1係H或甲基。
另一種非限制性之示例性結構E係結構E(iii)：
Figure 103115652-A0202-12-0034-8
其中L1、L2和L3各自獨立地是配位基；Q’1、Q’2、Q’3和Q”各自獨立地是連接基團；並且R1、R2、R3、R4和R5各自獨立地選自H、C1-C6烷基和取代的C1-C6烷基。
在一些實施方式中，Q’1、Q’2、Q’3和Q”各自獨立地選自：肽、醚、聚乙二醇、烷基、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基、取代的C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧基、胺基、醯胺基、吡咯啶、8-胺基-3,6-二氧雜辛酸(ADO)、4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸琥珀醯亞胺酯以及6-胺基己酸。在一些實施方式中，R1、R2、R3、R4和R5各自獨立地選自：H、甲基、乙基、丙基、異丙基以及丁基。在一些實施方式中，R1、R2、R3、R4和R5各自選自H和甲基。
另一種非限制性之示例性結構E係結構E(iv)：
Figure 103115652-A0202-12-0034-9
其中L1和L2各自獨立地是配位基；Q’1、Q’2和Q”各自獨立地是連接基團；並且R1、R2和R3各自獨立地選自H、C1-C6烷基和取代的C1-C6烷基。
在一些實施方式中，Q’1、Q’2和Q”各自獨立地選自：肽、醚、聚乙二醇、烷基、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基、取代的C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧基、胺基、醯胺基、吡咯啶、8-胺基-3,6-二氧雜辛酸(ADO)、4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸琥珀醯亞胺酯以及6-胺基己酸。在一些實施方式中，R1、R2和R3各自獨立地選自：H、甲基、乙基、丙基、異丙基以及丁基。在一些實施方式中，R1、R2和R3各自選自H和甲基。
另一種非限制性之示例性結構E係結構E(v)：
Figure 103115652-A0202-12-0035-10
其中L1和L2各自獨立地是配位基；Q’1、Q’2和Q”各自獨立地是連接基團；並且R1、R2和R3各自獨立地選自H、C1-C6烷基和取代的C1-C6烷基。
在一些實施方式中，Q’1、Q’2和Q”各自獨立地選自：肽、醚、聚乙二醇、烷基、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基、取代的C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧基、胺基、醯胺基、吡咯啶、8-胺基-3,6-二氧雜辛酸(ADO)、4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸琥珀醯亞胺酯以及6-胺基己酸。在一些實施方式中，R1、R2和R3各自獨立地選自：H、甲基、乙基、丙基、異丙基以及丁基。在 一些實施方式中，R1、R2和R3各自選自H和甲基。
另一種非限制性之示例性結構E係結構E(vi)：
Figure 103115652-A0202-12-0036-11
其中L1、L2和L3各自獨立地是配位基；Q’1、Q’2、Q’3和Q”各自獨立地是連接基團；並且R1、R2和R3各自獨立地選自H、C1-C6烷基和取代的C1-C6烷基。
在一些實施方式中，Q’1、Q’2、Q’3和Q”各自獨立地選自：肽、醚、聚乙二醇、烷基、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基、取代的C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧基、胺基、醯胺基、吡咯啶、8-胺基-3,6-二氧雜辛酸(ADO)、4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸琥珀醯亞胺酯以及6-胺基己酸。在一些實施方式中，R1、R2和R3各自獨立地選自：H、甲基、乙基、丙基、異丙基以及丁基。在一些實施方式中，R1、R2和R3各自選自H和甲基。
另一種非限制性之示例性結構E係結構E(vii)：
Figure 103115652-A0202-12-0037-12
其中L1、L2和L3各自獨立地是配位基；Q’1、Q’2、Q’3和Q”各自獨立地是連接基團；並且R1、R2和R3各自獨立地選自H、C1-C6烷基和取代的C1-C6烷基；並且Z和Z’各自獨立地選自O和S。
在一些實施方式中，Q’1、Q’2、Q’3和Q”各自獨立地選自：肽、醚、聚乙二醇、烷基、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基、取代的C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧基、胺基、醯胺基、吡咯啶、8-胺基-3,6-二氧雜辛酸(ADO)、4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸琥珀醯亞胺酯以及6-胺基己酸。在一些實施方式中，R1、R2和R3各自獨立地選自：H、甲基、乙基、丙基、異丙基以及丁基。在一些實施方式中，R1、R2和R3各自選自H和甲基。在一些實施方式中，在至少一個P原子上的Z或Z’係S，並且另一個Z或Z’係O(即，硫代磷酸酯鍵)。在一些實施方式中，每個-OP(Z)(Z’)O-都是硫代磷酸酯鍵。在一些實施方式中，在至少一個P原子上的Z和Z’均是O(即，磷酸二酯鍵)。在一些實施方式中，每個-OP(Z)(Z’)O-都是磷酸二酯鍵。
另一種非限制性之示例性結構E係結構E(viii)：
Figure 103115652-A0202-12-0038-13
其中L1、L2和L3各自獨立地是配位基；Q’1、Q’2、Q’3和Q”各自獨立地是連接基團；並且R1、R2、R3和R4各自獨立地選自H、C1-C6烷基和取代的C1-C6烷基。
在一些實施方式中，Q’1、Q’2、Q’3和Q”各自獨立地選自：肽、醚、聚乙二醇、烷基、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基、取代的C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧基、胺基、醯胺基、吡咯啶、8-胺基-3,6-二氧雜辛酸(ADO)、4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸琥珀醯亞胺酯以及6-胺基己酸。在一些實施方式中，R1、R2、R3和R4各自獨立地選自：H、甲基、乙基、丙基、異丙基以及丁基。在一些實施方式中，R1、R2、R3和R4各自選自H和甲基。
例如PCT公開號WO 2013/033230；美國專利號8,106,022 B2；美國公開號2012/0157509 A1；美國專利號5,994,517；美國專利號7,491,805 B2；美國專利號8,313,772 B2；馬諾哈蘭馬(Manoharan,M.)，第16章，反義藥物技術(Antisense Drug Technology)，斯汀克魯克(Crooke,S.T.)、馬塞爾德克爾(Marcel Dekker)公司，2001,391-469描述了非限制性的示例性骨架和/或包含骨架的接頭及其合成。
在一些實施方式中，化合物的Ln-接頭部分包含結構F：
Figure 103115652-A0202-12-0039-14
其中：B選自-O-、-S-、-N(RN)-、-Z-P(Z’)(Z”)O-、-Z-P(Z’)(Z”)O-Nm-X-以及-Z-P(Z’)(Z”)O-Nm-Y-；MO係經修飾之寡核苷酸；RN選自H、甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基以及苯甲基；Z、Z’和Z”各自獨立地選自O和S；每個N獨立地是經修飾或未經修飾之核苷；m係從1至5；X選自磷酸二酯鍵和硫代磷酸酯鍵；Y係磷酸二酯鍵；並且波形線表明連接至該接頭和一個或多個配位基之其餘部分。
在某些實施方式中，波形線表明連接至以上結構E。
在某些實施方式中，n係從1至5、1至4、1至3、或1至2。在某些實施方式中，n係1。在某些實施方式中，n係2。在某些實施方式中，n係3。在某些實施方式中，n係4。在某些實施方式中，n係5。
在一些實施方式中，化合物之Ln-接頭部分包含結構G：
Figure 103115652-A0202-12-0040-15
其中：B選自-O-、-S-、-N(RN)-、-Z-P(Z’)(Z”)O-、-Z-P(Z’)(Z”)O-Nm-X-以及-Z-P(Z’)(Z”)O-Nm-Y-；MO係經修飾之寡核苷酸；RN選自H、甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基以及苯甲基；Z、Z’和Z”各自獨立地選自O和S；每個N獨立地是經修飾或未經修飾之核苷；m係從1至5；X選自磷酸二酯鍵和硫代磷酸酯鍵；Y係磷酸二酯鍵；每個L獨立地是配位基；n係從1至10；S係骨架；並且Q’和Q”獨立地是連接基團。
在一些實施方式中，每個Q’和Q”獨立地選自：肽、醚、聚乙二醇、烷基、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基、取代的C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧基、胺基、醯胺基、吡咯啶、8-胺基-3,6-二氧雜辛酸(ADO)、4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸琥珀醯亞胺酯以及6-胺基己酸。
化合物的一個非限制之示例性Ln-接頭部分(例如，具有結構F或結構G)在以下結構H中示出：
Figure 103115652-A0202-12-0041-16
其中波形線表明連接至該經修飾之寡核苷酸(MO)上、例如結構B中的X1上或例如結構C或結構D中的X或Y上。
在某些實施方式中，每個配位基都是碳水化合物。當被細胞表面凝集素識別時，包含碳水化合物共軛的經修飾之寡核苷酸的化合物轉運穿過細胞膜進入細胞中。在某些實施方式中，細胞表面凝集素係C型凝集素。在某些實施方式中，該C型凝集素存在於枯否細胞(Kuppfer cell)上。在某些實施方式中，C型凝集素存在於巨噬細胞上。在某些實施方式中，C型凝集素存在于內皮細胞上。在某些實施方式中，C型凝集素存在于單核細胞上。在某些實施方式中，C型凝集素存在於白細胞上。在某些實施方式中，C型凝集素存在於樹突狀細胞上。在某些實施方式中，C型凝集素存在於B細胞上。共軛物可以促進抗miR-122化合物攝取到表現C-型凝集素的任何細胞類型中。
在某些實施方式中，C型凝集素係無唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)。在某些實施方式中，共軛物包含對該ASGPR具有親和性的一個或多個配位基，包括但不限於半乳糖或半乳糖衍生物。在某些實施方式中，對該ASGPR具有 親和性的配位基係N-乙醯基半乳糖胺、半乳糖、半乳糖胺、N-甲醯基半乳糖胺、N-丙醯基-半乳糖胺、N-正丁醯基半乳糖胺或N-異丁醯基半乳糖胺。此類共軛物促進化合物攝取到表現該ASGPR的細胞中，例如肝細胞和樹突狀細胞。
在某些實施方式中，配位基係選自以下的碳水化合物：甘露糖、葡萄糖、半乳糖、核糖、阿拉伯糖、果糖、岩藻糖、木糖、D-甘露糖、L-甘露糖、D-半乳糖、L-半乳糖、D-葡萄糖、L-葡萄糖、D-核糖、L-核糖、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-果糖、L-果糖、D-岩藻糖、L-岩藻糖、D-木糖、L-木糖、α-D-呋喃甘露糖、β-D-呋喃甘露糖、α-D-哌喃甘露糖、β-D-哌喃甘露糖、α-D-呋喃葡萄糖、β-D-呋喃葡萄糖、α-D-哌喃葡萄糖、β-D-哌喃葡萄糖、α-D-呋喃半乳糖、β-D-呋喃半乳糖、α-D-哌喃半乳糖、β-D-哌喃半乳糖、α-D-呋喃核糖、β-D-呋喃核糖、α-D-哌喃核糖、β-D-哌喃核糖、α-D-呋喃果糖、α-D-哌喃果糖、葡糖胺、半乳糖胺、唾液酸以及N-乙醯基半乳糖胺。
在某些實施方式中，配位基選自：N-乙醯基半乳糖胺、半乳糖、半乳糖胺、N-甲醯基半乳糖胺、N-丙醯基-半乳糖胺、N-正丁醯基半乳糖胺以及N-異丁醯基-半乳糖胺。
在某些實施方式中，配位基係N-乙醯基半乳糖胺。
在某些實施方式中，化合物包含以下結構：
Figure 103115652-A0202-12-0043-17
其中每個N獨立地是經修飾或未經修飾之核苷，並且m係從1至5；X1和X2各自獨立地是磷酸二酯鍵或硫代磷酸酯鍵；並且MO係經修飾之寡核苷酸。 在某些實施方式中，m係1。在某些實施方式中，m係2。在某些實施方式中，m係3、4或5。在某些實施方式中，m係2、3、4或5。在某些實施方式中，當m大於1時，Nm的每個經修飾或未經修飾之核苷都可以藉由磷酸二酯核苷間鍵聯或硫代磷酸酯核苷間鍵聯連接至Nm的相鄰的經修飾或未經修飾之核苷上。
在某些實施方式中，一化合物包含以下結構：
Figure 103115652-A0202-12-0043-18
其中X係磷酸二酯鍵或硫代磷酸酯鍵；每個N獨立地是經修飾或未經修飾之 核苷，並且m係從1至5；Y係磷酸二酯鍵；並且MO係經修飾之寡核苷酸。在某些實施方式中，m係1。在某些實施方式中，m係2。在某些實施方式中，m係3、4或5。在某些實施方式中，m係2、3、4或5。在某些實施方式中，當m大於1時，Nm的每個經修飾或未經修飾之核苷都可以藉由磷酸二酯核苷間鍵聯或硫代磷酸酯核苷間鍵聯連接至Nm的相鄰的經修飾或未經修飾之核苷上。
在某些實施方式中，一化合物包含以下結構：
Figure 103115652-A0202-12-0044-19
其中X係磷酸二酯鍵；每個N獨立地是經修飾或未經修飾之核苷，並且m係從1至5；Y係磷酸二酯鍵；並且MO係經修飾之寡核苷酸。在某些實施方式中，m係1。在某些實施方式中，m係2。在某些實施方式中，m係3、4或5。在某些實施方式中，m係2、3、4或5。在某些實施方式中，當m大於1時，Nm的每個經修飾或未經修飾之核苷都可以藉由磷酸二酯核苷間鍵聯或硫代磷酸酯核苷間鍵聯連接至Nm的相鄰的經修飾或未經修飾之核苷上。
在一些實施方式中，一化合物具有以下結構：
Figure 103115652-A0202-12-0045-20
其中每個N獨立地是經修飾或未經修飾之核苷，並且m係從1至5；X1和X2各自獨立地是磷酸二酯鍵或硫代磷酸酯鍵；並且MO係經修飾之寡核苷酸。
