CN104254607B

CN104254607B - 用于调节mir-21活性的微小rna化合物及方法

Info

Publication number: CN104254607B
Application number: CN201380020336.8A
Authority: CN
Inventors: B·巴特; E·马库松
Original assignee: Sanofi SA
Current assignee: Sanofi Aventis France
Priority date: 2012-04-25
Filing date: 2013-04-24
Publication date: 2020-10-27
Anticipated expiration: 2033-04-24
Also published as: TW201345918A; NZ630591A; KR20220028183A; CL2017001195A1; US9267137B2; AR090825A1; KR102369722B1; HK1207115A1; ECSP14028612A; US20160244753A1; TWI647235B; DOP2014000233A; CA2869639A1; AU2013251696A1; US20180305691A1; JP6322189B2; IL234904B; PH12014502387A1; EA030211B1; KR20230037703A

Abstract

本文描述了用于抑制miR‑21活性的组合物及方法。这些组合物具有某些产生miR‑21活性的有效抑制剂的核苷修饰型态。这些组合物可用于抑制miR‑21，并且还用于治疗与miR‑21的异常表达相关的疾病，例如纤维化和癌症。

Description

用于调节MIR-21活性的微小RNA化合物及方法

技术领域

本文提供用于调节miR-21活性的方法以及组合物。

相关技术说明

微小RNA(microRNA)亦称为“成熟微小RNA”，为在植物及动物的基因组中编码的小型(长约18-24个核苷酸)非编码RNA分子。在某些情况下，高度保守的内源性表达的微小RNA藉由结合至特定mRNA的3'-非转译区(3'-UTR)来调控基因的表达。已在植物及动物中鉴别出超过1000种不同的微小RNA。某些成熟微小RNA显现是来源于长度通常为数百个核苷酸的长内源性初级微小RNA转录物(亦称为初级微小RNA、初级mir、初级miR或初级微小RNA前体)(Lee等人，EMBO J.,2002,21(17),4663-4670)。

对微小RNA的功能性分析披露，这些小型非编码RNA促进动物的不同生理过程，包括发育时序、器官发生、分化、成型(patterning)、胚胎发生、生长控制及程序式细胞死亡。微小RNA参与的特定过程的实例包括干细胞分化、神经生成、血管生成、造血作用及胞吐作用(由Alvarez-Garcia及Miska,Development,2005,132,4653-4662评述)。

发明概述

本文提供包含经修饰寡核苷酸的化合物，其中经修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与miR-21互补且经修饰寡核苷酸具有本文所述的核苷型态。

本文提供抑制miR-21活性的方法，包含使细胞与本文所述的化合物接触。在某些实施例中，细胞在体内。在某些实施例中，细胞在体外。

本文提供治疗与miR-21相关的疾病的方法，包含向患有与miR-21相关的疾病的个体给予本文所述的化合物。在某些实施例中，个体为人类。在某些实施例中，个体为犬。

本文所述的化合物是提供用于疗法中。

本文提供包含由8至22个连接的核苷组成的经修饰寡核苷酸的化合物，其中该经修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与miR-21(SEQ ID NO:1)互补且其中该经修饰寡核苷酸按5’至3’方向包含以下核苷型态III的至少8个连续核苷：

(R)_X-N^B-N^Q-N^Q-N^B-(N^Q-N^Q-N^Q-N^B)₃-N^Y-N^Z

其中各R为非双环核苷；X为1至4；各N^B为双环核苷；各N^Q为非双环核苷；N^Y为经修饰核苷或未经修饰核苷；且各N^Z为经修饰核苷。

本文提供包含由8至19个连接的核苷组成的经修饰寡核苷酸的化合物，其中该经修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与miR-21(SEQ ID NO:1)互补且其中该经修饰寡核苷酸按5’至3’方向包含以下核苷型态IV的至少8个连续核苷：

N^M-N^B-N^Q-N^Q-N^B-(N^Q-N^Q-N^Q-N^B)₃-N^Y-N^Z

其中N^M为不是双环核苷的经修饰核苷；各N^B为双环核苷；各N^Q为非双环核苷；N^Y为经修饰核苷或未经修饰核苷；且N^Z为经修饰核苷。

本文提供包含由8至19个连接的核苷组成的经修饰寡核苷酸的化合物，其中该经修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与miR-21(SEQ ID NO:1)互补且其中该经修饰寡核苷酸按5’至3’方向包含以下核苷型态V的至少8个连续核苷：

N^M-N^B-(N^Q-N^Q-N^B-N^B)₄-N^Z

其中N^M为不是双环核苷的经修饰核苷；各N^B为双环核苷；各N^Q为非双环核苷；且N^Z为经修饰核苷。

本文提供包含由8至15个连接的核苷组成的经修饰寡核苷酸的化合物，其中该经修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与miR-21(SEQ ID NO:1)互补，且其中该经修饰寡核苷酸按5’至3’方向包含以下核苷型态VI的至少8个连续核苷：

N^Q-N^B-N^B-N^Q-(N^B-N^B-N^Q-N^Q)₂-N^B-N^Q-N^B

其中各N^Q为非双环核苷；且各N^B为双环核苷。

本文提供包含由8至19个连接的核苷组成的经修饰寡核苷酸的化合物，其中该经修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与miR-21(SEQ ID NO:1)互补，且其中该经修饰寡核苷酸按5’至3’方向包含以下核苷型态VII的至少8个连续核苷：

N^M-(N^B-N^M-N^M)₂-N^M-(N^B-N^Q-N^Q-N^Q)₂-N^B-N^B-N^Z

在本文提供的任何化合物的某些实施例中，经修饰寡核苷酸包含核苷型态III的至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个或22个连续核苷。在本文提供的任何化合物的某些实施例中，经修饰寡核苷酸包含核苷型态IV、V或VII的至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个或19个连续核苷。在本文提供的任何化合物的某些实施例中，经修饰寡核苷酸包含核苷型态VI的至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个或15个连续核苷。在本文提供的任何化合物的某些实施例中，经修饰寡核苷酸由核苷型态III的8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个连接的核苷组成。在本文提供的任何化合物的某些实施例中，经修饰寡核苷酸由核苷型态IV、V或VII的8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19个连接的核苷组成。在本文提供的任何化合物的某些实施例中，经修饰寡核苷酸由核苷型态VI的8、9、10、11、12、13、14或15个连接的核苷组成。

在本文提供的任何化合物的某些实施例中，经修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与miR-21的核苷碱基序列(SEQ ID NO:1)至少90％互补、至少95％互补或100％互补。

在本文提供的任何化合物的某些实施例中，miR-21位置1上的核苷碱基与经修饰寡核苷酸的3’端上的第一核苷碱基配对。

在本文提供的任何化合物的某些实施例中，各双环核苷独立地选自LNA核苷、cEt核苷及ENA核苷。

在本文提供的任何化合物的某些实施例中，各双环核苷为cEt核苷。在某些实施例中，cEt核苷为S-cEt核苷。在某些实施例中，cEt核苷为R-cEt核苷。在本文提供的任何化合物的某些实施例中，各双环核苷为LNA核苷。

在本文提供的任何化合物的某些实施例中，各双环核苷包含非甲基化核苷碱基。

在本文提供的任何化合物的某些实施例中，各非双环核苷独立地选自β-D-脱氧核糖核苷、β-D-核糖核苷、2’-O-甲基核苷、2’-O-甲氧基乙基核苷及2’-氟核苷。在本文提供的任何化合物的某些实施例中，各非双环核苷独立地选自β-D-脱氧核糖核苷及2’-O-甲氧基乙基核苷。在本文提供的任何化合物的某些实施例中，各非双环核苷为β-D-脱氧核糖核苷。在本文提供的任何化合物的某些实施例中，各非双环核苷为2’-O-甲氧基乙基核苷。

在本文提供的任何化合物的某些实施例中，至少两个非双环核苷包含彼此不同的糖部分。在本文提供的任何化合物的某些实施例中，各非双环核苷具有相同类型的糖部分。

在本文提供的任何化合物的某些实施例中，不超过2个非双环核苷为2’-O-甲氧基乙基核苷。在某些此类实施例中，各其他非双环核苷为β-D-脱氧核糖核苷。

在本文提供的任何化合物的某些实施例中，5’最末端非双环核苷及3’最末端非双环核苷为2’-O-甲氧基乙基核苷且其他各非双环核苷为β-D-脱氧核糖核苷。在本文提供的任何化合物的某些实施例中，两个非双环核苷为2’-MOE核苷且各其他非双环核苷为β-D-脱氧核糖核苷。

在核苷型态III的某些实施例中，各核苷R为2’-O-甲氧基乙基核苷。在核苷型态III的某些实施例中，三个核苷R为2’-O-甲氧基乙基核苷且一个核苷R为β-D-脱氧核糖核苷。

在核苷型态III的某些实施例中，各R为2’-O-甲氧基乙基核苷；X为1；各N^B为S-cEt核苷；各N^Q为β-D-脱氧核糖核苷；N^Y为β-D-脱氧核糖核苷；且N^Z为2’-O-甲氧基乙基核苷。在核苷型态III的某些实施例中，各R为2’-O-甲氧基乙基核苷；X为1；各N^B为S-cEt核苷；各N^Q为β-D-脱氧核糖核苷；N^Y为β-D-脱氧核糖核苷；且N^Z为S-cEt核苷。在核苷型态III的某些实施例中，各R为2’-O-甲氧基乙基核苷；X为1；各N^B为S-cEt核苷；各N^Q为β-D-脱氧核糖核苷；N^Y为S-cEt核苷；且N^Z为S-cEt核苷。

在核苷型态IV的某些实施例中，N^M为2’-O-甲氧基乙基核苷；各N^B为S-cEt核苷；各N^Q为β-D-脱氧核糖核苷；N^Y为β-D-脱氧核糖核苷；且N^Z为2’-O-甲氧基乙基核苷。在核苷型态IV的某些实施例中，N^M为2’-O-甲氧基乙基核苷；各N^B为S-cEt核苷；各N^Q为β-D-脱氧核糖核苷；N^Y为β-D-脱氧核糖核苷；且N^Z为S-cEt核苷。在核苷型态IV的某些实施例中，N^M为2’-O-甲氧基乙基核苷；各N^B为S-cEt核苷；各N^Q为β-D-脱氧核糖核苷；N^Y为S-cEt核苷；且N^Z为S-cEt核苷。在核苷型态IV的某些实施例中，N^M为2’-O-甲氧基乙基核苷；各N^B为S-cEt核苷；各N^Q独立地选自β-D-脱氧核糖核苷及2’-O-甲氧基乙基核苷；N^Y为β-D-脱氧核糖核苷；且N^Z为S-cEt核苷。在核苷型态IV的某些实施例中，经修饰寡核苷酸具有结构：

A_EC_SA_ET_EC_SA_EG_ET_EC_STGAU_SAAGC_STA_S(SEQ ID NO:3)；或

A_EC_SA_ET_EC_SA_EG_ET_EC_STGAU_SAAGC_SU_SA_S(SEQ ID NO:3)。

其中之后未接下标的核苷为β-D-脱氧核糖核苷；之后接有下标“E”的核苷为2’-MOE核苷；且之后接有下标“S”的核苷为S-cEt核苷。

在核苷型态V的某些实施例中，N^M为2’-O-甲氧基乙基核苷；各N^B为S-cEt核苷；各N^Q为β-D-脱氧核糖核苷；且N^Z为2’-O-甲氧基乙基核苷。在核苷型态V的某些实施例中，经修饰寡核苷酸具有结构：

A_EC_SATC_SA_SGTC_SU_SGAU_SA_SAGC_SUsA_E(SEQ ID NO:3)；

在核苷型态VI的某些实施例中，各N^Q为不是双环核苷的经修饰核苷。在核苷型态VI的某些实施例中，各N^Q独立地选自2’-O-甲氧基乙基核苷及β-D-脱氧核糖核苷。在核苷型态VI的某些实施例中，各N^Q为2’-O-甲氧基乙基核苷。在核苷型态VI的某些实施例中，各N^Q为β-D-脱氧核糖核苷。在核苷型态VI的某些实施例中，各N^Q为2’-O-甲氧基乙基核苷；且各N^B为S-cEt核苷。在核苷型态VI的某些实施例中，各N^Q为β-D-脱氧核糖核苷；且各N^B为S-cEt核苷。在核苷型态VI的任何实施例中，相对于miR-21的核苷碱基序列，经修饰寡核苷酸可具有0、1或2个错配。在某些此类实施例中，相对于miR-21的核苷碱基序列，经修饰寡核苷酸具有0个错配。在某些实施例中，相对于miR-21的核苷碱基序列，经修饰寡核苷酸具有1个错配。在某些实施例中，相对于miR-21的核苷碱基序列，经修饰寡核苷酸具有2个错配。在核苷型态VI的某些实施例中，经修饰寡核苷酸具有结构：

^MeC_EA_SA_ST_EC_SU_SA_EA_EU_SA_SA_EG_EC_ST_EA_S(SEQ ID NO:7)；

其中之后接有下标“E”的核苷为2’-MOE核苷；之后接有下标“S”的核苷为S-cEt核苷；且^MeC为5-甲基胞嘧啶。

在核苷型态VII的某些实施例中，各N^M为2’-O-甲氧基乙基核苷；各N^B为S-cEt核苷；各N^Q独立地选自2’-O-甲基核苷及β-D-脱氧核糖核苷；且N^Z独立地选自S-cEt核苷及2’-O-甲氧基乙基核苷。在核苷型态VII的某些实施例中，各N^M为2’-O-甲氧基乙基核苷；各N^B为S-cEt核苷；各N^Q为β-D-脱氧核糖核苷；且N^Z为S-cEt核苷。在核苷型态VII的某些实施例中，各N^M为2’-O-甲氧基乙基核苷；各N^B为S-cEt核苷；各N^Q独立地选自2’-O-甲基核苷及β-D-脱氧核糖核苷；且N^Z为S-cEt核苷。在核苷型态VII的某些实施例中，各N^M为2’-O-甲氧基乙基核苷；各N^B为S-cEt核苷；各N^Q独立地选自2’-O-甲基核苷及β-D-脱氧核糖核苷；且N^Z为2’-O-甲氧基乙基核苷。在核苷型态VII的某些实施例中，经修饰寡核苷酸具有结构：

A_EC_SA_ET_EC_SA_EG_ET_EC_STGAU_SAAGC_SU_SA_S(SEQ ID NO:3)。

在某些实施例中，化合物包含由8至22个连接的核苷组成的经修饰寡核苷酸，其中该经修饰寡核苷酸包含具有选自表1中的结构的结构的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个或至少19个连续核苷。在某些实施例中，化合物包含具有选自表1中的结构的结构的经修饰寡核苷酸。

在本文提供的任何化合物的某些实施例中，至少一个核苷间键联为经修饰核苷间键联。在本文提供的任何化合物的某些实施例中，各核苷间键联皆为经修饰核苷间键联。在某些实施例中，经修饰核苷间键联为硫代磷酸酯核苷间键联。

在本文提供的任何化合物的某些实施例中，至少一个核苷包含经修饰核苷碱基。在本文提供的任何化合物的某些实施例中，至少一个胞嘧啶为5-甲基胞嘧啶。在本文提供的任何化合物的某些实施例中，各胞嘧啶皆为5-甲基胞嘧啶。在本文提供的任何化合物的某些实施例中，在经修饰寡核苷酸的位置2处的胞嘧啶为5-甲基胞嘧啶。

在本文提供的任何化合物的某些实施例中，经修饰寡核苷酸具有选自SEQID NO:3至10的序列的核苷碱基序列，其中序列中的各T独立地选自T及U。

在本文提供的任何化合物的某些实施例中，相对于miR-21的核苷碱基序列，经修饰寡核苷酸具有0、1、2或3个错配。在本文提供的任何化合物的某些实施例中，相对于miR-21的核苷碱基序列，经修饰寡核苷酸具有0、1或2个错配。在某些此类实施例中，相对于miR-21的核苷碱基序列，经修饰寡核苷酸具有0个错配。在某些实施例中，相对于miR-21的核苷碱基序列，经修饰寡核苷酸具有1个错配。在某些实施例中，相对于miR-21的核苷碱基序列，经修饰寡核苷酸具有2个错配。

本文提供抑制miR-21活性的方法，其包含使细胞与本文提供的化合物接触。在某些实施例中，细胞在体内。在某些实施例中，细胞在体外。在某些实施例中，细胞为纤维母细胞、上皮细胞、星状细胞、角化细胞或纤维细胞。在某些实施例中，细胞为过度增殖性细胞或乏氧细胞。在某些实施例中，纤维母细胞为过度增殖性纤维母细胞。

本文提供抑制miR-21活性的方法，包含使细胞与本文所述的任何化合物接触。在某些实施例中，细胞在体内。在某些实施例中，细胞在体外。在某些实施例中，细胞为纤维母细胞、过度增殖性细胞、角化细胞或乏氧细胞。

本文提供减少细胞中的胶原蛋白表达的方法，包含使细胞与本文提供的化合物接触。

本文提供治疗与miR-21相关的疾病、预防或延迟其发作的方法，其包含向患有该种疾病的个体给予本文提供的任何化合物。

在某些实施例中，疾病为纤维化。在某些实施例中，纤维化为肾纤维化、肺纤维化、肝纤维化、心脏纤维化、皮肤纤维化、年龄相关性纤维化、脾纤维化、硬皮病和/或移植后纤维化。

在某些实施例中，纤维化为肾纤维化且存在于患有选自以下的疾病或病状的个体中：肾小球硬化、小管间质性纤维化、IgA肾病、间质性纤维化/肾小管萎缩；慢性肾损伤、慢性肾病、肾小球疾病、肾小球肾炎、糖尿病、特发性局部区段性肾小球硬化、膜性肾病、塌陷性肾小球病、慢性复发性肾脏感染、在急性肾损伤(AKI)之后的慢性肾病、在暴露于环境毒素和/或天然产物之后的肾损坏、及末期肾病。在某些实施例中，肾纤维化由肾脏的急性或反复性创伤引起。

在某些实施例中，纤维化为肝纤维化且存在于患有选自以下的疾病的个体中：慢性肝损伤、肝炎感染(诸如乙型肝炎感染和/或丙型肝炎感染)、非酒精性脂肪变性肝炎、酒精性肝病、在暴露于环境毒素和/或天然产物之后的肝损坏、及肝硬化。

在某些实施例中，肺纤维化为特发性肺纤维化，或个体患有慢性阻塞性肺病。

在某些实施例中，疾病为发炎性疾病。

本文提供促进个体的伤口愈合的方法，包含向具有急性或慢性伤口的个体给予本文提供的任何化合物。在某些实施例中，慢性伤口为急性或慢性手术伤口、穿透伤口、撕脱伤、挤压伤、剪力损伤、烧伤、撕裂、咬伤、动脉性溃疡、静脉性溃疡、褥疮及糖尿病性溃疡。在某些实施例中，化合物是局部给予伤口。

本文提供治疗个体的纤维增生性病症的方法，包含向个体给予本文提供的任何化合物。

本文提供的任何方法可包含选择一种或多种组织中的miR-21表达升高的个体。

在某些实施例中，向个体给予本文提供的任何化合物减少胶原蛋白表达。

在某些实施例中，个体需要改善的器官功能，其中该器官功能是选自心脏功能、肺功能、肝功能及肾功能。在某些实施例中，给予本文提供的任何化合物改善个体的器官功能，其中该器官功能是选自心脏功能、肺功能、肝功能及肾功能。

本文提供的任何方法皆包含评估个体的肾功能，可包括测量个体血液中的血液尿素氮；测量个体血液中的肌酸酐；测量个体的肌酸酐清除率；测量个体的蛋白尿；测量个体的白蛋白:肌酸酐比率；测量个体的尿排出量；测量个体尿中的菊糖清除率；测量个体的尿容积摩尔渗透浓度；测量个体的尿重量摩尔渗透浓度；测量个体的血尿；测量个体血液和/或尿中的胱抑素C(cystatin C)；和/或测量个体血液和/或尿中的嗜中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(NGAL)。

本文提供的任何方法可包括评估个体的肝功能，可包括测量个体血液中的丙氨酸转氨酶含量；测量个体血液中的天冬氨酸转氨酶含量；测量个体血液中的胆红素含量；测量个体血液中的白蛋白含量；测量个体的凝血酶原时间；测量个体的腹水；测量个体的脑病；和/或例如使用短暂弹性成像术测量肝硬化。

本文提供的任何方法可包括评估个体的肺功能，可包括测量个体的肺活量；测量个体的用力肺活量；测量个体的一秒内用力呼气量；测量个体的峰值呼气流速；测量个体的用力呼气流量；测量个体的最大随意通气量；测定个体的一秒内用力呼气量与用力肺活量的比率；测量个体的通气/灌注比率；测量个体的氮气清除率；和/或测量个体一个或多个肺中的绝对空气容积。

本文提供的任何方法可包括评估个体的心脏功能，可包括测量个体的心输出量；测量个体的心搏排血量；测量个体的平均收缩期射血率；测量个体的收缩期血压；测量个体的左心室射血分数；测定个体的心搏指数；测定个体的心脏指数；测量个体的左心室缩短百分率；测量个体的周径纤维平均缩短速度；测量个体的左心室流入血流速度图；测量个体的肺静脉血流速度图；和/或测量个体二尖瓣环的舒张早期峰值速度。

本文提供的任何方法可包括向个体给予至少一种选自以下的治疗剂：消炎剂、免疫抑制剂、抗糖尿病剂、地高辛(digoxin)、血管舒张药、血管紧张素II转化酶(ACE)抑制剂、血管紧张素II受体阻断剂(ARB)、钙通道阻断剂、异山梨醇二硝酸酯、肼屈嗪(hydralazine)、硝酸酯、肼屈嗪、β-阻断剂、利钠肽、类肝素、结缔组织生长因子抑制剂及转型生长因子抑制剂。在某些实施例中，消炎剂为非类固醇消炎剂，其中该非类固醇消炎剂可任选地选自布洛芬(ibuprofen)、COX-1抑制剂或COX-2抑制剂。在某些实施例中，免疫抑制剂是选自皮质类固醇、环磷酰胺(cyclophosphamide)及霉酚酸吗啉乙酯(mycophenolatemofetil)。在某些实施例中，消炎剂为皮质类固醇，其中该皮质类固醇可任选地为强的松(prednisone)。在某些实施例中，血管紧张素II转化酶(ACE)抑制剂是选自卡托普利(captopril)、依那普利(enalapril)、赖诺普利(lisinopril)、贝那普利(benazepril)、喹那普利(quinapril)、福辛普利(fosinopril)及雷米普利(ramipril)。在某些实施例中，血管紧张素II受体阻断剂(ARB)是选自坎地沙坦(candesartan)、伊贝沙坦(irbesartan)、奥美沙坦(olmesartan)、洛沙坦(losartan)、缬沙坦(valsartan)、替米沙坦(telmisartan)及依普沙坦(eprosartan)。

在某些实施例中，疾病为癌症。在某些实施例中，癌症为肝癌、乳癌、膀胱癌、前列腺癌、结肠癌、肺癌、脑癌、血液系统癌症、胰脏癌、头颈部癌、舌癌、胃癌、皮肤癌、甲状腺癌、神经母细胞瘤、食道癌、间皮瘤、神经母细胞瘤、骨癌、肾癌、睾丸癌、直肠癌、子宫颈癌或卵巢癌。在某些实施例中，肝癌为肝细胞癌。在某些实施例中，脑癌为多形性神经胶母细胞瘤、寡突星形细胞瘤或寡树突神经胶细胞瘤。在某些实施例中，多形性神经胶母细胞瘤为原神经多形性神经胶母细胞瘤、神经多形性神经胶母细胞瘤、经典多形性神经胶母细胞瘤或间质多形性神经胶母细胞瘤。在某些实施例中，血液系统癌症为急性髓细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性单核细胞性白血病、多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、霍奇金氏淋巴瘤(hodgkin's lymphoma)或非霍奇金氏淋巴瘤(non-hodgkin'slymphoma)。在某些实施例中，皮肤癌为黑素瘤。在某些实施例中，肾癌为肾细胞癌。在某些实施例中，乳癌为原位乳腺管细胞癌、侵袭性乳腺管细胞癌、三重阴性乳癌、髓样癌、管状癌及粘液癌。

