CN101821391A - 微小聚体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在体内靶向且抑制微小RNA的极短重度修饰寡核苷酸，及其在药物和药物组合物中的用途。

Description

微小聚体
发明领域
本发明涉及在体内靶向且抑制微小RNA的极短寡核苷酸，及其在药物和药物组合物中的用途。
发明背景
微小RNA(miRNA)是种类丰富的短内源RNA，其通过与其靶mRNA的碱基配对充当基因表达的转录后调节物。它们通过RNA酶III Dicer酶由称为pre-miRNA的更长(约70-80nt)发夹样前体加工而来。微小RNA在称为miRNP的核糖核蛋白复合物中装配，并且通过反义互补性识别其靶位点，从而介导其靶基因的下调。miRNA及其靶位点之间的接近极佳或极佳的互补性导致靶mRNA切割，而微小RNA和靶位点之间的有限互补性导致靶基因的翻译抑制。
微小RNA在人类疾病中的作用和使用单链寡核苷酸抑制微小RNA的概述由WO2007/112754和WO2007/112753提供，所述专利都整体通过引用并入本文。通过引用并入本文的WO2008046911提供与癌症相关的微小RNA序列。众多微小RNA已与疾病表型相关，并且因此希望提供能够在体内调控微小RNA可用性的物质。WO2007/112754和WO2007/112753公开了视为与其靶miRNA形成强双链体的短单链寡核苷酸。SEQ ID NO 1-45是如WO2007/112754和WO2007/112753中公开的抗微小RNA寡核苷酸的例子。
相关申请
本申请要求来自4个申请的优先权：于2007年10月4日提交的US 60/977497、于2007年10月11日提交的US 60/979217、于2008年2月12日提交的US 61/028062、和于2008年7月17日提交的EP 08104780，所有申请通过引用并入本文。此外，提及且通过引用合并WO2007/112754和WO2007/112753，所述专利是来自相同申请人的较早申请。
发明概述
本发明基于下述发现：通过在体内靶向微小RNA，极短寡核苷酸的使用在减轻RNA例如mRNA阻遏方面高度有效，所述极短寡核苷酸靶向微小RNA，并且具有高比例的核苷酸类似物核苷酸，例如LNA核苷酸。
本发明提供了长度为7、8、9或10个核苷酸单位的邻接序列的寡聚物，用于减少细胞或生物体中的微小RNA靶的有效量，其中寡聚物的至少70％，例如至少80％核苷酸单位选自LNA单位和2′取代的核苷酸类似物。
本发明提供了长度为7、8、9或10个核苷酸单位的邻接序列的寡聚物，用于减少细胞或生物体中的微小RNA靶的有效量，其中寡聚物的至少70％核苷酸单位选自LNA单位和2′取代的核苷酸类似物，并且其中寡聚物的至少50％，例如至少60％，例如至少70％核苷酸单位是LNA单位。
本发明提供了长度为7-10个核苷酸的寡聚物，其包括总共7-10个核苷酸，例如7、8、9个核苷酸单位的邻接核苷酸序列，其中寡聚物的至少50％核苷酸单位是核苷酸类似物。
本发明进一步提供了长度为7-10个核苷酸的寡聚物，其包括总共7-10个核苷酸，例如7、8、9或10个核苷酸单位的邻接核苷酸序列，其中核苷酸序列与哺乳动物或病毒微小RNA中发现的相对应核苷酸序列互补，并且其中寡聚物的至少50％核苷酸单位是核苷酸类似物。
本发明提供了作为药物的根据本发明的寡聚物。
本发明提供了药物组合物，其包括本发明的寡聚物和药学上可接受的稀释剂、载体、盐或佐剂。
本发明提供了缀合物，其包括根据本发明的寡聚物，与至少一个非核苷酸或多核苷酸实体，例如类固醇，例如胆固醇缀合。
本发明提供了根据本发明的寡聚物或缀合物在制造用于治疗疾病或医学病症的药物中的用途，所述疾病或医学病症与微小RNA，例如本文提及的一种或多种微小RNA的存在或过表达相关。
本发明提供了与微小RNA的存在或过表达相关的疾病或医学病症的治疗，其包括给患有或可能患有所述疾病或医学病症的患者施用包括根据本发明的寡聚物或缀合物的组合物(例如药物组合物)的步骤。
本发明提供了用于减少细胞或生物体中的微小RNA靶有效量的方法，其包括给细胞或生物体施用本发明的寡聚物、或包括根据本发明的寡聚物或缀合物的组合物(例如药物组合物)。
本发明提供了用于减少细胞或生物体中的微小RNA靶有效量的方法，其包括给细胞或生物体施用根据本发明的寡聚物或缀合物或药物组合物。
本发明提供了用于对细胞或生物体中的靶mRNA(或一种或多种RNA)去阻遏的方法，其包括给所述细胞或生物体施用根据本发明的寡聚物或缀合物、或包括所述寡聚物或缀合物的组合物。
本发明提供了根据本发明的寡聚物或缀合物用于抑制细胞中的微小RNA的用途，所述细胞包括所述微小RNA，例如人细胞。所述用途可以在体内或在体外。
附图简述
图1。miR-21、miR-155和miR-1228-聚体LNA-抗miR的示意性呈现，指出具有完全LNA修饰且硫代磷酸酯化(phosphorothiolated)LNA-抗mi R的靶向位置。还指出了在成熟微小RNA上的7聚体、8聚体、9聚体和10聚体LNA寡核苷酸的优选杂交位置。
图2。使用萤光素酶传感器测定法在MCF-7细胞中评估通过SEQ ID#3205和SEQ ID#3204LNA-抗miR的miR-21拮抗。用萤光素酶传感器质粒和LNA-抗miR以不同浓度共转染MCF-7细胞，所述萤光素酶传感器质粒包含关于miR-21的极佳匹配靶位点或错配靶位点(.mm2)。在24小时后，收获细胞并且测量萤光素酶活性。显示的是关于3次分开实验(条＝s.e.m)的海肾/萤火虫比的平均值，都已针对0nMpsiCHECK2(＝对照)进行标准化。
图3。使用萤光素酶传感器测定法在HeLa细胞中评估通过SEQ ID#3205和SEQ ID #3204 LNA-抗miR的miR-21拮抗。用萤光素酶传感器质粒和LNA-抗miR以不同浓度共转染HeLa细胞，所述萤光素酶传感器质粒包含关于miR-21(mir-21)的极佳匹配靶位点或错配靶位点(mm2)。在24小时后，收获细胞并且测量萤光素酶活性。显示的是关于3次分开实验(条＝s.e.m)的海肾/萤火虫比的平均值，都已针对0nM psiCHECK2(＝对照)进行标准化。
图4。使用萤光素酶传感器测定法在LPS处理小鼠RAW细胞中评估通过SEQ ID #3206和SEQ ID #3207 LNA-抗miR的miR-155拮抗。用miR-155和不同LNA-抗miR以不同浓度共转染RAW细胞。在24小时后，收获细胞并且测量萤光素酶活性。显示的是海肾/萤火虫的平均值，都已针对0 nM psiCHECK2进行标准化。
图5。使用萤光素酶传感器测定法在HuH-7细胞中评估通过SEQ ID#3208和SEQ ID #4 LNA-抗miR的miR-122拮抗。用miR-122萤光素酶传感器和不同LNA-抗miR以不同浓度共转染HuH-7细胞，所述miR-122萤光素酶传感器包含极佳匹配的miR-122靶位点。在24小时后，收获细胞并且测量萤光素酶活性。显示的是关于3次分开实验(条＝s.e.m)的海肾/萤火虫比的平均值，其中都已针对0 nM psiCHECK2(＝对照)进行标准化。
图6。miR-21萤光素酶报道子构建体的示意性呈现。
图7。使用萤光素酶报道子测定法在PC3细胞中评估通过8-聚体LNA-抗miR(SEQ ID #3205)与15-聚体LNA-抗miR(SEQ ID #3204)相比较的miR-21拮抗。用萤光素酶报道子质粒和LNA-抗miR以不同浓度共转染PC3细胞，所述萤光素酶报道子质粒包含关于miR-21的极佳匹配靶位点或错配靶位点。在24小时后，收获细胞并且测量萤光素酶活性。显示的是3次独立实验的平均值(条＝s.e.m)，其中海肾/萤火虫比已针对不含靶位点的0nM空载体(＝对照)进行标准化。显示的还是miR-21序列以及LNA-抗miR的设计和位置的示意性呈现。LNA核苷酸以椭圆形表示，并且DNA残基以条表示。
图8。使用萤光素酶报道子测定法在HeLa细胞中特异性评估通过8-聚体LNA-抗miR的miR-21拮抗。用萤光素酶报道子质粒和LNA-抗miR(SEQ ID #3205)或8-聚体LNA错配对照寡核苷酸(oligos)(SEQID #3218)以不同浓度共转染HeLa细胞，所述萤光素酶报道子质粒包含关于miR-21的极佳匹配或错配靶位点。在24小时后，收获细胞并且测量萤光素酶活性。显示的是关于3次独立实验的平均值(条＝s.e.m)，其中海肾/萤火虫比已针对不含靶位点的0nM空载体(＝对照)进行标准化。显示的还是miR-21序列以及LNA-抗miR的设计和位置的示意性呈现。错配以实心椭圆形表示。
图9。介导miR-21有效拮抗的完全LNA修饰的LNA-抗miR的最短可能长度评估。用萤光素酶报道子质粒和LNA-抗miR(SEQ ID #3209＝6-聚体和SEQ ID #3210＝7-聚体)以不同浓度共转染HeLa细胞，所述萤光素酶报道子质粒包含关于miR-21的极佳匹配或错配靶位点。在24小时后，收获细胞并且测量萤光素酶活性。显示的是关于3次独立实验的平均值(条＝s.e.m)，其中海肾/萤火虫比已针对不含靶位点的0nM空载体(＝对照)进行标准化。显示的还是miR-21序列以及LNA-抗miR的设计和位置的示意性呈现。
图10。拮抗miR-21的完全LNA取代的LNA-抗miR的长度评估。用萤光素酶报道子质粒和LNA-抗miR(SEQ ID #3211＝9-聚体、SEQ ID#3212＝10-聚体、SEQ ID #3213＝12-聚体和SEQ ID #3214＝14-聚体)以不同浓度共转染HeLa细胞，所述萤光素酶报道子质粒包含关于miR-21的极佳匹配或错配靶位点。在24小时后，收获细胞并且测量萤光素酶活性。显示的是关于3次独立实验的平均值(条＝s.e.m)，其中海肾/萤火虫比已针对不含靶位点的0nM空载体(＝对照)进行标准化。显示的还是miR-21序列以及LNA-抗miR的设计和位置的示意性呈现。
图11。关于8-聚体LNA-抗miR在miR靶识别序列内的最佳位置的测定。用萤光素酶报道子质粒和LNA-抗miR以不同浓度共转染HeLa细胞，所述萤光素酶报道子质粒包含关于miR-21的极佳匹配或错配靶位点。在24小时后，收获细胞并且测量萤光素酶活性。显示的是关于3次独立实验的平均值(条＝s.e.m)，其中海肾/萤火虫比已针对不含靶位点的0nM空载体(＝对照)进行标准化。显示的还是mi R-21序列以及LNA-抗miR的设计和位置的示意性呈现。
图12。通过8-聚体SEQ ID #3205LNA-抗miR验证Pdcd4-3′-UTR和miR-21的相互作用。用萤光素酶报道子质粒和LNA-抗miR(SEQ ID#3205＝8聚体，极佳匹配；SEQ ID #3218＝8聚体，错配；SEQ ID#3204＝15聚体，LNA/DNA混合物；SEQ ID #3220＝15聚体，缺口聚体(gapmer))以不同浓度共转染HeLa细胞，所述萤光素酶报道子质粒包含Pdcd4基因的3′UTR的部分。在24小时后，收获细胞并且测量萤光素酶活性。显示的是已针对0nM标准化的海肾/萤火虫比。显示的还是miR-21序列以及LNA-抗miR的设计和位置的示意性呈现。
图13。8-聚体LNA-抗miR(SEQ ID #3207)与15-聚体LNA-抗miR(SEQ ID #3206)在小鼠RAW细胞中拮抗miR-155中的比较。用萤光素酶报道子质粒和不同LNA-抗miR以不同浓度共转染小鼠RAW细胞，所述萤光素酶报道子质粒包含关于miR-155的极佳匹配。在24小时后，收获细胞并且测量萤光素酶活性。显示的是3次独立实验的平均值(条＝s.e.m)，其中海肾/萤火虫比已针对不含miR-155靶位点的0nM空载体(＝对照)进行标准化。显示的还是miR-155序列以及LNA-抗miR的设计和位置的示意性呈现。
图14。c/EBP□评估c/EBPer LNA-抗miR(SEQ ID #3207)与15-聚体LNA-抗miR(SEQ ID #3206)在小鼠RAW细胞中拮抗miR-155中的评估。用萤光素酶报道子质粒和不同20小时共转染小鼠RAW细胞，所述萤光素酶报道子质粒包含关于miR-155的极佳匹配，收获细胞并且执行来自RAW细胞的蛋白质提取物的western印迹分析。指出c/EBPβ的不同同工型，并且下文显示关于c/EBPβ LIP和β-微管蛋白计算的比。
图15。通过完全LNA修饰的8-聚体(SEQ ID #3221)LNA-抗miR或通过15-聚体混合物聚体(mixmer)(SEQ ID #3228)抗miR对miR-106b的拮抗。用萤光素酶报道子质粒和不同LNA-抗miR以不同浓度共转染HeLa细胞，所述萤光素酶报道子质粒包含关于miR-106b的极佳匹配。在24小时后，收获细胞并且测量萤光素酶活性。显示的是4次重复的平均值，其中海肾/萤火虫比已针对不含miRNA靶位点的0nM空载体(＝对照)进行标准化。显示的还是miR-106b序列以及LNA-抗miR的设计和位置的示意性呈现。
图16。通过完全LNA修饰的8-聚体(SEQ ID #3222)LNA-抗miR和15-聚体(SEQ ID #3229)混合物聚体抗miR对miR-19b的拮抗。用萤光素酶报道子质粒和2种LNA-抗miR以不同浓度共转染HeLa细胞，所述萤光素酶报道子质粒包含关于miR-19a的极佳匹配。在24小时后，收获细胞并且测量萤光素酶活性。显示的是4次重复实验的平均值，其中海肾/萤火虫比已针对不含miR-19a靶位点的0nM空载体(＝对照)进行标准化。显示的还是miR-19a序列以及LNA-抗miR的设计和位置的示意性呈现。
图17。显示成熟人miR-221和miR-222序列的示意性呈现。以正方形显示的是在2种miRNA序列中保守的种子序列(7-聚体)。
图18。使用短完全LNA取代的LNA-抗miR靶向微小RNA家族。用关于miR-221和miR-222的萤光素酶报道子质粒分别或一起且与不同LNA-抗miR以各种浓度共转染PC3细胞。当用LNA-抗miR(15-聚体)SEQ ID #3223(针对miR-221)和SEQ ID #3224(针对miR-222)共转染时，总浓度是2nM(各1nM)，而用SEQ ID #3225(7-聚体)转染细胞时，浓度是0、1、5、10或25nM。在24小时后，收获细胞并且测量萤光素酶活性。显示的是3次独立实验的平均值(条＝s.e.m)，其中海肾/萤火虫比已针对不含miRNA靶位点的0nM空载体(＝对照)进行标准化。显示的还是miR-221/222序列以及LNA-抗miR的设计和位置的示意性呈现。
图19。作为关于通过7-聚体SEQ ID #3225LNA-抗miR对miR-221/222家族拮抗的功能读数的p27蛋白质水平评估。用靶向miR-221和miR-222的7-聚体LNA-抗miR SEQ ID#3225以各种浓度转染PC3细胞。在24小时后，收获细胞并且在western印迹上测量蛋白质水平。显示的是p27/微管蛋白比。
图20。使用萤光素酶报道子测定法在HepG2细胞中评估通过8-聚体LNA-抗miR(SEQ ID #3205)与15-聚体LNA-抗miR(SEQ ID #3204)和具有2个错配的8-聚体(SEQ ID #3218)相比较对miR-21的拮抗。
用萤光素酶报道子质粒和LNA-抗miR以不同浓度共转染HepG2细胞，所述萤光素酶报道子质粒包含关于miR-21的极佳匹配靶位点。在24小时后，收获细胞并且测量萤光素酶活性。显示的是3次独立实验的平均值(条＝s.e.m)，其中海肾/萤火虫比已针对不含靶位点的0nM空载体(＝对照)进行标准化。显示的还是miR-21序列以及LNA-抗miR的设计和位置的示意性呈现。
图21。通过8-聚体SEQ ID #3205LNA-抗miR与15-聚体LNA-抗miR(SEQ ID #3204)和具有2个错配的8-聚体(SEQ ID #3218)相比较验证Pdcd4 3′-UTR和miR-21的相互作用。
用萤光素酶报道子质粒、pre-miR-21(10nM)和LNA-抗miR以不同浓度共转染Huh-7细胞，所述萤光素酶报道子质粒包含Pdcd4基因的3′UTR的部分。在24小时后，收获细胞并且测量萤光素酶活性。显示的是3次独立实验的平均值(条＝s.e.m)，其中海肾/萤火虫比已针对不含靶位点的0nM空载体(＝对照)进行标准化。显示的还是miR-21序列以及LNA-抗miR的设计和位置的示意性呈现。
图22。通过SEQ ID #3205对miR-21的拮抗导致增加水平的Pdcd4蛋白质水平。
用5nM LNA-抗miR SEQ ID #3205(极佳匹配)、或SEQ ID #3219LNA混杂(8聚体)或SEQ ID #3218(8-聚体错配)转染HeLa细胞。在24小时后收获细胞，并且实施用Pdcd4抗体的western印迹。
图23。在用SEQ ID #3205(极佳匹配)或SEQ ID #3218(错配对照)处理的小鼠中的ALT和AST水平。在14天后并且在每隔一天接受25mg/kg后处死小鼠。
图24。作为关于通过短LNA-抗miR(SEQ ID #3207)的miR-155拮抗的功能读数的PU.1蛋白质水平评估。
用pre-miR-155(5nmol)和不同LNA寡核苷酸(5nM)共转染THP-1细胞，并且加入100ng/ml LPS。在24小时后，收获细胞并且执行来自THP-1细胞的蛋白质提取物的western印迹分析。指出PU.1和微管蛋白。
图25。作为关于通过7-聚体SEQ ID #3225 LNA-抗miR对miR-221/222家族的拮抗的功能读数的p27蛋白质水平评估。
用靶向miR-221和miR-222的7-聚体LNA-抗miR SEQ ID #3225以及LNA混杂对照以5和25nM转染PC3细胞。在24小时后，收获细胞并且在western印迹上测量蛋白质水平。显示的是p27/微管蛋白比。
图26。通过7-聚体SEQ ID #3225(极佳匹配)LNA-抗miR对miR-221/222的敲减(knock-down)减少PC3细胞中在软琼脂中的集落形成。
用25nM靶向miR-221和miR-222的7-聚体LNA-抗miR SEQ ID#3225或7-聚体混杂对照((SEQ ID #3231)转染PC3细胞。在24小时后，收获细胞并且种植在软琼脂上。在12天后，计数集落。一个实验以一式三份地完成。
图27。人let-7家族和所测试拮抗剂的概述。
(上图)序列表示关于每个成员的成熟miRNA，并且盒描述核苷酸2-16，位置一般由LNA-抗miR拮抗。右侧的列显示与let-7a相比较分别在种子(S：位置2-8)、扩展种子(ES；位置2-9)、和一般通过LNA-抗miR靶向的其余序列(NE；位置9-16)内核苷酸差异的数目。具有反色的核苷酸与let-7a相比较是改变的。(下图)针对let-7家族的所测试拮抗剂的概述，包括关于设计、长度和极佳互补靶的信息。所有化合物都是完全硫代磷酸酯化的。
图28。使用萤光素酶传感器测定法在Huh-7细胞中评估通过6种不同LNA-抗miR对let-7的拮抗。
用萤光素酶传感器质粒、连同或不连同let-7a前体(分别为灰色和黑色条)和6种不同LNA-抗miR以渐增浓度共转染Huh-7细胞，所述萤光素酶传感器质粒包含部分HMGA2 3′UTR(具有4个let-7结合位点)。在24小时后，收获细胞并且测量萤光素酶活性。显示的是关于每次测定法的一式两份测量和标准差的海肾/萤火虫比的平均值。在每个LNA-抗miR组内，所有的比都已针对不包含let-7a前体(黑色条)的平均值进行标准化。
图29。来自用HMGA2 3′UTR传感器质粒，LNA-抗miR SEQ ID #3226(左)和SEQ ID #3227(右)，以及关于let-7a(A)、let-7d(B)、let-7e(C)和let-7i(D)的pre-miR转染的Huh-7细胞的萤光素酶结果。灰色条指出在pre-mis包括后的靶去阻遏，而黑色对照条表示不含pre-miR添加的等价水平。每个比是基于一式四份测量，并且已针对在每个处理组内不包含前体孔(黑色条)的平均值进行标准化。
图30。来自用HMGA2 3′UTR传感器质粒或对照载体、和LNA-抗miR SEQ ID #3227以各种浓度转染的HeLa细胞的萤光素酶结果。每个比是基于针对未处理(0nM)空对照载体(psi-CHECK-2；灰色条)标准化的一式四份测量。
图31。使用萤光素酶传感器测定法在HCT116细胞中评估通过8聚体(#3205)对miR-21的拮抗。用萤光素酶传感器质粒以及LNA-抗miR和对照寡核苷酸以不同浓度共转染HCT116细胞，所述萤光素酶传感器质粒包含关于miR-21的极佳匹配靶位点(灰色条)。在24小时后，收获细胞并且测量萤光素酶活性。显示的是两个中的一个一般例子，其中海肾/萤火虫比已针对0nM空载体(黑色条)进行标准化。
图32。通过8-聚体#3205 LNA-抗miR对miR-21的沉默减少PC3细胞中在软琼脂中的集落形成。用25nM靶向miR-21的8-聚体LNA-抗miR #3205转染PC3细胞。在24小时后，收获细胞并且种植在软琼脂上。在12天后，计数集落。显示的是3次分开实验的平均值，各自一式三份地执行，并且针对0nM对照(即不用LNA转染)标准化。对于#3205，p＝0.01898。
图33。通过8-聚体#3205 LNA-抗miR对miR-21的敲减减少HepG2细胞中在软琼脂中的集落形成。用25nM靶向miR-21的8-聚体LNA-抗miR#3205转染HepG2细胞。在24小时后，收获细胞并且种植在软琼脂上。在17天后，计数集落。显示的是来自一次实验的3次重复的平均值(条＝SEM)。
图34。在用#3205处理后在侵袭性人前列腺细胞系PC3中的伤口闭合。(A)在第3天时用LNA-抗miR和对照寡核苷酸以25nM，#3205(8聚体，极佳匹配)和#3219(8聚体，错配)转染PC3细胞，并且第二天进行划线。在24小时后获得照片，以便监控迁移。(B)在每个时间点中的面积已用软件程序Image J进行测量，并且针对分别0小时时间点进行标准化。
图35。拮抗miR-155的完全LNA取代的LNA-抗miR的长度评估。
用萤光素酶报道子质粒和LNA-抗miR寡核苷酸以不同浓度共转染RAW细胞，所述萤光素酶报道子质粒包含关于miR-155的极佳匹配靶位点。在24小时后，收获细胞并且测量萤光素酶活性。显示的是关于3次独立实验的平均值(条＝s.e.m)，其中海肾/萤火虫比已针对不含靶位点的0nM空载体(＝模拟)进行标准化。显示的还是miR-21序列以及LNA-抗miR的设计和位置的示意性呈现。
图36。5′-FAM标记的LNA-抗miR-21(#3205)与小鼠血浆蛋白质的结合。
(A)作为小鼠血浆中的寡核苷酸浓度的函数，未结合LNA-抗miR-21化合物％。(B)作为小鼠血浆中的#3205浓度的函数，未结合LNA-抗miR-21化合物#3205的浓度。
图37。通过western印迹分析定量Ras蛋白质水平。
A。显示在处理(抗-let-7；8-聚体)与未处理(盐水)肺和肾样品相比较中的Ras和微管蛋白(内部标准)蛋白质的凝胶图像。B。分别在LNA-抗miR处理小鼠(黑色条)肺和肾中的Ras蛋白质水平的定量，针对等价盐水对照(灰色条)标准化，使用微管蛋白作为等量装载对照。
B。通过#3205对miR-21的沉默导致在体内增加水平的Pdcd4蛋白质水平。
C。经过14天每隔一天用盐水或25mg/kg LNA-抗miR(#3205)注射小鼠，总共5次剂量。处死小鼠，并且从肾中分离蛋白质，并且用Pdcd4抗体实施western印迹分析。A。显示在处理的(抗miR-21；8-聚体)与未处理的(盐水)肾样品(M1，小鼠1；M2，小鼠2)相比较中的Pdcd4和Gapdh(内部标准)蛋白质的凝胶图像。B。在LNA-抗miR处理小鼠(深灰色条)肾中的Pdcd4蛋白质水平的定量，针对等价盐水对照(淡灰色条)平均值标准化，使用Gapdh作为装载对照。
发明详述
已知掺入LNA的短寡核苷酸来自体外试剂领域(参见例如WO2005/098029和WO 2006/069584)。然而，设计用于诊断或试剂用途的分子在设计方面与用于在体内或药学用途的那些非常不同。例如，试剂寡核苷酸的末端核苷酸一般不是LNA，而是DNA，并且核苷间连接一般不是硫代磷酸酯——在本发明的寡核苷酸中使用的优选连接。本发明因此提供了本身新种类的寡核苷酸(本文称为寡聚物)。
下述实施方案指本发明的寡聚物的特定实施方案，其可以在药物组合物中使用。就寡聚物而言的方面也可以指邻接核苷酸序列，并且反之亦然。
寡聚物
本发明的寡聚物是单链寡核苷酸，其包括核苷酸类似物例如LNA，其构成寡核苷酸的整个邻接核苷酸序列的部分。寡聚物的核苷酸序列由邻接核苷酸序列组成。
术语“寡核苷酸”(或简单地“寡核苷酸(oligo)”)在本发明的背景中可与术语“寡聚物”互换使用，指由2个或更多核苷酸的共价连接形成的分子。当在本发明的寡核苷酸(也指单链寡核苷酸)的背景中使用时，在一个实施方案中，术语“寡核苷酸”可以具有，例如具有7-10个核苷酸，例如在个别实施方案中，7、8、9或10个。
术语‘核苷酸’指核苷酸例如DNA和RNA，以及核苷酸类似物。应认识到在某些方面，术语核碱基也可以用于指可以是天然存在或非天然存在的核苷酸——在这个方面，术语核碱基和核苷酸可以在本文中互换使用。
在某些实施方案中，邻接核苷酸序列由7个核苷酸类似物组成。在某些实施方案中，邻接核苷酸序列由8个核苷酸类似物组成。在某些实施方案中，邻接核苷酸序列由9个核苷酸类似物组成。
在一个实施方案中，寡聚物的至少约50％核苷酸是核苷酸类似物，例如至少约55％，例如至少约60％、或至少约65％或至少约70％，例如至少约75％，例如至少约80％，例如至少约85％，例如至少约90％，例如至少约95％或例如100％。还显而易见的是寡核苷酸可以包括仅由核苷酸类似物组成的核苷酸序列。适当地，寡聚物可以包括至少一个LNA单体，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个LNA单体。如下所述，邻接核苷酸序列可以仅由LNA单位(包括连接基团，例如硫代磷酸酯连接)组成，或可以由LNA和DNA单位、或LNA和其他核苷酸类似物组成。在某些实施方案中，邻接核苷酸序列包括一个或两个DNA核苷酸，其余核苷酸是核苷酸类似物，例如LNA单位。
在某些实施方案中，邻接核苷酸序列由6个核苷酸类似物和单个DNA核苷酸组成。在某些实施方案中，邻接核苷酸序列由7个核苷酸类似物和单个DNA核苷酸组成。在某些实施方案中，邻接核苷酸序列由8个核苷酸类似物和单个DNA核苷酸组成。在某些实施方案中，邻接核苷酸序列由9个核苷酸类似物和单个DNA核苷酸组成。在某些实施方案中，邻接核苷酸序列由7个核苷酸类似物和2个DNA核苷酸组成。在某些实施方案中，邻接核苷酸序列由8个核苷酸类似物和2个DNA核苷酸组成。
寡聚物可以由邻接核苷酸序列组成。
在一个特别优选的实施方案中，所有核苷酸类似物都是LNA。在另一个优选的实施方案中，寡聚物的所有核苷酸都是LNA。在另一个优选的实施方案中，寡聚物的所有核苷酸都是LNA，并且所有核苷间连接基团都是硫代磷酸酯。
此处，术语“含氮碱基”意欲包含嘌呤和嘧啶，例如DNA核碱基A、C、T和G，RNA核碱基A、C、U和G，以及非DNA/RNA核碱基，例如5-甲基胞嘧啶(MeC)、异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基-6-氟尿嘧啶、5-甲基噻唑尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、肌苷、2，6-二氨基嘌呤、7-丙炔-7-脱氮杂腺嘌呤、7-丙炔-7-脱氮杂鸟嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤，特别是MeC。应当理解非DNA/RNA核碱基的实际选择将依赖于在微小RNA链中存在的所述寡核苷酸预期靶向的相对应(或匹配)核苷酸。例如，在相对应核苷酸是G的情况下，通常必须选择非DNA/RNA核碱基，其能够建立与G的氢键。在这个具体情况下，其中相对应核苷酸是G，优选非DNA/RNA核碱基的一般例子是MeC。
应认识到术语在‘一个实施方案’中不一定局限于指一个具体实施方案，还可以指可以存在于‘某些实施方案’中的特征，或甚至作为本发明的一般特征。同样，术语‘某些实施方案’的使用可以用于描述一个具体实施方案的特征，或实施方案集合，或甚至作为本发明的一般特征。
术语“与……相对应”和“对应于”指寡聚物的核苷酸序列或邻接核苷酸序列(第一种序列)和选自下述的其他序列的等价邻接核苷酸序列之间的对照：i)微小RNA核酸靶(例如选自SEQ ID 40-SEQID 976的微小RNA靶)的相反互补体的子序列，和/或ii)本文提供的核苷酸序列，例如由SEQ ID NO 977-1913、或SEQ ID NO 1914-2850、或SEQ ID NO 2851-3787组成的组。核苷酸类似物与其等价或相对应核苷酸直接比较。与在i)或ii)下的其他序列相对应的第一种序列一般在第一种序列的长度上与那种序列等同(例如邻接核苷酸序列)。
如本文提及的，当提及核苷酸分子的长度时，长度与单体单位即核苷酸的数目相对应，不考虑那些单体单位是核苷酸还是核苷酸类似物。就核苷酸或核碱基而言，术语单体和单位在本文中可互换使用。
应当理解当术语“约”在特定值或值范围的背景中使用时，公开内容应理解为包括提及的具体值或范围。
如本文所使用的，“杂交”指氢键合，这可以是在互补核苷或核苷酸碱基之间的沃森-克里克、Hoogsteen、反Hoogsteen氢键合等。在DNA中通常发现的4种核碱基是G、A、T和C，其中G与C配对，并且A与T配对。在RNA中，T被尿嘧啶(U)取代，其因此与A配对。核碱基中参于标准双链体形成的化学基团构成沃森-克里克面。Hoogsteen在数年后显示嘌呤核碱基(G和A)除其沃森-克里克面外还具有Hoogsteen面，其可以在双链体的外面被识别，并且用于经由氢键合结合嘧啶寡核苷酸，从而形成三螺旋结构。
在本发明的背景中，“互补”指2个核苷酸序列彼此之间精确配对的能力。例如，如果在寡核苷酸的特定位置处的核苷酸能够与DNA或RNA分子的相对应位置处的核苷酸氢键合，那么寡核苷酸和DNA或RNA视为在那个位置处彼此互补。当寡核苷酸中足够数目的核苷酸可以与靶DNA或RNA中的相对应核苷酸形成氢键，以使得能够形成稳定复合物时，DNA或RNA链视为彼此互补。为了在体外或在体内稳定，寡核苷酸序列无需与其靶微小RNA 100％互补。术语“互补”和“可特异性杂交”因此暗示寡核苷酸与靶分子足够强且特异性结合，以提供对靶正常功能的所需干扰，同时留下非靶RNA功能不受影响。然而，在一个优选实施方案中，术语互补应指100％互补或完全互补。
在一个优选例子中，本发明的寡核苷酸与miRNA序列例如人微小RNA序列，或本文提及的微小RNA序列之一100％互补。
在一个优选例子中，本发明的寡核苷酸包括与人微小RNA序列的种子区域100％互补的邻接序列。
优选地，术语“微小RNA”或“miRNA”在本发明的背景中指由长度18至25个核苷酸组成的RNA寡核苷酸。在功能术语中，miRNA一般是调节性内源RNA分子。
术语“靶微小RNA”或“靶miRNA”指在人疾病中具有生物作用的微小RNA，例如在癌症中的上调的、致癌miRNA或肿瘤抑制子miRNA，从而成为用于所述疾病的治疗干预的靶。
术语“靶基因”或“靶mRNA”指微小RNA的调节mRNA靶，其中所述“靶基因”或“靶mRNA”通过微小RNA被转录后调节，基于miRNA及其靶位点之间接近极佳或极佳互补性，导致靶mRNA切割；或有限互补性，通常赋予所谓的种子序列(miRNA的核苷酸2-7)和靶位点之间的互补性，导致靶mRNA的翻译抑制。
在本发明的背景中，寡核苷酸是单链的，这指其中寡核苷酸处于不存在互补寡核苷酸的情况下的情形——即它不是双链寡核苷酸复合物，例如siRNA。在一个实施方案中，根据本发明的组合物不包括其他寡核苷酸，其与5个或更多，例如6、7、8、9或10个连续核苷酸，例如8个或更多的寡聚物具有互补性区域。
长度
令人惊讶地，已发现此种短‘抗miR’提供在体内微小RNA的改善的特异性抑制，同时保留关于微小RNA靶的显著特异性。已发现进一步利益是同时抑制几种微小RNA的能力，由于微小RNA种类之间的同源短序列的保守——例如如本文描述的种子区域。根据本发明，已发现具有7、8、9、10个核苷酸，例如7、8或9个核苷酸的短寡核苷酸是特别有利的。
序列
邻接核苷酸序列与哺乳动物、人或病毒微小RNA(miRNA)序列，优选人或病毒miRNA序列的相对应区域互补(例如100％互补——即极佳互补)。
微小RNA序列可以适当地是成熟微小RNA。在某些实施方案中，微小RNA可以是微小RNA前体。
人微小RNA序列可以选自如WO2008/046911中公开的SEQ ID No 1-558，其全部通过引用在此且特别合并。如WO2008/046911中公开的，这些微小RNA与癌症相关。
在某些实施方案中，病毒微小RNA序列可以选自单纯疱疹病毒1、卡波西肉瘤相关疱疹病毒、EB病毒和人巨细胞病毒。
在一个实施方案中，邻接核苷酸序列与选自表1中列出的miRNA的miRNA序列的相对应区域互补(例如100％互补)。表1提供了7聚体、8聚体和9聚体寡聚物，其靶向miRBase(Release 12.0-http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/)中公开的人和病毒微小RNA。
在某些实施方案中，根据本发明的寡聚物可以由邻接核苷酸序列组成或包括邻接核苷酸序列，所述邻接核苷酸序列与选自下述的相对应微小RNA序列互补：miR-1、miR-10b、miR-17-3p、miR-18、miR-19a、miR-19b、miR-20、miR-21、miR-34a、miR-93、miR-106a、miR-106b、miR-122、miR-133、miR-134、miR-138、miR-155、miR-192、miR-194、miR-221、miR-222、miR-375。
因此，在一个实施方案中，miRNA(即靶miRNA)选自miR-1、miR-10b、miR-17-3p、miR-18、miR-19a、miR-19b、miR-20、miR-21、miR-34a、miR-93、miR-106a、miR-106b、miR-122、miR-133、miR-134、miR-138、miR-155、miR-192、miR-194、miR-221、miR-222和miR-375。
在一个实施方案中，miRNA靶是miR 17-92簇的成员，例如miR17、miR 106a、miR 106b、miR 18、miR 19a、miR 19b/1、miR 19b/2、miR20/93、miR92/1、miR92/2和miR25。
在某些实施方案中，邻接核苷酸序列与选自下述的微小RNA(miRNA)序列的相对应区域互补：miR-21、miR-155、miR-221、mir-222和mir-122。
在某些实施方案中，所述miRNA选自miR-1、miR-10miR-29、miR-125b，miR-126、miR-133、miR-141、miR-143、miR-200b、miR-206、miR-208、miR-302、miR-372、miR-373、miR-375和miR-520c/e。
在某些实施方案中，邻接核苷酸序列与miR 17-92簇中存在的微小RNA(miRNA)序列的相对应区域互补，例如选自miR-17-5p、miR-20a/b、miR-93、miR-106a/b、miR-18a/b、miR-19a/b、miR-25、miR-92a、miR-363的微小RNA。
在一个实施方案中，miRNA(即靶miRNA)是miR-21，例如hsa-miR-21。在一个实施方案中，miRNA(即靶miRNA)是miR-122，例如hsa-miR-122。在一个实施方案中，miRNA(即靶miRNA)是miR-19b，例如hsa-miR-19b。在一个实施方案中，miRNA(即靶miRNA)是miR-155，例如hsa-miR-155。在一个实施方案中，miRNA(即靶miRNA)是miR-375，例如hsa-miR-375。在一个实施方案中，miRNA(即靶miRNA)是miR-375，例如hsa-miR-106b。
适当地，邻接核苷酸序列可以与微小RNA的相对应区域互补，所述微小RNA例如选自19b、21、122、155和375的hsa-miR。
种子区域和种子聚体(Seedmers)
本发明人已发现小心设计的短单链寡核苷酸显示微小RNA的显著沉默，导致减少的微小RNA水平，所述短单链寡核苷酸包括核苷酸类似物或由核苷酸类似物组成，所述核苷酸类似物例如高亲和力核苷酸类似物例如锁核酸(LNA)单位。发现所述寡核苷酸与靶微小RNA的所谓种子序列的紧密结合是重要的，所述种子序列一般是从靶微小RNA的5′末端计数的核苷酸2至8或2至7。靶微小RNA的核苷酸1是非配对碱基，并且最可能隐藏在Ago 2蛋白质的结合袋中。尽管不希望受具体理论束缚，但本发明人考虑通过选择种子区域序列，特别是具有在与种子区域互补的区域中包括LNA优选LNA单位的寡核苷酸，miRNA和寡核苷酸之间的双链体在靶miRNA中特别有效，避免脱靶效应，并且可能提供阻止RISC指导miRNA功能的进一步特征。
本发明人已发现当LNA修饰的单链寡核苷酸在3′末端处不包含与这种非配对核苷酸1相对应的核苷酸时，微小RNA沉默甚至更被增强。进一步发现在根据本发明的寡核苷酸的3′末端中的至少2个LNA单位使得所述寡核苷酸高度核酸酶抗性。
在一个实施方案中，寡聚物的第一个或第二个3′核苷酸与微小RNA序列的第二个5′核苷酸相对应，并且可以是核苷酸类似物例如LNA。
在一个实施方案中，如从寡聚物的3′末端区域测量的寡聚物的核苷酸单位1至6(包括在内)与微小RNA种子区域序列互补，并且可以都是核苷酸类似物例如LNA。
在一个实施方案中，如从寡聚物的3′末端区域测量的寡聚物的核苷酸单位1至7(包括在内)与微小RNA种子区域序列互补，并且可以都是核苷酸类似物例如LNA。
在一个实施方案中，如从寡聚物的3′末端区域测量的寡聚物的核苷酸单位2至7(包括在内)与微小RNA种子区域序列互补，并且可以都是核苷酸类似物例如LNA。
在一个实施方案中，在与miRNA种子区域互补的区域内的位置中，寡聚物包括至少一个核苷酸类似物单位，例如至少一个LNA单位。在一个实施方案中，在与miRNA种子区域互补的区域内的位置中，寡聚物可以包括1至6个或1至7个核苷酸类似物单位，例如1至6个和1至7个LNA单位。
在一个实施方案中，邻接核苷酸序列由与所述微小RNA的种子序列互补(例如100％互补)的序列组成或包括与所述微小RNA的种子序列互补(例如100％互补)的序列。
在一个实施方案中，邻接核苷酸序列由选自表1中列出的种子聚体序列中的任何一个的序列组成，或包括选自表1中列出的种子聚体序列中的任何一个的序列。
在一个实施方案中，种子聚体的3′核苷酸形成邻接核苷酸序列的最3′核苷酸，其中邻接核苷酸序列可以任选包括对于种子聚体序列5′的一个或两个其他核苷酸。
在一个实施方案中，寡聚物不包括与从5′末端计数的微小RNA序列中存在的第一个核苷酸相对应的核苷酸。
在一个实施方案中，根据本发明的寡核苷酸不包括在3′末端处与靶微小RNA的第一个5′末端核苷酸相对应的核苷酸。
核苷酸类似物
根据本发明，已发现具有7、8、9、10个核苷酸，例如7、8或9个核苷酸的短寡核苷酸是特别有利的，其中寡聚物的至少50％，例如55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或例如100％核苷酸单位是(优选高亲和力)核苷酸类似物，例如锁核酸(LNA)核苷酸单位。
在某些实施方案中，本发明的寡核苷酸长7、8或9个核苷酸，并且包括这样的邻接核苷酸序列，所述邻接核苷酸序列与人或病毒微小RNA的种子区域互补，并且其中至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如100％核苷酸是锁核酸(LNA)核苷酸单位。
在此种寡聚物中，在某些实施方案中，连接基团与磷酸二酯连接不同，例如是硫代磷酸酯连接。
在一个实施方案中，邻接核苷酸序列的所有核苷酸单位都是LNA核苷酸单位。
在一个实施方案中，邻接核苷酸序列包括7、8、9或10个，优选邻接的LNA核苷酸单位，或由7、8、9或10个，优选邻接的LNA核苷酸单位组成。
在另一个优选的实施方案中，本发明的寡核苷酸长7、8或9个核苷酸，并且包括与人或病毒微小RNA的种子区域互补的邻接核苷酸序列，并且其中至少80％核苷酸是LNA，并且其中至少80％、例如85％、例如90％、例如95％、例如100％核苷酸间键是硫代磷酸酯键。应认识到寡聚物(种子聚体)的邻接核苷酸序列可以延长超过种子区域。
在某些实施方案中，本发明的寡核苷酸长7个核苷酸，其都是LNA。
在某些实施方案中，本发明的寡核苷酸长8个核苷酸，其中多至1个核苷酸可以与LNA不同。在某些实施方案中，本发明的寡核苷酸长9个核苷酸，其中多至1或2个核苷酸可以与LNA不同。在某些实施方案中，本发明的寡核苷酸长10个核苷酸，其中1、2或3个核苷酸可以与LNA不同。不同于LNA的核苷酸可以例如是DNA，或2′取代的核苷酸类似物。
高亲和力核苷酸类似物是产生寡核苷酸的核苷酸类似物，所述寡核苷酸与互补RNA核苷酸具有比等价DNA核苷酸的结合亲和力更高的热双链体稳定性。这可以通过测量Tm进行测定。
在某些实施方案中，邻接核苷酸序列中存在的核苷酸类似物单位任选独立地选自2′-O_烷基-RNA单位、2′-OMe-RNA单位、2′-氨基-DNA单位、2′-氟-DNA单位、LNA单位、PNA单位、HNA单位、INA单位和2′MOE RNA单位。
在某些实施方案中，邻接核苷酸序列中存在的核苷酸类似物单位任选独立地选自2′-O_烷基-RNA单位、2′-OMe-RNA单位、2′-氨基-DNA单位、2′-氟-DNA单位、LNA单位和2′MOE RNA单位。
术语2′氟-DNA指在2′位置处具有对氟的取代(2′F)的DNA类似物。2′氟-DNA是优选形式的2′氟-核苷酸。
在某些实施方案中，寡聚物包括至少4个核苷酸类似物单位、例如至少5个核苷酸类似物单位、例如至少6个核苷酸类似物单位、例如至少7个核苷酸类似物单位、例如至少8个核苷酸类似物单位、例如至少9个核苷酸类似物单位、例如10个核苷酸类似物单位。
在一个实施方案中，寡聚物包括至少3个LNA单位、例如至少4个LNA单位、例如至少5个LNA单位、例如至少6个LNA单位、例如至少7个LNA单位、例如至少8个LNA单位、例如至少9个LNA单位、例如10个LNA。
在一个实施方案中，其中至少一个核苷酸类似物例如LNA单位是胞嘧啶或鸟嘌呤，例如1-10个核苷酸类似物例如LNA单位是胞嘧啶或鸟嘌呤，例如2、3、4、5、6、7、8或9个核苷酸类似物例如LNA单位是胞嘧啶或鸟嘌呤。
在一个实施方案中，至少2个核苷酸类似物例如LNA单位是胞嘧啶或鸟嘌呤。在一个实施方案中，至少3个核苷酸类似物例如LNA单位是胞嘧啶或鸟嘌呤。在一个实施方案中，至少4个核苷酸类似物例如LNA单位是胞嘧啶或鸟嘌呤。在一个实施方案中，至少5个核苷酸类似物例如LNA单位是胞嘧啶或鸟嘌呤。在一个实施方案中，至少6个核苷酸类似物例如LNA单位是胞嘧啶或鸟嘌呤。在一个实施方案中，至少7个核苷酸类似物例如LNA单位是胞嘧啶或鸟嘌呤。在一个实施方案中，至少8个核苷酸类似物例如LNA单位是胞嘧啶或鸟嘌呤。
在一个优选实施方案中，核苷酸类似物对于互补RNA核苷酸具有比等价DNA核苷酸对于所述互补RNA核苷酸的结合亲和力更高的热双链体稳定性。
在一个实施方案中，核苷酸类似物对单链寡核苷酸赋予增强的血清稳定性。
尽管序列表和表1中的具体SEQ ID指具有硫代磷酸酯(PS)主链的LNA单体的寡聚物，但应认识到本发明还包含其他核苷酸类似物和/或连接的使用，例如LNA的备选物或与LNA组合。像这样，序列表中显示的核苷酸(碱基)序列可以是LNA例如LNA/PS，LNA，或可以是包含备选主链化学，例如糖/连接化学的寡聚物，同时保留相同碱基序列(A、T、C或G)。
虽然设想其他核苷酸类似物例如2′-MOE RNA或2′-氟核苷酸在根据本发明的寡聚物中可以是有用的，但优选寡聚物具有高比例例如至少50％的LNA核苷酸。