在某些實施方式中，X1和X2中的至少一個係磷酸二酯鍵。在某些實施方式中，X1和X2各自是磷酸二酯鍵。
在某些實施方式中，m係1。在某些實施方式中，m係2。在某些實施方式中，m係2、3、4或5。在某些實施方式中，m係3、4或5。在某些實施方式中，當m大於1時，Nm的每個經修飾或未經修飾之核苷都可以藉由磷酸二酯核苷間鍵聯或硫代磷酸酯核苷間鍵聯連接至Nm的相鄰的經修飾或未經修飾之核苷上。在某些實施方式中，當m係2時，Nm的該等核苷藉由磷酸二酯核苷間鍵聯連接。
在此描述的任何該等實施方式中，Nm可以是N’pN”，其中每個N’獨立地是經修飾或未經修飾之核苷，並且p係從0至4；並且N”係包含未經修飾之 糖部分之核苷。
在某些實施方式中，p係0。在某些實施方式中，p係1、2、3或4。在某些實施方式中，當p係1、2、3或4時，每個N’包含未經修飾之糖部分。
在某些實施方式中，未修飾的糖部分係β-D-核糖或β-D-去氧核糖。
在某些實施方式中，在p係1、2、3或4的情況下，N’包含嘌呤核鹼基。在某些實施方式中，N”包含嘌呤核鹼基。在某些實施方式中，嘌呤核鹼基選自：腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤以及7-甲基鳥嘌呤。在某些實施方式中，N係β-D-去氧核糖腺苷或β-D-去氧核糖鳥苷。在某些實施方式中，N”係β-D-去氧核糖腺苷或β-D-去氧核糖鳥苷。在一些實施方式中，p係1並且N’和N”各自是β-D-去氧核糖腺苷。
在某些實施方式中，在p係1、2、3或4的情況下，N’包含嘧啶核鹼基。在某些實施方式中，N”包含嘧啶核鹼基。在某些實施方式中，嘧啶核鹼基選自：胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶以及5,6-二氫尿嘧啶。
在此描述的任何該等實施方式中，每個N的糖部分獨立地選自：β-D-核糖、β-D-去氧核糖、2’-O-甲氧基糖、2’-O-甲基糖、2’-氟糖以及雙環糖部分。在某些實施方式中，每個雙環糖部分獨立地選自cEt糖部分、LNA糖部分以及ENA糖部分。在某些實施方式中，該cEt糖部分係S-cEt糖部分。在某些實施方式中，該cEt糖部分係R-cEt糖部分。在此描述的任何實施方式中，每個N之糖部分可以獨立地選自β-D-核糖、β-D-去氧核糖以及2’-氟糖。
在某些實施方式中，化合物包含以下結構：
Figure 103115652-A0202-12-0047-21
其中X係磷酸二酯鍵；m係1；N係β-D-去氧核糖腺苷；Y係磷酸二酯鍵；並且MO係經修飾之寡核苷酸。
在某些實施方式中，化合物包含以下結構：
Figure 103115652-A0202-12-0047-22
其中X係磷酸二酯鍵；m係2；每個N係β-D-去氧核糖腺苷；N的核苷藉由磷酸二酯核苷間鍵聯連接；Y係磷酸二酯鍵；並且MO係經修飾之寡核苷酸。
在某些實施方式中，在此提供的化合物包含經修飾之核苷酸和共軛部 分，其中該經修飾之寡核苷酸具有結構CSASCSASCSUSCSCS，其中下標“S”表明S-cEt並且後面沒有下標之核苷係β-D-去氧核糖核苷，並且每個核苷間鍵聯係硫代磷酸酯核苷間鍵聯，並且其中該共軛部分連接至該經修飾之寡核苷酸之3’末端並且具有以下結構：
Figure 103115652-A0202-12-0048-23
其中X1和X2係磷酸二酯鍵；m係1；N係β-D-去氧核糖腺苷；並且MO係經修飾之寡核苷酸。
用於共軛至經修飾之寡核苷酸的另外的部分包括吩
Figure 103115652-A0202-12-0048-85
、啡啶、蒽醌、吖啶、螢光素、繞單寧(rhodamine)、香豆素以及染料。在某些實施方式中，共軛基團係直接連接至經修飾之寡核苷酸上。
在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸之核鹼基序列與靶RNA的核鹼基序列至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少95%、至少96%或100%互補。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸與靶RNA至少 90%、至少93%、至少94%、至少95%或100%互補。
在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸包含具有經修飾之糖部分的至少一個核苷。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸包含多個非雙環核苷和多個雙環核苷。
在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸的至少70%的核苷包含經修飾之糖部分。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸的至少80%的核苷包含經修飾之糖部分。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸的至少90%的核苷包含經修飾之糖部分。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸的至少95%的核苷包含經修飾之糖部分。
在某些實施方式中，至少兩個雙環核苷包含彼此不同之糖部分。在某些實施方式中，每個雙環核苷都具有相同類型之糖部分。在某些實施方式中，至少兩個非雙環核苷包含彼此不同之糖部分。在某些實施方式中，每個非雙環核苷都具有相同類型之糖部分。
在某些實施方式中，每個非雙環核苷獨立地選自β-D-去氧核糖核苷、β-D-核糖核苷、2’-O-甲基核苷、2’-O-甲氧基乙基核苷以及2’-氟核苷。在某些實施方式中，每個非雙環核苷獨立地選自β-D-去氧核糖核苷和2’-O-甲氧基乙基核苷。在某些實施方式中，每個非雙環核苷都是β-D-去氧核糖核苷。
在某些實施方式中，該雙環核苷選自cEt核苷和LNA核苷以及ENA核苷。在某些實施方式中，該cEt核苷係S-cEt核苷。在某些實施方式中，該cEt核苷係R-cEt核苷。
在某些實施方式中，該經修飾之寡核苷酸包含多個修飾的核苷和多個β-D-去氧核糖核苷，其中每個β-D-去氧核糖核苷都可以包含經修飾或未經修飾之核鹼基。在某些實施方式中，該經修飾之寡核苷酸係缺口體。在某些實施方式中，每個核苷之糖部分都是經修飾之糖部分。在某些實施方式中，經修飾之核苷係2’-O-甲氧基乙基核苷。在某些實施方式中，經修飾之核苷係S-cEt核苷。
在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸由7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸由7至10個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸由8至10個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸由8至12個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸由8至25個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸由12至25個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸由15至25個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸由15至22個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸由17至22個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸由7個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸由8個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸由9個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸由10個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸由11個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾 之寡核苷酸由12個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸由13個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸由14個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸由15個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸由16個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸由8個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸由17個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸由18個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸由19個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸由20個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸由21個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸由8個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸由22個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸由23個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸由24個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸由25個連接之核苷組成。
在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸的至少一個核苷間鍵聯係經修飾之核苷間鍵聯。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸的每個核苷間鍵聯都是經修飾之核苷間鍵聯。在某些實施方式中，該經修飾之核苷間鍵聯係硫代磷酸酯核苷間鍵聯。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸的至少一個核苷包含經修飾之核鹼基。在某些實施方式中，該經修飾之寡核苷酸的至少一個嘧啶包含5-甲基基團。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸的至少一個核 苷包含5-甲基胞嘧啶。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸的每個胞嘧啶都是5-甲基胞嘧啶。
在某些實施方式中，在經修飾之寡核苷酸的長度為7與12個連接之核苷之間的情況下，該經修飾之寡核苷酸的每個核苷都包含經修飾之糖部分。在某些實施方式中，在經修飾之寡核苷酸之長度為7與10個連接之核苷之間的情況下，該經修飾之寡核苷酸的每個核苷都包含經修飾之糖部分。在某些實施方式中，在經修飾之寡核苷酸係在8與12個連接之核苷之間的情況下，該經修飾之寡核苷酸的每個核苷都包含經修飾之糖部分。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸由7個連接之核苷組成，其中該經修飾之寡核苷酸的每個核苷都包含經修飾之糖部分。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸由8個連接之核苷組成，其中該經修飾之寡核苷酸的每個核苷都包含經修飾之糖部分。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸由9個連接之核苷組成，其中該經修飾之寡核苷酸的每個核苷都包含經修飾之糖部分。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸由10個連接之核苷組成，其中該經修飾之寡核苷酸的每個核苷都包含經修飾之糖部分。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸由11個連接之核苷組成，其中該經修飾之寡核苷酸的每個核苷都包含經修飾之糖部分。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸由12個連接之核苷組成，其中該經修飾之寡核苷酸的每個核苷都包含經修飾之糖部分。在某些實施方式中，該經修飾之寡核苷酸的每個核苷都包含雙環糖部分。在某些實施方式中，該雙環糖部分係cEt糖部分。在某些實施方式中，該cEt糖部分係S-cEt糖部 分。在某些實施方式中，該雙環糖部分係LNA糖部分。
在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸係缺口體。
某些代謝產物
當在體外或體內暴露於核酸外切酶和/或核酸內切酶時，化合物可以經受在整個化合物不同位置上之裂解。此種裂解的產物可以保留一定程度母體化合物之活性，並且因此被認為是活性代謝物。因此，化合物之代謝產物可以用於在此描述的該等方法中。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸(未共軛或共軛的)經受5’末端和/或3’末端上的裂解，從而產生相對於母體經修飾之寡核苷酸在5’末端和/或3’末端上少1個、2個或3個核苷酸之代謝產物。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸經受5’末端上之裂解，釋放5’-末端之核苷酸並且產生相對於母體經修飾之寡核苷酸在5’末端上少1個核苷酸之代謝產物。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸經受5’末端上之裂解，釋放兩個5’-末端之核苷並且產生相對於母體經修飾之寡核苷酸在5’末端上少兩個核苷酸之代謝產物。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸經受3’末端上之裂解，釋放3’-末端之核苷酸並且產生相對於母體經修飾之寡核苷酸在3’末端上少一個核苷酸之代謝產物。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸經受3’末端上之裂解，釋放兩個3’-末端之核苷並且產生相對於母體經修飾之寡核苷酸在3’末端上少兩個核苷酸之代謝產物。
