EA015563B1 - Короткая внутренне сегментированная интерферирующая рнк - Google Patents

Короткая внутренне сегментированная интерферирующая рнк Download PDF

Info

Publication number
EA015563B1
EA015563B1 EA200870366A EA200870366A EA015563B1 EA 015563 B1 EA015563 B1 EA 015563B1 EA 200870366 A EA200870366 A EA 200870366A EA 200870366 A EA200870366 A EA 200870366A EA 015563 B1 EA015563 B1 EA 015563B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
rna
passenger
nucleotide
chain
antisense
Prior art date
Application number
EA200870366A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200870366A1 (ru
Inventor
Йеспер Венгель
Йерген Кемс
Original Assignee
Сантарис Фарма А/С
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Сантарис Фарма А/С filed Critical Сантарис Фарма А/С
Publication of EA200870366A1 publication Critical patent/EA200870366A1/ru
Publication of EA015563B1 publication Critical patent/EA015563B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/323—Chemical structure of the sugar modified ring structure
    • C12N2310/3231—Chemical structure of the sugar modified ring structure having an additional ring, e.g. LNA, ENA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C12N2310/334—Modified C
    • C12N2310/3341—5-Methylcytosine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3515—Lipophilic moiety, e.g. cholesterol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/50—Methods for regulating/modulating their activity

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится к фармацевтическим и терапевтическим композициям, содержащим РНК-комплексы, содержащие антисмысловую цепь и прерывистую цепь-пассажир, обладающие способностью регулировать экспрессию генов. Применение прерывистой цепи-пассажира позволяет минимизировать побочные эффекты РНК-комплексов, а также имеет другие преимущества.

