DE60202681T2

DE60202681T2 - Verfahren zur herstellung des lna phosphoramidite

Info

Publication number: DE60202681T2
Application number: DE60202681T
Authority: DE
Inventors: Troels Koch; Christoph Rosenbohm; Sejer Daniel PEDERSEN
Original assignee: Santaris Pharma AS
Current assignee: Roche Innovation Center Copenhagen AS
Priority date: 2001-07-12
Filing date: 2002-07-12
Publication date: 2006-01-12
Anticipated expiration: 2022-07-13
Also published as: DE60202681D1; EP1409497A2; WO2003006475A3; JP4402454B2; ATE287413T1; WO2003006475A2; DK1409497T3; AU2002328792A1; JP2004536125A; EP1409497B1

Description

Umfeld der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein mit hohen Ausbeuten verbundenes Schnellverfahren zur großtechnischen LNA-Phosphoramidit-Synthese.
Hintergrund der Erfindung
Monomere und Oligonukleotide von Locked Nucleic Acid (LNA), verschränkten Nukleinsäuren, wurden 1997 erfunden (WO 99/14226) und zeigten als Kandidaten für Antisense-Arzneimittel viel versprechende Resultate. Jedoch ist in der Literatur kein Herstellungsverfahren zur LNA-Phosphoramidit-Synthese im großen Maßstab beschrieben, das die zur effizienten Herstellung von auf LNA-beruhenden Antisense-Arzneimitteln notwendige optimale Ausbeuten an LNA-Amidit erlaubt.
Üblicherweise wird die Oligonukleotidsynthese nach dem Phosphoramidit-Verfahren durchgeführt, das von Caruthers, US 4,415,732 , 1980 erfunden und einige Jahre später durch Köster, US 4,725,677 , verbessert wurde. LNA-Oligomere werden nach dem Phosphoramidit-Verfahren synthetisiert, jedoch war bis jetzt die Bereitstellung von LNA-Monomeren in größerem Maßstab wegen der langsamen Reaktionen, der Nebenproduktbildung während der Reaktion und den bei Raumtemperaturen unstabilen eingesetzten Reagenzien problematisch.
Der Mechanismus der Phosphoramidit-Aktivierung und -Kopplung bei der Oligonukleotidsynthese wurde eingehend untersucht. Herkömmlich wurde Tetrazol verwendet (Dahl et al. 1987, Nucleic Acid Research, 15, 1729–1743; Beaucage & Iver, 1992, Tetrahedron, 48, 2223–2311). Der vorgeschlagene Mechanismus des Tetrazols ist zweistufig; zuerst protoniert Tetrazol trivalenten Phosphor und dann wird das N,N-Diisopropylamin durch das Tetrazolid ersetzt. Diese spätere Zwischenstufe ist hoch reaktiv mit Hydroxynukleophilen, wie etwa 5'-OH von Nukleinsäuren. Daher agiert Tetrazol sowohl als Säure als auch als Nukleophil.
Vargeese et al. (Vargeese, C.; Carter, J.; Krivjansky, S.; Settle, A.; Kropp, E.; Peterson, K.; Pieken, W. Nucleic Acid Research, 1998, 26, 1046–1050; WO 98/16540) haben einen Aktivator zur Kopplung von Phosphoramiditen an die 5'-Hydroxylgruppe während der Oligonukleotidsynthese beschrieben. Das Aktivierungsmittel ist 4,5-Dicyanoimidazol (DCI) und dessen Effektivität wird auf seine Nukleophilie zurückgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass DCI signifikant die Ausbeute bei der Phosphoramidit-Oligomerisation erhöht.