包含連接至共軛部分的經修飾之寡核苷酸的化合物還可以經受該經修飾之寡核苷酸與配位基之間的接頭內的一位點上之裂解。在某些實施方式中， 裂解產生包含一部分共軛部分的母體經修飾之寡核苷酸。在某些實施方式中，裂解產生在經修飾之寡核苷酸與配位基之間包含接頭的一個或多個亞單位之母體經修飾之寡核苷酸。例如，在化合物具有結構Ln-接頭-Nm-P-MO的情況下，在一些實施方式中，裂解產生包含Nm的一個或多個核苷酸之母體經修飾之寡核苷酸。在一些實施方式中，共軛的經修飾之寡核苷酸的裂解產生母體經修飾之寡核苷酸。在一些此類實施方式中，例如，在化合物具有結構Ln-接頭-Nm-P-MO的情況下，在一些實施方式中，裂解產生不包含Nm的任何核苷酸的母體經修飾之寡核苷酸。
共軛的經修飾之寡核苷酸之某些用途
在某些實施方式中，靶RNA與疾病相關。因此，向受試者施用共軛的經修飾之寡核苷酸化合物可以治療、預防或延緩與該靶RNA相關的疾病的發作。在某些實施方式中，該疾病與在肝臟細胞中表現的靶RNA相關。在某些實施方式中，該疾病與在肝細胞中表現的靶RNA相關。在某些實施方式中，該疾病與在巨噬細胞中表現的靶RNA相關。在某些實施方式中，該疾病與在樹突狀細胞中表現的靶RNA相關。在某些實施方式中，該靶RNA係微小RNA。
在此提供了用於治療中的共軛的化合物。
某些靶RNA
在此提供的任何該等化合物可以包含具有與靶RNA互補的核鹼基序列之 經修飾之寡核苷酸。在此描述的任何該等實施方式中，靶RNA可以是能夠被靶向的任何核酸，包括但不限於：微小RNA、初級微小RNA、先質微小RNA、前信使RNA、信使RNA、長的非編碼RNA、小的轉移RNA、小的核RNA、小的核仁RNA、小的核糖體RNA、小的髮夾RNA、內源反義RNA、引導RNA、極小非編碼RNA、在著絲點或其他染色體起點處由異染色質重複編碼的小的單股或雙股RNA以及其任何先質。靶RNA可以是編碼或非編碼之序列；單股或雙股或具有部分雙股特徵之單股；可以天然存在于信使RNA(mRNA)、核糖體RNA(rRNA)或轉移RNA(tRNA)的內含子或外顯子內；並且可以內源轉錄或外源產生。
當經修飾之寡核苷酸與它的靶RNA雜交時，可以藉由非降解性機理(例如RNA拮抗作用、調節RNA剪接、調節聚腺苷酸化、破壞RNA二級結構以及抑制翻譯)或藉由促進靶RNA降解的機理(例如RNA酶H、RNA干擾、核糖酶以及雙股RNA酶)來抑制該靶RNA的功能。
某些微小RNA靶標
在此提供的任何該等化合物可以包含具有與微小RNA互補的核鹼基序列的經修飾之寡核苷酸。
某些成熟微小RNA的核鹼基序列和它們的對應莖環序列可在miRBase(在microrna.sanger.ac.uk中找到的微小RNA序列和注釋的一種可線上搜索數據庫)中找到。該miRBase序列數據庫中的條目代表微小RNA轉錄物的預測的髮夾部分(莖環)，具有成熟微小RNA序列的位置和序列方面的資訊。 該數據庫中的該等微小RNA莖環序列不是嚴格地先質微小RNA(先質微小RNA)，並且在一些情況下可以包括先質微小RNA和來自假定的初級轉錄物的一些側翼序列。該等微小RNA靶標的序列涵蓋任何型式的微小RNA，包括在該miRBase序列數據庫的發佈版15.0中描述的序列和在該miRBase序列數據庫的任何更早發佈版中描述的序列。序列數據庫發佈版可能引起某些微小RNA重新命名。本發明該等組合物涵蓋與該等微小RNA靶標的任何核鹼基序列型式互補的經修飾之寡核苷酸。
在某些實施方式中，靶向微小RNA的經修飾之寡核苷酸的每個核鹼基都能夠經歷與該微小RNA或其先質的核鹼基序列中的每個對應位置上的核鹼基進行鹼基配對。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸之核鹼基序列可以相對於它的靶微小RNA或先質序列具有一個或多個錯配之鹼基對，並且仍保持能夠與它的靶序列雜交。
在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸具有與微小RNA先質的核鹼基序列(如微小RNA莖環序列)互補之核鹼基序列。當成熟微小RNA被包含在微小RNA先質序列內時，具有與微小RNA互補之核鹼基序列的經修飾之寡核苷酸也與對應的微小RNA先質之區互補。
在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸由許多連接之核苷組成，這許多連接之核苷等於與其互補的微小RNA序列之長度。
在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸的連接之核苷數係小於微小RNA或其先質之長度。在某些實施方式中，該寡核苷酸具有與該微小RNA或其先 質的區互補之核鹼基序列。具有小於該微小RNA長度的許多連接的核苷的經修飾之寡核苷酸(其中經修飾之寡核苷酸的每個核鹼基都與微小RNA核鹼基序列中的對應位置上的每個核鹼基互補)被認為具有與微小RNA核鹼基序列的區完全互補的核鹼基序列的經修飾之寡核苷酸。例如，由22個連接之核苷組成的經修飾之寡核苷酸(其中核苷1至22的核鹼基各自與微小RNA的對應位置互補，該微小RNA的長度為23個核鹼基)與該微小RNA的核鹼基序列的22個核鹼基區完全互補。這種經修飾之寡核苷酸具有與該微小RNA的22個核鹼基部分100%互補之核鹼基序列。此外，這種經修飾之寡核苷酸被認為是與該微小RNA 100%互補。
在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸的連接的核苷數比該微小RNA的長度小1。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸在5’末端上少一個核苷。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸在3’末端上少一個核苷。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸在5’末端上少兩個核苷。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸在3’末端上少兩個核苷。
在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸的核鹼基序列之區與微小RNA的核鹼基序列之區完全互補。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸的8個連續核鹼基各自與微小RNA的8個連續核鹼基互補。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸的9個連續核鹼基各自與微小RNA的9個連續核鹼基互補。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸的10個連續核鹼基各自與微小RNA的10個連續核鹼基互補。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸的11個連續核 鹼基各自與微小RNA的11個連續核鹼基互補。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸的12個連續核鹼基各自與微小RNA的12個連續核鹼基互補。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸的13個連續核鹼基各自與微小RNA的13個連續核鹼基互補。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸的14個連續核鹼基各自與微小RNA的14個連續核鹼基互補。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸的15個連續核鹼基各自與微小RNA的15個連續核鹼基互補。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸的16個連續核鹼基各自與微小RNA的16個連續核鹼基互補。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸的17個連續核鹼基各自與微小RNA的17個連續核鹼基互補。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸的18個連續核鹼基各自與微小RNA的18個連續核鹼基互補。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸的19個連續核鹼基各自與微小RNA的19個連續核鹼基互補。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸的20個連續核鹼基各自與微小RNA的20個連續核鹼基互補。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸的22個連續核鹼基各自與微小RNA的22個連續核鹼基互補。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸的23個連續核鹼基各自與微小RNA的23個連續核鹼基互補。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸的24個連續核鹼基各自與微小RNA的24個連續核鹼基互補。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸的25個連續核鹼基各自與微小RNA的25個連續核鹼基互補。
在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸包含與種子序列互補的核鹼基序列，即經修飾之寡核苷酸包含種子匹配序列。在某些實施方式中，種子序列 係六聚體種子序列。在某些實施方式中，六聚體種子序列係微小RNA的核鹼基1-6。在某些實施方式中，六聚體種子序列係微小RNA的核鹼基2-7。在某些實施方式中，六聚體種子序列係微小RNA的核鹼基3-8。在某些實施方式中，種子序列係七聚體種子序列。在某些實施方式中，七聚體種子序列係微小RNA的核鹼基1-7。在某些實施方式中，七聚體種子序列係微小RNA的核鹼基2-8。在某些實施方式中，該種子序列係八聚體種子序列。在某些實施方式中，八聚體種子序列係微小RNA的核鹼基1-8。在某些實施方式中，八聚體種子序列係微小RNA的核鹼基2-9。
在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸的核鹼基序列與在此列出的微小RNA核鹼基序列或其先質100%互補。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸具有相對於微小RNA或其先質的核鹼基序列具有一個錯配的核鹼基序列。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸具有相對於微小RNA或其先質的核鹼基序列具有兩個錯配的核鹼基序列。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸具有相對於微小RNA或其先質的核鹼基序列具有不多於兩個錯配的核鹼基序列。在某些實施方式中，該等錯配的核鹼基係連續的。在某些實施方式中，該等錯配的核鹼基係不連續的。
在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸的連接的核苷數大於微小RNA序列之長度。在某些實施方式中，額外的核苷之核鹼基與微小RNA莖環序列的核鹼基互補。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸的連接的核苷數比微小RNA的長度大1。在某些實施方式中，另外的核苷係處於經修飾之寡核苷酸 的5’末端上。在某些實施方式中，另外的核苷係處於經修飾之寡核苷酸的3’末端上。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸的連接的核苷數比微小RNA的長度大2。在某些實施方式中，這兩個另外的核苷係處於經修飾之寡核苷酸的5’末端上。在某些實施方式中，這兩個另外的核苷係處於經修飾之寡核苷酸的3’末端上。在某些實施方式中，一另外的核苷位於經修飾之寡核苷酸的5’末端上並且一另外的核苷位於經修飾之寡核苷酸的3’末端上。在某些實施方式中，該經修飾之寡核苷酸的區可以與微小RNA之核鹼基序列完全互補，但是該整個經修飾之寡核苷酸不與微小RNA完全互補。例如，由23個連接之核苷組成的經修飾之寡核苷酸(其中核苷1至22的核鹼基各自與微小RNA的對應位置互補，該微小RNA的長度為22個核鹼基)具有與微小RNA之核鹼基序列100%互補的22個核苷部分。
某些核鹼基序列
在此列出的任何核鹼基序列(包括但不限於在實例中和在序列表中找到的那些)無關於對核酸的任何修飾。因此，由SEQ ID NO定義之核酸可以獨立地包含對一個或多個糖部分、對一個或多個核苷間鍵聯和/或對一個或多個核鹼基的一個或多個修飾。
雖然本文件所附序列表將每個核鹼基序列根據需要鑒定為“RNA”或“DNA”，但實際上那些序列可以用化學修飾的任何組合進行修飾。熟習該項技術者將易於領會，如“RNA”或“DNA”這樣的名稱描述經修飾之寡核苷酸在一定程序上是任意的。例如，包含含有2’-OH糖部分和胸腺嘧啶鹼基的核苷之 寡核苷酸可以被描述為具有修飾的糖(針對DNA的天然2’-H為2’-OH)的DNA或具有經修飾之鹼基(針對RNA的天然尿嘧啶為胸腺嘧啶(甲基化的尿嘧啶))之RNA。
因此，在此提供的核酸序列(包括但不限於在序列表中的那些)旨在涵蓋含有任何組合的天然或修飾的RNA和/或DNA的核酸，包括但不限於具有經修飾之核鹼基之此類核酸。作為進一步實例而不是限制，具有核鹼基序列“ATCGATCG”的低聚化合物涵蓋具有此種核鹼基序列的任何低聚化合物，無論經修飾或未經修飾，包括但不限於包含RNA鹼基的此類化合物，如具有序列“AUCGAUCG”的那些和具有一些DNA鹼基和一些RNA鹼基如“AUCGATCG”的那些以及具有其他經修飾之鹼基如“ATmeCGAUCG”的低聚化合物，其中meC表明在5-位置上包含甲基之胞嘧啶鹼基。
某些合成方法