在某些实施例中，本文提供的方法包括向个体给予至少一种其他抗癌疗法。在某些实施例中，抗癌疗法为DNA损伤剂、增殖抑制剂、抗叶酸剂、生长因子受体抑制剂、抗血管生成剂、受体酪氨酸激酶抑制剂、激酶抑制剂、生长因子抑制剂、细胞毒性剂、放射疗法或手术切除肿瘤。在某些实施例中，DNA损伤剂为1,3-双(2-氯乙基)-1-亚硝基脲、白消安(busulfan)、卡铂(carboplatin)、卡莫司汀(carmustine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、顺铂(cisplatin)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、达喀尔巴嗪(dacarbazine)、道诺霉素(daunorubicin)、小红莓(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依托泊苷(etoposide)、伊达比星(idarubicin)、异环磷酰胺(ifosfamide)、伊立替康(irinotecan)、洛莫司汀(lomustine)、氮芥(mechlorethamine)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素C(mitomycin C)、米托蒽醌(mitoxantrone)、奥沙利铂(oxaliplatin)、替莫唑胺(temozolomide)或拓扑替康(topotecan)。在某些实施例中，抗叶酸剂为甲氨喋呤(methotrexate)、氨基喋呤(aminopterin)、胸苷酸合成酶、丝氨酸羟甲基转移酶、叶酸聚谷氨酰基合成酶、g-谷氨酰基水解酶、甘氨酰胺-核糖核苷酸转甲酰基酶、甲酰四氢叶酸、氨基-咪唑-甲酰胺-核糖核苷酸转甲酰基酶、5-氟尿嘧啶或叶酸转运体。在某些实施例中，生长因子受体抑制剂为埃罗替尼(erlotinib)或吉非替尼(gefitinib)。在某些实施例中，血管生成抑制剂为贝伐单抗(bevacizumab)、沙利度胺(thalidomide)、羧酰胺基三唑、TNP-470、CM101、IFN-α、血小板因子-4、苏拉明(suramin)、SU5416、血小板反应蛋白(thrombospondin)、VEGFR拮抗剂、软骨源性血管生成抑制因子、基质金属蛋白酶抑制剂、血管生成抑制素(angiostatin)、内皮抑素(endostatin)、2-甲氧基雌二醇、替可加兰(tecogalan)、四硫钼酸盐、催乳激素或利诺胺(linomide)。在某些实施例中，激酶抑制剂为贝伐单抗、BIBW 2992、西妥昔单抗(cetuximab)、伊马替尼(imatinib)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、吉非替尼、兰尼单抗(ranibizumab)、哌加他尼(pegaptanib)、索拉菲尼(sorafenib)、达沙替尼(dasatinib)、舒尼替尼(sunitinib)、埃罗替尼(erlotinib)、尼罗替尼(nilotinib)、拉帕替尼(lapatinib)、帕尼单抗(panitumumab)、凡德他尼(vandetanib)、E7080、帕唑帕尼(pazopanib)、莫立替尼(mubritinib)或福马替尼(fostamatinib)。

在某些实施例中，向患有癌症的个体给药使得肿瘤尺寸和/或肿瘤数减小。在某些实施例中，向患有癌症的个体给药预防或延迟肿瘤尺寸和/或肿瘤数增加。在某些实施例中，向患有癌症的个体给药预防或减缓转移性进展。在某些实施例中，向患有癌症的个体给药延长个体的总体存活时间和/或无进展存活期。在某些实施例中，本文提供的方法包括选择血清α-胎蛋白升高和/或血清脱-γ-羧基凝血酶原升高的个体。在某些实施例中，本文提供的方法包括使血清α-胎蛋白和/或血清脱-γ-羧基凝血酶原降低。在某些实施例中，本文提供的方法包括选择肝功能异常的动物。

在某些实施例中，个体为人类。在某些实施例中，个体为犬。

在本文提供的任何方法中，化合物以医药组合物形式存在。

本文提供的任何化合物可用于疗法中。本文提供的任何化合物可用于治疗纤维化。本文提供的任何化合物可用于促进伤口愈合。本文提供的任何化合物可用于治疗癌症。本文提供的任何化合物可用于预防和/或延迟转移发作。

本文提供的任何化合物可用于治疗心脏病。

本文提供的任何化合物可用于制备药物。本文提供的任何化合物可用于制备用于治疗纤维化的药物。本文提供的任何化合物可用于制备用于促进伤口愈合的药物。本文提供的任何化合物可用于制备用于治疗癌症的药物。本文提供的任何化合物可用于制备用于预防和/或延迟转移发作的药物。

附图简要说明

图1显示给予某些抗miR-21化合物的UUO模型小鼠的肾中的(A)胶原蛋白1A1及(B)胶原蛋白3A1表达的变化，如实例1中所述。

图2显示给予某些抗miR-21化合物的UUO模型小鼠的肾中的(A)胶原蛋白1A1及(B)胶原蛋白3A1表达的变化，如实例1中所述。

图3显示给予某些抗miR-21化合物的UUO模型小鼠的肾中的(A)胶原蛋白1A1及(B)胶原蛋白3A1表达的变化，如实例2中所述。

图4显示给予某些抗miR-21化合物的单侧IRI模型小鼠的肾中的(A)胶原蛋白1A1表达的变化，(B)胶原蛋白3A1表达的变化，及(C)胶原蛋白面积分数，如实例3中所述。

图5显示(A)给予化合物36328或对照化合物的IR/Nx模型小鼠的肾中的尿白蛋白与肌酸酐比率，(B)给予化合物36284的IR/Nx模型小鼠的肾中的尿白蛋白与肌酸酐比率，及(C)给予化合物25220的的IR/Nx模型小鼠的肾中的尿白蛋白与肌酸酐比率，如实例4中所述。

图6显示(A)抗miR-21化合物在培养细胞中的荧光素酶活性及(B)抗miR-21化合物在培养细胞中的抗增殖作用，如实例6中所述。

图7显示给予某些抗miR-21化合物的UUO模型小鼠的肾中的(A)胶原蛋白1A1及(B)胶原蛋白3A1表达的变化，如实例6中所述。

详细说明

除非另外规定，否则本文中所用的所有技术及科学术语具有与如本发明所属技术领域的技术人员通常所理解的相同的意义。除非提供特定定义，否则结合本文所述的分析化学、合成有机化学以及医疗及医药化学使用的命名法是本领域中熟知的且常用的。在本文中的术语存在多个定义的情况下，以本部分中的定义为准。可使用化学合成、化学分析、医药制备、调配及递送以及治疗个体的标准技术。某些此类技术及程序可见于例如以下文献中：“Carbohydrate Modifications in Antisense Research”,Sangvi及Cook编，American Chemical Society,Washington D.C.,1994；及“Remington's PharmaceuticalSciences”,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.，第18版，1990；且其出于任何目的以引用的方式并入本文中。除非另外说明，否则本文整篇披露内容中提及的所有专利、专利申请案、公开申请案及公开案、GENBANK序列、网站及其他公开材料在允许时均以全文引用的方式并入本文中。在提及URL或其他类似识别符或地址的情况下，应了解此类识别符可改变并且因特网上的特定信息可改变，但可通过搜索因特网找到等效信息。对其的提及证明这种信息的可用性及公开传播。

在披露及描述本发明的组合物及方法之前，应了解本文所用的术语仅出于描述特定实施例的目的而不欲具有限制性。须注意，除非上下文另外明确规定，否则如本说明书及所附权利要求书中所用的单数形式“一个(a/an)”及“该(the)”包括多个参考物。

定义

“纤维化”意谓在器官或组织中形成或产生过量纤维结缔组织。在某些实施例中，纤维化作为修复或反应性过程出现。在某些实施例中，纤维化响应于损害或损伤而出现。术语“纤维化”应理解为在器官或组织中作为修复或反应性过程形成或产生过量纤维结缔组织，而非形成纤维组织作为器官或组织的正常组分。

“埃布尔综合征(Alport Syndrome)”意谓肾病的一种遗传形式，其中产生异常含量的肾小球基底膜(GBM)，从而导致间质性纤维化、肾小球硬化及最终肾功能丧失。该疾病的特征亦常为听觉缺陷及眼部异常。

“怀疑患有……的个体”意谓展现疾病的一种或多种临床指标的个体。

“怀疑患有纤维化的个体”意谓展现纤维化的一种或多种临床指标的个体。

“纤维增生性病症”意谓特征在于纤维母细胞的过度增殖和/或活化的病症。

“肝癌”意谓肝脏的恶性肿瘤，为原发癌或转移癌。在某些实施例中，肝癌包括(但不限于)起因于肝细胞的癌症，诸如肝细胞瘤及肝细胞癌；纤维板层癌；及胆管细胞癌(或胆管癌)。

“转移”意谓癌症自其首先产生为原发性肿瘤的位置扩散至体内其他位置的过程。原发性肿瘤的转移性进展反映多个阶段，包括自相邻原发性肿瘤细胞解离、在循环中存活及在继发位置生长。

“总体存活时间”意谓个体在诊断出疾病或针对疾病进行治疗后存活的时间。在某些实施例中，疾病为癌症。在一些实施例中，总体存活时间为诊断后的存活期。在一些实施例中，总体存活时间为治疗开始后的存活期。

“无进展存活期”意谓患有疾病的个体在疾病不发生恶化的情况下存活的时间。在某些实施例中，无进展存活期是藉由对疾病进行分期或评分来评估。在某些实施例中，患有肝癌的个体的无进展存活期是藉由评估肿瘤尺寸、肿瘤数和/或转移来评估。

“停止进一步进展”意谓阻止医学病状向晚期状态移动。

“减缓进一步进展”意谓降低医学病状向晚期状态移动的速率。

“肾功能受损”意谓肾功能相对于正常肾功能降低。

“延迟透析时间”意谓维持肾功能以使对透析治疗的需要得以延迟。

“延迟肾移植时间”意谓维持肾功能以使对肾移植的需要得以延迟。

“改善肾功能”意谓使肾功能向正常限度变化。在某些实施例中，肾功能改善是藉由血液尿素氮降低、蛋白尿降低、白蛋白尿降低等加以量度。

“提高预期寿命”意谓藉由治疗个体的疾病的一种或多种症状来使个体寿命延长。

“血尿”意谓在尿中存在红血球。

“白蛋白尿”意谓在尿中存在过量白蛋白，且包括(但不限于)正常量白蛋白尿、高正常量白蛋白尿、微量白蛋白尿及大量白蛋白尿。通常，由足状突细胞、肾小球基底膜及内皮细胞构成的肾小球过滤渗透性障壁阻止血清蛋白质漏入尿中。白蛋白尿可反映肾小球渗透性障壁的损伤。白蛋白尿可由24小时尿样品、隔夜尿样品或点尿样品计算。

“高正常量白蛋白尿”意谓特征在于以下的白蛋白尿升高：(i)每24小时有15至<30mg白蛋白排出至尿中和/或(ii)雄性中白蛋白/肌酸酐比率为1.25至<2.5mg/mmol(或10至<20mg/g)或雌性中白蛋白/肌酸酐比率为1.75至<3.5mg/mmol(或15至<30mg/g)。

“微量白蛋白尿”意谓特征在于以下的白蛋白尿升高：(i)每24小时有30至300mg白蛋白排出至尿中和/或(ii)雄性中白蛋白/肌酸酐比率为2.5至<25mg/mmol(或20至<200mg/g)或雌性中白蛋白/肌酸酐比率为3.5至<35mg/mmol(或30至<300mg/g)。

“大量白蛋白尿”意谓特征在于以下的白蛋白尿升高：(i)每24小时有300mg以上白蛋白排出至尿中和/或(ii)雄性中白蛋白/肌酸酐比率为>25mg/mmol(或>200mg/g)或雌性中白蛋白/肌酸酐比率为>35mg/mmol(或>300mg/g)。

“白蛋白/肌酸酐比率”意谓每单位浓度尿肌酸酐(mg/dL)对应的尿白蛋白(mg/dL)的比率且表示为mg/g。白蛋白/肌酸酐比率可由点尿样品计算且可用作对历经24小时时期的白蛋白排出的估计。

“估计肾小球滤过率(eGFR)”或“肾小球滤过率(GFR)”意谓肾过滤肌酸酐的程度的测量结果，且用作每分钟有多少血液穿过肾小球的估计值。正常结果可在90-120mL/min/1.73m²的范围内。持续3个月或3个月以上水平低于60mL/min/1.73m²可指示慢性肾病。水平低于15mL/min/1.73m²可指示肾衰竭。

“蛋白尿”意谓存在过量血清蛋白质。蛋白尿的特征可在于每24小时有>250mg蛋白质排出至尿中和/或尿蛋白质与肌酸酐的比率为≥0.20mg/mg。与蛋白尿相关升高的血清蛋白质包括(但不限于)白蛋白。

“血液尿素氮”或“BUN”意谓血液中呈尿素形式的氮的量的量度。肝在尿素循环中产生尿素作为蛋白质消化的废弃产物，且尿素由肾自血液移除。正常人类成人血液可含有每100ml血液介于7至21mg(7-21mg/dL)之间的尿素氮。血液尿素氮的测量结果用作肾健康状况的指标。若肾不能自血液正常移除尿素，则个体的BUN升高。

“末期肾病(ESRD)”意谓肾功能完全或几乎完全衰竭。

“抗miR剂”意谓具有与微小RNA互补的核苷碱基序列的寡核苷酸。在某些实施例中，抗miR剂为经修饰寡核苷酸。

当“miR-X”表示特定微小RNA时，“抗miR-X剂”意谓具有与miR-X互补的核苷碱基序列的寡核苷酸。在某些实施例中，抗miR-X剂与miR-X完全互补(亦即100％互补)。在某些实施例中，抗miR-X剂与miR-X至少80％、至少85％、至少90％或至少95％互补。在某些实施例中，抗miR-X剂为经修饰寡核苷酸。

“miR-21”意谓具有核苷碱基序列UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA(SEQ ID NO:1)的成熟miRNA。

“miR-21茎-环序列”意谓具有核苷碱基序列UGUCGGGUAGCUUAUCAGACUGAUGUUGACUGUUGAAUCUCAUGGCAACACCAGUCGAUGGGCUGUCUGACA(SEQ ID NO:2)的茎-环序列。

“目标核酸”意谓这样一种核酸，一种寡聚化合物被设计用来与该核酸杂交。

“定标”意谓设计及选择将与目标核酸杂交的核苷碱基序列的过程。

“靶向”意谓具有允许与目标核酸杂交的核苷碱基序列。

“目标啮合”意谓寡核苷酸同与其互补的微小RNA以改变该微小RNA的活性、表达或含量的方式相互作用。在某些实施例中，目标啮合意谓抗miR剂同与其互补的微小RNA相互作用，使得该微小RNA的活性受到抑制。

“调节”意谓扰动功能、量或活性。在某些实施例中，调节意谓功能、量或活性增加。在某些实施例中，调节意谓功能、量或活性降低。

“表达”意谓基因所编码的信息藉以转化为细胞中存在及运转的结构的任何功能及步骤。

“5'目标位点”意谓目标核酸中与特定寡核苷酸的3'最末端核苷碱基互补的核苷碱基。

“3'目标位点”意谓目标核酸中与特定寡核苷酸的5'最末端核苷碱基互补的核苷碱基。

“区”意谓核酸内一部分连接的核苷。在某些实施例中，寡核苷酸具有与目标核酸的区互补的核苷碱基序列。举例而言，在某些此类实施例中，寡核苷酸与微小RNA茎-环序列的区互补。在某些此类实施例中，寡核苷酸与微小RNA茎-环序列的区完全互补。

“区段”意谓区的较小部分或子部分。

“核苷碱基序列”意谓寡聚化合物或核酸中连续核苷碱基的次序，通常按5'至3'方向列出，而与任何糖、键联和/或核苷碱基修饰无关。

“连续核苷碱基”意谓核酸中彼此紧邻的核苷碱基。

“核苷碱基互补性”意谓两个核苷碱基经由氢键非共价配对的能力。

“互补”意谓一个核酸能够与另一核酸或寡核苷酸杂交。在某些实施例中，互补是指寡核苷酸能够与目标核酸杂交。

“完全互补”意谓寡核苷酸的各核苷碱基皆能够与目标核酸中各相应位置处的核苷碱基配对。在某些实施例中，寡核苷酸与微小RNA完全互补，亦即寡核苷酸的各核苷碱基与微小RNA中相应位置处的核苷碱基皆互补。在某些实施例中，各核苷碱基与微小RNA茎-环序列的区内的核苷碱基皆具有互补性的寡核苷酸与该微小RNA茎-环序列完全互补。

“互补性百分比”意谓寡核苷酸中与目标核酸的等长部分互补的核苷碱基的百分率。互补性百分比藉由将寡核苷酸中与目标核酸中相应位置处的核苷碱基互补的核苷碱基的数目除以寡核苷酸中核苷碱基的总数来计算。

“一致性百分比”意谓第一核酸中与第二核酸中相应位置处的核苷碱基一致的核苷碱基的数目除以第一核酸中核苷碱基的总数。在某些实施例中，第一核酸为微小RNA且第二核酸为微小RNA。在某些实施例中，第一核酸为寡核苷酸且第二核酸为寡核苷酸。

“杂交”意谓经由核苷碱基互补性将互补核酸进行退火。

“错配”意谓第一核酸中的核苷碱基不能与第二核酸中相应位置处的核苷碱基进行沃森-克里克(Watson-Crick)配对。

“一致”在核苷碱基序列的情况下意谓具有相同核苷碱基序列，而与糖、键联和/或核苷碱基修饰无关且与所存在的任何嘧啶的甲基状态无关。

“微小RNA”意谓长度在18与25个核苷碱基之间的内源性非编码RNA，其为由酶Dicer裂解微小RNA前体的产物。成熟微小RNA的实例可见于称为miRBase的微小RNA数据库中(http://microrna.sanger.ac.uk/)。在某些实施例中，微小RNA缩写为“微小RNA”或“miR”。

“微小RNA前体”或“miR前体”意谓具有发夹结构的非编码RNA，其为由称为Drosha的双链RNA特异性核糖核酸酶裂解初级miR的产物。

“茎-环序列”意谓具有发夹结构且含有成熟微小RNA序列的RNA。微小RNA前体序列及茎-环序列可能重叠。茎-环序列的实例可见于称为miRBase的微小RNA数据库中(http://microrna.sanger.ac.uk/)。

“初级微小RNA”或“初级miR”意谓具有发夹结构的非编码RNA，其为双链RNA特异性核糖核酸酶Drosha的受质。

“微小RNA前体”意谓来源于基因组DNA且包含含一个或多个微小RNA序列的非编码结构化RNA的转录物。举例而言，在某些实施例中，微小RNA前体为微小RNA前体。在某些实施例中，微小RNA前体为初级微小RNA。

“微小RNA调控的转录物”意谓受微小RNA调控的转录物。

“单顺反子转录物”意谓含有单一微小RNA序列的微小RNA前体。

“多顺反子转录物”意谓含有两个或两个以上微小RNA序列的微小RNA前体。

“种子序列”意谓包含成熟微小RNA序列的5'端的核苷碱基1至9中6至8个连续核苷碱基的核苷碱基序列。

“种子匹配序列”意谓与种子序列互补并且长度与种子序列相同的核苷碱基序列。

“寡聚化合物”意谓包含多个连接的单体次单元的化合物。寡聚化合物包括寡核苷酸。

“寡核苷酸”意谓包含多个连接的核苷的化合物，其中各核苷可彼此独立地经修饰或未经修饰。

“天然存在的核苷间键联”意谓核苷之间的3'至5'磷酸二酯键联。

“天然糖”意谓DNA(2'-H)或RNA(2'-OH)中存在的糖。

“核苷间键联”意谓相邻核苷之间的共价键联。

“连接的核苷”意谓由共价键连接的核苷。

“核苷碱基”意谓能够与另一核苷碱基非共价配对的杂环部分。

“核苷”意谓连接于糖部分的核苷碱基。

“核苷酸”意谓具有共价连接于核苷的糖部分的磷酸酯基的核苷。

“包含由多个连接的核苷组成的经修饰寡核苷酸的化合物”意谓包括具有指定数目的连接的核苷的经修饰寡核苷酸的化合物。因此，该化合物可包括另外的取代基或结合物。除非另外说明，否则该化合物不包括除经修饰寡核苷酸的那些核苷以外的任何其他核苷。

“经修饰寡核苷酸”意谓相对于天然存在的末端、糖、核苷碱基和/或核苷间键联具有一或多处修饰的寡核苷酸。经修饰寡核苷酸可包含未经修饰核苷。

“单链经修饰寡核苷酸”意谓未与互补链杂交的经修饰寡核苷酸。

“经修饰核苷”意谓与天然存在的核苷相比具有任何变化的核苷。经修饰核苷可具有经修饰的糖及未经修饰核苷碱基。经修饰核苷可具有经修饰的糖及经修饰核苷碱基。经修饰核苷可具有天然糖及经修饰核苷碱基。在某些实施例中，经修饰核苷为双环核苷。在某些实施例中，经修饰核苷为非双环核苷。

“经修饰核苷间键联”意谓与天然存在的核苷间键联相比存在任何变化。

“硫代磷酸酯核苷间键联”意谓核苷间一个非桥连原子为硫原子的键联。

“经修饰的糖部分”意谓与天然糖相比的取代和/或任何变化。

“未经修饰核苷碱基”意谓RNA或DNA的天然存在的杂环碱基：嘌呤碱基腺嘌呤(A)及鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)(包括5-甲基胞嘧啶)及尿嘧啶(U)。

“5-甲基胞嘧啶”意谓包含连接于5位的甲基的胞嘧啶。

“非甲基化胞嘧啶”意谓不具有连接于5位的甲基的胞嘧啶。

“经修饰核苷碱基”意谓不为未经修饰核苷碱基的任何核苷碱基。

“呋喃醣基”意谓包含由四个碳原子及一个氧原子组成的5员环的结构。

“天然存在的呋喃醣基”意谓如在天然存在的RNA中所发现的呋喃核糖基或如在天然存在的DNA中所发现的脱氧呋喃核糖基。

“糖部分”意谓天然存在的呋喃醣基或经修饰的糖部分。

“经修饰的糖部分”意谓经取代的糖部分或糖替代物。

“经取代的糖部分”意谓不为天然存在的呋喃醣基的呋喃醣基。经取代的糖部分包括(但不限于)在天然存在的呋喃醣基的2'位、5'位和/或4'位包含修饰的糖部分。某些经取代的糖部分为双环糖部分。

“糖替代物”意谓不包含呋喃醣基且能够置换核苷中天然存在的呋喃醣基的结构，所述置换使得所得核苷能够(1)并入寡核苷酸中及(2)与互补核苷杂交。此类结构包括呋喃醣基的相对简单的变化，诸如包含不同数目的原子的环(例如4元、6元或7元环)；呋喃醣基的氧置换为非氧原子(例如碳、硫或氮)；或原子数变化及置换氧两者。此类结构亦可包含对应于针对经取代的糖部分所述的取代的取代(例如可任选地包含其他取代基的6员碳环双环糖替代物)。糖替代物亦包括更复杂的糖置换(例如肽核酸的非环系统)。糖替代物包括(但不限于)吗啉基、环己烯基及环己醣醇(cyclohexitol)。

