JP5244087B2 - 低分子内部セグメント化干渉ｒｎａ - Google Patents

低分子内部セグメント化干渉ｒｎａ Download PDF

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Description

本発明は修飾siRNAコンプレックスを用いた遺伝子発現のin vivoダウンレギュレーション（down-regulation）の分野に属する。一例として、本発明に記載の該RNAコンプレックスは医薬組成物または遺伝子発現のin vivo解析に用いられる。
特異的に遺伝子をノックアウトできることから、RNA干渉の分野は近年、大変な注目を集めた。言うまでもなく、このことは遺伝的および生化学的経路あるいは個々の遺伝子および遺伝子産物の機能に関する基礎研究において大変重要である。そのため、RNA干渉は医薬産業における標的検証の大変重要な手段となった。さらに、RNA干渉を媒介する能力を有し、薬剤として使用可能なRNAコンプレックスの開発という目標に、かなりの投資が行われている。
治療にRNAｉを用いることの魅力は、その感度と配列特異性にある。しかしながら、配列特異性に関しては、例えば、RNAコンプレックスの間違った鎖が間違った標的核酸に対する反応を導くといった懸念が生じた。さらに、一定のサイズのRNAコンプレックスは、非特異的インターフェロン依存性反応（non-specific interferon dependent response）をもたらし、それもまた望ましくない。
特許出願US2003/0108923にアンチセンス鎖およびパッセンジャー鎖を含有するRNAiを媒介する能力のあるRNAコンプレックスが記載されており、該鎖の長さは21-23ヌクレオチドである。該RNAコンプレックスは治療への応用に有用であると示唆されている。
同様に、特許出願US2005/0234007にアンチセンス鎖およびパッセンジャー鎖を含有するRNAiを媒介する能力のあるRNAコンプレックスが記載されており、該コンプレックスは3'-突出を含む。該RNAコンプレックスは治療への応用に有用であると示唆されている。
WO2005/073378にアンチセンス鎖およびパッセンジャー鎖を含有するRNAiを媒介する能力のあるRNAiコンプレックスが記載されている。該明細書に記載のRNAコンプレックスはLNA残基を含み、一つの鎖の5-末端で最も弱い塩基対を形成する鎖がRISCコンプレックスに組み込まれているので、5'末端付近へのLNA残基の挿入によりRISCコンプレックス中に組み込まれている鎖を制御できる状態にある。
Matrangaら(2005, Cell Vol 123, pp607-620)は、活性RISCコンプレックスの成熟にはAgo-2によるパッセンジャー鎖の切断が必要であると発表している。パッセンジャー鎖の切断は、RISC形成中にヌクレオチド9と10の間で生じる。
Leuschner ら(EMBO 報告、2006年1月20日オンライン公表)は、不連続パッセンジャー鎖を有するRNAi-誘導サイレンシング複合体（RNAi-induced silencing complex）を発表している。Leuschnerらはまた、パッセンジャー鎖(5'から3')のポジション9に2'-Oメチルリボースユニットを用いた。該RNAiコンプレックスを、in vitro 細胞抽出実験で検証した。不連続パッセンジャー鎖の使用は、RNAiコンプレックスと同様にパッセンジャー領域切断サイト(9)に位置する2'-O メチルリボースユニットでの効率的な標的RNA切断をもたらすことがわかった。しかしながら、2'-Oメチルリボースユニットが切断サイトのさらに上流に位置する場合は、標的RNA切断が減衰した。
Leuschner らおよびMatrangaらのどちらも、不連続パッセンジャー鎖を有するRNAi-誘導サイレンシング複合体が、治療における使用に望ましいRNAiコンプレックスであるという発表あるいは示唆をしていない。
in vivoでの合成siRNAsの使用は、siRNA運搬という意味での効率性の欠如、生体液中での低い生物学的安定性（biostabilily）および、調査された全てのsiRNAs(Jackson,A.Lら(2003) Nat Biotechnol,21,635-637;Birmingham,Aら,J.ら(2006) Nat Methods,3,199-204;Jackson,A.Lら,(2006) Rna,12,1179-1187.)のmicroRNA様作用に付随する固有遺伝子のオフターゲット効果（off-target effect）に起因した低い作用特異性により、現在のところ阻まれている。合成siRNAの化学的修飾によりオフターゲット効果を減少させるいくつかの試みがなされてきた(Jackson,A.Lら,(2003) Nat Biotechnol,21,635-637;Birmingham,Aら,J.ら (2006) Nat Methods,3,199-204;Jackson,A.Lら, (2006) RNA,12,1179-1187;Elmen,Jら (2005) Nucleic Acids Res,33,439-447;Jackson,A.Lら(2006) RNA)。センス鎖およびアンチセンス鎖の両者がオフターゲット効果に寄与し得るので(Jackson,A.Lら,(2003) Nat Biotechnol,21,635-637)、活性化RISCへのセンス鎖の挿入を最小限にすることが、標的特異性を顕著に向上させ、その結果、センス鎖のオフターゲット（off-targeting）を減少させるであろう。熱力学的に最も安定でない5'末端を有するsiRNA鎖を活性化RISCにおけるアンチセンス鎖として選択的に利用することが確立されている(Schwarz,D.Sら,(2003) Cell,115,199-208.)。
二本鎖RNAコンプレックスは、細胞内における標的核酸の様々な修飾を媒介できる。このプロセスにおいて、コンプレックスのアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖に対する配列相補性の伸長を有する標的核酸にハイブリダイズできることから、誘導体として作用する。
標的核酸を標的とする前に、該アンチセンス鎖はRNA誘導タンパク複合体（RNA guided protein complex (RGPC)）にしばしば組み込まれ、標的核酸上で作用する。RNA誘導タンパク複合体の一つの例が、RNA誘導サイレンシング複合体(RISC)である。他にそのようなRGPCが存在し、本発明のRNAコンプレックスはまたこれらの他のRGPCとともに用いる場合に有用であろうと確信している。
しかしながら、治療剤あるいは遺伝子探索ツールとしてin vivoで用いる場合は、RISCといったサイレンシング複合体は、siRNAサイレンシング複合体の二つの鎖のどちらが目的のアンチセンス鎖であるか、およびどちらがパッセンジャー鎖あるいはガイド鎖なのかを区別できない。サイレンシング複合体へのパッセンジャー鎖の取り込みは、おそらく、オフターゲット（off-targets）の意図せぬサイレンシングを引き起こすであろう（すなわちパッセンジャー鎖と顕著に高い相補性を有する意図せぬ標的）。それ故に、そのようなオフターゲット（off-target）のリスクは、siRNAコンプレックスに基づいた治療剤および遺伝子探索物質の両方の開発を考慮すると、重要な問題である。
一態様において、RISCコンプレックスへ挿入する鎖の選択は、それぞれの鎖の5'間の水素結合の強さに依存する。パッセンジャー鎖の5'塩基がG あるいは C、およびアンチセンス鎖の5'塩基がA あるいは Tであることを確実にするようにsiRNAを構築することにより、RISCサイレンシング複合体に組込むアンチセンス鎖の選択を差別的に偏らせることが可能である。しかしながら、このことはRISCサイレンシング複合体へのパッセンジャー鎖の組込みを妨げない。
パッセンジャー鎖の5'末端への親和性増強ヌクレオチド類似体の挿入は、RISCサイレンシング複合体に組み込まれるパッセンジャー鎖の割合を減少させる。それ故に、ロックト核酸(LNA)の挿入によるセンス鎖5'末端の選択的熱力学的安定化は、センス鎖による不当な遺伝子サイレンシングを減少させることを示した(Elmen,Jら(2005) Nucleic Acids Res,33,439-447;Petersen,M.およびWengel,J.(2003) Trends Biotechnol,21,74-81.)。
パッセンジャー鎖のポジション10および12(5'末端から)へのヌクレオチド類似体の挿入は、これらの残基がRISCコンプレックスの触媒中心と一直線上に並んでいると考えられるため、RISC切断を妨げることができる。しかしながら、親和性増強ヌクレオチド類似体の挿入は、修飾siRNAコンプレックスの効能を減衰させるが、これはおそらくRISCコンプレックスヘリカーゼの作用に対するsiRNAの妨害が増大することによるものである。それ故に、高荷重の（high loads of）親和性増強ヌクレオチド類似体の挿入は、そのような類似体が有するサイレンシング効率に対する悪影響のために制限された。
哺乳類細胞へのdsRNAコンプレックスの導入は、インターフェロン応答の誘導をもたらし、細胞死を導く。以前は、インターフェロンの効力は、長いdsRNA分子（例えばウイルス感染およびウイルス複製に関連するもの）が存在している場合に限られると考えられたが、今では、短いsiRNA様物質もインターフェロン応答を誘導することが知られている。siRNA内におけるヌクレオチド類似体の誘導は、干渉効力の誘導の制限あるいは阻止にさえ有用であることが示唆された。それ故に、in vivo 応用に用いられるコンプレックスのようなヌクレオチド類似体をsiRNAに導入することが望ましいと考えられた。
ヌクレアーゼ抵抗性ヌクレオチド類似体の挿入は、siRNAの3'重複末端の保護に有用であると考えられる。該3'重複は、センス鎖とパッセンジャー鎖間のハイブリダイゼーションの強度に寄与しないことから、これらはRISCコンプレックスヘリカーゼの作用に対して悪影響を有しない。
それ故に、in vivo 応用（例えば治療や遺伝子探索への応用など）、パッセンジャー鎖により引き起こされる意図せぬサイレンシングに起因するオフターゲット効果を防ぐ方法、さらには親和性増強ヌクレオチド類似体の使用に関連した望ましくないインヒビター効果の回避、におけるsiRNAの成果と効能を制限するという重大な問題がある。
（発明の概要）
本発明は、通常の長さがそれぞれ9から13核酸塩基である２つのヌクレオチドセンス鎖を含む不連続センス(パッセンジャー)鎖で補完された無傷のアンチセンス鎖を特徴とする、根本的に異なる構造の治療用サイレンシング複合体を提供する。我々は、本構造のアンチセンス鎖のみ、標的特異性を顕著に高める遺伝子サイレンシング療法が可能であることを示す。
さらに、場合によっては、不連続パッセンジャー鎖の使用は、パッセンジャー鎖およびアンチセンス鎖の分離を可能な限り生じやすくしたことに起因するサイレンシング複合体の安定性の減衰、それに続いてRISCコンプレックスとの相互作用を引き起こすが、驚くべきことに我々は、不連続パッセンジャー鎖とアンチセンス鎖の間に形成された二本鎖内における親和性増強ヌクレオチド類似体の使用は、アンチセンス鎖の標的のサイレンシングに関するサイレンシング複合体の機能性を過度に効果的にすることなく、in vivoにおいて二本鎖を効果的に安定化させるのに有用であることを見いだした。それ故に、本発明は、オフターゲット効果を媒介するパッセンジャー鎖を回避するための解決策だけでなく、サイレンシング複合体の二本鎖内における高荷重のヌクレオチド類似体の誘導、in vivoにおける二本鎖の安定性に関する著しい有用性の提供、ヌクレアーゼ攻撃に対する抵抗性、およびインターフェロン応答の回避、を可能にする極めてすばらしい解決策の両方を提供する。
２つのRNA分子間の二本鎖は一般的にA-型構造で存在するのに対して、２つのDNA分子間の二本鎖は一般的にB-型構造で存在する。DNAとRNA分子間の二本鎖は一般的に中間の構造（A/B型）で存在する。例えばβ-D-オキシLNAなどといったヌクレオチド類似体の使用は、さらなるA型様構造を促進するのに有用である。
RISCコンプレックスの採用はsiRNAの特異的構造形態に依存していると考えられるため、２本鎖内で用いられるヌクレオチド類似体は２本鎖RNAコンプレックスのA-型構造の形態を促進するかまたは崩壊させないことが望ましい。標準的なNMRあるいはCD法が、２本鎖がA-型構造を形成するかどうかを決定するのに用いられる。
しかしながら、我々はまた、B-型構造を促進するヌクレオチド類似体の使用が、パッセンジャー鎖への挿入のような場合において、本発明に関連した好ましいヌクレオチド類似体モノマーユニットであるLNAのα-L異性体のように効果的であることも見いだした。それ故に我々は、パッセンジャー鎖がアンチセンス鎖とともにA-型構造を形成することは不可欠ではないが、B-型構造の一つの態様においてさえも、中間体A/B-型構造を形成することを確信する。
一態様において、LNAおよび2'OMeあるいは2'フルオロヌクレオチド類似体の両方を含むオリゴヌクレオチドから成るパッセンジャー鎖はここに参照の通りである。そのような態様において、ひとつの構造は、交互にLNAおよび2'OMeヌクレオチド類似体残基、または交互にLNAおよび2'フルオロ、あるいはLNAおよび2'OMe/2'フルオロヌクレオチド類似体の組み合わせを含むパッセンジャー鎖を含有することが予想される。
さらに、切断されたセンス鎖にLNAモノマーユニットを挿入するといった、ヌクレオチド類似体の挿入は、血清安定性を顕著に増大させ、標的ノックダウンを長期化する。興味深いことに、sisiRNA構造は、標準的なsiRNAとしての機能を有しない大きく修飾されたアンチセンス鎖を機能的に調節できる。このことは、特に治療剤あるいは機能的ゲノム学ツール（functional genomics tool）としての使用に関する、in vivoにおけるsiRNA応用にとって非常に重要である。
本発明は、RNA-誘導遺伝子制御、特にRNA干渉に関して用いられる、不連続パッセンジャー鎖を有するRNAコンプレックスを提供する。従って、本発明の目的は、一般的に用いられるRNAコンプレックスと比べてオフターゲット効果を減少させたRNAコンプレックスを提供することである。別の目的は、インターフェロン応答を減少させたRNAコンプレックスの提供である。さらなる別の目的は、合成および化学的な修飾の実現性について改良した特性を有するRNAコンプレックスを提供することである。該RNAコンプレックスは、RNAコンプレックスおよび医薬的に許容可能な希釈剤、担体、あるいはアジュバントを含む医薬(治療用)組成の形態である。
（発明の詳細な説明）
本発明において、我々は、不連続パッセンジャー鎖で補完された無傷のアンチセンス鎖を含む新しい構造の治療用(あるいはin vivo)siRNA、主として２つの短い9-13ヌクレオチドセンス鎖を開発した。我々は、そのような構造が機能的に完全であり、標準的な21塩基の二本鎖siRNA構造に対していくつかの優位性を有することを示す。:
1.不連続パッセンジャー鎖は、標的特異性のかなりの増大およびオフターゲット効果の期待される減少により、不当な遺伝子ノックダウンへの寄与を完全になくす。
2.該sisiRNA構造は、より多くの化学的な修飾(例えば、ヌクレオチド類似体)を可能にしてアンチセンス鎖に挿入することにより、標準的なsiRNA二本鎖の中で機能を有しない化学的に修飾されたアンチセンス鎖(LNAのようなヌクレオチド類似体を含むアンチセンス鎖）の機能を救済する能力を有する。
3.該sisiRNA構造は、細胞輸送などを増大する機能的な化学基の結合に都合よく用いられるノーマルsiRNAの４つに比べて、少なくとも６つの末端を有する。例えば、コレステロールのような巨大基を、下流のセンス鎖の5'末端に、活性を失うことなく結合することができる。
4.合成収率は通常、短いRNA鎖より高いので、治療への応用に関連する大規模な合成費用を、sisiRNA構造を用いることで減らせる。
5.ヌクレオチド類似体の使用、特にsisiRNAパッセンジャー鎖中のLNAは、血清中での安定性を非常に高くし、標準的なsiRNAに比べて強力で長期化された遺伝子サイレンシングをもたらす。
sisiRNA構造の重要な特徴は、対立鎖のRNAi活性はそのままで、セグメント化された鎖のサイレンシングへの寄与を完全に排除する能力である(図17に示す)。遺伝子サイレンシング特異性の結果的な増大により、研究された他のsiRNAs(Jackson,A.L.ら(2003) Nat Biotechnol,21,635-637)で認められたゲノム規模でのオフターゲット効果（genome-wide off-targets effects）をセンス鎖から減らせることが期待できる。さらに、鎖の選択は初期のころはsiRNA二本鎖末端の熱力学的非対称により決定されるので、高効率のsiRNAは、標的配列が熱力学的に好ましくない領域に制限される場合（例えば単一ヌクレオチド突然変異あるいは融合遺伝子間の接合点を標的とする強化の場合）は、設計するのが困難である。こうした場合、該sisiRNA構造はセグメント化されていない鎖のみが、sisiRNA二本鎖の熱力学的側面に関係なく遺伝子サイレンシングに寄与できることを確実にし、それにより、熱力学的に有利な対立鎖から受ける著しく不当なサイレンシングを排除できる。
Leuchnerらは以前、我々の未修飾sisiRNAに類似した、プレ切断（pre-cleaved）siRNAに、細胞抽出物におけるRISCの挿入および標的切断をする能力があることを証明した。しかしながら我々は、パッセンジャー鎖を有するがLNA残基を有しないsisiRNAは、たとえ2'OMe修飾残基が短いセンス鎖に導入されていても、細胞抽出物(すなわちin vivo)において機能を有しないことを見いだした。我々の安定性試験に基づくと(図15A)、sisiRNAの未修飾鎖はin vivoにおいて解離および劣化しており、LNAユニットのようなヌクレオチド類似体ユニットにより供されるTmの顕著な増大のみが二本鎖をこれらの条件下で十分に安定な状態にする、ということが最も適当な説明である。
興味深い見解は、サイレンシング効率の大きな損失をせずに鎖のニックを1から2塩基動かせることから、sisiRNA機能は中間体Ago2-切断産物の正確な構造的模倣に完全には依存しないというものである(図16A)。特に、“天然の” Ago2-切断産物を模倣しているsisiRNA構造(sisiRNA9+13)は、ニックをセンス鎖の3'末端方向に1および2塩基移動させている場合(sisiRNA10+12およびsisiRNA11+11)より効率が低いと思われる。Leuchner らのin vitroでのデータに基づくと、これらの構造はAgo2により最も切断されやすい（各々、１あるいは２のヌクレオチドを遊離する）。従って、sisiRNA10+12およびsisiRNA11+11構造における“天然の”Ago2切断を可能にすることで、例えばセンス鎖の除去のようなRISC活性化の次のステップを促進することによるRISC活性化を助長することが可能である。それ故に我々は、siRNA機能において、sisiRNA10+12構造は、RNAi経路における天然中間体の構造的な模倣による改良よりも優れた新規の改良を導くと考える。
我々および他の者は、siRNAのアンチセンス鎖における大規模な化学的修飾は、一般に、遺伝子サイレンシングにおけるそれらの機能とは両立しないことを見いだした。興味深いことに、該sisiRNA構造は、重度に修飾されたアンチセンス鎖の活性化RISCへの取り込みを確実にでき、続いて、効率的なAgo2-媒介標的mRNA切断を誘導する。本発明において、我々は、大規模なLNA-修飾、LNA/アダマンチルおよびLNA/ピレニル-修飾アンチセンス鎖のRISC活性のサポートに関する無能力さは、sisiRNA-構造により部分的に救済されるのに対して、同様に修飾された通常のsiRNAは無機能である(図18)ことを示す。このことは、アンチセンス鎖の中央部分における修飾は、活性化RISCそれ自体による標的切断反応を損なうのではなく、むしろ、RLC、センス鎖切断および/あるいは二本鎖の巻き戻しへのsiRNAの登用を示す。さらに、アンチセンスにおける多重修飾はまた活性化RISCへのセンス鎖の挿入を誘導しないようでもあるという所見は、鎖選択における単なるシフトではないこと意味している(図18)。このことに一致して、sisiRNA構造によるサイレンシングの救済はアダマンチルおよびピレニル修飾のようなsiRNA熱力学的特性の変化に依存していないようであり、どちらかと言えば、LNA-残基の安定化効果とは対照的にsiRNA二本鎖をわずかに不安定化する。それ故に、sisiRNA効力についての最も明白な説明は、センス鎖切断の損失およびそれに続く除去をもたらすRISC活性化の間に、重度に修飾されたsiRNAがＡｇｏ２に認識されるには厳密すぎるか大きすぎる（too rigid or bulky）というものである。特定の見解にしたくはないけれども、我々は、sisiRNA構造の中央鎖のニックが、RISC活性化の間のAgo2切断にとってよりよいポジションであるようにsisiRNA二本鎖に構造的な柔軟性を与えるというのが、もっともらしい説明であると考える。
siRNAへの大規模な化学的修飾の導入は、RNAi経路におけるRISC活性化の上流（upstream）および下流（downstream）の両方のステップに対して有益な特性を有する。アダマンチルおよびピレニルのような親油基の導入は、siRNA二本鎖の細胞取り込みを増大させ、人工的な修飾は通常、細胞内および細胞外コンパートメントにおけるsiRNAの生物学的安定性を増大し得る。さらに、シード領域(アンチセンス鎖のヌクレオチド2から8)における修飾は、アンチセンス鎖のポジション2について明らかにされた(Jackson, A.L. ら、(2006) RNA)ように、siRNAによる固有遺伝子のオフターゲット効果を最小限に抑えるのに必須であることを証明する。我々はまた、アンチセンス鎖におけるLNA残基数の増加は、標的特異性および標的に対する親和性を改善するとも考える。
本発明の一つの目的は、二本鎖RNAコンプレックスのどちらの鎖がRGPCにおける誘導RNAとして実際に機能し得るかを制御することである。定義によれば、該アンチセンス鎖は誘導鎖であることを意図している。しかし、標的核酸の修飾を媒介する二本鎖RNAコンプレックスを用いることの懸念は、コンプレックスの間違った鎖を誘導鎖として作用させ得ることであると認識されている。従って、パッセンジャー鎖は標的核酸のどんな修飾をも媒介することを意図していない。
言い換えれば、本発明の一つの目的は、パッセンジャー鎖ではなくアンチセンス鎖のみが標的核酸の修飾を媒介し得ることを確実にすることである。この目的の達成により、オフターゲット効果の少ないRNAコンプレックスを提供し得る。
本発明の基本概念は、不連続パッセンジャー鎖を用いることであり、該不連続パッセンジャー鎖が細胞でRGPCに最も挿入されにくく、その結果標的核酸のいかなる修飾をも誘導できそうにない。言い換えれば、不連続性は二本鎖に非対称性をもたらすことによりパッセンジャー鎖を特徴づける。
その名称が示すように、不連続パッセンジャー鎖は不連続性を含む。以下の詳説から明らかなように、不連続とは、例えばニックまたはギャップであり、あるいはリンカーである。
不連続パッセンジャー鎖を含む本発明のRNAコンプレックスは、ここでは、低分子内部セグメント化干渉RNA(sisiRNA)とも称される。
該パッセンジャー鎖は、1、2、3あるいは4RNA分子のようないくつかの分離したRNA分子を含む。これらのRNA分子は互いに連結され、それらはまたアンチセンス鎖に連結される。それ故に、パッセンジャー鎖と言う場合、それらは不連続性により分断されているにもかかわらず、一般的に単一のRNA分子あるいはアンチセンス鎖にハイブリダイズしているRNA分子を意味する。該パッセンジャー鎖はまた、センス鎖とも称される。
パッセンジャー鎖の機能は、アンチセンス鎖の目標への到達、およびアンチセンス鎖のRGPCへの取り込みの補助であり、とりわけ、パッセンジャー鎖がアンチセンス鎖の生物学的利用能および生物学的安定性を増大させることを意味する。従って、一態様において、本発明の不連続パッセンジャー鎖は上述の機能を満たすとともに、本発明のRNAコンプレックスについて記載した構造的な主張を満たす。
一態様において、本発明は標的核酸の核酸修飾を媒介する能力のあるRNAコンプレックスを提供する。該RNAコンプレックスはアンチセンス鎖およびアンチセンス鎖にハイブリダイズした不連続パッセンジャー鎖を含有するコア二本鎖領域を含む。そのようなコンプレックスのいくつかの構造的特徴は、図1Aおよび1Bに記載の通りである。
ここで標的核酸と言われるものは、コンプレックスのアンチセンス鎖と非常に高い相補性を有する核酸である。望ましくは、相補性は一続きのいくつかのヌクレオチドにわたって完全である。
従って、一態様において、相補性は25ヌクレオチドにわたって完全である。
他の態様において、相補性は各々、24ヌクレオチド、23ヌクレオチド、22ヌクレオチド、21ヌクレオチド、20ヌクレオチド、19ヌクレオチド、18ヌクレオチド、17ヌクレオチド、16ヌクレオチド、15ヌクレオチド、14ヌクレオチド、13ヌクレオチド、12ヌクレオチド、11ヌクレオチド、10ヌクレオチド、9ヌクレオチドあるいは8ヌクレオチドの長さにわたって完全である。
一態様において、伸長相補性(例えば、完全である（perfect）'と上記に記載されたもの)は１つのミスマッチを含む。他の態様において、伸長相補性は各々、2つのミスマッチ、3つのミスマッチあるいは4つのミスマッチを含む。１のミスマッチは、伸長相補性の塩基対が形成できない領域、例えばGとAが逆である場合、である。より多くのミスマッチが存在する場合、お互いに隣接しているあるいは伸長相補性の異なる領域に間隔を開けて位置する。