核苷酸类似物可以是DNA类似物，例如其中2′-H基团被除-OH(RNA)外的取代而取代的DNA类似物，例如通过由-O-CH3、-O-CH2-CH2-O-CH3、-O-CH2-CH2-CH2-NH2、-O-CH2-CH2-CH2-OH或-F取代。核苷酸类似物可以是RNA类似物，例如在其2′-OH基团中例如由除-H(DNA)外的基团取代进行修饰的RNA类似物，所述基团例如-O-CH3、-O-CH2-CH2-O-CH3、-O-CH2-CH2-CH2-NH2、-O-CH2-CH2-CH2-OH或-F。在一个实施方案中，核苷酸类似物是“ENA”。
LNA
当在本文背景中使用时，术语“LNA单位”、“LNA单体”、“LNA残基”、“锁核酸单位”、“锁核酸单体”或“锁核酸残基”指二环核苷类似物。LNA单位尤其在WO 99/14226、WO 00/56746、WO 00/56748、WO 01/25248、WO 02/28875、WO 03/006475和WO 03/095467中描述。LNA单位还可以就其化学式而言进行限定。因此，如本文所使用的，
“LNA单位”具有下文方案1中所示的化学结构：
方案1
Figure GPA00001084492700231
或
Figure GPA00001084492700232
其中
X选自O、S和NRH，其中RH是H或C1-4-烷基；Y是(-CH2)r，其中r是1-4的整数；和B是含氮碱基。
在本发明的一个优选实施方案中，r是1或2，特别是1，即优选LNA单位具有下文方案2中所示的化学结构：
方案2
或
Figure GPA00001084492700234
其中X和B如上限定。
在一个有利的实施方案中，掺入本发明的寡核苷酸中的LNA单位独立地选自硫代-LNA单位、氨基-LNA单位和氧基-LNA单位。
因此，硫代-LNA单位可以具有下文方案3中所示的化学结构：
方案3
Figure GPA00001084492700235
或
Figure GPA00001084492700236
其中B如上限定。
优选地，硫代-LNA单位以其β-D-形式，即具有上文3A中所示的结构。
同样，氨基-LNA单位可以具有下文方案4中所示的化学结构：
方案4
Figure GPA00001084492700241
或
Figure GPA00001084492700242
其中B和RH如上限定。
优选地，氨基-LNA单位以其β-D-形式，即具有上文4A中所示的结构。
氧基-LNA单位可以具有下文方案5中所示的化学结构：
方案5
Figure GPA00001084492700243
或
Figure GPA00001084492700244
其中B如上限定。
优选地，氧基-LNA单位以其β-D-形式，即具有上文5A中所示的结构。如上所示，B是天然或非天然来源的含氮碱基。含氮碱基的具体例子包括腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、5-甲基胞嘧啶(MeC)、异胞嘧啶、假异胞嘧啶、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、尿嘧啶(U)、5-溴尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基-6、5-甲基噻唑尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、肌苷、2，6-二氨基嘌呤、7-丙炔-7-脱氮杂腺嘌呤、7-丙炔-7-脱氮杂鸟嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤。
术语“硫代-LNA单位”指其中方案1中的X是S的LNA单位。硫代-LNA单位可以为β-D形式和α-L形式。一般地，硫代-LNA单位的β-D形式是优选的。硫代-LNA单位的β-D形式和α-L形式在方案3中分别显示为化合物3A和3B。
术语“氨基-LNA单位”指其中方案1中的X是NH或NRH的LNA单位，其中RH是氢或C1-4-烷基。氨基-LNA单位可以为β-D形式和α-L形式。一般地，氨基-LNA单位的β-D形式是优选的。氨基-LNA单位的β-D形式和α-L形式在方案4中分别显示为化合物4A和4B。
术语“氧基-LNA单位”指其中方案1中的X是O的LNA单位。氧基-LNA单位可以为β-D形式和α-L形式。一般地，氧基-LNA单位的β-D形式是优选的。氧基-LNA单位的β-D形式和α-L形式在方案5中分别显示为化合物5A和5B。
在本文背景中，术语“C1-6-烷基”意指线性或分支的饱和烃链，其中最长的链具有1至6个碳原子，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基和己基。分支的烃链意指在任何碳处由烃链取代的C1-6-烷基。
在本文背景中，术语“C1-4-烷基”意指线性或分支的饱和烃链，其中最长的链具有1至4个碳原子，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。分支的烃链意指在任何碳处由烃链取代的C1-4-烷基。
当在本文中使用时，术语“C1-6-烷氧基”意指C1-6-烷基-氧基，例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、异戊氧基、新戊氧基和己氧基。
在本文背景中，术语“C2-6-烯基”意指具有2至6个碳原子且包含一个或多个双键的线性或分支的烃基团。C2-6-烯基的举例说明性例子包括烯丙基、同-烯丙基、乙烯基、巴豆基、丁烯基、丁二烯基、戊烯基、戊二烯基、己烯基和己二烯基。不饱和(双键)位置可以是在沿着碳链的任何位置处。
在本文背景中，术语“C2-6-炔基”意指包含2至6个碳原子且包含一个或多个三键的线性或分支的烃基团。C2-6-炔基的举例说明性例子包括乙炔、丙炔基、丁炔基、戊炔基和己炔基。不饱和(三键)位置可以是在沿着碳链的任何位置处。超过一个键可以是不饱和的，从而使得“C2-6-炔基”是如本领域技术人员已知的二炔或亚二炔(enedi-yne)。
当在本发明的背景中提及通过其相对应LNA单位取代DNA单位时，术语“相对应LNA单位”意指DNA单位已被包含与它已替换的DNA单位相同的含氮碱基的LNA单位替换，例如包含含氮碱基A的DNA单位的相对应LNA单位也包含含氮碱基A。例外是当DNA单位包含碱基C时，相对应LNA单位可以包含碱基C或碱基MeC，优选MeC。
此处，术语“非LNA单位”指不同于LNA单位的核苷，即术语“非LNA单位”包括DNA单位以及RNA单位。优选的非LNA单位是DNA单位。
术语“单位”、“残基”和“单体”在本文中可互换使用。
术语“至少一个”包括大于或等于1的整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20等等。
当关于核苷酸、试剂、LNA单位等使用时，术语“一”和“一个”意指一个或多个。特别地，表达“选自……的组分(例如核苷酸、试剂、LNA单位等)”意指可以选择一个或多个所述组分。因此，表达如“选自A、B和C的组分”意欲包括A、B和C的所有组合，即A、B、C、A+B、A+C、B+C和A+B+C。
核苷间连接
术语“核苷间连接基团”意指能够使2个核苷酸共价偶联的基团，例如在DNA单位之间、在DNA单位和核苷酸类似物之间、在2个非LNA单位之间、在非LNA单位和LNA单位之间、和在2个LNA单位之间等。例子包括磷酸酯(盐)、磷酸二酯基团和硫代磷酸酯基团。
在某些实施方案中，寡聚物中的至少一个例如所有的核苷间连接是磷酸二酯。然而，对于在体内的用途，硫代磷酸酯连接是优选的。
寡核苷酸中的一般核苷间连接基团是磷酸酯(盐)基团，但这些可以被不同于磷酸盐的核苷间连接基团替换。在本发明的另一个有利的实施方案中，本发明的寡核苷酸在其核苷间连接基团结构中进行修饰，即经修饰的寡核苷酸包括不同于磷酸盐的核苷间连接基团。因此，在一个优选实施方案中，根据本发明的寡核苷酸包括不同于磷酸盐的至少一个核苷间连接基团。
不同于磷酸盐(-O-P(O)2-O-)的核苷间连接基团的具体例子包括-O-P(O，S)-O-、-O-P(S)2-O-、-S-P(O)2-O-、-S-P(O，S)-O-、-S-P(S)2-O-、-O-P(O)2-S-、-O-P(O，S)-S-、-S-P(O)2-S-、-O-PO(RH)-O-、O-PO(OCH3)-O-、-O-PO(NRH)-O-、-O-PO(OCH2CH2S-R)-O-、-O-PO(BH3)-O-、-O-PO(NHRH)-O-、-O-P(O)2-NRH-、-NRH-P(O)2-O-、-NRH-CO-O-、-NRH-CO-NRH-、-O-CO-O-、-O-CO-NRH-、-NRH-CO-CH2-、-O-CH2-CO-NRH-、-O-CH2-CH2-NRH-、-CO-NRH-CH2-、-CH2-NRH-CO-、-O-CH2-CH2-S-、-S-CH2-CH2-O-、-S-CH2-CH2-S-、-CH2-SO2-CH2-、-CH2-CO-NRH-、-O-CH2-CH2-NRH-CO-、-CH2-NCH3-O-CH2-，其中RH是氢或C1-4-烷基。
当修饰核苷间连接基团时，核苷间连接基团优选是硫代磷酸酯基团(-O-P(O，S)-O-)。在一个优选实施方案中，根据本发明的寡核苷酸的所有核苷间连接基团是硫代磷酸酯。
核苷连接可以选自：-O-P(O)2-O-、-O-P(O，S)-O-、-O-P(S)2-O-、-S-P(O)2-O-、-S-P(O，S)-O-、-S-P(S)2-O-、-O-P(O)2-S-、-O-P(O，S)-S-、-S-P(O)2-S-、-O-PO(RH)-O-、O-PO(OCH3)-O-、-O-PO(NRH)-O-、-O-PO(OCH2CH2S-R)-O-、-O-PO(BH3)-O-、-O-PO(NHRH)-O-、-O-P(O)2-NRH-、-NRH-P(O)2-O-、-NRH-CO-O-、-NRH-CO-NRH-，和/或核苷间连接可以选自：-O-CO-O-、-O-CO-NRH-、-NRH-CO-CH2-、-O-CH2-CO-NRH-、-O-CH2-CH2-NRH-、-CO-NRH-CH2-、-CH2-NRH-CO-、-O-CH2-CH2-S-、-S-CH2-CH2-O-、-S-CH2-CH2-S-、-CH2-SO2-CH2-、-CH2-CO-NRH-、-O-CH2-CH2-NRH-CO-、-CH2-NCH3-O-CH2-，其中RH选自氢和C1-4-烷基。适当地，在某些实施方案中，如上文提供的包含硫(S)的核苷间连接是优选的。核苷间连接可以独立地选择，或所有都是相同的，例如硫代磷酸酯连接。
在一个实施方案中，邻接核苷酸序列的核苷酸单位之间存在的至少75％，例如80％或85％或90％或95％或所有核苷间连接是硫代磷酸酯核苷间连接。
靶向超过一个微小RNA的微小聚体寡核苷酸
在一个实施方案中，邻接核苷酸序列与至少2个miRNA序列例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个miRNA序列的相对应序列互补。单个通用碱基的使用可以允许本发明的单个寡聚物靶向2个独立的微小RNA，一个或两个所述微小RNA在其中通用核苷酸定位的位置处与寡聚物相对应的区域中具有单个错配。
在一个实施方案中，邻接核苷酸序列由这样的序列组成或包括这样的序列，所述序列与至少2个miRNA种子区域序列，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个miRNA种子区域序列的序列互补。
在一个实施方案中，邻接核苷酸序列与miR-221和miR-222两者的相对应区域互补。
在一个实施方案中，邻接核苷酸序列与miR-17-92簇的超过一个成员的相对应区域互补——例如miR-17-5p、miR-20a/b、miR-93、miR-106a/b中的2个或更多个或所有；miR-25、miR-92a和miR-363中的2个或更多个或所有。
在一个实施方案中，邻接核苷酸序列由与5′GCTACAT3′互补的序列组成或包括与5′GCTACAT3′互补的序列。
寡聚物设计
在一个实施方案中，根据本发明的寡聚物从3′末端计数的第一个核苷酸是核苷酸类似物，例如LNA单位。在一个实施方案中，其可以是相同或不同的，根据本发明的寡聚物从3′末端计数的最后一个核苷酸是核苷酸类似物，例如LNA单位。
在一个实施方案中，根据本发明的寡聚物从3′末端计数的第二个核苷酸是核苷酸类似物，例如LNA单位。
在一个实施方案中，根据本发明的寡聚物从3′末端计数的第九个和/或第十个核苷酸是核苷酸类似物，例如LNA单位。
在一个实施方案中，根据本发明的寡聚物从3′末端计数的第九个核苷酸是核苷酸类似物，例如LNA单位。
在一个实施方案中，根据本发明的寡聚物从3′末端计数的第十个核苷酸是核苷酸类似物，例如LNA单位。
在一个实施方案中，根据本发明的寡聚物从3′末端计数的第九个和第十个核苷酸是核苷酸类似物，例如LNA单位。
在一个实施方案中，根据本发明的寡聚物不包括超过3个连续DNA核苷酸单位的区域。在一个实施方案中，根据本发明的寡聚物不包括超过2个连续DNA核苷酸单位的区域。
在一个实施方案中，寡聚物至少包括由至少2个连续核苷酸类似物单位，例如至少2个连续LNA单位组成的区域。
在一个实施方案中，寡聚物至少包括由至少3个连续核苷酸类似物单位，例如至少3个连续LNA单位组成的至少区域。
寡聚物中的核苷酸类似物例如LNA的其他模式
虽然设想包含至少6个LNA例如至少7个核苷酸单位的寡聚物可以是优选的，但此种短寡聚物在体内靶向微小RNA方面高度有效的发现可以用于制备本发明的更短寡聚物，其包括其他核苷酸类似物，例如高亲和力核苷酸类似物。事实上，LNA与其他高亲和力核苷酸类似物的组合视为本发明的部分。
在从3′末端计数的位置1至2中的核苷酸修饰。在位置1和/或2处的核苷酸可以是核苷酸类似物，例如高亲和力核苷酸类似物，例如LNA，或选自2′-O-烷基-RNA单位、2′-OMe-RNA单位、2′-氨基-DNA单位、2′-氟-DNA单位、2′-MOE-RNA单位、LNA单位、PNA单位、HNA单位、INA单位的核苷酸类似物。2个3′核苷酸因此可以是Xx、xX、XX或xx，其中：在一个实施方案中，X是LNA，并且x是DNA或另一个核苷酸类似物，例如如选自2′-O_烷基-RNA单位、2′-OMe-RNA单位、2′-氨基-DNA单位、2′-氟-DNA单位、LNA和2′MOE RNA单位的2′取代的核苷酸类似物。所述非LNA单位(x)因此可以是2′MOE RNA或2′-氟-DNA。备选地，X是核苷酸类似物，并且x是DNA。
在2个3′末端核苷酸处的上述修饰可以与在从3′末端计数的位置3-8中的核苷酸修饰相组合，如下所述。在这个方面，命名为X和x的核苷酸在寡聚物中自始至终可以是相同的。应当指出当寡聚物长度仅是7个核苷酸时，应弃去从3′末端计数的第8个核苷酸。在涉及从3′末端计数的位置3至8中的核苷酸修饰的下述实施方案中，在一个实施方案中，LNA单位可以被其他核苷酸类似物例如本文提及的那些替换。“X”因此可以选自2′-O-烷基-RNA单位、2′-OMe-RNA单位、2′-氨基-DNA单位、2′-氟-DNA单位、2′-MOE-RNA单位、LNA单位、PNA单位、HNA单位、INA单位。“x”优选是DNA或RNA，最优选DNA。然而，X优选是LNA。
在本发明的一个实施方案中，本发明的寡核苷酸在从3′末端计数的位置3至8中进行修饰。这个序列的设计可以通过存在的非LNA单位数目或通过存在的LNA单位数目进行限定。在前者的一个优选实施方案中，在从3′末端计数的位置3至8中的至少一个例如一个核苷酸是非LNA单位。在另一个实施方案中，在从3′末端计数的位置3至8中的至少2个例如2个核苷酸是非LNA单位。在另外一个实施方案中，在从3′末端计数的位置3至8中的至少3个例如3个核苷酸是非LNA单位。在另外一个实施方案中，在从3′末端计数的位置3至8中的至少4个例如4个核苷酸是非LNA单位。在另一个的实施方案中，在从3′末端计数的位置3至8中的至少5个例如5个核苷酸是非LNA单位。在另外另一个的实施方案中，在从3′末端计数的位置3至8中的所有6个核苷酸是非LNA单位。
在一个实施方案中备选限定的，根据本发明的寡核苷酸在从3′末端计数的位置3至8中包括至少3个LNA单位。在其一个实施方案中，根据本发明的寡核苷酸在从3′末端计数的位置3至8中包括3个LNA单位。关于在从3′末端计数的位置3至8中的核苷酸取代模式可以选自XXXxxx、xXXXxx、xxXXXx、xxxXXX、XXxXxx、XXxxXx、XXxxxX、xXXxXx、xXXxxX、xxXXxX、XxXXxx、XxxXXx、XxxxXX、xXxXXx、xXxxXX、xxXxXX、xXxXxX和XxXxXx，其中“X”指LNA单位，和“x”指非LNA单位。在一个优选实施方案中，关于在从3′末端计数的位置3至8中的核苷酸取代模式选自XXxXxx、XXxxXx、XXxxxX、xXXxXx、xXXxxX、xxXXxX、XxXXxx、XxxXXx、XxxxXX、xXxXXx、xXxxXX、xxXxXX、xXxXxX和XxXxXx，其中“X”指LNA单位，和“x”指非LNA单位。在一个更优选的实施方案中，关于在从3′末端计数的位置3至8中的核苷酸取代模式选自xXXxXx、xXXxxX、xxXXxX、xXxXXx、xXxxXX、xxXxXX和xXxXxX，其中“X”指LNA单位，和“x”指非LNA单位。在一个实施方案中，关于在从3′末端计数的位置3至8中的核苷酸取代模式是xXxXxX或XxXxXx，其中“X”指LNA单位，和“x”指非LNA单位。在一个实施方案中，关于在从3′末端计数的位置3至8中的核苷酸取代模式是xXxXxX，其中“X”指LNA单位，和“x”指非LNA单位。
在另一个的实施方案中，根据本发明的寡核苷酸在从3′末端计数的位置3至8中包括至少4个LNA单位。在其一个实施方案中，根据本发明的寡核苷酸在从3′末端计数的位置3至8中包括4个LNA单位。关于在从3′末端计数的位置3至8中的核苷酸取代模式可以选自xxXXXX、xXxXXX、xXXxXX、xXXXxX、xXXXXx、XxxXXX、XxXxXX、XxXXxX、XxXXXx、XXxxXX、XXxXxX、XXxXXx、XXXxxX、XXXxXx和XXXXxx，其中“X”指LNA单位，和“x”指非LNA单位。
在另外另一个的实施方案中，根据本发明的寡核苷酸在从3′末端计数的位置3至8中包括至少5个LNA单位。在其一个实施方案中，根据本发明的寡核苷酸在从3′末端计数的位置3至8中包括5个LNA单位。关于在从3′末端计数的位置3至8中的核苷酸取代模式可以选自xXXXXX、XxXXXX、XXxXXX、XXXxXX、XXXXxX和XXXXXx，其中“X”指LNA单位，和“x”指非LNA单位。
优选地，根据本发明的寡核苷酸在从3′末端计数的位置3至8中包括1个或2个LNA单位。这对于通过寡核苷酸：微小RNA双链体——类似结构中的RNA：RNA双链体的双链体——形成的A-螺旋的稳定性视为有利的。
在另外另一个的实施方案中，根据本发明的寡核苷酸在从3′末端计数的位置3至8中包括至少6个LNA单位。在其一个实施方案中，根据本发明的寡核苷酸在从3′末端计数的位置3至8中包括3至6个LNA单位，以及此外在相同区域中零至3个其他高亲和力核苷酸类似物，从而使得高亲和力核苷酸类似物(包括LNA单位)总量在从3′末端计数的位置3至8中的区域中总计6。
在某些实施方案中，例如当X是LNA时，所述非LNA单位(x)是另一个核苷酸类似物单位，例如选自2′-O_烷基-RNA单位、2′-OMe-RNA单位、2′-氨基-DNA单位、2′-氟-DNA单位、LNA和2′MOE RNA单位的2′取代的核苷酸类似物。所述非LNA单位(x)因此可以是2′MOE RNA或2′-氟-DNA。
对于具有9个或10个核苷酸的寡聚物，在位置9和/或10处的核苷酸可以是核苷酸类似物，例如高亲和力核苷酸类似物，例如LNA，或选自2′-O-烷基-RNA单位、2′-OMe-RNA单位、2′-氨基-DNA单位、2′-氟-DNA单位、2′-MOE-RNA单位、LNA单位、PNA单位、HNA单位、I NA单位的核苷酸类似物。2个5′核苷酸因此可以是Xx、xX、XX或xx，其中：在一个实施方案中，X是LNA，和x是DNA或另一个核苷酸类似物，例如选自2′-O_烷基-RNA单位、2′-OMe-RNA单位、2′-氨基-DNA单位、2′-氟-DNA单位、LNA和2′MOE RNA单位的2′取代的核苷酸类似物。所述非LNA单位(x)因此可以是2′MOE RNA或2′-氟-DNA。备选地，X是核苷酸类似物，和x是DNA。
在2个5′末端核苷酸处的上述修饰可以与在从3′末端计数的位置3至8中的核苷酸，和/或如上所述的2个3′核苷酸修饰相组合。在这个方面，命名为X和x的核苷酸在寡聚物中自始至终可以是相同的。
在本发明的一个优选实施方案中，根据本发明的寡核苷酸在5′末端处包含LNA单位。在另一个优选实施方案中，根据本发明的寡核苷酸在从5′末端计数的前2个位置处包含LNA单位。
在一个实施方案中，本发明进一步提供了如在本发明的药物组合物的上下文中描述或用于在生物体中在体内使用的寡聚物，例如药物，其中所述寡聚物(或邻接核苷酸序列)包括
i)至少一个硫代磷酸酯连接和/或
ii)至少一个3′末端LNA单位，和/或
iii)至少一个5′末端LNA单位。
寡聚物因此可以包含至少一个硫代磷酸酯连接，例如所有连接都是硫代磷酸酯，以及至少一个3′末端LNA单位和至少一个5′末端LNA单位。
对于大多数治疗用途优选寡核苷酸完全是硫代磷酸酯化的——例外是对于用于在CNS中例如在大脑或脊柱中(在其中硫代磷酸酯化可以是毒性的)使用的治疗性寡核苷酸，并且由于不存在核酸酶，甚至在连续DNA单位之间可以使用磷酸二酯键。
如本文提及的，在根据本发明的寡核苷酸的一个方面中其他是第二个3′核苷酸、和/或第9个和/或第10个(从3′末端起)(如果存在)也可以是LNA。
在一个实施方案中，在与miRNA种子区域互补的位置中，寡聚物包括至少5个核苷酸类似物单位，例如至少5个LNA单位。
在一个实施方案中，与微小RNA种子区域的序列互补的寡聚物的核苷酸序列选自(X)xXXXXX、(X)XxXXXX、(X)XXxXXX、(X)XXXxXX、(X)XXXXxX和(X)XXXXXx，其中“X”指核苷酸类似物，例如LNA单位，(X)指任选的核苷酸类似物，例如LNA单位，和“x”指DNA或RNA核苷酸单位。
在一个实施方案中，在与miRNA种子区域互补的位置中，寡聚物包括6个或7个核苷酸类似物单位，例如6个或7个LNA单位。
在一个实施方案中，与微小RNA种子区域的序列互补的寡聚物的核苷酸序列选自XXXXXX、XxXXXXX、XXxXXXX、XXXxXXX、XXXXxXX、XXXXXxX和XXXXXXx，其中“X”指核苷酸类似物，例如LNA单位，例如LNA单位，和“x”指DNA或RNA核苷酸单位。
在一个实施方案中，在从寡聚物的3′末端计数的位置7至8处的2个核苷酸基序选自xx、XX、xX和Xx，其中“X”指核苷酸类似物，例如LNA单位，例如LNA单位，和“x”指DNA或RNA核苷酸单位。
在一个实施方案中，在从寡聚物的3′末端计数的位置7至8处的2个核苷酸基序选自XX、xX和Xx，其中“X”指核苷酸类似物，例如LNA单位，例如LNA单位，和“x”指DNA或RNA核苷酸单位。
在一个实施方案中，寡聚物包括12个核苷酸，并且其中在从寡聚物的3′末端计数的位置11至12处的2个核苷酸基序选自xx、XX、xX和Xx，其中“X”指核苷酸类似物，例如LNA单位，例如LNA单位，和“x”指DNA或RNA核苷酸单位。
在一个实施方案中，寡聚物包括12个核苷酸，并且其中在从寡聚物的3′末端计数的位置11至12处的2个核苷酸基序选自XX、xX和Xx，其中“X”指核苷酸类似物，例如LNA单位，例如LNA单位，和“x”指DNA或RNA核苷酸单位，例如DNA单位。
在一个实施方案中，寡聚物在5′末端处包括核苷酸类似物单位，例如LNA单位。
在一个实施方案中，核苷酸类似物单位例如X独立地选自：2′-O-烷基-RNA单位、2′-OMe-RNA单位、2′-氨基-DNA单位、2′-氟-DNA单位、2′-MOE-RNA单位、LNA单位、PNA单位、HNA单位、INA单位。
在一个实施方案中，本发明的寡聚物的所有核苷酸是核苷酸类似物单位。
在一个实施方案中，核苷酸类似物单位例如X独立地选自：2′-OMe-RNA单位、2′-氟-DNA单位和LNA单位，
在一个实施方案中，寡聚物包括所述至少一个LNA类似物单位和除LNA外的至少另一个的核苷酸类似物单位。
在一个实施方案中，一个或多个非LNA核苷酸类似物单位独立地选自2′-OMe RNA单位和2′-氟DNA单位。
在一个实施方案中，寡聚物由至少一个序列XYX或YXY组成，其中X是LNA，和Y是或者2′-OMe RNA单位和2′-氟DNA单位。
在一个实施方案中，寡聚物的核苷酸序列由二选一的X和Y单位组成。
在一个实施方案中，寡聚物包括交替LNA和DNA单位(Xx)或(xX)。在一个实施方案中，寡聚物包括随后为2个DNA单位的交替LNA基序(Xxx)、xXx或xxX。
在一个实施方案中，在选自在上文提交的任何一个实施方案中鉴定为LNA核苷酸单位的位置的位置中，至少一个DNA或非LNA核苷酸类似物单位被LNA核苷酸替换。在一个实施方案中，“X”指LNA单位。
关于本发明的寡聚物的进一步设计
下表1提供了可以有利地被本发明的寡核苷酸靶向的短微小RNA序列的非限制性例子。
在一个实施方案中，根据本发明的寡核苷酸，例如表1中公开的那些，可以具有7、8、9或10个LNA核苷酸的序列5′-3′LLLLLLL(L)(L)(L)(L)，或具有选自下述基序的前7、8、9或10个核苷酸的核苷酸序列：
LdLddL(L)(d)(d)(L)(d)(L)(d)(L)(L)、LdLdLL(L)(d)(d)(L)(L)(L)(d)(L)(L)、LMLMML(L)(M)(M)(L)(M)(L)(M)(L)(L)、LMLMLL(L)(M)(M)(L)(L)(L)(M)(L)(L)、LFLFFL(L)(F)(F)(L)(F)(L)(F)(L)(L)、LFLFLL(L)(F)(F)(L)(L)(L)(F)(L)(L)、并且每第三个设计例如；LddLdd(L)(d)(d)(L)(d)(d)(L)(d)(d)(L)(d)′dLddLd(d)(L)(d)(d)(L)(d)(d)(L)(d)(d)(L)、ddLddL(d)(d)(L)(d)(d)(L)(d)(d)(L)(d)(d)、LMMLMM(L)(M)(M)(L)(M)(M)(L)(M)(M)(L)(M)、MLMMLM(M)(L)(M)(M)(L)(M)(M)(L)(M)(M)(L)、MMLMML(M)(M)(L)(M)(M)(L)(M)(M)(L)(M)(M)、LFFLFF(L)(F)(F)(L)(F)(F)(L)(F)(F)(L)(F)、FLFFLF(F)(L)(F)(F)(L)(F)(F)(L)(F)(F)(L)、FFLFFL(F)(F)(L)(F)(F)(L)(F)(F)(L)(F)(F)和dLdLdL(d)(L)(d)(L)(d)(L)(d)(L)(d)(L)(d)并且每第二个设计，例如；LdLdLd(L)(d)(L)(d)(L)(d)(L)(d)(L)(d)(L)、MLMLML(M)(L)(M)(L)(M)(L)(M)(L)(M)(L)(M)、LMLMLM(L)(M)(L)(M)(L)(M)(L)(M)(L)(M)(L)、FLFLFL(F)(L)(F)(L)(F)(L)(F)(L)(F)(L)(F)和LFLFLF(L)(F)(L)(F)(L)(F)(L)(F)(L)(F)(L)；其中L＝LNA单位，d＝DNA单位，M＝2′MOE RNA，F＝2′氟，并且括号中的残基是任选的。
药物组合物和医学应用
本发明提供了包括根据本发明的寡聚物和药学上可接受的稀释剂、载体、盐或佐剂的药物组合物。
本发明进一步提供了根据本发明的寡核苷酸，例如可以构成药物组合物的部分的那些，在制造用于治疗疾病或医学病症的药物中的用途，所述疾病或医学病症与微小RNA的存在或过表达(上调)相关。
本发明进一步提供了用于治疗与微小RNA的存在或过表达相关的疾病或医学病症的方法，其包括给需要治疗的个人施用根据本发明的组合物(例如药物组合物)的步骤。
本发明进一步提供了用于减少细胞或生物体中的miRNA有效量的法，其包括给细胞或生物体施用根据本发明的组合物(例如药物组合物)或根据本发明的寡聚物。在这个背景中减少有效量指细胞或生物体中存在的功能miRNA减少。应认识到根据本发明的优选寡核苷酸可能不一定显著减少细胞或生物体中miRNA的实际量，因为它们一般与其miRNA靶形成非常稳定的双链体。在一个实施方案中，细胞中miRNA有效量的减少可以通过检测细胞中miRNA的靶的去阻遏水平进行测量。
本发明进一步提供了用于细胞或生物体中miRNA的靶mRNA去阻遏的方法，其包括给细胞或生物体施用根据本发明的组合物(例如药物组合物)或寡聚物。
本发明进一步提供了长度为7-10个例如7、8、9或10个核苷酸的寡聚物在制造用于治疗疾病或医学病症的药物中的用途，所述疾病或医学病症与微小RNA的存在或过表达相关。
在一个实施方案中，医学病状(或疾病)是丙型肝炎(HCV)，并且miRNA是miR-122。
在一个实施方案中，根据本发明的药物组合物用于在治疗选自下述的医学病症或疾病中使用：丙型肝炎病毒感染以及高胆固醇血症和相关病症、以及癌症。
在一个实施方案中，医学病状或疾病是CNS疾病，例如其中已知一种或多种微小RNA指示的CNS疾病。
在高胆固醇血症的背景中，相关病症指诸如动脉粥样硬化或高脂血症的疾病。相关疾病的进一步例子还包括不同类型的HDL/LDL胆固醇失调；血脂异常例如家族性混合性高脂血症(FCHL)、获得性高脂血症、抑制素抗性高胆固醇血症；冠状动脉疾病(CAD)冠心病(CHD)、动脉粥样硬化。
在一个实施方案中，根据本发明的药物组合物进一步包括第二种独立活性成分，其为VLDL装配途径的抑制剂，例如ApoB抑制剂，或MTP抑制剂(例如公开于通过引用并入本文的US 60/977,497中的那些)。
本发明进一步提供了用于治疗与微小RNA的存在或过表达相关的疾病或医学病症的方法，其包括给需要治疗的个人施用组合物(例如药物组合物)的步骤，所述组合物包括长度为7-10个例如7、8、9或10个核苷酸的寡聚物。
本发明进一步提供了用于减少细胞或生物体中的miRNA靶(即“有效”miRNA)有效量的方法，其包括给细胞或生物体施用组合物(例如药物组合物)，所述组合物包括长度67-10个例如7、8、9或10个核苷酸的寡聚物。
应认识到细胞或生物体中一种或多种微小RNA的“有效量减少”指细胞或生物体中对微小RNA功能的抑制。细胞优选是表达微小RNA或微小RNA的哺乳动物细胞或人细胞。
本发明进一步提供了用于细胞或生物体中miRNA的靶mRNA去阻遏的方法，其包括给细胞或生物体长度为7-10个例如7、8、9或10个核苷酸的寡聚物、或(或包括所述寡核苷酸的组合物)。
如上所述，微小RNA涉及许多疾病。因此，本发明的第四个方面涉及如本文限定的寡核苷酸在制造用于治疗疾病的药物中的用途，所述疾病与微小RNA表达相关，选自脊髓性肌萎缩、图雷特氏(Tourette′s)综合征、丙型肝炎、脆性X智力低下、迪乔治(DiGeorge)综合征和癌症，例如在非限制性例子中，慢性淋巴细胞性白血病、乳腺癌、肺癌和结肠癌，特别是癌症。
合成方法
本发明进一步提供了用于合成靶向针对人微小RNA的寡聚物的方法，例如本文描述的寡聚物，所述方法包括步骤：
a.任选地选择从3′末端计数的第一个核苷酸，其是核苷酸类似物，例如LNA核苷酸。
b.任选地选择从3′末端计数的第二个核苷酸，其是核苷酸类似物，例如LNA核苷酸。
c.选择与miRNA种子区域相对应的寡聚物的区域，其中所述区域如本文限定。
d.选择如本文限定的第七个和任选地八个核苷酸。
e.任选地选择寡聚物的一个或两个其他5′末端如本文限定的；
其中通过步骤a-e中限定的区域的顺次合成来进行合成，其中可以以3′-5′(a至f)或5′-3′(e至a)方向进行所述合成，并且其中所述寡聚物与miRNA靶的序列互补。
本发明进一步提供了用于制备寡聚物(例如根据本发明的寡聚物)的方法，所述方法包括步骤a)比较2个或更多个miRNA序列的序列，以鉴定2个或更多个miRNA序列，其包括长度至少7个核苷酸，例如长度为7、8、9或10个核苷酸的共同邻接核苷酸序列(即在2个非等同miRNA中发现的序列)，b)制备由邻接核苷酸序列组成或包括邻接核苷酸序列的寡聚物序列，所述邻接核苷酸序列与所述共同邻接核苷酸序列互补，其中所述寡聚物是如根据本发明的寡聚物。在一个优选例子中，共同邻接核苷酸序列由所述2个或更多个miRNA序列各自的种子区域组成，或包括所述2个或更多个miRNA序列各自的种子区域(其包括长度至少6个核苷酸的共同邻接核苷酸序列)。在一个实施方案中，2个或更多个miRNA的种子区域是等同的。适当地，寡聚物由长度为7或8个核苷酸的种子聚体序列组成，或包括长度为7或8个核苷酸的种子聚体序列，所述种子聚体序列包括与所述2个或更多个miRNA互补的序列。这种方法可以与上述方法的步骤c结合使用。
用于合成根据本发明的寡聚物的方法可以使用标准固相寡核苷酸合成来执行。
在一个实施方案中，用于合成靶向针对人微小RNA的寡聚物的方法以3′至5′方向a-e执行。
本发明的另一个方面是通过使靶微小RNA与如本文限定的寡核苷酸接触，减少靶微小RNA水平的方法，其中寡核苷酸(i)与靶微小RNA序列互补(ii)在3′末端处不包含与靶微小RNA的第一个5′末端核苷酸相对应的核苷酸。
双链体稳定性和Tm
在一个实施方案中，本发明的寡聚物能够由磷酸二酯核苷间连接与互补单链RNA核酸分子(一般具有所述单链寡核苷酸的大约相同长度)形成双链体，其中双链体具有30℃至70℃或80℃、例如30℃至60℃或70℃、或30℃至50℃或60℃的Tm。在一个实施方案中，Tm是至少40℃。可以通过在下述缓冲条件下测定寡聚物和互补RNA靶的Tm来测定Tm：100mM NaCl、0.1mM EDTA、10mM Na-磷酸盐，pH 7.0(关于详细方案参见实施例)。高亲和力类似物可以定义为这样的类似物，当在本发明的寡聚物中使用时，与仅包含DNA碱基的等同寡聚物相比较，其导致寡聚物的Tm中的增加。
缀合物
在一个实施方案中，所述寡聚物与一种或多种非核苷酸(或多核苷酸)化合物缀合。
在上下文中，术语“缀合物”意指通过如本文描述的寡聚物与一种或多种非核苷酸或非多核苷酸部分的共价附着(“缀合”)形成的异源分子。非核苷酸或非多核苷酸部分的例子包括大分子试剂例如蛋白质、脂肪酸链、糖残基、糖蛋白、聚合物或其组合。一般地蛋白质可以是关于靶蛋白的抗体。一般的聚合物可以是聚乙二醇。
因此，在各种实施方案中，本发明的寡聚物可以包括多核苷酸区域，其一般由核苷酸的邻接序列和其他非核苷酸区域组成。当提及由邻接核苷酸序列组成的本发明的寡聚物时，化合物可以包括非核苷酸组分，例如缀合物组分。
在本发明的各种实施方案中，寡聚化合物与配体/缀合物连接，所述配体/缀合物可以用于例如增加寡聚化合物的细胞摄取。通过引用并入本文的WO2007/031091提供了合适的配体和缀合物。
本发明还提供了这样的缀合物，其包括如本文描述的根据本发明的化合物、和与所述化合物共价附着的至少一个非核苷酸或非多核苷酸部分。因此，在其中本发明的化合物由特定核酸或核苷酸序列组成的各种实施方案中，如本文公开的，化合物还可以包括与所述化合物共价附着的至少一个非核苷酸或非多核苷酸部分(例如不包括一个或多个核苷酸或核苷酸类似物)。
缀合(至缀合物部分)可以增强本发明的寡聚物的活性、细胞分布或细胞摄取。此种部分包括但不限于抗体、多肽、脂质部分例如胆固醇部分、胆酸、硫醚例如己基-s-三苯甲硫醇、巯基胆固醇、脂肪族链例如十二烷二醇或十一烷残基、磷脂例如二-十六烷-rac-甘油或三乙胺1，2-二-o-十六烷-rac-甘油-3-h-膦酸酯、聚胺或聚乙二醇链、金刚烷乙酸、棕榈基部分、十八胺或己氨基-羰基-羟胆甾醇部分。
本发明的寡聚物还可以与活性药物物质缀合，所述活性药物物质例如阿司匹林、布洛芬、磺胺药、抗糖尿病药、抗菌剂或抗生素。
在特定实施方案中，缀合部分是类固醇例如胆固醇。
在各种实施方案中，缀合部分包括带正电聚合物或由带正电聚合物组成，例如长度为1-50个、例如2-20个例如3-10个氨基酸残基的带正电肽，和/或聚烯烃氧化物例如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇——参见通过引用并入本文的WO 2008/034123。适当地带正电聚合物例如聚烯烃氧化物可以经由接头附着至本发明的寡聚物，所述接头例如WO 2008/034123中描述的可释放接头。
例如，下述缀合物部分可以在本发明的缀合物中使用：
Figure GPA00001084492700411
活化的寡聚物
如本文所使用的，术语“活化的寡聚物”指与至少一个功能部分共价连接(即官能化)的本发明的寡聚物，所述功能部分允许寡聚物与一个或多个缀合部分的共价连接，所述缀合部分即其自身不是核酸或单体的部分，以形成本文描述的缀合物。一般地，功能部分将包含这样的化学基团，其能够经由例如腺嘌呤碱基的3′-羟基或环外NH2基团与寡聚物共价键合，优选是能够与缀合部分结合的亲水和末端基团的间隔物(例如，氨基、巯基或羟基)。在某些实施方案中，这个末端基团不是被保护的，例如是NH2基团。在其他实施方案中，末端基团例如通过任何合适的保护基团进行保护，例如通过Theodora WGreene和Peter G M Wuts在“Protective Groups in OrganicSynthesis”第3版(John Wiley & Sons，1999)中描述的那些。合适羟基保护基团的例子包括酯例如乙酸酯、芳烷基例如苄基、二苯甲基或三苯甲基和四氢吡喃基。合适氨基保护基团的例子包括苄基、α-甲苄基、二苯甲基、三苯甲基、苄氧羰基、叔丁氧基羰基和酰基例如三氯乙酰基或三氟乙酰基。在某些实施方案中，功能部分是自切割的。在其他实施方案中，功能部分是生物可降解的。参见例如通过引用整体合并入本文的美国专利号7,087,229。
在某些实施方案中，本发明的寡聚物在其5′末端处进行官能化，以便允许缀合部分与寡聚物的5′末端的共价附着。在其他实施方案中，本发明的寡聚物在3′末端处进行官能化。在另外其他的实施方案中，本发明的寡聚物可以沿着主链或在杂环碱基部分上进行官能化。在另外其他的实施方案中，本发明的寡聚物可以在独立地选自5′末端、3′末端、主链和碱基的超过一个位置处进行官能化。
在某些实施方案中，本发明的活化的寡聚物通过在合成过程中掺入一个或多个单体来合成，所述一个或多个单体与功能部分共价附着。在其他实施方案中，本发明的活化的寡聚物用未官能化的单体合成，并且寡聚物在合成结束时进行官能化。在某些实施方案中，寡聚物用包含氨基烷基接头的受阻碍酯进行官能化，其中烷基部分具有式(CH2)w，其中w是1至10优选约6的整数，其中烷氨基的烷基部分可以是直链或支链，并且其中官能团经由酯基团(-O-C(O)-(CH2)wNH)与寡聚物附着。
在其他实施方案中，寡聚物用包含(CH2)w-巯基(SH)接头的受阻碍酯进行官能化，其中w是1至10优选约6的整数，其中烷氨基的烷基部分可以是直链或支链，并且其中官能团经由酯基团(-O-C(O)-(CH2)wSH)与寡聚物附着。
在某些实施方案中，巯基-活化的寡核苷酸与聚合物部分例如聚乙二醇或肽(经由二硫键形成)缀合。
如上所述包含受阻碍酯的活化的寡聚物可以通过本领域已知的任何方法进行合成，并且特别是通过PCT公开号WO 2008/034122和其中实施例中公开的方法，所述专利通过引用整体合并入本文。
在另外其他的实施方案中，本发明的寡聚物通过将巯基、氨基或羟基引入寡聚物内进行官能化，借助于基本上如美国专利号4,962,029和4,914,210中描述的官能化试剂，即在一个末端处具有通过亲水间隔物链与相对末端连接的亚磷酰胺的基本上线性的试剂，所述相对末端包括保护或未保护巯基、氨基或羟基。此种试剂主要与寡聚物的羟基反应。在某些实施方案中，此种活化的寡聚物具有与寡聚物的5′-羟基偶联的官能化试剂。在其他实施方案中，活化的寡聚物具有与3′-羟基偶联的官能化试剂。在另外其他的实施方案中，本发明的活化的寡聚物具有与寡聚物的主链上的羟基偶联的官能化试剂。在再进一步的实施方案中，本发明的寡聚物用如美国专利号4,962,029和4,914,210中描述的超过一种官能化试剂进行官能化，所述专利通过引用整体合并入本文。合成此种官能化试剂且将它们掺入单体或寡聚物内的方法公开于美国专利号4,962,029和4,914,210中。
在某些实施方案中，固相结合寡聚物的5′末端用二烯基亚磷酰胺衍生物进行官能化，随后是经由Diels-Alder环化加成反应去保护寡聚物与例如氨基酸或肽的缀合。
在各种实施方案中，包含2′-糖修饰的单体例如2′-氨基甲酸酯取代的糖或2′-(O-戊基-N-邻苯二甲酰亚氨基)-脱氧核糖掺入寡聚物内促进缀合的部分与寡聚物的糖的共价附着。在其他实施方案中，使用试剂制备在一个或多个单体的2′位置处具有含氨基接头的寡聚物，所述试剂例如5′-二甲氧三苯甲基-2′-O-(e-邻苯二甲酰亚氨基氨基戊基)-2′-脱氧腺苷-3′--N，N-二异丙基-氰基乙氧基亚磷酰胺。参见例如，Manoharan，等人，Tetrahedron Letters，1991，34，7171。
在再进一步的实施方案中，本发明的寡聚物在核苷酸上可以具有含胺功能部分，包括在N6嘌呤氨基上，在鸟嘌呤的环外N2上，或在胞嘧啶的N4或5位置上。在各种实施方案中，此种官能化可以通过使用商业试剂来实现，所述商业试剂已在寡聚物合成中进行官能化。
某些功能部分是商购可得的，例如，异双功能和同双功能连接部分可从Pierce Co.(Rockford，III.)获得。其他商购可得的连接基团是5′-氨基-改性剂C6和3′-氨基-改性试剂，两者都可从GlenResearch Corporation(Sterling，Va.)获得。5′-氨基-改性剂C6也可从ABI(Applied Biosystems Inc.，Foster City，Calif.)作为氨基连接-2获得，和3′-氨基-改性剂也可从ClontechLaboratories Inc.(Palo Alto，Calif.)获得。
治疗和药物组合物-配制和施用
如最初解释的，本发明的寡核苷酸将构成具有改善性质的合适药物。有效和安全药物的设计需要各种参数的细调，所述参数例如亲和力/特异性、生物液体中的稳定性、细胞摄取、作用方式、药代动力学性质和毒性。
因此，在另一个的方面，本发明涉及包括根据本发明的寡核苷酸和药学上可接受的稀释剂、载体或佐剂的药物组合物。优选地，所述载体是盐水或缓冲盐水。
在一个再进一步的方面，本发明涉及根据本发明的寡核苷酸用于作为药物中的用途。
如应理解的，给药依赖于待治疗疾病状态的严重度和应答性，并且治疗过程持续从数天到数月，或直至实现治愈或达到疾病状态减少。最佳给药方案可以由患者体内的药物蓄积测量进行计算。最佳剂量可以依赖于个别寡核苷酸的相对功效而改变。一般地，它可以基于在体外和体内动物模型中有效的EC50s进行估计。一般而言，剂量是0.01μg至1g/kg体重，并且可以每天、每周、每月或每年给予一次或多次，或甚至每2至10年给予一次，或通过数小时直至数月的连续输注给予。关于给药的重复率可以基于在体液或组织中测量的药物停留时间和浓度进行估计。在成功治疗后，可能希望患者经历维持疗法以阻止疾病状态的复发。
如上所述，本发明还涉及药物组合物，其包括本发明的至少一种寡核苷酸作为活性成分。应当理解根据本发明的药物组合物任选包括药学载体，并且药物组合物任选包括其他化合物，例如化学治疗化合物、抗炎化合物、抗病毒化合物和/或免疫调节化合物。
本发明的寡核苷酸可以“像这样”或以各种药学上可接受的盐形式使用。如本文所使用的，术语“药学上可接受的盐”指保留本文鉴定的寡核苷酸的所需生物活性且显示最低限度不希望的毒理学效应的盐。此种盐的非限制性例子可以由有机氨基酸形成或由金属阳离子形成的碱加成盐，所述金属阳离子例如锌、钙、铋、钡、镁、铝、铜、钴、镍、镉、钠、钾等，或与由铵、N，N-二苄乙烯-二胺、D-葡糖胺、四乙胺或乙二胺形成的阳离子形成的碱加成盐。
在本发明的一个实施方案中，寡核苷酸可以为药物前体形式。寡核苷酸可以是带负电离子。由于细胞膜的亲脂性质，与中性或亲脂等价物相比较，寡核苷酸的细胞摄取减少。这种极性“阻碍”可以通过使用药物前体方法得到避免(参见例如Crooke，R.M.(1998)在Crooke，S.T.Antisense research and Application.Springer-Verlag，Berlin，Germany，第131卷，第103-140页中)。