“2'-O-甲基糖”或“2'-OMe糖”意谓在2'位具有O-甲基修饰的糖。

“2'-O-甲氧基乙基糖”或“2'-MOE糖”意谓在2'位具有O-甲氧基乙基修饰的糖。

“2'-O-氟”或“2'-F”意谓在2'位具有氟修饰的糖。

“双环糖部分”意谓包含4至7员环的经修饰糖部分(包括(但不限于)呋喃醣基)，其包含连接该4至7员环的两个原子的桥键以形成第二环，从而产生双环结构。在某些实施例中，4至7员环为糖环。在某些实施例中，4至7员环为呋喃醣基。在某些此类实施例中，桥键连接呋喃醣基的2'碳与4'碳。非限制性示例性双环糖部分包括LNA、ENA、cEt、S-cEt及R-cEt。

“锁核酸(LNA)糖部分”意谓在4'与2'呋喃醣环原子之间包含(CH₂)-O桥的经取代的糖部分。

“ENA糖部分”意谓在4'与2'呋喃醣环原子之间包含(CH₂)₂-O桥的经取代的糖部分。

“限制性乙基(cEt)糖部分”意谓在4'与2'呋喃醣环原子之间包含CH(CH₃)-O桥的经取代的糖部分。在某些实施例中，CH(CH₃)-O桥限制呈S型取向。在某些实施例中，CH(CH₃)-O限制呈R型取向。

“S-cEt糖部分”意谓在4'与2'呋喃醣环原子之间包含S型限制性CH(CH₃)-O桥的经取代的糖部分。

“R-cEt糖部分”意谓在4'与2'呋喃醣环原子之间包含R型限制性CH(CH₃)-O桥的经取代的糖部分。

“2'-O-甲基核苷”意谓具有2'-O-甲基糖修饰的2'位上经修饰核苷。

“2'-O-甲氧基乙基核苷”意谓具有2'-O-甲氧基乙基糖修饰的2'位上经修饰核苷。2'-O-甲氧基乙基核苷可包含经修饰或未经修饰核苷碱基。

“2'-氟核苷”意谓具有2'-氟糖修饰的2'位上经修饰核苷。2'-氟核苷可包含经修饰或未经修饰核苷碱基。

“双环核苷”意谓具有双环糖部分的2'位上经修饰核苷。双环核苷可具有经修饰或未经修饰核苷碱基。

“cEt核苷”意谓包含cEt糖部分的核苷。cEt核苷可包含经修饰或未经修饰核苷碱基。

“S-cEt核苷”意谓包含S-cEt糖部分的核苷。

“R-cEt核苷”意谓包含R-cEt糖部分的核苷。

“非双环核苷”意谓具有除双环糖以外的糖的核苷。在某些实施例中，非双环核苷包含天然存在的糖。在某些实施例中，非双环核苷包含经修饰的糖。在某些实施例中，非双环核苷为β-D-脱氧核糖核苷。在某些实施例中，非双环核苷为2'-O-甲氧基乙基核苷。

“β-D-脱氧核糖核苷”意谓天然存在的DNA核苷。“β-D-核糖核苷”意谓天然存在的RNA核苷。“LNA核苷”意谓包含LNA糖部分的核苷。

“ENA核苷”意谓包含ENA糖部分的核苷。

“基序”意谓寡核苷酸中经修饰和/或未经修饰核苷碱基、糖和/或核苷间键联的型态。在某些实施例中，基序为核苷型态。

“核苷型态”意谓经修饰寡核苷酸或其区中核苷修饰的型态。核苷型态为描述寡核苷酸中核苷修饰的排列的基序。

“完全修饰的寡核苷酸”意谓各核苷碱基、各糖和/或各核苷间键联均经修饰。

“均一修饰的寡核苷酸”意谓在整个经修饰寡核苷酸中各核苷碱基、各糖和/或各核苷间键联均具有相同修饰。

“稳定化修饰”意谓使经修饰寡核苷酸在核酸酶存在下的稳定性相对于由磷酸二酯核苷间键联连接的2'-脱氧核苷所提供的稳定性有所增强的核苷修饰。举例而言，在某些实施例中，稳定化修饰为稳定化核苷修饰。在某些实施例中，稳定化修饰为核苷间键联修饰。

“稳定化核苷”意谓经修饰以使寡核苷酸的核酸酶稳定性相对于由2'-脱氧核苷提供的稳定性有所增强的核苷。在一个实施例中，稳定化核苷为2'位上经修饰核苷。

“稳定化核苷间键联”意谓使寡核苷酸的核酸酶稳定性相对于由磷酸二酯核苷间键联提供的稳定性有所提高的核苷间键联。在一个实施例中，稳定化核苷间键联为硫代磷酸酯核苷间键联。

“个体”意谓选用于治疗或疗法的人类或非人类动物。在某些实施例中，非人类动物个体为犬。

“有需要的个体”意谓被鉴别为需要疗法或治疗的个体。

“给予”意谓向个体提供医药药剂或组合物，且包括(但不限于)由医学专业人员给予及自给予。

“肠胃外给予”意谓经由注射或输注给予。

肠胃外给予包括(但不限于)皮下给予、静脉内给予及肌肉内给予。

“皮下给予”意谓恰给予于皮肤下方。

“静脉内给予”意谓给予至静脉中。

“心脏内给予”意谓给予至心脏中。在某些实施例中，心脏内给予藉助于导管进行。在某些实施例中，心脏内给予藉助于开心手术进行。

“肺部给予”意谓给予至肺部。

“并行给予”是指两种或两种以上药剂以其两者的药理学作用在患者体内同时表达的任何方式共同给予。并行给予不需要该两种药剂于单一医药组合物中、以相同剂型或藉由相同给药途径给予。两种药剂的作用本身无需同时表现。这些作用仅需重叠一段时间而无需共同延长。

“持续时间”意谓活性或事件持续的时段。在某些实施例中，治疗的持续时间为给予医药药剂或医药组合物的剂量的时段。

“疗法”意谓疾病治疗方法。在某些实施例中，疗法包括(但不限于)化学疗法、放射疗法或给予医药药剂。

“治疗”意谓施用一种或多种用于治愈或改善疾病的特定程序。在某些实施例中，特定程序为给予一种或多种医药药剂。

“改善”意谓减轻病状或疾病的至少一种指标的严重性。在某些实施例中，改善包括延迟或减缓病状或疾病的一种或多种指标的进展。指标的严重性可藉由本领域的技术人员已知的主观或客观量度来确定。

“有产生……的风险”意谓个体易于产生病状或疾病的状态。在某些实施例中，有产生病状或疾病的风险的个体展现该病状或疾病的一种或多种症状，但并不展现足以诊断为患有该病状或疾病的数目的症状。在某些实施例中，有产生病状或疾病的风险的个体展现该病状或疾病的一种或多种症状，但程度轻于诊断为患有该病状或疾病所需的程度。

“预防……发作”意谓预防有产生疾病或病状的风险的个体产生该病状或疾病。在某些实施例中，有产生疾病或病状的风险的个体接受与已患该疾病或病状的个体所接受的治疗类似的治疗。

“延迟……发作”意谓延迟有产生疾病或病状的风险的个体产生该病状或疾病。在某些实施例中，有产生疾病或病状的风险的个体接受与已患该疾病或病状的个体所接受的治疗类似的治疗。

“治疗剂”意谓用于治愈、改善或预防疾病的医药药剂。

“剂量”意谓单次给药中所提供的医药药剂的指定量。在某些实施例中，剂量可以两次或两次以上快速注射(boluse)、锭剂或注射来给予。举例而言，在需要皮下给予的某些实施例中，所要剂量所需的体积不易藉由单次注射提供。在此类实施例中，可使用两次或两次以上注射来达成所要剂量。在某些实施例中，剂量可以两次或两次以上注射给予以使个体的注射部位反应最小。在某些实施例中，剂量是以缓慢输注形式给予。

“剂量单位”意谓提供医药药剂时所采用的形式。在某些实施例中，剂量单位为容纳冻干寡核苷酸的小瓶。在某些实施例中，剂量单位为容纳复原寡核苷酸的小瓶。

“治疗有效量”是指医药药剂向动物提供治疗效益的量。

“医药组合物”意谓包括医药药剂的适于给予个体的物质的混合物。举例而言，医药组合物可包含无菌水溶液。

“医药药剂”意谓在给予个体时提供治疗作用的物质。

“活性医药成分”意谓医药组合物中提供所要作用的物质。

“器官功能改善”意谓器官功能朝向正常限度变化。在某些实施例中，藉由测量个体血液或尿液中存在的分子来评估器官功能。举例而言，在某些实施例中，肝功能改善是藉由血液肝转氨酶含量降低来量度。在某些实施例中，肾功能改善是藉由血液尿素氮降低、蛋白尿降低、白蛋白尿降低等加以量度。

“可接受的安全性概况”意谓临床上可接受的限度内的副作用型态。

“副作用”意谓除所要作用以外的归因于治疗的生理反应。在某些实施例中，副作用包括(但不限于)注射部位反应、肝功能测试异常、肾功能异常、肝中毒、肾中毒、中枢神经系统异常及肌病。此类副作用可直接或间接检测。举例而言，血清中的转氨酶含量升高可指示肝中毒或肝功能异常。举例而言，胆红素增加可指示肝中毒或肝功能异常。

“注射部位反应”意谓个体的注射部位处皮肤的炎症或异常发红。

“个体顺应性”意谓个体遵循推荐或规定的疗法。

“顺应”意谓个体遵循推荐的疗法。

“推荐的疗法”意谓医学专业人员关于治疗、改善、延迟或预防疾病所推荐的治疗。

概论

miR-21为广泛表达的微小RNA，其与多种细胞过程有关，包括细胞分化、增殖、细胞凋亡及基质周转。另外，miR-21与多种疾病相关。miR-21在癌症中常常上调，且抑制miR-21已在若干癌症动物模型中展现出肿瘤生长抑制作用。在心脏肥大动物模型中抑制miR-21表明miR-21在心脏病中的作用。已在心脏纤维化、肾纤维化及肺纤维化的动物模型中表明在纤维化中的作用。在组织外植体模型中抑制miR-21的研究说明抑制miR-21会促进伤口愈合。因此，miR-21的抑制剂适用于多种研究及临床配置中。

为鉴别miR-21的有效抑制剂，设计且合成大量抗miR-21化合物。这些化合物在长度以及双环核苷及非双环核苷的数目、位置及身份方面不同。最初的一系列化合物在体外荧光素酶分析中进行测试，其鉴别出一个化合物子集为体外活性化合物。接着在体内分析中测试这些体外活性化合物以鉴别在体内作为miR-21的有效抑制剂的那些化合物。根据最初的体外及体内筛选，选择某些化合物作为设计其他化合物的基础。使用结构与活性(体外活性及体内活性两者)之间根据实验观测到的相关性来预测此类其他化合物的设计，这些化合物在长度及双环及非双环核苷的选择及排列方面具有进一步的变化。对这些其他化合物重复体外及体内筛选分析。亦测试某些化合物的其他性质，例如对核酸外切酶活性的敏感性及在溶液中的粘度。观测到体外活性最大的化合物并不一定为体内活性最大的化合物，且亦观测到一些在体外具中等活性的化合物为在体内具高度活性的化合物。

在此过程中体外筛选的接近300种化合物中，仅145种鉴别为在体外荧光素酶分析中具活性。在这些活性体外化合物中，鉴别出一个子集在体内具活性。经由设计及筛选化合物的此重复过程，观测到具有特定双环及非双环型态的化合物在体内为miR-21的有效抑制剂。因此，这些化合物适用于调节由miR-21活性促进的细胞过程。此外，这些化合物适用于治疗与miR-21相关的疾病、预防和/或延迟这些疾病发作。此类疾病的特征可在于相对于无病样品异常高的miR-21表达。此类疾病包括(但不限于)纤维化、急性肾损伤、心脏肥大、心肌梗塞及癌症。另外，本文提供的组合物及方法可用于促进伤口愈合。

靶向miR-21的某些经修饰寡核苷酸

本文提供具有某些双环及非双环核苷型态的经修饰寡核苷酸。具有本文鉴别的型态的经修饰寡核苷酸为miR-21活性的有效抑制剂。

本文说明的各核苷型态按5'至3'方向展示。

在某些实施例中，本文提供包含由8至22个连接的核苷组成的经修饰寡核苷酸的化合物，其中经修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与miR-21(SEQ ID NO:1)互补且其中经修饰寡核苷酸按5'至3'方向包含以下核苷型态III的至少8个连续核苷：

(R)_X-N^B-N^Q-N^Q-N^B-(N^Q-N^Q-N^Q-N^B)₃-N^Y-N^Z

其中各R为非双环核苷；X为1至4；

各N^B为双环核苷；

各N^Q为非双环核苷；

N^Y为经修饰核苷或未经修饰核苷；且

各N^Z为经修饰核苷。

在核苷型态III的某些实施例中，X为1。在核苷型态III的某些实施例中，X为2。在核苷型态III的某些实施例中，X为3。在核苷型态III的某些实施例中，X为4。

在某些实施例中，本文提供包含由8至19个连接的核苷组成的经修饰寡核苷酸的化合物，其中经修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与miR-21(SEQ ID NO:1)互补且其中经修饰寡核苷酸按5'至3'方向包含以下核苷型态IV的至少8个连续核苷：

N^M-N^B-N^Q-N^Q-N^B-(N^Q-N^Q-N^Q-N^B)₃-N^Y-N^Z

其中N^M为不是双环核苷的经修饰核苷；

各N^B为双环核苷；

各N^Q为非双环核苷；

N^Y为经修饰核苷或未经修饰核苷；且

N^Z为经修饰核苷。

在某些实施例中，本文提供包含由8至19个连接的核苷组成的经修饰寡核苷酸的化合物，其中经修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与miR-21(SEQ ID NO:1)互补且其中经修饰寡核苷酸按5’至3’方向包含以下核苷型态V的至少8个连续核苷：

N^M-N^B-(N^Q-N^Q-N^B-N^B)₄-N^Z

其中N^M为不是双环核苷的经修饰核苷；

各N^B为双环核苷；

各N^Q为非双环核苷；且

N^Z为经修饰核苷。

在某些实施例中，本文提供包含由8至15个连接的核苷组成的经修饰寡核苷酸的化合物，其中经修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与miR-21(SEQ ID NO:1)互补，且其中经修饰寡核苷酸按5’至3’方向包含以下核苷型态VI的至少8个连续核苷：

N^Q-N^B-N^B-N^Q-(N^B-N^B-N^Q-N^Q)₂-N^B-N^Q-N^B

其中各N^Q为非双环核苷；且

各N^B为双环核苷。

在某些实施例中，本文提供包含由8至19个连接的核苷组成的经修饰寡核苷酸的化合物，其中经修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与miR-21(SEQ ID NO:1)互补，且其中经修饰寡核苷酸按5’至3’方向包含以下核苷型态VII的至少8个连续核苷：

N^M-(N^B-N^M-N^M)₂-N^M-(N^B-N^Q-N^Q-N^Q)₂-N^B-N^B-N^Z

其中各N^M为不是双环核苷的经修饰核苷；

各N^B为双环核苷；

各N^Q为非双环核苷；且

N^Z为经修饰核苷。

以下实施例适用于本文所述的任何核苷型态，包括核苷型态III至VII。

在某些实施例中，经修饰寡核苷酸包含本文所述核苷型态的至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个或22个连续核苷。

在本文所述的任何核苷型态的某些实施例中，经修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与miR-21(SEQ ID NO:1)至少90％互补。在本文所述的任何核苷型态的某些实施例中，经修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与miR-21(SEQ ID NO:1)至少95％互补。在本文所述的任何核苷型态的某些实施例中，经修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与miR-21(SEQ ID NO:1)100％互补。

在本文所述的任何核苷型态的某些实施例中，经修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与miR-21互补以使得微小RNA的位置1与该寡核苷酸的3'端核苷碱基配对。举例而言：

在本文所述的任何核苷型态的某些实施例中，经修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与miR-21互补以使得微小RNA的位置2与该寡核苷酸的3’端核苷碱基配对。举例而言：

在本文所述的任何核苷型态的某些实施例中，经修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与miR-21互补，且相对于miR-21的核苷碱基序列具有1至3个错配。在某些实施例中，经修饰寡核苷酸与miR-21互补，且相对于miR-21的核苷碱基序列具有1个错配。经修饰寡核苷酸与miR-21互补，且相对于miR-21的核苷碱基序列具有2个错配。在某些实施例中，经修饰寡核苷酸具有SEQ ID NO:3至6、9及10的任一个的序列，但具有1或2个核苷碱基变化。举例而言：

应了解，在SEQ ID NO:3至10中，序列中的各“T”可独立地为“T”核苷碱基或“U”核苷碱基，且具有SEQ ID NO:3至10的任一个的序列的化合物可包含全部T核苷碱基、全部U核苷碱基、或U核苷碱基与T核苷碱基的任何组合。因此，在整篇本揭露内容及随附序列表中，“T”存在于SEQ ID NO:3至10中的各种位置处就彼特定核苷碱基为“T”或“U”而言不具有限制性。

在本文所述的任何核苷型态的某些实施例中，各双环核苷独立地选自LNA核苷、cEt核苷及ENA核苷。在某些实施例中，至少两个双环核苷的糖部分彼此不同。在某些实施例中，所有双环核苷均具有彼此相同的糖部分。在某些实施例中，各双环核苷为cEt核苷。在某些实施例中，各双环核苷为LNA核苷。

在本文所述的任何核苷型态的某些实施例中，cEt核苷为S-cEt核苷。在本文所述的任何核苷型态的某些实施例中，cEt核苷为R-cEt核苷。

在本文所述的任何核苷型态的某些实施例中，各非双环核苷独立地选自β-D-脱氧核糖核苷、β-D-核糖核苷、2'-O-甲基核苷、2'-O-甲氧基乙基核苷及2'-氟核苷。

在本文所述的任何核苷型态的某些实施例中，各非双环核苷独立地选自β-D-脱氧核糖核苷及2'-O-甲氧基乙基核苷。

在本文所述的任何核苷型态的某些实施例中，至少两个非双环核苷包含彼此不同的糖部分且独立地选自β-D-脱氧核糖核苷、β-D-核糖核苷、2'-O-甲基核苷、2'-O-甲氧基乙基核苷及2'-氟核苷。

在本文所述的任何核苷型态的某些实施例中，至少两个非双环核苷包含彼此不同的糖部分且独立地选自β-D-脱氧核糖核苷及2'-O-甲氧基乙基核苷。

在本文所述的任何核苷型态的某些实施例中，各非双环核苷独立地选自β-D-脱氧核糖核苷、2’-O-甲基核苷及2’-O-甲氧基乙基核苷。

在本文所述的任何核苷型态的某些实施例中，各非双环核苷具有相同类型的糖部分且选自β-D-脱氧核糖核苷、β-D-核糖核苷、2'-O-甲基核苷、2'-O-甲氧基乙基核苷及2'-氟核苷。

在本文所述的任何核苷型态的某些实施例中，各非双环核苷为β-D-脱氧核糖核苷。在某些实施例中，各非双环核苷为2'-O-甲基核苷。

在本文所述的任何核苷型态的某些实施例中，不超过3个非双环核苷为2'-O-甲氧基乙基核苷。在某些实施例中，不超过2个非双环核苷为2'-O-甲氧基乙基核苷。在某些实施例中，不超过1个非双环核苷为2'-O-甲氧基乙基核苷。

在本文所述的任何核苷型态的某些实施例中，一个非双环核苷为2'-MOE核苷且其他各非双环核苷为β-D-脱氧核糖核苷。在某些实施例中，两个非双环核苷为2'-O-甲氧基乙基核苷且其他各非双环核苷为β-D-脱氧核糖核苷。在某些实施例中，三个非双环核苷为2'-O-甲氧基乙基核苷且其他各非双环核苷为β-D-脱氧核糖核苷。

在本文所述的任何核苷型态的某些实施例中，5'最末端非双环核苷及3'最末端非双环核苷为2'-O-甲氧基乙基核苷且其他各非双环核苷为β-D-脱氧核糖核苷。

在核苷型态III的某些实施例中，R为不是双环核苷的经修饰核苷；且x为1。在核苷型态III的某些实施例中，R为不是双环核苷的经修饰核苷；x为1；且各N^Q为未经修饰核苷。在核苷型态III的某些实施例中，R为不是双环核苷的经修饰核苷；x为1；各N^Q为未经修饰核苷；各N^B独立地选自S-cEt核苷及LNA核苷；且N^Y选自β-D-脱氧核糖核苷、2'-O-甲氧基乙基核苷、S-cEt核苷及LNA核苷。在核苷型态III的某些实施例中，R为不是双环核苷的经修饰核苷；x为1；且各N^Q为β-D-脱氧核糖核苷。在核苷型态III的某些实施例中，R为不是双环核苷的经修饰核苷；x为1；各N^Q为β-D-脱氧核糖核苷；各N^B独立地选自S-cEt核苷及LNA核苷；且N^Y选自β-D-脱氧核糖核苷、2'-O-甲氧基乙基核苷、S-cEt核苷及LNA核苷。在核苷型态III的某些实施例中，R为不是双环核苷的经修饰核苷；x为1；各N^Q为未经修饰核苷；各N^B为S-cEt核苷；且N^Y选自β-D-脱氧核糖核苷、2'-O-甲氧基乙基核苷及S-cEt核苷。在核苷型态III的某些实施例中，R为不是双环核苷的经修饰核苷；x为1；各N^Q为β-D-脱氧核糖核苷；各N^B为S-cEt核苷；且N^Y选自β-D-脱氧核糖核苷、2'-O-甲氧基乙基核苷及S-cEt核苷。在某些实施例中，型态III的经修饰寡核苷酸具有选自SEQID NO:3至10的核苷碱基序列，其中序列中的各T独立地选自T及U。

在核苷型态IV的某些实施例中，N^M为2’-O-甲氧基乙基核苷；各N^B独立地选自S-cEt核苷及LNA核苷；各N^Q独立地选自β-D-脱氧核糖核苷及2’-O-甲氧基乙基核苷；N^Y选自2’-O-甲氧基乙基核苷、S-cEt核苷、LNA核苷及β-D-脱氧核糖核苷；且N^Z选自2’-O-甲氧基乙基核苷、LNA核苷及S-cEt核苷。在核苷型态IV的某些实施例中，N^M为2’-O-甲氧基乙基核苷；各N^B为S-cEt核苷；各N^Q独立地选自β-D-脱氧核糖核苷及2’-O-甲氧基乙基核苷；N^Y选自2’-O-甲氧基乙基核苷、S-cEt核苷及β-D-脱氧核糖核苷；且N^Z选自2’-O-甲氧基乙基核苷及S-cEt核苷。在核苷型态IV的某些实施例中，N^M为2’-O-甲氧基乙基核苷；各N^B为S-cEt核苷；各N^Q为β-D-脱氧核糖核苷；N^Y为S-cEt核苷；且N^Z为S-cEt核苷。在某些实施例中，型态IV的经修饰寡核苷酸具有选自SEQ ID NO:3至10的核苷碱基序列，其中序列中的各T独立地选自T及U。

在核苷型态V的某些实施例中，N^M为2’-O-甲氧基乙基核苷；各N^B独立地选自S-cEt核苷及LNA核苷；各N^Q独立地选自β-D-脱氧核糖核苷及2’-O-甲氧基乙基核苷；且N^Z选自2’-O-甲氧基乙基核苷、LNA核苷及S-cEt核苷。在核苷型态V的某些实施例中，N^M为2’-O-甲氧基乙基核苷；各N^B为S-cEt核苷；各N^Q为β-D-脱氧核糖核苷；且N^Z选自2’-O-甲氧基乙基核苷及S-cEt核苷。在核苷型态V的某些实施例中，N^M为2’-O-甲氧基乙基核苷；各N^B为S-cEt核苷；各N^Q为β-D-脱氧核糖核苷；且N^Z为2’-O-甲氧基乙基核苷。在某些实施例中，型态V的经修饰寡核苷酸具有选自SEQ ID NO:3至10的核苷碱基序列，其中序列中的各T独立地选自T及U。

在核苷型态VI的某些实施例中，各N^B为S-cEt核苷；且各N^Q为2’-O-甲氧基乙基核苷。在核苷型态VI的某些实施例中，各N^B为S-cEt核苷；且各N^Q为β-D-脱氧核糖核苷。在某些实施例中，型态VI的经修饰寡核苷酸具有选自SEQ ID NO:5及7的核苷碱基序列，其中序列中的各T独立地选自T及U。