該RNAコンプレックスは実質的な二本鎖領域であるコア二本鎖領域を含む。該RNAコンプレックスの一本鎖領域は、主にパッセンジャー鎖の不連続性およびコンプレックスの突出部に関与する。突出部はそれらのもともとの一本鎖によるものであり、該不連続性はアンチセンス鎖の一本鎖領域を生じさせる、あるいは該不連続性はそれ自体が一本鎖領域(バルジ)である。パッセンジャー鎖の不連続性に関与する一本鎖領域に加えて、かなりの二本鎖領域はミスマッチを含む。
それ故に、一態様において、二本鎖領域は１つのミスマッチを含む。他の態様において、二本鎖領域は各々、2つのミスマッチ、3つのミスマッチ、および4つのミスマッチを含む。
ここで用いられる“標的核酸"という用語は、アンチセンス鎖により誘導された修飾（例えば、標的切断あるいは立体妨害など）を受けやすい、いかなるRNA/DNAをも包含する。標的RNA/DNAは、例えば、ゲノムDNA、ゲノムウイルスRNA、mRNA、mRNA前駆体、あるいは非コードRNAであり得る。望ましい標的はmRNAである（例えば、ApoB、Bcl2、Hif-1α、スルビビンあるいはp21 ras（例えばHa-ras、K-rasあるいはN-ras）といった疾病関連タンパクをコードするmRNA）。
ここで用いられる“標的核酸修飾"という用語は、標的核酸の構造には影響せずに標的核酸の活性に影響を及ぼすものを含む、標的核酸に対するいかなる修飾をも意味する。
ここで用いられる“医薬組成物”という用語は、“治療の”あるいは“治療用組成物”という用語と同等の意味であり、言い換えることができる。この点において、本発明の組成物は、予防的にあるいは疾病の表現型あるいは診断の提示に応じて使用される。
“相当する”という用語は、本発明の合成物のヌクレオチド配列およびそれらの逆相補体との間の比較、あるいは一態様においては、核酸塩基配列および同等の(同一の)核酸塩基配列（例えば他の核酸塩基を含むが同一の塩基配列あるいは相補性を保持するもの）との間の比較のどちらについても言及する。ヌクレオチド類似体は、それらの同等あるいは相当する天然ヌクレオチドと直接的に比較される。逆相補配列を形成する配列は、配列の相補的配列と言われる。
本発明の望ましい標的核酸はmRNAである。それ故に、一態様において、RNAコンプレックスにより媒介される核酸修飾は、RNA干渉(RNAi)である。望ましい態様において、RNAiはmRNAの分解を媒介する。別の望ましい態様において、RNAiはmRNAの翻訳阻害を媒介する。さらに別の態様において、該RNAiはmRNAの翻訳阻害および分解の両方を媒介する。
一態様において、RNAコンプレックスにより媒介される核酸修飾は、遺伝子抑制といった遺伝子サイレンシングである。遺伝子サイレンシングは全体の一部であり、例えば、RNA切断、RNA分解および/あるいは翻訳阻害により調節される。
他の態様において、標的核酸は非コードRNAであり、例えばtRNA、miRNAおよびそれらの前駆体、snRNA、snoRNAあるいはrRNAである。
さらに別の態様において、標的核酸はゲノムDNAである。そのような態様において、望ましい核酸修飾はDNAメチル化およびDNA欠失を含む。
ここで用いられる“核酸塩基”という用語は、DNAあるいはRNAあるいはヌクレオチド類似体のような、ヌクレオチドを意味する。
ここで言うヌクレオチド分子の長さに関して、その長さは、モノマーユニットがヌクレオチドあるいはヌクレオチド類似体であるかどうかにかかわらず、モノマーユニット、すなわち核酸配列の数に相当する。核酸塩基に関して、モノマーおよびユニットという用語はここでは言い替え可能である。
本発明のRNAコンプレックスのサイズは、本発明あるいはそれ以上の目的を満たす範囲内で変化できる。これは、例えば特定の目的がオフターゲット効果を減らすことなどである場合にあてはまる。
それ故に、コア二本鎖領域は、10塩基対、11塩基対、12塩基対、13塩基対、14塩基対、15塩基対、16塩基対、17塩基対、18塩基対、19塩基対、20塩基対、21塩基対、22塩基対、23塩基対、24塩基対および25塩基対、26塩基対、27塩基対、28塩基対、29塩基対、30塩基対の群から選択される多くの塩基対を含む。
従って、同様あるいは異なる態様において、コア二本鎖領域は、35塩基対、40塩基対、42塩基対、45塩基対、50塩基対、55塩基対、60塩基対あるいは62塩基対の群から選択される多くの塩基対を含む。
一態様において、該コア二本鎖領域は15から40の塩基対を含む。
別の望ましい態様において、コア二本鎖領域は18-22の塩基対を含む。
一態様において、コア二本鎖領域は40塩基対よりさらに長く、いくつかの細胞において知られているけれども、より長い二本鎖RNAコンプレックスの導入は、インターフェロン依存的非特異反応の導入の可能性を増大させる。そのような一態様において、コンプレックスは、より短い二本鎖RNAコンプレックスへ処理された後、RGPCと協働すると考えられる。DICERなどのRNase III 様酵素が処理を行う。
本発明の望ましい態様において、該RNAコンプレックスは突出を含む。本発明の文脈で用いられる突出とは、二本鎖領域を受けて短鎖一本鎖領域（short single-stranded region）のことを言う。突出を含むRNAコンプレックスの様々な例を図2に示す。
一態様において、RNAコンプレックスのアンチセンス鎖は3'-突出を含む。
別の態様において、該パッセンジャー鎖は3'-突出を含む。
さらに別の態様において、該アンチセンス鎖は5'-突出を含む。
さらに別の態様において、該パッセンジャー鎖は5'-突出を含む。
望ましい態様において、アンチセンス鎖およびパッセンジャー鎖の両方とも3'-突出を含む。
突出の他の組み合わせは図2より明らかであろう。
RNAコンプレックスの突出は、コンプレックスの基本的な機能を妨害することなく、長さを変化できる。それ故に、一態様において該突出は、1ヌクレオチド、2ヌクレオチド、3ヌクレオチド、4ヌクレオチド、5ヌクレオチド、6ヌクレオチド、7ヌクレオチドおよび8ヌクレオチドの長さの突出の群から選択される。
最も望ましい突出は、各々、1、2および3ヌクレオチドの長さの突出である。
一態様において、アンチセンス鎖の突出は、パッセンジャー鎖の突出と同じ長さを有する。
別の態様において、アンチセンス鎖の突出は、パッセンジャー鎖の突出と同じ長さを有しない。
本発明のさらに別の態様において、該RNAコンプレックスは、少なくとも一つの平滑末端を含む。“平滑末端”とは、いかなる突出ヌクレオチドをも有しない二本鎖核酸の末端を言う（すなわち、二本鎖核酸末端の両方の鎖が同じポジションで終結している）。
別の態様において、該RNAコンプレックスは両方の末端が平滑末端である。
本発明の望ましいRNAコンプレックスは、パッセンジャー鎖の不連続性を除けば、より長い二本鎖RNAコンプレックスを処理するDICERの生成物に構造が似ている。
他の望ましいRNAコンプレックスは、パッセンジャー鎖を処理するAgo2エンドヌクレアーゼの生成物に構造が似ている。理論に縛られるつもりはないが、最近のデータは、RISCの触媒のコアタンパク質である、Ago2エンドヌクレアーゼが、RISC活性化中に5'-末端を形成する9のヌクレオチドを切断することによりパッセンジャー鎖除去を開始することを示唆する。
本発明の他の望ましいRNAコンプレックスは、コア二本鎖領域が18から22塩基対を含み、アンチセンス鎖およびパッセンジャー鎖がそれぞれ1から3ヌクレオチド(すなわち1、2あるいは3)の3'-突出を含む。
本発明のRNAコンプレックスのアンチセンス鎖は、コンプレックスの機能を妨害することなく長さを変化できる。それ故に、いくつかの態様において、アンチセンス鎖は各々、15-mer、16-mer、17-mer、18-mer、19-mer、20-mer、21-mer、22-mer、23-mer、24-mer、25-mer、26-mer、27-mer、28-mer、29-mer、30-mer、31-mer、32-mer、33-mer、34-mer、35-mer、36-mer、37-mer、38-mer、39-mer、40-mer、41-mer、42-mer、43-mer、44-mer、45-mer、46-mer、47-mer、48-mer、49-mer、50-mer、51-mer、52-mer、53-mer、54-mer、55-mer、56-mer、57-mer、58-mer、59-mer、60-mer、61-merあるいは62-merである。例えば、19-merは19モノマーのアンチセンス鎖（すなわちヌクレオチド/ヌクレオチド類似体(核酸塩基)）であると解される。
別の望ましい態様において、RNAコンプレックスのアンチセンス鎖は以下の群のアンチセンス鎖から選択される:18-mer、19-mer、20-mer、21-mer、22-merおよび23-mer。
一態様において、該アンチセンス鎖は不連続である。アンチセンス鎖の望ましい不連続性は、パッセンジャー鎖の望ましい不連続性と同じである。
前述したように、本発明のパッセンジャー鎖は不連続である。本発明の望ましい態様において、パッセンジャー鎖はいくつかの不連続RNA分子を含む。RNA分子の数は、例えば、1、2、3、4、5あるいは6である。いくつかの不連続RNA分子を有するRNAコンプレックスを図3にまとめる。
望ましい態様において、パッセンジャー鎖のRNA分子の個々の長さは、4モノマー以上である。他の望ましい態様において、パッセンジャー鎖のRNA分子の個々の長さは、各々、5モノマー、6モノマー、7モノマー、8モノマー、9モノマー、10モノマー、11モノマーおよび12モノマー以上である。
別の態様において、パッセンジャー鎖のRNA分子の個々の長さは、4モノマー以下である。他の態様において、パッセンジャー鎖のRNA分子の個々の長さは、各々、5モノマー、6モノマー、7モノマー、8モノマー、9モノマー、10モノマー、11モノマーおよび12モノマー以下である。
本発明の望ましい態様において、該不連続パッセンジャー鎖は第1および第2RNA分子を含み、それらは共に不連続パッセンジャー鎖を形成し、ここで第1RNA分子はアンチセンス鎖の下流部分にハイブリダイズし、第2RNA分子はアンチセンス鎖の上流部分にハイブリダイズしている。
一態様において、該パッセンジャー鎖は少なくとも第1および第2RNA分子を含み、それらは共に不連続パッセンジャー鎖を形成する。
一態様において、該パッセンジャー鎖は、上述した第1および第2の二つのRNA分子のみを含む。
一態様において、該パッセンジャー鎖は、上述した第1および第2の二つのRNA分子の両方および少なくともひとつの追加的なRNA分子を含む。
興味深い態様は、第1RNA分子が少なくとも3、例えば4、5、6、7、8、9、10、11、12あるいは13のヌクレオチド類似体ユニット（例えばLNAユニット）を含む場合である。そのような態様において、第2RNA分子は、3、2、1のようなほんのわずかのヌクレオチド類似体ユニットのみを含むか、ヌクレオチド類似体ユニットを含まない。または、少なくとも3つ（例；4、5、6、7、8、9、10、11、12あるいは13のような）のヌクレオチド類似体ユニット（例えばLNAユニット）を含む第2のRNA分子および、3、2、1のようなほんのわずかのヌクレオチド類似体ユニットのみを含むか、ヌクレオチド類似体ユニットを含まない第1のRNA分子である。その他としては、第1および第2鎖の両方ともが少なくとも3つ（例；4、5、6、7、8、9、10、11、12あるいは13のような）のヌクレオチド類似体ユニット（例えばLNAユニット）を含む。
少なくとも追加的なRNA分子は、望ましくは3から9核酸塩基ユニット（例；3、4、5、6、7、8あるいは9核酸塩基ユニット）あるいは4から6核酸塩基ユニットといった、少なくとも3核酸塩基ユニットの長さを有する。
概して、十分なin vivo安定性を有する強度の二本鎖を確保するためには、パッセンジャー鎖を形成するRNA分子がより短ければ短いほど、ヌクレオチド類似体のより高い取り込みが望ましい。
一態様において、該パッセンジャー鎖は、上述した第1および第2RNA分子の両方、および上述した1から4の追加的なRNA分子（例；1、2、3あるいは4の追加的なRNA分子）を含む。
一態様において、パッセンジャー鎖は、8から13のヌクレオチドユニット長（例えば8、9、10、11、12あるいは13のヌクレオチドユニット長、9から12のヌクレオチドユニット長、9から11の核酸塩基長）である第1RNA分子を含む。我々は、9、10あるいは11核酸塩基長のRNA分子を有するパッセンジャー鎖が特に効果的であることを見いだした。RISCコンプレックスの処理の過程で、該パッセンジャー鎖は通常、ポジション9にニックが入れられる。我々は、驚くべきことに、本発明に記載のRNAコンプレックスにとの関連で、10あるいは11核酸塩基ユニット長である第1RNA分子の提供による合成siRNAのポジション10あるいは11へのニックの導入は、9核酸塩基ユニットの長さの第2RNA分子を含有する類似のsiRNAコンプレックス以上に増強されると考えられる非常に効果的なsiRNA分子を提供することを見いだした。そのような態様において、不連続パッセンジャー鎖の中に追加的なRNA分子は存在しない。
上記の態様と同一あるいは異なる一態様において、該パッセンジャー鎖は、8から14ヌクレオチドユニット長（例；8、9、10、11、12、13あるいは14ヌクレオチドユニット長、9から13ヌクレオチドユニット長、10から13核酸塩基長）である第2RNA分子を含む。我々は、11、12あるいは13核酸塩基長である第1RNA分子を有するパッセンジャー鎖が特に効果的であることを見いだした。そのような態様において、不連続パッセンジャー鎖の中に追加的なRNA分子は存在しない。
一態様において、該パッセンジャー鎖は、9核酸塩基ユニットの長さを有する第1RNA分子、および12か13どちらかの核酸塩基ユニットの長さを有する第2RNA分子を含む。望ましくは、不連続パッセンジャー鎖の全長は21(9/12)あるいは22(9/13)核酸塩基である。そのような態様において、不連続パッセンジャー鎖の中に追加的なRNA分子は存在しない。
一態様において、該パッセンジャー鎖は、10核酸塩基ユニットの長さを有する第1RAN分子、および11か12どちらかの核酸塩基ユニットの長さを有する第2RNA分子を含む。そのような態様において、不連続パッセンジャー鎖の中に追加的なRNA分子は存在しない。
一態様において、該パッセンジャー鎖は、11核酸塩基ユニットの長さを有する第1RAN分子、および10か11どちらかの核酸塩基ユニットの長さを有する第2RNA分子を含む。そのような態様において、不連続パッセンジャー鎖の中に追加的なRNA分子は存在しない。
一態様において、第1、第2および適宜追加のRNA分子(即ち、全ての任意結合した核酸塩基を除いた不連続パッセンジャー鎖)を結合した長さは、18から25核酸塩基（例；18、19、20、21、22、23、24あるいは25核酸塩基長）であり、望ましくは21から23核酸塩基長(21、22あるいは23)である。
一態様において、好ましくは、任意結合した全ての核酸塩基を除いたアンチセンス鎖の長さは、不連続パッセンジャー鎖の長さと同一である。
一態様において、第1、第2および/あるいは追加的なRNA分子はヌクレオチド類似体を含む。未修飾siRNAと同等のパッセンジャー鎖よりも少ないRNA分子を含む（実際のRNAモノマー（actual RNA monomer）をわずかに含むか、全く含まない）ことから、ヌクレオチド類似体の使用は、本発明の範囲内において、RNA様構造の形成および/あるいはRNA分子の様に機能する分子の創出に有用である。例えば、DNA分子中で十分なLNAユニットを用いることで、パッセンジャー鎖として機能する分子を創出することができる。そのような態様において、第1、第2および/あるいは追加的なRNA分子(即ち、不連続パッセンジャー鎖を形成するRNA分子）のもとでは、siRNAサイレンシング複合体においてRNA分子のように機能する限り、RNA以外のヌクレオチドを含む分子あるいはRNA以外のヌクレオチドから成る分子は有用である。一態様において、第1、第2および/あるいは追加的なRNA分子といったパッセンジャー鎖は、好ましくは、少なくとも一つのLNAモノマーおよび任意のDNAモノマー（例；パッセンジャー鎖、第1、第2および/あるいはLNAおよびDNAモノマーから成る追加的なRNA分子）を含む。RNA様分子を作製するためにLNAをDNAモノマーへ包含する好ましいパターンには、１つおきあるいは２つおきの核酸塩基ポジションでのLNAの挿入が含まれる(図19に示すように)。
一態様において、該パッセンジャー鎖は、LNAおよびDNAのみの核酸塩基ユニット（例；LNAとDNAユニットの交互）を含む。
一態様において、該パッセンジャー鎖は、LNAおよびRNAのみの核酸塩基ユニット（例；LNAとDNAユニットの交互）を含む。
未修飾のDNA残基はパッセンジャー鎖において、あるいは一態様ではアンチセンス鎖においてさえも用いられることがまた想定される。
しかしながら一態様において、該パッセンジャー鎖および/あるいはアンチセンス鎖は未修飾のDNAヌクレオチドを含まない。
LNAおよび他のヌクレオチド類似体（例；2'OMethyl(2'OMe)および2'fluoro(2'F)）の組み合わせもまた、不連続パッセンジャー鎖、または不連続パッセンジャー鎖および/あるいは一態様においてアンチセンス鎖を形成する個々のRNA分子の可能な構造として考えられる。例えば、LNAと2'OMethyl(2'OMe)の交互、LNAと2'fluoroの交互、2'OMethyl(2'OMe)と2'fluoroの交互。そのような類似体リッチ鎖は、他の低いTmを有するRNAコンプレックスを考慮する場合にとりわけ有用であると考えられる。そのような類似体リッチ‘RNA'分子および鎖のさらなる利点は、ヌクレオシド間結合がヌクレアーゼ感受性である結合（例えばホスホジエステル結合あるいはリン酸塩結合）であるかそれを含む場合でさえも、in vivoにおける高い安定性および高いヌクレアーゼ耐性の分子の提供に有用である。主としてあるいは十分にホスホジエステル結合を含むRNAコンプレックスが、概してホスホロチオエート結合を有する同等の分子と比較して高い用量でより低い毒性を示すので、望ましい。
しかしながら、いくつかの態様において、RNA分子あるいは高いDNAまたはRNA含有量の鎖を用いるような場合には、ヌクレアーゼ耐性結合（例えばホスホロチオエート結合）を用いるのが望ましい。しかしながら、いくつかの出願において、ホスホロチオエート結合を有するRNAコンプレックスの使用は毒性の問題を引き起こす（例えば脳あるいは脊髄/髄液内でオリゴヌクレオチドを用いる場合）。
ホスホロチオエート結合は、アンチセンスおよび/あるいはパッセンジャー鎖分子のどちらかにおいて用いられる。一態様においてそのような鎖/分子は、他の結合、あるいは異なる結合の混合−例えば、リン酸塩とホスホロチオエート結合の両方−あるいはリン酸塩結合だけ、あるいはここに記載した他の結合、を含む。
該ヌクレオシド間結合は:-O-P(O)2-O-、-O-P(O,S)-O-、-O-P(S)2-O-、-S-P(O)2-O-、-S-P(O,S)-O-、-S-P(S)2-O-、-O-P(O)2-S-、-O-P(O,S)-S-、-S-P(O)2-S-、-O-PO(RH)-O-、O-PO(OCH3)-O-、-O-PO(NRH)-O-、-O-PO(OCH2CH2S-R)-O-、-O-PO(BH3)-O-、-O-PO(NHRH)-O-、-O-P(O)2-NRH-、-NRH-P(O)2-O-、-NRH-CO-O-、-NRH-CO-NRH-から成る群から選択され、および/あるいは、該ヌクレオシド間結合は:-O-CO-O-、-O-CO-NRH-、-NRH-CO-CH2-、-O-CH2-CO-NRH-、-O-CH2-CH2-NRH-、-CO-NRH-CH2-、-CH2-NRH-CO-、-O-CH2-CH2-S-、-S-CH2-CH2-O-、-S-CH2-CH2-S-、-CH2-SO2-CH2-、-CH2-CO-NRH-、-O-CH2-CH2-NRH-CO-、-CH2-NCH3-O-CH2-、から成る群から選択され、式中、RHは水素およびC1-4-アルキルから選択され、いくつかの態様において、好ましくは、上記に記載のような硫黄(S)含有ヌクレオシド間結合が望ましい。
パッセンジャー鎖へのニック(あるいは一態様においてはギャップ)の導入は、結果としてRNAコンプレックスの融解温度の効果的な引き下げをもたらし、コンプレックスをより分解しやすくする。一態様において、それぞれの不連続鎖分子(即ち、不連続パッセンジャー鎖を形成する、第1、第2、あるいは追加的なRNA分子)の融解温度は37℃より高い（例；少なくとも40℃、少なくとも45℃、望ましくは少なくとも50℃）。一部の不連続鎖分子の長さあるいはGC含有量が低すぎるとin vivoで二本鎖の分解を引き起こすので、Tmを上昇させるために親和性増大ヌクレオチド類似体が用いられる。しかしながら、本発明の範囲内において、それぞれの不連続鎖分子は、少なくとも3核酸塩基長（例；少なくとも4、あるいは少なくとも5、あるいはすくなくとも6、あるいは少なくとも7、あるいは少なくとも8核酸塩基長）である必要があると考えられる。
共にパッセンジャー鎖を形成する、第1および第2RNA分子、および適宜追加のRNA分子間に、不連続性が存在する。
本発明の非常に望ましい不連続性はニックである。ニックは、ホスホジエステル結合(好ましい核酸塩基内結合)の欠如により引き起こされる二本鎖核酸の一本の鎖における不連続性であると解されているが、ヌクレオチド欠失二本鎖核酸を有しない。それ故に、ニックの反対側の塩基はニックされた鎖の塩基にさらにハイブリダイズされるであろう。
本発明の別の不連続性は、選択的なニックであり、それは、糖-リン酸バックボーンにおいて(一態様においては、ホスホジエステル結合以外のもの)、1つの欠失結合あるいは1以上の欠失結合により引き起こされる二本鎖核酸の一本の鎖における不連続性であると解されているが、ヌクレオチド欠失二本鎖核酸を有しない。それ故に、ニックの反対側の塩基はニックされた鎖の塩基にさらにハイブリダイズされるであろう。
いくつかの態様において、ここで用いられるニックという用語は、‘選択的なニック'という用語を含むと認識されよう。
この文章中に用いられるギャップは、二本鎖核酸において少なくとも一つのヌクレオチドあるいはヌクレオシドあるいは核酸塩基が欠失している不連続性について言う。
本発明の望ましい態様において、ニックは、不連続パッセンジャー鎖を形成する第1および第2RNA分子、および任意の１以上の追加的なRNA分子を分断する。
望ましい一態様において、不連続パッセンジャー鎖は、第1および第2および適宜追加のRNA分子間におけるいかなるギャップも含まない。
しかしながら、一態様において、不連続パッセンジャー鎖は第1および第2および適宜追加のRNA分子間において一つ(あるいは適宜それ以上)のギャップを含むことが想定される。
一態様において、ギャップは第1および第2RNA分子を分断する。一態様において、ギャップは1-ヌクレオチドギャップである。他の態様において、ギャップは各々、2-ヌクレオチドギャップ、3-ヌクレオチドギャップ、4-ヌクレオチドギャップ、5-ヌクレオチドギャップ、6-ヌクレオチドギャップ、7-ヌクレオチドギャップ、8-ヌクレオチドギャップ、9-ヌクレオチド ギャップ、10-ヌクレオチドギャップ、11-ヌクレオチドギャップおよび12-ヌクレオチドギャップである。
一態様において、RNAコンプレックスの不連続パッセンジャー鎖はアンチセンス鎖に結合する。不連続パッセンジャー鎖がアンチセンス鎖に結合した様々なRNAコンプレックスを図5にまとめる。
それ故に、本発明の一態様において、第1RNA分子はリンカーによってアンチセンス鎖に結合している。
別の態様において、第2RNA分子はリンカーによってアンチセンス鎖に結合している。
さらに別の態様において、第1および第2RNA分子は両者ともリンカーによってアンチセンス鎖に結合している。
本発明のさらに別の態様において、リンカーは不連続パッセンジャー鎖の第1および第2RNA分子を結合する;ここで、該リンカーはここに言及される単純な（simple）ヌクレオシド間結合ではない（例えばホスホジエステル結合(リンカーが単純なホスホジエステル結合である場合、パッセンジャー鎖は通常、連続性パッセンジャー鎖である。)）。
本発明の望ましいリンカーは、一本鎖DNA、一本鎖RNAおよびPEGリンカーである。第1および第2RNA分子が一本鎖RNA(あるいは他の核酸塩基配列)により結合している場合、結果として得られる不連続性は実際には、しばしばバルジと呼ばれるもの（すなわち、不連続性サイトにおいて、パッセンジャー鎖がアンチセンス鎖に対して相補的でなく、通常は少なくとも１つの非相補的核酸塩基（例；少なくとも２つあるいは少なくとも３つの非相補的核酸塩基）から成るさらなる核酸塩基配列を含む）である。バルジの含有がRISCコンプレックスの形成に干渉すると認識され得ることから、バルジの大きさを最小（バルジは通常10非相補的核酸塩基長であることが好ましい）に保つことが望ましいであろう。
一態様において、RNAコンプレックスのRNA分子を機能的に結合する能力を有するあらゆるものがリンカーとして用いられる。しかしながら、リンカーは、各々の結合した分子に対する共有結合であり、アンチセンスあるいは不連続パッセンジャー鎖を形成する第1、第2あるいは適宜追加のRNA分子のバックボーン(すなわち、ミスマッチおよび3'突出の可能性を考慮して、逆鎖と相補的ハイブリッドを形成する核酸塩基)を形成する核酸塩基内結合以外の有機物（organic entity）であることが典型的である。
しかしながら、望ましい態様において、リンカーは一本鎖RNAである。
一態様において、リンカーは一本鎖DNA分子でない。
一態様において、リンカーは核酸塩基を含まない。
一態様において、本発明のリンカーには、アンチセンス鎖および/あるいはパッセンジャー鎖の塩基対合特性に影響しないものなどが選ばれる。
しかしながら、第1RNA分子の融解温度が所定温度での塩基対合に対して低すぎる場合、上記の第1RNA分子をアンチセンス鎖に結合することは、有効な融解温度を上昇させる可能性がある。従って、別の態様において、リンカーは、少なくとも第1RNA分子の融解温度を上昇させるように選ばれる。