药学上可接受的结合剂和佐剂可以包括所配制药物的部分。
用于递送本文描述的治疗剂的递送方法的例子以及药物制剂、盐的细节在其他地方充分描述，例如在通过引用并入本文的美国临时申请60/838,710和60/788,995，以及同样通过引用并入本文的丹麦申请PA 2006 00615。
本发明的药物组合物包括但不限于溶液、乳状剂和含脂质体制剂。这些组合物可以由各种组分产生，所述组分包括但不限于预先形成的液体、自乳化固体和自乳化半固体。药物至肿瘤组织的递送可以通过载体介导的递送得到增强，所述载体介导的递送包括但不限于阳离子脂质体、环糊精、卟啉衍生物、支链树枝状聚合物(dendrimers)、聚乙烯亚胺聚合物、纳米颗粒和微球体(Dass CR.J Pharm Pharmacol2002；54(1)：3-27)。可以方便地以单位剂型呈现的本发明的药物制剂，可以根据制药工业中众所周知的常规技术进行制备。此种技术包括使活性成分与一种或多种药学载体或一种或多种赋形剂结合的步骤。一般而言，这样制备制剂：通过使活性成分与液体载体或精细分开的固体载体或两者均匀且亲密地结合，并且随后需要时，使产物成型。本发明的组合物可以配制成许多可能剂型中的任何，所述剂型例如但不限于片剂、胶囊、凝胶胶囊、液体糖浆剂、软凝胶和栓剂。本发明的组合物还可以配制为在水、无水或混合介质中的悬浮液。水悬浮液可以进一步包含增加悬浮液粘度的物质，包括例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇和/或葡聚糖。悬浮液还可以包含稳定剂。本发明的化合物还可以与活性药物物质缀合，所述活性药物物质例如阿司匹林、布洛芬、磺胺药、抗糖尿病药、抗菌剂或抗生素。
在另一个实施方案中，本发明的组合物可以包含靶向第一种微小RNA的一种或多种寡核苷酸化合物，和靶向第二种微小RNA靶的一种或多种另外的寡核苷酸化合物。2种或更多种组合化合物可以一起或顺次使用。
本文公开的化合物对于如上所述的许多治疗应用有用。一般而言，本发明的治疗方法包括给哺乳动物特别是人施用治疗有效量的寡核苷酸。在一个特定实施方案中，本发明提供了药物组合物，其包含(a)本发明的一种或多种化合物，和(b)一种或多种化学治疗剂。当与本发明的化合物一起使用时，此种化学治疗剂可以个别、顺次或与一种或多种其他此种化学治疗剂组合或与放射疗法组合使用。本领域技术人员已知的所有化学治疗剂作为与根据本发明的化合物的组合疗法引入本文。其他活性剂例如抗炎药包括但不限于非甾体抗炎药和皮质类固醇、抗病毒药物和免疫调节药物也可以在本发明的组合物中组合。2种或更多组合化合物可以一起或顺次使用。
可以由本发明的药物组合物治疗的治疗适应症的例子：
  微小RNA   可能的医学适应症
  miR-1   心律失常
  miR-21   成胶质细胞瘤、乳腺癌、肝细胞癌、结肠直肠癌、胶质细胞瘤对细胞毒性药物的敏化、心脏肥大
  miR-21、miR-200b和miR-141   响应化学疗法和胆管上皮癌的生长调节
  miR-122   高胆固醇血症、丙型肝炎感染、血色素沉着病
  miR-19b   淋巴瘤和其他肿瘤类型
  miR-26a   人干细胞的成骨细胞分化
  微小RNA   可能的医学适应症
  miR-155   淋巴瘤、胰腺肿瘤发展、乳腺和肺癌
  miR-203   银屑病
  miR-375   糖尿病、代谢病症、葡萄糖诱导的来自胰内分泌细胞的胰岛素分泌
  miR-181   成肌细胞分化、自身免疫病症
  miR-10b   乳腺癌细胞侵入和转移
  miR-125b-1   乳腺、肺、卵巢和宫颈癌
  miR-221和222   前列腺癌、人甲状腺乳头状癌、人肝细胞癌
  miRNA-372和-373   睾丸生殖细胞肿瘤
  miR-142   B细胞白血病
  miR-17-19b簇   B细胞淋巴瘤、肺癌、肝细胞癌
肿瘤抑制基因原肌球蛋白1(tropomysin 1，TPM1)mRNA已被指定为miR-21的靶。肌侵蛋白(mtpn)mRNA已作为miR 375的靶指出。
在一个更进一步的方面，本发明涉及根据本发明的寡核苷酸在制造用于治疗选自下述的疾病的药物中的用途：动脉粥样硬化、高胆固醇血症和高脂血症；癌症；成胶质细胞瘤、乳腺癌、淋巴瘤、肺癌；糖尿病、代谢病症；成肌细胞分化；免疫病症。
本发明进一步涉及根据本发明的寡核苷酸用于在治疗选自下述的疾病中的用途：动脉粥样硬化、高胆固醇血症和高脂血症；癌症；成胶质细胞瘤、乳腺癌、淋巴瘤、肺癌；糖尿病、代谢病症；成肌细胞分化；免疫病症。
本发明提供了用于治疗患有选自下述的疾病或病状的受试者的方法：动脉粥样硬化、高胆固醇血症和高脂血症；癌症；成胶质细胞瘤、乳腺癌、淋巴瘤、肺癌；糖尿病、代谢病症；成肌细胞分化；免疫病症，该方法包括给有此需要的受试者施用本发明的寡核苷酸或药物组合物的步骤。
本发明进一步提供了包括根据本发明的药物组合物和第二种独立活性成分的试剂盒，所述第二种独立活性成分是VLDL装配途径的抑制剂，例如ApoB抑制剂，或MTP抑制剂。
癌症
在一个更进一步的方面，本发明涉及根据本发明的寡核苷酸在制造用于治疗癌症的药物中的用途。在另一个方面，本发明涉及用于治疗癌症或预防癌症的方法，所述方法包括给有此需要的患者施用本发明的寡核苷酸或本发明的药物组合物。
此种癌症可以包括淋巴网状内皮细胞赘生物、成淋巴细胞性白血病、脑瘤、胃肿瘤、浆细胞瘤、多发性骨髓瘤、白血病、结缔组织肿瘤、淋巴瘤和实体瘤。
在本发明的化合物在制造用于治疗癌症的药物中的用途中，所述癌症可以适当地为实体瘤的形式。类似地，在用于治疗本文公开的癌症的方法中，所述癌症可以适当地为实体瘤的形式。
此外，所述癌症还适当地是癌。癌一般选自恶性黑素瘤、基底细胞癌、卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、肾细胞癌、膀胱癌、复发性浅表膀胱癌、胃癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、宫颈癌、宫颈发育不良、喉乳头状瘤病、结肠癌、结肠直肠癌和类癌瘤。更一般地，所述癌选自恶性黑素瘤、非小细胞肺癌、乳腺癌、结肠癌和肾细胞癌。恶性黑素瘤一般选自浅表扩散性黑素瘤、结节性黑素瘤、恶性雀斑样黑素瘤、肢端黑素瘤、无黑素性黑素瘤和结缔组织增生性黑素瘤。
备选地，癌症可以适当地是肉瘤。肉瘤一般为选自下述的形式：骨肉瘤、尤因(Ewing′s)肉瘤、软骨肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、纤维肉瘤和卡波西氏肉瘤。
备选地，癌症可以适当地是神经胶质瘤。
另一个的实施方案涉及根据本发明的寡核苷酸在制造用于治疗癌症的药物中的用途，其中所述药物进一步包括选自下述的化学治疗剂：肾上腺皮质类固醇，例如泼尼松、氟美松或地塞米松；六甲蜜胺(克瘤灵、六甲三聚氰胺(HMM))；氨磷汀(阿密磷定)；氨鲁米特(安鲁米特)；安吖啶(M-AMSA)；阿那曲唑(瑞宁得)；雄激素例如睾酮；天冬酰胺酶(优适宝)；卡介苗；比卡鲁胺(康士得)；争光霉素(博来霉素)；白消安(马利兰)；卡铂(伯尔定)；卡莫司汀(BCNU、BiCNU)；苯丁酸氮芥(瘤可宁)；氯脱氧腺苷(2-CDA、克拉屈滨、克拉立平)；顺铂(顺氯氨铂)；胞嘧啶阿糖核苷(阿糖胞苷)；达卡巴嗪(DTIC)；更生霉素(放线菌素-D、放线菌素d)；柔红霉素(红比霉素)；多西他赛(泰素帝)；多柔比星(阿霉素(adriomycin))；表柔比星；雌莫司汀(emcyt)；雌激素例如己烯雌酚(DES)；依托泊苷(VP-16、VePesid、凡毕复)；氟达拉滨(福达华)；氟他胺(eulexin)；5-FUDR(氟尿苷)；5-氟尿嘧啶(5-FU)；吉西他滨(健择)；戈舍瑞林(zodalex)；赫赛汀(曲妥珠单抗)；羟基脲(hydrea)；伊达比星(idamycin)；异环磷酰胺；IL-2(阿地白介素、阿德斯白细胞素)；干扰素α(甘乐能、罗荛愫)；伊立替康(camptosar)；亮丙瑞林(利普安)；左旋咪唑(ergamisole)；洛莫司汀(CCNU)；二氯甲基二乙胺(mechlorathamine)(盐酸氮芥、氮芥)；美法仑(爱克兰)；巯嘌呤(巯基嘌呤、6-MP)；氨甲蝶呤(氨甲蝶呤钠)；丝裂霉素-C(突变霉素(mutamucin))；米托蒽醌(诺消灵)；奥曲肽(善宁)；喷司他丁(2-脱氧肋间型霉素、nipent)；普利霉素(光辉霉素、普卡霉素)；丙卡巴肼(prorocarbazine)(甲苯肼)；链佐星；他莫西芬(tamoxifin)(诺瓦得士)；泰素(紫杉醇)；替尼泊苷(威猛、VM-26)；噻替派；托泊替康(和美新)；维甲酸(凡善能、全反式维甲酸)；长春碱(valban)；长春新碱(安可平)和长春瑞滨(诺维本)。适当地，进一步化学治疗剂选自紫杉烷例如泰素、紫杉醇或多西他赛。
适当地，本发明进一步涉及根据本发明的寡核苷酸在制造用于治疗癌症的药物中的用途，其中所述治疗进一步包括施用选自下述的进一步化学治疗剂：肾上腺皮质类固醇，例如泼尼松、氟美松或地塞米松；六甲蜜胺(克瘤灵、六甲三聚氰胺(HMM))；氨磷汀(阿密磷定)；氨鲁米特(安鲁米特)；安吖啶(M-AMSA)；阿那曲唑(瑞宁得)；雄激素例如睾酮；天冬酰胺酶(优适宝)；卡介苗；比卡鲁胺(康士得)；争光霉素(博来霉素)；白消安(马利兰)；卡铂(伯尔定)；卡莫司汀(BCNU、BiCNU)；苯丁酸氮芥(瘤可宁)；2-氯脱氧腺苷(2-CDA、克拉屈滨、克拉立平)；顺铂(顺氯氨铂)；胞嘧啶阿糖核苷(阿糖胞苷)；达卡巴嗪(DTIC)；更生霉素(放线菌素-D、放线菌素d)；柔红霉素(红比霉素)；多西他赛(泰素帝)；多柔比星(阿霉素adriomycin)；表柔比星；雌莫司汀(emcyt)；雌激素例如己烯雌酚(DES)；依托泊苷(VP-16、VePesid、凡毕复)；氟达拉滨(福达华)；氟他胺(eulexin)；5-FUDR(氟尿苷)；5-氟尿嘧啶(5-FU)；吉西他滨(健择)；戈舍瑞林(zodalex)；赫赛汀(曲妥珠单抗)；羟基脲(hydrea)；伊达比星(idamycin)；异环磷酰胺；IL-2(阿地白介素、阿德斯白细胞素)；干扰素α(甘乐能、罗荛愫)；伊立替康(camptosar)；亮丙瑞林(利普安)；左旋咪唑(ergamisole)；罗莫司汀(CCNU)；二氯甲基二乙胺(mechlorathamine)(盐酸氮芥、氮芥)；美法仑(爱克兰)；巯嘌呤(巯基嘌呤、6-MP)；氨甲蝶呤(氨甲蝶呤钠)；丝裂霉素-C(突变霉素(mutamucin))；米托蒽醌(诺消灵)；奥曲肽(善宁)；喷司他丁(2-脱氧肋间型霉素、nipent)；普利霉素(光辉霉素、普卡霉素)；丙卡巴肼(prorocarbazine)(甲苯肼)；链佐星；他莫西芬(tamoxifin)(诺瓦得士)；泰素(紫杉醇)；替尼泊苷(成猛、VM-26)；噻替派；托泊替康(和美新)；维甲酸(凡善能、全反式维甲酸)；长春碱(valban)；长春新碱(安可平)和长春瑞滨(诺维本)。适当地，所述治疗进一步包括施用选自紫杉烷例如泰素、紫杉醇或多西他赛的进一步化学治疗剂。
备选地陈述，本发明进一步涉及用于治疗癌症的方法，所述方法包括给有此需要的患者施用本发明的寡核苷酸或根据本发明的药物组合物，并且进一步包括施用其他化学治疗剂。所述进一步施用可以是这样的，使得其他化学治疗剂与本发明的化合物缀合，存在于药物组合物中，或在分开制剂中施用。
传染病
考虑本发明的化合物可以广泛应用于广泛范围的传染病，例如白喉、破伤风、百日咳、小儿麻痹症、乙型肝炎、丙型肝炎、流感嗜血杆菌、麻疹、腮腺炎和风疹。
Hsa-miR122在丙型肝炎感染中指出，并且像这样靶向miR-122的根据本发明的寡核苷酸可以用于治疗丙型肝炎感染。
因此，在另外一个方面，本发明涉及根据本发明的寡核苷酸在制造用于治疗传染病的药物中的用途，以及用于治疗传染病的方法，所述方法包括给有此需要的患者施用根据本发明的寡核苷酸或根据本发明的药物组合物。
在一个优选实施方案中，本发明提供了组合治疗，提供与VLDL装配的抑制剂，例如apoB抑制剂，或MTP抑制剂组合的抗miR-122寡聚物。
炎性疾病
炎症应答是生物体针对传染原攻击的基本防御机制，并且它还牵涉许多急性和慢性疾病包括自身免疫性病症的发病机制。尽管是对抗病原体所需的，但炎症性爆发效应可以是破坏性的。因此，通常需要用抗炎药限制炎症的症状学。炎症是通常由组织损害触发的复杂过程，所述组织损害包括大量酶的活化，血管通透性和血外渗中的增加，细胞迁移和化学介质释放，所有旨在破坏和修复受损组织。
在另外一个方面，本发明涉及根据本发明的寡核苷酸在制造用于治疗炎性疾病的药物中的用途，以及用于治疗炎性疾病的方法，所述方法包括给有此需要的患者施用根据本发明的寡核苷酸或根据本发明的药物组合物。
在本发明的一个优选实施方案中，炎性疾病是风湿性疾病和/或结缔组织疾病，例如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)或狼疮、硬皮病、多肌炎、炎性肠病、皮肌炎、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、脉管炎、银屑病关节炎、红皮病性银屑病、寻常天疱疮和Sjorgren′s综合征，特别是炎性肠病和克罗恩氏病。
备选地，炎性疾病可以是非风湿性炎症，如滑囊炎、滑膜炎、囊炎、肌腱炎和/或创伤和/或运动起源的其他炎性病变。
代谢疾病
代谢疾病是由体内自然产生的化学制品蓄积引起的病症。这些疾病通常是严重的，某些甚至危害生命。其他可以减慢身体发育或引起智力低下。具有这些病症的大多数婴儿起初不显示明显病征。出生时的正确筛选通常可以发现这些问题。用早期诊断和治疗，通常可以有效管理代谢疾病。
在另外一个方面，本发明涉及根据本发明的寡核苷酸或其缀合物在制造用于治疗代谢疾病的药物中的用途，以及用于治疗代谢疾病的方法，所述方法包括给有此需要的患者施用根据本发明的寡核苷酸或其缀合物、或根据本发明的药物组合物。
在本发明的一个优选实施方案中，代谢疾病选自淀粉样变性病、生物素酶、OMIM(Online Mendelian Inheritance in Man)、克-纳二氏(Crigler Najjar)综合征、糖尿病、Fabry Support & InformationGroup、脂肪酸氧化病症、半乳糖血症、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺陷、戊二酸尿症、戊二酸血症国际组织(InternationalOrganization of Glutaric Acidemia)、戊二酸血症I型、戊二酸血症II型、戊二酸血症I型、戊二酸血症II型、F-HYPDRR-家族性低磷酸盐血症、抗维生素D佝偻病、克拉伯(Krabbe)病、长链3羟酰CoA脱氢酶缺陷(LCHAD)、甘露糖苷贮积症团体、枫糖尿病、线粒体病症、粘多糖病综合征：尼-皮二氏(Niemann Pick)、有机酸血症、PKU、庞皮(Pompe)病、卟啉症、代谢综合征、高脂血症和遗传脂代谢紊乱、三甲基胺尿症：臭鱼征和尿素循环紊乱。
肝病症
在另外一个方面，本发明涉及根据本发明的寡核苷酸或其缀合物在制造用于治疗肝病症的药物中的用途，以及用于治疗肝病症的方法，所述方法包括给有此需要的患者施用根据本发明的寡核苷酸或其缀合物、或根据本发明的药物组合物。
在本发明的一个优选实施方案中，肝病症选自胆管闭锁、Alagille综合征、α-1抗胰蛋白酶、酪氨酸血症、新生儿肝炎和威尔逊(Wilson)病。
其他用途
本发明的寡核苷酸可以用作研究试剂用于诊断、治疗和预防。在研究中，寡核苷酸可以用于特异性抑制细胞和实验动物中的靶基因合成，从而促进靶的功能分析或其作为用于治疗干预靶的有用性的估计。在诊断中，通过Northern印迹、原位杂交或相似技术，寡核苷酸可以用于检测且定量细胞和组织中的靶表达。对于治疗，通过施用依照本发明的寡核苷酸化合物治疗怀疑具有可以通过调控靶表达治疗的疾病或病症的动物或人。进一步提供的是通过施用治疗或预防有效量的本发明的一种或多种寡核苷酸化合物或组合物治疗动物特别是小鼠和大鼠以及治疗人的方法，所述动物或人怀疑具有或易于具有与靶表达相关的疾病或病状。
靶向miR-122a的寡核苷酸的治疗用途
我们已证实靶向miR-122a的LNA-抗miR减少血浆胆固醇水平。
因此，本发明的另一个方面是靶向miR-122a的上述寡核苷酸作为药物的用途。
本发明的另外一个方面是靶向miR-122a的上述寡核苷酸用于制备用于治疗血浆胆固醇水平增加(或高胆固醇血症和相关病症)的药物中的用途。技术人员应当理解血浆胆固醇水平增加是不希望有的，因为它增加各种病状例如动脉粥样硬化的危险。
本发明的另外一个方面是靶向miR-122a的上述寡核苷酸用于上调Nrdg3、Aldo A、Bckdk或CD320的mRNA水平的用途。
实施方案
本发明的下述实施方案可以与本文描述的其他实施方案组合使用。
1.包括长度6-12个核苷酸的寡聚物和药学上可接受的稀释剂、载体、盐或佐剂的药物组合物，其中所述寡聚物包括总共6-12个核苷酸，例如6、7、8、9、10、11或12个核苷酸单位的邻接核苷酸序列，其中所述寡聚物的至少50％核碱基单位是高亲和力核苷酸类似物单位。
2.根据实施方案1的药物组合物，其中所述邻接核苷酸序列与哺乳动物、人或病毒微小RNA(miRNA)序列的相对应区域互补。
3.根据实施方案2的药物组合物，其中所述邻接核苷酸序列与选自表3、4或5中任何一个中列出的miRNA的miRNA序列的相对应区域互补。
4.根据实施方案2或3的药物组合物，其中所述邻接核苷酸序列由与所述微小RNA的种子序列互补的序列组成，或包括与所述微小RNA的种子序列互补的序列。
5.根据实施方案2-4中任何一个的药物组合物，其中所述邻接核苷酸序列由选自表3或4中列出的任何一个序列的序列组成，或包括选自表3或4中列出的任何一个序列的序列。
6.根据实施方案4或5的药物组合物，其中所述种子聚体的3′核碱基构成所述邻接核苷酸序列的最3′核碱基，其中所述邻接核苷酸序列可以任选地包括一个或两个其他5′核碱基。
7.根据实施方案1-6中任何一个的药物组合物，其中所述邻接核苷酸序列不包括与从5′末端计数的微小RNA序列中存在的第一个核苷酸相对应的核苷酸。
8.根据实施方案1-7中任何一个的药物组合物，其中所述邻接核苷酸序列与选自表3或4或5中所示的那些的miRNA中存在的相对应核苷酸序列互补。
9.根据实施方案8的药物组合物，其中所述miRNA选自miR-1、miR-10b、miR-17-3p、miR-18、miR-19a、miR-19b、miR-20、miR-21、miR-34a、miR-93、miR-106a、miR-106b、miR-122、miR-133、miR-134、miR-138、miR-155、miR-192、miR-194、miR-221、miR-222和miR-375。
10.根据实施方案1-9中任何一个的药物组合物，其中所述邻接核苷酸序列的至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或所有核碱基单位是核苷酸类似物单位。
11.根据实施方案10的药物组合物，其中所述核苷酸类似物单位选自2′-O_烷基-RNA单位、2′-OMe-RNA单位、2′-氨基-DNA单位、2′-氟-DNA单位、LNA单位、PNA单位、HNA单位、INA单位和2′MOE RNA单位。
12.根据实施方案10或11的药物组合物，其中所述邻接核苷酸序列的至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或所有核碱基单位是锁核酸(LNA)核碱基单位。
13.根据实施方案12的药物组合物，其中所述邻接核苷酸序列的所有核碱基单位是LNA核碱基单位。
14.根据实施方案1-13中任何一个的药物组合物，其中所述邻接核苷酸序列包括7、8、9或10个优选邻接的LNA核碱基单位，或由7、8、9或10个优选邻接的LNA核碱基单位组成。
15.根据实施方案1-14中任何一个的药物组合物，其中所述寡聚物由7、8、9或10个邻接的核碱基单位组成，并且其中至少7个核碱基单位是核苷酸类似物单位。
16.根据实施方案15的药物组合物，其中所述核苷酸类似物单位是锁核酸(LNA)核碱基单位。
17.根据实施方案15的药物组合物，其中所述分子中的核苷酸类似物单位由至少50％LNA单位和多至50％其他核苷酸类似物单位的混合物组成。
18.根据实施方案1-17中任何一个的药物组合物，其中所述邻接核苷酸序列的核碱基单位之间存在的至少75％，例如80％或85％或90％或95％或所有核苷间连接是硫代磷酸酯核苷间连接。
19.根据实施方案1-18中任何一个的药物组合物，其中所述寡聚物与一种或多种非核碱基化合物缀合。
20.根据实施方案1-19中任何一个的药物组合物，其中所述邻接核苷酸序列与至少2个miRNA序列，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个miRNA序列的相对应序列互补。
21.根据实施方案1-20中任何一个的药物组合物，其中所述邻接核苷酸序列由这样的序列组成或包括这样的序列，所述序列与至少2个miRNA种子区域序列，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个miRNA种子区域序列的序列互补。
22.根据实施方案20或21中任何一个的药物组合物，其中所述邻接核苷酸序列与miR-221和miR-222两者的相对应区域互补。
23.根据实施方案22的药物组合物，其中所述邻接核苷酸序列由与5′GCUACAU3′互补的序列组成，或包括与5′GCUACAU3′互补的序列。
24.根据实施方案1-23中任何一个的药物组合物，其中所述寡聚物作为药物前体构成。
25.根据实施方案1-24中任何一个的药物组合物，其中所述邻接核苷酸序列与has-miR-122的相对应区域互补。
26.根据实施方案25的药物组合物，用于在选自下述的医学病症或疾病的治疗中的用途：丙型肝炎病毒感染以及高胆固醇血症和相关病症。
27.根据实施方案25或26的药物组合物，其中所述组合物进一步包括第二种独立活性成分，其为VLDL装配途径的抑制剂，例如ApoB抑制剂，或MTP抑制剂。
28.包括根据实施方案25或26的药物组合物和第二种独立活性成分的试剂盒，所述第二种独立活性成分是VLDL装配途径的抑制剂，例如ApoB抑制剂，或MTP抑制剂。
29.用于治疗与微小RNA的存在或过表达相关的疾病或医学病症的方法，其包括给患者施用根据实施方案1-28中任何一个的药物组合物的步骤，所述患者患有或可能患有所述疾病或医学病症。
30.寡聚物，其如根据实施方案1-25中任何一个限定。
31.缀合物，其包括根据实施方案30的寡聚物和至少一种非核碱基化合物。
32.如实施方案30-31中任何一个中限定的寡聚物或缀合物在制造用于治疗疾病或医学病症的药物中的用途，所述疾病或医学病症与微小RNA的存在或过表达相关。
33.用于减少细胞中的miRNA量或有效量的方法，其包括给表达所述miRNA的细胞施用根据前述实施方案中任何一个的寡聚物、缀合物或药物组合物，以便减少所述细胞中的miRNA量或有效量。
34.用于对细胞中其表达受miRNA阻遏的mRNA去阻遏的方法，其包括给表达所述mRNA和所述miRNA的细胞施用根据前述实施方案中任何一个的寡聚物、缀合物或药物组合物，以便去阻遏所述mRNA的表达。
参考文献：参考文献的细节在优先权文件中提供。
实施例
使用WO2007/112754的实施例1和2中提及的方法执行LNA单体和寡核苷酸合成。使用WO2007/112754的实施例4中提及的方法执行LNA寡核苷酸在人或大鼠血浆中的稳定性。使用WO2007/112754的实施例6中提及的方法执行用LNA抗miR反义寡核苷酸(靶向miR-122)处理体外细胞。使用WO2007/112754的实施例7中提及的方法执行在体外和体内模型中微小RNA特异性定量PCR的miR表达的寡核苷酸抑制分析。使用WO2007/112754的实施例8中提及的方法执行使用miRNA微阵列表达谱的LNA抗miR敲减特异性的评估。使用WO2007/112754的实施例9中提及的方法执行通过原位杂交的微小RNA检测。使用WO2007/112754的实施例10中提及的方法执行在体外和体内模型中mRNA表达(用于mRNA分析的总RNA分离和cDNA合成)的分离和分析。使用WO2007/112754的实施例11-27中公开的方法执行使用靶向微小RNA-122的本发明的寡聚物的体内实验和后续分析。WO2007/112754的上述实施例通过引用特别并入本文。
实施例1：LNA抗miR寡核苷酸的设计和解链温度
表2-在实施例和附图中使用的寡聚物。SEQ#是实施例和附图自始至终使用的标识符——还提供了在序列表中使用的SEQ ID NO。
  实施例/附图SEQ#  SEQ ID NO   化合物序列   注释
  #3204  1   TcAGtCTGaTaAgCT
  #3205  2   GATAAGCT
  #3206  3   TcAcAATtaGCAtTA
  #3207  4   TAGCATTA
  实施例/附图SEQ#  SEQ ID NO   化合物序列   注释
  #4  5   CcAttGTcaCaCtCC
  #3208  6   CACACTCC
  #3209  7   TAAGCT
  #3210  8   ATAAGCT
  #3211  9   TGATAAGCT
  #3212  10   CTGATAAGCT
  #3213  11   GTCTGATAAGCT
  #2114  12   CAGTCTGATAAGCT
  #3215  13   TCTGATAA
  #3216  14   ATCAGTCT
  #3217  15   TCAACATC
  #3218/#3230  16   GGTAAACT   下划线＝错配
  #3219  17   CGTAATGA   下划线＝错配
  #3220  18   TCAgtctgataaGCTa   5′荧光标记(FAM)
  #3221  19   AGCACTTT
  #3222  20   ATTTGCAC
  #3223  21   AgCagACaaTgTaGC   5′荧光标记(FAM)
  #3224  22   GtAgcCAgaTgTaGC   5′荧光标记(FAM)
  #3225  23   ATGTAGC
实施例2：体外模型：细胞培养
LNA寡核苷酸对靶核酸表达(量)的作用可以在各种细胞类型的任何中进行测试，条件是靶核酸以可测量水平存在。靶可以内源表达或通过编码所述核酸的核酸瞬间或稳定转染进行表达。
靶核酸的表达水平可以使用例如NORTHERN印迹分析(包括微小RNA northern)、定量PCR(包括微小RNA qPCR)、核糖核酸酶保护测定法进行常规测定。提供下述细胞类型用于举例说明目的，但可以照常规使用其他细胞类型，条件是靶在选择的细胞类型中表达。
细胞如下所述培养在合适培养基中，并且维持在37℃、95-98％湿度和5％CO2下。细胞照常规每周传代2-3次。
15PC3：人前列腺癌细胞系15PC3由Dr.F.Baas，NeurozintuigenLaboratory，AMC，The Netherlands友情捐赠，并且在DMEM(Sigma)+10％胎牛血清(FBS)+Glutamax I+庆大霉素中培养。
PC3：人前列腺癌细胞系PC3购自ATCC，并且在具有谷氨酰胺(Gibco)+10％FBS+庆大霉素的F12 Coon′s中培养。
518A2：人黑素瘤癌细胞系518A2由Dr.B.Jansen，Section ofexperimental Oncology，Molecular Pharmacology，Department ofClinical Pharmacology，University of Vienna友情捐赠，并且在DMEM(Sigma)+10％胎牛血清(FBS)+Glutamax I+庆大霉素中培养。
HeLa：宫颈癌细胞系HeLa在包含10％胎牛血清庆大霉素的MEM(Sigma)中在37℃、95％湿度和5％CO2下培养。
MPC-11：多发性骨髓瘤细胞系MPC-11购自ATCC，并且在具有4mMGlutamax+10％马血清的DMEM中维持。
DU-145：人前列腺癌细胞系DU-145购自ATCC，并且在具有Glutamax+10％FBS的RPMI中维持。
RCC-4+/-VHL：用表达VHL的质粒或空质粒稳定转染的人肾癌细胞系RCC4购自ECACC，并且根据制造商说明书维持。
786-0：人肾细胞癌细胞系786-0购自ATCC，并且根据制造商说明书维持。
HUVEC：人脐静脉内皮细胞系HUVEC购自Camcrex，并且在EGM-2培养基中维持。
K562：人慢性骨髓性白血病细胞系K562购自ECACC，并且在具有Glutamax+10％FBS的RPMI中维持。U87MG：人成胶质细胞瘤细胞系U87MG购自ATCC，并且根据制造商说明书维持。
B16：鼠类黑色素瘤细胞系B16购自ATCC，并且根据制造商说明书维持。
LNCap：人前列腺癌细胞系LNCap购自ATCC，并且在具有Glutamax+10％FBS的RPMI中维持。
Huh-7：人肝、上皮样在具有10％FBS、2mM Glutamax I、1x非必需氨基酸、庆大霉素25μg/ml中培养
L428：(Deutsche Sammlung für Mikroorganismen(DSM，Braunschwieg，Germany))：人B细胞淋巴瘤在补充有10％FCS、L-谷氨酰胺和抗生素的RPMI 1640中维持。
L1236：(Deutsche Sammlung für Mikroorganismen(DSM，Braunschwieg，Germany))：人B细胞淋巴瘤在补充有10％FCS、L-谷氨酰胺和抗生素的RPMI 1640中维持。
实施例3：在miRBase微小RNA数据库中设计关于所有人微小RNA序列的LNA抗miR文库
使用的miRBase版本是版本12，如Griffiths-Jones，S.，Grocock，R.J.，van Dongen，S.，Bateman，A.，Enright，A.J.2006.miRBase：microRNA sequences，targets and gene nomenclature.Nucleic Acids Res.34：D140-4中报告的，并且经由http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/index.shtml可获得。
表1显示包括根据miRBase微小RNA数据库的微小RNA的种子聚体序列的7、8和9聚体核苷酸序列。种子聚体序列包括微小RNA种子区域的相反互补体。在某些实施方案中，本发明的寡聚物具有选自7聚体、8聚体或9聚体序列的邻接核苷酸序列。就7聚体、8聚体或9聚体序列而言，在某些实施方案中，所有核苷间连接都是硫代磷酸酯。7聚体、8聚体和9聚体核苷酸序列可以由如本文所描述的核苷酸类似物例如LNA核苷酸类似物的序列组成。LNA胞嘧啶可以是甲基-胞嘧啶(5′甲基-胞嘧啶)。在某些实施方案中，LNA是β-D-氧基-LNA。
表3提供了分组成可以通过相同种子聚体寡聚物，例如本文提供的7、8或9聚体被靶向的那些的微小RNA列表(参见表1)。
  表3
  hsa-let-7a*、hsa-let-7f-1*
  hsa-let-7a、hsa-let-7b、hsa-let-7c、hsa-let-7d、hsa-let-7f、hsa-miR-98、hsa-let-7g、hsa-let-7i
  hsa-miR-1、hsa-miR-206
  hsa-miR-103、hsa-miR-107
  hsa-miR-10a、hsa-miR-10b
  hsa-miR-125b、hsa-miR-125a-5p
  hsa-miR-129*、hsa-miR-129-3p
  hsa-miR-130a、hsa-miR-301a、hsa-miR-130b、hsa-miR-454、hsa-miR-301b
  hsa-miR-133a、hsa-miR-133b
  hsa-miR-135a、hsa-miR-135b
  hsa-miR-141、hsa-miR-200a
  hsa-miR-146a、hsa-miR-146b-5p
  hsa-miR-152、hsa-miR-148b
  hsa-miR-154*、hsa-miR-487a
  hsa-miR-15a、hsa-miR-16、hsa-miR-15b、hsa-miR-195、hsa-miR-497
  hsa-miR-17、hsa-miR-20a、hsa-miR-93、hsa-miR-106a、hsa-miR-106b、hsa-miR-20b、hsa-miR-526b*
  hsa-miR-181a、hsa-miR-181c
  hsa-miR-181b、hsa-miR-181d
  hsa-miR-18a、hsa-miR-18b
  表3
  hsa-miR-190、hsa-miR-190b
  hsa-miR-192、hsa-miR-215
  hsa-miR-196a、hsa-miR-196b
  hsa-miR-199a-3p、hsa-miR-199b-3p
  hsa-miR-199a-5p、hsa-miR-199b-5p
  hsa-miR-19a*、hsa-miR-19b-1*、hsa-miR-19b-2*
  hsa-miR-19a、hsa-miR-19b
  hsa-miR-200b、hsa-miR-200c
  hsa-miR-204、hsa-miR-211
  hsa-miR-208a、hsa-miR-208b
  hsa-miR-212、hsa-miR-132
  hsa-miR-23a*、hsa-miR-23b*
  hsa-miR-23a、hsa-miR-23b、hsa-miR-130a*
  hsa-miR-24-1*、hsa-miR-24-2*
  hsa-miR-25、hsa-miR-92a、hsa-miR-367、hsa-miR-92b
  hsa-miR-26a、hsa-miR-26b
  hsa-miR-26a-1*、hsa-miR-26a-2*
  hsa-miR-27a、hsa-miR-27b
  hsa-miR-29a、hsa-miR-29b、hsa-miR-29c
  表3
  hsa-miR-302a、hsa-miR-302b、hsa-miR-302c、hsa-miR-302d、hsa-miR-373、hsa-miR-520e、hsa-miR-520a-3p、hsa-miR-520b、hsa-miR-520c-3p、hsa-miR-520d-3p
  hsa-miR-302b*、hsa-miR-302d*
  hsa-miR-30a*、hsa-miR-30d*、hsa-miR-30e*
  hsa-miR-30a、hsa-miR-30c、hsa-miR-30d、hsa-miR-30b、hsa-miR-30e
  hsa-miR-330-5p、hsa-miR-326
  hsa-miR-34a、hsa-miR-34c-5p、hsa-miR-449a、hsa-miR-449b
  hsa-miR-362-3p、hsa-miR-329
  hsa-miR-374a、hsa-miR-374b
  hsa-miR-376a、hsa-miR-376b
  hsa-miR-378、hsa-miR-422a
  hsa-miR-379*、hsa-miR-411*
  hsa-miR-381、hsa-miR-300
  hsa-miR-509-5p、hsa-miR-509-3-5p
  hsa-miR-515-5p、hsa-miR-519e*
  hsa-miR-516b*、hsa-miR-516a-3p
  hsa-miR-517a、hsa-miR-517c
  hsa-miR-518a-5p、hsa-miR-527
  hsa-miR-518f、hsa-miR-518b、hsa-miR-518c、hsa-miR-518a-3p、hsa-miR-518d-3p
  hsa-miR-519c-3p、hsa-miR-519b-3p、hsa-miR-519a
  表3
  hsa-miR-519c-5p、hsa-miR-519b-5p、hsa-miR-523*、hsa-miR-518f*、hsa-miR-526a、hsa-miR-520c-5p、hsa-miR-518e*、hsa-miR-518d-5p、hsa-miR-522*、hsa-miR-519a*
  hsa-miR-519e、hsa-miR-33b*
  hsa-miR-520a-5p、hsa-miR-525-5p
  hsa-miR-520g、hsa-miR-520h
  hsa-miR-524-5p、hsa-miR-520d-5p
  hsa-miR-525-3p、hsa-miR-524-3p
  hsa-miR-548b-5p、hsa-miR-548a-5p、hsa-miR-548c-5p、hsa-miR-548d-5p
  hsa-miR-7-1*、hsa-miR-7-2*
  hsa-miR-99a、hsa-miR-100、hsa-miR-99b
我们已构建针对miR-21、miR-155和miR-122(本文命名为微小miR)的8-聚体LNA-抗miR，其是完全LNA修饰且硫代磷酸酯化的(参见图1和表6)。来自使用关于miR-21、miR-155和miR-122的萤光素酶传感器质粒在MCF-7、HeLa、Raw和Huh-7细胞中的重复实验的结果证实，完全LNA修饰的短LNA-抗miR在拮抗微小RNA中是高度有效的。
Figure GPA00001084492700621
解链温度可以针对成熟微小RNA序列进行评估，使用合成的微小RNA寡核苷酸(一般由具有磷酸二酯主链的RNA核苷酸组成)。当使用针对RNA靶的量寡聚物时，一般测量的Tms高于预测的Tms。
实施例4：使用萤光素酶传感器测定法在MCF-7细胞中评估通过SEQ ID #3205LNA-抗miR对miR-21的拮抗。
为了评估完全LNA修饰的8-聚体LNA-抗miR(SEQ ID #3205)寡核苷酸在靶向且拮抗miR-21中的功效，制备萤光素酶传感器构建体，其包含关于成熟miR-21的极佳匹配靶位点，以及作为对照，在种子中具有2个突变的靶位点(图6)。为了监控微小RNA-21抑制，与用针对miR-21的15-聚体LNA-抗miR SEQ ID #3204相比较，用不同萤光素酶构建体连同miR-21拮抗剂SEQ ID #3205以各种浓度转染乳腺癌细胞系MCF-7。在24小时后，测量萤光素酶活性。
结果：如图2中可见，如通过萤光素酶活性的去阻遏显示的，与SEQ ID #3204相比较，新的完全LNA修饰的8-聚体LNA-抗miR(SEQID #3205)显示2倍高的功效。相比之下，在miR-21种子中具有2个错配的对照miR-21传感器构建体未显示萤火虫萤光素酶活性中的任何去阻遏，由此证实极佳匹配miR-21传感器在监控细胞中的miR-21活性中的特异性。萤光素酶活性通过8-聚体LNA-抗miR的去阻遏明显是剂量依赖性的，这对于SEQ ID #3204不可见。此外，新的8-聚体在更低剂量下也比SEQ ID #3204有效得多。
总之，与靶向miR-21的15-聚体LNA-抗miR SEQ ID #3204相比较，8-聚体LNA-抗miR(SEQ ID #3205)显示在体外抑制miR-21中显著改善的效力。
材料与方法：
细胞系：乳腺癌细胞系MCF-7购自ATCC(#HTB-22TM)。MCF-7细胞在补充有10％胎牛血清、2mM Glutamax、1x NEAA和25ug/ml庆大霉素的EMEM培养基中培养。
转染：在转染前一天将400.000个细胞种植在6孔板的每个孔中，以便第二天得到50-70％融合。在转染当天时，根据制造商的说明书，用0.8ug miR-21极佳匹配/psiCHECK2、miR-21.mm2/psiCHECK2或空psiCHECK2载体(SDS Promega)连同1μl Lipofectamine2000(Invitrogen)转染MCF-7细胞。在24小时后，收获细胞用于萤光素酶测量。
萤光素酶测定法：细胞用PBS洗涤并且用细胞刮棒收获，这之后将细胞在10.000rpm下离心5分钟。弃去上清液，并且将50μl 1xPassive Lysis Buffer(Promega)加入细胞团块中，这之后将细胞置于冰上30分钟。裂解细胞在10.000rpm下旋转30分钟，这之后将20μl转移至96孔板，并且根据制造商的说明书(Promega)执行萤光素酶测量。
实施例5：使用萤光素酶传感器测定法在HeLa细胞中评估通过SEQID#3205LNA-抗miR的miR-21拮抗。
为了进一步评估完全LNA修饰的8-聚体LNA-抗miR SEQ ID #3205在靶向miR-21中的功效，如上文部分中所述，用先前描述的miR-21萤光素酶传感器构建体连同SEQ ID #3205以各种浓度同样转染宫颈癌细胞系HeLa(图3)。
结果：与直至最高剂量(50nM)才显示完全去阻遏的SEQ ID #3204相比较，SEQ ID #3205在HeLa细胞中在5nm下已显示miR-21萤光素酶传感器构建体的完全去阻遏。此外，通过8-聚体SEQ ID #3205 LNA-抗miR的miR-21拮抗是剂量依赖性的。为了证实miR-21萤光素酶传感器测定法的特异性，将错配的miR-21靶位点(在种子中的2个错配)同样转染到HeLa细胞内，但未显示萤火虫萤光素酶活性中的任何去阻遏。
总之，与15-聚体LNA-抗miR SEQ ID #3204相比较，完全LNA修饰的SEQ ID #3205显示在MCF-7和HeLa细胞中在体外抑制miR-21中显著改善的效力。
材料与方法：
细胞系：人宫颈癌细胞系HeLa购自ECACC(#93021013)。HeLa细胞在补充有10％胎牛血清、2mM Glutamax、1x NEAA和25ug/ml庆大霉素的EMEM培养基中培养。
转染：在转染前一天将60.000个细胞种植在24孔板的每个孔中，以便第二天得到50-70％融合。在转染当天时，根据制造商的说明书，用0.2ug miR-21极佳匹配/psiCHECK2、miR-21.mm2/psiCHECK2或空psiCHECK2载体连同0,7μl Lipofectamine2000(Invitrogen)转染HeLa细胞。在24小时后，收获细胞用于萤光素酶测量。
萤光素酶测定法：细胞用PBS洗涤并且将100μl 1x PassiveLysis Buffer(Promega)加入每个孔中，这之后将24孔板置于定轨摇床上30分钟。收集细胞并且转移至eppendorf管，并且在10.000rpm下旋转30分钟，这之后将10μl转移至96孔板，并且根据制造商的说明书(Promega)执行萤光素酶测量。
实施例6：使用萤光素酶传感器测定法在小鼠RAW细胞中评估通过SEQ ID #3207 LNA-抗miR的miR-155拮抗。
为了询问完全LNA修饰的8-聚体LNA-抗miR是否有效拮抗miR-155，将关于miR-155的极佳匹配靶位点克隆到相同萤光素酶载体(psiCHECK2)内，并且转染到小鼠白血病单核细胞巨噬细胞RAW细胞系内。因为miR-155的内源水平在RAW细胞系中很低，所以细胞用100ng/ml LPS处理24小时，以便诱导miR-155蓄积。
结果：萤光素酶测量显示与15-聚体LNA-抗miR SEQ ID #3206相比较，靶向miR-155的完全LNA修饰的8-聚体LNA-抗miR SEQ ID#3207在拮抗miR-155中同样有效(图4)。2种LNA-抗miR都显示在0.25nM浓度下miR-155萤光素酶传感器＞50％的去阻遏，并且以依赖依赖性方式抑制miR-155。
结论：这些数据进一步支持来自拮抗miR-21的结果，如实施例1和2中所示，证实完全硫醇化的8-聚体LNA-抗miR在微小RNA靶向中高度有效。
材料与方法：
细胞系：小鼠白血病单核细胞巨噬细胞RAW 264.7购自ATCC(TIB-71)。RAW细胞在补充有10％胎牛血清、4mM Glutamax和25ug/ml庆大霉素的DMEM培养基中培养。