Vargeese et al. haben ein im kleinen Maßstab durchgeführtes Verfahren der DNA-Phosphoramidit-Thyminmonomer-Synthese unter Verwendung von DCI beschrieben, wobei das von Ihnen benutzte Verfahren eine moderate Ausbeute (75%) nach zahlreichen Umfällungsschritten des Amidits liefert. Kittaka et al. (Kittaka A., Kuze T.; Amano M.; Tanaka H.; Miyasaka T.; Hirose K.; Yoshrda T.; Sarai A.; Yasukawa T. und Ishii S. Nucleosides & Nucleotides 18, 2769–2783, 1999) haben zur Amiditsynthese ebenfalls DCI eingesetzt, aber sie berichteten von einer noch niedrigeren Ausbeute an dem Produkt (65%). Kittaka et al. (Kittaka A.; Horii C.; Kuze T.; Asakura T.; Ito K.; Nakamura K. T.; Miyasaka T. und Inoue J., Synthetic letters, S1, 869–872, 1999) haben auch ein derivatisiertes Uridin-Phosphoramidit durch 3'-O-Phosphitylierung unter Verwendung von DCI (0,7 Äquivalente) hergestellt, jedoch ohne die Reaktionsparameter näher zu beschreiben. Die Ausbeute wurde mit bis zu 92% angegeben. Allgemein ergibt die Phosphitylierung von Urazil und Thymin die höchsten Ausbeuten, da diese Nukleinbasen normalerweise nicht mit dem Phosphylierungsmittel wechselwirken.
Demgemäß ist in der Literatur nichts beschrieben, was den Einsatz von DCI als Aktivierungsmittel zur LNA-Phosphoramidit-Synthese betrifft.
Das vorab beschriebene oxy-β-D-ribo-LNA-Syntheseverfahren (2) verwendet 2-Cyanoethyl-N,N-diisopropylchlorphosphoramidit und Diisopropylethylamin (Koshkin, A. A.; Singh, S. K.; Nielsen, P.; Rajwanshi, V. K.; Kumar, R.; Meldgaard, M.; Olsen, C. E.; Wengel, J. Tet. 1998, 54, 3607–3630). Die berichteten Ausbeuten waren niedrig (LNA-T 70%, LNA-U 58%, LNA-G 64%, LNA-A 73% und für LNA-C wurde keine Ausbeute berichtet). Das vorab beschriebene Verfahren zur Synthese von oxy-α-L-ribo-Thyminphosphoramidit (3) verwendet ebenfalls 2-Cyanoethyl-N,N-diisopropylchlorphosphoramidit und Diisopropylethy lamin und ergibt Ausbeuten von 60% (Hakansson, A. E.; Koshkin, A. A.; Sorensen M. D.; Wengei J. J. Org. Chem. 2000, 65, 5161–5166).
Schließlich beschreiben Satoshi et al. (Bioorganic & medical chemistry, 9 (2001), 1001 – 1011) die Synthese von LNA-Phosphoramidit unter Verwendung von 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphoramidit in der Gegenwart von Diisopropyl-ammoniumtetrazolid.
Kurzbeschreibung der Figuren
1: Phosphitylierung von Guanin, a) 2-Cyanoethyl-N,N-Diisopropylchlorphosphoramidit, Diisopropylethylamin, b) Phosphitylierung von 3'-OH Guanin über eine Übertragungs-/Umlagerungsreaktion.
2: Oxy-β-D-ribo-LNA-Phosphoramidite
3: Amin-β-D-ribo-LNA-Phosphoramidite und Oxy-α-L-ribo-LNA-Thymin-Phosphoramidit.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein neues mit hohen Ausbeuten verbundenes Schnellverfahren zur Synthese reiner LNA-Phosphoramidite in größerem Maßstab bereit. Für die Herstellung der LNA-Monomere wie Phosphoramidite ist der Phosphorylierungsschritt kritisch. Sofern notwendig ist aufgrund der Reaktivität der Phosphoramidite und auch um deren Zersetzung während der Reinigung zu vermeiden eine einfache und effiziente Aufreinigung wünschenswert. Eine absolute Reinheit der Amidite ist eine Voraussetzung, denn die Monomere werden eine Zeit lang in langsequenziellen Oligomerisationen verwendet, wo Verunreinigungen zur Zersetzung der Phosphoramidite führen können.
Die neue Strategie wird anhand der Synthese von oxy-β-ribo-LNA-Phosphoramidit erläutert, wobei B A^Bz, ^MeC^Bz, G^Ibu und T und oxy-α-L-ribo-LNA-T ist (3).
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Synthese eines LNA-Phosphoramidits bereit. Das Verfahren umfasst die Phosphitylierung der 3'-OH-Gruppe eines LNA-Monomers mit einem 2-cyanoethyl-N,N,N',N'-tetra-substituierten Phosphoramidit in der Gegenwart eines nukleophilen Aktivierungsmittels.
Die Vorteile des vorliegenden Aktivierungsverfahrens sind:

a) einfache Handhabung
b) alle Reagenzien sind bei Raumtemperatur stabil
c) es sind nur 0,7 Äquivalente DCI notwendig
d) eine einfache Aufarbeitung
e) schnelle und mit hohen Ausbeuten verbundene Reaktionen bei Raumtemperatur
f) kostengünstige Reaktionen
g) eine Chromatographie ist nicht notwendig, um die Amidite mit hoher Reinheit zu erhalten

Die bekannten Nebenreaktionen der Phosphitylierung bei der Nukleinbase Guanin, denen eine langsame Übertragung/Umlagerung zum gewünschten Amidit folgt (Nielsen, J.; Taagaard, M.; Marugg, J. E.; van Boom, J. H.; Dahl, O. Nuc. Acid. Res. 1986, 14, 7391–7403) (siehe 1), wurden unter den erfindungsgemäßen Bedingungen nicht beobachtet.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Vorliegend steht der Begriff „LNA-Monomer" für ein Ribonukleotid mit einer 2',4'-Brücke (speziell eine -O-CH₂- (oxy-LNA), -S-CH₂- (thio-LNA), -NR-CH₂-Brücke (amino-LNA, wobei R, C_1-6-Alkyl, Phenyl, Benzyl, etc. ist), wie es in der internationalen Patentanmeldung WO 99/14226 und nachfolgend in WO 00/56746, WO 00/56748, WO 00/66604 und WO 02/28875 beschrieben wird.
Beispiele von LNA-Monomeren mit besonderem Interesse sind oxy-β-D-ribo-LNA (vgl. 2), thio-β-D-ribo-LNA, amino-β-D-ribo-LNA, oxy-α-L-ribo-LNA (vgl. 3), thio-α-L-ribo-LNA oder amino-α-L-ribo-LNA.
Der Begriff „LNA-Phosphoramidit", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf ein Nukleotid mit einer geschützten 5'-Hydroxygruppe (z. B. DMT-geschützt, wie es in den 2 und 3 dargestellt ist), bei der die 3'-Hydroxygruppe mit einem trivalenten Phosphoratom gekoppelt ist, welches selbst mit einer geeigneten Fluchtgruppe, wie N,N-Dialkylamin, z. B. Diisopropylamin, und einer Schutzgruppe wie der Cyanoethylgruppe (NCCH₂CH₂-) verbunden ist. Für die vorliegende Erfindung kann jedes LNA-Phosphoramidit verwendet werden, das für die Festphasen- oder Flüssigphasen-Oligonukleotidsynthese geeignet ist. Dies umfasst auch geschützte Dimere und Trimere von LNA-Phosphoramidit.
Der Begriff „2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetra-substituiertes Phosphoramidit", wie er hier verwendet wird, auch bezeichnet als „PN₂-Reagent", bezieht sich kurzgefasst auf ein 2-cyanoethyl-N,N,N',N'-tetra-substituiertes Phosphoramidit, bei dem der Begriff „substituiert" einen linearen, zyklischen oder verzweigt ungesättigten Kohlenwasserstoff, wie Allyl oder Vinyl, oder gesättigten Kohlenwasserstoff oder substituierte Kohlenwasserstoffgruppe oder aromatische Gruppe oder substituierte aromatische Gruppe mit 1 bis 9 Kohlenstoffatomen ist, wie Methyl, Ethyl, Propyl, iso-Propyl, Pentyl, Cyclopentyl, Hexyl, Cyclohexyl, bevorzugte Beispiele für Alkyl sind Methyl, Ethyl, Propyl, iso-Propyl, Butyl, tert-Butyl, iso-Butyl, Pentyl, Cyclopentyl, Hexyl, Cyclohexyl, insbesondere Methyl, Ethyl, Propyl, iso-Propyl, tert-Butyl, iso-Butyl, Cyclohexyl, Propylen, Butylen, Pentylen, Hexylen, Heptylen, wobei die Substituenten ein Heteroatom, wie Sauerstoff oder Stickstoff sein können.
Die LNA-Monomere als auch die Phosphoramidit-LNA-Monomere können jedwede Nukleinbase in der 1'-Position tragen.