本発明のリンカーにはまた、他の分子がRNAコンプレックスに接合するのを可能にする結合サイト（conjugation site）を提供するもの等も選ばれる。そのような他の分子は、例えば、細胞あるいは有機体へのRNAコンプレックスの取り込みを助ける担体である。あるいは、誘導鎖のRGPCへの結合に直接的に影響を与える（例えば、さらにアンチセンス鎖のみが結合されるのを確実にするような）分子である。
本発明の望ましい態様において、RNAコンプレックスのパッセンジャー鎖は、お互いに共有結合でなく、またアンチセンス鎖とも共有結合でない第1および第2RNA分子を含む。従って、該RNAコンプレックスは、３つの個々のRNA分子、すなわちアンチセンス鎖、および、不連続パッセンジャー鎖を共に形成する第1および第2RNA分子、を含み得る。明らかに、パッセンジャー鎖が追加的なRNA分子を含む場合、RNAコンプレックスは３以上の個々のRNA分子を含む。
一態様において、この文脈におけるRNAという用語はポリ核酸塩基配列のことを言い、それは、アンチセンス鎖にハイブリダイズされると、siRNAとして機能する能力を有するおよび/あるいは、A-型構造を形成する能力を有するコンプレックスを形成する。
一態様において、該RNA分子/パッセンジャー鎖/アンチセンス鎖は、RNA分子/パッセンジャー鎖/アンチセンス鎖中の総核酸塩基数の少なくとも10%のRNAヌクレオチドを含む（できれば、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%RNAヌクレオチド、あるいはさらに言えば100%RNAヌクレオチドなど）。
別の望ましい態様において、RNAコンプレックスのパッセンジャー鎖は共有結合でない3つのRNA分子を含む。他の態様において、該パッセンジャー鎖は、お互いに共有結合でなくアンチセンス鎖とも共有結合でない4、5および6つのRNA分子を含む。
共有結合でない２以上のRNA分子、化学合成を含むRNAコンプレックスのパッセンジャー鎖を用いる場合のほうが、連続パッセンジャー鎖の合成に比べてより容易である（すなわち、１つの長鎖RNA分子分子よりも２以上の短鎖RNA分子の合成および精製のほうが容易である）。
さらに、２以上のRNA分子の使用は、RNA分子への接合に関する合成上の自由をより多くもたらす。ひとつの利点は、分離したRNA分子が別々に接合できるので、同じ化学反応がそれぞれのRNA分子で用いられる点である。別の利点は、接合ポイントがより多いことである。例えば、２つの5-末端は、それぞれ、リガンドあるいはエフェクター分子といった特定の基に接合する。
本発明のRNAコンプレックスのパッセンジャー鎖は２以上の不連続性を含む。一態様において、該パッセンジャー鎖は２つの不連続性を含む。他の態様において、該パッセンジャー鎖は３つの不連続性、４つの不連続性、５つの不連続性をそれぞれ含む。
不連続パッセンジャー鎖の不連続性は、様々なポジションに位置する。それ故に、一態様においては、不連続パッセンジャー鎖は、アンチセンス鎖と塩基対を作るパッセンジャー鎖の第1ヌクレオチドより5'から3'方向に数えてポジション３に不連続性を有する。
他の態様において、ポジション4、ポジション5、ポジション6、ポジション、ポジション7、ポジション8、ポジション9、ポジション10、ポジション11、ポジション12、ポジション13、ポジション14、ポジション15、ポジション16、ポジション17、ポジション18、ポジション19、ポジション20、ポジション21、ポジション22、ポジション23、ポジション24、ポジション25およびポジション26に各々、不連続性がある。
望ましい不連続性は、パッセンジャー鎖の5'末端から数えてポジション8、9、10、11、12あるいは13、これらのポジションの１つにおけるパッセンジャー鎖中の単一の不連続性の大部分から成る群から選択される（例；ポジション9から12の間）。
望ましくは、RNAコンプレックスの5'-末端はリン酸化されているあるいは、リン酸化反応に利用できる。リン酸化反応に利用可能とは、5'-ヒドロキシ基が、5'-ヒドロキシ基がリン酸化されるのを防ぐであろう直接接合あるいは5'-ヒドロキシ基付近における他の基への他の接合などにより、ブロックされていないことを意味する。
故に、本発明の望ましい態様において、第1RNA分子は5'-リン酸塩および3'-ヒドロキシ基を含む。
別の態様において、第2RNA分子は5'-末端リン酸塩および3'-ヒドロキシ基を含む。
さらに別の態様において、該アンチセンス鎖は5'-末端リン酸塩および3'-ヒドロキシ基を含む。
望ましい態様において、不連続パッセンジャー鎖を形成するRNA分子（例；第1RNA分子、第2RNA分子および/あるいは追加的なRNA分子）は、少なくとも37℃（例；少なくとも40℃、少なくとも50℃、少なくとも55℃、あるいは少なくとも60℃）のTmで、二本鎖を形成するようにアンチセンス鎖に対してハイブリダイズする能力を有する。一態様において、Tmは37℃から80℃（例；50から70℃）の間である。
Tmの測定
10 mM リン酸ナトリウム/100 mM NaCl/0.1 nM EDTA、pH7.0中、3μMの合成物溶液と、10 mM リン酸ナトリウム/100 mM NaCl/ 0.1 nM EDTA、pH 7.0中、3 μMの濃度のその相補的DNAあるいはRNAオリゴヌクレオチド(望ましくはRNA)を、90℃で1分混合し、室温まで冷却する。ついで、25から95℃の範囲内において加熱率1℃/分で、260nmの吸光度を測定することにより、二本鎖の融解曲線を決定する。Tmは融解曲線の一次導関数（first derivative）の最大値として測定される。
本発明の文脈において、“相補的”とは２つのヌクレオチド配列間における互いの正確な対合能力のことを言う。例えば、オリゴヌクレオチドのあるポジションのヌクレオチドが、DNAあるいはRNA分子の相当するポジションで水素結合する能力がある場合、オリゴヌクレオチドおよびDNAあるいはRNAは、そのポジションで互いに相補的であると考えられる。オリゴヌクレオチド中の十分な数のヌクレオチドが、安定したコンプレックスを形成できるように標的DNAあるいはRNAにおいて相補的なヌクレオチドと水素結合を形成できる場合、DNAあるいはRNAおよびオリゴヌクレオチドは、互いに相補的であると考えられる。in vitroあるいはin vivoで安定であるために、該配列はその標的核酸に100%相補的である必要はなく（すなわち、それらは標的DNAあるいはRNAにおいて対応するヌクレオチドと対でない１以上のヌクレオチドあるいはヌクレオチド類似体を含む）、これらをここでは“ミスマッチ”と言う。従って、“相補性”および“ハイブリダイズ可能”という用語は、本発明の合成物が十分に強くそして特異的に標的分子に結合し、標的の正常機能が目的とする干渉を受けるという意味を含む。好ましくは、該配列は１つのミスマッチあるいは２つのミスマッチを含む。しかしながら、一態様において、3'突出の可能性は別として、本発明に記載の不連続パッセンジャー鎖およびRNAコンプレックスのアンチセンス鎖はいかなるミスマッチもなく相補的である。一態様において、相補的という用語は、二本鎖領域全体にわたって(すなわち、3'突出は除く)100%相補的であることを意味する。
本発明のいくつかの態様において、該RNAコンプレックスは１以上のヌクレオチド類似体を含むことが望ましい。
ヌクレオチド類似体の使用は、いくつかの理由がよく挙げられる。例えば、それらはコア二本鎖領域の融解温度の増大のために用いられる。第1および/あるいは第2RNA分子が短い場合、所定の温度での安定した塩基対合をサポートしない融解温度を有する。そのような場合において、LNAといったヌクレオチド類似体は融解温度を上昇させるために用いられる。ヌクレオチド類似体はまた、コア二本鎖領域の融解温度を低下させるためにも用いられる。この目的のために、塩基性ヌクレオチドが用いられる。さらには、ヌクレオチド類似体が費用あるいは合成の容易さにに関する理由で用いられる。
従って、望ましい態様において、該アンチセンス鎖はヌクレオチド類似体を含む。
別の望ましい態様において、不連続パッセンジャー鎖はヌクレオチド類似体を含む。
さらに別の望ましい態様において、パッセンジャー鎖の第1および第2RNA分子はそれぞれヌクレオチド類似体を含む。
本発明の一態様において、アンチセンス鎖中のヌクレオチド類似体の数は10である。本発明の他の態様において、アンチセンス鎖中のヌクレオチド類似体の数は、それぞれ9、8、7、6、5、4、3、2あるいは1である。
別の態様において、アンチセンス鎖の全てのヌクレオチドがヌクレオチド類似体である。
本発明の一態様において、アンチセンス鎖中のヌクレオチド類似体の数は、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12あるいは11である。
一態様において、アンチセンス鎖は、0から10（例；1から8、2あるいは3から8）のヌクレオチド類似体を含む。
同様に、本発明の別の態様において、パッセンジャー鎖中のヌクレオチド類似体の数は10である。本発明の他の態様において、パッセンジャー鎖中のヌクレオチド類似体の数は、それぞれ9、8、7、6、5、4、3、2あるいは1である。
別の態様において、パッセンジャー鎖の全てのヌクレオチドはヌクレオチド類似体である。
本発明の一態様において、パッセンジャー鎖中のヌクレオチド類似体の数は25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12あるいは11である。
一態様において、該パッセンジャー鎖は、0から10（例；1から8、2あるいは3から8）のヌクレオチド類似体を含む。
望ましい態様において、アンチセンス鎖およびパッセンジャー鎖の両者はヌクレオチド類似体を含む。
一態様において、RNAコンプレックスのヌクレオチド類似体は同一である(即ち、例えばそれらは全てLNAである)。別の態様において、様々な異なるヌクレオチド類似体が同一のRNAコンプレックス中で用いられる。
一態様において、パッセンジャー鎖のヌクレオチド類似体は同一である（即ち、例えばそれらは全てLNAである）。別の態様において、様々な異なるヌクレオチド類似体が同一のパッセンジャー鎖中で用いられる。
一態様において、アンチセンス鎖のヌクレオチド類似体は同一である（即ち、例えばそれらは全てLNAである）。別の態様において、様々な異なるヌクレオチド類似体が同一のアンチセンス鎖中で用いられる。
一態様において、パッセンジャー鎖の第1RNA分子は、１以上のヌクレオチド類似体を含む。
一態様において、パッセンジャー鎖の第1RNA分子は少なくとも２つのヌクレオチド類似体を含む。
一態様において、パッセンジャー鎖の第2RNA分子は１以上のヌクレオチド類似体を含む。
一態様において、パッセンジャー鎖の第2RNA分子は少なくとも２つのヌクレオチド類似体を含む。
一態様において、ヌクレオチド類似体は、第1および/あるいは第2RNA分子の３つの末端(5'あるいはできれば3')核酸塩基ユニット内に位置する（例；ポジション１、２あるいは３の個別の末端核酸塩基ユニット）。
一態様において、パッセンジャー鎖の追加的なRNA分子の少なくとも一つは、少なくとも一つのヌクレオチド類似体を含む。
一態様において、不連続パッセンジャー鎖の一部を形成するそれぞれの追加的なRNA分子は少なくとも一つのヌクレオチド類似体を含む。
一態様において、該不連続パッセンジャー鎖は、パッセンジャー鎖の5'末端からのポジション10および12にヌクレオチド類似体を含む。
一態様において、不連続パッセンジャー鎖の一部を形成するそれぞれのRNA分子は少なくとも一つのヌクレオチド類似体を含む。
一態様において、不連続パッセンジャー鎖を形成する第1、第2および適宜追加のRNA分子のそれぞれの該融解温度(Tm)は少なくとも40℃である。
一態様において、不連続パッセンジャー鎖を形成する第1、第2および適宜追加のRNA分子のそれぞれの長さは少なくとも３核酸塩基ユニットである。
一態様において、該アンチセンス鎖は少なくとも1つのヌクレオチド類似体を含む。
一態様において、該アンチセンス鎖は、不連続パッセンジャー鎖により形成される二本鎖領域内に、少なくとも１つのヌクレオチド類似体を含む。
一態様において、該アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の3''末端から数えて4核酸塩基内のポジション（例；アンチセンス鎖の3'末端からポジション1、2、3および/あるいは4）に少なくとも一つのヌクレオチド類似体を含む。
一態様において、アンチセンス鎖の9つ（5'側）の核酸塩基ユニットに存在している核酸塩基の少なくとも一つはヌクレオチド類似体である。
一態様において、アンチセンス鎖の3'末端の10から数えて4から10核酸塩基内の領域に存在する核酸塩基の少なくとも一つはヌクレオチド類似体である。
一態様において、該アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の5'末端からのポジション１１にヌクレオチド類似体を有する。
一態様において、該アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の5'末端からのポジション１０および１２にRNAヌクレオチドを有する。
一態様において、5'アンチセンス鎖側の核酸塩基ユニットは、RNAヌクレオチドユニットである。
一態様において、該アンチセンス鎖は少なくとも２つのヌクレオチド類似体を含む。
一態様において、リン酸結合により結合されたRNAユニットのみから成る相補的なRNA分子を有する二本鎖の中においては、該ヌクレオチド類似体はA-型(あるいは一態様においては、A/B型−すなわち、A型およびB型構造の間の形態）構造形態と適合する。
一態様において、アンチセンス鎖および/あるいはパッセンジャー鎖に存在するヌクレオチド類似体は独立して、：2'-O-アルキル-RNAモノマー(例；2'OME)、2'-アミノ-DNAモノマー、2'-フルオロ-DNAモノマー、アラビノ核酸(ANA)モノマー、2'-フルオロ-ANAモノマー、LNAモノマー、INAモノマー、から成る群から選択される。
一態様において、不連続パッセンジャー鎖(あるいはアンチセンス鎖、あるいは両方、分離されたものあるいはRNAコンプレックス内で結合された全ヌクレオチド類似体のどちらかとして)に存在するヌクレオチド類似体は、上記のヌクレオチド類似体(2'OMEだけのような個々で、あるいは、上記から選択されるような集団でのどちらか)のうち少なくとも一つを含む（例；1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24あるいは25ヌクレオチドモノマー）。
LNAは別として、望ましいヌクレオチドモノマーは、2'-O-アルキル-RNAモノマー(例；2'OME)、および2'-フルオロ-DNAモノマーを含む。
一態様において、アンチセンス鎖あるいはパッセンジャー鎖(あるいは両方、分離されたものあるいはRNAコンプレックス内で結合された全ヌクレオチド類似体のどちらかとして)に存在するヌクレオチド類似体の数は、:少なくとも一つのヌクレオチド類似体、例えば、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19あるいは少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24および少なくとも25のヌクレオチド類似体、から成る群から選択される。好ましくは、ヌクレオチド類似体の数は20未満、例えば18未満、16未満、14未満、12未満、10未満、である。
一態様において、不連続パッセンジャー鎖(あるいはアンチセンス鎖、あるいは両方、分離されたものあるいはRNAコンプレックス内で結合された全ヌクレオチド類似体のどちらかとして)に存在するヌクレオチド類似体は、少なくとも一つの2'-O-アルキル-RNAモノマー(例えば2'OME)を含む（例；1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24あるいは25の2'-O-アルキル-RNAモノマー(例えば2'OME)）。
一態様において、同一または異なって、不連続パッセンジャー鎖(あるいはアンチセンス鎖、あるいは両方、分離されたものあるいはRNAコンプレックス内で結合された全ヌクレオチド類似体のどちらかとして)に存在するヌクレオチド類似体は、少なくとも一つの2'-フルオロ-DNAモノマーを含む（例；1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24あるいは25の2'-フルオロ-DNAモノマー）。
一態様において、不連続パッセンジャー鎖に存在するヌクレオチド類似体は少なくとも一つのロックト核酸(LNA)ユニットを含む。
一態様において、同一または異なって、不連続 パッセンジャー鎖(あるいはアンチセンス鎖、あるいは両方、分離されたものあるいはRNAコンプレックス内で結合された全ヌクレオチド類似体のどちらかとして)に存在するヌクレオチド類似体は、少なくとも一つのLNAモノマーを含む（例；1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24あるいは25のLNAモノマー）。
一態様において、一つあるいは複数のLNAユニットは、D-βおよびL-α構造、あるいはそれらの組み合わせのどちらかにおいて、オキシ-LNA、チオ-LNA、およびアミノ-LNAから成る群から独立して選択される。
一態様において、アンチセンス鎖に存在するヌクレオチド類似体は、少なくとも一つのロックト核酸(LNA)ユニットを含む（例；少なくとも2, 少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19あるいは少なくとも20のLNAユニット）。好ましいLNAユニットの数は20未満である（例；18未満、16未満、14未満、12未満、10未満）。
一態様において、アンチセンス鎖に存在する全てのヌクレオチド類似体はロックト核酸(LNA)ユニットである。
望ましい態様において、該アンチセンス鎖はわずかなヌクレオチド類似体ユニット（例えばLNAユニット）を含むのみである。主として、アンチセンス鎖に存在するヌクレオチドユニットは、アンチセンス鎖の3'側半分以内（例；アンチセンス鎖のポジション1から9、アンチセンス鎖のポジション1、2、3、4、5、6、7、8または9、3突出領域内、あるいは、アンチセンス鎖の3'末端から数えて1番目、2番目あるいは3番目の二本鎖の核酸塩基ポジションのような最初の３つ以内）に配置していることが望ましい。
一態様において、パッセンジャー鎖(あるいはアンチセンス鎖、あるいは両方、分離されたものあるいはRNAコンプレックス内で結合された全ヌクレオチド類似体のどちらかとして)に存在するヌクレオチド類似体は、少なくとも一つのロックト核酸(LNA)ユニット（例；少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19あるいは少なくとも20のLNAユニット）を含む。好ましいLNAユニットの数は20未満である（例；18未満、16未満、14未満、12未満、10未満）。
一態様において、パッセンジャー鎖に存在する全てのヌクレオチド類似体はロックト核酸(LNA)ユニットである。
一態様において、不連続パッセンジャー鎖に存在するヌクレオチド類似体のうち少なくとも一つは、アンチセンス鎖に存在する相補的なヌクレオチド類似体と塩基対を形成する。
一態様において、不連続パッセンジャー鎖に存在する全てのヌクレオチド類似体は、3'突出(もしあれば)に存在するヌクレオチド類似体以外の、アンチセンス鎖に存在する相補的なヌクレオチド類似体と塩基対を形成する。
一態様において、アンチセンス鎖に存在する全てのヌクレオチド類似体は、(もしあれば)3'突出に存在するヌクレオチド類似体以外の、不連続パッセンジャー鎖に存在する相補的なヌクレオチド類似体と塩基対を形成する。
一態様において、該パッセンジャー鎖は、LNAユニットといったヌクレオチド類似体を1から5個（例えばLNAユニットを２つ）有する9から11のヌクレオチド(核酸塩基)RNA分子（例；10ヌクレオチドRNA分子）および、LNAユニットといったヌクレオチド類似体ユニットを1から5個（例えば３つのLNA残基）含有する11から13のヌクレオチドRNA分子（例；12ヌクレオチドRNA分子）から成る、あるいは含む。
一態様において、パッセンジャー鎖の第2RNA分子の３つの3'末端核酸塩基のうちの少なくとも一つは、LNAといったヌクレオチド類似体である。そのような態様において、パッセンジャー鎖の第2RNA分子の3'末端核酸塩基は、以下の核酸塩基モチーフ、Xxx-3'、XXx-3'、xXx-3'、xxX-3'、XXX-3'のうち一つを含み、ここで、xはRNAモノマーを表し、XはLNAユニットといったヌレオチド類似体ユニットを表す。この態様において、パッセンジャー鎖の第2RNA分子は、１以上のさらなるヌクレオチド類似体モノマーを含む（例；第2RNA分子の3'末端から数えてポジション4、5、6、7、8、9、10、11、12あるいは13に位置する１以上のさらなるLNAモノマー）。一態様において、パッセンジャー鎖の第2RNA分子は、3、4あるいは5つのヌクレオチド類似体ユニット（例；LNAモノマーユニット）を含む。
一態様において、パッセンジャー鎖の第2RNA分子の３つの3'末端核酸塩基のうち少なくとも一つは、LNAといったヌクレオチド類似体である。そのような態様において、パッセンジャー鎖の第2RNA分子の3'末端核酸塩基は、以下の核酸塩基モチーフ、Xxx-3'、XXx-3'、xXx-3'、xxX-3'、XXX-3'のうち一つを含み、ここで、xはRNAモノマーを表し、XはLNAユニットのようなヌレオチド類似体ユニットを表す。この態様において、パッセンジャー鎖の第2RNA分子は、１以上のさらなるヌクレオチド類似体モノマーを含む（例；第2RNA分子の3'末端から数えてポジション4、5、6、7、8、9、10、11、12あるいは13に位置する１以上のさらなるLNAモノマー）。一態様において、パッセンジャー鎖の第2RNA分子は、3、4あるいは5つのヌクレオチド類似体ユニット（例；LNAモノマーユニット）を含む。
一態様において、パッセンジャー鎖の第1RNA分子の３つの5'末端核酸塩基のうち少なくとも一つは、LNといったヌクレオチド類似体である。そのような態様において、パッセンジャー鎖の第1RNA分子の5'末端核酸塩基は、以下の核酸塩基モチーフ、5'-Xxx、5'-XXx、5'-xXx、5'-xxX、5'-XXXのうち一つを含み、この中で、xはRNAモノマーを表し、XはLNAユニットのようなヌクレオチド類似体ユニットを表す。この態様において、パッセンジャー鎖の第1RNA分子は、１以上のさらなるヌクレオチド類似体モノマーを含む（例；第1RNA分子の5'末端から数えてポジション4、5、6、7、8、9、10、11、12あるいは13に位置する１以上のさらなるLNAモノマー）。一態様において、パッセンジャー鎖の第1RNA分子は、3、4あるいは5つのヌクレオチド類似体ユニット（例；LNAモノマーユニット）を含む。
好ましくは、該パッセンジャー鎖は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23あるいは24のヌクレオチド類似体、例えば:ポジション1、ポジション2、ポジション3、ポジション4、ポジション5、ポジション6、ポジション7、ポジション8、ポジション9、ポジション10、ポジション11、ポジション12、ポジション13、ポジション14、ポジション15、ポジション16、ポジション17、ポジション18、ポジション19、ポジション20、ポジション21、ポジション22、ポジション23あるいはポジション24、から成る群から選択される5'末端からのポジションに位置するヌクレオチド類似体（例えばLNAモノマー）を含む。
一態様において、不連続パッセンジャー鎖の第2RNA分子は、１以上の2'アダマンチル-アミノおよび/あるいは2'ピレンLNAユニットを含む。
図20は、本発明に記載のRNAコンプレックスの不連続パッセンジャー鎖の第1および第2RNA分子へのLNAの導入は、パッセンジャー鎖がRNAユニットのみを含む同等のRNA分子と比べて、標的RNAのサイレンシングにおいて高い効果を提供することを示す。加えて、ヌクレオチド類似体（例えばLNA）のパッセンジャー鎖への結合およびパッセンジャー鎖の不連続性の両者の組み合わせにより、治療で用いるのに適した、高い効果を有しかつ安定なRNAサイレンシング複合体の創出を可能にする(図20参照)。
好ましくは、パッセンジャー鎖に存在するヌクレオチド類似体は、例えば2'ハロ置換RNAあるいはDNAユニット(例；2'-F-DNA)あるいは2'-O-Me-RNAといった、2'置換修飾ヌクレオチド(RNAあるいはDNA)である(図21参照)。
図22は、不連続パッセンジャー鎖（例えば本発明に記載の不連続パッセンジャー鎖）の導入により、パッセンジャー鎖がヌクレオチド類似体のさらなる修飾あるいは官能化（例；LNAあるいは官能化LNA）を可能にすることを見いだしたことを示す。
さらなる態様において、不連続パッセンジャー鎖の第2RNA分子は、:xxXxXxxxxXXx、xxxXxxxxXXxから成る群から選択される配列(5'−3')を有し、ここで、xはRNAモノマーを表し、XはLNAユニットといったヌクレオチド類似体ユニットを表す。
上記とは異なるさらなる態様において、不連続パッセンジャー鎖の第1RNA分子は、:xxXxxxxxXxから成る群から選択される配列(5'−3')を有し、この中で、xはRNAモノマーを表し、XはLNAユニットのようなヌクレオチド類似体ユニットを表す。