转染：在转染前一天将500.000个细胞种植在6孔板的每个孔中，以便第二天得到50％融合。在转染当天时，根据制造商的说明书，用0.3ug miR-155或空psiCHECK2载体连同10μl Lipofectamine2000(Invitrogen)转染MCF-7细胞。为了诱导miR-155蓄积，在与转染复合物温育4小时后，将LPS(100ng/ml)加入RAW细胞中。在另外24小时后，收获细胞用于萤光素酶测量。
萤光素酶测定法：细胞用PBS洗涤并且用细胞刮棒收获，这之后将细胞在2.500rpm下离心5分钟。弃去上清液，并且将50μl 1xPassive Lysis Buffer(Promega)加入细胞团块中，这之后将细胞置于冰上30分钟。裂解细胞在10.000rpm下旋转30分钟，这之后将20μl转移至96孔板，并且根据制造商的说明书(Promega)执行萤光素酶测量。
实施例7：使用萤光素酶传感器测定法在HuH-7细胞中评估通过SEQ ID #3208 LNA-抗miR的miR-122拮抗。
在人肝瘤细胞系HuH-7中评估完全修饰的8-聚体LNA-抗miR SEQID #3208针对miR-122的效力。用包含极佳匹配miR-122靶位点的萤光素酶传感器构建体转染HuH-7细胞。在24小时后，执行萤光素酶测量(图5)。
结果：如通过miR-122萤光素酶传感器的去阻遏显示的，完全LNA修饰的8-聚体LNA-抗miR SEQ ID #3208在低浓度下比15-聚体LNA-抗miR SEQ ID #4更有效。2种LNA-抗miR都以剂量依赖性方式抑制miR-122(图5)。
结论：靶向miR-122的完全LNA修饰的8-聚体LNA-抗miR SEQ ID#3208显示在体外抑制miR-122中改善的效力。
材料与方法：
细胞系：人肝瘤细胞系HuH-7是来自R.Bartenschlager，Heidelberg的友情赠予。Huh-7细胞在补充有10％胎牛血清、2mMGlutamax、1x NEAA和25ug/ml庆大霉素的EMEM培养基中培养。
转染：在转染前一天将8.000个细胞种植在96孔板的每个孔中，以便第二天得到50-70％融合。在转染当天时，用57ng miR-122或空psiCHECK2载体连同1μl Lipofectamine2000(Invitrogen)转染HuH-7细胞。在24小时后，收获细胞用于萤光素酶测量。
萤光素酶测定法：将50μl 1x Passive Lysis Buffer(Promega)加入每个孔中，这之后将96孔板置于定轨摇床上30分钟。向每个孔中加入Dual-luciferase Reporter测定法系统(Promega)，并且根据制造商的说明书(Promega)执行萤光素酶测量。
实施例8.在人前列腺癌细胞(PC3)中评估通过8-聚体(SEQ ID#3205)与15-聚体(SEQ ID #3204)LNA-抗miR相比较的miR-21拮抗。
我们先前已显示(专利申请1051)，完全LNA修饰且硫代磷酸酯化的8-聚体LNA-抗miR在人宫颈癌细胞系HeLa中能够完全去阻遏miR-21萤光素酶报道子水平，并且在人乳腺癌细胞系MCF-7中部分去阻遏miR-21萤光素酶报道子水平。接下来我们将这种筛选方法扩展至人前列腺癌细胞系PC3。为了评估不同LNA-抗miR寡核苷酸针对miR-21的功效，产生萤光素酶报道子构建体，其中将关于成熟miR-21的极佳匹配靶位点和在种子中具有2个错配的靶位点克隆到海肾萤光素酶基因的3′UTR中(图7)。为了监控miR-21抑制，用不同萤光素酶构建体连同miR-21拮抗剂SEQ ID #3205(8-聚体)和用于比较的15-聚体LNA-抗miR极佳匹配SEQ ID #3204以各种浓度转染PC3细胞。在24小时后，测量萤光素酶活性。
结果：萤光素酶报道子实验显示使用针对miR-21的15-聚体LNA-抗miR(SEQ ID #3204)的萤光素酶miR-21报道子活性的剂量依赖性去阻遏。然而，即使在最高浓度下也未获得萤光素酶报道子的完全去阻遏(图7)。相比之下，用8-聚体完全LNA取代的LNA-抗miR转染的细胞显示在1nM下的完全去阻遏，指出与15-聚体LNA-抗miR相比较显著改善的效力。具有关于miR-21的错配靶位点的萤光素酶对照报道子不受任一LNA-抗miR的影响，证实2种LNA-抗miR的高特异性。
结论：微小聚体(micromer)在靶向miR-21中比15-聚体LNA-抗miR有效得多，并且迄今为止已显示在前列腺癌细胞中最有效。
材料与方法：
细胞系：人前列腺癌PC3细胞系购自ECACC(#90112714)。PC3细胞在补充有10％胎牛血清、2mM Glutamax和25ug/ml庆大霉素的DMEM培养基中培养。
转染：在转染前一天将100.000个细胞种植在12孔板的每个孔中，以便第二天得到50％融合。在转染当天时，根据制造商的说明书，用0.3μg miR-21或空psiCHECK2载体连同1,2μl Lipofectamine2000(Invitrogen)转染PC3细胞。还转染了各种浓度的LNA-抗miR。在24小时后，收获细胞用于萤光素酶测量。
萤光素酶测定法：细胞用PBS洗涤并且将250μl 1x PassiveLysis Buffer(Promega)加入孔中。将平板置于摇床上30分钟，这之后将细胞裂解物转移至eppendorf管。细胞裂解物在2.500rpm下离心10分钟，这之后将20μl转移至96孔板，并且根据制造商的说明书(Promega)执行萤光素酶测量。
实施例9.通过8-聚体LNA-抗miR的miR-21拮抗的特异性评估
为了研究我们的靶向miR-21的短LNA-抗miR的特异性，设计在种子识别序列中包含2个错配的8-聚体错配对照LNA-抗miR(SEQ ID#3218)(参见图8)。将实施例1中描述的萤光素酶报道子构建体连同LNA错配对照寡核苷酸SEQ ID #3218一起转染到人宫颈癌细胞系HeLa内，并且将它的功效与靶向miR-21的8-聚体LNA-抗miR(SEQ ID#3205)相比较。在24小时后，测量萤光素酶活性。
结果：如图8中所示，完全LNA修饰的8-聚体LNA-抗miR在HeLa细胞中的转染导致已在5nM下的萤光素酶miR-21报道子的完全去阻遏。相比之下，当细胞用8-聚体LNA错配对照寡核苷酸转染时，与用在miR-21种子中具有2个错配的对照miR-21萤光素酶报道子获得的结果相组合，这些数据证实完全LNA取代的8-聚体LNA-抗miR在HeLa细胞中靶向miR-21的高特异性。
miRBase微小RNA序列数据库的分析显示LNA-抗miR SEQ ID #3205的miR-21识别序列对于微小RNA-21是独特的。然而，当将微小聚体长度减至7nt时，它不只是对于miR-21特异，因为还靶向ath-miR-844、mmu-miR-590-3p和has-miR-590-3p。
结论：用2个错配核苷酸交换8-聚体LNA-抗miR内的2个核苷酸位置完全取消LNA-抗miR对于miR-21的拮抗活性。
材料与方法：
细胞系：人宫颈癌细胞系HeLa购自ECACC(#93021013)。HeLa细胞在补充有10％胎牛血清、2mM Glutamax、1x NEAA和25ug/ml庆大霉素的EMEM培养基中培养。
转染：在转染前一天将60.000个细胞种植在24孔板的每个孔中，以便第二天得到50-70％融合。在转染当天时，根据制造商的说明书，用0.2ug miR-21极佳匹配/psiCHECK2、miR-21.mm2/psiCHECK2或空psiCHECK2载体连同0,7μl Lipofectamine2000(Invitrogen)转染HeLa细胞。还转染了各种浓度的LNA-抗miR。在24小时后，收获细胞用于萤光素酶测量。
萤光素酶测定法：细胞用PBS洗涤并且将100μl 1x PassiveLysis Buffer(Promega)加入每个孔中，这之后将24孔板置于定轨摇床上30分钟。收集细胞并且转移至eppendorf管，并且在10.000rpm下旋转30分钟，这之后将10μl转移至96孔板，并且根据制造商的说明书(Promega)执行萤光素酶测量。
实施例10.介导miR-21有效拮抗的完全LNA修饰的LNA-抗miR的最短可能长度评估。
为了进一步研究LNA-抗miR长度需求，我们设计靶向miR-21的7-聚体和6-聚体LNA-抗miR，两者都是完全LNA修饰且硫代磷酸酯化的寡核苷酸。将miR-21萤光素酶报道子构建体连同LNA-抗miR以各种浓度一起转染到HeLa细胞内。在24小时后，执行萤光素酶测量。
结果：如图9中所示，7-聚体LNA-抗miR介导miR-21萤光素酶报道子质粒的去阻遏，但与8-聚体LNA-抗miR(SEQ ID #3205)相比较处于较低效力。然而，仍可以观察到剂量依赖性趋势。相比之下，6-聚体LNA-抗miR未显示任何抑制活性。
结论：总之，能够介导miR-21抑制的LNA-抗miR的最短可能长度是7个核苷酸。然而，对于miR-21与8-聚体LNA-抗miR相比较，7-聚体LNA-抗miR较不有效。
材料与方法：
细胞系：人宫颈癌细胞系HeLa购自ECACC(#93021013)。HeLa细胞在补充有10％胎牛血清、2mM Glutamax、1x NEAA和25ug/ml庆大霉素的EMEM培养基中培养。
转染：在转染前一天将60.000个细胞种植在24孔板的每个孔中，以便第二天得到50-70％融合。在转染当天时，根据制造商的说明书，用0.2ug miR-21极佳匹配/psiCHECK2、miR-21.mm2/psiCHECK2或空psiCHECK2载体连同0,7μl Lipofectamine2000(Invitrogen)转染HeLa细胞。还转染了各种浓度的LNA-抗miR。在24小时后，收获细胞用于萤光素酶测量。
萤光素酶测定法：细胞用PBS洗涤并且将100μl 1x PassiveLysis Buffer(Promega)加入每个孔中，这之后将24孔板置于定轨摇床上30分钟。收集细胞并且转移至eppendorf管，并且在10.000rpm下旋转30分钟，这之后将10μl转移至96孔板，并且根据制造商的说明书(Promega)执行萤光素酶测量。
实施例11.拮抗miR-21的完全LNA取代的LNA-抗miR的长度评估。
接下来，我们研究了使长度从9-聚体增至14-聚体完全LNA取代的LNA-抗miR对在HeLa细胞中拮抗miR-21的作用。将所得到的LNA-抗miR连同miR-21萤光素酶报道子构建体一起转染到HeLa细胞内(图10)。在24小时后，执行萤光素酶测量。
结果：如对于7-聚体LNA-抗miR(SEQ ID #3210)证实的，9-聚体LNA-抗miR SEQ ID #3211(9-聚体)显示miR-21萤光素酶报道子的剂量依赖性去阻遏，这未达到完全去阻遏。如通过miR-21报道子的较不有效去阻遏显示的，使长度增至10-聚体至14-聚体(SEQ ID#3212、SEQ ID #3213和SEQ ID #3214)减少效力。
结论：如图10中所示，仍能够介导miR-21抑制的最长完全LNA修饰且硫代磷酸酯化的LNA-抗miR是9-聚体LNA-抗miR SEQ ID#3211。然而，它明显不如7-聚体和8-聚体LNA-抗miR有效。
材料与方法：细胞系：人宫颈癌细胞系HeLa购自ECACC(#93021013)。HeLa细胞在补充有10％胎牛血清、2mM Glutamax、1x NEAA和25ug/ml庆大霉素的EMEM培养基中培养。
转染：在转染前一天将60.000个细胞种植在24孔板的每个孔中，以便第二天达到50-70％融合。在转染当天时，根据制造商的说明书，用0.2ug miR-21极佳匹配/psiCHECK2、miR-21.mm2/psiCHECK2或不含靶位点的空psiCHECK2对照载体连同0,7μl Lipofectamine2000(Invitrogen)转染HeLa细胞。还转染了各种浓度的LNA-抗miR。在24小时后，收获细胞用于萤光素酶测量。
萤光素酶测定法：细胞用PBS洗涤并且将100μl 1x PassiveLysis Buffer(Promega)加入每个孔中，这之后将24孔板置于定轨摇床上30分钟。收集细胞并且转移至eppendorf管，并且在10.000rpm下旋转30分钟，这之后将10μl转移至96孔板，并且根据制造商的说明书(Promega)执行萤光素酶测量。
实施例12.关于8-聚体LNA-抗miR在miR靶识别序列内的最佳位置的测定。
我们的实验已显示最有效的完全LNA修饰硫代磷酸酯化的LNA-抗miR的长度是8个核苷酸。为了评估关于8-聚体LNA-抗miR在miR靶识别序列内的最佳位置，如图11中所示我们设计了平铺在成熟miR-21序列上的4种不同的完全LNA修饰的8-聚体LNA-抗miR。将不同LNA-抗miR连同miR-21萤光素酶报道子构建体一起共转染到HeLa细胞内。在24小时后，执行萤光素酶测量。
结果：如通过萤光素酶报道子测量的，介导miR-21的有效沉默的唯一LNA-抗miR是靶向miR-21的种子区域的SEQ ID #3205。设计为覆盖种子的3′末端(50％种子靶向)的SEQ ID #3215，以及定位以分别靶向成熟miR-21的中央区域和3′末端的其他2种LNA-抗miR SEQ ID#3216或SEQ ID #3217都未显示任何作用。
结论：介导miR-21的有效沉默的唯一8-聚体LNA-抗miR是靶向miR-21的种子的那种。
材料与方法：
细胞系：人宫颈癌细胞系HeLa购自ECACC(#93021013)。HeLa细胞在补充有10％胎牛血清、2mM Glutamax、1x NEAA和25ug/ml庆大霉素的EMEM培养基中培养。
转染：在转染前一天将60.000个细胞种植在24孔板的每个孔中，以便第二天达到50-70％融合。在转染当天时，根据制造商的说明书，用0.2ug miR-21极佳匹配/psiCHECK2、miR-21.mm2/psiCHECK2或不含靶位点的空psiCHECK2载体连同0,7μl Lipofectamine2000(Invitrogen)转染HeLa细胞。还转染了各种浓度的LNA-抗miR。在24小时后，收获细胞用于萤光素酶测量。
萤光素酶测定法：细胞用PBS洗涤并且将100μl 1x PassiveLysis Buffer(Promega)加入每个孔中，这之后将24孔板置于定轨摇床上30分钟。收集细胞并且转移至eppendorf管，并且在10.000rpm下旋转30分钟，这之后将10μl转移至96孔板，并且根据制造商的说明书(Promega)执行萤光素酶测量。
实施例13.使用8-聚体SEQ ID #3205LNA-抗miR验证在Pdcd4-3′-UTR和miR-21中的miR-21靶位点的相互作用。
肿瘤抑制蛋白质Pdcd4抑制TPA诱导的赘生物转化、肿瘤启动和进展。也已显示Pdcd4在响应不同诱导物的凋亡中被上调。此外，Pdcd4在肺和结肠直肠癌中的下调也已与患者预后不良相关。近来，Asangani等人和Frankel等人显示Pdcd4-3′-UTR包含对于miR-21的保守靶位点，并且用抗miR-21转染细胞导致Pdcd4蛋白质中的增加。因此我们构建了具有包含上述miR-21靶位点的Pdcd4的313nt 3′UTR区域的萤光素酶报道子质粒，这与不同LNA-抗miR一起共转染到HeLa细胞内。不同LNA-抗miR是；SEQ ID #3205(8-聚体，极佳匹配)或SEQ ID#3218(8-聚体，错配)。在24小时后，执行萤光素酶测量。
结果：如图12中所示，在用Pdcd43′UTR萤光素酶报道子和SEQID #3205转染的细胞中，观察到萤光素酶活性中的增加，指出Pdcd43′UTR和miR-21之间的相互作用。然而，用错配化合物SEQ ID #3218转染细胞，未观察到萤光素酶活性中的改变，这是预期到的，因为该化合物不拮抗miR-21。当使8-聚体LNA-抗miR针对2种更长设计的LNA-抗miR相比较时，短完全LNA修饰且硫代磷酸酯化的LNA-抗miR明显更有效，证实先前萤光素酶测定法数据。
结论：这些数据得出结论拮抗miR-21的SEQ ID#3205可以调节Pdcd43′UTR和miR-21之间的相互作用。
材料与方法：
细胞系：人宫颈癌细胞系HeLa购自ECACC(#93021013)。HeLa细胞在补充有10％胎牛血清、2mM Glutamax、1x NEAA和25ug/ml庆大霉素的EMEM培养基中培养。
转染：在转染前一天将60.000个细胞种植在24孔板的每个孔中，以便第二天达到50-70％融合。在转染当天时，根据制造商的说明书，用0.2ug Pdcd4-3′-UTR/psiCHECK2或空psiCHECK2载体连同0,7μlLipofectamine2000(Invitrogen)转染HeLa细胞。还转染了各种浓度的LNA-抗miR寡核苷酸。在24小时后，收获细胞用于萤光素酶测量。
萤光素酶测定法：细胞用PBS洗涤并且将100μl 1x PassiveLysis Buffer(Promega)加入每个孔中，这之后将24孔板置于定轨摇床上30分钟。收集细胞并且转移至eppendorf管，并且在10.000rpm下旋转30分钟，这之后将10μl转移至96孔板，并且根据制造商的说明书(Promega)执行萤光素酶测量。
实施例14.8-聚体LNA-抗miR(SEQ ID #3207)与15-聚体LNA-抗miR(SEQ ID #3206)在小鼠RAW细胞中拮抗miR-155中的比较。
为了询问使用短LNA-抗miR的方法是否可以适合于靶向其他miRNA，我们设计了针对微小RNA-155的完全LNA修饰的8-聚体LNA-抗miR。将关于miR-155的极佳匹配靶位点克隆到报道子质粒psiCHECK2中的萤光素酶基因的3′UTR内，并且连同8-聚体或15-聚体LNA-抗miR一起转染到小鼠RAW巨噬细胞细胞系内。因为miR-155的内源水平在RAW细胞系中很低，所以细胞用100ng/ml LPS处理24小时，以便诱导miR-155蓄积。在24小时后，执行萤光素酶分析。
结果：萤光素酶测量显示与15-聚体LNA-抗miR SEQ ID #3206相比较，靶向miR-155的完全LNA修饰的8-聚体LNA-抗miR SEQ ID#3207在拮抗miR-155中同样有效(图13)。2种LNA-抗miR都显示在0.25nM浓度下miR-155萤光素酶传感器＞50％的去阻遏，并且以依赖依赖性方式抑制miR-155。
miRBase微小RNA序列数据库的分析显示LNA-抗miR SEQ ID #3207的miR-155识别序列对于微小RNA-155是独特的。然而，当将LNA-抗miR长度减至7nt时，它不只是对于miR-155特异，还靶向mdv1-miR-M4和kshv-miR-K12-11。
结论：在拮抗miR-155中，与混合LNA/DNA设计的15-聚体LNA-抗miR相比较，完全LNA修饰且硫代磷酸酯化的8-聚体LNA-抗miR同样有效。因此，使用短LNA-抗miR的方法可以容易地适合于靶向其他miRNA。
材料与方法：
细胞系：小鼠巨噬细胞RAW 264.7细胞系购自ATCC(TIB-71)。RAW细胞在补充有10％胎牛血清、4mM Glutamax和25ug/ml庆大霉素的DMEM培养基中培养。
转染：在转染前一天将500.000个细胞种植在6孔板的每个孔中，以便第二天得到50％融合。在转染当天时，根据制造商的说明书，用0.3ug miR-155极佳匹配/psiCHECK2或空psiCHECK2载体连同10μlLipofectamine2000(Invitrogen)转染RAW 264.7细胞。还转染了各种浓度的LNA-抗miR。为了诱导miR-155蓄积，在与转染复合物温育4小时后，将LPS(100ng/ml)加入RAW细胞中。在另外24小时后，收获细胞用于萤光素酶测量。
萤光素酶测定法：细胞用PBS洗涤并且用细胞刮棒收获，这之后细胞在2.500rpm下旋转5分钟。弃去上清液，并且将50μl 1x PassiveLysis Buffer(Promega)加入细胞团块中，这之后将细胞置于冰上30分钟。裂解细胞在10.000rpm下旋转30分钟，这之后将20μl转移至96孔板，并且根据制造商的说明书(Promega)执行萤光素酶测量。
实施例15.作为关于通过短LNA-抗miR(SEQ ID #3207)的miR-155拮抗的功能读数的c/EBPβ蛋白质水平评估。
作为关于通过短LNA-抗miR(SEQ ID #3207)的miR-155拮抗的功能读数，我们测定了新miR-155靶——c/EBPβ的蛋白质水平。在miR-155前体的不存在或存在下，连同8-聚体(SEQ ID #3207)或15-聚体(SEQ ID #3206)LNA-抗miR转染小鼠巨噬细胞RAW细胞系。作为对于15-聚体的错配对照，使用靶向miR-122的SEQ ID #4，并且对于8-聚体，使用靶向miR-21的SEQ ID #3205。这2种对照miRNA不调节c/EBPβ表达水平。LPS用于诱导miR-155蓄积，并且在用LPS 16小时后收获细胞。c/EBPβ具有3种同工型：LIP、LAP和LAP*，其通过western印迹分析进行检测，并且用β-微管蛋白作为上样对照重新探测相同膜。
结果：如图14中所示计算关于c/EBPβ LIP和β-微管蛋白的比。用15-聚体LNA-抗miR和无pre-miR-155转染的RAW细胞，全都显示相等的c/EBPβ LIP/β-微管蛋白比，由于对miR-155的抑制增加c/EBPβ LIP水平(图14，左图)。相比之下，在RAW细胞中pre-miR-155的转染导致如预期减少的c/EBPβ LIP水平，如果c/EBPβ是miR-155靶，如在具有来自不用LNA处理或用错配处理的RAW细胞的蛋白质提取物的泳道中所示的。然而，来自用针对miR-155的LNA-抗miR转染的RAW细胞的蛋白质提取物显示c/EBPβ LIP水平的增加。还用8-聚体LNA-抗miR-155(SEQ ID #3207)执行相同实验，并且如图14(右图)中所示，获得与用15-聚体LNA-抗miR SEQ ID #3206的那些可比较的结果。
结论：使用8-聚体或15-聚体LNA-抗miR拮抗miR-155导致直接靶c/EBPβ的去阻遏。
材料与方法：
细胞系：小鼠巨噬细胞RAW 264.7细胞系购自ATCC(TIB-71)。RAW细胞在补充有10％胎牛血清、4mM Glutamax和25ug/ml庆大霉素的DMEM培养基中培养。
转染：在转染前一天将500.000个细胞种植在6孔板的每个孔中，以便第二天达到50％融合。在转染当天时，根据制造商的说明书，用5nmol pre-miR-155(Ambion)和/或5nM LNA-抗miR连同10μlLipofectamine2000(Invitrogen)转染RAW 264.7细胞。还转染了各种浓度的LNA-抗miR。为了诱导miR-155蓄积，在与转染复合物温育4小时后，将LPS(100ng/ml)加入RAW细胞中。在16小时后，收获细胞用于蛋白质提取和western印迹分析。
western印迹：细胞用PBS洗涤、进行胰蛋白酶处理、转移至eppendorf管，并且加入250μl裂解缓冲液(1xRIPA)。将细胞裂解物置于冰上20分钟，并且在10.000rpm下旋转10分钟。根据制造商的说明书，用Coomassie Plus测量蛋白质浓度，并且将80ug装载到4-12％BIS-TRIS凝胶上。使膜与单克隆小鼠一抗C/EBPβ(SantaCruz)以1∶100浓度在4℃下温育过夜。用ECL Plus(Amersham)显现免疫反应性条带。
实施例16.通过完全LNA修饰的8-聚体(SEQ ID #3221)LNA-抗miR对miR-106b的拮抗
为了证实使用短LNA-抗miR的方法可以适合于靶向其他miRNA，我们设计了针对微小RNA-106b的完全LNA修饰的8-聚体LNA-抗miR。将关于miR-106b的极佳匹配靶位点克隆到载体(psiCHECK2)中的萤光素酶基因的3′UTR内，并且连同短LNA-抗miR(SEQ ID #3221)或15-聚体LNA-抗miR(SEQ ID #3228)一起以各种浓度转染到人宫颈癌HeLa细胞系内。在24小时后，执行萤光素酶测量。
结果：如通过萤光素酶报道子的去阻遏显示的，针对miR-106b的8-聚体LNA-抗miR SEQ ID #3221转染导致miR-106b的剂量依赖性抑制，这在1nM LNA-抗miR浓度下完全去阻遏(图15)。使用15-聚体LNA-抗miR SEQ ID #3228获得可比较的结果，证实8-聚体LNA-抗miR与15-聚体同样有效。
结论：在HeLa细胞中靶向miR-106b显示与15-聚体LNA/DNA混合聚体LNA-抗miR相比较，8-聚体完全LNA修饰且硫代磷酸酯化的LNA-抗miR同样有效。
材料与方法：
细胞系：人宫颈癌细胞系HeLa购自ECACC(#93021013)。HeLa细胞在补充有10％胎牛血清、2mM Glutamax、1x NEAA和25ug/ml庆大霉素的EMEM培养基中培养。
转染：在转染前一天将5.200个细胞种植在96孔板的每个孔中，以便第二天达到50-70％融合。在转染当天时，根据制造商的说明书，用57ng miR-21极佳匹配/psiCHECK2、miR-21.mm2/psiCHECK2或空psiCHECK2载体连同0,14μl Lipofectamine2000(Invitrogen)转染HeLa细胞。还转染了各种浓度的LNA-抗miR。在24小时后，收获细胞用于萤光素酶测量。
萤光素酶测定法：细胞用PBS洗涤并且将30μl 1x Passive LysisBuffer(Promega)加入每个孔中，这之后将24孔板置于定轨摇床上30分钟。收集细胞并且转移至eppendorf管，并且在10.000rpm下旋转30分钟，这之后根据制造商的说明书(Promega)执行萤光素酶测量。
实施例17.通过完全LNA修饰的8-聚体(SEQ ID #3222)LNA-抗miR对miR-19a的拮抗
为了进一步证实使用短LNA-抗miR的方法可以容易地适合于靶向其他miRNA，我们设计了针对微小RNA-19a的完全LNA修饰的8-聚体LNA-抗miR。将关于miR-19a的极佳匹配靶位点克隆到psiCHECK2载体中的萤光素酶基因的3′UTR内。将报道子质粒连同靶向miR-19a的短LNA-抗miR(SEQ ID #3222)或15-聚体LNA-抗miR(SEQ ID #3229)一起以各种浓度转染到人宫颈癌HeLa细胞系内。在24小时后，执行萤光素酶测量。
结果：如图16中所示，如通过在1nM LNA-抗miR浓度下的完全去阻遏证实的，15-聚体LNA-抗miR SEQ ID #3229转染到HeLa内有效拮抗miR-19a。相比之下，8-聚体LNA-抗miR SEQ ID #3222的转染导致已在0.5nM浓度下的有效miR-19a拮抗，指出在HeLa细胞中与15-聚体LNA-抗miR相比较，这种8-聚体LNA-抗miR至少同样有效。
结论：在HeLa细胞中靶向miR-19a显示与15-聚体LNA/DNA混合聚体LNA-抗miR相比较，8-聚体完全LNA修饰且硫代磷酸酯化的LNA-抗miR至少同样有效。
材料与方法：细胞系：人宫颈癌细胞系HeLa购自ECACC(#93021013)。HeLa细胞在补充有10％胎牛血清、2mM Glutamax、1x NEAA和25ug/ml庆大霉素的EMEM培养基中培养。
转染：在转染前一天将5.200个细胞种植在96孔板的每个孔中，以便第二天达到50-70％融合。在转染当天时，根据制造商的说明书，用57ng miR-21极佳匹配/psiCHECK2、miR-21.mm2/psiCHECK2或空psiCHECK2载体连同0,14μl Lipofectamine2000(Invitrogen)转染HeLa细胞。还转染了各种浓度的LNA-抗miR。在24小时后，收获细胞用于萤光素酶测量。
萤光素酶测定法：细胞用PBS洗涤并且将30μl 1x Passive LysisBuffer(Promega)加入每个孔中，这之后将24孔板置于定轨摇床上30分钟。收集细胞并且转移至eppendorf管，并且在10.000rpm下旋转30分钟，这之后根据制造商的说明书(Promega)执行萤光素酶测量。
实施例18.使用短完全LNA取代的LNA-抗miR靶向微小RNA家族。
接下来，研究是否能够使用与种子序列互补的单个短7-聚体LNA-抗miR靶向微小RNA家族，所述种子序列是所有家族成员共有的(参见图17)。在这个实验中，我们聚焦于在结肠、胰腺、前列腺和胃的实体瘤中过表达的miR-221和miR-222。还已显示miR-221和miR-222是在多形性成胶质细胞瘤中最显著上调的微小RNA。此外，miR-221和miR-222的过表达可能促成前列腺癌的生长和进展，这至少部分通过阻断肿瘤抑制蛋白质p27。将分别关于miR-221和miR-222的极佳匹配靶位点克隆到萤光素酶基因的3′UTR内，导致2种报道子构建体。这些构建体随后分开或组合转染到前列腺癌细胞系PC3内。除靶向miR-221和miR-222两者的7-聚体外，还共转染靶向miR-221(SEQ ID #3223)或miR-222(SEQ ID #3224)的15-聚体LNA-抗miR(15聚体)，各自分开或一起转染(参见图18左)。
结果：如图18中所示，用针对miR-221的LNA-抗miR SEQ ID #3223转染PC3细胞导致在1nM LNA-抗miR浓度下对miR-221的有效抑制。
当使用关于miR-222的萤光素酶报道子质粒时，以及当将关于miR-221和miR-222的2种萤光素酶报道子同时共转染到PC3细胞内时，也观察到抑制效应。这种抑制效应最可能是由于miR-221和miR-222之间共享的种子序列。类似地，如通过关于miR-222的萤光素酶报道子的完全去阻遏显示的，用针对miR-222的LNA-抗miR SEQ ID #3224转染PC3细胞导致在1nM LNA-抗miR浓度下miR-222的有效抑制。当使用关于miR-222的萤光素酶报道子质粒时，以及当将关于miR-221和miR-222的2种萤光素酶报道子同时共转染到PC3细胞内时，也观察到抑制效应。当分别转染时和当共转染到PC3细胞内时，如通过萤光素酶报道子质粒的完全去阻遏显示的，分别针对miR-221和miR-222的2种LNA-抗miR化合物SEQ ID #3223和SEQ ID #3224的共转染(参见图18左)，导致2种miRNA的有效抑制。有趣的是，当分别转染时和当共转染到PC3细胞内时，如通过萤光素酶报道子质粒的完全去阻遏显示的，靶向miR-221和miR-222的种子序列的单个完全LNA修饰的7-聚体LNA-抗miR(SEQ ID #3225)转染到PC3细胞内，导致miR-221和miR-222同时有效的剂量依赖性拮抗。这证实单个短LNA取代的LNA-抗miR可以有效靶向种子序列，从而同时拮抗整个微小RNA家族。miRBase微小RNA序列数据库的分析显示LNA-抗miR SEQ ID #3225的miR-221/222种子识别序列对于2种miRNA是独特的。
结论：我们的结果证实LNA使得能够设计并合成短完全LNA取代的LNA-抗miR寡核苷酸，其可以有效靶向微小RNA种子序列，从而同时拮抗整个微小RNA家族。
材料与方法：
细胞系：人前列腺癌PC3细胞系购自ECACC(#90112714)。PC3细胞在补充有10％胎牛血清、2mM Glutamax和25ug/ml庆大霉素的DMEM培养基中培养。
转染：在转染前一天将100.000个细胞种植在12孔板的每个孔中，以便第二天得到50％融合。在转染当天时，根据制造商的说明书，用关于miR-221或关于miR-222的0.3μg萤光素酶报道子质粒或作为对照不含miRNA靶位点的空psiCHECK2载体连同1,2μlLipofectamine2000(Invitrogen)转染PC3细胞。在24小时后，收获细胞用于萤光素酶测量。
萤光素酶测定法：细胞用PBS洗涤并且将250μl 1x PassiveLysis Buffer(Promega)加入孔中。将平板置于摇床上30分钟，这之后将细胞裂解物转移至eppendorf管。细胞裂解物在2.500rpm下离心10分钟，这之后将20μl转移至96孔板，并且根据制造商的说明书(Promega)执行萤光素酶测量。
实施例19.作为关于通过7-聚体SEQ ID #3225LNA-抗miR的miR-221/222家族拮抗的功能读数的p27蛋白质水平评估。
先前工作已显示(le Sage等人2007，Galardi等人2007)miR-221和miR-222转录后调节涉及细胞周期调节的肿瘤抑制子基因p27的表达。在这些研究中，显示miR-221和miR-222的下调增加p27的表达水平。因此，作为关于通过7-聚体SEQ ID #3225LNA-抗miR的miR-221/222家族拮抗的功能读数，与8-聚体LNA错配对照相比较，在将LNA-抗miR SEQ ID #3225转染到PC3细胞内后，测定p27的蛋白质水平。在24小时后，收获细胞用于western印迹分析(图19)。
结果：如图19中所示，与未转染或LNA错配对照转染的PC3细胞相比较，靶向miR-221和miR-222中的种子序列的7-聚体LNA-抗miRSEQ ID #3225转染导致p27蛋白质水平中的剂量依赖性增加。这些结果明确证实7-聚体LNA-抗miR能够有效拮抗miR-221/222家族，导致直接靶p27在蛋白质水平上的去阻遏。
结论：靶向miR-221/222家族中的种子序列的完全LNA修饰的7-聚体LNA-抗miR有效拮抗2种miRNA，导致直接靶p27在蛋白质水平上的去阻遏。
材料与方法：
细胞系：人前列腺癌PC3细胞系购自ECACC(#90112714)。PC3细胞在补充有10％胎牛血清、2mM Glutamax和25ug/ml庆大霉素的DMEM培养基中培养。
转染：在转染前一天将250.000个细胞种植在6孔板的每个孔中，以便第二天得到50％融合。在转染当天时，用LNA-抗miR以各种浓度连同Lipofectamine2000转染PC3细胞。在24小时后，收获细胞用于蛋白质提取和western印迹分析。
western印迹：细胞用PBS洗涤、进行胰蛋白酶处理、转移至eppendorf管，并且加入250μl裂解缓冲液(1xRIPA)。将细胞裂解物置于冰上20分钟，并且在10.000rpm下旋转10分钟。根据制造商的说明书，用Coomassie Plus测量蛋白质浓度，并且将100ug装载到4-12％BIS-TRIS凝胶上。使膜与单克隆小鼠一抗p27(BDBiosciences)以1∶1000稀释度在4℃下温育过夜。用ECL Plus(Amersham)显现免疫反应性条带。
实施例20.LNA-抗miR的双链体解链温度(Tm)。
如表5中所示，Tm值随着短完全修饰的LNA-抗miR的长度增加而增加(参见表7中关于SEQ ID #3205、SEQ ID #3209-3214的Tm值)。用针对miR-21的8-聚体LNA-抗miR SEQ ID #3205达到最佳抑制效应，而6-聚体SEQ ID #3209的极低Tm最可能不足以介导miR-21靶的拮抗。另一方面，长度增加超过10-聚体(SEQ ID #3212)显著增加Tm，这同时减少如使用萤光素酶miR-21报道子测量的抑制活性，这最可能是由于完全修饰的12-和14-聚体LNA-抗miR形成同二聚体的高倾向。使用完全LNA修饰的8-聚体LNA-抗miR经过mir-21识别序列的滑动窗的实验明确证实，除LNA-抗miR的足够Tm值外，种子区域对于miRNA功能最关键，并且因此是待通过LNA-抗miR靶向的最佳区域。
表5：针对互补RNA寡核苷酸测量的关于miR-21LNA-抗miR的Tm值
 SEQ ID#   微小RNA   长度(bp)   序列   测量的Tm(RNA)℃
 3205   miR-21   8   5′-GATAAGCT-3′   64,0
 3209   miR-21   6   5′-TAAGCT-3′   32,0
 3210   miR-21   7   5′-ATAAGCT-3′   45,0
 3211   miR-21   9   5′-TGATAAGCT-3′   65,0
 3212   miR-21   10   5′-CTGATAAGCT-3′   63,0
 3213   miR-21   12   5′-GTCTGATAAGCT-3′   86,8
 3214   miR-21   14   5′-CAGTCTGATAAGCT-3′   89,9
 3215   miR-21   8   5′-TCTGATAA-3′   56,0
 3216   miR-21   8   5′-ATCAGTCT-3   72,0
 3217   miR-21   8   5′-TCAACATC-3   48,0
结论：用萤光素酶报道子获得的Tm值连同实验数据显示，通过LNA-抗miR的有效拮抗不仅依赖于Tm，还依赖于LNA-抗miR在微小RNA识别序列内的定位。
材料与方法：
T m 测量：寡核苷酸：将miR-21 RNA双链体在500μl无RNA酶H2O中稀释至3μM，并且与500μl 2x Tm-缓冲液(200mM NaCl、0.2mMEDTA、20mM Na-磷酸盐，pH 7，0)相混合。使溶液加热至95℃3分钟，并且随后允许在RT中复性30分钟。使用PE Templab软件(PerkinElmer)，在配备Peltier温度程序控制器PTP6的Lambda 40UV/VIS分光光度计上测量双链体解链温度(Tm)。温度从20℃急剧升高到95℃，并且随后降至25℃，记录在260nm处的吸收。解链和复性两者的第一个衍生和局部最大值用于评估双链体解链温度。
实施例21.在人肝细胞系HepG2中通过使8-聚体(SEQ ID #3205)与15-聚体(SEQ ID #3204)LNA-抗miR相比较来评估miR-21拮抗。
先前在本申请中已显示，完全LNA修饰且硫代磷酸酯化的8-聚体LNA-抗miR在人宫颈癌细胞系HeLa、人乳腺癌细胞系MCF-7和人前列腺癌细胞系PC3中有效拮抗miR-21。我们将这种筛选方法扩展至人肝细胞癌细胞系HepG2。为了评估8-聚体LNA-抗miR寡核苷酸针对miR-21的功效，产生萤光素酶报道子构建体，其中将关于成熟miR-21的极佳匹配靶位点克隆到海肾萤光素酶基因的3′UTR中。为了监控miR-21抑制，用萤光素酶构建体连同miR-21拮抗剂SEQ ID #3205(8-聚体)以及用于比较特异性的8-聚体LNA-抗miR错配(SEQ ID #3218)和用于比较效力的15-聚体(SEQ ID #3204)以各种浓度转染HepG2细胞。在24小时后，执行萤光素酶测量。
结果：萤光素酶报告子实验显示使用针对miR-21的15-聚体(SEQID #3204)的萤光素酶miR-21报告子活性的剂量依赖性去阻遏。然而，即使在更高浓度下，也未获得萤光素酶报道子的完全去阻遏(图20)。相比之下，用8-聚体完全LNA修饰的LNA-抗miR(SEQ ID #3205)转染的细胞已显示在5nM下的完全去阻遏，指出与15-聚体LNA-抗miR相比较，显著改善的效力。使8-聚体极佳匹配与8-聚体错配的特异性相比较，错配LNA-抗miR(SEQ ID #3218)根本未显示任何去阻遏，证实LNA-抗miR化合物针对miR-21的高特异性。
结论：8-聚体(SEQ ID #3205)在靶向miR-21中比15-聚体LNA-抗miR更有效，并且通过SEQ ID #3205的miR-21拮抗是特异性的。
材料与方法：
细胞系：人肝细胞HepG2细胞系购自ECACC(#85011430)。HepG2细胞在补充有10％胎牛血清、2mM Glutamax和25ug/ml庆大霉素的EMEM培养基中培养。
转染：将650.000个细胞种植在6孔板的每个孔中，并且进行逆转染。根据制造商的说明书，用0.6μg miR-21或空psiCHECK2载体连同2,55μl Lipofectamine2000(Invitrogen)转染HepG2细胞。还转染了各种浓度的LNA-抗miR。在24小时后，收获细胞用于萤光素酶测量。
萤光素酶测定法：细胞用PBS洗涤并且将300μl 1x PassiveLysis Buffer(Promega)加入孔中。将平板置于摇床上30分钟，这之后将细胞裂解物转移至eppendorf管。细胞裂解物在2.500rpm下离心10分钟，这之后将50μl转移至96孔板，并且根据制造商的说明书(Promega)执行萤光素酶测量。
实施例22.在人肝细胞细胞系Huh-7中使用8-聚体SEQ ID#3205 LNA-抗miR验证在Pdcd4 3′-UTR和miR-21中的miR-21靶位点的相互作用。
肿瘤抑制蛋白质Pdcd4抑制肿瘤启动和进展。此外，Pdcd4在肺和结肠直肠癌中的下调也已与患者预后不良相关。近来，Asangani等人(Oncogene 2007)和Frankel等人(J Biol Chem 2008)显示Pdcd43′UTR包含关于miR-21的保守靶位点，并且用miR-21转染细胞导致Pdcd4蛋白质中的增加。我们因此构建具有包含上述miR-21靶位点的Pdcd4的313 nt 3′UTR区域的萤光素酶报道子质粒，这与不同LNA-抗miR和pre-miR-21(10nM)一起共转染到Huh-7细胞内。不同LNA-抗miR是；SEQ ID #3205(8-聚体，极佳匹配)、SEQ ID #3218(8-聚体，错配)和SEQ ID #3204(15-聚体，DNA/LNA混合聚体)。在24小时后，执行萤光素酶测量。
结果：如图21中所示，在用Pdcd4 3′UTR萤光素酶报道子和SEQID #3205转染的细胞中，观察到萤光素酶活性中的增加，指出Pdcd43′UTR和miR-21之间的相互作用。然而，用错配化合物SEQ ID #3218转染细胞，未观察到萤光素酶活性中的改变，这是预期到的，因为该化合物不拮抗miR-21。当使8-聚体LNA-抗miR针对15-聚体LNA-抗miR(SEQ ID #3204)相比较时，短完全LNA修饰且硫代磷酸酯化的LNA-抗miR明显更有效，证实先前数据。
材料与方法：
细胞系：人肝瘤细胞系Huh-7是来自R.Bartinschlager(Dept MolVirology，University of Heidelberg)的友情赠予。Huh-7细胞在补充有10％胎牛血清、2mM Glutamax、1x NEAA和25ug/ml庆大霉素的DMEM培养基中培养。
转染：在转染前一天将11.000个细胞种植在96孔板的每个孔中，以便第二天达到50-70％融合。在转染当天时，根据制造商的说明书，用20ng Pdcd4 3′UTR/psiCHECK2或空psiCHECK2载体连同10nMpre-miR-21(Ambion)和0,14μl Lipofectamine2000(Invitrogen)转染Huh-7细胞。还转染了各种浓度的LNA-抗miR寡核苷酸。在24小时后，收获细胞用于萤光素酶测量。
萤光素酶测定法：洗涤细胞并且将30μl 1x Passive LysisBuffer(Promega)加入每个孔中，这之后将96孔板置于定轨摇床上。30分钟后，将在Luciferase Assay Buffer II(来自Promega的Dual-Luciferase Reporter Assay System，目录#E1910)中溶解的50μl萤光素酶底物加入具有裂解细胞的孔中，并且根据制造商的说明书(Promega)执行萤光素酶测量。
实施例23.作为关于通过8-聚体LNA-抗miR(SEQ ID #3205)的miR-21拮抗的功能读数的Pdcd4蛋白质水平评估。
此外，还用SEQ ID #3205(极佳匹配)、SEQ ID #3218(错配)、SEQ ID #3219(混杂)转染HeLa细胞，并且在24小时后用western印迹分析Pdcd4蛋白质水平(图22)。如显示的，与2种对照LNA寡核苷酸相比较，在来自其中已加入SEQ ID #3205的细胞的蛋白质提取物中，由于通过SEQ ID #3205的mir-21拮抗，Pdcd4蛋白质水平增加。
结论：使用8-聚体(SEQ ID #3205)对miR-21的拮抗导致miR-21拮抗的直接靶Pdcd4的去阻遏。
材料与方法：
细胞系：人宫颈癌细胞系HeLa购自ECACC(#93021013)。HeLa细胞在补充有10％胎牛血清、2mM Glutamax、1x NEAA和25ug/ml庆大霉素的EMEM培养基中培养。