可以使用本領域中已知的自動化固相合成方法來制得經修飾之寡核苷酸。在固相合成過程中，亞磷醯胺單體依次與共價連接至固體載體上的核苷偶合。此核苷係該經修飾之寡核苷酸之3’末端核苷。典型地，該偶合循環包括四步：脫三苯甲基(用酸去除5’-羥基保護基團)、偶合(將活化的亞磷醯胺連接至載體結合之核苷或寡核苷酸)、氧化或硫化(用氧化劑或硫化劑轉化新形成的亞磷酸三酯)，並且加帽(乙醯化未反應的5’-羥基)。在最後的偶合循環之後，使該固體載體結合之寡核苷酸經受脫三苯甲基步驟，接著是裂解和去保護步驟，該裂解和去保護步驟同時使寡核苷酸從固體載體上釋放 並且使保護基團從鹼基上去除。藉由過濾去除固體載體，濃縮濾液並且測試所得到的溶液的特性和純度。然後例如使用填充有陰離子交換樹脂的柱來純化寡核苷酸。
可以使用與產生未共軛的寡核苷酸之固相合成類似的自動固相合成來制得GalNAc共軛的經修飾之寡核苷酸。在合成GalNAc共軛的寡核苷酸過程中，該等亞磷醯胺單體依次與共價連接至固體載體上的GalNAc共軛物偶合。GalNAc共軛物和GalNAc共軛物固體載體的合成例如在美國專利號8,106,022中描述，為了描述含碳水化合物之共軛物(包括包含一個或多個GalNAc部分的共軛物)之合成和共價連接至固體載體上的共軛物之合成，該參考文件藉由引用以其全部內容結合在此。
在此提供了製備具有在化學式(IV)中示出的結構的GalNAc共軛的經修飾之寡核苷酸之方法：
Figure 103115652-A0202-12-0062-24
其中每個N獨立地是經修飾或未經修飾之核苷，並且m係從1至5；X1和X2各自獨立地是磷酸二酯鍵或硫代磷酸酯鍵；並且MO係經修飾之寡核苷酸； 該等方法包括以下步驟：提供包含如在化學式IV中所示的共軛物之固體載體；
Figure 103115652-A0202-12-0063-25
在有效產生反應性羥基的條件下將DMT基團去保護；進行順次的亞磷醯胺偶合步驟以形成Nm；進行順次的亞磷醯胺偶合步驟以形成MO；並且使該共軛的經修飾之寡核苷酸從該固體載體上釋放。
某些經修飾之寡核苷酸
在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸由8至30個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸由15至30個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸由12至25個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸由15至21個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸由15至19個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸由15至16個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸由19至24個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸由21至24個連接之核苷組成。
在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸由8個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸由9個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸由10個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸由11個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸由12個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸由13個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸由14個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸由15個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸由16個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸由17個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸由18個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸由19個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸由20個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸由21個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸由22個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸由23個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸由24個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸由25個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸由26個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸由27個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸由28個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸由29個連接之核苷組成。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸由30個連接之核苷組成。
在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸係完全經修飾之寡核苷酸。在某些實施方式中，完全經修飾之寡核苷酸在每個核苷上都包含糖修飾。在某些實施方式中，完全經修飾之寡核苷酸包含至少一個經修飾之核苷間鍵聯。在某些實施方式中，完全經修飾之寡核苷酸在每個核苷上都包含糖修飾，並且每個核苷間鍵聯都是經修飾之核苷間鍵聯。在某些實施方式中，完全經修飾之寡核苷酸在每個核苷上都包含糖修飾，並且包含至少一個硫代磷酸酯核苷間鍵聯。在某些實施方式中，完全經修飾之寡核苷酸在每個核苷上都包含糖修飾，並且每個核苷間鍵聯都是硫代磷酸酯核苷間鍵聯。在某些實施方式中，完全經修飾之寡核苷酸的每個核苷都包含相同的經修飾之糖部分。
在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸係均勻經修飾之寡核苷酸。在某些實施方式中，均勻經修飾之寡核苷酸的每個核苷都包含相同的糖修飾的部分。在某些實施方式中，均勻經修飾之寡核苷酸的每個核苷間鍵聯都包含相同的經修飾之核苷間鍵聯。
在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸具有缺口體基序。在某些實施方式中，每個外部的每個核苷都包含相同的經修飾之糖部分。在某些實施方式中，一外部區的至少兩個核苷包含彼此不同的修飾的糖部分。在某些實施方式中，每個外部區的至少兩個核苷包含彼此不同的修飾的糖部分。在某些實施方式中，每個外部區的每個核苷都包含2’-O-甲氧基乙基糖。在某些實施方式中，每個外部區的每個核苷都包含雙環糖部分。在某些實施方式中，該雙環糖部分係cEt糖部分。在某些實施方式中，該cEt糖部分係S-cEt糖部分。 在某些實施方式中，該雙環糖部分係LNA糖部分。
在某些實施方式中，缺口體的每個外部區都由相同數目的連接之核苷組成。在某些實施方式中，缺口體的一個外部區由與另一個外部區的連接的核苷數不同的數目的連接之核苷組成。
在某些實施方式中，每個外部區獨立地包含1至6個核苷。在某些實施方式中，外部區包含1個核苷。在某些實施方式中，外部區包含2個核苷。在某些實施方式中，外部區包含3個核苷。在某些實施方式中，外部區包含4個核苷。在某些實施方式中，外部區包含5個核苷。在某些實施方式中，外部區包含6個核苷。在某些實施方式中，該內部區由17至28個連接之核苷組成。在某些實施方式中，內部區由17至21個連接之核苷組成。在某些實施方式中，內部區由17個連接之核苷組成。在某些實施方式中，內部區由18個連接之核苷組成。在某些實施方式中，內部區由19個連接之核苷組成。在某些實施方式中，內部區由20個連接之核苷組成。在某些實施方式中，內部區由21個連接之核苷組成。在某些實施方式中，內部區由22個連接之核苷組成。在某些實施方式中，內部區由23個連接之核苷組成。在某些實施方式中，內部區由24個連接之核苷組成。在某些實施方式中，內部區由25個連接之核苷組成。在某些實施方式中，內部區由26個連接之核苷組成。在某些實施方式中，內部區由27個連接之核苷組成。在某些實施方式中，內部區由28個連接之核苷組成。
在某些實施方式中，每個外部區都包含5個連接之核苷，並且內部區包 含10個連接之核苷。在某些實施方式中，每個外部區都包含4個連接之核苷，並且內部區包含10個連接之核苷。在某些實施方式中，每個外部區都包含3個連接之核苷，並且內部區包含10個連接之核苷。在某些實施方式中，每個外部區都包含2個連接之核苷，並且內部區包含10個連接之核苷。
在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸係單股siRNA。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸係雙股siRNA。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸係單股微小RNA模擬物。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸係雙股微小RNA模擬物。
某些修飾
在此提供了包含被連接至共軛部分的經修飾之寡核苷酸的化合物。經修飾之寡核苷酸可以包含對核鹼基、糖和/或核苷間鍵聯的一種或多種修飾。可以因為希望的特性(例如像細胞攝取增強、對其他寡核苷酸或核酸靶標的親和性增強以及在核酸酶存在下的穩定性增加)選擇經修飾之核鹼基、糖和/或核苷間鍵聯優先於未經修飾之形式。
在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸包含一個或多個經修飾之核苷。在某些實施方式中，經修飾之核苷係穩定性核苷。穩定性核苷的一實例係糖修飾之核苷。
在某些實施方式中，經修飾之核苷包含經修飾之糖部分。在某些實施方式中，包含經修飾之糖部分的經修飾之核苷包含未經修飾之核鹼基。在某些實施方式中，經修飾之糖包含經修飾之核鹼基。在某些實施方式中，經修飾 之核苷係2’-修飾之核苷。
在某些實施方式中，2’-修飾之核苷包含雙環糖部分。在某些實施方式中，該雙環糖部分係呈α構型之D糖。在某些實施方式中，該雙環糖部分係呈β構型之D糖。在某些實施方式中，該雙環糖部分係呈α構型之L糖。在某些實施方式中，該雙環糖部分係呈β構型之L糖。
在某些實施方式中，該雙環糖部分在2'碳原子與4'碳原子之間包含橋聯基團。在某些實施方式中，該橋聯基團包含1至8個連接的雙基團。在某些實施方式中，該雙環糖部分包含1至4個連接之雙基團。在某些實施方式中，該雙環糖部分包含2個或3個連接的雙基團。在某些實施方式中，該雙環糖部分包含2個連接的雙基團。此類4’至2’糖取代基的實例包括但不限於：-[C(Ra)(Rb)]n-、-[C(Ra)(Rb)]n-O-、-C(RaRb)-N(R)-O-或-C(RaRb)-O-N(R)-；4'-CH2-2'、4'-(CH2)2-2'、4'-(CH2)3-2'；4'-(CH2)-O-2'(LNA)；4'-(CH2)-S-2'；4'-(CH2)2-O-2'(ENA)；4'-CH(CH3)-O-2'(cEt)和4'-CH(CH2OCH3)-O-2'及其類似物(參見，例如於2008年7月15日發行的美國專利7,399,845)；4'-C(CH3)(CH3)-O-2'及其類似物(參見，例如於2009年1月8日出版的WO 2009/006478)；4'-CH2-N(OCH3)-2'及其類似物(參見，例如於2008年12月11日出版的WO 2008/150729)；4'-CH2-O-N(CH3)-2'(參見，例如於2004年9月2日出版的US 2004/0171570)；4'-CH2-O-N(R)-2和4'-CH2-N(R)-O-2'-，其中每個R獨立地是H、保護基團或C1-C12烷基；4'-CH2-N(R)-O-2'，其中R係H、C1-C12烷基或保護基團(參見，於2008年9月23日發行的美國專利 7,427,672)；4'-CH2-C(H)(CH3)-2'(參見，例如查多帕迪亞亞(Chattopadhyaya)等人，有機化學雜誌(J.Org.Chem.),2009,74,118-134)；以及4'-CH2-C(=CH2)-2'及其類似物(參見，於2008年12月8日出版的公開PCT國際申請WO 2008/154401)。
在某些實施方式中，此類4’至2’橋聯獨立地包含1個或2至4個連接之基團，該等連接的基團獨立地選自-[C(Ra)(Rb)]n-、-C(Ra)=C(Rb)-、-C(Ra)=N-、-C(=NRa)-、-C(=O)-、-C(=S)-、-O-、-Si(Ra)2-、-S(=O)x-以及-N(Ra)-；其中：X係0、1或2；n係1、2、3或4；每個Ra和Rb獨立地是H、保護基團、羥基、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、取代的C5-C20芳基、雜環基、取代的雜環基、雜芳基、取代的雜芳基、C5-C7脂環基、取代的C5-C7脂環基、鹵素、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、COOJ1、醯基(C(=O)-H)、取代的醯基、CN、磺醯基(S(=O)2-J1)或亞磺醯基(S(=O)-J1)；並且每個J1和J2獨立地是H、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、取代的C5-C20芳基、醯基(C(=O)-H)、取代的醯基、雜環基、取代的雜環基、C1-C12胺基烷基、取代的C1-C12胺基烷基、或保護基團。