LNAといったヌクレオチド類似体を含むアンチセンス鎖の使用は、RNAサイレンシング複合体のサイレンシング能力の顕著な減衰あるいは破壊さえも可能である。アンチセンス鎖のヌクレオチド修飾(類似体の導入)に対するこの感受性は、in vivoでの安定性に必要とみなされているヌクレオチド類似体の導入のようなsiRNAに基づく治療の開発において障害であり、とりわけ、十分なin vivo安定性に必要なヌクレオチド類似体を安定にする投与量において、分子の治療能力を効果的に破壊する。我々は、不連続パッセンジャー鎖（例えば本発明に記載の不連続パッセンジャー鎖）の導入により、アンチセンス鎖はLNAといったヌクレオチド類似体(図23、24、および25参照)および2'-F-DNAあるいは2'-O-Me-RNAといった他のヌクレオチド類似体の投与量をかなり高くできるを可能にすることを見いだした。該利点は、アンチセンス鎖がアンチセンス鎖の３つの3'末端核酸塩基ユニット(通常はヌクレオチド修飾に対して最も感受性のない領域)の上流領域にヌクレオチド類似体を有する場合でさえも見受けられる。加えて我々は、図24において、ヌクレオチド類似体（例；2'-F-DNAあるいは2'-O-Me-RNA）のみを含むアンチセンス鎖は、不連続パッセンジャー鎖と対合した場合、標的において正当なサイレンシング効果をさらに提供できることを示す。
一態様において、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の3つの3'末端核酸塩基残基の外側にある少なくとも1つのヌクレオチド類似体を含む。
一態様において、アンチセンス鎖の全ての核酸塩基は、2'置換を有するヌクレオチド類似体（例；2'-F-DNAあるいは2'-O-Me-RNA）といったヌクレオチド類似体である。
一態様において、該アンチセンス鎖は、以下の核酸塩基モチーフ、5'-Xxx、5'-XXx、5'-xXx、5'-xxX、5'-XXXのうち一つを含み、ここで、xはRNAモノマーを表し、Xはヌクレオチド類似体ユニット（例えばLNAユニット）を表す。
好ましくは、該アンチセンス鎖は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23あるいは24のヌクレオチド類似体、例えば:ポジション1、ポジション2、ポジション3、ポジション4、ポジション5、ポジション6、ポジション7、ポジション8、ポジション9、ポジション10、ポジション11、ポジション12、ポジション13、ポジション14、ポジション15、ポジション16、ポジション17、ポジション18、ポジション19、ポジション20、ポジション21、ポジション22、ポジション23あるいはポジション24、から成る群から選択される5'末端からのポジションに位置するLNAモノマー、を含む。該アンチセンス鎖は、3つの主要な突出を有するヌクレオチド類似体（例；3'末端を形成するポジション1、2、3および/あるいはパッセンジャー鎖を有する二本鎖内）を含む。一態様において、アンチセンス鎖の5'側のモノマーはRNAヌクレオチドである。該パッセンジャー鎖は、3つの主要な突出を有するヌクレオチド類似体（例；3'末端を形成するポジション1、2、3中、および/あるいはアンチセンス鎖を有する二本鎖内）を含む。
一態様において、同一または異なって、該アンチセンス鎖は、少なくとも３つのヌクレオチド類似体（例えばLNAユニットなど）を含む。好ましくはヌクレオチド類似体ユニットの少なくとも一つがアンチセンス鎖の３つの3'末端核酸塩基モノマーの外側に位置している（例えば少なくとも２つのヌクレオチド類似体ユニットがアンチセンス鎖の３つの3'末端核酸塩基モノマーの外側に位置している、ヌクレオチド類似体ユニットの少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22がアンチセンス鎖の３つの3'末端核酸塩基モノマーの外側に位置している、ヌクレオチド類似体ユニットの1から10がアンチセンス鎖の３つの3'末端核酸塩基モノマーの外側に位置しているなど）。
一態様において、該アンチセンス鎖は3から10のヌクレオチド類似体ユニット(例えばLNAユニット）を含む（例えば4から6のヌクレオチド類似体モノマー）。
望ましい態様において、該アンチセンス鎖は１以上のヌクレオチド類似体を含む（例えばパッセンジャー鎖と相補的な二本鎖を形成するアンチセンス鎖の領域の範囲内のLNAなど）。
一態様において、該アンチセンス鎖は核酸塩基モチーフ5'-xxXxxXを含む。
一態様において、該アンチセンス鎖は以下の核酸塩基モチーフ5'-Xxx、5'-XXx、5'-xXx、5'-xxX、5'-XXXの一つを含み、ここで、xはRNAモノマーを表し、Xは例えばLNAユニットなどのヌクレオチド類似体ユニットを表す。
一態様において該アンチセンス鎖は以下の核酸塩基モチーフ5'-xxxxX、5'-xxxXx、5'-xxXxx、5'-xXxxx、5'-Xxxxx、5' xxxXX、5' xxXXx、5' xXXxx、5' XXxxx、5' xxXXX、5' xXXXx、5' XXXxx、5' xXXXX、5' XXXXx、5' XxxxX、5' XxxXx、5' XxXxx、5' XXxxx、5' XXxxX、5' XxxXX、5' XxXxX、5' XXxXX、5' XXXXXを含み、ここで、xはRNAモノマーを表し、Xは例えばLNAユニットといったヌクレオチド類似体ユニットを表す。
一態様において、該アンチセンス鎖は配列5'xxXxxXxxxxXxxXxxxxxXXx3'を含み、ここでxはRNAモノマーを表し、Xは例えばLNAユニットといったヌクレオチド類似体ユニットを表す。
一態様において、パッセンジャー鎖の第2RNA分子の３つの3'末端核酸塩基のうち少なくとも一つは、ヌクレオチド類似体（例えばLAN）である。そのような態様において、パッセンジャー鎖の第2RNA分子の3'末端核酸塩基は以下の核酸塩基モチーフXxx-3'、XXx-3'、xXx-3'、xxX-3'、XXX-3' を含み、ここで、xはRNAモノマーを表し、Xは例えばLNAユニットといったヌクレオチド類似体ユニットを表す。この態様において、パッセンジャー鎖の第2RNA分子は、例えばLNAユニットなどのさらなるヌクレオチド類似体を含む。
本発明に記載のRNAコンプレックスに用いられるロックト核酸(LNA)は、一般的化学式の構造を有する。
Figure 0005244087
XおよびYは基-O-、-S-、-N(H)-、N(R)-、-CH2-あるいは-CH- (二重結合の一部の場合）、-CH2-O-、-CH2-S-、-CH2-N(H)-、-CH2-N(R)-、-CH2-CH2-あるいは-CH2-CH-(二重結合の一部の場合)、-CH=CH-の中から独立して選択され、ここでRは水素およびC1-4-アルキルから選択され、;ZおよびZ*はヌクレオチド内結合、末端基あるいは保護基から独立して選択され、;Bは天然あるいは非天然の核酸塩基を構成し、;不斉基はどちらか一方の配向において見られる。
ホスホロチオエート結合が望ましい。しかしながら、RNAコンプレックスを形成する分子は、他の結合、あるいは異なる結合の混合−例えばリン酸結合とホスホロチオエート結合の両方、あるいはリン酸塩結合だけ、あるいはここに開示した他の結合、を含む。
“チオ-LNA"という用語は、スキーム1におけるXあるいはYのうち少なくとも一つがSあるいは-CH2-S-から選択される、ロックト核酸塩基を含む。チオ-LNAはベータ-D およびアルファ-L-構造の両方にある。
“アミノ-LNA"という用語は、スキーム1におけるXあるいはYのうち少なくとも一つが-N(H)-、N(R)-、CH2-N(H)-、-CH2-N(R)-（Rは水素およびC1-4-アルキルから選択される）から選択される、ロックト核酸塩基を含む。アミノ-LNAはベータ-Dおよびアルファ-L-構造の両方にある。
“オキシ-LNA"という用語は、スキーム1におけるXあるいはYの少なくとも一つが、-O-あるいは-CH2-O-を表す、ロックトヌクレオチドを含む。オキシ-LNAはベータ-Dおよびアルファ-L-構造の両方にある。
“エナ（ena）-LNA"という用語は、スキーム1におけるYが-CH2-O-(-CH2-O-の酸素原子が核酸塩基Bと相対的な2-ポジションに結合している)であるロックトヌクレオチドを含む。
“アルファ-L-LNA"という用語は、スキーム2(右側の構造)に示すように表されるロックトヌクレオチドを含む。
“LNA誘導体”という用語は、ベータ-D-メチレンLNAだけでなくスキーム1の全てのロックトヌクレオチドを含む（例えば、ベータ-D-オキシ-LNAを除く、チオ-LNA、アミノ-LNA、アルファ-L-オキシ-LNAおよびエナ（ena）-LNA）。
ロックトヌクレオチド'という用語は、‘ロックト核酸塩基'のことを言い、ここに定義したヌクレオチド'という用語と同じ意味では用いられない。
スキーム1において、固定された構造に4つの不斉中心が見られる。しかしながら、スキーム1における構造は必ずしも固定されてはいない。また本発明に含まれるのは、異なる配置で不斉中心が認められる一般的なスキーム1の化合物である（例えばスキーム2に表されるものなど）。従って、スキーム1の図解はが意図することは、不斉中心の配置の制限ではない。スキーム1におけるそれぞれの不斉中心は、RかS構造のどちらかに存在する。R(rectus)およびS(sinister)の定義は、IUPAC 1974 提案（Recommendations）、セクション E、Fundamental Stereochemistryに記載がある。:該ルールは Pure Appl. Chem. 45、13-30、(1976)および“Nomenclature of organic Chemistry” pergamon、New York、1979 に見られる。
ZおよびZ*は、ヌクレオシド間結合、末端基あるいは保護基の中から独立して選択される。
ヌクレオシド間結合は、:-O-P(O)2-O-、-O-P(O,S)-O-、-O-P(S)2-O-、-S-P(O)2-O-、-S-P(O,S)-O-、-S-P(S)2-O-、-O-P(O)2-S-、-O-P(O,S)-S-、-S-P(O)2-S-、-O-PO(RH)-O-、O-PO(OCH3)-O-、-O-PO(NRH)-O-、-O-PO(OCH2CH2S-R)-O-、-O-PO(BH3)-O-、-O-PO(NHRH)-O-、-O-P(O)2-NRH-、-NRH-P(O)2-O-、-NRH-CO-O-、-NRH-CO-NRH-から成る群から選択され、および/あるいは、ヌクレオシド間結合は:-O-CO-O-、-O-CO-NRH-、-NRH-CO-CH2-、-O-CH2-CO-NRH-、-O-CH2-CH2-NRH-、-CO-NRH-CH2-、-CH2-NRH-CO-、-O-CH2-CH2-S-、-S-CH2-CH2-O-、-S-CH2-CH2-S-、-CH2-SO2-CH2-、-CH2-CO-NRH-、-O-CH2-CH2-NRH-CO-、-CH2-NCH3-O-CH2-からなる群から選択され、式中、RHは水素およびC1-4-アルキルから選択される。
該末端基は、水素、アジド、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、Prot-O-、Act-O-、メルカプト、Prot-S-、Act-S-、C1-6-アルキルチオ、アミノ、Prot-N(RH)-、Act-N(RH)-、モノ-あるいはジ(C1-6-アルキル)アミノ、適宜置換されたC1-6-アルコキシ、適宜置換されたC1-6-アルキル、適宜置換されたC2-6-アルケニル、適宜置換されたC2-6-アルケニルオキシ、適宜置換されたC2-6-アルキニル、適宜置換されたC2-6-アルキニルオキシ、一リン酸塩、モノチオリン酸、二リン酸塩、ジチオホスフェート、トリホスフェート、トリチオリン酸、DNA挿入剤、光化学活性基（photochemically active groups）、熱化学活性基（thermochemically active groups）、キレート基、レポーター基、リガンド、カルボキシ、スルホノ、ヒドロキシメチル、Prot-O-CH2-、Act-O-CH2-、アミノメチル、Prot-N(RH)-CH2-、Act-N(RH)-CH2-、カルボキシメチル、スルホノメチルの中から独立して選択され、式中、Protは各々-OH、-SH、および-NH(RH)の保護基であり、Actは各々-OH、-SH、および-NH(RH)の活性化基であり、RHは水素およびC1-6-アルキルから選択される。;
ヒドロキシ置換基の保護基は、置換されたトリチル（例えば4,4'-ジメトキシトリチルオキシ(DMT)、4-モノメトキシトリチルオキシ(MMT)、およびトリチルオキシ、適宜置換された9-(9-フェニル)キサンテニルオキシ(ピキシル)、適宜置換されたメトキシテトラヒドロピラニルオキシ (mthp)、シリルオキシ（例；トリメチルシリルオキシ(TMS)、トリイソプロピルシリルオキシ(TIPS)、tert-ブチルジメチルシリルオキシ(TBDMS)、トリエチルシリルオキシ、およびフェニルジメチルシリルオキシ、tert-ブチルエーテル、アセタール (２つのヒドロキシ基を含有）、例えばアセチルあるいはハロゲン置換アセチル（例；クロロアセチルオキシあるいはフルオロアセチルオキシ、イソブチリルオキシ、ピバロイルオキシ、ベンゾイルオキシ）といったアシルオキシ、および置換されたベンゾイル、メトキシメチルオキシ(MOM)、例えば2,6-ジクロロベンジルオキシ(2,6-Cl2Bzl)といったベンジルエーテルを含む。また、ZあるいはZ*がヒドロキシである場合、リンカーを介して固体担体に任意に結合することにより、それらは保護される。
上記の態様において、Actは各々-OH、-SH、および-NH(RH)の活性化基を指す。そのような活性化基は、例えば、適宜置換されたO-ホスホルアミダイト、適宜置換されたO-ホスホルトリエステル、適宜置換されたO-ホスホルジエステル、適宜置換されたH-ホスホン酸塩（H-phosphonate）、および適宜置換されたO-ホスホン酸塩（O-phosphonate）から選択される。
本文脈において、“ホスホルアミダイト"という用語は化学式-P(ORx)-N(Ry)2の基を意味し、式中、Rxは適宜置換されたアルキル基、例えばメチル、2-シアノエチル、あるいはベンジルを指定し、それぞれのRyは適宜置換されたアルキル基、例えばエチルあるいはイソプロピルを指定し、そして基-N(Ry)2はモルホリノ基(-N(CH2CH2)2O)を形成する。Rxは望ましくは2-シアノエチルを指定し、２つのRyは望ましくはイソプロピルと同一であるかイソプロピルを指定する。従って、特に関連のあるホスホルアミダイトはN,N ジイソプロピル-O-(2-シアノエチル)ホスホルアミダイトである。
Bは天然あるいは非天然の核酸塩基の構成要素となり、アデニン、シトシン、5-メチルシトシン、イソシトシン、プソイドシトシン、グアニン、チミン、ウラシル、5-ブロモウラシル、5-プロピニルウラシル、5-プロピニル-6-フルオロウラシル、5-メチルチアゾルウラシル、6-アミノプリン、2-アミノプリン、イノシン、ジアミノプリン、7-プロピニル-7-デアザアデニン、7-プロピニル-7-デアザグアニン、および2-クロロ-6-アミノプリンの中で選択される。いくつかの態様において、本発明のオリゴマー化合物に用いられるロックト核酸(LNA)は、5-メチルシトシン、イソシトシン、プソイドシトシン、5-ブロモウラシル、5-プロピニルウラシル、6-アミノプリン、2-アミノプリン、イノシン、ジアミノプリン、2-クロロ-6-アミノプリンから成る群から選択される修飾核酸塩基である核酸塩基を含む。
望ましくは、本発明のオリゴマー化合物に用いられるロックト核酸(LNA)、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドなどは、化学式のいずれかに一致したロックト核酸(LNA)ユニットを含有する少なくとも一つのヌクレオチドを含む。
Figure 0005244087
 式中、Yは-O-、-S-、-NH-、あるいはN(RH);ZおよびZ*は、ヌクレオシド間結合、末端基あるいは保護基から独立して選択され、;Bは天然あるいは非天然の核酸塩基の構成要素となる。
LNAモノマーおよびそれらの調製は、WO 99/14226および後願であるWO 00/56746、WO 00/56748、WO 00/66604、WO 00/125248、WO 02/28875、WO 2002/094250およびWO 2003/006475に記載している。チミジンLNAモノマーの一つの特定例は、(1S,3R,4R,7S)-7-ヒドロキシ-1-ヒドロキシメチル-5-メチル-3-(チミン-1イル)-2,5-ジオキサ-ビシクロ[2:2:1]ヘプタンである。
特に望ましいLNAユニットがスキーム3に示され、式中、BおよびZ*およびZは既に定義されたものであり、式中、RHは水素およびC1-4-アルキルから選択される。
一態様において、該ヌクレオチド類似体はピレン2'-アミノ-LNAモノマー、あるいはアダマンチル2'-アミノ-LNAモノマーである。
LNAモノマー(例えばアルファ-L-LNA、チオ-LNA、アミノ-LNA）だけでなく、ENA、用いられる他のヌクレオチド類似体は、sisiRNAコンプレックスのA-型構造を分解しないもの、あるいは実際にA-型構造を促進するもののどちらかである。一態様において、HNA-ヘキシトール核酸が、例えばヌクレオチド類似体のみで、あるいはLNAヌクレオチドとともに用いられる。
望ましい態様において、該RNAコンプレックスはホスホロチオエート結合を含む。
本発明の望ましいヌクレオチド類似体は、2'-O-アルキル-RNAモノマー、2'-アミノ-DNAモノマー、2'-フルオロ-DNAモノマー、LNAモノマー、およびINAモノマーから成る群から選択されるヌクレオチド類似体である。
一態様において、該パッセンジャー鎖、例えば第1および/あるいは第2RNA分子などは、１以上のLNAモノマー(ヌクレオチド類似体)を含む。
一態様において、該アンチセンス鎖は１以上のLNAモノマー(ヌクレオチド類似体)を含む。
一態様において、前述したように、本発明のRNAコンプレックスは、連続パッセンジャー鎖を有する原RNAコンプレックスに比べて、オフターゲット効果を減少させた。
別の態様において、本発明のRNAコンプレックスは、連続パッセンジャー鎖を有する原RNAコンプレックスに比べて、免疫反応を減少させた。
さらに別の態様において、本発明のRNAコンプレックスは、連続パッセンジャー鎖を有する原RNAコンプレックスに比べて、持続効果を有する。従って、望ましい態様において、本発明のRNAコンプレックスの効果は、連続パッセンジャー鎖を有する原RNAコンプレックスに比べてより長期間にわたって効果的である。
さらに別の態様において、本発明のRNAコンプレックスは、連続パッセンジャー鎖を有する原RNAコンプレックスに比べて、増大された効果を有する。従って、望ましい態様において、該RNAコンプレックスは、原RNAコンプレックスよりも効果的にRNAiを媒介する（例えば、標的mRNAのより効率的な分解あるいは標的ｍRNAのより効率的な翻訳阻害により）。
本発明の別の態様は、コア二本鎖領域を含有するRNAコンプレックス（該RNAコンプレックスは対応する細胞内RNAのRNA干渉を媒介する能力を有する）が形成されることを条件としてパッセンジャー鎖とアンチセンス鎖をインキュベートすることを特徴とする本発明のRNA コンプレックスの調製方法である。
さらに本発明の別の態様は、ステップ：
a．標的核酸の修飾が生じ得る状況下における、本発明のRNAコンプレックスと細胞あるいは有機体との接触、
b．それによる標的核酸の修飾の媒介
を特徴とする、細胞あるいは有機体における標的核酸の核酸修飾を媒介する方法である。
一態様において、標的核酸の核酸修飾の調節の方法はin vitro(ただし細胞内)で実施される。
一態様において、標的核酸の核酸修飾の調節方法はin vivo (有機体において)で実施される。
さらに別の態様において、該方法は分離細胞で実施される。
望ましい態様において、該方法の核酸修飾はRNA干渉、標的mRNAの望ましい分解または翻訳阻害、あるいは他のタイプのRNA（例えば非コードRNA）の阻害である。
別の態様において、該核酸修飾はDNAメチル化である。
本発明の別の態様は、:
a．遺伝子によりコードされるRNA（例えばmRNAあるいは他の機能性RNA）を標的として分解やサイレンシングを行う本発明のRNAコンプレックスを細胞あるいは有機体へ導入すること、それによる被験細胞や被験有機体の生成、
b．遺伝子によりコードされるRNAの分解やサイレンシングが生じることを条件とした被験細胞や被験有機体の維持、それによる遺伝子のRNAレベルが減衰された被験細胞や被験有機体の生成、
c．ステップbで生成された被験細胞や被験有機体の表現型の観察、および観察された表現型と対応するコントロール細胞や有機体の表現型の適宜比較、それによる遺伝子の機能に関する情報の提供、
を特徴とする、細胞あるいは有機体における遺伝子の機能の調査方法である。
本発明のRNAコンプレックスは、添付の実施例に述べたように、細胞に導入される（例えば、トランスフェクションを用いて）。
有機体や細胞の表現型は、例えば、タンパク濃度を評価するプロテオミクスあるいはmRNAレベルを評価するマイクロアレイなどを用いて観察される。また、より明確な表現型（例えば特定の遺伝子の発現）が用いられる。
遺伝子の機能に関して得られた情報は、遺伝子産物が特定の疾病に関する治療行為に対する好ましい標的であるかどうかを判断するのに用いられる。従って、特定の遺伝子産物が、例えば癌の特定的なサブタイプに影響を与えると知られている特定の生化学的経路に作用することが証明されれば、該遺伝子産物は上記の癌のサブタイプの治療に関する治療行為の好ましい標的であるかもしれない。
細胞や有機体における遺伝子の機能の調査方法の望ましい態様において、該方法の核酸修飾はRNA干渉、標的mRNAの望ましい分解または翻訳阻害、である。
別の態様において、核酸修飾の修飾はDNAメチル化である。
細胞や有機体における遺伝子の機能の調査方法の望ましい態様において、該方法はin vitroで実施される。
さらに別の態様において、該方法は分離細胞で実施される。
本発明の別の態様は、ステップ:
a．該遺伝子に対応する本発明のRNAコンプレックスの細胞や有機体への導入、それによる被験細胞や被験有機体の生成、
b．標的核酸の修飾が生じることを条件とした被験細胞や被験有機体の維持、
c．被験細胞や被験有機体への媒体の導入、
d．ステップcで生成された被験細胞や被験有機体の表現型の観察および、観察された表現型と相当するコントロール細胞やコントロール有機体の表現型との適宜比較、それによる媒体が遺伝子産物に作用するかどうかに関する情報の提供、
を特徴とする、媒体が遺伝子産物に作用するかどうかの評価方法である。
ステップdの望ましいコントロールは、ステップaで導入されたRNAコンプレックスを有しない被験細胞や被験有機体である。
媒体が遺伝子あるいは遺伝子産物に作用するかどうかの調査方法の望ましい態様において、該方法の核酸修飾はRNA干渉、標的mRNAの望ましい分解または翻訳阻害、である。別の態様において、核酸修飾の修飾はDNAメチル化である。
さらに別の態様において、該方法は分離細胞において実施される。
さらなる態様において、本発明は、コア二本鎖領域を含有するRNAコンプレックスが形成されることを条件として、ここに記載のアンチセンス鎖と、不連続パッセンジャー鎖を形成する少なくとも２つのRNA分子、およびここに記載のパッセンジャー鎖の適宜追加のRNA分子をインキュベートすることを特徴とするRNAコンプレックスの調製方法を提供する。好ましくは、RNAコンプレックスと言われるものは、細胞内RNAに相当するRNA干渉を媒介することができる。
さらなる態様において、本発明は、相当する細胞内RNAのRNA干渉を調節する能力のあるコア二本鎖領域を含有するRNAコンプレックスが形成されることを条件として、ここに記載のアンチセンス鎖と、ここに記載の不連続パッセンジャー鎖を形成する少なくとも２つのRNA分子、およびここに記載のパッセンジャー鎖の適宜追加的なRNA分子とのインキュベートすることを特徴とする、RNAコンプレックスを含有する医薬組成物の調製方法を提供し、ここにおいて、該インキュベーションが医薬的に許容可能な希釈剤、担体、あるいはアジュバント内で生じるか、あるいは続いて該RNAコンプレックスが医薬的に許容可能な希釈剤、担体、あるいはアジュバントと混合されるかのどちらかである。
本発明は、ここに定義されたRNAコンプレックスの、薬剤としての使用を提供する。
本発明は、ここに定義されたRNAコンプレックスの、癌の治療薬剤としての使用を提供する。
本発明は、ここに定義されたRNAコンプレックスの、癌の治療薬剤の製造における使用を提供する。
本発明は、本発明に記載の医薬組成物を必要としている患者に投与することを特徴とする、患者の治療方法を提供する。そのような方法は癌の治療である得る(例えば、p21 ras（例；H-ras）を標的とすることにより）。
本発明のさらなる別の態様は、RNA コンプレックスおよび医薬的に許容可能な希釈剤、担体、あるいはアジュバントである(すなわち本発明は、本発明に記載のRNAコンプレックスを含有する医薬組成物あるいは治療用組成物に言及する)。本発明のRNAコンプレックスが特異的な遺伝子および遺伝子産物を標的とするように設計されることは当業者には明らかであろう。当然のことながら、RNAコンプレックスはタンパク質ではなくDNA配列あるいはRNA配列を標的とする。しかしながら、該mRNAが例えばmRNA分解あるいは翻訳阻害により修飾される場合、例えばタンパク質といった遺伝子産物のレベルは間接的に影響を受ける。また、タンパク質をコードする遺伝子の発現も影響を受ける（例えばDNAメチル化により）。
従って、別の態様は、本発明のRNAコンプレックスの薬剤としての使用である。RNAコンプレックスの特異性はもっぱらアンチセンス鎖の配列内にのみ存在するので、一度治療の標的が確認されれば、当業者は標的のレベルおよび活性に影響を与えるRNAコンプレックスを設計できる。連続パッセンジャー鎖を有する天然のRNAコンプレックスについては、ガイド配列として作用するパッセンジャー鎖に起因するオフターゲット効果の問題が残っている。
医薬組成物
医薬組成物の調製指図は、Alfonso R. Gennaro による“Remington: The Science and Practice of Pharmacy”、および以下にある。