Description

Область, к которой относится настоящее изобретение
Настоящее изобретение относится к ингибированию экспрессии гена ίη νίνο с использованием модифицированных киРНК-комплексов. Так, например, РНК-комплексы согласно изобретению могут быть использованы в фармацевтических композициях или в ίη νίνο анализах на генные функции.
Предшествующий уровень техники
В последние годы интерференция РНК привлекает огромное внимание ученых, поскольку она может обеспечивать специфическое ингибирование экспрессии гена. Очевидно, что это является очень важным фактором в базовых исследованиях по изучению генетических и биохимических процессов или функций отдельных генов и генных продуктов. Поэтому интерференция РНК становится очень важным инструментом для подтверждения мишеней, используемых в фармацевтической промышленности. Более того, были инвестированы значительные средства в разработку РНК-комплексов, которые обладали бы способностью опосредовать интерференцию РНК и которые могли бы быть использованы в качестве лекарственных средств.
Привлекательность интерференции РНК (РНКи) для ее применения в терапии заключается в чувствительности и в специфичности последовательности интерферирующей РНК. Однако в связи со специфичностью такой последовательности могут возникать определенные проблемы, которые связаны, например, с тем, что несоответствующая цепь РНК-комплекса может продуцировать ответ на нерелевантные нуклеиновые кислоты-мишени. Кроме того, РНК-комплексы определенного размера индуцируют неспецифический интерферон-зависимый ответ, который также является нежелательным.
В патентной заявке И82003/0108923 описаны РНК-комплексы, способные опосредовать РНКи и содержащие антисмысловую цепь и цепь-пассажир, где указанные цепи имеют длину в 21-23 нуклеотида. Было высказано предположение, что РНК-комплексы могут быть использованы в терапевтических целях.
Аналогичным образом, в патентной заявке И82005/0234007 описаны РНК-комплексы, обладающие способностью опосредовать РНКи и содержащие антисмысловую цепь и цепь-пассажир, где указанный комплекс имеет выступающие 3'-концы. Было высказано предположение, что РНК-комплексы могут быть использованы в терапевтических целях.
В №02005/073378 описаны РНК-комплексы, которые способны опосредовать РНКи и содержат антисмысловую цепь и цепь-пассажир. РНК-комплексы, описанные в этой заявке, включают остатки Ь№А, при этом было установлено, что включение остатков ΤΝΑ возле 5'-конца одной из цепей может регулировать включение цепи в комплекс К18С, так как в комплекс Ш8С включается цепь, которая образует самую слабую пару оснований у 5'-конца.
В публикации Майапда е! а1. (2005, Се11 Уо1. 123, рр. 607-620) указывается, что для созревания активного комплекса К18С необходимо расщепление цепи-пассажира белком Адо-2. Расщепление цепипассажира происходит в процессе сборки К18С в положениях между нуклеотидами 9 и 10.
В публикации Ьеикейпег е! а1., (отчеты ЕМВО, опубликованные в оперативном режиме 20-го января 2006 г.) описаны комплексы РНКи-индуцированного сайленсинга, которые имеют прерывистую цепьпассажир. В публикации Ьеиксйпег е! а1. также указывается присутствие остатков 2'-О-метилрибозы в положении 9 цепи-пассажира (5'-3'). РНКи-комплексы были протестированы ίη νίίτο в эксперименте с использованием клеточных экстрактов. Было обнаружено, что использование прерывистых цепейпассажиров приводит к эффективному расщеплению РНК-мишени так, как это происходит под действием РНКи-комплексов, в которых остаток 2'-О-метилрибозы расположен в сайте расщепления цепипассажира (9). Однако если остаток 2'-О-метилрибозы расположен еще выше от сайта расщепления, то наблюдается снижение уровня расщепления РНК-мишени.
Ни в работе Ьеиксйпег еί а1., ни в работе Ма1гапда еί а1. ранее не указывалось или не высказывалось предположения, что комплексы РНКи-индуцированного сайленсинга, имеющие прерывистую цепьпассажир, представляют собой РНКи-комплексы, которые являются предпочтительными для применения в терапии.
В настоящее время использование синтетических киРНК ίη νίνο связано с определенными проблемами, возникающими из-за отсутствия эффективных средств для доставки киРНК, а также из-за ее низкой биологической стабильности в биологических жидкостях и низкой специфичности действия, обусловленной нежелательными эффектами, обычно продуцируемыми генами и ассоциированными с поведением всех исследуемых киРНК, которое подобно поведению микроРНК Оаскюг!. А.Ь. еί а1., (2003) №11. ΒίοίεςΗηο1, 21, 635-637; Впташдйаш, А. еί а1., 1. еί а1. (2006) №а!. Меίйοάκ, 3, 199-204; Заскю!!, А.Ь. еί а1., (2006) ΚΝΑ, 12, 1179-1187). Было предпринято несколько попыток снижения уровня нежелательных эффектов посредством химической модификации синтетической киРНК (.Гаскто^ А.Ь. еί а1., (2003) №11 Βίοίесйηο1., 21, 635-637; Внтшдйаш, А еί а1., 1. еί а1. (2006) №а1 Меίйοάκ, 3, 199-204; Заскю!!, А.Ь. еί а1., (2006) В№А, 12, 1179-1187; Е1шещ 1. е! а1. (2005) №ис1ек Аабк Век, 33, 439-447; .Таск^, А.Ь. е! а1. (2006) Κ.ΝΛ) . Поскольку в индуцировании нежелательных эффектов могут участвовать как смысловые, так и антисмысловые цепи (.Гаскто^ А.Ь. е! а1., (2003) №а!. В^есйшЕ, 21, 635-637), то минимизация включения смысловой цепи в активированный К18С должна значительно повышать специфичность нацеливания и, тем самым, снижать уровень нежелательных эффектов от действия смысловой цепи. Хорошо известно,
- 1 015563 что цепь киРНК, имеющая наименее термодинамически стабильный 5'-конец, преимущественно используется в активированном ВКС в качестве антисмысловой цепи (Ъс11\уагх. Ό.8. е! а1., (2003) Се11, 115, 199208).
Двухцепочечные РНК-комплексы могут опосредовать различные модификации нуклеиновых кислот-мишеней в клетке. В этом процессе антисмысловая цепь комплекса действует как ведущая цепь. поскольку антисмысловая цепь может гибридизоваться с нуклеиновыми кислотами-мишенями, которые имеют фрагменты последовательности. комплементарной антисмысловой цепи.
Перед нацеливанием на нуклеиновую кислоту-мишень антисмысловую цепь часто включают в РНК-управляемый белковый комплекс (ВОРС), который может воздействовать на нуклеиновую кислотумишень. Одним из примеров РНК-управляемого белкового комплекса является комплекс РНКиндуцированного сайленсинга (В18С). Очевидно, что существуют и другие ВОРС, и что РНК-комплексы согласно изобретению при их использовании вместе с этими другими ВОРС также будут иметь определенные преимущества.
Однако комплекс сайленсинга, такой как В18С, при его использовании ίη νίνο в качестве терапевтического средства или инструмента для обнаружения генов, не способен распознавать, какая из двух цепей комплекса киРНК-сайленсинга является нужной антисмыловой цепью, а какая является цепьюпассажиром или ведущей цепью. Введение цепи-пассажира в комплекс сайленсинга может, очевидно, приводить к случайному сайленсингу последовательности, не являющейся мишенью, т.е. к сайленсингу нежелательных мишеней, которые имеют достаточно высокую степень комплементарности цепипассажиру. Поэтому риск возникновения таких нежелательных эффектов является основной проблемой, которую необходимо рассматривать при разработке терапевтических средств и средств для обнаружения генов с использованием киРНК-комплексов.
В одном из аспектов изобретения выбор цепи для ее введения в комплекс В18С зависит от прочности водородных связей между 5'-концами каждой цепи. При конструировании киРНК, в которой 5'основание цепи-пассажира представляет собой О или С, а 5'-основание антисмысловой цепи представляет собой А или Т, желательно остановить свой выбор на включение в комплекс сайленсинга В18С антисмысловой цепи. Однако это не исключает введения в комплекс сайленсинга В18С и цепипассажира.
Введение повышающих аффинность нуклеотидных аналогов у 5'-конца цепи-пассажира также позволяет дополнительно уменьшить число цепей-пассажиров, вводимых в комплекс сайленсинга В18С. В соответствии с этим было обнаружено, что селективная термодинамическая стабилизация 5'-концов смысловой цепи путем включения блокированных нуклеиновых кислот (ΕΝΑ) позволяет снизить уровень нежелательного сайленсинга генов под действием смысловой цепи (Е1теп, 1. е! а1. (2005) Ыис1е1с Ас1бк Век, 33, 439-447; Ре1еткеп, М. апб ^епде1, 1. (2003) Тгепбк Вю1есйпо1, 21, 74-81).
Включение нуклеотидных аналогов в положения 10 и 12 (от 5'-конца) цепи-пассажира может предотвращать В18С-расщепление, поскольку считается, что эти остатки находятся на одной линии с каталитическим центром комплекса В18С. Однако включение повышающих аффинность нуклеотидных аналогов приводит к снижению эффективности модифицированных комплексов киРНК, что возможно обусловлено повышением резистентности киРНК к действию геликазы комплекса В18С. Поэтому введение большого числа повышающих аффинность нуклеотидных аналогов должно быть ограничено из-за негативного влияния таких аналогов на эффективность сайленсинга.
Введение дцРНК-комплексов в клетки млекопитающего может приводить к индуцированию интерферонового ответа и, тем самым, к гибели клеток. Хотя ранее считалось, что интерфероновый ответ ограничивается присутствием более длинных молекул дцРНК, например, молекул, ассоциированных с вирусной инфекцией и репликацией вируса, однако в настоящее время известно, что такой интерфероновый ответ может быть также индуцирован молекулами, подобными короткой интерферирующей РНК. Было высказано предположение, что введение нуклеотидных аналогов в киРНК может быть осуществлено для ограничения или даже предупреждения индуцирования эффекта интерференции.
Следовательно, может оказаться желательным введение нуклеотидных аналогов в киРНК-подобные комплексы для их последующего применения ш νίνο.
Считается, что введение резистентных к нуклеазе нуклеотидных аналогов может оказаться полезным для защиты выступающих 3'-концов киРНК. Поскольку выступающие 3'-концы не повышают жесткости условий гибридизации смысловой цепи и цепи-пассажира, то они не оказывают негативного влияния на действие геликазы комплекса В18С.
Следовательно, успешное и эффективное ш νίνο применение киРНК, например, в терапевтических целях и в целях обнаружения генов, связано с серьезными проблемами, которые могут быть решены путем предупреждения нежелательных эффектов, ассоциированных с нерелевантным сайленсингом, вызываемым цепью-пассажиром, и предотвращения возникновения нежелательных ингибирующих эффектов, ассоциированных с использованием усиливающих аффинность нуклеотидных аналогов.
Краткое описание графического материала
На фиг. 1-6 проиллюстрированы примеры различных структур РНК-комплексов согласно изобрете
- 2 015563 нию. Для специалиста в данной области очевидно, что различные проиллюстрированные признаки могут быть объединены друг с другом, например, конкретный паттерн выступающих концов может быть объединен с одним или несколькими разрывами в конкретных положениях, которые могут быть, а могут и не быть, связаны между собой. Таким образом, представленный иллюстративный материал не должен интерпретироваться как ограничение объема изобретения, так, например, природа и положение разрыва могут быть изменены, и могут быть добавлены дополнительные признаки.
На фиг. 1 проиллюстрированы основные структурные признаки РНК-комплексов согласно изобретению.
А: Показана коровая двухцепочечная область РНК-комплексов согласно изобретению.
В: Показана антисмысловая цепь (нижняя цепь) и прерывистая цепь-пассажир (верхняя цепь). Также показан разрыв цепи-пассажира. Следует отметить, что указанный разрыв представляет собой репрезентативный одноцепочечный разрыв, и в настоящей заявке описаны разрывы других видов.
На фиг. 2 - различные комбинации выступающих и тупых концов.
На фиг. 3 показано, что в цепи-пассажире могут присутствовать один или несколько разрывов.
На фиг. 4 показано, что размер разрывов может варьироваться.
На фиг. 5 показано, что для соединения антисмысловой цепи с цепью-пассажиром и/или для соединения первой и второй молекул РНК цепи-пассажира могут быть использованы один или несколько линкеров.
На фиг. 6 показано, что положение разрыва может варьироваться.
На фиг. 7-12 приводятся экспериментальные данные, полученные, как описано в разделе Примеры.
Фиг. 7 - Стабильность киРНК, κίΕΝΑ и квсиРНК в сыворотке. Дуплексы киРНК (еСРРкиРНК), κίΕΝΑ (1\ν1103,1\У1106) и квсиРНК (1\У1103, \У004. \У005) инкубировали в 10% фетальной бычьей сыворотке в течение указанного времени при концентрации 20 мкМ и при 37°С, а затем подвергали электрофорезу в неденатурирующем полиакриламидном геле и визуализировали путем окрашивания 8ΥΒΚзолотом. Прямая линия проведена непосредственно над предполагаемой миграцией нерасщепленных олигонуклеотидов.
Фиг. 8 - Анализ на экспрессию еСРР, проводимый с помощью флуоресцентной микроскопии. Тестирование ингибирования квсиРНК и родственных конструкций. Клетки НТ1089 обрабатывали 50 нМ указанных комбинаций РНК/ΤΝΑ и анализировали через 48 ч после экспрессии еСРР. Экспрессию ЕСРР оценивали на уровне РНК и на уровне белка.
(А) Анализ на экспрессию ЕСРР в клетках, проводимый с помощью флуоресцентной микроскопии. Клетки обрабатывали 50 нМ указанных комбинаций олигонуклеотидов РНК/ΕΝΑ и анализировали через 48 ч после анализа на экспрессию ЕСРР.
(С) Нозерн-блот-анализ, указывающий на экспрессию мРНК ЕСРР через 48 ч (дорожки 1-6) и через 120 ч (дорожки 7-12).
Фиг. 9 - Анализ на экспрессию мРНК еСРР и белка ЕСРР в квсиРНК-обработанных клетках.
А: Вестерн-блот-анализ, указывающий на экспрессию белка еСРР в клетках, обработанных 50 нМ указанных комбинаций олигонуклеотидов. Фильтр повторно зондировали антителом, специфичным к белку йиКНРС1, используемому в качестве контроля загрузки.
В: Нозерн-блот-анализ, указывающий на экспрессию мРНК еСРР через 48 ч (дорожки 1-6) и 120 ч (дорожки 7-12). Фильтр снова зондировали на экспрессию белка йиКНР Α1, используемого в качестве загрузочного контроля. Образцы РНК анализировали в дубликатах при тех же самых условиях.
Фиг. 10 - Анализ на экспрессию еСРР в течение более длительного периода времени.
10А: Вестерн-блот-анализ, указывающий на экспрессию еСРР через 48, 120 и 180 ч после трансфекции с использованием указанных комбинаций олигонуклеотидов. Белок ЬиКНР С1 был включен в качестве внутреннего контроля. Фильтр повторно зондировали на экспрессию ЪиКЫР Α1, используемого в качестве загрузочного контроля (дорожки 1-12). Образцы РНК анализировали в дубликатах при тех же самых условиях.
10В: Проточный анализ на среднюю эффективность флуоресценции для 50000 клеток (данные получены из трех экспериментов).
Фиг. 11 - Сравнение эффективности ингибирования под действием квсиРНК и других κίΕΝΑ и киРНК, нацеленных на одну и ту же последовательность.
A. Эффективность ингибирования квсиРНК, κίΕΝΑ и киРНК.
B. Анализ зависимости эффективности ингибирования от концентрации. Количественную оценку белка проводили, исходя из среднего уровня экспрессии еСРР приблизительно для 50000 клеток, определенного с помощью проточной цитометрии, а мРНК еСРР количественно оценивали с помощью Нозернблот-анализа так же, как это было проиллюстрировано на фиг. 3. киРНК с несоответствиями, представляет собой киРНК, которая содержит 4 несоответствия по отношению к еСРР-мишени (см. последовательность, представленную ниже).
Фиг. 12 - Оптимизация конструкции квсиРНК. Эффективность ингибирования еСРР, оцениваемая с
- 3 015563 использованием различных вариантов конструкций квсиРНК, содержащих прерывистую цепьпассажир. Количественную оценку белка проводили, исходя из среднего уровня еСЕР. измеренного с помощью проточной цитометрии. киРНК с несоответствиями представляет собой киРНК, содержащую 4 несоответствия по отношению к еСЕР-мишени (см. последовательность. представленную ниже). Сравнение столбцов 3 и 4 показало. что положение ника может смещаться из положения 10 в положение 11 без каких-либо негативных эффектов; в столбце 7 показано. что цепью-пассажиром может быть и РНК. однако более предпочтительными являются цепи-пассажиры. включающие нуклеотидные аналоги. такие как ΕΝΑ; сравнение столбцов 6 и 8 показало. что в квсиРНК может присутствовать ΕΝΑмодифицированная антисмысловая цепь (в дуплексной области). но это приводит к элиминации активности в соответствующей нормальной конструкции киРНК. содержащей аналогичную ΕΝΆмодифицированную антисмысловую цепь.
Фиг. 13 - Индуцирование 18С56 после РНК-трансфекции в клетках Т98С. Анализ интерферонового ответа. индуцированного квсиРНК и другими киРНК-конструкциями. Уровень 1СН56. т.е. нижерасположенного маркера интерферонового ответа. то есть вырабатывания интерферона-альфа. измеряли с помощью количественной ОТ-ПЦР. Ро1у(1/С) был включен в качестве позитивного контроля (представлено без соблюдения масштаба). Ранее было обнаружено. что 27-мерная киРНК. состоящая из 27- и 25нуклеотидной ведущей цепи и цепи-пассажира. соответственно. индуцирует интерфероновый ответ на умеренном уровне. ΕΝΆ-модифицированная квсиРНК и ΕΝΆ-модифицированная киРНК не активирует интерфероновую систему. как было оценено по индуцированию 18С56 в клетках Т98С. Клеточную линию глиобластомы Т98С трансфицировали 80 нМ вариантами киРНК или 0.8 мкг ро1у(1:С). как показано на данной фигуре. и уровни мРНК 18С56 оценивали с помощью кол.ПЦР-анализа. проводимого через 48 ч после трансфекции. Трансфекция лишь полинуклеотидами ро1у(1:С) (используемыми в качестве позитивного контроля) приводила к индуцированию высоких уровней 18С56. а уровни 18С56 для всех киРНК-вариантов не отличались от уровней. наблюдаемых в необработанных клетках или в клетках. обработанных только трансфицирующим реагентом (М1ги5 Тгап5-1Т ТКОК) .
Фиг. 14 - Определение нежелательного эффекта квсиРНК.
Фиг. 15 - квсиРНК и 51ΕΝΑ обнаруживают повышенную стабильность в сыворотке по сравнению с немодифицированной киРНК. Стабильность конструкции квсиРНК в сыворотке.
(A) ΕΝΑ-модифицированная квсиРНК и ΕΝΑ-модифицированная киРНК обнаруживали более высокую стабильность в сыворотке по сравнению с немодифицированной киРНК. Варианты киРНК инкубировали в 80% ЕС8 и через определенные промежутки времени брали аликвоты. Стабильность в сыворотке оценивали с помощью электрофореза в ПААГ. с последующим окрашиванием 8УВК-золотом. киРНК разлагалась уже через 1-1.5 ч после начала инкубирования в сыворотке. тогда как ΕΝΑмодифицированная квсиРНК и ΕΝΑ-модифицированная киРНК еще присутствовали в значительном количестве через 13 ч после инкубирования. Маркер размера указан слева.
(B) Спаривание ΕΝΑ-оснований играет важную роль в целостности молекул квсиРНК после инкубирования в 10% ЕС8. Указанные молекулы квсиРНК. имеющие различные ΕΝΑ-модификации или не имеющие таких модификаций. инкубировали в течение 24 ч в присутствии (+) или в отсутствие (-) 10% ЕС8. и стабильность дуплекса оценивали с помощью электрофореза в ПААГ. с последующим окрашиванием 8УВК-золотом. Конструкции квсиРНК. содержащие ΕΝΑ в обеих цепях. обладали абсолютной стабильностью. тогда как квсиРНК. содержащая только РНК. полностью разлагалась после инкубирования в сыворотке. Схематически показано положение ΕΝΑ-модификаций (вертикальные линии).
Фиг. 16 - Оптимизация конструкции квсиРНК. Эффективности ингибирования различных конструкций квсиРНК и киРНК сравнивали по нацеливанию на мРНК ЕСЕР.
(A) Анализ эффекта гэпов в различных положениях смысловой цепи. Числа соответствуют размерам 5'- и З'-фрагментов смысловой цепи. соответственно.
(B) Анализ влияния модификаций в З'-концевом нуклеотиде на смысловую цепь. Дуплексы схематически представлены ниже. Среднюю интенсивность флуоресценции приблизительно для 50000 клеток измеряли с помощью проточной цитометрии. киРНК с несоответствиями представляет собой киРНК. содержащую четыре несоответствия по отношению к ЕСЕР-мишени.
Фиг. 17 - Конструкция квсиРНК повышает специфичность сайленсинга генов. Ингибирующую активность двух цепей оценивали путем измерения уровня экспрессии люциферазы в репортерных конструкциях. содержащих любую последовательность-мишень в смысловой или в антисмысловой ориентации (белые и серые столбцы. соответственно). Репортерные конструкции представлены выше (без соблюдения масштаба). а конструкции киРНК схематически представлены ниже. Величины. полученные из трех полностью независимых экспериментов. усредняли. Величины для люциферазы. полученные в каждом эксперименте. нормализовали так. чтобы суммы люциферазных активностей в каждом из экспериментов были равны. Для каждой репортерной конструкции отношение люциферазная активность светляка (ЕБ)/люциферазная активность коралла КепШа (КБ) нормализовали по контролю с несоответствиями.
Фиг. 18 - Конструкция квсиРНК усиливает эффекты сайленсинга химически модифицированных
- 4 015563 антисмысловых цепей.
(A) молекулярная структура ЬЫА-мономера, Ы2'-адамантилметилкарбонил-2'-амино-ЬМАмономера (аТ) и Ы2'-пирен-1-илметил-2'-амино-ЬМА-тиминового мономера (рТ).
(B) Анализ влияния квсиРНК на эффективность сайленсинга в высокой степени модифицированных антисмысловых цепей. Средняя интенсивность флуоресценции приблизительно для 50000 клеток измеряли с помощью проточной цитометрии. киРНК с несоответствием представляет собой киРНК, содержащую четыре основания, не соответствующие ЕСРР-мишени.
(C) Ингибирующую активность двух цепей оценивали путем измерения уровня экспрессии люциферазы в репортерных конструкциях, содержащих любую последовательность-мишень в смысловой или антисмысловой ориентации (светлые и темно-серые столбцы, соответственно). Эксперимент осуществляли с тремя повторностями, и для каждой репортерной конструкции отношение люциферазной активности светляка (РЬ)/люциферазной активности коралла геиШа (КЬ) нормализовали по контролю с несоответствиями.
На фиг. 19 проиллюстрировано сравнение киРНК-комплексов, содержащих цепь-пассажир, которая включает в себя только остатки ДНК и ЬИА, либо комбинацию этих остатков, где второй и третий остатки от З'-конца цепи-пассажира представляют собой ЕЫА-остатки в ДНК-цепи-пассажире, или чередование двух остатков ДНК и одного остатка ЬИА. Было показано, что не-РНК-цепи-пассажиры, присутствующие в комплексе сайленсинга киРНК, могут быть функциональными.
На фиг. 20 проиллюстрировано сравнение ΕΝΑ-модифицированных и немодифицированных квсиРНК-конструкций в клеточной культуре и показано, что введение ЬИА в прерывистую цепьпассажир приводит к усилению эффекта сайленсинга и что смещение одноцепочечного разрыва (ника) из положения 10 в положение 11 цепи-пассажира не оказывает значительного влияния на эффективность сайленсинга. Уровни экспрессии, указанные для мРНК СРР со средней интенсивностью флуоресценции и ЕСРР, представляют собой величины, оцененные в проводимых экспериментах.
На фиг. 21 проиллюстрировано сравнение 2'-Р-ДНК- и 2'-О-Ме-РНК-модифицированных квсиРНК и показано, что цепи-пассажиры, содержащие такие модификации, дают некоторый уровень сайленсинга, но этот сайленсинг не является таким эффективным, как сайленсинг, наблюдаемый в присутствии ЬИА (фиг. 20). Уровни экспрессии, указанные для мРНК СРР со средней интенсивностью флуоресценции и ЕСРР, представляют собой величины, оцененные в проводимых экспериментах.
На фиг. 22 проиллюстрировано сравнение прерывистых и непрерывных ΕΝΑ-модифицированных цепей-пассажиров квсиРНК, которое показало, что более функциональными являются цепипассажиры в ЬЫА-модифицированной квсиРНК, чем в δίΡ-ΝΛ (ЕЫА-модифицированной киРНК). Уровни экспрессии, указанные для мРНК СРР со средней интенсивностью флуоресценции и ЕСРР, представляют собой величины, оцененные в проводимых экспериментах.
На фиг. 23 проиллюстрировано сравнение квсиРНК с ^NΛ-модифицированными антисмысловыми цепями, которое со всей очевидностью указывает на то, что присутствие прерывистой цепи-пассажира подавляет ингибирующее действие большого числа модификаций антисмысловых цепей, в частности, в областях, которые образуют гибрид с цепью-пассажиром. Уровни экспрессии, указанные для мРНК СРР и ЕСРР со средней интенсивностью флуоресценции, представляют собой величины, оцененные в проводимых экспериментах.
На фиг. 24 проиллюстрировано сравнение квсиРНК с 2'-Р/2'-ОМе-^NΛ-модифицированными антисмысловыми цепями, которое показало, что использование прерывистой цепи-пассажира позволяет использовать полностью модифицированную антисмысловую цепь. Уровни экспрессии, указанные для мРНК СРР и ЕСРР со средней интенсивностью флуоресценции, представляют собой величины, оцененные в проводимых экспериментах.
На фиг. 25 показано, что использование прерывистой цепи-пассажира также позволяет включать 2' -адамантил-амино-^NΛ в антисмысловую цепь. Уровни экспрессии, указанные для мРНК СРР со средней интенсивностью флуоресценции и ЕСРР, представляют собой величины, оцененные исходя из проводимых экспериментов.
На фиг. 26 проиллюстрирован анализ 2'-Р и 2'ОМе-квсиРНК-конструкций по сравнению с ^NΛквсиРНК-конструкциями и показано, что если цепь-пассажир модифицирована 2'-Р и 2'ОМе, то ингибирование происходит не так эффективно, как это наблюдается в случае конструкций, содержащих ^NΛ.
На фиг. 27 показано, что квсиРНК-конструкции с тремя молекулами РНК в цепи-пассажире, являются также эффективными в отношении ингибирования их мРНК-мишени, хотя их действие не является таким явным, как действие эквивалентной квсиРНК с тремя молекулами, в которой цепьпассажир состоит только из двух молекул РНК.
Описание сущности изобретения
Настоящее изобретение относится к абсолютно новой конструкции терапевтического комплекса сайленсинга, отличающейся тем, что она содержит интактную антисмысловую цепь, комплементарную прерывистой цепи (цепи-пассажира) и обычно состоящую из двух нуклеотидных смысловых цепей, каждая из которых имеет длину в 9-13 нуклеотидных оснований. Авторами настоящего изобретения бы
- 5 015563 ло обнаружено, что лишь антисмысловая цепь этой конструкции способна осуществлять сайленсинг генов и, тем самым, значительно повышать специфичность нацеливания.
Кроме того, хотя, в некоторых случаях, использование прерывистой цепи-пассажира может приводить к снижению стабильности комплекса сайленсинга, что обусловлено, возможно, более высокой вероятностью диссоциации цепей-пассажиров и антисмысловых цепей перед взаимодействием с комплексом К18С, однако авторами настоящего изобретения было неожиданно обнаружено, что усиливающие аффинность нуклеотидные аналоги в дуплексе, образованном между прерывистой цепьюпассажиром и антисмысловой цепью, могут быть использованы для эффективной стабилизации дуплекса ίη νίνο, без какого-либо чрезмерного воздействия на функциональность указанного комплекса в отношении сайленсинга, направленного на нужную мишень антисмысловой цепи. Поэтому настоящее изобретение позволяет избежать возникновения побочных эффектов, опосредуемых цепьюпассажиром, и что особенно примечательно, оно позволяет также вводить большое число нуклеотидных аналогов в дуплекс комплекса сайленсинга, что дает значительное преимущество с точки зрения стабильности дуплекса ίη νίνο, повышает его резистентность к действию нуклеазы и предотвращает продуцирование интерферонового ответа.
Дуплекс, образованный между двумя молекулами РНК, обычно присутствует в А-конформации, а дуплекс, образованный между двумя молекулами ДНК, обычно присутствует в В-конформации. Дуплекс, образованный между молекулами ДНК и РНК, обычно присутствует в промежуточной конформации (А/В-форме).
Нуклеотидные аналоги, такие как бета-Э-окси-ΕΝΑ, могут быть использованы для стимуляции образования конформации, больше напоминающей А-форму.
Поскольку считается, что рекрутинг под действием комплекса К18С зависит от конкретной структурной конформации киРНК, то предпочтительно, чтобы нуклеотидные аналоги, используемые в дуплексе, либо стимулировали образование А-конформации двухцепочечного РНК-комплекса, либо не препятствовали такому образованию. Для того чтобы определить, образует ли такой дуплекс Аконформацию, могут быть применены стандартные ЯМР-или СЭ-методы (методы циркулярного дихроизма).
Однако авторами настоящего изобретения было также установлено, что может также оказаться эффективным использование нуклеотидных аналогов, стимулирующих образование В-конформации, таких как альфа-Ь-изомер ΕΝΑ, который с точки зрения настоящего изобретения является предпочтительным мономерным остатком нуклеотидного аналога, то есть предпочтительным для его включения в цепьпассажир. Поэтому авторы настоящего изобретения считают, что главное не то, что цепь-пассажир образует А-конформацию с антисмысловой цепью, а то, что она может образовывать промежуточную А/В-конформацию, а в одном из вариантов изобретения, даже В-конформацию.
В одном из вариантов изобретения цепь-пассажир состоит из олигонуклеотидов, которые включают нуклеотидные ΕΝΑ-аналоги и 2'ОМе- или 2'-фтор-аналоги, описанные ниже. В этом варианте изобретения предусматривается, что одна конструкция может включать цепи-пассажиры, состоящие из чередующихся остатков нуклеотидных аналогов ΕΝΑ и 2'-ОМе-аналогов, или из чередующихся ΕΝΑ и 2'-фтор-аналогов, или из комбинаций нуклеотидных аналогов ΕΝΑ и 2'-ОМе/2'-фтор-аналогов.
Кроме того, включение нуклеотидных аналогов, таких как мономерные остатки ΕΝΑ в дезинтегрированную смысловую цепь, приводит к значительному повышению стабильности в сыворотке и к пролонгированному ингибированию мишени. Интересно отметить, что конструкция квсиРНК может быть функционально адаптирована к высокомодифицированным антисмысловым цепям, которые являются нефункциональными в качестве стандартных киРНК. Это особенно важно для применения киРНК ίη νίνο, в частности, для их применения в качестве терапевтического средства или в качестве средства для исследований в области функциональной геномики.
Настоящее изобретение относится к РНК-комплексам, содержащим прерывистую цепь-пассажир, используемую для РНК-управляемой регуляции гена, в частности, интерференции РНК. Таким образом, целью настоящего изобретения является получение РНК-комплексов, которые снижают уровень нежелательных эффектов по сравнению с обычно используемыми РНК-комплексами. В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к РНК-комплексам, которые снижают уровень интерферонового ответа. В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к РНК-комплексам, обладающим улучшенными свойствами с точки зрения синтеза и возможности введения химических модификаций. РНКкомплексы могут присутствовать в форме фармацевтической (терапевтической) композиции, содержащей РНК-комплекс и фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель или адъювант.
Подробное описание изобретения
Авторами настоящего изобретения была разработана новая конструкция терапевтической (или ίη νίνο) киРНК, состоящей из интактной антисмысловой цепи, комплементарной прерывистой цепипассажиру, обычно двум более коротким смысловым цепям, состоящим из 9-13 нуклеотидов. Авторами настоящего изобретения было обнаружено, что такая конструкция является полностью функциональной и, по сравнению со стандартными дуплексными киРНК-конструкциями из 21 нуклеотида, имеет не
- 6 015563 сколько следующих преимуществ:
1. Сегментированная природа цепи-пассажира полностью предотвращает ее участие в нежелательном ингибировании гена, поэтому значительно повышает специфичность нацеливания и, вероятно, снижает уровень нежелательных эффектов.
2. Конструкция квсиРНК способна сохранять функцию химически модифицированных антисмысловых цепей (таких как антисмысловые цепи, которые включают нуклеотидные аналоги, такие как ΕΝΑ), которые являются нефункциональными в присутствии стандартного киРНК-дуплекса, что позволяет включать большее число химических модификаций (например, нуклеотидных аналогов) в антисмысловую цепь.
3. Конструкция квсиРНК имеет по меньшей мере шесть концов по сравнению с нормальной киРНК, имеющей 4 конца, и такая конструкция может быть с успехом использована в целях присоединения функциональных химических групп для облегчения, например, доставки в клетки. Так, например, можно присоединять объемные группы, такие как холестерин, к 5'-концу нижерасположенной смысловой цепи без какой-либо потери активности.
4. Поскольку при синтезе более коротких РНК-цепей выход обычно является более высоким, то, в случае использования конструкции квсиРНК, затраты на крупномасштабный синтез в сочетании с терапевтическим применением могут быть снижены.
5. Использование нуклеотидных аналогов, в частности, ΕΝΑ в цепи-пассажире квсиРНК значительно повышает стабильность в сыворотке, что приводит к более эффективному и пролонгированному сайленсингу генов по сравнению со стандартными киРНК.
Важным отличительным признаком конструкции квсиРНК является ее способность полностью предотвращать какое-либо участие сегментированной цепи в сайленсинге генов при сохранении РНКиактивности противоположной интактной цепи (как показано на фиг. 17). Предполагается, что увеличение специфичности сайленсинга генов может приводить к снижению нежелательного воздействия смысловой цепи на весь геном, которое наблюдалось в других исследуемых киРНК (1аекьоп, Α. Ь. с1 а1., (2003) Ναι ΒίοΙοοΙιηοΙ. 21, 635-637). Кроме того, поскольку выбор цепи определяется, главным образом, термодинамической асимметрией концов киРНК-дуплекса, то конструирование высокоэффективной киРНК может быть затруднено в том случае, если последовательность-мишень ограничена термодинамически неблагоприятной областью, например, в случае, если потребуется ввести нужную мутацию в один нуклеотид, либо если такое конструирование проводят в области стыка гибридных генов. В этих случаях использование конструкции квсиРНК будет гарантировать то, что только несегментированная цепь сможет участвовать в сайленсинге генов независимо от термодинамического профиля квсиРНК-дуплекса, что позволит устранять значительный нерелевантный сайленсинг, индуцируемый термодинамически благоприятной противоположной цепью.
Ееисйпег с1 а1. ранее продемонстрировали, что предварительно расщепленная киРНК, аналогичная немодифицированной квсиРНК согласно изобретению, способна включаться в К18С и обеспечивать расщепление мишени в клеточном экстракте. Однако авторами настоящего изобретения было обнаружено, что квсиРНК, содержащие цепи-пассажиры без остатков ΕΝΑ, являются нефункциональными в клеточной среде (то есть ίη νίνο), даже если в короткие смысловые цепи ввести 2'ОМемодифицированные остатки. Из проведенных авторами анализов на стабильность (фиг. 15 А) очевидно, что наиболее вероятным объяснением этому является то, что немодифицированные цепи в квсиРНК подвергаются диссоциации и разлагаются ίη νίνο, а также то, что лишь значительное увеличение Тт, сообщаемое остатками нуклеотидных аналогов, такими как остатки ΕΝΑ, делает этот дуплекс достаточно стабильным в данных условиях.
Интересным наблюдением является то, что функция квсиРНК не имеет явной зависимости от конкретной структурной мимикрии промежуточного продукта Αдο2-расщепления, поскольку одноцепочечный разрыв может быть смещен в пределах 1-2 нуклеотидов без значительной потери эффективности сайленсинга (фиг. 16А). В частности, конструкция квсиРНК, имитирующая природный продукт Α§ο2расщепления (квсиРНК9+1з), очевидно, является менее эффективной, чем конструкция, в которой одноцепочечный разрыв в 1 и 2 нуклеотида смещается в направлении 3'-конца смысловой цепи (квсиРНК10+12 и квсиРНКц+ц). Исходя из данных ίη νΐίτο, полученных Ьеисйпег е1 а1., можно отметить, что эти конструкции, по всей вероятности, расщепляются Α§ο2 с высвобождением одного или двух нуклеотидов, соответственно. Поэтому возможно, что событие природного Αдο2-расщепления в конструкциях квсиРНК10+12 и квсиРНКц+ц может также усиливать активацию К18С посредством облегчения последующих стадий активации К18С, таких как, например, элиминация смысловой цепи. Поэтому авторы настоящего изобретения считают, что конструкция квсиРНК10+12 вводит новые коррективы в функции киРНК, помимо тех, которые сообщаются структурной мимикрией природных промежуточных соединений в каскаде реакций РНКи.
Наблюдения, проведенные авторами настоящего изобретения и другими исследователями, показали, что большое число химических модификаций в антисмысловой цепи киРНК обычно несовместимо с их функцией сайленсинга генов. Интересно отметить, что конструкция квсиРНК может обеспечивать
- 7 015563 введение в высокой степени модифицированных антисмысловых цепей в активированный К1БС, который затем будет эффективно регулировать Адо2-опосредуемое расщепление мРНК-мишени. Авторами настоящего изобретения было обнаружено, что неспособность антисмысловых цепей, экстенсивно модифицированных ΕΝΑ, ΕΝΑ/адамантилом и ЬЫА/пиренилом, поддерживать активность К1БС может частично устраняться с помощью квсиРНК-конструкции, тогда как аналогичным образом модифицированные стандартные киРНК являются нефункциональными (фиг. 18). Это указывает на то, что модификации в центральной части антисмысловой цепи не оказывают негативного влияния на реакцию расщепления мишени самим активированным К1БС, а вместо этого приводят к рекрутингу киРНК в РЕС, расщеплению смысловой цепи и/или расплетанию дуплекса. Кроме того, наблюдение того, что множество модификаций в антисмысловой цепи очевидно также не индуцирует включение смысловой цепи в активированный К1БС, позволяет сделать вывод, что это обусловлено не просто ошибкой в выборе цепи (фиг. 18). В соответствии с этим спасение сайленсинга квсиРНК-конструкцией, очевидно, не зависит от изменения термодинамического профиля киРНК, поскольку адамантильные и пиренильные модификации, если они существуют, слегка дестабилизируют киРНК-дуплексы, в отличие от стабилизирующего действия ΕΝΑ-остатков. Поэтому наиболее вероятным объяснением эффекта квсиРНК является то, что в высокой степени модифицированные киРНК могут быть слишком ригидными или объемными, а поэтому не могут распознаваться Адо2 в процессе активации К1БС, что приводит к невозможности расщепления смысловой цепи и ее последующего удаления. Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, авторы настоящего изобретения лишь отмечают, что возможным объяснением этому может служить тот факт, что центральный одноцепочечный разрыв цепи в конструкции квсиРНК может сообщать квсиРНКдуплексу большую структурную гибкость, что позволяет ему занимать лучшее положение для Адо2расщепления в процессе активации К1БС.
Введение большого числа химических модификаций в киРНК может давать определенные преимущества на более ранних и более поздних стадиях активации К1БС в каскаде реакций РНКи. Введение липофильных групп, таких как адамантил и пиренил, может приводить к увеличению уровня поглощения киРНК-дуплексов клетками, а введение неприродных модификаций обычно приводит к повышению биологической стабильности киРНК во внутриклеточных и во внеклеточных компартментах. Кроме того, модификации в уникальной (кееб) области (нуклеотиды 2-8 антисмысловой цепи) могут играть важную роль в минимизации нежелательных эффектов природных генов под действием киРНК, как это было ранее продемонстрировано для положения 2 в антисмысловой цепи (1асккоп, А.Ь. е1 а1. (2006) КNΑ). Авторы настоящего изобретения также считают, что увеличение числа остатков ^NΑ в антисмысловой цепи может улучшать специфичность мишени и аффинность по отношению к этой мишени.
Одной из целей настоящего изобретения является возможность установить, которая из цепей двухцепочечного РНК-комплекса фактически функционирует как ведущая РНК в КОРС. По определению, считается, что ведущей цепью является антисмысловая цепь. Однако при этом следует отметить, что проблема, связанная с использованием двухцепочечных РНК-комплексов в целях опосредования модификации нуклеиновых кислот-мишеней, заключается в том, что неправильная цепь этого комплекса может действовать как ведущая цепь. То есть, при этом не имеется в виду, что цепь-пассажир должна опосредовать любую модификацию нуклеиновых кислот-мишеней.
Другими словами, целью настоящего изобретения является обеспечение гарантии того, что только антисмысловая цепь, но не цепь-пассажир, будет опосредовать модификации нуклеиновых кислотмишеней. Эта цель может быть достигнута путем получения РНК-комплексов, оказывающих меньшее побочное действие.
Основной идеей настоящего изобретения является использование прерывистой цепи-пассажира, поскольку такая прерывистая цепь-пассажир, по всей вероятности, не будет включаться в КОРС в клетке, поэтому она будет неспособна регулировать включение каких-либо модификаций нуклеиновых кислот-мишеней. Другими словами, прерывистость определяет цепь-пассажир по внесению асимметрии в дуплекс.
Прерывистая цепь-пассажир, на что указывает ее название, имеет разрывы. Таким разрывом может быть, например, ник или гэп, либо им может быть линкер, как будет очевидно из нижеследующего описания изобретения.
РНК-комплексы согласно изобретению, содержащие прерывистую цепь-пассажир, также называются здесь короткой внутренне сегментированной интерферирующей РНК (квсиРНК).
Цепь-пассажир может включать несколько отдельных молекул РНК, например, 1, 2, 3 или 4 молекулы РНК. Эти молекулы РНК могут быть связаны друг с другом, а также с антисмысловой цепью. В соответствии с этим термин цепь-пассажир также обычно означает молекулу РНК или молекулы РНК, которые гибридизуются с антисмысловой цепью, независимо от того, разделены ли они разрывом или нет. Такая цепь-пассажир также называется здесь смысловой цепью.
Функция цепи-пассажира может стимулировать действие антисмысловой цепи и включение антисмысловой цепи в КОРС, что, в частности, означает, что цепь-пассажир улучшает биологическую доступность и биологическую стабильность антисмысловой цепи. Таким образом, в одном из вариантов
- 8 015563 изобретения прерывистыми цепями-пассажирами согласно изобретению являются любые цепи, которые обладают вышеупомянутыми функциями и, в то же самое время, удовлетворяют структурным требованиям, заявленным для РНК-комплексов согласно изобретению.
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к РНК-комплексу, способному опосредовать нуклеотидные модификации в нуклеиновой кислоте-мишени. РНК-комплекс включает в себя коровую двухцепочечную область, содержащую антисмысловую цепь и прерывистую цепь-пассажир, которая гибридизуется с антисмысловой цепью. Некоторые структурные признаки такого комплекса представлены на фиг. 1А и 1В.
Нуклеиновая кислота-мишень согласно изобретению представляет собой нуклеиновую кислоту, которая в высокой степени комплементарна антисмысловой цепи указанного комплекса. Предпочтительно, чтобы указанная комплементарность была абсолютной по всему фрагменту из нескольких нуклеотидов.