包含雙環糖部分的核苷稱為雙環核苷或BNA。在某些實施方式中，雙環核苷包括但不限於如下所描繪的(A)α-L-亞甲基氧基(4’-CH2-O-2’)BNA；(B)β-D-亞甲基氧基(4’-CH2-O-2’)BNA；(C)亞乙基氧基(4’-(CH2)2-O-2’)BNA；(D)胺基氧基(4’-CH2-O-N(R)-2’)BNA；(E)氧基胺基(4’-CH2-N(R)-O-2’)BNA；(F)甲基(亞甲基氧基)(4’-CH(CH3)-O-2’)BNA(又稱為約束的乙基或cEt)；(G)亞甲基硫代(4’-CH2-S-2’)BNA；(H)亞甲基-胺基(4’-CH2-N(R)-2’)BNA；(I)甲基碳環(4’-CH2-CH(CH3)-2’)BNA；(J)c-MOE(4’-CH2-OMe-2’)BNA以及(K)亞丙基碳環(4’-(CH2)3-2’)BNA。
Figure 103115652-A0202-12-0070-26
其中Bx係核鹼基部分，並且R獨立地是H、保護基團或C1-C12烷基。
在某些實施方式中，2’-修飾之核苷包含選自以下的2'-取代基：鹵基、烯 丙基、胺基、疊氮基、SH、CN、OCN、CF3、OCF3、O-、S-或N(Rm)-烷基；O-、S-或N(Rm)-烯基；O-、S-或N(Rm)-炔基；O-伸烷基-O-烷基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基、O-芳烷基、O(CH2)2SCH3、O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)或O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn)，其中每個Rm和Rn獨立地是H、胺基保護基團或取代或未取代的C1-C10烷基。該等2'-取代基可以進一步被獨立地選自以下的一個或多個取代基取代：羥基、胺基、烷氧基、羰基、苯甲基、苯基、硝基(NO2)、硫醇基、硫代烷氧基(S-烷基)、鹵素、烷基、芳基、烯基以及炔基。
在某些實施方式中，2’-修飾之核苷包含選自以下的2’-取代基：F、NH2、N3、OCF3、O-CH3、O(CH2)3NH2、CH2-CH=CH2、O-CH2-CH=CH2、OCH2CH2OCH3、O(CH2)2SCH3、O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)、-O(CH2)2O(CH2)2N(CH3)2以及N-取代的乙醯胺(O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn))，其中每個Rm和Rn獨立地是H、胺基保護基團或取代或未取代的C1-C10烷基。
在某些實施方式中，2’-修飾的核苷包含選自以下的2’-取代基：F、OCF3、O-CH3、OCH2CH2OCH3、2'-O(CH2)2SCH3、O-(CH2)2-O-N(CH3)2、-O(CH2)2O(CH2)2N(CH3)2以及O-CH2-C(=O)-N(H)CH3。
在某些實施方式中，2’-修飾之核苷包含選自以下的2’-取代基：F、O-CH3和OCH2CH2OCH3。
在某些實施方式中，包含經修飾之糖部分的核苷係4’-硫代修飾之核苷。 在某些實施方式中，包含經修飾之糖部分的核苷係4’-硫代-2’-修飾之核苷。4'-硫代修飾之核苷具有β-D-核糖核苷，其中4'-O置換為4'-S。4'-硫代-2'-修飾之核苷係2'-OH置換為2'-取代基的4'-硫代修飾之核苷。適合的2'-取代基包括2'-OCH3、2'-O-(CH2)2-OCH3和2'-F。
在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸包含一個或多個核苷間修飾。在某些實施方式中，寡核苷酸的每個核苷間鍵聯都是經修飾之核苷間鍵聯。在某些實施方式中，經修飾之核苷間鍵聯包含磷原子。
在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸包含至少一個硫代磷酸酯核苷間鍵聯。在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸的每個核苷間鍵聯都是硫代磷酸酯核苷間鍵聯。
在某些實施方式中，經修飾之核苷間鍵聯不包含磷原子。在某些實施方式中，核苷間鍵聯由短鏈烷基核苷間鍵聯形成。在某些實施方式中，核苷間鍵聯由環烷基核苷間鍵聯形成。在某些實施方式中，核苷間鍵聯由混合的雜原子與烷基核苷間鍵聯形成。在某些實施方式中，核苷間鍵聯由混合的雜原子與環烷基核苷間鍵聯形成。在某些實施方式中，核苷間鍵聯由一個或多個短鏈雜原子核苷間鍵聯形成。在某些實施方式中，核苷間鍵聯由一個或多個雜環核苷間鍵聯形成。在某些實施方式中，核苷間鍵聯具有醯胺骨架。在某些實施方式中，核苷間鍵聯具有混合的N、O、S和CH2組分部分。
在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸包含一個或多個修飾的核鹼基。
在某些實施方式中，經修飾之核鹼基選自：5-羥基甲基胞嘧啶、7-脫氮鳥 嘌呤和7-脫氮腺嘌呤。在某些實施方式中，經修飾之核鹼基選自：7-脫氮-腺嘌呤、7-脫氮鳥苷、2-胺基吡啶以及2-吡啶酮。在某些實施方式中，經修飾之核鹼基選自：5-取代的嘧啶、6-氮雜嘧啶以及N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2胺基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。
在某些實施方式中，經修飾之核鹼基包含多環雜環。在某些實施方式中，經修飾之核鹼基包含三環雜環。在某些實施方式中，經修飾之核鹼基包含吩
Figure 103115652-A0202-12-0073-86
衍生物。在某些實施方式中，該吩
Figure 103115652-A0202-12-0073-87
可以進一步被修飾以形成本領域中稱為G-夾之核鹼基。
在某些實施方式中，經修飾之寡核苷酸包含連接至寡核苷酸的一個或兩個末端上的一個或多個穩定基團以增強例如像核酸酶穩定性之特性。穩定性基團中包括帽結構。該等末端修飾保護寡核苷酸免受核酸外切酶降解，並且可以幫助在細胞內內遞送和/或定位。帽可以存在於5'-末端(5'-帽)或3'-末端(3'-帽)，或可以存在於這兩個末端上。帽結構包括例如反向去氧無鹼基帽。
適合的帽結構包括：4',5'-亞甲基核苷酸、1-(β-D-赤呋喃糖基)核苷酸、4'-硫代核苷酸、碳環核苷酸、1,5-脫水己糖醇核苷酸、L-核苷酸、α-核苷酸、經修飾之鹼基核苷酸、二硫代磷酸酯鍵、蘇式呋喃戊糖基核苷酸、無環3',4'-開環核苷酸、無環3,4-二羥基丁基核苷酸、無環3,5-二羥基戊基核苷酸、3'-3'-反向核苷酸部分、3'-3'-反向無鹼基部分、3'-2'-反向核苷酸部分、3'-2'-反向無鹼基部分、1,4-丁二醇磷酸酯、3'-胺基磷酸酯、己基磷酸酯、胺基己基磷酸酯、 3'-磷酸酯、3'-硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、橋聯的甲基磷酸酯部分和非橋聯的甲基磷酸酯部分5'-胺基-烷基磷酸酯、1,3-二胺基-2-丙基磷酸酯、3-胺基丙基磷酸酯、6-胺基己基磷酸酯、1,2-胺基十二烷基磷酸酯、羥基丙基磷酸酯、5'-5'-反向核苷酸部分、5'-5'-反向無鹼基部分、5'-胺基磷酸酯、5'-硫代磷酸酯、5'-胺基、橋聯和未橋聯的5'-胺基磷酸酯、硫代磷酸酯以及5'-巰基部分。
某些藥物組合物
在此提供的任何該等化合物都可以製備成藥物組合物。
在某些實施方式中，以劑量單位(例如，片劑、膠囊、大丸劑等等)形式施用藥物組合物。在一些實施方式中，藥物組合物包含選自以下範圍內之劑量的在此提供之化合物：25mg至800mg、25mg至700mg、25mg至600mg、25mg至500mg、25mg至400mg、25mg至300mg、25mg至200mg、25mg至100mg、100mg至800mg、200mg至800mg、300mg至800mg、400mg至800mg、500mg至800mg、600mg至800mg、100mg至700mg、150mg至650mg、200mg至600mg、250mg至550mg、300mg至500mg、300mg至400mg以及400mg至600mg。在某些實施方式中，此類藥物組合物包含以選自以下之劑量存在的在此提供之化合物：25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、55mg、60mg、65mg、70mg、75mg、80mg、85mg、90mg、95mg、100mg、105mg、110mg、115mg、120mg、125mg、130mg、135mg、140mg、145mg、150mg、155mg、160mg、165mg、170mg、175mg、180mg、185mg、190mg、195mg、200mg、205 mg、210mg、215mg、220mg、225mg、230mg、235mg、240mg、245mg、250mg、255mg、260mg、265mg、270mg、270mg、280mg、285mg、290mg、295mg、300mg、305mg、310mg、315mg、320mg、325mg、330mg、335mg、340mg、345mg、350mg、355mg、360mg、365mg、370mg、375mg、380mg、385mg、390mg、395mg、400mg、405mg、410mg、415mg、420mg、425mg、430mg、435mg、440mg、445mg、450mg、455mg、460mg、465mg、470mg、475mg、480mg、485mg、490mg、495mg、500mg、505mg、510mg、515mg、520mg、525mg、530mg、535mg、540mg、545mg、550mg、555mg、560mg、565mg、570mg、575mg、580mg、585mg、590mg、595mg、600mg、605mg、610mg、615mg、620mg、625mg、630mg、635mg、640mg、645mg、650mg、655mg、660mg、665mg、670mg、675mg、680mg、685mg、690mg、695mg、700mg、705mg、710mg、715mg、720mg、725mg、730mg、735mg、740mg、745mg、750mg、755mg、760mg、765mg、770mg、775mg、780mg、785mg、790mg、795mg以及800mg。在某些此類實施方式中，藥物組合物包含選自以下之劑量的在此提供之化合物：25mg、50mg、75mg、100mg、150m、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、500mg、600mg、700mg以及800mg。
在某些實施方式中，藥物組合物包含在以下劑量下施用的在此提供之化合物：10mg/kg或更少、9mg/kg或更少、8mg/kg或更少、7.5mg/kg或更 少、7mg/kg或更少、6.5mg/kg或更少、6mg/kg或更少、5.5mg/kg或更少、5mg/kg或更少、4.5mg/kg或更少、4mg/kg或更少、3.5mg/kg或更少、3mg/kg或更少、2.5mg/kg或更少、2mg/kg或更少、1.5mg/kg或更少、1mg/kg或更少、0.75mg/kg或更少、0.5mg/kg或更少、或0.25mg/kg或更少。
在某些實施方式中，藥劑係用適合的稀釋劑(例如，注射用無菌水或注射用無菌鹽水)復原的無菌凍乾化合物。在稀釋到鹽水中之後，復原的產品以皮下注射或靜脈內輸注形式施用。凍乾的藥物產品由化合物組成，該化合物已在注射用水中或在注射用鹽水中製備，在製備過程中用酸或鹼調節至pH 7.0-9.0，並且然後凍乾。凍乾的化合物可以是25mg至800mg的寡核苷酸。 應當理解，這涵蓋了25mg、50mg、75mg、100mg、125mg、150mg、175mg、200mg、225mg、250mg、275mg、300mg、325mg、350mg、375mg、425mg、450mg、475mg、500mg、525mg、550mg、575mg、600mg、625mg、650mg、675mg、700mg、725mg、750mg、775mg以及800mg的經修飾之凍乾寡核苷酸。此外，在一些實施方式中，凍乾的化合物以在以下範圍內的量存在：25mg至800mg、25mg至700mg、25mg至600mg、25mg至500mg、25mg至400mg、25mg至300mg、25mg至200mg、25mg至100mg、100mg至800mg、200mg至800mg、300mg至800mg、400mg至800mg、500mg至800mg、600mg至800mg、100mg至700mg、150mg至650mg、200mg至600mg、250mg至550mg、300mg至500mg、300mg至400mg、或400mg至600mg。凍乾的藥物產品可以被包裝在 2mL I型透明玻璃小瓶(經過硫酸銨處理的)中，用溴丁基橡膠封閉件塞住並且用鋁FLIP-OFF®密封件密封。
在某些實施方式中，在此提供的藥物組合物包含治療有效量之化合物。在某些實施方式中，該治療有效量足以預防、緩解或改善疾病之症狀或延長正治療的受試者之存活期。確定治療有效量完全處於熟習該項技術者的能力之內。
在某些實施方式中，在此提供的該等藥物組合物可以另外包含其他本領域熟知用量的在藥物組合物中常規存在的輔助組分。因此，例如該等組合物可以包含另外的、可相容的藥物活性材料，例如像止癢劑、收斂劑、局部麻醉劑或抗炎劑，或可以包含對物理配製本發明該等組合物的各種劑型有用之另外材料，如染料、芳香劑、防腐劑、抗氧化劑、遮光劑、增稠劑和穩定劑。然而，當添加此類材料時，它們不應當過度干擾本發明該等組合物的組分之生物活性。可以對該等配製物進行滅菌並且必要時與助劑例如潤滑劑、防腐劑、穩定劑、濕潤劑、乳化劑、用於影響滲透壓的鹽、緩衝劑、著色物質、芳香物質和/或芬芳物質等進行混合，該等助劑不與該配製物中的這個或該等寡核苷酸發生有害相互作用。
脂質部分已用於各種方法中的核酸療法中。在一個方法中，核酸被引入到預形成的脂質體或由陽離子性脂質與中性脂質的混合物製成的脂質複合物中。在另一個方法中，在沒有中性脂質存在的情況下形成與單陽離子性脂質或聚陽離子性脂質的DNA複合物。在某些實施方式中，選擇脂質部分來增加 藥劑向特定細胞或組織之分佈。在某些實施方式中，選擇脂質部分來增加藥劑向脂肪組織的分佈。在某些實施方式中，選擇脂質部分來增加藥劑向肌肉組織的分佈。