望ましくは、本発明の化合物は、例えば、医薬的に許容可能な担体あるいは希釈剤、患者に深刻な副作用を引き起こさずに治療に有効な量を患者に運搬するために十分な量といった単位形態に含まれる。しかしながら、いくつかの治療形態において、治療療法の良好な結果を確実にするという観点においては、深刻な副作用が許容されることもある。
医薬組成物の用量は、治療する病状の重篤性および反応性、および数日から数ヶ月にわたる治療の経過、あるいは治療が効果を示すまたは病状の減衰が達成されるまでによって決まる。最適な投与スケジュールは、患者体内における薬物の蓄積の測定から計算される。最適な投与量は、個々のオリゴヌクレオチド相対力に依存して変わる。通常、in vitroおよびin vivo動物モデルにおいて効果が認められるEC50に基づいて推定される。通常、投与量は体重1kgあたり0.01μgから1gであり、1日、1週間、1か月、あるいは1年に1回以上、あるいは2から10年の各年に最低1回、あるいは数ヶ月までは何時間も持続注入することにより投与される。投与の反復率は、測定された滞留時間および体液や組織の薬物濃度に基づいて推定される。治療の成功後、病状の再発を抑えるために、患者は維持療法を受けることが望ましい。
形成された薬剤は医薬的に許容可能な結合剤およびアジュバントを含有する。カプセル、錠剤、ピルなどは、例えば以下の化合物:結合剤として微結晶性セルロース、ゴムあるいはゼラチン;賦形剤としてデンプンあるいはラクトース; 潤滑剤としてステアリン酸塩;様々な甘味料あるいは香味剤、を含む。カプセルの投与ユニットは油脂のような液体担体を含む。同様に、糖あるいは腸溶性剤でのコーティングが投与ユニットの一部であり得る。オリゴヌクレオチド剤はまた、医薬品有効成分のエマルジョンおよびミセルエマルジョンを形成する脂質でもある。
本発明の医薬組成物は、局所あるいは全身療法のどちらが好ましいか、および治療部位に依存した数多くの方法により投与される。投与は、(a)経口投与、(b)噴霧器の使用を含む粉末またはエアロゾルの吸入あるいは吹送などのような肺への投与;気管内投与、経鼻投与、(c)表皮、経皮、眼を含む局所投与、腔内および直腸投与を含む粘膜への投与;あるいは(d)静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉注射あるいは筋肉注入を含む非経口投与;あるいは、髄腔内あるいは脳室内などのような頭蓋内投与、である。一態様において、活性オリゴは、IV、IP、経口で、局所にあるいはボーラス注入法で投与されるか、または標的器官に直接的に投与される。
医薬組成物および局所投与剤には、経皮貼布、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、スプレー、坐薬、液体および粉末が含まれる。汎用の医薬的担体、水性の、粉末のあるいは油性基剤、増粘剤（濃縮剤）およびその類似物が必要あるいは望まれる。望ましい局所投与剤は、本発明のオリゴヌクレオチドが、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート剤および界面活性剤といった局所運搬剤との混合剤の中にあることを特徴とする。経口投与用の組成物および剤形には、粉末あるいは顆粒、微粒子、ナノ粒子、水あるいは非水性媒体中の懸濁液あるいは溶液、カプセル、ゲルカプセル、小袋、錠剤あるいは小型錠剤が含まれるが、これらに制限されない。非経口、髄腔内あるいは脳室内投与用の組成物および剤形には、緩衝剤、希釈剤および他の好ましい添加剤（例えば、浸透促進剤、キャリア化合物および他の医薬的に許容可能な担体あるいは賦形剤などであるが、これに限定されない）も含有する無菌水溶液が含まれる。
本発明の医薬組成物は、溶液、エマルジョン、リポソーム含有剤であるが、それに限定されない。これらの組成物は、予備液体（preformed liquid）、自己乳化固体（self-emulsifying solid）および自己乳化半固体（self-emulsifying semisolid）を含むがこれらに限定されない様々な構成要素から作られる。腫瘍組織への薬剤の運搬は、カチオン性リポソーム、シクロデキストリン、ポルフィリン誘導体、分枝デンドリマー、ポリエチレンイミンポリマー、ナノ粒子およびミクロスフェアに限定はされないがこれらを含む担体-媒介運搬により増強される(Dass CR. J Pharm Pharmacol 2002; 54(1):3-27)。
単位用量形態に都合よく存在するような本発明の製剤処方は、医薬産業において周知である一般的な手法に従って調製される。そのような手法には、薬剤担体あるいは賦形剤とともに有効成分の組成に組み込むステップが含まれる。通常、該処方は、有効成分と液体担体、あるいは細かく分割された固体担体、あるいはその両方とともに均一かつ密接に組成にに組み込まれ、その後、必要であれば、生成物を成形することにより調製される。
本発明の組成物は、多くの可能な用量形態（例えば、錠剤、カプセル、ゲルカプセル、液体シロップ、軟質ゲルおよび坐薬などであるがこれらに限定しない）のいずれにも編成される。本発明の組成物はまた、水溶液中の懸濁液、非水性あるいは混合媒体としても編成される。水性懸濁液はさらに、懸濁液の粘度を増大させる物質（例えば、カルボキシメチルセルロールナトリウム、ソルビトールおよび/あるいはデキストラン）を含む。該懸濁液はまた、安定化剤も含む。
非経口、皮下、皮内あるいは局所投与用の処方には、無菌の希釈剤、緩衝剤、弾力調整剤および抗菌加工が含まれる。活性化合物は、分解あるいは体から急速に排出されるのを防ぐ担体（インプラントあるいは放出特性をコントロールされたマイクロカプセルなど）を用いて調製される。静脈内投与のための望ましい担体は生理食塩水あるいはリン酸緩衝生理食塩水である。
本発明のRNAコンプレックスは、目的とする作用を完璧に有するあらゆる物質、あるいは目的とする作用を補完する物質と混合される。これらは、他のヌクレオシド化合物を含有する他の薬剤を含む。
本発明に記載の薬剤には、適宜、例えばさらなるアンチセンス化合物、化学療法化合物、抗炎症化合物、抗ウイルス化合物および/あるいは免疫調節化合物などの治療剤が含まれる。非ステロイド系抗炎症薬およびコルチコステロイド、抗ウイルス薬、および免疫調節剤を含むがこれらに限定されない抗炎症薬もまた、本発明の組成物の中に組み込まれる。
２以上の結合化合物は、一緒にまたは連続して用いられる（すなわち本発明に記載の化合物(RNAコンプレックス)は、ここに述べた１以上の他の治療剤より前、同時あるいは後に用いられる。）
本発明に記載のRNAコンプレックスに用いられるオリゴヌクレオチドはまた、例えば、アスピリン、イブプロフェン、サルファ剤、抗糖尿病薬、抗菌剤あるいは抗生物質といった有効な製剤原料に結合している。
一態様において、本発明に記載の医薬組成物はさらに、少なくとも一つの化学療法剤を含む。該化学療法剤は、望ましくは、副腎皮質ステロイド（例；プレドニゾン、デキサメタゾンあるいはデカドロン）;アルトレタミン(ヘキサレン、ヘキサメチルメラミン(HMM));アミフォスチン(エチヨル);アミノグルテチミド(シタドレン); アムサクリン(M-AMSA); アナストロゾール (アリミデックス); アンドロゲン（例；テストステロン）; アスパラギナーゼ(エルスパル); バシラス カルメッテ−グリン;ビカルタミド(カソデックス);ブレオマイシン(ブレノキサン); ブスルファン(ミレラン);カルボプラチン(パラプラチン);カルムスチン(BCNU、BiCNU);クロラムブシル(リューケラン);クロロデオキシアデノシン(2-CDA、クラドリビン、ロイスタチン);シスプラチン(プラチノール);シトシンアラビノシド(シタラビン);ダカルバジン(DTIC);ダクチノマイシン(アクチノマイシン-D、コスメゲン);ダウノルビシン(セルビジン);ドセタキセル(タキソテール);ドキソルビシン(アドリアマイシン); エピルビシン;エストラムスチン(emcyt);エストロゲン（例；ジエチルスチルベストロール(DES);エトポシド(VP-16、ベプシド、エトポホス);フルダラビン(フルダラ);フルタミド(ユーレクシン);5-FUDR(フロキシウリジン); 5-フルオロウラシル(5-FU);ゲムシタビン(ジェムザール);ゴセレリン(ゾダレックス);ハーセプチン(トラスツズマブ);ヒドロキシウレア(hydrea);イダルビシン(イダマイシン);イフォスファミド;IL-2(プロリュウキン、アルデスロイキン);インターフェロン アルファ(イントロンA、ロフェロンA);イリノテカン(カンプトサー);ロイプロリド(ループロン);レバミゾール(エルガミソール);ロムスチン(CCNU);メクロラタミン(ムスタルゲン、ナイトロジェン マスタード);メルファラン(アルケラン);メルカプトプリン(プリネトール、6-MP);メトトレキサート(メキセート);マイトマイシン-C(ムタムシン);ミトキサントロン(ノバントロン);オクトレオチド(サンドスタチン);ペントスタチン(2-デオキシコホルマイシン、ニペント);プリカマイシン(ミトラマイシン、ミタラシン);プロロカルバジン（マツラン）;ストレプトゾシン;タモキシフェン (ノルバデックス);タキソール(パクリタキセル);テニポシド(ブモン、VM-26);チオテパ;トポテカン(ハイカムチン);トレチノイン(ベサノイド、オールトランス型レチノイン酸);ビンブラスチン(バルバン); ビンクリスチン(オンコビン)およびビノレルビン(ナベルビン)から成る群から選択される。
ある態様において本発明は、(a)ここに記載の１以上のRNAコンプレックス、および(b)非アンチセンスメカニズムにより機能する１以上の他の化学療法剤を含有する医薬組成物を提供する。本発明の化合物(RNAコンプレックス)とともに用いられる場合、そのような化学療法剤は、個々に(例；ミトラマイシンとオリゴヌクレオチドなど)、連続して(例；ミトラマイシンとオリゴヌクレオチドを一定期間用いた後、別の薬剤とオリゴヌクレオチドを用いるなど)、あるいは１以上の他の化学療法剤と一緒に、あるいは放射線治療と一緒に用いられる。当業者には既知の全ての化学療法剤が、本発明に記載の化合物との併用療法としてここに組み込まれる。
別の態様において、本発明の組成物は、第１核酸を標的とする１以上のRNAコンプレックス、および１以上の付加化合物（例えば、第２核酸を標的とするアンチセンスオリゴブクレオチド）を含む。２以上の結合化合物は、一緒にあるいは連続して用いられる。すなわち、本発明に記載の化合物はここに述べた他の治療剤より前、同時、あるいは後に用いられる。
本発明の医薬組成物はプロドラッグの構成要素となる。それ故に、本発明の一態様において、本発明のRNAコンプレックスはプロドラッグの形をとっている。オリゴヌクレオチドはその特性により、負の電荷を帯びたイオンである。細胞膜の親油性に起因して、オリゴヌクレオチドの細胞内取り込みが、中性あるいは親油性の同等物に比べて減衰される。この“妨害”という矛盾は、プロドラッグアプローチを用いることにより回避できる（例えばCrooke, R. M. (1998) in Crooke, S. T. Antisens research and Application. Springer-Verlag, Berlin, Germany, vol. 131, pp. 103-140を参照）。このアプローチにおいて該オリゴヌクレオチドは、投与時にオリゴが中性であるので、保護された形で調製される。これらの保護基は、保護基が取り除かれることでオリゴが細胞に取り込まれるように設計される。そのような保護基の例は、S-アセチルチオエチル(SATE)あるいはS-ピバロイルチオエチル(t-ブチル-SATE)である。これらの保護基はヌクレアーゼ耐性であり、選択的に細胞内で除去される。
望ましくは、本発明の医薬組成物は、さらに抗炎症化合物および/あるいは抗ウイルス化合物を含む。
ここに述べる発明は、治療効果を有する量の本発明の医薬組成物あるいはRNAコンプレックスを投与することを特徴とする、癌の予防あるいは治療方法を包含する。
複合体（Conjugate）
本発明の一態様において、RNAコンプレックスを形成する１以上のオリゴヌクレオチドは、例えばRNAコンプレックスの細胞内取り込みを増大させるために用いられる、リガンド/複合体に結合する。この結合は末端のポジション5'/3'-OHで生じるが、リガンドは糖および/あるいは塩基でも生じる。本発明に記載のRNAコンプレックスは、通常、より多くの末端(不連続パッセンジャー鎖に起因)を有し、化学物質の取り込みを増大させる成分を結合するサイトがより多く存在する。
望ましい態様において、RNAコンプレックスを形成する分子のうち少なくとも一つ、望ましくはパッセンジャー鎖を形成する第１、第２および/あるいは追加的なRNA分子が、RNAコンプレックス（例；コレステロール）のin vivo取り込みを即興で行う成分と結合している(Soutschek ら、Nature 432 (11) pp 173 - 178参照)。
一態様において、オリゴヌクレオチドが接合し得る成長因子には、トランスフェリンあるいは葉酸が含まれる。トランスフェリン-ポリリシン-オリゴヌクレオチド複合体あるいは葉酸-ポリリシン-オリゴヌクレオチド複合体は、トランスフェリンあるいは葉酸受容体を高レベル発現している細胞により取り込まれるように調製される。複合体/リガンドの他の例は、コレステロール成分、２重挿入剤（例；アクリジン）、ポリ-L-リジン、１以上のヌクレアーゼ耐性結合基を有する“末端キャッピング（end-capping）”（例；ホスホロモノチオ酸）、および類似物である。
本発明はまた、ここに述べたような本発明に記載のRNAコンプレックス、および該複合体に共有結合している少なくとも一つの非ヌクレオチドあるいは非ポリヌクレオチド成分を含有する複合体を提供する。
望ましい態様において、本発明に記載の医薬組成物は、核酸運搬剤、すなわち、体内における治療剤の供給および分配を高める物質を含む。望ましい運搬剤としては、核酸を結合し、毒性が低く、一般的に体内での耐性が高い、非常に良好な物質であると認識されているキトサンが含まれる。それはヌクレオチドの電荷を最小に抑え、それにより良好な取り込みを可能にすると考えられる。用いることのできる代替運搬剤として（適宜他の物質（例；キトサン）とともに用いられる）、ポリエチレンイミンが含まれる。RNAコンプレックスおよび運搬剤のそのような処方が、本発明の望ましい態様である。そのような態様は、例えば、末端の結合（例；オリゴヌクレオチド合成中に核酸塩基に接合した3'末端のコレステロールの結合による）などといった上記の複合態様と組み合わせられ得る。
適切な治療標的
以下はほんの一例である。
ApoB: WO 2007/031081に記載の通り、Apo B mRNAは、例えばアステローム性動脈硬化、高コレステロール血症あるいは高脂血症の治療などにおける治療行為の適切な標的である。
スルビビン: WO 2006/050732に記載の通り、スルビビンmRNAは、例えば癌の治療などにおける治療行為の適切な標的である。
Hif-1α: WO 2006/050734に記載の通り、Hif-1α mRNAは、例えば癌疾患、炎症性疾患および眼疾患（例；癌: 多発性骨髄腫、腎臓癌、子宮頸癌、結腸癌、脳腫瘍、および 乳癌、その他:アテローム性動脈硬化症、乾癬、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、関節リウマチ、ぜんそく、炎症性大腸炎、いぼ、アレルギー性皮膚炎、炎症、および皮膚炎）の治療などにおける治療行為の適切な標的である。
Bcl2: WO 2005/061710に記載の通り、Bcl2 mRNA は、例えば癌（例；急性骨髄性白血病、びまん性（大細胞型）B細胞リンパ腫、急性リンパ性白血病、肝臓癌、腎臓癌、尿道癌および結腸直腸癌から成る群から選択される癌）の治療などにおける治療行為の適切な標的である。
P21-Ras: PCT/DK2006/000512に記載の通り、p21 rasのmRNA（例；K-ras、Ha-rasおよびN-ras）は、癌（例；固形腫瘍、癌腫、肉腫、あるいは神経膠腫）の治療などにおける治療行為の適切な標的である。
実施例の方法において、上記の標的および条件は、本発明に記載の医薬組成物による標的とされる。
本発明の他の態様と組み合わされるさらなる態様をここに開示した:
1．アンチセンス鎖、およびアンチセンス鎖にハイブリダイズした不連続パッセンジャー鎖を含有する該コア二本鎖領域を含む、標的核酸の核酸修飾を媒介する能力のあるRNAコンプレックス
2．該核酸修飾がRNA干渉およびDNAメチル化の群から選択される、請求項１に記載のRNAコンプレックス。
3．RNA干渉が標的RNAの分解あるいは標的RNAの翻訳阻害あるいは両者の組み合わせを媒介する、態様２に記載のRNAコンプレックス。
4．コア二本鎖領域が15から40のいくつかの塩基対を含む、態様１に記載のRNAコンプレックス。
5．コア二本鎖領域が18塩基対、19塩基対、20塩基対、21塩基対、22塩基対および23塩基対の群から選択されるいくつかの塩基対を含む、態様４に記載のRNAコンプレックス。
6．突出を含む、態様１−５のいずれかに記載のRNAコンプレックス。
7．２つの突出を含む、態様６に記載のRNAコンプレックス。
8．アンチセンス鎖が3'-突出を含む、態様６および７のいずれかに記載のRNAコンプレックス。
9．パッセンジャー鎖が3'-突出を含む、態様６および７のいずれかに記載のRNAコンプレックス。
10．突出の長さが1から8ヌクレオチドである、態様６−９のいずれかに記載のRNAコンプレックス。
11．突出の長さが、1ヌクレオチド、2ヌクレオチドおよび3ヌクレオチドの長さの突出の群から選択される、態様１０に記載のRNAコンプレックス。
12．少なくとも一つの平滑末端を含む、態様１−６のいずれかに記載のRNAコンプレックス。
13．RNAコンプレックスの両末端が平滑末端である、態様１−５のいずれかに記載のRNAコンプレックス。
14．コア二本鎖領域が18-22塩基対を含み、アンチセンス鎖およびパッセンジャー鎖がそれぞれ1-3ヌクレオチドの3'-突出を含む、態様１−５のいずれかに記載のRNAコンプレックス。
15．該不連続パッセンジャー鎖が、一緒に不連続パッセンジャー鎖を形成する第1および第2RNA-分子を含み、第1RNA分子がアンチセンス鎖の下流部分にハイブリダイズされ、第2RNA分子はアンチセンス鎖の上流部分にハイブリダイズされている、前述の態様のいずれかに記載のRNAコンプレックス。
16．第1および第2RNA分子がニックにより分断される、態様１５に記載のRNAコンプレックス。
17．第1および第2RNA分子が、:1ヌクレオチドギャップ、2ヌクレオチドギャップ、3ヌクレオチドギャップ、4ヌクレオチドギャップ、5-ヌクレオチドギャップ、6-ヌクレオチドギャップ、7-ヌクレオチドギャップ、8-ヌクレオチドギャップ、9-ヌクレオチドギャップ、10-ヌクレオチドギャップ、11-ヌクレオチドギャップおよび12-ヌクレオチドギャップの群から選択されるギャップにより分断される、態様１５に記載のRNAコンプレックス。
18．第1RNA分子がリンカーによってアンチセンス鎖に結合される、態様１５−１７に記載のRNAコンプレックス。
19．第2RNA分子がリンカーによってアンチセンス鎖に結合される、態様１５−１７に記載のRNAコンプレックス。
20．第1RNA分子が第1リンカーによってアンチセンス鎖に結合され、第2RNA分子が第2リンカーによってアンチセンス鎖に結合されている、態様１８−１９に記載のRNAコンプレックス。
21．第1および第2RNA分子がリンカーによって結合される、態様１５−２０のいずれかに記載のRNAコンプレックス。
22．リンカーが一本鎖RNAリンカーではない、態様１５−２１のいずれかに記載のRNAコンプレックス。
23．RNAコンプレックスが３つの個々のRNA分子、すなわちアンチセンス鎖および、不連続パッセンジャー鎖を一緒に形成する第1および第2RNA分子を含むように、第1および第2RNA分子が結合していない、態様１５に記載のRNAコンプレックス。
24．不連続パッセンジャー鎖が、:パッセンジャー鎖において、アンチセンス鎖に塩基対合するパッセンジャー鎖の第1ヌクレオチドより5'から3'方向に数えて、ポジション3、ポジション4、ポジション5、ポジション6、ポジション、ポジション7、ポジション8、ポジション9、ポジション10、ポジション11、ポジション12、ポジション13、ポジション14、ポジション15、ポジション16、ポジション17、ポジション18、ポジション19、ポジション20、ポジション21、ポジション22、ポジション23、ポジション24、ポジション25、の群から選択されるポジションに不連続性を有する、態様１５−２３のいずれかに記載のRNAコンプレックス。
25．コンプレックスの5-末端がリン酸化されるあるいはリン酸化反応に利用可能である、前述の態様のいずれかに記載のRNAコンプレックス。
26．第1RNA分子が5'-末端リン酸基および3'-末端ヒドロキシ基を含む、態様１５に記載のRNAコンプレックス
27．5'-末端リン酸基および3'-末端ヒドロキシ基を含む、態様１５に記載のRNAコンプレックス。
28．RNAコンプレックスがヌクレオチド類似体を含む、前述の態様のいずれかに記載のRNAコンプレックス。
29．アンチセンス鎖がヌクレオチド類似体を含む、態様２８に記載のRNAコンプレックス。
30．パッセンジャー鎖がヌクレオチド類似体を含む、態様２８に記載のRNAコンプレックス。
31．パッセンジャー鎖の第1および第2RNA分子がヌクレオチド類似体を含む、態様２８−３０に記載のRNAコンプレックス。
32．ヌクレオチド類似体が、2'-O-アルキル-RNAモノマー、2'-アミノ-DNAモノマー、2'-フルオロ-DNAモノマー、LNAモノマー、PNAモノマー、INAモノマー、の群から選択される、態様２８−３１のいずれかに記載のRNAコンプレックス。
33．非モジュールパッセンジャー鎖を含有する天然のRNAコンプレックスに比べてオフターゲット効果を減少させた、態様１−３２のいずれかに記載のRNAコンプレックス。
34．非モジュールパッセンジャー鎖を含有する原RNAコンプレックスに比べて免疫反応を減少させる、態様１−３２のいずれかに記載のRNAコンプレックス。
35．非モジュールパッセンジャー鎖を含有するRNAコンプレックスに比べて標的核酸における持続効果を有する、態様１−３２のいずれかに記載のRNAコンプレックス。
36．非モジュールパッセンジャー鎖を含有するRNAコンプレックスに比べて標的核酸における増大効果を有する、態様１−３２のいずれかに記載のRNAコンプレックス。
37．コア二本鎖領域を含有し、相当する細胞内RNAのRNA干渉を調節する能力のあるRNAコンプレックスが形成されることを条件として、アンチセンス鎖とパッセンジャー鎖をインキュベートすることを特徴とする、態様１−３６のいずれかに記載のRNAコンプレックスの調製方法。
38．下記工程：
a．標的特異的核酸修飾が生じ得る条件下に、態様１−３６のいずれかの該細胞あるいは有機体とRNAコンプレックスの接触させる工程、
b．それによりRNAコンプレックスのアンチセンス鎖により誘導される標的の特異的核酸修飾を媒介する工程、
から成ることを特徴とする、細胞または有機体において標的核酸の核酸修飾を媒介する方法。
39．in vitroで実施される、態様３８に記載の方法。
40．分離細胞で実施される、態様３９に記載の方法。
41．a．mRNAを狙って分解し細胞または有機体に導入することにより被験細胞あるいは被験有機体を作製する、態様１−３６のいずれかのRNAコンプレックスの導入、
b．該遺伝子のmRNAの分解が生じることを条件とした被験細胞あるいは被験有機体の維持、それによる該遺伝子のmRNAレベルが減衰された被験細胞あるいは被験有機体の作製、
c．ステップbで作製された被験細胞あるいは被験有機体の表現型の観察、および観察された表現型と相当するコントロール細胞あるいはコントロール有機体との適宜比較、それによる遺伝子の機能に関する情報の提供、
を特徴とする、細胞あるいは有機体における遺伝子の機能を調べる方法
42．遺伝子産物が治療行為の好ましい標的かどうかの決定に用いられる、態様４１に記載の方法。
43．in vitroで実施される、態様４１および４２に記載の方法。
44．分離細胞において実施される、態様４３に記載の方法。
45．下記工程:
a．mRNAを標的とする態様１−３６のいずれかのRNAコンプレックスを、分解のために細胞または有機体に導入し、それによって被験細胞または被験有機体を産生させる工程、
b．遺伝子のmRNAの分解が生じる条件下に、被験細胞または被験有機体の維持を維持し、それによって遺伝子のmRNAレベルが減少している被験細胞または被験有機体を産生させる工程、
c．被験細胞または被験有機体へ薬剤を導入する工程、
d．工程ｃで作製された被験細胞または被験有機体の表現型を観察し、相当するコントロール細胞またはコントロール有機体の観察された表現型と適宜比較し、それにより、遺伝子産物上で薬剤が機能するかどうかに関する情報を提示する工程、
から成ることを特徴とする、薬剤が遺伝子産物上で機能するかどうかを評価する方法。
46．in vitroにおいて実施される、態様４５のいずれかに記載の方法。
47．分離された細胞において実施される、態様４６に記載の方法。
48．態様１−３６のRNAコンプレックスおよび、医薬的に許容可能な希釈剤、単体あるいはアジュバントを含む医薬組成物。
49．医薬として使用される、態様１−３６のいずれかのRNAコンプレックス。
50．相当する標的核酸の核酸修飾を媒介するための、態様１−３６のいずれかのRNAコンプレックスの使用法。
51．該核酸修飾がRNA干渉およびDNAメチル化の群から選択される、態様５０に記載の使用法。
52．RNA干渉が標的RNAの分解あるいは標的RNAの翻訳阻害あるいは両者の組み合わせを媒介する、態様５１に記載の使用法。
53．オフターゲット効果を減少させた、態様５０−５２に記載の使用法。
54．インターフェロン応答を減少させた態様５０−５２に記載の使用法。
55．診断あるいは予後診断のための、態様１−３６のいずれかのRNAコンプレックスの使用法。