在核苷型态VII的某些实施例中，各N^M为2’-O-甲氧基乙基核苷；各N^B为S-cEt核苷；各N^Q独立地选自2’-O-甲基核苷及β-D-脱氧核糖核苷；且N^Z选自S-cEt核苷及2’-O-甲氧基乙基核苷。在核苷型态VII的某些实施例中，各N^M为2’-O-甲氧基乙基核苷；各N^B为S-cEt核苷；各N^Q为β-D-脱氧核糖核苷；且N^Z为S-cEt核苷。在核苷型态VII的某些实施例中，各N^M为2’-O-甲氧基乙基核苷；各N^B为S-cEt核苷；各N^Q独立地选自2’-O-甲基核苷及β-D-脱氧核糖核苷；且N^Z为S-cEt核苷。在核苷型态VII的某些实施例中，各N^M为2’-O-甲氧基乙基核苷；各N^B为S-cEt核苷；各N^Q独立地选自2’-O-甲基核苷及β-D-脱氧核糖核苷；且N^Z为2’-O-甲氧基乙基核苷。在某些实施例中，型态VII的经修饰寡核苷酸具有选自SEQ ID NO:3至10的核苷碱基序列，其中序列中的各T独立地选自T及U。

在某些实施例中，本文提供的化合物具有如表1中所示的核苷碱基序列及修饰(亦即“结构”)的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个或至少19个连续核苷。在某些实施例中，本文提供的化合物具有选自表1中的结构的结构。核苷修饰如下指示：之后未接下标的核苷指示β-D-脱氧核糖核苷；之后接有下标“E”的核苷指示2’-MOE核苷；之后接有下标“M”的核苷指示2’-O-甲基核苷；之后接有下标“S”的核苷指示S-cEt核苷。各核苷间键联为硫代磷酸酯核苷间键联。上标“Me”指示核苷的碱基上的5-甲基。

表1：抗miR-21化合物

在本文所述的任何核苷型态的某些实施例中，经修饰寡核苷酸由8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个连接的核苷组成。在某些实施例中，经修饰寡核苷酸包含核苷型态III中所述核苷型态的至少8个连接的核苷。在某些实施例中，经修饰寡核苷酸包含核苷型态IV中所述核苷型态的至少8个连接的核苷。在某些实施例中，经修饰寡核苷酸包含核苷型态V中所述核苷型态的至少8个连接的核苷。在某些实施例中，经修饰寡核苷酸包含核苷型态VI中所述核苷型态的至少8个连接的核苷。在某些实施例中，经修饰寡核苷酸包含核苷型态VII中所述核苷型态的至少8个连接的核苷。

在某些实施例中，具有本文所述的任何核苷型态的经修饰寡核苷酸包含至少一个经修饰核苷间键联。在某些实施例中，各核苷间键联为经修饰核苷间键联。在某些实施例中，经修饰核苷间键联为硫代磷酸酯核苷间键联。

在某些实施例中，经修饰寡核苷酸具有至少一个核苷碱基为胞嘧啶的核苷碱基序列。在某些实施例中，至少一个胞嘧啶为5-甲基胞嘧啶。在某些实施例中，各胞嘧啶均为5-甲基胞嘧啶。在某些实施例中，至少一个核苷包含经修饰核苷碱基。

经修饰寡核苷酸可在整个经修饰寡核苷酸的各个位置上由核酸外切酶和/或核酸内切酶裂解。该酶促裂解的产物可保留miR-21抑制活性，并因而视为活性代谢物。因此，在本文所述的方法中可使用经修饰寡核苷酸的代谢产物。

在某些实施例中，靶向miR-21的经修饰寡核苷酸具有选自表2A的核苷型态，其中N^M为不是双环核苷的经修饰核苷；各N^B为双环核苷；各N^Q为非双环核苷；N^Y为经修饰核苷或未经修饰核苷；且N^Z为经修饰核苷。

表2A：核苷型态IV的代谢产物

5’

3’

NM

NB

NQ

NB

NQ

NB

NQ

NB

NQ

NB

NY

NZ

NB

NQ

NB

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在某些实施例中，靶向miR-21的经修饰寡核苷酸具有选自表2B的核苷型态，其中N^M为不是双环核苷的经修饰核苷；各N^B为双环核苷；各N^Q为非双环核苷；且N^Z为经修饰核苷。

表2B：核苷型态V的代谢产物

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在某些实施例中，靶向miR-21的经修饰寡核苷酸具有选自表2C的核苷型态，其中各N^B为双环核苷；且各N^Q为非双环核苷。

表2C：核苷型态VI的代谢产物

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在某些实施例中，靶向miR-21的经修饰寡核苷酸具有选自表2D的核苷型态，其中N^M为不是双环核苷的经修饰核苷；各N^B为双环核苷；各N^Q为非双环核苷；且N^Z为经修饰核苷。

表2D：核苷型态VII的代谢产物

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在某些实施例中，靶向miR-21的经修饰寡核苷酸具有选自表3A、表3B、表3C、表3D、表3D或表3E的核苷型态及核苷碱基序列。之后未接下标的核苷指示β-D-脱氧核糖核苷。之后接有下标“E”的核苷指示2'-MOE核苷。之后接有下标“S”的核苷指示S-cEt核苷。各核苷间键联为硫代磷酸酯核苷间键联。核苷碱基在5'位可包含或可不包含甲基。

表3A：25221号化合物的代谢产物

表3B：25220号化合物的代谢产物

表3C：36284号化合物的代谢产物

表3D：36039号化合物的代谢产物

表3E：36731号化合物的代谢产物

在某些实施例中，经修饰寡核苷酸由超过19个连接的核苷组成，且包含本文所述的核苷型态。除由该核苷型态描述的核苷外亦存在的核苷为经修饰或未经修饰核苷。举例而言，由21个连接的核苷组成且具有与miR-21互补的核苷碱基序列的经修饰寡核苷酸可具有长度为19个连接的核苷的核苷型态IV、V或VII，或可具有长度为15个核苷的核苷型态VI，或可具有长度可为19至22个核苷的核苷型态III。其他核苷可包含经修饰或未经修饰的糖部分。在某些实施例中，经修饰寡核苷酸由19个连接的核苷组成，且包含本文所述的任何核苷型态。在某些实施例中，经修饰寡核苷酸由20个连接的核苷组成，且包含本文所述的任何核苷型态。在某些实施例中，经修饰寡核苷酸由21个连接的核苷组成，且包含本文所述的任何核苷型态。在某些实施例中，经修饰寡核苷酸由22个连接的核苷组成，且包含本文所述的任何核苷型态。在某些实施例中，经修饰寡核苷酸由23个连接的核苷组成，且包含本文所述的任何核苷型态。在某些实施例中，经修饰寡核苷酸由24个连接的核苷组成，且包含本文所述的任何核苷型态。在某些实施例中，经修饰寡核苷酸由25个连接的核苷组成，且包含本文所述的任何核苷型态。

本发明的某些用途

调节miR-21活性

本文提供的化合物为miR-21活性的有效且具特异性的抑制剂，且因此适用于调节miR-21活性。

微小RNA结合至信使RNA并阻遏信使RNA表达。在某些情况下，抑制微小RNA的活性会导致信使RNA去阻遏，亦即信使RNA表达在RNA和/或蛋白质的水平上增加。本文提供调节miR-21调控的转录物表达的方法，包括使细胞与本发明的化合物接触，其中该化合物包含具有与miR-21互补的序列的经修饰寡核苷酸。

在某些实施例中，miR-21调控的转录物为YOD1，且抑制miR-21使得YOD1mRNA的含量增加。在某些实施例中，miR-21调控的转录物为PPAR-α，且抑制miR-21使得PPAR-αmRNA的含量增加。在某些实施例中，miR-21调控的转录物为RNF167。

在某些实施例中，miR-21调控的转录物为SPG20。在某些实施例中，在肝脏中抑制miR-21使得SPG20mRNA的含量增加。

在某些实施例中，在使细胞与本发明的化合物接触后，观测到miR-21调控的转录物的mRNA含量增加至至少1.5倍。在某些实施例中，在使细胞与本发明的化合物接触后，观测到miR-21调控的转录物的mRNA含量增加至至少2.0倍。在某些实施例中，微小RNA调控的转录物的mRNA含量增加至至少2.5倍。在某些实施例中，微小RNA调控的转录物的mRNA含量增加至至少3.0倍。在某些实施例中，微小RNA调控的转录物的mRNA含量增加至至少3.5倍。在某些实施例中，微小RNA调控的转录物的mRNA含量增加至至少4.0倍。在某些实施例中，微小RNA调控的转录物的mRNA含量增加至至少4.5倍。在某些实施例中，微小RNA调控的转录物的mRNA含量增加至至少5.0倍。

已知某些微小RNA靶向若干信使RNA，在一些情况下，靶向数百种信使RNA。抑制单一微小RNA的活性可使得许多微小RNA标靶的表达发生可检测的变化。本文提供调节多种由miR-21调控的转录物的方法，其包括抑制miR-21的活性，其中发生广泛基因表达变化。

在某些实施例中，在用本发明的化合物抑制miR-21后可观测到表型变化。此类表型变化可在miR-21调控的转录物的表达有或无可检测变化的情况下出现。

疾病及病症

器官或组织中对损害或损伤的正常生理反应涉及受损组织修复，其为存活所必需的基本生物学过程。在修复过程中，在外来物质、细菌及受损组织消除后，纤维母细胞迁移至损伤部位以沉积新的细胞外基质，接着作为组织重塑期的一部分，在结构上组织化。

纤维母细胞为结缔组织中存在的最常见细胞，且负责合成网硬蛋白(reticulin)及其他支撑细胞外基质且在正常伤口愈合中起重要作用的弹性纤维(Sempowski,G.D.等人，2002.Wound Repair Regeneration.3:120-131)。纤维母细胞负责沉积胶原蛋白，此为修复受损组织及恢复其结构及功能所必需。在伤口愈合过程中，活化的纤维母细胞转型成肌纤维母细胞，其为胶原蛋白分泌性α-SMA+纤维母细胞。在伤口愈合过程的最初阶段，肌纤维母细胞产生基质金属蛋白酶，其破坏基底膜并且允许发炎性细胞有效募集至损伤部位。在损伤修复的稍后阶段中，肌纤维母细胞促进伤口收缩，该过程为伤口边缘朝向伤口中心迁移的过程。因此，纤维母细胞活性对正常愈合过程而言必不可少。

参与正常损伤修复过程的纤维母细胞可来源于局部间质细胞，自骨髓募集，或由上皮-间质转化产生。上皮-间质转化(EMT)描述细胞表型的一系列快速变化(Kalluri,R.及Neilson,E.G.2003.J.Clin.Invest.112:1776-1784)，期间静态上皮细胞丧失细胞-细胞接触，获取间质特征并且表达出迁移性表型。常驻纤维母细胞、浸润纤维细胞或外膜细胞样细胞亦可参与损伤修复过程。

在一些情况下，组织修复过程过度进行，从而导致细胞外基质(ECM)组分过度积聚及ECM实质性重塑，引起永久性纤维变性瘢痕形成。此过量纤维结缔组织的形成(称为纤维化的过程)造成组织架构的异常变化且干扰正常器官功能。

纤维化可在身体的任何部分发生，并且可由多种物理性、代谢性、缺血性、感染性、发炎性或免疫性损伤引起。尽管纤维化的解剖学位置、起因及临床表现可多种多样，但所有类型的纤维化存在共同的重要病理学特征。与发生纤维化的位置无关，纤维变性过程涉及促纤维变性细胞激素分泌及活化、间质细胞群体扩增及活化以及细胞外基质合成及组织化，并且最终导致正常组织破坏。若不加治疗，则纤维化可导致心脏、肺、肾、肝脏、眼睛及皮肤以及其他组织的多种病状。

如本文所证明，在纤维化模型中抑制miR-21会使胶原蛋白沉积减少。因此，本文提供用于治疗纤维化、预防和/或延迟纤维化发作的方法，其包括向个体给予包含经修饰寡核苷酸的化合物，其中该经修饰寡核苷酸与miR-21互补。本文亦提供用于治疗个体的纤维化、预防和/或延迟个体的纤维化发作的组合物，其包含含有经修饰寡核苷酸的化合物，其中该经修饰寡核苷酸与miR-21互补。该个体可能已接受到纤维化的诊断，可能具有产生纤维化的风险，或可能怀疑患有纤维化。

在某些实施例中，患有纤维化的个体患有肾纤维化、肺纤维化、肝纤维化、心脏纤维化、皮肤纤维化、年龄相关性纤维化、脾纤维化、硬皮病或移植后纤维化。

肾脏的许多疾病或异常的特征为存在纤维化。因而，本文提供的化合物适用于治疗、改善特征在于存在纤维化的任何肾脏疾病、预防和/或延迟其发作。在某些实施例中，患有纤维化的个体患有肾脏疾病或病状。在某些实施例中，具有产生纤维化的风险的个体患有肾脏疾病或病状。在某些实施例中，怀疑患有纤维化的个体患有肾脏疾病或病状。因此，本文提供用于治疗患有纤维化、具有产生纤维化的风险或怀疑患有纤维化的个体的方法，其中该个体患有肾脏疾病或病状。肾脏疾病或病状可为(但不限于)以下一种或多种：肾小球疾病、肾小管间质性纤维化、IgA肾病、间质性纤维化/肾小管萎缩、肾小球硬化、肾小球肾炎、糖尿病、埃布尔综合征、特发性局部区段性肾小球硬化、膜性肾病、塌陷性肾小球病、慢性复发性肾脏感染、糖尿病、糖尿病性肾病、慢性复发性肾脏感染、高血压、全身性高血压、肾小球内高血压或末期肾病。

本文提供改善个体的肾功能的方法。在某些实施例中，本文提供延迟和/或预防末期肾病发作的方法。在某些实施例中，本文提供延迟个体的透析需要的方法。在某些实施例中，本文提供延迟个体的肾移植需要的方法。在某些实施例中，本文提供延迟个体的肾功能受损的方法。

慢性肾病的特征可在于存在纤维化。因此，在某些实施例中，肾脏疾病或病状为慢性肾病。在某些实施例中，个体具有产生慢性肾病的风险。在某些实施例中，患有急性肾损伤的个体具有产生纤维化和/或慢性肾病的风险。因此，本文提供的组合物及方法可给予患有急性肾损伤的个体以预防或延迟纤维化和/或慢性肾病的发作。

在某些实施例中，患有纤维化的个体患有由肾脏的急性或反复性创伤引起的肾纤维化。创伤可由手术、化学疗法、放射治疗、同种异体移植排斥反应、慢性移植排斥反应及急性移植排斥反应导致。

在某些实施例中，肾纤维化可由暴露于可能在短期或长期暴露后具肾毒性的任何药剂引起。此类药剂包括医药药剂，包括(但不限于)止痛剂、非类固醇消炎药、抗生素、锂、环孢菌素、美色拉嗪(mesalazine)、造影介质、化学治疗剂；职业性毒素，包括(但不限于)重金属；及环境毒素，包括(但不限于)重金属(例如镉、氯化汞)或植物肾毒素(例如马兜铃酸)。

本文提供治疗埃布尔综合征的方法，其包含向患有或怀疑患有埃布尔综合征的个体给予与miR-21互补的经修饰寡核苷酸。在某些实施例中，个体在给予经修饰寡核苷酸之前已诊断为患有埃布尔综合征。埃布尔综合征的诊断可经由评估包括(但不限于)以下的参数达成：个体的家族史、临床特征(包括(但不限于)蛋白尿、白蛋白尿、血尿、受损GFR、耳聋和/或眼部变化)及组织生检结果。可测试肾生检体中IV型胶原蛋白α-3、α-4及α-5链的存在或不存在。另外，可藉由对肾生检材料进行电子显微检测来检测肾小球结构变化。可测试皮肤生检体中IV型胶原蛋白α-5链的存在，其通常存在于皮肤中且通常不存在于患有X连锁形式的埃布尔综合征的雄性个体中。埃布尔综合征的诊断亦可包括筛选Col4a3、Col4a4或Col4a5基因的一种或多种中的突变。

在某些实施例中，miR-21在患有埃布尔综合征的个体的肾中的含量增加。在某些实施例中，在给药之前，确定个体的肾中的miR-21含量增加。可由肾生检材料测量miR-21含量。

肝脏的许多疾病或异常的特征为存在纤维化。因此，在某些实施例中，患有纤维化的个体患有肝脏疾病或病状。在某些实施例中，具有产生纤维化的风险的个体患有肝脏疾病或病状。在某些实施例中，怀疑患有纤维化的个体患有肝脏疾病或病状。因此，本文提供用于治疗患有纤维化、具有产生纤维化的风险或怀疑患有纤维化的个体的方法，其中该个体患有肝脏疾病或病状。在某些实施例中，肝脏疾病或病状可为(但不限于)以下一种或多种：慢性肝损伤、肝炎病毒感染(包括丙型肝炎病毒感染及乙型肝炎病毒感染)、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪变性肝炎(NASH)、酒精性肝病(ALD)、酒精性脂肪变性肝炎、桥接纤维化或肝硬化。在某些实施例中，肝脏疾病或病状与暴露于毒性化学品相关。在某些实施例中，肝脏疾病或病状由暴露于医药药剂(例如乙酰胺苯酚)引起。在某些实施例中，接受化学疗法的个体具有肝纤维化和/或慢性肝损伤的风险。

纤维化的存在或程度可藉由针穿刺肝脏生检或经由评估肝硬化程度的非侵袭性短暂弹性成像术方法(诸如

方法)检测。

在肺的许多疾病或异常中可存在纤维化。因此，在某些实施例中，患有纤维化的个体患有肺部疾病或病状。在某些实施例中，具有产生纤维化的风险的个体患有肺部疾病或病状。在某些实施例中，怀疑患有纤维化的个体患有肺部疾病或病状。因此，本文提供用于治疗患有纤维化、具有产生纤维化的风险或怀疑患有纤维化的个体的方法，其中该个体患有肺部疾病或病状。在某些实施例中，肺部疾病或病状可为(但不限于)以下一种或多种：肺纤维化、特发性肺纤维化或慢性阻塞性肺病。在某些实施例中，肺纤维化可由吸入微粒物质，诸如硅胶、石棉、空气污染物或卷烟烟气中存在的微粒物质引起。

在某些实施例中，纤维化为心脏纤维化。

在某些实施例中，纤维化为皮肤纤维化。在某些实施例中，纤维化为年龄相关性纤维化。在某些实施例中，纤维化为脾纤维化。

硬皮病为特征在于纤维化以及其他症状的慢性自体免疫性疾病。在某些实施例中，患有纤维化的个体患有硬皮病。在某些实施例中，患有硬皮病的个体除皮肤的纤维化外亦在内部器官中具有纤维化。

纤维化常发生于移植的器官中，从而导致器官功能丧失并最终引起所移植器官的慢性排斥反应。预防或治疗所移植器官的纤维化可预防或延迟所移植器官的慢性排斥反应，或换言之，可延长所移植器官的功能。因此，在某些实施例中，个体患有移植后纤维化。在某些实施例中，移植后纤维化为肾脏移植后纤维化。在某些实施例中，移植相关性纤维化为肝脏移植后纤维化。在某些实施例中，在移植之前给予本文所述的化合物。在某些实施例中，本文所述的化合物与移植同时给予。在某些实施例中，在移植之后给予本文所述的化合物。

本文提供治疗患有纤维增生性病症的个体的方法。在某些实施例中，此类方法包括向患有或怀疑患有纤维增生性病症的个体给予具有与miRNA或其前体互补的核苷碱基序列的经修饰寡核苷酸。在某些实施例中，miRNA为miR-21。

癌症及转移

已在众多类型的癌症中证明异常高的miR-21表达。此外，在体外及体内模型中抑制miR-21已证明miR-21的抑制剂适用于抑制支持癌细胞生长的细胞过程以及适用于治疗癌症。

因此，在某些实施例中，本文提供的化合物用于治疗、预防、改善癌症和/或延迟癌症发作。在某些实施例中，癌症为肝癌、乳癌、膀胱癌、前列腺癌、骨癌、结肠癌、肺癌、脑癌、血液系统癌症、胰脏癌、头颈部癌、舌癌、胃癌、皮肤癌、甲状腺癌、神经母细胞瘤、食道癌、间皮瘤、神经母细胞瘤、肾癌、睾丸癌、直肠癌、子宫颈癌或卵巢癌。在某些实施例中，肝癌为肝细胞癌。在某些实施例中，肝癌是归因于起源于身体另一部分的癌症的转移，例如癌症是归因于骨癌、结肠癌或乳癌的转移。在某些实施例中，脑癌为多形性神经胶母细胞瘤、寡突星形细胞瘤或寡树突神经胶细胞瘤。在某些实施例中，多形性神经胶母细胞瘤为原神经多形性神经胶母细胞瘤、神经多形性神经胶母细胞瘤、经典多形性神经胶母细胞瘤或间质多形性神经胶母细胞瘤。在某些实施例中，血液系统癌症为急性髓细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性单核细胞性白血病、多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、霍奇金氏淋巴瘤或非霍奇金氏淋巴瘤。在某些实施例中，皮肤癌为黑素瘤。在某些实施例中，肾癌为肾细胞癌。在某些实施例中，乳癌为原位乳腺管细胞癌、侵袭性乳腺管细胞癌、三重阴性乳癌、髓样癌、管状癌及粘液癌。在某些实施例中，癌症对化学疗法具有抗性。

在某些实施例中，在肝癌中，miR-21升高且一种或多种由miR-21调控的转录物的含量降低。在某些实施例中，降低的miR-21调控的转录物为SPG20。

在某些实施例中，肝癌为肝细胞癌(HCC)。通常藉由肝脏成像测试对肝细胞癌作出诊断，诸如腹部超音波、螺旋计算机断层摄影(CT)扫描或三相CT扫描。此类成像测试可与测量α-胎蛋白的血液含量和/或脱-γ-羧基凝血酶原的血液含量结合进行。在某些个体中，可使用MRI来替代CT扫描。肝脏成像测试允许评估肿瘤尺寸、数目、位置、肝外转移、开放性和/或肿瘤对肝脏的动脉及静脉的侵袭。此评估有助于决定适当的治疗性或姑息性介入模式。最终诊断通常藉由针穿刺生检及组织病理学检查来证实。

因此，在某些实施例中，肝癌根据检测肿瘤的计算机断层摄影(CT)扫描进行检测。在某些实施例中，肝癌根据磁共振成像(MRI)进行检测。在某些实施例中，HCC表征为单一原发性肿瘤。在某些实施例中，HCC表征为多个原发性肿瘤。在某些实施例中，HCC表征为具有浸润性生长模式的界定不良原发性肿瘤。在某些实施例中，HCC为具血管侵袭性的单一原发性肿瘤。在某些实施例中，HCC表征为具血管侵袭性的多个原发性肿瘤。在某些实施例中，HCC已转移至一个或多个淋巴结。在某些此类实施例中，淋巴结为局部淋巴结。在某些实施例中，HCC已转移至一个或多个远程组织。在某些实施例中，HCC已转移至肝脏的其他区域、门静脉、淋巴结、肾上腺、骨或肺部。在某些实施例中，存在纤维化。

已采用多种系统来预测HCC的预后，包括TNM系统、奥田系统(Okuda system)、巴塞罗那临床肝癌(Barcelona Clinic Liver Cancer；BCLC)及CLIP评分。此类系统各自并有四种已公认为存活的重要决定因素的特征：潜在肝脏疾病的严重性、肿瘤尺寸、肿瘤扩展至相邻结构中的程度及转移的存在。TNM系统将HCC分类为第I期、第II期、第III期、第IV期或第V期。BCLC将HCC分类为A1期、A2期、A3期、A4期、B期、C期及D期，且包括对Child-Pugh评分的考虑。