在某些實施方式中，使用英脫利匹特(INTRALIPID)來製備包含寡核苷酸之藥物組合物。英脫利匹特係製備用於靜脈內施用的脂肪乳液。它由10%大豆油、1.2%蛋黃磷脂、2.25%甘油以及注射用水組成。另外，添加氫氧化鈉以調節pH使得最終產品pH範圍係6至8.9。
在某些實施方式中，在此提供的藥物組合物包含聚胺化合物或與核酸複合的脂質部分。此類製備描述在PCT公佈WO/2008/042973中，為了揭露脂質製備該文獻藉由引用以其全部內容結合在此。某些另外的製備描述在埃克裡克(Akinc)等人，自然生物技術(Nature Biotechnology)26,561-569(2008年5月1日)中，為了揭露脂質製備，該參考文件藉由引用以其全部內容結合在此。
在某些實施方式中，在此提供的多種藥物組合物包含一種或多種化合物和一種或多種賦形劑。在某些此類實施方式中，賦形劑選自：水、鹽溶液、醇、聚乙二醇、明膠、乳糖、澱粉酶、硬脂酸鎂、滑石、矽酸、粘性石蠟、羥甲基纖維素以及聚乙烯吡咯啶酮。
在某些實施方式中，在此提供的藥物組合物使用已知的技術，包括但不限於混合、溶解、造粒、制糖丸、粉碎、乳化、囊封、截留或壓片工藝來製備。
在某些實施方式中，在此提供的藥物組合物係液體(例如，混懸液、酏劑和/或溶液)。在某些此類實施方式中，液體藥物組合物使用本領域已知成分，包括但不限於水、二醇、油、醇、芳香劑、防腐劑以及著色劑來製備。
在某些實施方式中，在此提供的藥物組合物係固體(例如，散劑、片劑和/或膠囊)。在某些此類實施方式中，包含一種或多種寡核苷酸的固體藥物組合物使用本領域已知的成分，包括但不限於澱粉、糖、稀釋劑、粒化劑、潤滑劑、粘合劑以及崩解劑來製備。
在某些實施方式中，在此提供的藥物組合物被配製成儲積型(depot)製劑。某些此類儲積型製劑典型地比非儲積型製劑作用更長。在某些實施方式中，此類製劑藉由植入(例如，皮下或肌肉內)或藉由肌肉內注射來施用。在某些實施方式中，儲積型製劑使用適合的聚合材料或疏水材料(例如，可接受的油中的乳液)或離子交換樹脂或作為微溶性衍生物(例如作為微溶性鹽)來製備。
在某些實施方式中，在此提供的藥物組合物包含遞送系統。遞送系統之實例包括但不限於脂質體和乳液。某些遞送系統適用於製備某些藥物組合物，包括包含疏水化合物的那些組合物。在某些實施方式中，使用了某些有機溶劑，如二甲亞碸。
在某些實施方式中，在此提供的藥物組合物包含被設計成將在此提供的一種或多種化合物遞送至特定組織或細胞類型的一種或多種組織特異性遞送分子。例如，在某些實施方式中，藥物組合物包括塗有組織特異性抗體的脂 質體。
在某些實施方式中，在此提供之藥物組合物包含共溶劑系統。某些此類共溶劑系統包含例如苯甲醇、非極性表面活性劑、水不可混溶的有機聚合物以及水相。在某些實施方式中，此類共溶劑系統用於疏水化合物。這種共溶劑系統的一非限制性實例係VPD共溶劑系統，該VPD共溶劑系統係包含3% w/v苯甲醇、8% w/v非極性表面活性劑聚山梨醇酯80TM和65% w/v聚乙二醇300的無水乙醇溶液。此類共溶劑系統中的比例可以在不顯著改變它們的溶解性和毒性特徵情況下大幅度改變。此外，共溶劑組分之特性可以改變：例如，可以使用其他表面活性劑代替聚山梨醇酯80TM；聚乙二醇的部分大小可以改變；其他生物可相容聚合物可以代替聚乙二醇，例如聚乙烯吡咯啶酮；並且其他糖或多糖可以取代葡萄糖。
在某些實施方式中，在此提供的藥物組合物包含持續釋放系統。這種持續釋放系統的一非限制性實例係固體疏水聚合物之半滲透基質。在某些實施方式中，持續釋放系統可以取決於它們的化學性質在數小時、數天、數週或數月的時間裡釋放藥劑。
在某些實施方式中，在此提供之藥物組合物被製備用於口服施用。在某些此類實施方式中，藥物組合物藉由將包含經修飾之寡核苷酸的一種或多種化合物與一種或多種藥學上可接受的載劑組合來配製。某些此類載劑能夠使藥物組合物配製成用於由受試者口服攝入的片劑、大丸劑、糖衣丸、膠囊、液體、凝膠、糖漿、漿料、混懸劑等。在某些實施方式中，用於口服使用的 藥物組合物藉由將寡核苷酸與一種或多種固體賦形劑混合來獲得。適合的賦形劑包括但不限於：填充劑，如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纖維素製劑，例如像玉米澱粉、小麥澱粉、米澱粉、土豆澱粉、明膠、黃蓍膠、甲基纖維素、羥丙甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和/或聚乙烯吡咯啶酮(PVP)。在某些實施方式中，可隨意地研磨這種混合物並且可隨意地添加助劑。在某些實施方式中，使藥物組合物成形以獲得片劑或糖衣丸芯。在某些實施方式中，添加崩解劑(例如，交聯聚乙烯吡咯啶酮、瓊脂或海藻酸或其鹽，如海藻酸鈉)。
在某些實施方式中，糖衣丸芯具有塗層。在某些此類實施方式中，可以使用濃縮的糖溶液，該等濃縮的糖溶液可以可隨意地包含阿拉伯膠、滑石、聚乙烯吡咯啶酮、卡波姆凝膠、聚乙二醇和/或二氧化鈦、漆溶液以及適合的有機溶劑或溶劑混合物。可以將染料或顏料添加至片劑或糖衣丸塗層中。
在某些實施方式中，用於口服施用之藥物組合物係由明膠製成之推入配合膠囊。某些此類推入配合膠囊包含與一種或多種填充劑如乳糖、粘合劑如澱粉和/或乳化劑如滑石或硬脂酸鎂以及可隨意地穩定劑相混合的本發明的一種或多種藥劑。在某些實施方式中，用於口服施用的藥物組合物係由明膠和增塑劑(如甘油或山梨醇)製成之軟密封膠囊。在某些軟膠囊中，本發明的一種或多種藥劑被溶解或懸浮在適合液體中，如脂肪油、液體石蠟或液體聚乙二醇。另外，可以添加穩定劑。
在某些實施方式中，藥物組合物被製備用於經頰施用。某些此類藥物組 合物是以常規方式配製之片劑或錠劑。
在某些實施方式中，藥物組合物被製備用於藉由注射(例如，靜脈內、皮下、肌肉內等)來施用。在某些此類實施方式中，藥物組合物包含載劑並且被配製在水溶液中，如水或生理上相容的緩衝液如漢克斯溶液(Hanks's solution)、林格氏溶液(Ringer's solution)或生理鹽水緩衝液。在某些實施方式中，包括其他成分(例如，幫助溶解或充當防腐劑的成分)。在某些實施方式中，使用適當液體載劑、懸浮劑等來製備可注射混懸液。某些注射用藥物組合物以單位劑型存在，例如在安瓿中或在多劑量容器中。某些注射用藥物組合物係油性或水性媒介物中的混懸液、溶液或乳液，並且可以包含配製劑，如懸浮劑、穩定劑和/或分散劑。適合用於注射用藥物組合物的某些溶劑包括但不限於：親脂性溶劑和脂肪油，如芝麻油；合成脂肪酸酯，如油酸乙酯或甘油三酯；以及脂質體。水性注射混懸液可以包含增加該混懸液的粘度的物質，如羧甲基纖維素鈉、山梨醇或葡聚糖。可隨意地，此類混懸液還可以包含適合的穩定劑或增加藥劑溶解性以允許製備高濃度溶液的藥劑。
在某些實施方式中，藥物組合物被製備用於透粘膜施用。在某些此類實施方式中，在配製物中使用了適合於透過屏障之滲透劑。此類滲透劑通常是本領域中已知的。
在某些實施方式中，在此提供的一種或多種經修飾之寡核苷酸以前藥形式施用。在某些實施方式中，當體內施用時，前藥以化學或酶促方式轉化為寡核苷酸的生物學上、藥學上或治療上更有活性之形式。在某些實施方式 中，前藥係有用的，因為它們比對應的活性形式更容易施用。例如，在某些情況下，前藥可以是比對應的活性形式更具有可生物利用性(例如，藉由口服施用)。在某些實施方式中，前藥具有優良的跨細胞膜傳輸。在某些實施方式中，前藥有利於經修飾之寡核苷酸遞送至所希望之細胞類型、組織或器官。在某些實施方式中，前藥係包含共軛的經修飾之寡核苷酸之化合物。在某些實施方式中，與對應的活性形式相比，前藥可以具有提高的溶解性。在某些實施方式中，前藥比對應的活性形式的水溶性小。在某些實施方式中，前藥係酯。在某些此類實施方式中，當施用時，該酯被代謝水解成羧酸。在某些情況下，含有羧酸之化合物係對應的活性形式。在某些實施方式中，前藥包含結合至酸基團之短肽(聚胺基酸)。在某些此類實施方式中，當施用時，該肽裂解以形成對應的活性形式。
在某些實施方式中，藉由修飾藥物活性化合物以使得該活性化合物在體內施用時將再生來產生前藥。該前藥可以被設計成改變藥物的代謝穩定性或轉運特徵，掩蔽副作用或毒性，改進藥物的香味和/或改變藥物的其他特徵或特性。憑藉體內的藥物動力學過程和藥物代謝的知識，熟習該項技術者一旦已知藥物活性化合物，就可以設計該化合物的前藥(參見，例如諾甘地(Nogrady)(1985)藥物化學A生物化學方法(Medicinal Chemistry A Biochemical Approach)，牛津大學出版，紐約，第388-392頁)。在某些實施方式中，前藥係包含連接至共軛的部分上的經修飾之寡核苷酸之化合物，連接之方式允許在體內施用時該共軛部分裂解和該經修飾之寡核苷酸再生。 包含連接至可裂解的共軛部分之經修飾之寡核苷酸之化合物(例如像在此描述的具有結構B、C、D、(I)或(II)的化合物)在體內施用時，可以釋放未共軛形式的該經修飾之寡核苷酸。
某些施用途徑
在某些實施方式中，向受試者施用包括腸胃外施用。在某些實施方式中，向受試者施用包括靜脈內施用。在某些實施方式中，向受試者施用包括皮下施用。
在某些實施方式中，向受試者施用包括動脈內、肺部、口服、直腸、透粘膜、腸內、小腸內、局部、透皮、栓劑、鞘內、心室內、腹膜內、鼻內、眼內、肌肉內、髓內以及瘤內施用。
某些另外療法
對於與靶RNA相關的疾病的治療可以包括多於一種療法。因此，在某些實施方式中，在此提供了用於治療患有或懷疑患有與靶RNA相關的疾病的受試者之方法，該等方法包括除了施用GalNAc共軛的經修飾之寡核苷酸以外，還施用至少一種療法。
在某些實施方式中，該至少一種另外的療法包含藥劑。
在某些實施方式中，藥劑包括抗炎劑。在某些實施方式中，抗炎劑係類固醇抗炎劑。在某些實施方式中，類固醇抗炎劑係皮質類固醇。在某些實施方式中，皮質類固醇係強的松(prednisone)。在某些實施方式中，抗炎劑係 非類固醇抗炎藥物。在某些實施方式中，非類固醇抗炎劑係布洛芬(ibuprofen)、COX-I抑制劑或COX-2抑制劑。
在某些實施方式中，藥劑包括但不限於：利尿劑(例如螺內酯(sprionolactone)、依普利酮(eplerenone)、利尿磺胺)、正性肌力藥(例如多巴酚丁胺、米力農(milrinone))、地高辛(digoxin)、血管擴張劑、血管緊張素II轉換酶(ACE)抑制劑(例如是卡托普利(captopril)、依那普利(enalapril)、賴諾普利(lisinopril)、貝那普利(benazepril)、喹那普利(quinapril)、福辛普利(fosinopril)以及雷米普利(ramipril))、血管緊張素II受體阻斷劑(ARB)(例如坎地沙坦(candesartan)、厄貝沙坦(irbesartan)、奧美沙坦(olmesartan)、氯沙坦(losartan)、纈沙坦(valsartan)、替米沙坦(telmisartan)、依普羅沙坦(eprosartan))、鈣通道阻斷劑、硝酸異山梨酯、肼屈
Figure 103115652-A0202-12-0085-88
、硝酸酯類(例如單硝酸異山梨酯、硝酸異山梨酯)、肼屈
Figure 103115652-A0202-12-0085-89
、β-阻斷劑(例如卡維地洛(carvedilol)、美托洛爾(metoprolol))以及利鈉肽(例如奈西立肽)。
在某些實施方式中，藥劑包括類肝素。在某些實施方式中，類肝素係戊聚糖多硫酸酯。
在某些實施方式中，另外的療法可以是增強身體免疫系統之藥劑，包括低劑量環磷醯胺、胸腺刺激素、維生素和營養補充劑(例如，抗氧化劑，包括維生素A、維生素C、維生素E、β-胡蘿蔔素、鋅、硒、谷胱甘肽、輔酶Q-10以及松果菊)以及疫苗，例如包含組合多聚體形式之抗原和佐劑之疫苗 配製物之免疫刺激性複合物(ISCOM)。
在某些實施方式中，選擇該另外的療法來治療或改善本發明的一種或多種藥物組合物之副作用。此類副作用包括但不限於：注射部位反應、肝功能測試異常、腎功能異常、肝毒性、腎毒性、中樞神經系統異常以及肌病。例如，血清中的轉胺酶水平增加可以表明肝毒性或肝功能異常。例如，膽紅素增加可以表明肝毒性或肝功能異常。
另外的藥劑的其他實例包括但不限於：免疫球蛋白，包括但不限於靜脈內免疫球蛋白(IVIg)；鎮痛劑(例如，對乙醯胺基酚)；水楊酸鹽；抗生素；抗病毒劑；抗真菌劑；腎上腺素能調節劑；激素(例如，合成代謝類固醇、雄激素、雌激素、降鈣素、孕激素、生長抑素(somatostan)以及甲狀腺激素)；免疫調節劑；肌肉鬆弛劑；抗組胺劑；骨質疏鬆劑(例如，雙膦酸鹽、降鈣素和雌激素)；前列腺素；抗腫瘤劑；心理治療劑；鎮靜劑；毒橡樹或毒漆樹產物；抗體；以及疫苗。
某些試劑盒
在此提供之任何化合物可以存在於試劑盒中。該試劑盒還可以包含關於使用在此提供的化合物之說明書。在一些實施方式中，在此提供之化合物可以存在於小瓶內。在例如分配包裝中可以存在多個小瓶，如10個。在一些實施方式中，小瓶製造成注射器可接近。
在一些實施方式中，該等試劑盒可以用於向受試者施用在此提供的化合物。在此類情況下，除了在此提供的化合物以外，該試劑盒可以進一步包括 以下中的一個或多個：注射器、酒精棉簽、棉球和/或紗布墊。在一些實施方式中，該等化合物可以存在於預填充注射器(如具有例如帶針保護器的27號、½英吋針頭的單次劑量注射器)中，而不是小瓶中。在例如分配包裝中可以存在多個預填充注射器，如10個。該試劑盒還可以包含關於施用該等化合物之說明書。
某些定量測定
可以藉由本領域中已知的各種方法來評價經修飾之寡核苷酸對它的靶RNA的活性之作用。在某些實施方式中，該等方法用來定量體外或體內細胞或組織中之微小RNA水平。
在某些實施方式中，藉由微陣列分析來測量靶標水平和/或活性的變化。在某些實施方式中，藉由若干商業上可獲得的PCR測定之一如TaqMan®微小RNA測定(應用生物系統)來測量靶標水平和/或活性之變化。
可以使用螢光素酶細胞培養測定來評價抗miR化合物之體外活性。在這個測定中，微小RNA螢光素酶感測器構建體被工程改造成包含相關微小RNA的一個或多個結合位點以及螢光素酶基因。當微小RNA結合螢光素酶感測器構建體中它的同源位點時，螢光素酶表現被壓制。當將適當的抗miR引入到細胞中時，它結合靶微小RNA並且解除螢光素酶表現的壓制。因此，在這個測定中，作為相關抗miR的有效抑制劑的抗miR將引起螢光素酶表現增加。
可以藉由測量微小RNA的靶標之mRNA和/或蛋白質水平來評價抗miR 化合物之活性。微小RNA在一個或多個靶RNA內結合它的同源位點，導致壓制靶RNA，因此抑制該微小RNA引起該微小RNA的靶標之mRNA和/或蛋白質的水平增加(即，去阻抑)。可以在體內或體外測量一個或多個靶RNA的去阻抑。
實例
提出以下實例以便更完全地說明本發明的一些實施方式。然而，該等實 例決不應當解釋為對本發明寬泛範圍之限制。熟習該項技術者將易於在不背 離本發明精神情況下，採用本發現基本原理來設計各種化合物。
實例1：共軛的經修飾之寡核苷酸