実施例
実験:
LNAオリゴヌクレオチドは、PCT/DK2006/000512あるいはWO2005/073378において開示あるいは参照される方法に従って、作製および精製できる。
オリゴヌクレオチドはRNA合成およびLNA合成の標準的な技術を用いて合成された。
LNAは、１以上の2'-O,4'-C-メチレン-結合リボヌクレオチド(LNAヌクレオチド)[M. Petersen; J. Wengel, Trends Biotechnol. 2003, 21, 74-81]を含むオリゴヌクレオチドである。
LNA修飾RNAは、１以上の2'-O,4'-C-メチレン-結合リボヌクレオチド(LNAヌクレオチド)を含むRNA鎖である。
LNA修飾siRNA(siLNA)は、１以上の2'-O,4'-C-メチレン-結合リボヌクレオチド(LNAヌクレオチド)を含むsiRNA構造である。
構築（Construct）
安定してEGFP(EGFP 半減期 2時間)を発現するように作製されたヒト肺ガン細胞株H1299を、Dr Anne Chauchereau (CNRS, Villejuif, France)より入手した。２つのレポーター構築、pISOアンチセンス-標的およびpISOセンス-標的は、等モル量の以下のDNAオリゴ5'-GCGACGTAAACGGCCACAAGTTC-3'(SEQ ID NO 29)および3'-TCGACGCTGCATTTGCCGGTGTTCAAGGATC-5'(SEQ ID NO 30)(アンチセンス標的)あるいは5'-CTAGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCT-3'(SEQ ID NO 31)および3'-CGCTGCATTTGCCGGTGTTCAAG-5'(SEQ ID NO 32)(センス標的)を、蛍ルシフェラーゼコード配列の下流のpISO(David Bartelより快く提供された)(Lewis, B.P. ら、(2003) Cell, 115, 787-798.)で消化されたSacI/NheIにアニーリングして導入することにより構築された。
オリゴヌクレオチドの調製
LNA-修飾RNAオリゴは、前に述べられたように、自動DNA合成装置で調製された(Singh, S. K. and Wengel, J (1988) Chem. Commun. 1247-8)。
アミダイト（amidite）Nu-2を用いた自動合成器、および文献に記載の一般的な方法(Singh, S. K. and Wengel, J (1988) Chem. Commun. 1247-8）における、アダマンチル アミノ-LNA モノマー aT (図18)のRNAへの結合を可能にする誘導体Nu-2 (Nu-1経由)の合成。
A）(1R,3R,4R,7S)-1-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシメチル)-7-ヒドロキシ-5-(1-アダマンチルメチルカルボニル)-3-(チミン-1-イル)-2-オキサ-5-アザビシクロ[2.2.1]ヘプタン (Nu-1)の合成。1-アダマンタン酢酸(233mg、1.2mmol)による開始（starting）ヌクレオシド(572 mg, 1.0 mmol)(Nucleoside 3f” in Sφrensen, M. D., Petersen, M. and Wengel, J. (2003) Chem. Commun. 2130-1)のN-アシル化が、無水CH2Cl2(10mL)中EDC×HCl (230 mg、1.2 mmol)の存在下において実施された。完了するまで(〜6時間)室温で撹拌した後、該反応混合物をCH2Cl2で希釈し、NaHCO3飽和水溶液（sat.aq.）(2回)で洗浄し、結合した有機相を乾燥させ(Na2SO4)、濾過し、減圧下で乾燥するまで濃縮させた。汚れ除去処理（work-up procedure）の後に得られた残余物をカラムクロマトグラフィー(80-95% EtOAc/軽油（light petroleum）、v/v)により精製し、ヌクレオシドNu-1 (680 mg、91%)の回転異性体（rotameric）混合物(〜1:1、1H NMRによる)を白色固体物質として得た。1H NMR (CDCl3) δ7.66 (s、1H)、7.63 (s、1H)、7.48-7.44 (m、4H)、7.37-7.20 (m、14H)、6.85-6.81 (m、8H)、5.53 (s、1H)、5.44 (s、1H)、5.14 (s、1H)、4.65 (s、1H)、4.35 (s、2H)、3.77 (s、12H)、3.61-3.42 (m、8H)、2.29 (d、J = 13.8 Hz、1H)、2.18 (d、J = 13.9 Hz、1H)、1.97 (d、J = 5.6 Hz、1H)、1.93-1.89 (m、9H)、1.73-1.60 (m、28H); 13C NMR (CDCl3) δ171.4、171.3、164.7、164.5、158.7、158.6、150.3、149.8、144.5、135.6、135.5、135.4、135.3、135.1、134.9、130.2、130.1、128.2、128.0、127.1、113.4、110.3、110.0、88.9、88.1、87.5、87.2、86.7、70.2、68.6、64.4、61.6、59.6、59.3、55.2、53.5、51.3、47.6、47.4、42.8、37.1、36.8、36.7、33.8、33.5、28.9、28.7、28.6、12.6; MALDI-HRMS: m/z 770.3396 ([M+Na]+、C44H49N3O8Na+ calcd 770.3417)。
B．(1R,3R,4R,7S)-7-(2-シアノエトキシ(ジイソプロピルアミノ)フォスフィノキシ)-1-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシメチル)-5-(1-アダマンチルメチルカルボニル)-3-(チミン-1-イル)-2-オキサ-5-アザビシクロ[2.2.1]ヘプタン(Nu-2)の合成。2-シアノエチルN,N-ジイソプロピルフォスフォルアミドクロリド酸（diisopropylphosphoramidochloridite）(247 mg、1.04 mmol)を、ヌクレオシド Nu-1 (650 mg、0.87 mmol)とN,N-(ジイソプロピル)エチルアミン(1.0 mL)/無水CH2Cl2 (10 mL)の撹拌溶液に滴下添加した。室温で14時間撹拌した後、該反応混合物をCH2Cl2(50mL)で希釈した。該有機相をNaHCO3 飽和水溶液（sat. aq.）(2×50 mL)で洗浄し、乾燥させ(Na2SO4)、濾過し、減圧下で濃縮した。得られた残余物をカラムクロマトグラフィー (50-60% EtOAc/n-ヘキサン、v/v)により精製し、ヌクレオシドアミダイトNu-2 (685 mg、83%)を白い発泡体として得た。31P NMR (CDCl3)δ151.1、151.0、150.7、149.4; MALDI-HRMS: m/z 970.4457 ([M+Na]+、C53H66N5O9PNa+ calcd 970.4496).
文献(Sφrensen, M. D., Petersen, M. and Wengel, J. (2003) Chem. Commun. 2130-1)に記載の通りに、自動合成器を用いてピレニルアミノ-LNAモノマー pT (図18) のRNAへの挿入を実施した。
本研究において用いられたオリゴヌクレオチド:
siRNAコントロール:
eGFPsiRNA
SEQ ID NO:1 5'-GACGUAAACGGCCACAAGUUC
SEQ ID NO:2 3'-CGCUGCAUUUGCCGGUGUUCAｆ
siRNA-mismatch
SEQ ID NO:3 5'- GACUUAGACUGACACAAGUUC
SEQ ID NO:4 3'- CGCUGAAUCUGACUGUGUUC
siRNA-BCR-ABL
SEQ ID NO:5 5'-GCAGAGUUCAAAAGCCCUUUU
SEQ ID NO:6 3'-UUCGUCUCAAGUUUUCGGGAA
センスオリゴヌクレオチド:
SEQ ID NO:7、別称W004: 5'-GAC MeL GUAAAC MeL G
SEQ ID NO:8、別称W005: 5'-GCC MeL AC MeL AAGUT L C MeL U
SEQ ID NO:9、別称W037: 5'-GAC MeL GUAAAC MeL GGCC MeL AC MeL AAGUT L C MeL U
SEQ ID NO:10、別称JW1106: 5'-GAC MeL GUAAAC MeL GGCCAC MeL AAGUT L C MeL U
SEQ ID NO:11、別称W034: 5'-GAC MeL GUAAAC MeL GG
SEQ ID NO:12、別称W035: 5'-CC MeL AC MeL AAGUTLC MeL U
SEQ ID NO:13、別称W036: 5'-GCC MeL AC MeL AAGUT L C
SEQ ID NO:14、別称W040: 5'-GACGUAAACG
SEQ ID NO:15、別称W041: 5'-GCCACAAGUUCU
SEQ ID NO:17、別称JW1105: 5'-GA L CG L UAAACGGCCACAAGUT L C MeL U
アンチセンスオリゴヌクレオチド
SEQ ID NO:16、別称JW1103: 5'-ACUUGUGGCCGUUUACGUCGLCMeLU
SEQ ID NO:18、別称W010: 5'-ACT L UGT L GGCCGUUT L ACGT L CG L C MeL U
さらなるオリゴヌクレオチドs
SEQ ID NO:19 W006_GFP1-a ACUUGUGGCCGUUUACGUCG L C MeL U
SEQ ID NO:20 W038_GFP1-s GAC M GUAAAC M G
SEQ ID NO:21 W039_GFP1-s GCC M AC M AAGUU M C M U
SEQ ID NO:22 W056_GFP1-s GACfGUAAACfG
SEQ ID NO:23 W057_GFP1-s GCCfACfAAGUTfCfU
SEQ ID NO:24 W058_GFP1-s GCCfACAAGUTfCfU
SEQ ID NO:25 W074_GFP1-a ACUUGUGGCCGUUUACGUCGLC
SEQ ID NO:26 W075_GFP1-a ACUUGUGGCCGUUUACGUC MeL GLC
SEQ ID NO:27 W038_GFP1-s GACMGUAAACMG
SEQ ID NO:28 W039_GFP1-s GCCMACMAAGUUMCMU
多重鎖パッセンジャー鎖の短鎖sisiRNA鎖（short sisiRNA strands）:
Figure 0005244087
W037はW004およびW005の連続バージョンに相当する。W034およびW035は、ニックが3'-末端方向に１ポジションシフトしたW004およびW005対の変異体である。W040およびW041は、W004およびW005のRNAバージョンである。W036はW005と同等であるが、3' 末端 U-残基を有しない。
W004は5'SS1、W005は3'SS1、WO37はSS1、WO34は5'SS3、WO35は3'SS3、WO36は3'SS5およびJW1103はAS1である。
上付き文字の小さい“L”は残基がLNA核酸塩基であることを示す。
上付き文字の小さい“MeL”は、残基が5-メチルシトシン対を有するLNA核酸塩基であることを示す。
上付き文字の大文字“M”は、残基が2'-OMe核酸塩基であることを示す。
上付き文字の小さい“f”は、残基が2'-フルオロ核酸塩基であることを示す。
本発明の組成物における使用のための治療用sisiRNAコンプレックス。
Figure 0005244087
-Cl-3'は3'末端コレステロール結合オリゴヌクレオチドを示す。
該sisiRNA治療用化合物は、適宜RNA分子の3'末端にコレステロールが結合している（例えば、第1あるいは第2パッセンジャー鎖あるいはアンチセンス鎖のどちらか）。
本発明に記載の医薬組成物は好ましくはキトサン（例えば、pH 5.5の200μlの0.2 M 酢酸ナトリウム緩衝液を添加したpH 5.5の1mg/ml溶液において800μlのキトサンを用いて形成された粒子として添加される）を含む。例えば20μlの250μMsisiRNA溶液を用いて複合体が作製される。
ここに記載のようなsisiRNA構造を用いることで、治療用sisiRNAコンプレックスも多くの他の治療標的に（例えばこれまではsiRNAが用いられてきた標的（以下の参照において同定された標的配列））対して構築できる。
スルビビン:
Beltramiら、J.Biol.Chem., 279, 2077-2084.
Coma, S. ら、Oligonucleotides , 14, 100-113.
Ning ら、Int.J.Oncol., 25, 1065-1071.
ApoB:
Soutschek, ら、Nature, 432, 173-178.
Hif-1a:
Jiang G ら、Eur J Pharmacol. 2007 Feb 8
Jiang M ら、J Vasc Res. 2006;43(6):511-21.
Ono Y ら、J Cell Biochem. 2006 Jun 1;98(3):642-9.
K-ras:
Chen LM ら., World J Gastroenterol. 2005 Feb 14;11(6):831-8.
siRNA Sequence:
Kim IA, ら., Cancer Res. 2005 Sep 1;65(17):7902-10.
Bcl2:
Miura Yら., Apoptosis. 2006 Oct;11(10):1825-35.
トランスフェクション
センスおよびアンチセンス鎖を、20 mM 等モル濃度のアニーリング緩衝液(10 mM Tris-HCl、pH 7.3、50 mM NaCl)において混合し、95℃で1分および37℃で1時間インキュベートした。フローサイトメトリーに用いる細胞は6-wellプレートに播種し、10% FBS、1%ペニシリン/ストレプトマイシン含有RPMI-1640において、60-80%の密集度になるまで育成された。細胞を、Cells Mirus TransIT-TKO 試薬を用いて製造者の指図書に従い、トランスフェクトした。最終的なRNAコンプレックス濃度は10-50 nMであった。24時間培養後、新鮮な培地を添加し、細胞をRNAおよび蛋白分析の前にもう一度24時間培養した。EGFP蛋白発現を、約5 x 104の細胞とその平均について計測するフローサイトメトリー分析により測定した。ノーザンおよびウエスタン解析に用いる細胞は、約20%の密集度に播種し、Bio-Rad Silentfect トランスフェクション試薬(50 nM 最終RNA濃度)を用いて、製造者の指図書に従い、トランスフェクションした。24時間後、新鮮な培地で満たして細胞をもう一度24時間培養した後、Lipofectamine2000 (50 nM 最終RNA濃度)を用いてメーカーの指図書に従い再トランスフェクションを行うか、またはウエスタンあるいはノーザン解析のために採取した。ウエスタンブロット法は以下のように実施した：細胞をPBSで2回洗浄し、同量の細胞を、90℃において10分に分けて2回、優しくピペッティングすることにより、2 x SDSサンプルバッファー[4% ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、20% グリセロール、125 mM Tris/HCl pH 6.8、0.01 mg/ml ブロモフェノールブルー、10% b-メルカプトエタノール]に溶解させた。タンパクを12% SDS アクリルアミドゲルで分離し、PVDFメンブレン(Immobilon)に一晩エレクトロブロットした。該フィルターを10% w/vミルク含有PBSで1時間ブロッキングした。EGFP蛋白は、1:1000希釈のウサギポリクローナルEGFP抗体を用いて検出した。マウスhnRNP C1 抗体はSeraphin Pinol-Romaより与えられた。視覚化のため、西洋ワサビペルオキシダーゼ(hrp)結合二次抗体(DAKO)をECL試薬(アマシャム バイオサイエンス)とともに用いた。EGFP mRNAを、ノーザンブロット法の標準的な方法に従い、分析した。
mRNAおよび蛋白の定量
eGFP蛋白の発現は、フローサイトメトリーにより分析した。ウエスタンブロット法を以下のように実施した: 細胞をPBSで2回洗浄し、同量の細胞を、90℃で10分に分けて2回、優しくピペッティングすることにより2 x SDSサンプルバッファー[4% ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、20% グリセロール、125 mM Tris/HCl pH 6.8、0.01 mg/ml ブロモフェノールブルー、10% b-メルカプトエタノール]に溶解させた。タンパクを8% SDS アクリルアミドゲルで分離し、PVDFメンブレン(Immobilon)に一晩エレクトロブロットした。該フィルターを10% w/vミルク含有PBSで1時間ブロッキングした。EGFP蛋白は、1:1000希釈のウサギポリクローナルEGFP抗体(Santa Cruz Biotechnology)を用いて検出した。マウスhnRNP C1 抗体はSeraphin Pinol-Romaより与えられた。視覚化のため、西洋ワサビペルオキシダーゼ(hrp)結合二次抗体(DAKO)をECL試薬(アマシャム バイオサイエンス)とともに用いた。EGFP mRNAを、ノーザンブロット法の標準的な方法に従い、分析した。
安定性分析
RNA/LNA コンプレックスはD-MEM (Gibco)に希釈した10%ウシ胎仔血清中において37℃で培養した。5 μlのサンプルを指示された時点で回収し、15 μl 1.33 × TBE/10%グリセロール ローディングバッファー中でドライアイスにより即座に凍結し、15%ゲルにおける非変性PAGEを施した。RNA'sはSYBR gold (インビトロジェン)を用いて視覚化した。
インターフェロン応答分析
siRNA-変異体(80 nM)あるいはpoly(I:C)(0,8 μg/ml)を、TransIT-TKO（登録商標）トランスフェクション試薬(Mirus)を用いて製品プロトコールに従い、T98G細胞にトランスフェクトした。T98G細胞を10% FCS含有DMEM (Gibco)中で培養した。トータルRNAをTrizol (インビトロジェン)を用いて精製し、DNase処理、oligo-dT-primed逆転写を施した。qPCRは、platinum SYBR（登録商標）Green qPCR supermix (インビトロジェン)を用いてStratagene Mx3005p qPCR systemにより実施した。ISG56の増幅に用いたプライマー: 5'-AAGGCAGGCTGTCCGCTTA-3' および5'-TCCTGTCCTTCATCCTGAAGCT-3'。GADPHの増幅に用いたプライマー: 5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3'および5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。PCR条件は: 1 サイクル: 95℃ 10 分、40 サイクル: 95℃ 30 秒、55℃ 1分、72℃ 30 秒、 1 サイクル: 95℃ 30秒、55℃ 1 分、95℃ 1 分である。mRNAレベルの相対的定量はΔΔCT-methodを用いて行われた。該実験は3回行われ、siRNA-処理細胞のISG56レベルはTransIT-TKO 処理コントロールにノーマライズした。
デュアル ルシフェラーゼ アッセイ
H1299細胞を、6-wellプレート、10%ウシ胎仔血清添加RPMI中に播種し、密集度40-60%になるように一晩培養した。製品プロトコールに従って、6μl TransIT-LT1 (Mirus)と6μl TransIT-TKO(Mirus)の同時使用により、pISOアンチセンス-targetおよびpISOセンス-target(1μg)を0.002μg pRluc-N2 (Perkin-Elmer)およびsiRNA二本鎖(10 nM 最終濃度)で、同時トランスフェクトさせた。48時間のトランスフェクション後、“Dual- luciferase reporter assay system” (Promega)を用いて製品プロトコールに従い、デュアル ルシフェラーゼ アッセイを行った。ルシフェラーゼ活性を、Lumat LB 950 luminometer (Berthold)で測定し、ウミシイタケルシフェラーゼシグナルにノーマライズした。
実施例1:血清中で高い安定性を有する三量体RNAコンプレックスの構造
低分子内部セグメント化干渉RNA(sisiRNA)は、不連続アンチセンス鎖および連続アンチセンス鎖を含む二本鎖のことである。我々は最初に、3'-末端近くに２つのLNA残基を含有するアンチセンス鎖(JW1103)および、２つのRNA分子;W004（２つのLNA残基を有する10 ヌクレオチド RNA 分子）およびW005（３つのLNA残基を含有する12 ヌクレオチド RNA分子）を含有する不連続パッセンジャー鎖、から成るsisiRNA構造を検証した。
LNA修飾sisiRNAは10%血清中において、通常のsiRNA (eGFPsiRNA)よりも顕著に安定であり、通常のsiRNAは数時間のうちにわずかなヌクレオチドを急速に短縮し、1-2日でさらに短縮した(図7、上のパネルと比較)。対照的に、sisiRNAサイズの極めて小さな減少のみが、5-日間培養後に観察されたが、これはW005の3-末端における3'U残基の除去を反映している可能性がある(図7、下のパネル)。このUは、合成を容易にするために追加の未修飾ヌクレオチドとして加えるだけのものであるので、単にsisiRNAの効能を増大させるだけのはずである。sisiRNAと、センス鎖にニックを有さない通常のLNA-修飾構造を比較する場合(JW1103およびJW1106含有siLNA; 図7、真ん中のパネル)、全体的な安定性は類似しているけれども、通常のsiLNAはわずかに短い分解産物をもたらした。移動度シフトにおけるこの違いに関する的確な理由はこれ以上特徴づけられなかった。
実施例2：sisiRNAのRNAi活性
ニックされたセンス鎖を含有するsiRNAは、機能的に完全である。:標準的なsiRNAおよび非関連コントロールsiRNAをともに、該構造を、弱体化したEGFPを安定して発現するH1299 肺カルシノーマ細胞株にトランスフェクションすることにより検証した。その後、EGFP mRNAのレベルおよびタンパク発現を、蛍光顕微鏡検査法、ノーザンブロット、ウエスタンブロットおよびフローサイトメトリーに基づいて測定した。50 nM LNA-修飾sisiRNAあるいはsiRNAによる処理細胞は、ノックダウン48時間後の10倍に匹敵した。短いセンス鎖(5'SS1あるいは3'SS1)の一つあるいは両方の除外は、sisiRNAの活性を除去し、これによりLNA修飾sisiRNAの活性が３つの全ての鎖の存在に完全に依存していたことを示唆した。それ故に、短期的な研究においては、該sisiRNA構造は標準的なsiRNAと類似したサイレンシング効率を有する。
活性化RISCへのセンス鎖の取り込みを除去するため、２つの短いセンス鎖で補完された無傷のアンチセンス鎖により特徴づけられる新規siRNA構造を利用した。我々は、そのような３分子構造へのLNAヌクレオチドの挿入により、十分な安定性とdsRNAの構造的模倣がなされ、RNA干渉作用を可能にしたと予想した。我々は当初、増強緑色蛍光タンパク質(EGFP)をコードするmRNAにおいて、以前に確立した機能的標的に対する10塩基および12塩基センス鎖から構成されるsisiRNAを構築した。該sisiRNA構造を安定化させるために、我々はLNAを、センス5'および3'ハーフ鎖（half-strands）におけるそれぞれ２つおよび４つのポジション、およびアンチセンス鎖の3'末端の近く、そしてこれら３つの鎖(JW1103、W004およびW005)から成る集合構造に組み込んだ。アンチセンス鎖および不連続パッセンジャー鎖(JW1103、W004およびW005)を含有するsisiRNAは、細胞におけるeGFP発現の視覚的検査に基づく完全な機能(図8)およびeGFPタンパク質(図9A)およびeGFP mRNA (図9B;レーン 1-6)をノックダウンする能力を保持している。
コンプレックスからW004あるいはW005あるいは両方のいずれかが除去されると、mRNAおよびタンパク発現のレベルの両方で干渉機能が完全になくなったことから、両方のセンス鎖が存在している(不連続パッセンジャー鎖を形成する該２つのRNA分子)ことが重要である(図8および9)。
長期的なノックダウンにおけるLNA-修飾sisiRNAおよび標準的なsiRNAsの能力を検証するために、細胞を４８時間後に再トランスフェクトし、120時間（5日）あるいは180時間（7.5日）後に採取した。120時間後、siRNA処理細胞はおよそ50%のEGFP mRNA およびいくらかのEGFPタンパク発現(図9B)を回復した。対照的に、LNA修飾sisiRNA処理細胞は、EGFPmRNAおよびタンパク発現の両方が低く保持されていた(図9と10)。LNA修飾sisiRNAで処理された細胞においては、180時間後でさえもEGFP発現の著しいノックダウンがまだ観察された一方、EGFP発現は標準的なsiRNAで処理された細胞においては完全に回復した(図10A)。それ故に、標準的なsiRNAに比べて、sisiRNAは細胞培養における持続的サイレンシング活性を示す。
実施例 3：sisiRNAの機能と他のsiRNA/LNA構造の比較
通常のsiRNA/LNAと比較したsisiRNAの効力を評価するために、我々は、sisiRNA、以前は高い活性のsiLNA構造として特徴づけられていた２つのsiLNA構造(JW1103+JW1105とJW1103+JW1106)および通常のsiRNAを用いて、HT1092細胞をトランスフェクトした。
