JP5995849B2 - ヒト白血病細胞のアポトーシスを誘導するヘプタマー型スモールガイド核酸 - Google Patents
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Description
(1)ヒト白血病細胞のアポトーシスを誘導する、配列番号1から15のいずれかの7塩基配列からなるヘプタマー型スモールガイド核酸。
(2)ヒト白血病細胞のアポトーシスが、3日間で85%以上の細胞死である前記(1)のヘプタマー型スモールガイド核酸。
(3)前記(1)または(2)に記載のヘプタマー型スモールガイド核酸の1種または2種以上を有効成分として含有する白血病治療薬。
(1-1)ヘプタマー型sgRNAの合成
表1に示した15種のヘプタマー型sgRNA(配列番号1-15)を化学合成機にて合成した。
(1-2)MTTアッセイ
ヒトがん細胞株(1000個/100 μl培地)の入った96ウエル培養プレートに、細胞内導入試薬なしで各sgRNA(最終濃度1 μM)を加え、37℃のCO2インキュベーターにて培養した。72時間後MTT試薬(テトラカラーワン6 μl、生化学バイオビジネス(株))を加え、3時間後と6時間後に分光光度計で450 nmの吸光度を測定することにより生細胞数の定量(triplicateの平均値として表示)を行なった。ヒトがん細胞株は、白血病細胞HL60、骨髄腫細胞KMM1およびRPMI-8226を使用し、生細胞数量をsgRNA非投与群と比較した。また対照として正常細胞HEK293に対して各sgRNAを導入し、同様のMTTアッセイを行なった。
(1-3)フローサイトメトリー実験
ヒトがん細胞株(1000個/100 μl培地)の入った96ウエル培養プレートに、細胞内導入試薬なしでsgRNA(最終濃度1 μM)を加え、37℃のCO2インキュベーターにて培養した。72時間後、細胞を室温にて15分間phycoerythrin-conjugated Annexin V(BD Pharmingen)および7-AAD(Sigma)により染色し、フローサイトメター(FACSCalibur)を用いて解析した。
(1-4)マウスゼノグラフト実験
免疫不全マウスであるヌードマウスの皮下に、2 X 106個のヒト白血病細胞HL60を細胞外マトリクスと共に移植した。この移植部位に、各ヘプタマー型sgRNA(100 μM)を10 μl毎日1回(連続5日間)投与し、腫瘍の体積を毎日測定した。腫瘍体積が1500 mm3に達した時点で安楽死させた。グループあたり6から8匹のマウスを用いて実験を行い、各sgRNA投与グループの生存日数の中央値と非投与(あるいは効果のないヘプタマー型sgRNA投与)グループの生存日数の中央値の差をヘプタマー型sgRNAによる余命の延長日数とした。
(2)結果
(2-1)MTTアッセイ
結果は表2に示したとおりである。配列番号1−15のヘプタマー型sgRNAは、ヒト白血病細胞株HL60の85%以上を3日間で死滅させた。また、配列番号8、9のヘプタマー型sgRNAは、ヒト白血病細胞のほか、ヒト骨髄腫細胞株KMM1およびRPMI-8226の75%以上を3日間で死滅させた。さらに、配列番号6、12のヘプタマー型sg核酸は骨髄腫細胞株KMM1の72%を、配列番号7のヘプタマー型sg核酸は骨髄腫細胞株RPMI-8226の75%を3日間で死滅させた。従って、これらKMM1細胞やRPMI-8226細胞に対してアポトーシス誘導効果を有するヘプタマー型sg核酸はヒト骨髄腫の治療にも使用することができる。なお、全てのヘプタマー型sg核酸で正常細胞HEK293の死滅率は0%であった。
結果は図1−9に示したとおりである。試験したヘプタマー型sgRNAは、効果のないヘプタマー型sgRNA[(Hep3(EGFP))およびsgRNA無添加(mock)に較べ、遙かに多くの細胞のアポトーシスを誘導することが確認された。
(2-3)マウスゼノグラフト実験
結果は表2に示したとおりである。試験したヘプタマー型sgRNAは少なくとも6日、最大で22日間もHL60細胞移植マウスを延命させた。
Claims (2)
- 配列番号1から15のいずれかの7塩基配列からなるヘプタマー型スモールガイド核酸の1種または2種以上を有効成分として含有する白血病治療薬。
- 3日間で85%以上のヒト白血病細胞のアポトーシスを誘導する請求項1の白血病治療薬。
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