Таким образом, в одном из вариантов изобретения комплементарность является абсолютной по всему фрагменту из 25 нуклеотидов.
В других вариантах изобретения комплементарность является абсолютной по всему фрагменту из 24 нуклеотидов, 23 нуклеотидов, 22 нуклеотидов, 21 нуклеотида, 20 нуклеотидов, 19 нуклеотидов, 18 нуклеотидов, 17 нуклеотидов, 16 нуклеотидов, 15 нуклеотидов, 14 нуклеотидов, 13 нуклеотидов, 12 нуклеотидов, 11 нуклеотидов, 10 нуклеотидов, 9 нуклеотидов или 8 нуклеотидов, соответственно.
В одном из вариантов изобретения фрагмент комплементарности (например, фрагменты, перечисленные выше как полностью комплементарные) содержит 1 несоответствие. В других вариантах изобретения фрагмент комплементарности содержит 2 несоответствия, 3 несоответствия или 4 несоответствия, соответственно. Область с несоответствием в 1 основание означает область во фрагменте комплементарности, где не может образовываться одна пара оснований, например, если О находится напротив А. Если присутствует большее число несоответствий, то они могут находиться рядом друг с другом, либо на определенном расстоянии друг от друга в различных областях фрагмента комплементартности.
РНК-комплекс включает в себя коровую двухцепочечную область, которая, в основном, представляет собой двухцепочечную область. Одноцепочечные области в РНК-комплексе ассоциируются, главным образом, с разрывом цепи-пассажира и с выступающими концами этого комплекса. Выступающие концы по своей природе являются одноцепочечными, и разрывы могут приводить к образованию одноцепочечных областей в антисмысловой цепи, либо такие разрывы, сами по себе, могут представлять собой одноцепочечную область (узел, Ьи1дс). По существу, помимо одноцепочечных областей, ассоциированных с разрывом цепи-пассажира, двухцепочечная область может включать несоответствия.
Так, например, в одном из вариантов изобретения двухцепочечная область имеет 1 несоответствие. В других вариантах изобретения двухцепочечная область имеет 2 несоответствия, 3 несоответствия и 4 несоответствия, соответственно.
Используемый здесь термин нуклеиновая кислота-мишень может охватывать любую РНК/ДНК, которая должна быть подвергнута модуляции под управлением антисмысловой цепи, такой как расщепление мишени или стерическое блокирование. РНК/ДНК-мишенями могут быть, например, геномная ДНК, геномная вирусная РНК, мРНК, пре-мРНК или некодирующая РНК. Предпочтительной мишенью является мРНК, такая как мРНК, кодирующая белок, ассоциированный с данным заболеванием, такой как АроВ, Вс12, Ηίί-1-альфа, сурвивин или р21 гак, такой как На-гак, К-гак или Ν-гак.
Используемый здесь термин модификация нуклеиновой кислоты-мишени означает любую модификацию нуклеиновой кислоты-мишени, включая модификации, которые влияют на активность нуклеиновой кислоты-мишени, но не влияют на структуру указанной нуклеиновой кислоты-мишени.
Используемый здесь термин фармацевтическая композиция эквивалентен терминам терапевтическое средство или терапевтическая композиция и является синонимом этих терминов. В соответствии с этим композиция согласно изобретению может быть использована для профилактики заболевания или для лечения данного заболевания после проявления его фенотипических признаков или его диагностики.
Термины соответствующий и соответствует используются здесь для сравнения нуклеотидных последовательностей соединений согласно изобретению и их обратных комплементов или в одном из вариантов изобретения для сравнения нуклеотидных последовательностей и эквивалентных (идентичных) нуклеотидных последовательностей, которые могут, например, содержать другие нуклеотидные основания, но при этом сохранять ту же самую последовательность оснований или их комплементов. Нуклеотидные аналоги непосредственно сравнивают с их эквивалентными или соответствующими природными нуклеотидами. Последовательности, образующие обратный комплемент данной последовательности, называются здесь последовательностями, комплементарными данной последовательности.
Предпочтительной нуклеиновой кислотой-мишенью согласно изобретению является мРНК. В соответствии с этим в одном из вариантов изобретения модификацией нуклеиновой кислоты, опосредуемой РНК-комплексом, является интерференция РНК (РНКи). В предпочтительном варианте изобретения РНКи опосредует разложение мРНК. В другом предпочтительном варианте изобретения РНКи опосредует ингибирование трансляции мРНК. В другом варианте изобретения РНКи опосредует ингибирование
- 9 015563 трансляции и разложение мРНК.
В одном из вариантов изобретения модификацией нуклеиновой кислоты, опосредуемой РНКкомплексом, является сайленсинг гена, например суппрессия гена. Сайленсинг гена может быть частичным или полным, и, например, может опосредоваться расщеплением РНК, разложением РНК и/или ингибированием трансляции.
В других вариантах изобретения нуклеиновой кислотой-мишенью является некодирующая РНК, например, тРНК, миРНК и их предшественники, малая ядерная РНК (мяРНК), малая ядрышковая РНК (8иоРНК) или рекомбинантная РНК (рРНК).
В другом варианте изобретения нуклеиновой кислотой-мишенью является геномная ДНК. В таких вариантах изобретения предпочтительными модификациями нуклеиновых кислот являются метилирование ДНК и делеция ДНК.
Используемый здесь термин нуклеотидное основание означает нуклеотид, такой как ДНК или РНК, или нуклеотидный аналог.
Что касается длины описанной здесь нуклеотидной молекулы, то ее длина соответствует числу мономерных остатков, т.е. нуклеотидных оснований, независимо от того, являются ли эти мономерные остатки нуклеотидами или нуклеотидными аналогами. Что касается нуклеотидных оснований, то термины мономер и остаток являются здесь синонимами.
Размер РНК-комплекса согласно изобретению может варьироваться, однако он должен быть подходящим для осуществления одной или нескольких целей изобретения. Это, например, относится к тем случаям, когда конкретной целью изобретения является снижение нежелательного эффекта.
Так, например, коровая двухцепочечная область может содержать определенное число пар оснований, выбранное из группы, состоящей из 10 пар оснований, 11 пар оснований, 12 пар оснований, 13 пар оснований, 14 пар оснований, 15 пар оснований, 16 пар оснований, 17 пар оснований, 18 пар оснований, 19 пар оснований, 20 пар оснований, 21 пары оснований, 22 пар оснований, 23 пар оснований, 24 пар оснований, 25 пар оснований, 26 пар оснований, 27 пар оснований, 28 пар оснований, 29 пар оснований и 30 пар оснований.
Так, например, в этом или в другом варианте изобретения коровая двухцепочечная область может содержать определенное число пар оснований, выбранное из группы, состоящей из 35 пар оснований, 40 пар оснований, 42 пар оснований, 45 пар оснований, 50 пар оснований, 55 пар оснований, 60 пар оснований или 62 пар оснований.
В одном из вариантов изобретения коровая двухцепочечная область содержит от 15 до 40 пар оснований.
В другом предпочтительном варианте изобретения коровая двухцепочечная область содержит 18-22 пары оснований.
В одном из вариантов изобретения коровая двухцепочечная область имеет длину, даже превышающую 40 пар оснований, хотя известно, что в некоторых клетках, введение более длинного двухцепочечного РНК-комплекса повышает вероятность индуцирования интерферонзависимого неспецифического ответа. В одном из таких вариантов изобретения предусматривается, что указанный комплекс перед его связыванием с КОРС процессируется в более короткие двухцепочечные РНК-комплексы. Такой процессинг может осуществляться под действием фермента, подобного РНКазе III, такого как Э1СЕК.
В предпочтительном варианте изобретения РНК-комплекс имеет выступающие концы. Термин выступающий конец, используемый в настоящем изобретении, означает короткую одноцепочечную область, расположенную за двухцепочечной областью. Различные примеры РНК-комплексов, содержащих выступающие концы, представлены на фиг. 2.
В одном из вариантов изобретения антисмысловая цепь РНК-комплекса содержит выступающий 3'конец.
В другом варианте изобретения цепь-пассажир содержит выступающий 3'-конец.
В одном из вариантов изобретения антисмысловая цепь содержит выступающий 5'-конец.
В еще одном варианте изобретения цепь-пассажир содержит выступающий 5'-конец.
В предпочтительном варианте изобретения антисмысловая цепь и цепь-пассажир содержат выступающий 3'-конец.
Другие комбинации выступающих концов представлены на фиг. 2.
Выступающие концы РНК-комплекса могут иметь различную длину, при условии, что она не будет влиять на основную функцию данного комплекса. Так, например, в одном из вариантов изобретения выступающие концы выбраны из группы выступающих концов длиной в 1 нуклеотид, 2 нуклеотида, 3 нуклеотида, 4 нуклеотида, 5 нуклеотидов, 6 нуклеотидов, 7 нуклеотидов и 8 нуклеотидов.
Наиболее предпочтительными являются выступающие концы длиной в 1, 2 и 3 нуклеотида, соответственно.
В одном из вариантов изобретения выступающий конец антисмысловой цепи имеет такую же длину, как и длина выступающего конца цепи-пассажира.
В другом варианте изобретения выступающий конец антисмысловой цепи имеет длину, отличаю
- 10 015563 щуюся от длины выступающего конца цепи-пассажира.
В еще одном варианте изобретения РНК-комплекс содержит по меньшей мере один тупой конец. Термин тупой конец означает конец двухцепочечной нуклеиновой кислоты, не имеющий каких-либо выступающих нуклеотидов, то есть обе цепи двухцепочечной нуклеиновой кислоты заканчиваются в одном и том же положении.
В другом варианте изобретения РНК-комплекс затуплен с обоих концов.
Предпочтительные РНК-комплексы согласно изобретению, по своей структуре, аналогичны продуктам О1СЕЕ-процессинга более длинных двухцепочечных РНК-комплексов, за исключением разрыва в цепи-пассажире.
Другие предпочтительные РНК-комплексы, по своей структуре, аналогичны продуктам процессинга цепи-пассажира под действием эндонуклеазы Адо2. Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, можно лишь отметить, что недавно были получены данные, которые позволяют предположить, что каталитический коровый белок К18С, эндонуклеаза Адо2, инициирует элиминацию цепи-пассажира путем отщепления от нее 9 нуклеотидов у 5'-конца в процессе активации К18С.
Другими предпочтительными РНК-комплексами согласно изобретению являются комплексы, в которых коровая двухцепочечная область содержит 18-22 пар оснований, и где антисмысловая цепь и цепьпассажир содержат выступающий З'-конец из 1-3 нуклеотидов (то есть 1, 2 или 3).
Антисмысловая цепь РНК-комплекса согласно изобретению может иметь различные длины, при условии, что такое различие не будет оказывать негативного влияния на функцию данного комплекса. Так, например, в некоторых вариантах изобретения, антисмысловой цепью является 15-мер, 16-мер, 17мер, 18-мер, 19-мер, 20-мер, 21-мер, 22-мер, 23-мер, 24-мер, 25-мер, 26-мер, 27-мер, 28-мер, 29-мер, 30мер, 31-мер, 32-мер, 33-мер, 34-мер, 35-мер, Зб-мер, 37-мер, 38-мер, 39-мер, 40-мер, 41-мер, 42-мер, 43мер, 44-мер, 45-мер, 46-мер, 47-мер, 48-мер, 49-мер, 50-мер, 51-мер, 52-мер, 53-мер, 54-мер, 55-мер, 5бмер, 57-мер, 58-мер, 59-мер, 60-мер, 61-мер или 62-мер, соответственно. Следует отметить, что, например, 19-мер представляет собой антисмысловую цепь из 19 мономеров, то есть цепь из нуклеотидов/нуклеотидных аналогов (нуклеотидных оснований).
В другом предпочтительном варианте изобретения антисмысловая цепь РНК-комплекса выбрана из нижеследующей группы антисмысловых цепей: 18-мера, 19-мера, 20-мера, 21-мера, 22-мера и 23-мера.
В одном из вариантов изобретения антисмысловая цепь имеет разрывы. Предпочтительно, чтобы разрывы в антисмысловых цепях были аналогичными предпочтительным разрывам в цепи-пассажире.
Как указывалось выше, цепь-пассажир согласно изобретению имеет разрывы. В предпочтительном варианте изобретения указанная цепь-пассажир включает в себя несколько отдельных молекул РНК. Число молекул РНК может составлять, например, 1, 2, 3, 4, 5 или 6. РНК-комплексы с несколькими отдельными молекулами РНК представлены на фиг. 3.
В предпочтительном варианте изобретения длина отдельных молекул РНК цепи-пассажира составляет свыше 4 мономеров. В других предпочтительных вариантах изобретения длина отдельных РНКмолекул цепи-пассажира составляет свыше 5 мономеров, 6 мономеров, 7 мономеров, 8 мономеров, 9 мономеров, 10 мономеров, 11 мономеров и 12 мономеров, соответственно.
В другом варианте изобретения длина отдельных РНК-молекул цепи-пассажира составляет менее 4 мономеров. В других предпочтительных вариантах изобретения длина отдельных молекул РНК цепипассажира составляет менее 5 мономеров, 6 мономеров, 7 мономеров, 8 мономеров, 9 мономеров, 10 мономеров, 11 мономеров и 12 мономеров, соответственно.
В предпочтительном варианте изобретения прерывистая цепь-пассажир содержит первую и вторую молекулы РНК, которые вместе образуют прерывистую цепь-пассажир, где первая молекула РНК гибридизуется с нижерасположенной частью антисмысловой цепи, а вторая молекула РНК гибридизуется с вышерасположенной частью антисмысловой цепи.
В одном из вариантов изобретения цепь-пассажир содержит по меньшей мере первую и вторую молекулы РНК, которые вместе образуют прерывистую цепь-пассажир.
В одном из вариантов изобретения цепь-пассажир содержит только две молекулы РНК, то есть первую и вторую молекулы РНК, описанные выше.
В одном из вариантов изобретения цепь-пассажир содержит первую и вторую молекулы РНК, описанные выше, и по меньшей мере одну другую молекулу РНК.
Особый интерес представляет вариант, в котором первая молекула РНК содержит по меньшей мере 3, например, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13 остатков нуклеотидного аналога, таких как остатки ЬЫА. В этом варианте изобретения вторая молекула РНК может содержать лишь небольшое число остатков нуклеотидного аналога, например 3, 2, 1 или даже вообще не содержать остатков нуклеотидного аналога. Альтернативно, может присутствовать вторая молекула РНК, которая содержит по меньшей мере 3, например, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13 остатков нуклеотидного аналога, таких как остатки ЬЫА, и первая молекула РНК, которая может содержать лишь небольшое число остатков нуклеотидного аналога, например, 3, 2, 1 или даже вообще не содержать остатков нуклеотидного аналога. Альтернативно, первая и вторая цепи могут содержать по меньшей мере 3, например, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13 остатков
- 11 015563 нуклеотидного аналога, таких как остатки ΤΝΆ.
Указанная по меньшей мере другая молекула РНК, предпочтительно, имеет длину по меньшей мере в 3 нуклеотидных остатка, например, 3-9 нуклеотидных остатков, а именно, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 нуклеотидных остатков, или, например, 4-6 нуклеотидных остатков.
Вообще говоря, для обеспечения прочности дуплекса, достаточной для его стабильности ίη νίνο, следует учесть, что чем короче длина молекулы(молекул) РНК, составляющей(их) цепь-пассажир, тем больше должно быть число нуклеотидных аналогов.
В одном из вариантов изобретения цепь-пассажир содержит первую и вторую молекулы РНК, описанные выше, и 1-4 дополнительные молекулы РНК, описанные выше, например, 1, 2, 3 или 4 дополнительных молекулы РНК.
В одном из вариантов изобретения цепь-пассажир включает в себя первую молекулу РНК длиной в 8-13 нуклеотидных остатков, например, 8, 9, 10, 11, 12 или 13 нуклеотидных остатков, например, 9-12 нуклеотидных остатков, а именно 9-11 нуклеотидных остатков. Авторами настоящего изобретения было обнаружено, что особенно эффективными являются цепи-пассажиры, содержащие первую молекулу РНК длиной 9, 10 или 11 нуклеотидов. Во время процессинга в комплексе В18С цепь-пассажир обычно разрывается в положении 9. Авторами настоящего изобретения было неожиданно обнаружено, что в случае РНК-комплексов согласно изобретению, которые вводят одноцепочечный разрыв (ник) в синтезированную киРНК в положении 10 или 11 посредством первой молекулы РНК длиной в 10 или 11 нуклеотидных остатков, обеспечивается очень высокая эффективность молекул киРНК, которая, очевидно, превышает эффективность аналогичных киРНК-комплексов, содержащих вторую молекулу РНК длиной в 9 нуклеотидных остатков. В таких вариантах изобретения прерывистая цепь-пассажир может не содержать других молекул РНК.
В одном из вариантов изобретения, который может быть аналогичным вышеуказанному варианту или отличаться от него, цепь-пассажир включает в себя вторую молекулу РНК длиной в 8-14 нуклеотидных остатков, например, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 нуклеотидных остатков, например 9-13 нуклеотидных остатков, а именно 10-13 нуклеотидных остатков. Авторами настоящего изобретения было обнаружено, что особенно эффективными являются цепи-пассажиры, содержащие первую молекулу РНК длиной в 11, 12 или 13 нуклеотидов. В таких вариантах изобретения прерывистая цепь-пассажир может не содержать других молекул РНК.
В одном из вариантов изобретения цепь-пассажир включает в себя первую молекулу РНК длиной в 9 нуклеотидных остатков и вторую молекулу РНК длиной в 12 или 13 нуклеотидных остатков. При этом предпочтительно, чтобы общая длина прерывистой цепи-пассажира составляла 21 (9/12) или 22 (9/13) нуклеотидов. В таких вариантах изобретения прерывистая цепь-пассажир может не содержать других молекул РНК.
В одном из вариантов изобретения цепь-пассажир включает в себя первую молекулу РНК длиной в 10 нуклеотидных остатков и вторую молекулу РНК длиной в 11 или 12 нуклеотидных остатков. В таких вариантах изобретения прерывистая цепь-пассажир может не содержать других молекул РНК.
В одном из вариантов изобретения цепь-пассажир включает в себя первую молекулу РНК длиной в 11 нуклеотидных остатков и вторую молекулу РНК длиной в 10 или 11 нуклеотидных остатков. В таких вариантах изобретения прерывистая цепь-пассажир может не содержать других молекул РНК.
В одном из вариантов изобретения общая длина первой и второй и, необязательно, других молекул РНК (то есть прерывистой цепи-пассажира, за исключением любых необязательных линкерных нуклеотидов) составляет 18-25 нуклеотидов, например, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 нуклеотидов, а предпочтительно 21-23 нуклеотида (21, 22 или 23).
В соответствии с этим в одном из вариантов изобретения длина антисмысловой цепи, за исключением любых необязательных линкерных нуклеотидов, равна длине прерывистой цепи-пассажира.
В одном из вариантов изобретения первая, вторая и/или другие молекулы РНК могут содержать нуклеотидный аналог. Такие нуклеотидные аналоги могут быть использованы для получения молекулы, которая образует РНК-подобную структуру и/или обладает функциями, подобными функциям молекулы РНК согласно изобретению, но при этом содержит меньшее число молекул РНК, чем цепь-пассажир эквивалентной немодифицированной киРНК, то есть совсем незначительное число РНК-мономеров, или, фактически, вообще не содержит таких мономеров. Так, например, путем включения достаточного количества остатков ΤΝΆ в молекулу ДНК можно создать молекулу, функционирующую как цепьпассажир. В таком варианте изобретения в первую, вторую и/или другую молекулу РНК (то есть в молекулы РНК, образующие прерывистую цепь-пассажир) могут быть введены молекулы, содержащие нуклеотиды, не являющиеся РНК-нуклеотидами, или состоящие из таких нуклеотидов, при условии, что в комплексе сайленсинга киРНК такая молекула будет функционировать как молекула РНК. В соответствии с этим в одном из вариантов изобретения цепь-пассажир, например первая, вторая и/или другие молекулы РНК содержат по меньшей мере один ΤΝΆ-мономер и, необязательно, ДНК-мономеры, а именно, цепь-пассажир, например, первая, вторая и/или другие молекулы РНК состоят из ΤΝΆ- и ДНК
- 12 015563 мономеров. Способы включения ΕΝΑ в молекулы ДНК, подходящие для продуцирования РНК-подобной молекулы, предусматривают введение ΕΝΑ в каждое второе или в каждое третье положение нуклеотидных оснований (как показано на фиг. 19).
В одном из вариантов изобретения цепь-пассажир содержит нуклеотидные остатки, которыми являются только ΕΝΑ и ДНК, например, чередующиеся остатки ΕΝΑ и ДНК.
В одном из вариантов изобретения цепь-пассажир содержит нуклеотидные остатки, которыми являются только ΕΝΑ и РНК, например чередующиеся остатки ΕΝΑ и РНК.
Также предусматривается, что в цепях-пассажирах или даже в одном из вариантов изобретения в антисмысловой цепи могут присутствовать немодифицированные остатки ДНК.
Однако в одном из вариантов изобретения цепи-пассажиры и/или антисмысловые цепи не содержат немодифицированных ДНК-нуклеотидов.
Комбинация ΕΝΑ и других нуклеотидных аналогов, таких как 2'О-метил (2'ОМе) и 2'-фтор (2'Р), также может быть использована для конструирования прерывистых цепей-пассажиров или отдельных молекул РНК, образующих прерывистую цепь-пассажир, и/или, в одном из вариантов изобретения, антисмысловую цепь. Так, например, могут присутствовать чередующиеся ΕΝΑ и 2'О-метил (2'ОМе), чередующиеся ΕΝΑ и 2'-фтор и чередующиеся 2'О-метил (2'ОМе) и 2'-фтор. Считается, что такие богатые аналогами цепи являются особенно эффективными, если используются РНК-комплексы, которые по каким-либо причинам имеют низкую Тт. Другим преимуществом таких богатых аналогами молекул и цепей РНК является то, что они могут быть использованы для получения в высокой степени ίη νίνο стабильной и резистентной к нуклеазе молекулы, даже если межнуклеозидные связи представляют собой или включают связи, которые, по каким-либо соображениям, должны быть чувствительны к нуклеазе, например, фосфодиэфирные или фосфатные связи. РНК-комплексы, содержащие в основном или только фосфодиэфирные связи, могут оказаться предпочтительными, поскольку, по сравнению с эквивалентными молекулами, содержащими фосфортиоатные связи, они обычно обладают меньшей токсичностью при высоких дозах.
Однако в некоторых вариантах изобретения, например, при использовании молекул или цепей РНК, которые имеют высокое содержание ДНК или РНК, может оказаться предпочтительным использование резистентных к нуклеазе связей, таких как фосфортиоатные связи. Однако в некоторых случаях РНКкомплексы, содержащие фосфортиоатные связи, могут оказывать токсическое действие, например, в случае введения таких олигонуклеотидов в головной мозг или в спинной мозг/спинномозговую жидкость.
Фосфортиоатные связи могут быть использованы в молекулах антисмысловой цепи и/или цепипассажира. В одном из вариантов изобретения такие цепи/молекулы могут содержать другие связи или смешанные связи, например фосфатные и фосфортиоатные связи, или только фосфатные связи или другие описанные здесь связи.
Межнуклеозидная связь может быть выбрана из группы, состоящей из -О-Р(О)2-О-, -О-Р(О,8)-О-, -О-Р (8)2-0-, -8-Р(О)2-О-, -8-Р(О,8)-О-, -8-Р(8)2-О-, -О-Р(О)2-8-, -О-Р(0,8)-8-, -8-Р(О)2-8-, -О-РО(ИН)-О-, ОРО(ОСН3)-О-, -О-РО(ХРН)-О-, -О-РО(ОСН2СН28-К)-О-, -О-РО(ВН3)-О-, -О-РО(ХНИн)-О-, -О-Р(О)2-ПКн-, -ХКН-Р(О)2-О-, -ХИН-СО-О-, -ХКН-СО-ХКН-, и/или межнуклеозидная связь может быть выбрана из группы, состоящей из -О-СО-О-, -О-СО-ХИ-, -ХИ^СО-СН;-, -О-СН.-СО-ХИ-, -О-СН.-СН.-ХИ-, -СО-Х1КН-СН2-, -СН.-ХИ^СО-, -О-СН2-СН2-8-, -8-СН2-СН2-О-, -8-СН2-СН2-8-, -СН2-8О2-СН2-, -СН2-СО-ХРН-, -О-СН2-СН2ХИН-СО-, -СН2-ХГСН3-О-СН2-, где ИН выбран из водорода и С1-4-алкила. В некоторых вариантах изобретения могут оказаться предпочтительными межнуклеозидные связи, содержащие серу (8), как описано выше.
Введение ников (или, в одном из вариантов изобретения, гэпов) в цепь-пассажир может приводить к эффективному снижению температуры плавления РНК-комплекса, в результате чего этот комплекс становится более чувствительным к диссоциации. В одном из вариантов изобретения температура плавления каждой молекулы с прерывистой цепью (то есть первой, второй или других молекул РНК, образующих прерывистую цепь-пассажир) превышает 37°С, например, она составляет по меньшей мере 40°С, а именно, по меньшей мере 45°С, а предпочтительно по меньшей мере 50°С. Если длина или содержание СС в части молекулы с прерывистой цепью слишком малы для осуществления диссоциации дуплекса ίη νίνο, то в целях повышения Тт могут быть использованы нуклеотидные аналоги, усиливающие аффинность. Однако в соответствии с настоящим изобретением, считается, что каждая молекула с прерывистой цепью должна иметь длину по меньшей мере в 3 нуклеотида, например, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7 или по меньшей мере 8 нуклеотидов.
Между первой и второй молекулами РНК и, необязательно, другими молекулами РНК, которые вместе образуют цепь-пассажир, имеется разрыв.
Особенно предпочтительным разрывом согласно изобретению является ник (одноцепочечный разрыв). Ник представляет собой разрыв в одной цепи двухцепочечной нуклеиновой кислоты, вызываемый отсутствием фосфодиэфирной связи (подходящей межнуклеотидной связи), но не отсутствием нуклеотида в данной двухцепочечной нуклеиновой кислоте. Таким образом, основания, находящиеся напротив такого разрыва, все же гибридизуются с основаниями на разорванной цепи.
- 13 015563
Другим разрывом согласно изобретению является альтернативный ник, который известен как разрыв в одной цепи двухцепочечной нуклеиновой кислоты, вызываемый отсутствием одной связи или более чем одной связи в сахарофосфатном остове (в одном из вариантов изобретения, не фосфодиэфирной связи), но не отсутствием нуклеотидного основания в данной двухцепочечной нуклеиновой кислоте. Таким образом, основания, находящиеся напротив такого разрыва, все же гибридизуются с основаниями на разорванной цепи.
Следует отметить, что в некоторых вариантах изобретения используемый здесь термин ник может включать понятие альтернативный ник.
Термин гэп, используемый в настоящем изобретении, означает разрыв, при котором в двухцепочечной нуклеиновой кислоте отсутствует по меньшей мере один нуклеотид или нуклеозид, или одно нуклеотидное основание.
В предпочтительном варианте изобретения ник разделяет первую и вторую молекулу РНК и, необязательно, одну или несколько других молекул РНК, образующих прерывистую цепь-пассажир.
В одном из предпочтительных вариантов изобретения прерывистая цепь-пассажир не содержит каких-либо гэпов между первой и второй и, необязательно, другими молекулами РНК.
Однако следует отметить, что рассматривается один из вариантов изобретения, в котором прерывистая цепь-пассажир содержит один гэп (или, необязательно, несколько гэпов) между первой и второй и, необязательно, другими молекулами РНК.
В одном из вариантов изобретения гэп разделяет первую и вторую молекулу РНК. В одном из вариантов изобретения указанным гэпом является гэп в 1 нуклеотид. В других вариантах изобретения указанным гэпом является гэп в 2 нуклеотида, 3 нуклеотида, 4 нуклеотида, 5 нуклеотидов, 6 нуклеотидов, 7 нуклеотидов, 8 нуклеотидов, 9 нуклеотидов, 10 нуклеотидов, 11 нуклеотидов и 12 нуклеотидов, соответственно.
В одном из вариантов изобретения прерывистая цепь-пассажир РНК-комплекса может быть присоединена к антисмысловой цепи. Различные РНК-комплексы, в которых прерывистая цепь-пассажир присоединена к антисмысловой цепи, представлены на фиг. 5.
Так, например, в одном из вариантов изобретения первая молекула РНК присоединена к антисмысловой цепи посредством линкера.
В другом варианте изобретения вторая молекула РНК присоединена к антисмысловой цепи посредством линкера.
В еще одном варианте изобретения первая и вторая молекула РНК присоединены к антисмысловой цепи посредством линкера.
В еще одном варианте изобретения линкер соединяет первую и вторую молекулу РНК прерывистой цепи-пассажира, где указанный линкер не является простой межнуклеозидной связью, описанной в настоящем изобретении, такой как фосфодиэфирная связь (если линкер представляет собой простую фосфодиэфирную связь, то указанной цепью-пассажиром обычно является непрерывная цепьпассажир).
Предпочтительными линкерами согласно изобретению являются одноцепочечная ДНК, одноцепочечная РНК и ПЭГ-линкер. Если первая и вторая молекулы РНК соединены одноцепочечной РНК (или другой нуклеотидной последовательностью), то образовавшийся разрыв является фактически таким разрывом, который часто называют узлом, то есть в месте этого разрыва данная цепь-пассажир содержит дополнительную нуклеотидную последовательность, которая не является комплементарной антисмысловым цепям, и которая обычно состоит по меньшей мере из одного, например, по меньшей мере из двух, или по меньшей мере из трех некомплементарных нуклеотидных оснований. Следует отметить, что включение узла может препятствовать образованию комплекса К18С, поэтому размер узла должен быть минимальным, в частности, такой узел обычно должен иметь длину менее чем 10 некомплементарных нуклеотидных оснований.
В одном из вариантов изобретения в качестве линкера может быть использовано любое соединение, способное функционально связывать молекулы РНК данного РНК-комплекса. Однако обычно используемый линкер представляет собой органическую молекулу, ковалентно связанную с каждой из линкерных молекул, и не является межнуклеозидной связью, образующей остов (то есть нуклеотидными основаниями, которые образуют комплементарные гибриды с противоположной цепью и могут содержать несоответствия и выступающий 3'-конец) антисмысловой, либо первой, второй или, необязательно, других молекул РНК, образующих прерывистую цепь-пассажир.
Однако в предпочтительном варианте изобретения указанный линкер не является одноцепочечной РНК.
В одном из вариантов изобретения указанным линкер не является одноцепочечной молекулой ДНК.
В одном из вариантов изобретения указанный линкер не содержит нуклеотидных оснований.
В одном из вариантов изобретения линкеры согласно изобретению выбирают так, чтобы они не оказывали какого-либо влияния на спаривание оснований антисмысловой цепи и/или цепи-пассажира .
Однако если температура плавления первой молекулы РНК слишком мала для спаривания основа
- 14 015563 ний, которые спариваются при определенной температуре, то для эффективного повышения температуры плавления, указанная первая молекула РНК может быть присоединена к антисмысловой цепи. Таким образом, в другом варианте изобретения линкеры выбирают так, чтобы это приводило к повышению температуры плавления по меньшей мере первой молекулы РНК.
Линкеры согласно изобретению могут быть выбраны так, чтобы можно было получить сайты конъюгирования, позволяющие присоединять другие молекулы к РНК-комплексу. Такими другими молекулами могут быть, например, носители, облегчающие поглощение РНК-комплекса клеткой или организмом. Либо такими носителями могут быть молекулы, которые непосредственно влияют на включение ведущей цепи в ВОРС и которые могут быть использованы, например, для гарантии того, что будет включена только антисмысловая цепь.
В предпочтительном варианте изобретения цепь-пассажир РНК-комплекса содержит первую и вторую молекулу РНК, которые не являются ковалентно связанными друг с другом, а также не являются ковалентно связанными с антисмысловой цепью. Таким образом, РНК-комплекс может содержать три отдельных молекулы РНК, а именно, антисмысловую цепь, и первую и вторую молекулу РНК, которые вместе образуют прерывистую цепь-пассажир. Совершенно очевидно, что в том случае, если цепьпассажир содержит другие молекулы РНК, то РНК-комплекс может включать более чем три отдельных молекулы РНК.
В одном из вариантов изобретения термин РНК, используемый в контексте настоящего описания, означает полинуклеотидную последовательность, которая при ее гибридизации с антисмысловой цепью образует комплекс, способный функционировать как киРНК и/или способный образовывать Аконформацию.
В одном из вариантов изобретения молекулы РНК/цепь-пассажир/антисмысловая цепь содержат по меньшей мере 10%, например, по меньшей мере 20%, например, по меньшей мере 30%, например, по меньшей мере 40%, например, по меньшей мере 50%, например, по меньшей мере 60%, например, по меньшей мере 70%, например, по меньшей мере 80%, например, по меньшей мере 90%, или даже 100% РНК-нуклеотидов по отношению к общему числу нуклеотидных оснований в молекулах РНК/цепипассажире/антисмысловой цепи, соответственно.
В другом предпочтительном варианте изобретения цепь-пассажир РНК-комплекса содержит 3 молекулы РНК, не связанные ковалентной связью. В других вариантах изобретения цепь-пассажир содержит 4, 5 и 6 молекул РНК, не связанных друг с другом ковалентной связью, а также не связанных с антисмысловой цепью.
При использовании цепи-пассажира РНК-комплекса, содержащего две или более молекулы РНК, не связанных ковалентной связью, химический синтез может быть значительно облегчен по сравнению с химическими синтезом непрерывной цепи-пассажира, то есть синтез и очистку двух или более коротких молекул РНК осуществлять значительно легче, чем синтез одной более длинной молекулы РНК.
Кроме того, использование двух или более молекул РНК значительно облегчает синтез, если его осуществляют путем конъюгирования с молекулами РНК. Одним из преимуществ является то, что отдельные молекулы РНК могут быть конъюгированы по отдельности, то есть для получения каждой молекулы РНК может быть использован один и тот же способ синтеза. Другим преимуществом является большее число сайтов конъюгирования. Так, например, каждый из двух 5'-концов может быть конъюгирован с конкретной группой, такой как лиганд или эффекторная молекула.
Цепь-пассажир РНК-комплекса согласно изобретению может включать более чем один разрыв. В одном из вариантов изобретения цепь- пассажир включает в себя 2 разрыва. В других вариантах изобретения цепь-пассажир включает в себя 3 разрыва, 4 разрыва и 5 разрывов, соответственно.
Разрыв прерывистой цепи-пассажира может находиться в различных положениях. Так, например, в одном из вариантов изобретения прерывистая цепь- пассажир имеет разрыв в 3-положении, считая в направлении 5'^3' от основания первого нуклеотида цепи-пассажира, спаренного с основанием антисмысловой цепи.
В других вариантах изобретения разрыв находится в положении 4, положении 5, положении 6, положении 7, положении 8, положении 9, положении 10, положении 11, положении 12, положении 13, положении 14, положении 15, положении 16, положении 17, положении 18, положении 19, положении 20, положении 21, положении 22, положении 23, положении 24, положении 25 и в положении 26, соответственно.
Предпочтительные разрывы могут быть выбраны из группы, состоящей из разрывов в положении 8, 9, 10, 11, 12 или 13, считая от 5'-конца цепи-пассажира, а наиболее предпочтительным вариантом является один разрыв в цепи-пассажире, присутствующий в одном из указанных положений, например в положениях 9-12.
Предпочтительно, чтобы 5'-концы РНК-комплекса были фосфорилированы или были доступны для фосфорилирования. Термин доступный для фосфорилирования означает, что 5'-гидроксигруппа не является блокированной, например, посредством прямого конъюгирования или другого конъюгирования с другими группами, расположенными рядом с 5'-гидроксигруппой, которые предотвращают фосфорили
- 15 015563 рование 5'-гидроксигруппы.
Следовательно, в предпочтительном варианте изобретения первая молекула РНК включает в себя 5'-фосфатную группу и З'-гидроксигруппу.
В другом варианте изобретения вторая молекула РНК включает в себя 5'-концевую фосфатную группу и 3'-гидроксигруппу.
В еще одном варианте изобретения антисмысловая цепь включает в себя 5'-концевую фосфатную группу и 3'-гидроксигруппу.
В предпочтительном варианте изобретения молекулы РНК, образующие прерывистую цепьпассажир, например, первая молекула РНК, вторая молекула РНК и/или другие молекулы РНК, обладают способностью гибридизоваться с антисмысловой цепью с образованием дуплекса, имеющего Тт, составляющую по меньшей мере 37°С, например, по меньшей мере 40°С, по меньшей мере 50°С, по меньшей мере 55°С или по меньшей мере 60°С. В одном из аспектов изобретения Тт составляет 3780°С, например, 50-70°С.
Измерение Тт мкМ раствор данного соединения в 10 мМ фосфата натрия/100 мМ ЫаС1/0,1 нМ ΕΌΤΆ, рН 7,0, смешивают с его комплементарным ДНК- или РНК-олигонуклеотидом (предпочтительно, РНК) при концентрации 3 мкМ в 10 мМ фосфата натрия/100 мМ ЫаС1/0,1 нМ ΕΌΤΆ, рН 7,0, при 90°С в течение одной минуты и оставляют для охлаждения до комнатной температуры. Затем строят кривую плавления дуплекса путем измерения оптической плотности при 260 нм при скорости нагревания 1°С/мин в пределах от 25 до 95°С. Тт определяют как максимум первой производной функции, соответствующей данной кривой плавления.
В контексте настоящего изобретения термин комплементарный относится к способности двух нуклеотидных последовательностей точно спариваться друг с другом. Так, например, если нуклеотид в определенном положении олигонуклеотида способен образовывать водородную связь с нуклеотидом в соответствующем положении молекулы ДНК или РНК, то считается, что такой олигонуклеотид и ДНК или РНК являются комплементарными друг другу в этом положении. Считается, что ДНК или РНК и олигонуклеотид комплементарны друг другу, если достаточное число нуклеотидов в данном олигонуклеотиде могут образовывать водородные связи с соответствующими нуклеотидами в ДНК- или РНКмишени, и тем самым образовывать стабильный комплекс. При этом для сообщения стабильности последовательности ίη νίΐτο или ίη νίνο эти последовательности необязательно должны быть на 100% комплементарны их нуклеиновой кислоте-мишени, то есть они могут содержать один или несколько нуклеотидов или нуклеотидных аналогов, которые не спариваются с соответствующим нуклеотидом в ДНК- или РНК-мишени, и такие последовательности называются здесь последовательностями с несоответствиями. Так, например, термины комплементарный и гибридизующийся означают, что соединение согласно изобретению достаточно сильно и специфически связывается с молекулой-мишенью, что обеспечивает необходимое подавление нормальной функции данной(ых) мишени(ей). В соответствии с этим указанная последовательность может содержать одно несоответствие или два несоответствия. Однако в одном из вариантов изобретения помимо того, что прерывистая цепь-пассажир и антисмысловая цепь РНК-комплекса согласно изобретению могут иметь выступающие 3'-концы, они могут быть комплементарными без каких-либо несоответствий. В одном из вариантов изобретения термин комплементарный означает 100% комплементарность по всей области дуплекса (то есть за исключением выступающих 3'концов).
В некоторых вариантах изобретения РНК-комплекс предпочтительно содержит один или несколько нуклеотидных аналогов.
Использование нуклеотидных аналогов может оказаться предпочтительным по нескольким причинам. Они могут быть, например, использованы для повышения температуры плавления коровой двухцепочечной области. Если первая и/или вторая молекулы РНК являются короткими, то они могут иметь температуру плавления, при которой не обеспечивается стабильное спаривание оснований. В этом случае для повышения температуры плавления могут быть использованы нуклеотидные аналоги, такие как ΕΝΆ. Нуклеотидные аналоги могут быть также использованы для снижения температуры плавления коровой двухцепочечной области. Для этих целей могут быть использованы неосновные нуклеотиды. Кроме того, нуклеотидные аналоги могут быть использованы с учетом стоимости проведения такого синтеза или его трудоемкости.
В соответствии с этим в предпочтительном варианте изобретения антисмысловая цепь содержит нуклеотидные аналоги.
В другом предпочтительном варианте изобретения прерывистая цепь-пассажир содержит нуклеотидные аналоги.
В еще одном предпочтительном варианте изобретения первая и вторая молекулы РНК цепипассажира содержат нуклеотидные аналоги.
В одном из вариантов изобретения число нуклеотидных аналогов в антисмысловой цепи составляет 10. В других вариантах изобретения число нуклеотидных аналогов в антисмысловой цепи составляет 9,
- 16 015563
8. 7. 6. 5. 4. 3. 2 или 1. соответственно.
В другом варианте изобретения все нуклеотиды антисмысловой цепи представляют собой нуклеотидные аналоги.
В одном из вариантов изобретения число нуклеотидных аналогов в антисмысловой цепи составляет 25. 24. 23. 22. 21. 20. 19. 18. 17. 16. 15. 14. 13. 12 или 11.
В одном из вариантов изобретения антисмысловая цепь содержит от 0 до 10. например от 1 до 8. а именно. от 2 или 3 до 8 нуклеотидных аналогов.
Аналогичным образом. в другом варианте изобретения число нуклеотидных аналогов в цепипассажире составляет 10. В других вариантах изобретения число нуклеотидных аналогов в цепипассажире составляет 9. 8. 7. 6. 5. 4. 3. 2 или 1. соответственно.
В другом варианте изобретения все нуклеотиды цепи-пассажира представляют собой нуклеотидные аналоги.
В одном из вариантов изобретения число нуклеотидных аналогов в цепи-пассажире составляет 25. 24. 23. 22. 21. 20. 19. 18. 17. 16. 15. 14. 13. 12 или 11.
В одном из вариантов изобретения цепь-пассажир содержит от 0 до 10. например. от 1 до 8. а именно. от 2 или 3 до 8 нуклеотидных аналогов.
В предпочтительном варианте изобретения антисмысловая цепь и цепь-пассажир содержат нуклеотидные аналоги.
В одном из вариантов изобретения нуклеотидные аналоги РНК-комплекса являются идентичными. то есть все они. например. представляют собой ΕΝΑ. В другом варианте изобретения в одном и том же РНК-комплексе присутствуют различные нуклеотидные аналоги.
В одном из вариантов изобретения нуклеотидные аналоги цепи-пассажира являются идентичными. то есть все они. например. представляют собой ΕΝΑ. В другом варианте изобретения в одной и той же цепи-пассажире присутствуют различные нуклеотидные аналоги.
В одном из вариантов изобретения нуклеотидные аналоги антисмысловой цепи являются идентичными. то есть все они. например. представляют собой ΕΝΑ. В другом варианте изобретения в одной и той же антисмысловой цепи присутствуют различные нуклеотидные аналоги.
В одном из вариантов изобретения первая молекула РНК цепи-пассажира содержит один или несколько нуклеотидных аналогов.
В одном из вариантов изобретения первая молекула РНК цепи-пассажира содержит по меньшей мере 2 нуклеотидных аналога.
В одном из вариантов изобретения вторая молекула РНК цепи-пассажира содержит один или несколько нуклеотидных аналогов.
В одном из вариантов изобретения вторая молекула РНК цепи-пассажира содержит по меньшей мере 2 нуклеотидных аналога.