該sisiRNA、siLNAおよび標準siRNAの効率は非常に類似しており、全て、10-50 nM 濃度で80-90%のノックダウンを施す(図11A)。
低濃度で機能の違いが明らかになるかどうか調べるために、該二本鎖を10 pMから100 nM の濃度で供給した。さらに、sisiRNAのように同一のLNA修飾パターンを含む連続二本鎖(JW1103およびW037)が含まれる。さらに、RNAi能力における著しい違いは観察されなかった(図11B)。特に、二本鎖が極めて低い濃度(10pM)で供給された場合、全ての二本鎖は約50％のノックダウンをもたらした。
実施例 4：sisiRNA構造の最適化
sisiRNA構造における柔軟性を調べるために、我々は、一連の異なるセンスおよびアンチセンス鎖について検証した。
未修飾不連続センスRNA、W004およびW005にそれぞれ相当するW040およびW041をもちいることで、LNA-修飾sisiRNAに比べていくらか活性が減衰されたけれどもRNAi活性を誘導するコンプレックスをもたらした(図12における柱1および2の比較)。
sisiRNAのセンス鎖においてニックを3'末端方向に１ヌクレオチド移動させると(11+11構造)、RNAi機能を妨げない(柱5、図12)。
合成上の技術的理由で、付加的なU-残基がW005の3'末端に存在した。この残基がRNAコンプレックスの機能に影響を与えるかどうか検証するために、末端U-残基を有せずに新しいオリゴを合成した(W036)。この変化は、構造の機能をほとんど変えなかった(柱4、図12)。
以前にアンチセンス鎖の大幅な修飾はRNAi機能を強く妨害することを見いだしたことから、JW1103は3'末端の近くに２つのLNA残基を含むのみである。不連続センス鎖が、限定された修飾ヌクレオチドを有するアンチセンスの要求に影響を及ぼすかどうかを調べるために、センス鎖と6LNA残基を含む高度に修飾されたアンチセンス鎖の同じ組み合わせを検証した(W010)。このアンチセンス鎖は、連続性修飾センス鎖と対を作る場合には本質的に不活性である(W037;柱8、図12)。
興味深いことに、不連続センス鎖が用いられる場合、この要求はあまり強くなく、ノックダウン効率が約２倍減少しただけであった(それぞれ、柱6、7、9および10と1、2、4および5の比較;図12)。
従って、不連続パッセンジャー鎖を用いる場合、より多くのLNA残基を有する、潜在的により安定なアンチセンス鎖を用いることが可能である。
実施例 5：sisiRNAの免疫反応
核酸の化学的修飾は、培養細胞および動物における細胞の免疫反応に対して劇的な影響を有し得る。sisiRNA構造の免疫特性を解析するために、ヒト神経膠芽腫T98G細胞株を80nMの異なるsiRNA構造でトランスフェクトし、タイプI IFNとdsRNAの両方により強く誘導されるISG56の導入を測定した。siRNAトランスフェクションにおけるPKR-媒介ISG56誘導はT98G細胞において以前に報告されたが、ISG56誘導における著しい違いは、sisiLNA、siLNAおよび未修飾siRNAの間で観察されなかった(図13)。対照的に、poly(I/C)はISG56を数百倍誘導した。我々は、sisiRNAは80nMのsiRNA濃度ではインターフェロンαを顕著には誘導しないと結論づける。
実施例 6：オフターゲット効果の減少
目的とするパッセンジャー鎖の不連続性は、それ自体のRISCコンプレックスへの組込みを排除するであろう。この仮説を検証するために、EGFP標的配列を、ルシフェラーゼレポーター構築の3'UTR内のセンスあるいはアンチセンスの位置のいずれかに挿入した(図14)。この方法は、パッセンジャー鎖の結合から導かれるノックダウン効果の評価を可能にした。目的通り、sisiLNA構造は同等のsiRNAおよびsiLNA二本鎖よりも顕著に特異的であった。EGFPセンス標的を内部に含有するmRNAによるルシフェラーゼ発現は、sisiRNAにより、リバース（reversed）標的を含有するmRNAによるよりも8倍多く減衰された。対照的に、siLNAおよびsiRNAは、２つの構造間でおよそ３倍の差が出たのみであった。この研究で用いられたEGFP標的配列が、最適な標的であるための熱力学的法則のほとんどを満たすDharmacon製の市販のEGFP siRNAに相当することを考慮すると、特異性におけるこの進歩は驚くべきことである。準最適なパッセンジャー鎖ををなんとかして強制的にRISCに入れ込むことが可能かどうか検証するために、無傷のパッセンジャー鎖およびニックされたアンチセンス鎖(sisiLNAリバース)を有する新しいLNA-修飾sisiRNAを合成し、フォワードおよびリバース標的を含有するmRNAノックダウン能力を検証した。標的選択はリバースではなかったけれども、sisiLNAリバースはリバース標的を含有する転写産物のノックダウン(50%)を他のどのsiRNA構造よりも強く示し、センス標的においては最も弱い活性であった(図14)。これらのデータは、sisiRNAが対象の標的に対して著しく特異的であることを明らかに証明する。
実施例 7：80%血清における安定性
siRNA、sisiRNAおよびsiLNAの安定性を、80%FCSにおける培養によりさらに検証した(図15)。sisiRNAおよびsiLNAの両方とも、未修飾siRNAに比べて増大した血清安定性を示した。
実施例 8：sisiRNAセンス鎖ニックのポジションおよびサイズ
sisiRNA構造をさらに最適化するために、一連の異なるセンスおよびアンチセンス鎖を検証した。一態様において、センス鎖におけるギャップのポジションを、研究の開始時からRISCにおけるAgo2に対する天然（natural)切断部位であると報告されていた5'末端(AS1+5'SS4+3'SS4; sisiRNA9+13)方向に１ポジション、あるいは3'末端(AS1+5'SS3+3'SS3; sisiRNA11+11)方向に１ポジションのいずれかに移動させた。sisiRNA11+11構造については、サイレンシングにおけるわずかな減衰のみが観察された一方、sisiRNA9+13構造は遺伝子サイレンシングにおいてわずかに低い効率であった(図16A)。センス鎖のギャップサイズの1から2ヌクレオチドへの増大は、ギャップのポジションに関わらず、sisiRNA活性の劇的な減衰をもたらした(データ非公表)。それ故に、sisRNA10+12構造は検証された全てのsisiRNAsのうちで最も効率的であることが分かった。該3'SS1鎖は当初、化学的合成を容易にするために、3'末端に付加的なU-残基を含むように構築された。この残基がsisiRNA活性に影響を及ぼすかどうか検証するために、3'SS5をこの末端U-残基(3'SS5)なしで合成した。この変更は、構造の活性にほとんど変化を与えなかった(柱2および4の比較、図16B)。
実施例 9：センス鎖の不連続性がその誘導機能を完全に排除する
目的とするセンス鎖の不連続性が遺伝子サイレンシングに対する寄与を排除するかどうか検証するために、EGFP標的配列をルシフェラーゼレポーター構築の3'UTR内のsiRNAEGFPアンチセンスあるいはセンス鎖のいずれかに挿入した(図17)。この方法は、アンチセンスおよびセンス鎖挿入によるノックダウン効果の特異的な評価を可能にした。予測したように、標準的なsiRNA構造を有するセンス鎖による約50%のノックダウンが常に認められたことから、LNA修飾sisiRNA構造は、同等のsiRNAおよびLNA修飾siRNA二本鎖よりも著しく特異的であった(柱1および2、図17)。対照的に、ミスマッチコントロールに比べてsisiRNA構造は、アンチセンス鎖により媒介される強力なノックダウンを有することなく、“センス標的”のサイレンシングを完全に無効にした(柱3、図17)。ニックを有する他の最適なアンチセンス鎖のサイレンシング機能を無効とすることが可能かどうか検証するために、無傷のセンス鎖および不連続アンチセンス鎖を有する別のLNA修飾sisiRNA(5'AS2、3'AS2、SS3)の、アンチセンスおよびセンス標的をノックダウンする能力について検証した。この構造はアンチセンス標的のサイレンシングを完全に排除したけれども、センス標的のサイレンシングは標準的なsiRNAに匹敵するレベルを維持していた(柱4、図17)。これらのデータを総合すると、sisiRNA構造は通常のsiRNA構造に比べて対象とする標的に対する非常に高いレベルの特異性を示すことが明瞭に証明される。
実施例 10： sisiRNA構造は高いレベルのアンチセンス鎖修飾に適合する
我々および他の者は、アンチセンス鎖の大規模なLNA-修飾が、標準的なsiRNA構造におけるRNAi活性を強く妨害することを以前に見いだした(図18、柱5およびデータ非公表)(Elmen, J.,ら (2005) Nucleic Acids Res, 33, 439-447., Braasch, D.A.ら、(2003) Biochemistry, 42, 7967-7975.)。従って、我々は当初、3'末端付近に２つのLNA残基のみを含むようにAS1を構築した。センス鎖の不連続性がアンチセンス鎖の本体の未修飾残基の要求に影響を与えるかどうか調べるために、６つのLNA残基を含有する高度に修飾されたアンチセンス鎖(AS2)を有するLNA修飾sisiRNAを検証した。このアンチセンス鎖は、全てのRNAセンス鎖(データ非公表)あるいはLNA修飾センス鎖(LNA修飾siRNA二本鎖 AS2+SS1 図18B、柱2)と対合する場合、本質的に不活性である。興味深いことに、sisiRNA構造を用いる場合には、アンチセンス鎖の未修飾残基に対する要求はあまり強くなかった(柱2と3の比較、図18B)。3'末端の短縮されたセンス構造およびLNA修飾sisiRNA11+11構造を用いるとこで、ノックダウン効率における同様の改善が認められた。このことは、sisiRNA構造が、重度に修飾されたアンチセンス鎖の活性化RISCへのローディング障害を部分的に救済し得ることを示唆する。同様の効果がsiRNAの熱力学的安定性を増大させない他のタイプの化学的修飾に当てはまるかどうか検証するため、アンチセンス鎖中に付加的に単一の、N2'-アダマンチル(AS4およびAS5)あるいはN2'-ピレン-1-イル2'-アミノ-LNA-T(AS6)(図18A)修飾のいずれかを含有する３つの構造を検証した。これらのタイプの修飾は、標準的な(LNA-修飾)siRNA構造(図18B、柱4、6、8)においてSS1と対合する場合、siRNAをほとんど機能しない状態にする。しかしながら、sisiRNA構造との関連において、アダマンチルおよびピレニル修飾アンチセンス鎖の両者は、ノックダウン効率を、著しく〜2.5から4倍増大させた(図18B、柱5、7、9)。総合するとこのことは、sisiRNA構造は、他が標準的なsiRNAの機能にそぐわない多種多様の大きな化学的修飾を許容できることを示す。
さらに、アンチセンス構造の厳重さ緩和するメカニズムを特徴づけるために、重度のアンチセンス-修飾siRNA (AS2、SS1;AS4、SS1;AS5、SS1;AS6、SS1)に比べて高機能で軽度のアンチセンス-修飾siRNA(AS1、SS1)におけるセンス鎖(SS1)の分解を調査した。LNA-修飾siRNA(AS1、SS1)はリバース標的(図18C、柱2)によるレポーターレベルの〜2.5倍の減衰を引き起こしたが、高度に修飾されたsiRNA(AS2、SS1;AS4、SS1;AS5、SS1;AS6、SS1)(図18C、柱6、10、14、18)を用いた場合はこの標的について著しい減衰は見られなかった。このことは、アンチセンスが重度に修飾されている場合にはRISCローディングはいずれかの鎖が欠損していること、および、sisiRNA構造は、RISCローディングに先立つあるいはRISCローディング中の鎖選択に影響を与えるよりむしろ、重度に修飾されたsiRNA二本鎖のRISCローディングを促進することを強く示唆する。
実施例11:鼻から脳への輸送および鼻から肺への輸送における異なるエントロピーのキトサン-siRNAの評価
キトサンの粘膜接着および粘膜浸透特性は、EGFPトランスジェニックマウスおよび疾病動物モデルにおける、siRNAおよびsisiRNAの粘膜輸送（例えば、鼻、肺、口腔および膣経路）に利用される。加えて、例えば腹腔内および皮内といった局所経路の投与は、キトサン-ベースシステムを用いて評価され得るであろう。最近実施した検討では、異なるエントロピーのキトサンを用いた分離粒子に処方されたCy3-ラベルsiRNAおよびsisiRNA、または経鼻投与の直前に調製される混合物においてキトサンにより運搬されるsiRNAの肺および嗅部への分布に差違がある。この検討において、マウスは１日目と3日目に、5μg Cy3-siRNA含有の30μl量(鼻孔あたり15μl)の鼻腔内投与を受けた。その後、5日目に全身かん流を施した。肺、肝臓および脳は、それぞれ、Stereology Research Laboratory、AU および Ortopeadic Reasearch Laboratoryにおいて解剖および切片化された。
肺投与における、siRNAおよびsisiRNAの輸送および効率の最適化
噴霧化処方(キトサン/siRNAおよび未修飾（naked）siRNA)の気管内投与においては噴霧カテーテルシステム（catheter-based nebuliser system）を実施し、液体処方の鼻腔内投与に比べて低い投与量での良好な肺沈積を実証した。
in vitroおよびin vivo におけるインターフェロン応答およびオフターゲット効果の解析
in vitroアッセイにおいて、異なるsiRNAおよびsisiRNA構造によるRNAi-誘導オフターゲット/インターフェロン誘導効果を評価するために、全ゲノム発現プロファイリングを実施した。in vivo 研究において、異なる投与経路(肺、静脈内、腹腔内)を用いて同じ一連の修飾siRNAで処理したマウスからの血液サンプルを、発現プロファイリングシステムを用いてサイトカイン発現についてプロファイルした。
レポーターマウスにおける、化学的に修飾されたレポーター遺伝子に対するsiRNAおよびsisiRNAインヒビターの薬物動態特性の評価
異なるsiRNAs、siLNAおよびsisiRNAsは、トランスジェニックeGFPマウスにおいて、有効性、生物学的利用能、臓器分布、siRNA安定性(半減期およびクリアランス)、毒性および免疫反応などの機能的特性について検証された。異なる投与経路(生体外、鼻、肺、静脈内、腹腔内および局所)を調査した。該最適化RNAiインヒビターは投与システム(未修飾、キトサンポリプレックス、リポソーム)と組み合わせて検証した。siRNAを特異的細胞または組織に結合したリガンドを標的とする可能性をマウスで解析した。放射性標識あるいは蛍光標識されたsiRNAを、局在性（位置特定）の視覚化に用いた。
実施例 12 ：鼻投与および静脈内投与後の肺におけるEGFP発現についてのsiLNAおよびsisiRNAのノックダウン効果の評価
この検討の目的は、未修飾siLNAおよび未修飾あるいはキトサン-処方sisiRNAの経鼻投与あるいは静脈内投与後の肺細気管支上皮細胞における、EGFPのノックダウンを検証することである。
被験物質の処方および調製
HMWキトサンを、酢酸緩衝液(0.2M、pH5.5)中に250 μg/ml sisiRNAで、sisiRNAを含有するナノ粒子を作製するために用いた。該粒子を、酢酸緩衝液中で(鼻腔内処方のために)、濃縮カラムを用いて1 mg/ml sisiRNAまで濃縮した。
処方化されていないsiLNA/sisiRNAは、静脈内投与用にPBS中に濃縮(1mg/ml)され、鼻腔内投与用に酢酸緩衝液中に濃縮(1mg/ml)される。
構造:
Figure 0005244087
 太字の残基 = LNA
用法と用量群
15個体のEGFPトランスジェニックマウスが以下の群に振り分けられ、処理される:
群1: 未修飾（Naked）siLNA、鼻腔内(3マウス)
群2: 未修飾（Naked）sisiRNA、鼻腔内(3マウス)
群3: キトサン-sisiRNA粒子、鼻腔内(3マウス)
群4: 未修飾（Naked）sisiRNA、静脈内(3マウス)
群5: 鼻投与コントロール、siRNA-ミスマッチ(3マウス)
5日連続で各日、鼻腔内投与の場合は30μl量(鼻孔あたり15μl)、あるいは静脈内の投与の場合は50μlを、マウスが麻酔 にかかっている間に投与した。
その後、全身かん流を施して臓器を解剖した(肺、肝臓、脾臓、頭部、腎臓)。
実施例 13：噴霧カテーテルを用いたトランスジェニック グリーンマウスの肺におけるEGFPのノックダウン
この検討の目的は、キトサン-処方siRNA、siLNAおよびsisiRNAの気管内（intratrachael）投与後の肺細気管支上皮細胞におけるEGFPのノックダウンを検証することである。
該検討では、トランスジェニックグリーンマウスの肺における、EGFPに対するsiRNAを含有するキトサン粒子のノックダウン効率を調査した。該粒子は、肺胞といった肺の深部領域までのsiRNA運搬を増大させるように、噴霧カテーテルを用いて気管内経路を介して運ばれた。
構造:
Figure 0005244087
実験設計：
EGFPを発現している12個体のトランスジェニックマウスに2回投与した。
群1: キトサン/ siRNA (4マウス)
群2: キトサン/siRNAミスマッチ (4マウス)
群3: キトサン/ sisiRNA (4マウス)
マウスが麻酔にかかっている間に、1日目に各2μlの粒子溶液投与を2回投与し、翌日(2日目)再び2回投与する。48時間後、該組織を全身かん流により固定する(4日目)。
切片を肺から採取し、EGFPのノックダウンを調査する。
粒子は、pH 5.5の0.2 M 酢酸ナトリウム緩衝液 200 μl を添加したpH 5.5の1mg/ml 溶液中で800μlのキトサンを用いて調製する。コンプレックスは、20μl の 250μM siRNA 溶液を用いて作製する。
実施例 14：細胞培養モデル
以下のsisiRNA構造がWO2005/073378に開示の方法に従って調製される。
標的核酸発現におけるsisiRNAの効果は、標的核酸が測定可能なレベル存在している様々な細胞タイプのいずれかにおいて検証される。標的は、内生的、あるいは該核酸をコードする核酸の一時的あるいは安定なトランスフェクションにより発現される。標的核酸の発現レベルは通常、例えばノーザンブロット分析、リアルタイムPCR、リボプロテアーゼプロテクション法（Ribonuclease protection assays）を用いて決定される。以下の細胞タイプを例証目的で提供するが、他の細胞タイプもごく普通に用いられ、選ばれた細胞タイプにおける標的の発現をもたらす。
細胞は、以下に記載する通りの適した培地で培養され、37℃、湿度95-98%および5% CO2に維持された。細胞は通常、週に2から3回継代される。
- BNCL-2: マウス肝細胞株BNCL-2はATCCから購入し、10% FBS + Glutamax I +
非必須アミノ酸 + ゲンタマイシン含有のDMEM (Sigma)で培養した。
- Hepa1-6: マウス肝細胞株Hepa1-6 ATCCから購入し、10% FBS + Glutamax I +
非必須アミノ酸 + ゲンタマイシン含有のDMEM (Sigma)で培養した。
- HepG2: ヒト肝細胞株HepG2 ATCCから購入し、10% FBS + Glutamax I +
非必須アミノ酸 + ゲンタマイシン含有のEagle MEM(Sigma)で培養した。
実施例 15: sisiRNA療法による治療
以下の実施例は、治療標的のダウンレギュレーションにおけるsisiRNAコンプレックスの使用方法の例証のために用いられる。一般に、sisRNAの使用は、siRNAあるいはアンチセンス オリゴヌクレオチドと同様の手法により用いられる。しかしながら、前述の通り、RNAコンプレックスはキトサンと複合化および/あるいは処方化されたコレステロールのいずれかであることが望ましい。概して、アンチセンス オリゴヌクレオチドに比べて3から5倍の投与量のsisiRNA(あるいはsiRNA)が要求される。
例として、:
Bcl2: WO2005/061710
スルビビン: WO2006/050732
Hif1-alpha: WO2006/050734
P21-ras: PCT/DK2006/000512
Apo-B: PCT/DK2006/000481
に開示される詳細なプロトコールを参照する
非常に多くのsiRNAの治療用構造が、従来知られている。今日の分析は、例えばsisiLNA療法といったsisiRNAの形態においてこれらを検証する。好ましくは、ApoBを標的とするsisiRNAが用いられる。
実施例 16:アンチセンス オリゴヌクレオチドによる処理
BNCL-2あるいはHepa1-6細胞を、10% FBS、Glutamax I およびゲンタマイシンを添加した増殖培地に、37℃ (5% CO2)で、12ウェルプレートに播種する。細胞が60から70%の密集度の時に、それらを異なる濃度のオリゴヌクレオチド(0.04 - 25 nM)でLipofectamine 2000 (5 μg/mL)を用いて二重にトランスフェクトする。トランスフェクションは、基本的にはDean ら(1994, JBC 269:16416-16424)による記載の通り実施された。手短に言うと、細胞をOptiMEM中でLipofectamineにより10分間培養し、続いてオリゴヌクレオチドをウェルあたり総量0.5 mLのトランスフェクション混合物に添加する。4時間後、該トランスフェクション混合物を除去し、細胞を洗浄して37℃でおよそ20時間培養する(適切な増殖培地におけるmRNA分析およびタンパク質分析）。その後、細胞はタンパクおよびRNA分析のために採取される。
実施例 17: RNAの抽出およびcDNA合成
トータルRNAの分離
RNeasy mini kit (Qiagen)を用いてトータルRNAを分離する。細胞をPBSで洗浄し、1% メルカプトエタノールを添加した細胞溶解液（Cell Lysis Buffer）(RTL、Qiagen)をウェルに直接加える。数分後、サンプルはメーカーの指図書に従って必要な処理を施す。
第一鎖合成
第一鎖合成は、OmniScript Reverse Transcriptase kit あるいは M-MLV Reverse transcriptase (基本的には製造者(Ambion)による記載の通り)のいずれかを用いてメーカーの指図書(Qiagen)に従って実施した。OmniScript Reverse Transcriptaseを用いる場合、各サンプルの0.5μgのトータルRNAが12μlに調整され、0.2 μlポリ(dT)12-18(0.5μg/μl)(Life Technologies)、2μl dNTP mix (各5 mM)、2μl 10x RT バッファー、0.5 μl RNAguardTM RNase インヒビター(33 units/mL、アマシャム)および1μl OmniScript Reverse Transcriptaseと混合し、続いて、37℃で60分培養し、93℃で5分間熱して不活化する。
第一鎖合成が、ランダムデカマー（random decamer）およびM-MLV-Reverse Transcriptase(基本的には製造者(Ambion)による記載の通り)を用いて実施される場合、各サンプルの0.25μgトータルRNAがH2O中10.8 μlに調整される。2μlのデカマー（decamer）および2μl dNTP mix (各2.5mM)を添加する。サンプルを70℃になるまで3分間熱し、氷水において即座に冷却し、3.25 μlの混合物(2 μl 10x RT バッファー;1μl M-MLV Reverse Transcriptase; 0.25μl RNAase インヒビター)を添加する。cDNAは、42℃で60分間、続いて95℃で10分間の熱処理による不活化ステップ、最後に4℃に冷却することで合成される。
実施例 18:リアルタイムPCRによる、Apo-B100発現のオリゴヌクレオチド阻害の分析
Apo-B100発現のアンチセンス修飾は、当技術分野で周知の様々な方法で分析できる。例えば、Apo-B100 mRNAレベルは、ノーザンブロット分析、競合ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、あるいはリアルタイムPCRなどにより定量できる。現在では、リアルタイム定量PCRが望ましい。RNA分析がtotal細胞RNAあるいはmRNAにおいて実施される。
ノーザンブロット分析などといったRNA分離およびRNA分析方法が当技術分野では普通であり、例えばCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sonsなどにおいて教示されている。
リアルタイム定量(PCR)は、BioRADから入手可能な市販のiQ Multi-Color リアルタイム PCR Detection Systemを用いることで容易に実施できる。リアルタイム定量PCRは当技術分野においてはよく知られた技術であり、例えばHeid らのReal time quantitative PCR, Genome Research (1996), 6: 986-994において教示されている。
Apo-B100 mRNAレベルのリアルタイム定量PCR分析
処理済みおよび未処理のサンプルにおける相対的なマウスApoB mRNAレベルを測定するために、生成されたcDNAを、BioRad製のiCyclerによる定量PCR分析に用いる。
8μlの5倍(Gapdhおよびβ-アクチン)希釈cDNAに、29.5μl Platinum qPCR Supermix-UDG (インビトロジェン)、1030 nM の各プライマー、0.57 X SYBR Green (分子プローブ)および11.4 nM フルオレセイン(分子プローブ)を含む混合物を52μl添加する。
25μlの複製物がQ-PCRに用いられる: 50℃で120秒、95℃で120秒、および40サイクル[95℃ 30秒および60℃ 60秒].