在某些实施例中，肝癌分类为第1期、第2期、第3A期、第3B期、第3C期或第4期。第1期的特征在于癌症的尺寸不大于2cm并且尚未开始扩散。在第2期，癌症正侵袭肝脏中的血管，或者肝脏中存在多于一个肿瘤。在第3A期，癌症的尺寸大于5cm或已扩散至肝脏附近的血管。在第3B期，癌症已扩散至附近器官，诸如肠或胃，但尚未扩散至淋巴结。在第3C期，癌症可具有任何尺寸并且已扩散至附近的淋巴结。在第4期，癌症已扩散至身体中更加远离肝脏的部分，诸如肺部。

可使用个体血液中的生物标记来增强肝癌的诊断、对肝癌进行分期或产生关于存活的预后。此类生物标记包括血液肿瘤生物标记，诸如α-胎蛋白及脱-γ羧基凝血酶原。在某些此类实施例中，个体的血液α-胎蛋白升高。在某些此类实施例中，个体的血液脱-γ羧基凝血酶原升高。

患有肝癌的个体亦可能罹患肝功能异常。肝功能可藉由肝功能测试进行评估，此类肝功能测试尤其测量肝转氨酶的血液含量。在某些实施例中，肝功能异常的个体的血液肝转氨酶升高。血液肝转氨酶包括丙氨酸转氨酶(ALT)及天冬氨酸转氨酶(AST)。在某些实施例中，肝功能异常的个体的血液胆红素升高。在某些实施例中，个体具有异常血液白蛋白含量。

在某些实施例中，个体的肝功能藉由Child-Pugh分类系统来评估，该Child-Pugh分类系统定义肝功能的三个类别。在此分类系统中，对以下五个类别中的一种的测量结果指定分数：胆红素含量、白蛋白含量、凝血酶原时间、腹水及脑病。将存在以下各特征每一者指定一分：血液胆红素低于2.0mg/dl；血液白蛋白高于3.5mg/dl；凝血酶原时间低于1.7国际标准化比值(INR)；不存在腹水；或不存在脑病。将存在以下各特征每一者指定两分：血液胆红素为2-3mg/dl；血液胆红素为3.5至2.8mg/dl；凝血酶原时间为1.7-2.3INR；腹水轻度至中度；或脑病轻度。将存在以下各特征每一者指定三分：胆红素高于3.0mg/dl；血液白蛋白低于2.8mg/dl；凝血酶原时间高于2.3INR；腹水重度至难治；或脑病重度。将得分相加，且得分5-6分指定为类别A，得分7-9分指定为类别B，且得分10-15分指定为类别C。

患有肝癌的个体可能先前已罹患或可能当前正罹患慢性丙型肝炎感染、慢性乙型肝炎感染、非酒精性脂肪性肝病或肝硬化。患有伴有丙型肝炎感染、乙型肝炎感染、非酒精性脂肪性肝病或肝硬化和/或由其引起的肝癌的个体可藉由本文所述的方法治疗。

个体对治疗的反应可藉由与诊断肝癌所用测试类似的测试来评估，包括(但不限于)CT扫描、MRI及针穿刺生检。对治疗的反应亦可藉由测量血液中的生物标记以与治疗前的生物标记含量比较来评估。

miR-21亦与转移过程相关。虽然上皮-间质转移(EMT)在正常生理过程中存在，但已将EMT与转移过程联系起来。已在若干研究中研究EMT在肿瘤进展中的相关性(Greenburg,G.及Hay,E.1986.Dev.Biol.115:363-379；Boyer,B.等人，1989.J.Cell.Biol.109:1495-1509；Uehara,Y.等人，1992.J.Cell.Biol.117:889-894)。上皮细胞经由整合素(integrin)与称为基底膜的下层细胞外基质(ECM)保持在一起。另一方面，间质细胞能够侵入并移动穿过ECM的三维结构。因此，EMT至少表面上类似于正常粘附细胞转化为转移表型。

本文提供治疗、预防、改善转移和/或延迟转移发作的方法。转移可由癌细胞自任何癌症原发部位迁移至任何癌症继发部位引起。

急性肾损伤

急性肾损伤为肾功能快速丧失，其可能由多种原因导致，包括低血容量、暴露于毒素及尿路梗阻。急性肾损伤可进展成纤维化和/或慢性肾病。已在急性肾损伤模型中观测到miR-21升高。因此，在某些实施例中，本文提供的化合物用于治疗、预防、改善和/或延迟因急性肾损伤而出现的纤维化。在某些实施例中，急性肾损伤可为暴露于毒性物质的结果，此类毒性物质为诸如环境毒素或癌症治疗剂。急性肾损伤可由对肾脏本身的损害引起，例如在诸如肾小球肾炎、急性肾小管坏死及急性间质性肾炎的病状中。在某些实施例中，急性肾损伤由尿路梗阻引起，诸如与良性前列腺增生、肾结石、尿导管阻塞、膀胱结石、膀胱、输尿管或肾脏恶性疾病有关的尿路梗阻。在一些实施例中，将本文提供的化合物给予个体以增强自急性肾损伤的恢复。

心脏病

已在人类心脏病中发现miR-21表达升高，并且在相关动物模型中抑制miR-21已展现出使心脏纤维化及心脏功能得到改善。因此，在某些实施例中，本文提供的化合物用于治疗、预防、改善一种或多种心脏病和/或延迟其发作。在某些实施例中，心脏病为心脏纤维化、心脏增大、心脏肥大、心脏扩张、肥厚型心肌病、心脏衰竭、心肌梗塞后重塑、心肌梗塞、心肌病(例如肥厚型心肌病、限制型心肌病、扩张型心肌病(DCM)、特发性扩张型心肌病或伴有心律不整的扩张型心肌病)、舒张性心脏衰竭、慢性心房纤维性颤动、原发性肺循环血压过高、急性呼吸窘迫综合征、布鲁戈登综合征(brugada syndrome)、进行性心脏传导疾病、尿毒症性心包炎、蒽环霉素心肌病(anthracycline cardiomyopathy)、动脉纤维化、辐射后淋巴纤维化、类肉瘤病、硬皮病、心内膜弹性纤维增生病、血清素激导性过度(serotonergicexcess)、心脏瓣膜病、心房纤维化、心房纤维性颤动、二尖瓣病、高血压、慢性心室功能不全、压力及容量超负荷或心肌纤维化。

细胞过程

本文提供用于减少或防止纤维母细胞增殖或活化的组合物及方法。本文亦提供用于抑制细胞外基质合成的组合物及方法，该合成包括(但不限于)胶原蛋白、纤维结合蛋白、胶原蛋白酶或金属蛋白酶组织抑制因子合成。

本文提供调节与上皮-间质转化(EMT)相关的细胞过程的方法。此类方法包括使上皮细胞与由经修饰寡核苷酸组成的化合物接触，其中经修饰寡核苷酸与miR-21互补。在某些实施例中，该接触会延迟上皮细胞向纤维母细胞转化。在某些实施例中，该接触会阻止上皮细胞转化为纤维母细胞。

在某些实施例中，本文提供的化合物可阻止、减缓或减少癌细胞增殖。在某些实施例中，本文提供的化合物可在癌细胞中诱导细胞凋亡。在某些实施例中，本文提供的化合物可减少癌细胞存活。

在某些实施例中，上皮细胞为癌细胞。在某些实施例中，接触延迟癌细胞的转移。在某些实施例中，接触阻止癌细胞的转移。

某些临床结果

在某些实施例中，给予本文提供的化合物或方法会对个体产生一种或多种临床上希望的结果。此类改善可用于确定个体对治疗产生反应的程度。

在某些实施例中，临床上希望的结果为纤维化改善。在某些实施例中，临床上希望的结果为纤维化进一步进展减缓。在某些实施例中，临床上希望的结果为纤维化停止进一步进展。在某些实施例中，临床上希望的结果为纤维化减少。在某些实施例中，临床上希望的结果为患有纤维化的器官中的胶原蛋白含量降低。

在某些实施例中，临床上希望的结果为任何器官或组织中的纤维化改善。在某些实施例中，临床上希望的结果为纤维化进一步进展减缓。在某些实施例中，临床上希望的结果为纤维化停止进一步进展。在某些实施例中，临床上希望的结果为纤维化减少。在某些实施例中，临床上希望的结果为受侵害器官中的胶原蛋白含量降低。

在某些实施例中，临床上希望的结果为肾功能改善。肾功能可藉由通常在临床配置中进行的一种或多种已知方法来评估，这些方法包括(但不限于)：测量个体血液中的血液尿素氮；测量个体血液中的肌酸酐；测量个体的肌酸酐清除率；测量个体的蛋白尿；测量个体的白蛋白:肌酸酐比率；测量个体的肾小球滤过率；测量个体的尿排出量；测量个体尿中的菊糖清除率；测量个体的尿容积摩尔渗透浓度；测量个体的尿重量摩尔渗透浓度；测量个体的血尿；测量个体血液和/或尿中的胱抑素C；测量个体血液和/或尿中的嗜中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(NGAL)；测量尿中的肾损伤分子-1(KIM-1)mRNA含量；和/或测量尿中的成簇蛋白(clusterin)含量。

在某些实施例中，给药改善个体的肾功能。在某些实施例中，给药延迟透析时间。在某些实施例中，给药延迟肾移植时间。在某些实施例中，给药提高个体的预期寿命。在某些实施例中，给药降低血尿。在某些实施例中，给药延迟血尿发作。在某些实施例中，给药降低蛋白尿。在某些实施例中，给药延迟蛋白尿发作。

在本文提供的任何实施例中，给予靶向miR-21的经修饰寡核苷酸改善个体的肾功能的一个或多个标记。肾功能的标记的改善包括(但不限于)：个体的血液尿素氮降低；个体血液中的肌酸酐降低；个体的肌酸酐清除率提高；个体的蛋白尿降低；个体的白蛋白：肌酸酐比率降低；个体的肾小球滤过率提高；个体的菊糖清除率提高；个体血液中的嗜中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(NGAL)降低；个体血液中的胱抑素C降低；及个体的尿排出量增加。在某些实施例中，蛋白尿为微量白蛋白尿。在某些实施例中，蛋白尿为大量白蛋白尿。

在某些实施例中，临床上希望的结果为肝功能改善。肝功能可藉由通常在临床配置中进行的一种或多种已知方法来评估，这些方法包括(但不限于)：测量个体血液中的丙氨酸转氨酶含量；测量个体血液中的天冬氨酸转氨酶含量；测量个体血液中的胆红素含量；测量个体血液中的白蛋白含量；测量个体的凝血酶原时间；测量个体的腹水；和/或测量个体的脑病。

在某些实施例中，临床上希望的结果为患有肺纤维化的个体的肺功能改善。在某些实施例中，个体患有特发性肺纤维化。肺功能可藉由通常在临床配置中进行的一种或多种已知方法来评估，这些方法包括(但不限于)：测量个体的肺活量；测量个体的用力肺活量；测量个体的一秒内用力呼气量；测量个体的峰值呼气流速；测量个体的用力呼气流量；测量个体的最大随意通气量；测定个体的一秒内用力呼气量与用力肺活量的比率；测量个体的通气/灌注比率；测量个体的氮气清除率；测量个体一个或多个肺中的绝对空气容积；及给予6分钟步行测试。

在某些实施例中，临床上希望的结果为患有心脏纤维化的个体的心脏功能改善。心脏功能可藉由通常在临床配置中进行的一种或多种已知方法来评估，这些方法包括(但不限于)：测量个体的心输出量；测量个体的心搏排血量；测量个体的平均收缩期射血率；测量个体的收缩期血压；测量个体的左心室射血分数；测定个体的心搏指数；测定个体的心脏指数；测量个体的左心室缩短百分率；测量个体的周径纤维平均缩短速度；测量个体的左心室流入血流速度图；测量个体的肺静脉血流速度图；测量个体二尖瓣环的舒张早期峰值速度。

在某些实施例中，临床上希望的结果为患有癌症的个体的肿瘤数减少和/或肿瘤尺寸减小。在某些实施例中，临床上希望的结果为患有癌症的个体的癌细胞数减少。其他临床上希望的结果包括个体的总体存活时间延长和/或个体的无进展存活时间延长。在某些实施例中，给予本文提供的化合物可防止肿瘤尺寸和/或肿瘤数增加。在某些实施例中，给予本文提供的化合物可预防转移性进展。在某些实施例中，给予本文提供的化合物可减缓或阻止转移性进展。在某些实施例中，给予本文提供的化合物可预防肿瘤复发。在某些实施例中，给予本文提供的化合物可预防肿瘤转移复发。

某些希望的临床结果可藉由测量血液生物标记来评估。在某些实施例中，给予本文提供的化合物可使得血液α-胎蛋白和/或血液脱-γ羧基凝血酶原降低。此外，给予本文提供的化合物可使得肝功能得到改善，如由血液ALT和/或AST含量降低所证明。

某些其他疗法

对纤维化或本文列出的任何病状的治疗可包含一种以上疗法。因此，在某些实施例中，本文提供治疗患有或怀疑患有纤维化的个体的方法，其包括除给予具有与miR-21互补的核苷碱基序列的经修饰寡核苷酸外亦给予至少一种疗法。

在某些实施例中，至少一种其他疗法包含医药药剂。

在某些实施例中，医药药剂包括消炎剂。在某些实施例中，消炎剂为类固醇消炎剂。在某些实施例中，类固醇消炎剂为皮质类固醇。在某些实施例中，皮质类固醇为强的松(prednisone)。在某些实施例中，消炎剂为非类固醇消炎药。在某些实施例中，非类固醇消炎剂为布洛芬(ibuprofen)、COX-I抑制剂或COX-2抑制剂。

在某些实施例中，医药药剂包括免疫抑制剂。在某些实施例中，免疫抑制剂为皮质类固醇、环磷酰胺(cyclophosphamide)或霉酚酸吗啉乙酯(mycophenolate mofetil)。

在某些实施例中，医药药剂包括抗糖尿病剂。抗糖尿病剂包括(但不限于)双胍、葡萄糖苷酶抑制剂、胰岛素、磺酰脲、噻唑啶二酮、GLP-1类似物及DPP-IV抑制剂。

在某些实施例中，医药药剂包括血管紧张素II受体阻断剂(ARB)。在某些实施例中，血管紧张素II受体阻断剂为坎地沙坦(candesartan)、伊贝沙坦(irbesartan)、奥美沙坦(olmesartan)、洛沙坦(losartan)、缬沙坦(valsartan)、替米沙坦(telmisartan)或依普沙坦(eprosartan)。

在某些实施例中，医药药剂包括血管紧张素II转化酶(ACE)抑制剂。在某些实施例中，ACE抑制剂为卡托普利(captopril)、依那普利(enalapril)、赖诺普利(lisinopril)、贝那普利(bnazepril)、喹那普利(quinapril)、福辛普利(fosinopril)或雷米普利(ramipril)。

在某些实施例中，另一疗法为透析。在某些实施例中，另一疗法为肾移植。

在某些实施例中，医药药剂包括(但不限于)利尿剂(例如螺内酯(sprionolactone)、依普利酮(eplerenone)、呋喃苯胺酸(furosemide))、收缩影响剂(inotrope)(例如多巴酚丁胺(dobutamine)、米力农(milrinone))、地高辛(digoxin)、血管舒张药、钙通道阻断剂、异山梨醇二硝酸酯、肼屈嗪(hydralazine)、硝酸酯(例如异山梨醇单硝酸酯、异山梨醇二硝酸酯)、肼屈嗪、β-阻断剂(例如卡维地洛(carvedilol)、美托洛尔(metoprolol))及利钠肽(例如奈西利肽(nesiritide))。

在某些实施例中，医药药剂包括类肝素。在某些实施例中，类肝素为戊聚醣多硫酸酯(pentosan polysulfate)。

在某些实施例中，医药药剂为阻断对纤维发生信号的一种或多种反应的医药药剂。

在某些实施例中，医药药剂为抗结缔组织生长因子疗法。在某些实施例中，抗CTGF疗法为针对CTGF的单株抗体。在某些实施例中，医药药剂为抗转型生长因子β疗法。在某些实施例中，抗TGF-β疗法为针对TGF-β的单株抗体。

在某些实施例中，其他疗法可为增强身体免疫系统的医药药剂，包括低剂量环磷酰胺、胸腺刺激素、维生素及营养补充剂(例如抗氧化剂，包括维生素A、C、E、β-胡萝卜素、锌、硒、麸胱甘肽、辅酶Q-10及紫花马兰菊(echinacea))，以及疫苗，例如免疫刺激性复合物(ISCOM)，其包含组合抗原的多聚呈现形式与佐剂的疫苗配制品。

在某些实施例中，其他疗法选用于治疗或改善本发明的一种或多种医药组合物的副作用。此类副作用包括(但不限于)注射部位反应、肝功能测试异常、肾功能异常、肝中毒、肾中毒、中枢神经系统异常及肌病。举例而言，血清中的转氨酶含量升高可指示肝中毒或肝功能异常。举例而言，胆红素增加可指示肝中毒或肝功能异常。

其他医药药剂的其他实例包括(但不限于)：免疫球蛋白，包括(但不限于)静脉内免疫球蛋白(IVIg)；止痛剂(例如乙酰胺苯酚(acetaminophen))；水杨酸盐；抗生素；抗病毒剂；抗真菌剂；肾上腺素激导性调节剂；激素(例如同化类固醇、雄激素、雌激素、降血钙素、孕酮、生长抑素及甲状腺激素)；免疫调节剂；肌肉松弛剂；抗组织胺剂；骨质疏松剂(例如双膦酸盐、降血钙素及雌激素)；前列腺素、抗肿瘤生物剂；精神治疗剂；镇静剂；毒葛或毒漆树产物；抗体；及疫苗。

癌症治疗通常包含一种以上疗法。因此，在某些实施例中，本发明提供减少或预防转移的方法，其包括向个体给予包含经修饰寡核苷酸的化合物，其中经修饰寡核苷酸与miR-21互补，及给予作为抗癌疗法的至少一种其他疗法。

在某些实施例中，抗癌疗法为化学疗法。适合化学治疗剂包括多西紫杉醇(docetaxel)、环磷酰胺、异环磷酰胺(ifosfamide)、甲氨喋呤(methotrexate)、长春花碱(vinblastine)、顺铂(cisplatin)、5-氟尿嘧啶、吉西他滨(gemcitabine)、小红莓(doxorubicin)、丝裂霉素C(mitomycin c)、索拉菲尼(sorafenib)、依托泊苷(etoposide)、卡铂(carboplatin)、表柔比星(epirubicin)、伊立替康(irinotecan)及奥沙利铂(oxaliplatin)。其他适合化学治疗剂包括除本文所提供的靶向miR-21的组合物以外的用于治疗癌症的寡聚化合物。

在某些实施例中，抗癌疗法为放射疗法。在某些实施例中，抗癌疗法为手术切除肿瘤。在某些实施例中，抗癌疗法为DNA损伤剂、增殖抑制剂、抗叶酸剂、生长因子受体抑制剂、抗血管生成剂、受体酪氨酸激酶抑制剂、激酶抑制剂、生长因子抑制剂或细胞毒性剂。

在某些实施例中，DNA损伤剂为1,3-双(2-氯乙基)-1-亚硝基脲、白消安(busulfan)、卡铂、卡莫司汀(carmustine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、顺铂、环磷酰胺、达喀尔巴嗪(dacarbazine)、道诺霉素(daunorubicin)、小红莓、表柔比星、依托泊苷、伊达比星(idarubicin)、异环磷酰胺、伊立替康、洛莫司汀、氮芥(mechlorethamine)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素C、米托蒽醌(mitoxantrone)、奥沙利铂、替莫唑胺(temozolomide)或拓扑替康(topotecan)。

在某些实施例中，抗叶酸剂为甲氨喋呤、氨基喋呤(aminopterin)、胸苷酸合酶、丝氨酸羟甲基转移酶、叶酰聚谷氨酰基合成酶(folyilpolyglutamyl synthetase)、g-谷氨酰基水解酶、甘氨酰胺-核糖核苷酸转甲酰基酶、甲酰四氢叶酸、氨基-咪唑-甲酰胺-核糖核苷酸转甲酰基酶、5-氟尿嘧啶或叶酸转运体。

在某些实施例中，生长因子受体为埃罗替尼(erlotinib)或吉非替尼(gefitinib)。

在某些实施例中，血管生成抑制剂为贝伐单抗(bevacizumab)、沙利度胺(thalidomide)、羧酰胺基三唑、TNP-470、CM101、IFN-α、血小板因子-4、苏拉明(suramin)、SU5416、血小板反应蛋白(thrombospondin)、VEGFR拮抗剂、软骨源性血管生成抑制因子、基质金属蛋白酶抑制剂、血管生成抑制素(angiostatin)、内皮抑素(endostatin)、2-甲氧基雌二醇、替可加兰(tecogalan)、四硫钼酸盐、催乳激素或利诺胺(linomide)。

在某些实施例中，激酶抑制剂为贝伐单抗、BIBW 2992、西妥昔单抗(cetuximab)、伊马替尼(imatinib)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、吉非替尼、兰尼单抗(ranibizumab)、哌加他尼(pegaptanib)、索拉菲尼、达沙替尼(dasatinib)、舒尼替尼(sunitinib)、埃罗替尼(erlotinib)、尼罗替尼(nilotinib)、拉帕替尼(lapatinib)、帕尼单抗(panitumumab)、凡德他尼(vandetanib)、E7080、帕唑帕尼(pazopanib)、莫立替尼(mubritinib)或福马替尼(fostamatinib)。

某些微小RNA核苷碱基序列

具有本文所述的核苷型态的经修饰寡核苷酸具有与miR-21(SEQ ID NO:1)或其前体(SEQ ID NO:2)互补的核苷碱基序列。在某些实施例中，经修饰寡核苷酸的各核苷碱基能够与miR-21的核苷碱基序列中各相应位置处的核苷碱基进行碱基配对。在某些实施例中，经修饰寡核苷酸的核苷碱基序列相对于miR-21的核苷碱基序列或其前体序列可具有一个或多个错配碱基对，并且仍能够与其目标序列杂交。

因为miR-21序列含于miR-21前体序列内，所以具有与miR-21互补的核苷碱基序列的经修饰寡核苷酸亦与miR-21前体的区互补。

在某些实施例中，经修饰寡核苷酸由等于miR-21长度的数目的连接的核苷组成。

在某些实施例中，经修饰寡核苷酸的连接的核苷的数目小于miR-21的长度。具有小于miR-21长度的数目的连接的核苷的经修饰寡核苷酸在该经修饰寡核苷酸的各核苷碱基与miR-21相应位置上的各核苷碱基互补的情况下是视为具有与miR-21序列的区完全互补的核苷碱基序列的经修饰寡核苷酸。举例而言，由19个连接的核苷组成的经修饰寡核苷酸在各核苷碱基与长度为22个核苷碱基的miR-21的相应位置互补的情况下与miR-21的具有19个核苷碱基的区完全互补。该经修饰寡核苷酸与miR-21的具有19个核苷碱基的部分具有100％互补性，且视为与miR-21100％互补。

在某些实施例中，经修饰寡核苷酸包含与种子序列互补的核苷碱基序列，亦即经修饰寡核苷酸包含种子匹配序列。在某些实施例中，种子序列为六聚体种子序列。在某些此类实施例中，种子序列为miR-21的核苷碱基1-6。在某些此类实施例中，种子序列为miR-21的核苷碱基2-7。在某些此类实施例中，种子序列为miR-21的核苷碱基3-8。在某些实施例中，种子序列为七聚体种子序列。在某些此类实施例中，七聚体种子序列为miR-21的核苷碱基1-7。在某些此类实施例中，七聚体种子序列为miR-21的核苷碱基2-8。在某些实施例中，种子序列为八聚体种子序列。在某些此类实施例中，八聚体种子序列为miR-21的核苷碱基1-8。在某些实施例中，八聚体种子序列为miR-21的核苷碱基2-9。