藉由將圖2中的結構共軛至表A中示出的經修飾之寡核苷酸的3’末端上來形成含GalNAc之化合物。糖部分、核苷間鍵聯以及核鹼基指明如下：上標“Me”表明5-甲基胞嘧啶；後面沒有下標之核苷係β-D-去氧核糖核苷；後面有下標“E”之核苷係2’-MOE核苷；後面有下標“S”之核苷係S-cEt核苷；後面有下標“L”之核苷係LNA核苷；並且每個核苷間鍵聯都是硫代磷酸酯核苷間鍵聯。
Figure 103115652-A0202-12-0088-28
Figure 103115652-A0202-12-0089-29
評價該GalNAc共軛的經修飾之寡核苷酸的體內效力，全長未共軛的經修飾之寡核苷酸的釋放以及肝臟和組織濃度。
為了確定體內效力，針對該等化合物使通常被miR-122活性壓制的基因，即髒醛縮酶A(ALDOA)的表現去阻抑的能力，對它們進行評估。抑制miR-122導致ALDOA表現增加，因此ALDOA mRNA水平可以用來測量體內之miR-122抑制活性。向小鼠施用化合物，並且藉由定量PCR測量從肝臟中分離出的RNA中的ALDOA mRNA水平。相對於鹽水，計算ALDOA mRNA的倍數變化以確定體內效力。
如在圖3A和3B中所示，在表A中示出的每個GalNAc共軛的經修飾之寡核苷酸比對應的未共軛的經修飾之寡核苷酸更有效。相對於未共軛的38128和38577，化合物38856和38853展現出效力增加大約10倍。
還測試了在表B中示出的含LNA的未共軛和共軛的經修飾之寡核苷酸。
Figure 103115652-A0202-12-0089-30
Figure 103115652-A0202-12-0090-31
糖部分和鍵部分指明如下：其中後面沒有下標之核苷表明β-D-去氧核糖核苷；後面有下標“L”之核苷表明LNA核苷；並且每個核苷間鍵聯都是硫代磷酸酯核苷間鍵聯。
根據與以上所述相同的方案測試化合物38848和38852的體內效力，以評估該等化合物抑制miR-122活性和增加ALDOA表現的能力。如在圖4A中所示，雖然每種化合物均是miR-122的有效抑制劑，但是GalNAc共軛的化合物38852展現出比未共軛的化合物38848更大之效力。
根據與以上所述相同的方案測試化合物38632之體內效力，以評估該化合物抑制miR-122活性和增加ALDOA表現之能力。如在圖4B中所示，雖然每種化合物均是miR-122的有效抑制劑，但是GalNAc共軛的化合物38632展現出比未共軛的化合物38848和共軛的化合物38852這兩者更大的效力。在這個實驗中，38848的ED5O係4.24mg/kg，並且38632的ED50係0.31mg/kg，證明了效力提高至少20倍。
藉由將圖2中的結構共軛至38649經修飾之寡核苷酸的3’末端上來制得 另外的含GalNAc之化合物。經修飾之寡核苷酸38649具有結構AE MeCEAE MeCE MeCEAETETGUSCSACSACSTCSCS，其中上標“Me”表明5-甲基胞嘧啶；後面沒有下標之核苷係β-D-去氧核糖核苷；後面有下標“E”之核苷係2’-MOE核苷；後面有下標“S”之核苷係S-cEt核苷；並且每個核苷間鍵聯都是硫代磷酸酯核苷間鍵聯。
該含GalNAc的部分與38649的3’-末端之間的鍵有所不同，如在表C中所示。例如，在化合物38368中，該含GalNAc的部分藉由磷酸二酯鍵直接連接至38649的3’-末端核苷上，如在圖2C中所示，其中X係磷酸二酯鍵並且MO係38649。在化合物38458中，該含GalNAc的部分藉由β-D-去氧核苷連接至38649的3’-末端核苷上，其中在38649的3’-末端核苷之間具有硫代磷酸酯鍵並且在該β-D-去氧核苷與該含GalNAc的部分之間具有磷酸二酯鍵，如在圖2A中所示，其中X2係硫代磷酸酯鍵，m係1，Nm係β-D-去氧核苷，X1係磷酸二酯鍵，並且MO係38649。
Figure 103115652-A0202-12-0091-32
Figure 103115652-A0202-12-0092-33
如在圖5A、5B和5C中所示，表C中的這三種GalNAc共軛的經修飾之寡核苷酸中的每一種都比未共軛的經修飾之寡核苷酸更有效。相對於未共軛之38649，化合物38368和38371展現出效力增加大約3倍(圖5A)。化合物38458和38459(每種化合物均具有β-D-去氧核糖核苷連接基團)展現出效力增加至少10倍(圖5B)。化合物38597和38598(每種化合物均具有2’-糖修飾的連接基團)也展現出效力增加至少10倍(圖5C)。在另外的研究中，針對化合物38459、38458、38597和38598，已觀察到效力增加高達20倍。
還測量了在1mg/kg和3mg/kg劑量下單次皮下給予化合物38368和38371以及在0.3mg/kg、1mg/kg和3mg/kg劑量下單次皮下給予化合物38458和38459第7天后的肝臟和腎臟組織中的未共軛的經修飾之寡核苷酸之量。對每個樣品進行高效液相層析法-飛行時間質譜法(HPLC-TOF MS)以測量寡核苷酸長度和量。由這種方法定量的下限(LLOQ)係0.2μg/g至1.0μg/g。
發現該等GalNAc共軛的經修飾之寡核苷酸具有不同的未共軛的經修飾之寡核苷酸之形成速率。例如，在施用化合物38368之後，在肝臟中檢測到小於10%的化合物38649(未共軛的經修飾之寡核苷酸)。在施用化合物38371之後，在化合物38371的任一劑量下，在肝臟中都檢測不到化合物38649。相反地，在皮下施用化合物38459七天后，僅檢測到的未共軛的經修飾之寡核苷酸種類係未共軛之38649；未檢測到母體化合物38459。在施用化合物38458之後，檢測到兩種形式的未共軛的經修飾之寡核苷酸：38649以及38649-PO-A(化合物38458的一代謝物)。在高於未共軛的38649的水平處檢測到這種代謝物。
還測量了在0.3mg/kg、1mg/kg和3mg/kg劑量下單次皮下給予化合物38458和38459之後24小時肝臟中的未共軛的經修飾之寡核苷酸的量。藉由LC-TOF測量抗miR水平。由這種方法定量的下限(LLOQ)係0.2μg/g至1.0μg/g。觀察到在施用化合物38459之後，存在於肝臟中的總化合物的90%係未共軛的化合物38649。在施用38458之後，存在於肝臟中的總化合物的大約46%係未共軛的化合物38649。因此，未共軛的化合物38649從化合物38459的釋放比從化合物38458的釋放快。
寡核苷酸一般在腎臟組織中的積累水平最高，接著是肝臟組織。關於未共軛的化合物，為了確定GalNAc共軛物相比於腎臟組織是否改變了化合物在肝臟組織中的積累，還測量了腎臟組織中未共軛的38649的量。如上所述，在施用化合物38459之後，在肝臟中發現的總化合物的100%都是未共軛的 38649，這表明38649從該GalNAc共軛的化合物38459中完全釋放。在施用化合物38459之後，相對於施用化合物38649之後的化合物38649的積累，相對於肝臟，化合物38649在腎臟中積累更少(即展現出更低的腎臟：肝臟比率)。因此，與未共軛的38649相比，38459可以優先將化合物38649遞送至肝臟，同時使向腎臟的遞送減至最少。
在體內研究中評估了化合物38459的作用之起效和持續時間。給予各組小鼠0.1mg/kg、0.3mg/kg、1mg/kg和3mg/kg的化合物38459的單次皮下(SC)劑量。在10mg/kg的劑量下向另外一組小鼠施用未共軛的化合物38649。來自每種處理的一組動物在第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第14天、第21天、第28天和第56天的每一天被處死。從肝臟中分離出RNA，並且藉由即時PCR測量ALDOA mRNA水平。計算每組的平均ALDOA水平。相對於對照組(PBS-處理的)之倍數變化在表D中示出。
Figure 103115652-A0202-12-0094-34
Figure 103115652-A0202-12-0095-35
表D中的數據證明化合物38459以及化合物38649具有快速的作用起效，如藉由早在單次劑量的化合物後1天的ALDOA去阻抑所證實。另外，在單次給予化合物之後，ALDOA去阻抑維持至少8週。
該等數據證明：效力比未共軛的38649化合物高至少10倍的GalNAc共軛的化合物38459在顯著更低的肝臟組織濃度下即可實現這種效力，其中優先遞送至肝臟組織。另外，化合物38459展現出快速的作用起效和至少8週之作用持續時間。
實例2：共軛的較短修飾寡核苷酸
藉由將圖2中的結構共軛至表E中示出的經修飾之寡核苷酸的3’末端上來形成含GalNAc之化合物。糖部分、核苷間鍵聯以及核鹼基指明如下：後面沒有下標的之核苷係β-D-去氧核糖核苷；後面有下標“S”之核苷係S-cEt核苷；並且每個核苷間鍵聯都是硫代磷酸酯核苷間鍵聯。
Figure 103115652-A0202-12-0095-37
Figure 103115652-A0202-12-0096-38
為了確定體內效力，評估該等化合物使肝臟醛縮酶A(ALDOA)之表現去阻抑之能力。向小鼠施用化合物，並且藉由定量PCR測量從肝臟中分離出的RNA中之ALDOA mRNA水平。相對於鹽水，計算ALDOA mRNA的倍數變化以確定體內效力(圖6A和6B以及圖7A和7B)。從那些實驗的結果中計算的ED50(ALDOA去阻抑係最大值的50%的化合物濃度)和ED90(ALDOA去阻抑係最大值的90%的化合物濃度)在表F和表G中示出。
Figure 103115652-A0202-12-0096-39
Figure 103115652-A0202-12-0096-40
如在表F中所示，根據本發明之GalNAc共軛使8聚體抗miR-122化合物的ED50和ED90提高至少100倍。如在表G中所示，根據本發明之GalNAc共軛使13聚體抗miR-122化合物之ED50和ED90提高至少10倍。
還確定了化合物38634和38998對另一種miR-122靶基因CD320之去阻抑。結果類似於針對在表F中示出的ALDOA所獲得之結果：根據本發明之GalNAc共軛分別使實驗1和實驗2中的ED50提高343倍和272倍，並且分別使實驗1和實驗2中的ED90提高492倍和545倍。
在此描述的GalNAc共軛還提高了針對包含GalNAc的該等化合物所觀察到的膽固醇下降效力。來自實驗1之示例性結果在圖8A和8B中示出。作為GalNAc共軛物的化合物38633和38634比缺乏GalNAc的化合物38591和38998更有效。針對實驗2獲得類似結果(數據未示出)。
實例3：共軛的RNA酶H經修飾之寡核苷酸
在此描述的GalNAc共軛還提高了靶向蛋白質編碼RNA的經修飾之寡核苷酸之效力。所測試的該寡核苷酸係靶向PTEN mRNA的5-10-5 2’-MOE修飾的‘缺口體’。該缺口體經修飾之寡核苷酸與PTEN mRNA雜交導致該mRNA被RNA酶H裂解，從而降低PTEN mRNA的水平。藉由化合物降低PTEN mRNA的水平的能力來評估該化合物的效力。
藉由將圖2中的結構共軛至表H中所示的經修飾之寡核苷酸的3’末端上來形成含GalNAc的化合物。
表H：未共軛和共軛的經修飾之寡核苷酸
Figure 103115652-A0202-12-0098-41
糖部分、核苷間鍵聯以及核鹼基指明如下：上標“Me”表明5-甲基胞嘧啶；後面沒有下標之核苷係β-D-去氧核糖核苷；後面有下標“E”之核苷係2’-O-甲氧基乙基核苷；並且每個核苷間鍵聯都是硫代磷酸酯核苷間鍵聯。
在1mg/kg、3mg/kg和10mg/kg的劑量下，向小鼠皮下施用單次劑量的未共軛的化合物(n=3)。在0.03mg/kg、0.1mg/kg、0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg和10mg/kg的劑量下，向小鼠皮下施用單次劑量的共軛的化合物(n=6)。施用後兩天，終止研究，並且從由每只動物中收集的肝臟組織中萃取RNA。進行定量PCR以測量PTEN mRNA的水平。如在表I中所示，化合物38631在測試的任何3個劑量下都不會顯著減少PTEN mRNA。然而，在3mg/kg和10mg/kg的劑量下，含GalNAc的化合物顯著減少PTEN mRNA。
Figure 103115652-A0202-12-0098-42
Figure 103115652-A0202-12-0099-43
實例4：共軛的經修飾之寡核苷酸
將抗miR-21修飾之寡核苷酸共軛至含GalNAc的部分上，以確定該共軛是否將提高該等寡核苷酸的效力。
藉由將圖1中的結構共軛至36731修飾之寡核苷酸的3’末端上來形成含GalNAc之化合物。在化合物40601中，該含GalNAc的部分藉由β-D-去氧核苷連接至36731的3’-末端核苷上，其中在36731的3’-末端核苷之間具有磷酸二酯(PO)鍵並且在該β-D-去氧核苷(β-D-去氧腺苷(A))與該含GalNAc的部分之間具有磷酸二酯(PO)鍵，如在圖2A中所示，其中X2係磷酸二酯鍵，m係1,Nm係β-D-去氧核苷(A),X1係磷酸二酯鍵，並且MO係化合物36731。在化合物40379中，該含GalNAc的部分藉由在36731的3’-末端核苷與該含GalNAc的部分之間的磷酸二酯(PO)鍵連接至36731的3’-末端核苷上，如在圖2C中所示，其中X係磷酸二酯鍵，並且MO係化合物36731。
40601：AECSAETECSAEGETECSTGAUSAAGCSUSAS-PO-A-PO-GalNAc
40379：AECSAETECSAEGETECSTGAUSAAGCSUSAS-PO-GalNAc
在三至五隻野生型C7/B16小鼠中單次皮下給予化合物之後48小時和168小時，測量36731和40601的肝臟濃度。在1mg/kg、3mg/kg和10mg/kg下施用36731的經修飾之寡核苷酸部分，並且在0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg 和10mg/kg下施用40601。對每個樣品進行液相層析法串聯質譜法(LC-MS/MS)以測量寡核苷酸長度和量。如在表J和圖9A中所示，在這兩個時間點，施用40601之後經修飾之寡核苷酸的肝臟濃度比施用類似劑量的36731之後顯著更高。在圖9A和表J中示出的每個40601濃度係由LC-MS/MS檢測的所有含經修飾之寡核苷酸的物種之總濃度。共軛經修飾之寡核苷酸引起肝臟中的化合物與劑量成比例增加。
還評估了40601釋放經修飾之寡核苷酸36731之代謝作用。發現在單次皮下施用化合物40601之後48小時，由LC-MS/MS鑒定的主要物種係36731。表J和表9B示出在單次皮下施用化合物36731或化合物40601之後在小鼠肝臟中的經修飾之寡核苷酸36731的濃度。表J示出在施用40601之後在小鼠肝臟中檢測到的36731物種之百分比(CV%=變異係數)。
Figure 103115652-A0202-12-0100-44