ApoB発現を50-倍希釈cDNAおよび標準的Q-PCRプロトコールを用いて定量する。プライマー(フォワードおよびリバースプライマーの最終濃度は各々0.6 μM および 0.9 μM)およびプローブ(最終濃度 0.1 μM)を2 x Platinum Quantitative PCR SuperMix UDG (cat. # 11730, インビトロジェン)と混合し、最終量 25 μlになるように、3.3 μl cDNAに添加する。各サンプルは重複して分析される。PCR プログラム: 50℃ 2 分、95℃ 10分、続いて95℃、15秒、60℃、1分を40サイクル。
ApoB mRNA発現は、Q-PCRを用いて同様に定量されたマウスβ-アクチンあるいはGapdh mRNAにノーマライズする。
プライマー:
mGapdh: 5'-agcctcgtcccgtagacaaaat-3' (SEQ ID NO: 73) および 5'-gttgatggcaacaatctccacttt-3' (SEQ ID NO: 74)
mβ-actin: 5'-ccttccttcttgggtatggaa-3' (SEQ ID NO: 75) および 5'-gctcaggaggagcaatgatct-3' (SEQ ID NO: 76)
mApoB: 5'-gcccattgtggacaagttgatc-3' (SEQ ID NO: 77) および 5'-ccaggacttggaggtcttgga-3' (SEQ ID NO: 78)
mApoB Taqman probe: 5'-fam-aagccagggcctatctccgcatcc-3' (SEQ ID NO: 79)
未処理のマウス肝細胞株(Hepa1-6細胞)(5倍希釈され、かつApoBとβ-アクチンの両方あるいはGapdhを発現している)から合成されたcDNAの2-倍希釈を、アッセイの検量線を作成するために用いた。ApoB mRNAの相対量は、iCycler iQ Real Time Detection System softwareを用いてCt値（Threshold cycle）を算出することにより測定された。
実施例 19:Apo-B100 タンパクレベルのウェスタンブロット分析
トランスフェクト細胞におけるApo-B100 タンパクレベルに対するApo-B100 オリゴのin vitro効果は、ウエスタンブロットにより測定される。
細胞を採取し、プロテアーゼ阻害剤cocktail(Roche)を添加した、50 mM Tris-HCl pH 6.8、10%グリセロール、2.5%SDS、5 mM DTTおよび6 M尿素において溶解する。総タンパク濃度をBCA protein assay kit(Pierce)を用いて測定する。50 μg の総タンパクはMOPSバッファー中の10-12% Bis-Trisゲル、あるいは3-8% Tris酢酸ゲル上を泳動させ、製品の指図書(インビトロジェン)に従ってPVDFメンブレンにブロットする。ブロッキングバッファー(5% 低脂肪乳粉末添加PBS-T)中で一晩インキュベーションした後、メンブレンをApoB-100検出１次抗体とともに一晩インキュベートする。ローディングの制御として、チューブリンあるいはアクチンを、ネオマーカー製のモノクローナル抗体を用いて検出する。次いで、メンブレンを２次抗体でインキュベートし、ApoB-100をchromogenic immunodetection kit(インビトロジェン)あるいはchemiluminescens ECL+ detection kit(アマシャム)を用いて視覚化する。
実施例 20:アンチセンス オリゴヌクレオチドを用いたヒトApo-B100発現のアンチセンス阻害
本発明によると、一連のsisiRNA オリゴヌクレオチドはヒトApo-B100 sisiRNAの異なる領域を標的とするように構築される。合成物は、脂質介在吸収（lipid-assisted uptake）、およびsisiRNAコンプレックスのBNLCL2とHepa 1-6細胞におけるApoB-100のノックダウンの比較に続いて、マウス肝細胞(Hepa1-6 細胞)においてApo-B100 mRNAをノックダウンする能力を評価される。
転写の定常状態をリアルタイムPCRにより測定し、GAPDHの転写定常状態にノーマライズした。初期解析から、sisiRNAが効果的であるようだ。
実施例 20:オリゴヌクレオチド化合物を含有するLNAのIn-vivo標的ダウンレギュレーション
C57BL/6マウス(20 g)に３日連続で50 mg/kg i.v.を投与する(群の大きさはマウス７個体)。sisiRNAsを0.9% 生理食塩水(NaCl)に溶かし、10 mL/kg体重(投与あたり〜0.2 ml)で投与する。犠牲にし、肝臓の重量を記録する。ApoB mRNA発現の測定用組織は、使用するまでRNA later(Ambion)中に−20℃で保存する。空腸および肝臓、および血漿中の総コレステロールにおけるmRNA分析を、最終i.v.投与から24時間後に実施する。
実施例 21:血漿中のコレステロール濃度
血漿中の総コレステロール濃度は、ABX Pentra製のcolometric assay Cholesterol CPを用いて測定する。コレステロールは、酵素加水分解および酸化の後に測定する。21.5 μLの水を1.5μLの血漿に添加する。250μLの試薬を加え、5分以内のコレステロール含量を540nMの波長で測定する。各個体における測定は２回行う。感度および直線性を2倍希釈コントロール化合物で検証する(ABX Pentra N コントロール)。相対的なコレステロール濃度をバックグラウンドの除去により決定し、生理食塩水処理マウスの血漿中のコレステロール濃度に対して相対的に示す。
実施例 22: LNAオリゴヌクレオチド合成物のIn-vivo標的ダウンレギュレーション
C57BL/6 マウス(20 g)に３日連続で25 あるいは50 mg/kg i.v.を投与する(群の大きさはマウス7個体)。該sisiRNA構造は、0.9% 生理食塩水 (NaCl)に溶解し、10 mL/kg 体重(投与あたり〜0.2mL)で投与する。ApoB mRNA発現の測定用組織は、使用するまでRNA later(Ambion)中に−20℃で保存する。空腸および肝臓、血漿中の総コレステロールおよびLDLコレステロールにおけるmRNA分析を、最終i.v.投与から24時間後に実施する。
ApoBを標的とするsisiRNA構造が、ApoB mRNA、ApoBタンパクおよび相対的なコレステロール濃度のダウンレギュレーションに効果的であるようだ。
さらなる実施例を図19から27に示す。
図1-6は、本発明のRNAコンプレックスの異なる構造の例を示す。例示された様々な特徴が結合できることは当業者にとっては明白であろう（例えば、突出の特定のパターンが、結合可能かは不明の特定のポジションにおいて（at particular positions that may or may not be linked)、一つあるいはいくつかの不連続性と結合される）。従って、図は非限定的なものとして解釈されるべきである（例えば、不連続性の種類およびポジションは変化可能であり、また付加的な特性が追加できる、など）。
図1は、本発明のRNAコンプレックスの基本的な構造的特性を示す。A：本発明のRNAコンプレックスのコア二本鎖領域を示す。 B：アンチセンス鎖(下の鎖)および不連続パッセンジャー鎖(上の鎖)を示す。パッセンジャー鎖の不連続性もまた示される。示される不連続性は典型的なニックであり、他の種類の不連続性が明細書の中に記載されている点に注意する。
図2は突出と平滑末端の様々な組み合わせを示す。
図3は１以上の不連続性がパッセンジャー鎖に用いられることを示す。
図4は不連続性のサイズが変化できることを示す。
図5は１以上のリンカーが、アンチセンス鎖とパッセンジャー鎖を結合するように、および/あるいは、パッセンジャー鎖の第１および第２RNA分子を結合するように用いられることを示す。
図6は不連続性のポジションが変化できることを示す。
図7-12は実施例の項に記載の通り得られた実験データを示す。
図7:siRNA、siLNAおよびsisiRNAの血清安定性。 siRNA(eGFPsiRNA)、siLNA (JW1103、JW1106)およびsisiRNA(JW1103、W004、W005)の二本鎖を、10%ウシ胎仔血清中において37℃、濃度20μMで、表示時間インキュベートし、次いで、非変性ポリアクリルアミゲル電気泳動にかけ、SYBR gold stainingにより可視化した。直線は、切断されていないオリゴヌクレオチドの予測される移動度の真上を示す。
図8: eGFP発現の蛍光顕微鏡解析。 sisiRNAおよび関連する構造のノックダウン検証。HT1089細胞を、50nMの表示されたRNA/LNAの組み合わせで処理し、eGFP発現を48時間後に解析した。EGFP発現は、RNAおよびタンパクレベルの両方で評価した。(A) 細胞におけるEGFP発現の蛍光顕微鏡解析。細胞を、50nMの表示されたRNA/LNAオリゴの組み合わせで処理し、eGFP発現を48時間後に解析した。(C)48時間後(レーン 1- 6)および120時間後(レーン7-12)のEGFP mRNA発現を示すノーザンブロット。
図9:sisiRNA処理細胞におけるeGFP mRNAおよびタンパク発現の分析。 A．50nMの表示されたオリゴヌクレオチドの組み合わせによる処理細胞におけるeGFPタンパクの発現を示すウエスタンブロット。フィルターを、ローディングコントロールとして、hnRNPC1タンパクに特異的な抗体でリプローブした。 B．48時間後(レーン 1-6)および120 時間後(レーン 7-12)のeGFP mRNA発現を調査するノーザンブロット。フィルターを、ローディングコントロールとして、hnRNP A1発現についてリプローブした。RNAサンプルは、同じ条件下で２回分析した。
図10: 長期間にわたるeGFP 発現の解析。 10A: 表示されたオリゴヌクレオチドの組み合わせによるトランスフェクション後、48、120および180時間におけるeGFP発現を示すウエスタンブロット。hnRNP C1 タンパクは、内部コントロールとして用いた。フィルターを、ローディングコントロール(レーン 1-12)として、hnRNP A1発現についてリプローブした。RNAサンプルは、同じ条件下で２回分析した。10B: 50.000細胞の平均蛍光のフロー分析(３つの実験に基づく)。
図11: 同じ配列を標的とするsisiRNAおよび他のsiLNAおよびsiRNA間におけるノックダウン効率の比較。 A. sisiRNA、siLNAおよびsiRNA間におけるノックダウン効率。 B.ノックダウン効率における濃度依存の分析。タンパクの定量化は、フローサイトメトリーにより測定されたおよそ50.000細胞の平均eGFP発現に基づいており、eGFP mRNAは、図3に示されるものと同様にノーザンブロットにより定量された。siRNAミスマッチは、eGFP標的に対する4つのミスマッチ(以下の配列を参照)を含むsiRNAを表す。
図12:sisiRNA構造の最適化。 不連続パッセンジャー鎖を有する異なる様々なsisiRNA構造によるeGFPノックダウン効率。タンパクの定量化は、フローサイトメトリーにより測定された平均eGFPに基づいている。siRNAミスマッチは、eGFP標的に対する4つのミスマッチ(以下の配列を参照)を含むsiRNAを表す。柱3と4の比較は、ニックのポジションが、有害な影響なしにポジション10から11に移動可能であることを示す。;柱7は、パッセンジャー鎖は単にRNAでもよいが、LNAといったヌクレオチド類似体を含むパッセンジャー鎖のほうがよいということを示す。;柱6から8の比較は、sisiRNAはLNA-修飾アンチセンス鎖(二本鎖領域内)を受け入れ可能であるが、一方でこれは類似するsilimarly LNA-修飾アンチセンス鎖を含有する類似のノーマルsiRNA構造における活性を除去することを示す。
図13:T98G細胞におけるRNAトランスフェクションによるISG56誘導。 sisiRNAおよび他のsiRNA構造により誘導されるインターフェロン応答の評価。インターフェロンα応答の下流マーカーであるIGH56のレベルを、定量RT-PCRにより測定した。ポリ(I/C)がポジティブコントロールとして用いられた(スケールを越えて描画)。27-mer siRNA は、それぞれ27および25のヌクレオチド ガイド鎖とパッセンジャー鎖で構成されており、インターフェロンを適度に導入することが以前に示されている。LNA修飾sisiRNAおよびLNA-修飾siRNAは、T98G細胞におけるISG56の誘導による評価の通り、インターフェロンシステムを活性化しない。グリア芽腫細胞株T98Gを、表示の通り80nMのsiRNA変異体あるいは0.8μgのポリ(I:C)でトランスフェクトし、ISG56 mRNAレベルを、トランスフェクション後48時間目にqPCR分析により評価した。ポリ(I:C)(ポジティブコントロール)によるトランスフェクションのみが高いレベルのISG56 誘導をもたらした一方、全てのsiRNA-変異体のISG56レベルは、未処理細胞あるいはトランスフェクション試薬のみで処理した細胞(Mirus Trans-IT TKO（登録商標）)と区別できなかった。
図14： sisiRNAのオフターゲット効果の測定。
図 15： sisiRNAおよびsiLNAは未修飾siRNAに比べて高い血清安定性を示す。 sisiRNA構造の血清安定性。(A) LNA修飾sisiRNAおよびLNA-修飾siRNAは、未修飾siRNAに比べて高い血清安定性を有する。siRNA変異体を80%FCS中でインキュベートし一定分量を表示された時間ポイントで採取した。血清安定性をPAGEにより評価した後、SYBR Gold（登録商標）染色を施した。siRNAが血清インキュベーションの1-1 1/2時間以内に劣化したのに対し、かなりの量のLNA修飾sisiRNAおよびLNA-修飾siRNAはインキュベーション13時間後においてもまだ存在する。サイズマーカーを左に示す。 (B) LNA-塩基対合は、10% FCS中でのインキュベーションにおけるsisiRNA分子の完全性に不可欠である。異なるLNA修飾を有するあるいはLNA修飾を有しない表示のsisiRNA分子を、10% FCS存在下(+)あるいは非存在下(-)で24時間インキュベートし、二本鎖安定性をPAGEにより評価した後、SYBR Gold（登録商標）染色を施した。両方の鎖にLNAを有するsisiRNA構造は完全な安定性を示した一方、RNAのみを有するsisiRNAは血清インキュベーションにおいて完全に劣化した。LNA修飾のポジションを図式的に示す(垂直ライン)。
図16： sisiRNA 構造の最適化。 異なるsisiRNAおよびsiRNA構造間のノックダウン効率を標的EGFP mRNAにより比較した。 (A) センス鎖におけるギャップポジションの違いによる効果の解析。数値はそれぞれのセンス鎖の5'および3'フラグメントのサイズに相当する。 (B) センス鎖上の3'末端ヌクレオチドにおける修飾の効果の解析。二本鎖の図式を以下に示す。およそ50.000細胞の平均蛍光（強度）をフローサイトメトリーにより測定した。siRNAミスマッチは、EGFP標的に対する４つのミスマッチを含むsiRNAを表す。
図17：isiRNA構造は遺伝子サイレンシングの特異性を増大させる。２つの鎖のノックダウン活性を、センスあるいはアンチセンス中の標的配列(各々、白およびグレーのバー)のいずれかを含有するレポーター構築によるルシフェラーゼ発現の測定により評価した。レポーター構築を上部に表し(ノンスケール)、siRNA構造を図式的に下部に示す。数値は、３つの完全に独立した実験を平均している。各実験のルシフェラーゼ値は、各実験のルシフェラーゼ活性の合計が同等になるようにノーマライズされた。各々のレポーター構築に関して、蛍ルシフェラーゼ(FL)/ウミシイタケ ルシフェラーゼ(RL)比をミスマッチコントロールにノーマライズした。
図18：sisiRNA構造は、化学的に修飾されたアンチセンス鎖のサイレンシング効力をサポートする。(A) LNA-モノマー、N2'-アダマンチルメチルカルボニル 2'-アミノ-LNAモノマー(aT)およびN2'-ピレン-1-イルメチル 2'-アミノ-LNA-チミン モノマー (pT)の分子構造。 (B) 重度に修飾されたアンチセンス鎖のサイレンシング効率におけるsisiRNA構造の効力の分析。およそ50.000細胞の平均蛍光（強度）をフローサイトメトリーにより測定した。siRNAミスマッチは、EGFP標的に対する４つのミスマッチを含有するsiRNAを表す。 (C) ２つの鎖のノックダウン活性を、センスあるいはアンチセンス中の標的配列(各々ライトグレーおよびダークグレーのバー)のいずれかを含有するレポーター構築によるルシフェラーゼ発現の測定により評価した。実験は３回繰り返して行われ、レポーター構築に関して、蛍ルシフェラーゼ(FL)/ウミシイタケ ルシフェラーゼ(RL)比をミスマッチコントロールにノーマライズした。
図19は、DNAパッセンジャー鎖内の2番目および3番目の3'残基がLNAであるか、あるいは２つのDNAと単一のLNAユニットの交互パターンのいずれかの形で、DNAおよびLNAユニットのみを含むパッセンジャー鎖を有するsiRNA間の比較を示す。非RNAパッセンジャー鎖は、siRNAサイレンシング複合体という枠の中で機能的であり得ることを示す。
図20は細胞培養におけるLNA-修飾および未修飾sisiRNA構造の比較を表し、また、不連続パッセンジャー鎖へのLNAの導入がサイレンシング効力を高めること、およびパッセンジャー鎖のポジション10からポジション11へのニックの移動はサイレンシングの効能にほとんど効果がないことを示す。平均GFPおよびEGFP mRNAに示される発現レベルは、実施した実験に基づく推定値である。
図21は2'-F-DNAと2'-O-Me-RNA修飾sisiRNAsの比較を表し、また、そのような修飾を含有するパッセンジャー鎖はある程度のサイレンシングを有するが、このことはLNAで認められたほどの効果ではないことを示す(図20)。平均GFPおよびEGFP mRNAに示される発現レベルは、実施した実験に基づく推定値である。
図22はsisiRNAの不連続および連続LNA修飾パッセンジャー鎖の比較を表し、また、LNA修飾sisiRNAには、siLNA(LNA修飾siRNA)と比較してより機能化されたパッセンジャー鎖が与えられることを示す。平均GFPおよびEGFP mRNAに示される発現レベルは、実施した実験に基づく推定値である。
図23はsisiRNAとLNA修飾アンチセンス鎖との比較を表し、不連続パッセンジャー鎖の存在がアンチセンス鎖の重度の修飾（特にパッセンジャー鎖とハイブリッドを形成する領域）による阻害作用を克服することを明確に示す。平均GFPおよびEGFP mRNAに示される発現レベルは、実施した実験に基づく推定値である。
図24はsisiRNAと2'-F/2'-OMe LNA修飾アンチセンス鎖との比較を表し、不連続パッセンジャー鎖を用いることで完全に修飾されたアンチセンス鎖の使用を可能にすることを示す。平均GFPおよびEGFP mRNAに示される発現レベルは、実施した実験に基づく推定値である。
図25は、不連続パッセンジャー鎖を用いることでアンチセンス鎖内における2'アダマンチル-アミノLNAの使用をも可能にすることを示す。平均GFPおよびEGFP mRNAに示される発現レベルは、実施した実験に基づく推定値である。
図26は、LNAsisiRNA 構造に比べた2'Fおよび2'OMe sisiRNA構造の検証を表し、パッセンジャー鎖が2'-Fあるいは2'OMeで修飾されている場合、LNAを用いた相対的な構造に比べてダウンレギュレーションが全く効果的でないことを示す。
図27は、パッセンジャー鎖中に３つのRNA分子を有するsisiRNA構造は、パッセンジャー鎖が２つのRNA分子のみから成る同等の‘3分子'sisiRNAほど顕著ではないけれども、それらの標的mRNAのダウンレギュレーションにおいてもまた効果的であることを示す。

Claims (11)

  1. １８〜２３塩基対のコア二本鎖領域を含む、ＲＮＡ干渉を媒介することができるＲＮＡコンプレックスであって、
    該コア二本鎖領域は、アンチセンス鎖および不連続パッセンジャー鎖からなり；
    該不連続パッセンジャー鎖は該アンチセンス鎖とハイブリダイズし；
    該不連続パッセンジャー鎖の不連続性は、ニックであり；
    該ＲＮＡコンプレックスは、２またはそれ以上のＬＮＡユニットを含み；
    該不連続パッセンジャー鎖は、少なくとも、第１ＲＮＡ分子および第２ＲＮＡ分子を含み；
    該不連続パッセンジャー鎖の第１ＲＮＡ分子は８〜１３核酸塩基の長さであり、かつ、該不連続パッセンジャー鎖の第２ＲＮＡ分子は８〜１４核酸塩基の長さであり；および
    該不連続パッセンジャー鎖の第１ＲＮＡ分子および第２ＲＮＡ分子は、各々、少なくとも１個のＬＮＡユニットを含む；
    ことを特徴とする、ＲＮＡコンプレックス。
  2. 該不連続パッセンジャー鎖の第１ＲＮＡ分子が、少なくとも２個のＬＮＡユニットを含む、請求項１に記載のＲＮＡコンプレックス。
  3. 該不連続パッセンジャー鎖の第２ＲＮＡ分子が、少なくとも２個のＬＮＡユニットを含む、請求項１に記載のＲＮＡコンプレックス。
  4. 該不連続パッセンジャー鎖の第１ＲＮＡ分子および第２ＲＮＡ分子が、各々、少なくとも２個のＬＮＡユニットを含む、請求項１に記載のＲＮＡコンプレックス。
  5. ＬＮＡユニットが、該不連続パッセンジャー鎖の第１ＲＮＡ分子および第２ＲＮＡ分子の３’末端の３ヌクレオチド内にある、請求項１に記載のＲＮＡコンプレックス。
  6. 該アンチセンス鎖が、該不連続パッセンジャー鎖と共に形成する該コア二本鎖領域内に、少なくとも１個のＬＮＡユニットを含む、請求項１に記載のＲＮＡコンプレックス。
  7. 該不連続パッセンジャー鎖に含まれるＬＮＡユニットの少なくとも１個が、該アンチセンス鎖に含まれる相補的なＬＮＡユニットと塩基対を形成する、請求項１に記載のＲＮＡコンプレックス。
  8. 該アンチセンス鎖が、１、２または３ヌクレオチドの３’突出を有する、請求項１に記載のＲＮＡコンプレックス。
  9. 該不連続パッセンジャー鎖が、１、２または３ヌクレオチドの３’突出を有する、請求項１に記載のＲＮＡコンプレックス。
  10. 該アンチセンス鎖および該不連続パッセンジャー鎖が共に、１、２または３ヌクレオチドの３’突出を有する、請求項１に記載のＲＮＡコンプレックス。
  11. 該ＬＮＡユニットが、ベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡである、請求項１に記載のＲＮＡコンプレックス。
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