转染：在转染前一天将200.000个细胞种植在6孔板的每个孔中，以便第二天得到50-70％融合。在转染当天时，根据制造商的说明书，用5nM LNA寡核苷酸和2,5μg/ml Lipofectamine2000(Invitrogen)转染HeLa细胞。在24小时后，收获细胞用于western印迹分析。
western印迹：细胞用PBS洗涤、进行胰蛋白酶处理、转移至eppendorf管，并且加入50μl裂解缓冲液(1xRIPA)。将细胞裂解物置于冰上20分钟，并且在10.000rpm下旋转10分钟。将相等量(15μl细胞裂解物)装载到4-12％BIS-TRIS凝胶上。根据制造商说明书，使用iBlot(Invitrogen)将蛋白质转移至硝酸纤维素膜。使膜与亲和力纯化的兔血清一抗Pdcd4(Rockland)以1∶2000浓度在4℃下温育过夜。作为对照，使用以1∶5000稀释度的抗-β微管蛋白抗体(Thermo Scientific)。用ECL Plus(Amersham)显现免疫反应性条带。
实施例24.8-聚体极佳匹配LNA-抗miR SEQ ID #3205和LNA错配对照SEQ ID #3218的潜在肝毒性评估。
将每种化合物以25mg/kg、5mg/kg和1mg/kg的剂量注射到雌性NMRI小鼠内，每隔一天，共2周。处死动物，并且从全血中收集血清用于ALT和AST分析。如图23中所示，与盐水或SEQ ID #3218(错配对照)相比较，ALT和AST水平对于SEQ ID #3205未升高。然而，一只小鼠显示增加的水平(标记为红色)，因为血清样品由红血细胞污染，所述红血细胞包含的ALT和AST水平是血浆的6-8倍。接受5mg/kg和1mg/kg的小鼠也就ALT和AST水平进行分析，并且与盐水处理的对照动物相比较，未显示改变(数据未显示)。
材料与方法：
实验设计：
组编号 动物ID号   小鼠数目 化合物剂量水平/天   在剂量体积下的浓度10ml/kg   施用途径 给药
1 1-10 10   NaCl0.9％   - i.v 0、2、4、7、9
2 11-15 5   SEQ ID #320525mg/kg 2.5mg/ml i.v 0、2、4、7、9
3 16-20 5   SEQ ID #32055mg/kg 0.5mg/ml i.v 0、2、4、7、9
4 21-25 5   SEQ ID #32051mg/kg 0.1mg/ml i.v 0、2、4、7、9
5 26-30 5   SEQ ID #323025mg/kg 2.5mg/ml i.v 0、2、4、7、9
6 31-35 5   SEQ ID #32305mg/kg 0.5mg/ml i.v 0、2、4、7、9
处死；通过颈椎脱位处死动物。
用于ALT/AST的血清取样；在收集眶窦后血液前用70％CO2-30％O2使动物麻醉。将血液收集到S-monovette Serum-Gel小瓶内。从每只个别小鼠中收获血清样品且贮存。血样在室温下贮存2小时，并且其后在3000rpm、室温下离心10分钟。将血清部分收获到在湿冰上的Eppendorf管内。
ALT和AST测量；根据制造商的说明书，使用来自ABX Pentra的ALT和AST试剂(A11A01627-ALT，A11A01629-AST)中在96孔板中执行ALT和AST测量。简言之，血清样品用H2O稀释2.5倍，并且每份样品一式两份地进行测定。将50μl稀释的样品或标准(来自的ABX Pentra-A11A01652的multical)加入每个孔中后，将200μl 37℃AST或ALT试剂混合物加入每个孔中。动力学测量在340nm和37℃下执行5分钟，伴随30秒间隔。
实施例25.作为关于通过短LNA-抗miR(SEQ ID #3207)的miR-155拮抗的功能读数的PU.1蛋白质水平评估。
先前已显示拮抗miR-155的8-聚体(SEQ ID #3207)导致在小鼠巨噬细胞RAW细胞中miR-155靶c/EBPβ的去阻遏。为了进一步验证SEQ ID #3207的效力，我们测定了另一种miR-155靶——PU.1的蛋白质水平。作为关于通过短LNA-抗miR(SEQ ID #3207)的miR-155拮抗的功能读数，执行western印迹。在人单核细胞THP-1细胞系中验证拮抗，在pre-miR-155的不存在或存在下，连同8-聚体(SEQ ID#3207)极佳匹配或8-聚体对照LNA转染所述小鼠单核细胞THP-1细胞系。LPS用于诱导miR-155蓄积，并且在用24小时后收获细胞。
结果：用pre-miR-155转染的THP-1细胞显示PU.1水平中的减少(图24)。用完全LNA修饰且硫代磷酸酯化的SEQ ID #3207转染细胞有效拮抗miR-155，导致未改变水平的PU.1蛋白质。相比之下，用8-聚体LNA对照转染细胞，PU.1水平减少，指出通过SEQ ID #3207LNA-抗miR的miR-155拮抗是特异性的。
结论：使用8-聚体对miR-155的拮抗导致在人THP-1细胞中直接靶PU.1的去阻遏。
材料与方法：
细胞系：人单核细胞THP-1细胞系购自ECACC(#88081201)。THP-1细胞在补充有10％胎牛血清的具有L-谷氨酰胺的RPMI培养基中培养。
转染：在转染前一天将200.000个细胞种植在12孔板的每个孔中。在转染当天时，根据制造商的说明书，用5nmol pre-miR-155(Ambion)和/或5nM LNA-抗miR连同Lipofectamine2000(Invitrogen)转染THP-1细胞。在与转染复合物温育4小时后，将LPS(100ng/ml)加入细胞中。在24小时后，收获细胞用于蛋白质提取和western印迹分析。
western印迹：细胞用PBS洗涤、进行胰蛋白酶处理、转移至eppendorf管，并且加入50μl裂解缓冲液(1xRIPA)。将细胞裂解物置于冰上20分钟，并且在10.000rpm下旋转10分钟。将相等量(15μl细胞裂解物)装载到4-12％BIS-TRIS凝胶上。根据制造商说明书，使用iBlot(Invitrogen)将蛋白质转移至硝酸纤维素膜。使膜与兔单克隆PU.1抗体(Cell Signaling)以1∶2000浓度在4℃下温育过夜。作为相等对照，使用以1∶5000稀释度的微管蛋白(ThermoScientific)。用ECL Plus(Amersham)显现免疫反应性条带。
实施例26.作为关于通过7-聚体SEQ ID #3225 LNA-抗miR的miR-221/222家族拮抗的功能读数的p27蛋白质水平评估。
先前工作已显示(le Sage等人2007，Galardi等人2007)miR-221和miR-222转录后调节涉及细胞周期调节的肿瘤抑制基因p27的表达。在这些研究中，显示miR-221和miR-222的下调增加p27的表达水平。因此，作为关于通过7-聚体SEQ ID #3225 LNA-抗miR的miR-221/222家族拮抗的功能读数，在将LNA-抗miR SEQ ID #3225转染到PC3细胞内后，测定p27的蛋白质水平。
结果：如图25中所示，与未转染或LNA混杂对照转染的PC3细胞相比较，靶向miR-221和miR-222中的种子序列的7-聚体LNA-抗miRSEQ ID #3225的转染导致p27蛋白质水平的剂量依赖性增加。这些结果明确证实7-聚体LNA-抗miR能够有效拮抗miR-221/222家族，导致在低至5nM的浓度下直接靶p27在蛋白质水平上的去阻遏。
结论：靶向miR-221/222家族中的种子序列的完全LNA修饰的7-聚体LNA-抗miR在5nM下可以有效拮抗2种miRNA，导致直接靶p27在蛋白质水平上的去阻遏。
材料与方法：
细胞系：人前列腺癌PC3细胞系购自ECACC(#90112714)。PC3细胞在补充有10％胎牛血清、2mM Glutamax和25ug/ml庆大霉素的DMEM培养基中培养。
转染：在转染前一天将250.000个细胞种植在6孔板的每个孔中，以便第二天得到50％融合。在转染当天时，用LNA-寡核苷酸以各种浓度(参见图25)与Lipofectamine2000转染PC3细胞。在24小时后，收获细胞用于蛋白质提取和western印迹分析。
western印迹：细胞用PBS洗涤、进行胰蛋白酶处理、转移至eppendorf管，并且加入50μl裂解缓冲液(1xRIPA)。将细胞裂解物置于冰上20分钟，随后在10.000rpm下旋转10分钟。将相等量(15μl细胞裂解物)装载到4-12％BIS-TRIS凝胶上。根据制造商说明书，使用iBlot(Invitrogen)将蛋白质转移至硝酸纤维素膜。使膜与单克隆小鼠一抗p27(BD Biosciences)以1∶1000稀释度在4℃下温育过夜。作为上样对照，以1∶5000稀释度使用微管蛋白(ThermoScientific)。用ECL Plus(Amersham)显现免疫反应性条带。
实施例27.通过7-聚体SEQ ID #3225LNA-抗miR对miR-221/222的敲减减少PC3细胞的集落形成
细胞转化的标志是关于肿瘤细胞以锚着非依赖性方式在半固体培养基中生长的能力。我们因此已执行软琼脂测定法，其是与癌症相关的表型测定法，考虑到它测量肿瘤细胞的减少。将SEQ ID #3225(极佳匹配)和SEQ ID #3231(混杂)转染到PC3细胞内，并且在24小时后将细胞铺平板到软琼脂中。在12天后计数集落。在图26中显示与混杂对照LNA-抗miR相比较，通过SEQ ID #3225抑制miR-221和miR-222可以减少在软琼脂中生长的集落量，指出肿瘤细胞的减少。
结论：靶向miR-221/222家族的7-聚体(SEQ ID #3225)减少软琼脂中的集落数目，指出PC3细胞的增殖停滞。
材料与方法：
细胞系：人前列腺癌PC3细胞系购自ECACC(#90112714)。PC3细胞在补充有10％胎牛血清、2mM Glutamax和25ug/ml庆大霉素的DMEM培养基中培养。
转染：在转染前一天将250.000个细胞种植在6孔板的每个孔中，以便第二天得到50％融合。在转染当天时，用25nM不同LNA寡核苷酸与Lipofectamine2000转染PC3细胞。
在软琼脂中的克隆生长：将2.5x103 PC3细胞种植在包含0.5％琼脂的基底层之上的0.35％琼脂中。细胞在转染后24小时铺平板。平板在37℃、5％CO2下在湿润培养箱中温育12天，并且用0.005％结晶紫染色1小时，这之后计数细胞。测定法一式三份地执行。
实施例28：在用let-7a前体miRNA转染的Huh-7细胞中和萤光素酶传感器测定法评估通过6-9-聚体LNA-抗miR的let-7拮抗。
为了评估完全LNA修饰的6-9-聚体寡核苷酸在靶向并拮抗miRNA的let-7家族中的功效，制备包含某一800bp HMGA2 3′UTR的萤光素酶传感器构建体。克隆到载体内的序列包含7个功能let-7结合部位中的4个(部位2-5)，如先前由Mayr等人(Science，2007)以及Lee和Dutta(Genes Dev，2007)证实的。为了监控let-7抑制，用萤光素酶传感器构建体，用let-7a前体miRNA，且用6-9聚体let-7拮抗剂SEQ ID #3232、-3233、-3227、-3234、-3235；参见图27)以渐增浓度转染肝细胞癌细胞系Huh-7(具有低至不存在的内源let-7水平)。6-9-聚体LNA-抗miR与SEQ ID #3226——作为阳性对照针对let-7a的15-聚体相比较。在24小时后，测量萤光素酶活性。
结果：如图28中所示，完全LNA修饰的8-和9-聚体LNA-抗miR(SEQ ID #3227、SEQ ID #3234和SEQ ID #3235)在萤光素酶传感器测定法中显示在去阻遏let-7靶中与阳性对照15-聚体SEQ ID#3226相似的效力。关于这些高度有效化合物的完全靶去阻遏已在1-5nM下达到，而7-聚体SEQ ID #3233需要以略微更高的浓度(10nM)存在，以产生相同作用。然而，6-聚体SEQ ID #3232即使在高达50nM的浓度下也不显示作用。萤光素酶活性通过7-9-和15-聚体LNA-抗miR的去阻遏是剂量依赖性的，这在略微更不有效的SEQ ID #3233的情况下特别明显。
结论：总之，与靶向let-7a的15-聚体LNA-抗miR SEQ ID #3226相比较，8-9-聚体LNA-抗miR(SEQ ID #3227、SEQ ID #3234和SEQID #3235)显示在体外抑制let-7a中相等的拮抗剂效力。对于7-聚体SEQ ID #3233也可见有效作用，尽管在略微更高的浓度下，而6-聚体在测试浓度下无作用。
材料与方法：
细胞系：人肝细胞癌细胞系Huh-7是来自R.Bartinschlager(Dept Mol Virology，University of Heidelberg)的友情赠予。Huh-7细胞在补充有10％胎牛血清、2mM Glutamax、1x NEAA和25ug/ml庆大霉素的DMEM培养基中培养。
转染：在转染前一天将8.000个细胞种植在96孔板的每个孔中，以便第二天得到60-80％融合。在转染当天时，根据制造商的说明书，用20ng HMGA2 3′UTR/psiCHECK2质粒，let-7a前体miRNA(Dharmacon；10nM终浓度)，LNA-抗miR SEQ ID #3232、-3233、-3227、-3234、-3235、-3226；0-50nM终浓度)连同0.17μl Lipofectamine2000(Invitrogen)转染每个孔中的Huh-7细胞。在24小时后，收获细胞用于萤光素酶测量。
萤光素酶测定法：弃去生长培养基并且将30μl 1x Passive LysisBuffer(Promega)加入每个孔中。在定轨摇床上温育15-30分钟后，根据制造商的说明书(Promega)执行海肾和萤火虫萤光素酶测量。
实施例29：在用萤光素酶传感器测定法转染的Huh-7细胞中评估通过8-和15-聚体LNA-抗miR的整个let-7家族拮抗。
为了评估完全LNA修饰的8-聚体寡核苷酸在拮抗miRNA的整个let-7家族中的功效，使用与先前实施例中描述相同的萤光素酶传感器构建体。再次，用传感器构建体，用家族代表性let-7a、let-7d、let-7e或let-7i前体之一，且用拮抗剂SEQ ID #3227以渐增浓度转染Huh-7细胞(具有低至不存在的内源let-7水平)。8-聚体LNA-抗miR与SEQ ID #3226——作为阳性和有效对照的针对let-7a的15-聚体相比较。在24小时后，测量萤光素酶活性。
结果：如图29中所示，完全LNA修饰的8-聚体LNA-抗miR(SEQID #3227)在萤光素酶传感器测定法中显示在去阻遏各种let-7靶中与阳性对照15-聚体SEQ ID #3226相似的效力。关于8-聚体的接近完全靶去阻遏已在0.5-1nM下达到，除在用let-7e premiR的情况下(图29C)，对于其SEQ ID #3227的8个核苷酸中仅7个与靶杂交。然而，尽管在这种情况下的末端错配，SEQ ID #3227在5nM下产生完全靶去阻遏。阳性对照15-聚体显示所有前体的有效拮抗，并且在0.5nM下产生接近完全去阻遏。萤光素酶活性通过8-和15-聚体LNA-抗miR的去阻遏明显是剂量依赖性的，如在所有4个实验对象组中可见的(图29A-D)。
结论：总之，8-聚体LNA-抗miR(SEQ ID #3227)是在体外针对4种代表性let-7家族成员，并且因此可能针对整个家族的有效拮抗剂。与15-聚体阳性对照拮抗剂SEQ ID #3226相比较，8-聚体对于4种靶中的3种同样有效，并且对于第4种靶let-7e略微较不有效，这通过这种情况下的末端错配解释。
材料与方法：
细胞系：人肝细胞癌细胞系Huh-7是来自R.Bartinschlager(Dept Mol Virology，University of Heidelberg)的友情赠予。Huh-7细胞在补充有10％胎牛血清、2mM Glutamax、1x NEAA和25ug/ml庆大霉素的DMEM培养基中培养。
转染：在转染前一天将8,000个细胞种植在96孔板的每个孔中，以便第二天得到60-80％融合。在转染当天时，根据制造商的说明书，用20ng HMGA2 3′UTR/psiCHECK2质粒，用let-7a、-7d、-7e或-7i前体miRNA(Dharmacon；10nM终浓度)，且用LNA-抗miR SEQ ID #3227和SEQ ID #3226；0-50nM终浓度)连同0.17μl Lipofectamine2000(Invitrogen)转染每个孔中的Huh-7细胞。在24小时后，收获细胞用于萤光素酶测量。
萤光素酶测定法：弃去生长培养基并且将30μl 1x Passive LysisBuffer(Promega)加入每个孔中。在定轨摇床上温育15-30分钟后，根据制造商的说明书(Promega)执行海肾和萤火虫萤光素酶测量。
实施例30：在用萤光素酶传感器测定法转染的HeLa细胞中评估通过SEQ ID #3227——8-聚体LNA-抗miR的内源let-7拮抗。
为了测定完全LNA修饰的8-聚体寡核苷酸在靶向且拮抗内源let-7中的功效，如先前2个实施例中所述相同的萤光素酶传感器构建体与SEQ ID #3227共转染到宫颈癌细胞系HeLa(如通过Q-PCR测定的，其表达中至高水平的let-7，数据未显示)内。包括空psiCHECK-2载体作为阴性对照。
结果：如图30中可见，完全LNA修饰的8-聚体LNA-抗miR SEQID #3227显示内源let-7的有效拮抗，并且在5-10nM的浓度下产生完全靶去阻遏。萤光素酶活性的去阻遏是剂量依赖性的，从约1nM开始并且在约10nM下达到平稳。
结论：总之，8-聚体LNA-抗miR(SEQ ID #3227)也是在体外针对内源let-7的有效拮抗剂，并且因此提供明确证据：整个miRNA家族可以通过短且完全LNA修饰的拮抗剂成功靶向。
材料与方法：
细胞系：人宫颈癌细胞系HeLa购自ATCC(#CCL-2TM)。HeLa细胞在补充有10％胎牛血清、2mM Glutamax、1x NEAA和25ug/ml庆大霉素的Eagle’s MEM培养基中培养。
转染：在转染前一天将8.000个细胞种植在96孔板的每个孔中，以便第二天得到50-70％融合。在转染当天时，根据制造商的说明书，用20ng HMGA2 3′UTR/psiCHECK2质粒或psiCHECK-2(空载体)、且用LNA-抗miR SEQ ID #3227(0-50nM，终浓度)，且连同0.17μlLipofectamine2000(Invitrogen)共转染每个孔中的HeLa细胞。在24小时后，收获细胞用于萤光素酶测量。
萤光素酶测定法：弃去生长培养基并且将30μl 1x Passive LysisBuffer(Promega)加入每个孔中。在定轨摇床上温育15-30分钟后，根据制造商的说明书(Promega)执行海肾和萤火虫萤光素酶测量。
实施例31.在人结肠癌细胞系HCT116中评估通过8-聚体LNA-抗miR-21(#3205)与8-聚体(#3219)混杂对照LNA相比较的miR-21拮抗。
先前在本申请中已显示，完全LNA修饰且硫代磷酸酯化的8-聚体LNA-抗miR在人宫颈癌细胞系HeLa、人乳腺癌细胞系MCF-7、人前列腺癌细胞系PC3和人肝细胞癌细胞系HepG2中有效拮抗miR-21。我们将这种筛选方法扩展至人结肠癌细胞系HCT116。为了评估8-聚体LNA-抗miR寡核苷酸针对miR-21的功效，产生萤光素酶报道子构建体，其中将关于成熟miR-21的极佳匹配靶位点克隆到海肾萤光素酶基因的3′UTR中。为了监控miR-21抑制，用萤光素酶构建体连同miR-21拮抗剂#3205(8-聚体)和用于比较特异性的8-聚体LNA混杂对照(#3219)转染HCT116细胞。在24小时后，测量萤光素酶活性。
结果：萤光素酶报道子实验显示用针对miR-21的8-聚体LNA-抗miR(#3205)的萤光素酶miR-21报道子活性的剂量依赖性去阻遏，并且在5nM下获得完全去阻遏(图31)。当使8-聚体极佳匹配和8-聚体混杂对照的特异性相比较时，混杂对照LNA-抗miR(#3219)根本未显示任何去阻遏，证实LNA-抗miR化合物针对miR-21的高特异性。
结论：8-聚体(#3205)在靶向miR-21中有效，并且通过#3205的miR-21拮抗是特异性的。
材料与方法：
细胞系：人结肠癌HCT116细胞系购自ATCC(CCL-247)。HCT116细胞在补充有10％胎牛血清和25ug/ml庆大霉素的RPMI培养基中培养。
转染：将110.000个细胞种植在12孔板的每个孔中，并且进行转染。根据制造商的说明书，用0.3μg miR-21萤光素酶传感器质粒或空psiCHECK2载体连同1.2μl Lipofectamine2000(Invitrogen)转染HCT116细胞。还转染了各种浓度的LNA-抗miR和对照寡核苷酸。在24小时后，收获细胞用于萤光素酶测量。
萤光素酶测定法：细胞用PBS洗涤并且将250μl 1x PassiveLysis Buffer(Promega)加入孔中。将平板置于摇床上30分钟，这之后将细胞裂解物转移至eppendorf管。细胞裂解物在2.500rpm下离心10分钟，这之后将50μl转移至96孔板，并且根据制造商的说明书(Promega)执行萤光素酶测量。
实施例32.通过8-聚体#3205 LNA-抗miR对miR-21的敲减减少PC3细胞的集落形成。
细胞转化的标志是关于肿瘤细胞以锚着非依赖性方式在半固体培养基中生长的能力。因此已执行软琼脂测定法，其是与癌症相关的表型测定法，考虑到它测量肿瘤细胞的减少。将#3205(极佳匹配LNA-抗miR-21)和#3219(LNA混杂对照)转染到PC3细胞内，并且在24小时后将细胞铺平板到软琼脂中。在12天后计数集落。在图32中显示与混杂对照LNA处理或未处理对照(转染的，但不含LNA)相比较，通过#3205抑制miR-21可以减少在软琼脂中生长的集落量，证实肿瘤细胞的减少。
结论：靶向miR-21家族的8-聚体(#3205)减少软琼脂中的集落数目，证实PC3细胞的增殖停滞。
材料与方法：
细胞系：人前列腺癌PC3细胞系购自ECACC(#90112714)。PC3细胞在补充有10％胎牛血清、2mM Glutamax和25ug/ml庆大霉素的DMEM培养基中培养。
转染：在转染前一天将250.000个细胞种植在6孔板的每个孔中，以便第二天得到50％融合。在转染当天时，用25nM不同LNA寡核苷酸与Lipofectamine2000转染PC3细胞。
在软琼脂中的克隆生长：将2.5x103PC3细胞种植在包含0.5％琼脂的基底层之上的0.35％琼脂中。细胞在转染后24小时铺平板。平板在37℃、5％CO2下在湿润培养箱中温育12天，并且用0.005％结晶紫染色1小时，这之后计数细胞。测定法一式三份地执行。
实施例33.通过8-聚体#3205LNA-抗miR对miR-21的沉默减少HepG2细胞的集落形成。
miR-21在人肝细胞癌细胞系HepG2中过表达，并且先前已显示我们能够在这些细胞中用#3205调节miR-21传感器质粒的萤光素酶活性。用#3205和#3219(混杂8-聚体)转染HepG2细胞，并且在24小时后铺平板到软琼脂内。在17天后用显微镜计数集落。
结果：在图33中显示通过#3205抑制miR-21可以减少在软琼脂中生长的集落量，显示已发生增殖停滞。此外，混杂8-聚体对照#3219对集落数目无显著作用。
结论：靶向miR-21家族的8-聚体(#3205)减少软琼脂中的集落数目，证实HepG2细胞的增殖停滞。
材料与方法：
细胞系：人肝细胞HepG2细胞系购自ECACC(#85011430)。HepG2细胞在补充有10％胎牛血清、2mM Glutamax和25ug/ml庆大霉素的EMEM培养基中培养。
转染：将650.000个细胞种植在6孔板的每个孔中，并且进行逆转染。根据制造商的说明书，用0.6μg miR-21萤光素酶传感器质粒或空psiCHECK2载体连同2,55μl Lipofectamine2000(Invitrogen)转染HepG2细胞。还转染了作为各种浓度的LNA-抗miR和对照寡核苷酸。在24小时后，收获细胞用于萤光素酶测量。
在软琼脂中的克隆生长：将2.0x103个HepG2细胞种植在包含0.5％琼脂的基底层之上的0.35％琼脂中。细胞在转染后24小时铺平板。平板在37℃、5％CO2下在湿润培养箱中温育17天，并且用0.005％结晶紫染色1小时，这之后计数细胞。测定法一式三份地执行。
实施例34.通过8-聚体#3205LNA-抗miR对miR-21的沉默抑制PC3细胞中的细胞迁移。
通过执行伤口闭合测定法(＝划线测定法)监控细胞迁移，其中“划线”在细胞单层中进行，并且在开始时和在细胞迁移过程中以规律间隔获取图像。通过比较图像，可以测定细胞迁移率的定量。这在人前列腺癌细胞系PC3中完成。种植细胞，并且在第3天时转染细胞，并且第二天当达到100％融合时，进行划线(＝伤口)。当进行划线时，获取照片以便记录起始伤口。然后用自由软件程序Image J在不同时间点时测量伤口闭合的面积。如图34A中所示，PC3细胞已用25nM#3205(极佳匹配，miR-21)，对照#3219处理或留下不转染。在24小时后获取照片，并且计算关于在分别时间点时伤口闭合的面积。与针对miR-21的LNA-抗miR——#3205相比较，关于未转染细胞和关于对照#3219的伤口闭合更快速，指出#3205抑制miR-21，并且阻止细胞迁移(图34B)。
结论：与未转染和对照转染的细胞相比较，靶向miR-21的8-聚体(#3205)抑制PC3细胞的细胞迁移。
材料与方法：
细胞系：人前列腺癌PC3细胞系购自ECACC(#90112714)。PC3细胞在补充有10％胎牛血清、2mM Glutamax和25ug/ml庆大霉素的DMEM培养基中培养。
划线测定法：在转染前3天将150.000个细胞种植在6孔板的每个孔中，以便在第二天得到100％融合。在转染后24小时时，用200μl尖端在细胞单层中进行划线。通过使用与显微镜联接的数码相机在0小时和在24小时后获取照片。软件程序Image J用于测定伤口闭合。
实施例35.拮抗miR-155的完全LNA取代的LNA-抗miR的长度评估。
先前已显示就完全LNA取代的LNA-抗miR而言关于miR-21的长度评估，并且显示最有效的LNA-抗miR长度是7-、8-或9nt。用miR-155重复相同实验。将关于miR-155的极佳匹配靶位点克隆到报道子质粒psiCHECK2中的萤光素酶基因的3′UTR内，并且连同不同长度完全LNA取代的LNA-抗miR转染到小鼠RAW巨噬细胞细胞系内。因为miR-155的内源水平在RAW细胞系中很低，所以细胞用100ng/ml LPS处理24小时，以便诱导miR-155蓄积。在24小时后，执行萤光素酶分析。
结果：如图35中所示，最有效的LNA-抗miR是#3207(8nt)和#3241(9nt)，在仅0.25nM LNA浓度下达到几乎80％的去阻遏。6-聚体(#3244)未显示明显去阻遏。如通过miR-155报道子的较不有效去阻遏显示的，使长度从12-聚体增至14-聚体(#3242和#3243)减少效力。
结论：靶向miR-155的最有效完全LNA取代的LNA-抗miR是8-和9-聚体(#3207和#3241)。
材料与方法：
细胞系：小鼠巨噬细胞RAW 264.7细胞系购自ATCC(TIB-71)。RAW细胞在补充有10％胎牛血清、4mM Glutamax和25ug/ml庆大霉素的DMEM培养基中培养。
转染：在转染前一天将500.000个细胞种植在6孔板的每个孔中，以便第二天得到50％融合。在转染当天时，根据制造商的说明书，用0.3ug miR-155极佳匹配/psiCHECK2或空psiCHECK2载体连同10μlLipofectamine2000(Invitrogen)转染RAW 264.7细胞。还转染了各种浓度的LNA-抗miR。为了诱导miR-155蓄积，在与转染复合物温育4小时后，将LPS(100ng/ml)加入RAW细胞中。在另外24小时后，收获细胞用于萤光素酶测量。
萤光素酶测定法：细胞用PBS洗涤并且用细胞刮棒收获，这之后细胞在2.500rpm下旋转5分钟。弃去上清液，并且将50μl 1x PassiveLysis Buffer(Promega)加入细胞团块中，这之后将细胞置于冰上30分钟。裂解细胞在10.000rpm下旋转30分钟，这之后将20μl转移至96孔板，并且根据制造商的说明书(Promega)执行萤光素酶测量。
实施例36.关于靶向miR-21的全长LNA取代的8-聚体#3205(LNA-抗miR-21)的血浆蛋白质结合。
血浆蛋白质在图36A中所示的实验中在血浆浓度下用#3205未饱和。在广泛范围的#3205下，血浆蛋白质结合中的浓度在图36B中是约95％的#3205LNA-抗miR-21。在#3205浓度50.1μM(174μg/mL)下，血浆蛋白质对于FAM-标记的#3205的结合能力仍未饱和。
材料与方法：小鼠血浆(100μL)用FAM-标记的#3205掺料至0.167、1.67、5.01、10.02、16.7、25.05和50.1μM浓度。溶液在37℃下温育30分钟。将溶液转移至Microcon Ultracel YM-30滤器(再生纤维素30.000 MWCO)。使滤器在2000g下和在室温下在微量离心机中旋转20分钟。使滤液稀释5、10和20倍，并且将100μL样品转移至微量滴定板(Polystyrene Black NUNC-237108)。使用FLUOstar Optima酶标仪用激发458nm和发射520nm检测荧光。未结合的FAM-标记的#3205量由标准曲线进行计算，所述标准曲线衍生自用FAM-标记的#3205以12个不同(0.45-1000nM)浓度掺料的过滤血浆。用来自在过滤血浆中的#3205浓度0.167、1.67、5.01、10.02、16.7、25.05和50.1μM的过滤实验建立的回收数目来校正数目。FAM-标记的#3205的回收是86％。
实施例37.35S-标记的#3205LNA-抗miR-21的单次静脉内施用后，在雌性色素沉着小鼠中的定量全身放射自显影术研究。
为了测定短完全LNA修饰的LNA-抗miR(#3205，8-聚体)的生物分布，在小鼠中完成放射性标记化合物的全身组织分布。用单次静脉内施用将35S-标记的#3205给小鼠用药，并且在不同时间点时处死小鼠，从5分钟到21天。
表6(i)在雌性色素沉着小鼠中单次静脉内施用35S-标记的#3205后的个别组织浓度(μg#3205/g组织)。数字是关于每个组织的3次测量的平均值和比。变异系数(CV)一般是约10％。
  组织   寡核苷酸最大浓度μg #3205/g组织   最大浓度时间，小时 T1/2小时
  肾上腺   13,6   0,083 374
  胆汁   4   1
  骨髓   7,2   0,083 411
  脑   0,4   0,083
  棕色脂肪   8,8   0,083
  组织   寡核苷酸最大浓度μg #3205/g组织   最大浓度时间，小时 T1/2小时
  胃粘膜   10,1   0,083
  心血   26,2   0,083 10,3
  肾ctx.   58,7   24 104
  肝   11,8   0,083 588
  10,7   24
  肺   13,2   0,083 289
  淋巴结   5   0,083 262
  2,4   48
  淋巴   18,8   4
  20,8   168
  心肌   8,1   0,083 662
  卵巢   13   0,083 198
  胰腺   5   0,083
  垂体腺   6,7   0,083
  唾液腺   8,6   0,083 405
  5,5   168
  骨骼肌   4,8   0,083
  皮肤色素层   5,4   0,25
  脾   9,8   0,083 564
  胸腺   3,8   0,083 185
  甲状腺   10,9   0,083 592
  尿道   328,9   0,083
  组织   寡核苷酸最大浓度μg #3205/g组织   最大浓度时间，小时 T1/2小时
  子宫   9,6   0,25 177
  眼葡萄膜   13,6   0,083
  LOQ   0,045   0,083
  0,033   24
  0,03   168
表6(ii)在雌性色素沉着小鼠中单次静脉内施用35S-标记的#3205后的组织与肝的比。
  35S-#3205
  动物编号   10   11   12   13   14   15   16   17   18
  存活时间(小时)   0,083   0,25   1h   4h   24h   48h   96h   168   504
  器官
  肾上腺   肝   肝   肝   肝   肝   肝   肝   肝   肝
  胆汁   1,15   1,08   0,52   0,27   0,24   0,26   0,23   0,18   0,17
  骨髓   0,03   0,11   0,55   0,10   0,03   0,07   0,04   0,03   0,04
  脑   0,61   0,81   0,55   0,45   0,40   0,48   0,43   0,42   0,34
  棕色脂肪   0,03   0,03   0,01   0,00   0,00   0,00   0,00   0,00   0,00
  胃粘膜   0,75   0,57   0,29   0,12   0,07   0,12   0,08   0,10   0,07
  心血   0,86   0,71   0,31   0,22   0,10   0,21   0,15   0,16   0,12
  肾ctx   2,23   1,91   0,74   0,11   0,01   0,00   0,00   0,00   0,00
  肝   2,87   3,94   6,45   6,95   5,51   6,68   3,92   2,24   0,40
  肺   1,00   1,00   1,00   1,00   1,00   1,00   1,00   1,00   1,00
  35S-#3205
  淋巴结   1,12   0,97   0,63   0,09   0,04   0,04   0,03   0,02   0,02
  淋巴   0,43   0,30   0,25   0,19   0,11   0,32   0,20   0,17   0,12
  心肌   0,82   1,09   1,78   2,78   1,03   2,05   1,62   3,17   1,89
  卵巢   0,69   0,63   0,30   0,13   0,10   0,15   0,09   0,11   0,12
  胰   1,10   1,40   0,61   0,31   0,27   0,28   0,21   0,21   0,08
  垂体腺   0,42   0,37   0,22   0,18   0,12   0,17   0,12   0,15   0,11
  唾液腺   0,57   0,54   0,28   0,11   0,15   0,16   0,12   0,10   0,08
  骨骼肌   0,73   0,81   0,38   0,25   0,25   0,42   0,23   0,85   0,24
  皮肤，色素层   0,40   0,28   0,14   0,04   0,02   0,04   0,03   0,03   0,03
  脾   0,34   0,69   0,65   0,36   0,20   0,26   0,20   0,19   0,13
  胸腺   0,83   0,86   0,44   0,32   0,24   0,34   0,35   0,29   0,31
  甲状腺   0,32   0,31   0,14   0,07   0,09   0,08   0,05   0,04   0,02
  尿道   0,9   1,2   0,43   0,28   0,25   0,34   0,19   0,26   0,25
  子宫   27,96   39,48   9,90   5,44   0,24   0,39   0,12   0,15   0,03
  眼葡萄膜   0,56   1,23   0,65   0,30   0,30   0,07   0,27   0,16   0,08
结论：#3205显示具有8-10小时的清除半衰期的放射性血液清除率。在肾皮质、淋巴、肝、骨髓、脾、卵巢和子宫中记录到高水平放射性。在肾皮质中记录到最高水平的放射性，显示对于#3205是肝的5倍的水平。注意到在肾皮质、淋巴、肝、骨髓和脾中关于#3205LNA-抗miR-21的强放射性保留。
材料与方法：
剂量施用：所有小鼠在施用前进行称重。9只雌性小鼠在尾静脉中静脉内给予10mg/kg 35S-#3205。给予每只动物的体积是10mL/kg测试试剂。比活性75.7μCi/mg。在施用#3205后5分钟、15分钟、1小时、4小时、24小时、2天、4天、7天和21天后杀死个别小鼠。全身放射自显影术：通过七氟烷使小鼠麻醉，并且随后立即浸入庚烷中，用干冰冷却至-80℃，ABR-SOP-0130。使冷冻尸体在羟甲基纤维素(CMC)水凝胶中包埋，在乙醇中冷冻，用干冰(-80℃)冷却，并且矢状(sagittaly)切片用于全身放射自显影术，根据标准方法，ABR-SOP-0131。对于每只动物，在约-20℃下用cryomicrotome(LeicaCM 3600)在不同水平下切割20μm切片。使所获得切片贴附于胶带(Minnesota Mining and Manufacturing Co.，No.810)上，并且用放射性墨水连续编号。在-20℃下冷冻干燥约24小时后，用薄层聚酯箔覆盖所选择的切片，并且置于成像板(Fuji，Japan)上。曝光在不透光盒在铅屏箱中于-20℃发生，以保护成像板不受环境辐射。在曝光后，以50μm的像素大小扫描成像板，并且使用生物成像分析系统(Bas 2500，Fuji，Japan)通过放射发光绘图术(radioluminography)进行分析，并且在ABR-SOP-0214中描述。使35S放射性的水溶性标准测试溶液与全血相混合且用于产生校准量表，ABR-SOP-0251。然而，使不同血液标准溶解于500uL Soluene-35中。随后将4.5mL UltimaGold加入溶解的样品中。因为35S和14C具有非常相似的能量谱，当设置关于不同血样的放射性时，使用标准14C-程序(Packard 2200CA)。
药代动力学计算：将在全血和组织中测量的35S放射性表示为nCi/g组织，并且重新计算为nmol当量/g组织用于药代动力学评估。使用WinNonlin Professional(Pharsight Corporation，MountainView，CA，USA)，通过非室分析(non-compartmental analysis)测定关于全血和组织的药代动力学参数Cmax、t1/2和AUC。在静脉内施用后，浓度回推至零，并且表示为(C0)。通过对数血浆浓度-时间曲线的末端斜率的线性回归分析估计清除速率常数λ。使用等式t1/2＝ln2/λ计算清除半衰期t1/2。如果未有另外说明，那么在清除半衰期计算中使用在LOQ上的最后3个时间点。
实施例38.如通过在小鼠肺和肾中的Ras蛋白质定量测定的，评估通过8-聚体LNA-抗miR在体内的let-7抑制
为了研究在体内拮抗丰富表达的let-7家族的可能性，用8-聚体LNA-抗miR拮抗剂或用盐水静脉内(i.v.)注射小鼠。为了测量处理效果，从肺和肾中分离蛋白质。因为Ras蛋白质家族(N-Ras、K-Ras和H-Ras)，特别是N-Ras和K-Ras，先前已通过Johnson等人(Cell，2005)显示由let-7家族调节(阻遏)，所以目的是分析这些let-7靶是否能够在体内去阻遏。
结果：如图37中可见，8-聚体LNA-抗miR在处理的小鼠的肾中有效去阻遏Ras蛋白质水平，针对盐水对照标准化。这个器官中的上调超过3倍，显示明确的体内作用。然而，在肺中，仅观察到最低限度(1.2-倍)的Ras去阻遏(图1B)，暗示不充足量的LNA-抗miR已进入这个器官，以便抑制其大量let-7，如先前由Johnson等人(Cancer Research，2007)描述的。
结论：8-聚体LNA-抗miR显示在体内调节靶let-7miRNA中的明确作用，如基于在处理与对照小鼠中相比较的Ras蛋白质水平评估的。尽管作用看起来在肺中较小，但肾中的Ras水平显示在抗miR处理后的大量上调。
材料与方法：动物和给药：C57BL/6雌性小鼠用10mg/kg LNA-抗miR或盐水处理，共连续3天(0、1和2)，并且在第4天时处死。使来自肺和肾的组织样品速冻，并且贮存于-80℃直至进一步加工。
western印迹分析：使用100μg/样品，在NuPAGE Bis Tris 4-12％(Invitrogen)上分离来自盐水和LNA-抗miR-处理小鼠的肺和肾蛋白质。根据制造商的说明书，使用iBlot(Invitrogen)将蛋白质转移至硝酸纤维素膜。根据制造商的说明书执行封闭、抗体稀释和检测。对于Ras检测，使用兔抗Ras一抗(SC-3339，Santa CruzBiotechnology)和HRP缀合的猪抗兔二抗(P0399，Dako)，并且对于微管蛋白检测，使用微管蛋白α一抗(MS-581-P1，Neomarkers)和HRP缀合的山羊抗小鼠(P0447，Dako)二抗。
实施例40.如通过小鼠肾中的Pdcd4蛋白质上调测定的，8-聚体LNA-抗miR(#3205)在靶向miR-21中的体内功效评估。
已显示完全LNA修饰的8-聚体LNA-抗miR拮抗miR-21，并且具有在体外调节miR-21靶Pdcd4的蛋白质水平的能力。我们因此将LNA-抗miR注射到小鼠内以测定LNA-抗miR在体内的作用。小鼠每隔一天通过i.v.注射接受25mg/kg #3205，共14天(总共5次剂量)。在第14天时处死小鼠，取出肾，并且分离蛋白质。为了测定靶调节，执行western印迹分析。
结果：如图37中所示，用#3205处理小鼠显示与盐水对照相比较，显著增加的Pdcd4蛋白质水平。尽管标准化的Pdcd4与Gapdh的比在2种盐水样品中是一致的，但2种LNA-抗miR处理的小鼠(#32059小鼠中的蛋白质上调分别测量为3.3-和6.3倍，证实#3205 8-聚体LNA-抗miR的体内药理学作用。
结论：如通过其去阻遏(上调)Pdcd4——验证miR-21靶的小鼠肾水平的能力证实的，完全LNA修饰的8-聚体LNA-抗miR#3205在体内拮抗miR-21。
材料与方法：
动物与给药：在所有实验中使用在第一次给药时具有20g体重平均值的C57BL/6雌性小鼠，并且接受常规食物饮食(Altromin no 1324，Brogaarden，Gentofte，Denmark)。物质在生理盐水(0.9％NaCl)中进行配制。动物用LNA-抗miR或盐水(0.9％NaCl)给药，接受25mg/kg每隔一天的注射，共14天，总共5次剂量。在第14天时处死动物。
western印迹分析：在NuPAGE Bis Tris 4-12％(Invitrogen)上分离来自盐水或LNA处理小鼠的80μg肾组织。根据制造商的说明书，使用iBlot(Invitrogen)将蛋白质转移至硝酸纤维素膜。使膜与Pdcd4抗体(Bethyl Laboratories)温育，随后为HRP缀合的猪抗兔抗体(Dako)。作为等量上样对照，使用GAPDH(Abcam)，随后为HRP缀合的猪抗小鼠抗体。通过化学发光(ECL，Amersham)显现膜。
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序列表
<110>Santaris Pharma A/S
 