在某些实施例中，经修饰寡核苷酸具有相对于miR-21或其前体的核苷碱基序列具有一处错配的核苷碱基序列。在某些实施例中，经修饰寡核苷酸具有相对于miR-21或其前体的核苷碱基序列具有两处错配的核苷碱基序列。在某些此类实施例中，经修饰寡核苷酸具有相对于miR-21或其前体的核苷碱基序列具有不超过两处错配的核苷碱基序列。在某些此类实施例中，错配的核苷碱基为连续的。在某些此类实施例中，错配的核苷碱基不连续。

在某些实施例中，经修饰寡核苷酸的连接的核苷的数目大于miR-21的长度。在某些此类实施例中，额外核苷的核苷碱基与miR-21茎-环序列的核苷碱基互补。在某些实施例中，经修饰寡核苷酸的连接的核苷的数目比miR-21的长度多一个。在某些此类实施例中，额外核苷位于寡核苷酸的5'端。在某些此类实施例中，额外核苷位于寡核苷酸的3'端。在某些实施例中，经修饰寡核苷酸的连接的核苷的数目比miR-21的长度多两个。在某些此类实施例中，两个额外核苷位于寡核苷酸的5'端。在某些此类实施例中，两个额外核苷位于寡核苷酸的3'端。在某些此类实施例中，一个额外核苷位于寡核苷酸的5'端且一个额外核苷位于寡核苷酸的3'端。在某些实施例中，寡核苷酸的区可与miR-21的核苷碱基序列完全互补，但整个经修饰寡核苷酸并不与miR-21完全互补。举例而言，由24个连接的核苷组成的经修饰寡核苷酸在核苷1至22的核苷碱基各自与长度为22个核苷碱基的miR-21的相应位置互补的情况下具有与miR-21的核苷碱基序列完全互补的具22个核苷的部分且与miR-21的核苷碱基序列具有约92％总体互补性。

某些经修饰寡核苷酸

在某些实施例中，经修饰寡核苷酸由8至30个连接的核苷组成。在某些实施例中，经修饰寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成。在某些实施例中，经修饰寡核苷酸由15至30个连接的核苷组成。在某些实施例中，经修饰寡核苷酸由12至25个连接的核苷组成。在某些实施例中，经修饰寡核苷酸由15至25个连接的核苷组成。在某些实施例中，经修饰寡核苷酸由12至19个连接的核苷组成。在某些实施例中，经修饰寡核苷酸由15至19个连接的核苷组成。在某些实施例中，经修饰寡核苷酸由12至16个连接的核苷组成。在某些实施例中，经修饰寡核苷酸由15至16个连接的核苷组成。在某些实施例中，经修饰寡核苷酸由19至24个连接的核苷组成。在某些实施例中，经修饰寡核苷酸由21至24个连接的核苷组成。

在某些实施例中，经修饰寡核苷酸由8个连接的核苷组成。在某些实施例中，经修饰寡核苷酸由9个连接的核苷组成。在某些实施例中，经修饰寡核苷酸由10个连接的核苷组成。在某些实施例中，经修饰寡核苷酸由11个连接的核苷组成。在某些实施例中，经修饰寡核苷酸由12个连接的核苷组成。在某些实施例中，经修饰寡核苷酸由13个连接的核苷组成。在某些实施例中，经修饰寡核苷酸由14个连接的核苷组成。在某些实施例中，经修饰寡核苷酸由15个连接的核苷组成。在某些实施例中，经修饰寡核苷酸由16个连接的核苷组成。在某些实施例中，经修饰寡核苷酸由17个连接的核苷组成。在某些实施例中，经修饰寡核苷酸由18个连接的核苷组成。在某些实施例中，经修饰寡核苷酸由19个连接的核苷组成。在某些实施例中，经修饰寡核苷酸由20个连接的核苷组成。在某些实施例中，经修饰寡核苷酸由21个连接的核苷组成。在某些实施例中，经修饰寡核苷酸由22个连接的核苷组成。在某些实施例中，经修饰寡核苷酸由23个连接的核苷组成。在某些实施例中，经修饰寡核苷酸由24个连接的核苷组成。在某些实施例中，经修饰寡核苷酸由25个连接的核苷组成。

本文所述的核苷碱基序列(包括(但不限于)见于实例及序列表中者)独立于对核酸所进行的任何修饰。因此，由SEQ ID NO限定的核酸可独立地包含对一个或多个糖部分、一个或多个核苷间键联和/或一个或多个核苷碱基所进行的一个或多个修饰。

虽然随附于此申请的序列表根据需要将各核苷碱基序列标识为“RNA”或“DNA”，但实际上，那些序列可用化学修饰的任何组合修饰。本领域的技术人员将易于了解诸如“RNA”或“DNA”的用以描述经修饰寡核苷酸的名称多少有些随意。举例而言，包含含有2′-OH糖部分及胸腺嘧啶碱基的核苷的经修饰寡核苷酸可描述为具有经修饰糖(针对DNA的天然2′-H的2′-OH)的DNA或描述为具有经修饰碱基(针对RNA的天然尿嘧啶的胸腺嘧啶(甲基化尿嘧啶))的RNA。

因此，本文提供的核酸序列(包括(但不限于)序列表中者)意欲涵盖含有天然或经修饰RNA和/或DNA的任何组合的核酸，包括(但不限于)具有经修饰核苷碱基的此类核酸。进一步举例且不加限制，具有核苷碱基序列“ATCGATCG”的寡核苷酸涵盖具有此核苷碱基序列(无论经修饰或未经修饰)的任何寡核苷酸，包括(但不限于)包含RNA碱基的此类化合物，诸如具有序列“AUCGAUCG”者及具有一些DNA碱基及一些RNA碱基者(诸如“AUCGATCG”)及具有其他经修饰碱基的寡核苷酸，诸如“AT^meCGAUCG”，其中^meC指示5-甲基胞嘧啶。类似地，具有核苷碱基序列“AUCGAUCG”的寡核苷酸涵盖具有此核苷碱基序列(无论经修饰或未经修饰)的任何寡核苷酸，包括(但不限于)包含RNA碱基的此类化合物，诸如具有序列“ATCGATCG”者及具有一些DNA碱基及一些RNA碱基者(诸如“AUCGATCG”)及具有其他经修饰碱基的寡核苷酸，诸如“AT^meCGAUCG”，其中^meC指示5-甲基胞嘧啶。

某些修饰

在某些实施例中，本文提供的寡核苷酸可包含一或多处核苷碱基、糖和/或核苷间键联修饰，且因此为经修饰寡核苷酸。经修饰核苷碱基、糖和/或核苷间键联可因诸如细胞吸收增强、对其他寡核苷酸或核酸目标的亲和力增强及在核酸酶存在下的稳定性增强的希望特性而优先于未经修饰形式加以选择。

在某些实施例中，经修饰寡核苷酸包含一个或多个经修饰核苷。在某些此类实施例中，经修饰核苷为稳定化核苷。稳定化核苷的实例为糖经修饰核苷。

在某些实施例中，经修饰核苷为糖经修饰核苷。在某些此类实施例中，糖经修饰核苷可进一步包含天然或经修饰的杂环碱基部分和/或天然或经修饰核苷间键联且可独立于糖修饰包括其他修饰。在某些实施例中，糖经修饰核苷为2'位上经修饰核苷，其中糖环在天然核糖或2'-脱氧-核糖的2'碳上经修饰。

在某些实施例中，2'位上经修饰核苷具有双环糖部分。在某些此类实施例中，双环糖部分为呈α组态的D型糖。在某些此类实施例中，双环糖部分为呈β组态的D型糖。在某些此类实施例中，双环糖部分为呈α组态的L型糖。在某些此类实施例中，双环糖部分为呈β组态的L型糖。

在某些实施例中，双环糖部分在2'与4'碳原子之间包含桥基。在某些此类实施例中，桥基包含1至8个连接的双基。在某些实施例中，双环糖部分包含1至4个连接的双基。在某些实施例中，双环糖部分包含2或3个连接的双基。在某些实施例中，双环糖部分包含2个连接的双基。此类4'至2'糖取代基的实例包括(但不限于)：-[C(R_a)(R_b)]_n-、-[C(R_a)(R_b)]_n-O-、-C(R_aR_b)-N(R)-O-或-C(R_aR_b)-O-N(R)-；4'-CH₂-2'、4'-(CH₂)₂-2'、4'-(CH₂)₃-2'；4'-(CH₂)-O-2'(LNA)；4'-(CH₂)-S-2'；4'-(CH₂)₂-O-2'(ENA)；4'-CH(CH₃)-O-2'(cEt)及4'-CH(CH₂OCH₃)-O-2'及其类似物(参见例如美国专利7,399,845，2008年7月15日颁予)；4'-C(CH₃)(CH₃)-O-2'及其类似物(参见例如WO 2009/006478，2009年1月8日公开)；4'-CH₂-N(OCH₃)-2'及其类似物(参见例如WO 2008/150729，2008年12月11日公开)；4'-CH₂-O-N(CH₃)-2'(参见例如US 2004/0171570，2004年9月2日公开)；4'-CH₂-O-N(R)-2'及4'-CH₂-N(R)-O-2'-，其中各R独立地为H、保护基或C₁-C₁₂烷基；4'-CH₂-N(R)-O-2'，其中R为H、C₁-C₁₂烷基或保护基(参见美国专利7,427,672，2008年9月23日颁予)；4'-CH₂-C(H)(CH₃)-2'(参见例如Chattopadhyaya等人，J.Org.Chem.,2009,74,118-134)；及4'-CH₂-C(＝CH₂)-2'及其类似物(参见公开的PCT国际申请案WO 2008/154401，2008年12月8日公开)。

在某些实施例中，此类4'至2'桥基独立地包含1个或2至4个独立地选自以下的连接的基团：-[C(R_a)(R_b)]_n-、-C(R_a)＝C(R_b)-、-C(R_a)＝N-、-C(＝NR_a)-、-C(＝O)-、-C(＝S)-、-O-、-Si(R_a)₂-、-S(＝O)_x-及-N(R_a)-；

其中：

x为0、1或2；

n为1、2、3或4；

各R_a及R_b独立地为H、保护基、羟基、C₁-C₁₂烷基、经取代的C₁-C₁₂烷基、C₂-C₁₂烯基、经取代的C₂-C₁₂烯基、C₂-C₁₂炔基、经取代的C₂-C₁₂炔基、C₅-C₂₀芳基、经取代的C₅-C₂₀芳基、杂环基、经取代的杂环基、杂芳基、经取代的杂芳基、C₅-C₇脂环基、经取代的C₅-C₇脂环基、卤素、OJ₁、NJ₁J₂、SJ₁、N₃、COOJ₁、酰基(C(＝O)-H)、经取代的酰基、CN、磺酰基(S(＝O)₂-J₁)或砜基(S(＝O)-J₁)；且

各J₁及J₂独立地为H、C₁-C₁₂烷基、经取代的C₁-C₁₂烷基、C₂-C₁₂烯基、经取代的C₂-C₁₂烯基、C₂-C₁₂炔基、经取代的C₂-C₁₂炔基、C₅-C₂₀芳基、经取代的C₅-C₂₀芳基、酰基(C(＝O)-H)、经取代的酰基、杂环基、经取代的杂环基、C₁-C₁₂氨基烷基、经取代的C₁-C₁₂氨基烷基或保护基。

包含此类双环糖部分的核苷称为双环核苷或BNA。在某些实施例中，双环核苷包括(但不限于)如下文所描绘的(A)α-L-亚甲氧基(4'-CH₂-O-2')BNA；(B)β-D-亚甲氧基(4'-CH₂-O-2')BNA；(C)乙烯氧基(4'-(CH₂)₂-O-2')BNA；(D)氨氧基(4'-CH₂-O-N(R)-2')BNA；(E)氧氨基(4'-CH₂-N(R)-O-2')BNA；(F)甲基(亚甲氧基)(4'-CH(CH₃)-O-2')BNA(亦称为限制性乙基或cEt)；(G)亚甲基-硫基(4'-CH₂-S-2')BNA；(H)亚甲基-氨基(4'-CH2-N(R)-2')BNA；(I)甲基碳环(4'-CH₂-CH(CH₃)-2')BNA；(J)c-MOE(4'-CH₂-OMe-2')BNA；及(K)丙烯碳环(4'-(CH₂)₃-2')BNA。

其中Bx为核苷碱基部分且R独立地为H、保护基或C₁-C₁₂烷基。

在某些实施例中，2'位上经修饰核苷包含选自以下的2'-取代基：卤基、烯丙基、氨基、叠氮基、SH、CN、OCN、CF₃、OCF₃、O-、S-或N(R_m)-烷基；O-、S-或N(R_m)-烯基；O-、S-或N(R_m)-炔基；O-伸烷基-O-烷基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基、O-芳烷基、O(CH₂)₂SCH₃、O-(CH₂)₂-O-N(R_m)(R_n)或O-CH₂-C(＝O)-N(R_m)(R_n)，其中各R_m及R_n独立地为H、氨基保护基或经取代或未经取代的C₁-C₁₀烷基。此类2'-取代基可进一步经一个或多个独立地选自以下的取代基取代：羟基、氨基、烷氧基、羧基、苄基、苯基、硝基(NO₂)、硫醇、硫烷氧基(S-烷基)、卤素、烷基、芳基、烯基及炔基。

在某些实施例中，2'位上经修饰核苷包含选自以下的2'-取代基：F、NH₂、N₃、OCF₃、O-CH₃、O(CH₂)₃NH₂、CH₂-CH＝CH₂、O-CH₂-CH＝CH₂、OCH₂CH₂OCH₃、O(CH₂)₂SCH₃、O-(CH₂)₂-O-N(R_m)(R_n)、-O(CH₂)₂O(CH₂)₂N(CH₃)₂及N上经取代的乙酰胺(O-CH₂-C(＝O)-N(R_m)(R_n)，其中各R_m及R_n独立地为H、氨基保护基或经取代或未经取代的C₁-C₁₀烷基。

在某些实施例中，2'位上经修饰核苷包含选自以下的2'-取代基：F、OCF₃、O-CH₃、OCH₂CH₂OCH₃、2'-O(CH₂)₂SCH₃、O-(CH₂)₂-O-N(CH₃)₂、-O(CH₂)₂O(CH₂)₂N(CH₃)₂及O-CH₂-C(＝O)-N(H)CH₃。

在某些实施例中，2'位上经修饰核苷包含选自以下的2'-取代基：F、O-CH₃及OCH₂CH₂OCH₃。

在某些实施例中，糖经修饰核苷为4'-硫基修饰的核苷。在某些实施例中，糖经修饰核苷为4'-硫基-2'-修饰的核苷。4'-硫基修饰的核苷具有4'-O置换为4'-S的β-D-核糖核苷。4'-硫基-2'-修饰的核苷为2'-OH置换为2'-取代基的4'-硫基修饰的核苷。适合2'-取代基包括2'-OCH₃、2'-O-(CH₂)₂-OCH₃及2'-F。

在某些实施例中，经修饰寡核苷酸包含一个或多个核苷间修饰。在某些此类实施例中，经修饰寡核苷酸的各核苷间键联为经修饰核苷间键联。在某些实施例中，经修饰核苷间键联包含磷原子。

在某些实施例中，经修饰寡核苷酸包含至少一个硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施例中，经修饰寡核苷酸的各核苷间键联为硫代磷酸酯核苷间键联。

在某些实施例中，经修饰核苷间键联不包含磷原子。在某些此类实施例中，核苷间键联由短链烷基核苷间键联形成。在某些此类实施例中，核苷间键联由环烷基核苷间键联形成。在某些此类实施例中，核苷间键联由混合杂原子及烷基核苷间键联形成。在某些此类实施例中，核苷间键联由混合杂原子及环烷基核苷间键联形成。在某些此类实施例中，核苷间键联由一个或多个短链杂原子核苷间键联形成。在某些此类实施例中，核苷间键联由一个或多个杂环核苷间键联形成。在某些此类实施例中，核苷间键联具有酰胺主链。在某些此类实施例中，核苷间键联具有混合的N、O、S及CH₂组成部分。

在某些实施例中，经修饰寡核苷酸包含一个或多个经修饰核苷碱基。在某些实施例中，经修饰寡核苷酸包含一个或多个5-甲基胞嘧啶。在某些实施例中，经修饰寡核苷酸的各胞嘧啶包含5-甲基胞嘧啶。

在某些实施例中，经修饰核苷碱基是选自5-羟甲基胞嘧啶、7-去氮鸟嘌呤及7-去氮腺嘌呤。在某些实施例中，经修饰核苷碱基是选自7-去氮-腺嘌呤、7-去氮鸟苷、2-氨基吡啶及2-吡啶酮。在某些实施例中，经修饰核苷碱基是选自5位上经取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶及N-2、N-6及O-6经取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶及5-丙炔基胞嘧啶。

在某些实施例中，经修饰核苷碱基包含多环杂环。在某些实施例中，经修饰核苷碱基包含三环杂环。在某些实施例中，经修饰核苷碱基包含吩噁嗪衍生物。在某些实施例中，吩噁嗪可经进一步修饰以形成本领域中称为G形夹(G-clamp)的核苷碱基。

某些医药组合物

本文提供包含寡核苷酸的医药组合物。在某些实施例中，此类医药组合物用于治疗纤维化、肾病及癌症。在某些实施例中，本文提供的医药组合物包含本文所述的化合物。

适合给药途径包括(但不限于)经口、直肠、经粘膜、经肠、肠内、局部、栓剂、经由吸入、鞘内、心内、心室内、腹膜内、鼻内、眼内、肿瘤内及肠胃外(例如静脉内、肌肉内、髓内及皮下)。在某些实施例中，给予鞘内医药药剂以达成局部暴露而非全身性暴露。举例而言，医药组合物可直接注射于所要作用的区域中(例如注射至肝脏或肾中)。

在某些实施例中，医药组合物以剂量单位形式给予(例如锭剂、胶囊、快速注射等)。在一些实施例中，医药组合物包含剂量在选自以下的范围内的经修饰寡核苷酸：25mg至800mg、25mg至700mg、25mg至600mg、25mg至500mg、25mg至400mg、25mg至300mg、25mg至200mg、25mg至100mg、100mg至800mg、200mg至800mg、300mg至800mg、400mg至800mg、500mg至800mg、600mg至800mg、100mg至700mg、150mg至650mg、200mg至600mg、250mg至550mg、300mg至500mg、300mg至400mg及400mg至600mg。在某些实施例中，此类医药组合物包含选自以下的剂量的经修饰寡核苷酸：25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、55mg、60mg、65mg、70mg、75mg、80mg、85mg、90mg、95mg、100mg、105mg、110mg、115mg、120mg、125mg、130mg、135mg、140mg、145mg、150mg、155mg、160mg、165mg、170mg、175mg、180mg、185mg、190mg、195mg、200mg、205mg、210mg、215mg、220mg、225mg、230mg、235mg、240mg、245mg、250mg、255mg、260mg、265mg、270mg、270mg、280mg、285mg、290mg、295mg、300mg、305mg、310mg、315mg、320mg、325mg、330mg、335mg、340mg、345mg、350mg、355mg、360mg、365mg、370mg、375mg、380mg、385mg、390mg、395mg、400mg、405mg、410mg、415mg、420mg、425mg、430mg、435mg、440mg、445mg、450mg、455mg、460mg、465mg、470mg、475mg、480mg、485mg、490mg、495mg、500mg、505mg、510mg、515mg、520mg、525mg、530mg、535mg、540mg、545mg、550mg、555mg、560mg、565mg、570mg、575mg、580mg、585mg、590mg、595mg、600mg、605mg、610mg、615mg、620mg、625mg、630mg、635mg、640mg、645mg、650mg、655mg、660mg、665mg、670mg、675mg、680mg、685mg、690mg、695mg、700mg、705mg、710mg、715mg、720mg、725mg、730mg、735mg、740mg、745mg、750mg、755mg、760mg、765mg、770mg、775mg、780mg、785mg、790mg、795mg及800mg。在某些此类实施例中，医药组合物包含选自以下的剂量的经修饰寡核苷酸：25mg、50mg、75mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、500mg、600mg、700mg及800mg。

在某些实施例中，医药药剂为用适合稀释剂(例如无菌注射用水或无菌注射用生理食盐水)复原的无菌冻干经修饰寡核苷酸。复原的产物在于生理食盐水中稀释后以皮下注射形式或以静脉内输注形式给予。冻干的药品由已于注射用水或注射用生理食盐水中制备、在制备期间用酸或碱调整至pH 7.0-9.0且接着冻干的经修饰寡核苷酸组成。冻干的经修饰寡核苷酸可为25-800mg寡核苷酸。应了解，此涵盖25mg、50mg、75mg、100mg、125mg、150mg、175mg、200mg、225mg、250mg、275mg、300mg、325mg、350mg、375mg、425mg、450mg、475mg、500mg、525mg、550mg、575mg、600mg、625mg、650mg、675mg、700mg、725mg、750mg、775mg及800mg的经修饰冻干寡核苷酸。此外，在一些实施例中，冻干的经修饰寡核苷酸为选自以下的范围内的量的寡核苷酸：25mg至800mg、25mg至700mg、25mg至600mg、25mg至500mg、25mg至400mg、25mg至300mg、25mg至200mg、25mg至100mg、100mg至800mg、200mg至800mg、300mg至800mg、400mg至800mg、500mg至800mg、600mg至800mg、100mg至700mg、150mg至650mg、200mg至600mg、250mg至550mg、300mg至500mg、300mg至400mg及400mg至600mg。冻干的药品可包装于用溴丁基橡胶盖塞住且用铝

顶封密封的2mL I型透明玻璃小瓶(经硫酸铵处理)中。

在某些实施例中，本文提供的医药组合物可另外含有本领域中已确定的用量的常规见于医药组合物中的其他辅助组分。因此，举例而言，组合物可含有其他相容的医药活性物质，诸如止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂或消炎剂，或可含有适用于以物理方式调配本发明组合物的各种剂型的其他物质，诸如染料、调味剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、增稠剂及稳定剂。然而，此类物质在添加时应不会不适当地干扰本发明组合物的组分的生物活性。配制品可灭菌且必要时可与不会与配制品的寡核苷酸不利地相互作用的助剂混合，此类助剂为例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂、调味剂和/或芳香物质及其类似物。

已在多种方法中在核酸疗法中使用脂质部分。在一种方法中，将核酸引入预成型的脂质体或由阳离子性脂质与中性脂质的混合物制成的脂质复合物(lipoplex)中。在另一方法中，在无中性脂质存在的情况下形成DNA与单阳离子性脂质或聚阳离子性脂质的复合物。在某些实施例中，脂质部分选用于增加医药药剂向特定细胞或组织中的分布。在某些实施例中，脂质部分选用于增加医药药剂向脂肪组织中的分布。在某些实施例中，脂质部分选用于增加医药药剂向肌肉组织中的分布。

在某些实施例中，使用英托利匹特(INTRALIPID)来制备包含寡核苷酸的医药组合物。英托利匹特为制备用于静脉内给予的脂肪乳液。它由10％大豆油、1.2％卵黄磷脂、2.25％甘油及注射用水构成。此外，添加氢氧化钠来调节pH值以使最终产物pH值范围为6至8.9。

在某些实施例中，本文提供的医药组合物包含与核酸复合的多元胺化合物或脂质部分。在某些实施例中，此类制剂包含一种或多种各自个别地具有由式(Z)定义的结构的化合物或其医药学上可接受的盐，

其中各X^a及X^b在每次出现时独立地为C_1-6伸烷基；n为0、1、2、3、4或5；各R独立地为H，其中制剂中的至少约80％式(Z)化合物分子中至少n+2个R部分不为H；m为1、2、3或4；Y为O、NR²或S；R¹为烷基、烯基或炔基；其各自可任选地经一个或多个取代基取代；且R²为H、烷基、烯基或炔基；其各自可任选地经一个或多个取代基取代；其限制条件为，若n＝0，则至少n+3个R部分不为H。此类制剂描述于PCT公开案WO/2008/042973中，该案对脂质制剂的披露内容以全文引用的方式并入本文中。某些其他制剂描述于Akinc等人，NatureBiotechnology 26,561-569(2008年5月1日)中，该文献对脂质制剂的披露内容以全文引用的方式并入本文中。