Der Begriff „Nukleinbase" umfasst im vorliegenden Kontext natürlich vorkommende Nukleinbasen als auch nicht natürlich vorkommende Nukleinbasen. Dem Fachmann dürfte klar sein, dass zahlreiche Nukleinbasen, die zuvor als „nicht natürlich vorkommend" bezeichnet wurden, danach in der Natur gefunden wurden. Daher umfasst „Nukleinbase" nicht nur die bekannten Purin- und Pyrimidin-Heterozyklen, sondern auch heterozyklische Analoga und Tautomere hiervon. Ausführungsbeispiele an Nukleinbasen sind Adenin, Guanin, Thymin, Cytosin, Uracil, Purin, Xanthin, Diaminopurin, 8-oxo-N⁶-Methyladenin, 7-Deazaxanthin, 7-Deazaguanin, N⁴,N⁴-Ethanocytosin, N⁶,N⁶-Ethano-2,6-diaminopurin, 5-Methylcytosin, 5-(C³-C⁶)-Alkynylcytosin, 5-Fluoruracil, 5-Bromuracil, Pseudoisocytosin, 2-Hydroxy-5-methyl-4-triazolopyridin, Isocytosin, Isoguanin, Inosin, N⁶-Alylpurine, N⁶-Acylpurine, N⁶-Benzylpurin, N⁶-Halopurin, N⁶-Vinylpurin, N⁶-Acetylpurin, N⁶-Acylpurin, N⁶-Hydroxyalkylpurin, N⁶-Thioalkylpurin, N²-Alkylpurine, N⁴-Alkylpyrimidine, N⁴-Acylpyrimidine, N⁴-Benzylpurin, N⁴-Halopyrimidine, N⁴-Vinylpyrimidine, N⁴-Acetylpyrimidine, N⁴-Acylpyrimidine, N⁴-Hydroxyalkylpyrimidine, N⁶-Thioalkylpyrimidine, Thymin, Cytosin, 6-Azapyrimidin, umfassend 6-Azacytosin, 2- und/oder 4-Mercaptopyrimidin, Uracil, C⁵-Alkylpyrimidine, C⁵-Benzylpyrimidine, C⁵-Halopyrimidine, C⁵-Vinylpyrimidin, C⁵-Acetylpyrimidin, C⁵-Acylpyrimidin, C⁵-Hydroxyalkylpurin, C⁵-Amidopyrimidin, C⁵-Cyanopyrimidin, C⁵-Nitropyrimidin, C⁵-Aminopyrimidin, N²-Alkylpurine, N²-Alkyl-6-thiopurine, 5-Azacytidinyl, 5-Azauracilyl, Trazolopyridinyl, Imidazolopyridinyl, Pyrrolopyrimidinyl und Pyrazolopyrimidinyl. Funktionelle Sauerstoff- und Stickstoffgruppen der Basen können, sofern notwendig oder gewünscht, geschützt werden. Geeignete Schutzgruppen sind dem Fachmann bekannt und umfassen Trimethylsilyl-, Dimethylhexylsilyl-, t-Butyldimenthylsilyl- und t-Butyldiphenylsilyl-, Trityl-, Alkylgruppen, Acylgruppen, wie Acetyl und Propionyl, Methansulfonyl, und p-Toluosulfonyl, Imine, wie N-Dimethylmethylenamin und Dibutylmethylenamin.
Bevorzugte Basen umfassen Cytosin, Methylcytosin, Uracil, Thymin, Adenin und Guanin.
LNA-Phosphoramidite gemäß der vorliegenden Erfindung werden in hohen Ausbeuten mit 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphoramidit (einem PN₂-Reagenz) hergestellt. Dieses Reagenz wurde bisher nicht erfolgreich zur Herstellung von LNA-Phosphoramiditen eingesetzt. 2-Cyanoethyl-N,N'-diisopropylchlorphosphoramidit wurde bisher für die Herstellung von LNA-Amiditen verwendet. Dieses gewährt nicht die hohe Reinheit, hohe Ausbeuten und kurzen Reaktionszeiten gemäß der vorliegenden Erfindung.
Die überraschende Entdeckung bei der vorliegenden Erfindung ist, dass 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphoramidit durch 4,5-Dicyanoimidazol aktiviert werden kann und dass dieser Komplex eine ausreichende Reaktivität unter den beschriebenen Bedingungen besitzt, um eine einwandfreie Phosphitylierung aller 4 LNA DMT-geschützten Nukleoside, umfassend die G-Nukleoside, sicherzustellen. Mit den bisher unter Verwendung von 2-Cyanoethyl-N,N-diisopropylchlorphosphoramidit bekannten Verfahren würde die Phosphitylierungsreaktion über Sauerstoff an der geschützten Guanin-Nukleinbase ablaufen (1a) und anschließend zum thermodynamisch stabileren 3'-O-Amidit (1b) umgelagert werden. Die Nachteile der Vorläufermethoden lagen darin, dass das Endprodukt Nebenprodukte enthielt und es aufgrund der langsamen Umlagerung, die zum thermodynamischen Produkt führt, deutlich längerer Reaktionszeiten bedarf (bis zu 24 Stunden).