<120>微小聚体
 
<130>1051WO
 
<150>US 60/977497
<151>2007-10-04
 
<150>US 60/979217
<151>2007-10-11
 
<150>US 61/028062
<151>2008-02-12
 
<150>EP08104780.5
<151>2008-07-17
 
<160>3787
 
<170>PatentIn version 3.5
 
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<211>15
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<220>
<223>种子聚体，任选的全长LNA硫代磷酸酯
 
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<221>misc_feature
<222>(1)..(8)
<223>全长LNA和硫代磷酸酯连接
 
<400>16
ggtaaact                                               8
 
<210>17
<211>8
<212>DNA
<213>人工
 
<220>
<223>LNA寡聚体
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(8)
<223>全长LNA和硫代磷酸酯连接
 
<400>17
cgtaatga                                               8
 
<210>18
<211>16
<212>DNA
<213>人工
 
<220>
<223>LNA寡聚体
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(16)
<223>LNA缺口聚体3LNA-9DNA-3LNA-1DNA，5’FAM标记，硫代磷酸酯连接。
 
<400>18
tcagtctgat aagcta                                      16
 
<210>19
<211>8
<212>DNA
<213>人工
 
<220>
<223>LNA寡聚体
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(8)
<223>全长LNA和硫代磷酸酯连接
 
<400>19
agcacttt                                               8
 
<210>20
<211>8
<212>DNA
<213>人工
 
<220>
<223>LNA寡聚体
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(8)
<223>全长LNA和硫代磷酸酯连接
 
<400>20
atttgcac                                               8
 
<210>21
<211>15
<212>DNA
<213>人工
 
<220>
<223>LNA寡聚体
 
<400>21
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<210>22
<211>15
<212>DNA
<213>人工
 
<220>
<223>LNA寡聚体
 
<400>22
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<210>23
<211>7
<212>DNA
<213>人工
 
<220>
<223>LNA寡聚体
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(7)
<223>全长LNA和硫代磷酸酯连接
 
<400>23
atgtagc                                                7
 
<210>24
<211>15
<212>DNA
<213>人工
 
<220>
<223>LNA寡聚体
 
<400>24
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<210>25
<211>8
<212>DNA
<213>人工
 
<220>
<223>LNA寡聚体
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(8)
<223>全长LNA和硫代磷酸酯连接
 
<400>25
actacctc                                               8
 
<210>26
<211>15
<212>DNA
<213>人工
 
<220>
<223>LNA寡聚体
 
<400>26
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<210>27
<211>15
<212>DNA
<213>人工
 
<220>
<223>LNA寡聚体
 
<400>27
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<210>28
<211>7
<212>DNA
<213>人工
 
<220>
<223>LNA寡聚体
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(7)
<223>全长LNA和硫代磷酸酯连接
 
<400>28
gtagact                                                7
 
<210>29
<211>6
<212>DNA
<213>人工
 
<220>
<223>LNA寡聚体
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(6)
<223>全长LNA和硫代磷酸酯连接
 
<400>29
tacctc                                                 6
 
<210>30
<211>7
<212>DNA
<213>人工
 
<220>
<223>LNA寡聚体
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(7)
<223>全长LNA和硫代磷酸酯连接
 
<400>30
ctacctc                                                7
 
<210>31
<211>9
<212>DNA
<213>人工
 
<220>
<223>LNA寡聚体
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(9)
<223>全长LNA和硫代磷酸酯连接，N＝通用碱基
 
<400>31
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<210>32
<211>9
<212>DNA
<213>人工
 
<220>
<223>LNA寡聚体
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(9)
<223>全长LNA和硫代磷酸酯连接，N＝通用碱基
 
<400>32
tnctacctc                                              9
<210>33
<211>15
<212>DNA
<213>人工
 
<220>
<223>LNA寡聚体
 
<400>33
gcaacctact acctc                                       15
 
<210>34
<211>15
<212>DNA
<213>人工
 
<220>
<223>LNA寡聚体
 
<400>34
acaacctcct acctc                                       15
 
<210>35
<211>15
<212>DNA
<213>人工
 
<220>
<223>LNA寡聚体
 
<400>35
acaaactact acctc                                       15
 
<210>36
<211>7
<212>DNA
<213>人工
 
<220>
<223>LNA寡聚体
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(7)
<223>全长LNA和硫代磷酸酯连接，
 
<400>36
ctacctc                                                7
 
<210>37
<211>7
<212>DNA
<213>人工
 
<220>
<223>LNA寡聚体
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(7)
<223>全长LNA和硫代磷酸酯连接，
 
<400>37
ctaactc                                                7
 
<210>38
<211>9
<212>DNA
<213>人工
 
<220>
<223>LNA寡聚体
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(9)
<223>全长LNA和硫代磷酸酯连接，
 
<400>38
ttagcatta                                              9
 
<210>39
<211>9
<212>DNA
<213>人工
 
<220>
<223>LNA寡聚体
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(9)
<223>全长LNA和硫代磷酸酯连接，
 
<400>39
ttagcatta                                              9
 
<210>40
<211>22
<212>RNA
<213>EB病毒
 
<400>40
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<210>41
<211>24
<212>RNA
<213>EB病毒
 
<400>41
ucuuagugga agugacgugc ugug                             24
 
<210>42
<211>23
<212>RNA
<213>EB病毒
<400>42
uacauaacca uggaguuggc ugu                              23
 
<210>43
<211>22
<212>RNA
<213>EB病毒
 
<400>43
gccaccucuu ugguucugua ca                               22
 
<210>44
<211>21
<212>RNA
<213>EB病毒
 
<400>44
acgcacacca ggcugacugc c                                21
 
<210>45
<211>24
<212>RNA
<213>EB病毒
 
<400>45
ucagacaguu uggugcgcua guug                             24
 
<210>46
<211>22
<212>RNA
<213>EB病毒
 
<400>46
uccuguggug uuuggugugg uu                               22
 
<210>47
<211>23
<212>RNA
<213>EB病毒
<400>47
uguaacuugc cagggacggc uga                              23
 
<210>48
<211>22
<212>RNA
<213>EB病毒
 
<400>48
aaccggcucg uggcucguac ag                               22
 
<210>49
<211>22
<212>RNA
<213>EB病毒
 
<400>49
uaaaugcugc aguaguaggg au                               22
 
<210>50
<211>22
<212>RNA
<213>EB病毒
 
<400>50
uacccuacgc ugccgauuua ca                               22
 
<210>51
<211>22
<212>RNA
<213>EB病毒
 
<400>51
gucagugguu uuguuuccuu ga                               22
 
<210>52
<211>24
<212>RNA
<213>EB病毒
 
<400>52
uuagauagag ugggugugug cucu                             24
 
<210>53
<211>23
<212>RNA
<213>EB病毒
 
<400>53
uguaugccug guguccccuu agu                              23
 
<210>54
<211>22
<212>RNA
<213>EB病毒
 
<400>54
uaagaggacg caggcauaca ag                               22
 
<210>55
<211>22
<212>RNA
<213>EB病毒
 
<400>55
uaucggaagu uugggcuucg uc                               22
 
<210>56
<211>22
<212>RNA
<213>EB病毒
 
<400>56
ucaaguucgc acuuccuaua ca                               22
 
<210>57
<211>21
<212>RNA
<213>EB病毒
 
<400>57
uuuuguuugc uugggaaugc u                                21
 
<210>58
<211>23
<212>RNA
<213>EB病毒
 
<400>58
acauuccccg caaacaugac aug                              23
 
<210>59
<211>24
<212>RNA
<213>EB病毒
 
<400>59
aaggagcgau uuggagaaaa uaaa                             24
 
<210>60
<211>22
<212>RNA
<213>EB病毒
 
<400>60
uauuuucugc auucgcccuu gc                               22
 
<210>61
<211>22
<212>RNA
<213>EB病毒
 
<400>61
caugaaggca cagccuguua cc                               22
 
<210>62
<211>21
<212>RNA
<213>EB病毒
 
<400>62
uagcaggcau gucuucauuc c                               21
 
<210>63
<211>22
<212>RNA
<213>EB病毒
 
<400>63
cgcaccacua gucaccaggu gu                               22
 
<210>64
<211>21
<212>RNA
<213>EB病毒
 
<400>64
accuaguguu aguguugugc u                               21
 
<210>65
<211>22
<212>RNA
<213>EB病毒
 
<400>65
gaccugaugc ugcuggugug cu                               22
 
<210>66
<211>24
<212>RNA
<213>EB病毒
 
<400>66
caaggugaau auagcugccc aucg                             24
<210>67
<211>22
<212>RNA
<213>EB病毒
 
<400>67
cggggaucgg acuagccuua ga                               22
 
<210>68
<211>22
<212>RNA
<213>EB病毒
 
<400>68
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<210>69
<211>22
<212>RNA
<213>EB病毒
 
<400>69
caucauaguc caguguccag gg                               22
 
<210>70
<211>22
<212>RNA
<213>EB病毒
 
<400>70
ccuggaccuu gacuaugaaa ca                               22
 
<210>71
<211>22
<212>RNA
<213>EB病毒
 
<400>71
uacgguuucc uagauuguac ag                               22
<210>72
<211>23
<212>RNA
<213>EB病毒
 
<400>72
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<210>73
<211>23
<212>RNA
<213>EB病毒
 
<400>73
uaacacuuca ugggucccgu agu                              23
 
<210>74
<211>22
<212>RNA
<213>EB病毒
 
<400>74
uacuggaccc ugaauuggaa ac                               22
 
<210>75
<211>22
<212>RNA
<213>EB病毒
 
<400>75
uaaccugauc agccccggag uu                               22
 
<210>76
<211>22
<212>RNA
<213>EB病毒
 
<400>76
uaucuuuugc ggcagaaauu ga                               22
<210>77
<211>22
<212>RNA
<213>EB病毒
 
<400>77
aaauucuguu gcagcagaua gc                               22
 
<210>78
<211>22
<212>RNA
<213>EB病毒
 
<400>78
uaacgggaag uguguaagca ca                               22
 
<210>79
<211>22
<212>RNA
<213>人巨细胞病毒
 
<400>79
aagugacggu gagauccagg cu                               22
 
<210>80
<211>21
<212>RNA
<213>人巨细胞病毒
 
<400>80
ucguccuccc cuucuucacc g                                21
 
<210>81
<211>20
<212>RNA
<213>人巨细胞病毒
 
<400>81
 uaacuagccu ucccgugaga                                20
 
<210>82
<211>22
<212>RNA
<213>人巨细胞病毒
 
<400>82
ucaccagaau gcuaguuugu ag                               22
 
<210>83
<211>22
<212>RNA
<213>人巨细胞病毒
 
<400>83
ucguugaaga caccuggaaa ga                               22
 
<210>84
<211>22
<212>RNA
<213>人巨细胞病毒
 
<400>84
uuuccaggug uuuucaacgu gc                               22
 
<210>85
<211>20
<212>RNA
<213>人巨细胞病毒
 
<400>85
ggggaugggc uggcgcgcgg                                  20
 
<210>86
<211>21
<212>RNA
<213>人巨细胞病毒
<400>86
ugcgucucgg ccucguccag a                                21
 
<210>87
<211>21
<212>RNA
<213>人巨细胞病毒
 
<400>87
aaccgcucag uggcucggac c                                21
 
<210>88
<211>22
<212>RNA
<213>人巨细胞病毒
 
<400>88
uccgaacgcu aggucgguuc uc                               22
 
<210>89
<211>23
<212>RNA
<213>人巨细胞病毒
 
<400>89
auccacuugg agagcucccg cgg                              23
 
<210>90
<211>22
<212>RNA
<213>人巨细胞病毒
 
<400>90
agcggucugu ucagguggau ga                               22
 
<210>91
<211>20
<212>RNA
<213>人巨细胞病毒
<400>91
ucacgguccg agcacaucca                                  20
 
<210>92
<211>22
<212>RNA
<213>人巨细胞病毒
 
<400>92
gauugugccc ggaccguggg cg                               22
 
<210>93
<211>22
<212>RNA
<213>人巨细胞病毒
 
<400>93
cgacauggac gugcaggggg au                               22
 
<210>94
<211>21
<212>RNA
<213>人巨细胞病毒
 
<400>94
ugacaagccu gacgagagcg u                                21
 
<210>95
<211>22
<212>RNA
<213>人巨细胞病毒
 
<400>95
uuaugauagg ugugacgaug uc                               22
 
<210>96
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>96
ugagguagua gguuguauag uu                               22
 
<210>97
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>97
cuauacaauc uacugucuuu c                                21
 
<210>98
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>98
ugagguagua gguugugugg uu                               22
 
<210>99
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>99
cuauacaacc uacugccuuc cc                               22
 
<210>100
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>100
ugagguagua gguuguaugg uu                               22
 
<210>101
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>101
uagaguuaca cccugggagu ua                               22
 
<210>102
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>102
agagguagua gguugcauag uu                               22
 
<210>103
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>103
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<210>104
 
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>104
ugagguagga gguuguauag uu                               22
 
<210>105
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>105
cuauacggcc uccuagcuuu cc                               22
 
<210>106
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>106
ugagguagua gauuguauag uu                               22
 
<210>107
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>107
cuauacaauc uauugccuuc cc                               22
 
<210>108
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>108
cuauacaguc uacugucuuu cc                               22
 
<210>109
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>109
ugagguagua guuuguacag uu                               22
 
<210>110
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>110
cuguacaggc cacugccuug c                                21
<210>111
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>111
ugagguagua guuugugcug uu                               22
 
<210>112
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>112
cugcgcaagc uacugccuug cu                               22
 
<210>113
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>113
uggaauguaa agaaguaugu au                               22
 
<210>114
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>114
aacccguaga uccgaacuug ug                               22
 