在某些实施例中，本文提供的医药组合物包含一种或多种经修饰寡核苷酸及一种或多种赋形剂。在某些此类实施例中，赋形剂是选自水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、淀粉酶、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素及聚乙烯吡咯烷酮。

在某些实施例中，本文提供的医药组合物是使用已知技术制备，此类已知技术包括(但不限于)混合、溶解、造粒、制糖衣药丸、水磨、乳化、囊封、覆埋或制片制程。

在某些实施例中，本文提供的医药组合物为液体(例如悬浮液、酏剂和/或溶液)。在某些此类实施例中，液体医药组合物是使用本领域中已知的成分制备，此类成分包括(但不限于)水、二醇、油、醇、调味剂、防腐剂及着色剂。

在某些实施例中，本文提供的医药组合物为固体(例如粉末、片剂和/或胶囊)。在某些此类实施例中，包含一种或多种寡核苷酸的固体医药组合物是使用本领域中已知的成分制备，此类成分包括(但不限于)淀粉、糖、稀释剂、造粒剂、润滑剂、粘合剂及崩解剂。

在某些实施例中，本文提供的医药组合物是调配成储槽式制剂。某些此类储槽式制剂的作用时间通常比非储槽式制剂长。在某些实施例中，此类制剂藉由植入(例如皮下或肌肉内)或藉由肌肉内注射给予。在某些实施例中，储槽式制剂是使用适合聚合物质或疏水性物质(例如于可接受的油中的乳液)或离子交换树脂制备，或制备成微溶性衍生物，例如制备成微溶性盐。

在某些实施例中，本文提供的医药组合物包含递送系统。递送系统的实例包括(但不限于)脂质体及乳液。某些递送系统适用于制备某些医药组合物，包括包含疏水性化合物的医药组合物。在某些实施例中，使用某些有机溶剂，诸如二甲亚砜。

在某些实施例中，本文提供的医药组合物包含一种或多种经设计以将本发明的一种或多种医药药剂递送至特定组织或细胞类型的组织特异性递送分子。举例而言，在某些实施例中，医药组合物包括包覆有组织特异性抗体的脂质体。

在某些实施例中，本文提供的医药组合物包含共溶剂系统。某些此类共溶剂系统包含例如苄醇、非极性界面活性剂、水可混溶性有机聚合物及水相。在某些实施例中，此类共溶剂系统用于疏水性化合物。该共溶剂系统的非限制性实例为VPD共溶剂系统，其为包含3％w/v苄醇、8％w/v非极性界面活性剂Polysorbate 80^TM及65％w/v聚乙二醇300的绝对乙醇溶液。此类共溶剂系统的比例可在不实质性改变其溶解度及毒性特征的情况下显著变化。此外，共溶剂组分的身份可变化：例如，可使用其他界面活性剂替代Polysorbate 80^TM；聚乙二醇的大小分数可变化；其他生物相容性聚合物可替代聚乙二醇，例如聚乙烯吡咯烷酮；及其他糖或多糖可取代右旋糖。

在某些实施例中，本文提供的医药组合物包含持续释放系统。该持续释放系统的非限制性实例为固体疏水性聚合物的半透性基质。在某些实施例中，持续释放系统可视其化学性质而定在数小时、数天、数周或数月的时间内释放医药药剂。

在某些实施例中，本文提供的医药组合物制备用于经口给予。在某些此类实施例中，医药组合物是藉由将一种或多种包含经修饰寡核苷酸的化合物与一种或多种医药学上可接受的载剂组合来进行调配。某些此类载剂使得医药组合物能够调配成片剂、丸剂、糖衣药丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆料、悬浮液及其类似物，以供个体经口摄取。在某些实施例中，用于经口使用的医药组合物藉由混合寡核苷酸与一种或多种固体赋形剂而获得。适合赋形剂包括(但不限于)填充剂，诸如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇；纤维素制剂，诸如玉米淀粉、小麦淀粉、稻米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。在某些实施例中，可任选地研磨该混合物并且可任选地添加助剂。在某些实施例中，使医药组合物成型以获得片剂或糖衣药丸核心。在某些实施例中，添加崩解剂(例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐，诸如海藻酸钠)。

在某些实施例中，糖衣药丸核心具有包衣。在某些此类实施例中，可使用浓缩糖溶液，其可可任选地含有阿拉伯胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡巴浦尔凝胶(carbopol gel)、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶液及适合有机溶剂或溶剂混合物。可添加染料或颜料至片剂或糖衣药丸包衣中。

在某些实施例中，用于经口给予的医药组合物为由明胶制成的配合插入型胶囊。某些此类配合插入型胶囊包含一种或多种本发明的医药药剂与一种或多种填充剂(诸如乳糖)、粘合剂(诸如淀粉)和/或润滑剂(诸如滑石或硬脂酸镁)及可任选地选用的稳定剂的混合物。在某些实施例中，用于经口给予的医药组合物为由明胶及塑化剂(诸如甘油或山梨糖醇)制成的软密封胶囊。在某些软胶囊中，一种或多种本发明的医药药剂溶解或悬浮于适合液体(诸如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇)中。此外，可添加稳定剂。

在某些实施例中，医药组合物是制备用于经颊给予。某些此类医药组合物为以常规方式调配的片剂或口含剂。

在某些实施例中，医药组合物是制备用于藉由注射给予(例如静脉内、皮下、肌肉内等)。在某些此类实施例中，医药组合物包含载剂且于水溶液中调配，诸如水或生理上相容的缓冲液，诸如汉克氏溶液(Hanks's solution)、林格氏溶液(Ringer's solution)或生理食盐水缓冲液。在某些实施例中，包括其他成分(例如有助于溶解或充当防腐剂的成分)。在某些实施例中，可注射悬浮液是使用适当液体载剂、悬浮剂及其类似物制备。某些注射用医药组合物以单位剂型存在于例如安瓿或多剂量容器中。某些注射用医药组合物为于油性或水性媒剂中的悬浮液、溶液或乳液，且可含有调配剂，诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。某些适用于注射用医药组合物中的溶剂包括(但不限于)亲脂性溶剂及脂肪油，诸如芝麻油、合成脂肪酸酯，诸如油酸乙酯或三酸甘油酯，以及脂质体。水性注射悬浮液可含有增加悬浮液的粘度的物质，诸如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或聚葡萄糖。可任选地，此类悬浮液亦可含有适合稳定剂或增加医药药剂的溶解度以允许制备高度浓缩溶液的试剂。

在某些实施例中，医药组合物是制备用于经粘膜给予。在某些此类实施例中，在配制品中使用适于欲渗透的障壁的渗透剂。此类渗透剂通常为本领域中所已知。

在某些实施例中，医药组合物是制备用于藉由吸入给予。某些此类吸入用医药组合物制备成于加压包装或雾化器中的气雾剂喷雾形式。某些此类医药组合物包含推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他适合气体。在使用加压气雾剂的某些实施例中，剂量单位可用递送计量的量的阀门确定。在某些实施例中，可调配供吸入器或吹入器中使用的胶囊及药筒。某些此类配制品包含本发明医药药剂与适合粉末基质(诸如乳糖或淀粉)的粉末混合物。

在某些实施例中，医药组合物是制备用于直肠给予，诸如栓剂或保留灌肠剂。某些此类医药组合物包含已知成分，诸如可可脂和/或其他甘油酯。

在某些实施例中，医药组合物是制备用于局部给予。某些此类医药组合物包含温和保湿基质，诸如软膏或乳膏。示例性适合软膏基质包括(但不限于)矿脂、矿脂加挥发性聚硅氧，及羊毛脂及油包水乳液。示例性适合乳膏基质包括(但不限于)冷乳膏及亲水性软膏。

在某些实施例中，本文提供的医药组合物包含治疗有效量的经修饰寡核苷酸。在某些实施例中，治疗有效量足以预防、减轻或缓解疾病的症状或延长所治疗个体的存活期。治疗有效量的确定完全在本领域的技术人员的能力范围内。

在某些实施例中，本文提供的一种或多种经修饰寡核苷酸是调配成前药。在某些实施例中，体内给予时，前药化学转化为寡核苷酸的生物学上、医药学上或治疗上更具活性的形式。在某些实施例中，前药因其比相应活性形式更易给予而适用。举例而言，在某些情况下，前药的生物可用率(例如经由经口给予)可比相应活性形式高。在某些情况下，前药相比于相应活性形式可具有改良的溶解度。在某些实施例中，前药的水溶性低于相应活性形式。在某些情况下，此类前药具有较佳的跨细胞膜递送，其中水溶性不利于迁移。在某些实施例中，前药为酯。在某些此类实施例中，酯在给予时代谢水解为羧酸。在某些情况下，含羧酸化合物为相应活性形式。在某些实施例中，前药包含结合于酸基的短肽(聚氨基酸)。在某些此类实施例中，肽在给予时裂解以形成相应活性形式。

在某些实施例中，藉由对医药活性化合物进行修饰而产生前药，以使得活性化合物在体内给予时再生。前药可经设计以改变药物的代谢稳定性或转运特征，遮蔽副作用或毒性，改良药物的风味或改变药物的其他特征或特性。藉助于对体内药效动力学过程及药物代谢的了解，本领域的技术人员在已知医药活性化合物后即可设计该化合物的前药(参见例如Nogrady (1985) Medicinal Chemistry A Biochemical Approach, OxfordUniversity Press, New York，第388-392页)。

某些给药途径

在某些实施例中，向个体给药包含肠胃外给药。在某些实施例中，向个体给药包含静脉内给药。在某些实施例中，向个体给药包含皮下给药。

在某些实施例中，向个体给药包含动脉内给药。在某些实施例中，向个体给药包含心内给药。心内给药的适合方式包括使用导管或在开心手术期间给药。在某些实施例中，给药包含使用支架。

在某些实施例中，给药包括肺部给药。在某些实施例中，肺部给药包含藉由吸入将气雾化寡核苷酸递送至个体的肺部。个体吸入气雾化寡核苷酸后，寡核苷酸分布至正常与发炎肺组织的细胞，包括肺泡巨噬细胞、嗜伊红血球、上皮细胞、血管内皮细胞及细支气管上皮细胞。适用于递送包含经修饰寡核苷酸的医药组合物的装置包括(但不限于)标准雾化器装置。用于使用雾化器装置调节小液滴的大小以靶向呼吸道及肺的特定部分的配制品及方法为本领域的技术人员所熟知。其他适合装置包括干粉吸入器或定剂量吸入器。

在某些实施例中，给予医药组合物以达成局部暴露而非全身性暴露。举例而言，肺部给予将医药组合物递送至肺部，而使全身性暴露达到最低。

其他适合给药途径包括(但不限于)经口、直肠、经粘膜、经肠、肠内、局部、经皮、栓剂、鞘内、心室内、腹膜内、鼻内、眼内、肌肉内、髓内及肿瘤内。

某些化合物

本文提供包含具有某些核苷型态的经修饰寡核苷酸的化合物，及此类化合物用于调节目标核酸的活性、含量或表达的用途。在某些实施例中，化合物包含寡核苷酸。在某些此类实施例中，化合物由寡核苷酸组成。在某些实施例中，寡核苷酸为经修饰寡核苷酸。在某些实施例中，经修饰寡核苷酸与小型非编码RNA互补。在某些实施例中，小型非编码RNA为miR-21。

在某些此类实施例中，化合物包含与互补链杂交的经修饰寡核苷酸，亦即化合物包含双链寡聚化合物。在某些实施例中，经修饰寡核苷酸与互补链杂交会形成至少一个钝端。在某些此类实施例中，经修饰寡核苷酸与互补链杂交会在双链寡聚化合物的各末端形成钝端。在某些实施例中，经修饰寡核苷酸的末端相对于互补链的连接的核苷的数目包含一个或多个额外的连接的核苷。在某些实施例中，一个或多个额外核苷位于寡核苷酸的5'端。在某些实施例中，一个或多个额外核苷位于寡核苷酸的3'端。在某些实施例中，一个或多个额外核苷的核苷的至少一个核苷碱基与目标RNA互补。在某些实施例中，一个或多个额外核苷各自的各核苷碱基与目标RNA互补。在某些实施例中，互补链的末端相对于寡核苷酸的连接的核苷的数目包含一个或多个额外的连接的核苷。在某些实施例中，一个或多个额外的连接的核苷位于互补链的3'端。在某些实施例中，一个或多个额外的连接的核苷位于互补链的5'端。在某些实施例中，两个额外的连接的核苷连接于末端。在某些实施例中，一个额外的核苷连接于末端。

在某些实施例中，化合物包含与一个或多个增强所得反义寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞吸收的部分结合的经修饰寡核苷酸。在某些此类实施例中，该部分为胆固醇部分。在某些实施例中，该部分为脂质部分。用于结合的额外部分包括碳水化合物、磷脂、生物素、吩嗪、叶酸盐、啡啶、蒽醌、吖啶、荧光素、罗丹明(rhodamine)、香豆素及染料。在某些实施例中，结合基团直接连接于寡核苷酸。在某些实施例中，结合基团藉由选自以下的连接部分连接至经修饰寡核苷酸：氨基、羟基、羧酸、硫醇、不饱和度(例如双键或三键)、8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(ADO)、4-(N-顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸丁二酰亚胺酯(SMCC)、6-氨基己酸(AHEX或AHA)、经取代的C1-C10烷基、经取代或未经取代的C2-C10烯基及经取代或未经取代的C2-C10炔基。在某些此类实施例中，取代基是选自羟基、氨基、烷氧基、羧基、苄基、苯基、硝基、硫醇、硫烷氧基、卤素、烷基、芳基、烯基及炔基。

在某些此类实施例中，化合物包含经修饰寡核苷酸，该寡核苷酸具有一个或多个稳定化基团连接于经修饰寡核苷酸的一端或两端以增强诸如核酸酶稳定性的特性。在稳定化基团中包括帽结构。此类末端修饰保护经修饰寡核苷酸免遭核酸外切酶降解，且可有助于递送和/或定位于细胞内。帽可存在于5'端(5'帽)或3'端(3'帽)，或可存在于两个末端上。帽结构包括例如反转脱氧无碱基帽。

适合帽结构包括4',5'-亚甲基核苷酸、1-(β-D-赤呋喃醣基)核苷酸、4'-硫核苷酸、碳环核苷酸、1,5-去水己醣醇核苷酸、L-核苷酸、α-核苷酸、经修饰碱基核苷酸、二硫代磷酸酯键联、苏-戊呋喃醣基核苷酸、无环3',4'-断核苷酸、无环3,4-二羟基丁基核苷酸、无环3,5-二羟基戊基核苷酸、3'-3'-反转核苷酸部分、3'-3'-反转无碱基部分、3'-2'-反转核苷酸部分、3'-2'-反转无碱基部分、1,4-丁二醇磷酸酯、3'-氨基磷酸酯、己基磷酸酯、氨基己基磷酸酯、3'-磷酸酯、3'-硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、桥连甲基膦酸酯部分及非桥连甲基膦酸酯部分、5'-氨基-烷基磷酸酯、1,3-二氨基-2-丙基磷酸酯、3-氨基丙基磷酸酯、6-氨基己基磷酸酯、1,2-氨基十二烷基磷酸酯、羟基丙基磷酸酯、5'-5'-反转核苷酸部分、5'-5'-反转无碱基部分、5'-氨基磷酸酯、5'-硫代磷酸酯、5'-氨基、桥连和/或非桥连5'-氨基磷酸酯、硫代磷酸酯及5'-巯基部分。

某些试剂盒

本发明亦提供试剂盒。在一些实施例中，试剂盒包含一种或多种包含经修饰寡核苷酸的本发明化合物，其中寡核苷酸的核苷碱基序列与miR-21的核苷碱基序列互补。与miR-21互补的化合物可具有本文所述的任何核苷型态。在一些实施例中，与miR-21互补的化合物可存在于小瓶内。多个小瓶(诸如10个)可存在于例如分配包装中。在一些实施例中，小瓶经制造以可用注射器出入。试剂盒亦可含有与miR-21互补的化合物的使用说明书。

在一些实施例中，试剂盒可用于向个体给予与miR-21互补的化合物。在此类情况下，除与miR-21互补的化合物外，试剂盒亦可进一步包含以下一种或多种：注射器、酒精药签、棉球和/或网垫。在一些实施例中，与miR-21互补的化合物可存在于预先填充药品的注射器(诸如具有例如具针套的27号1/2吋针的单次剂量注射器)而非小瓶中。多个预先填充药品的注射器(诸如10个)可存在于例如分配包装中。试剂盒亦可含有给予与miR-21互补的化合物的说明书。

某些实验模型

在某些实施例中，本发明提供在实验模型中使用和/或测试本发明的经修饰寡核苷酸的方法。本领域的技术人员能够选择及修改此类实验模型的方案以评估本发明的医药药剂。

一般而言，首先在培养细胞中测试经修饰寡核苷酸。适合细胞类型包括与需要在体内递送经修饰寡核苷酸的细胞类型相关的细胞类型。举例而言，适用于本文所述方法的研究的细胞类型包括初级细胞或培养细胞。

在某些实施例中，在培养细胞中评估经修饰寡核苷酸干扰miR-21活性的程度。在某些实施例中，可藉由测量微小RNA的含量来评估对微小RNA活性的抑制。或者，可测量预测或确定的由微小RNA调控的转录物的含量。抑制微小RNA活性可使得miR-21调控的转录物和/或由miR-21调控的转录物编码的蛋白质增加。此外，在某些实施例中，可测量某些表型结果。

本领域的技术人员可获得若干动物模型用于在人类疾病的模型中研究miR-21。举例而言，miR-21抑制剂可在以下癌症模型中研究，诸如原位异种移植模型、毒素诱发的癌症模型或遗传诱发的癌症模型。在此类癌症模型中，可进行研究以评估miR-21抑制剂对肿瘤尺寸、肿瘤数目、总体存活期和/或无进展存活期的影响。

miR-21抑制剂对心脏功能及纤维化的影响可在经主动脉结扎或心肌梗塞的模型中研究，此类模型各自诱发异常心脏功能及纤维化。肾纤维化模型包括单侧输尿管梗阻及缺血/再灌注损伤。在早期时间点，可使用肾脏缺血再灌注损伤模型作为急性肾损伤的模型，而稍后时间点用作肾纤维化模型。另一肾纤维化模型为马兜铃酸诱发的纤维化模型。肝纤维化模型由例如四氯化碳中毒或胆管结扎诱发。肝纤维化亦可由会产生伴有纤维化的脂肪变性肝的甲硫氨酸及胆碱缺乏膳食诱发。miR-21对肺纤维化的影响可在例如博来霉素(bleomycin)诱发的肺纤维化模型中或在肺中过度表达TGF-β的小鼠中研究。伤口愈合模型亦可由本领域的技术人员获得，例如C57Bl/KsJ-db/db小鼠，其展现成年发作型糖尿病的若干特征，诸如伤口闭合显著延迟。

另一动物模型包括小鼠或犬埃布尔综合征模型。小鼠埃布尔综合征模型的一实例为Col4a3基因敲除小鼠。

某些定量分析

给予经修饰寡核苷酸后对miR-21的反义抑制作用可藉由本领域中已知的多种方法来评估。在某些实施例中，这些方法用于在体外或体内定量细胞或组织中的微小RNA含量。在某些实施例中，微小RNA含量的变化藉由微阵列分析来测量。在某些实施例中，微小RNA含量的变化藉由若干市售PCR分析的一者来测量，诸如

微小RNA分析(Applied Biosystems)。在某些实施例中，对miR-21的反义抑制作用藉由测量miR-21的目标的mRNA和/或蛋白质含量来评估。对miR-21的反义抑制作用通常使得微小RNA的目标的mRNA和/或蛋白质含量增加。

目标啮合分析

用抗miR剂或微小RNA模拟物调节微小RNA活性可藉由测量目标啮合来评估。在某些实施例中，藉由mRNA的微阵列概况分析来测量目标啮合。搜寻由抗miR剂或微小RNA模拟物调节(增加或减少)的mRNA的序列中的微小RNA种子序列，以比较对作为微小RNA的目标的mRNA的调节作用与对不为微小RNA的目标的mRNA的调节作用。以此方式，可评估抗miR剂与miR-21或miR-21模拟物与其目标的相互作用。在抗miR剂的情况下，筛选表达量增加的mRNA中包含与抗miR剂所互补的微小RNA匹配的种子的mRNA序列。

实例

提供以下实例以便更充分地说明本发明的一些实施例。然而，其不应以任何方式视作限制本发明的广泛范围。

本领域中的普通技术人员将容易地采用本发明的基本原理来设计各种化合物而不背离本发明的精神。

实例1：抗miR-21化合物

设计靶向miR-21且包含cEt核苷的各种抗miR剂，其在长度及与miR-21的互补性方面，以及在经修饰糖部分的数目、类型及置放方面具有变化。在体外荧光素酶分析中评估化合物对miR-21活性的抑制作用。

荧光素酶分析

在荧光素酶分析中评估此类化合物的miR-21抑制活性。使用pGL3-MCS2(Promega)对微小RNA荧光素酶感测构建体进行工程改造。将该构建体引入Hela细胞中以测试抗miR化合物抑制miR-21活性的能力。在此分析中，存在于Hela细胞中的miR-21结合至其在荧光素酶感测构建体中的同源位点，并抑制荧光素酶表达。当将适当抗miR剂引入细胞中时，其结合至miR-21并且减轻对荧光素酶表达的抑制。因此，在此分析中，作为miR-21表达的有效抑制剂的抗miR剂将使荧光素酶表达增加。

第1天：将用经工程改造以含有与miR-21互补的序列的荧光素酶构建体稳定转染的Hela细胞(ATCC)以3.5×10⁶个细胞/烧瓶接种于T-170烧瓶(BD Falcon)中。在高糖杜贝卡氏改良伊格培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium with High Glucose)(Invitrogen)中培养Hela细胞。

第2天：用0.5μg表达用于校正的海肾(Renilla)的phRL感测质粒(Promega)转染各烧瓶的Hela细胞。使用20μl脂染胺2000(Lipofectamine2000)/烧瓶(Invitrogen)对Hela细胞进行转染。转染4小时后，用PBS洗涤细胞且以胰蛋白酶处理。将Hela细胞以每孔40k个接种于24孔板(BD Falcon)中且静置隔夜。

第3天：使用Lipofectin(Invitrogen)用抗miR剂以2.5μl Lipofectin/100nMASO/ml Opti-MEM I血清减少型培养基(Invitrogen)转染Hela细胞4小时。ASO转染后，向Hela细胞中再馈入高糖杜贝卡氏改良伊格培养基(Invitrogen)。

第4天：将Hela细胞被动溶解且使用双重荧光素酶报导体分析系统(Dual-Luciferase Reporter Assay System)(Promega)测量荧光素酶活性。

将抗miR-21剂处理的细胞中的荧光素酶活性与‘空白对照’处理进行比较，在‘空白对照’处理中，细胞未接受抗miR剂处理。

某些活性化合物显示于表A中。核苷修饰如下指示：之后未接下标的核苷指示β-D-脱氧核糖核苷；之后接有下标“E”的核苷指示2’-MOE核苷；之后接有下标“S”的核苷指示S-cEt核苷。各核苷间键联为硫代磷酸酯核苷间键联。上标“Me”指示核苷的碱基上的5-甲基。