Die herkömmlichen Arbeitsverfahren zur Herstellung von LNA-Phosphoramiditen liefern Ausbeuten im Bereich von 14–73%, wohingegen das vorliegende Arbeitsverfahren Ausbeuten von 95% oder mehr ermöglicht. Dies ist auch aus dem Grund beachtenswert, als dass die korrespondierende Reaktion für DNA/RNA-Nukleotide nur Ausbeuten von 92% liefert.
Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung liegt darin, dass die Reaktion innerhalb von 0,5–4 Stunden, vorzugsweise 1,0–3,5 Stunden beendet ist und dass eine Chromatographie der LNA-Amidite wegen der effizienten Reaktion nicht notwendig ist. Demzufolge wird die Phosphitylierungsreaktion üblicherweise über 0,1–12 Stunden, wie auch 0,2–8 Stunden, beispielsweise 0,5–4 Stunden, als auch 1,0–3,5 Stunden, Aufrecht erhalten.
Ein LNA-Phosphoramidit für den unmittelbaren Einsatz in der Oligonukleotidsynthese kann direkt oder durch einfaches Ausfällen des Produktes aus dem Reaktionsgemisch erhalten werden. Daher liegt ein gesonderter Aspekt der Erfindung darin, dass das Verfahren wenigstens einen Ausfällungsschritt umfasst.
Für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignete nukleophile Aktivierungsmittel umfassen, sind jedoch nicht beschränkt hierauf, 4,5-Dicyanoimidazol (DCI), 4-Alkylthioimidazol, 2-Alkylthioimidazol, 2-Nitroimidazol, 4-Nitroimidazol, 4,5-Dihaloimidazol, 4-Haloimidazol, 2-Haloimidazol und 5-Alkoxytetrazol. DCI ist das bevorzugte nukleophile Aktivierungsmittel. DCI hat einen pK_a von 5,2 und lässt sich leicht in Acetonitril lösen.
Geeignete PN₂-Reagenzien sind z. B., aber nicht beschränkt hierauf, 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphoramidit und 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraethylphosphoramidit und die Verbindungen, die von Dahl, B. H., Nielsen J. und Dahl O. Nucleic Acid Research, 1987, 15, 1729–1743 beschrieben wurden, die allesamt durch Verweis einbezogen werden. Derzeit wird angenommen, dass 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphoramidit und 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraethylphosphoramidit, insbesondere 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphoramidit, besonders bedeutsam sind.
Nach einer derzeit bevorzugten Kombination ist das 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetrasubstituierte Phosphoramidit 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphoramidit und das nukleophile Aktivierungsmittel 4,5-Dicyanoimidazol.
Das Mol-Verhältnis zwischen dem LNA-Monomer und dem nukleophilen Aktivierungsmittel liegt üblicherweise im Bereich von 1:0,0001 bis 1:10, bevorzugt 1:0,0001 bis 1:1 und besonders bevorzugt 1:0,0001 bis 1:0,7.
Das Mol-Verhältnis zwischen dem LNA-Monomer und der PN₂-Reagenz liegt üblicherweise im Bereich von 1:09 bis 1:10, vorzugsweise 1:0,95 bis 1:5, besonders bevorzugt bei 1:1.
Die derzeit vielversprechendsten LNA-Monomere sind diejenigen, bei denen die Nukleinbase ausgewählt ist aus Guanin, Thymin, Cytosin, Methylcytosin, Uracil und Adenin, in der Regel in der geschützten Form, etwa als N-benzoyl-geschütztes Cytosin (C^Bz), N-benzoyl-geschütztes Methylcytosin (^MeC^Bz), N-isobutanoyl-geschütztes Guanin (G^Ibu), Uracil (U), Thymin (T), N-benzoyl-geschütztes Adenin (A^Bz).
Beispiele
Beispiel 1 – Phosphorylierungsverfahren
Vier Verfahren zur Phosphitylierung wurden untersucht und verglichen:
Phosphitylierungsreaktion. B = A^Bz, C^Bz, ^MeC^Bz, G^Ibu und T