<210>115
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>115
caagcuugua ucuauaggua ug                               22
<210>116
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>116
uacaguacug ugauaacuga a                                21
 
<210>117
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>117
caguuaucac agugcugaug cu                               22
 
<210>118
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>118
agcagcauug uacagggcua uga                              23
 
<210>119
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>119
ucauagcccu guacaaugcu gcu                              23
 
<210>120
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>120
ucaaaugcuc agacuccugu ggu                              23
<210>121
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>121
acggauguuu gagcaugugc ua                               22
 
<210>122
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>122
aaaagugcuu acagugcagg uag                              23
 
<210>123
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>123
cugcaaugua agcacuucuu ac                               22
 
<210>124
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>124
uaaagugcug acagugcaga u                                21
 
<210>125
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>125
ccgcacugug gguacuugcu gc                               22
 
<210>126
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>126
agcagcauug uacagggcua uca                              23
 
<210>127
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>127
uacccuguag auccgaauuu gug                              23
 
<210>128
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>128
caaauucgua ucuaggggaa ua                               22
 
<210>129
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>129
uacccuguag aaccgaauuu gug                              23
 
<210>130
<211>22
<212>RNA
<213>人
<400>130
acagauucga uucuagggga au                               22
 
<210>131
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>131
uugcucacug uucuucccua g                                21
 
<210>132
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>132
aagcauucuu ucauugguug g                                21
 
<210>133
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>133
uuuccggcuc gcgugggugu gu                               22
 
<210>134
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>134
ccgucgccgc cacccgagcc g                                21
 
<210>135
<211>23
<212>RNA
<213>人
<400>135
gagggucuug ggagggaugu gac                              23
 
<210>136
<211>27
<212>RNA
<213>人
 
<400>136
cacuguaggu gauggugaga gugggca                          27
 
<210>137
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>137
ccugcagcga cuugauggcu ucc                              23
 
<210>138
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>138
agaggauacc cuuuguaugu u                                21
 
<210>139
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>139
uaggacacau ggucuacuuc u                                21
 
<210>140
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>140
cuccugagcc auucugagcc uc                               22
 
<210>141
<211>24
<212>RNA
<213>人
 
<400>141
agccugauua aacacaugcu cuga                             24
 
<210>142
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>142
gugccagcug caguggggga g                                21
 
<210>143
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>143
cccggagcca ggaugcagcu c                                21
 
<210>144
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>144
ucguggccug gucuccauua u                                21
 
<210>145
<211>20
<212>RNA
<213>人
 
<400>145
ucugcagggu uugcuuugag                                  20
 
<210>146
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>146
uguucaugua  gauguuuaag c                               21
 
<210>147
<211>18
<212>RNA
<213>人
 
<400>147
ucagcuggcc cucauuuc                                    18
 
<210>148
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>148
uggcagggag gcugggaggg g                                21
 
<210>149
<211>20
<212>RNA
<213>人
 
<400>149
ucacuguuca gacaggcgga                                  20
 
<210>150
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>150
uggaguguga caaugguguu ug                               22
 
<210>151
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>151
aacgccauua ucacacuaaa ua                               22
 
<210>152
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>152
ccccaccucc ucucuccuca g                                21
 
<210>153
<211>19
<212>RNA
<213>人
 
<400>153
gugaggacuc gggaggugg                                   19
 
<210>154
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>154
ugagccccug ugccgccccc ag                               22
<210>155
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>155
guggguacgg cccagugggg gg                               22
 
<210>156
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>156
ucaccagccc uguguucccu ag                               22
 
<210>157
<211>26
<212>RNA
<213>人
 
<400>157
gugagggcau gcaggccugg augggg                           26
 
<210>158
<211>20
<212>RNA
<213>人
 
<400>158
cgugccaccc uuuuccccag                                  20
 
<210>159
<211>20
<212>RNA
<213>人
 
<400>159
ucacaccugc cucgcccccc                                  20
<210>160
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>160
gugggcgggg gcaggugugu g                                21
 
<210>161
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>161
cucucaccac ugcccuccca cag                              23
 
<210>162
<211>20
<212>RNA
<213>人
 
<400>162
gugucugggc ggacagcugc                                  20
 
<210>163
<211>20
<212>RNA
<213>人
 
<400>163
ugagcccugu ccucccgcag                                  20
 
<210>164
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>164
ucggccugac cacccacccc ac                               22
<210>165
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>165
ccucuucccc uugucucucc ag                               22
 
<210>166
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>166
uccuucugcu ccguccccca g                                21
 
<210>167
<211>20
<212>RNA
<213>人
 
<400>167
cuuccucguc ugucugcccc                                  20
 
<210>168
<211>20
<212>RNA
<213>人
 
<400>168
uaaggcacgc ggugaaugcc                                  20
 
<210>169
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>169
cguguucaca gcggaccuug au                               22
 
<210>170
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>170
aacuggauca auuauaggag ug                               22
 
<210>171
<211>26
<212>RNA
<213>人
 
<400>171
aaguaguugg uuuguaugag augguu                           26
 
<210>172
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>172
aagugaucua aaggccuaca u                                21
 
<210>173
<211>19
<212>RNA
<213>人
 
<400>173
gauggauuuu  uggagcagg                                  19
 
<210>174
<211>22
<212>RNA
<213>人
<400>174
acccgucccg uucguccccg ga                               22
 
<210>175
<211>27
<212>RNA
<213>人
 
<400>175
accuucuugu auaagcacug ugcuaaa                          27
 
<210>176
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>176
acgcccuucc cccccuucuu ca                               22
 
<210>177
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>177
acggugcugg auguggccuu u                                21
 
<210>178
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>178
acucuagcug ccaaaggcgc u                                21
 
<210>179
<211>22
<212>RNA
<213>人
<400>179
agaaggaaau ugaauucauu ua                               22
 
<210>180
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>180
agagaagaag aucagccugc a                                21
 
<210>181
<211>24
<212>RNA
<213>人
 
<400>181
agccuggaag cuggagccug cagu                             24
 
<210>182
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>182
aggaugagca aagaaaguag auu                              23
 
<210>183
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>183
cggaugagca aagaaagugg uu                               22
 
<210>184
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>184
aggcauugac uucucacuag cu                               22
 
<210>185
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>185
agugaaugau ggguucugac c                                21
 
<210>186
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>186
aguuaggauu aggucgugga a                                21
 
<210>187
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>187
auauaugaug acuuagcuuu u                                21
 
<210>188
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>188
acaggugagg uucuugggag cc                               22
 
<210>189
<211>24
<212>RNA
<213>人
 
<400>189
ucccugagac ccuuuaaccu guga                             24
 
<210>190
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>190
ucccugagac ccuaacuugu ga                               22
 
<210>191
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>191
acggguuagg cucuugggag cu                               22
 
<210>192
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>192
ucacaaguca ggcucuuggg ac                               22
 
<210>193
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>193
ucguaccgug aguaauaaug cg                               22
 
<210>194
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>194
cauuauuacu uuugguacgc g                                21
 
<210>195
<211>18
<212>RNA
<213>人
 
<400>195
aucccaccuc ugccacca                                    18
 
<210>196
<211>19
<212>RNA
<213>人
 
<400>196
auggauaagg cuuuggcuu                                   19
 
<210>197
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>197
augggugaau uuguagaagg au                               22
 
<210>198
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>198
augguacccu ggcauacuga gu                               22
<210>199
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>199
caagucuuau uugagcaccu guu                              23
 
<210>200
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>200
caggaugugg ucaaguguug  uu                               22
 
<210>201
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>201
ccucagggcu guagaacagg gcu                              23
 
<210>202
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>202
ccuguugaag uguaaucccc a                                21
 
<210>203
<211>18
<212>RNA
<213>人
 
<400>203
cgggcguggu gguggggg                                    18
<210>204
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>204
cuggacugag ccgugcuacu gg                               22
 
<210>205
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>205
ucggauccgu cugagcuugg cu                               22
 
<210>206
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>206
cugaagcuca gagggcucug au                               22
 
<210>207
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>207
cuggagauau ggaagagcug ugu                              23
 
<210>208
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>208
cuuggcaccu agcaagcacu ca                               22
<210>209
<211>26
<212>RNA
<213>人
 
<400>209
gaugaugaug gcagcaaauu cugaaa                           26
 
<210>210
<211>25
<212>RNA
<213>人
 
<400>210
gggcgacaaa gcaagacucu uucuu                            25
 
<210>211
<211>18
<212>RNA
<213>人
 
<400>211
gucccuguuc aggcgcca                                    18
 
<210>212
<211>17
<212>RNA
<213>人
 
<400>212
ucccuguucg ggcgcca                                     17
 
<210>213
<211>17
<212>RNA
<213>人
<400>213
gugggggaga ggcuguc                                     17
 
<210>214
<211>20
<212>RNA
<213>人
 
<400>214
uaaagagccc uguggagaca                                  20
 
<210>215
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>215
uacguagaua uauauguauu uu                               22
 
<210>216
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>216
uaguacugug cauaucaucu au                               22
 
<210>217
<211>17
<212>RNA
<213>人
 
<400>217
ucauauugcu ucuuucu                                     17
 
<210>218
<211>21
<212>RNA
<213>人
<400>218
ucacagugaa ccggucucuu u                                21
 
<210>219
<211>17
<212>RNA
<213>人
 
<400>219
ucccaccgcu gccaccc                                     17
 
<210>220
<211>17
<212>RNA
<213>人
 
<400>220
ucgccuccuc cucuccc                                     17
 
<210>221
<211>20
<212>RNA
<213>人
 
<400>221
ucguuugccu uuuucugcuu                                  20
 
<210>222
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>222
ucuacaaagg aaagcgcuuu cu                               22
 
<210>223
<211>22
<212>RNA
<213>人
<400>223
ucuauacaga cccuggcuuu uc                               22
 
<210>224
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>224
ucugggcaac aaagugagac cu                               22
 
<210>225
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>225
ugcaggacca agaugagccc u                                21
 
<210>226
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>226
ugcuggauca gugguucgag uc                               22
 
<210>227
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>227
uggacugccc ugaucuggag a                                21
 
<210>228
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>228
uggaguccag gaaucugcau uuu                              23
 
<210>229
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>229
aagcccuuac cccaaaaagu au                               22
 
<210>230
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>230
aagcccuuac cccaaaaagc au                               22
 
<210>231
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>231
cuuuuugcgg ucugggcuug c                                21
 
<210>232
<211>19
<212>RNA
<213>人
 
<400>232
uggauuuuug gaucaggga                                   19
 
<210>233
<211>24
<212>RNA
<213>人
 
<400>233
uggcccugac ugaagaccag cagu                             24
 
<210>234
<211>25
<212>RNA
<213>人
 
<400>234
ugggaacggg uuccggcaga cgcug                            25
 
<210>235
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>235
uggguggucu ggagauuugu gc                               22
 
<210>236
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>236
ugugagguug gcauuguugu cu                               22
 
<210>237
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>237
uuaggccgca gaucugggug a                                21
 
<210>238
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>238
uuagggcccu ggcuccaucu cc                               22
 
<210>239
<211>17
<212>RNA
<213>人
 
<400>239
uucaaguaau ucaggug                                     17
 
<210>240
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>240
uucauucggc uguccagaug ua                               22
 
<210>241
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>241
uucuggaauu cugugugagg ga                               22
 
<210>242
<211>18
<212>RNA
<213>人
 
<400>242
uugagaagga ggcugcug                                    18
<210>243
<211>24
<212>RNA
<213>人
 
<400>243
uugcagcugc cugggaguga cuuc                             24
 
<210>244
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>244
uugggacaua cuuaugcuaa a                                21
 
<210>245
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>245
uuuagagacg gggucuugcu cu                               22
 
<210>246
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>246
uuugaggcua cagugagaug ug                               22
 
<210>247
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>247
uuuucaacuc uaaugggaga ga                               22
<210>248
<211>18
<212>RNA
<213>人
 
<400>248
acguuggcuc ugguggug                                    18
 
<210>249
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>249
acucggcgug gcgucggucg ug                               22
 
<210>250
<211>18
<212>RNA
<213>人
 
<400>250
gcaugggugg uucagugg                                    18
 
<210>251
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>251
cagugcaaug uuaaaagggc au                               22
 
<210>252
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>252
uucacauugu gcuacugucu gc                               22
<210>253
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>253
cagugcaaug augaaagggc au                               22
 
<210>254
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>254
acucuuuccc uguugcacua c                                21
 
<210>255
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>255
uaacagucua cagccauggu cg                               22
 
<210>256
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>256
accguggcuu ucgauuguua cu                               22
 
<210>257
<211>18
<212>RNA
<213>人
 
<400>257
cagggaggug aaugugau                                    18
 
<210>258
<211>19
<212>RNA
<213>人
 
<400>258
gaugaugcug cugaugcug                                   19
 
<210>259
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>259
ucaaaacuga ggggcauuuu cu                               22
 
<210>260
<211>24
<212>RNA
<213>人
 
<400>260
ccagacagaa uucuaugcac uuuc                             24
 
<210>261
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>261
uuuggucccc uucaaccagc ug                               22
 
<210>262
<211>22
<212>RNA
<213>人
<400>262
uuuggucccc uucaaccagc ua                               22
 
<210>263
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>263
ugugacuggu ugaccagagg gg                               22
 
<210>264
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>264
uauggcuuuu uauuccuaug uga                              23
 
<210>265
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>265
uauagggauu ggagccgugg cg                               22
 
<210>266
<211>23
<212>RNA
<213>人
<400>266
uauggcuuuu cauuccuaug uga                              23
 
<210>267
<211>22
<212>RNA
<213>人
<400>267
auguagggcu aaaagccaug gg                               22
 
<210>268
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>268
acuccauuug uuuugaugau gga                              23
 
<210>269
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>269
caucaucguc ucaaaugagu cu                               22
 
<210>270
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>270
uuauugcuua agaauacgcg uag                              23
 
<210>271
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>271
agcugguguu gugaaucagg ccg                              23
 
<210>272
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>272
gcuacuucac aacaccaggg cc                               22
 
<210>273
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>273
gcuauuucac gacaccaggg uu                               22
 
<210>274
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>274
ggagacgcgg cccuguugga gu                               22
 
<210>275
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>275
ucuacagugc acgugucucc ag                               22
 
<210>276
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>276
uaccacaggg uagaaccacg g                                21
 
<210>277
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>277
cagugguuuu acccuauggu ag                               22
 
<210>278
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>278
uaacacuguc ugguaaagau gg                               22
 
<210>279
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>279
caucuuccag uacaguguug ga                               22
 
<210>280
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>280
uguaguguuu ccuacuuuau gga                              23
 
<210>281
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>281
cauaaaguag aaagcacuac u                               21
 
<210>282
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>282
ugagaugaag cacuguagcu c                               21
 
<210>283
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>283
ggugcagugc ugcaucucug gu                               22
 
<210>284
<211>20
<212>RNA
<213>人
 
<400>284
uacaguauag augauguacu                                  20
 
<210>285
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>285
ggauaucauc auauacugua ag                               22
 
<210>286
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>286
guccaguuuu cccaggaauc ccu                              23
<210>287
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>287
ggauuccugg aaauacuguu cu                               22
 
<210>288
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>288
cuccguuugc cuguuucgcu g                                21
 
<210>289
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>289
cucggcgcgg ggcgcgggcu cc                               22
 
<210>290
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>290
ugagaacuga auuccauggg uu                               22
 
<210>291
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>291
ccucugaaau ucaguucuuc ag                               22
<210>292
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>292
ugcccugugg acucaguucu gg                               22
 
<210>293
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>293
ugagaacuga auuccauagg cu                               22
 
<210>294
<211>20
<212>RNA
<213>人
 
<400>294
guguguggaa augcuucugc                                  20
 
<210>295
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>295
gcccuccgcc cgugcacccc g                                21
 
<210>296
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>296
gcccgcgugu ggagccaggu gu                               22
<210>297
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>297
gugugcggaa augcuucugc ua                               22
 
<210>298
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>298
ucagugcacu acagaacuuu gu                               22
 
<210>299
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>299
aaaguucuga gacacuccga cu                               22
 
<210>300
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>300
ucagugcauc acagaacuuu gu                               22
 
<210>301
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>301
aaguucuguu auacacucag gc                               22
 
<210>302
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>302
ucuggcuccg ugucuucacu ccc                              23
 
<210>303
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>303
agggagggac gggggcugug c                                21
 
<210>304
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>304
ucucccaacc cuuguaccag ug                               22
 
<210>305
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>305
cugguacagg ccugggggac ag                               22
 
<210>306
<211>21
<212>RNA
<213>人
<400>306
cuagacugaa gcuccuugag g                                21
 
<210>307
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>307
ucgaggagcu cacagucuag u                                21
 
<210>308
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>308
ucagugcaug acagaacuug g                                21
 
<210>309
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>309
uugcauaguc acaaaaguga uc                               22
 
<210>310
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>310
aaaaccgucu aguuacaguu gu                               22
 
<210>311
<211>23
<212>RNA
<213>人
<400>311
cggcccgggc ugcugcuguu ccu                              23
 
<210>312
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>312
uccugcgcgu cccagaugcc c                                21
 
<210>313
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>313
uagguuaucc guguugccuu cg                               22
 
<210>314
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>314
aaucauacac gguugaccua uu                               22
 
<210>315
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>315
uuaaugcuaa ucgugauagg ggu                               23
 
<210>316
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>316
cuccuacaua uuagcauuaa ca                               22
 
<210>317
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>317
uagcagcaca uaaugguuug ug                               22
 
<210>318
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>318
caggccauau ugugcugccu ca                               22
 
<210>319
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>319
uagcagcaca ucaugguuua ca                               22
 
<210>320
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>320
cgaaucauua uuugcugcuc ua                               22
 
<210>321
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>321
uagcagcacg uaaauauugg cg                               22
 
<210>322
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>322
ccaguauuaa cugugcugcu ga                               22
 
<210>323
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>323
ccaauauuac ugugcugcuu ua                               22
 
<210>324
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>324
caaagugcuu acagugcagg uag                              23
 
<210>325
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>325
acugcaguga aggcacuugu ag                               22
 
<210>326
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>326
aacauucaac gcugucggug agu                              23
 
<210>327
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>327
accaucgacc guugauugua cc                               22
 
<210>328
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>328
accacugacc guugacugua cc                               22
 
<210>329
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>329
aacauucauu gcugucggug ggu                              23
 
<210>330
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>330
aacauucaac cugucgguga gu                               22
<210>331
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>331
aaccaucgac cguugagugg ac                               22
 
<210>332
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>332
aacauucauu guugucggug ggu                              23
 
<210>333
<211>24
<212>RNA
<213>人
 
<400>333
uuuggcaaug guagaacuca cacu                             24
 
<210>334
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>334
ugguucuaga cuugccaacu a                                21
 
<210>335
<211>18
<212>RNA
<213>人
 
<400>335
uccagugccc  uccucucc                                   18
<210>336
<211>27
<212>RNA
<213>人
 
<400>336
auugaucauc gacacuucga acgcaau                          27
 
<210>337
<211>18
<212>RNA
<213>人
 
<400>337
ugaggcagua gauugaau                                    18
 
<210>338
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>338
uauggcacug guagaauuca cu                               22
 
<210>339
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>339
gugaauuacc gaagggccau aa                               22
 
<210>340
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>340
uggacggaga acugauaagg gu                               22
<210>341
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>341
uggagagaaa ggcaguuccu ga                               22
 
<210>342
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>342
aggggcuggc uuuccucugg uc                               22
 
<210>343
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>343
caaagaauuc uccuuuuggg cu                               22
 
<210>344
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>344
gcccaaaggu gaauuuuuug gg                               22
 
<210>345
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>345
ucgugucuug uguugcagcc gg                               22
 
<210>346
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>346
ggcuacaaca caggacccgg gc                               22
 
<210>347
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>347
cucccacaug caggguuugc a                                21
 
<210>348
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>348
caucccuugc augguggagg g                                21
 
<210>349
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>349
uaaggugcau cuagugcaga uag                              23
 
<210>350
<211>23
<212>RNA
<213>人
<400>350
acugcccuaa gugcuccuuc ugg                              23
 
<210>351
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>351
uaaggugcau cuagugcagu uag                              23
 
<210>352
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>352
ugcccuaaau gccccuucug gc                               22
 
<210>353
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>353
ugauauguuu gauauauuag gu                               22
 
<210>354
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>354
cggcggggac ggcgauuggu c                                21
 
<210>355
<211>22
<212>RNA
<213>人
<400>355
cgcaggggcc gggugcucac cg                               22
 
<210>356
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>356
ugagugccgg ugccugcccu g                                21
 
<210>357
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>357
ugauauguuu gauauugggu u                                21
 
<210>358
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>358
caacggaauc ccaaaagcag cug                              23
 
<210>359
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>359
gcugcgcuug gauuucgucc cc                               22
 
<210>360
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>360
ccaguccugu gccugccgcc u                                21
 
<210>361
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>361
ugaguaccgc caugucuguu ggg                              23
 
<210>362
<211>20
<212>RNA
<213>人
 
<400>362
caccaggcau uguggucucc                                  20
 
<210>363
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>363
uacccagagc augcagugug aa                               22
 
<210>364
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>364
ucugcccccu ccgcugcugc ca                               22
 
<210>365
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>365
cccugugccc ggcccacuuc ug                               22
 
<210>366
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>366
ggaggggucc cgcacuggga gg                               22
 
<210>367
<211>20
<212>RNA
<213>人
 
<400>367
ccccagggcg acgcggcggg                                  20
 
<210>368
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>368
accuugccuu gcugcccggg cc                               22
 
<210>369
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>369
cugaccuaug aauugacagc c                                21
 
<210>370
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>370
cugccaauuc cauaggucac ag                               22
 
<210>371
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>371
aacuggccua caaaguccca gu                               22
 
<210>372
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>372
ugggucuuug cgggcgagau ga                               22
 
<210>373
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>373
aacuggcccu caaagucccg cu                               22
 
<210>374
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>374
cgggguuuug agggcgagau ga                               22
<210>375
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>375
uguaacagca acuccaugug ga                               22
 
<210>376
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>376
ccaguggggc ugcuguuauc ug                               22
 
<210>377
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>377
uagcagcaca gaaauauugg c                                21
 
<210>378
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>378
ccaauauugg cugugcugcu cc                               22
 
<210>379
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>379
uagguaguuu cauguuguug gg                               22
<210>380
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>380
cggcaacaag aaacugccug ag                               22
 
<210>381
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>381
uagguaguuu ccuguuguug gg                               22
 
<210>382
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>382
uucaccaccu ucuccaccca gc                               22
 
<210>383
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>383
gguccagagg ggagauaggu uc                               22
 
<210>384
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>384
cccaguguuc agacuaccug uuc                              23
<210>385
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>385
acaguagucu gcacauuggu ua                               22
 
<210>386
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>386
cccaguguuu agacuaucug uuc                              23
 
<210>387
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>387
ugugcaaauc uaugcaaaac uga                              23
 
<210>388
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>388
aguuuugcau aguugcacua ca                               22
 
<210>389
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>389
ugugcaaauc caugcaaaac uga                              23
 
<210>390
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>390
aguuuugcag guuugcaucc agc                              23
 
<210>391
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>391
aguuuugcag guuugcauuu ca                               22
 
<210>392
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>392
uaacacuguc ugguaacgau gu                               22
 
<210>393
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>393
caucuuaccg gacagugcug ga                               22
 
<210>394
<211>22
<212>RNA
<213>人
<400>394
uaauacugcc ugguaaugau ga                               22
 
<210>395
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>395
caucuuacug ggcagcauug ga                               22
 
<210>396
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>396
uaauacugcc ggguaaugau gga                              23
 
<210>397
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>397
cgucuuaccc agcaguguuu gg                               22
 
<210>398
<211>20
<212>RNA
<213>人
 
<400>398
agagguauag ggcaugggaa                                  20
 
<210>399
<211>22
<212>RNA
<213>人
<400>399
uuccuaugca uauacuucuu ug                               22
 
<210>400
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>400
gugaaauguu uaggaccacu ag                               22
 
<210>401
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>401
uucccuuugu cauccuaugc cu                               22
 
<210>402
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>402
uccuucauuc caccggaguc ug                                22
 
<210>403
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>403
uggaauguaa ggaagugugu gg                               22
 
<210>404
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>404
auaagacgag caaaaagcuu gu                               22
 
<210>405
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>405
auaagacgaa caaaagguuu gu                               22
 
<210>406
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>406
uaaagugcuu auagugcagg uag                              23
 
<210>407
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>407
acugcauuau gagcacuuaa ag                               22
 
<210>408
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>408
caaagugcuc auagugcagg uag                              23
 
<210>409
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>409
acuguaguau gggcacuucc ag                               22
 
<210>410
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>410
uagcuuauca gacugauguu ga                               22
 
<210>411
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>411
caacaccagu cgaugggcug u                                21
 
<210>412
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>412
cugugcgugu gacagcggcu ga                               22
 
<210>413
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>413
uucccuuugu cauccuucgc cu                               22
 
<210>414
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>414
uaacagucuc cagucacggc c                                21
 
<210>415
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>415
acagcaggca cagacaggca gu                               22
 
<210>416
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>416
ugccugucua cacuugcugu gc                               22
 
<210>417
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>417
augac cuaug aauugacaga c                                21
 
<210>418
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>418
uaaucucagc uggcaacugu ga                               22
<210>419
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>419
aaaucucugc aggcaaaugu ga                               22
 
<210>420
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>420
uacugcauca ggaacugauu gga                              23
 
<210>421
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>421
uugugcuuga ucuaaccaug u                                21
 
<210>422
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>422
augguuccgu caagcaccau gg                               22
 
<210>423
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>423
caugguucug ucaagcaccg cg                               22
<210>424
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>424
agaguugagu cuggacgucc cg                               22
 
<210>425
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>425
agaauugugg cuggacaucu gu                               22
 
<210>426
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>426
ugauugucca aacgcaauuc u                                21
 
<210>427
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>427
aagcugccag uugaagaacu gu                               22
 
<210>428
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>428
aguucuucag uggcaagcuu ua                               22
<210>429
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>429
ccacaccgua ucugacacuu u                                21
 
<210>430
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>430
ccaccaccgu gucugacacu u                                21
 
<210>431
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>431
acacagggcu guugugaaga cu                               22
 
<210>432
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>432
agcuacauug ucugcugggu uuc                              23
 
<210>433
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>433
accuggcaua caauguagau uu                               22
 
<210>434
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>434
agcuacaucu ggcuacuggg u                                21
 
<210>435
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>435
cucaguagcc aguguagauc cu                               22
 
<210>436
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>436
ugucaguuug ucaaauaccc ca                               22
 
<210>437
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>437
cguguauuug acaagcugag uu                               22
 
<210>438
<211>21
<212>RNA
<213>人
<400>438
caagucacua gugguuccgu u                                21
 
<210>439
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>439
aucacauugc cagggauuuc c                                21
 
<210>440
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>440
gggguuccug gggaugggau uu                               22
 
<210>441
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>441
aucacauugc cagggauuac c                                21
 
<210>442
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>442
uggguuccug gcaugcugau uu                               22
 
<210>443
<211>22
<212>RNA
<213>人
<400>443
uggcucaguu cagcaggaac ag                               22
 
<210>444
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>444
ugccuacuga gcugauauca gu                               22
 
<210>445
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>445
ugccuacuga gcugaaacac ag                               22
 
<210>446
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>446
cauugcacuu gucucggucu ga                               22
 
<210>447
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>447
aggcggagac uugggcaauu g                                21
 
<210>448
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>448
uucaaguaau ccaggauagg cu                               22
 
<210>449
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>449
ccuauucuug guuacuugca cg                               22
 
<210>450
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>450
ccuauucuug auuacuuguu uc                               22
 
<210>451
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>451
uucaaguaau ucaggauagg u                                21
 
<210>452
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>452
ccuguucucc auuacuuggc uc                               22
 
<210>453
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>453
uucacagugg cuaaguuccg c                                21
 
<210>454
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>454
agggcuuagc ugcuugugag ca                               22
 
<210>455
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>455
uucacagugg cuaaguucug c                                21
 
<210>456
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>456
agagcuuagc ugauugguga ac                               22
 
<210>457
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>457
cacuagauug ugagcuccug ga                               22
 
<210>458
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>458
aaggagcuca cagucuauug ag                               22
 
<210>459
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>459
gaggguuggg uggaggcucu cc                               22
 
<210>460
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>460
agggcccccc cucaauccug u                                21
 
<210>461
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>461
auguaugugu gcaugugcau g                                21
 
<210>462
<211>24
<212>RNA
<213>人
 
<400>462
agcagaagca gggagguucu ccca                             24
<210>463
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>463
uaugugggau gguaaaccgc uu                               22
 
<210>464
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>464
ugguuuaccg ucccacauac au                               22
 
<210>465
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>465
uagcaccauc ugaaaucggu ua                               22
 
<210>466
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>466
acugauuucu uuugguguuc ag                               22
 
<210>467
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>467
uagcaccauu ugaaaucagu guu                              23
<210>468
<211>24
<212>RNA
<213>人
 
<400>468
gcugguuuca uauggugguu uaga                             24
 
<210>469
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>469
cugguuucac augguggcuu ag                               22
 
<210>470
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>470
uagcaccauu ugaaaucggu ua                               22
 
<210>471
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>471
ugaccgauuu cuccuggugu uc                               22
 
<210>472
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>472
uauacaaggg cagacucucu cu                               22
<210>473
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>473
cagugcaaua guauugucaa agc                              23
 
<210>474
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>474
cagugcaaug auauugucaa agc                              23
 
<210>475
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>475
uaagugcuuc cauguuuugg uga                              23
 
<210>476
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>476
acuuaaacgu ggauguacuu gcu                              23
 
<210>477
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>477
uaagugcuuc cauguuuuag uag                              23
 
<210>478
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>478
acuuuaacau ggaagugcuu uc                               22
 
<210>479
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>479
uaagugcuuc cauguuucag ugg                              23
 
<210>480
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>480
uuuaacaugg ggguaccugc ug                               22
 
<210>481
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>481
uaagugcuuc cauguuugag ugu                              23
 
<210>482
<211>22
<212>RNA
<213>人
<400>482
acuuuaacau ggaggcacuu gc                               22
 
<210>483
<211>17
<212>RNA
<213>人
 
<400>483
uaagugcuuc caugcuu                                     17
 
<210>484
<211>17
<212>RNA
<213>人
 
<400>484
uaauugcuuc cauguuu                                     17
 
<210>485
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>485
uguaaacauc cucgacugga ag                               22
 
<210>486
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>486
cuuucagucg gauguuugca gc                               22
 
<210>487
<211>22
<212>RNA
<213>人
<400>487
uguaaacauc cuacacucag cu                               22
 
<210>488
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>488
cugggaggug gauguuuacu uc                               22
 
<210>489
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>489
uguaaacauc cuacacucuc agc                              23
 
<210>490
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>490
cugggagagg guuguuuacu cc                               22
 
<210>491
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>491
cugggagaag gcuguuuacu cu                               22
 
<210>492
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>492
uguaaacauc cccgacugga ag                               22
 
<210>493
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>493
cuuucaguca gauguuugcu gc                               22
 
<210>494
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>494
uguaaacauc cuugacugga ag                               22
 
<210>495
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>495
cuuucagucg gauguuuaca gc                               22
 
<210>496
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>496
aggcaagaug cuggcauagc u                                21
 
<210>497
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>497
ugcuaugcca acauauugcc au                               22
 
<210>498
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>498
uauugcacau uacuaaguug ca                               22
 
<210>499
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>499
caauuuagug ugugugauau uu                               22
 
<210>500
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>500
aaaagcuggg uugagagggc ga                               22
 
<210>501
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>501
aaaagcuggg uugagagggc aa                               22
 
<210>502
<211>20
<212>RNA
<213>人
 
<400>502
aaaagcuggg uugagagggu                               20
 
<210>503
<211>19
<212>RNA
<213>人
 
<400>503
aaaagcuggg uugagagga                               19
 
<210>504
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>504
cacauuacac ggucgaccuc u                               21
 
<210>505
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>505
aggugguccg uggcgcguuc gc                               22
 
<210>506
<211>20
<212>RNA
<213>人
 
<400>506
acugccccag gugcugcugg                                  20
<210>507
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>507
cgcauccccu agggcauugg ugu                              23
 
<210>508
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>508
ccuaguaggu guccaguaag ugu                              23
 
<210>509
<211>20
<212>RNA
<213>人
 
<400>509
ccucugggcc cuuccuccag                                  20
 
<210>510
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>510
cuggcccucu cugcccuucc gu                               22
 
<210>511
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>511
aacacaccug guuaaccucu uu                               22
<210>512
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>512
gcaaagcaca cggccugcag aga                              23
 
<210>513
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>513
ucucugggcc ugugucuuag gc                               22
 
<210>514
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>514
gccccugggc cuauccuaga a                                21
 
<210>515
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>515
cuagguaugg ucccagggau cc                               22
 
<210>516
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>516
ucaagagcaa uaacgaaaaa ugu                              23
<210>517
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>517
uuuuucauua uugcuccuga cc                               22
 
<210>518
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>518
cuccuauaug augccuuucu uc                               22
 
<210>519
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>519
gaacggcuuc auacaggagu u                                21
 
<210>520
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>520
uccagcauca gugauuuugu ug                               22
 
<210>521
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>521
aacaauaucc uggugcugag ug                               22
 
<210>522
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>522
ugagcgccuc gacgacagag ccg                              23
 
<210>523
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>523
ucccuguccu ccaggagcuc acg                              23
 
<210>524
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>524
gugcauugua guugcauugc a                                21
 
<210>525
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>525
caauguuucc acagugcauc ac                               22
 
<210>526
<211>20
<212>RNA
<213>人
<400>526
gugcauugcu guugcauugc                                  20
 
<210>527
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>527
cagugccucg gcagugcagc cc                               22
 
<210>528
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>528
uuauaaagca augagacuga uu                               22
 
<210>529
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>529
uccgucucag uuacuuuaua gc                               22
 
<210>530
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>530
ucucacacag aaaucgcacc cgu                              23
 
<210>531
<211>21
<212>RNA
<213>人
<400>531
aggggugcua ucugugauug a                                21
 
<210>532
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>532
gcugacuccu aguccagggc uc                               22
 
<210>533
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>533
ugucugcccg caugccugcc ucu                              23
 
<210>534
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>534
uggcaguguc uuagcugguu gu                               22
 
<210>535
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>535
caaucagcaa guauacugcc cu                               22
 
<210>536
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>536
caaucacuaa cuccacugcc au                               22
 
<210>537
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>537
uaggcagugu cauuagcuga uug                              23
 
<210>538
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>538
aaucacuaac cacacggcca gg                               22
 
<210>539
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>539
aggcagugua guuagcugau ugc                              23
 
<210>540
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>540
ucccccaggu gugauucuga uuu                              23
 
<210>541
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>541
uuaucagaau cuccaggggu ac                               22
 
<210>542
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>542
aacacaccua uucaaggauu ca                               22
 
<210>543
<211>24
<212>RNA
<213>人
 
<400>543
aauccuugga accuaggugu gagu                             24
 
<210>544
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>544
aauugcacgg uauccaucug ua                               22
 
<210>545
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>545
cggguggauc acgaugcaau uu                               22
 
<210>546
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>546
uaaugccccu aaaaauccuu au                               22
 
<210>547
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>547
aauugcacuu uagcaauggu ga                               22
 
<210>548
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>548
acuguugcua auaugcaacu cu                               22
 
<210>549
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>549
aauaauacau gguugaucuu u                                21
 
<210>550
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>550
agaucgaccg uguuauauuc gc                               22
<210>551
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>551
gccugcuggg guggaaccug gu                               22
 
<210>552
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>552
aagugccgcc aucuuuugag ugu                              23
 
<210>553
<211>20
<212>RNA
<213>人
 
<400>553
acucaaacug ugggggcacu                                  20
 
<210>554
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>554
aaagugcugc gacauuugag cgu                               23
 
<210>555
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>555
gaagugcuuc gauuuugggg ugu                              23
<210>556
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>556
acucaaaaug ggggcgcuuu cc                               22
 
<210>557
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>557
uuauaauaca accugauaag ug                               22
 
<210>558
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>558
cuuaucagau uguauuguaa uu                               22
 
<210>559
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>559
auauaauaca accugcuaag ug                               22
 
<210>560
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>560
cuuagcaggu uguauuauca uu                               22
<210>561
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>561
uuuguucguu cggcucgcgu ga                               22
 
<210>562
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>562
aucauagagg aaaauccacg u                                21
 
<210>563
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>563
guagauucuc cuucuaugag ua                               22
 
<210>564
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>564
aucauagagg aaaauccaug uu                               22
 
<210>565
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>565
aacauagagg aaauuccacg u                                21
 
<210>566
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>566
aucacacaaa ggcaacuuuu gu                               22
 
<210>567
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>567
agagguugcc cuuggugaau uc                               22
 
<210>568
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>568
acuggacuug gagucagaag g                                21
     
<210>569
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>569
cuccugacuc cagguccugu gu                               22
 
<210>570
<211>21
<212>RNA
<213>人
<400>570
ugguagacua uggaacguag g                                21
 
<210>571
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>571
uauguaacau gguccacuaa cu                               22
 
<210>572
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>572
uauguaauau gguccacauc uu                               22
 
<210>573
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>573
ugguugacca uagaacaugc  gc                               22
 
<210>574
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>574
uauacaaggg caagcucucu gu                               22
 
<210>575
<211>22
<212>RNA
<213>人
<400>575
gaaguuguuc gugguggauu cg                               22
 
<210>576
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>576
agaucagaag gugauugugg cu                               22
 
<210>577
<211>20
<212>RNA
<213>人
 
<400>577
auuccuagaa auuguucaua                                  20
 
<210>578
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>578
gaauguugcu cggugaaccc cu                               22
 
<210>579
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>579
agguuacccg agcaacuuug cau                              23
 
<210>580
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>580
aauauaacac agauggccug u                                21
 
<210>581
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>581
uaguagaccg uauagcguac g                                21
 
<210>582
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>582
uauguaacac gguccacuaa cc                               22
 
<210>583
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>583
acuucaccug guccacuagc cgu                              23
 
<210>584
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>584
aucaacagac auuaauuggg cgc                              23
 
<210>585
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>585
acuggacuua gggucagaag gc                               22
 
<210>586
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>586
agcucggucu gaggccccuc agu                              23
 
<210>587
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>587
ugaggggcag agagcgagac uuu                              23
 
<210>588
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>588
cagcagcaau ucauguuuug aa                               22
 
<210>589
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>589
caaaacguga ggcgcugcua u                                21
 
<210>590
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>590
aaugacacga ucacucccgu uga                              23
 
<210>591
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>591
aucgggaaug ucguguccgc cc                               22
 
<210>592
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>592
uaauacuguc ugguaaaacc gu                               22
 
<210>593
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>593
ugucuugcag gccgucaugc a                                21
 
<210>594
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>594
caggucgucu ugcagggcuu cu                               22
<210>595
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>595
ucuuggagua ggucauuggg ugg                              23
 
<210>596
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>596
cuggauggcu ccuccauguc u                                21
 
<210>597
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>597
aucaugaugg gcuccucggu gu                               22
 
<210>598
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>598
uugcauaugu aggauguccc au                               22
 
<210>599
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>599
uggcagugua uuguuagcug gu                               22
<210>600
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>600
aggcagugua uuguuagcug gc                               22
 
<210>601
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>601
uuuugcgaug uguuccuaau au                               22
 
<210>602
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>602
uugggaucau uuugcaucca ua                               22
 
<210>603
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>603
uuuugcaaua uguuccugaa ua                               22
 
<210>604
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>604
aaaccguuac cauuacugag uu                               22
<210>605
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>605
aacuguuugc agaggaaacu ga                               22
 
<210>606
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>606
cucaucugca aagaaguaag ug                               22
 
<210>607
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>607
agguuguccg uggugaguuc gca                              23
 
<210>608
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>608
uagugcaaua uugcuuauag ggu                              23
 
<210>609
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>609
acccuaucaa uauugucucu gc                               22
 