В одном из вариантов изобретения нуклеотидный аналог присутствует в области из трех концевых (5' или 3'. соответственно) нуклеотидных остатков первой и/или второй молекулы РНК. например. в положении 1. 2 или 3 соответствующих концевых нуклеотидных остатков.
В одном из вариантов изобретения по меньшей мере одна из других РНК-молекул цепипассажира содержит по меньшей мере один нуклеотидный аналог.
В одном из вариантов изобретения каждая другая молекула РНК. образующая часть прерывистой цепи-пассажира. содержит по меньшей мере один нуклеотидный аналог.
В одном из вариантов изобретения прерывистая цепь-пассажир содержит нуклеотидный аналог в положениях 10 и 12 от 5'-конца цепи-пассажира.
В одном из вариантов изобретения каждая молекула РНК. образующая часть прерывистой цепипассажира. содержит по меньшей мере один нуклеотидный аналог.
В одном из вариантов изобретения температура плавления (Тт) для первой. второй и. необязательно. других молекул РНК. образующих прерывистую цепь-пассажир. составляет по меньшей мере 40°С.
В одном из вариантов изобретения длина первой. второй и. необязательно. других молекул РНК. образующих прерывистую цепь-пассажир. составляет по меньшей мере три нуклеотидных остатка.
В одном из вариантов изобретения антисмысловая цепь содержит по меньшей мере 1 нуклеотидный аналог.
В одном из вариантов изобретения антисмысловая цепь содержит по меньшей мере 1 нуклеотидный аналог в области дуплекса. образованной прерывистой цепью-пассажиром.
В одном из вариантов изобретения антисмысловая цепь содержит по меньшей мере один нуклеотидный аналог в положении. которое находится в пределах области 4 нуклеотидных оснований. считая от 3'-конца антисмысловой цепи. например. в положении 1. 2. 3 и/или 4 от 3'-конца антисмысловой цепи.
В одном из вариантов изобретения по меньшей мере один из нуклеотидов. присутствующих в 5'концевой области из 9 нуклеотидных остатков антисмысловой цепи. представляет собой нуклеотидный аналог.
- 17 015563
В одном из вариантов изобретения по меньшей мере один из нуклеотидов, присутствующих в области, соответствующей положениям 4-10 нуклеотидов, считая от З'-конца антисмысловой цепи, состоящей из 10 нуклеотидов, представляет собой нуклеотидный аналог.
В одном из вариантов изобретения антисмысловая цепь содержит нуклеотидный аналог в положении 11 от 5'-конца антисмысловой цепи.
В одном из вариантов изобретения антисмысловая цепь содержит РНК-нуклеотиды в положениях 10 и 12 от 5'-конца антисмысловой цепи.
В одном из вариантов изобретения 5'-концевые нуклеотидные остатки антисмысловой цепи представляют собой остатки РНК-нуклеотидов.
В одном из вариантов изобретения антисмысловая цепь содержит по меньшей мере 2 нуклеотидных аналога.
В одном из вариантов изобретения нуклеотидные аналоги позволяют образовывать Аконформацию (или, в одном из вариантов изобретения, А/В-конформацию, то есть промежуточную форму между А- и В-конформациями), если они присутствуют в дуплексе, содержащем комплементарную молекулу РНК, состоящую только из РНК-остатков, связанных фосфатными связями.
В одном из вариантов изобретения нуклеотидные аналоги, присутствующие в антисмысловой цепи и/или в цепи-пассажире, независимо выбраны из группы, состоящей из 2'-О-алкил-РНК-мономеров (таких как 2'-ОМЕ), 2'-амино-ДНК-мономеров, 2'-фтор-ДНК-мономеров, мономеров арабино-нуклеиновой кислоты (ΑΝΑ), 2'-фтор-ΑNΑ-мономеров, ΕΝΑ-мономеров, ΙΝΑ-мономеров.
В одном из вариантов изобретения нуклеотидные аналоги, присутствующие в прерывистой цепипассажире (или в антисмысловой цепи или в обеих цепях, либо в виде отдельных молекул, либо в виде комбинаций всех нуклеотидных аналогов в РНК-комплексе), представляют собой по меньшей мере один из вышеуказанных нуклеотидных аналогов (взятые отдельно, например, только 2'ОМЕ, или в комбинации друг с другом, например, выбранные, как описано выше), например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 нуклеотидных мономеров.
Предпочтительными нуклеотидными мономерами, помимо ΕΝΑ, являются 2'-О-алкил-РНКмономеры (такие как 2'-ОМЕ) и 2'-фтор-ДНК-мономеры .
В одном из вариантов изобретения число нуклеотидных аналогов, присутствующих в антисмысловой цепи или в цепи-пассажире (или в обеих цепях, либо в виде отдельных молекул, либо в виде комбинации всех нуклеотидных аналогов в РНК-комплексе), выбрано из группы, состоящей по меньшей мере из одного по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или по меньшей мере 20, по меньшей мере 21, по меньшей мере 22, по меньшей мере 23, по меньшей мере 24 и по меньшей мере 25 нуклеотидных аналогов. В соответствии с этим, число нуклеотидных аналогов может составлять менее чем 20, например, менее чем 18, менее чем 16, менее чем 14, менее чем 12, менее чем 10.
В одном из вариантов изобретения нуклеотидные аналоги, присутствующие в прерывистой цепипассажире (или в антисмысловой цепи или в обеих цепях, либо в виде отдельных молекул, либо в виде комбинаций всех нуклеотидных аналогов в РНК-комплексе), представляют собой по меньшей мере один 2'-О-алкил-РНК-мономер (такой как 2'ОМе), например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 2'-О-алкил-РНК-мономеров (таких как 2'ОМе).
В одном из вариантов изобретения, которые могут быть одинаковыми или различными, нуклеотидные аналоги, присутствующие в прерывистой цепи-пассажире (или в антисмысловой цепи или в обеих цепях, либо в виде отдельных молекул, либо в виде комбинаций всех нуклеотидных аналогов в РНКкомплексе), представляют собой по меньшей мере один 2'-фтор-ДНК-мономер, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 2'-фтор-ДНК-мономеров.
В одном из вариантов изобретения нуклеотидные аналоги, присутствующие в прерывистой цепипассажире, представляют собой по меньшей мере один остаток блокированной нуклеиновой кислоты (ΕΝΑ).
В одном из вариантов изобретения, которые могут быть одинаковыми или различными, нуклеотидные аналоги, присутствующие в прерывистой цепи-пассажире (или в антисмысловой цепи или в обеих цепях, либо в виде отдельных молекул, либо в виде комбинаций всех нуклеотидных аналогов в РНКкомплексе), представляют собой по меньшей мере один ΕΝΑ-мономер, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 ΕΝΑ-мономеров.
В одном из вариантов изобретения остаток или остатки ΕΝΑ независимо выбраны из группы, состоящей из окси-ΕΝΑ, тио-ΕΝΑ и амино-ΕΝΑ, в Ό-β- и Ь-а-конфигурациях или их комбинациях.
В одном из вариантов изобретения нуклеотидные аналоги, присутствующие в антисмысловой цепи, представляют собой по меньшей мере один остаток блокированной нуклеиновой кислоты (ΕΝΑ), например, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по
- 18 015563 меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или по меньшей мере 20 остатков ^NΛ. В соответствии с этим, число остатков ^NΛ может составлять менее чем 20, например, менее чем 18, менее чем 16, менее чем 14, менее чем 12, менее чем 10.
В одном из вариантов изобретения все нуклеотидные аналоги, присутствующие в антисмысловой цепи, представляют собой остатки блокированной нуклеиновой кислоты (^NΛ).
В предпочтительном варианте изобретения антисмысловая цепь содержит лишь небольшое число остатков нуклеотидных аналогов, таких как остатки ^NΛ. Обычно, предпочтительно, чтобы нуклеотидные остатки, присутствующие в антисмысловой цепи, находились в З'-половине антисмысловой цепи, например, в положениях 1-9 антисмысловой цепи, а именно, в положениях 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 антисмысловой цепи, например, в области из трех выступающих концов, или в первых 3, например, в первом, втором или третьем положениях нуклеотидов дуплекса, считая от 3'-конца антисмысловой цепи.
В одном из вариантов изобретения нуклеотидные аналоги, присутствующие в цепи-пассажире (или в антисмысловой цепи или в обеих цепях, либо в виде отдельных молекул, либо в виде комбинации всех нуклеотидных аналогов в РНК-комплексе), представляют собой по меньшей мере один остаток блокированной нуклеиновой кислоты (^NΛ), например, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или по меньшей мере 20 остатков ^NΛ. В соответствии с этим, число остатков ^NΛ может составлять менее чем 20, например, менее чем 18, менее чем 16, менее чем 14, менее чем 12, менее чем 10.
В одном из вариантов изобретения все нуклеотидные аналоги, присутствующие в цепипассажире, представляют собой остатки блокированной нуклеиновой кислоты (^NΛ).
В одном из вариантов изобретения по меньшей мере один из нуклеотидных аналогов, присутствующих в прерывистой цепи-пассажире, образует пару оснований с комплементарным нуклеотидным аналогом, присутствующим в антисмысловой цепи.
В одном из вариантов изобретения все нуклеотидные аналоги, присутствующие в прерывистой цепи-пассажире, образуют пары оснований с комплементарными нуклеотидными аналогами, присутствующими в антисмысловой цепи и не являющимися нуклеотидными аналогами выступающего 3'-конца (если он имеется).
В одном из вариантов изобретения все нуклеотидные аналоги, присутствующие в антисмысловой цепи, образуют пары оснований с комплементарными нуклеотидными аналогами, присутствующими в прерывистой цепи-пассажире и не являющимися нуклеотидными аналогами выступающего 3'-конца (если он имеется).
В одном из вариантов изобретения цепь-пассажир состоит из молекул РНК длиной 9-11 нуклеотидов (нуклеотидных оснований) или содержит такие молекулы РНК, например, молекулу РНК из 10 нуклеотидов, включающую 1-5 нуклеотидных аналогов, таких как остатки ^NΛ, например, два остатка ^NΛ, и молекулу РНК из 11-13 нуклеотидов, например, молекулу РНК из 12 нуклеотидов, содержащую 1-5 остатков нуклеотидных аналогов, таких как остатки ^NΛ, а именно, три остатка ^NΛ.
В одном из вариантов изобретения по меньшей мере один из трех 3'-концевых нуклеотидов второй молекулы РНК цепей-пассажиров представляет собой нуклеотидный аналог, такой как ^NΛ. В таком варианте изобретения 3'-концевые нуклеотиды второй молекулы РНК цепи-пассажира могут включать один из нижеследующих мотивов нуклеотидных оснований, а именно: Ххх-3', ХХх-3', хХх-3', ххХ-3', ХХХ-3', где х означает РНК-мономер, а X означает остаток нуклеотидного аналога, такой как остаток ^NΛ. В этом варианте изобретения вторая молекула РНК цепей-пассажиров может содержать один или несколько других мономеров нуклеотидных аналогов, например, один или несколько других ^NΛмономеров в определенных положениях, таких как положения 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13, считая от 3'-конца второй молекулы РНК. В одном из вариантов изобретения вторая молекула РНК цепипассажира содержит 3, 4 или 5 остатков нуклеотидных аналогов, таких как остатки ^NΛ-мономеров.
В одном из вариантов изобретения по меньшей мере один из трех 3'-концевых нуклеотидов второй молекулы РНК цепей-пассажиров представляет собой нуклеотидный аналог, такой как ^NΛ. В таком варианте изобретения 3'-концевые нуклеотиды второй молекулы РНК цепи-пассажира могут включать один из нижеследующих мотивов нуклеотидных оснований, а именно: Ххх-3', ХХх-3', хХх-3', ххХ-3', ХХХ-3', где х означает РНК-мономер, а X означает остаток нуклеотидного аналога, такой как остаток ^NΛ. В этом варианте изобретения вторая молекула РНК цепей-пассажиров может содержать один или несколько других мономеров нуклеотидных аналогов, например, один или несколько других ^NΛмономеров в определенных положениях, таких как положения 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13, считая от 3'-конца второй молекулы РНК. В одном из вариантов изобретения вторая молекула РНК цепипассажира содержит 3, 4 или 5 остатков нуклеотидных аналогов, таких как остатки ^NΛ-мономеров.
В одном из вариантов изобретения по меньшей мере один из трех 5'-концевых нуклеотидов первой молекулы РНК цепей-пассажиров является нуклеотидным аналогом, таким как ^NΛ. В таком варианте
- 19 015563 изобретения 5'-концевые нуклеотиды первой молекулы РНК цепи-пассажира могут включать один из нижеследующих мотивов нуклеотидных оснований, а именно: Ххх-5', ХХх-5', хХх-5', ххХ-5', ХХХ-5', где х означает РНК-мономер, а X означает остаток нуклеотидного аналога, такой как остаток ^NΑ. В этом варианте изобретения первая молекула РНК цепей-пассажиров может содержать один или несколько других мономеров нуклеотидных аналогов, например, один или несколько других ^NΑ-мономеров в определенных положениях, таких как положения 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13, считая от 5'-конца первой молекулы РНК. В одном из вариантов изобретения первая молекула РНК цепи-пассажира содержит 3, 4 или 5 остатков нуклеотидных аналогов, таких как остатки ^NΑ-мономеров.
В соответствии с этим цепь-пассажир может содержать 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидных аналогов, таких как ^NΑ-мономер в положении от 5'конца, выбранном из группы, состоящей из положения 1, положения 2, положения 3, положения 4, положения 5, положения 6, положения 7, положения 8, положения 9, положения 10, положения 11, положения 12, положения 13, положения 14, положения 15, положения 16, положения 17, положения 18, положения 19, положения 20, положения 21, положения 22, положения 23 или положения 24.
В одном из вариантов изобретения вторая молекула РНК прерывистой цепи-пассажира содержит один или несколько 2'-адамантил-амино- и/или 2'-пирен-^NΑ-остатков.
На фиг. 20 показано, что введение Ь-Ν А в первую и вторую молекулы РНК прерывистой цепипассажира РНК-комплекса согласно изобретению обеспечивает высокоэффективный сайленсинг РНКмишени по сравнению с эквивалентной РНК-молекулой, в которой цепь-пассажир содержит только РНК-остатки. Действительно, наличие комбинации нуклеотидных аналогов, таких как ^NΑ, вводимых в цепь-пассажир, и разрывов в цепи-пассажире позволяет получить высокоэффективный и стабильный комплекс сайленсинга РНК, который может быть использован в терапии (см. фиг. 20).
В соответствии с этим нуклеотидные аналоги, присутствующие в цепи-пассажире, могут представлять собой 2'-модифицированные нуклеотиды (РНК или ДНК), такие как 2'-галогензамещенные остатки РНК или ДНК (такие как 2'-Е-ДНК) или 2'-О-Ме-РНК (см. фиг. 21).
На фиг. 22 показано, что после введения прерывистой цепи-пассажира, такой как прерывистые цепи-пассажиры согласно изобретению, авторами настоящего изобретения было обнаружено, что цепьпассажир может быть толерантной к большему числу модифицированных или функционализированных нуклеотидных аналогов, таких как ^NΑ или функционализированная ^NΑ.
В других вариантах изобретения вторая молекула РНК прерывистой цепи-пассажира имеет последовательность (5'-3'), выбранную из группы, состоящей из последовательностей: ххХхХххххХХх, хххХххххХХх, где х означает РНК-мономер, а X означает остаток нуклеотидного аналога, такой как остаток ^NΑ.
В других вариантах изобретения, которые могут быть такими же, как вышеуказанные варианты или отличаться от вышеуказанных вариантов, первая молекула РНК прерывистой цепи-пассажира имеет последовательность (5'-3'), выбранную из группы, состоящей из последовательности ххХхххххХх, где х означает РНК-мономер, а X означает остаток нуклеотидного аналога, такой как остаток ^NΑ.
Использование антисмысловой цепи, содержащей нуклеотидные аналоги, такие как ^NΑ, может значительно снижать или даже подавлять способность комплекса РНК-сайленсинга осуществлять сайленсинг. Такая чувствительность антисмысловой цепи к нуклеотидной модификации (к введению аналогов) затрудняет разработку терапевтических средств на основе киРНК, поскольку введение нуклеотидных аналогов, очевидно, необходимое для ίη у1уо стабильности, может в значительной степени блокировать терапевтическую активность молекулы, в частности, в дозе, способствующей стабилизации нуклеотидных аналогов, необходимых для достаточной стабильности ίη у1уо. После введения прерывистой цепи-пассажира, таких как прерывистые цепи-пассажиры согласно изобретению, авторами настоящего изобретения было обнаружено, что антисмысловая цепь может быть толерантной к значительно более высоким дозам нуклеотидных аналогов, таких как ^NΑ (см. фиг. 23, 24 и 25), и других нуклеотидных аналогов, таких как 2'-Е-ДНК или 2'-О-Ме-РНК. Такое преимущество очевидно даже в том случае, если антисмысловая цепь имеет нуклеотидные аналоги в области, расположенной выше трех 3'-концевых нуклеотидных остатков антисмысловой цепи (обычно в области, по меньшей мере, чувствительной к нуклеотидным модификациям). Действительно, как показано на фиг. 24, авторами настоящего изобретения было обнаружено, что антисмысловая цепь, содержащая только нуклеотидные аналоги, такие как 2'Е-ДНК или 2'-О-Ме-РНК, могут при спаривании с прерывистой цепью-пассажиром еще сохранять достаточный уровень сайленсинга мишени.
В одном из вариантов изобретения антисмысловая цепь содержит по меньшей мере 1 нуклеотидный аналог, расположенный за пределами трех 3'-концевых нуклеотидных остатков антисмысловой цепи.
В одном из вариантов изобретения все нуклеотидные основания антисмысловой цепи представляют собой нуклеотидные аналоги, такие как нуклеотидные аналоги, в которых 2'-замещениями являются 2'-ЕДНК или 2'-О-Ме-РНК.
В одном из вариантов изобретения антисмысловая цепь может содержать один из нижеследующих нуклеотидных мотивов: 5'-Ххх, 5'-ХХх, 5'-хХх, 5'-ххХ, 5'-ХХХ, где х означает РНК-мономер, а X означа
- 20 015563 ет остаток нуклеотидного аналога, такой как остаток ΕΝΆ.
В соответствии с этим, антисмысловая цепь может содержать 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидных аналогов, таких как ΕΝΆ-мономер в положениях от 5'-конца, выбранных из группы, состоящей из положения 1, положения 2, положения 3, положения 4, положения 5, положения 6, положения 7, положения 8, положения 9, положения 11, положения 13, положения 14, положения 15, положения 16, положения 17, положения 18, положения 19, положения 20, положения 21, положения 22, положения 23 или положения 24. Антисмысловая цепь может содержать нуклеотидные аналоги с выступающим 3'-концом, присутствующие, например, в положениях 1, 2, 3 от 3'конца, и/или в дуплексе с цепью-пассажиром. В одном из вариантов изобретения 5'-концевой мономер антисмысловой цепи представляет собой РНК-нуклеотид. Цепь-пассажир может содержать нуклеотидные аналоги с выступающим 3'-концом, присутствующие, например, в положениях 1, 2, 3 от 3'-конца, и/или в дуплексе с антисмысловой цепью.
В одном из вариантов изобретения, которые могут быть одинаковыми или различными, антисмысловая цепь содержит по меньшей мере три нуклеотидных аналога, таких как ΕΝΆ-остатки. При этом предпочтительно по меньшей мере один из остатков нуклеотидного аналога находится за пределами трех 3'-концевых нуклеотидных мономеров антисмысловой цепи, например, по меньшей мере два остатка нуклеотидного аналога находятся за пределами трех 3'-концевых нуклеотидных мономеров антисмысловой цепи, например, по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 остатка нуклеотидного аналога находятся за пределами трех 3'-концевых нуклеотидных мономеров антисмысловой цепи, например, 1-10 остатков нуклеотидного аналога находятся за пределами трех 3'концевых нуклеотидных мономеров антисмысловой цепи.
В одном из вариантов изобретения антисмысловая цепь содержит 3-10 остатков нуклеотидного аналога, таких как ΕΝΆ-мономеры, например, 4-6 мономеров нуклеотидного аналога.
В предпочтительном варианте изобретения антисмысловая цепь содержит один или несколько остатков нуклеотидного аналога, таких как ΕΝΆ, в той области антисмысловой цепи, которая образует комплементарный дуплекс с цепью-пассажиром.
В одном из вариантов изобретения антисмысловая цепь может содержать нуклеотидный мотив 5'ххХххХ.
В одном из вариантов изобретения антисмысловая цепь может содержать один из следующих нуклеотидных мотивов: 5'-Ххх, 5'-ХХх, 5'-хХх, 5'-ххХ, 5'-ХХХ, где х представляет собой РНК-мономер, а X представляет собой остаток нуклеотидного аналога, такой как ΕΝΆ-остаток.
В одном из вариантов изобретения антисмысловая цепь может содержать один из следующих нуклеотидных мотивов: 5'-ххххХ, 5'-хххХх, 5'-ххХхх, 5'-хХххх, 5'-Ххххх, 5'-хххХХ, 5'-ххХХх, 5'-хХХхх, 5'ХХххх, 5'-ххХХХ, 5'-хХХХх, 5'-ХХХхх, 5'-хХХХХ, 5'-ХХХХх, 5'-ХхххХ, 5'-ХххХх, 5'-ХхХхх, 5'-ХХххх, 5'-ХХххХ, 5'-ХххХХ, 5'-ХхХхХ, 5'-ХХхХХ, 5'-ХХХХХ, где х представляет собой РНК-мономер, а Х представляет собой остаток нуклеотидного аналога, такой как ΕΝΆ-остаток.
В одном из вариантов изобретения антисмысловая цепь может содержать последовательность: 5'ххХххХххххХххХхххххХХх3', где х представляет собой РНК-мономер, а Х представляет собой остаток нуклеотидного аналога, такой как ΕΝΆ-остаток.
В одном из вариантов изобретения по меньшей мере один из трех 3'-концевых нуклеотидных оснований второй молекулы РНК цепей-пассажиров представляет собой нуклеотидный аналог, такой как ΕΝΆ. В этом варианте изобретения 3'-концевые нуклеотидные основания второй молекулы РНК цепипассажира могут содержать один из следующих нуклеотидных мотивов: Ххх-3', ХХх-3', хХх-3', ххХ-3', ХХХ-3', где х представляет собой РНК-мономер, а X представляет собой остаток нуклеотидного аналога, такой как ΕΝΆ-остаток. В этом варианте изобретения вторая молекула РНК цепей-пассажиров может содержать дополнительные остатки нуклеотидного аналога, такие как ΕΝΆ-остатки.
Блокированная нуклеиновая кислота (ΕΝΆ), используемая в РНК-комплексе согласно изобретению имеет структуру общей формулы
где X и Υ независимо выбраны из группы, состоящей из -О-, -8-, -Ν(Η)-, Ν(Β)-, -СН2- или -СН- (если он является часть двойной связи), -СН2-О-, -СН2-8-, -СН2-Ы(Н)-, -СН2-К(В)-, -СН2-СН2- или -СН2-СН(если он является часть двойной связи), -СН=СН-, где В выбран из водорода и С1-4алкила; Ζ и Ζ* независимо выбраны из группы, состоящей из межнуклеотидной связи, концевой группы или защитной группы; В представляет собой природное или неприродное нуклеотидное основание; а асимметрические группы могут находиться в любой ориентации.
Фосфортиоатные связи могут оказаться предпочтительными. Однако молекулы, образующие РНК
- 21 015563 комплекс могут содержать и другие связи или различные смешанные связи, например фосфатные и фосфортиоатные связи, либо только фосфатные или другие описанные здесь связи.
Термин тио-ΕΝΑ включает в себя блокированное нуклеотидное основание, где по меньшей мере один из X или Υ на схеме 1 выбран из 8 или -СН2-8-. Остаток тио-ΕΝΑ может присутствовать в бета-Э- и альфа-Ъ-конфигурации.
Термин амино-ΕΝΑ включает в себя блокированное нуклеотидное основание, где по меньшей мере один из X или Υ на схеме 1 представляет собой -Ν(Η)-, Ν(Κ)-, СН2-Ы(Н)-, -СН2-Ы(К)-, где К выбран из водорода и С1-4-алкила. Остаток амино-ΕΝΑ может присутствовать в бета-О- и альфа-Ъ-конфигурации.
Термин окси-ΕΝΑ включает в себя блокированное нуклеотидное основание, где по меньшей мере один из X или Υ на схеме 1 представляет собой О- или -СН2-О-. Остаток окси-ΕΝΑ может присутствовать в бета-О- и альфа-Ъ-конфигурации.
Термин ена-ΕΝΑ включает в себя блокированное нуклеотидное основание, где Υ на схеме 1 представляет собой -СН2-О- (где атом кислорода в -СН2-О- присоединен во 2-положении по отношению к нуклеотидному основанию В).
Термин альфа-Ъ-ΕΝΑ включает в себя блокированный нуклеотид, представленный на схеме 2 (структура справа).
Термин 'ΈΝΑ-производные включает в себя все блокированные нуклеотиды на схеме 1, а также бета-О-метилен-ΕΝΑ, например, тио-ΕΝΑ, амино-ΕΝΑ, альфа-Ъ-окси-ΕΝΑ и ена-ΕΝΑ, за исключением бета-О-окси-ΕΝΑ.
Термин «блокированный нуклеотид» означает блокированное нуклеотидное основание и не употребляется в таком же смысле, как термин нуклеотид, определенный в настоящей заявке.
На схеме 1 4 хиральных центра показаны в определенной конфигурации. Однако конфигурации на схеме 1 необязательно должны быть фиксированными. В настоящем изобретении также рассматриваются соединения общей схемы 1, в которых хиральные центры имеют различные конфигурации, такие как конфигурации, представленные на схеме 2. А поэтому представленная для иллюстрации схема 1 не должна рассматриваться как ограничение конфигурации хиральных центров. Каждый хиральный центр на схеме 1 может присутствовать либо в К-, либо в 8-конфигурации. Определение конфигурации К (правовращающая) и 8 (левовращающая) описаны в ИЮПАК (IυΡΑС 1974 Кесοттеηάаί^οη5, 8есί^οη Е, Ецпбатейа1 8ίе^еοсЬет^5ί^у: ТНе тц1е5 сап Ье Γοιιηά ίη Риге ΑρρΙ. СНет. 45, 13-30, (1976) и в №тепс1аШге οΓ οΓ^αηκ С’НетЩгу ρе^датοη, №\ν ΥοιΈ 1979.
Ζ и Ζ* независимо выбраны из межнуклеозидной связи, концевой группы или защитной группы.
Межнуклеозидная связь может быть выбрана из группы, состоящей из -О-Р(О)2-О-, -О-Р(О,8)-О-, -О-Р(8)2-О-, -8-Р(О)2-О-, -8-Р(О,8)-О-, -8-Р(8)2-О-, -О-Р(О)2-8-, -О-Р(О,8)-8-, -8-Р(О)2-8-, -О-РО(Кн)-О-, ОРО(ОСН2)-О-, -О-РО(ЫКН)-О-, -О-РО(ОСН2СН28-К)-О-, -О-РО(ВН2)-О-, -О-РО(ХНКн)-О-, -О-Р(О)2-ХКн-, -ХКН-Р(О)2-О-, -ΝΚ'-СО-О-, -ΝΚ.1 '-СО-ХК.1'-, и/или межнуклеозидная связь может быть выбрана из группы, состоящей из -О-СО-О-, -О-СО-МКН-, -МКН-СО-СН2-, -О-СН2-СО-МКН-, -О-СН2-СН2-МКН-, -СО-МКН-СН2-, -СН2-ХКН-СО-, -О-СН2-СН2-8-, -8-СН2-СН2-О-, -8-СН2-СН2-8-, -СН2-8О2-СН2-, -СЩ-СО-ХК'-, -О-СН2СН2-ХКН-СО-, -СН2-ЫСН3-О-СН2-, где КН выбран из водорода и С1-4-алкила.
Концевые группы независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, азидо, галогена, циано, нитро, гидрокси, Ρτοί-О-, ЛсЕО-, -меркапто, Ρτοί-8-, ΑΛ-8-, С1-6-алкилтио, амино, Ρτοί-Ν(ΚΗ)-, ΑΠ-Ν(ΚΗ)-, моноили ди(С1-6-алкил)амино, необязательно замещенного С1-6-алкокси, необязательно замещенного С1-6-алкила, необязательно замещенного С2-6-алкенила, необязательно замещенного С2-6-алкенилокси, необязательно замещенного С2-6-алкинила, необязательно замещенного С2-6-алкинилокси, монофосфата, монотиофосфата, дифосфата, дитиофосфата, трифосфата, тритиофосфата, ДНК-интеркалирующих агентов, фотохимически активных групп, термохимически активных групп, хелатообразующих групп, репортерных групп, лигандов, карбокси, сульфоно, гидроксиметила, РгоЕО-СН2-, Αсί-О-СΗ2-, аминометила, Ρτοί-Ν(ΚΗ)-ΟΗ2-, ΑΠ-Ν (КН)СН2-, карбоксиметила, сульфонометила, где Ρτοί представляет собой защитную группу для -ОН, -8Н и -ΝΗ(ΚΗ), соответственно, ΑΠ представляет собой активирующую группу для -ОН, -8Н и -ΝΗ(ΚΗ), соответственно, а КН выбран из водорода и С1-6-алкила.
Защитными группами гидроксизаместителей являются замещенный тритил, такой как 4,4'диметокситритилокси (ОМТ), 4-монометокситритилокси (ММТ); тритилокси, необязательно замещенный 9-(9-фенил)ксантенилокси (пиксил), необязательно замещенный метокситетрагидропиранилокси (ιηΐΐιρ); силилокси, такой как триметилсилилокси (ТМ8), триизопропилсилилокси (Т1Р8), третбутилдиметилсилилокси (ТВИМ8), триэтилсилилокси и фенилдиметилсилилокси; трет-бутиловые эфиры; ацетали (включающие две гидроксигруппы); ацилокси, такие как ацетил или замещенные галогеном ацетилы, например хлорацетилокси или фторацетилокси, изобутирилокси, пивалоилокси, бензоилокси и замещенные бензоилы, метоксиметилокси (МОМ), бензиловые эфиры или замещенные бензиловые эфиры, такие как 2,6-дихлорбензилокси (2, 6-С12В/1). Альтернативно, если Ζ или Ζ* представляют собой гидроксил, то они могут быть защищены путем присоединения к твердому носителю необязательно посредством линкера.
В вышеуказанном примере ΑΛ означает активирующую группу для -ОН, -8Н и -ΝΗ(ΚΗ), соответст
- 22 015563 венно. Такими активирующими группами являются, например, группы, выбранные из необязательно замещенного О-фосфорамидита, необязательно замещенного 0-фосфортриэфира, необязательно замещенного О-фосфордиэфира, необязательно замещенного Н-фосфоната и необязательно замещенного Офосфоната.
В контексте настоящего изобретения термин фосфорамидит означает группу формулы -Р(ОВх)№(Ву)2, где Вх означает необязательно замещенную алкильную группу, например метил, 2-цианоэтил или бензил, а каждый из Ву означает необязательно замещенные алкильные группы, например этил или изопропил, либо группа -№(Ву)2 образует морфолиногруппу (-№(СН2СН2)2О-). Вх предпочтительно означает 2-цианоэтил, а два Ву являются, предпочтительно идентичными и представляют изопропил. Так, например, особенно подходящим фосфорамидитом является №,№-диизопропил-О-(2-цианоэтил)фосфорамидит.
В представляет собой природное или неприродное нуклеотидное основание, выбранное из аденина, цитозина, 5-метилцитозина, изоцитозина, псевдоизоцитозина, гуанина, тимина, урацила, 5-бромурацила, 5-пропинилурацила, 5-пропинил-6-фторурацила, 5-метилтиазолурацила, 6-аминопурина, 2-аминопурина, инозина, диаминопурина, 7-пропин-7-деазааденина, 7-пропин-7-деазагуанина и 2-хлор-6-аминопурина. В некоторых вариантах изобретения блокированная нуклеиновая кислота (Ь№А), используемая в олигомерном соединении согласно изобретению, содержит нуклеотидные основания, которые представляют собой модифицированные нуклеотидные основания, выбранные из группы, состоящей из 5метилцитозина, изоцитозина, псевдоизоцитозина, 5-бромурацила, 5-пропинилурацила, 6-аминопурина, 2аминопурина, инозина, диаминопурина и 2-хлор-6-аминопурина.
При этом предпочтительно, чтобы блокированная нуклеиновая кислота (Ь№А), используемая в олигомерном соединении, таком как антисмысловой олигонуклеотид согласно изобретению, содержала по меньшей мере один нуклеотид, включающий остаток блокированной нуклеиновой кислоты (Ь№А), соответствующий любой из следующих формул:
Схема 2
где Υ представляет собой -О-, -8-, -ΝΗ- или -№(ВН); Ζ и Ζ* независимо выбраны из группы, состоящей из межнуклеозидной связи, концевой группы или защитной группы; а В представляет собой природное или неприродное нуклеотидное основание.
Ь№А-мономеры и их получение описаны в заявке №О 99/14226 и в более поздних заявках, №О 00/56746, №0 00/56748, №О 00/66604, №О 00/125248, №О 02/28875, №О 2002/094250 и в №О 2003/006475. Конкретным примером тимидинового Ь№А-мономера является (18,3В,4В,78)-7-гидрокси-1гидроксиметил-5-метил-3-(тимин-1-ил)-2,5-диоксабицикло[2:2:1]гептан.
Особенно предпочтительные Ь№А-остатки показаны на схеме 3, где В и Ζ* и Ζ являются такими, как они были определены ранее, а ВН выбран из водорода и С1-4алкила.
В одном из вариантов изобретения нуклеотидным аналогом является пирен-2'-амино-Ь№А-мономер или адамантил-2'-амино-Ь№А-мономер.
Могут быть также использованы Ь№А-мономеры (например, альфа-Ь-Ь№А, тио-Ь№А, амино-Ь№А, Е№А и другие нуклеотидные аналоги), которые не нарушают А-конфигурацию квсиРНК-комплекса или которые фактически обеспечивают сохранение А-конфигурации. В одном из вариантов изобретения может быть использована нуклеиновая кислота Н№А-гексит, например, либо в виде отдельного нуклеотидного аналога, либо в комбинации с Ь№А нуклеотидами.
В предпочтительном варианте изобретения РНК-комплекс включает в себя фосфоротиоатные связи.
Предпочтительными нуклеотидными аналогами согласно изобретению являются нуклеотидные аналоги, выбранные из группы, состоящей из 2'-О-алкил-РНК-мономеров, 2'-амино-ДНК-мономеров, 2'фтор-ДНК мономеров, Ь№А-мономеров и 1№А-мономеров.
В одном из вариантов изобретения цепь-пассажир, такая как первая и/или вторая молекулы РНК, содержит один или несколько Ь№А-мономеров (нуклеотидных аналогов).
В одном из вариантов изобретения антисмысловая цепь содержит один или несколько Ь№Амономеров (нуклеотидных аналогов).
В одном из вариантов изобретения РНК-комплекс согласно изобретению оказывает значительно меньшее побочное действие по сравнению с нативными РНК-комплексами, содержащими непрерывную цепь-пассажир, как уже указывалось ранее в данном описании.
В другом варианте изобретения РНК-комплекс согласно изобретению продуцирует более низкий уровень иммунного ответа по сравнению с нативными РНК-комплексами, содержащими непрерывную цепь-пассажир.
В еще одном варианте изобретения РНК-комплексы согласно изобретению обладают более продолжительным действием по сравнению с нативными РНК-комплексами, содержащими непрерывную цепь-пассажир. В соответствии с этим в предпочтительном варианте изобретения действие РНК
- 23 015563 комплексов согласно изобретению является эффективным в течение более длительного периода времени по сравнению с действием нативных РНК-комплексов, содержащих непрерывную цепь-пассажир.
В другом варианте изобретения РНК-комплексы согласно изобретению обладают более эффективным действием, чем нативные РНК-комплексы, содержащие непрерывную цепь-пассажир. В соответствии с этим в предпочтительном варианте изобретения РНК-комплекс опосредует РНКи с большей эффективностью, чем нативный РНК-комплекс, например, он оказывает более сильное действие, направленное на разложение мРНК-мишени, или более сильное действие, направленное на ингибирование трансляции мРНК-мишени.
Другим аспектом настоящего изобретения является способ получения РНК-комплекса согласно изобретению, включающий инкубирование антисмысловой цепи вместе с цепью-пассажиром в условиях, которые способствуют образованию РНК-комплекса, содержащего коровую двухцепочечную область, где указанный РНК-комплекс способен опосредовать РНК-интерференцию соответствующей клеточной РНК.
Другим аспектом изобретения является способ опосредования модификации нуклеиновой кислотымишени в клетке или в организме, включающий следующие стадии:
a) контактирование клетки или организма с РНК-комплексом согласно изобретению в условиях, при которых может происходить модификация нуклеиновой кислоты-мишени;
b) опосредование, тем самым, модификации нуклеиновой кислоты-мишени.
В одном из вариантов изобретения способ опосредования модификации нуклеиновой кислотымишени осуществляют ίη νίίτο (но в клетке).
В одном из вариантов изобретения способ опосредования модификации нуклеиновой кислотымишени осуществляют ίη νίνο (в организме).
В еще одном варианте изобретения указанный способ осуществляют в выделенной клетке.
В предпочтительном варианте изобретения указанной модификацией нуклеиновой кислоты, осуществляемой указанным способом, является интерференция РНК, предпочтительно деградация мРНКмишени или ингибирование трансляции мРНК-мишени или ингибирование РНК других типов, например, некодирующей РНК.
В другом варианте изобретения указанной модификацией нуклеиновой кислоты является метилирование ДНК.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу оценки функции гена в клетке или в организме, включающему:
a) введение в клетку или организм РНК-комплекса согласно изобретению, направленного на РНК, кодируемую указанным геном, такую как мРНК или другую функциональную РНК, в целях осуществления деградации или сайленсинга, и, тем самым, продуцирование исследуемой клетки или исследуемого организма;
b) поддержание указанной тестируемой клетки или тестируемого организма в условиях, при которых происходит деградация или сайленсинг РНК, кодируемой данным геном, и, тем самым, продуцирование исследуемой клетки или исследуемого организма, имеющих пониженные уровни РНК данного гена;
c) наблюдение фенотипа исследуемой клетки или исследуемого организма, продуцированных на стадии Ь, и, необязательно, сравнение наблюдаемого фенотипа с фенотипом соответствующей контрольной клетки или контрольного организма, и, тем самым, получение информации о функции данного гена.
РНК-комплекс согласно изобретению может быть введен в клетки, например, путем трансфекции, описанной в прилагаемых примерах.
Наблюдение за фенотипом организма или клетки может быть осуществлено, например, с помощью протеомики, применяемой для оценки уровней белка, или с помощью микромассивов, применяемых для оценки уровней мРНК. Кроме того, для более точного определения фенотипа могут быть использованы, например, данные об экспрессии одного конкретного гена.
Полученная информация о функции гена может быть использована для того чтобы определить, является ли данный генный продукт подходящей мишенью для терапевтического лечения конкретного заболевания. Так, например, если было продемонстрировано, что определенный генный продукт действует в определенном пути биохимических реакций, которые, как известно, играют негативную роль в данном организме, например, в развитии рака определенного подтипа, то такой генный продукт может быть подходящей мишенью для терапевтического лечения рака вышеупомянутого подтипа.
В предпочтительном варианте способа оценки функции гена в клетке или в организме модификациями нуклеиновой кислоты, осуществляемыми способом согласно изобретению, являются интерференция РНК, предпочтительно деградация мРНК-мишени или ингибирование трансляции мРНК-мишени.
В другом варианте изобретения модификацией нуклеиновой кислоты является метилирование ДНК.
В предпочтительных вариантах способа оценки функции гена в клетке или в организме указанный способ осуществляют ίη νίίτο.
В другом варианте изобретения указанный способ осуществляют в выделенной клетке.
- 24 015563
Другим аспектом согласно изобретению является способ оценки действия данного средства на генный продукт, где указанный способ включает в себя стадии:
a) введения РНК-комплекса согласно изобретению, соответствующего указанному гену, в клетку или организм и, тем самым, продуцирования исследуемой клетки или исследуемого организма;
b) поддержание указанной тестируемой клетки или тестируемого организма в условиях, способствующих модификации нуклеиновой кислоты-мишени;
c) введения указанного средства в исследуемую клетку или исследуемый организм;
ά) наблюдения фенотипа исследуемой клетки или исследуемого организма, продуцированных на стадии с, и, необязательно, сравнения наблюдаемого фенотипа с фенотипом соответствующей контрольной клетки или контрольного организма, и, тем самым, получения информации о действии данного средства на генный продукт.
Предпочтительным контролем на стадии ά является исследуемая клетка или исследуемый организм, не содержащие РНК-комплекса, вводимый на стадии а.
В предпочтительном варианте способа установления того, действует ли данное средство на ген или генный продукт, модификациями нуклеиновой кислоты в способе согласно изобретению являются интерференция РНК, предпочтительно деградация мРНК-мишени или ингибирование трансляции мРНКмишени. В другом варианте изобретения модификацией нуклеиновой кислоты является метилирование ДНК.
В еще одном варианте изобретения указанный способ осуществляют в выделенной клетке.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу получения РНК-комплекса, включающему инкубирование антисмысловой цепи, описанной в настоящей заявке, по меньшей мере с двумя молекулами РНК, образующими непрерывную цепь-пассажир, описанную в настоящей заявке, и, необязательно, дополнительные молекулы РНК цепи-пассажира, описанные в настоящей заявке, в условиях, которые способствуют образованию РНК-комплекса, содержащего коровую двухцепочечную область. В соответствии с этим указанный РНК-комплекс способен опосредовать интерференцию соответствующей клеточной РНК.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу получения фармацевтической композиции, содержащей РНК-комплекс, где указанный способ включает инкубирование антисмысловой цепи, описанной в настоящей заявке, по меньшей мере с двумя молекулами РНК, образующими непрерывную цепь-пассажир, описанную в настоящей заявке, и, необязательно, дополнительные молекулы РНК цепи-пассажира, описанные в настоящей заявке, в условиях, которые способствуют образованию РНК-комплекса, содержащего коровую двухцепочечную область и способного опосредовать интерференцию соответствующей клеточной РНК, где либо указанное инкубирование осуществляют в фармацевтически приемлемом разбавителе, носителе или адъюванте, либо указанный РНК-комплекс затем смешивают с фармацевтически приемлемым разбавителем, носителем или адъювантом.
Настоящее изобретение относится к применению РНК-комплекса, определенного в настоящей заявке как лекарственный препарат.
Настоящее изобретение относится к применению РНК-комплекса, определенного в настоящей заявке как лекарственный препарат для лечения рака.
Настоящее изобретение относится к применению РНК-комплекса, определенного в настоящей заявке, в целях получения лекарственного препарата для лечения рака.
В другом своем варианте настоящее изобретение относится к способу лечения пациента, где указанный способ включает введение фармацевтической композиции согласно изобретению пациенту, нуждающемуся в таком лечении. Указанный способ может быть применен для лечения рака (например, путем выбора в качестве мишени р21 гак, такого как Н-гак).
Еще одним аспектом изобретения является РНК-комплекс и фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель или адъювант (то есть настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции или терапевтической композиции, включающей РНК-комплекс согласно изобретению). Совершенно очевидно, что РНК-комплексы согласно изобретению могут быть сконструированы для их нацеливания на специфические гены и генные продукты. При этом следует отметить, что РНК-комплексы будут нацелены на последовательность ДНК или последовательность РНК, но не на белок. Однако опосредованное действие может быть направлено на уровень генного продукта, такого как белок, если его мРНК является модифицированной, например, посредством ингибирования деградации или трансляции мРНК. Кроме того, на экспрессию гена, кодирующего белок, может влиять, например, метилирование ДНК.
Таким образом, другим аспектом изобретения является РНК-комплекс согласно изобретению, используемый в качестве лекарственного препарата. После подтверждения терапевтической мишени специалист может сконструировать РНК-комплексы, которые влияют на уровень и активность мишени, поскольку специфическая область РНК-комплексов находится исключительно в пределах последовательности антисмысловой цепи. Что касается нативных РНК-комплексов с непрерывной цепью-пассажиром, то проблема, связанная с побочными эффектами, вызываемыми цепью-пассажиром, действующей как ведущая последовательность, остается актуальной.
- 25 015563
Фармацевтическая композиция
Инструкции по приготовлению фармацевтических композиций можно найти в руководстве Ветшд1оп: Тйе 8аепсе апб Ргасйсе о£ Рйагтасу, А1£опко В. Оеппаго, и в нижеследующем описании.
При этом предпочтительно, чтобы соединение согласно изобретению было включено в унифицированную композицию, например, в фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель, в количестве, достаточном для доставки пациенту терапевтически эффективного количества соединения, так, чтобы оно не вызывало каких-либо серьезных побочных эффектов в организме пациента, подвергаемого лечению. Однако при некоторых формах терапии серьезные побочные эффекты могут быть допустимы, если при таком терапевтическом лечении гарантируется положительный результат.