i. 2-Cyanoethyl-N,N-diisopropylchlorphosphoramidit, Diisopropylethylamin
ii. 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphoramidit, 1H-Tetrazol
iii. 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphoramidit, Pyridiniumtrifluoracetat
iv. 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphoramidit, 4,5-Dicyanoimidazol

2-Cyanoethyl-N,N-diisopropylchlorphosphoramidit schien verglichen mit 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphoramidit (PN₂-Reagenz) zahlreiche Nachteile zu haben. Es ist bei Raumtemperatur instabil, teuer und aufgrund sei ner hohen Reaktivität schwer handhabbar. Darüber hinaus werden mit 2-Cyanoethyl-N,N-diisopropylchlorphosphoramidit (1) häufig unerwünschte Reaktionen mit den Nukleinbasen beobachtet.
Es wurden drei verschiedene Aktivierungsmittel für 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphoramidit untersucht (1H-Tetrazol, Pyridiniumtrifluoracetat und 4,5-Dicyanoimidazol). 4,5-Dicyanoimidazol (DCI) zeigte die besten Resultate.
Beispiel 2 – Allgemeiner experimenteller Arbeitsablauf zur Herstellung der LNA-Phosphoramiditen 1–6:
Eine 0,2 M-Lösung des LNA-Nukleosids (1,0 Äquivalente) in wasserfreiem CH₂Cl₂ wurde unter Argon gerührt. Eine 1,0 M-Lösung von DCI (0,70 Äquivalente) im wasserfreien MeCN wurde zugesetzt, es folgte eine tropfenweise Zugabe von 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphordiamidit (1.0 Äquivalente). Nach Abschluss der Reaktion (erfasst durch analytische Dünnschichtchromatographie (TLC) wurde mit CH₂Cl₂ verdünnt und zweimal mit gesättigter wässriger NaHCO₃ und einmal mit Sole gewaschen. Die organische Phase wurde getrocknet (Na₂SO₄), gefiltert und im Vakuum zu einem farblosen Schaum konzentriert. Alle Phosphoramidite wurden in sehr hohen Ausbeuten isoliert (≥ 95%). Es konnten keine Nebenprodukte mit HPLC-MS, TLC oder ³¹P-NMR (Reinheit ≈ 100%) detektiert werden. Sofern die Ausgangsmaterialen trocken und rein sind, ist eine Chromatographie nicht notwendig.
Synthese von (1R,3R,4R,7S)-3-(4-N-Benzoyl-5-methylcytosin-1-yl)-7-(2-cyanoethoxy-(diisopropylamin)phosphinoxy)-1-(4,4'-dimethoxytrityloxymethyl)-2,5-dioxabicyclo[2.2.1]heptan (3)
(1R,3R,4R,7S)-3-(4-N-Benzoyl-5-methylcytosin-1-yl)-1-(4,4'-dimethoxytrityloxymethyl)-7-hydroxy-2,5-dioxabicyclo[2.2.1]heptan (4,86 g, 7,2 mmol) wurde in wasserfreiem CH₂Cl₂ (40 ml) gelöst und 4,5-Dicyanoimidazol in MeCN (1,0 M, 5 ml) wurde zugesetzt. Es wurde bei Raumtemperatur unter Argon gerührt. 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphordiamidit (2,4 ml, 7,2 mmol) wurde tropfenweise zum Reaktionsgemisch zugesetzt. Nach 2 Stunden wurde die Reaktionsmasse mit CH₂Cl₂ (100 ml) verdünnt und in einen Trenntricher überführt und mit gesättigter wässriger NaHCO₃ (2 × 150 ml) und Sole (150 ml) extrahiert. Die vereinigten wässrigen Phasen wurden mit CH₂Cl₂ (100 ml) extrahiert. Die organischen Phasen wurden zusammengeführt und getrocknet (Na₂SO₄). Nach dem Filtern wurde die organische Phase im Vakuum eingeengt und lieferte einen hellgelben Schaum (6,0 g, 95% Ausbeute). Eine kleine Probe wurde zum Vergleich mit chromatographiertem Material entnommen. Das Produkt wurde durch Trockensäulen-Vakuumchromatographie aufgereinigt (∅ 10 cm; mit 5% Et₃N in n-Heptan v/v vorbehandeltes Silikat; 0→70% EtOAc, n-Heptan v/v). Die gesammelten Fraktionen, die 3 enthalten, wurden vereinigt und im Vakuum eingeengt und lieferten einen farblosen Schaum (5,3 g, 84% Ausbeute).
Zwischen dem rohen und chromatographierten Phosphoramidit konnte kein Unterschied in der Effizienz der Kopplung in einem Oligonucleotidgenerator bei einer Prüfung der Kopplungseffizienz (siehe oben) festgestellt werden.
Die Verbindungen 1, 2, 4, 5 und 6 wurden in gleicher Weise hergestellt.
Analytische Daten der Phosphoramedite 1–6
(1R,3R,4R,7S)-7-(2-Cyanoethoxy(diisopropylamino)phosphinoxy)-1-(4,4'-dimethoxytrityloxymethyl)-3-(thymin-1-yl)-2,5-dioxabicyclo[2:2:1]heptan (1)