<210>610
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>610
gcaguccaug ggcauauaca c                                21
 
<210>611
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>611
uaugugccuu uggacuacau cg                               22
 
<210>612
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>612
ucacuccucu ccucccgucu u                                21
 
<210>613
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>613
aagacgggag gaaagaaggg ag                               22
 
<210>614
<211>22
<212>RNA
<213>人
<400>614
ucaggcucag uccccucccg au                               22
 
<210>615
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>615
gucauacacg gcucuccucu cu                               22
 
<210>616
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>616
agaggcuggc cgugaugaau uc                               22
 
<210>617
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>617
cggggcagcu caguacagga u                                21
 
<210>618
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>618
uccuguacug agcugccccg ag                               22
 
<210>619
<211>22
<212>RNA
<213>人
<400>619
aaucauacag ggacauccag uu                               22
 
<210>620
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>620
aaucguacag ggucauccac uu                               22
 
<210>621
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>621
uugaaaggcu auuucuuggu c                                21
 
<210>622
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>622
cccagauaau ggcacucuca a                                21
 
<210>623
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>623
gugacaucac auauacggca gc                               22
 
<210>624
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>624
caaccuggag gacuccaugc ug                               22
 
<210>625
<211>20
<212>RNA
<213>人
 
<400>625
ccauggaucu ccaggugggu                                  20
 
<210>626
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>626
cuuaugcaag auucccuucu ac                               22
 
<210>627
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>627
aguggggaac ccuuccauga gg                               22
 
<210>628
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>628
aggaccugcg ggacaagauu cuu                              23
 
<210>629
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>629
ugaaggucua cugugugcca gg                               22
 
<210>630
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>630
uuguacaugg uaggcuuuca uu                               22
 
<210>631
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>631
ugaaacauac acgggaaacc uc                               22
 
<210>632
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>632
aaacaaacau ggugcacuuc uu                               22
 
<210>633
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>633
ugaguauuac auggccaauc uc                               22
 
<210>634
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>634
cagcagcaca cugugguuug u                                21
 
<210>635
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>635
caaaccacac ugugguguua ga                               22
 
<210>636
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>636
uuucaagcca gggggcguuu uuc                              23
 
<210>637
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>637
aacaucacag caagucugug cu                               22
 
<210>638
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>638
uuaagacuug cagugauguu u                                21
<210>639
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>639
uaaauccuugc uaccugggug aga                             23
 
<210>640
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>640
augcaccugg gcaaggauuc ug                               22
 
<210>641
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>641
aaugcacccg ggcaaggauu cu                               22
 
<210>642
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>642
aauccuuugu cccuggguga ga                               22
 
<210>643
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>643
aaugcaccug ggcaaggauu ca                               22
<210>644
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>644
auccuugcua ucugggugcu a                                21
 
<210>645
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>645
uagcagcggg aacaguucug cag                              23
 
<210>646
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>646
agacccuggu cugcacucua uc                               22
 
<210>647
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>647
cgucaacacu ugcugguuuc cu                               22
 
<210>648
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>648
gggagccagg aaguauugau gu                               22
<210>649
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>649
uaaggcaccc uucugaguag a                                21
 
<210>650
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>650
uuuugcaccu uuuggaguga a                                21
 
<210>651
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>651
ugauuguagc cuuuuggagu aga                              23
 
<210>652
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>652
uacuccagag ggcgucacuc aug                              23
 
<210>653
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>653
uacugcagac guggcaauca ug                               22
 
<210>654
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>654
ugauugguac gucugugggu ag                               22
 
<210>655
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>655
uacugcagac aguggcaauc a                                21
 
<210>656
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>656
uacucaggag aguggcaauc ac                               22
 
<210>657
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>657
gugucuuuug cucugcaguc a                                21
 
<210>658
<211>22
<212>RNA
<213>人
<400>658
aagugcuguc auagcugagg uc                               22
 
<210>659
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>659
cacucagccu ugagggcacu uuc                              23
 
<210>660
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>660
uaaauuucac cuuucugaga agg                              23
 
<210>661
<211>18
<212>RNA
<213>人
 
<400>661
uucacaggga ggugucau                                    18
 
<210>662
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>662
uucacaagga ggugucauuu au                               22
 
<210>663
<211>22
<212>RNA
<213>人
<400>663
uucucaagga ggugucguuu au                               22
 
<210>664
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>664
auugacacuu cugugaguag a                                21
 
<210>665
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>665
gagugccuuc uuuuggagcg uu                               22
 
<210>666
<211>24
<212>RNA
<213>人
 
<400>666
uucuccaaaa gaaagcacuu ucug                             24
 
<210>667
<211>18
<212>RNA
<213>人
 
<400>667
ugcuuccuuu cagagggu                                    18
 
<210>668
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>668
uucucgagga aagaagcacu uuc                              23
 
<210>669
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>669
aucuggaggu aagaagcacu uu                               22
 
<210>670
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>670
ccucuagaug gaagcacugu cu                               22
 
<210>671
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>671
aucgugcauc ccuuuagagu gu                               22
 
<210>672
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>672
ucgugcaucc cuuuagagug uu                               22
 
<210>673
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>673
aucgugcauc cuuuuagagu gu                               22
 
<210>674
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>674
gaaagcgcuu cccuuugcug ga                               22
 
<210>675
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>675
caaagcgcuc cccuuuagag gu                               22
 
<210>676
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>676
caaagcgcuu cucuuuagag ugu                              23
 
<210>677
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>677
ucucuggagg gaagcacuuu cug                              23
 
<210>678
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>678
caaagcgcuu cccuuuggag c                                21
 
<210>679
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>679
cucuagaggg aagcacuuuc ug                               22
 
<210>680
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>680
aaagcgcuuc ccuucagagu g                                21
 
<210>681
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>681
gaaagcgcuu cucuuuagag g                                21
 
<210>682
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>682
cucuagaggg aagcacuuuc uc                               22
<210>683
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>683
aaagugcauc cuuuuagagu gu                               22
 
<210>684
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>684
cucuagaggg aagcgcuuuc ug                               22
 
<210>685
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>685
aaagugcauc cuuuuagagg uu                               22
 
<210>686
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>686
aaagugcauc uuuuuagagg au                               22
 
<210>687
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>687
caaagugccu cccuuuagag ug                               22
<210>688
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>688
aagugccucc uuuuagagug uu                               22
 
<210>689
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>689
uucuccaaaa gggagcacuu uc                               22
 
<210>690
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>690
aaagugcuuc ccuuuggacu gu                               22
 
<210>691
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>691
cuccagaggg aaguacuuuc u                                21
 
<210>692
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>692
aaagugcuuc cuuuuagagg g                                21
<210>693
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>693
aaagugcuuc cuuuuagagg gu                               22
 
<210>694
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>694
aaagugcuuc ucuuuggugg gu                               22
 
<210>695
<211>20
<212>RNA
<213>人
 
<400>695
cuacaaaggg aagcccuuuc                                  20
 
<210>696
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>696
aaagugcuuc cuuuuugagg g                                21
 
<210>697
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>697
aagugcuucc uuuuagaggg uu                               22
 
<210>698
<211>24
<212>RNA
<213>人
 
<400>698
acaaagugcu ucccuuuaga gugu                             24
 
<210>699
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>699
acaaagugcu ucccuuuaga gu                               22
 
<210>700
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>700
aacgcacuuc ccuuuagagu gu                               22
 
<210>701
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>701
aaaaugguuc ccuuuagagu gu                               22
 
<210>702
<211>23
<212>RNA
<213>人
<400>702
gaacgcgcuu cccuauagag ggu                              23
 
<210>703
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>703
gaaggcgcuu cccuuuggag u                                21
 
<210>704
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>704
cuacaaaggg aagcacuuuc uc                               22
 
<210>705
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>705
gaaggcgcuu cccuuuagag cg                               22
 
<210>706
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>706
cuccagaggg augcacuuuc u                                21
 
<210>707
<211>23
<212>RNA
<213>人
<400>707
cucuugaggg aagcacuuuc ugu                              23
 
<210>708
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>708
gaaagugcuu ccuuuuagag gc                               22
 
<210>709
<211>20
<212>RNA
<213>人
 
<400>709
cugcaaaggg aagcccuuuc                                  20
 
<210>710
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>710
ccucccacac ccaaggcuug ca                               22
 
<210>711
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>711
caugccuuga guguaggacc gu                               22
 
<210>712
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>712
ggagaaauua uccuuggugu gu                               22
 
<210>713
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>713
uggugggcac agaaucugga cu                               22
 
<210>714
<211>25
<212>RNA
<213>人
 
<400>714
aaaggauucu gcugucgguc ccacu                            25
 
<210>715
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>715
ugugacagau ugauaacuga aa                               22
 
<210>716
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>716
ucggggauca ucaugucacg aga                              23
 
<210>717
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>717
aaacauucgc ggugcacuuc uu                               22
 
<210>718
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>718
auucugcauu uuuagcaagu uc                               22
 
<210>719
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>719
ucagcaaaca uuuauugugu gc                               22
 
<210>720
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>720
ucaguaaaug uuuauuagau ga                               22
 
<210>721
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>721
caaaacuggc aauuacuuuu gc                               22
 
<210>722
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>722
aaaaguaauu gcgaguuuua cc                               22
 
<210>723
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>723
caagaaccuc aguugcuuuu gu                               22
 
<210>724
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>724
aaaaguaauu gugguuuugg cc                               22
 
<210>725
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>725
caaaaaucuc aauuacuuuu gc                               22
 
<210>726
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>726
aaaaguaauu gcgguuuuug cc                               22
<210>727
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>727
caaaaaccac aguuucuuuu gc                               22
 
<210>728
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>728
aaaaguaauu gugguuuuug cc                               22
 
<210>729
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>729
aaaaacugag acuacuuuug ca                               22
 
<210>730
<211>19
<212>RNA
<213>人
 
<400>730
aaaaacugua auuacuuuu                                   19
 
<210>731
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>731
aaaacuguaa uuacuuuugu ac                               22
<210>732
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>732
aaaaguaauc gcgguuuuug uc                               22
 
<210>733
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>733
aaaaguaauu gcggauuuug cc                               22
 
<210>734
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>734
aaaaguaauu gcggucuuug gu                               22
 
<210>735
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>735
aaaaguacuu gcggauuuug cu                               22
 
<210>736
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>736
aaaaguauuu gcggguuuug uc                               22
<210>737
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>737
caaagguauu ugugguuuuu g                                21
 
<210>738
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>738
caaaaguaau uguggauuuu gu                               22
 
<210>739
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>739
ccaaaacugc aguuacuuuu gc                               22
 
<210>740
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>740
uagcaaaaac ugcaguuacu uu                               22
 
<210>741
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>741
ugacaacuau ggaugagcuc u                                21
 
<210>742
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>742
agugccugag ggaguaagag ccc                              23
 
<210>743
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>743
ugucuuacuc ccucaggcac au                               22
 
<210>744
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>744
gcgacccacu cuugguuucc a                                21
 
<210>745
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>745
gcgacccaua cuugguuuca g                                21
 
<210>746
<211>22
<212>RNA
<213>人
<400>746
gaaaucaagc gugggugaga cc                               22
 
<210>747
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>747
aacaggugac ugguuagaca a                                21
 
<210>748
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>748
aaaacgguga gauuuuguuu u                                21
 
<210>749
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>749
gcuaguccug acucagccag u                                21
 
<210>750
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>750
aggguaagcu gaaccucuga u                                21
 
<210>751
<211>22
<212>RNA
<213>人
<400>751
auauuaccau uagcucaucu uu                               22
 
<210>752
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>752
gaugagcuca uuguaauaug ag                               22
 
<210>753
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>753
guuugcacgg gugggccuug ucu                              23
 
<210>754
<211>19
<212>RNA
<213>人
 
<400>754
ugagcugcug uaccaaaau                                   19
 
<210>755
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>755
uaaaguaaau augcaccaaa a                                21
 
<210>756
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>756
caaaguuuaa gauccuugaa gu                               22
 
<210>757
<211>20
<212>RNA
<213>人
 
<400>757
aaaguagcug uaccauuugc                                  20
 
<210>758
<211>19
<212>RNA
<213>人
 
<400>758
agguugacau acguuuccc                                   19
 
<210>759
<211>19
<212>RNA
<213>人
 
<400>759
aggcacggug ucagcaggc                                   19
 
<210>760
<211>19
<212>RNA
<213>人
 
<400>760
gggcgccugu gaucccaac                                   19
 
<210>761
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>761
aguauguucu uccaggacag aac                              23
 
<210>762
<211>20
<212>RNA
<213>人
 
<400>762
auguauaaau guauacacac                                  20
 
<210>763
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>763
aguuaaugaa uccuggaaag u                                21
 
<210>764
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>764
cgaaaacagc aauuaccuuu gc                               22
 
<210>765
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>765
ugaguuggcc aucugaguga g                                21
 
<210>766
<211>20
<212>RNA
<213>人
 
<400>766
guccgcucgg cgguggccca                                  20
 
<210>767
<211>24
<212>RNA
<213>人
 
<400>767
cugaagugau guguaacuga ucag                             24
 
<210>768
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>768
cacgcucaug cacacaccca ca                               22
 
<210>769
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>769
ugagugugug ugugugagug ugu                              23
 
<210>770
<211>19
<212>RNA
<213>人
 
<400>770
gagccaguug gacaggagc                                   19
<210>771
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>771
aagaugugga aaaauuggaa uc                               22
 
<210>772
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>772
auucuaauuu cuccacgucu uu                               22
 
<210>773
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>773
uagauaaaau auugguaccu g                                21
 
<210>774
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>774
cuucuugugc ucuaggauug u                                21
 
<210>775
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>775
uucauuuggu auaaaccgcg auu                              23
<210>776
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>776
uugagaauga ugaaucauua gg                               22
 
<210>777
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>777
ucuuguguuc ucuagaucag u                                21
 
<210>778
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>778
uaacugguug aacaacugaa cc                               22
 
<210>779
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>779
uuacaguugu ucaaccaguu acu                              23
 
<210>780
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>780
caaagaggaa ggucccauua c                                21
<210>781
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>781
uuaugguuug ccugggacug ag                               22
 
<210>782
<211>19
<212>RNA
<213>人
 
<400>782
ugggcguauc uguaugcua                                   19
 
<210>783
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>783
uaugcauugu auuuuuaggu cc                               22
 
<210>784
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>784
uuuccauagg ugaugaguca c                                21
 
<210>785
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>785
uuggccacaa uggguuagaa c                                21
 
<210>786
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>786
ugagaaccac gucugcucug ag                               22
 
<210>787
<211>24
<212>RNA
<213>人
 
<400>787
ucagaacaaa ugccgguucc caga                             24
 
<210>788
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>788
uaauuuuaug uauaagcuag u                                21
 
<210>789
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>789
gagcuuauuc auaaaagugc ag                               22
 
<210>790
<211>20
<212>RNA
<213>人
<400>790
agaccauggg uucucauugu                                  20
 
<210>791
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>791
uugugucaau augcgaugau gu                               22
 
<210>792
<211>19
<212>RNA
<213>人
 
<400>792
ugucucugcu gggguuucu                                   19
 
<210>793
<211>25
<212>RNA
<213>人
 
<400>793
aggcaccagc caggcauugc ucagc                            25
 
<210>794
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>794
gaagugugcc gugguguguc u                                21
 
<210>795
<211>21
<212>RNA
<213>人
<400>795
aagccugccc ggcuccucgg g                                21
 
<210>796
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>796
ugugucacuc gaugaccacu gu                               22
 
<210>797
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>797
uacgucaucg uugucaucgu ca                               22
 
<210>798
<211>20
<212>RNA
<213>人
<400>798
guugugucag uuuaucaaac                                  20
 
<210>799
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>799
acuuacagac aagagccuug cuc                              23
 
<210>800
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>800
uggucuagga uuguuggagg ag                               22
 
<210>801
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>801
gacacgggcg acagcugcgg ccc                              23
 
<210>802
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>802
cacacacugc aauuacuuuu gc                               22
 
<210>803
<211>19
<212>RNA
<213>人
 
<400>803
aggcugcgga auucaggac                                   19
 
<210>804
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>804
uaaaucccau ggugccuucu ccu                              23
 
<210>805
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>805
aaacuacuga aaaucaaaga u                                21
 
<210>806
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>806
guucaaaucc agaucuauaa c                                21
 
<210>807
<211>25
<212>RNA
<213>人
 
<400>807
agggguggug uugggacagc uccgu                            25
 
<210>808
<211>20
<212>RNA
<213>人
 
<400>808
aggguguuuc ucucaucucu                                  20
 
<210>809
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>809
ugagcuaaau gugugcuggg a                                21
 
<210>810
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>810
gcgaggaccc cucggggucu gac                              23
 
<210>811
<211>25
<212>RNA
<213>人
 
<400>811
gcugggcagg gcuucugagc uccuu                            25
<210>812
<211>20
<212>RNA
<213>人
 
<400>812
aggaauguuc cuucuuugcc                                  20
 
<210>813
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>813
gaacgccugu ucuugccagg ugg                              23
 
<210>814
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>814
uccgagccug ggucucccuc uu                               22
<210>815
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>815
gggggucccc ggugcucgga uc                               22
 
<210>816
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>816
agucauugga ggguuugagc ag                               22
 
<210>817
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>817
acucaaaacc cuucagugac uu                               22
 
<210>818
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>818
agacuuccca uuugaaggug gc                               22
 
<210>819
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>819
aaacucuacu uguccuucug agu                              23
<210>820
<211>24
<212>RNA
<213>人
 
<400>820
gaccuggaca uguuugugcc cagu                             24
 
<210>821
<211>20
<212>RNA
<213>人
 
<400>821
auggagauag auauagaaau                                  20
 
<210>822
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>822
ggcuagcaac agcgcuuacc u                                21
 
<210>823
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>823
acagucugcu gagguuggag c                                21
 
<210>824
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>824
aucccuugca ggggcuguug ggu                              23
<210>825
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>825
cacaagguau ugguauuacc u                                21
 
<210>826
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>826
uaguaccagu accuuguguu ca                               22
 
<210>827
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>827
agggggaaag uucuauaguc c                                21
 
<210>828
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>828
gacuauagaa cuuucccccu ca                               22
 
<210>829
<211>19
<212>RNA
<213>人
 
<400>829
agcugucuga aaaugucuu                                   19
 
<210>830
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>830
gugagucucu aagaaaagag ga                               22
 
<210>831
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>831
ucuaguaaga guggcagucg a                                21
 
<210>832
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>832
augcugacau auuuacuaga gg                               22
 
<210>833
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>833
uggguuuacg uugggagaac u                                21
 
<210>834
<211>22
<212>RNA
<213>人
<400>834
guucucccaa cguaagccca gc                               22
 
<210>835
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>835
aguauucugu accagggaag gu                               22
 
<210>836
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>836
agaccuggcc cagaccucag c                                21
 
<210>837
<211>19
<212>RNA
<213>人
 
<400>837
gugucugcuu ccuguggga                                   19
 
<210>838
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>838
cuaauaguau cuaccacaau aaa                              23
 
<210>839
<211>22
<212>RNA
<213>人
<400>839
aaccagcacc ccaacuuugg ac                               22
 
<210>840
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>840
acuugggcac ugaaacaaug ucc                              23
 
<210>841
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>841
ugugcuugcu cgucccgccc gca                              23
 
<210>842
<211>24
<212>RNA
<213>人
 
<400>842
acugggggcu uucgggcucu gcgu                             24
 
<210>843
<211>25
<212>RNA 
<213>人
 
<400>843
agggaucgcg ggcggguggc ggccu                            25
 
<210>844
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>844
aucgcugcgg uugcgagcgc ugu                              23
 
<210>845
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>845
augauccagg aaccugccuc u                                21
 
<210>846
<211>24
<212>RNA
<213>人
 
<400>846
aaagacauag gauagaguca ccuc                             24
 
<210>847
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>847
gucccucucc aaaugugucu ug                               22
 
<210>848
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>848
acuuguaugc uagcucaggu ag                               22
 
<210>849
<211>19
<212>RNA
<213>人
 
<400>849
aguguggcuu ucuuagagc                                   19
 
<210>850
<211>19
<212>RNA
<213>人
 
<400>850
ucuaggcugg uacugcuga                                   19
 
<210>851
<211>19
<212>RNA
<213>人
 
<400>851
aagcagcugc cucugaggc                                   19
 
<210>852
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>852
guggcugcac ucacuuccuu c                                21
 
<210>853
<211>19
<212>RNA
<213>人
 
<400>853
aagugugcag ggcacuggu                                   19
 
<210>854
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>854
aaaccugugu uguucaagag uc                               22
 
<210>855
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>855
aggaggcagc gcucucagga c                                21
 
<210>856
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>856
uuuaggauaa gcuugacuuu ug                               22
 
<210>857
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>857
aauggcgcca cuaggguugu g                                21
 
<210>858
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>858
guguugaaac aaucucuacu g                                21
<210>859
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>859
uaugucugcu gaccaucacc uu                               22
 
<210>860
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>860
uggugggccg cagaacaugu gc                               22
 
<210>861
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>861
auaauacaug guuaaccucu uu                               22
 
<210>862
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>862
aauauuauac agucaaccuc u                                21
 
<210>863
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>863
ggcagguucu cacccucucu agg                              23
<210>864
<211>25
<212>RNA
<213>人
 
<400>864
ggcggaggga aguagguccg uuggu                            25
 
<210>865
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>865
cuugguucag ggaggguccc ca                               22
 
<210>866
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>866
uacccauugc auaucggagu ug                               22
 
<210>867
<211>24
<212>RNA
<213>人
 
<400>867
ugccuggguc ucuggccugc gcgu                             24
 
<210>868
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>868
ucccacguug uggcccagca g                                21
<210>869
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>869
aggcggggcg ccgcgggacc gc                               22
 
<210>870
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>870
gguggcccgg ccgugccuga gg                               22
 
<210>871
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>871
uauucauuua uccccagccu aca                              23
 
<210>872
<211>24
<212>RNA
<213>人
 
<400>872
acuggcuagg gaaaaugauu ggau                             24
 
<210>873
<211>20
<212>RNA
<213>人
 
<400>873
accaggaggc ugaggccccu                                  20
 
<210>874
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>874
ugucacucgg cucggcccac uac                              23
 
<210>875
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>875
uccgguucuc agggcuccac c                                21
 
<210>876
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>876
aggaagcccu ggaggggcug gag                              23
 
<210>877
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>877
uggugcggag agggcccaca gug                              23
 
<210>878
<211>20
<212>RNA
<213>人
<400>878
cuguaugccc ucaccgcuca                                  20
 
<210>879
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>879
uggaagacua gugauuuugu ugu                              23
 
<210>880
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>880
caacaaauca cagucugcca ua                               22
 
<210>881
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>881
caacaaaucc cagucuaccu aa                               22
 
<210>882
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>882
aaggagcuua caaucuagcu ggg                               23
 
<210>883
<211>22
<212>RNA
<213>人
<400>883
caacuagacu gugagcuucu ag                               22
 
<210>884
<211>17
<212>RNA
<213>人
 
<400>884
ucucgcuggg gccucca                                     17
 
<210>885
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>885
ugcggggcua gggcuaacag ca                               22
 
<210>886
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>886
cuguugccac uaaccucaac cu                               22
 
<210>887
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>887
uuugugaccu gguccacuaa cc                               22
 
<210>888
<211>20
<212>RNA
<213>人
 
<400>888
cggcucuggg ucugugggga                                  20
 
<210>889
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>889
uggaggagaa ggaaggugau g                                21
 
<210>890
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>890
acuccagccc cacagccuca gc                               22
 
<210>891
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>891
ucugcucaua ccccaugguu ucu                              23
 
<210>892
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>892
ugcaccaugg uugucugagc aug                              23
 
<210>893
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>893
cugggaucuc cggggucuug guu                              23
 
<210>894
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>894
ugagaccucu ggguucugag cu                               22
 
<210>895
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>895
uccaguacca cgugucaggg cca                              23
 
<210>896
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>896
caguaacaaa gauucauccu ugu                              23
 
<210>897
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>897
gcaggaacuu gugagucucc u                                21
 
<210>898
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>898
cugcccuggc ccgagggacc ga                               22
 
<210>899
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>899
ccuggaaaca cugagguugu g                                21
 
<210>900
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>900
uauaccucag uuuuaucagg ug                               22
 
<210>901
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>901
uggugguuua caaaguaauu ca                               22
 
<210>902
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>902
uggauuucuu ugugaaucac ca                               22
<210>903
<211>20
<212>RNA
<213>人
 
<400>903
guagaggaga uggcgcaggg                                  20
 
<210>904
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>904
uccucuucuc ccuccuccca g                                21
 
<210>905
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>905
aggcagcggg guguagugga ua                               22
 
<210>906
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>906
uccauuacac uacccugccu cu                               22
 
<210>907
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>907
cgcgggugcu uacugacccu u                                21
<210>908
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>908
cgggucggag uuagcucaag cgg                              23
 
<210>909
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>909
gugaacgggc gccaucccga gg                               22
 
<210>910
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>910
uacucaaaaa gcugucaguc a                                21
 
<210>911
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>911
gacugacacc ucuuugggug aa                               22
 
<210>912
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>912
uuaauaucgg acaaccauug u                                21
<210>913
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>913
uacuuggaaa ggcaucaguu g                                21
 
<210>914
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>914
ugcaacgaac cugagccacu ga                               22
 
<210>915
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>915
ugcaacuuac cugagucauu ga                               22
 
<210>916
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>916
cacugugucc uuucugcgua g                                21
 
<210>917
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>917
cacuggcucc uuucugggua ga                               22
 
<210>918
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>918
ucuuugguua ucuagcugua uga                              23
 
<210>919
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>919
auaaagcuag auaaccgaaa gu                               22
 
<210>920
<211>20
<212>RNA
<213>人
 
<400>920
ggggagcugu ggaagcagua                                  20
 
<210>921
<211>25
<212>RNA
<213>人
 
<400>921
cuagugaggg acagaaccag gauuc                            25
 
<210>922
<211>23
<212>RNA
<213>人
<400>922
gcagcagaga auaggacuac guc                              23
 
<210>923
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>923
gucagcggag gaaaagaaac u                                21
 
<210>924
<211>20
<212>RNA
<213>人
 
<400>924
agagucuugu gaugucuugc                                  20
 
<210>925
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>925
uauugcacuu gucccggccu gu                               22
 
<210>926
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>926
agguugggau cgguugcaau gcu                              23
 
<210>927
<211>22
<212>RNA
<213>人
<400>927
ggguggggau uuguugcauu ac                               22
 
<210>928
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>928
uauugcacuc gucccggccu cc                               22
 
<210>929
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>929
agggacggga cgcggugcag ug                               22
 
<210>930
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>930
caaagugcug uucgugcagg uag                              23
 
<210>931
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>931
acugcugagc uagcacuucc cg                               22
 
<210>932
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>932
ugugcgcagg gagaccucuc cc                               22
 
<210>933
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>933
ugucuacuac uggagacacu gg                               22
 
<210>934
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>934
ccaguuaccg cuuccgcuac cgc                              23
 
<210>935
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>935
acaguagagg gaggaaucgc ag                               22
 
<210>936
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>936
auccgcgcuc ugacucucug cc                               22
 
<210>937
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>937
ugcccuuaaa ggugaaccca gu                               22
 
<210>938
<211>24
<212>RNA
<213>人
 
<400>938
uggggagcug aggcucuggg ggug                             24
 
<210>939
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>939
aaggcagggc ccccgcuccc c                                21
 
<210>940
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>940
cacccggcug ugugcacaug ugc                              23
 
<210>941
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>941
ucuucucugu uuuggccaug ug                               22
 
<210>942
<211>21
<212>RNA
<213>人
 
<400>942
cugacuguug ccguccucca g                                21
<210>943
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>943
aaauuauugu acaucggaug ag                               22
 
<210>944
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>944
uucaacgggu auuuauugag ca                               22
 
<210>945
<211>23
<212>RNA
<213>人
 
<400>945
uuuggcacua gcacauuuuu gcu                              23
 
<210>946
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>946
aaucaugugc agugccaaua ug                               22
<210>947
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>947
ugagguagua aguuguauug uu                               22
 
<210>948
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>948
aacccguaga uccgaucuug ug                               22
 
<210>949
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>949
caagcucgcu ucuauggguc ug                               22
 
<210>950
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>950
cacccguaga accgaccuug cg                               22
 
<210>951
<211>22
<212>RNA
<213>人
 
<400>951
caagcucgug ucuguggguc cg                               22
<210>952
<211>21
<212>RNA
<213>单纯疱疹病毒1
 
<400>952
uggaaggacg ggaaguggaa g                                21
 
<210>953
<211>24
<212>RNA
<213>单纯疱疹病毒1
 
<400>953
ccugagccag ggacgagugc gacu                             24
 
<210>954
<211>22
<212>RNA
<213>单纯疱疹病毒1
 
<400>954
ucgcacgcgc ccggcacaga cu                               22
 
<210>955
<211>20
<212>RNA
<213>单纯疱疹病毒1
 
<400>955
cugggacugu gcgguuggga                                  20
 
<210>956
<211>22
<212>RNA
<213>单纯疱疹病毒1
 
<400>956
cuugccuguc uaacucgcua gu                               22
<210>957
<211>22
<212>RNA
<213>单纯疱疹病毒1
 
<400>957
gguagaguuu gacaggcaag ca                               22
 
<210>958
<211>22
<212>RNA
<213>单纯疱疹病毒1
 
<400>958
gucagagauc caaacccucc gg                               22
 
<210>959
<211>21
<212>RNA
<213>单纯疱疹病毒1
 
<400>959
cacuucccgu ccuuccaucc c                                21
 
<210>960
<211>23
<212>RNA
<213>卡波西肉瘤相关疱疹病毒
 
<400>960
auuacaggaa acugggugua agc                              23
 
<210>961
<211>22
<212>RNA
<213>卡波西肉瘤相关疱疹病毒
 
<400>961
uaguguuguc cccccgagug gc                               22
 
<210>962
<211>22
<212>RNA
<213>卡波西肉瘤相关疱疹病毒
 
<400>962
ugguguuguc cccccgagug gc                               22
 
<210>963
<211>22
<212>RNA
<213>卡波西肉瘤相关疱疹病毒
 
<400>963
uuaaugcuua gccugugucc ga                               22
 
<210>964
<211>22
<212>RNA
<213>卡波西肉瘤相关疱疹病毒
 
<400>964
accaggccac cauuccucuc cg                               22
 
<210>965
<211>22
<212>RNA
<213>卡波西肉瘤相关疱疹病毒
 
<400>965
aacuguaguc cgggucgauc ug                               22
 
<210>966
<211>23
<212>RNA
<213>卡波西肉瘤相关疱疹病毒
<400>966
ucacauucug aggacggcag cga                              23
 
<210>967
<211>21
<212>RNA
<213>卡波西肉瘤相关疱疹病毒
 
<400>967
ucgcggucac agaaugugac a                                21
 
<210>968
<211>22
<212>RNA
<213>卡波西肉瘤相关疱疹病毒
 
<400>968
uagaauacug aggccuagcu ga                               22
 
<210>969
<211>22
<212>RNA
<213>卡波西肉瘤相关疱疹病毒
 
<400>969
agcuaaaccg caguacucua gg                               22
 
<210>970
<211>22
<212>RNA
<213>卡波西肉瘤相关疱疹病毒
 
<400>970
uaggaugccu ggaacuugcc gg                               22
 
<210>971
<211>22
<212>RNA
<213>卡波西肉瘤相关疱疹病毒
<400>971
ugaugguuuu cgggcuguug ag                               22
 
<210>972
<211>22
<212>RNA
<213>卡波西肉瘤相关疱疹病毒
 
<400>972
ccagcagcac cuaauccauc gg                               22
 
<210>973
<211>21
<212>RNA
<213>卡波西肉瘤相关疱疹病毒
 
<400>973
ugaucccaug uugcuggcgc u                                21
 
<210>974
<211>22
<212>RNA
<213>卡波西肉瘤相关疱疹病毒
 
<400>974
uaggcgcgac ugagagagca cg                               22
 
<210>975
<211>22
<212>RNA
<213>卡波西肉瘤相关疱疹病毒
 
<400>975
cuggguauac gcagcugcgu aa                               22
 
<210>976
<211>22
<212>RNA
<213>卡波西肉瘤相关疱疹病毒
 
<400>976
acccagcugc guaaaccccg cu                               22
 
<210>977
<211>14
<212>DNA
<213>人工
 
<220>
<223>LNA寡聚体
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(14)
<223>全长LNA和硫代磷酸酯连接，
 
<400>977
cacgattagc atta                                        14
 
<210>978
<211>6
<212>DNA
<213>人工
 
<220>
<223>LNA寡聚体
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(6)
<223>全长LNA和硫代磷酸酯连接，
 
<400>978
gcatta                                                 6
 
<210>979
<211>7
<212>DNA
<213>人工
 
<220>
<223>LNA寡聚体
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(7)
<223>全长LNA和硫代磷酸酯连接，
 
<400>979
agcatta                                                7
 
<210>980
<211>10
<212>DNA
<213>人工
 
<220>
<223>LNA寡聚体
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(10)
<223>全长LNA和硫代磷酸酯连接，
 
<400>980
attagcatta                                             10

Claims (33)

1.长度为7、8、9或10个核苷酸单位的邻接序列的寡聚物，用于减少细胞或生物体中的微小RNA靶的有效量，其中所述寡聚物的至少70％核苷酸单位选自LNA单位和2′取代的核苷酸类似物，并且其中所述寡聚物的至少50％核苷酸单位是LNA单位，并且其中所述邻接核苷酸序列的核苷酸单位之间存在的至少一个核苷间连接是硫代磷酸酯核苷间连接。
2.根据权利要求1的寡聚物，其中所述邻接核苷酸序列的核苷酸单位之间存在的所有核苷间连接都是硫代磷酸酯核苷间连接。
3.根据权利要求2的寡聚物，其中所述寡聚物长度是7、8或9个邻接核苷酸，其中所述邻接核苷酸单位独立地选自LNA单位和2′取代的核苷酸类似物。
4.根据权利要求1-3中任一项的寡聚物，其中所述寡聚物的至少70％核苷酸单位是LNA单位。
5.根据权利要求1-3中任一项的寡聚物，其中所述寡聚物的所有核苷酸单位都是LNA单位。
6.根据权利要求1-5中任一项的寡聚物，所述邻接核苷酸序列与选自miR-21、miR-155、miR-221、miR-222和miR-122的微小RNA(miRNA)序列的相对应区域互补。
7.根据权利要求1-5中任一项的寡聚物，所述miRNA选自miR-1、miR-10b、miR-29、miR-125b、miR-126、miR-133、miR-141、miR-143、miR-200b、miR-206、miR-208、miR-302、miR-372、miR-373、miR-375和miR-520c/e。
8.根据权利要求1-5中任一项的寡聚物，其中所述邻接核苷酸序列与miR 17-92簇中存在的微小RNA(miRNA)序列的相对应区域互补，例如选自miR-17-5p、miR-20a/b、miR-93、miR-106a/b、miR-18a/b、miR-19a/b、miR-25、miR-92a、miR-363的微小RNA。
9.根据权利要求1-5中任一项的寡聚物，其中所述邻接核苷酸序列与选自表1中列出的miRNA的哺乳动物、人或病毒微小RNA(miRNA)序列的相对应区域互补。
10.根据权利要求1-5中任一项的寡聚物，其中所述邻接核苷酸序列与选自如WO2008/046911中公开的SEQ ID No 1-558的miRNA的哺乳动物、人或病毒微小RNA(miRNA)序列的相对应区域互补。
11.根据权利要求1-10中任一项的寡聚物，其中所述寡聚物的邻接核苷酸序列由与所述微小RNA的种子序列互补的序列组成，或包括与所述微小RNA的种子序列互补的序列。
12.根据权利要求1-11中任一项的寡聚物，其中所述寡聚物的邻接核苷酸序列由这样的序列组成或包括这样的序列，所述序列选自表1中列出的7聚体、8聚体或9聚体种子聚体序列中任何一个。
13.根据权利要求11或12的寡聚物，其中所述种子聚体的3′核苷酸构成所述邻接核苷酸序列的最3′核苷酸，其中所述邻接核苷酸序列可以任选包括一个或两个其他的5′核苷酸。
14.根据权利要求1-13中任一项的寡聚物，其中所述寡聚物的所述邻接核苷酸序列不包括与从5′末端计数的微小RNA序列中存在的第一个核苷酸相对应的核苷酸。
15.根据权利要求1-14中任一项的寡聚物，其中所述核苷酸类似物单位选自2′-O-烷基-RNA单位、2′-OMe-RNA单位、2′-氨基-DNA单位、2′-氟-DNA单位、LNA单位和2′-MOE RNA单位。
16.根据权利要求1-15中任一项的寡聚物，其中所述核苷酸类似物单位是锁核酸(LNA)核苷酸类似物单位。
17.根据权利要求1-16中任一项的寡聚物，其中所述寡聚物的邻接核苷酸序列与至少2个miRNA序列，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个miRNA序列的相对应序列互补，任选使用在所述寡聚物邻接核苷酸序列内的单个通用核苷酸。
18.根据权利要求17的寡聚物，其中所述寡聚物的邻接核苷酸序列由这样的序列组成或包括这样的序列，所述序列与至少2个miRNA种子区域序列，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个miRNA种子区域序列的序列互补。
19.根据权利要求17或18中任一项的寡聚物，其中所述邻接核苷酸序列与miR-221和miR-222两者的相对应区域互补。
20.根据权利要求19的寡聚物，其中所述邻接核苷酸序列由与5′GCUACAU3′互补的序列组成，或包括与5′GCUACAU3′互补的序列。
21.根据权利要求1-20中任一项的寡聚物，其中所述邻接核苷酸序列与hsa-miR-122的相对应区域互补。
22.根据权利要求21的寡聚物，用于在治疗选自下述的医学病症或疾病中使用：丙型肝炎病毒感染以及高胆固醇血症和相关病症。
23.根据权利要求1-22中任一项的寡聚物作为药物。
24.根据权利要求1-23中任一项的寡聚物，用于在医学中使用，例如用于治疗与微小RNA的存在或过表达相关的疾病或医学病症。
25.药物组合物，其包括根据权利要求1-23中任一项的寡聚物，和药学上可接受的稀释剂、载体、盐或佐剂。
26.根据权利要求25的药物组合物，其中所述寡聚物是根据权利要求21或22，并且所述组合物进一步包括第二种独立活性成分，其为VLDL装配途径的抑制剂，例如ApoB抑制剂，或MTP抑制剂。
27.包括药物组合物的试剂盒，所述药物组合物包括根据权利要求21或22的寡聚物和第二种独立活性成分，其为VLDL装配途径的抑制剂，例如ApoB抑制剂，或MTP抑制剂。
28.用于治疗与微小RNA的存在或过表达相关的疾病或医学病症的方法，其包括给患有或可能患有所述疾病或医学病症的患者施用根据权利要求25-26中任一项的药物组合物的步骤。
29.缀合物，其包括根据权利要求1-24中任一项的寡聚物和至少一种非核苷酸化合物。
30.如前述权利要求中任一项中限定的寡聚物或缀合物，在制造用于治疗疾病或医学病症的药物中的用途，所述疾病或医学病症与微小RNA的存在或过表达相关。
31.如前述权利要求中任一项中限定的寡聚物或缀合物，用于抑制在包括微小RNA的细胞中的所述微小RNA的用途。
32.用于减少细胞中的miRNA量或有效量的方法，其包括给表达所述mi RNA的细胞施用根据前述权利要求中任一项的寡聚物、缀合物或药物组合物，以便减少所述细胞中的miRNA量或有效量。
33.用于细胞中其表达受miRNA阻遏的一种或多种mRNA去阻遏的方法，其包括给表达所述mRNA和所述miRNA两者的所述细胞施用根据前述权利要求中任一项的寡聚物、缀合物或药物组合物，以便去阻遏所述mRNA的表达。
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