Доза фармацевтической композиции зависит от тяжести патологического состояния, подвергаемого лечению, и его отвечаемости на такое лечение, а также от конкретного курса лечения, которое проводят от нескольких дней до нескольких месяцев, или до тех пор, пока такое лечение не даст нужный эффект или не будет достигнуто ослабление симптомов указанного патологического состояния. Оптимальная схема введения доз может быть определена, исходя из измерения уровня аккумуляции лекарственного средства в организме пациента. Оптимальные дозы могут варьироваться в зависимости от относительной эффективности отдельных олигонуклеотидов. В основном, такая доза может быть определена исходя из ЕСког которая, по оценкам, проведенным на животных-моделях ш νίΙΐΌ и ш у|уо, является эффективной. В общих чертах доза составляет от 0,01 мкг до 1 г на кг массы тела и может быть введена один или несколько раз в день, в неделю, в месяц или год, или даже один раз в каждые 2-10 лет, либо путем непрерывного вливания в течение периода времени от нескольких часов до нескольких месяцев. Частота введения дозы может быть оценена, исходя из установленного времени присутствия лекарственного средства и от концентраций лекарственного средства в физиологических жидкостях или в тканях. После успешного лечения пациенту может быть назначена поддерживающая терапия в целях предупреждения рецидивов указанного патологического состояния.
Приготовленное лекарственное средство может содержать фармацевтически приемлемые связывающие агенты и адъюванты. Капсулы, таблетки и драже и т. п. могут содержать, например, следующие соединения: микрокристаллическую целлюлозу, камедь или желатин в качестве связывающих агентов; крахмал или лактозу в качестве наполнителей; стеараты в качестве замасливателей; и различные подсластители или ароматизаторы. Унифицированная лекарственная форма в виде капсул может содержать жидкий носитель, такой как жирные масла. Аналогичным образом, частью унифицированной лекарственной формы могут быть сахарные или энтеросолюбильные покрытия. Олигонуклеотидные препараты могут быть также приготовлены в виде эмульсий, содержащих активные фармацевтические ингредиенты и липид, образующий мицеллярную эмульсию.
Фармацевтические композиции согласно изобретению могут быть введены различными способами в зависимости от выбранного курса лечения, то есть местного или системного лечения, и от площади пораженного участка, подвергаемого лечению. Таким введением может быть:
a) пероральное введение,
b) внутрилегочное введение, например, путем ингаляции или инсуффляции порошков или аэрозолей, включая введение с помощью аэрозольного ингалятора; интратрахеальное и интраназальное введение;
c) местное введение, включая эпидермальное, чрескожное, внутриглазное введение и введение через слизистую, включая вагинальное и ректальное введение; или
б) парентеральное введение, включая внутривенные, внутриартериальные, подкожные, внутрибрюшинные или внутримышечные инъекции или вливания; или внутричерепное введение, например интратекальное или интравентрикулярное введение.
В одном из вариантов изобретения активный олигонуклеотид вводят в орган-мишень внутривенно (ί.ν.), внутрибрюшинно (ί.ρ.), перорально, местно или в виде инъекции ударной дозы или непосредственно в данный орган.
Фармацевтическими композициями и препаратами для местного введения могут быть пластыри для чрескожной доставки, мази, лосьоны, кремы, гели, капли, спреи, суппозитории, жидкости и порошки. При этом могут оказаться необходимыми или желательными стандартные фармацевтические носители, водные, порошкообразные или масляные основы, загустители и т. п. Предпочтительными препаратами для местного введения являются препараты, в которых олигонуклеотиды согласно изобретению представляют собой смесь с веществами, используемыми для местной доставки, такими как липиды, липосомы, жирные кислоты, сложные эфиры жирных кислот, стероиды, хелатообразующие вещества и поверхностно-активные вещества. Композициями и препаратами для перорального введения являются, но не ограничивается ими, порошки или гранулы, микрочастицы, наночастицы, суспензии или растворы в воде или в безводной среде, капсулы, гелевые капсулы, саше, таблетки или минитаблетки. Композициями и препаратами для парентерального, интратекального или интравентрикулярного введения могут быть стерильные водные растворы, которые могут также содержать буферы, разбавители и другие подходящие добавки, такие как, но не ограничивающиеся ими, усилители пенетрации, соединения-носители и другие
- 26 015563 фармацевтически приемлемые носители или наполнители.
Фармацевтическими композициями согласно изобретению являются. но не ограничиваются ими. растворы. эмульсии и препараты. содержащие липосомы. Такие композиции могут быть приготовлены из различных компонентов. которые представляют собой. но не ограничивается ими. предварительно полученные жидкости. самоэмульгирующиеся твердые вещества и самоэмульгирующиеся полутвердые вещества. Доставка лекарственного средства в опухолевую ткань может быть улучшена путем применения опосредующих такую доставку носителей. включая. но не ограничиваясь ими. катионные липосомы. циклодекстрины. производные порфирина. дендримеры с разветвленной цепью. полиэтилениминовые полимеры. наночастицы и микросферы (Ба55 СК. 1. РНагт. РНагтасо1. 2002; 54(1):3-27). Фармацевтические композиции согласно изобретению. которые могут присутствовать. в основном. в виде унифицированной лекарственной формы. могут быть приготовлены стандартными методами. широко применяемыми в фармацевтической промышленности. Такие методы включают стадию взаимодействия активных ингредиентов с фармацевтическим(ими) носителем(ями) или наполнителем(ями). В общих чертах. такие композиции приготавливают путем равномерного и тщательного смешивания активных ингредиентов с жидкими носителями или тонкоизмельченными твердыми носителями или с теми и другими. с последующим формованием. если это необходимо. нужного продукта.
Композиции согласно изобретению могут быть приготовлены в виде любой из многих возможных лекарственных форм. таких как. но не ограничивающихся ими. таблетки. капсулы. гелевые капсулы. жидкие сиропы. мягкие гели и суппозитории. Композиции согласно изобретению могут быть также приготовлены в виде суспензий в водных. безводных или в смешанных средах. Водные суспензии могут также содержать вещества. повышающие вязкость такой суспензии. и такими веществами являются. например. натрий-содержащая карбоксиметилцеллюлоза. сорбит и/или декстран. Такая суспензия может также содержать стабилизаторы.
Препарат для парентерального. подкожного. чрескожного или местного введения может включать стерильный разбавитель. буферы. регуляторы тоничности и антибактериальные средства. Активное соединение может быть получено с использованием носителей. которые служат в качестве защиты данного соединения от разложения или от его непосредственного выведения из организма. включая носители. применяемые в имплантатах. или микрокапсулы с регулируемым высвобождением. Предпочтительными носителями для внутривенного введения являются физиологический раствор или забуференный фосфатом физиологический раствор.
РНК-комплекс согласно изобретению может быть смешан с любым веществом. которое не оказывает негативного влияния на желаемый эффект или стимулирует желаемый эффект. Такими веществами могут быть другие лекарственные средства. включая другие нуклеозидные соединения.
Фармацевтический препарат согласно изобретению включает в себя. необязательно. терапевтические средства. такие как дополнительные антисмысловые соединения. химиотерапевтические соединения. противовоспалительные соединения. противовирусные соединения и/или иммуномодулирующие соединения. В композициях согласно изобретению могут также присутствовать комбинации противовоспалительных средств. включая. но не ограничиваясь ими. нестероидные противовоспалительные средства и кортикостероиды. противовирусные лекарственные средства и иммуномодулирующие лекарственные средства.
Два или несколько объединенных соединений могут быть использованы вместе или отдельно. то есть соединение (РНК-комплекс) согласно изобретению может быть использовано до. во время или после введения одного или нескольких других описанных здесь терапевтических средств. Олигонуклеотиды. используемые в РНК-комплексах согласно изобретению. могут быть также конъюгированы с активными лекарственными веществами. например. с аспирином. ибупрофеном. серусодержащими лекарственными средствами. антидиабетическими лекарственными средствами. антибактериальными лекарственными средствами или антибиотиками.
В одном из вариантов изобретения фармацевтическая композиция согласно изобретению также содержит по меньшей мере одно химиотерапевтическое средство. Указанное химиотерапевтическое средство предпочтительно выбрано из группы. состоящей из адренокортикостероидов. таких как преднизон. дексаметазон или декадрон; альтретамина (гексалена. гексаметилмеламина (НММ)); амифостина (этиола); аминоглютетимида (цитадрена); амсакрина (Μ-ΑΜ8Α); анастрозола (аримидекса); андрогенов. таких как тестостерон; аспарагиназы (элспара); бациллы Кальметта-Герена; бикалутамида (казодекса); блеомицина (бленоксана); бусульфана (милерана); карбоплатина (параплатина); кармустина (ВСNυ. Βίί’Νυ); хлорамбуцила (лейкерана); хлордезоксиаденозина (2-С’БЛ. кладрибина. лейстатина); цисплатина (платинола); арабинозида цитозина (цитарабина); дакарбазина (БТ1С); дактиномицина (актиномицина-Б. космегена); даунорубицина (церубидина); доцетаксела (таксотера); доксорубицина (адриомицина); эпирубицина; эстрамустина (эмцита); эстрогенов. таких как диэтилстильбестрол (ΌΕ8); этопсида (УР-16. вепезида. этопофоса); флударабина (флудары); флутамида (эйлексина); 5-ΕυΌΚ (флоксуридина); 5фторурацила (5-Еи); гемцитабина (гемзара); гозерелина (зодалекса); герцептина (трастузумаба); гидроксимочевины (гидреи); идарубицина (идамицина); ифосфамида; 1Ь-2 (пролейкина. альдеслейкина); интерферона-альфа (интрона А. роферона А); иринотекана (камптозара); лейпролида (лупрона); левамизола
- 27 015563 (эргамизола); ломустина (ССЫИ); мехлоретамина (мустаргена, азотного аналога горчичного газа); мелфалана (алкерана); меркаптопурина (пуринетола, 6-МР); метотрексата (мексата); митомицина-С (мутамицина); митоксантрона (новантрона); октреотида (сандостатина); пентостатина (2дезоксикоформицина, нипента); пликамицина (митрамицина, митрацина); пророкарбазина (матулана); стрептозоцина; тамоксифина (нолвадекса); таксола (паклитаксела); тенипозида (вумона, УМ-26); тиотепы; топотекана (гикамтина); третиноина (везаноида, полностью транс-ретиноевой кислоты); винбластина (валбана); винкристина (онковина) и винорелбина (навелбина).
В некоторых своих вариантах настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим (а) один или несколько описанных здесь РНК-комплексов и (Ь) один или несколько других химиотерапевтических средств, которые функционируют по неантисмысловому механизму. Такие как химиотерапевтические средства при их использовании вместе с соединениями (РНК-комплексами) согласно изобретению, могут быть введены отдельно (например, митромицин и олигонуклеотид), последовательно (например, сначала вводят митромицин и олигонуклеотид в течение определенного периода времени, а затем вводят другое средство и олигонуклеотид) или в комбинации с одним или несколькими другими такими химиотерапевтическими средствами или в комбинации с лучевой терапией. Все химиотерапевтические средства, известные специалистам, вводят в виде комбинированной терапии с соединением согласно изобретению.
В другом варианте изобретения композиции согласно изобретению могут содержать один или несколько РНК-комплексов, направленных на первую нуклеиновую кислоту, и одно или несколько дополнительных соединений, таких как антисмысловые олигонуклеотиды, направленные на вторую нуклеиновую кислоту-мишень. Два или более объединенных соединений могут быть использованы вместе или отдельно, то есть соединение согласно изобретению может быть использовано до, во время или после введения одного или нескольких других описанных здесь терапевтических средств.
Фармацевтическая композиция согласно изобретению может иметь форму пролекарства. Поэтому в одном из вариантов изобретения РНК-комплекс согласно изобретению может иметь форму пролекарства. Олигонуклеотиды образуются отрицательно заряженными ионами. Вследствие липофильной природы клеточных мембран, поглощение олигонуклеотидов клетками, по сравнению с нейтральными или липофильными эквивалентами, снижается. Такую проблему полярности можно решить путем использования пролекарств. (См., например, Сгооке, К. М. (1998) ίη Сгооке, 8. Т. ЛпЦкспкс гсксагск апй Λρρίίοηΐίοη. 8ргшдег-Уег1ад, Вег1т, Оститу, νοί. 131, рр. 103-140). В этом методе олигонуклеотиды получают в защищенном виде, так, чтобы при введении эти олигонуклеотиды были нейтральными. Защитные группы конструируют так, чтобы они могли удаляться при поглощении данного олигонуклеотида клетками. Примерами таких защитных групп являются 8-ацетилтиоэтил (8ΑΤΕ) или 8-пивалоилтиоэтил (третбутил-8АТЕ). Указанные защитные группы являются резистентными к нуклеазе и подвергаются селективному удалению в клетках.
Фармацевтическая композиция согласно изобретению также, предпочтительно, содержит противовоспалительные соединения и/или противовирусные соединения.
Описанное здесь изобретение относится к способу предупреждения или лечения рака, включающему введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции или РНКкомплекса согласно изобретению.
Конъюгаты
В одном из вариантов изобретения один или несколько олигонуклеотидов, образующих РНКкомплекс, могут быть связаны с лигандами/конъюгатами, которые могут быть использованы, например, для усиления поглощения клетками РНК-комплекса. Такое конъюгирование может быть осуществлено в концевых 5'/3'-ОН-положениях, однако лиганды могут также присутствовать у сахаров и/или оснований. Поскольку РНК-комплекс согласно изобретению обычно содержит несколько концов (что обусловлено прерывистостью цепи-пассажира) , то имеется большее число сайтов, с которыми могут быть конъюгированы данные молекулы, что способствует усилению химического поглощения.
В предпочтительном варианте изобретения по меньшей мере одна из молекул, образующих РНКкомплекс, предпочтительно первая, вторая и/или другие молекулы РНК, образующие цепь-пассажир, конъюгированы с молекулой, повышающей уровень ίη νίνο поглощения РНК-комплекса, такой как холестерин (см. 8οπΐδΌ^ е! а1., ЫаШгс 432 (11) рр. 173-178).
В одном из вариантов изобретения фактор роста, с которым может быть конъюгирован олигонуклеотид, может включать трансферрин или фолат. Комплексы трансферрин-полилизин-олигонуклеотид или комплексы фолат-полилизин-олигонуклеотид могут быть получены так, чтобы они поглощались клетками, экспрессирующими высокие уровни рецептора трансферрина или фолата. Другими примерами конъюгатов/лигандов являются молекулы холестерина, дуплексные интеркалирующие агенты, такие как акридин, поли-Ь-лизин, конец-кэпирующие молекулы с одной или несколькими резистентными к нуклеазе связывающими группами, такими как фосформонотиоат и т.п. Настоящее изобретение также относится к конъюгату, содержащему описанный здесь РНК-комплекс согласно изобретению, и по меньшей мере одну ненуклеотидную или неполинуклеотидную молекулу, ковалентно связанную с указанным
- 28 015563 комплексом.
В предпочтительном варианте изобретения фармацевтическая композиция согласно изобретению содержит агент для доставки нуклеиновой кислоты, то есть агент, регулирующий уровень и распределение данного терапевтического средства в организме. Предпочтительным агентом для доставки является хитозан, известный как очень хорошее средство, которое связывается с нуклеиновыми кислотами, обладает низкой токсичностью и обычно хорошо переносится организмом. Считается, что оно минимизирует нуклеотидную нагрузку и тем самым облегчает поглощение нуклеотидов. Альтернативным агентом для доставки, который может быть использован необязательно с другими агентами, такими как хитозан, является полиэтиленимин. Указанные препараты, содержащие РНК-комплексы и агенты для доставки, являются предпочтительным вариантом настоящего изобретения. Такие варианты могут быть объединены с вышеуказанными вариантами конъюгирования, например, с введением концевой группы, такой как 3'концевой холестерин, конъюгированный с нуклеотидным основанием в процессе олигонуклеотидного синтеза.
Подходящие терапевтические мишени
Нижеследующее описание приводится лишь в целях иллюстрации.
АроВ: Как описано в \УО 2007/031081, мРНК Аро В представляет собой подходящую мишень для терапевтического вмешательства, например, для лечения атеросклероза, гиперхолестеринемии или гиперлипидемии.
Сурвивин: Как описано в XVО 2006/050732, мРНК сурвивина является подходящей мишенью для терапевтического вмешательства, например, для лечения рака.
Ηίί-1-альфа: Как описано в VО 2006/050734, мРНК Ηίί-1-альфа представляет собой подходящую мишень для терапевтического вмешательства, например для лечения раковых заболеваний, воспалительных заболеваний и глазных болезней, где указанными раковыми заболеваниями являются множественная миелома, рак почек, рак шейки матки, рак толстой кишки, рак головного мозга и рак молочной железы, и других заболеваний, таких как атеросклероз, псориаз, диабетическая ретинопатия, дегенерация желтого пятна, ревматоидный артрит, астма, воспалительное заболевание кишечника, папилломы, аллергический дерматит, воспалительные заболевания и воспаление кожи.
Вс12: Как описано в VО 2005/061710, мРНК Вс12 представляет собой подходящую мишень для терапевтического вмешательства, например, для лечения рака, такого как раковое заболевание, выбранное из группы, состоящей из острого миелоцитарного лейкоза, диффузной В-клеточной лимфомы, острого лимфоцитарного лейкоза, рака печени, рака почек, рака мочевых путей и рака прямой и ободочной кишки.
Р21-Рак: Как описано в РСТ/ЭК2006/000512, мРНК р21 гак, например К-гак, На-гак и Ν-гак, являются подходящими мишенями для терапевтического вмешательства, например, для лечения раковых заболеваний, таких как солидные опухоли, карцинома, саркома или глиома.
Так, например, вышеуказанные цели и условия могут быть достигнуты и обеспечены с использованием фармацевтических композиций согласно изобретению.
Ниже представлены дополнительные варианты, которые могут быть объединены с другими вариантами согласно изобретению:
1. РНК-комплекс, обладающий способностью опосредовать модификации нуклеиновой кислотымишени, которой они соответствуют, и включающий коровую двухцепочечную область, где указанная коровая двухцепочечная область содержит антисмысловую цепь и прерывистую цепь-пассажир, которая гибридизуется с антисмысловой цепью.
2. РНК-комплекс по п.1, где указанная модификация нуклеиновой кислоты выбрана из группы, состоящей из интерференции РНК и метилирования ДНК.
3. РНК-комплекс согласно варианту 2, где указанная интерференция РНК опосредует деградацию РНК-мишени или ингибирование трансляции РНК-мишени или их комбинации.
4. РНК-комплекс согласно варианту 1, где указанная кбровая двухцепочечная область содержит 1540 пар оснований.
5. РНК-комплекс согласно варианту 4, где указанная кбровая двухцепочечная область содержит определенное число пар оснований, выбранное из группы, состоящей из 18 пар оснований, 19 пар оснований, 20 пар оснований, 21 пары оснований, 22 пар оснований и 23 пар оснований.
6. РНК-комплекс согласно любому из вариантов 1-5, содержащий выступающий конец.
7. РНК-комплекс согласно варианту 6, содержащий два выступающих конца.
8. РНК-комплекс согласно любому из вариантов 6 и 7, где указанная антисмысловая цепь содержит выступающий 3'-конец.
9. РНК-комплекс согласно любому из вариантов 6 и 7, где указанная цепь-пассажир содержит выступающий 3'-конец.
10. РНК-комплекс согласно любому из вариантов 6-9, где выступающий конец имеет длину в 1-8 нуклеотидов.
11. РНК-комплекс согласно варианту 10, где выступающий конец имеет длину, выбранную из 1 нуклеотида, 2 нуклеотидов и 3 нуклеотидов.
- 29 015563
12. РНК-комплекс согласно любому из вариантов 1-6, содержащий по меньшей мере один тупой конец.
13. РНК-комплекс согласно любому из вариантов 1-5, где указанный РНК-комплекс затуплен по обоим концам.
14. РНК-комплекс согласно любому из вариантов 1-5, где указанная коровая двухцепочечная область содержит 18-22 пары оснований, и где указанная антисмысловая цепь и цепь-пассажир содержат выступающий З'-конец из 1-3 нуклеотидов.
15. РНК-комплекс согласно любому из предыдущих вариантов, где указанная прерывистая цепьпассажир содержит первую и вторую молекулы РНК, которые вместе образуют прерывистую цепьпассажир, где указанная первая молекула РНК гибридизована с нижерасположенной частью антисмысловой цепи, а вторая молекула РНК гибридизована с вышерасположенной частью антисмысловой цепи.
16. РНК-комплекс согласно варианту 15, где первая и вторая молекулы РНК разделены одноцепочечным разрывом (ником).
17. РНК-комплекс согласно варианту 15, где первая и вторая молекулы РНК разделены гэпом, выбранным из группы, состоящей из гэпа в 1 нуклеотид, в 2 нуклеотида, 3 нуклеотида, 4 нуклеотида, 5 нуклеотидов, 6 нуклеотидов, 7-нуклеотидов, 8 нуклеотидов, 9 нуклеотидов, 10 нуклеотидов, 11 нуклеотидов и 12 нуклеотидов.
18. РНК-комплекс согласно вариантам 15-17, где первая молекула РНК связана с антисмысловой цепью посредством линкера.
19. РНК-комплекс согласно вариантам 15-17, где вторая молекула РНК связана с антисмысловой цепью посредством линкера.
20. РНК-комплекс согласно вариантам 18 и 19, где указанная первая молекула РНК связана с антисмысловой цепью посредством первого линкера, а вторая молекула РНК связана с антисмысловой цепью посредством второго линкера.
21. РНК-комплекс согласно любому из вариантов 15-20, где указанная первая и вторая молекулы РНК связаны посредством линкера.
22. РНК-комплекс согласно любому из вариантов 15-21, где указанный линкер не является одноцепочечным РНК-линкером.
23. РНК-комплекс согласно варианту 15, где первая и вторая молекулы РНК не связаны друг с другом, в результате чего РНК-комплекс содержит три отдельные молекулы РНК, а именно, антисмысловую цепь и первую и вторую молекулы РНК, которые вместе образуют прерывистую цепь-пассажир.
24. РНК-комплекс согласно любому из вариантов 15-23, где указанная прерывистая цепь-пассажир имеет разрыв в положении, выбранном из группы, состоящей из положения 3, положения 4, положения 5, положения б, положения 7, положения 8, положения 9, положения 10, положения 11, положения 12, положения 13, положения 14, положения 15, положения 16, положения 17, положения 18, положения 19, положения 20, положения 21, положения 22, положения 23, положения 24, положения 25, где указанные положения считают в направлении 5' 3' от первого нуклеотида цепи-пассажира, спаренного с нуклеотидом антисмысловой цепи.
25. РНК-комплекс согласно любому из предыдущих вариантов, где 5'-концы данного комплекса являются фосфорилированными или доступными для фосфорилирования.
26. РНК-комплекс согласно варианту 15, где первая молекула РНК содержит 5'-концевую фосфатную группу и 3'-концевую гидроксигруппу.
27. РНК-комплекс согласно варианту 15, где вторая молекула РНК содержит 5'-концевую фосфатную группу и 3'-концевую гидроксигруппу.
28. РНК-комплекс согласно любому из предыдущих вариантов, где РНК-комплекс содержит нуклеотидные аналоги.
29. РНК-комплекс согласно варианту 28, где антисмысловая цепь содержит нуклеотидные аналоги.
30. РНК-комплекс согласно варианту 28, где цепь-пассажир содержит нуклеотидные аналоги.
31. РНК-комплекс согласно вариантам 28-30, где первая и вторая молекулы РНК цепи-пассажира содержат нуклеотидные аналоги.
32. РНК-комплекс согласно любому из вариантов 28-31, где нуклеотидные аналоги выбраны из группы, состоящей из 2'-О-алкил-РНК-мономеров, 2'-амино-ДНК-мономеров, 2'-фтор-ДНК-мономеров, ΕΝΑ-мономеров, ΡΝΑ-мономеров, ΙΝΑ-мономеров.
33. РНК-комплекс согласно любому из вариантов 1-32, который обладает меньшим нежелательным действием, чем нативный РНК-комплекс, содержащий немодульную цепь-пассажир.
34. РНК-комплекс согласно любому из вариантов 1-32, который продуцирует меньший иммунный ответ, чем нативный РНК-комплекс, содержащий немодульную цепь-пассажир.
35. РНК-комплекс согласно любому из вариантов 1-32, который обладает более пролонгированным действием на нуклеиновые кислоты-мишени, чем РНК-комплекс, содержащий немодульную цепьпассажир.
36. РНК-комплекс согласно любому из вариантов 1-32, который обладает усиленным действием на
- 30 015563 нуклеиновые кислоты-мишени по сравнению с РНК-комплексом, содержащим немодульную цепьпассажир.
37. Способ получения РНК-комплекса согласно любому из вариантов 1-3 6, включающий инкубирование антисмысловой цепи с цепью-пассажиром в условиях, которые способствуют образованию РНКкомплекса, содержащего коровую двухцепочечную область, где указанный РНК-комплекс способен опосредовать РНК-интерференцию соответствующей клеточной РНК.
38. Способ опосредования модификаций нуклеиновой кислоты-мишени в клетке или в организме, где указанный способ включает стадии:
a) контактирования указанной клетки или организма с РНК-комплексом согласно любому из вариантов 1-36, в условиях, при которых может происходить специфическая модификация нуклеиновой кислоты-мишени;
b) опосредования, тем самым, специфической модификации нуклеиновой кислоты-мишени, регулируемой антисмысловой цепью РНК-комплекса.
39. Способ согласно варианту 38, где указанный способ осуществляют ίη νίίτο.
40. Способ согласно варианту 39, где указанный способ осуществляют в выделенной клетке.
41. Способ оценки функции гена в клетке или в организме, включающий в себя:
a) введение в клетку или организм РНК-комплекса согласно любому из вариантов 1-36, направленного на мРНК в целях осуществления ее деградации и, тем самым, продуцирование исследуемой клетки или исследуемого организма;
b) поддержание исследуемой клетки или исследуемого организма в условиях, при которых происходит деградация мРНК данного гена и, тем самым, продуцирование тестируемой клетки или тестируемого организма, имеющих пониженные уровни мРНК данного гена;
c) наблюдение фенотипа исследуемой клетки или исследуемого организма, продуцированных на стадии Ь, и, необязательно, сравнение наблюдаемого фенотипа с фенотипом соответствующей контрольной клетки или контрольного организма и, тем самым, получение информации о функции данного гена.
42. Способ согласно варианту 41, применяемый для того, чтобы определить, является ли данный генный продукт подходящей мишенью для терапевтического лечения конкретного заболевания.
43. Способ согласно вариантам 41 и 42, где указанный способ осуществляют ίη νίίτο.
44. Способ согласно варианту 43, где указанный способ осуществляют в выделенной клетке.
45. Способ оценки действия данного средства на генный продукт, где указанный способ включает в себя стадии:
a) введения РНК-комплекса согласно любому из вариантов 1-36, направленного на мРНК в целях осуществления ее деградации или и, тем самым, продуцирования исследуемой клетки или исследуемого организма;
b) поддержания указанной исследуемой клетки или исследуемого организма в условиях, способствующих деградации мРНК гена и, тем самым, продуцирования исследуемой клетки или исследуемого организма, имеющих пониженные уровни мРНК данного гена;
c) введение указанного средства в исследуемую клетку или исследуемый организм;
б) наблюдения фенотипа исследуемой клетки или исследуемого организма, продуцированных на стадии с, и, необязательно, сравнение наблюдаемого фенотипа с фенотипом соответствующей контрольной клетки или контрольного организма и, тем самым, получения информации о действии данного средства на генный продукт.
46. Способ согласно варианту 45, где указанный способ осуществляют ίη νίίτο.
47. Способ согласно варианту 46, где указанный способ осуществляют в выделенной клетке.
48. Фармацевтическая композиция, содержащая РНК-комплекс согласно вариантам 1-36 и фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель или адъювант.
49. РНК-комплекс согласно любому из вариантов 1-36, используемый в качестве лекарственного препарата.
50. Применение РНК-комплекса согласно любому из вариантов 1-36 для опосредования модификации нуклеиновой кислоты-мишени под действием нуклеиновой кислоты, соответствующей данной нуклеиновой кислоте-мишени.
51. Применение согласно варианту 50, где указанная модификация нуклеиновой кислоты выбрана из группы, состоящей из интерференции РНК и метилирования ДНК.
52. Применение согласно варианту 51, где интерференция РНК опосредует деградацию РНКмишени или ингибирование трансляции РНК-мишени или их комбинации.
53. Применение согласно любому из вариантов 50-52, не вызывающее серьезных побочных действий.
54. Применение согласно любому из вариантов 50-52, не вызывающее продуцирования значительного интерферонового ответа.
55. Применение РНК-комплекса согласно любому из вариантов 1-36 в целях диагностики или прогноза заболевания.
- 31 015563
Примеры
Экспериментальная часть:
^NΛ-олигонуклеотиды могут быть получены и очищены методами, описанными или указанными в РСТ/0К2006/000512 или №02005/073378.
Олигонуклеотиды были синтезированы стандартными методами синтеза РНК и Ь^А.
^NΛ представляет собой олигонуклеотид, содержащий один или несколько 2'-О,4'-С-метиленсвязанных рибонуклеотидов (^NΛ-нуклеотидов) [М. Ре1ег§еп; 1 №епде1, Тгепбк Вю1ее11по1. 2003, 21, 7481].
^NΛ-модифицированная РНК представляет собой РНК-цепь, содержащую один или несколько 2'О,4'-С-метилен-связанных рибонуклеотидов (^NΛ-нуклеотидов).
^NΛ-модифицированная киРНК (8^^NΛ) представляет собой киРНК-конструкцию, содержащую один или несколько 2'-О,4'-С-метилен-связанных рибонуклеотидов (^NΛ-нуклеотидов).
Конструкции
Клеточная линия рака легких человека Н1299, продуцированная в целях стабильной экспрессии ЕСРР (время полужизни ЕСРР составляет 2 ч), была получена в дар от Όγ. Аппе СНаисНегеаи (САКН, УП1е]шГ. Франция). Две репортерных конструкции рКОапШепкебагде! и р18О?,е||?,е-|,||де1. были сконструированы путем гибридизации эквимолярных количеств нижеследующих ДНК-олигонуклеотидов: 5'СССΛССТαСССССΛСΛΛСТТС-3' (8 ЕЕ) ГО ^:29) и 3'-ТССАСССТССАТТТСССССТСТТСААССАТС-5' (8Е0 ГО NО:30) (антисмысловая мишень) или 5'-СТАССССАССТαСССССΛСΛΛСТТСΛССТ-3' (8 ЕС) ГО ^:31) и 3'-СССТССАТТТСССССТСТТСААС-5' (8 ЕС) ГО NО:32) (смысловая мишень) с 8ас1/А2ЬеГгидролизованной конструкцией р18О (любезно предоставленной Όανίά Ваг1е1) (Ье^18, В.Р. е) а1., (2003) Се11, 115, 787-798), локализованной ниже последовательности, кодирующей люциферазу светляка.
Получение олигонуклеотидов ^NΛ-модифицированные РНК-олигонуклеотиды получали на автоматизированном синтезаторе ДНК, как описано в литературе (8тдй, 8. К. аиб №еиде1, 1 (1988) СЬет. Соттип. 1247-8.
Синтез производных Νυ-2 (через Νυ-1) осуществляли в целях введения в РНК адамантил-амино^NΛ-МОНОМера аТ (фиг. 18) на автоматизированном синтезаторе с использованием амидита Νυ-2 и с применением стандартных методов, описанных в литературе (8тдЬ, 8. К. апб №епде1, 1 (1988) СЬет. Соттип. 1247-8).
A. Синтез (1К,3К,4К,78)-1 -(4,4'-диметокситритилоксиметил)-7-гидрокси-5-( 1 -адамантилметилкарбонил)-3-(тимин-1-ил)-2-окса-5-азабицикло[2.2.1]гептана (Νυ-1). Ν-ацилирование исходного нуклеозида (572 мг, 1,0 ммоль) (М1с1ео51бе 3Г ш 80^еи8еи, М. Ό., Ре1ег8еп, М. апб №епде1, 1 (2003) СЬет. Соттип. 2130-1) 1-адамантан-уксусной кислотой (233 мг, 1,2 ммоль) осуществляли в присутствии Е0С-НС1 (230 мг, 1,2 ммоль) в безводном СН2С12 (10 мл) . После перемешивания при комнатной температуре до полного завершения реакции (~6 ч), реакционную смесь разбавляли СН2С12, промывали насыщенным водным №НСО3 (два раза), и объединенные органические фазы сушили (№28О4), фильтровали и концентрировали досуха при пониженном давлении. Остаток, полученный после процедуры обработки, очищали колоночной хроматографией (80-95% ЕЮАс в петролейном эфире, об./об.), в результате чего получали ротамерную смесь (~1:1, !Н-ЯМР) нуклеозида Νυ-1 (680 мг, 91%) в виде белого твердого вещества.
Ή-ЯМР (СПС13) δ: 7,66 (с, 1Н), 7,63 (с, 1Н), 7,48-7,44 (м, 4Н), 7,37-7,20 (м, 14Н), 6,85-6,81 (м, 8Н), 5,53 (с, 1Н), 5,44 (с, 1Н), 5,14 (с, 1Н), 4,65 (с, 1Н), 4,35 (с, 2Н), 3,77 (с, 12Н), 3,61-3,42 (м, 8Н), 2,29 (д, I = 13,8 Гц, 1Н), 2,18 (д, I = 13,9 Гц, 1Н), 1,97 (д, 1=5,6 Гц, 1Н), 1,93-1,89 (м, 9Н), 1,73-1,60 (м, 28Н);
13С-ЯМР (СПС13) δ: 171,4, 171,3, 164,7, 164,5, 158,7, 158,6, 150,3, 149,8, 144,5, 135,6, 135,5, 135,4, 135,3, 135,1, 134,9, 130,2, 130,1, 128,2, 128,0, 127,1, 113,4, 110,3, 110,0, 88,9, 88,1, 87,5, 87,2, 86,7, 70,2, 68,6, 64,4, 61,6, 59,6, 59,3, 55,2, 53,5, 51,3, 47,6, 47,4, 42,8, 37,1, 36,8, 36,7, 33,8, 33,5, 28,9, 28,7, 28,6, 12,6; МАСЫ-ШАА: т/ζ 770,3396 ([М+№]+, СН Е^ОЛа': вычислено 770,3417).
B. Синтез (1В,3В,4В,78)-7-(2-цианоэтокси(диизопропиламино)фосфинокси)-1-(4,4'-диметокситритилоксиметил)-5-(1-адамантилметилкарбонил)-3-(тимин-1-ил-2-окса-5-азабицикло [2.2.1]гептана (Νυ2).
2-цианоэтил-^№диизопропилфосфорамидохлоридит (247 мг, 1,04 ммоль) по каплям добавляли к перемешанному раствору нуклеозида Νυ-1 (650 мг, 0,87 ммоль) и ^№(диизопропил)этиламина (1,0 мл) в безводном СН2С12 (10 мл). После перемешивания в течение 14 ч при комнатной температуре реакционную смесь разбавляли СН2С12 (50 мл) . Органическую фазу промывали насыщенным водным NаНСО3 (2x50 мл), сушили (№28О4), фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток очищали колоночной хроматографией (50-60% ЕЮАс в н-гексане, об./об.) с получением нуклеозид-амидита Νυ-2 (685 мг, 83%) в виде белой пены. 31Н-ЯМР (СЭС13) δ: 151,1, 151,0, 150,7, 149,4; НАЕА-ШАА: т/ζ 970,4457 ([М+№]+, СНЕАСОРАа': вычислено 970,4496).
Введение пирениламино-^NΛ-МОНОМера рТ в РНК (фиг. 18) на автоматизированном синтезаторе осуществляли, как описано в литературе (80^еи8еи, М. Ό., Ре1ег8еп, М. апб №епде1, Р (2003) СЬет. Сот
- 32 015563 тип. 2130-1).
В данном исследовании были использованы следующие олигонуклеотиды:
киРНК-контроль:
киРНК ЕСГР
ЗЕО Ю N0:1 5'-САССиАААСССССАСААСииС зео ю N0:2 з' -сссиссдотисссссисиисл киРНК с несоответствиями
ЗЕО Ю N0:3 5'-бАСОиАСАСиСАСАСААСииС зео ю N0:4 з'-сссисддисисдсисисиис киРНК-ВСК-АВЪ
ЗЕО 10 N0:5 5'-ССАСАСииСААААССССииии зео ю N0:6 3'-ииссисисААсиииососоАД
Смысловые олигонуклеотиды:
ЗЕО Ю N0:7, также обозначаемый Н004: 5'-ОАС^СЗААДС^б
ЗЕО
N0:8, также обозначаемый
И005:
5'ССС^АС^ААОТТ’Ч^и
3Ε0
N0:9, также обозначаемый
И037:
5'САС'“ьСиАААСмьСССС№ьАС^ьААСиТьСмв1,и
ЗЕО
N0:10, также обозначаемый
ЛЯ1106:
САСИвЬ<ЗиАААСМв1'0СССАСм’1,ААбиТьС>й1'и
5Е0 Ю N0:11, также обозначаемый И034: 5'-ЕАСИ*ЬСОАААСИЛСС
ЗЕО
N0:12, также обозначаемый
Н035:
5' ссИаьдсм*1,ДАсит1,сМа1,о
ЗЕО Ю N0:13, также обозначаемый И036: 5 ’ - БССИе1,АСМ81ААСиТ1,С
ЗЕО Ю N0:14, также обозначаемый И040: 5'- САССО АААСС
ЗЕО Ю N0:15, также обозначаемый И041: 5'-ессАСААсииси
ЗЕО Ю N0 :17, также обозначаемый ОИ1105: 5'-
<ЗАьсб1,иАААссдссАСААеитьсМв1,и
Антисмысловые олигонуклеотиды
ЗЕО также обозначаемый
ЛИ1103:
5' АсиисисосссиииАсзис^с^о
ЗЕО
N0:18, также обозначаемый
МОЮ:
АС1ьистьссссоиитЪ\сст1'сс^’’Ч1
Другие олигонуклеотиды
ЗЕО 10 N0: 19 И006 СРР1-а АсиисисссссиииАСбисб1^”·1^
ЗЕО ю N0:20 И038_ _СЕР1-з САС^СЦАДАС^С
ЗЕО 10 N0:21 ИО 39 СЕР1-5 сссмАСиАасирсми
ЗЕО 10 N0:22 И056_ _СЕР1-3 6АС£СиАААС£С
ЗЕО ю N0:23 И057 СГР1-3 ссс£дс£Адсит£сси
ЗЕО 10 N0:24 И058_ _СГР1-з ссс£АСААсит£с£и
ЗЕО 10 N0:25 И074_ _СЕР1-а Асиисиссссс(лл1АСсосе1'с
5Е0 ю N0:26 И075_ _СГР1-а дсиисисзсссииидсбис^е^
ЗЕО 10 N0:27 И038_ _СГР1-з САСЛзиДААС^С
ЗЕО ю N0:28 И039 СГР1-3 сссмАсиААсиимсни
Короткие цепи квсиРНК для многоцепочечной цепи-пассажира:
- 33 015563
Две короткие цепи для использования с УИОО4:
5ЕО Ю N0:33 УУ141 5'-СС^ С АС1**1—
5Е0 ΙΡ N9:34 1Ν142
Три короткие цепи, испсльзуевь» вместо Ш004-ИЛЮ05
5Е0 ГО_Ы9:35 9/143 8,-5АСн¥гаТкА
₽Е0 ΙΡ Мр;3$ ν/144 5’-αα£^ се!:с с
УП45 5'-дсме|· аас1· иТ-с*1 и
Короткие цепи, используемые в мсследованияхТт и являющиеся родственными квсиРНК-конструкциям:
5Е0 ГО N0:38 ν/146 Б'-САС СОА
5Е0 ГО N0:34 №147 В'-САС1· СОА
5Е0 ГО ΝΟ 40 9/148 Б'-САС
аеаюал 91/149 5'-6дс^ сН+а
СЕО ГО N0:42 9/150 б'-й^ас сид
5ЕО Ю N0:43 9/151 б'-сас сил!:
А037 соответствует варианту А004 и А005 с непрерывной последовательностью. А034 и А035 представляют собой вариант пары А004 и А005. где ник смещен на одно положение в направлении 3'конца. А040 и А041 представляют собой РНК-варианты А004 и А005. А036 является эквивалентным А005, но не содержит 3'-концевого остатка и.
А004 представляет собой 5'881, А005 представляет собой 3'881, А037 представляет собой 881, А034 представляет собой 5'-8$3, А035 представляет собой 3'-883, А036 представляет собой 3'-885, а ΙΑ1103 представляет собой А81.
Строчная буква Ь в надстрочном индексе указывает на то, что данный остаток представляет собой ЬЫА-нуклеотид.
Строчные буквы МеЬ в надстрочном индексе указывают на то, что данный остаток представляет собой Ь-ΝΑ-нуклеотид с 5-метилцитозиновым основанием.
Заглавная буква М в надстрочном индексе указывает на то, что данный остаток представляет собой 2'-ОМе-нуклеотид.
Строчная буква ί в надстрочном индексе указывает на то, что данный остаток представляет собой 2'-фтор-нуклеотид.
Терапевтические квсиРНК-комплексы, используемые в композициях согласно изобретению:
квсиРНК АроВ-1 ЗЕ<2ГО:52 ΞΕςΐϋ:53 5Е(} 10:54 5,-бисн<|-Аисм<:|'САС- з7 Б'-ие^ААЦАС^ААЦ - 0-3' з'-сАС^Ас^^АбисисАС^ШАиб^иА-Б'
квсиРНК АроВ-1 ЗЕр Ю:55 5Е<2 ГО: 56 5Е0 ГО: 57 5' сис^дис^сАС- з' 5,-Ц6м*|,ААиАСМе1'ААи - 0-3' з'-САС^сиАсиоиСАсииАиеииА-Б'
квсиРНК АроВ-2 5Е<^Ю:58 5Е(2 ГО:59 ЗЕС5 ГО 60 5'- Аби<1-бМвЧ1биАиабТз' 5 '-сииссНе1ААССМе1-сисс1 - з' з'-ис№>1исм<|-САСАиАсссААсн*иибссм*АС-5'
квсиРНК АроВ-2 5Е0ГО61 5Е<2 ГО. 62 5Е(} 10:63 Б'-дсМе1-бм*1исиАис -з' 5'-б^сиис^ААС£2^си(3-с1 - з' з'-ис^^с^сАс^иАса^сиибссАс-Б'
квсиРНК суреиаина 1 5Ες ГО64 5Е<2ГО:65 5 Ер 10:66 .Б'-ссм<;|-АиисМсксисМе1с-3' э'-ве^иисс^сиии-а-з1 3'- ииС^иААе^САССССААССССА-Б'
квсиРНК сурвивина 2а 5Е<2 10:67 5ЕС2 ГО68 ЗЕО ГО: 69 5'-иии£^исАй^си-з' 5'-ссАбВе1-оиисНс1-ии -а-3' з'-А^^А<^иссАсаиссААСбии-5'
квсиРНК сурвивина 2Ь 5ЕС? ГО: 70 5Ες 10:71 3Ε(2Πλ72 5'-ииисНе1ибАСМс<-си-з: ’ 5'-бСА<8и^сиис*ии -а-з' з '-Аб^Ас^исаАсооссдАб^с ии -5Г
где -С1-3' означает 3'-концевой олигонуклеотид, конъюгированный с холестерином.
- 34 015563 квсиРНК-содержащие терапевтические соединения конъюгируют, необязательно, с холестерином у 3'-конца молекулы РНК, такой как первая или вторая цепь-пассажир или антисмысловая цепь.
Фармацевтические композиции согласно изобретению предпочтительно содержат хитозан, который может быть, например, добавлен в виде частиц, полученных с использованием 800 мкл хитозана в 1 мг/мл раствора при рН 5,5, к которому добавляют 200 мкл 0,2 М натрийацетатного буфера при рН 5,5. Комплексы могут быть получены с использованием, например, 2 0 мкл 250 мкМ раствора квсиРНК.
С использованием описанных здесь квсиРНК-конструкций могут быть также получены терапевтические квсиРНК-комплексы, направленные против множества других терапевтических мишеней, например, против мишеней, в которых ранее были использованы киРНК, таких как последовательностимишени, идентифицированные в нижеследующих публикациях:
Сурвивин:
Ве1!гаш1 е! а1., 1. Бю1. СНет., 279, 2077-2084.
Сота, 8. е! а1, ОЛдопис1ео!1бек, 14, 100-113.
Νίιιμ е! а1., 1п!. 1. Опсо1., 25, 1065-1071.
АроВ:
8ои!ксНек, е! а1., №11иге. 432, 173-178.
НГ-1а:
Лапд О е! а1., Еиг. I. Рйагтасо1. 2007 ЕеЬ 8,
Лапд М е! а1., I Уакс Кек. 2006; 43(6):511-21.
Опо Υ е! а1., I Се11 Вюсйет. 2006 .1ип 1; 98(3):642-9.
К-гак:
Сйеп Ь.М. е! а1. , Аог1б 1 Оак!гоеп!его1. 2005 ЕеЬ 14; 11(6):831-8.
к|КНА 8ес.|иепсе:
К1т 1.А, е! а1., Сапсег Кек. 2005 8ер 1; 65 (17) :7902-10.
Вс12:
Мшга Υ е! а1., Арор!ок1к. 2006 Ос!; 11(10): 1825-35.
Трансфекция
Смысловые и антисмысловые цепи смешивали в буфере для отжига (10 мМ Тпк-НС'Т рН 7,3, 50 мМ №1С1) в эквимолярной концентрации 20 мМ и инкубировали при 95°С в течение 1 мин и при 37°С в течение 1 ч. Клетки, используемые для проточной цитометрии, высевали в 6-луночные планшеты и культивировали в среде КРМ1-1640, содержащей 10% ЕВ8, 1% пенициллин/стрептомицин, до 60-80% конфлюентности. Клетки трансфицировали реагентом М1гик Тгапк1Т-ТКО в соответствии с инструкциями производителей. Конечная концентрация РНК-комплекса составляла 10-50 нМ. После инкубирования в течение 24 ч добавляли свежую среду и клетки инкубировали еще 24 ч, а затем проводили анализ РНК и белка. Уровень экспрессии белка ЕОЕР количественно оценивали путем проведения проточного цитометрического анализа приблизительно 5х104 клеток и полученные данные усредняли. Клетки, используемые для нозерн- и вестерн-анализов, высевали приблизительно при 20%-ной конфлюентности и трансфицировали с использованием транфецирующего реагента Вю-Каб 8беп1Гес1 (до конечной концентрации РНК 50 нМ) в соответствии с инструкциями производителей. Через 24 ч к клеткам добавляли свежую среду и клетки инкубировали еще 24 ч, а затем либо снова трансфицировали с использованием липофектамина 2000 (до конечной концентрации РНК 50 нМ) в соответствии с инструкциями производителей, либо собирали для проведения вестерн- или нозерн-анализов. Вестерн-блот-анализ проводили следующим образом: клетки два раза промывали в РВ8, и равное количество клеток подвергали лизису в 2 х ДСН-буфере для образцов [4% додецилсульфат натрия (ДСН), 20% глицерин, 125 мМ трис/НС1, рН 6,8, 0,01 мг/мл бромфенолового синего, 10% р-меркаптоэтанол] при 90°С в течение 2х10 мин, и разделяли путем осторожного пипетирования. Белки разделяли в 12% ДСН-акриламидном геле и в течение ночи подвергали электроблоттингу на ПВДФ-мембране (1ттоЬ11оп). Фильтр в течение 1 ч блокировали РВ8, содержащим 10% (мас./об.) молоко. Белок ЕОЕР детектировали с использованием 1:1000-разведения кроличьего поликлонального антитела против ЕОЕР. Мышиное антитело против йпК№ С1 было любезно предоставлено фирмой БегарЫп Р1по1-Кота. Для визуализации использовали конъюгированное пероксидазой хрена (ПХ) второе антитело (БАКО) вместе с ЭХЛ-реагентом (Атегкйат Вюкаепсек). мРНК ЕОЕР анализировали с помощью нозерн-блоттинга в соответствии со стандартными процедурами.
Количественная оценка мРНК и белка