³¹P-NMR (CDCl₃, 121,49 MHz): δ 150,0 (s), 149,3 (s).
MS (ES): m/z berechnet für C₄₁H₄₉N₄O₉P [M + H]⁺: 773,3. Gefunden: 773,1.
RP HPLC: R_T = 5,89 min, 6,19 min.

(1R,3R,4R,7S)-7-(2-Cyanoethoxy(diisopropylamino)phosphinoxy)-1-(4,4'-dimethoxytrityloxymethyl)-3-(2-N-isobutyrylguanin-1-yl)-2,5-dioxabicyclo[2.2.1]heptan (2)

³¹P-NMR (CDCl₃, 121,49 MHz): δ 150,2 (s), 149,2 (s).
MS (ES): m/z berechnet für C₄₅H₅₄N₇O₉P [M + H]⁺: 868,4. Gefunden: 868,0.
RP HPLC: R_T = 5,52 min, 5,72 min.

(1R,3R,4R,7S)-3-(4-N-Benzoyl-5-methylcytosin-1-yl)-7-(2-cyanoethoxy(diisopropylamino)phosphinoxy)-1-(4,4'-dimethoxytrityloxymethyl)-2,5-dioxabicyclo[2.2.1]heptan (3)

^3IP-NMR (CDCl₃, 121,49 MHz): δ 150,5 (s), 150,5 (s).
MS (ES): m/z berechnet für C₄₈H₅₄N₅O₉P [M + H]⁺: 876,4. Gefunden: 876,2.
RP HPLC: R_T = 7,67 min, 8,13 min.
(HPLC Lösungsmittelgradient: 0,0–0,5 min 95% B, 0,5–2,0 min 95%→100% B, 2,0–7,0 min 100% B, 7,0–7,5 min 100%→95% B, 7,5–12,0 min 95% B)

(1R,3R,4R,7S)-3-(6-/V-Benzoyladenin-9-yl)-7-(2-cyanoethoxy(diisopropylamino)phosphinoxy)-1-(4,4'-dimethoxytrityloxymethyl)-2,5-dioxabicyclo[2.2.1]heptan (4)

^3JP-NMR (CDCl₃, 121,49 MHz): δ 150,1 (s), 149,7 (s).
MS (ES): m/z berechnet für C₄₈H₅₂N₇O₈P [M + H]⁺: 886,3. Gefunden: 886,0.
RP HPLC: R_T = 6,65 min, 6,82 min.

(1R,3R,4R,7S)-7-(2-Cyanoethoxy(diisopropylamino)phosphinoxy)-1-(4,4'-dimethoxytrityloxymethyl)-5-N-methyl-3-(thymin-1-yl)-2-oxa-5-azabicyclo[2.2.1]heptan (5)

³¹P-NMR (CDCl₃, 121,49 MHz): δ 149,8 (s), 149,6 (s).
MS (ES): m/z berechnet für C₄₂H₅₂N₅O₈P [M + H]⁺: 786,3. Gefunden: 786,2.
RP HPLC: R_T = 5,87 min, 6,26 min.

(1S,3R,4S,7R)-7-(2-Cyanoethoxy(diisopropylamino)phosphinoxy)-1-(4,4'-dimethoxytrityloxymethyl)-3-(thymin-1-yl)-2,5-dioxabicyclo[2:2:1]heptan (6)

^3IP-NMR (CDCl₃, 121,49 MHz): δ 150,9 (s), 150,6 (s).
MS (ES): m/z berechnet für C₄₁H₄₉N₄O₉P [M + H]⁺: 773,3. Gefunden: 773,1.