表A：抗miR-21化合物

表B：抗miR-21化合物的抑制活性

如表B中所示，表A的抗miR-21化合物在荧光素酶分析中体外抑制miR-21活性。选择这些活性化合物用于在体内肾纤维化模型中进一步测试。

UUO纤维化模型

单侧输尿管梗阻(UUO)为已确立的导致间质性纤维化的肾损伤实验模型且因此用作反映人类肾脏疾病的实验模型。UUO藉由手术结扎单个输尿管诱发。因为纤维化的特征在于胶原蛋白增加，所以可藉由测量胶原蛋白含量来确定肾纤维化的存在及程度。测量胶原蛋白1A1(Col 1A1)及胶原蛋白3A1(Col 3A1)两者以评估胶原蛋白含量。纤维化的另一指针为UUO程序后展示出胶原蛋白表达的肾脏组织的百分率。此‘胶原蛋白面积分率’经由对由天狼星红染料染成红色的肾脏组织的面积进行定量图像处理而以组织学方式测量；检测为红色的百分比是由肾脏切片面积来校正。肾纤维化亦可藉由测量样品中作为胶原蛋白主要组分的羟基脯氨酸的量来观测。

在UUO肾纤维化模型中测试含cEt的抗miR-21化合物36232、36234、36235、36237及36328。如下处理各组动物：仅UUO(n＝4)，UUO及PBS(n＝8)，或UUO及抗miR-21化合物(n＝7至8)。相对于UUO程序当天，在第-4、-2、0及+3天给予PBS或抗miR-21化合物。在20mg/kg的剂量下给予抗miR-21化合物。因为抗miR化合物在UUO程序之前给予，所以此给药方案视为预防性治疗。在第11天，处死动物且分离肾用于测量胶原蛋白表达。胶原蛋白表达藉由实时PCR进行测量并且首先针对GAPDH进行校正且接着针对假手术对照组(sham control)动物进行校正。根据单因子ANOVA检验确定统计显著性。如图1中所示，相对于假手术处理动物，用36232及36328处理以统计显著方式使胶原蛋白1A1(图1A)及胶原蛋白3A1(图1B)的表达降低。虽然其在体外为miR-21的活性抑制剂，但化合物36234、36235及36237在体内不使胶原蛋白表达统计显著降低。

这些结果说明36328及36232为治疗或预防纤维化(包括肾纤维化)的候选药剂。

虽然化合物36328及36232具有相同S-cEt核苷置放且在体外及在体内抑制miR-21，但其在溶液中展现显著不同的粘度。36328在盐水溶液中高度粘稠，而36232在此情况下并非如此。高度粘稠溶液可能不适于例如经由皮下注射给予，因为将需要较大给予体积来容纳所需量的抗miR剂，且较大体积更难以皮下给予。较低粘度溶液可合乎促进药剂给予的需要。在欲改变36328的粘度的尝试中，如表C中所示设计变化。测试各化合物在荧光素酶分析中的活性、在水中的粘度、及在UUO模型中的活性。

表C：36328及相关化合物

荧光素酶分析的结果显示于表D中且显示为相对于空白对照转染的荧光素酶活性倍数增加。如表D中所示，36283、36284及36328抑制miR-21活性。36282及36285在体外不为有效miR-21抑制剂。显示来自另一实验的36328抑制活性(上文)以供比较。

表D：体外抗miR-21活性

将化合物溶解于水中。使用路径选择法，以重量分析方式计算寡核苷酸浓度(mg/g)且使用粘度计测量粘度(cP)。结果显示于表E中。

表E：抗miR-21化合物粘度

将单一错配引入36382号化合物中仅略微降低粘度，且在荧光素酶分析中显著降低miR-21抑制活性。将三个错配引入36285号化合物中显著降低粘度，但在荧光素酶分析中产生极微弱miR-21抑制活性。化合物36283及36284在荧光素酶分析中各自抑制miR-21但展现极其不同粘度。化合物36284具有在核苷碱基位置3处的一个错配及在核苷碱基位置7处的一个错配且展现极低粘度。化合物36283具有在核苷碱基位置3处的一个错配及在核苷碱基位置5处的一个错配且被发现具有高粘度。

为评估体内活性，在UUO模型中测试各化合物。如下处理各组动物：假手术(n＝4)，UUO及PBS(n＝8)，或UUO及抗miR-21化合物(n＝7至8)。相对于UUO程序当天，在第-3、-1及+5天给予PBS或抗miR-21化合物。在20mg/kg的剂量下给予抗miR-21化合物。因为抗miR化合物在UUO程序之前给予，所以此给药方案视为预防性治疗。在第11天，处死动物且分离肾用于测量胶原蛋白表达。胶原蛋白表达藉由实时PCR进行测量并且首先针对GAPDH进行校正且接着针对假手术对照组动物进行校正。根据单因子ANOVA检验确定统计显著性。如图2中所示，相对于假手术处理动物，用36283及36284处理以统计显著方式使胶原蛋白1A1(图2A)及胶原蛋白3A1(图2B)的表达降低。化合物36282及36285在体内不使胶原蛋白表达统计显著降低。

这些结果说明36284使Col1A1与Col1A3两者的表达显著降低且在溶液中展现低粘度。

实例2：抗miR-21化合物的代谢稳定性

已发现某些抗miR-21化合物特别易受核酸内切酶和/或核酸外切酶活性代谢影响。为促进抗miR剂分布且延长半衰期，在核酸酶存在下的体内稳定性增加可为抗miR-21化合物的希望性质，且因此测试结构不同的化合物的代谢稳定性。测试的化合物包括发现对核酸酶活性敏感的25923及结构变异体25220及25221。各化合物的结构显示于表F中。核苷修饰如下指示：之后未接下标的核苷指示β-D-脱氧核糖核苷；之后接有下标“E”的核苷指示2’-MOE核苷；之后接有下标“S”的核苷指示S-cEt核苷。各核苷间键联为硫代磷酸酯核苷间键联。

表F：抗miR-21化合物

在离体分析中，在37℃下于肝组织匀浆(每毫升50mg组织)中培育5μM寡核苷酸24小时。在此培育之后，依次藉由液-液萃取(LLE)及固相萃取(SPE)来萃取寡核苷酸。藉由高效液相层析飞行时间质谱(HPLC-TOF MS)测量寡核苷酸长度及量。藉由使用参照寡核苷酸来确认肝组织匀浆中的核酸酶活性，此类参照寡核苷酸包括对核酸酶活性具有已知抗性的化合物、对3’-核酸外切酶活性敏感的化合物、及对核酸内切酶活性敏感的化合物。内部标准化合物用作萃取效率的对照。对于测试体内代谢稳定性，向小鼠给予化合物，分离肾组织，且如同离体分析一般对化合物进行萃取及检测。表G显示化合物25923、25220及25221的结构、及稳定性测量结果。

表G：25923、25220及25221离体及体内稳定性

如表G中所示，在离体分析与体内分析两者中，化合物25220及25221均展现对核酸酶活性的抗性增加。

为评估化合物对纤维化的作用，在UUO模型中测试化合物25220及25221以及25923。各组8只动物如下处理：假手术，UUO及PBS，UUO及25220，UUO及25221，或UUO及25923。相对于UUO程序当天，在第-5、-3及+3天给予PBS或抗miR-21化合物。在20mg/kg的剂量下给予抗miR-21化合物。因为抗miR化合物在UUO程序之前给予，所以此给药方案视为预防性治疗。在第10天，处死动物且分离肾用于测量胶原蛋白表达。胶原蛋白表达藉由实时PCR测量且针对GAPDH校正。

彼实验的结果显示于图3中。胶原蛋白1A1及胶原蛋白3A1表达分别显示于图3A及图3B中。给予化合物25220或25221使胶原蛋白1A1及胶原蛋白3A1表达降低统计显著量(*＝p<0.05；**＝p<0.01；***＝p<0.001)，给予化合物25923亦如此。

这些结果说明25220及25221使Col1A1表达与Col3A1表达两者均显著降低且展现对核酸酶代谢具有抗性。

亦测试25284的代谢稳定性。在离体分析中，仅检测到全长化合物。在体内，检测到的96％化合物为全长化合物。这些结果说明25284对核酸酶活性具有高度抗性。

实例3：在缺血/再灌注损伤模型中抑制miR-21

单侧缺血再灌注损伤(IRI)模型为一种导致进行性间质性纤维化的经充分表征的肾损伤模型。经由夹闭肾动脉短暂时期，随后恢复血流来在小鼠中产生损伤。再灌注对肾产生严重损伤，其继的以伴有纤维化的慢性损伤。导致慢性损伤的IRI常在人类中观测到，因此小鼠IRI模型可用于测试候选药剂在肾损伤的情形下对纤维化的治疗和/或预防。

在单侧IRI模型中测试抗miR-21化合物。持续30分钟的时期诱发单侧IRI(第0天)。处理组如下：IRI程序假手术对照组；IRI与皮下给予PBS；IRI与在20mg/kg的剂量下腹膜内给予抗miR-21化合物。在IRI之后第5、6及7天给予PBS或抗miR化合物，且在第13天处死动物。因为抗miR化合物是在肾损伤之后5天或5天后给予，此时纤维化已在某一程度上发生，所以此治疗方案视为治疗性方案而非防治性方案。

收集肾组织用于分析胶原蛋白1A1及胶原蛋白3A1表达、以及胶原蛋白面积分数(如先前实例中所述)。藉由单因子ANOVA检验确定统计显著性。结果显示于图4中。在此研究中，用36328或36232进行的抗miR-21处理产生Col1a1表达(图4A；*＝p<0.05)及胶原蛋白面积分数(图4C；***＝p<0.0001)的统计显著降低。化合物36232以统计显著方式降低Col3a1表达(图4B)。化合物36328使Col3a1表达降低，然而，降低不具有统计显著性(图4B)。

这些研究说明在急性肾损伤模型中，在抑制miR-21之后，胶原蛋白含量降低。因此，抗miR-21化合物36232及36328为在急性肾损伤的情形下用于治疗纤维化的治疗剂。举例而言，在急性肾损伤之后预防或延迟纤维化发作可预防或延迟纤维化及慢性肾病发作。

实例4：在缺血再灌注损伤/肾切除模型中抑制miR-21

在小鼠中经由以下建立缺血再灌注损伤/肾切除(IR/Nx)模型：在一只肾中对动脉进行暂时单侧夹闭，该夹闭导致肾小管损害、炎症及纤维化，接着在稍后时间点移除第二只肾。在此模型中，急性肾功能不全期适用于测试用于治疗急性肾损伤的候选药剂(亦即直至约前5天)，且稍后的肾功能不全期适用于模拟慢性纤维化(亦即在约前5天以后)。

在IR/Nx模型中测试抗miR-21化合物。使用与miR-21有6碱基错配的25109作为对照化合物(A_EA_SATC_STGTC_STCAU_SAATA_SAA_E；SEQ ID NO:14；其中之后未接下标的核苷指示β-脱氧核苷；之后接有下标“E”的核苷指示2’-MOE核苷；之后接有下标“S”的核苷指示S-cEt核苷；且所有核苷间键联均为硫代磷酸酯核苷间键联)。

诱发单侧IRI持续30分钟的时间。处理组如下：IR程序假手术对照组(n＝8)；IR与皮下给予PBS(n＝16)；IR与以20mg/kg的剂量皮下给予错配对照25109(n＝16)；及IR与以20mg/kg的剂量皮下给予抗miR-21化合物36328(n＝16)。PBS或抗miR剂在IR后第2、3、4及8天时给予。第8天，藉由肾切除术自各动物移除健康肾，且在第9天处死动物。临处死前，藉由直接膀胱穿刺收集尿。

为评估白蛋白尿，测量各小鼠的尿中的尿白蛋白与肌酸酐的比率。彼实验的结果展示于图5A中。在此研究中，36328使尿白蛋白：肌酸酐比率出现统计显著性降低(图5A)。各组小鼠的白蛋白:肌酸酐比率的几何平均值为16μgAlb/mgCr(单独肾切除术对照组)、127μgAlb/mgCr(IR/Nx-PBS对照组)、140μgAlb/mgCr(IR/Nx-25109对照组)及30μgAlb/mgCr(IR/Nx-36328组)。所有IR/Nx小鼠的血液尿素氮及血清肌酸酐含量相似，且相对于单独肾切除术对照组小鼠有所升高(数据未示)。

在一类似设计的实验中，亦在IR/Nx模型中测试化合物36284。持续30分钟的时期诱发单侧IR。处理组如下：IR程序假手术对照组(n＝7)；IR与皮下给予PBS(n＝13)；及IR与以20mg/kg的剂量皮下给予抗miR-21化合物36284(n＝19)。PBS或抗miR剂在IR后第2、3、4及8天时给予。第8天，藉由肾切除术自各动物移除健康肾，且在第9天处死动物。临处死前，藉由直接膀胱穿刺收集尿。为评估白蛋白尿，测量各小鼠的尿中的尿白蛋白与肌酸酐的比率。彼实验的结果显示于图5B中。在此研究中，36284产生尿白蛋白与肌酸酐比率的统计显著降低。

亦在IR/Nx模型中测试化合物25220。持续30分钟的时期诱发单侧IR。处理组如下：IR程序假手术对照组(n＝7)；IR与皮下给予PBS(n＝13)；及IR与以20mg/kg的剂量皮下给予抗miR-21化合物25220(n＝19)。PBS或抗miR剂在IR后第2、3、4及8天时给予。第8天，藉由肾切除术自各动物移除健康肾，且在第9天处死动物。临处死前，藉由直接膀胱穿刺收集尿。为评估白蛋白尿，测量各小鼠的尿中的尿白蛋白与肌酸酐的比率。彼实验的结果显示于图5C中。在此研究中，25220产生尿白蛋白与肌酸酐比率的统计显著降低。

实例5：给予抗miR-21化合物后IR/Nx模型小鼠的存活率

在6个不同实验中测定肾切除术后两天IR/Nx模型小鼠的存活率，以确定给予抗miR-21化合物是否使存活率增加。在前三个实验中，在缺血再灌注损伤后第5、6及7天给予抗miR-21化合物，并且在第10天或第11天进行肾切除术。在其次三个实验中，在第2、3及4天给予抗miR-21化合物且在第7天进行肾切除术。各实验中IR/Nx小鼠的存活率展示于表H中。

表H：36328使肾切除术后两天IR/Nx小鼠的存活率增加。

在肾切除术于第10天进行的第一实验中，经PBS处理的小鼠的存活率为55％，而经36328处理的小鼠的存活率为75％(P＝0.02，使用单侧费希尔精确检验(1-sided Fisher'sExact Test))。在肾切除术于第7天进行的第二实验中，经PBS处理的小鼠的存活率为52％，而经36328处理的小鼠的存活率为69％(P＝0.11，使用单侧费希尔精确检验)。

实例6：抗miR-21化合物

设计靶向miR-21且包含S-cEt核苷的其他抗miR剂，其在长度方面，以及在经修饰糖部分的数目、类型及置放方面具有变化。这些抗miR剂显示于表I中。核苷型态III、IV、V及VII显示于表I的前三列中。核苷修饰如下指示：之后未接下标的核苷指示β-D-脱氧核糖核苷；之后接有下标“E”的核苷指示2’-MOE核苷；之后接有下标“M”的核苷指示2’-O-甲基核苷；之后接有下标“S”的核苷指示S-cEt核苷。各核苷间键联为硫代磷酸酯核苷间键联。

在体外荧光素酶分析中评估选自表I的化合物对miR-21活性的抑制作用。如本文所述进行分析，且结果显示于表J及图6A中。

表J：抗miR-21化合物荧光素酶数据

基于表J中的数据及来自重复实验的数据，观测到化合物36731、36039、36846及36847在荧光素酶分析中一致抑制miR-21。

另外测试某些抗miR-21化合物在体外分析中对细胞增殖的作用。使用两个错配对照抗miR剂(36965G_EG_SA_EA_EU_S ^MC_E T_ET_EA_SACTA_SGACU_SA_SC_S，SEQ ID NO:15；36967G_EA_SA_ET_EA_SA_ET_EA_EU_SAACC_SCCTG_SG_SU_S，SEQ ID NO:16)。人类腺癌细胞株SK-Hep1用于此实验中。将SK-Hep1以每孔500个细胞的密度涂铺于胶原蛋白涂布的96孔板上。次日，细胞用浓度在50nM至20μM的范围内的抗miR剂处理(对于各处理，n＝6孔)。不使用转染试剂。使用

发光细胞活力分析来测量细胞活力。结果计算为相对于未处理对照的活细胞百分比。如表K及图6B中所示，化合物36731、36846、36847及25220以浓度依赖性方式降低细胞活力。

表K：抗miR-21化合物的抗增殖作用

降低细胞活力的化合物为用于治疗癌症的候选治疗剂。

为评估在纤维化模型中的体内活性，在UUO模型中测试某些化合物。如下处理各组动物：假手术(n＝4)，UUO及PBS(n＝8)，或UUO及抗miR-21化合物(n＝8)。相对于UUO程序当天，在第-5、-3及+3天给予PBS或抗miR-21化合物。在20mg/kg的剂量下给予抗miR-21化合物。因为抗miR化合物在UUO程序之前给予，所以此给药方案视为预防性治疗。在UUO程序之后第10天，处死动物且分离肾用于测量胶原蛋白表达。胶原蛋白表达藉由实时PCR进行测量并且首先针对GAPDH进行校正且接着针对假手术对照组动物进行校正。根据单因子ANOVA检验确定统计显著性。如图7中所示，相对于假手术处理动物(*＝p<0.05；**＝p<0.01)，用36731及36055处理以统计显著方式使胶原蛋白1A1(图7A)及胶原蛋白3A1(图7B)的表达降低。在此研究中，化合物36847降低胶原蛋白1A1及胶原蛋白3A1表达，但并非呈统计显著方式。

亦测定某些化合物的粘度。将化合物溶解于水中。使用路径选择法，以重量分析方式计算寡核苷酸浓度(mg/g)且使用粘度计测量粘度(cP)。结果显示于表L中。

表L：抗miR-21化合物粘度

相较于36847及本文所述的其他化合物，化合物36731及36846展现相对较低粘度。

测定某些化合物的代谢稳定性。在如上所述进行的离体分析中，在分析结束时检测到约89％的全长36731化合物。因此，36731为一种在核酸酶存在下具有高度稳定性的化合物。

实例7：异种移植物模型

人类异种移植物模型常用于测量潜在癌症疗法的体内功效。

藉由将人类癌细胞注射至免疫缺陷小鼠中来制备细胞株基异种移植物模型。注射细胞形成肿瘤，且可评估潜在抗癌剂对包括肿瘤尺寸、肿瘤数目、肿瘤构造及转移潜力在内的参数的影响。将细胞培养生长，且接着收集用于注射至小鼠中。细胞来自癌症细胞株(例如SK-Hep1、Huh7、HeLa293、Hep3B、SNU)。为起始肿瘤生长，将约5×10⁶个细胞皮下注射至免疫缺陷小鼠(例如SCID小鼠或无胸腺裸小鼠)的侧腹中。使细胞形成平均体积高达75mm²的肿瘤。

藉由将人类肿瘤外植体移植至免疫缺陷小鼠中来产生患者源性肿瘤组织异种移植物模型(患者源性异种移植物或PDX模型)。为尽可能多地保留原始肿瘤特征，外植体可自一只小鼠至另一小鼠中增殖，但通常不在细胞培养中增殖。

测试抗miR-21化合物在人类异种移植物模型中的抗癌作用。当肿瘤具有适当尺寸时，如下测试小鼠：PBS(n＝5至10)；抗miR-21(n＝5至10)；或抗miR-21错配(可任选地选用；n＝5至10)。每周多达3次持续多达12周皮下给予治疗剂。

例如使用测径规每周测量肿瘤尺寸一至两次。每周测量体重两至三次。每周一次及在研究结束时收集血液。在研究结束时收集肿瘤及其他组织。

相对于PBS处理的小鼠，在抗miR-21处理的小鼠的肿瘤尺寸中观测到肿瘤尺寸降低，表明抗miR-21剂为可用于治疗癌症的治疗剂。

除本文所述外，对本发明的各种修改对于本领域的技术人员而言根据前述描述亦是清楚的。此类修改亦意欲处于所附权利要求书的范围内。本申请案中引用的各参考文献(包括(但不限于)期刊文章、美国及非美国专利、专利申请公开案、国际专利申请公开案、

登录号及其类似物)明确以全文引用的方式并入本文中。

Claims

1.一种经修饰寡核苷酸，其结构选自如下：

其中之后未接下标的核苷为β-D-脱氧核糖核苷；之后接有下标“E”的核苷为2’-MOE核苷；之后接有下标“S”的核苷为S-cEt核苷，之后接有下标“M”的核苷为2’-O-甲基核苷；且之前接有上标“Me”的核苷在所述核苷的核碱基上具有5-甲基；其中各核苷间键联均为经修饰核苷间键联，且其中该经修饰核苷间键联为硫代磷酸酯核苷间键联。

2.权利要求1所述的经修饰寡核苷酸，其中所述经修饰寡核苷酸选自化合物编号25221、25220、36328、36284、36232、36731和36055。

3.权利要求1所述的经修饰寡核苷酸，其结构为：

A_EC_SA_ET_EC_SA_EG_ET_EC_STGAU_SAAGC_SU_SA_S

4.一种药物组合物，其包含权利要求2或3所述的经修饰寡核苷酸和医药学上可接受的载剂。

5.一种用于抑制细胞中miR-21的活性的体外方法，其包括使所述细胞接触权利要求1至3任一项的经修饰寡核苷酸。

6.如权利要求5所述的方法，其中该细胞为纤维母细胞、过度增殖性细胞、角化细胞或乏氧细胞。

7.一种用于减少细胞中的胶原蛋白表达的体外方法，其包括使所述细胞接触权利要求1至3任一项的经修饰寡核苷酸。

8.如权利要求2或3所述的经修饰寡核苷酸在制造用于治疗个体的与miR-21相关的疾病、预防或延迟与miR-21相关的疾病发作的药物中的用途，其中所述与miR-21相关的疾病是纤维化。

9.如权利要求8所述的用途，其中该纤维化是选自肾纤维化、肺纤维化、肝纤维化、心脏纤维化、皮肤纤维化、年龄相关性纤维化、脾纤维化、硬皮病及移植后纤维化。

10.如权利要求9所述的用途，其中：

a.该肾纤维化存在于患有选自以下的疾病的个体中：肾小球硬化、肾小管间质性纤维化、IgA肾病、间质性纤维化/肾小管萎缩；慢性肾损伤、肾小球肾炎、埃布尔综合征、糖尿病、特发性局部区段性肾小球硬化、膜性肾病、塌陷性肾小球病、慢性复发性肾脏感染及末期肾病；

b.该肾纤维化由肾脏的急性或反复性创伤引起；

c.该肝纤维化存在于患有选自以下的疾病的个体中：慢性肝损伤、肝炎感染、非酒精性脂肪变性肝炎及肝硬化；

d.该肺纤维化为特发性肺纤维化；和/或

e.该个体患有慢性阻塞性肺病。

11.如权利要求8至10中任一项所述的用途，其中该个体需要改善器官功能，其中该器官功能是选自心脏功能、肺功能、肝功能及肾功能。

12.如权利要求8至10中任一项所述的用途，其中该经修饰寡核苷酸改善该个体的器官功能，其中该器官功能是选自心脏功能、肺功能、肝功能及肾功能。

13.如权利要求8至10中任一项所述的用途，其中所述药物用于与至少一种选自以下的其他治疗剂一起给予：消炎剂、免疫抑制剂、抗糖尿病剂、地高辛、血管舒张药、血管紧张素II转化酶(ACE)抑制剂、血管紧张素II受体阻断剂(ARB)、钙通道阻断剂、异山梨醇二硝酸酯、肼屈嗪、硝酸酯、β-阻断剂、利钠肽、类肝素及结缔组织生长因子抑制剂。

14.如权利要求8至10中任一项所述的用途，其包括选择一种或多种组织中miR-21表达升高的个体。

15.如权利要求8至10中任一项所述的用途，其中该个体为人类。

16.如权利要求8至10中任一项所述的用途，其中该经修饰寡核苷酸以医药组合物形式存在。

17.如权利要求2或3所述的经修饰寡核苷酸，用于治疗纤维化。

18.一种如权利要求2或3所述的经修饰寡核苷酸的用途，用于制备一种用于治疗纤维化的药物。