Экспрессию белка еОЕР анализировали с помощью проточного цитометрического анализа. Вестерн-блот-анализ проводили следующим образом: клетки два раза промывали в РВ8, и равное количество клеток подвергали лизису в 2 х ДСН-буфере для образцов [4% додецилсульфат натрия (ДСН), 20% глицерин, 125 мМ трис/НС1, рН 6,8, 0,01 мг/мл бромфенолового синего, 10% β-меркаптоэтанол] при 90°С в течение 2х10 мин и разделяли путем осторожного пипетирования. Белки разделяли в 8% ДСНакриламидном геле и в течение ночи подвергали электроблоттингу на ПВДФ-мембране (1ттоЬ11оп). Фильтр в течение 1 ч блокировали РВ8, содержащим 10% (мас./об.) молоко. Белок ЕОЕР детектировали с использованием 1:1000-разведения кроличьего поликлонального антитела против ЕОЕР (8ап!а Сгпх Вю
- 35 015563 (ескгюкду). Мышиное антитело против ΗηΚΝΡ С1 было любезно предоставлено фирмой 8е^арЫη Ρίηο1Вοта. Для визуализации использовали конъюгированное с пероксидазой хрена (ПХ) второе антитело (ЭАКО) вместе с ЭХЛ-реагентом (Ашегкйаш В^аемек). мРНК ЕСЕР анализировали с помощью нозерн-блоттинга в соответствии со стандартными процедурами.
Анализ на стабильность
РНК/Ь№А-комплексы инкубировали при 37°С в 10% фетальной бычьей сыворотке (Όί№ο), разведенной в Ό-МЕМ (Όί№ο). 5 мкл образцов собирали в указанные моменты времени и сразу замораживали на сухом льду в 15 мкл загрузочного буфера, содержащего 1,33хТВЕ/10% глицерина, а затем подвергали электрофорезу в неденатурирующем 15% ПААГ. РНК визуализировали с использованием 8ΥΒΚ.-золота (1№Йгодец).
Анализ на интерфероновый ответ киРНК-варианты (80 нМ) или ρο^(ΙΌ) (0,8 мкг/мл) трансфицировали в клетки Т98С с использованием транфицирующего реагента ТгяпНТ-ТКО® (М1гик) в соответствии с инструкциями производителей. Клетки Т98С культивировали в 10% ЕС8 в ЭМЕМ (Όί№ο). Полноразмерную РНК очищали с использованием тризола (^йгодец), обрабатывали ДНКазой и подвергали обратной транскрипции с использованием ο1^дο-άТ-праймеров.
Количественную ПЦР проводили с использованием ПЦР-смеси платины и реагента 8ΥΒΚ®, флуоресцирующего в зеленом диапазоне спектра, с|РСИ-8ирепп1х (1№1!годец), на системе для количественной ПЦР 81га1адег1е Мх3005р. Для амплификации 18С56 использовали праймеры: 5'ААСССАСССТСТССССТТА-3' и 5'-ТССТСТССТТСАТССТСААССТ-3'. Для амплификации САНРН использовали праймеры: 5'-СААССТСААССТСССАСТ-3' и 5'-СААСАТССТСАТСССАТТТС-3'. ПЦР проводили в следующих условиях: 1 цикл: 95°С, 10 мин, 40 циклов: 95°С, 30 с, 55°С, 1 мин, 72°С, 30 с, 1 цикл: 95°С, 30 с, 55°С, 1 мин, 95°С, 1 мин. Оценку относительных уровней мРНК проводили с применением АДСТ-метода. Эксперименты проводили с тремя повторностями, и уровни 18С56 для киРНКобработанных клеток нормализовали по ТгаггиТ-ТКО-обработанному контролю.
Анализ с использованием двух люцифераз
Клетки Н1299 высевали в 6-луночные планшеты со средой ВРМ1, в которую была добавлена 10% фетальная бычья сыворотка, и культивировали на этой среде до 40-60% конфлюентности.
р^Оа^^^е-й^е! И р18О8ег18е-1агде1 (1 МКГ) котрансфицировали 0,002 мкг рВ1ис-№2 (РегкшЕ1тег) и киРНК-дуплексами (до конечной концентрации 10 нМ) с одновременным использованием 6 мкл ТяпИТ-ЬТ (Миик) и 6 мкл Тгяпк1Т-ТКО (М1гик) в соответствии с протоколом производителей. Анализ с использованием двух люцифераз проводили в течение 48 ч после трансфекции с использованием аналитической репортерной системы с двумя люциферазами (Ргошеда) в соответствии с протоколом производителей. Люциферазную активность измеряли на люминометре Ьиша! ЬВ 950 (Вег11ю1б) и нормализовали по сигналу люциферазы Веш11а.
Пример 1. Получение тримерного РНК-комплекса, обладающего высокой стабильностью в сыворотке
Короткая внутренне сегментированная интерферирующая РНК (квсиРНК) представляет собой дуплекс, содержащий прерывистую антисмысловую цепь и непрерывную антисмысловую цепь. Авторами настоящего изобретения была впервые проанализирована квсиРНК-конструкция, состоящая из антисмысловой цепи, содержащей два Ь№А-остатка, расположенных возле 3'-конца Ц№1103), и прерывистой цепи-пассажира, содержащей две молекулы РНК: №004, то есть молекулы РНК длиной в 10 нуклеотидов, содержащей два Ь№А-остатка, и №005, то есть молекулы РНК длиной в 12 нуклеотидов, содержащей три Ь№А-остатка.
Е№А-модифицированная квсиРНК была значительно более стабильной в 10% сыворотке, чем стандартная киРНК (еСЕРкиРНК), которая быстро укорачивалась на несколько нуклеотидов в течение нескольких часов, а затем разлагалась в течение 1-2 дней (фиг. 7, см. верхнюю панель). В противоположность этому после 5-дневного инкубирования наблюдалось лишь очень небольшое уменьшение размера квсиРНК, на что указывало удаление 3'И-остатка у 3'-конца №005 (фиг. 7, см. нижнюю панель). Поскольку этот и был добавлен как дополнительный немодифицированный нуклеотид только для облегчения синтеза, то такое удаление должно приводить лишь к усилению действия квсиРНК. При сравнении квсиРНК с обычной Ь№А-модифицированной конструкцией (к1Е№А, содержащей ί№1103 и ί№1106; фиг. 7, средняя панель), не содержащей ника в смысловой цепи, общая стабильность оставалась неизменной, хотя обычная к1Ь№А давала немного более короткий продукт деградации. Конкретная причина такого различия в изменении подвижности пока еще точно не установлена.
Пример 2. РНКи-активность квсиРНК киРНК, содержащая смысловую цепь с одноцепочечныи разрывом (ником), является полностью функциональной: конструкции, полученные с использованием стандартной киРНК и неродственной контрольной киРНК, были протестированы путем их трансфекции в клеточную линию карциномы легких Н1299, стабильно экспрессирующую дестабилизированный ЕСЕР. Затем проводили мониторинг уровня экспрессии мРНК ЕСЕР и белка ЕСЕР с помощью флуоресцентной микроскопии, нозерн-блот-анализа,
- 36 015563 вестерн-блот-анализа и проточной цитометрии. Обработка клеток 50 нМ ЬЫА-модифицированной квсиРНК или киРНК приводила к сравнимому 10-кратному ингибированию через 48 ч. Отсутствие одной или обеих коротких смысловых цепей (5'881 или 3'881) приводило к элиминации активности квсиРНК, что позволяет предположить, что активность ЬЫА-модифицированной квсиРНК строго зависит от присутствия всех трех цепей. Следовательно, непродолжительные исследования показали, что квсиРНКконструкция обладала такой же высокой эффективностью в отношении сайленсинга, как и стандартные киРНК.
Для предотвращения включения смысловой цепи в активированный В18С авторами настоящего изобретения была использована новая конструкция киРНК, отличающаяся тем, что она содержит интактную антисмысловую цепь, комплементарную двум более коротким смысловым цепям. Авторы настоящего изобретения предполагают, что при введении ЬЫА-нуклеотидов в такую конструкцию из трех молекул можно достичь достаточной стабильности и структурной мимикрии дцРНК, и тем самым, обеспечить активность РНК-интерференции. Авторами настоящего изобретения была сконструирована квсиРНК, состоящая из смысловой цепи длиной в 10 и 12 нуклеотидов и направленная против предварительно установленной функциональной мишени в мРНК, кодирующей активированный белок, флуоресцирующий в зеленом диапазоне спектра (ЕОРР). Для стабилизации квсиРНК-конструкции авторами настоящего изобретения была включена Ь-Ν А в двух и в четырех положениях в смысловых 5'- и 3'половинах цепей, соответственно, и возле 3'-конца антисмысловой цепи, а затем из этих трех цепей была создана конструкция (IV1103, ν004 и ν005). квсиРНК, содержащая антисмысловую цепь и прерывистую цепь-пассажир (ΐν1103, ν004 и ν005), полностью сохраняла свою активность, на что указывало визуальное наблюдение экспрессии еОРР в клетках (фиг. 8), и свою способность ингибировать белок ЕОРР (фиг. 9 А) и мРНК еОРР (фиг. 9В; дорожки 1-6).
Важно отметить, что поскольку удаление ν004 или ν005 или обеих этих молекул из комплекса приводит к полной элиминации интерферирующей активности как на уровне экспрессии мРНК, так и на уровне экспрессии белка, то, очевидно, что необходимо присутствие обеих смысловых цепей (двух молекул РНК, составляющих прерывистую цепь-пассажир) (фиг. 8 и 9).
Для оценки эффективности ^NА-модифицированной квсиРНК и стандартных киРНК в отношении пролонгированного ингибирования клетки повторно трансфицировали через 48 ч и собирали через 120 ч (5 дней) или 180 ч (7,5 дней). Через 120 ч в киРНК-обработанных клетках восстанавливался 50%-ный уровень экспрессии мРНК ЕОРР и некоторый уровень экспрессии белка ЕОРР (фиг. 9В). В противоположность этому клетки, обработанные ^NА-модифицированной квсиРНК, сохраняли низкий уровень экспрессии мРНК и белка ЕОРР (фиг. 9 и 10). Даже через 180 ч в клетках, обработанных ^NАмодифицированной квсиРНК, еще наблюдался значительный уровень ингибирования экспрессии ЕОРР, тогда как в клетках, обработанных стандартной киРНК, уровень экспрессии ЕОРР полностью восстанавливался (фиг. 10А). Следовательно, квсиРНК, по сравнению с со стандартными киРНК, обладала пролонгированной сайленсинг-индуцирующей активностью в клеточной культуре.
Пример 3. Сравнение активности квсиРНК с активностью других киРНК/^NА-конструкций
Для анализа эффективности квсиРНК, проводимого авторами настоящего изобретения в целях сравнения с эффективностью стандартной киРНК/^NА, клетки НТ1092 были трансфицированы конструкцией квсиРНК, двумя к^^NА-конструкциями (ΐν1103+ΐν1105 и ΐν1103+ΐν1106), которые, как было ранее установлено, являются в высокой степени активными к^^NА-конструкциями, и стандартной киРНК.
Эффективности квсиРНК, к^^NА и нормальной киРНК были почти аналогичными, и все они обнаруживали 80-90%-ное ингибирующее действие при концентрациях 10-50 нМ (фиг. 11А).
Для того чтобы определить, существует ли какое-либо различие в их активности при более низких концентрациях, дуплексы использовали в концентрациях 10 пМ - 100 нМ. Кроме того, был включен непрерывный дуплекс (1\У1103 и ν037), содержащий ^NА-модификацию, идентичную ^NА-модификации квсиРНК. И в этом случае каких-либо явных различий в РНКи-активности не наблюдалось (фиг. 11В). Интересно отметить, что все дуплексы, при их использовании в очень низких концентрациях (10 пМ), обнаруживали примерно 50% ингибирующую активность.
Пример 4. Оптимизация квсиРНК-конструкции
Для оценки гибкости в квсиРНК-конструкции авторами настоящего изобретения была протестирована серия различных конструкций смысловых и антисмысловых цепей.
С использованием немодифицированных прерывистых смысловых РНК, ν040 и ν041, соответствующих ν004 и ν005, соответственно, был получен комплекс, который индуцировал РНКи-активность, хотя и в несколько меньшей степени, чем с использованием ^NА-модифицированной квсиРНК (см. столбцы 1 и 2 на фиг. 12).
Смещение ника в смысловой цепи квсиРНК на один нуклеотид в сторону 3'-конца (конструкция 11+11) не оказывало негативного влияния на РНКи-активность (столбец 5, фиг. 12).
По техническим соображениям, в данном синтезе, дополнительный И-остаток был помещен у 3'конца ν005. Для того чтобы определить, влияет ли такой остаток на активность РНК-комплекса, был синтезирован новый олигонуклеотид без концевого И-остатка (ν036). Такая модификация не оказывала
- 37 015563 значительного влияния на активность данной конструкции (столбец 4. фиг. 12).
б^У1103 содержит только 2 ΕΝΑ-остатка. расположенных возле 3'-конца. так как авторами настоящего изобретения ранее было обнаружено. что экстенсивная модификация антисмысловой цепи сильно влияет на РНКи-активность. Для того чтобы определить. может ли присутствие прерывистой смысловой цепи влиять на требования. предъявляемые к антисмысловой цепи с ограниченным числом модифицированных нуклеотидов. авторами настоящего изобретения была протестирована та же самая серия смысловых цепей с высокомодифицированной антисмысловой цепью. которая содержит 6 ΕΝΑ-остатков (\У010). Эта антисмысловая цепь является. по существу. неактивной при ее спаривании с непрерывной модифицированной смысловой цепью (\У037; столбец 8. фиг. 12).
Интересно отметить. что это требование является менее строгим. если используется прерывистая смысловая цепь. где наблюдается лишь приблизительно двухкратное снижение эффективности ингибирования (ср. столбцы 6. 7. 9 и 10 с 1. 2. 4 и 5. соответственно; фиг. 12).
Таким образом. при применении прерывистой цепи-пассажира. можно использовать потенциально более стабильную антисмысловую цепь с большим числом ΕΝΑ-остатков.
Пример 5. Иммунный ответ квсиРНК
Химические модификации нуклеиновых кислот могут оказывать сильное влияние на клеточный иммунный ответ в клеточных культурах и у животных. Для анализа иммуногенных свойств квсиРНКконструкций авторы настоящего изобретения трансфицировали клеточную линию человеческой глиобластомы Т98С с использованием 80 нМ различных киРНК-конструкций и определили уровень индуцирования 18С56. который подвергается активному индуцированию под действием ΙΕΝ типа I и дцРНК. РКК-опосредуемое индуцирование 18С56 после трансфекции киРНК ранее наблюдалось в клетках Т98С. однако каких-либо значимых различий в индуцировании 18С5 6 для δίδίΕΝΑ. δίΕΝΑ и немодифицированной киРНК не наблюдалось (фиг. 13). В отличие от этого. индуцирование 18С56 полинуклеотидом ро1у(1/С) было выше в несколько сотен раз. Авторами настоящего изобретения был сделан вывод. что квсиРНК не индуцирует интерферон-альфа на каком-либо значимом уровне при концентрации киРНК 80 нМ.
Пример 6. Снижение побочных эффектов
Прерывистость рассматриваемой цепи-пассажира. вероятно. способствует предотвращению ее включения в комплекс К18С. Для проверки этой гипотезы последовательность ЕСЕР-мишени встраивали либо в смысловой. либо в антисмысловой ориентации в 3'-иТК люциферазной репортерной конструкции (фиг. 14). Эта стратегия позволила авторам проанализировать эффект ингибирования. вызываемый введением цепи-пассажира. Как и предполагалось. δίδίΕΝΑ-конструкция была значительно более специфической. чем эквивалентные киРНК- и δίΕΝΑ-дуплексы. Экспрессия люциферазы из мРНК. содержащей смысловую ЕСЕР-мишень. снижалась под действием квсиРНК более чем в 8 раз по сравнению с экспрессией под действием мРНК. содержащей обратную мишень. Для сравнения. отличия в δίΕΝΑ и киРНК примерно в 3 раза наблюдалось только у двух конструкций. Такое увеличение специфичности явилось полной неожиданностью. если учесть. что последовательность ЕСЕР-мишени. используемая в этом исследовании. соответствовала коммерчески доступной киРНК ЕСЕР. поставляемой фирмой БНагшасоп и удовлетворяющей большинству законов термодинамики для оптимальной мишени. Для того чтобы определить. может ли субоптимальная цепь-пассажир вступать в какой-либо каскад реакций К18С. была синтезирована новая ΕΝΑ-модифицированная квсиРНК. содержащая интактную цепь-пассажир и антисмысловую цепь с ником (δίδίΕΝΑϊΌνΌΐ^). а затем она была протестирована на способность ингибировать мРНК. содержащую прямую и обратную мишень. Хотя предпочитаемость мишени не является полностью обратимой. однако δίδίΕΝΑ^^. по сравнению с любыми другими киРНК-конструкциями. обнаруживала наиболее сильное ингибирование (50%) транскриптов. содержащих обратную мишень. и была. по меньшей мере. активной по отношению к смысловой мишени (фиг. 14). Полученные данные ясно продемонстрировали. что квсиРНК является значительно более специфичной по отношению к рассматриваемой мишени.
Пример 7. Стабильность в 80% сыворотке
Стабильность киРНК. квсиРНК и δίΕΝΑ была дополнительно протестирована путем инкубирования в 80% ЕС8 (фиг. 15). Обе квсиРНК и δίΕΝΑ обладали более высокой стабильностью в сыворотке. чем немодифицированная киРНК.
Пример 8. Положение и размер ника в смысловой цепи квсиРНК
Для дополнительной оптимизации конструкции квсиРНК авторами настоящего изобретения была протестирована серия различных смысловых и антисмысловых цепей. В одном из экспериментов положение гэпа в смысловой цепи смещалось либо на одно положение в направлении 5'-конца (Α81 + 5'884 + 3'884; квсиРНК9+13). где такое смещение в начале эксперимента сообщалось для природного сайта расщепления в К18С. либо на одно положение в направлении 3'-конца (Α81+5'883+3'883;
квсиРНК11+11). Для квсиРНК11+11-конструкции наблюдалось лишь небольшое снижение уровня сайленсинга. а квсиРНК9+1з-конструкция обнаруживала несколько меньшую эффективность в отношении сайленсинга генов (фиг. 16А). Увеличение размера гэпа в смысловой цепи на 1-2 нуклеотида приводило к резкому снижению активности квсиРНК независимо от положения гэпа (данные не приводятся). Следо
- 38 015563 вательно, квсиРНК10+12-конструкция оказалась наиболее эффективной среди всех протестированных квсиРНК. Для облегчения химического синтеза была сначала сконструирована цепь 3'881, содержащая дополнительный И-остаток у 3'-конца. Для того чтобы определить, влияет ли такой остаток на активность квсиРНК, 3'885 синтезировали без этого концевого И-остатка (3'885). Такая модификация не оказывала значительного влияния на активность данной конструкции (ср. столбцы 2 и 4, фиг. 16В).
Пример 9. Прерывистость смысловой цепи полностью подавляет ее активность как ведущей цепи
Для того чтобы определить, приводит ли прерывистость рассматриваемой смысловой цепи к предотвращению ее участия в сайленсинге генов, авторами настоящего изобретения была встроена последовательность ЕСЕР-мишени для антисмысловой или смысловой цепи киРНКеорр в 3'-ИТР люциферазной репортерной конструкции (фиг. 17). Эта стретегия позволяет авторам дифференциально оценивать эффект ингибирования, обусловленный включением антисмысловой цепи и смысловой цепи. Как и предполагалось, ΕΝΑ-модифицированная квсиРНК-конструкция была гораздо более специфичной, чем эквивалентные киРНК- и ΕΝΑ-модифицированные киРНК-дуплексы, поскольку в присутствии конструкции смысловой цепи со стандартной киРНК постоянно наблюдалось приблизительно 50% ингибирование (столбцы 1 и 2, фиг. 17). В противоположность этому, квсиРНК-конструкция полностью блокировала сайленсинг смысловой мишени по сравнению с контролем с несоответствиями, который не препятствовал сильному ингибированию, опосредуемому антисмысловой цепью (столбец 3, фиг. 17). Для оценки возможности предотвращения функции сайленсинга какой-либо другой оптимальной антисмысловой цепи с ником, авторами была проанализирована другая ΕΝΑ-модифицированная квсиРНК с интактной смысловой цепью и с прерывистой антисмысловой цепью (5'Α82, 3'Α82, 883) на ее способность ингибировать антисмысловые и смысловые мишени. Эта конструкция полностью предотвращала сайленсинг антисмысловой мишени, но сохраняла сайленсинг смысловой мишени на уровне, сравнимом с уровнем сайленсинга стандартной киРНК (столбец 4, фиг. 17). В целом, эти данные со всей очевидностью указывают на то, что квсиРНК-конструкция обладает гораздо большей специфичностью к рассматриваемой мишени, чем обычная киРНК-конструкция.
Пример 10. Конструкция квсиРНК толерантна к более высоким уровням модификации антисмысловой цепи
Авторами и другими сотрудниками ранее было обнаружено, что высокий уровень ΕΝΑмодификации антисмысловых цепей оказывает сильное ингибирующее действие на РНКи-активность стандартных киРНК-конструкций (фиг. 18, столбец 5, данные не приводятся) (Е1тещ I.. е1 а1. (2005) Νυс1е1с Αοίάκ Рек, 33, 439-447, Вгааксб, Ό.Α. е1 а1., (2003) Вюсбетщбу, 42, 7967-7975). Поэтому авторами настоящего изобретения сначала была сконструирована Α81, содержащая только два ΕΝΑ-остатка возле 3'-конца. Для того чтобы определить, может ли прерывистая смысловая цепь влиять на требования, предъявляемые к немодифицированным остаткам в остове антисмысловой цепи, авторами настоящего изобретения была протестирована ΕΝΑ-модифицированная квсиРНК с высокомодифицированной антисмысловой цепью, содержащей шесть ΕΝΑ-остатков (Α82). Эта антисмысловая цепь, при ее спаривании со всеми смысловыми цепями РНК (данные не приводятся) или с ΕΝΑ-модифицированной смысловой цепью (ΕΝΑ-модифицированным киРНК-дуплексом Α82+881, фиг. 18В, столбец 2), является, по существу, неактивной. Интересно отметить, что потребность антисмысловой цепи в немодифицированных остатках является менее строгой, чем при использовании квсиРНК-конструкции (ср. столбцы 2 и 3, фиг. 18В). Аналогичное повышение эффективности ингибирования наблюдалось при использовании 3'концевой укороченной смысловой конструкции и ΕΝΑ-модифицированной квсиРНКц+11-конструкции. Это дает основание предположить, что квсиРНК-конструкция поможет частично избежать нежелательной загрузки в высокой степени модифицированных антисмысловых цепей в активированный Р18С. Для того чтобы определить, может ли аналогичный эффект применяться к другим типам химических модификаций, которые не повышают термодинамическую стабильность киРНК, авторами настоящего изобретения были протестированы три конструкции, содержащие либо одну дополнительную Ν2'адамантильную модификацию (Α84 и Α85), либо одну дополнительную Н2'-пирен-1-ил-2'-амино-ЕНЛ-Тмодификацию (Α86) (фиг. 18А) в антисмысловой цепи. Модификации такого типа делают киРНК почти нефункциональной при ее спаривании с 881 в стандартной (ΕΝΑ-модифицированной) киРНКконструкции (фиг. 18В, столбцы 4, 6, 8). Однако в квсиРНК-конструкции антисмысловые цепи, модифицированные адамантилом и пиренилом, обнаруживают значительное, а именно ~2,5-4-кратное увеличение эффективности ингибирования (фиг. 18В, столбец 5, 7, 9). В целом, полученные результаты показали, что квсиРНК-конструкция может быть толерантной к большому числу объемных химических модификаций, которые в иных случаях являются несовместимыми с активностью стандартной киРНК.
Для дополнительной характеризации механизма ослабления жесткости антисмысловой структуры авторами настоящего изобретения было проанализировано дальнейшее поведение смысловой цепи (881) в высокой степени функциональной киРНК, модифицированной легкой антисмысловой цепью (Α81, 881), по сравнению с поведением киРНК, модифицированных тяжелой антисмысловой цепью (Α82, 881; Α84, 881; Α85, 881; Α86, 881). ΕΝΑ-модифицированная киРНК (Α81, 881) обнаруживала ~2,5-кратное снижение репортерных уровней для обратной мишени (фиг. 18С, столбец 2), однако при использовании в
- 39 015563 высокой степени модифицированных киРНК для этой мишени какого-либо значительного снижения не наблюдалось (А82, 881; А84, 881; А85, 881; А86, 881) (фиг. 18С, столбец 6, 10, 14, 18). Это дает все основания предполагать, что для любых цепей, в случае, если антисмысловая цепь является в высокой степени модифицированной, загрузка в К18С является неполной, и что квсиРНК-конструкция может облегчать загрузку в К18С в высокой степени модифицированных киРНК-дуплексов, и не будет влиять на выбор цепи до или во время загрузки в К18С.
Пример 11. Оценка влияния различных уровней энтропии хитозан-киРНК на доставку из носовой полости в головной мозг и из носовой полости в легкие
Мукоадгезивные свойства хитозана и его способность проникать через слизистую использовали для доставки киРНК и квсиРНК через слизистую, например интраназально, внутрилегочно, перорально и интравагинально, ЕСЕР-трансгенным мышам и животным с моделью заболевания. Кроме того, с использованием системы на основе хитозана могут быть проанализированы местные способы введения, такие как внутрибрюшинное и чрескожное введение. В одном из недавно проводимых исследований оценивали различия в распределении в легких и органах обоняния Су3-меченной киРНК и квсиРНК, приготовленных в виде дискретных частиц с хитозаном при различных уровнях энтропии, или киРНК, доставляемой вместе с хитозаном в смеси, приготовленной непосредственно перед интраназальным введением. В этом исследовании мышам интраназально вводили состав в объеме 30 мкл (15 мкл на ноздрю), содержащий 5 мкг Су3-киРНК, на дни 1 и 3. Затем на 5-й день проводили перфузию всего организма. Легкие, печень и головной мозг одновременно извлекали и приготавливали срезы в Научно-исследовательской стереологической лаборатории (8ΐοΐΌο1οβν РсксагсН ^аЬο^аΐο^у, АИ) и Научно-исследовательской ортопедической лаборатории (ОгЮреаФс РсаксагсН ^аЬο^аΐο^у), соответственно.
Оптимизация доставки и эффективности киРНК и квсиРНК при внутрилегочном введении
Авторы настоящего изобретения использовали катетерную ингаляторную систему для эндотрахеальной доставки аэрозольных препаратов (хитозан/киРНК и оголенная киРНК) и продемонстрировали, что при более низкой дозе наблюдается лучшее осаждение жидких препаратов в легких, чем при интраназальном введении таких препаратов.
Анализ на интерфероновый ответ и побочные эффекты ΐη νίίτο и ΐη νίνο
Определение профиля экспрессии всего генома осуществляли для оценки РНКи-индуцированных побочных/индуцированных интерфероном эффектов различных киРНК- и квсиРНК-конструкций в анализе ίη νίίτο. В исследовании ίη νίνο пробы крови, взятые у мышей, обработанных одной и той же серией модифицированных киРНК с применением различных способов доставки (внутрилегочной, внутривенной, внутрибрюшинной), анализировали на профили экспрессии цитокинов с использованием системы оценки профиля экспрессии Ьитшех.
Оценка факмакокинетических свойств химически модифицированных киРНК- и квсиРНКингибиторов репортерных генов у мышей-моделей с репортерными генами
Различные киРНК, κΕΝΑ и квсиРНК тестировали у еСЕР-трансгенных мышей на функциональные свойства, включая эффективность, биологическую доступность, распределение в различных органах, стабильность киРНК (время полужизни и клиренс), токсичность и иммунный ответ. Оценку проводили при различных способах доставки (ех νίνο, интраназальной, внутрилегочной, внутривенной, внутрибрюшинной и местной). Оптимизированные ингибиторы РНКи тестировали в комбинации с системами доставки (оголенной, хитозановой системой Ρο^ρ^χ, липосомой). У мышей была проанализирована возможность доставки лиганда, конъюгированного с киРНК, в конкретные клетки или ткани. Для выявления локализации использовали радиоактивно меченную или флуоресцентно меченную киРНК.
Пример 12. Оценка влияния ингибирования κίΕΝΑ и квсиРНК на экспрессию ЕСЕР в легких после интраназальной и внутривенной доставки
Целью данного исследования является оценка ингибирования ЕСЕР в эпителиальных клетках бронхиол легких после интраназального введения или внутривенного введения оголенной κίΕΝΑ и оголенной квсиРНК или квсиРНК в смеси с хитозаном.
Получение и приготовление тест-вещества
Хитозан ΗΜ\ν использовали для получения квсиРНК-содержащих наночастиц в ацетатном буфере (0,2 М, рН 5,5) при концентрации 250 мкг/мл квсиРНК. Частицы концентрировали в ацетатном буфере (для интраназальных препаратов) с использованием колоночных концентраций виваспина до 1 мг/мл квсиРНК. Немодифицированную κίΕΝΑ/квсиРНК концентрировали в РВ8 (1 мг/мл) для внутривенного введения, и в ацетатном буфере для интраназального введения.
- 40 015563
Конструкции:
киРНК 5ЕС2 10:44 εες Ю45 5'-5АС611АААС6<ЗССАСААбиис з'-сЕсиесАиицссссЕисиисА
киРНК с несоответствиями 5Ер 10:46 БЕЦ 10:47 5'-ЕАСЦЦАСАСиСАСАСААЕииС з'-сссисАдисисАсисисиис
ΒίίΝΑ 5Е(} Ю:48 5Е0 Ю49 5'-САСбиААА£ССС£АСААСи1£и· 3' зЩ££сцбСАиииесСЕсисиисА-5 ’
квсиРНК 5ЕС> 10:50 5ЕС}10:51 5'-ЕАЕеиАААСЕ ЕС£АСААЕЦ1£11-3' з'-исбсиЕСАиииЕС-сЕеисиисА'5'
Остатки, выделенные жирным шрифтом, представляют собой остатки ΕΝΑ
Схема введения доз и группы
ЕСРР-трансгенных мышей распределяли по нижеследующим группам и обрабатывали в соответствии с нижеследующим протоколом:
Группа 1: оголенная κίΕΝΑ, интраназально (3 мыши)
Группа 2: оголенная квсиРНК, интраназально (3 мыши)
Группа 3: частицы из хитозан-квсиРНК, интраназально (3 мыши)
Группа 4: оголенная квсиРНК, внутривенно (3 мыши)
Группа 5: интраназальная доставка контроля, киРНК с несоответствиями (3 мыши)
Каждой анестезированной мыши ежедневно в течение 5 дней подряд интраназально вводили объем в 30 мкл (15 мкл на ноздрю), или внутривенно вводили объем 50 мкл.
Затем проводили перфузию всего организма, и иссекали органы (легкие, печень, селезенку, голову, почки).
Пример 13. Ингибирование ЕСРР в легких трансгенных зеленых мышей с использованием катетера с аэрозольным баллоном
Целью данного исследования является оценка ингибирования ЕСРР в эпителиальных клетках бронхиол легких после интратрахеального введения киРНК, κίΕΝΑ и квсиРНК, приготовленных в смеси с хитозаном.
В этом исследовании оценивали ингибирующую эффективность хитозановых частиц, содержащих киРНК, направленную против ЕСРР, в легких трансгенных зеленых мышей. Эти частицы вводили эндотрахеально с помощью катетера с аэрозольным баллоном для улучшения доставки киРНК в глубокие области легких, такие как альвеолы.
Конструкции:
киРНК как в примере 11
киРНК с несоответствиями как в примере 11
квсиРНК как в примере 11
Протокол исследования:
трансгенным мышам, экспрессирующим ЕСРР, вводили две дозы.
Группа 1: Хитозан/киРНК (4 мыши)
Группа 2: Хитозан/киРНК с несоответствиями (4 мыши)
Группа 3: Хитозан/квсиРНК (4 мыши)
Каждой анестезированной мыши вводили 2 дозы, каждая из которых содержала 2 мкл раствора частиц, в день 1, а затем снова вводили эти 2 дозы на следующий день (день 2). Через 48 ч ткань фиксировали путем перфузии всего организма (день 4).
Легкие иссекали и приготавливали срезы, которые оценивали на ингибирование ЕСРР. Частицы получали с использованием 800 мкл хитозана в 1 мг/мл раствора при рН 5,5, к которому добавляли 200 мкл 0,2 М натрийацетатного буфера при рН 5,5. Комплексы получали с использованием 20 мкл 250 мкМ раствора киРНК.
Пример 14. Модель клеточной культуры
Нижеследующие квсиРНК-конструкции получали методами, описанными в \УО 2005/073378.
Воздействие квсиРНК на экспрессию нуклеиновой кислоты-мишени может быть проанализировано в клетках любого из вышеописанных типов при условии, что такая нуклеиновая кислота-мишень присутствует на измеримых уровнях. Мишень может быть экспрессирована эндогенно или путем временной или стабильной трансфеции нуклеиновой кислоты, кодирующей указанную нуклеиновую кислоту. Уровень экспрессии нуклеиновой кислоты-мишени может быть определен рутинным способом с помощью, например, нозерн-блот-анализа, ПЦР в реальном времени и анализа на защиту от рибонуклеазы. Клетки нижеследующих типов приводятся лишь в целях иллюстрации, а поэтому могут быть использованы клетки других типов, при условии, что в клетках выбранного типа будет экспрессироваться данная мишень.
Клетки культивировали в соответствующей среде как описано ниже и поддерживали при 37°С и влажности 95-98% в атмосфере с 5% СО2. Клетки пассировали рутинным способом 2-3 раза в неделю.
- 41 015563
ΒΝί.Ε-2: Клеточную линию мышиной печени ΒΝΟΕ-2 закупали у АТСС и культивировали в ΌΜΕΜ (81дта), содержащей 10% ΕΒ8 + глутамакс I + заменимые аминокислоты + гентамицин.
Нера1-6: Клеточную линию мышиной печени Нера1-6 закупали у АТСС и культивировали в ΌΜΕΜ (81дта), содержащей 10% ΕΒ8 + глутамакс I + заменимые аминокислоты + гентамицин.
НерС2: Клеточную линию человеческой печени НерС2 закупали у АТСС и культивировали в ΜΕΜ Игла (81дта), содержащей 10% ΕΒ8 + глутамакс I + заменимые аминокислоты + гентамицин.
Пример 15. Обработка терапевтическими квсиРНК
Нижеследующие примеры приводятся для того, чтобы продемонстрировать, каким образом квсиРНК-комплексы могут быть использованы для ингибирования терапевтической мишени. В общих чертах, квсиРНК могут быть использованы в соответствии с процедурами, аналогичными процедурам, описанным для киРНК или антисмысловых олигонуклеотидов. Однако предпочтительно, чтобы РНКкомплексы содержали холестерин и/или были приготовлены в виде смеси с хитозаном, как описано выше. Обычно по сравнению с антисмысловым олигонуклеотидом для квсиРНК (или киРНК) требуется в 35 раз большая доза.
Подробное описание протоколов можно найти, например, в следующих заявках:
Βο12: №0 2005/061710
Сурвивин: №0 2006/050732
Н1И-альфа: №0 2006/050734
Р21-тав: РСТ/0К2006/000512
Αρο-Β: РСТ/0К2006/000481.
Различные терапевтические конструкции киРНК известны специалистам. В анализах согласно изобретению эти конструкции были протестированы в форме квсиРНК, такой как терапевтическая βίβίΕΝΑ. Подходящими для использования являются квсиРНК, нацеленные на АроВ.
Пример 16. Обработка антисмысловым олигонуклеотидом
Клетки ΒΝί.Ε-2 или Нера1-6 высевали в 12-луночные планшеты при 37°С (5% СО2) в среде для культивирования, в которую было добавлены 10% ΕΒ8, глутамакс I и гентамицин. Когда клетки достигали конфлюентности 60-70%, их трансфицировали в дубликатах различными концентрациями олигонуклеотидов (0,04-25 нМ) с использованием липофектамина 2000 (5 мкг/мл). Трансфекции осуществляли, в основном, как описано Иеаи е! а1. (1994, ШС 269: 16416-16424). Вкратце, клетки инкубировали в течение 10 мин с липофектамином в среде Оρΐ^ΜΕΜ, а затем добавляли олигонуклеотид до общего объема 0,5 мл смеси для трансфекции на лунку. Через 4 ч трансфицирующую смесь удаляли, клетки промывали и культивировали при 37°С в течение приблизительно 20 ч (для анализа мРНК и белка) в соответствующей культуральной среде. Затем клетки собирали для анализа белка и РНК.
Пример 17. Экстракция РНК и синтез кДНК
Выделение полноразмерной РНК
Полноразмерную РНК выделяли с использованием набора ЯЫеаву т1ш кй (01адеп). Клетки промывали ΡΒ8, и в лунки непосредственно добавляли буфер для лизиса клеток (ЯТЬ, О|ацеп). в который был добавлен 1%-ный меркаптоэтанол. Через несколько минут образцы обрабатывали в соответствии с инструкциями производителей.
Синтез первой цепи
Синтез первой цепи осуществляли с использованием набора, содержащего обратную транскриптазу Отш8спр1 или обратную транскриптазу Μ-ΜΕΫ (в общих чертах описанных производителем (ЛтЫоп)) в соответствии с инструкциями производителей (О|ацеп). При использовании обратной транскриптазы Отш8спр1 0,5 мкг полноразмерной РНК каждого образца доводили до 12 мкл и смешивали с 0,2 мкл ро1у-(бТ)12-18 (0,5 мкг/мл) (ЫГе Тесйио1од1е5), 2 мкл άΝΤΡ-смеси (5 мМ каждой), 2 мкл 10х ЯТ-буфера, 0,5 мкл ингибитора РНКазы ΡΝΑβίκΐΓά™ (33 единицы/мл, Αιι-κι^ΐκιη!) и 1 мкл обратной транскриптазы Отш8спр!, а затем инкубировали при 37°С в течение 60 мин и подвергали термоинактивации при 93°С в течение 5 мин. При осуществлении синтеза первой цепи с использованием рандомизированных декамеров и обратной транскриптазы Μ-ΜΕν (по существу, в соответствии с рекомендациями производителя ^тЬюи)), 0,25 мкг полноразмерной РНК для каждого образца доводили до 10,8 мкл в Н2О. После этого добавляли 2 мкл декамеров и 2 мкл б№ТР-смеси (2,5 мМ каждых). Образцы нагревали до 70°С в течение 3 мин и сразу охлаждали в ледяной воде, после чего добавляли 3,25 мкл смеси (содержащей 2 мкл 10х ЯТ-буфера; 1 мкл обратной транскриптазы Μ-ΜΤν; 0,25 мкл ингибитора РНКазы). кДНК синтезировали при 42°С в течение 60 мин, а затем проводили стадию термоинактивации при 95°С в течение 10 мин и, наконец, охлаждали до 4°С.
Пример 18. Анализ на ингибирование экспрессии Аро-В100 с помощью ПЦР в реальном времени
Антисмысловая модуляция экспрессии Аро-В100 может быть оценена различными способами, известными специалистам. Так, например, уровни мРНК Аро-В100 могут быть оценены, например, с помощью нозерн-блот-анализа, конкурентной полимеразной цепной реакции (ПЦР) или ПЦР в реальном времени. При этом в настоящем изобретении предпочтительной является количественная ПЦР в реальном времени. Анализ РНК может быть осуществлен на полноразмерной клеточной РНК или мРНК.
- 42 015563
Способы выделения РНК и анализа РНК, такого как нозерн-блот-анализ известны специалистам и их описание можно найти, например, в руководстве СштеШ ΡΐΌΐο^Ικ ίη ΜοΚα.ι1;·ΐΓ Βίοίοβ}·, ίοΐιη ^11еу & 8οηκ. Количественная ПЦР в реальном времени может быть легко осуществлена с использованием коммерчески доступной многоцветной системы детекции для ПЦР в реальном времени (1Ц Μι.ι11ί-ί.'ο1οΓ Кеа1 Т1те РСК Ое!^!^ 8ук1ет), поставляемой ΒίοΚΑΌ. Количественная ПЦР в реальном времени хорошо известна специалистам и описана, например, в руководстве Ней с! а1. Кеа1 Рте Γ|ΐι;·ιηΙίΙ;·ιΙί\Ό РСК, Семте Кекеагсй (1996), 6: 986-994.
Анализ на уровни мРНК Аро-В100, проводимый с помощью количественной ПЦР в реальном времени
Для определения относительного уровня мышиной мРНК АроВ в обработанных и необработанных образцах проводили количественный ПЦР-анализ на циклизаторе 1Сус1ег, ВюКай, с использованием генерированной кДНК.
К 8 мкл 5-кратно разведенной кДНК (нормализованной на Сарйй и бета-актин) добавляли 52 мкл смеси, содержащей 29,5 мкл платины (с.|РСК 8ирсгт1х-иЭС (Ιηνίίτο^η)), 1030 нМ каждого праймера, 0,57 X белка 8УВК, флуоресцирующего в зеленом диапазоне спектра (ΜοΚαιΡ·ΐΓ ргоЬек), и 11,4 нМ флуоресцеина (Μο1οου13Γ ргоЬек).
мкл дубликатов использовали для количественной ПЦР: 50°С, 120 с, 95°С, 120 с и 40 циклов [95°С, 30 с и 60°С, 60 с].
Экспрессию АроВ количественно оценивали с использованием 50-кратно разведенной кДНК в соответствии со стандартным протоколом проведения количественной ПЦР. Праймеры (конечные концентрации прямого и обратного праймеров составляют 0,6 мкМ и 0,9 мкМ, соответственно) и зонд (конечная концентрация 0,1 мкМ) смешивали с 2 х платиновой смесью (Р1а1йшт ОиаШйаЙуе РСК 8ирегМ1х ИЭС) (са!. # 11730, ΙηνίύΌ^η) и добавляли к 3,3 мкл кДНК до конечного объема 25 мкл. Каждый образец анализировали в дубликатах. ПЦР проводили по следующей программе: 50°С, 2 мин, 95°С, 10 мин, а затем 40 циклов: 95°С, 15 с, 60°С, 1 мин.
Экспрессию мРНК АроВ нормализовали на экспрессию мРНК мышиного β-актина или Сарйй, которые аналогичным образом оценивали с помощью количественной ПЦР.
Праймеры:
тСарйй: 5'-адсс1сд1:сссд1:адасаа1-3' (8ЕЦ ΙΌ N0:73) и 5'-Ц1§а1ддсаасаа1с1ссасШ-3'(8ЕО ΙΌ N0:74) ιηβ-актин: 5'-ссйссйсйддд1а1ддаа-3' (8ЕЦ ΙΌ N0:75) и 5'-дс1саддаддадсаа1да1:с1-3' (8ЕЦ ΙΌ N0:76) тΑрοΒ: 5'-дсссайд1ддасаадйда1:с-3' (8ЕЦ ΙΌ N0:77) и 5'-ссаддасйддадд1:сйдда-3' (8ЕЦ ΙΌ N0:78) Зонд тΑрοΒ Тасцти-т: 5'-£ат-аадссадддсс1а1:с1:ссдса1сс-3' (8ЕЦ ΙΌ N0:79).
2-кратные разведения кДНК, синтезированной из необработанной клеточной линии мышиных гепатоцитов (клеток Нера1-6) (5-кратно разведенной и экспрессирующей АроВ и β-актин или Сарйй), использовали в целях построения стандартных кривых для анализов. Относительные количества мРНК АроВ определяли исходя из вычисленного порогового цикла с помощью системного программного обеспечения для детекции в реальном времени (1Сус1ег ίθ Кеа1 Т1те ^еΐесйοη 8ук1ст κοΕ^π^.
Пример 19. Вестерн-блот-анализ для определения уровней белка Аро-В100
Влияние олигонуклеотидов Аро-В100 ίη νίΐτο на уровни белка Аро-В100 в трансфицированных клетках определяли с помощью вестерн-блоттинга.
Клетки собирали и подвергали лизису в среде, которая содержала 50 мМ трис-НС1, рН 6,8, 10% глицерин, 2,5% ДСН, 5 мМ ДТТ и 6 М мочевину, и в которую была добавлена смесь ингибиторов протеазы (Κοсйе). Общую концентрацию белка измеряли с помощью набора для анализа белка ВСА (Р1егсе). 50 мкг общего белка подвергали электрофорезу на 10-12% бис-трис-гелях в буфере М0Р8 или на 3-8% трис-ацетатных гелях и подвергали блоттингу на ПВДФ-мембранах в соответствии с инструкциями производителей (Ιηνίίτο^η). После инкубирования в течение ночи в блокирующем буфере (в РВ8-Т, в который было добавлено 5% сухое молоко низкой жирности) мембраны инкубировали в течение ночи с первым антителом, детектирующим АроВ-100. Тубулин или актин, используемые в качестве загрузочного контроля, детектировали с использованием моноклональных антител, поставляемых №οιη;·ΐΓ1^Γ. Затем мембраны инкубировали со «вторыми» антителами, и АроВ-100 визуализировали с использованием набора для хромогенной иммунодетекции (Ιηνίίτο^η) или набора для хемилюминесцентной детекции с применением ЭХЛ+ (Атегкйат).
Пример 20. Ингибирование экспрессии человеческого Аро-В100 с использованием антисмысловых олигонуклеотидов
В соответствии с настоящим изобретением конструировали серию квсиРНК-олигонуклеотидов для нацеливания на различные области человеческого Аро-В100. Соединения квсиРНК оценивали на их способность ингибировать мРНК Аро-В100 в мышиных гепатоцитах (клетках Нера1-6) после опосредуемого липидом поглощения, и сравнивали уровни ингибирования АроВ-100 в ВМЕСЬ2 под действием квсиРНК-комплекса и в клетках Нера1-6.
Мониторинг уровня стабильной экспрессии транскрипта проводили с помощью ПЦР в реальном времени и нормализовали на уровень стабильной экспрессии транскрипта САРЭН.
Предварительный анализ показал, что квсиРНК может быть эффективной.
- 43 015563
Пример 20. Ιη νΐνο ингибирование мишени под действием ΕΝΑ-содержащих олигонуклеотидных соединений
Мышам С57ВЬ/6 (20 г) ί.ν. вводили дозу 50 мг/кг в течение трех дней подряд (группе из 7 мышей). квсиРНК снова растворяли в 0,9% физиологическом растворе (Νηί,Ί) и вводили в дозе 10 мл/кг массы тела (~0,2 мл на инъекцию). При умерщвлении регистрировали массу печени. Ткани для определения уровня экспрессии мРНК АроВ хранили в реагенте ΚΝΑΙπΙογ (АшЬюп) при -20°С до их использования. Анализ мРНК в тощей кишке и печени и определение общего уровня холестерина в плазме проводили через 24 часа после последней ί.ν. инъекции.
Пример 21. Уровни холестерина в плазме
Общий уровень холестерина в плазме определяли с помощью колориметрического анализа на холестерин С1ю1с51сго1 СР, разработанного АВХ Рейга. Уровень холестерина измеряли после ферментативного гидролиза и окисления. 21,5 мкл воды добавляли к 1,5 мкл плазмы. Затем добавляли 250 мкл реагента и через 5 мин определяли содержание холестерина на длине волны 540 нМ. Измерения проводили для каждого животного в дубликатах. Чувствительность и линейность тестировали с использованием 2кратно разведенного контрольного соединения (АВХ Реп1га Ν εοηίτοί). Относительные уровни холестерина определяли путем вычитания фоновых значений и выражали как отношение уровней холестерина в плазме к уровням холестерина в плазме у мышей, обработанных физиологическим раствором.
Пример 22. Ιη νΐνο ингибирование мишени под действием ΕΝΑ-олигонуклеотидных соединений
Мышам С57ВЬ/6 (20 г) ί.ν. вводили дозы 25 или 50 мг/кг в течение трех дней подряд (группе из 7 мышей). квсиРНК-конструкции растворяли в 0,9% физиологическом растворе (№С1) и вводили в дозе 10 мл/кг массы тела (~0,2 мл на инъекцию). Ткани для определения уровня экспрессии мРНК АроВ хранили в реагенте
КХА1а1ег (АшЬюп) при -20°С до их использования. Анализ мРНК в тощей кишке и печени и определение общего уровня холестерина и уровня холестерина ЛПНП в плазме проводили через 24 ч после последней ί.ν. инъекции.
Очевидно, что квсиРНК-конструкции, направленные против АроВ, могут оказывать эффективное ингибирующее действие на мРНК АроВ, белок АроВ и относительные уровни холестерина.
Дополнительные примеры проиллюстрированы на фиг. 19-27.