RP HPLC: R_T = 6,06 min, 6,44 min.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines LNA Phosphoramidites, wobei das Verfahren eine Phosphitylierung der 3'-OH Gruppe eines LNA Monomers mit einem 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetra-substituierten Phosphoramidit in Gegenwart eines nukleophilen Aktivators ausgewählt aus 4,5-Dicyanoimidazol (DCI), 4-Alkylthioimidazol, 2-Alkylthioimidazol, 2-Nitroimidazol, 4-Nitroimidazol, 4,5-Dihaloimidazol, 4-Haloimidazol, 2-Haloimidazol und 5-Alkoxytetrazol beinhaltet.
Verfahren nach Anspruch 1, umfassend wenigstens einen Fällungsschritt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem das 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetra-substituierte Phosphoramidit ausgewählt wird aus 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-Tetraisopropylphosphoramidit und 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-Tetraethylphosphoramidit.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 2, bei dem das 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetra-substituierte Phosphoramidit 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-Tetraisopropylphosphoramidit und der nukleophile Aktivator 4,5-Dicyanoimidazol ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem das molare Verhältnis zwischen dem LNA Monomer und dem nukleophilen Aktivator im Bereich von 1:0,0001 bis 1:10 liegt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem das molare Verhältnis zwischen dem LNA Monomer und dem 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetra-substituierten Phosphoramidit PN₂-Reagenz im Bereich von 1:0,9 bis 1:10 liegt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Phosphitylierung für 0,2 bis 8 Stunden aufrechterhalten wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem das LNA Monomer eine Nukleinbase ausgewählt aus Guanin, Thymin, Cytosin, 5-Methylcytosin, Uracil und Adenin aufweist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Struktur des LNA Monomers ausgewählt ist aus oxy-β-D-Ribo-LNA, thio-β-D-Ribo-LNA, amino-β-D-Ribo-LNA, oxy-α-L-Ribo-LNA, thio-α-L-Ribo-LNA und amino-α-L-Ribo-LNA.