Figure 103115652-A0202-12-0101-45
在五隻野生型C7/B16小鼠中單次皮下給予化合物之後48小時和168小時，還測量了40379的肝臟濃度。在0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg和10mg/kg下施用該化合物。對每個樣品進行液相層析法串聯質譜法(LC-MS/MS)以測量寡核苷酸長度和量。如針對化合物40601所觀察，在這兩個時間點，施用40379之後化合物的肝臟濃度比施用類似劑量的36731之後顯著更高。共軛經修飾之寡核苷酸引起肝臟中的化合物與劑量成比例增加。還評估了40379釋放經修飾之寡核苷酸36731之代謝作用。發現在單次皮下施用化合物40601之後48小時，存在化合物36371，但是相對於在施用化合物40379後存在的化合物36371的量處於較低濃度(數據未示出)。然而，在48小時或168小時之後至少50%的化合物40601以化合物36731形式存在，大約15%至30%的化合物40379以化合物36731形式存在。因此，雖然化合物40379確實經歷了引起未共軛的化合物36731的釋放的一些代謝作用，但是未共軛的化合物的釋放小於關於化合物40601所觀察到的釋放。該等數據表明PO-A-PO接頭的存在促進了未共軛的經修飾之寡核苷酸從含GalNAc之化合物中釋放。
為了評價抑制miR-21對已知的mRNA靶標之作用，在向野生型小鼠施 用單次劑量的36731(1mg/kg和10mg/kg)或單次劑量的40601(0.1mg/kg、1mg/kg和10mg/kg)之後測量正常小鼠肝臟中的SPG20、Rnf167和Taf7的去阻抑。在施用之後4天或7天收集肝臟。如在表K中所示，在單次給予36731之後七天觀察到SPG20和Taf7之適度靶基因去阻抑，而Rnf167在最高劑量下在這兩個時間點去阻抑。單次劑量施用40601表明在這兩個時間點SPG20和Taf7兩者之靶去阻抑提高和類似的Rnf167去阻抑。提高之靶去阻抑包括靶基因表現更大倍數變化和去阻抑更早起效。
Figure 103115652-A0202-12-0102-46
在用來對小鼠中的肝細胞癌(HCC)進行建模的肝臟特異性強力黴素調節的致癌基因表現系統中，評估抗miR-21化合物的遞送和功效。在這個模型 中，轉基因小鼠在強力黴素可阻抑的肝臟特異性啟動子(Tet-o-H-rasG12V；LAP-TTA；參見例如林(Lim)等人，肝病學(Hepatology),2013)的控制下表現致癌基因H-rasG12V。當去除強力黴素時，在肝臟中啟動H-rasG12V轉基因表現並且小鼠發展肝臟腫瘤。已證實，在去除強力黴素後至少6週，GalNAc受體ASGR1和ASGR2的表現仍保持高水平，而miR-21表現隨著形態上可檢測的疾病發作而增加(數據未示出)。
為了證明化合物40601和36731向肝臟腫瘤之遞送，在去除強力黴素之後4週向小鼠施用該等化合物，到這個時候小鼠具有顯著的腫瘤負荷。在每組五隻小鼠中兩次給予化合物之後，在168小時測量肝臟腫瘤組織(包含腫瘤的整個肝臟)中的36731和40601的濃度。在0小時給予第一劑量，在72小時給予第二劑量並且在168小時收集腫瘤組織。在10mg/kg下施用化合物36731，而在0.1mg/kg、1mg/kg和10mg/kg下施用化合物40601。如在表L中所示，與36731相比，40601達到的總藥物水平係80%以上。從化合物40601上釋放的36731修飾之寡核苷酸在總量的44%與70%之間。
Figure 103115652-A0202-12-0103-47
Figure 103115652-A0202-12-0104-48
還在肝臟腫瘤組織中評估了在正常肝臟中評估的三種miR-21靶基因的靶去阻抑。雖然沒有達到統計顯著性，但是與媒介物相比在處理的肝臟腫瘤組織中存在趨向去阻抑之趨勢。表M示出在施用化合物40601或化合物36731之後肝臟腫瘤組織中的SPG21、Rnf167和Taf7之去阻抑。
Figure 103115652-A0202-12-0104-49
另外，在施用化合物40601或化合物36731後評估肝臟腫瘤組織中的AFP水平。在接受兩週一次劑量的10mg/kg 40601的小鼠中存在趨向AFP水平降低之趨勢。
接下來，在Tet-o-H-rasG12V；LAP-TTA轉基因小鼠中測試化合物40601和36731的功效。藉由從6週齡雄性小鼠中去除強力黴素來引發腫瘤發展。 在去除強力黴素兩週之後，將小鼠分成5個治療組：媒介物36731 25mg/kg兩週一次(BIW),40601 25mg/kg BIW,40601 25mg/kg每週一次(Q7D)以及40601 5mg/kg BIW。對小鼠處理4週。肝臟形態(斑雜外觀)用作腫瘤形成之指示，並且在研究結束時由對治療組一無所知的調查者來評分。如在 表N中所示，媒介物組中的大多數(6/8)動物具有斑雜肝臟，而在25mg/kg 36731 BIW組中的大約一半(5/9)動物具有斑雜肝臟。在化合物40601的該等BIW施用組中看到斑雜外觀發生率極大地減小，其中25mg/kg 40601 BIW組中3/8和5mg/kg 40601 BIW組中2/8顯示斑雜肝臟。每週一次施用25mg/kg 40601產生與媒介物類似的斑雜外觀頻率(8/10)。
Figure 103115652-A0202-12-0105-51
在研究結束時，藉由西方墨點(Western blot)分析根據樣品中的肝臟腫瘤的標記物對肝臟腫瘤組織AFP進行評價，根據β-肌動蛋白進行歸一化。如在表O中所示，用25mg/kg 40601 BIW處理使AFP顯著降低。
Figure 103115652-A0202-12-0105-52
在轉基因小鼠的肝臟腫瘤組織中評價36731或40601施用後之靶去阻 抑。如在表P中所示，在研究結束時SPG20和Rnf167轉錄物在來自36731和40601 BIW施用組的樣品中去阻抑。還評估了Taf7，但沒有顯示一致的去阻抑(數據未示出)。
Figure 103115652-A0202-12-0106-53
最後，在研究結束時評估腫瘤藥物濃度。如在表Q中所示，36731和總40601達成相當之水平。從40601中釋放36731修飾之寡核苷酸在所有三個劑量係總量的大約50%。
Figure 103115652-A0202-12-0106-54
為了評估是否存在對更晚期疾病開始處理的效力參數之影響，開始了具有可比設計之研究，除了在去除強力黴素之後4週開始處理並且僅對小鼠處理三週以外。在這個實驗中，不包括每週一次給藥組。在研究結束時測量AFP和靶基因評價。觀察到在40601,25mg/kg BIW的高劑量組中存在趨向AFP水平降低的趨勢(數據未示出)。在該等治療組中還觀察到靶接合，在25mg/kg的36731和40601下Taf7達到統計顯著性(數據未示出)。
如在此所證明，將經修飾之寡核苷酸共軛至含GalNAc的部分上引起該寡核苷酸之效力提高。可以藉由核苷連接基團將該含GalNAc的部分連接至經修飾之寡核苷酸上來進一步提高效力，例如在圖2A和2B中所示。另外，使用核苷連接基團使得未共軛的經修飾之寡核苷酸從共軛的結構中更完全釋放。
實例5：共軛的較短修飾寡核苷酸
藉由將膽固醇共軛至在表R中示出的經修飾之寡核苷酸的3’末端上來形成含膽固醇之化合物。糖部分、核苷間鍵聯以及核鹼基指明如下：後面沒有下標之核苷係β-D-去氧核糖核苷；後面有下標“S”之核苷係S-cEt核苷；並且每個核苷間鍵聯都是硫代磷酸酯核苷間鍵聯，除了由下標(O)指示之核苷間鍵聯以外，該等核苷間鍵聯係磷酸二酯鍵。
Figure 103115652-A0202-12-0108-55
為了確定體內效力，評估該等化合物使肝臟醛縮酶A(ALDOA)的表現去阻抑之能力。向小鼠施用化合物，並且藉由定量PCR測量從肝臟中分離出的RNA中之ALDOA mRNA水平。相對於鹽水，計算ALDOA mRNA的倍數變化以確定體內效力。從那些實驗的結果中計算的ED50(ALDOA去阻抑係最大值的50%的化合物濃度)和ED90(ALDOA去阻抑係最大值的90%之化合物濃度)在表S中示出。
Figure 103115652-A0202-12-0109-56
如在表S中所示，根據本發明之膽固醇共軛使8聚體抗miR-122化合物之ED50和ED90提高至少30倍。
還確定了化合物38070和38998對另一種miR-122靶基因CD320之去阻抑。結果類似於針對ALDOA所獲得的結果(數據未示出)。
在此描述的膽固醇共軛還提高了膽固醇下降效力。在測試的大多數濃度下，化合物38070使膽固醇降低的程度比相同濃度之化合物38998大(數據未示出)。
除了在此描述的那些修改之外，本發明各種修改將因前述說明而對熟習該項技術者變得清楚。意欲此類修改也處於所附申請專利範圍的範圍之內。本申請中引用的每個參考文件(包括，但不限於雜誌文章、美國專利和非美國專利、專利申請公佈、國際專利申請公佈、GENBANK®保藏編號等)藉由引用以其全部內容明確結合在此。
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成
<400> 3
Figure 103115652-A0202-12-0111-59
<210> 4
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 4
Figure 103115652-A0202-12-0111-60
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 5
Figure 103115652-A0202-12-0112-61
<210> 6
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 6
Figure 103115652-A0202-12-0112-62
<210> 7
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 7
Figure 103115652-A0202-12-0112-63
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 8
Figure 103115652-A0202-12-0113-64
Figure 103115652-A0202-11-0002-1

Claims (22)

  1. 一種化合物，其具有以下結構：
    Figure 103115652-A0305-02-0116-1
     其中Nm中每個N是未經修飾之核苷並且m係1或2；X1和X2各自獨立地是磷酸二酯鍵或硫代磷酸酯鍵，其中至少一個X是磷酸二酯鍵；並且MO係經修飾之寡核苷酸。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之化合物，其中X1和X2各自是磷酸二酯鍵。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之化合物，其中Nm中每個N係獨立地為β-D-核糖或β-D-去氧核糖。
  4. 如申請專利範圍第3項所述之化合物，其中至少一個N包含嘌呤核鹼基，其中該嘌呤核鹼基係選自腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤以及7-甲基鳥嘌呤。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之化合物，其中該經修飾之寡核苷酸與第二修飾之寡核苷酸雜交，其中該第二修飾之寡核苷酸之核鹼基序列與該經 修飾之寡核苷酸之核鹼基序列互補。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之化合物，其中該經修飾之寡核苷酸之核鹼基序列與微小RNA之核鹼基序列至少90%相同。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之化合物，其中該微小RNA係人類微小RNA。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之化合物，其中該經修飾之寡核苷酸由12至25個、15至25個、15至22個、或17至22個連接之核苷組成。
  9. 如申請專利範圍第1項所述之化合物，其中該經修飾之寡核苷酸包含具有經修飾之糖部分的至少一個核苷。
  10. 如申請專利範圍第1項所述之化合物，其中該經修飾之寡核苷酸的每個核苷都包含經修飾之糖部分。
  11. 如申請專利範圍第1項所述之化合物，其中該經修飾之寡核苷酸包含具有經修飾之糖部分之多個核苷和具有未經修飾之糖部分之多個核苷。
  12. 如申請專利範圍第1項所述之化合物，其中每個經修飾之糖部分獨立地選自：2’-O-甲基糖部分、2’-O-甲氧基乙基糖部分、2’-氟糖部分以及雙環糖部分。
  13. 如申請專利範圍第12項所述之化合物，其中每個雙環糖部分獨立地選自約束乙基(cEt)糖部分和LNA糖部分。
  14. 如申請專利範圍第13項所述之化合物，其中每個約束乙基(cEt)核苷都是S-cEt核苷。
  15. 如申請專利範圍第1項所述之化合物，其中該經修飾之寡核苷酸的至少一個鍵聯係經修飾之核苷間鍵聯，或其中該經修飾之寡核苷酸的各核苷間鍵聯係經修飾之核苷間鍵聯，且視情況，其中該經修飾之核苷間鍵聯係硫代磷酸酯鍵核苷間鍵聯。
  16. 一種醫藥組合物，其包含如申請專利範圍第1至15項中任一項所述之化合物。
  17. 一種體外方法，包括使細胞與如申請專利範圍第1至15項中任一項所述之化合物相接觸。
  18. 如申請專利範圍第17項所述之方法，其中該細胞係肝臟細胞(liver cell)。
  19. 如申請專利範圍第18項所述之方法，其中該肝臟細胞係肝細胞(hepatocyte)。
  20. 一種提高經修飾之寡核苷酸的效力之方法，該方法包括a)形成具有下列結構之化合物
    Figure 103115652-A0305-02-0118-2
     其中Nm中每個N是未經修飾之核苷並且m係1或2；X1和X2各自獨立地是磷酸二酯鍵或硫代磷酸酯鍵；其中至少一個X為磷酸二酯鍵；並且 MO係經修飾之寡核苷酸，其係由8至25個連結之核苷組成，且包含至少一個具有經約束乙基(cEt)修飾糖部分之核苷，且其中該經修飾之寡核苷酸之核鹼基序列與微小RNA互補；b)從而相對於未共軛的經修飾之寡核苷酸，提高該經修飾之寡核苷酸之效力。
  21. 一種如申請專利範圍第1至15項中任一項所述之化合物用於製備藥物之用途。
  22. 如申請專利範圍第21項所述之用途，其中該藥物係用於治療與存在於肝臟細胞中的靶RNA相關之疾病。
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