Claims (14)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. РНК-комплекс, способный к опосредованию интерференции РНК, содержащий двухцепочечную коровую область, насчитывающую от 15 до 40 пар оснований, где указанная двухцепочечная коровая область содержит антисмысловую цепь и прерывистую цепь-пассажир, которая гибридизуется с антисмысловой цепью, где прерывистость цепи-пассажира создается ником или гэпом, и где РНКкомплекс содержит нуклеотидные аналоги, где прерывистая цепь-пассажир содержит первую и вторую молекулы РНК, которые вместе образуют прерывистую цепь-пассажир, и где первая или вторая молекула РНК прерывистой цепи-пассажира содержит по меньшей мере один нуклеотидный аналог.
  2. 2. РНК-комплекс по п.1, где либо:
    (a) антисмысловая цепь содержит по меньшей мере один нуклеотидный аналог в дуплексной области, образованной прерывистой цепью-пассажиром; либо (b) первая и/или вторая молекулы РНК прерывистой цепи-пассажира содержат по меньшей мере один нуклеотидный аналог, и антисмысловая цепь содержит по меньшей мере один нуклеотидный аналог в дуплексной области, образованной прерывистой цепью-пассажиром.
  3. 3. РНК-комплекс по п.1 или 2, где либо:
    (a) цепь-пассажир содержит от 2 до 10 нуклеотидных аналогов и/или (b) первая молекула РНК прерывистой цепи-пассажира содержит по меньшей мере 2 нуклеотидных аналога, и/или (c) вторая молекула РНК прерывистой цепи-пассажира содержит по меньшей мере 2 нуклеотидных аналога.
  4. 4. РНК-комплекс по п.3, где нуклеотидный аналог находится в пределах трех концевых (соответственно, 5' или 3' ) нуклеотидных остатков первой и/или второй молекулы РНК.
  5. 5. РНК-комплекс по любому из пп.1-4, где прерывистость цепи-пассажира создается ником.
  6. 6. РНК-комплекс по любому из пп.1-5, где по меньшей мере один из нуклеотидных аналогов, присутствующих в молекуле РНК прерывистой цепи-пассажира, образует пару оснований с комплементарным нуклеотидным аналогом, присутствующим в антисмысловой цепи.
  7. 7. РНК-комплекс по любому из пп.1-6, где нуклеотидные аналоги независимо выбраны из группы, состоящей из 2'-О-алкил-РНК-мономеров, 2'-амино-ДНК-мономеров, 2'-фтор-ДНК-мономеров, ΕΝΑмономеров, мономеров арабинонуклеиновой кислоты (ΑΝΑ), 2'-фтор-АNА-мономеров, ΗΝΑ-мономеров, ΙΝΑ-мономеров.
  8. 8. РНК-комплекс по любому из пп.1-7, где нуклеотидные аналоги повышают температуру плавления двухцепочечного корового дуплекса.
    - 44 015563
  9. 9. РНК-комплекс по любому из пп.1-7, где нуклеотидные аналоги представляют собой блокированную нуклеиновую кислоту (ΣΝΆ) или представляют собой нуклеотидные аналоги с 2'-замещением, такие как 2'-фтор-ДНК или 2'-Ме-РНК.
  10. 10. РНК-комплекс по любому из пп.1-8, где нуклеотидные аналоги, присутствующие в комплексе, представляют собой остаток блокированной нуклеиновой кислоты (^NА).
  11. 11. РНК-комплекс по любому из пп.1-10, где либо обе цепи - антисмысловая цепь и цепь-пассажир указанного РНК-комплекса, либо одна из этих цепей содержит выступающий 3'-конец, имеющий от 1 до 8 нуклеотидов в длину, например 1, 2 или 3 нуклеотида.
  12. 12. РНК-комплекс по любому из пп.1-11, где либо обе цепи - антисмысловая цепь и цепь-пассажир указанного РНК-комплекса, либо одна из этих цепей представляет собой тупой конец.
  13. 13. РНК-комплекс по любому из пп.1-12, где двухцепочечная коровая область указанного РНКкомплекса содержит число пар оснований, выбранное из группы, состоящей из 18 пар оснований, 19 пар оснований, 20 пар оснований, 21 пары оснований, 22 пар оснований и 23 пар оснований.
  14. 14. РНК-комплекс по любому из пп.1-13, где длина первой молекулы РНК цепи-пассажира составляет от 8 до 13 нуклеотидов, а длина второй молекулы РНК цепи-пассажира составляет от 8 до 14 нуклеотидов.
EA200870366A 2006-03-23 2007-03-23 Короткая внутренне сегментированная интерферирующая рнк EA015563B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DKPA200600433 2006-03-23
DKPA200601254 2006-09-28
PCT/DK2007/000146 WO2007107162A2 (en) 2006-03-23 2007-03-23 Small internally segmented interfering rna

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200870366A1 EA200870366A1 (ru) 2009-04-28
EA015563B1 true EA015563B1 (ru) 2011-08-30

Family

ID=38255274

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200870366A EA015563B1 (ru) 2006-03-23 2007-03-23 Короткая внутренне сегментированная интерферирующая рнк

Country Status (10)

Country Link
US (1) US8329888B2 (ru)
EP (1) EP2002004B1 (ru)
JP (1) JP5244087B2 (ru)
AU (1) AU2007229161B2 (ru)
CA (1) CA2644347C (ru)
DK (1) DK2002004T3 (ru)
EA (1) EA015563B1 (ru)
ES (1) ES2556128T3 (ru)
IL (1) IL194290A (ru)
WO (1) WO2007107162A2 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11130949B2 (en) 2016-10-05 2021-09-28 Syngenta Participations Ag Gene silencing

Families Citing this family (140)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
USRE44779E1 (en) 1997-03-07 2014-02-25 Santaris Pharma A/S Bicyclonucleoside and oligonucleotide analogues
CA2519860C (en) 2003-03-21 2018-01-16 Santaris Pharma A/S Short interfering rna (sirna) analogues
CA2638837A1 (en) * 2006-01-27 2007-08-02 Santaris Pharma A/S Lna modified phosphorothiolated oligonucleotides
EP2076600A1 (en) * 2006-10-18 2009-07-08 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Nicked or gapped nucleic acid molecules and uses thereof
WO2008109475A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting sirt2 gene expression and uses thereof
WO2008109532A2 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting fas gene expression and uses thereof
WO2008109364A2 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting frap1 gene expression and uses thereof
WO2008109548A2 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting tgfb gene expression and uses thereof
WO2008109373A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting erbb gene expression and uses thereof
WO2008109368A2 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting vegfr gene expression and uses thereof
WO2008109500A2 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting prkca gene expression and uses thereof
WO2008109493A2 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting cd19 gene expression and uses thereof
WO2008109495A2 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting cd40 gene expression and uses thereof
WO2008109509A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting snca gene expression and uses thereof
WO2008109488A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting angpt2 gene expression and uses thereof
WO2008109546A2 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting tgfbr gene expression and uses thereof
WO2008109350A2 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting il6 gene expression and uses thereof
WO2008109378A2 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting pdgfr gene expression and uses thereof
WO2008109506A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting jun gene expression and uses thereof
WO2008109374A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting mapk gene expression and uses thereof
WO2008109553A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting ptpn11 gene expression and uses thereof
WO2008109354A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting il18 gene expression and uses thereof
WO2008109375A2 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting pik3c gene expression and uses thereof
WO2008109473A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting abcb1 gene expression and uses thereof
WO2008109379A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting il17a gene expression and uses thereof
WO2008109358A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting mapk1 gene expression and uses thereof
WO2008109503A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting ms4a1 gene expression and uses thereof
WO2008109505A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting cd22 gene expression and uses thereof
WO2008109369A2 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting tnf gene expression and uses thereof
WO2008109487A2 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting mme gene expression and uses thereof
WO2008109497A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting folh1 gene expression and uses thereof
WO2008109520A2 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting cxc gene expression and uses thereof
JP2010519911A (ja) * 2007-03-02 2010-06-10 エムディーアールエヌエー，インコーポレイテッド Ｍｙｃ遺伝子の発現を抑制するための核酸化合物およびその使用
WO2008109494A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting stat3 gene expression and uses thereof
US20100055784A1 (en) * 2007-03-02 2010-03-04 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting wnt gene expression and uses thereof
CA2679388A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting ras gene expression and uses thereof
US20080286866A1 (en) * 2007-03-02 2008-11-20 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting vegf gene expression and uses thereof
WO2008109461A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting cd3 gene expression and uses thereof
WO2008109556A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting telomerase gene expression and uses thereof
WO2008109365A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting raf1 gene expression and uses thereof
WO2008109498A2 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting hdac gene expression and uses thereof
WO2008109382A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting pkn3 gene expression and uses thereof
WO2008109443A2 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting cdk2 gene expression and uses thereof
WO2008109454A2 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting fos gene expression and uses thereof
WO2008109376A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting bcr-abl gene expression and uses thereof
US20100047909A1 (en) * 2007-03-02 2010-02-25 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting vegf family gene expression and uses thereof
WO2008109370A2 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting srd5a1 gene expression and uses thereof
WO2008109558A2 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting tlr gene expression and uses thereof
WO2008109534A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting ezh2 gene expression and uses thereof
WO2008109544A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting muc1 gene expression and uses thereof
WO2008109492A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting igf1r gene expression and uses thereof
WO2008109526A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting egr gene expression and uses thereof
WO2008109555A2 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting nrg1 gene expression and uses thereof
WO2008109551A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting tacstd1 gene expression and uses thereof
WO2008109371A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting p38 mapk family gene expression and uses thereof
WO2008109511A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting fcer2 gene expression and uses thereof
WO2008109366A2 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting ccnd1 gene expression and uses thereof
US20100105134A1 (en) * 2007-03-02 2010-04-29 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting gene expression and uses thereof
WO2008109380A2 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting vegfr family gene expression and uses thereof
US20080293136A1 (en) * 2007-03-02 2008-11-27 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting akt gene expression and uses thereof
WO2008109468A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting mmp gene expression and uses thereof
WO2008109359A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting pdgfr family gene expression and uses thereof
WO2008109531A2 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Ndrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting hsd11b1 expression and uses thereof
WO2008109547A2 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting tymp gene expression and uses thereof
WO2008109357A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting apob gene expression and uses thereof
WO2008109356A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting tnfsf13b gene expression and uses thereof
WO2008109355A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting srd5a2 gene expression and uses thereof
EP2121923A1 (en) * 2007-03-02 2009-11-25 MDRNA, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting erbb family gene expression and uses thereof
WO2008109490A2 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting chek1 gene expression and uses thereof
WO2008109372A2 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting pdgf gene expression and uses thereof
CA2679347A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting bcl2 gene expression and uses thereof
EP2126081A2 (en) * 2007-03-02 2009-12-02 MDRNA, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting hif1a gene expression and uses thereof
WO2008109353A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting map2k gene expression and uses thereof
US8410330B2 (en) * 2007-03-07 2013-04-02 The Penn State Research Foundation Composition to control acid rock drainage
WO2009004995A1 (ja) 2007-06-29 2009-01-08 Stelic Institute Of Regenerative Medicine, Stelic Institute & Co. 生理活性物質を定着および発現させる方法
US20100022618A1 (en) * 2007-09-05 2010-01-28 Dong Liang Long interfering nucleic acid duplexes targeting multiple RNA targets
EP2225376B1 (en) 2007-12-03 2014-01-08 Santaris Pharma A/S Rna antagonist compounds for the modulation of pik3ca expression
US20100015708A1 (en) * 2008-06-18 2010-01-21 Mdrna, Inc. Ribonucleic acids with non-standard bases and uses thereof
EP2361305A2 (en) * 2008-08-05 2011-08-31 Marina Biotech, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting birc5 gene expression and uses thereof
JP6209309B2 (ja) 2008-09-22 2017-10-04 アールエックスアイ ファーマシューティカルズ コーポレーション サイズが減少した自己送達用ＲＮＡｉ化合物
ES2708944T3 (es) 2008-09-22 2019-04-12 Dicerna Pharmaceuticals Inc Composiciones y métodos para la inhibición específica de la expresión de genes por DSRNA que tenga modificaciones
US8283460B2 (en) * 2008-10-15 2012-10-09 Somagenics, Inc. Short hairpin RNAs for inhibition of gene expression
EP2384197B1 (en) * 2008-12-31 2016-04-06 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Use of lna apob antisense oligomers for the treatment of acute coronary syndromes
WO2010090762A1 (en) 2009-02-04 2010-08-12 Rxi Pharmaceuticals Corporation Rna duplexes with single stranded phosphorothioate nucleotide regions for additional functionality
EP2756845B1 (en) * 2009-04-03 2017-03-15 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the specific inhibition of KRAS by asymmetric double-stranded RNA
CN102802637A (zh) 2009-06-12 2012-11-28 桑塔里斯制药公司 新的有力的抗apob反义化合物
EP2454371B1 (en) 2009-07-13 2021-01-20 Somagenics, Inc. Chemical modification of small hairpin rnas for inhibition of gene expression
US9096850B2 (en) 2009-08-24 2015-08-04 Sirna Therapeutics, Inc. Segmented micro RNA mimetics
US20150025122A1 (en) 2009-10-12 2015-01-22 Larry J. Smith Methods and Compositions for Modulating Gene Expression Using Oligonucleotide Based Drugs Administered in vivo or in vitro
WO2011105902A2 (en) 2010-02-23 2011-09-01 Academisch Ziekenhuis Bij De Universiteit Van Amsterdam Antagonists of complement component 8-beta (c8-beta) and uses thereof
WO2011105901A2 (en) 2010-02-23 2011-09-01 Academisch Ziekenhuis Bij De Universiteit Van Amsterdam Antagonists of complement component 9 (c9) and uses thereof
WO2011105900A2 (en) 2010-02-23 2011-09-01 Academisch Ziekenhuis Bij De Universiteit Van Amsterdam Antagonists of complement component 8-alpha (c8-alpha) and uses thereof
WO2011163526A2 (en) 2010-06-23 2011-12-29 California Institute Of Technology Signal activated molecular delivery
WO2011163499A2 (en) * 2010-06-23 2011-12-29 Opko Curna, Llc Treatment of sodium channel, voltage-gated, alpha subunit (scna) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to scna
EP2714089A4 (en) 2011-05-24 2014-11-26 Polyvalor Sec COMPOSITIONS AND METHODS FOR EFFICIENT AND SAFE DELIVERY OF RNsIS USING SPECIFIC NANOCOMPLEXES BASED ON CHITOSAN
KR101590586B1 (ko) * 2011-05-30 2016-02-01 성균관대학교산학협력단 표적 유전자 발현 억제 및 면역 반응을 동시에 유발하는 이중가닥의 긴 간섭 ｒｎａ
US9115355B2 (en) 2011-06-23 2015-08-25 California Institute Of Technology Exonuclease resistant polynucleotide and related duplex polynucleotides, constructs, compositions, methods and systems
US9725715B2 (en) 2011-06-23 2017-08-08 California Institute Of Technology Signal activatable constructs and related components compositions methods and systems
EP3521432A1 (en) 2011-09-02 2019-08-07 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. Organic compositions to treat hsf1-related diseases
WO2013142735A1 (en) * 2012-03-21 2013-09-26 California Institute Of Technology Targeting domain and related signal activated molecular delivery
CN109481455A (zh) 2012-05-02 2019-03-19 箭头研究公司 治疗kras相关疾病的有机组合物
KR20150083920A (ko) 2012-11-15 2015-07-20 로슈 이노베이션 센터 코펜하겐 에이/에스 항 apob 안티센스 접합체 화합물
US10006024B2 (en) 2012-11-29 2018-06-26 Gifu University RNA interference agent, method for producing same, and use therefor
SG10201706960TA (en) 2013-02-28 2017-10-30 Arrowhead Res Corp Organic compositions to treat epas1-related diseases
AU2014282666A1 (en) * 2013-06-16 2016-01-07 National University Corporation Tokyo Medical And Dental University Double-stranded antisense nucleic acid with exon-skipping effect
WO2015042556A1 (en) 2013-09-23 2015-03-26 Georgia Tech Research Corporation Targeting non-coding rna for rna interference
US9988627B2 (en) 2013-10-04 2018-06-05 Novartis Ag Formats for organic compounds for use in RNA interference
WO2015051044A2 (en) 2013-10-04 2015-04-09 Novartis Ag Novel formats for organic compounds for use in rna interference
WO2015051135A2 (en) 2013-10-04 2015-04-09 Novartis Ag Organic compositions to treat hepcidin-related diseases
EP3052464B1 (en) 2013-10-04 2020-04-15 Novartis AG 3'end caps for rna-interferring agents for use in rna interference
CN105792832B (zh) 2013-10-04 2021-03-23 诺华股份有限公司 用于治疗乙肝病毒的有机化合物
WO2015106128A2 (en) * 2014-01-09 2015-07-16 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. MODIFIED RNAi AGENTS
EP3169784B1 (en) 2014-07-16 2020-06-10 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. Rnai compositions to treat apoc3-related diseases
EP3169309B1 (en) 2014-07-16 2023-05-10 Novartis AG Method of encapsulating a nucleic acid in a lipid nanoparticle host
WO2016022526A1 (en) * 2014-08-04 2016-02-11 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Ruthenium-based photolinkers and methods of use
MX2019005816A (es) * 2016-11-23 2019-10-07 Alnylam Pharmaceuticals Inc Agentes de arn modificados con efecto reducido fuera de la diana.
TN2020000039A1 (en) 2017-09-11 2021-10-04 Arrowhead Pharmaceuticals Inc Rnai agents and compositions for inhibiting expression of apolipoprotein c-iii (apoc3)
CA3088071A1 (en) 2018-02-09 2019-08-15 Genentech, Inc. Oligonucleotides for modulating tmem106b expression
WO2019215066A1 (en) 2018-05-07 2019-11-14 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Quality control of lna oligonucleotide therapeutics using massively parallel sequencing
WO2019233921A1 (en) 2018-06-05 2019-12-12 F. Hoffmann-La Roche Ag Oligonucleotides for modulating atxn2 expression
PE20211306A1 (es) 2018-07-13 2021-07-20 Hoffmann La Roche Oligonucleotidos para modular la expresion de rtel1
WO2020150636A1 (en) * 2019-01-18 2020-07-23 University Of Massachusetts Dynamic pharmacokinetic-modifying anchors
CN113906139A (zh) 2019-04-03 2022-01-07 百时美施贵宝公司 Angptl2反义寡核苷酸及其用途
WO2021122910A1 (en) 2019-12-19 2021-06-24 F. Hoffmann-La Roche Ag Use of sbds inhibitors for treating hepatitis b virus infection
EP4077667A1 (en) 2019-12-19 2022-10-26 F. Hoffmann-La Roche AG Use of sept9 inhibitors for treating hepatitis b virus infection
EP4077670A1 (en) 2019-12-19 2022-10-26 F. Hoffmann-La Roche AG Use of cops3 inhibitors for treating hepatitis b virus infection
JP2023506540A (ja) 2019-12-19 2023-02-16 エフ． ホフマン－ラ ロシュ エージー． Ｂ型肝炎ウイルス感染を処置するためのｓｃａｍｐ３阻害剤の使用
CN114867856A (zh) 2019-12-19 2022-08-05 豪夫迈·罗氏有限公司 Saraf抑制剂用于治疗乙型肝炎病毒感染的用途
AU2020415322A1 (en) 2019-12-24 2022-06-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Pharmaceutical combination of antiviral agents targeting HBV and/or an immune modulator for treatment of HBV
EP4081639A1 (en) 2019-12-24 2022-11-02 F. Hoffmann-La Roche AG Pharmaceutical combination of a therapeutic oligonucleotide targeting hbv and a tlr7 agonist for treatment of hbv
EP4150084A1 (en) 2020-05-11 2023-03-22 Genentech, Inc. Complement component 4 inhibitors for treating neurological diseases, and related compositons, systems and methods of using same
WO2021231210A1 (en) 2020-05-11 2021-11-18 Genentech, Inc. Complement component c1r inhibitors for treating a neurological disease, and related compositions, systems and methods of using same
JP2023527684A (ja) 2020-05-11 2023-06-30 ジェネンテック， インコーポレイテッド 神経疾患を治療するための補体成分ｃ１ｓ阻害剤、並びにそれを使用する関連組成物、システム及び方法
WO2022038211A2 (en) 2020-08-21 2022-02-24 F. Hoffmann-La Roche Ag Use of a1cf inhibitors for treating hepatitis b virus infection
KR102604882B1 (ko) * 2021-07-01 2023-11-21 인천대학교 산학협력단 신규 특이적 항암 및 항염증 siRNA 및 이의 용도
CA3229305A1 (en) 2021-08-16 2023-02-23 Vib Vzw Oligonucleotides for modulating synaptogyrin-3 expression
EP4430184A2 (en) 2021-11-11 2024-09-18 F. Hoffmann-La Roche AG Pharmaceutical combinations for treatment of hbv
EP4448106A1 (en) 2021-12-17 2024-10-23 Hoffmann-La Roche Inc. Combination of oligonucleotides for modulating rtel1 and fubp1
WO2024175586A2 (en) 2023-02-21 2024-08-29 Vib Vzw Inhibitors of synaptogyrin-3 expression
WO2024175588A1 (en) 2023-02-21 2024-08-29 Vib Vzw Oligonucleotides for modulating synaptogyrin-3 expression

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003070918A2 (en) * 2002-02-20 2003-08-28 Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated Rna interference by modified short interfering nucleic acid
WO2007056153A2 (en) * 2005-11-04 2007-05-18 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Peptide-dicer substrate rna conjugates as delivery vehicles for sirna

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5898031A (en) 1996-06-06 1999-04-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligoribonucleotides for cleaving RNA
ES2242291T5 (es) 1997-09-12 2016-03-11 Exiqon A/S Análogos de nucleósidos bicíclicos y tricíclicos, nucleótidos y oligonucleótidos
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
DE19956568A1 (de) 1999-01-30 2000-08-17 Roland Kreutzer Verfahren und Medikament zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Gens
DE60044241D1 (de) 1999-03-18 2010-06-02 Exiqon As Xylo-lna analoge
DK1163250T3 (da) 1999-03-24 2006-11-13 Exiqon As Forbedret syntese af [2.2.1]bicyclonukleosider
ATE356824T1 (de) 1999-05-04 2007-04-15 Santaris Pharma As L-ribo-lna analoge
JP2003511016A (ja) 1999-10-04 2003-03-25 エクシコン エ／エス オリゴヌクレオチドを補充する高親和性ｒｎアーゼｈの設計
EP1240322A2 (en) 1999-12-23 2002-09-18 Exiqon A/S Therapeutic uses of lna-modified oligonucleotides
US20070026394A1 (en) 2000-02-11 2007-02-01 Lawrence Blatt Modulation of gene expression associated with inflammation proliferation and neurite outgrowth using nucleic acid based technologies
DK1309726T4 (en) 2000-03-30 2019-01-28 Whitehead Inst Biomedical Res RNA Sequence-Specific Mediators of RNA Interference
US6998484B2 (en) 2000-10-04 2006-02-14 Santaris Pharma A/S Synthesis of purine locked nucleic acid analogues
CZ308053B6 (cs) 2000-12-01 2019-11-27 Max Planck Gesellschaft Izolovaná molekula dvouřetězcové RNA, způsob její výroby a její použití
ATE287413T1 (de) 2001-07-12 2005-02-15 Santaris Pharma As Verfahren zur herstellung des lna phosphoramidite
ATE529512T1 (de) * 2002-02-01 2011-11-15 Life Technologies Corp Doppelsträngige oligonukleotide
AU2003207708A1 (en) 2002-02-20 2003-09-09 Sirna Therapeutics, Inc. Rna interference mediated inhibition of map kinase genes
AU2003222743B2 (en) 2002-05-08 2008-12-11 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Synthesis of locked nucleic acid derivatives
SI3222724T1 (sl) 2002-08-05 2019-03-29 Silence Therapeutics Gmbh Nadaljnje nove oblike molekul interferenčne RNA
CA2504694C (en) 2002-11-05 2013-10-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Polycyclic sugar surrogate-containing oligomeric compounds and compositions for use in gene modulation
DE10322662A1 (de) 2002-11-06 2004-10-07 Grünenthal GmbH Wirksame und stabile DNA-Enzyme
CA2519860C (en) 2003-03-21 2018-01-16 Santaris Pharma A/S Short interfering rna (sirna) analogues
US20040224405A1 (en) 2003-05-06 2004-11-11 Dharmacon Inc. siRNA induced systemic gene silencing in mammalian systems
US20080249039A1 (en) 2004-01-30 2008-10-09 Santaris Pharma A/S Modified Short Interfering Rna (Modified Sirna)
EP1833840B9 (en) 2004-11-09 2010-11-10 Santaris Pharma A/S Potent lna oligonucleotides for the inhibition of hif-1a
CA2638837A1 (en) 2006-01-27 2007-08-02 Santaris Pharma A/S Lna modified phosphorothiolated oligonucleotides
EP2076600A1 (en) 2006-10-18 2009-07-08 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Nicked or gapped nucleic acid molecules and uses thereof

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003070918A2 (en) * 2002-02-20 2003-08-28 Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated Rna interference by modified short interfering nucleic acid
WO2007056153A2 (en) * 2005-11-04 2007-05-18 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Peptide-dicer substrate rna conjugates as delivery vehicles for sirna

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BRAMSEN JESPER B. ET AL.: "Improved silencing properties using small Internally segmented interfering RNAs.", NUCLEIC ACIDS RESEARCH 2007, vol. 35, no. 17, 2007, pages 5886-5897, XP002458184, ISSN: 1362-4962, table 1, page 5893, right-hand column, paragraph 2 - page 5895, left-hand column, paragraph 2 *
LEUSCHNER PHILIPP J. F. ET AL.: "Cleavage of the siRNA passenger strand during RISC assembly in human cells", EMBO REPORTS, vol. 7, no. 3, March 2006 (2006-03), pages 314-320, XP002443952, ISSN: 1469-221X, cited in the application published online 20.1.2006, page 317, left-hand column, paragraph 1 - right-hand column, paragraph 1, page 318, left-hand column, lines 3-10, page 318, right-hand column, paragraph 5-9, figure 3 *
MAITI MEKHALA ET AL.: "QIP, a putative exonuclease, interacts with the Neurospora Argonaute protein and facilitates conversion of duplex siRNA into single strands", GENES & DEVELOPMENT, vol. 21, no. 5, March 2007 (2007-03), pages 590-600, XP009087098, ISSN: 0890-9369, page 599, left-hand column, paragraph 4 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11130949B2 (en) 2016-10-05 2021-09-28 Syngenta Participations Ag Gene silencing

Also Published As

Publication number Publication date
WO2007107162A3 (en) 2008-05-08
DK2002004T3 (en) 2015-11-30
ES2556128T3 (es) 2016-01-13
EA200870366A1 (ru) 2009-04-28
JP5244087B2 (ja) 2013-07-24
WO2007107162A2 (en) 2007-09-27
AU2007229161B2 (en) 2012-07-12
AU2007229161A1 (en) 2007-09-27
CA2644347A1 (en) 2007-09-27
IL194290A (en) 2014-02-27
US20090182136A1 (en) 2009-07-16
US8329888B2 (en) 2012-12-11
EP2002004B1 (en) 2015-10-14
EP2002004A2 (en) 2008-12-17
IL194290A0 (en) 2011-08-01
JP2009530319A (ja) 2009-08-27
CA2644347C (en) 2017-05-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA015563B1 (ru) Короткая внутренне сегментированная интерферирующая рнк
US20200362343A1 (en) METHODS AND MODIFICATIONS THAT PRODUCE ssRNAi COMPOUNDS WITH ENHANCED ACTIVITY, POTENCY AND DURATION OF EFFECT
RU2377301C2 (ru) ОЛИГОМЕРНОЕ СОЕДИНЕНИЕ, ПОНИЖАЮЩЕЕ ЭКСПРЕССИЮ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ГЕНА Bcl-2, КОНЪЮГАТ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ ОЛИГОМЕРНОГО СОЕДИНЕНИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА
AU2009221064B2 (en) Pharmaceutical compositions for treatment of microRNA related diseases
JP2020188771A (ja) 二本鎖ＲＮＡによるα−１アンチトリプシンの特異的阻害のための方法及び組成物
US20150291957A1 (en) METHODS AND COMPOSITIONS TO PRODUCE ss-RNAi ACTIVITY WITH ENHANCED POTENCY
JP2021521796A (ja) 高コレステロール血症及び関連状態を治療するための、ｐｃｓｋ９を標的とするオリゴヌクレオチド
US20160272972A1 (en) Methods and compositions for modulating gene expression using components that self assemble in cells and produce rnai activity
WO2015023937A1 (en) Heterochromatin forming non-coding rnas
US20240043837A1 (en) Modulation of signal transducer and activator of transcription 3 (stat3) expression
EP3088524A1 (en) Artificial mimic mirna for controlling gene expression, and use of same
EP3366774A1 (en) Nucleic acid complex having at least one bulge structure
EP4129338A1 (en) Prevention or treatment of aneurysms using mir-33b inhibitor
WO2011017408A1 (en) Anti-mir-1 therapy for wound healing
WO2022230987A1 (ja) ｍｉＲ－３３ｂ阻害物質による筋疾患の予防又は治療
WO2020184700A1 (ja) Ｉｈｈ発現を調節するための核酸複合体
WO2011010737A1 (ja) マイクロｒｎａ切断用のガイド核酸
CN116615543A (zh) Umlilo反义转录抑制剂
TW202400786A (zh) 具有RNAi活性的化學修飾寡核苷酸
KR20240154682A (ko) RNAi 활성을 갖는 화학 수식 올리고뉴클레오티드
KR20230110293A (ko) Umlilo 안티센스 전사 억제제
NZ617944B2 (en) Methods and compositions for modulating gene expression using components that self assemble in cells and produce rnai activity

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM