EA015570B1 - Фармацевтическая композиция - Google Patents

Фармацевтическая композиция Download PDF

Info

Publication number
EA015570B1
EA015570B1 EA200870402A EA200870402A EA015570B1 EA 015570 B1 EA015570 B1 EA 015570B1 EA 200870402 A EA200870402 A EA 200870402A EA 200870402 A EA200870402 A EA 200870402A EA 015570 B1 EA015570 B1 EA 015570B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
oligonucleotide
residues
ενα
residue
dna
Prior art date
Application number
EA200870402A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200870402A1 (ru
Inventor
Йоаким Элмен
Фил Кирни
Сакари Кауппинен
Original Assignee
Сантарис Фарма А/С
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Сантарис Фарма А/С filed Critical Сантарис Фарма А/С
Publication of EA200870402A1 publication Critical patent/EA200870402A1/ru
Publication of EA015570B1 publication Critical patent/EA015570B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C12N2310/113—Antisense targeting other non-coding nucleic acids, e.g. antagomirs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/323—Chemical structure of the sugar modified ring structure
    • C12N2310/3231—Chemical structure of the sugar modified ring structure having an additional ring, e.g. LNA, ENA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3515—Lipophilic moiety, e.g. cholesterol

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Rheumatology (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, включающим короткие одноцепочечные олигонуклеотиды длиной 8-26 нуклеотидов, комплементарных человеческим микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-19b, miR-21, miR-122a, miR-155 и miR-375. Короткие олигонуклеотиды особенно эффективно способствуют подавлению миРНК in vivo. Было обнаружено, что включение высокоаффинных нуклеотидных аналогов в олигонуклеотиды приводит к образованию высокоэффективных молекул, которые подавляют микроРНК и, очевидно, действуют посредством образования почти необратимых дуплексов с миРНК-мишенью, но не посредством механизмов на основе расщепления РНК, таких как механизмы, ассоциированные с действием РНКазы Н или RISC.

Description

Настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, включающим ΕΝΆ-содержащие одноцепочечные олигонуклеотиды, способные ингибировать вызывающие заболевания микроРНК, в частности человеческие микроРНК т1К-19Ь, Щ1К-21, т1К-122а, Щ1К-155 и Щ1К-375.
Предшествующий уровень техники
МикроРНК - новые регуляторы экспрессии генов.
МикроРНК (миРНК) принадлежат к широкому классу коротких эндогенных РНК, которые действуют как посттранскрипционные регуляторы экспрессии генов посредством спаривания оснований с основаниями их мРНК-мишеней. Зрелые миРНК последовательно процессируются из более длинных шпилечных транскриптов под действием рибонуклеаз РНКазы III Итокба (Бее е! а1., 2003) и 01сег (Ни!уадпет е! а1., 2001, Ке!бпд е! а1., 2001). На октябрь 2005 г. в базе данных микроРНК, тЖБаье, версия 7.1, имеется более чем 3400 миРНК позвоночных, беспозвоночных и растений (СпГГННЛопех 2004, СпГГННЛопех е! а1., 2006), а также были идентифицированы многие миРНК, соответствующие предполагаемым генам.
У большинства животных миРНК распознают свои сайты-мишени, локализованные в 3'-ϋΤΚ, посредством неполного спаривания оснований, что приводит к подавлению трансляции генов-мишеней (Ваг!е1, 2004). Более широкомасштабные исследования показали, что миРНК животных играют фундаментальную биологическую роль в росте и апоптозе клеток (Вгеппеске е! а1., 2003), в дифференцировке гемопоэтических клеток (Сбеп е! а1., 2004), в регуляции продолжительности жизни клеток (Воейт апб 81аск, 2005), в дифференцировке фоторецепторов (6ί апб Саг111е\\·. 2005), в регуляции генов гомеобокса (Уек!а е! а1., 2004, Нотп8!еш е! а1., 2005), в формировании асимметрии нейронов (1ойп§!оп е! а1., 2004), в секреции инсулина (Роу е! а1., 2004), в морфогенезе головного мозга (Оба1бех е! а1., 2005), в пролиферации и дифференцировке мышечных клеток (Сйеп, Мапбе1 е! а1., 2005, 1<\топ е! а1., 2005, 8око1 апб ЛтЬтоь, 2005), в кардиогенезе (2йао е! а1., 2005) и в позднем эмбриональном развитии позвоночных (^1епйо1б8 е! а1., 2005).
МикроРНК, участвующие в развитии заболеваний человека.
миРНК участвуют в развитии человеческих заболеваний широкого ряда. Одним из таких заболеваний является мышечная атрофия спинного мозга (8МЛ), нейродегенеративные заболевания у детей, вызываемые снижением уровней белка или мутацией, что обусловлено потерей функции гена, ответственного за выживание двигательных нейронов (8ΜΝ) (Раизйкш е! а1., 2002). Недавно было обнаружено, что мутация в сайте-мишени т1К-189 человеческого гена 8Б1ТКК1 ассоциируется с развитием синдрома Туретта (ЛЬе1воп е! а1., 2005), хотя в других недавно проведенных исследованиях сообщалось, что РНК-содержащий геном вируса гепатита С взаимодействует с микроРНК клетки-хозяина, т.е. с печеньспецифической т1К-122а, и, тем самым, облегчает ее репликацию в хозяине (1орйпд е! а1., 2005). Другим заболеванием, в развитии которого участвуют миРНК или которое вызвано механизмами их процессинга, является умственная отсталость, ассоциированная с синдромом ломкой Х-хромосомы (ЕХМК) и вызываемая отсутствием белка, ответственного за развитие указанного синдрома ломкой Х-хромосомы, приводящего к снижению продолжительности жизни (ЕМ6Р) (№коп е! а1., 2003, Лп е! а1. 2004), и синдрома Ди Георге (Еапб1йа1ет е! а1., 2004).
Кроме того, сообщалось, что при многих раковых заболеваниях человека наблюдалось нарушенние профилей экспрессии миРНК. Так, например, в большинстве случаев хронического В-клеточного лимфоцитарного лейкоза (ХЛЛ) человеческие гены миРНК т1К-15а и 1166-16-1 подвергаются делеции или ингибированию, и недавно было показано, что уникальная сигнатура из 13 генов миРНК может быть использована для прогноза и прогрессирования заболевания (Сабп е! а1., 2002, Сабп е! а1. 2005). Роль миРНК в развитии рака подтверждается тем фактом, что более 50% человеческих генов миРНК расположено в ассоциированных с раком геномных областях или в ломких сайтах (Сабп е! а1., 2004). Недавно проведенный анализ системной экспрессии у людей с различными злокачественными заболеваниями показал, что в опухолях, по сравнению с нормальными тканями, происходит общее ингибирование миРНК (Би е! а1., 2005). Интересно отметить, что классификация низкодифференцированных опухолей на основе миРНК была проведена успешно, тогда как в тех же самых образцах профили миРНК оказались в высокой степени неточными. Было также обнаружено, что нарушение регуляции миРНК происходит при раке молочной железы (1опо е! а1., 2005), раке легких (1ойпзоп е! а1., 2005) и раке толстой кишки (М1сйае1 е! а1., 2004), и сообщалось, что кластер 1166-17-92, который амплифицируется в человеческих Вклеточных лимфомах, а также 1166-155, который активируется в лимфоме Беркитта, являются главными человеческими миРНК-онкогенами (Είδ е! а1., 2005, Не е! а1., 2005). Таким образом, в будущем человеческие миРНК могут быть с успехом использованы не только в качестве биомаркеров для диагностики рака, но также, как уже обсуждается в последнее время, в качестве привлекательных мишеней для лечения заболеваний с применением олигонуклеотидной технологии.
- 1 015570
Ингибирование микроРНК с использованием одноцепочечных олигонуклеотидов.
Для ингибирования миРНК было описано несколько способов с применением олигонуклеотидной технологии.
В №0 03/029459 (ТиксН1) заявлены олигонуклеотиды, кодирующие микроРНК и их комплементы длиной в 18-25 нуклеотидов, которые могут включать нуклеотидные аналоги. Было также высказано предположение, что возможным нуклеотидным аналогом является ΕΝΆ, хотя в данной заявке ΕΝΑсодержащие олигонуклеотиды не описаны. В заявке ТиксЫ указывается, что олигонуклеотиды миРНК могут быть использованы в терапии.
В заявке И82005/0182005 описан 24-мерный олигорибонуклеотид 2'ОМе-РНК, комплементарный самой длинной форме тгК.-21, который, как было обнаружено, снижает уровень тгК.-21-индуцированной репрессии, тогда как эквивалентный ДНК-содержащий олигонуклеотид не обладает такой функцией. Термин 2'0Ме-РНК означает аналог РНК, где во 2-положении имеется замещение метилом (2'-0-метил).
Заявка И82005/0227934 (ТиксЫ) относится к тй-ингибирующим молекулам (аЫттй), содержащим до 50% остатков ДНК. Также сообщалось, что 2'ОМе-РНК, содержащие молекулы агШтй могут быть использованы для подавления микроРНК поджелудочной железы, однако фактические структуры этих олигонуклеотидов не описаны.
В И8200/50261218 (1818) заявлено олигомерное соединение, включающее первую область и вторую область, где по меньшей мере одна область содержит модификацию, а часть олигомерного соединения нацелена на небольшую некодирующую нуклеиновую кислоту, являющуюся РНК-мишенью, где указанный небольшой некодирующей нуклеиновой кислотой, которая представляет собой РНК-мишень, является миРНК. Были также заявлены олигомерные соединения, имеющие длину 17-25 нуклеотидов. Примеры относятся, главным образом, к 2'ОМе-Р8-соединениям, 21-мерам, 20-мерам и к 2'ОМе-гэп-мерным олигонуклеотидам, нацеленным на ряд пре-миРНК и зрелых миРНК-мишеней.
В работе ВоиЙа е! а1., 2003 (ШсШс ЛсШк Векеагсй, 31: 4973-4980) описано использование антисмысловых ДНК-олигонуклеотидов, комплементарных 11 различным миРНК у дрозофил (ИгокорЫ1а), а также их использование для инактивации миРНК путем введения ДНК-олигонуклеотидов в эмбрионы мух. Из 11 антисмысловых ДНК-олигонуклеотидов лишь 4 конструкции вызывали значительное подавление нормального развития, а остальные 7 олигонуклеотидов не давали какого-либо изменения фенотипа, что, вероятно, обусловлено их неспособностью ингибировать рассматриваемую миРНК.
Нийадгег е! а1. (2004) и Ьеашаи е! а1. (2005) был описан альтернативный метод, в котором антисмысловые 2'-0-метил-олигонуклеотиды, комплементарные зрелой миРНК, могут быть использованы в качестве сильнодействующих и необратимых ингибиторов функций короткой интерферирующей РНК (киРНК) и миРНК ίη νίίτο и ίη νίνο у ЭгокорЫ1а и С.е1едапк и, следовательно, в качестве индукторов фенотипа, характеризующихся отсутствием таких функций. Недостатком такого метода является необходимость проведения экспериментов по трансфекции и инъекции высоких концентраций 2'-0-метилолигонуклеотидов (100 мкмоль), которые могут быть токсичными для животного. Этот метод был недавно применен в исследованиях на мышах и включает конъюгирование антисмысловых 2'-О-метилолигонуклеотидов, комплементарных четырем различным миРНК, с холестерином для сайленсинга РНК ίη νί\Ό (КгЫхГеЫ е! а1., 2005). Эти так называемые антагонисты тй (аШадотй) были введены мышам путем внутривенных инъекций. Хотя такие эксперименты приводили к эффективному сайленсингу эндогенных миРНК ίη νίνΌ, который, как было обнаружено, был специфическим, эффективным и продолжительным, однако главным недостатком такого метода является то, что для эффективного сайленсинга необходимо вводить высокую дозу (80 мг/кг) 2'0Ме-аШадот1г.
Ингибирование микроРНК с использованием ΕΝΑ-модифицированных олигонуклеотидов было описано в работах С1иш е! а1. Сагеег Векеагсй, 2005, 65 (14), 6029-6033, ЬесеШег е! а1. 8^1^, 2005, 308, 557-560, NадшЬηеνа е! а1. №1Шге Се11 Вю1оду, 2006, 8 (3), 278-84 и 0гиш е! а1. Сеге 2006 (доступных онлайн с 24 февраля 2006 г.). Во всех случаях ΕΝΑ-модифицированные олигонуклеотиды-антагонисты шй были комплементарны полноразмерной зрелой микроРНК, т.е. имели длину в 20-23 нуклеотида, что препятствовало эффективному поглощению этих молекул ίη νί\Ό и их широкому биологическому распределению.
В работе NадшЬгеνа (№1дшЬгеуа е! а1. №1Шге Се11 Вю1оду, 2006, 8) описано использование смешанного антисмыслового олигонуклеотида ДНК-ΕΝΑ-ДНК, направленного против тй, для ингибирования функции микроРНК тгК.-181 ίη уйго, где блок из 8 нуклеотидов ΕΝΑ расположен в центре молекулы, фланкированной 6 нуклеотидами ДНК у 5'-конца и 9 нуклеотидами ДНК у 3'-конца соответственно. Главным недостатком такой антисмысловой конструкции является ее низкая стабильность ίη νίνΌ, обусловленная низкой резистентностью фланкирующих ДНК-концов к нуклеазе.
В своих исследованиях СНэп е! а1. (СНаи е! а1. Сагеег ВекеагсН, 2005, 65 (14), 6029-6033) и 0гцш е! а1. (0гцш е! а1. Сеге, 2006) (доступных он-лайн с 24 февраля 2006 г.) не описывают конструирования ΕΝΑмодифицированных молекул-антагонистов ш1г, а ЬесеШег е! а1. (ЬесеШег е! а1. 8аегее, 2005, 308, 557560) описывают использование гэп-мерного антисмыслового ^NΑ-ДНК-^NΑ-олигонуклеотида, являющегося антагонистом тл, в целях ингибирования функций микроРНК, где в указанном олигонуклеотиде
- 2 015570 блок из 4 ΕΝΑ-нуклеотидов расположен у 5'- и З'-конца соответственно, при этом в центре данной молекулы имеется окно из 13 ДНК-нуклеотидов. Главными недостатками такой антисмысловой конструкции являются низкий уровень поглощения ίη νίνο, а также низкая стабильность ίη νίνο, обусловленные присутствием в указанном олигонуклеотиде-антагонисте т1г ДНК-фрагмента из 13 нуклеотидов.
Таким образом, необходимость в повышении способности олигонуклеотидов ингибировать микроРНК остается актуальной.
Описание сущности изобретения
Настоящее изобретение основано на обнаружении того факта, что использование коротких олигонуклеотидов, сконструированных для высокоаффинного связывания с миРНК-мишенями, является в высокой степени эффективным для ослабления репрессии мРНК под действием микроРНК ίη νίνο.
Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, следует лишь отметить, что высокоэффективное нацеливание на миРНК ίη νίνο может быть осуществлено путем конструирования олигонуклеотидов для получения в высокой степени стабильного дуплекса с миРНК-мишенью ίη νίνο. Это может быть достигнуто с использованием высокоаффинных нуклеотидных аналогов, таких как по меньшей мере один из ΕΝΆ-остатков, и других подходящих высокоаффинных аналогов нуклеотидных аналогов, таких как, ΕΝΆ, 2'МОе-РНК, состоящие из 2'-фтор-нуклеотидных аналогов, короче, таких как олигонуклеотиды, состоящие из 10-17 или 10-16 нуклеотидных оснований. В одном из аспектов целью изобретения является получение олигонуклеотида, имеющего длину, недостаточную для образования киРНК-комплекса (т.е. короткого олигонуклеотида), и содержащего достаточное количество высокоаффинных нуклеотидных аналогов, благодаря которым такой олигонуклеотид почти всегда связывается со своей миРНКмишенью, что приводит к эффективному образованию стабильного и нефункционального дуплекса с миРНК-мишенью. Авторами настоящего изобретения было обнаружено, что такие конструкции являются значительно более эффективными, чем известные олигонуклеотиды, а в частности гэп-мерные и блокмерные конструкции, и олигонуклеотиды, имеющие длинную последовательность, например 20-23меры. Термин 2'-фтор-ДНК означает аналог ДНК, в котором во 2'-положении имеется замещение фтором (2'Е).
Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей олигонуклеотид, имеющий длину 8-17, например 10-17, а именно 8-16 или 10-16 нуклеотидных остатков, фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель или адъювант, где по меньшей мере одно из нуклеотидных остатков одноцепочечного олигонуклеотида представляет собой высокоаффинный нуклеотидный аналог, такой как остаток нуклеотидного основания блокированной нуклеиновой кислоты (ΕΝΑ), и где указанный одноцепочечный олигонуклеотид комплементарен человеческой последовательности микроРНК, выбранной из группы, состоящей из человеческих микро-РНК т1В-19Ь, тЖ+21, т1В-122а, т1В-155 и тЖ-375.
Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей олигонуклеотид, имеющий длину в 10-26 нуклеотидов, и фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель или адъювант, где указанный олигонуклеотид содержит коровую ДНК-последовательность в положениях 2-7 или от положений 3-8, если считать от З'-конца, 3'-асдШ-5' (ЬЕО ΙΌ ΝΟ: 6, 5'-Шдса-3'). где по меньшей мере один, а предпочтительно по меньшей мере два, например два или три, ДНК-остатка в указанной последовательности были замещены соответствующими нуклеотидами ΕΝΑ и где, но необязательно, указанный олигонуклеотид не содержит область из более чем 7 смежных остатков ДНК.
Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей олигонуклеотид, имеющий длину в 10-26 нуклеотидов, и фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель или адъювант, где указанный олигонуклеотид содержит коровую ДНК-последовательность в положениях 2-7 или от положений 3-8, если считать от 3'-конца, 3'-с1саса-5' (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 7, 5'-асас1с-3'), где по меньшей мере один, а предпочтительно по меньшей мере два, например два или три, ДНК-остатка в указанной последовательности были заменены соответствующими остатками ΕΝΑ и где указанный олигонуклеотид, но необязательно, не содержит область из более чем 7 смежных остатков ДНК.
Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей олигонуклеотид, имеющий длину в 10-26 нуклеотидов, и фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель или адъювант, где указанный олигонуклеотид содержит коровую ДНК-последовательность в положениях 2-7 или от положений 3-8, если считать от 3'-конца, 3'-йасда-5' (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 8, 5'-адсай-3'), где по меньшей мере один, а предпочтительно по меньшей мере два, например два или три, ДНК-остатка в указанной последовательности были заменены соответствующими остатками ΕΝΑ и где, но необязательно, указанный олигонуклеотид не содержит область из более чем 7 смежных остатков ДНК.
Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей одноцепочечный олигонуклеотид, имеющий длину в 10-26 нуклеотидов, и фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель или адъювант, где указанный олигонуклеотид содержит коровую ДНК-последовательность в положениях 2-7 или от положений 3-8, если считать от 3'-конца, 3'-асаадс-5' (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 9, 5'-сдааса-3'), где по меньшей мере один, а предпочтительно по меньшей мере два, например два или три, ДНК-остатка в указанной последовательности были заменены соответствующими нуклеотидами ΕΝΑ и где указанный олигонуклеотид, необязательно, не содержит область из более чем 7 смежных остатков ДНК.
- 3 015570
Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей одноцепочечный олигонуклеотид, имеющий длину в 10-26 нуклеотидов, и фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель или адъювант, где указанный олигонуклеотид содержит коровую ДНК-последовательность в положениях 2-7 или от положений 3-8, если считать от З'-конца, 3'-едаа1а-5' (8ЕО ГО N0: 10, 5'-а1ааде-3'), где по меньшей мере один, а предпочтительно по меньшей мере два, например два или три, ДНК-остатка в указанной последовательности были замещены соответствующими остатками ΕΝΑ и где указанный олигонуклеотид, необязательно, не содержит область из более чем 7 смежных остатков ДНК.
Высокоаффинными нуклеотидными аналогами являются нуклеотидные аналоги, образующие олигонуклеотид, который, в случае если он образует дуплекс с комплементарным нуклеотидом РНК, имеет более высокую термостабильность, чем в случае его аффинного связывания с эквивалентным нуклеотидом ДНК. Такое свойство обычно определяют путем измерения Тт.
Авторы настоящего изобретения при использовании указанных коротких высокоаффинных олигонуклеотидов, направленных против специфичных миРНК, не обнаружили каких-либо нежелательных эффектов. Действительно, данные, приведенные в настоящем описании, указывают на то, что влияние на экспрессию мРНК обусловлено присутствием последовательности, комплементарной миРНК-мишени (первичной мРНК-мишени), в мРНК или вторичным действием на мРНК, которые регулируются первичными мРНК-мишенями (вторичными мРНК-мишенями). При этом не было обнаружено какого-либо токсического действия, что указывало на отсутствие каких-либо явных негативных побочных эффектов.
Настоящее изобретение также относится к применению олигонуклеотида согласно изобретению, такого как олигонуклеотид, который может образовывать часть фармацевтической композиции, в целях приготовления лекарственного средства для лечения заболевания или патологического расстройства, ассоциированного с присутствием или со сверхэкспрессией (активацией) микроРНК.
Настоящее изобретение также относится к способу лечения заболевания или патологического расстройства, ассоциированного с присутствием или со сверхэкспрессией микроРНК, где указанный способ включает стадию введения композиции (такой как фармацевтическая композиция) согласно изобретению индивидууму, нуждающемуся в таком лечении.
Настоящее изобретение также относится к способу снижения эффективного количества миРНК в клетке или в организме, включающему введение композиции (такой как фармацевтическая композиция) согласно изобретению или одноцепочечного олигонуклеотида согласно изобретению в указанную клетку или в указанный микроорганизм. В контексте настоящего описания снижение эффективного количества означает снижение количества функциональной миРНК, присутствующей в данной клетке или в данном организме. При этом следует отметить, что предпочтительные олигонуклеотиды согласно изобретению не всегда могут значительно снижать фактическое количество миРНК, присутствующей в клетке или в организме, поскольку они обычно образуют в высокой степени стабильные дуплексы со своими миРНКмишенями.
Настоящее изобретение также относится к способу дерепрессии мРНК-мишени для миРНК в клетке или организме, включающему введение композиции (такой как фармацевтическая композиция) или одноцепочечного олигонуклеотида согласно изобретению в клетку или организм.
Настоящее изобретение также относится к использованию одноцепочечного олигонуклеотида длиной в 8-16, например 10-16, нуклеотидных оснований в целях приготовления лекарственного препарата для лечения заболевания или расстройства, ассоциированного с присутствием или со сверхэкспрессией микроРНК.
Настоящее изобретение также относится к способу лечения заболевания или патологического расстройства, ассоциированного с присутствием или со сверхэкспрессией микроРНК, где указанный способ включает введение композиции (такой как фармацевтическая композиция), содержащей одноцепочечный олигонуклеотид длиной 8-16, например 10-16, нуклеотидных оснований индивидууму, нуждающемуся в таком лечении.
Настоящее изобретение также относится к способу снижения эффективного количества миРНКмишени (т.е. количества миРНК, которое является достаточным для ингибирования мРНК-мишеней) в клетке или в организме, где указанный способ включает введение композиции (такой как фармацевтическая композиция), содержащей одноцепочечный олигонуклеотид длиной в 8-16, например 10-16, нуклеотидных оснований в клетку или организм.
Настоящее изобретение также относится к способу дерепрессии мРНК-мишени для миРНК в клетке или организме, включающему введение одноцепочечного олигонуклеотида длиной в 8-16, например 1016, нуклеотидных оснований (или композиции, содержащей указанный олигонуклеотид) в клетку или в организм.
- 4 015570
Настоящее изобретение также относится к способу синтеза одноцепочечного олигонуклеотида, направленного против человеческой микроРНК, выбранной из группы, состоящей из человеческих микроРНК Щ1К-19Ь, Щ1К-21, т1К-122а, Щ1К-155 и Щ1К-375, такого как описанный здесь одноцепочечный олигонуклеотид, где указанный способ включает стадии:
a) необязательного выбора первого, считая с З'-конца, нуклеотидного основания, которое представляет собой нуклеотидный аналог, такой как нуклеотидное основание ΕΝΆ;
b) необязательного выбора второго, считая с З'-конца, нуклеотидного основания, которое представляет собой нуклеотидный аналог, такой как нуклеотидное основание ΕΝΆ;
c) выбора области одноцепочечного олигонуклеотида, которая соответствует уникальной области (кееб-области) миРНК, где указанная область определена в настоящем изобретении;
б) необязательного выбора 7- и 8-го нуклеотидного основания, определенного в настоящем изобретении;
е) необязательного выбора 1-10 дополнительных нуклеотидных оснований, которые могут быть выбраны из группы, состоящей из нуклеотидов (х) и нуклеотидных аналогов (X), таких как ΕΝΆ;
1) необязательного выбора 5'-области одноцепочечного олигонуклеотида, определенного в настоящем изобретении;
д) необязательного выбора 5'-концевого одноцепочечного олигонуклеотида, определенного в настоящем изобретении.
Если указанный синтез осуществляют путем последовательного присоединения областей, определенных в стадиях а)-д), то этот синтез может быть проведен либо в направлении 3'-5' (а-д), либо в направлении 5'-3' (д-а), где указанный одноцепочечный олигонуклеотид комплементарен последовательности миРНК-мишени.
В одном из вариантов изобретения олигонуклеотид согласно изобретению конструируют так, чтобы он не подвергался связыванию под действием К18С или не мог опосредовать К.18С-направленное расщепление миРНК-мишени. При этом считается, что при использовании длинных олигонуклеотидов, например 21- или 22-меров, в частности РНК-олигонуклеотидов или РНК-олигонуклеотидов-аналогов, которые комплементарны миРНК-мишени, указанный олигонуклеотид может конкурировать с мРНКмишенью за связывание с К!8С-комплексом и тем самым ослаблять репрессию мРНК, являющейся мишенью для миРНК, посредством включения олигонуклеотида, который конкурирует как субстрат за связывание с миРНК.
Однако настоящее изобретение было разработано для предупреждения такого нежелательного расщепления мРНК-мишени или ингибирования ее трансляции путем создания олигонуклеотидов, способных к комплементарному, а в некоторых случаях, вероятно, почти к необратимому их связыванию со зрелой микроРНК. Это, очевидно, приводит к запуску механизма защиты от деградации или расщепления (например, под действием К18С или РНКазы Н или других эндо- или экзонуклеаз), и такой запуск не может приводить к значительному или даже значимому снижению уровней миРНК в клетке (например, как было определено с помощью нозерн-блот-анализа, проводимого с использованием ΕΝΆ-зондов), но гарантирует значительное снижение эффективного количества миРНК, как было определено в анализе на дерепрессию. Поэтому в одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к олигонуклеотидам, которые были специально сконструированы так, чтобы они были несовместимы с К!8С-комплексом и чтобы миРНК можно было удалять путем титрования олигонуклеотидом. Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, объясняющей причину такой эффективности олигонуклеотидов согласно изобретению, можно лишь отметить, что если провести аналогию с РНК-олигонуклеотидами (или полноразмерными 2'ОМе-олигонуклеотидами), то становится очевидным, что олигонуклеотиды согласно изобретению действуют по механизму неконкурентного ингибирования функции миРНК, поскольку они эффективно удаляют имеющуюся миРНК из цитоплазмы, тогда как известные олигонуклеотиды являются альтернативными субстратами для миРНК, которые могут действовать как конкурентные ингибиторы, эффективность которых должна в высокой степени зависеть от концентрации олигонуклеотида в цитоплазме, а также от концентрации мРНК- и миРНК-мишени.
Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, следует отметить, что еще одной проблемой, которая может возникать в случае использования олигонуклеотидов, имеющих длину, приблизительно аналогичную длине миРНК-мишеней (т.е. миРНК), является то, что эти олигонуклеотиды могут образовывать киРНК-подобный дуплекс с миРНК-мишенью, а это приводит к снижению эффективности олигонуклеотида. Возможно также, что сами олигонуклеотиды могут быть использованы в качестве ведущей цепи в К18С-комплексе, в результате чего возникает возможность осуществления К1§С-направленной деградации неспецифических мишеней, которые чисто случайно могут быть достаточно комплементарными ведущему олигонуклеотиду.
Эти проблемы можно решить путем выбора коротких олигонуклеотидов для нацеливания на последовательности миРНК.
- 5 015570
Короткие олигонуклеотиды, которые включают БЫЛ, известны специалистам, работающим с такими реагентами, как БЫЛ (см., например, АО 2005/098029 и АО 2006/069584). Однако молекулы, предназначенные для их использования в целях диагностики или в качестве реагентов, по своей конструкции значительно отличаются от олигонуклеотидов, используемых в фармацевтических целях. Так, например, концевыми нуклеотидными основаниями этих олигонуклеотидных реагентов обычно являются ДНК, а не БЫЛ, а межнуклеозидными связями обычно являются другие, нефосфортиоатные связи, т.е. связи, которые не являются предпочтительными для использования в олигонуклеотидах согласно изобретению. Поэтому настоящее изобретение, по существу, относится к новому классу олигонуклеотидов.
Настоящее изобретение также относится к (одноцепочечному) олигонуклеотиду, описанному в разделе, посвященном фармацевтической композиции согласно изобретению, где указанный олигонуклеотид включает:
(ί) по меньшей мере одну фосфортиоатную связь, и/или (ίί) по меньшей мере один 3'-концевой остаток БЫА, и/или (ΐϊϊ) по меньшей мере один 5'-концевой остаток БЫЛ.
Для большинства терапевтических применений предпочтительно, чтобы олигонуклеотид был полностью фосфортиолирован, за исключением терапевтических олигонуклеотидов, применяемых для лечения заболеваний ЦНС, таких как заболевания головного мозга или позвоночника, где такое фосфортиолирование может быть токсичным, что обусловлено отсутствием нуклеаз, при этом фосфордиэфирные связи могут быть использованы даже между смежными ДНК-остатками. Как указывается в настоящем изобретении, в соответствии с другими предпочтительными аспектами изобретения олигонуклеотидом согласно изобретению является олигонуклеотид, в котором второе нуклеотидное основание и/или 9- и 10-е нуклеотидные основания (от З'-конца) могут также представлять собой БЫЛ.
Авторами настоящего изобретения было обнаружено, что могут быть также применены и другие методы предотвращения расщепления РНК (такого как деградация под действием экзонуклеаз в сыворотке крови или К18С-ассоциированное расщепление олигонуклеотида согласно изобретению), а поэтому настоящее изобретение также относится к одноцепочечному олигонуклеотиду, который содержит:
a) остаток БЫА в положении 1 и 2 от З'-конца; и/или
b) остаток БЫА в положениях 9 и/или 10, также считая от З'-конца; и/или
c) любой один или два остатка 5'-БЫА.
Хотя преимущества указанных других аспектов можно продемонстрировать на примере более длинных олигонуклеотидов, таких как нуклеотиды длиной до 26 нуклеотидных оснований, однако, принимая во внимание указанные отличительные признаки, можно также использовать и более короткие олигонуклеотиды, описанные в настоящем изобретении, такие как олигонуклеотиды, имеющие 8-17, 8-16, 10-17 или 10-16 нуклеотидных оснований. Особенно предпочтительно, чтобы олигонуклеотиды содержали высокоаффинные нуклеотидные аналоги, такие как аналоги, описанные в настоящем изобретении, а наиболее предпочтительно остатки БЫА.
Авторами настоящего изобретения было неожиданно обнаружено, что правильно сконструированные одноцепочечные олигонуклеотиды, содержащие остатки блокированной нуклеиновой кислоты (БЫА) в определенном порядке, играют важную роль в сайленсинге микроРНК, что приводит к снижению уровней микроРНК. Было обнаружено, что важное значение имеет жесткое связывание указанных олигонуклеотидов с так называемой уникальной (кееб) последовательностью микроРНК-мишеней в положении нуклеотидов 2-8 или 2-7 от 5'-конца. Нуклеотид 1 микроРНК-мишеней представляет собой неспаривающееся основание и, по всей вероятности, скрытое в связывающем кармане белка Адо 2. Не высказывая какой-либо конкретной теории, авторы настоящего изобретения лишь отмечают, что посредством отбора последовательностей уникальной области, в частности области, включающей олигонуклеотиды, содержащие БЫА, а предпочтительно остатки БЫА в области, комплементарной уникальной области, т.е. где дуплекс, образованный между миРНК и олигонуклеотидом, является особенно эффективным для нацеливания на миРНК, можно избежать возникновения побочных эффектов и сообщать олигонуклеотиду другое отличительное свойство, которое позволяло бы предотвращать КБ5С-направленное действие на миРНК.
Авторами настоящего изобретения было неожиданно обнаружено, что сайленсинг микроРНК может оказаться даже еще более сильным в том случае, если БЫА-модифицированные одноцепочечные олигонуклеотиды не содержат нуклеотида у З'-конца, соответствующего данному неспаренному нуклеотиду 1. Было также обнаружено, что два остатка БЫА у З'-конца олигонуклеотидов согласно изобретению придают указанным олигонуклеотидам высокий уровень резистентности к нуклеазе.
Было также обнаружено, что олигонуклеотиды согласно изобретению, которые имеют по меньшей мере один нуклеотидный аналог, такой как нуклеотид БЫА в положениях, соответствующих положениям 10 и 11 от 5'-конца микроРНК-мишени, могут предупреждать расщепление олигонуклеотидов согласно изобретению.
- 6 015570
В соответствии с этим в одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к олигонуклеотиду, имеющему длину от 12 до 26 нуклеотидов, где:
ί) первый нуклеотид, от З'-конца, представляет собой остаток блокированной нуклеиновой кислоты ДОЛ);
ίί) второй нуклеотид, от З'-конца, представляет собой остаток ΕΝΆ;
ϊϊΐ) девятый и/или десятый нуклеотиды, от З'-конца, представляют собой остаток ΕΝΆ.
Настоящее изобретение также относится к определенным здесь олигонуклеотидам, которые могут быть использованы в качестве лекарственного средства.
Настоящее изобретение также относится к композициям, содержащим определенные здесь олигонуклеотиды и фармацевтически приемлемый носитель.
Как упоминалось выше, микроРНК ассоциируются с развитием ряда заболеваний. Следовательно, в своем четвертом аспекте настоящее изобретение относится к применению определенного здесь олигонуклеотида в целях получения лекарственного средства для лечения заболеваний, ассоциированных с экспрессией микроРНК и выбранных из группы, состоящей из атрофии мышц позвоночника, синдрома Туретта, заболевания, вызываемого вирусом гепатита С, умственной отсталости, т.е. синдрома ломкой Х-хромосомы, синдрома Ди Георге и рака, такого как хронический лимфоцитарный лейкоз, рак молочной железы, рак легких и рак толстой кишки.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу снижения уровней микроРНКмишени, который включает контактирование микроРНК-мишени с определенным здесь олигонуклеотидом, где указанный олигонуклеотид:
1) является комплементарным микроРНК-мишени;
2) не содержит нуклеотида у З'-конца, соответствующего первому нуклеотиду у 5'-конца микроРНК-мишени.
Настоящее изобретение также относится к олигонуклеотиду, содержащему нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8Еф ΙΌ N0: 20, 8Еф ΙΌ N0: 21, 8Еф ΙΌ N0:22,
8Еф ГО N0: 23, 8Еф ГО N0: 24, 8Еф ГО N0: 25, 8Еф ГО N0: 28, 8Еф ГО N0: 26, 8Еф ГО N0:27,
8Еф ГО N0: 82, 8Еф ГО N0: 83, 8Еф ГО N0: 84, 8Еф ГО N0: 85, 8Еф ГО N0: 86, 8Еф ГО N0:87,
8Еф ГО N0: 88 и 8Еф ГО N0: 89; где строчные буквы обозначают азотистые основания остатка ДНК, а прописные буквы обозначают азотистые основания остатка ^NΑ и где цитозины ^NΑ являются, но необязательно, метилированными, или к его конъюгату.
Настоящее изобретение также относится к олигонуклеотиду, содержащему нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8Еф ГО N0: 11, 8Еф ГО N0: 12, 8Еф ГО N0:13,
8Еф ГО N0: 14, 8Еф ГО N0: 15, 8Еф ГО N0: 16, 8Еф ГО N0: 17, 8Еф ГО N0: 18, 8Еф ГО N0:19,
8Еф ГО N0: 90, 8Еф ГО N0: 91, 8Еф ГО N0: 92, 8Еф ГО N0: 93, 8Еф ГО N0: 94, 8Еф ГО N0:95,
8Еф ГО N0: 96, 8Еф ГО N0: 97, 8Еф ГО N0: 98, 8Еф ГО N0: 99, 8Еф ГО N0: 100 и 8Еф ГО N0: 101; где строчные буквы обозначают азотистые основания остатка ДНК, а прописные буквы обозначают азотистые основания остатка ^NΑ и где цитозины ^NΑ являются, но необязательно, метилированными, или к его конъюгату.
Настоящее изобретение также относится к олигонуклеотиду, содержащему нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8Еф ГО N0: 29, 8Еф ГО N0: 30, 8Еф ГО N0: 31, 8Еф ГО N0: 32, 8Еф ГО N0: 33, 8Еф ГО N0: 34, 8Еф ГО N0: 35, 8Еф ГО N0: 36, 8Еф ГО N0: 37, 8Еф ГО N0: 102, 8Еф ГО N0: 103, 8Еф ГО N0: 104 и 8Еф ГО N0: 105; где строчные буквы обозначают азотистые основания остатка ДНК, а прописные буквы обозначают азотистые основания остатка ^NΑ и где цитозины ^NΑ являются, но необязательно, метилированными, или к его конъюгату.
Настоящее изобретение также относится к олигонуклеотиду, содержащему нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8Еф ГО N0: 47, 8Еф ГО N0: 48, 8Еф ГО N0: 49, 8Еф ГО N0: 50, 8Еф ГО N0: 51, 8Еф ГО N0: 52, 8Еф ГО N0: 53, 8Еф ГО N0: 54, 8Еф ГО N0: 55, 8Еф ГО N0: 106, 8Еф ГО N0: 107, 8Еф ГО N0: 108 и 8Еф ГО N0: 109; где строчные буквы обозначают азотистые основания остатка ДНК, а прописные буквы обозначают азотистые основания остатка ^NΑ и где цитозины ^NΑ являются, но необязательно, метилированными, или к его конъюгату.
Настоящее изобретение также относится к олигонуклеотиду, содержащему нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8Еф ГО N0: 65, 8Еф ГО N0: 66, 8Еф ГО N0: 67, 8Еф ГО N0: 68, 8Еф ГО N0: 69, 8Еф ГО N0: 38, 8Еф ГО N0: 39, 8Еф ГО N0: 40, 8Еф ГО N0: 41, 8Еф ГО N0: 42, 8Еф ГО N0: 43, 8Еф ГО N0: 44, 8Еф ГО N0: 45 и 8Еф ГО N0: 46, где строчные буквы обозначают азотистые основания остатка ДНК, а прописные буквы обозначают азотистые основания остатка ^NΑ и где цитозины ^NΑ являются, но необязательно, метилированными, или к его конъюгату.
В одном из вариантов изобретения олигонуклеотид может иметь нуклеотидную последовательность из 1-17 нуклеотидных оснований, например из 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или 17 нуклеотидных оснований, и в таком варианте изобретения олигонуклеотидные основания могут составлять непрерывную подпоследовательнось в описанных здесь олигонуклеотидах.
- 7 015570
Авторами настоящего изобретения было неожиданно обнаружено, что антисмысловые олигонуклеотиды определенной длины, содержащие конкретную коровую ДНК-последовательность и блокированные нуклеиновые кислоты (ΕΝΑ) в указанной коровой последовательности, обладают превосходными микроРНК-ингибирующими свойствами.
Краткое описание графического материала
Фиг. 1. Влияние обработки различными ΕΝΑ-олигонуклеотидами, направленными против шЖ, на экспрессию нуклеиновой кислоты-мишени в тЖ-122а-экспрессирующей клеточной линии НиН-7. Указаны также количества тЖ-122а (в условных единицах), полученные в результате проведения тЖ-122аспецифической количественной ОТ-ПЦР, по сравнению с необработанными клетками (контроль). ΕΝΑолигонуклеотиды, направленные против тЖ, были использованы в двух концентрациях, 1 и 100 нМ соответственно. Был также включен контроль с несоответствиями (8РС3350) по сравнению с 8РС3349 (также обозначенный здесь 8РС3549).
Фиг. 2. Оценка дозозависимого ингибирования нуклеиновой кислотой ΕΝΑ против тЖ-122а, 8РС3548 и 8РС3549 по сравнению с 8РС3372, где указанную оценку проводили ίη νίνο в мышиной печени с помощью тЖ-122а-специфической ОТ-ПЦР в режиме реального времени.
Фиг. 2Ь. Уровни тЖ-122 в мышиной печени после обработки различными ΕΝΑ, направленными против тЖ (ΕΝΑ-;·ιηΙίιιπΒ). Молекулы Б-НЛ-апНтЖ. 8РС3372 и 8РС3649, вводили здоровым мышам посредством трех 1.р.-инъекций через день в течение шести дней в указанных дозах и мышей умерщвляли через 48 ч после введения последней дозы. Полноразмерную РНК экстрагировали из мышиной печени, а уровни шЖ-122 определяли с помощью тЖ-122-специфической количественной ПЦР.
Фиг. 3. Оценка уровней холестерина в плазме у мышей, обработанных ΕΝΑ против тЖ-122а, по сравнению с уровнями холестерина у контрольных мышей, которым вводили физиологический раствор.
Фиг. 4а. Оценка относительных уровней мРНК Вскбк у мышей, обработанных ΕΝΑ против тЖ122а, по сравнению с уровнями у контрольных мышей, которым вводили физиологический раствор, где указанную оценку проводили с помощью количественной ОТ-ПЦР в реальном времени.
Фиг. 4Ь. Оценка относительных уровней мРНК альдолазы А у мышей, обработанных ΕΝΑ против тЖ-122а, по сравнению с уровнями у контрольных мышей, которым вводили физиологический раствор, где указанную оценку проводили с помощью количественной ОТ-ПЦР в реальном времени.
Фиг 4с. Оценка относительных уровней мРНК ΟΑΕΠΗ у мышей, обработанных ΕΝΑ против тЖ122а (животные 4-30), по сравнению с уровнями у контрольных мышей, которым вводили физиологический раствор (животные 1-3), где указанную оценку проводили с помощью количественной ОТ-ПЦР в реальном времени.
Фиг. 5. Оценка дозозависимого ингибирования тЖ™-122а нуклеиновой кислотой ΕΝΑ, проводимая ίη νίνο в мышиной печени с помощью т1К-122а-специфической ОТ-ПЦР в режиме реального времени. Шесть групп животных (5 мышей на группу) обрабатывали следующим образом. Животным группы 1 вводили ί.ν. 0,2 мл физиологического раствора каждый день в течение 3 дней, животным группы 2 вводили 2,5 мг/кг 8РС3372, животным группы 3 вводили 6,25 мг/кг 8РС3372, животным группы 4 вводили 12,5 мг/кг 8РС3372, животным группы 5 вводили 25 мг/кг 8РС3372, а животным группы 6 вводили 25 мг/кг 8РС3373 (олигонуклеотида ΕΝΑ против тЖ™ с несоответствующими основаниями), где каждую инъекцию вводили одним и тем же способом. Этот эксперимент повторяли (η=10) и результаты объединяли.
Фиг. 6. Проводили сравнение нозерн-блотов 8РС3649 и 8РС3372. Полноразмерную РНК от одной мыши в каждой группе подвергали тЖ-122-специфическому нозерн-блоттингу. Показаны зрелый шЖ122 и дуплекс (блокированной микроРНК), образованный между ΕΝΑ-ηπίΟι-ΗΒ и тЖ-122.
Фиг. 7. Мышей обрабатывали 25 мг/кг/день ΕΝΑ^ηΙ^Κ или физиологическим раствором каждый день в течение трех дней и умерщвляли через 1, 2 или 3 недели после введения последней дозы. Включены также значения, полученные для животных, умерщвленных через 24 ч после введения последней дозы (пример 11, старая конструкция). Уровни тЖ-122 оценивали с помощью количественной ПЦР и нормализовали по среднему значению, полученному для группы мышей, которым вводили физиологический раствор в каждый выбранный момент времени. Включены также значения, полученные для животных, умерщвленных через 24 ч после введения последней дозы (указано среднее и среднеквадратическая ошибка, η=7, 24 ч, η=10). Умерщвление на дни 9, 16 или 23 соответствует умерщвлению через 1, 2 или 3 недели после введения последней дозы.
Фиг. 8. Мышей обрабатывали 25 мг/кг/день ΕΝΑ^ηΙ^Κ или физиологическим раствором каждый день в течение трех дней и умерщвляли через 1, 2 или 3 недели после введения последней дозы. Включены также значения, полученные для животных, умерщвленных через 24 ч после введения последней дозы (пример 11, старая конструкция). Измеряли уровень холестерина в плазме и нормализовали по значению, полученному для группы мышей, которым вводили физиологический раствор в каждый выбранный момент времени (указано среднее и среднеквадратическая ошибка, η=7, 24 ч, η=10).
- 8 015570
Фиг. 9. Дозозависимое индуцирование мРНК, являющейся мишенью для ш1К.-122а, путем ингибирования ш1К-122а под действием 8РС3372. Мышей обрабатывали различными дозами 8РС3372 каждый день в течение трех дней, как описано выше, и умерщвляли через 24 ч после введения последней дозы. Полноразмерную РНК, экстрагированную из печени, подвергали количественной ПЦР. Гены, которые имели предсказанный сайт-мишень для ш1К-122 и активировались, как наблюдалось в анализе, проводимом на микромассивах, оценивали с помощью количественной ПЦР на дозозависимое индуцирование путем увеличения доз 8РС3372. Полноразмерную РНК печени, взятую от 2-3 мышей на группу, умерщвленных через 24 ч после введения последней дозы, подвергали количественной ПЦР для указанных генов. На фиг. 9 показаны уровни мРНК по сравнению с уровнями мРНК у животных в группе, которой вводили физиологический раствор, п=2-3 (2,5-12,5 мг/кг/день: п=2, без среднеквадратической ошибки). Показан также контроль с несоответствиями (тт, 8РС3373).
Фиг. 10. Временное индуцирование мРНК-мишеней для тЖ.-122а-мишени после обработки молекулой 8РС3372. Самок мышей ΝΜ.Ι обрабатывали 25 мг/кг/день 8РС3372, а контрольным животным вводили физиологический раствор каждый день в течение трех дней и умерщвляли через 1, 2 или 3 недели после введения последней дозы соответственно. РНК экстрагировали из печени и уровни предсказанных мРНК, которые являются мишенью для тЖ.-122а и которые были отобраны исходя из данных анализа на микромассивах, оценивали с помощью количественной ПЦР. Были проанализированы по три животных от каждой группы.
Фиг. 11. Индуцирование У1й1г в печени путем 8РС3372-обработки. Те же самые образцы РНК печени, которые были использованы в предыдущем примере (фиг. 10), оценивали на индуцирование У1й1г.
Фиг. 12. Стабильность дуплекса тЖ.-122а/8РС3372 в плазме мышей. Стабильность 8РС3372 и дуплекса 8РС3372/тЖ.-122а анализировали в плазме мышей при 37°С в течение 96 ч. На фиг. 12 проиллюстрирован электрофорез в ПААГ, окрашенном 8УВР.-золотом.
Фиг. 13. Секвестрация зрелой тЖ-122а под действием 8РС3372 приводит к образованию дуплекса. На фиг. 13 показана мембрана, зондированная тЖ.-122а-специфическим зондом (верхняя панель) и повторно зондированная Ье1-7-специфическим зондом (нижняя панель). С использованием шЖ.-122специфического зонда были детектированы две полосы, где одна полоса соответствовала зрелой ιηιΚ122, а другая полоса соответствовала дуплексу, образованному между 8РС3372 и тЖ-122.
Фиг. 14. Секвестрацию тЖ.-122а под действием 8РС3372, а также распределение 8РС3372 оценивали с помощью ίη зйи гибридизации срезов печени. На фигуре представлены криосрезы печени обработанных животных.
Фиг. 15. Экспрессия генов печени у мышей, обработанных ΓΝΑ против т1К.-122. Мышей, обработанных физиологическим раствором и ^NΑ-аηι^шЖ. сравнивали по профилю экспрессии всего генома с помощью программ типа массивов Айутейтх Моизе Сепоте 430 2.0.
(а,1) Показан ряд зондов, отображающих дифференциальную экспрессию в образцах печени мышей, обработанных ΓΝΑ против т1К.-122 и физиологическим раствором, через 24 ч после обработки.
(Ь,2) Показано присутствие уникальной последовательности (последовательности-зерна или зеей-последовательности) тЖ-122 в дифференциально экспрессируемых генах. На графике указано процентное содержание транскриптов по меньшей мере с одной уникальной последовательностью распознавания т1К.-122 в их 3'ИТК. Рандомизация: были генерированы произвольные последовательности, которые были исследованы на присутствие уникальных последовательностей распознавания тЖ.-122. Представлены профили временной экспрессии генов в печени у мышей, обработанных ΕΝΑ-Ηη!™!.. Мышей обрабатывали 25 мг/кг/день ^NΑ-аηί^шЖ, а контрольным животным в течение трех дней вводили физиологический раствор каждый день и через 1, 2 или 3 недели после введения последней дозы умерщвляли. Включены также величины, полученные от животных, умерщвленных через 24 ч после введения последней дозы.
(с,3) РНК-образцы, полученные в различные промежутки времени, также анализировали на профили экспрессии.
Иерархический кластерный анализ профилей экспрессии генов, идентифицированных как дифференциально экспрессированные гены, проводили у мышей, обработанных ΕΝΑ против тЖ, и у мышей, обработанных физиологическим раствором через 24 ч, через одну неделю или через три недели после обработки.
(й,4) Во время всего эксперимента у мышей, обработанных ^NΑ-аηΐ^тЖ, и у мышей, обработанных физиологическим раствором, проводили мониторинг профилей экспрессии генов, идентифицированных как дифференциально экспрессирующиеся гены. Во время всего эксперимента отношение уровней экспрессии активируемых и ингибируемых генов у мышей, обработанных ΕΝΑ^ηΙ^Κ, составляло приблизительно 1, что указывало на обратимый эффект обработки ^NΑ-аηΐ^тЖ.
Фиг. 16. Влияние обработки молекулами 8РС3372 и 3595 на уровни тЖ-122 в мышиной печени.
Фиг. 17. Влияние обработки молекулами 8РС3372 и 3595 на уровни альдолазы А в мышиной печени.
Фиг. 18. Влияние обработки молекулами 8РС3372 и 3595 на уровни Вскйк в мышиной печени.
Фиг. 19. Влияние обработки молекулами 8РС3372 и 3595 на уровни СЭ320 в мышиной печени.
Фиг. 20. Влияние обработки молекулами 8РС3372 и 3595 на уровни Νφ·§3 в мышиной печени.
- 9 015570
Фиг. 21. Влияние длительной обработки молекулой 8РС3649 на общий уровень холестерина в плазме у мышей с гиперхолестеринемией и у нормальных мышей. Пробы плазмы крови брали еженедельно у мышей, обработанных молекулой 8РС3649, и у контрольных мышей, обработанных физиологическим раствором, а затем проводили оценку общего уровня холестерина в плазме. Мышей обрабатывали 5 мг/кг 8РС3649, 8РС3744 или физиологического раствора два раза в неделю. Одновременно проводили обработку нормальных мышей.
Фиг. 22. Влияние длительной обработки молекулой 8РС3649 на уровни ш1В-122 у мышей с гиперхолестеринемией и у нормальных мышей.
Фиг. 23. Влияние длительной обработки молекулой 8РС3649 на уровни альдолазы А у мышей с гиперхолестеринемией и у нормальных мышей.
Фиг. 24. Влияние длительной обработки молекулой 8РС3649 на уровни Вскбк у мышей с гиперхолестеринемией и у нормальных мышей.
Фиг. 25. Влияние длительной обработки молекулой 8РС3649 на уровни А8Т у мышей с гиперхолестеринемией и у нормальных мышей.
Фиг. 26. Влияние длительной обработки молекулой 8РС3649 на уровни АЬТ у мышей с гиперхолестеринемией и у нормальных мышей.
Фиг. 27. Модуляция репликации НСУ под действием 8РС3649 в клеточной модели НиН-7. Нозернблот-анализ РНК НСУ в клетках НиН-7 после трансфекции различными молекулами Б-ΝΑ против Ш1К (8РС3648, 8РС3649 и 8РС3550) и 2'ОМе-молекулами-антагонистами Ш1Т-122 (верхняя панель). Интенсивности сигналов гибридизации количественно оценивали и нормализовали по сигналам мРНК спектрина на каждой дорожке (нижняя панель).
Фиг. 28. Функциональная дерепрессия репрессированной люциферазы коралла (Веш11а) под действием т1В-19Ь-блокирующих олигонуклеотидов в клеточной линии Не1а, эндогенно экспрессирующей 1шВ-19Ь. т1В-19Ь-мишень представляет собой плазмиду, содержащую т1В-19Ь-мишень, но не котрансфицированную олигонуклеотидом, блокирующим т1К-19Ь, а поэтому она представляет Ш1В-19Ь, которая полностью подавляет экспрессию люциферазы Кеш11а.
Фиг. 29. Функциональная дерепрессия репрессированной люциферазы коралла (Веш11а) под действием тЖ.-122-блокирующих олигонуклеотидов в клеточной линии НиН-7, эндогенно экспрессирующей т1К-122. ΊηιΚ- 122-мишень представляет собой соответствующую плазмиду, содержащую тгК- 122мишень, но не котрансфицированную олигонуклеотидом, блокирующим ιηίΒ-122. а поэтому она представляет т1К-122, которая полностью подавляет экспрессию люциферазы Веш11а.
Фиг. 30. Диаграмма, иллюстрирующая выравнивание олигонуклеотида согласно изобретению и микроРНК-мишени.
Подробное описание изобретения
Олигонуклеотид согласно изобретению обычно является одноцепочечным. Поэтому следует отметить, что в соответствии с настоящим изобретением термин олигонуклеотид может быть синонимом термина одноцепочечный олигонуклеотид.
В одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим короткие (одноцепочечные) олигонуклеотиды длиной в 8-17 нуклеотидных оснований, например 10-17 нуклеотидных оснований, комплементарных человеческим микроРНК. Короткие олигонуклеотиды особенно эффективно способствуют подавлению миРНК ίη νίνο. Было обнаружено, что включение высокоаффинных нуклеотидных аналогов в олигонуклеотиды приводит к образованию высокоэффективных молекул, которые подавляют микроРНК и, очевидно, действуют посредством образования почти необратимых дуплексов с миРНК-мишенью, а не посредством механизмов на основе расщепления РНК, таких как механизмы, ассоциированные с действием РНКазы Н или В18С.
При этом особенно предпочтительно, чтобы одноцепочечный олигонуклеотид согласно изобретению содержал область из последовательности смежных нуклеотидных оснований, которая на 100% комплементарна человеческой уникальной области микроРНК.
Предпочтительно, чтобы одноцепочечный олигонуклеотид согласно изобретению был комплементарен зрелой человеческой последовательности микроРНК.
Предпочтительные олигонуклеотиды согласно изобретению комплементарны последовательности микроРНК, выбранной из группы, состоящей из йка-т1В-19Ь, йка-т1В-21, йка-т1В-122, йка-тЖ.-142 а7Ь, Й8а-т1В-155, йка-тЖ.-375.
В одном из вариантов изобретения олигонуклеотид согласно изобретению не содержит нуклеотидного основания у 3'-конца, соответствующего первому 5'-концевому нуклеотиду микроРНК-мишени.
В одном из вариантов изобретения первым нуклеотидным основанием одноцепочечного олигонуклеотида согласно изобретению, если считать от 3'-конца, является нуклеотидный аналог, такой как остаток ΕΝΑ.
В одном из вариантов изобретения вторым нуклеотидным основанием одноцепочечного олигонуклеотида согласно изобретению, если считать от 3'-конца, является нуклеотидный аналог, такой как остаток ΕΝΑ.
- 10 015570
В одном из вариантов изобретения девятым и/или десятым нуклеотидом одноцепочечного олигонуклеотида согласно изобретению, если считать от З'-конца, является нуклеотидный аналог, такой как остаток ΕΝΆ.
В одном из вариантов изобретения девятым нуклеотидным основанием одноцепочечного олигонуклеотида согласно изобретению, если считать от З'-конца, является нуклеотидный аналог, такой как остаток ΕΝΆ.
В одном из вариантов изобретения десятым нуклеотидным основанием одноцепочечного олигонуклеотида согласно изобретению, если считать от З'-конца, является нуклеотидный аналог, такой как остаток ΕΝΆ.
В одном из вариантов изобретения девятым и десятым нуклеотидным основанием одноцепочечного олигонуклеотида согласно изобретению, если считать от З'-конца, является нуклеотидный аналог, такой как остаток ΕΝΆ.
В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид согласно изобретению не содержит область из более чем 5 смежных нуклеотидных остатков ДНК. В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид согласно изобретению не содержит область из более чем 6 смежных нуклеотидных остатков ДНК. В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид согласно изобретению не содержит область из более чем 7 смежных нуклеотидных остатков ДНК. В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид согласно изобретению не содержит область из более чем 8 смежных нуклеотидных остатков ДНК. В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид согласно изобретению не содержит область из более чем З смежных нуклеотидных остатков ДНК. В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид согласно изобретению не содержит область из более чем 2 смежных нуклеотидных остатков ДНК.
В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид содержит, по меньшей мере, область, состоящую по меньшей мере из двух смежных остатков нуклеотидных аналогов, например по меньшей мере из двух смежных остатков ΕΝΆ.
В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид содержит, по меньшей мере, область, состоящую по меньшей мере из трех смежных остатков нуклеотидных аналогов, например по меньшей мере из трех смежных остатков ΕΝΆ.
В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид согласно изобретению не содержит область из более чем 7 смежных остатков нуклеотидных аналогов, таких как остатки ΕΝΆ. В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид согласно изобретению не содержит область из более чем 6 смежных остатков нуклеотидных аналогов, таких как остатки ΕΝΆ. В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид согласно изобретению не содержит область из более чем 5 смежных остатков нуклеотидных аналогов, таких как остатки ΕΝΆ. В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид согласно изобретению не содержит область из более чем 4 смежных остатков нуклеотидных аналогов, таких как остатки ΕΝΆ. В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид согласно изобретению не содержит область из более чем З смежных остатков нуклеотидных аналогов, таких как остатки ΕΝΆ. В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид согласно изобретению не содержит область из более чем 2 смежных остатков нуклеотидных аналогов, таких как остатки ΕΝΆ.
В одном из вариантов изобретения первое или второе З'-нуклеотидное основание одноцепочечного олигонуклеотида соответствует второму 5'-нуклеотиду последовательности микроРНК.
В одном из вариантов изобретения остатки нуклеотидных оснований 1-6 (включительно) одноцепочечного олигонуклеотида от З'-конца области одноцепочечного олигонуклеотида комплементарны последовательности уникальной области микроРНК.
В одном из вариантов изобретения остатки нуклеотидных оснований 1-7 (включительно) одноцепочечного олигонуклеотида от З'-конца области одноцепочечного олигонуклеотида комплементарны последовательности уникальной области микроРНК.
В одном из вариантов изобретения остатки нуклеотидных оснований 2-7 (включительно) одноцепочечного олигонуклеотида от З'-конца области одноцепочечного олигонуклеотида комплементарны последовательности уникальной области микроРНК.
В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид включает по меньшей мере один остаток нуклеотидного аналога, такой как по меньшей мере один остаток ΕΝΆ, в положении, которое находится в области, комплементарной уникальной области миРНК. В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид может включать 1-6 или 1-7 остатков нуклеотидных аналогов, например 1-6 и 1-7 остатков ΕΝΆ, в положении, которое находится в области, комплементарной уникальной области миРНК.
- 11 015570
В одном из вариантов изобретения нуклеотидная последовательность одноцепочечного олигонуклеотида, которая является комплементарной последовательности уникальной области микроРНК, выбрана из группы, состоящей из (Х)Хххххх, (Х)хХхххх, (Х)ххХххх, (Х)хххХхх, (Х)ххххХх и (Х)хххххХ, расположенных в направлении 3'-5', где X обозначает нуклеотидный аналог, (X) обозначает необязательный нуклеотидный аналог, такой как остаток ΕΝΆ, а х обозначает нуклеотидный остаток ДНК или РНК.
В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид включает по меньшей мере два остатка нуклеотидного аналога, такие как по меньшей мере два остатка ΕΝΆ, в положениях, комплементарных уникальной области миРНК.
В одном из вариантов изобретения нуклеотидная последовательность одноцепочечного олигонуклеотида, которая является комплементарной последовательности уникальной области микроРНК, выбрана из группы, состоящей из (Х)ХХхххх, (Х)ХхХххх, (Х)ХххХхх, (Х)ХхххХх, (Х)ХххххХ, (Х)хХХххх, (Х)хХхХхх, (Х)хХххХх, (Х)хХхххХ, (Х)ххХХхх, (Х)ххХхХх, (Х)ххХххХ, (Х)хххХХх, (Х)хххХхХ и (Х)ххххХХ, где Х обозначает нуклеотидный аналог, такой как остаток ΕΝΆ, (Х) обозначает необязательный нуклеотидный аналог, такой как остаток ΕΝΆ, а х обозначает нуклеотидный остаток ДНК или РНК.
В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид включает по меньшей мере три остатка нуклеотидного аналога, такие как по меньшей мере три остатка ΕΝΆ, в положениях, комплементарных уникальной области миРНК.
В одном из вариантов изобретения нуклеотидная последовательность одноцепочечного олигонуклеотида, которая является комплементарной последовательности уникальной области микроРНК, выбрана из группы, состоящей из (Х)ХХХххх, (Х)хХХХхх, (Х)ххХХХх, (Х)хххХХХ, (Х)ХХхХхх, (Х)ХХххХх, (Х)ХХхххХ, (Х)хХХхХх, (Х)хХХххХ, (Х)ххХХхХ, (Х)ХхХХхх, (Х)ХххХХх, (Х)ХхххХХ, (Х)хХхХХх, (Х)хХххХХ, (Х)ххХхХХ, (Х)хХхХхХ и (Х)ХхХхХх,, где Х обозначает нуклеотидный аналог, такой как остаток ΕΝΆ, (Х) обозначает необязательный нуклеотидный аналог, такой как остаток ΕΝΆ, а х обозначает нуклеотидный остаток ДНК или РНК.
В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид включает по меньшей мере четыре остатка нуклеотидного аналога, такие как по меньшей мере четыре остатка ΕΝΆ, в положениях, комплементарных уникальной области миРНК.
В одном из вариантов изобретения нуклеотидная последовательность одноцепочечного олигонуклеотида, которая является комплементарной последовательности уникальной области микроРНК, выбрана из группы, состоящей из (Х)ххХХХ, (Х)хХхХХХ, (Х)хХХхХХ, (Х)хХХХхХ, (Х)хХХХХх, (Х)ХххХХХХ, (Х)ХхХхХХ, (Х)ХхХХхХ, (Х)ХхХХх, (Х)ХХххХХ, (Х)ХХхХхХ, (Х)ХХхХХх, (Х)ХХХххХ, (Х)ХХХхХх и (Х)ХХХХхх, где Х обозначает нуклеотидный аналог, такой как остаток ΕΝΆ, (Х) обозначает необязательный нуклеотидный аналог, такой как остаток ΕΝΆ, а х обозначает нуклеотидный остаток ДНК или РНК.
В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид включает по меньшей мере пять остатков нуклеотидного аналога, такие как по меньшей мере пять остатков ΕΝΆ, в положениях, комплементарных уникальной области миРНК.
В одном из вариантов изобретения нуклеотидная последовательность одноцепочечного олигонуклеотида, которая является комплементарной последовательности уникальной области микроРНК, выбрана из группы, состоящей из (Х)хХХХХХ, (Х)ХхХХХХ, (Х)ХХхХХХ, (Х)ХХХхХХ, (Х)ХХХХхХ и (Х)ХХХХХх, где Х обозначает нуклеотидный аналог, такой как остаток ΕΝΆ, (Х) обозначает необязательный нуклеотидный аналог, такой как остаток ΕΝΆ, а х обозначает нуклеотидный остаток ДНК или РНК.
В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид включает шесть или семь остатков нуклеотидного аналога, такие как шесть или семь остатков ΕΝΆ, в положениях, комплементарных уникальной области миРНК.
В одном из вариантов изобретения нуклеотидная последовательность одноцепочечного олигонуклеотида, которая является комплементарной последовательности уникальной области микроРНК, выбрана из группы, состоящей из ХХХХХХ, ХхХХХХХ, ХХхХХХХ, ХХХхХХХ, ХХХХхХХ, ХХХХХхХ и ХХХХХХх, где Х обозначает нуклеотидный аналог, такой как остаток ΕΝΆ, а х обозначает нуклеотидный остаток ДНК или РНК.
В одном из вариантов изобретения мотив из двух нуклеотидных оснований в положениях 7-8, если считать от 3'-конца, одноцепочечного олигонуклеотида выбран из группы, состоящей из хх, ХХ, хХ и Хх, где Х обозначает нуклеотидный аналог, такой как остаток ΕΝΆ, а х обозначает нуклеотидный остаток ДНК или РНК.
В одном из вариантов изобретения мотив из двух нуклеотидных оснований в положениях 7-8, если считать от 3'-конца, одноцепочечного олигонуклеотида выбран из группы, состоящей из ХХ, хХ и Хх, где Х обозначает нуклеотидный аналог, такой как остаток ΕΝΆ, а х обозначает нуклеотидный остаток ДНК или РНК.
- 12 015570
В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид включает по меньшей мере 12 нуклеотидных оснований, где мотив из двух нуклеотидных оснований в положениях 11-12, если считать от З'-конца, одноцепочечного олигонуклеотида выбран из группы, состоящей из хх, XX, хХ и Хх, где X обозначает нуклеотидный аналог, такой как остаток БЫЛ, а х обозначает нуклеотидный остаток ДНК или РНК.
В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид включает по меньшей мере 12 нуклеотидных оснований, где мотив из двух нуклеотидных оснований в положениях 11-12, если считать от З'-конца, одноцепочечного олигонуклеотида выбран из группы, состоящей из XX, хХ и Хх, где X обозначает нуклеотидный аналог, такой как остаток БЫА, а х обозначает нуклеотидный остаток ДНК или РНК.
В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид включает по меньшей мере 1З нуклеотидных оснований, где мотив из трех нуклеотидных оснований в положениях 11-1З, если считать от З'-конца, выбран из группы, состоящей из ххх, Ххх, хХх, ххХ, ХХх, ХхХ, хХХ и XXX, где X обозначает нуклеотидный аналог, такой как остаток БЫА, а х обозначает нуклеотидный остаток ДНК или РНК.
В одном из вариантов изобретения мотив из трех нуклеотидных оснований в положениях 11-1З, если считать от З'-конца, одноцепочечного олигонуклеотида выбран из группы, состоящей из Ххх, хХх, ххХ, ХХх, ХхХ, хХХ и XXX, где X обозначает нуклеотидный аналог, такой как остаток БЫА, а х обозначает нуклеотидный остаток ДНК или РНК.
В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид включает по меньшей мере 14 нуклеотидных оснований, где мотив из четырех нуклеотидных оснований в положениях 11-14, если считать от З'-конца, выбран из группы, состоящей из хххх, Хххх, хХхх, ххХх, хххХ, ХХхх, ХхХх, ХххХ, хХХх, хХхХ, ххХХ, ХХХх, ХхХХ, хХХХ, ХХхХ и ХХХХ, где X обозначает нуклеотидный аналог, такой как остаток БЫА, а х обозначает нуклеотидный остаток ДНК или РНК.
В одном из вариантов изобретения мотив из четырех нуклеотидных оснований в положениях 11-14 одноцепочечного олигонуклеотида, если считать от З'-конца, выбран из группы, состоящей из Хххх, хХхх, ххХх, хххХ, ХХхх, ХхХх, ХххХ, хХХх, хХхХ, ххХХ, ХХХх, ХхХХ, хХХХ, ХХхХ и ХХХХ, где X обозначает нуклеотидный аналог, такой как остаток БЫА, а х обозначает нуклеотидный остаток ДНК или РНК.
В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид включает 15 нуклеотидных оснований, где мотив из пяти нуклеотидных оснований в положениях 11-15, если считать от З'-конца, выбран из группы, состоящей из Ххххх, хХххх, ххХхх, хххХх, ххххХ, ХХххх, ХхХхх, ХххХх, ХхххХ, хХХхх, хХхХх, хХххХ, ххХХх, ххХхХ, хххХХ, ХХХхх, ХХххХ, ХххХХ, хХХХх, ххХХХ, ХХхХХ, ХхХхХ, ХХХХх, ХХХхХ, ХХхХХ, ХхХХХХ, хХХХХ и ХХХХХ, где X обозначает нуклеотидный аналог, такой как остаток БЫА, а х обозначает нуклеотидный остаток ДНК или РНК.
В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид включает 16 нуклеотидных оснований, а мотив из шести нуклеотидных оснований в положениях 11-16, если считать от З'-конца, выбран из группы, состоящей из Хххххх, хХхххх, ххХххх, хххХхх, ххххХх, хххххХ, ХХхххх, ХхХххх, ХххХхх, ХхххХх, ХххххХ, хХХххх, хХхХхх, хХххХх, хХхххХ, ххХХхх, ххХхХх, ххХххХ, хххХХх, хххХхХ, ххххХХ, ХХХххх, ХХхХхх, ХХххХх, ХХхххХ, ХхХХхх, ХхХхХх, ХхХххХ, ХххХХх, ХххХхХ, ХхххХХ, хХХХхх, хХХхХх, хХХххХ, хХхХХх, хХхХхХ, хХххХХ, ххХХХх, ххХХхХ, ххХхХХ, хххХХХ, ХХХХхх, ХХХххХ, ХХххХХ, ХххХХХ, ххХХХХ, хХхХХХ, ХхХхХХ, ХХхХхХ, ХХХхХх, хХХхХХ, ХхХХхХ, ХХхХХх, хХХХхХ, ХхХХХх, хХХХХх, хХХХХХ, ХхХХХХ, ХХхХХХ, ХХХхХХ, ХХХХхХ, ХХХХХх и ХХХХХХ, где X обозначает нуклеотидный аналог, такой как остаток БЫА, а х обозначает нуклеотидный остаток ДНК или РНК.
В одном из вариантов изобретения мотив из шести нуклеотидных оснований в положениях 11-16 одноцепочечного олигонуклеотида, если считать от З'-конца, представляет собой ххХххХ, где X обозначает нуклеотидный аналог, такой как остаток БЫА, а х обозначает нуклеотидный остаток ДНК или РНК.
В одном из вариантов изобретения три крайних 5'-концевых нуклеотидных основания выбраны из группы, состоящей из Ххх, хХх, ххХ, ХХх, ХхХ, хХХ и XXX, где X обозначает нуклеотидный аналог, такой как остаток БЫА, а х обозначает нуклеотидный остаток ДНК или РНК.
В одном из вариантов изобретения х обозначает остаток ДНК.
В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид включает, у 5'-конца, остаток нуклеотидного аналога, такой как остаток БЫА.
В одном из вариантов изобретения остатки нуклеотидных аналогов, такие как X, независимо выбраны из группы, состоящей из остатка 2'-О-алкил-РНК, остатка 2'ОМе-РНК, остатка 2'-амино-ДНК, остатка 2'-фтор-ДНК, остатка БЫА, остатка РЫА, остатка НЫА, остатка 1ЫА.
В одном из вариантов изобретения все нуклеотидные основания одноцепочечного олигонуклеотида согласно изобретению представляют собой остатки нуклеотидных аналогов.
В одном из вариантов изобретения остатки нуклеотидных аналогов, такие как X, независимо выбраны из группы, состоящей из остатков 2'ОМе-РНК, остатков 2'-фтор-ДНК и остатков БЫА.
- 1З 015570
В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид включает указанный по меньшей мере один остаток аналога ΕΝΑ и по меньшей мере один дополнительный остаток нуклеотидного аналога, не являющийся остатком ΕΝΑ.
В одном из вариантов изобретения остаток или остатки нуклеотидных аналогов, не являющихся ΕΝΑ, независимо выбраны из остатков 2'ОМе-РНК и остатков 2'-фтор-ДНК.
В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид состоит по меньшей мере из одной последовательности ΧΥΧ или ΥΧΥ, где X представляет собой ΕΝΑ, а Υ представляет собой остаток 2'ОМе-РНК и остаток 2'-фтор-ДНК.
В одном из вариантов изобретения последовательность нуклеотидных оснований одноцепочечного олигонуклеотида состоит из чередующихся остатков Χ и Υ.
В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид включает чередующиеся остатки ΕΝΑ и ДНК (Хх) или (хХ).
В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид включает мотив из чередующихся остатков ΕΝΑ, за которыми следуют 2 остатка ДНК (Ххх), хХх или ххХ.
В одном из вариантов изобретения по меньшей мере один из остатков нуклеотидных аналогов ДНК или остатков нуклеотидного аналога, не являющегося ΕΝΑ, заменен нуклеотидным основанием ΕΝΑ в положении, выбранном из положений, идентифицированных как остатки нуклеотидных оснований ΕΝΑ согласно любому из вышеуказанных вариантов.
В одном из вариантов изобретения X обозначает остаток ΕΝΑ.
В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид включает по меньшей мере 2 остатка нуклеотидных аналогов, например по меньшей мере 3 остатка нуклеотидных аналогов, например по меньшей мере 4 остатка нуклеотидных аналогов, например по меньшей мере 5 остатков нуклеотидных аналогов, например по меньшей мере 6 остатков нуклеотидных аналогов, например по меньшей мере 7 остатков нуклеотидных аналогов, например по меньшей мере 8 остатков нуклеотидных аналогов, например по меньшей мере 9 остатков нуклеотидных аналогов, например по меньшей мере 10 остатков нуклеотидных аналогов.
В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид включает по меньшей мере 2 остатка ΕΝΑ, например по меньшей мере 3 остатка ΕΝΑ, например по меньшей мере 4 остатка ΕΝΑ, например по меньшей мере 5 остатков ΕΝΑ, например по меньшей мере 6 остатков ΕΝΑ, например по меньшей мере 7 остатков ΕΝΑ, например по меньшей мере 8 остатков ΕΝΑ, например по меньшей мере 9 остатков ΕΝΑ, например по меньшей мере 10 остатков ΕΝΑ.
В одном из вариантов изобретения по меньшей мере один остаток нуклеотидного аналога, такой как остаток ΕΝΑ, например остаток в положениях 1-10 нуклеотидного аналога, такой как остаток ΕΝΑ, в частности, остаток в положении 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 нуклеотидных аналогов, таких как остатки ΕΝΑ, представляет собой цитозин или гуанин.
В одном из вариантов изобретения по меньшей мере два остатка нуклеотидных аналогов, такие как остатки ΕΝΑ, представляют собой цитозин или гуанин. В одном из вариантов изобретения по меньшей мере три остатка нуклеотидных аналогов, такие как остатки ΕΝΑ, представляют собой цитозин или гуанин. В одном из вариантов изобретения по меньшей мере четыре остатка нуклеотидных аналогов, такие как остатки ΕΝΑ, представляют собой цитозин или гуанин. В одном из вариантов изобретения по меньшей мере пять остатков нуклеотидных аналогов, такие как остатки ΕΝΑ, представляют собой цитозин или гуанин. В одном из вариантов изобретения по меньшей мере шесть остатков нуклеотидных аналогов, такие как остатки ΕΝΑ, представляют собой цитозин или гуанин. В одном из вариантов изобретения по меньшей мере семь остатков нуклеотидных аналогов, такие как остатки ΕΝΑ, представляют собой цитозин или гуанин. В одном из вариантов изобретения по меньшей мере восемь остатков нуклеотидных аналогов, такие как остатки ΕΝΑ, представляют собой цитозин или гуанин.
В предпочтительном варианте изобретения нуклеотидные аналоги образуют дуплекс с комплементарным нуклеотидом РНК, который имеет более высокую термостабильность, чем дуплекс, в котором эквивалентный нуклеотид ДНК аффинно связан с указанным комплементарным нуклеотидом РНК.
В одном из вариантов изобретения нуклеотидные аналоги сообщают одноцепочечному олигонуклеотиду более высокую стабильность в сыворотке.
В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид образует А-спиральную конформацию с комплементарной одноцепочечной молекулой РНК.
Дуплекс, образованный между двумя молекулами РНК, обычно присутствует в А-конформации, а дуплекс, образованный между двумя молекулами ДНК, обычно присутствует в В-конформации. Дуплекс, образованный между молекулами ДНК и РНК, обычно присутствует в промежуточной конформации (в А/В-форме). Нуклеотидные аналоги, такие как бета-Э-окси-ΕΝΑ, могут быть использованы для стимуляции образования конформации, наиболее близкой к А-конформации. Для определения формы дуплексов между олигонуклеотидами согласно изобретению и комплементарными молекулами РНК применяют стандартный метод кольцевого дихроизма (ΚΌ) или ЯМР-анализ.
- 14 015570
Поскольку считается, что рекрутинг под действием К18С-комплекса зависит от конкретной структурной конформации миРНК/мРНК-мишени, то в одном из вариантов изобретения олигонуклеотиды согласно изобретению могут образовывать дуплекс в А/В-конформации с комплементарной молекулой РНК.
Однако авторами настоящего изобретения было также определено, что использование нуклеотидных аналогов, таких как альфа-Ь-изомер ΕΝΑ, может также оказаться эффективным для стимуляции образования А-конформационной структуры.
В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид образует А/В-конформацию с комплементарной одноцепочечной молекулой РНК.
В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид образует А-конформацию с комплементарной одноцепочечной молекулой РНК.
В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид согласно изобретению не опосредует расщепление комплементарной одноцепочечной молекулы РНК под действием РНКазы Н. Обычно для эффективного рекрутинга РНКазы Н под действием олигонуклеотида необходимо, чтобы олигонуклеотидный фрагмент состоял по меньшей мере из 5 (обычно он не является эффективным для рекрутинга РНКазы Н), более предпочтительно по меньшей мере из 6, а еще более предпочтительно по меньшей мере примерно из 7 или 8 смежных нуклеотидных оснований ДНК (или альтернативных нуклеотидных оснований, которые способны осуществлять рекрутинг РНКазы Н, таких как альфа-Ь-амино ΕΝΑ).
В ЕР 1222309 описаны методы ίη νίΐτο определения активности РНКазы Н, которые могут быть применены для определения способности олигонуклеотида к рекрутингу РНКазы Н. Считается, что соединение способно осуществлять рекрутинг РНКазы Н, если, в случае использования комплементарной РНК-мишени, исходный уровень РНКазы Н, измеряемый в пмоль/л/мин, составляет по меньшей мере 1%, например по меньшей мере 5%, например по меньшей мере 10% или менее чем 20% от исходного уровня, определяемого с использованием только эвивалентных ДНК-олигонуклеотидов, не имеющих 2'-замещений и имеющих фосфортиоатные связи между всеми нуклеотидами в данном олигонуклеотиде, как было определено с применением методики, описанной в примерах 91-95 ЕР 1222309.
При этом считается, что соединение в основном не способно осуществлять рекрутинг РНКазы Н, если, в случае использования комплементарной РНК-мишени, исходный уровень РНКазы Н, измеряемый в пмоль/л/мин, составляет менее чем 1%, например менее чем 5%, например менее чем 10% или менее чем 20% от исходного уровня, определяемого с использованием только эквивалентных только ДНКолигонуклеотидов, не имеющих 2'-замещений и имеющих фосфортиоатные связывающие группы между всеми нуклеотидами в данном олигонуклеотиде, как было определено с применением методики, описанной в примерах 91-95 ЕР 1222309.
В особенно предпочтительном варианте изобретения одноцепочечный олигонуклеотид согласно изобретению обладает способностью образовывать дуплекс с комплементарной одноцепочечной молекулой нуклеиновой кислоты РНК (обычно примерно такой же длины, как и указанный одноцепочечный олигонуклеотид), имеющей фосфодиэфирные межнуклеозидные связи, где указанный дуплекс имеет Тт по меньшей мере примерно 60°С, при этом предпочтительно, чтобы одноцепочечный олигонуклеотид обладал способностью образовывать дуплекс с комплементарной одноцепочечной молекулой нуклеиновой кислоты РНК, имеющей фосфодиэфирные межнуклеозидные связи, где указанный дуплекс имеет Тт примерно 70-95°С, например примерно 70-90°С, например примерно 70-85°С.
В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид согласно изобретению обладает способностью образовывать дуплекс с комплементарной одноцепочечной молекулой нуклеиновой кислоты ДНК, имеющей фосфодиэфирные межнуклеозидные связи, где указанный дуплекс имеет Тт примерно 50-95°С, например примерно 50-90°С, например по меньшей мере примерно 55°С, например по меньшей мере примерно 60°С или не более чем примерно 95°С.
В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид может иметь длину 14-16 нуклеотидных оснований, включая 15 нуклеотидных оснований.
В одном из вариантов изобретения остаток или остатки ΕΝΑ независимо выбраны из группы, состоящей из окси-ΕΝΑ, тио-ΕΝΑ и амино-ΕΝΑ, в любой из Ό-β- и Б-а-конфигураций или их комбинаций.
В одном из конкретных вариантов изобретения остатками ΕΝΑ могут быть нуклеотидные основания ΕΝΑ.
В одном из вариантов изобретения остатки ΕΝΑ составляют бета-Э-окси-ΕΝΑ.
В одном из вариантов изобретения остатки ΕΝΑ составляют альфа-Е-амино-ΕΝΑ.
В предпочтительном варианте изобретения одноцепочечный олигонуклеотид включает 3-17 остатков ΕΝΑ.
В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид включает по меньшей мере одну межнуклеозидную связывающую группу, которая не является фосфатом.
В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид включает по меньшей мере одну фосфортиоатную межнуклеозидную связь.
- 15 015570
В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид включает фосфодиэфирную и фосфортиоатную связи.
В одном из вариантов изобретения все межнуклеозидные связи представляют собой фосфортиоатные связи.
В одном из вариантов изобретения одноцепочечный олигонуклеотид включает по меньшей мере одну фосфодиэфирную межнуклеозидную связь.
В одном из вариантов изобретения все межнуклеозидные связи одноцепочечного олигонуклеотида согласно изобретению представляют собой фосфодиэфирные связи.
В одном из вариантов изобретения фармацевтическая композиция согласно изобретению включает носитель, такой как физиологический раствор или забуференный физиологический раствор.
В одном из вариантов изобретения синтез одноцепочечного олигонуклеотида, направленного против человеческой микроРНК, осуществляют в направлении 3'-5' а-ί.
Такой способ синтеза одноцепочечного олигонуклеотида согласно изобретению может быть осуществлен с применением стандартного твердофазного олигонуклеотидного синтеза.
Другие варианты изобретения, которые могут быть объединены с вышеописанными вариантами, приводятся в формуле изобретения и в разделе, озаглавленном Другие варианты изобретения.
Определения
Термин нуклеотидное основание обозначает нуклеотиды, такие как нуклеотиды ДНК и РНК, и нуклеотидные аналоги.
Термин олигонуклеотид (или просто олиго) в контексте настоящего описания обозначает молекулу, образованную посредством ковалентной связи двух или более нуклеотидных оснований. В одном из вариантов изобретения олигонуклеотид, используемый в настоящем изобретении (также называемый одноцепочечным олигонуклеотидом), может иметь длину, например 8-26 нуклеотидов, например 10-26 нуклеотидов, например 12-26 нуклеотидов. В предпочтительном варианте изобретения, подробно описанном в настоящем изобретении, олигонуклеотид согласно изобретению имеет длину 8-17 нуклеотидов, например 20-27 нуклеотидов, например 8-16 нуклеотидов, например 12-15 нуклеотидов.
В таком варианте изобретения олигонуклеотид согласно изобретению может иметь длину 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или 26 нуклеотидов.
Следует отметить, что в случае использования более коротких олигонуклеотидов может оказаться необходимым увеличение числа (высокоаффинных) нуклеотидных аналогов, таких как ΕΝΆ. Поэтому в одном из вариантов, изобретения по меньшей мере примерно 30% нуклеотидов, например по меньшей мере примерно 33%, например по меньшей мере примерно 40% или по меньшей мере примерно 50% или по меньшей мере примерно 60%, например по меньшей мере примерно 66%, например по меньшей мере примерно 70%, например по меньшей мере примерно 80%, или по меньшей мере примерно 90% нуклеотидов представляют собой нуклеотидные аналоги. Также очевидно, что указанный олигонуклеотид может состоять из нуклеотидной последовательности, состоящей только из последовательностей нуклеотидных аналогов.
Используемый здесь термин азотистое основание включает пурины и пиримидины, такие как нуклеотидные основания ДНК А, С, Т и О, нуклеотидные основания РНК А, С, и и О, а также нуклеотидные основания, не являющиеся основаниями ДНК/РНК, такие как 5-метилцитозин (МеС), изоцитозин, псевдоизоцитозин, 5-бромурацил, 5-пропинилурацил, 5-пропинил-6-фторурацил, 5-метилтиазолурацил, 6-аминопурин, 2-аминопурин, инозин, 2,6-диаминопурин, 7-пропин-7-деазааденин, 7-пропин-7деазагуанин и 2-хлор-6-аминопурин, в частности МеС. При этом следует отметить, что практически выбор нуклеотидного основания, не являющегося основанием ДНК/РНК, зависит от соответствующего (или спаривающегося) нуклеотида, присутствующего в цепи микроРНК, т. е. олигонуклеотида, который, предположительно, является мишенью. Так, например, в случае если соответствующим нуклеотидом является О, то обычно необходимо выбрать такое нуклеотидное основание, не являющееся основанием ДНК/РНК, которое будет обладать способностью образовывать водородные связи с О. В этом конкретном случае, если соответствующим нуклеотидом является О, то типичным примером предпочтительного не-ДНК/РНК нуклеотидного основания является МеС.
Термин межнуклеозидная связывающая группа означает группу, способную образовывать ковалентные связи между двумя нуклеотидами, например между остатками ДНК, между остатками ДНК и нуклеотидными аналогами, между двумя не-^NΑ-остатками, между не-^NΑ-остатком и остатком ΕΝΆ и между двумя остатками ΕΝΆ и т.п. Предпочтительными примерами являются фосфатные, фосфодиэфирные и фосфортиоатные группы.
Межнуклеозидная связь может быть выбрана из группы, состоящей из -О-Р(О)2-О-, -О-Р(О,8)-О-, -О-Р(8Д-О-, -8-Р(О)2-О-, -8-Р(О,8)-О-, -8-Р(8Д-О-, -О-Р(ОД-8-, -О-Р(О,8)-8-, -8-Р(ОД-8-, -О-РО(Рн)-О-, О-РО(ОСН3)-О-, -О-РО(NΚН)-О-, -О-РО(ОС1 ЕСНХ-Ю-О-. -О-РО(ВН3)-О-, -О-РО(\Н1Г)-О-. -О-Р(О)2-№н-, -№н-Р(О)2-О-, -№н-СО-О-, -ΝΕ^ΕΌ-ΝΕ11-, и/или межнуклеозидная связь может быть выбрана из группы, состоящей из -О-СО-О-, -О-СО-ΝΡ-, -№н-СО-СН2-, -О-СН2-СО-№Н-, -О-СН2-СН2-МКН-, -СО-\Р-С1 Р-, -СН2-№н-СО-, -О-СН2-СН2-8-, -8-СН2-СН2-О-, -8-СН2-СН2-8-, -СН2-8О2-СН2-, -СН2-СО-Х1КН-, -О-СН2-СН2-Х1КН-СО-, -СН2^СН3-О-СН2-, где Р выбран из водорода и
- 16 015570
С1-4алкила. В некоторых вариантах изобретения могут оказаться предпочтительными межнуклеозидные связи, содержащие серу (8), как описано выше.
Термины соответствующий... и соответствует..., относящиеся к олигонуклеотидам, используются здесь для сравнения нуклеотидных последовательностей соединений согласно изобретению и их обратных комплементов или в одном из вариантов изобретения для сравнения нуклеотидных последовательностей и эквивалентных (идентичных) нуклеотидных последовательностей, которые могут, например, содержать другие нуклеотидные основания, но при этом сохранять ту же самую последовательность оснований или их комплементов. Нуклеотидные аналоги непосредственно сравнивают с их эквивалентными или соответствующими природными нуклеотидами. Последовательности, образующие обратный комплемент данной последовательности, называются здесь последовательностями, комплементарными данной последовательности.
Что касается длины описанной здесь нуклеотидной молекулы, то она соответствует числу мономерных остатков, т.е. нуклеотидных оснований, независимо от того, являются ли такие мономерные остатки нуклеотидами или нуклеотидными аналогами. Что касается нуклеотидных оснований, то термины мономер и остаток являются здесь взаимозаменяемыми.
Следует отметить, что если при определении конкретных величин или интервалов величин используется слово примерно, то при этом подразумевается, что данные величины включают конкретно указанную величину или указанный интервал величин.
Предпочтительными аналогами ДНК являются аналоги ДНК, в которых группа 2'-Н замещена группой, не являющейся -ОН (РНК), например группами -О-СН3, -О-СН2-СН2-О-СН3, -О-СН2-СН2-СН2-ЫН2, -О-СН2-СН2-СН2-ОН или -Р.
Предпочтительными аналогами РНК являются аналоги РНК, которые были модифицированы в их 2'-ОН-группе, например, путем замещения группой, не являющейся -Н (ДНК), например, группами -О-СН3, -О-СН2-СН2-О-СН3, -О-СН2-СН2-СН2^2, -О-СН2-СН2-СН2-ОН или -Р.
В одном из вариантов изобретения нуклеотидным аналогом является ΕΝΑ.
Используемые здесь термины структурная единица ΕΝΑ, мономер ΕΝΑ, остаток ΕΝΑ, структурная единица блокированной нуклеиновой кислоты, мономер блокированной нуклеиновой кислоты или остаток блокированной нуклеиновой кислоты означают бициклический нуклеозидный аналог.
Структурные единицы ΕΝΑ описаны пЯег аНа в заявках АО 99/14226, АО 00/56746, АО 00/56748, АО 01/25248, АО 02/28875, АО 03/006475 и АО 03/095467. Структурная единица ΕΝΑ может быть также определена по ее химической формуле. Так, например, используемая здесь структурная единица ΕΝΑ имеет химическую структуру, представленную на схеме 1.
Схема 1
ИЛИ
где X выбран из группы, состоящей из О, 8 и ΝΕ11, где КН представляет собой Н или С1-4алкил;
Υ представляет собой (-СН2)Г, где г представляет собой целое число 1-4; и
В представляет собой азотистое основание.
Если в соответствии с настоящим изобретением остаток ДНК заменен соответствующим остатком ΕΝΑ, то термин соответствующий остаток ΕΝΑ означает, что остаток ДНК был заменен остатком ΕΝΑ, содержащим такое же азотистое основание, как и замененный остаток ДНК, например остаток ΕΝΑ, соответствующий остатку ДНК, содержащему азотистое основание А, также содержит азотистое основание А. Исключением является тот случай, когда остаток ДНК содержит основание С, и в этом случае соответствующий остаток ΕΝΑ может содержать основание С или основание МеС, предпочтительно МеС.
Используемый здесь термин не-^NΑ-остаток означает нуклеозид, отличающийся от ΕΝΑ-остатка, т.е. термин не-1АЛ-остагок включает остаток ДНК, а также остаток РНК. Предпочтительным не-ΕΝΑостатком является остаток ДНК.
Используемые здесь термины структурная единица, остаток и мономер являются синонимами.
Используемый здесь термин конъюгат означает гетерогенную молекулу, образованную посредством ковалентного связывания описанного здесь олигонуклеотида с одной или несколькими ненуклеотидными или не-полинуклеотидными молекулами. Примерами не-нуклеотидных или неполинуклеотидных молекул являются макромолекулярные агенты, такие как белки, цепи жирных кислот, сахарные остатки, гликопротеины, полимеры или их комбинации. Типичными белками могут быть антитела для белка-мишени. Типичными полимерами могут быть полиэтиленгликоли.
Термин по меньшей мере один охватывает целое число, равное или превышающее 1, такое как 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 и т.д.
- 17 015570
При использовании терминов нуклеотид, агент, остаток ΕΝΆ и т.п. подразумевается, что указанные объекты могут быть в единственном или во множественном числе. В частности, выражение компонент (такой как нуклеотид, агент, остаток ΕΝΆ или т.п.), выбранный из группы, состоящей из ..., означает, что могут быть выбраны один или несколько из указанных компонентов. Так, например, выражения, подобные выражению компонент, выбранный из группы, состоящей из А, В и С, означают все комбинации А, В и С, т.е. А, В, С, А+В, А+С, В+С и А+В+С.
Термин остаток тио-ΕΝΆ означает остаток ΕΝΆ, в котором X на схеме 1 представляет собой 8. Остаток тио-ΕΝΆ может присутствовать в бета-И-форме и альфа-Ь-форме. Обычно предпочтительной является бета-И-форма остатка тио-ΕΝΑ. Бета-И-форма и альфа-Ь-форма остатка тио-ΕΝΑ представлены на схеме З как соединения ЗА и ЗВ соответственно.
Термин остаток амино-ΕΝΑ означает остаток ΕΝΑ, в котором X на схеме 1 представляет собой ΝΗ или ΝΚΗ, где К представляет собой водород или С1-4алкил. Остаток амино-ΕΝΑ может присутствовать в бета-И-форме и альфа-Ь-форме. Обычно предпочтительной является бета-И-форма остатка аминоΕΝΑ. Бета-И-форма и альфа-Ь-форма остатка амино-ЬХЛ представлены на схеме 4 как соединения 4А и 4В соответственно.
Термин остаток окси-^NΑ означает остаток Γ-ΝΑ, в котором X на схеме 1 представляет собой О. Остаток τηθ^ΝΑ может присутствовать в бета-И-форме и альфа-Ь-форме. Обычно предпочтительной является бета-И-форма остатка окси-^NΑ. Бета-И-форма и альфа-Ь-форма остатка окси-^NΑ представлены на схеме 5 как соединения 5А и 5В соответственно.
Используемый здесь термин С1-6алкил означает прямую или разветвленную насыщенную углеводородную цепь, где самые длинные цепи имеют от одного до шести атомов углерода, например метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, пентил, изопентил, неопентил и гексил. Разветвленная углеводородная цепь представляет собой С1-6алкил, замещенный у любого атома углерода углеводородной цепью.
Используемый здесь термин С1-4алкил означает прямую или разветвленную насыщенную углеводородную цепь, где самые длинные цепи имеют от одного до четырех атомов углерода, например метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, втор-бутил и трет-бутил. Разветвленная углеводородная цепь представляет собой С1-4алкил, замещенный у любого атома углерода углеводородной цепью.
Используемый здесь термин С1-6алкокси означает С1-6алкилокси, такой как метокси, этокси, н-пропокси, изопропокси, н-бутокси, изобутокси, втор-бутокси, трет-бутокси, пентокси, изопентокси, неопентокси и гексокси.
Используемый здесь термин С2-6алкенил означает прямую или разветвленную углеводородную группу, имеющую от двух до шести атомов углерода и содержащую одну или несколько двойных связей. Репрезентативными примерами С2-6алкенильных групп являются аллил, гомоаллил, винил, кротил, бутенил, бутадиенил, пентенил, пентадиенил, гексенил и гексидиенил. Положением ненасыщенной связи (двойной связи) может быть любое положение в углеродной цепи.
Используемый здесь термин С2-6алкинил означает прямую или разветвленную углеводородную группу, имеющую от двух до шести атомов углерода и содержащую одну или несколько тройных связей. Репрезентативными примерами С2-6алкинильных групп являются ацетилен, пропинил, бутинил, пентинил и гексинил. Положением ненасыщенной связи (тройной связи) может быть любое положение в углеродной цепи. Более чем одна связь может быть ненасыщенной, а поэтому С2-6алкинил представляет собой диин или ендиин, известные специалистам.
Используемый здесь термин гибридизация означает водородные связи, которыми могут быть водородные связи Уотсона-Крика, Хугстена, реверсивные водородные связи Хугстена и т.п. между комплементарными нуклеозидными или нуклеотидными основаниями. Четырьмя нуклеотидными основаниями, обычно присутствующими в ДНК, являются С, А, Т и С, из которых С спаривается с С, а А спаривается с Т. В РНК Т заменен урацилом (И), который спаривается с А. Химические группы в нуклеотидных основаниях, которые участвуют в образовании стандартного дуплекса, составляют основания Уотсона-Крика. За последние два года Хугстеном было показано, что пуриновые нуклеотидные основания (С и А), помимо оснований Уотсона-Крика, включают основания Хугстена, которые могут распознаваться с внешней стороны дуплекса и используются для связывания с пиримидиновыми олигонуклеотидами посредством водородных связей, образуя, тем самым, тройную спиральную структуру.
В контексте настоящего изобретения термин комплементарный относится к способности двух нуклеотидных последовательностей точно спариваться друг с другом. Так, например, если нуклеотид в определенном положении олигонуклеотида способен образовывать водородную связь с нуклеотидом в соответствующем положении молекулы ДНК или РНК, то считается, что такой олигонуклеотид и ДНК или РНК являются комплементарными друг другу в этом положении. Считается, что цепи ДНК или РНК комплементарны друг другу в том случае, если достаточное число нуклеотидов в олигонуклеотиде могут образовывать водородные связи с соответствующими нуклеотидами в ДНК- или РНК-мишени и тем самым образовывать стабильный комплекс. При этом для сообщения стабильности последовательности олигонуклеотидов ίη νίΐτο или ίη νΐνο эти последовательности необязательно должны быть на 100% комплементарны их микроРНК-мишеням. Так, например, термины комплементарный и специфически
- 18 015570 гибридизующийся означают, что олигонуклеотид достаточно сильно и специфически связывается с молекулой-мишенью, что обеспечивает необходимое подавление нормальной функции мишени, но при этом функция РНК, не являющаяся мишенью, остается неизменной.
В предпочтительном примере олигонуклеотид согласно изобретению на 100% комплементарен человеческой последовательности микроРНК, такой как одна из описанных здесь последовательностей микроРНК.
В предпочтительном примере олигонуклеотид согласно изобретению содержит непрерывную последовательность, которая на 100% комплементарна уникальной области человеческой последовательности микроРНК.
МикроРНК представляют собой короткие некодирующие РНК, происходящие от эндогенных генов, действующих как посттранскрипционные регуляторы экспрессии генов. Они процессируются из более длинных (примерно 70-80 нуклеотидов) шпилькоподобных предшественников, называемых пре-миРНК, под действием фермента РНКазы III Икег. МикроРНК образуют рибонуклеопротеиновые комплексы, называемые миРНП, и распознают их сайты-мишени благодаря антисмысловой комплементарности, опосредуя, тем самым, ингибирование их генов-мишеней. Почти полная или полная комплементарность между миРНК и ее сайтом-мишенью приводит к расщеплению мРНК-мишени, тогда как ограниченная комплементарность между микроРНК и сайтом-мишенью приводит к ингибированию трансляции генамишени.
В контексте настоящего изобретения термин микроРНК или миРНК означает олигонуклеотид РНК, состоящий из 18-25 нуклеотидов. По своим функциям миРНК представляют собой типичные регуляторные эндогенные молекулы РНК.
Термины целевая микроРНК, или целевая миРНК, или миРНК-мишень означают микроРНК, которая играет определенную биологическую роль в развитии заболевания у человека, например миРНК может стимулировать онкогенез или подавлять развитие опухоли при раке, а поэтому она является мишенью для терапевтического воздействие на рассматриваемое заболевание.
Термины ген-мишень или мРНК-мишень означают регуляторные мРНК-мишени для микроРНК, где указанный ген-мишень или мРНК-мишень подвергаются посттранскрипционной регуляции под действием микроРНК, что обусловлено полной или почти полной комплементарностью между миРНК и ее сайтом-мишенью и приводит к расщеплению мРНК-мишени; либо ограниченной комплементарностью, часто определяемой как комплементарность между так называемой уникальной последовательностью (нуклеотидами 2-7 миРНК) и сайтом-мишенью, которая приводит к ингибированию трансляции мРНК-мишени.
В контексте настоящего изобретения олигонуклеотид согласно изобретению является одноцепочечным, а это означает, что олигонуклеотид не имеет комплементарного олигонуклеотида, т. е. он не может быть двухцепочечным олигонуклеотидным комплексом, таким как киРНК. В одном из вариантов изобретения композиция согласно изобретению не содержит другого олигонуклеотида, который имеет область, комплементарную одноцепочечному олигонуклеотиду из пяти или более смежных нуклеотидных оснований, например из восьми или более, или из 12 или более смежных нуклеотидных оснований. Считается, что такой другой олигонуклеотид не связан ковалентной связью с одноцепочечным олигонуклеотидом.
ΕΝΆ-содержащие олигонуклеотиды согласно изобретению.
Хотя ΕΝΆ-остатки и не-^NА-остатки могут быть объединены различными методами с образованием олигонуклеотидов, однако авторами настоящего изобретения было неожиданно обнаружено, что присутствие определенной коровой последовательности ДНК и присутствие определенных остатков ΕΝΆ в указанной последовательности ДНК приводят к особенно сильному ингибированию микроРНК. Такое присутствие остатков ΕΝΆ в указанной коровой последовательности олигонуклеотидов согласно изобретению сообщает указанным олигонуклеотидам высокий уровень резистентности к нуклеазе.
Нуклеотидами, расположенными за пределами коровой последовательности, могут быть ΕΝΆ-остатки и/или не-^NА-остатки. В одном из вариантов изобретения не-^NА-остатками, расположенными за пределами коровой последовательности, являются остатки ДНК.
Коровая последовательность.
Для более эффективного, по возможности, ингибирования микроРНК-мишеней антисмысловыми олигонуклеотидами согласно изобретению необходима определенная степень комплементарности между антисмысловым олигонуклеотидом согласно изобретению и соответствующей микроРНК-мишенью.
При этом особенно важно, чтобы олигонуклеотиды согласно изобретению были комплементарны соответствующей микроРНК-мишени в положениях 3-8 от 5'-конца. В некоторых микроРНК-мишениях нуклеотид 1, если считать от 5'-конца, представляет собой неспаривающееся основание, которое, по все вероятности, скрыто в связывающем кармане белка Адо 2. В соответствии с этим олигонуклеотид согласно изобретению может иметь, а может и не иметь нуклеотид в положении 1 от 3'-конца, соответствующий нуклеотиду 1 от 5'-конца соответствующей микроРНК-мишени. В некоторых случаях, первые два нуклеотида от 5'-конца соответствующей микроРНК-мишени могут оставаться неспаренными.
- 19 015570
Поэтому коровой последовательностью олигонуклеотидов согласно изобретению является последовательность ДНК в 1-6-положениях, 2-7-положениях или 3-8-положениях, если считать от 3'-конца, соответствующая 3-8-положениям, если считать от 5'-конца, соответствующей микроРНК-мишени.
т1К-19Ь.
Одна из конкретных микроРНК-мишеней обозначена т1К-19Ь. Последовательность т1К-19Ь в 3-8положениях, если считать от 5'-конца, представляет собой идсааа (см. ОепВапк Α1421740 и Α1421739). Соответствующая ДНК-последовательность представляет собой асд!!!. Кроме того, авторами настоящего изобретения было обнаружено, что для максимального ингибирования микроРНК-мишеней олигонуклеотиды согласно изобретению должны содержать в своей коровой последовательности по меньшей мере один остаток ΕΝΑ.
В соответствии с этим в своем первом аспекте настоящее изобретение относится к олигонуклеотиду согласно изобретению, такому как олигонуклеотид длиной 12-26 нуклеотидов, в котором в положениях 1-6, 2-7 или 3-8, а предпочтительно в положениях 2-7 или 3-8, считая от 3'-конца, имеется следующая последовательность ДНК:
асдЕЕЕ (5Е<2 Ю N0 6) где по меньшей мере один, например один, а предпочтительно по меньшей мере два, например два или три, остатка ДНК в указанной последовательности были заменены соответствующим остатком ΕΝΑ.
Комплементарность с другими нуклеотидами микроРНК-мишени может повышать уровень ингибирования указанной микро-РНК-мишени. Поэтому в одном из вариантов изобретения описанный выше олигонуклеотид в положениях 1-7, 2-8 или 3-9, а предпочтительно в положениях 2-8 или 3-9, считая от 3'-конца, имеет следующую последовательность ДНК:
асдОАа (ЗЕ<2 Ю N0 70) где по меньшей мере один, например один, а предпочтительно по меньшей мере два, например два, а более предпочтительно по меньшей мере три, например три или четыре, остатка ДНК в указанной последовательности были заменены соответствующим остатком ΕΝΑ.
В другом варианте изобретения олигонуклеотид согласно изобретению в положениях 1-8, 2-9 или 310, а предпочтительно в положениях 2-9 или 3-10, считая от 3'-конца, имеет следующую последовательность ДНК:
асдЕЕСад (8Е<2 Ю ΝΟ 71) где по меньшей мере один, например один, а предпочтительно по меньшей мере два, например два, а более предпочтительно по меньшей мере три, например три или четыре, остатка ДНК в указанной последовательности были заменены соответствующим остатком ΕΝΑ.
В еще одном варианте изобретения олигонуклеотид согласно изобретению в положениях 1-9, 2-10 или 3-11, а предпочтительно в положениях 2-10 или 3-11, считая от 3'-конца, имеет следующую последовательность ДНК:
асдЕЕГадд (3Εζ) Ю N0 72) где по меньшей мере один, например один, а предпочтительно по меньшей мере два, например два, а более предпочтительно по меньшей мере три, например три, а еще более предпочтительно по меньшей мере четыре, например четыре или пять, остатков ДНК в указанной последовательности были заменены соответствующим остатком ΕΝΑ.
т1К- 122а.
Другой представляющей интерес микроРНК-мишенью является т1К-122а. Последовательность т1К-122а в положениях 3-8, считая от 5'-конца, представляет собой дадиди (см. ттКВазе, имя файла НΟNС:ΜIΚN122Α). Соответствующая последовательность ДНК представляет собой с!саса.
В соответствии с этим во втором своем аспекте настоящее изобретение относится к олигонуклеотиду согласно изобретению, такому как олигонуклеотид длиной 12-26 нуклеотидов, имеющий в положениях 1-6, 2-7 или 3-8, а предпочтительно в положениях 2-7 или 3-8, считая от 3'-конца, следующую последовательность ДНК:
сЕсаса (ЗЕО 10 N0 7) где по меньшей мере один, например один, а предпочтительно по меньшей мере два, например два или три, остатка ДНК в указанной последовательности были заменены соответствующим остатком ΕΝΑ.
В одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к олигонуклеотиду-антагонисту т1К-122а, который в положениях 1-7, 2-8 или 3-9, а предпочтительно в положениях 2-8 или 3-9, считая от 3'-конца, имеет следующую последовательность ДНК:
сЕсасас (ЗЕО Ю N0 73) где по меньшей мере один, например один, а предпочтительно по меньшей мере два, например два, а более предпочтительно по меньшей мере три, например три или четыре, остатка ДНК в указанной последовательности были заменены соответствующим остатком ΕΝΑ.
- 20 015570
В другом варианте изобретения олигонуклеотид согласно изобретению в положениях 1-8, 2-9 или 310, а предпочтительно в положениях 2-9 или 3-10, считая от 3'-конца, имеет следующую последовательность ДНК:
сТсасасЕ (ЗЕ<2 ГО N0 74) где по меньшей мере один, например один, а предпочтительно по меньшей мере два, например два, а более предпочтительно по меньшей мере три, например три или четыре, остатка ДНК в указанной последовательности были заменены соответствующим остатком ΕΝΑ.
В еще одном варианте изобретения олигонуклеотид согласно изобретению в положениях 1-9, 2-10 или 3-11, а предпочтительно в положениях 2-10 или 3-11, считая от 3'-конца, имеет следующую последовательность ДНК:
сЬсасасЕд (ЗЕ<2 ГО ΝΟ 75) где по меньшей мере один, например один, а предпочтительно по меньшей мере два, например два, а более предпочтительно по меньшей мере три, например три, а еще более предпочтительно по меньшей мере четыре, например четыре или пять, остатков ДНК в указанной последовательности были заменены соответствующим остатком ΕΝΑ.
т1К-155.
Другой представляющей интерес микроРНК-мишенью является т1К-155. Последовательность т1К155 в положениях 3-8, считая от 5'-конца, представляет собой ааидси (см. тЖВаке, имя файла НСNС:МIΚN155). Соответствующая последовательность ДНК представляет собой !!асда.
В соответствии с этим в своем третьем аспекте настоящее изобретение относится к олигонуклеотиду согласно изобретению, такому как олигонуклеотид длиной 12-26 нуклеотидов, имеющий в положениях 1-6, 2-7 или 3-8, а предпочтительно в положениях 2-7 или 3-8, считая от 3'-конца, следующую последовательность ДНК:
ЕЕасда (5Е<2 ГО N0 8) где по меньшей мере один, например один, а предпочтительно по меньшей мере два, например два или три, остатка ДНК в указанной последовательности были заменены соответствующим остатком ΕΝΑ.
В одном из вариантов изобретения олигонуклеотид против т1К-155 в положениях 1-7, 2-8 или 3-9, а предпочтительно в положениях 2-8 или 3-9, считая от 3'-конца, имеет следующую последовательность ДНК:
еЬасдаЕ (ЗЕ<2 ГО ΝΟ 76) где по меньшей мере один, например один, а предпочтительно по меньшей мере два, например два, а более предпочтительно по меньшей мере три, например три или четыре, остатка ДНК в указанной последовательности были заменены соответствующим остатком ΕΝΑ.
В другом варианте изобретения олигонуклеотид согласно изобретению в положениях 1-8, 2-9 или 310, а предпочтительно в положениях 2-9 или 3-10, считая от 3'-конца, имеет следующую последовательность ДНК:
ЕЕасдаЕЬ (ЗЕ<2 ГО ΝΟ 77) где по меньшей мере один, например один, а предпочтительно по меньшей мере два, например два, а более предпочтительно по меньшей мере три, например три или четыре, остатка ДНК в указанной последовательности были заменены соответствующим остатком ΕΝΑ.
В еще одном варианте изобретения олигонуклеотид согласно изобретению в положениях 1-9, 2-10 или 3-11, а предпочтительно в положениях 2-10 или 3-11, считая от 3'-конца, имеет следующую последовательность ДНК:
Е'Ьасда'Ь'Ьа (ЗЕ<2 10 N0 78) где по меньшей мере один, например один, а предпочтительно по меньшей мере два, например два, а более предпочтительно по меньшей мере три, например три, а еще более предпочтительно по меньшей мере четыре, например четыре или пять, остатков ДНК в указанной последовательности были заменены соответствующим остатком ΕΝΑ.
т1К-375.
Другой представляющей интерес микроРНК-мишенью является т1К-375. Последовательность т1К-375 в положениях 3-8, считая от 5'-конца, представляет собой идиисд (см. тЖВаке, имя файла НСNС:МIΚN375). Соответствующая последовательность ДНК представляет собой асаадс.
В соответствии с этим в своем четвертом аспекте настоящее изобретение относится к олигонуклеотиду согласно изобретению, такому как олигонуклеотид длиной 12-26 нуклеотидов, имеющий в положениях 1-6, 2-7 или 3-8, а предпочтительно в положениях 2-7 или 3-8, считая от 3'-конца, следующую последовательность ДНК:
асаадс (5Е<2 ГО N0 9) где по меньшей мере один, например один, а предпочтительно по меньшей мере два, например два или три, остатка ДНК в указанной последовательности были заменены соответствующим остатком ΕΝΑ.
- 21 015570
В одном из вариантов изобретения описанный выше олигонуклеотид против т1К-375 в положениях 1-7, 2-8 или 3-9, а предпочтительно в положениях 2-8 или 3-9, считая от 3'-конца, имеет следующую последовательность ДНК:
асаадса (5Е<2 Ю N0 79) где по меньшей мере один, например один, а предпочтительно по меньшей мере два, например два, а более предпочтительно по меньшей мере три, например три или четыре, остатка ДНК в указанной последовательности были заменены соответствующим остатком ΕΝΑ.
В другом варианте изобретения олигонуклеотид согласно изобретению в положениях 1-8, 2-9 или 3-10, а предпочтительно в положениях 2-9 или 3-10, считая от 3'-конца, имеет следующую последовательность ДНК:
асаадсаа (5Εζ) Ю ΝΟ ЕЮ) где по меньшей мере один, например один, а предпочтительно по меньшей мере два, например два, а более предпочтительно по меньшей мере три, например три или четыре, остатка ДНК в указанной последовательности были заменены соответствующим остатком ΕΝΑ.
В еще одном варианте изобретения олигонуклеотид согласно изобретению в положениях 1-9, 2-10 или 3-11, а предпочтительно в положениях 2-10 или 3-11, считая от 3'-конца, имеет следующую последовательность ДНК:
асаадсаад (5Εζ) Ιϋ ΝΟ 81) где по меньшей мере один, например один, а предпочтительно по меньшей мере два, например два, а более предпочтительно по меньшей мере три, например три, а еще более предпочтительно по меньшей мере четыре, например четыре или пять, остатков ДНК в указанной последовательности были заменены соответствующим остатком ΕΝΑ.
Модификация нуклеотидов в коровой последовательности.
Как упоминалось выше, в коровой последовательности олигонуклеотидов согласно изобретению по меньшей мере один, например один, а предпочтительно по меньшей мере два, например два или три, остатка ДНК в указанной последовательности были заменены соответствующим остатком ΕΝΑ. Авторами настоящего изобретения было также обнаружено, что ингибирование микроРНК-мишеней может быть еще более усилено, если два остатка ΕΝΑ в указанной коровой последовательности будут разделены по меньшей мере одним остатком ДНК.
В соответствии с этим в одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к вышеописанному олигонуклеотиду, в котором по меньшей мере два, например два или три, остатка ДНК в положениях 1-6, 2-7 или 3-8, а предпочтительно в положениях 2-7 или 3-8, считая от 3'-конца, были заменены соответствующим остатком ΕΝΑ и в котором остатки ΕΝΑ разделены по меньшей мере одним остатком ДНК.
Авторами настоящего изобретения было также обнаружено, что ингибирование микроРНКмишеней может быть еще более усилено, если два остатка ΕΝΑ в указанной коровой последовательности будут разделены максимум двумя остатками ДНК. В соответствии с этим в одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к вышеописанному олигонуклеотиду, в котором число смежных остатков ДНК в положениях 1-6, 2-7 или 3-8, а предпочтительно в положениях 2-7 или 3-8, считая от 3'-конца, составляет максимум два.
Указанные данные относятся к коровой последовательности рег зе, т.е. они относятся к положениям олигонуклеотидов согласно изобретению, соответствующих коровой последовательности. Следовательно, в другом своем варианте настоящее изобретение относится к описанному выше олигонуклеотиду, где по меньшей мере два, например два, три или четыре, остатка ДНК в положениях 1-7, 2-8 или 3-9, а предпочтительно в положениях 2-8 или 3-9 от 3'-конца были заменены соответствующим остатком ΕΝΑ и где остатки ΕΝΑ разделены по меньшей мере одним остатком ДНК. В другом своем варианте, настоящее изобретение относится к описанному выше олигонуклеотиду, где число смежных остатков ДНК в положениях 1-7, 2-8 или 3-9, а предпочтительно в положениях 2-8 или 3-9 от 3'-конца составляет максимум два.
В еще одном своем варианте настоящее изобретение относится к вышеописанному олигонуклеотиду, где по меньшей мере два, например два, три или четыре, остатка ДНК в положениях 1-8, 2-9 или 3-10, предпочтительно в положениях 2-9 или 3-10 от 3'-конца были заменены соответствующим остатком ΕΝΑ и где остатки ΕΝΑ разделены по меньшей мере одним остатком ДНК. В другом своем варианте настоящее изобретение относится к описанному выше олигонуклеотиду, где число смежных остатков ДНК в положениях 1-8, 2-9 или 3-10, а предпочтительно в положениях 2-9 или 3-10, считая от 3'-конца, составляет максимум два.
- 22 015570
В еще одном своем варианте настоящее изобретение относится к вышеописанному олигонуклеотиду, где по меньшей мере два, например два, три, четыре или пять, остатков ДНК в положениях 1-9, 2-10 или 3-11, а предпочтительно в положениях 2-10 или 3-11, считая от 3'-конца, были заменены соответствующим остатком ^NΑ и где остатки ^NΑ разделены по меньшей мере одним остатком ДНК. В другом своем варианте настоящее изобретение относится к описанному выше олигонуклеотиду, где число смежных остатков ДНК в положениях 1-9, 2-10 или 3-11, а предпочтительно в положениях 2-10 или 3-11, считая от 3'-конца, составляет максимум два.
Модификация нуклеотидов, расположенных за пределами коровой последовательности.
Как упоминалось выше, нуклеотидами, находящимися за пределами коровой последовательности, могут быть остатки ^NΑ и/или не-^NΑ-остатки. В одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к описанному выше олигонуклеотиду, где число остатков ^NΑ, находящихся за пределами коровой последовательности, составляет по меньшей мере один, например один, два, три или четыре и где указанные остатки ^NΑ разделены по меньшей мере одним не-^NΑ-остатком. В другом варианте изобретения замену за пределами коровой последовательности осуществляют таким образом, чтобы число смежных не-^NΑ-остатков, находящихся за пределами коровой последовательности, составляло максимум два.
Модификация нуклеотидов в положениях 3-8 от 3'-конца.
В нижеследующих вариантах, которые относятся к модификации нуклеотидов в положениях 3-8 от 3'-конца, остатки ^NΑ могут быть заменены другими нуклеотидными аналогами, такими как аналоги, описанные в настоящем изобретении. Поэтому X может быть выбран из группы, состоящей из 2'-О-алкил-РНК-остатка, 2'ОМе-РНК-остатка, 2'-амино-ДНК-остатка, 2'-фтор-ДНК-остатка, ^NΑ-остатка, ΡNΑ-остатка, ΗNΑ-остатка, ШЛ-остатка. х предпочтительно обозначает ДНК или РНК, наиболее предпочтительно ДНК.
В представляющем интерес варианте изобретения олигонуклеотиды согласно изобретению модифицированы в положениях 3-8 от 3'-конца. Конструкция этой последовательности может определяться числом не-^NΑ-остатков или числом ^NΑ-остатков, присутствующих в данной последовательности. В предпочтительном варианте первого аспекта по меньшей мере один, например один, нуклеотид в положениях 3-9 от 3'-конца представляет собой не-^NΑ-остаток. В другом варианте изобретения по меньшей мере два, например два, нуклеотида в положениях 3-8 от 3'-конца представляют собой не-^NΑ-остатки. В еще одном варианте изобретения по меньшей мере три, например три, нуклеотида в положениях 3-8 от 3'-конца представляют собой не-^NΑ-остатки. В еще одном варианте изобретения по меньшей мере четыре, например четыре, нуклеотида в положениях 3-8 от 3'-конца представляют собой не-^NΑ-остатки. В другом варианте изобретения по меньшей мере пять, например пять, нуклеотидов в положениях 3-8 от 3'конца представляют собой не-^NΑ-остатки. В еще одном варианте изобретения все шесть нуклеотидов в положениях 3-8 от 3'-конца представляют собой не-^NΑ-остатки. В предпочтительном варианте изобретения указанным не-^NΑ-остатком является остаток ДНК.
Альтернативно, в своем предпочтительном варианте настоящее изобретение относится к олигонуклеотиду согласно изобретению, содержащему по меньшей мере один остаток ^NΑ в положениях 3-8 от 3'-конца. В одном из вариантов изобретения олигонуклеотид согласно изобретению содержит один остаток ^NΑ в положениях 3-8 от 3'-конца. Тип замены нуклеотидов в положениях 3-8 от 3'-конца может быть выбран из группы, состоящей из Хххххх, хХхххх, ххХххх, хххХхх, ххххХх и хххххХ, где X означает остаток ^NΑ, а х означает не-^NΑ-остаток.
В другом варианте изобретения олигонуклеотид согласно изобретению содержит по меньшей мере два остатка ^NΑ в положениях 3-8 от 3'-конца. В одном из вариантов изобретения олигонуклеотид согласно изобретению содержит два остатка ^NΑ в положениях 3-8 от 3'-конца. Тип замены нуклеотидов в положениях 3-8 от 3'-конца может быть выбран из группы, состоящей из ХХхххх, ХхХххх, ХххХхх, ХхххХх, ХххххХ, хХХххх, хХхХхх, хХххХх, хХхххХ, ххХХхх, ххХхХх, ххХххХ, хххХХх, хххХхХ и ххххХХ, где X означает остаток ^NΑ, а х означает не-^NΑ-остаток. В предпочтительном варианте изобретения тип замены нуклеотидов в положениях 3-8 от 3'-конца может быть выбран из группы, состоящей из ХхХххх, ХххХхх, ХхххХх, ХххххХ, хХхХхх, хХххХх, хХхххХ, ххХхХх, ххХххХ и хххХхХ, где X означает остаток ^NΑ, а х означает не-^NΑ-остаток. В более предпочтительном варианте изобретения тип замены нуклеотидов в положениях 3-8 от 3'-конца может быть выбран из группы, состоящей из хХхХхх, хХххХх, хХхххХ, ххХхХх, ххХххХ и хххХхХ, где X означает остаток ^NΑ, а х означает не-^NΑ-остаток. В еще более предпочтительном варианте изобретения тип замены нуклеотидов в положениях 3-8 от 3'-конца может быть выбран из группы, состоящей из хХхХхх, хХххХх и ххХхХх, где X означает остаток ^NΑ, а х означает не-^NΑ-остаток. В наиболее предпочтительном варианте изобретения тип замены нуклеотидов в положениях 3-8 от 3'-конца представляет собой хХхХхх, где X означает остаток ^NΑ, а х означает не-^NΑ-остаток.
В другом варианте изобретения олигонуклеотид согласно изобретению содержит по меньшей мере три остатка ^NΑ в положениях 3-8 от 3'-конца. В одном из вариантов изобретения олигонуклеотид согласно изобретению содержит три остатка ^NΑ в положениях 3-8 от 3'-конца. Тип замены нуклеотидов в положениях 3-8 от 3'-конца может быть выбран из группы, состоящей из ХХХххх, хХХХхх, ххХХХх,
- 23 015570 хххХХХ, ХХхХхх, ХХххХх, ХХхххХ, хХХхХх, хХХххХ, ххХХхХ, ХхХХхх, ХххХХх, ХхххХХ, хХхХХх, хХххХХ, ххХхХХ, хХхХхХ и ХхХхХх, где X означает остаток ΕΝΑ, а х означает не-ΕΝΑостаток. В предпочтительном варианте изобретения тип замены нуклеотидов в положениях 3-8 от 3'конца может быть выбран из группы, состоящей из ХХхХхх, ХХххХх, ХХхххХ, хХХхХх, хХХххХ, ххХХхХ, ХхХХхх, ХххХХх, ХхххХХ, хХхХХх, хХххХХ, ххХхХХ, хХхХхХ и ХхХхХх, где ''Х означает остаток ΕΝΑ, а х означает не-ЕНЛ-остаток. В более предпочтительном варианте изобретения тип замены нуклеотидов в положениях 3-8 от 3'-конца выбран из группы, состоящей из хХХхХх, хХХххХ, ххХХхХ, хХхХХх, хХххХХ, ххХхХХ и хХхХхХ, где X означает остаток ΕΝΑ, а х означает не-ΕΝΑостаток. В еще более предпочтительном варианте изобретения тип замены нуклеотидов в положениях 3-8 от 3'-конца представляет собой хХхХхХ или ХхХхХх, где X обозначает остаток ΕΝΑ, а х обозначает не-^NΑ-остаток. В наиболее предпочтительном варианте изобретения, тип замены нуклеотидов в положениях 3-8 от 3'-конца представляет собой хХхХхХ, где X означает остаток ΕΝΑ, а х означает не-^NΑ-остаток.
В другом варианте изобретения олигонуклеотид согласно изобретению содержит по меньшей мере четыре остатка ΕΝΑ в положениях 3-8 от 3'-конца. В одном из вариантов изобретения олигонуклеотид согласно изобретению содержит четыре остатка ΕΝΑ в положениях 3-8 от 3'-конца. Тип замены нуклеотидов в положениях 3-8 от 3'-конца может быть выбран из группы, состоящей из ххХХХХ, хХхХХХ, хХХхХХ, хХХХхХ, хХХХХх, ХххХХХ, ХхХхХХ, ХхХХхХ, ХхХХХх, ХХххХХ, ХХхХхХ, ХХхХХх, ХХХххХ, ХХХхХх и ХХХХхх, где X означает остаток ΕΝΑ, а х означает не-^NΑ-остаток.
В другом варианте изобретения олигонуклеотид согласно изобретению содержит по меньшей мере пять остатков ΕΝΑ в положениях 3-8 от 3'-конца. В одном из вариантов изобретения олигонуклеотид согласно изобретению содержит пять остатков ΕΝΑ в положениях 3-8 от 3'-конца. Тип замены нуклеотидов в положениях 3-8 от 3'-конца может быть выбран из группы, состоящей из хХХХХХ, ХхХХХХ, ХХхХХХ, ХХХхХХ, ХХХХхХ и ХХХХХх, где X означает остаток ΕΝΑ, а х означает не-ΕΝΑостаток.
При этом предпочтительно, чтобы олигонуклеотид согласно изобретению содержал один или два остатка ΕΝΑ в положениях 3-8 от 3'-конца. Такая конструкция рассматривается как предпочтительная с точки зрения стабильности А-спирали, образованной дуплексом олигонуклеотид:микроРНК, т.е. дуплексом, который по своей структуре напоминает дуплекс РНК: РНК.
В предпочтительном варианте изобретения указанным не-^NΑ-остатком является остаток ДНК. Изменение длин олигонуклеотидов.
Длина олигонуклеотидов согласно изобретению необязательно должна точно соответствовать длине микроРНК-мишеней. Фактически, предпочтительнее использовать короткие олигонуклеотиды, такие как олигонуклеотиды длиной 10-17 или 10-16 нуклеотидов.
В одном из вариантов изобретения олигонуклеотид согласно изобретению имеет длину 8-24 нуклеотида, например 10-24 нуклеотида, 12-24 нуклеотида, а именно 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов, предпочтительно 10-22, например 12-22 нуклеотида, а именно 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или 22 нуклеотида, более предпочтительно 10-20, например 12-20 нуклеотидов, а именно 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 нуклеотидов, еще более предпочтительно 10-19, например 12-19 нуклеотидов, а именно 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 или 19 нуклеотидов, например 10-18, а именно 12-18 нуклеотидов, например 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 или 18 нуклеотидов, более предпочтительно 10-17, например 12-17 нуклеотидов, а именно 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или 17 нуклеотидов, а наиболее предпочтительно 10-16, например 12-16 нуклеотидов, а именно 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 нуклеотидов.
Модификация нуклеотидов от положения 11 в направлении от 3'-конца до 5'-конца.
Тип замены нуклеотидов от положения 11 в направлении от 3'-конца до 5'-конца может включать, а может и не включать остатки нуклеотидных аналогов (такие как ΕΝΑ). В предпочтительном варианте изобретения олигонуклеотид согласно изобретению содержит по меньшей мере один остаток нуклеотидного аналога (такого как ΕΝΑ), например один остаток нуклеотидного аналога от положения 11 в направлении от 3'-конца до 5'-конца. В другом предпочтительном варианте изобретения олигонуклеотид согласно изобретению содержит по меньшей мере два остатка нуклеотидного аналога, такого как ΕΝΑ, например два остатка нуклеотидного аналога от положения 11 до 5'-конца в направлении от 3'-5'.
В нижеследующих вариантах, которые относятся к модификации нуклеотидов от положения 11 до 5'-конца данного олигонуклеотида, остатки ΕΝΑ могут быть заменены другими нуклеотидными аналогами, такими как аналоги, описанные в настоящем изобретении. Поэтому X может быть выбран из группы, состоящей из 2'-О-алкил-РНК-остатка, 2'ОМе-РНК-остатка, 2'-амино-ДНК-остатка, 2'-фторДНК-остатка, ΕΝΑ-остатка, ΡΝΑ-остатка, ΗΝΑ-остатка, ΙΝΑ-остатка, х предпочтительно, обозначает ДНК или РНК, а наиболее предпочтительно ДНК.
- 24 015570
В одном из вариантов изобретения олигонуклеотид согласно изобретению имеет нижеследующий тип замены, который повторяется от нуклеотида 11 до 5'-конца в направлении от 3'-5': хХхХ или ХхХх, где X означает остаток ΕΝΑ, а х означает не-Е-НЛ-остаток. В другом варианте изобретения олигонуклеотид согласно изобретению имеет нижеследующий тип замены, который повторяется от нуклеотида 11 до 5'-конца в направлении от 3'-5': ХххХхх, хХххХх или ххХххХ, где X означает остаток ΕΝΑ, а х означает не-^NΑ-остаток. В еще одном варианте изобретения олигонуклеотид согласно изобретению имеет нижеследующий тип замены, который повторяется от нуклеотида 11 до 5'-конца в направлении от 3'-5': ХхххХххх, хХхххХхх, ххХхххХх или хххХхххХ, где X означает остаток ΕΝΑ, а х означает неΕΝΑ-остаток.
Характер специфической замены для нуклеотидов от положения 11 до 5'-конца в направлении от 3'-5' зависит от числа нуклеотидов в олигонуклеотидах согласно изобретению. В предпочтительном варианте изобретения олигонуклеотид согласно изобретению содержит 12 нуклеотидов, и такую замену для положений 11-12 от 3'-конца выбирают из группы, состоящей из хХ и Хх, где X означает остаток ΕΝΑ, а х означает не-^NΑ-остаток. В более предпочтительном варианте изобретения замена в положениях 11-12 от 3'-конца имеет характер хХ, где X означает остаток ΕΝΑ, а х означает не-^NΑ-остаток. Альтернативно, остатки ΕΝΑ отсутствуют в положениях 11-12 от 3'-конца, т.е. замена имеет характер хх.
В другом предпочтительном варианте изобретения олигонуклеотид согласно изобретению содержит 13 нуклеотидов, и замену для положений 11-13 от 3'-конца выбирают из группы, состоящей из Ххх, хХх, ххХ, ХХх, ХхХ, хХХ и XXX, где X означает остаток ΕΝΑ, а х означает не-^NΑ-остаток. В более предпочтительном варианте изобретения замена в положениях 11-13 от 3'-конца выбрана из группы, состоящей из хХх, ххХ и хХХ, где X означает остаток ΕΝΑ, а х означает не-^NΑ-остаток. В более предпочтительном варианте изобретения замена в положениях 11-13 от 3'-конца имеет характер ххХ, где X означает остаток ΕΝΑ, а х означает не-^NΑ-остаток. Альтернативно, остатки ΕΝΑ отсутствуют в положениях 11-12 от 3'-конца, т.е. замена имеет характер ххх.
В другом предпочтительном варианте изобретения олигонуклеотид согласно изобретению содержит 14 нуклеотидов, и замену для положений 11-14 от 3'-конца выбирают из группы, состоящей из Хххх, хХхх, ххХх, хххХ, ХХхх, ХхХх, ХххХ, хХХх, хХхХ и ххХХ, где X означает остаток ΕΝΑ, а х означает не-^NΑ-остаток. В предпочтительном варианте изобретения замена в положениях 11-14 от 3'-конца выбрана из группы, состоящей из хХхх, ххХх, хххХ, хХхХ и ххХХ, где X означает остаток ΕΝΑ, а х означает не-^NΑ-остаток. В более предпочтительном варианте изобретения замена в положениях 11-14 от 3'-конца имеет характер хХхХ, где X означает остаток ΕΝΑ, а х означает не-^NΑ-остаток. Альтернативно, остатки ΕΝΑ отсутствуют в положениях 11-14 от 3'-конца, т.е. замена имеет характер хххх.
В другом предпочтительном варианте изобретения олигонуклеотид согласно изобретению содержит 15 нуклеотидов, и такую замену для положений 11-15 от 3'-конца выбирают из группы, состоящей из Ххххх, хХххх, ххХхх, хххХх, ххххХ, ХХххх, ХхХхх, ХххХх, ХхххХ, хХХхх, хХхХх, хХххХ, ххХХх, ххХхХ, хххХХ и ХхХхХ, где X означает остаток ΕΝΑ, а х означает не-^NΑ-остаток. В предпочтительном варианте изобретения замена в положениях 11-15 от 3'-конца выбрана из группы, состоящей из ххХхх, ХхХхх, ХххХх, хХхХх, хХххХ и ххХхХ, где X означает остаток ΕΝΑ, а х означает не-ΕΝΑостаток. В более предпочтительном варианте изобретения замена в положениях 11-15 от 3'-конца выбрана из группы, состоящей из ххХхх, хХхХх, хХххХ и ххХхХ, где X означает остаток ΕΝΑ, а х означает не-^NΑ-остаток. В еще более предпочтительном варианте изобретения замена в положениях 11-15 от 3'-конца выбрана из группы, состоящей из хХххХ и ххХхХ, где X означает остаток ΕΝΑ, а х означает не-^NΑ-остаток. В еще более предпочтительном варианте изобретения, замена в положениях 11-15 от 3'-конца имеет характер ххХхХ, где X означает остаток ΕΝΑ, а х означает не-^NΑ-остаток. Альтернативно, остатки ΕΝΑ отсутствуют в положениях 11-15 от 3'-конца, т.е. замена имеет характер ххххх.
В другом предпочтительном варианте изобретения олигонуклеотид согласно изобретению содержит 16 нуклеотидов, и такую замену для положений 11-16 от 3'-конца выбирают из группы, состоящей из Хххххх, хХхххх, ххХххх, хххХхх, ххххХх, хххххХ, ХХхххх, ХхХххх, ХххХхх, ХхххХх, ХххххХ, хХХххх, хХхХхх, хХххХх, хХхххХ, ххХХхх, ххХхХх, ххХххХ, хххХХх, хххХхХ, ххххХХ, ХХХххх, ХХхХхх, ХХххХх, ХХхххХ, ХхХХхх, ХхХхХх, ХхХххХ, ХххХХх, ХххХхХ, ХхххХХ, хХХХхх, хХХхХх, хХХххХ, хХхХХх, хХхХхХ, хХххХХ, ххХХХх, ххХХхХ, ххХхХХ и хххХХХ, где X означает остаток ΕΝΑ, а х означает не-^NΑ-остаток. В предпочтительном варианте изобретения замена в положениях 11-16 от 3'-конца выбрана из группы, состоящей из ХххХхх, хХхХхх, хХххХх, ххХхХх, ххХххХ, ХхХхХх, ХхХххХ, ХххХхХ, хХхХхХ, хХххХХ и ххХхХХ, где X означает остаток ΕΝΑ, а х означает не-^NΑ-остаток. В более предпочтительном варианте изобретения замена в положениях 11-16 от 3'-конца выбрана из группы, состоящей из хХхХхх, хХххХх, ххХхХх, ххХххХ, хХхХхХ, хХххХХ и ххХхХХ, где X означает остаток ΕΝΑ, а х означает не-^NΑ-остаток. В еще более предпочтительном варианте изобретения замена в положениях 11-16 от 3'-конца выбрана из группы, состоящей из ххХххХ, хХхХхХ, хХххХХ и ххХхХХ, где X означает остаток ΕΝΑ, а х означает не-^NΑ-остаток. В еще более предпочтительном варианте изобретения замена в положениях 11-16 от 3'-конца выбрана из группы, состоящей из ххХххХ и хХхХхХ, где X означает остаток ΕΝΑ, а х означает не-^NΑ-остаток. В наиболее предпочтительном варианте изобретения замена в положениях 11-16 от 3'-конца имеет характер
- 25 015570 ххХххХ, где X означает остаток ЬЫА, а х означает не-ЬЫА-остаток. Альтернативно, остатки ЬЫА отсутствуют в положениях 11-16 от З'-конца, т.е. замена имеет характер хххххх.
В предпочтительном варианте изобретения олигонуклеотид согласно изобретению содержит остаток ЬЫА у 5'-конца. В другом предпочтительном варианте изобретения олигонуклеотид согласно изобретению содержит остаток ЬЫА в первых двух положениях от 5'-конца.
В особенно предпочтительном варианте изобретения олигонуклеотид согласно изобретению содержит 1З нуклеотидов, и замена от З'-конца имеет характер ХХхХхХххХХххХ, где X означает остаток ЬЫА, а х означает не-ЬЫА-остаток. Предпочтительной последовательностью этого варианта от З'-конца является последовательность СС!СаСасТСйА, где прописные буквы означают азотистые основания в ЬЫА-остатке, а строчные буквы означают азотистые основания в не-ЬЫА-остатке.
В другом особенно предпочтительном варианте изобретения олигонуклеотид согласно изобретению содержит 15 нуклеотидов, и замена от З'-конца имеет характер ХХхХхХххХХххХхХ, где X означает остаток ЬЫА, а х означает не-ЬЫА-остаток. Предпочтительной последовательностью этого варианта от З'-конца является последовательность СС!СаСасТСйАсС, где прописные буквы означают азотистые основания в ЬЫА-остатке, а строчные буквы означают азотистые основания в не-ЬЫА-остатке.
Модификация межнуклеозидной связывающей группы.
Типичными межнуклеозидными связывающими группами в олигонуклеотидах являются фосфатные группы, но эти группы могут быть заменены межнуклеозидными связывающими группами, не являющимися фосфатом. В другом представляющем интерес варианте изобретения олигонуклеотид согласно изобретению имеет модифицированную структуру межнуклеозидных связывающих групп, т.е. модифицированный олигонуклеотид содержит межнуклеозидную связывающую группу, не являющуюся фосфатом. В соответствии с этим в предпочтительном варианте изобретения олигонуклеотид согласно изобретению содержит по меньшей мере одну группу.
Конкретные примеры межнуклеозидных связывающих групп, за исключением фосфата (-О-Р(О)2-О-), включают -О-Р(О,8)-О-, -О-Р(8)2-О-, -8-Р(О)2-О-, -8-Р(О,8)-О-, -8-Р(8)2-О-, -О-Р(О)2-8-, -О-Р(0,8)-8-, -8-Р(О)2-8-, -О-РО(Ян)-О-, О-РО(ОСН3)-О-, -О-РО(ЫКн)-О-, -О-РО(ОСН2СН28-Я)-О-, -О-РО(ВНЗ)-О-, -О-РО(ЫНЯН)-О-, -О-Р(О)2-ЫКН-, -ЫКН-Р(О)2-О-, -ЫКН-СО-О-, -ЫЯН-СО-ЫКН-, -О-СО-О-, -О-СО-ЫЯН-, -ЫЯН-СО-СН2-, -О-СН2-СО-ЫКН-, -О-СН2-СН2-ЫКН-, -СО-ЫКН-СН2-, -СН2-ЫКН-СО-, -О-СН2-СН2-8-, -8-СН2-СН2-О-, -8-СН2-СН2-8-, -СН2-8О2-СН2-, -СН2-СО-ЫКН-, -О-СН2-СН2-ЫКН-СО-, -СН2-ЫСНЗ-О-СН2-, где Ь11 представляет собой водород или С1-4алкил.
Если межнуклеозидная связывающая группа является модифицированной, то указанная межнуклеозидная связывающая группа предпочтительно представляет собой фосфортиоатную группу (-О-Р(О,8)-О-). В предпочтительном варианте изобретения все межнуклеозидные связывающие группы олигонуклеотидов согласно изобретению представляют собой фосфортиоат.
- 26 015570
Конструкции специфических микроРНК.
В нижеследующей таблице приводятся примеры олигонуклеотидов согласно изобретению, а именно олигонуклеотидов, используемых в фармацевтических композициях, и для сравнения известных молекул. ___________________.____________________________________________________
мишень: Ьза-ш±К-122а ΜΙΜΑΤ0000421 ЗЕф Ю
иддадидидасааиддидиииди ЗЕО 10 N0 1
скринирован в клеточной линии нин-7, экспрессирующей ιηίΗ-122
η.πντΓΌ) Λ . миктхэРНК—мишамь . олигонуклеотидная последовательность Конструкция
3962 :ιηίΚ-122 5'- АСААасассаЫсдбсасасТССА-З' 3965 :πιίΡ.-122 5'- асааасАССАТТСТсасасбсса-З' 3972:ιηίΒ-122 5'асАааСасСабТдЬСасАсбСса-З' ОСЛО /Ο/ίΓ/ΐΩ\.·τν,-:ηΊΟΟΠΙ чЭ *ι (эичд; . х δ. & и — СсАЬЬСТсаСаСЪСС-3 ' 3975 :ΐϊΐίΚ~122 5 ' -СсАЬТСТсаСАСХСС-З ' 3975':ш±К-122 5'-АТТСТсАСАСЬСС-З' 3975' ' :ш1К-122 5'-ТОТсАСАСЬСС-З' 3549' (3649) :τηίΚ-122 5 ' ССМАТМТМСТСМАМСАМСТМСС-3 ' 3549'' (3649):ш1К-122 5' СС^АТ^Т^СТС^А^СА^СТ^СС-З ' мишень: Ь5а-т1Н-1ЭЬ ΜΙΜΑΤ0000074 идидсаааиссаидсаааасида скринирован в клеточной линии НеЬа, экспрессирующей пп.К-19Ь Олиго микроРНК-мишень, олигонуклеотидная последовательность 3963:ш1К-19Ь 5'- ТСАСЬЬЬЕдса'ЬддаЬ'ЫгдСАСА-З ' 3967 :ш1В.-19Ь 5'- ЕсадЬЬТТССАТСОаббЬдсаса-З' Полный комплемент, гэп Полный комплемент, блок Полный комплемент, ЬЫА_3 Н'О ВаЯ конструкция Улучшенная новая конструкция Εϋ - 13-мер Εϋ - 11-мер Новая конструкция 2' МОЕ Новая конструкция 2'-фтор Конструкция Полный комплемент, гэп Полный комплемент, блок ЗЕО Ю N0 11 ЗЕО Ю N0 12 ЗЕО Ю N0 13 О ΤΊ Г\ ТТЛ ЪТ/Л Л Л О X 1Э 1М X ч ЗЕО Ю N0 15 ЗЕО Ю N0 16 ЗЕО Ю N0 17 ЗЕО Ю N0 18 ЗЕО Ю N0 19 ЗЕО Ю N0 2 ЗЕО Ю N0 20 ЗЕО 10 N0 21
3973:ш1К-19Ь 5'- бсАдбТб'ЬСсаТддАЬбТдсАса-З' Полный комплемент, ЬЫА_3 ЗЕО Ю N0 22
3560:ш1К-19Ь 5'-ТдСаЬССаЕТЕСсАС-3’ Новая конструкция ЗЕО Ю N0 23
397б:т±К-19Ь 5'-ТдСаТССабТТСсАС-З' Улучшенная ЗЕО Ю N0 24
- 27 015570
новая
конструкция
3976':ш1К-19Ь 5'-СаТССаТТТСсАС-З' ЕЦ - 13-мер 8Е<2 Ю N0 25
3976'':т1К-19Ь 5'-ТССаТТТСсАС-3' ЕО - 11-мер 5Е<2 Ю N0 26
3560' :тШ-19Ь 5' Новая 5Е<2 Ю N0 27
ТСМСАМТМССАМТМТТМССМАС-3 ' конструкция -
2'МОЕ
3560'' :ш1К-19Ь 5'- Новая ЗЕ<2 ΙΏ N0 28
тсгсае'тгссагтгттгссгас-з ' конструкция -
2'МОЕ
Мишень: Нза-ш1К-155 ΜΙΜΑΤ0000646
ииааидсиааисдидаиадддд 5Е<2 Ιϋ N0 3
скринирован в клеточной линии 518А2,
экспрессирующей πιίΚ-155
Олиго микроРНК-мишень, Конструкция
олигонуклеотидная последовательность
3964:т1К-155 5'- Полный ЗЕО Ю N0 29
ССССЕабсасдаббадсаТТАА-З' комплемент,
гэпр
3968: ιηίΚ-155 5'- Полный 3Εζ) Ιϋ N0 30
ссссбаТСАССАТТадсабРаа-3' комплемент,
блок
3974:ш1К-155 5'- Полный 3Εζ) Ιϋ N0 31
сСссТаЕСасСаРТадСабТаа-З' комплемент,
ЬЫА_3
3758: πιίΚ-155 5'-ТсАсдАТЕаСсАЕТА-3' Новая 8Ε<2 Ю N0 32
конструкция
3818: ιηίΚ-155 5'-ТсАсСАТЕаССАЕТА-З' Улучшенная 5Ε<2 Ιϋ N0 33
новая
конструкция
3818' : πιίΚ-155 5 ' -АССАТЕАССАЕТА-3 ' ЕЕ> - 13-мер 3Εζ) Ιϋ N0 34
3818: ιηίΚ-155 5'-САТЕАССаТТА-3' ЕЕ) - 11-мер 3Εζ) Ю N0 35
3758' : πιίΚ-155 5'- Новая 3Ε0 Ιϋ N0 36
ТСМАСМСМАТТАМССМАТМТА-3 ' конструкция -
2' МОЕ
3758' ' : πιίΚ-155 5'- Новая 3Εζ) Ιϋ N0 37
ТСГАСГСГАТТГАГССГАТГТА-3 ’ конструкция -
- 28 015570
2' --фтор
мишень: Ьза-пш.В-21 ΜΙΜΑΤ0000076
иадсииаисадасидаидиида ЗЕО Ю N0 4
т1К-21 5'- ТСААсабсадбсбдабааССТА - 3' Полный комплемент, ГЭП ЗЕО Ю N0 38
πιίΚ-21 5'- ЕсаасаТСАСТСТСа'Ьаадс’Еа - 3 ' Полный комплемент, блок ЗЕО Ю N0 39
ιηίΒ-21 5'- ЬсАЕсАксАдЕСХдАЕаАСсТ'Ь - 3 ' Полный комплемент, ΕΝΑ_3 ЗЕО Ю N0 40
ГП1К-21 5'-ТсАдбСТдаТаАдСТ -3’ Новая конструкция ЗЕО Ю N0 41
πιϊΒ-21 5 ' -ТсАдТСТдаТААдСТ -3'- Улучшенная новая конструкция ЗЕО Ю N0 42
ΐηίΚ-21 5 '-АСТСТдАТААдСТ -3'- Εϋ - 13-мер ЗЕО Ю N0 43
ΐηίΚ-21 5 ' -ТСТдАбААССТ -3'- Εϋ - 11-мер ЗЕО Ю N0 44
ΓηίΚ-21 5 ' -ТСМАСМТМСТСМАМТАМАСМСТ-3' Новая конструкция - 2' МОЕ ЗЕО Ю N0 45
ΠΐίΒ-21 5 ' -ТСАЗГТАТСАТАГАСГСТ-3 ' мишень: Ьза-т1В.-375 ΜΙΜΑΤ0000728 Новая конструкция - 2'-фтор ЗЕО Ю N0 46
ииидиисдиисддсисдсдида ЗЕО Ю N0 5
ιηίΚ-375 5 ' -ТСТСдсд-ЬдссдббсдббСТТТ - 3 ' Полный комплемент, ГЭП ЗЕО Ю N0 47
πιίΚ-375 5'- бсбсдсОТССССТТсдббсббб - 3 ' Полный комплемент, блок ЗЕО Ю N0 48
ιηίΚ-375 5 '-ЬсТсдСдбСссОббСдбТсбТ'Ь - 3' Полный комплемент, ЬЫА_3 ЗЕО Ю N0 49
ιηίΚ-375 5'-СССссСТбсОбТсТТ 3' Новая конструкция ЗЕО Ю N0 50
πιίΚ-375 5 '-СЪСсССТЕсСТТсТТ 3' Улучшенная новая конструкция ЗЕО Ю N0 51
Ш1К-375 5'-ССССТССдТТСТТ 3' Εϋ - 13-мер ЗЕО Ю N0 52
πιίΚ-375 5 '-ССТТсСТТСТТ 3' ЕЭ - 11-мер ЗЕО Ю N0 53
πιίΚ-375 5 '-СТМССМСМСТТМСМСТМТСМТТ 3' Новая конструкция - 2' МОЕ ЗЕО Ю N0 54
ιπίΚ-375 5 '-СТЕ’ССЕ’СЕ’СТТ|?СГСТГТСЕ’ТТ 3' Новая конструкция 2'-фтор ЗЕО Ю N0 55
- 29 015570
Прописные буквы без надстрочного индекса М или Е обозначают остатки ΕΝΑ. Строчные буквы обозначают ДНК, за исключением строчных букв, выделенных жирным шрифтом, которые означают РНК. Цитозины ΕΝΑ могут быть, но необязательно, метилированными. Прописные буквы с надстрочным индексом М означают остатки 2'ОМЕ РНК, прописные буквы с надстрочным индексом Е обозначают остатки 2'-фтор-ДНК, а строчные буквы обозначают ДНК. В одном из вариантов изобретения вышеописанные олигонуклеотиды могут иметь только фосфортиоатные связи, но могут быть использованы олигонуклеотиды с другими нуклеотидными связями. В одном из вариантов изобретения все нуклеотиды имеют фосфодиэфирные связи. Считается, что для введения в головной/спинной мозг, предпочтительно, например, использовать олигонуклеотиды против т1К-21, имеющие фосфодиэфирные связи.
В одном из вариантов изобретения олигонуклеотиды согласно изобретению могут иметь последовательность нуклеотидов в направлении 5'-3', выбранную из группы, состоящей из:
(Новая конструкция) ьаьаььысшъьсшъ (Улучшенная новая конструкция)
ЪМЪММЬЬММЬМЬМЬЬ
ЪМЬМЬЬЬММЬЬЬМЬЬ (Новая конструкция - 2'МОЕ) (Улучшенная новая конструкция- 2'МОЕ)
ЪЕЬЕГЬЪЕЕЬЕЬЕЬЕ
ЬЕЬЕЬЬЪЕТЬЬЬЕЪЬ (Улучшенная новая конструкция- 2'-фтор) (Новая конструкция - 2'-фтор)
ЬсЩЬсЩЪсЩЬ (ά) (ά) (Ь) (ά) (ά) (С (ά) ' Каждый третий'
бШбЬббЫсКЬ) (ά) (ά) (С (ά) (ά) (Ε) 'Каждый третий'
ЦЦЬЦсШсИЬсНсП (Ε) (ά) (ά) (Б) (ά) (ά) 'Каждый третий'
ЬММЬММЬММЬ(М) (Μ) (Ь) (Μ) (Μ) (Ь) (Μ) 'Каждый третий'
МЬММЬММЬММ(Ь) (Μ) (Μ) (Ь) (Μ) (Μ) (Ε) 'Каждый третий'
ММЕММБММЕМ(М) (Ь) (Μ) (Μ) (Щ (Μ) (Μ) 'Каждый третий'
ЬЕЕЬЕЕЬЕЕЕ(Е) (Ε) (Ь) (Ε) (Ε) (Ε) (Ε) 'Каждый третий'
ЕЪЕЕЪЕЕЬЕЕ(Ь) (Ε) (Ε) (Ь) (Ε) (Ε) (Б) 'Каждый третий'
ЕЕЬЕЕЬЕЕЬЕ(Е) (Ь) (Ε) (Ε) (Ε) (Ε) (Ε) 'Каждый третий'
ЦШШШЬсШ (ά) (Ь) (ά) (Ъ) (ά) (Ε) (ά) 'Каждый второй'
МЬМЪМЬМЬМЪ(М)(Ъ)(М)(Ъ)(М)(Ъ) (М) 'Каждый второй'
ЬсМЬбЫЦб) (Ъ) (ά) (Ь) (ά) (Ь) (ά) (Ъ) 'Каждый второй'
ЪМЬМЬМЬМГДМ)(Ь)(М)(Ъ)(М)(Ъ)(М)(Ъ) 'Каждый второй'
ЕЕЕЬЕЬЕЬЕЬ(Е)(Ь)(Е)(Ε)(Ε)(Е)(Е) 'Каждый второй'
ЬЕЪЕЪЕЬЕЬ(Е)(Ъ)(Ε)(Ε)(Е)(Ь)(Е)(Ъ) 'Каждый второй' где Ь = остаток ΕΝΑ, ά = остатки ДНК, М = 2'МОЕ-РНК, Е=2'-фтор, а остатки в скобках являются необязательными.
Конкретные примеры олигонуклеотидов согласно изобретению могут быть выбраны из группы, состоящей из
ЕдСаЕСдаТЕЕСсаСа (ЗЕО Ю N0 82), ЕдСаЕСдаТЕЕСсаС( :зео Ιϋ N0 83),
СаЕСдаТЕЕСсаС (ЗЕО Ю N0 84), ЕСсАЕОдАЕТЕОсАс (ЗЕО Ю N0 85),
сАЕСдАЕТЕОсАс (ЗЕО Ю N0 86), СаЕССаЕТЕСсАС (ЗЕО Ю N0 87),
ТдСаЕССаЕТЕСсАС (ЗЕО ю N0 88), ТдСаТдСаТТЕСсАСа (ЗЕО ю N0 8 9) ,
Ю ю
(ЗЕО (ЗЕО сСаЕТдЕСасАсЕСса ссАЕЕСЕсАсаСЕсСа аЕТдЕСасАсЕСс (ЗЕО
N0
АЕЕСЕсАсаСЕсС (ЗЕО
N0
96), аТЕСЕСаСаСЕСс (ЗЕО Ю
N0
АЕЕСТсаСаСЕСС
N0
N0 99) ,
СсаТЕдТсасАсЕсСа
ЕСасОаЕТадСаЕТаа (ЗЕО
ТсАсОаТЕАдСаТЕАа дАдсСдаАсдАасАа
СаСсСдАаСдАаСаА где строчные буквы обозначают азотистое основание остатка ДНК, прописные буквы обозначают азотистое основание остатка ΕΝΑ, а прописные буквы С обозначают МеС.
Следует отметить, что нуклеотидная конструкция ΕΝΑ/ДНК в вышеописанных конкретных примерах может быть использована и в других олигонуклеотидах согласно изобретению.
- 30 015570
Конъюгаты.
Настоящее изобретение также относится к конъюгатам, содержащим олигонуклеотид согласно изобретению.
В одном из вариантов изобретения олигомерное соединение связано с лигандами/конъюгатами, которые могут быть использованы, например, для улучшения поглощения клетками антисмысловых олигонуклеотидов. Такое конъюгирование может быть осуществлено в концевых 5'/3'-ОН-положениях, однако лиганды могут также присутствовать у сахаров и/или оснований. В частности, фактором роста, с которым может быть конъюгирован антисмысловой олигонуклеотид, может быть трансферрин или фолат. Комплексы трансферрин-полилизин-олигонуклеотид или комплексы фолат-полилизинолигонуклеотид могут быть получены так, чтобы они поглощались клетками, экспрессирующими высокие уровни рецептора трансферрина или фолата. Другими примерами конъюгатов/лигандов являются молекулы холестерина, дуплексные интеркалирующие агенты, такие как акридин, поли-Ь-лизин, конецкэпирующие молекулы с одной или несколькими резистентными к нуклеазе связывающими группами, такими как фосформонотиоат и т.п. Настоящее изобретение также относится к конъюгату, включающему описанное здесь соединение согласно изобретению и по меньшей мере одну не-нуклеотидную или неполинуклеотидную молекулу, ковалентно связанную с указанным соединением. Следовательно, в одном из вариантов изобретения, относящемся к соединению согласно изобретению, которое состоит из описанной здесь конкретной нуклеиновой кислоты, указанное соединение может также включать по меньшей мере одну не-нуклеотидную или не-полинуклеотидную молекулу (например, не содержащую один или несколько нуклеотидов или нуклеотидных аналогов), ковалентно связанную с указанным соединением. Такая не-нуклеотидная молекула может, например, представлять собой или включать стерол, такой как холестерин.
Поэтому следует отметить, что олигонуклеотид согласно изобретению, такой как олигонуклеотид, используемый в фармацевтических (терапевтических) препаратах, может также содержать ненуклеотидные компоненты, такие как конъюгаты, описанные в настоящем изобретении.
Остаток ΕΝΑ.
В предпочтительном варианте изобретения остаток ΕΝΑ имеет общую химическую структуру, представленную на схеме 1.
где Х выбран из группы, состоящей из О, 8 и ΝΚΗ, где Кн представляет собой Н или С1-4алкил;
Υ представляет собой (-СН2)Г, где г равно целому числу 1-4; и
В представляет собой азотистое основание.
В предпочтительном варианте изобретения г равно 1 или 2, в частности 1, т.е. предпочтительный остаток ΕΝΑ имеет химическую структуру, представленную на схеме 2.
где Х и В являются такими, как они определены выше.
В представляющем интерес варианте изобретения остатки ΕΝΑ, включенные в олигонуклеотиды согласно изобретению, независимо выбраны из группы, состоящей из тио-^А-остатков, амино-ΕΝΑостатков и окси-^А-остагков.
- 31 015570
где В является таким, как он определен выше.
При этом предпочтительно, чтобы тио-1,\А-остаток имел бета-Э-форму, т.е. структуру, представленную на схеме 3А.
Аналогичным образом, амино-Б\А-остаток может иметь химическую структуру, представленную на схеме 4.
где В и Кн являются такими, как они определены выше.
При этом предпочтительно, чтобы амино-Б\А-остаток имел бета-Э-форму, т.е. структуру, представленную на схеме 4А.
Окси-Ь\А-остаток может иметь химическую структуру, представленную на схеме 5.
где В является таким, как он определен выше.
При этом предпочтительно, чтобы окси-Ь\А-остаток имел бета-Э-форму, т.е. структуру, представленную выше на схеме 5А.
Как указывалось выше, В представляет собой азотистое основание, которое может быть природным или неприродным. Конкретными примерами азотистых оснований являются аденин (А), цитозин (С), 5-метилцитозин (МеС), изоцитозин, псевдоизоцитозин, гуанин (О), тимин (Т), урацил (и), 5-бромурацил, 5-пропинилурацил, 5-пропини-6,5-метилтиазолурацил, 6-аминопурин, 2-аминопурин, инозин,
2,6-диаминопурин, 7-пропин-7-деазааденин, 7-пропин-7-деазагуанин и 2-хлор-6-аминопурин.
Концевые группы.
Конкретными примерами концевых групп являются концевые группы, выбранные из группы, состоящей из водорода, азидо, галогена, циано, нитро, гидрокси, Рго!-О-, Ас!-О-, меркапто, Рго!-8-, Ас!-8-, С1-6алкилтио, амино, Рго!-\(КН)-, Ас!-\(КН)-, моно- или ди(С1-6алкил)амино, необязательно замещенного С1-6алкокси, необязательно замещенного С1-6алкила, необязательно замещенного С2-6алкенила, необязательно замещенного С2-6алкенилокси, необязательно замещенного С2-6алкинила, необязательно замещенного С2-6алкинилокси, монофосфата, включая защищенный монофосфат; монотиофосфата, включая защищенный монотиофосфат; дифосфата, включая защищенный дифосфат; дитиофосфата, включая защищенный дитиофосфат; трифосфата, включая защищенный трифосфат; тритиофосфата, включая защищенный тритиофосфат, где Рго! представляет собой защитную группу для -ОН, -8Н и -\Н(Кн), Ас! представляет собой активирующую группу для -ОН, -8Н и -\Н(Кн), а Кн представляет собой водород или С1-6алкил.
Примерами фосфатзащитных групп являются 8-ацетилтиоэтил (8АТЕ) и 8-пивалоилтиоэтил (третбутил-8АТЕ).
Другими примерами концевых групп являются ДНК-интеркалирующие агенты, фотохимически активные группы, термохимически активные группы, хелатообразующие группы, репортерные группы, лиганды, карбокси, сульфоно, гидроксиметил, Рго!-О-СН2-, Ас!-О-СН2-, аминометил, Рго!-\(КН)-СН2-, Ас!-\(КН)-СН2-, карбоксиметил, сульфонометил, где Рго! представляет собой защитную группу для -ОН, -8Н и -\Н(КН), Ас! представляет собой активирующую группу для -ОН, -8Н и -\Н(КН), а Кн представляет собой водород или С1-6алкил.
- 32 015570
Примерами защитных групп для групп -ОН и -8Н являются замещенный тритил, такой как 4,4'-диметокситритилокси (ΌΜΤ), 4-монометокситритилокси (ММТ); тритилокси, необязательно замещенный 9-(9-фенил)ксантенилокси (пиксил), необязательно замещенный метокситетрагидропиранилокси (ιηΐΐιρ); силилокси, такой как триметилсилилокси (ΤΜ8), триизопропилсилилокси (Т1Р8), третбутилдиметилсилилокси (ΤΒΌΜ8), триэтилсилилокси, фенилдиметилсилилокси; трет-бутиловые эфиры; ацетали (включающие две гидроксигруппы); ацилокси, такие как ацетил или замещенные галогеном ацетилы, например хлорацетилокси или фторацетилокси, изобутирилокси, пивалоилокси, бензоилокси и замещенные бензоилы, метоксиметилокси (ΜΟΜ), бензиловые эфиры или замещенные бензиловые эфиры, такие как 2,6-дихлорбензилокси (2,6-Ο2Βζ1). Кроме того, если Ζ или Ζ* представляют собой гидроксил, то они могут быть защищены путем присоединения к твердому носителю, необязательно, посредством линкера.
Примерами аминовых защитных групп являются флуоренилметоксикарбониламино (Ешос), трет-бутилоксикарбониламино (ВОС), трифторацетиламино, аллилоксикарбониламино (а11ос, АОС), Ζ-бензилоксикарбониламино (ί.Εζ), замещенный бензилоксикарбониламино, такой как 2-хлорбензилоксикарбониламино (2-ΟΖ), монометокситритиламино (ММТ), диметокситритиламино (ΌΜΤ), фталоиламино и 9-(9-фенил)ксантениламино (пиксил).
Активирующая группа предпочтительно опосредует связывание с другими остатками и/или с нуклеотидными мономерами, и после завершения связывания активирующая группа обычно превращается в межнуклеозидную связь. Примерами таких активирующих групп являются необязательно замещенный Ο-фосфорамидит, необязательно замещенный О-фосфотриэфир, необязательно замещенный О-фосфодиэфир, необязательно замещенный Н-фосфонат и необязательно замещенный Ο-фосфонат. В контексте настоящего изобретения термин фосфорамидит означает группу формулы -ЕДОНЦ-^КЦ, где Кх означает необязательно замещенную алкильную группу, например метил, 2-цианоэтил или бензил, а каждый из Ку означает необязательно замещенные алкильные группы, например этил или изопропил, или группа -К(Ку)2 образует морфолиногруппу (-Ы(СН2СН2)2О). Кх предпочтительно, означает 2-цианоэтил, а два Ку являются предпочтительно идентичными и означают изопропил. В соответствии с этим особенно предпочтительным фосфорамидитом является ^№диизопропил-О-(2-цианоэтил)фосфорамидит.
Наиболее предпочтительными концевыми группами являются гидрокси, меркапто и амино, в частности гидрокси.
Терапия и фармацевтические композиции
Как указывалось выше, олигонуклеотиды согласно изобретению входят в состав соответствующих лекарственных средств с улучшенными свойствами. Для получения эффективных и безопасных лекарственных средств необходима тонкая регуляция различных параметров, таких как аффинность/специфичность, стабильность в биологических жидкостях, поглощение клетками, механизм действия, фармакокинетические свойства и токсичность.
В соответствии с этим в другом своем аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей олигонуклеотид согласно изобретению и фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель или адъювант. Указанным носителем предпочтительно является физиологический раствор или забуференный физиологический раствор.
В еще одном своем аспекте настоящее изобретение относится к олигонуклеотиду согласно изобретению, используемому в качестве лекарственного препарата.
Следует отметить, что доза зависит от тяжести патологического состояния, подвергаемого лечению, и его отвечаемости на такое лечение, а также от конкретного курса лечения, которое проводят от нескольких дней до нескольких месяцев или до тех пор, пока такое лечение не даст нужный эффект или не будет достигнуто ослабление симптомов указанного патологического состояния. Оптимальная схема введения доз может быть определена исходя из измерения уровня аккумуляции лекарственного средства в организме пациента. Оптимальные дозы могут варьироваться в зависимости от относительной эффективности отдельных олигонуклеотидов. В основном такая доза может быть определена исходя из ЕС50, которая, по оценкам, проведенным на животных-моделях ίη νίίτο и ίη νίνο, является эффективной. В общих чертах, доза составляет от 0,01 мкг до 1 г/кг массы тела и может быть введена один или несколько раз в день, в неделю, в месяц или год или даже один раз в каждые 2-10 лет либо путем непрерывного вливания в течение периода времени от нескольких часов до нескольких месяцев. Частота введения дозы может быть оценена исходя из установленного времени присутствия лекарственного средства в организме и от концентраций лекарственного средства в физиологических жидкостях или в тканях. После успешного лечения пациенту может быть назначена поддерживающая терапия в целях предупреждения рецидивов указанного патологического состояния.
- 33 015570
Фармацевтические композиции.
Как указывалось выше, настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере один олигонуклеотид согласно изобретению в качестве активного ингредиента. Следует отметить, что фармацевтическая композиция согласно изобретению может содержать, но необязательно, фармацевтический носитель и что указанная фармацевтическая композиция может содержать, но необязательно, другие соединения, такие как химиотерапевтические соединения, противовоспалительные соединения, противовирусные соединения и/или иммуномодулирующие соединения.
Олигонуклеотиды согласно изобретению могут быть использованы в чистом виде или в форме различных фармацевтически приемлемых солей. Используемый здесь термин фармацевтически приемлемые соли означает соли, сохраняющие нужную биологическую активность идентифицированных здесь олигонуклеотидов и обладающие минимальной нежелательной токсичностью. Неограничивающими примерами таких солей могут быть соли, образованные органическими аминокислотами, и основноаддитивные соли, образованные катионами металлов, таких как цинк, кальций, висмут, барий, магний, алюминий, медь, кобальт, никель, кадмий, натрий, калий и т. п., или соли, образованные катионами аммиака, Ν,Ν-дибензилэтилен-диамина, Ό-глюкозамина, тетраэтиламмония или этилендиамина.
В одном из вариантов изобретения олигонуклеотид может иметь форму пролекарства. Олигонуклеотиды образуются отрицательно заряженными ионами. Вследствие липофильной природы клеточных мембран поглощение олигонуклеотидов клетками, по сравнению с нейтральными или липофильными эквивалентами, снижается. Такую проблему полярности можно решить методом, предусматривающим использование пролекарств (см., например, Сгооке, К.М. (1998) ίη Сгооке, 8.Т. Αηίίββηββ гевеагсй апб Αρρίίοαίίοη. 8ргтдег-Уег1ад, Вег1т, Сегта^, νοί. 1З1, р. 10З-140).
Частью приготовленного лекарственного средства могут быть фармацевтически приемлемые связывающие агенты и адъюванты.
Примеры методов доставки описанных здесь терапевтических средств, а также подробное описание фармацевтических препаратов и солей можно найти, например, в предварительных заявках на патенты США 60/8З8710 и 60/788995, которые вводятся в настоящее описание посредством ссылки, и в заявке на патент Дании РА 200600615, которая также вводится в настоящее описание посредством ссылки.
Фармацевтическими композициями согласно изобретению являются, но не ограничивается ими, растворы, эмульсии и препараты, содержащие липосомы. Такие композиции могут быть приготовлены из различных компонентов, которые представляют собой, но не ограничиваются ими, предварительно полученные жидкости, самоэмульгирующиеся твердые вещества и самоэмульгирующиеся полутвердые вещества. Доставка лекарственного средства в опухолевую ткань может быть улучшена путем применения опосредующих такую доставку носителей, включая, но не ограничиваясь ими, катионные липосомы, циклодекстрины, производные порфирина, дендримеры с разветвленной цепью, полиэтилениминовые полимеры, наночастицы и микросферы (Оавв С.К. ί. Рйагт. Ρ1ι;·ιπη;·κο1. 2002; 54(1):З-27). Фармацевтические композиции согласно изобретению, которые могут присутствовать в основном в виде унифицированной лекарственной формы, могут быть приготовлены стандартными методами, хорошо известными специалистам-фармацевтам. Такие методы включают стадию взаимодействия активных ингредиентов с фармацевтическим(ими) носителем(ями) или наполнителем(ями). В общих чертах, такие композиции приготавливают путем равномерного и тщательного смешивания активных ингредиентов с жидкими носителями, или тонкоизмельченными твердыми носителями, или с теми и другими с последующим формованием, если это необходимо, нужного продукта. Композиции согласно изобретению могут быть приготовлены в виде любой из многих возможных лекарственных форм, таких как, но не ограничивающихся ими, таблетки, капсулы, гелевые капсулы, жидкие сиропы, мягкие гели и суппозитории. Композиции согласно изобретению могут быть также приготовлены в виде суспензий в водных, безводных или в смешанных средах. Водные суспензии могут также содержать вещества, повышающие вязкость такой суспензии, и такими веществами являются, например, натрийсодержащая карбоксиметилцеллюлоза, сорбит и/или декстран. Такая суспензия может также содержать стабилизаторы. Соединения согласно изобретению могут быть также конъюгированы с активными лекарственными веществами, например с аспирином, ибупрофеном, серосодержащими лекарственными средствами, антидиабетическими лекарственными средствами, антибактериальными лекарственными средствами или антибиотиками.
В другом варианте изобретения композиции согласно изобретению могут содержать одно или несколько олигонуклеотидных соединений, нацеленных на первую микроРНК, и одно или несколько дополнительных олигонуклеотидных соединений, нацеленных на вторую микроРНК-мишень. Указанные два или более объединенных соединений могут быть использованы вместе или отдельно.
Описанные здесь соединения могут быть использованы в различных терапевтических целях, указанных выше. В общих чертах, терапевтические методы согласно изобретению включают введение терапевтически эффективного количества олигонуклеотида млекопитающему, в частности человеку. В некоторых своих вариантах настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим (а) одно или несколько соединений согласно изобретению и (Ь) одно или несколько химиотерапевтических средств. Такие химиотерапевтические средства, при их использовании с соединениями согласно изобретению, могут быть введены отдельно, последовательно или в комбинации с одним или не
- З4 015570 сколькими другими указанными химиотерапевтическими средствами, или в комбинации с лучевой терапией. Все химиотерапевтические средства, известные специалистам, вводят в качестве комбинированной терапии вместе с соединением согласно изобретению. Другими активными средствами, такими как противовоспалительные лекарственные средства, являются, но не ограничивается ими, нестероидные проти вовоспалительные средства и кортикостероиды, противовирусные лекарственные средства и иммуномодулирующие лекарственные средства, которые могут быть также объединены в композиции согласно изобретению. Два или более объединенных соединений могут быть использованы вместе или отдельно.
Примерами показаний к лечению фармацевтическими композициями согласно изобретению могут служить следующие заболевания.
микроРНК Возможные медицинские показания
ιηϊΚ-21 Глиобластома, рак молочной железы
Было показано, что мРНК гена-супрессора опухоли, тропомизина 1 (ТРМ1), является мишенью т1К-21. Кроме того, было показано, что мРНК миотропина (т!рп) является мишенью т1К-375.
В еще одном своем аспекте настоящее изобретение относится к применению олигонуклеотида согласно изобретению в целях приготовления лекарственного препарата для лечения заболевания, выбранного из группы, состоящей из атеросклероза, гиперхолистеринемии и гиперлипидемии; рака, глиобластомы, рака молочной железы, лимфомы, рака легких; диабета, метаболических расстройств; миобластной дифференциации и иммунных расстройств.
Настоящее изобретение также относится к олигонуклеотидам согласно изобретению, которые могут быть использованы для лечения заболевания, выбранного из группы, состоящей из атеросклероза, гиперхолистеринемии и гиперлипидемии; рака, глиобластомы, рака молочной железы, лимфомы, рака легких; диабета, метаболических расстройств; миобластной дифференциации и иммунных расстройств.
Настоящее изобретение относится к способу лечения индивидуума, страдающего заболеванием или состоянием, выбранным из группы, состоящей из атеросклероза, гиперхолистеринемии и гиперлипидемии; рака, глиобластомы, рака молочной железы, лимфомы, рака легких; диабета, метаболических расстройств; миобластной дифференциации и иммунных расстройств, где указанный способ включает стадию введения олигонуклеотида или фармацевтической композиции согласно изобретению индивидууму, нуждающемуся в таком лечении.
Рак.
В еще одном своем аспекте настоящее изобретение относится к применению олигонуклеотида согласно изобретению или его конъюгата в целях приготовления лекарственного препарата для лечения рака. В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения или профилактики рака, где указанный способ включает введение олигонуклеотида согласно изобретению или его конъюгата или фармацевтической композиции согласно изобретению пациенту, нуждающемуся в таком лечении.
Такими раковыми заболеваниями могут быть лимфоретикулярная неоплазия, лимфобластный лейкоз, опухоли головного мозга, опухоли желудка, плазмацитомы, множественная миелома, лейкоз, опухоли соединительных тканей, лимфомы и солидные опухоли.
Соединение настоящего изобретения или его конъюгат могут быть использованы в целях приготовления лекарственного препарата для лечения рака и являются подходящими для лечения рака в форме солидной опухоли. Аналогичным образом, описанный здесь способ может быть подходящим для лечения рака в форме солидной опухоли.
Кроме того, указанной раковой опухолью, подходящей для такого лечения, является карцинома. Карциному обычно выбирают из группы, состоящей из злокачественной меланомы, базально-клеточной карциномы, карциномы яичника, карциномы молочной железы, немелкоклеточного рака легких, почечно-клеточной карциномы, карциномы мочевого пузыря, рецидивирующего поверхностного рака мочевого пузыря, карциномы желудка, карциномы предстательной железы, карциномы поджелудочной железы, карциномы легких, карциномы шейки матки, дисплазии шейки матки, папилломатоза носоглотки, карциномы толстой кишки, карциномы прямой и ободочной кишки и карциноидных опухолей. Чаще, указанную карциному выбирают из группы, состоящей из злокачественной меланомы, немелкоклеточного рака легких, карциномы молочной железы, карциномы толстой кишки и почечно-клеточной карциномы. Злокачественную меланому обычно выбирают из группы, состоящей из поверхностно распространяющейся меланомы, нодулярной меланомы, злокачественного лентиго, акральной меланомы, амеланотиче
- 35 015570 ской меланомы и десмопластической меланомы.
Альтернативно, подходящим раковым заболеванием может быть саркома. Саркома обычно имеет форму, выбранную из группы, состоящей из остеосаркомы, саркомы Юинга, хондросаркомы, злокачественной фиброзной гистиоцитомы, фибросаркомы и саркомы Капоши.
Альтернативно, подходящим раковым заболеванием является глиома.
В другом своем варианте настоящее изобретение относится к использованию олигонуклеотида согласно изобретению или его конъюгата в целях приготовления лекарственного препарата для лечения рака, где указанный лекарственный препарат также содержит химиотерапевтическое средство, выбранное из группы, состоящей из адренокортикостероидов, таких как преднизон, дексаметазон или декадрон; альтретамина (гексалена, гексаметилмеламина (НММ)); амифостина (этиола); аминоглютетимида (цитадрена); амсакрина (Μ-ΑΜ8Α); анастрозола (аримидекса); андрогенов, таких как тестостерон; аспарагиназы (элспара); бациллы Кальметта-Герена; бикалутамида (казодекса); блеомицина (бленоксана); бусульфана (милерана); карбоплатина (параплатина); кармустина (ВСNυ, Βί’ΝΌ); хлорамбуцила (лейкерана); хлордезоксиаденозина (2-СОЛ, кладрибина, лейстатина); цисплатина (платинола); арабинозида цитозина (цитарабина); дакарбазина (ΌΤΚ’); дактиномицина (актиномицина-Ό, космегена); даунорубицина (церубидина); доцетаксела (таксотера); доксорубицина (адриомицина); эпирубицина; эстрамустина (эмцита); эстрогенов, таких как диэтилстильбестрол (ΌΕ8); этопсида (УР-16, вепезида, этопофоса); флударабина (флудары); флутамида (эйлексина); 5-ΕυΌΚ (флоксуридина); 5-фторурацила (5-ЕИ); гемцитабина (гемзара); гозерелина (зодалекса); герцептина (трастузумаба); гидроксимочевины (гидреи); идарубицина (идамицина); ифосфамида; 1Ь-2 (пролейкина, альдеслейкина); интерферона-альфа (интрона А, роферона А); иринотекана (камптозара); лейпролида (лупрона); левамизола (эргамизола); ломустина (ί.’ί.’Νυ); мехлоретамина (мустаргена, азотного аналога горчичного газа); мелфалана (алкерана); меркаптопурина (пуринетола, 6-МР); метотрексата (мексата); митомицина-С (мутамицина); митоксантрона (новантрона); октреотида (сандостатина); пентостатина (2-дезоксикоформицина, нипента); пликамицина (митрамицина, митрацина); пророкарбазина (матулана); стрептозоцина; тамоксифина (нолвадекса); таксола (паклитаксела); тенипозида (вумона, УМ-26); тиотепы; топотекана (гикамтина); третиноина (везаноида, полностью трансретиноевой кислоты); винбластина (валбана); винкристина (онковина) и винорелбина (навелбина). В соответствии с этим другое химиотерапевтическое средство выбирают из таксанов, таких как таксол, паклитаксел или доцетаксел.
Аналогичным образом, настоящее изобретение также относится к использованию олигонуклеотида согласно изобретению или его конъюгата в целях приготовления лекарственного препарата для лечения рака, где указанное лечение также включает введение другого химиотерапевтического средства, выбранного из группы, состоящей из адренокортикостероидов, таких как преднизон, дексаметазон или декадрон; альтретамина (гексалена, гексаметилмеламина (НММ)); амифостина (этиола); аминоглютетимида (цитадрена); амсакрина (Μ-ΑΜ8Α); анастрозола (аримидекса); андрогенов, таких как тестостерон; аспарагиназы (элспара); бациллы Кальметта-Герена; бикалутамида (казодекса); блеомицина (бленоксана); бусульфана (милерана); карбоплатина (параплатина); кармустина (ВСNυ, Βίί,’Νυ); хлорамбуцила (лейкерана); хлордезоксиаденозина (2-’ΌΑ, кладрибина, лейстатина); цисплатина (платинола); арабинозида цитозина (цитарабина); дакарбазина (ΌΤΚ.’); дактиномицина (актиномицина-Ό, космегена); даунорубицина (церубидина); доцетаксела (таксотера); доксорубицина (адриомицина); эпирубицина; эстрамустина (эмцита); эстрогенов, таких как диэтилстильбестрол (ΌΕ8); этопсида (УР-16, вепезида, этопофоса); флударабина (флудары); флутамида (эйлексина); 5-ΕυΌΚ (флоксуридина); 5-фторурацила (5-Ευ); гемцитабина (гемзара); гозерелина (зодалекса); герцептина (трастузумаба); гидроксимочевины (гидреи); идарубицина (идамицина); ифосфамида; 1Ь-2 (пролейкина, альдеслейкина); интерферона-альфа (интрона А, роферона А); иринотекана (камптозара); лейпролида (лупрона); левамизола (эргамизола); ломустина (’’Νυ); мехлоретамина (мустаргена, азотного аналога горчичного газа); мелфалана (алкерана); меркаптопурина (пуринетола, 6-МР); метотрексата (мексата); митомицина-С (мутамицина); митоксантрона (новантрона); октреотида (сандостатина); пентостатина (2-дезоксикоформицина, нипента); пликамицина (митрамицина, митрацина); пророкарбазина (матулана); стрептозоцина; тамоксифина (нолвадекса); таксола (паклитаксела); тенипозида (вумона, УМ-26); тиотепы; топотекана (гикамтина); третиноина (везаноида, полностью трансретиноевой кислоты); винбластина (валбана); винкристина (онковина) и винорелбина (навелбина). В соответствии с этим указанное лечение также включает введение другого химиотерапевтического средства, выбранного из таксанов, таких как таксол, паклитаксел или доцетаксел.
Альтернативно, настоящее изобретение также относится к способу лечения рака, где указанный способ включает введение олигонуклеотида согласно изобретению или его конъюгата или фармацевтической композиции согласно изобретению пациенту, нуждающемуся в таком лечении, а также введение другого химиотерапевтического средства. Такой способ может включать введение дополнительного химиотерапевтического средства, конъюгированного с соединением согласно изобретению и присутствующего в фармацевтической композиции или вводимого в виде отдельного препарата.
- 36 015570
Инфекционные заболевания.
Считается, что соединения согласно изобретению могут быть использованы для лечения инфекционных заболеваний широкого ряда, таких как дифтерия, столбняк, коклюш, полиомиелит, гепатит В, гепатит С, инфекция, вызываемая ΗетορЬ^1и8 ^ηΠиеηζа. корь, паротит и коревая краснуха.
Олигонуклеотид Н8а-т1К-122 показан для лечения инфекций, вызываемых вирусом гепатита С, а, по существу, все олигонуклеотиды согласно изобретению, направленные против т1К-122, могут быть использованы для лечения инфекций, вызываемых вирусом гепатита С.
В соответствии с этим в еще одном своем аспекте настоящее изобретение относится к применению олигонуклеотида согласно изобретению или его конъюгата в целях приготовления лекарственного средства для лечения инфекционного заболевания, а также к способу лечения инфекционного заболевания, включающему введение олигонуклеотида согласно изобретению или его конъюгата или фармацевтической композиции согласно изобретению пациенту, нуждающемуся в таком лечении.
Воспалительные заболевания.
Воспалительный ответ является главным механизмом защиты организма от поражения инфекционными агентами, такой механизм также играет определенную роль в патогенезе многих острых и хронических заболеваний, включая аутоиммунные расстройства. Несмотря на усилия, предпринимаемые в последнее время для борьбы с патогенами, все еще существует возможность возникновения вспышек воспалительных заболеваний, которые могут иметь тяжелые последствия. А поэтому часто возникает необходимость подавлять симптомы воспалений путем введения противовоспалительных лекарственных средств. Воспаление представляет собой сложный процесс, обычно инициируемый поражением ткани, в основе которого лежит активация большого числа ферментов, увеличение проницаемости сосудов и экстравазация жидкостей крови, миграция клеток и высвобождение химических медиаторов, и все эти факторы вызывают как разрушение, так и репарацию пораженной ткани.
В еще одном своем аспекте настоящее изобретение относится к применению олигонуклеотида согласно изобретению или его конъюгата в целях приготовления лекарственного препарата для лечения воспалительного заболевания, а также к способу лечения воспалительного заболевания, где указанный способ включает введение олигонуклеотида согласно изобретению или его конъюгата или фармацевтической композиции согласно изобретению пациенту, нуждающемуся в таком лечении.
В одном из предпочтительных вариантов изобретения указанным воспалительным заболеванием является ревматическое заболевание и/или заболевания соединительной ткани, такие как ревматоидный артрит, системная красная волчанка (СКВ) или волчанка, склеродермия, полимиозит, воспалительное заболевание кишечника, дерматомиозит, язвенный колит, болезнь Крона, васкулит, псориатический артрит, эксфолиативный псориатический дерматит, вульгарная пузырчатка и синдром Сьегрена, в частности воспалительное заболевание кишечника и болезнь Крона.
Альтернативно, воспалительным заболеванием может быть неревматическое воспаление, такое как бурсит, синовит, капсулит, тендинит и/или другие воспалительные поражения при бытовых и/или спортивных травмах.
Нарушения метаболизма.
Нарушение метаболизма представляет собой расстройство, вызываемое аккумуляцией химических веществ, продуцируемых в организме. Такие расстройства обычно представляют серьезную опасность, а в некоторых случаях могут приводить к летальному исходу. В других случаях такие расстройства могут замедлять физическое развитие или вызывать умственную отсталось. У большинства детей, страдающих такими расстройствами, сначала не наблюдается явных признаков заболевания. Часто такие расстройства выявляются при соответствующем обследовании новорожденных. При ранней диагностике и соответствующей терапии такие метаболические расстройства часто поддаются эффективному лечению.
В еще одном своем аспекте настоящее изобретение относится к применению олигонуклеотида согласно изобретению или его конъюгата в целях приготовления лекарственного препарата для лечения метаболического расстройства, а также к способу лечения такого расстройства, где указанный способ включает введение олигонуклеотида согласно изобретению или его конъюгата или фармацевтической композиции согласно изобретению пациенту, нуждающемуся в таком лечении.
В одном из предпочтительных вариантов изобретения указанное метаболическое расстройство выбирают из группы, состоящей из амилоидоза, биотинидоза, наследственного заболевания у мужчин, передающегося по менделевскому механизму (он-лайновая база данных о наследовании заболевания по закону Менделя, ΟΜΙΜ, ОнПие МенбеИан [пНегЦансе ίη Маи), синдрома Криглера-Найяра, диабета, болезни Фабри (РаЬгу διιρροΠ & Iпίο^таΐ^οη Сгоир), расстройств, вызываемых нарушением окисления жирных кислот, галактоземии, дефицита глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы (С6РЭ), ацидурии, вызываемой чрезмерной экскрецией глутаровой кислоты (Международная организация по исследованию ацидемии, вызываемой увеличением содержания глутаровой кислоты), глутаровой ацидемии типа Ι, глутаровой ацидемии типа ΙΙ, Ρ-ΗΥΡΌΒΚ - наследственной гипофосфатемии, витамин Ό-резистентного рахита, болезни Краббе, дефицита длинных цепей гидроксиацил-СоА-дегидрогеназы 3 (^СΗЛ^), заболевания группы маннозидозов, болезни кленового сиропа, митохондриальных расстройств, синдромов мукополисахаридоза: болезни Нимана-Пика, органической ацидемии, фенилкетонурии (ΡΚϋ), болезни Помпе,
- 37 015570 порфиринурии, метаболического синдрома, гиперлипидемии и наследственных нарушений липидного обмена, триметиламинурии: синдрома, характеризующегося неприятным запахом тела, отдающим рыбой, и нарушения цикла мочевины (орнитинового цикла).
Заболевания печени.
В еще одном своем аспекте настоящее изобретение относится к применению олигонуклеотида согласно изобретению или его конъюгата в целях приготовления лекарственного препарата для лечения заболевания печени, а также к способу лечения заболевания печени, где указанный способ включает введение олигонуклеотида согласно изобретению или его конъюгата или фармацевтической композиции согласно изобретению пациенту, нуждающемуся в таком лечении.
В одном из предпочтительных вариантов изобретения заболевание печени выбрано из группы, состоящей из билиарной атрезии, синдрома Алажилля, заболевания, ассоциированного с присутствием альфа-1-антитрипсина, тирозинемии, гепатита новорожденных и болезни Вильсона.
Другие применения.
Олигонуклеотиды согласно изобретению могут быть использованы в исследованиях в качестве тест-реагентов для диагностики, терапии и профилактики заболеваний. В исследовании указанный олигонуклеотид может быть использован для специфического ингибирования синтеза генов-мишеней в клетках и у экспериментальных животных, и такое его применение облегчает проведение функционального анализа данной мишени или оценку ее эффективности в качестве мишени для терапевтического лечения. В диагностике указанные олигонуклеотиды могут быть использованы для детектирования и количественной оценки экспрессии данной мишени в клетках и в тканях с помощью нозерн-блотанализа, гибридизации ίη δίΐιι или аналогичными методами. В терапии животному или человеку с подозрением на заболевание или расстройство, которое может быть подвергнуто лечению путем модуляции экспрессии мишени, может быть назначено лечение, включающее введение олигонуклеотидных соединений согласно изобретению. Кроме того, настоящее изобретение относится к способам лечения животного, в частности мыши и крысы, и человека с подозрением на заболевание или состояние или человека с предрасположенностью к заболеванию или состоянию, ассоциированному с экспрессией данной мишени, где указанный способ включает введение терапевтически или профилактически эффективного количества одного или нескольких олигонуклеотидных соединений или композиций согласно изобретению.
Терапевтическое применение олигонуклеотидов, нацеленных против т1К-122а.
В разделе Примеры продемонстрировано, что олигонуклеотид ΕΝΑ-ηηΙίιηίΕ™. такой как 8РС3372, нацеленный на т1К-122а, способствует снижению уровней холестерина в плазме. Поэтому в другом своем аспекте настоящее изобретение относится к применению вышеописанных олигонуклеотидов, нацеленных на т1К-122а-мишень, в качестве лекарственного средства.
В еще одном своем аспекте настоящее изобретение относится к применению вышеописанных олигонуклеотидов, нацеленных на т1К-122а-мишень, в целях приготовления лекарственного препарата для снижения повышенных уровней холестерина в плазме. Для специалиста-медика очевидно, что повышенный уровень холестерина в плазме является нежелательным фактором, поскольку он приводит к увеличению риска возникновения различных патологий, например атеросклероза.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к применению вышеописанных олигонуклеотидов, нацеленных на т1К-122а-мишень, в целях позитивной регуляции уровней мРНК №бд3, А1бо А, Вскбк или СИ320.
Другие варианты осуществления
Нижеследующие варианты настоящего изобретения могут быть объединены с другими его вариантами, описанными в настоящем изобретении.
1. Олигонуклеотид, имеющий длину 12-26 нуклеотидов и содержащий коровую ДНКпоследовательность, в положениях 2-7 или в положениях 3-8 от 3'-конца, асдй!, где по меньшей мере один, например один, а предпочтительно по меньшей мере два, например два или три, остатка ДНК в указанной последовательности были заменены соответствующими остатками ^NΑ, или его конъюгат.
2. Олигонуклеотид, имеющий длину 12-26 нуклеотидов и содержащий коровую ДНКпоследовательность, в положениях 2-7 или в положениях 3-8 от 3'-конца, с!саса, где по меньшей мере один, например один, а предпочтительно по меньшей мере два, например два или три, остатка ДНК в указанной последовательности были заменены соответствующими остатками ^NΑ, или его конъюгат.
3. Олигонуклеотид, имеющий длину 12-26 нуклеотидов и содержащий коровую ДНКпоследовательность, в положениях 2-7 или в положениях 3-8 от 3'-конца, йасда, где по меньшей мере один, например один, а предпочтительно по меньшей мере два, например два или три, остатка ДНК в указанной последовательности были заменены соответствующими остатками ^NΑ, или его конъюгат.
4. Олигонуклеотид, имеющий длину 12-26 нуклеотидов и содержащий коровую ДНКпоследовательность в положениях 2-7 или вт положениях 3-8 от 3'-конца, асаадс, где по меньшей мере один, например один, а предпочтительно по меньшей мере два, например два или три, остатка ДНК в указанной последовательности были заменены соответствующими остатками ^NΑ, или его конъюгат.
- 38 015570
5. Олигонуклеотид по любому из вариантов 1-4 или его конъюгат, где по меньшей мере два, например два или три, остатка ДНК в положениях 1-6, 2-7 или 3-8 от 3'-конца были заменены соответствующими остатками ΕΝΑ и где указанные остатки ΕΝΑ разделены по меньшей мере одним остатком ДНК.
6. Олигонуклеотид согласно варианту 5 или его конъюгат, в котором число смежных остатков ДНК в положениях 1-6, 2-7 или 3-8 от 3'-конца составляет максимум два.
7. Олигонуклеотид согласно варианту 6 или его конъюгат, в котором каждый второй нуклеотид в положениях 1-6, 2-7 или 3-8 от 3'-конца представляет собой остаток ΕΝΑ.
8. Олигонуклеотид согласно варианту 6 или его конъюгат, в котором каждый третий нуклеотид в положениях 1-6, 2-7 или 3-8 от 3'-конца представляет собой остаток ΕΝΑ.
9. Олигонуклеотид согласно варианту 6 или его конъюгат, в котором тип замены нуклеотидов в положениях 1-6, 2-7 или 3-8 от 3'-конца выбран из группы, состоящей из ххХххХ, ххХхХх, хХххХх, хХхХхх, ХххХхх, хХхХхХ, ХхХхХх, ХххХхХ и ХхХххХ, где X означает остаток ΕΝΑ, а х означает остаток ДНК.
10. Олигонуклеотид согласно варианту 9 или его конъюгат, в котором тип замены нуклеотидов в положениях 1-6, 2-7 или 3-8 от 3'-конца выбран из группы, состоящей из ххХххХ, хХххХх, ХххХхх, хХхХхХ и ХхХхХх, где X обозначает остаток ΕΝΑ, а х обозначает остаток ДНК.
11. Олигонуклеотид согласно варианту 1 или его конъюгат, имеющий последовательность ДНК в положениях 1-7, 2-8 или 3-9 от 3'-конца, асдШа, где по меньшей мере один, например один, предпочтительно по меньшей мере два, например два, более предпочтительно по меньшей мере три, например три или четыре, остатка ДНК в указанной последовательности были заменены соответствующими остатками ΕΝΑ.
12. Олигонуклеотид согласно варианту 2 или его конъюгат, имеющий последовательность ДНК в положениях 1-7, 2-8 или 3-9 от 3'-конца, с!сасас, где по меньшей мере один, например один, предпочтительно по меньшей мере два, например два, более предпочтительно по меньшей мере три, например три или четыре, остатка ДНК в указанной последовательности были заменены соответствующими остатками ΕΝΑ.
13. Олигонуклеотид согласно варианту 3 или его конъюгат, имеющий последовательность ДНК в положениях 1-7, 2-8 или 3-9 от 3'-конца, йасда!, где по меньшей мере один, например один, предпочтительно по меньшей мере два, например два, более предпочтительно по меньшей мере три, например три или четыре, остатка ДНК в указанной последовательности были заменены соответствующими остатками ΕΝΑ.
14. Олигонуклеотид согласно варианту 4 или его конъюгат, имеющий последовательность ДНК в положениях 1-7, 2-8 или 3-9 от 3'-конца, асаадса, где по меньшей мере один, например один, предпочтительно по меньшей мере два, например два, более предпочтительно по меньшей мере три, например три или четыре, остатка ДНК в указанной последовательности были заменены соответствующими остатками ΕΝΑ.
15. Олигонуклеотид согласно любому из вариантов 11-14 или его конъюгат, где по меньшей мере два, например два, три или четыре, остатка ДНК в положениях 1-7, 2-8 или 3-9 от 3'-конца были заменены соответствующими остатками ΕΝΑ и где указанные остатки ΕΝΑ разделены по меньшей мере одним остатком ДНК.
16. Олигонуклеотид согласно варианту 15 или его конъюгат, в котором число смежных остатков ДНК в положениях 1-7, 2-8 или 3-9 от 3'-конца составляет максимум два.
17. Олигонуклеотид согласно варианту 16 или его конъюгат, в котором каждый второй нуклеотид в положениях 1-7, 2-8 или 3-9 от 3'-конца представляет собой остаток ΕΝΑ.
18. Олигонуклеотид согласно варианту 16 или его конъюгат, в котором каждый третий нуклеотид в положениях 1-7, 2-8 или 3-9 от 3'-конца представляет собой остаток ΕΝΑ.
19. Олигонуклеотид согласно варианту 16 или его конъюгат, в котором тип замены нуклеотидов в положениях 1-7, 2-8 или 3-9 от 3'-конца выбран из группы, состоящей из ххХххХх, ххХхХхх, хХххХхх, ххХхХхХ, хХххХхХ, хХхХххХ, хХхХхХх, ХххХххХ, ХххХхХх, ХхХххХх, ХхХхХхх и ХхХхХхХ, где X обозначает остаток ΕΝΑ, а х обозначает остаток ДНК.
20. Олигонуклеотид согласно варианту 16 или его конъюгат, в котором тип замены нуклеотидов в положениях 1-7, 2-8 или 3-9 от 3'-конца выбран из группы, состоящей из ххХххХх, хХххХхх, ХххХххХ, хХхХхХх, ХхХхХхХ и ХхХхХхх, где X обозначает остаток ΕΝΑ, а х обозначает остаток ДНК.
21. Олигонуклеотид согласно, варианту 11 или его конъюгат, имеющий последовательность ДНК в положениях 1-8, 2-9 или 3-10 от 3'-конца, асдШад, где по меньшей мере один, например один, предпочтительно по меньшей мере два, например два, более предпочтительно по меньшей мере три, например три или четыре, остатка ДНК в указанной последовательности были заменены соответствующими остатками ΕΝΑ.
- 39 015570
22. Олигонуклеотид согласно варианту 12 или его конъюгат, имеющий последовательность ДНК в положениях 1-8, 2-9 или 3-10 от 3'-конца, с!сасас!, где по меньшей мере один, например один, предпочтительно по меньшей мере два, например два, более предпочтительно по меньшей мере три, например три или четыре, остатка ДНК в указанной последовательности были заменены соответствующими остатками ^NΑ.
23. Олигонуклеотид согласно варианту 13 или его конъюгат, имеющий последовательность ДНК в положениях 1-8, 2-9 или 3-10 от 3'-конца, йасдай, где по меньшей мере один, например один, предпочтительно по меньшей мере два, например два, более предпочтительно по меньшей мере три, например три или четыре, остатка ДНК в указанной последовательности были заменены соответствующими остатками 1№.
24. Олигонуклеотид согласно варианту 14 или его конъюгат, имеющий последовательность ДНК в положениях 1-8, 2-9 или 3-10 от 3'-конца, асаадсаа, где по меньшей мере один, например один, предпочтительно по меньшей мере два, например два, более предпочтительно по меньшей мере три, например три или четыре, остатка ДНК в указанной последовательности были заменены соответствующими остатками ^NΑ.
25. Олигонуклеотид согласно любому из вариантов 21-24 или его конъюгат, где по меньшей мере два, например два, три или четыре, остатка ДНК в положениях 1-8, 2-9 или 3-10 от 3'-конца были заменены соответствующими остатками ^NΑ и где указанные остатки ^NΑ разделены по меньшей мере одним остатком ДНК.
26. Олигонуклеотид согласно варианту 25 или его конъюгат, в котором число смежных остатков ДНК в положениях 1-8, 2-9 или 3-10 от 3'-конца составляет максимум два.
27. Олигонуклеотид согласно варианту 26 или его конъюгат, в котором каждый второй нуклеотид в положениях 1-8, 2-9 или 3-10 от 3'-конца представляет собой остаток ^NΑ.
28. Олигонуклеотид согласно варианту 26 или его конъюгат, в котором каждый третий нуклеотид в положениях 1-8, 2-9 или 3-10 от 3'-конца представляет собой остаток ^NΑ.
29. Олигонуклеотид согласно варианту 26 или его конъюгат, в котором тип замены нуклеотидов в положениях 1-8, 2-9 или 3-10 от 3'-конца выбран из группы, состоящей из ххХххХхх, ххХххХхХ, ххХхХххХ, ххХхХхХх, хХххХххХ, хХххХхХх, хХхХххХх, хХхХхХхх, ХххХххХх, ХххХхХхх, ХхХххХхх, хХхХхХхХ, ХхХхХххХ, ХхХххХхХ, ХххХхХхХ и ХхХхХхХх, где X обозначает остаток ^NΑ, а х обозначает остаток ДНК.
30. Олигонуклеотид согласно варианту 29 или его конъюгат, в котором тип замены нуклеотидов в положениях 1-8, 2-9 или 3-10 от 3'-конца выбран из группы, состоящей из ххХххХхх, хХххХххХ, ХххХххХх, хХхХхХхХ, ХхХхХхХх и ХхХхХххХ, где X обозначает остаток ^NΑ, а х обозначает остаток ДНК.
31. Олигонуклеотид согласно варианту 21 или его конъюгат, имеющий последовательность ДНК в положениях 1-9, 2-10 или 3-11 от 3'-конца, асдШадд, где по меньшей мере один, например один, предпочтительно по меньшей мере два, например два, более предпочтительно по меньшей мере три, например три, еще более предпочтительно по меньшей мере четыре, например четыре или пять, остатков ДНК в указанной последовательности были заменены соответствующими остатками ^NΑ.
32. Олигонуклеотид согласно варианту 22 или его конъюгат, имеющий последовательность ДНК в положениях 1-9, 2-10 или 3-11 от 3'-конца, с!сасас!д, где по меньшей мере один, например один, предпочтительно по меньшей мере два, например два, более предпочтительно по меньшей мере три, например три, еще более предпочтительно по меньшей мере четыре, например четыре или пять, остатков ДНК в указанной последовательности были заменены соответствующими остатками ^NΑ.
33. Олигонуклеотид согласно варианту 23 или его конъюгат, имеющий последовательность ДНК в положениях 1-9, 2-10 или 3-11 от 3'-конца, йасдайа, где по меньшей мере один, например один, предпочтительно по меньшей мере два, например два, более предпочтительно по меньшей мере три, например три, еще более предпочтительно по меньшей мере четыре, например четыре или пять, остатков ДНК в указанной последовательности были заменены соответствующими остатками ^NΑ.
34. Олигонуклеотид согласно варианту 24 или его конъюгат, имеющий последовательность ДНК в положениях 1-9, 2-10 или 3-11 от 3'-конца, асаадсаад, где по меньшей мере один, например один, предпочтительно по меньшей мере два, например два, более предпочтительно по меньшей мере три, например три, еще более предпочтительно по меньшей мере четыре, например четыре или пять, остатков ДНК в указанной последовательности были заменены соответствующими остатками ^NΑ.
35. Олигонуклеотид согласно любому из вариантов 21-24 или его конъюгат, где по меньшей мере два, например два, три, четыре или пять, остатка ДНК в положениях 1-9, 2-10 или 3-11 от 3'-конца были заменены соответствующими остатками ^NΑ и где указанные остатки ^NΑ разделены по меньшей мере одним остатком ДНК.
36. Олигонуклеотид согласно варианту 35 или его конъюгат, в котором число смежных остатков ДНК в положениях 1-9, 2-10 или 3-11 от 3'-конца составляет максимум два.
- 40 015570
37. Олигонуклеотид согласно варианту 36 или его конъюгат, в котором каждый второй нуклеотид в положениях 1-9, 2-10 или 3-11 от 3'-конца представляет собой остаток ΕΝΑ.
38. Олигонуклеотид согласно варианту 36 или его конъюгат, в котором каждый третий нуклеотид в положениях 1-9, 2-10 или 3-11 от 3'-конца представляет собой остаток ΕΝΑ.
39. Олигонуклеотид согласно варианту 36 или его конъюгат, в котором тип замены нуклеотидов в положениях 1-9, 2-10 или 3-11 от 3'-конца выбран из группы, состоящей из ххХххХххХ, ххХххХхХх, ххХхХххХх, ххХхХхХхх, хХххХххХх, хХххХхХхх, хХхХххХхх, ХххХххХхх, ххХхХхХхХ, хХххХхХхХ, хХхХххХхХ, хХхХхХххХ, ХххХххХхХ, ХххХхХххХ, ХхХххХххХ, ХххХхХхХх,
ХхХххХхХх, ХхХхХххХх, ХхХхХхХхх и ХхХхХхХхХ, где X обозначает остаток ΕΝΑ, а х обозначает остаток ДНК.
40. Олигонуклеотид согласно любому из предыдущих вариантов или его конъюгат, где указанный олигонуклеотид имеет длину от 12 до 24 нуклеотидов, например от 12 до 22 нуклеотидов, предпочтительно от 12 до 20 нуклеотидов, например от 12 до 19 нуклеотидов, более предпочтительно от 12 до 18 нуклеотидов, например от 12 до 17 нуклеотидов, а еще более предпочтительно от 12 до 16 нуклеотидов.
41. Олигонуклеотид согласно варианту 1, имеющий последовательность, выбранную из группы, состоящей из
ЕдМеСаЕСдаТЕЕСсаМеСа, ЕдМеСаЕСдаТЕЕСсаМеС, МеСаЕСдаТЕЕСсаМеС,
ЕСсАЕСдАЕТЕСсАс, сАЕСдАЕТЕСсАс, МеСаЕССаЕТЕСсАМеС,
ТдМеСаЕССаЕТЕСсАМеС и
ТдМеСаТдСаТТЕСсАСа, где строчные буквы обозначают азотистое основание остатка ДНК, а прописные буквы обозначают азотистое основание остатка ΕΝΑ;
или его конъюгат (8ΕΡ ΙΌ ΝΟ: 82-89).
42. Олигонуклеотид согласно варианту 2, имеющий последовательность, выбранную из группы, состоящей из сМеСаТТдЕСасАсЕМеСса, сМеСаЕТдЕМеСасАсЕМеСс, АЕЕСЕсАсаМеСЕсМеС, сМеСаЕТдЕАасТсЕМеСса, аЕТдЕМеСасАсЕМеСс, аТЕСЕМеСаСаМеСЕМеСс, ссАЕЕСЕсАсаМеСЕсМеСа, ссАЕЕСЕсАсаМеСЕсМеС, АЕЕСТсаМеСаМеСЕМеСМеС,
Ме,
МеСМеСАЕЕдЕсасасТМеСМеСа;
где строчные буквы обозначают азотистое основание остатка ДНК, а прописные буквы обозначают азотистое основание остатка ΕΝΑ;
или его конъюгат (8ΕΡ ГО ΝΟ: 90-101).
43. Олигонуклеотид согласно варианту 3, имеющий последовательность, выбранную из группы, состоящей из
ЕМеСасСаЕТадМеСаЕТаа, аТсаМеСдаТЕа6саТЕа, ТсАсСаТЕАдМеСаТЕАа, АЕсАсСаТЕАдМеСаТЕа, где строчные буквы обозначают азотистое основание остатка ДНК, а прописные буквы обозначают азотистое основание остатка ΕΝΑ;
или его конъюгат (8ΕΡ ГО ΝΟ: 102-105).
44. Олигонуклеотид согласно варианту 4, имеющий последовательность, выбранную из группы, состоящей из дАдсМеСдаАсдАасАа, дсМеСдаАсдАасАа, СаСсМеСдАаМеСдАаМеСаА,
СсМеСдАаМеСдАаМеСаА, где строчные буквы обозначают азотистое основание остатка ДНК, а прописные буквы обозначают азотистое основание остатка ΕΝΑ;
или его конъюгат (8ΕΡ ГО ΝΟ: 106-109).
45. Олигонуклеотид согласно любому из предыдущих вариантов или его конъюгат, где указанный олигонуклеотид включает по меньшей мере одну межнуклеозидную связывающую группу, которая не является фосфодиэфиром.
46. Олигонуклеотид согласно варианту 45 или его конъюгат, где указанная межнуклеозидная связывающая группа, не являющаяся фосфодиэфиром, представляет собой фосфортиоат.
47. Олигонуклеотид согласно варианту 46 или его конъюгат, где все межнуклеозидные связывающие группы представляют собой фосфортиоат.
48. Олигонуклеотид согласно любому из предыдущих вариантов или его конъюгат, где указанные остатки ΕΝΑ независимо выбраны из группы, состоящей из тио-^NΑ-остатков, амино-^NΑ-остатков и окси-ΕΝ Α-остатков.
49. Олигонуклеотид согласно варианту 48 или его конъюгат, где указанные остатки ΕΝΑ присутствуют в бетаГО-форме.
- 41 015570
50. Олигонуклеотид согласно варианту 48 или его конъюгат, где указанные остатки ЬЫА представляют собой окси-ЬЫА-остатки, присутствующие в бета-Б-форме.
51. Олигонуклеотид согласно любому из предыдущих вариантов или его конъюгат, которые могут быть использованы в качестве лекарственного препарата.
52. Фармацевтическая композиция, содержащая олигонуклеотид согласно любому из вариантов 150 или его конъюгат и фармацевтически приемлемый носитель.
53. Композиция согласно варианту 52, где указанным носителем является физиологический раствор или забуференный физиологический раствор.
54. Применение олигонуклеотида согласно любому из вариантов 1-50 или его конъюгата или композиции согласно варианту 52 в целях приготовления лекарственного препарата для лечения рака.
55. Способ лечения рака, включающий стадию введения олигонуклеотида по любому из вариантов 1-50 или его конъюгата или композиции согласно варианту 52.
56. Применение олигонуклеотида согласно любому из вариантов 1-50 или его конъюгата или композиции согласно варианту 52 в целях приготовления лекарственного препарата для лечения заболевания, ассоциированного с повышенными уровнями холестерина в плазме.
57. Применение олигонуклеотида согласно любому из вариантов 1-50 или его конъюгата, или композиции согласно варианту 52 для позитивной регуляции уровней мРНК ЫгбдЗ, А1бо А, Вскбк или СБЗ20.
Экспериментальная часть
Пример 1. Синтез мономеров.
Структурные блоки ЬЫА-мономера и их производные получали в соответствии с процедурами, описанными и указанными в литературе, см., например, АО 0З/095467 А1 и Б.8. Ребегкеп, С. ЯокепЬокт, Т. КосН (2002), Ргерагабоп ок ЬЫА Ркокркогат1бйек, 8уп1Нек18, 6, 802-808.
Пример 2. Синтез олигонуклеотидов.
Олигонуклеотиды синтезировали фосфорамидитным методом на синтезаторе Ехребйе 8900/МО88 (МиШр1е О11допис1еоббе 8уп111ек1к 8ук1ет) в масштабе 1 мкмоль или 15 мкмоль. Для более крупномасштабного синтеза использовали синтезатор Ак!а О11до Рбо! (СЕ НеаНксаге). По окончании синтеза (БМТ-оп) олигонуклеотиды отщепляли от твердого носителя с использованием водного аммиака в течение 1-2 ч при комнатной температуре, а затем подвергали реакции снятия защиты в течение 4 ч при 65°С. Олигонуклеотиды очищали с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ (ОФ-ВЭЖХ). После удаления группы БМТ олигонуклеотиды охарактеризовывали с помощью анионообменной ВЭЖХ, ОФ-ВЭЖХ и электрофореза в полиакриламидном геле (ССЕ), а молекулярную массу дополнительно подтверждали с помощью Е81-М8. Более подробно см. ниже.
Получение ЬЫА на твердом носителе.
Получение неполного сукцинилового эфира ЬЫА.
Мономер 5'-О-Бт!-З'-гидрокси-ЬЫА (500 мг), ангидрид янтарной кислоты (1,2 экв.) и БМАР (1,2 экв.) растворяли в ДХМ (З5 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. После экстрагирования 0,1 М ЫаН2РО4, рН 5,5 (2х) и раствором соли (1х) органический слой сушили безводным Ыа28О4, фильтровали и упаривали. Производное неполного эфира получали с выходом 95% и использовали без дополнительной очистки.
Получение ЬЫА на носителе.
Производное неполного эфира, полученное, как описано выше (90 мкмоль), растворяли в минимальном количестве ДМФ, добавляли Б1ЕА и руВОР (90 мкмоль) и смешивали в течение 1 мин. Эту предварительно активированную смесь объединяли с ЬСАА-СРС (500 А, размер пор 80-120 меш, З00 мг) в лабораторном синтезаторе и перемешивали. После выдерживания в течение 1,5 ч при комнатной температуре носитель отфильтровывали и промывали ДМФ, ДХМ и МеОН. После сушки загрузка составляла 57 мкмоль/г (см. Тот Вгочп, Богсак 18. Вгочп. Мобет тасЫпе-а1беб тебюбк ок о11добеохупЬопис1еоббе кугИНекЬ. 1п: Е. Ескк!ет, ебйог. О11допис1еоббек апб Апа1одиек А Ргасбса1 Арргоасй. Охкогб: ШЬ Ргекк, 1991: 1З-14).
Удлинение олигонуклеотида.
Взаимодействие фосфорамидитов (А(Ь/), С(1Ьи), 5-метил-С(Ьх)) или Т-в-цианоэтилфосфорамидита) осуществляли с использованием раствора 0,1 М 5'-О-БМТ-защищенного амидита в ацетонитриле и БС1 (4,5-дицианоимидазола) в ацетонитриле (0,25 М) в качестве активатора. Реакцию тиолирования проводили с использованием хлорида ксантана (0,01 М в ацетонитриле :пиридине, 10%). Оставшиеся реагенты обычно использовали для синтеза олигонуклеотидов.
- 42 015570
Очистка с помощью ОФ-ВЭЖХ.
Колонка:
Скорость потока:
Буферы:
Сокращения:
ΌΜΤ:
0С1:
ϋΜΑΡ:
ДХМ (ОСМ):
ДМФ (ЭМГ):
ТГФ (ТНЕ) :
ϋΙΕΑ:
РуВОР:
Βζ:
1Ьи:
ХСегга КР18 мл/мин
0,1 М ацетат аммония, рН 8, и ацетонитрил
Диметокситритил
4,5-дицианоимидазол
4-диметиламинопиридин
Дихлорметан
Диметилформамид
Тетрагидрофуран
Ν, Ν- диизопропилэтиламин
Гексафторфосфат бензотриазол-1-ил-окситрис-пирролидинофосфония
Бензоил .
Изобутирил
Пример З. Конструирование ΕΝΑ-олигонуклеотидов против т1К и температуры плавления микроРНК-мишень:
гп1К.-122а: 5'-иддадидидасааиддидиииди-3' 5Е<2 Ιϋ ΝΟ: 1 ш1К-122а, в 3' -идииидиддиаасадидидадди-5' (ЗЕ<2 Ιϋ N0: 1 ориентации 3'-5': в обратной ориентации)
Таблица 1
Олигонуклеотидные последовательности ΕΝΑ-αηΐ^ΐΚ и Тт
ЗЕф 10 N0: ОПдо ю 3Εϋ Ιϋ Последовательность: Тт т
2 ЗРС3370 конструкция ЗЕ<2 Ю 56 5' - РЗ- 75
ХххХ сСаГТдГСасАсССса-З' остов
3 5РС3372 конструкция 5Е<2 Ю 57 5' - РЗ- 69
ХххХ ссАСбСбсАсаСЬсСа-З' остов
4 5РС3375 Гэп-мер 3ΕΏ Ю 58 5' - РЗ- 69
ССАббдСсасасТССа-З' остов
5 5РС3549 15-мер ЗЕО 10 59 5'-СсАГГСТсаСаСГСС- РЗ- 78
3' остов
6 ЗРС3550 контроль с 3Εζ) 10 60 5'-СсАГГСТдаСсССАС- РЗ- 32
несоответ 3' остов
ствиями
7 5РС3373 контроль с 3Εζ2 Ιϋ 61 5' - РЗ- 46
несоответ ссАГГССсТсаАСсСа-3' остов
ствиями
8 ЗРС3548 13-мер 5Е<2 ю 62 5' -АЕЮТсаСаСбСС-З' РЗ-
остов
Строчные буквы: ДНК; прописные буквы: ΕΝΑ (все цитозины (С) ΕΝΑ были метилированными), подчеркнуто: несоответствия.
- 4З 015570
Температуры плавления зрелой последовательности тЖ-122а определяли с использованием синтетического РНК-олигонуклеотида против тЖ-122а с фосфортиоатными связями.
Дуплекс ΕΝΑ-олигонуклеотидов против т^Κ/т^Κ-122а разводили до 3 мкМ в 500 мкл РНКазы, не содержащей Н2О, а затем смешивали с 500 мкл 2х буфера для димеризации (конечная концентрация олигонуклеотидного дуплекса = 1,5 мкМ, 2х Тт-буфер: 200 мМ КаС1, 0,2 мМ ΕΌΤΑ, 20 мМ ХаР. рН 7,0, ЭБРС-обработка для удаления РНКаз). Полученную смесь сначала нагревали до 95°С в течение 3 мин, а затем охлаждали при комнатной температуре (к.т.) в течение 30 мин.
После инкубирования при комнатной температуре Тт измеряли на спектрофотометре БатЬйа 40 иУ/У18, снабженном устройством для программирования температур РТР6 РеШег, осуществляемого с помощью компьютерной программы РЕ Тетр1аЬ (Регкт Б1тег). Температуру повышали с 20 до 95°С, а затем снова снижали до 20°С и при этом непрерывно регистрировали абсорбцию при 260 нм. Для определения температуры плавления/отжига (Тт) использовали производную первого порядка и локальные максимумы функции температур плавления и отжига, которые должны давать аналогичные/одинаковые значения Тт. Кривую для производной первого порядка строили по 91 точке.
Для определения Тт для других олигонуклеотидов, таких как олигонуклеотиды согласно изобретению, может быть применен вышеуказанный анализ с заменой олигонуклеотида против тЖ и комплементарной молекулы РНК.
Однако в одном из вариантов изобретения Тт может быть определена с использованием комплементарной молекулы ДНК (с фосфортиоатными связями). Обычно Тт комплементарной молекулы ДНК примерно на 10°С меньше, чем Тт эквивалентного РНК-комплемента. Следовательно, Тт, измеренная с использованием ДНК-комплемента, может быть использована в тех случаях, когда дуплекс имеет очень высокую Тт (табл. 2)
Определение температур плавления (Тт)
Олигонуклеотид против РНК-комплемента πιϊΚ-122 Тт
ЗРС3372 + ш1К-122а, РНК 69°С
ЗРС3648 + ш1К-122а, РНК 74°С
ЗРС3649 + ш1К-122а, РНК 7 9°С
Олигонуклеотид против ДНК-комплемента тт
ЗРС3372 + 122К, ДНК 57°С
ЗРС3649 + 122К, ДНК 6 6°С
Известно, что если использовать олигонуклеотиды с очень высокими Тт, то для определения Тт недостаточно проведения лишь вышеуказанных анализов. В этом случае использование комплементарной ДНК-молекулы с фосфортиоатными связями может приводить к снижению значений Тт.
В анализе на гибридизацию олигонуклеотидов обычно используется формамид (см. Нийоп, 1977, ΝΑ., 4 (10), 3537-3555). В вышеуказанном анализе включение 15% формамида обычно приводит к снижению Тт примерно на 9°С, а включение 50% формамида обычно приводит к снижению Тт примерно на 30°С. Поэтому, используя такие соотношения, можно определить сравнительную Тт олигонуклеотида по отношению к его комплементарной молекуле РНК (с фосфодиэфирной связью), даже если Тт дуплекса, например, выше 95°С (в отсутствие формамида).
Для олигонуклеотидов с очень высокой Тт используют альтернативный метод определения Тт, который включает титрование и электрофорез в геле, проводимый для идентификации одной цепи от дуплекса, и по их концентрациям и отношениям определяют Кй (константу диссоциации), которая соответствует йе1!аС, а также Тт.
Пример 4. Стабильность ΕΝΑ-олигонуклеотидов в плазме человека или крыс.
Олигонуклеотид ΕΝΑ тестировали на стабильность в плазме человека или крыс (можно также использовать плазму мышей, обезьян или собак). В 45 мкл плазмы добавляли 5 мкл ΕΝΑ-олигонуклеотида (при конечной концентрации 20 мкМ). ΕΝΑ-олигонуклеотиды инкубировали в плазме в течение 0-96 ч при 37°С (плазму тестировали на нуклеазную активность в течение периода времени до 96 ч, и этот тест не выявил каких-либо различий в характере расщепления нуклеазой).
В указанное время образец быстро замораживали в жидком азоте. 2 мкл (=40 пмоль) ΕΝΑолигонуклеотида в плазме разводили путем добавления 15 мкл воды и 3 мкл 6х загрузочного красителя (1пу11годеп). В качестве маркера использовали 10 п.н.-лэддер (1пуйгодеп, ϋ8Α, 10821-015). К 1 мкл лэддера добавляли 1 мкл 6х загрузочного красителя и 4 мкл воды. Образцы смешивали, нагревали до 65°С в течение 10 мин и загружали на предварительно полученный гель для электрофореза (16% акриламид, 7 М мочевина, 1х ТВЕ, предварительный электрофорез при 50 Вт в течение 1 ч) и проводили электрофорез при 50-60 Вт в течение 2,5 ч. Затем гель окрашивали 1хх 8уВ.-золотом (Мо1еси1аг РгоЬез) в 1х ТВЕ в течение 15 мин. Полосы визуализировали с использованием люминесцентного визуализатора от ВюЯай.
- 44 015570
Пример 5. Ιη νίΐΓο модель: клеточная культура.
Влияние ΌΝΑ-олигонуклеотидов на экспрессию нуклеиновой кислоты-мишени (количественную экспрессию) может быть проанализировано в клетках любых типов при условии, что такая нуклеиновая кислота-мишень присутствует на измеримых уровнях. Мишень может экспрессироваться эндогенно или посредством временной или стабильной трансфекции нуклеиновой кислоты, кодирующей указанную нуклеиновую кислоту.
Уровень экспрессии нуклеиновой кислоты-мишени может быть рутинно определен с помощью, например, нозерн-блот-анализа (включая нозерн-анализ микроРНК), количественной ПЦР (включая количественную ПЦР микроРНК) и анализов на защиту от рибонуклеазы. Клетки нижеследующих типов используются в иллюстративных целях, однако могут быть использованы клетки и других типов при условии, что в клетке выбранного типа будет экспрессироваться данная мишень.
Клетки культивировали в подходящей среде, описанной ниже, и выдерживали при 37°С, при влажности 95-98% и при 5% СО2. Пассажи клеток проводили рутинным способом 2-3 раза в неделю.
15РС3: Клеточная линия рака человеческой предстательной железы 15РС3 была любезно предоставлена Όγ. Е. Вааз, Лаборатория №ιιΐΌζίηΙιιί^η ЬаЬогаЮгу, ΑΜ^ Нидерланды и была культивирована в среде ΌΜΕΜ (З^та), содержащей 10% фетальную бычью сыворотку (ЕВ8) + глутамакс I + гентамицин.
РС3: Клеточная линия рака человеческой предстательной железы РС3 была закуплена у АТСС и была культивирована в среде Куна Е12, содержащей глутамин (С1Ьсо) + 10% ЕВ8 + гентамицин.
518А2: Клеточная линия человеческой злокачественной меланомы 518А2 была любезно предоставлена Όγ. В. Ланзен (Отдел экспериментальной онкологии, кафедра молекулярной фармакологии, Отделение клинической фармакологии Венского университета) и была культивирована в среде ΌΜΕΜ (Зщта), содержащей 10% фетальную бычью сыворотку (ЕВ8) + глутамакс I + гентамицин.
НеЬа: Клеточную линию карциномы шейки матки НеЬа культивировали в среде ΜΕΜ (З^та), содержащей 10% фетальную бычью сыворотку и гентамицин, при 37°С, влажности 95% и 5% СО2.
МРС-11: Клеточную линию мышиной множественной миеломы МРС-11 закупали у АТСС и выдерживали в среде ΌΜΕΜ, содержащей 4 мМ глутамакса + 10% лошадиной сыворотки.
ΌΌ-145: Клеточную линию рака человеческой предстательной железы ΌΌ-145 закупали у АТСС и выдерживали в среде ΡΓΜΙ, содержащей глутамакс + 10% ЕВ8.
КСС-4+/-УНЬ: Клеточную линию рака почек человека КСС4, стабильно трансфицированную плазмидой, экспрессирующей УНЬ, или пустой плазмидой, закупали у ЕСАСС и поддерживали в соответствии с инструкциями производителей.
786-0: Клеточную линию почечно-клеточной карциномы человека 786-0 закупали у АТСС и поддерживали в соответствии с инструкциями производителей.
НЦУЕС: Клеточную линию эндотелия пупочной вены человека НЦУЕС закупали у Сатсгех и поддерживали в среде ΕΟΜ-2.
К562: Клеточную линию хронического миелогенного лейкоза человека К562 закупали у АТСС и поддерживали в среде ΚΓΜΙ, содержащей глутамакс + 10% ЕВ8.
Ό87ΜΟ: Клеточную линию человеческой глиобластомы Ό87ΜΟ закупали у АТСС и поддерживали в соответствии с инструкциями производителей.
В16: Клеточную линию мышиной меланомы В16 закупали у АТСС и поддерживали в соответствии с инструкциями производителей.
ЬНСар: Клеточную линию рака человеческой предстательной железы ЬМСар закупали у АТСС и поддерживали в среде ΡΓΜΙ, содержащей глутамакс + 10% ЕВ8.
НиН-7: Эпителиальные клетки печени человека культивировали в минимальной поддерживающей среде (ΜΕΜ) Игла, содержащей 10% ЕВ8, 2 мМ глутамакс I, 1х заменимых аминокислот, 25 мкг/мл гентамицина.
Ь428: (Немецкая коллекция микроорганизмов (НКМ, Брауншвейг, Германия)): В-клетки человеческой лимфомы поддерживали в среде ΚΓΜΙ 1640, в которую были добавлены 10% ЕС8, Ь-глутамин и антибиотики.
Ь1236: (Немецкая коллекция микроорганизмов (НКМ, Брауншвейг, Германия)): В-клетки человеческой лимфомы поддерживали в среде ΚΓΜΙ 1640, в которую были добавлены 10% ЕС8, Ь-глутамин и антибиотики.
Пример 6. Ιη νίΐΓο модель: обработка антисмысловым олигонуклеотидом ΌΝΑ, направленным против тЖ.
Клеточную линию НиН-7, экспрессирующую ιπίΚ-122а, трансфицировали олигонуклеотидом ΌΝΑ против тЖ при концентрациях 1 и 100 нМ в соответствии с оптимизированным протоколом, осуществляемым с использованием липофектамина 2000 (ЬЕ2000, Ιηνίίτο^η) (как описано ниже).
Клетки НиН-7 культивировали в среде ΜΕΜ Игла, содержащей 10% ЕВ8, 2 мМ глутамакс Ι, 1х заменимых аминокислот, 25 мкг/мл гентамицина. За 1 день до трансфекции клетки высевали в 6-луночные планшеты (300000 клеток на лунку) в общем объеме 2,5 мл. В день трансфекции приготавливали раствор, содержащий ЬЕ2000, разведенный в среде ОрВтет (Ιηνίίτο^η) (1,2 мл ОрВтет + 3,75 мкл ЬЕ2000
- 45 015570 на лунку, БР2000 в конечной концентрации 2,5 мкг/мл, конечный общий объем 1,5 мл).
Олигонуклеотиды Ь\А (Ь\А против Ш1К) также разводили в среде Орйшеш, содержащей 285 мкл Орйтет + 15 мкл олигонуклеотида Ь\А (10 мкМ маточного раствора олигонуклеотида на конечную концентрацию 100 нМ и 0,1 мкМ на конечную концентрацию 1 нМ). Клетки один раз промывали в среде Орйтет, а затем в каждую лунку добавляли 1,2 мл смеси Орйтеш/ЬР2000. Клетки инкубировали в течение 7 мин при комнатной температуре в смеси БР2000, а затем добавляли раствор 300 мкл олигонуклеотида в Орйтет.
Затем клетки инкубировали в течение 4 ч с олигонуклеотидом и липофектамином 2000 (в стандартном клеточном инкубаторе, при 37°С и 5% СО2). Через 4 ч среду/смесь удаляли и добавляли стандартную полную среду. Клетки оставляли еще на 20 ч для роста. Через 24 ч после трансфекции клетки собирали в тризоле (1иу11годеи). РНК экстрагировали с использованием тризола в соответствии со стандартным протоколом, представленным в инструкциях производителей (1пуПгодеп). в частности, для сохранения микроРНК при экстракции всей РНК.
Пример 7. Ιη νίίΓΟ и ίη νίνο модель: анализ на ингибирование экспрессии ιηίΡ олигонуклеотидами, проводимый с помощью микроРНК-специфической количественной ПЦР.
Уровни ш1К-122а в образцах РНК оценивали на аппарате для быстрой ПЦР в реальном времени АВ1 7500 (Аррйеб Вюзузйтз, И8А) с использованием набора для тгк-122а-специфической количественной ОТ-ПЦР, тнУапа (АтЬюп, И8А) и праймеров для ш1К-122а (АтЬюп, И8А). Эту процедуру проводили в соответствии с инструкциями производителей.
Результаты.
ш1К-122а-специфическая новая конструкция олигонуклеотида Ь\А-аийш1В (т.е. 8РС3349 (также обозначаемая 8РС3549)) была более эффективной для ингибирования ш1К-122а при 1 нМ по сравнению с описанными ранее моделями конструкций, включающих мотивы каждый третий и гэп-мер (8РС3370, 8РС3372, 8РС3375), при концентрации 100 нМ. Контроль с несоответствиями не обнаруживал ингибирования Ш|К-122а (8РС3350). Результаты представлены на фиг. 1.
Пример 8. Оценка специфичности Ь\А-антагониста шгй в отношении ингибирования Ш1К, проводимая по профилю экспрессии миРНК на микромассивах.
A) Мечение РНК для анализа на профиль экспрессии миРНК на микромассивах.
Полноразмерную РНК экстрагировали с использованием реагента тризола (ЗпуЦгодеп) и метили у З'-конца с использованием РНК-лигазы Т4 и Су3- или Су5-меченого РНК-линкера (5'-РО4-гигигиСу3/бТ-3' или 5'-РО4-гигИги-Су5/бТ-3'). Реакционная смесь для мечения содержала 2-5 мкг полноразмерной РНК, 15 мкМ РНК-линкера, 50 мМ трис-НС1 (рН 7,8), 10 мМ МдС12, 10 мМ ДТТ, 1 мМ АТР, 16% полиэтиленгликоля и 5 единиц РНК-лигазы Т4 (АтЬюп, И8А) и эту смесь инкубировали при 30°С в течение 2 ч, а затем РНК-лигазу Т4 подвергали термоинактивации при 80°С в течение 5 мин.
B) Гибридизация микромассива и промывки после гибридизации.
Ь\А-модифицированные зонды для захвата олигонуклеотидов, включая зонды для всех описанных миРНК, имеющихся в базе данных тгКВазе для микроРНК мыши (Миз ши8си1и8) и человека (Ното зархепз), версия 7.1, а также серию зондов позитивного и негативного контроля, закупали у Εχίςοη (Ех1цоп, Эепшагк) и использовали для получения отпечатков микромассивов в целях определения профилей миРНК. Зонды для захвата содержали 5'-концевой С6-аминомодифицированный линкер и были сконструированы так, чтобы зонды, комплементарные миРНК-мишеням, имели Тт 12°С, что было осуществлено путем коррекции содержания Ь\А и длины зондов для захвата. Зонды для захвата разводили до конечной концентрации 10 мкМ в 150 мМ натрийфосфатного буфера (рН 8,5) и наносили пятнами на предметные стекла Собейпк (Атегзйаш Вюзаепсез) при влажности 45% и при комнатной температуре (с четырьмя повторностями) с использованием устройства для создания массивов МюгоСйй II, поставляемого компанией ВюКоЬойсз. Затем предметные стекла с нанесенными на них пятнами обрабатывали в соответствии с рекомендациями производителя.
Меченую РНК гибридизовали с Ь\А-микромассивами в течение ночи при 65°С в смеси для гибридизации, содержащей 4х 88С, 0,1% ДСН, 1 мкг/мл ДНК спермы сельди и 38% формамида. Гибридизованные предметные стекла три раза промывали в 2х 88С, 0,025% ДСН при 65°С, затем три раза промывали в 0,08х 88С и, наконец, три раза промывали в 0,4х 88С при комнатной температуре.
C) Сканирование массивов, анализ изображений и обработка данных.
Микромассивы сканировали на сканере АггауХУог.х (Аррйеб Ргеазюп, И8А) в соответствии с рекомендациями производителей. Сканированные изображения вводили в устройство ТЮК 8ро1Ппбег хегзюп 3.1 (8аееб е! а1., 2003) для определения средней интенсивности пятна и средней интенсивности локального фона, исключая пятна, интенсивность которых ниже интенсивности среднего локального фона + 4х стандартные отклонения. Интенсивности с поправками на фон нормализовали с помощью пакета программ по нормализации стабилизации дисперсии, версия 1.8.0 (НиЬег е! а1., 2002), для К (\у\у\у.г-рго)ес1.огд).
Интенсивности пятен-дубликатов усредняли с помощью программы Мюгозой Ехсе1. Зонды с коэффициентом дисперсии >100% были исключены из последующего анализа данных.
- 46 015570
Пример 9. Детектирование микроРНК посредством гибридизации ίη к1!и: Детектирование микроРНК в фиксированных формалином и залитых в парафин тканевых срезах посредством гибридизации ίη кйи.
Α) Приготовление фиксированных формалином и залитых в парафин срезов для гибридизации ίη кйи.
Залитые в парафин образцы брали из соответствующих архивов образцов и разрезали на 5-10-мм срезы, а затем помещали на положительно заряженные предметные стекла с применением метода флотации. Предметные стекла хранили при 4°С до проведения экспериментов ίη к1!и.
В) Гибридизация ίη кйи.
Срезы на предметных стеклах депарафинизировали в ксилоле, а затем подвергали регидратации серийными разведениями этанола (от 100 до 25%). Предметные стекла помещали в ОЕРС-обработанную воду и обрабатывали НС1 и 0,2% глицином, а затем снова фиксировали в 4% параформальдегиде и обрабатывали ангидридом уксусной кислоты/триэтаноламином, после чего в промежутках между обработками их несколько раз промывали 1х РВ8. Предметные стекла предварительно гибридизовали в растворе для гибридизации (50% формамид, 5х 88С, 500 мг/мл дрожжевой тРНК, 1х раствор Денхардта) при 50°С в течение 30 мин. Затем в раствор для гибридизации добавляли 3 пмоль ФИТЦ-меченого ΕΝΑ-зонда (Ех1цоп, ^еηта^к), комплементарного каждой отобранной миРНК, и гибридизовали в течение 1 ч при температуре, которая на 20-25°С ниже предсказанной Тт зонда (обычно в пределах 45-55°С в зависимости от последовательности миРНК). После промывания в 0,1х и 0,5х 8СС при 65°С осуществляли реакцию амплификации тирамидного сигнала с использованием набора, содержащего флуоресцеин Сег1рот1 (ФИТЦ) (Оако^^та!^, ^еηша^к), в соответствии с рекомендациями поставщиков. И, наконец, предметные стекла помещали в раствор золота РюШ^. После этого проводили флуоресцентную реакцию для проявления в течение 16-24 ч, которая позволяла подтвердить экспрессию выбранной миРНК с помощью эпифлуоресцентного микроскопа.
Детектирование микроРНК методом гибридизации ίη к1!и на цельных эмбрионах рыбы зебры, лягушек (Хетрик) и мышей.
Все стадии промывки и инкубирования проводили в 2-миллилитровых пробирках Эппендорфа. Эмбрионы фиксировали в течение ночи при 4°С в 4% параформальдегиде в РВ8, а затем пропускали через градиент метанола (25% МеОН в РВ8Т (РВ8, содержащий 0,1% твин-20), 50% МеОН в РВ8Т, 75% МеОН в РВ8Т - 100% метанола) и хранили при -20°С в течение нескольких месяцев. В первый день гибридизации ίη к1!и эмбрионы подвергали регидратации путем последовательного инкубирования в течение 5 мин в 75% МеОН в РВ8Т, 50% МеОН в РВ8Т, 25% МеОН в РВ8Т и 100% РВ8Т (4х5 мин).
Эмбрионы рыб, мышей и лягушек обрабатывали протеиназой К (10 мкг/мл в РВ8Т) в течение 45 мин при 37°С, а затем снова фиксировали в течение 20 мин в 4% параформальдегиде в РВ8 и 3х5 мин промывали РВ8Т. После короткой промывки в воде активность эндогенной щелочной фосфатазы блокировали путем инкубирования эмбрионов в 0,1 М триэтаноламина и 2,5% уксусного ангидрида в течение 10 мин, с последующей короткой промывкой в воде и 5 х 5-минутной промывкой в РВ8Т. После этого эмбрионы переносили на 2-3 ч в буфер для гибридизации (50% формамид, 5х 88С, 0,1% твин, 9,2 мМ лимонная кислота, 50 мкг/мл гепарина, 500 мкг/мл дрожжевой РНК) при температуре гибридизации. Гибридизацию осуществляли в свежем предварительно нагретом буфере для гибридизации, содержащем 10 нМ 3'-Э1С-меченый ΕΝΑ-зонд (КосНе П1адтк!1ск), комплементарный каждой выбранной миРНК. Промывки после гибридизации осуществляли при температуре гибридизации путем последовательного инкубирования в течение 15 мин в НМ (буфере для гибридизации, не содержащем гепарина и дрожжевой РНК), 75% НМ-/25% 2х 88СТ (88С, содержащем 0,1% твин-20), 50% НМ-/50% 2х 88СТ, 25% НМ-/75% 2х 88СТ, 100% 2х 88СТ и в течение 2х30 мин в 0,2х 88СТ.
Затем эмбрионы переносили в РВ8Т путем последовательного инкубирования в течение 10 мин в 75% 0,2х 88СТ/25% РВ8Т, 50% 0,2х 88СТ/50% РВ8Т, 25% 0,2х 88СТ/75% РВ8Т и 100% РВ8Т. После блокирования в течение 1 ч в блокирующем буфере (2% овечья сыворотка/2 мг:мл Β8Α в РВ8Т) эмбрионы инкубировали в течение ночи при 4°С в блокирующем буфере, содержащем конъюгированные с щелочной фосфатазой ЕаЬ-фрагменты против Э1С (КосНе, 1/2000). На следующий день эмбрионы рыбы зебры промывали в течение 6х15 мин в РВ8Т, а эмбрионы мыши и Х.!гор1са11к промывали 6х1 ч в ТВ8Т, содержащем 2 мМ левамизол, а затем в течение 2 дней при 4°С с постоянной заменой свежим промывочным буфером.
После промывки, осуществляемой после обработки антителом, эмбрионы промывали 3х5 мин в буфере для окрашивания (100 мМ трис-НС1, рН 9,5, 50 мМ МдС12, 100 мМ №С1, 0,1% твин-20). Окрашивание проводили в буфере, в который было добавлено 4,5 мкл/мл МВТ (КосНе, 50 мг/мл маточного раствора) и 3,5 мкл/мл ВС1Р (КосНе, 50 мг/мл маточного раствора). Реакцию прекращали добавлением 1 мМ ΕΌ^ в РВ8Т и эмбрионы хранили при 4°С. После этого эмбрионы помещали в раствор Мюррея (бензилбензоат:бензиловый спирт, 2:1) в градиенте увеличения концентраций метанола (25% МеОН в РВ8Т, 50% МеОН в РВ8Т, 75% МеОН в РВ8Т, 100% МеОН), а затем визуализировали.
- 47 015570
Пример 10. Ιη νίίτο модель: Выделение мРНК и анализ на экспрессию мРНК (выделение полноразмерной РНК и синтез кДНК для проведения анализа мРНК).
Полноразмерную РНК выделяли с использованием набора КАеа^у ιηίηί кН (0|адег1) или с использованием реагента тризола (Iην^ί^οдеη). Для выделения полноразмерной РНК с использованием набора К^еаку ιηίηί ΚίΙ (0|адег1) клетки промывали ΡΒ8 и в лунки непосредственно добавляли буфер для лизиса клеток (ЯТЬ, Р1адец), в который был добавлен 1%-ный меркаптоэтанол. Через несколько минут образцы обрабатывали в соответствии с инструкциями производителей.
Для проведения ίη νίνο анализа на экспрессию мРНК образцы тканей сначала гомогенизировали на гомогенизаторе Кейс11 300ММ, а затем выделяли полноразмерную РНК с использованием реагента тризола или набора КИеаку ιιιίηί ΚίΙ в соответствии с инструкциями производителя.
Синтез первой цепи (кДНК из мРНК) осуществляли с использованием набора, содержащего обратную транскриптазу Οти^§с^^рί, или обратной транскриптазы М-МЬУ (в общих чертах описанных производителем ^пЬюи)) в соответствии с инструкциями производителей (0|адег1). При использовании обратной транскриптазы Οти^§с^^рί 0,5 мкг полноразмерной РНК каждого образца доводили до 12 мкл и смешивали с 0,2 мкл ρο^-(6Τ)12-18 (0,5 мкг/мл) (ЬгТе ТесНпο1οд^е5). 2 мкл άΝΤΡ-смеси (5 мМ каждой), мкл 10х КТ-буфера, 0,5 мкл ингибитора РНКазы КNΑдиа^ά™ (33 единицы/мл, Лте^5Нат) и 1 мкл обратной транскриптазы Οти^§с^^ρί, а затем инкубировали при 37°С в течение 60 мин и подвергали термоинактивации при 93°С в течение 5 мин.
При осуществлении синтеза первой цепи с использованием рандомизированных декамеров и обратной транскриптазы М-МЬУ (по существу, в соответствии с рекомендациями производителя (ΑтЬ^οп)) 0,25 мкг полноразмерной РНК для каждого образца доводили до 10,8 мкл в Η2Ο. После этого добавляли 2 мкл декамеров и 2 мкл άΝΤΡ-смеси (2,5 мМ каждых). Образцы нагревали до 70°С в течение мин и сразу охлаждали в ледяной воде, после чего добавляли 3,25 мкл смеси (содержащей 2 мкл 10х КТ-буфера; 1 мкл обратной транскриптазы М-МЬУ; 0,25 мкл ингибитора РНКазы). кДНК синтезировали при 42°С в течение 60 мин, а затем проводили стадию термоинактивации при 95°С в течение 10 мин и, наконец, охлаждали до 4°С. кДНК может быть также использована для количественной оценки мРНК, например путем проведения количественной ПЦР в реальном времени.
Экспрессия мРНК может быть проанализирована различными методами, известными специалистам. Так, например, уровни мРНК могут быть количественно оценены с помощью, например, нозерн-блотанализа, конкурентной полимеразной цепной реакции (ПЦР), анализа на защиту от рибонуклеазы (ΚΡΑ) или ПЦР в реальном времени. В настоящем изобретении предпочтительной является количественная ПЦР в реальном времени. Анализ РНК может быть проведен на полноразмерной клеточной РНК или мРНК.
Методы выделения РНК и анализ РНК, такой как нозерн-блот-анализ, известны специалистам и описаны, например, в руководстве Сштет Ρτοίο^Η ίη Μο1еси1а^ ВюЦду, ιοίιη №Пеу & δοηκ.
Количественная ПЦР в реальном времени может быть легко проведена с использованием коммерчески доступной системы ПЦР-детекции в реальном времени (|Ц Μи1ί^-Сο1ο^ Кеа1 Т1те ГСК Ое!^^ ЗуЧет), поставляемой компанией Β^οКЛ^.
Количественная ПЦР в реальном времени представляет собой метод, хорошо известный специалистам и описанный, например, в публикации Не1б е! а1. Кеа1 Кте сци-тЩаНте КСК, Сегюте КекеагсН (1996), 6: 986-994.
Пример 11. Поглощение ΕΝΑ-олигонуклеотида и эффективность ίη νίνο.
Исследование ίη νίνο: Шесть групп животных (5 мышей на группу) обрабатывали следующим образом. Животным группы 1 непрерывно в течение 3 дней вводили ί.ν. 0,2 мл физиологического раствора, животным группы 2 вводили 2,5 мг/кг &КС3372, животным группы 3 вводили 6,25 мг/кг 8КС3372, животным группы 4 вводили 12,5 мг/кг 8ΡΟ3372, животным группы 5 вводили 25 мг/кг 8ΡΟ3372, а животным группы 6 вводили 25 мг/кг 8ΡΟ3373 (олигонуклеотида ^NΑ-апί^т^К™) с несоответствиями, все эти процедуры проводили одним и тем же способом. Все дозы вычисляли из расчета массы тела каждого животного на день 0.
Перед введением дозы (в день 0) и через 24 ч после введения последней дозы (день 3) в пробирки, содержащие ΕΩ^, собирали кровь, взятую из ретроорбитальной области, а затем собирали фракцию плазмы и хранили в замороженном виде при -80°С для проведения анализа на уровень холестерина. После умерщвления животных печень удаляли и одну часть разрезали на 5-мм кубики, а затем погружали в 5 объемов охлажденного льдом реагента КNΑ1аίе^. Другую часть быстро замораживали в жидком азоте и хранили в криогенных условиях для последующего приготовления срезов.
Полноразмерную РНК экстрагировали из образцов печени, как описано выше, и анализировали на уровни т1К-122а с помощью микроРНК-специфической количественной ПЦР. На фиг. 5 продемонстрирована четкая зависимость доза-ответ, полученная с использованием ЯКС3372 с КА, при 3-5 мг/кг, тогда как с использованием олигонуклеотида ΕΝΑ &КС3373, который является антагонистом ииК-122а и имеет несоответствия, ингибирование ииК-122а не наблюдалось.
- 48 015570
Пример 12. Зависимость доза-ответ для ^NΑ против т1К-122а ίη νίνο у самок мышей С57/ВБ/1.
Исследование ίη νίνο: Десять групп животных (самок С57/ВБ6; 3 мыши на группу) обрабатывали следующим образом. Животным группы 1 на день 0, на день 2 и на день 4 вводили ί.ρ. 0,2 мл физиологического раствора. Животным групп 2-10 внутрибрюшинно вводили три различные концентрации (25, 5 и 1 мг/кг) ^NΑ против т1К-122а/8РС3372 (группы 2-4), ^NΑ-аηΐ^т^Κ-122а/8РС3548 (группы 5-7) или ^NΑ-аηΐ^т^Κ-122а/8РС3549 (группы 8-10), где последовательности ^NΑ-аηΐ^т^Κ-122 представлены в табл. 1. Все три олигонуклеотида ^NΑ против т1К-122а были нацелены на печень-специфическую т1К122а. Дозы вычисляли из расчета массы тела каждого животного на день 0.
Животных умерщвляли через 48 ч после введения последней дозы (день 6) и кровь, взятую из ретроорбитальной области, собирали в пробирки, содержащие БИТА, а затем собирали фракцию плазмы и хранили в замороженном виде при -80°С для проведения анализа на уровень холестерина. После умерщвления животных печень удаляли и одну часть разрезали на 5-мм кубики, а затем погружали в 5 объемов охлажденного льдом реагента РХА1а!ег. Другую часть быстро замораживали в жидком азоте и хранили для последующего приготовления срезов в криогенных условиях.
Полноразмерную РНК экстрагировали из образцов печени с использованием реагента тризола в соответствии с рекомендациями производителей (1пуНгодеп, И8А) и анализировали на уровни т1К-122а путем проведения микроРНК-специфической количественной ПЦР в соответствии с рекомендациями производителей (АтЫоп, И8А). На фиг. 2 продемонстрирована четкая зависимость доза-ответ для всех трех молекул ^NΑ-аηΐ^т^Κ-122а (8РС3372, 8РС3548, 8РС3549). Молекулы 8РС3548 и 8РС3549 обеспечивали значительно более эффективный сайленсинг ίη νίνο в отношении т1К-122а (на что указывало снижение уровней т1К-122а) по сравнению с молекулой 8РС3372, при этом наиболее эффективной оказалась молекула 8РС3549 (1С50 приблизительно при 1 мг/кг).
Вышеописанную процедуру повторяли в присутствии 8РС3372 и 8РС3649 с использованием 5 мышей на группу и объединенные данные (для всех восьми мышей на группу) представлены на фиг. 2Ь.
Пример 12а. Нозерн-блот-анализ.
МикроРНК-специфический нозерн-блот-анализ, проводимый в мышиной печени, обработанной ^NΑ против ητίΡ., указывал на усиление блокирования т1К-122 под действием 8РС3649 по сравнению с 8РС3372.
Олигонуклеотиды, используемые в этом примере:
ЗРС3649: 5 ' -СсАЕРСТсаСаСЕСС-З ' (ЗЕ<2 Ю 59) Новая конструкция
ЗРС3372: 5 '-СсАЪССйсАсаСЪсСа-З ' (ЗЕ<2 Ю 57) Старая конструкция
Авторами настоящего изобретения было принято решение проанализировать влияние 8РС3649 на уровни миРНК т1К-122 в печени 8РС3649-обработанных мышей. Мышам через день в течение шести дней вводили три 1.р.-инъекции ^NΑ-аηΐ^т^Κ 8РС3649 и 8РС3372 в указанных дозах и через 48 ч после введения последней дозы животных умерщвляли. Полноразмерную РНК экстрагировали из печени. Уровни т1К-122 оценивали с помощью микроРНК-специфического нозерн-блот-анализа (фиг. 6).
Обработка здоровых мышей молекулой 8РС3649 приводила к резкому усилению дозозависимого снижения уровня т1К-122. Был проведен микроРНК-специфический нозерн-блот-анализ, в котором сравнивали 8РС3649 и 8РС3372 (фиг. 6). 8РС3649 полностью блокировал т1К-122 при 5 и 25 мг/кг, на что указывало отсутствие зрелой одноцепочечной т1К-122 и присутствие лишь полосы дуплекса ^NΑ против т1К и т1К-122. Сравнение полосы дуплекса со зрелой полосой, проводимое с помощью нозернблот-анализа, показало, что эффективность 8РС3649 при 1 мг/кг равна эффективности 8РС3372 при 25 мг/кг.
Пример 13. Оценка уровней холестерина в плазме у мышей, обработанных ^NΑ-аηΐ^т^Κ-122.
Общий уровень холестерина в плазме определяли с помощью колориметрического анализа СБо1ез!его1 СР, разработанного компанией АВХ Рейга. Уровень холестерина определяли после ферментативного гидролиза и окисления (2, 3). К 1,5 мкл плазмы добавляли 21,5 мкл воды. Затем добавляли 250 мкл реагента и содержание холестерина измеряли в течение 5 мин на длине волны 540 нм. Для каждого животного измерения проводили с двумя повторностями. Чувствительность и линейность цепи оценивали с использованием контрольного соединения с 2-кратным разведением (контроль АВХ Рейта Ν). Уровень холестерина определяли путем вычитания фона и сравнивали с уровнями холестерина в плазме мышей, обработанных физиологическим раствором.
На фиг. 3 продемонстрировано заметное снижение уровня холестерина в плазме у мышей, которым вводили 8РС3548 и 8РС3549, по сравнению с уровнем холестерина у контрольных мышей, которым вводили физиологический раствор на день 6.
Пример 14. Оценка уровней мРНК-мишени для т1К-122а у мышей, обработанных Ь-Ν А против т1К-122а.
Контрольных животных, обработанных физиологическим раствором, и животных, обработанных различными ^NΑ против т1К-122а, умерщвляли через 48 ч после введения последней дозы (день 6) и полноразмерную РНК экстрагировали из образцов печени с использованием реагента тризола в соответствии с рекомендациями производителей (йуйгодеп, и8А). Уровни мРНК оценивали путем проведения
- 49 015570 количественной ОТ-ПЦР в реальном времени для двух генов-мишеней для ш1К-122а, Вскйк (гена киназы дегидрогеназ кетокислоты с разветвленной цепью, ΕΝ§Μϋ8000000030802) и альдолазы Α (аИоЛ, ΕΝ8Μϋ8000000030695) соответственно, а также ΟΑΓΌΗ в качестве контроля с помощью анализов Тас|шап в соответствии с инструкциями производителя (Αρρίίβά ЬюкуМетк, υ8Α). На фиг. 4а и 4Ь продемонстрирована четкая дозозависимая активация двух генов-мишеней для т1К-122а, Вскбк и ΑΙάοΑ соответственно в ответ на обработку всеми тремя молекулами ^NΑ-аηί^т^Κ-122а (8РС3372, 8РС3548, 8РС3549). В противоположность этому, количественные ПЦР-анализы на ΟΑΓΩ в качестве контроля не выявили каких-либо различий в уровнях мРНК ОЛР^ у мышей, обработанных ^NΑ-аηί^т^Κ-122а, по сравнению с уровнями мРНК ОΑР^ у контрольных животных, обработанных физиологическим раствором (фиг. 4с). Уровни мРНК Вскбк и ΑΙάοΑ у 8РС3548- и 8РС3549-обработанных мышей были значительно выше, по сравнению с уровнями, наблюдаемыми у 8РС3372-обработанных мышей (фиг. 4а и 4Ь), что указывает на более высокую ίη νίνο эффективность данных молекул.
Пример 15. Длительность действия ΕΝΑ-олигонуклеотида ίη νίνο.
Исследование ίη νίνο: Две группы животных (21 мышь на группу) обрабатывали следующим образом. Животным группы 1 ежедневно в течение 3 дней внутривенно вводили 0,2 мл физиологического раствора, а животным группы 2 аналогичным образом вводили 25 мг/кг 8РС3372. Все дозы вычисляли из расчета массы тела каждого животного на день 0.
После введения последней дозы (день 3) 7 животных от каждой группы умерщвляли на дни 9, 16 и 23 соответственно. Перед этим каждый день в пробирки, содержащие ΕΌΤΑ, собирали кровь, взятую из ретроорбитальной области, а затем собирали фракцию плазмы и хранили в замороженном виде при -80°С для ежедневного проведения анализа на уровень холестерина. После умерщвления животных печень удаляли и одну часть разрезали на 5-мм кубики, а затем погружали в 5 объемов охлажденного льдом реагента ΚΝΑΕι^γ. Другую часть быстро замораживали в жидком азоте и хранили в криогенных условиях для последующего приготовления срезов.
Полноразмерную РНК экстрагировали из образцов печени, как описано выше, и анализировали на уровни тгР-122а путем проведения микроРНК-специфической количественной ПЦР. На фиг. 7 (умерщвление на дни 9, 16 или 23 соответствует умерщвлению через 1, 2 или 3 недели после введения последней дозы) продемонстрировано двукратное ингибирование у мышей, которым вводили 8РС3372, по сравнению с ингибированием у контрольных мышей, которым вводили физиологический раствор, и такое ингибирование еще могло быть детектировано на день 16, а на день 23 уровни тгР-122а приближались к уровням, наблюдаемым у группы, которой вводили физиологический раствор.
Пример 16. Длительность действия ΕΝΑ-олигонуклеотида ίη νίνο.
Исследование ίη νίνο: Две группы животных (21 мышь на группу) обрабатывали следующим образом. Животным группы 1 ежедневно в течение 3 дней внутривенно вводили 0,2 мл физиологического раствора, а животным группы 2 аналогичным образом вводили 25 мг/кг 8РС3372. Все дозы вычисляли из расчета массы тела каждого животного на день 0.
После введения последней дозы (день 3) 7 животных от каждой группы умерщвляли на дни 9, 16 и 23 соответственно. Перед этим каждый день в пробирки, содержащие ΕΌΤΑ, собирали кровь, взятую из ретроорбитальной области, а затем собирали фракцию плазмы и хранили в замороженном, виде при -80°С для ежедневного проведения анализа на уровень холестерина. После умерщвления животных печень удаляли и одну часть разрезали на 5-мм кубики, а затем погружали в 5 объемов охлажденного льдом реагента ΚΝΑΡι^γ. Другую часть быстро замораживали в жидком азоте и хранили в криогенных условиях для последующего приготовления срезов.
Полноразмерную РНК экстрагировали из образцов печени, как описано выше, и анализировали на уровни т1К-122а путем проведения микроРНК-специфической количественной ПЦР. На фиг. 8 продемонстрировано, что у мышей, которым вводили 8РС3372, по сравнению с контрольными мышами, которым вводили физиологический раствор, наблюдалось в два раза большее ингибирование, и такое ингибирование еще могло быть детектировано на 16-й день, а на 23-й день уровни тгК.-122а приближались к уровням, наблюдаемым у группы, которой вводили физиологический раствор.
Нижеследующие процедуры проводили, как описано в примерах 17-22.
Мышам ΝΜΕΙ ежедневно в течение трех дней внутривенно вводили 8РС3372 в дозе 2,5-25 мг/кг. Через 24 ч, 1, 2 или 3 недели после введения последней дозы животных умерщвляли. Собранную печень разрезали на куски и погружали в реагент ΚΝΑΠΙόγ (ΑιηΝοη) или быстро замораживали. РНК экстрагировали реагентом тризолом в соответствии с инструкциями производителя (Iην^ί^οдеη) из ткани, обработанной реагентом за исключением осажденной РНК, которую промывали в 80% этаноле и не подвергали перемешиванию. РНК использовали для количественной ПЦР Тас.|Ма1'1 на мРНК, проводимой в соответствии с инструкциями производителя (Αρρ^ά Ьюкуйетк), или для нозерн-блот-анализа (см. ниже). Из быстрозамороженных кусков ткани приготавливали срезы в криогенных условиях для гибридизации ίη δίΐιι.
Кроме того, как показано на фиг. 9-14, 8РС3372 представляет собой ΕΝΑ-ηηΐΜίΚ, а 8РС3373 (контроль с несоответствиями) был обозначен не 8РС, а тт.
- 50 015570
Пример 17. Дозозависимое индуцирование мРНК-мишени для ш1К-122а путем 8РС3372ингибирования ш1К-122а.
Мышей обрабатывали различными дозами 8РС3372 каждый день в течение трех дней, как описано выше, а затем через 24 ч после введения последней дозы мышей умерщвляли. Полноразмерную РНК, экстрагированную из печени, подвергали количественной ПЦР. Гены, имеющие предсказанный сайтмишень для т1К-122 и активируемые, как наблюдалось в анализе на микромассивах, оценивали на дозозависимое индуцирование с помощью количественной ПЦР путем увеличения доз 8РС3372. Полноразмерную РНК печени, взятую у 2-3 мышей на группу, умерщвленных через 24 ч после введения последней дозы, подвергали количественной ПЦР для анализа указанных генов. На фиг. 9 показаны уровни мРНК по сравнению с уровнями мРНК у группы, которой вводили физиологический раствор, п=2-3 (2,512,5 мг/кг/день: п=2, без ср. кв. от.). Показан также контроль с несоответствиями (тт, 8РС3373).
Анализируемые гены: №йд3 Л1йо А, Вскйк, СЭ320 с предсказанным сайтом-мишенью для ιηίΚ-122. А1йо В и Сарйк не имели предсказанного сайта-мишени для тгК.-122а.
Явное дозозависимое индуцирование наблюдалось в случае генов-мишеней для тгК.-122а после обработки различными дозами 8РС3372.
Пример 18. Временное индуцирование мРНК-мишеней для т1К-122а после обработки 8РС3372.
Самок мышей NΜΚ1 обрабатывали 25 мг/кг/день 8РС3372, а контроль обрабатывали физиологическим раствором ежедневно в течение трех дней, а затем через 1, 2 или 3 недели после введения последней дозы соответственно умерщвляли. РНК экстрагировали из печени и уровни предсказанных мРНКмишеней для тгК.-122а, отобранных в соответствии с данными анализа на микромассивах, оценивали с помощью количественной ПЦР. Было исследовано три животных от каждой группы.
Анализируемые гены: №йд3 А1йо А, Вскйк, СЭ320 с предсказанным сайтом-мишенью для т1К-122. Сарйк не имел предсказанного сайта-мишени для тгК.-122а.
Наблюдалось временное индуцирование с последующим восстановленим нормальных уровней экспрессии аналогично восстановлению нормальных уровней тгК.-122а (фиг. 10).
Уровни мРНК нормализовали на отдельные уровни САРЭН и на средние значения, полученные для группы, обработанной физиологическим раствором, в каждый отдельный момент времени. Были также включены величины, полученные для животных, умерщвленных через 24 ч после введения последней дозы. Указано среднее и стандартное отклонение, п=3 (24 ч, п=3).
Пример 19. Индуцирование У1й1г в печени путем 8РС3372-обработки.
Те же самые образцы РНК печени, которые были получены в предыдущем примере, оценивали на индуцирование У1й1г.
Временная активация наблюдалась после обработки 8РС3372, как и в случае других предсказанных мРНК-мишеней для ιηίΚ-122;·ι (фиг. 11).
Пример 20. Стабильность дуплекса т1В-122а/8РС3372 в мышиной плазме.
Стабильность 8РС3372 и дуплекса 8РС3372/т1К-122а тестировали в мышиной плазме при 37°С в течение 96 ч. На фиг. 12 проиллюстрирован электрофорез в ПААГ, окрашенном 8УВВ-золотом.
8РС3372 оставался полностью стабильным в течение 96 ч. Дуплекс 8РС3372/т1В-122а сразу подвергался усечению (одноцепочечная область т1К-122а не поддавалась разложению под действием 8РС3372) и оставался почти полностью стабильным в течение 96 ч.
Тот факт, что стабильность предварительно полученного дуплекса 8РС3372/т1К-122 и термостабильность дуплекса молекулы 8РС3372 в сыворотке сохранялась в течение 96 ч, подтвердил мнение авторов настоящего изобретения о том, что ингибирование т1К-122а под действием 8РС3372 обусловлено образованием стабильного дуплекса между двумя молекулами, что было также обнаружено из наблюдений в клеточной культуре ЩадшЬпеуа с1 а1. 2006).
Пример 21. Секвестрация зрелой ιηίΚ-122;·ι под действием 8РС3372 приводит к образованию дуплекса.
РНК печени также подвергали микроРНК-специфическому нозерн-блоттингу. На фиг. 13 показана мембрана, зондированная тгК.-122а-специфическим зондом (верхняя панель) и повторно зондированная Ье!-7-специфическим зондом (нижняя панель). С использованием тгК.-122-зонда можно было детектировать две полосы, где одна полоса соответствовала зрелой т1К-122, а другая соответствовала дуплексу между 8РС3372 и т1В-122.
Для подтверждения сайленсинга т1К-122 образцы РНК печени подвергали нозерн-блот-анализу на короткую РНК, этот анализ указывал на значимое снижение уровней детектируемой зрелой т1К-122 в соответствии с результатами ОТ-ПЦР в реальном времени, полученными авторами настоящего изобретения. Для сравнения можно отметить, что уровни для Ье!-7а-контроля не изменялись.
Интересно отметить, что авторами настоящего изобретения была обнаружена дозозависимая аккумуляция смещенной полосы гетеродуплекса тгК.-122/8РС3372, что позволяет предположить, что ιηίΚ122 не является мишенью, которая подвергается деградации под действием молекулы 8РС3372, но, при этом эта молекула связывается с микроРНК и тем самым препятствует осуществлению ее функций вследствие стерического затруднения.
Нозерн-блот-анализ осуществляли следующим образом.
- 51 015570
Нозерн-мембраны получали, как описано в публикации 8етреге е( а1. 2002, за исключением следующих изменений: полноразмерную РНК, 10 мкг на дорожку, в формамидном загрузочном буфере (47,5% формамид, 9 мМ ΕΌΤΑ, 0,0125% бромфеноловый синий, 0,0125% ксилол-цианол, 0,0125% ДСН) загружали на 15% денатурирующий полиакриламидный гель с ТВЕ-мочевиной Ыоуех (Ιηνί(годен) без предварительного нагревания РНК. РНК подвергали электрофоретическому переносу на гибридизационную блоттинг-мембрану Сепе8сгееп р1ик (Регк1пЕ1тег) при 200 мА в течение 35 мин. Эти мембраны зондировали 32Р-мечеными ΕΝΑ-модифицированными олигонуклеотидами, комплементарными зрелым микроРНК*. ΕΝΑ-олигонуклеотиды метили и гибридизовали с мембраной, как описано в литературе (Уа10с/1 е( а1. 2004), за исключением следующих изменений: растворы для предварительной гибридизации и растворы для гибридизации содержали 50% формамид, 0,5% ДСН, 5х 88С, 5х раствор Денхардта и 20 мкг/мл денатурированной фрагментированной ДНК спермы сельди. Гибридизацию осуществляли при 45°С. Блоты визуализировали путем сканирования на сканере 81огт 860. Фоновый сигнал мембраны вычитали из радиактивных сигналов, поступаемых от полос миРНК. Величины сигналов ιιιίΕ-122 корректировали на различия в загрузке по отношению к сигналу 1е1-7а. Для определения размера радиоактивных сигналов использовали систему Эесабе Магкег 8у5(еш (АтЫоп) в соответствии с рекомендациями поставщиков.
Пример 22. Секвестрация т1К-122а под действием 8РС3372 и распределение 8РС3372, проанализированные посредством гибридизации ίη кйи в срезах печени.
Криосрезы печени, полученные от обработанных животных, подвергали гибридизации ίη Ши для детектирования и для определения локализации т1К-122 и 8РС3372 (фиг. 14). Зонд, комплементарный т1К-122, позволяет детектировать т1К-122а. Второй зонд был комплементарен 8РС3372. На фиг. 14 проиллюстрировано перекрывание, зеленым цветом показано распределение и кажущиеся количества т1К122а и 8РС3372, а синим цветом показано окрашивание ядер красителем ЭАР1, при 10х увеличении. При 100х увеличении было выявлено внутриклеточное распределение т1К-122а и 8РС3372 в клетках мышиной печени.
Все срезы печени, взятые у контрольных животных, обработанных физиологическим раствором, обнаруживали интенсивное окрашивание т1К-122, тогда как срезы, взятые у 8РС3372-обработанных мышей, обнаруживали значимое снижение интенсивности окрашивания пятен. В противоположность этому, молекула 8РС3372 легко детектировалась в 8РС3372-обработанной печени, но не детектировалась в печени контрольного животного, обработанного физиологическим раствором. Еще большее увеличение позволило определить локализацию т1К-122а в цитоплазме гепатоцитов, где наблюдалась явная компартментализация т1К-122 ίη кШг и было обнаружено однородное распределение молекулы 8РС3372 по всей цитоплазме.
Пример 23. Анализ на микромассивах.
Авторами настоящего изобретения были оценены профили экспрессии по всему геному в образцах полноразмерных РНК, взятых из печени мышей, обработанных физиологическим раствором, ΕΝΑолигонуклеотидом против ш1К-122 и контрольным ΕΝΑ с несоответствиями, через 24 ч после введения последней дозы, где указанную оценку проводили с использованием программы массивов Αίушеΐπx Мойке Сеноте 430 2.0. Анализ данных, полученных с помощью массивов, выявил 455 транскриптов, которые были активированы в печени мышей, обработанных ΕΝΑ против т1К, по сравнению с контрольными мышами, обработанными физиологическим раствором и ΕΝΑ с несоотвествиями, тогда как 54 транскрипта были ингибированы (фиг. 15а). В базе данных ЕпкетЫ были идентифицированы всего 415 активированных и 53 ингибированных транскрипта. Затем авторами настоящего изобретения были оценены 3'-нетранслируемые области (ИТК) дифференциально экспрессированных мРНК на присутствие последовательности из 6 нуклеотидов САСТСС, соответствующих обратному комплементу уникальной области из 2-7 нуклеотидов в зрелой т1К-122. Из всех активированных транскриптов число транскриптов, имеющих по меньшей мере одну т1К-122-распознающую последовательность, составляло 213 (51%), а из всех ингибированных транскриптов такое число составляло 10 (19%), при этом встречаемость популяции неспецифических последовательностей составляла 25%, что указывает на то, что значительный пул активированных мРНК представляет собой непосредственные мишени для т1К-122 в печени (фиг. 15Ь).
Обработка ΕΝΑ-;·ιη(ίΐΗίΕ приводила к максимальному снижению уровней т1К-122 через 24 ч после введения последней дозы ΕΝΑ и к 50% снижению через одну неделю после введения последней дозы ΕΝΑ, а в соответствующем контроле, обработанном физиологическим раствором, к 50% снижению через три недели после введения последней дозы ΕΝΑ (пример 12, старая конструкция). Это соответствует данным по значительному снижению числа дифференциально экспрессированных генов для двух групп мышей, полученным в более поздние моменты времени. По сравнению с 509 мРНК, которые были идентифицированы через 24 ч после введения последней дозы ΕΝΑ, авторами настоящего изобретения был идентифицирован 251 дифференциально экспрессированный ген через одну неделю, а через три недели после обработки было идентифицировано лишь 18 генов (фиг. 15с и 156). В общих чертах, гены активировались через 24 ч после обработки ΕΝΑ-ηη^ηκΕ, а затем в течение следующих двух недель уровни их
- 52 015570 активации возвращались к контрольным уровням (фиг. 15б).
В заключение следует отметить, что большая часть активированных/дерепрессированных генов после обработки молекулой ЬЫА-апПткЯ представляют собой мишени для т1Я-122, что указывает на высокую специфичность блокирования ιηίΡ-122. Кроме того, тот факт, что через З недели после конечной обработки уровни активированных/дерепрессированных генов приближались к нормальным уровням, дает основание предположить об относительно длительном терапевтическом действии, которое при этом не вносит каких-либо стабильных изменений, т.е. такой эффект является обратимым.
Методы
Определение профиля экспрессии генов у мышей, обработанных молекулой ЬЫА-апЦтЖ..
Было проведено сравнение профилей экспрессии генов в печени мышей, обработанных физиологическим раствором и молекулой ЬЫА-апбт1К. Самок мышей ЫМЯ1 обрабатывали 25 мг/кг/день ЬЫАапйткК, а также физиологическим раствором в качестве контроля ежедневно в течение трех дней, а через 24 ч, одну, две или три недели после введения последней дозы животных умерщвляли. Кроме того, через 24 ч после введения последней дозы были получены профили экспрессии генов в печени мышей, обработанных контрольным ЬЫА-олигонуклеотидом с несоответствиями. Были исследованы три мыши от каждой группы и был получен всего 21 профиль экспрессии. Качественную оценку и определение концентрации РНК проводили на биоанализаторе АдПеп! 2100 и Ыапобгор ЫБ-1000 соответственно. Полноразмерная РНК была процессирована после экспрессии на генных чипах СепеСЫр в соответствии с инструкциями, прилагаемыми к набору для одноциклового синтеза кДНК, проводимого с использованием реагентов для З'-амплификации (АГку-теЦтх 1пс, 8ап!а С1ага, СА, И8А), в результате чего была получена двухцепочечная кДНК. Эту кДНК использовали в качестве матрицы для продуцирования меченной биотином кРНК в соответствии с инструкциями производителей. 15 мкг меченной биотином кРНК фрагментировали с получением цепей, имеющих длину З5-200 оснований, и 10 мкг из них были гибридизованы на массивах АПущеМу Мойке Сепоте 4З0 2.0 в течение ночи в печи 6400 для гибридизации на генных чипах СепеСЫр в соответствии со стандартными процедурами. Затем массивы промывали и окрашивали на станции СепеСЫр Ишбюк 8!а!1оп 450. Сканирование осуществляли на сканере СепеСЫр 8саппег З000, а анализ изображений проводили с помощью операционной компьютерной программы СепеСЫр. Нормализацию и статистический анализ проводили с помощью пакета программ ЫММА для системного программирования Я (ргодгатттд епупоптеп!27). Зонды, о которых программа ССО8 сообщала как об отсутствующих при всех гибридизациях, удаляли из набора данных. Кроме того, к набору данных прилагался фильтр интенсивности для удаления зондов, обнаруживающих скрорректированную по фону интенсивность ниже 16. Данные нормализовали с использованием программы нормализации по квантилям (с.|иапШе погта1|/а1юп28).
Дифференциальную экспрессию оценивали методом линейной модели. Величины Р корректировали по множеству параметров с использованием критериев Бенджамини и Хохберга (Вещатт & НосНЬегд). Эти критерии рассматривались как критерии значимости, если скорректированные величины р составляли р<0,05. Кластеризация и визуализация данных, полученных с использованием массивов ЛкГуте!^^x, былы проведены с помощью компьютерной программы визуализации (МиШЕхрептеп! У1е\уег коП\уаге29).
Предсказание сайта-мишени
Транскрипты с описанными З'ИТЯ брали из базы данных ЕпкетЬ1 (версия 41) с использованием программы для анализа данных (ЕпкМаг! ба!а ттпд !оо1З0) и анализировали на присутствие последовательности САСТСС, которая представляет собой обратный комплемент из 2-7 уникальных нуклеотидов в зрелой последовательности Ш1Я-122. В качестве фонового контроля серию из 1000 последовательностей длиной в 1200 нуклеотидов, соответствующих средней длине З'ИТЯ активированных и ингибированных транскриптов, скринировали через 24 ч после введения последней дозы ЬЫА-ап!т!Я на соответствие уникальной области т1Я-122 из 6 нуклеотидов. Такой скрининг был проведен 500 раз и среднее количество было использовано для сравнения.
Пример 24. Дозозависимое ингибирование Ш1Я-122 в мышиной печени под действием ЬЫА-апПтзЯ было более сильным по сравнению с ингибированием т1Я-122 под действием антагониста ти
Самок мышей ЫМЯ1 обрабатывали указанными дозами ЬЫА-ап!1т1Я (8РСЗЗ72), контролем с несоответствиями (гат, 8РСЗЗ7З), физиологического раствора и антагониста ши (ап!адот1г) (8РСЗ595) ежедневно в течение трех дней и через 24 ч после введения последней дозы мышей умерщвляли (как описано в примере 11, старая конструкция, п=5). Уровни т!Я-122 анализировали с помощью количественной ПЦР и нормализовали по данным, полученным для группы, обработанной физиологическим раствором. Гены с предсказанным сайтом-мишенью для ш!Я-122 и с профилем активированной экспрессии (А1боА, ЫгбдЗ, Вскбк и СБЗ20) обнаруживали дозозависимую дерепрессию при возрастающих дозах ЬЫАап!т1Я, как было определено с помощью количественной ПЦР.
У мышей, обработанных ЬЫА-ап!т!Я, такая дерепрессия была стабильно выше для всех протестированных мРНК, являющихся мишенями для т!Я-122 (А1боА, Вскбк, СБЗ20 и ЫгбдЗ, фиг. 17-20), чем у мышей, обработанных антагонистом тк (ап!адот1г). Это было также продемонстрировано в анализе на ингибирование ш!Я-122, проводимом с помощью т!Я-122-специфической количественной ПЦР
- 5З 015570 (фиг. 16). Следовательно, ΕΝΑ против тЖ. являются более эффективными функциональными ингибиторами тЖ-122, чем агИадотй при соответствующих дозах.
Пример 25. Ингибирование тЖ-122 под действием ^NЛ-аηι^тЖ у мышей с гиперхолистеринемией, снижение уровней холистеринемии и дерепрессия мРНК-мишени для тЖ-122.
Самки мышей С57ВБ/61 получали корм с высоким содержанием жира в течение 13 недель перед их обработкой 8РС3649. В результате этого их масса возрастала до 30-35 г по сравнению с массой нормальных мышей, которая составляла лишь 20 г, как было определено путем взвешивания в начале обработки молекулой ^NЛ-аηι^тЖ. Кормление мышей пищей с высоким содержанием жира приводило к значительному увеличению общего уровня холестерина в плазме, составляющего примерно 130 мг/дл, в результате чего у таких мышей развивалась гиперхолистеринемия, в отличие от нормальных мышей, у которых уровень холестерина составлял примерно 70 мг/дл. Мышей с гиперхолистеринемией и нормальных мышей два раза в неделю обрабатывали 1.р. 5 мг/кг 8РС3649 и соответствующим контрольным 8РС3744 с несоответствиями во время исследования в течение 5,5 недель. Пробы крови брали еженедельно и во время всего исследования измеряли общий уровень холестерина в плазме. После умерщвления мышей брали образцы печени и пробы крови для проведения общей экстракции полимеразной РНК, количественной оценки миРНК и мРНК, оценки уровней трансаминазы в сыворотке и гистологического анализа печени.
Обработка мышей с гиперхолистеринемией молекулой 8РС3649 приводила к снижению общего уровня холестерина в плазме примерно на 30% уже через 10 дней, и такой уровень, в отличие от уровня холестерина у контрольных мышей, обработанных физиологическим раствором, сохранялся в течение всего исследования (фиг. 21). Такой эффект не наблюдался у мышей, получавших нормальный корм. В отличие от этого, введение контрольного 8РС3744 с несоответствиями не оказывало какого-либо влияния на уровни холестерина в плазме ни у мышей с гиперхолистеринемией, ни у нормальных мышей.
Количественная оценка ингибирования шЖ-122 и дерепрессии мРНК гена-мишени для тЖ-122 (ΑΙ^Α и Вскйк), проводимая после длительной обработки молекулой 8РС3649, выявила, что мыши с гиперхолистеринемией и нормальные мыши имели сравнимые профили (фиг. 22-24), в результате чего было продемонстрировано, что 8РС3649 является сильным антагонистом тЖ-122 у животных обеих групп. Анализ, проводимый с помощью количественной ПЦР шЖ-122, показал, что контрольный 8РС3744 с несоответствиями оказывал, хотя и в меньшей степени, влияния на уровни тЖ-122 в печени обработанных мышей, по сравнению с 8РС3649. Такое снижение может быть ассоциировано с количественной ПЦР, проводимой с использованием структуры стебель-петля в качестве праймеров. В соответствии с этим обработка мышей контрольным 8РС3744 с несоответствиями не приводила к какой-либо функциональной дерепрессии генов-мишеней для шЖ-122 (фиг. 23 и 24) или к снижению уровня холестерина в плазме (фиг. 21), а это означает, что 8РС3649-опосредованный антагонизм шЖ-122 является в высокой степени специфическим ίη у1уо.
После длительной обработки молекулой 8РС3649 проводили анализ ферментов в печени у мышей с гиперхолистеринемией и у нормальных мышей. У 8РС3649-обработанных мышей с гиперхолистеринемией, по сравнению с контрольными мышами, обработанными физиологическим раствором, каких-либо изменений уровней аланин- и аспартат-аминотрансферазы (ΑΕΤ и Α8Τ) не обнаруживалось (фиг. 25 и 26). Увеличение уровня ΑΕΤ может наблюдаться у нормальных мышей после длительной обработки 8РС3649 (фиг. 26).
Пример 26. Методы проведения эксперимента и анализа на ^NΑ-аηΐ^тЖ/гиперхолестеринемию.
Мыши и введение доз.
В этом эксперименте использовали самок мышей С57ВБ/61 (Тасошс М&В ЕаЬогаЮгу Αη^ша1з, Б_)Ьу, Эептагк). Все вещества приготавливали в физиологическом растворе (0,9% №1С1) до конечной концентрации, пригодной для введения внутрибрюшинной инъекции мышам в объеме 10 мл/кг.
В исследовании, проводимом на мышах с индуцированным ожирением, этим мышам в течение 13 недель перед введением доз давали корм (Ό12492, Незеагсй Э|е1з) с высоким содержанием жира (60%, в соответствии с Европейским стандартом (ΕΝ)) в целях увеличения у них уровня холестерина в крови. ^NΑ-аηί^тЖ™ в дозе 5 мг/кг вводили два раза в неделю в течение 5,5 недель. Плазму крови брали один раз в неделю в течение всего периода введения доз. После завершения эксперимента мышей умерщвляли и РНК экстрагировали из печени для последующего проведения анализа. Для анализа на ферменты печени также брали сыворотку.
Экстракция полноразмерной РНК.
Срезы печени умерщвленных мышей сразу помещали на хранение в реагенте ΕΝΑΕ-ιΕι· (АтЬти). Полноразмерную РНК экстрагировали реагентом тризолом в соответствии с инструкциями производителей (ЧпуЦгодеп). за исключением того, что осажденную РНК промывали в 80% этаноле и не перемешивали.
МикроРНК-специфическая количественная ОТ-ПЦР.
Уровни микроРНК шЖ-122 и 1е!-7а количественно оценивали с помощью анализа микроРНК Тас.|Мап (Аррйей В1озуз1ешз) в соответствии с инструкциями производителя. Реакционную смесь для ОТПЦР подвергали 10-кратному разведению в воде, а затем использовали для ПЦР-амплификации в реальном времени в соответствии с инструкциями производителя. Двукратные серийные разведения кДНК,
- 54 015570 полученной из полноразмерной РНК печени животных, обработанных физиологическим раствором, или реакционная смесь кДНК ложнотрансфицированных клеток (где количество используемой полноразмерной РНК было в 2,5 раза больше, чем в образцах) служили в качестве стандарта для гарантии прохождения амплификации в линейном режиме (количество или относительное число копий). ПЦРамплификацию проводили в режиме реального времени на аппарате Αρρ^ά Вюкук!етк 7500 или 7900.
Количественная ОТ-ПЦР.
Количественную оценку мРНК выбранных генов проводили с использованием стандартных анализов ТоцМоп аккаук (Αρρ^ά Вюкук!етк). Реакцию обратной транскрипции осуществляли с использованием рандомизированных декамеров, 0,5 мкг полноразмерной РНК и фермента ОТ вируса М-МЙУ от ΑтЬ^οη в соответствии со стандартным протоколом. Затем кДНК первой цепи 10-кратно разводили в воде, не содержащей нуклеазы, после чего ее добавляли в реакционную смесь для ОТ-ПЦР. Двукратные серийные разведения кДНК, полученной из полноразмерной РНК печени животных, обработанных физиологическим раствором, или реакционная смесь кДНК ложнотрансфицированных клеток (где использовали в 2,5 раз большее количество полноразмерной РНК, чем в образцах) служили в качестве стандарта для гарантии прохождения амплификации в линейном режиме (количество или относительное число копий). ПЦР-амплификацию проводили в режиме реального времени на аппарате Αρρ^ά Вюкук!етк 7500 или 7900.
Оценка метаболизма.
У животных, непосредственно перед их умерщвлением, из области ретроорбитального синуса брали кровь и эту кровь собирали в Ε^ΤΑ-содержащие пробирки с последующим выделением фракции плазмы. Общий уровень холестерина в плазме анализировали с использованием устройства АВХ РеШа СНо1ек!его1 СР (НопЬа Сго^, НопЬа ЛΒX Охад^^с^ в соответствии с инструкциями производителей.
Измерение уровней ферментов печени (Α^ и Α8Γ).
Сыворотку, взятую от каждой отдельной мыши, приготавливали следующим образом. Пробы крови хранили при комнатной температуре в течение 2 ч, а затем центрифугировали (10 мин, 3000 об/мин при комнатной температуре). После центрифугирования сыворотку собирали и замораживали при -20°С.
Измерение уровней ферментов и Α8Τ проводили в 96-луночных планшетах с использованием реагентов для и Α8Χ поставляемых от ЛΒX РеШта, в соответствии с инструкциями производителей. Вкратце, пробы сыворотки 2,5-кратно разводили Н20 и каждую пробу анализировали в дубликате. После добавления в каждую лунку 50 мкл разведенной пробы или стандарта (многие из них поставлялись компанией ЛΒX РеШа) в эти лунки добавляли 200 мкл смеси реагентов для Α8Τ или при 37°С. Определение кинетических параметров проводили при 37°С на спектрофотометре в течение 5 мин с интервалом в 30 с на длине волны 340 нм.
Пример 27. Модуляция репликации вируса гепатита С под действием ^NΑ-аη!^т^Κ (8РС3649).
Олигонуклеотиды, используемые в данном примере (прописные буквы: ΌΝΑ, строчные буквы: ДНК, цитозины ΌΝΑ являются метилированными, а ΌΝΑ предпочтительно представляют собой В-Оокси-ΕΝΑ (надстрочный индекс о после остатка ΌΝΑ).
ЗРС3649 (ША-ап1:1т1К,
ЗРС3648 (ЬЫА-апЫппК, нацеленный на т1К-122, лабораторном синтезе, и обозначен ЗРС3548) анти-122,
2'ОМе-СЕг1: смешанный 2'ОМе-модифицированныи контроль комплементарный πιιΚ-122 олигонуклеотид,
Было показано, что репликация вируса гепатита С (НСУ) стимулируется т1К-122 и в соответствии с этим было продемонстрировано, что ингибирование т1К-122 оказывает влияние на репликацию НСУ в клеточной модели гепатомы ίη уйго. Авторами настоящего изобретения была проанализирована эффек
- 55 015570 тивность 8РС3649 в отношении снижения уровня репликации НСУ в клеточной модели НиН-7. Различные молекулы ^NΑ-аηΐ^ш^Κ, а также антисмысловой и смешанный 2'ОМе-олигонуклеотид переносили в клетки НиН-7 и оставляли на 48 ч для репликации НСУ. Образцы полноразмерной РНК, экстрагированной из клеток НиН-7, подвергали нозерн-блот-анализу.
Пример 28. Улучшенный антисмысловой олигонуклеотид ΓΝΑ^ηΐ^ίΚ™, нацеленный на ш1К-21. Зрелая последовательность ш1К-21, взятая из базы данных тПНВазе Института Сэнгера:
>Ъза-ш1К-21 ΜΙΜΑΤ0000076 идосиидисАСАсисАисиисА (зе<2 ю νο 4) >шти-т1К-21 ΜΙΜΑΤ0000530 иАосиидисАСАсисАисиисА (зе<2 ю νο 64)
Последовательность соединений:
8РС3521 ιηίΚ-21 (гэп-мерная конструкция)
ЗРС3870 т1К-21(мМ)
5'-ЕАМ ТССдЬсЕЬадааСАТа-3'
ЗРС3825 ιηϊΚ-21
ТсТдЬСАдаТаСдАТ-3 конструкция) (ЗЕО ΙΌ N0 πύΚ-21 (мМ) πιΐΚ-21 5’5'
ЕАМ
-ЕАМ ТсАдИСТдаТаАдСТ-З’ТсАСЬСТСаТаАдСТ-3' (новая конструкция) - (5Е<2 Ю N0 69)
Все соединения имели полностью или почти полностью тиолированный остов, а также содержали метку ΡΑΜ у 5'-конца.
Было обнаружено, что ш1К-21 активируется в глиобластоме (СКан е! а1. Сапсег КезеагсК, 2005, 65 (14), р. 6029) и в раковых клетках молочной железы (Ιοιίο е! а1. Сапсег КезеагсК, 2005, 65 (16), р. 7065), а поэтому считается, что ш1К-21 является потенциальной онкогенной микроРНК. СКаи е! а1. также указывали на индуцирование апоптоза клеток глиобластомы в результате ингибирования ш1К-21 под действием 2'ОМе- или ΡΝΑ-модифицированных антисмысловых олигонуклеотидов. Следовательно, агенты, ингибирующие ш1К-21, являются потенциальными терапевтическими средствами для лечения глиобластомы и других солидных опухолей, таких как рак молочной железы. Авторами настоящего изобретения был представлен улучшенный ΡΝΑ-модифицированный олигонуклеотид, направленный против ш1К-21, ^NΑ-аηΐ^ш^Κ™, который, как было неожиданно обнаружено, обладает хорошей способностью ингибировать молекулу ш1К-21, которая является подходящей мишенью для вышеупомянутых терапевтических целей.
Подходящими терапевтическими способами введения являются, например, внутричерепные инъекции в область локализации глиобластомы, внутриопухолевые инъекции в глиобластому и раковую опухоль молочной железы, а также системная доставка при раке молочной железы.
Ингибирование ш1К-21 в клеточной линии глиобластомы И373 и в клеточной линии рака молочной железы ΜСΡ-7.
Эффективность современных препаратов ΓΝΑ^οΙ^Ε™ и контрольных олигонуклеотидов оценивали путем их трансфекции при различных концентрациях в клеточные линии И373 и ΜСΡ-7, которые, как известно, экспрессируют ш1К-21 (или в других ш1К-21-экспрессирующих клеточных линиях). Трансфекцию осуществляли в соответствии со стандартным протоколом, проводимым с использованием липофектамина 2000 (ΙηνίίΐΌββη). Через 24 ч после трансфекции клетки собирали и полноразмерную РНК экстрагировали в соответствии с протоколом с использованием тризола (ΙηνίίΐΌββη). Оценку уровней ш1К-21, в зависимости от применяемого лечения и используемой концентрации, проводили с помощью т1К-21-специфической ОТ-ПЦР в режиме реального времени, где в качестве праймеров использовали структуру стебель-петля ^ррИеб Β^ο8у8ΐеш8), или альтернативно, с помощью т1К-21-снецифических нозерн-блот-анализов без использования радиоактивных меток. В клетках, трансфицированных ΡΝΑаηΐ^ш^Κ, детектируемые уровни ш1К-21, в отличие от клеток, трансфицированных носителем, используемым в качестве контроля, указывали на ингибирующую способность ΕΝΑ-πηΝι-πίΚ'1 ™.
Функциональное ингибирование ш1К-21, оцениваемое по активации гена-мишени для ш1К-21.
Эффект антагонистического воздействия на ш1К-21 исследовали путем клонирования последовательности-мишени для ш1К-21 с полным соответствием, где указанные исследования проводили с применением стандартной репортерной системы на основе люциферазы КешПа (между кодирующей последовательностью и 3'ϋΤΚ, ρ8^СНΕСК-2, Рготеда) (см. пример 29). Репортерную конструкцию и ΡΝΑаηΐ^ш^Κ™ котрансфицировали в ш1К-21-экспрессирующие клеточные линии (например, И373, ΜСΡ-7). Через 24 ч после трансфекции в буфере для пассивного лизиса клетки собирали и измеряли активность люциферазы в соответствии со стандартным протоколом (Рготеда, Опа! ЕисИегазе КероПег Α88ау 8у81£ш). Индуцирование активности люциферазы проводили в целях демонстрации функционального ингибирующего воздействия ΕΝΑ-πηΡι-πίΚ™ на ш1К-21.
- 56 015570
Пример 29. Анализ с использованием люциферазного репортера для оценки функционального ингибирования микроРНК под действием Ι/ΝΑ-πη^ίΚ. и других олигонуклеотидов, нацеленных на микроРНК: общий анализ новой и улучшенной новой конструкции как предпочтительных конструкций для блокирования функции микроРНК.
Олигонуклеотиды, используемые в данном примере (прописные буквы: Ι.ΝΑ, строчные буквы: ДНК) для оценки дерепрессирующего действия олигонуклеотида ^NΑ-аηΐ^т^Κ на люциферазный репортер, проводимой с использованием клонированной последовательности-мишени для микроРНК, путем блокирования соответствующей микроРНК.___
мишень: Нза-т1К-122а ΜΙΜΑΤ0000421
цддадидидасааиддидиииди
скринирован в клеточной линии.ΗϋΗ-7, экспрессирующей πιϊΚ-122
Олиго #, микроРНК-мишень г олигонуклеотидная последовательность Конструкция
3962: ιηϊΚ-122 5'-АСААасассаббдбсасасТССА-3' Полный комплемент г ГЭП
3965: ιηίΚ-122 5'-асааасАССАТТСТсасасбсса-З' Полный комплемент, блок
3972: ιηίΚ-122 5 '-асАааСасСабТд-ЬСасАсбСса-З ' Полный комплемент, ЬЫА_3
3549 (3649) :ιηίΚ-122 5 ' -СсАСЪСТсаСаСХСС-3 ' Новая конструкция
3975: πιϊΚ-122 5 ' -СсАбТСТсаСАСЪСС-З ' Улучшенная новая конструкция
мишень: Иза-т1К-19Ь ΜΙΜΑΤ0000074
цдцдсаааиссаидсаааасида
скринирован в клеточной линии НеЬа, экспрессирующей Ш1К-19Ь
Олиго #, микроРНК-мишень, олигонуклеотидная последовательность конструкция
3963: ш1К-19Ь 5'-ТСАССЪЪЪдсаСддаЪЪЪдСАСА-З' Полный комплемент, гэп
3967: гп1К-19Ь 5 ' -ЬсадкЪТТССАТССаЪЪЪдсаса-З' Полный комплемент, блок
3973: Ш1К-19Ь 5'-ГсАдбТббСсаТддАббТдсАса-З' Полный комплемент, ΗΝΑ_3
3560: т1К-19Ь 5'-ТдСабССабТЪСсАС-З' Новая конструкция
3976: Ш1К-19Ь 5'-ТдСаТССабТТСсАС-З’ Улучшенная новая конструкция
мишень: Нза-ш1К-155 ΜΙΜΑΤ0000646
ииааидсиааисдцдаиадддд
скринирован в клеточной линии 518А2, экспрессирующей πιίΚ-155
Олиго #, микроРНК-мишень, олигонуклеотидная Конструкция
последовательность
3964: ιηίΚ-155 5'-ССССбабсасдаСбадсаТТАА-З' Полный комплемент, гэп
3968: πιίΚ-155 5 '-ссссбаТСАССАТТадсаббаа-З ' Полный комплемент, блок
397 4: πιϊΚ-155 5 ' -сСссТакСасСабТадСакТаа-З ' Полный комплемент, 1ιΝΑ_3
3758: πιίΚ-155 5 '-ТсАсдАТбаСсАСТА-З ' Новая конструкция
3818: πιίΚ-155 5 '-ТсАсСАТЪаССАСТА-З ' Улучшенная новая конструкция
- 57 015570
8БЭ ΙΌ ΝΟ являются такими, как они были указаны выше.
Репортерную плазмиду (рз1Сйеск-2 Рготеда), кодирующую варианты люцифераз, а именно люциферазу коралла КепШа и люциферазу светляка, конструировали так, чтобы 3'ИТК люциферазы КепШа включала одну копию последовательности, полностью комплементарной исследуемой миРНК.
Клетки, эндогенно экспрессирующие исследуемые миРНК (НиН-7 для т1К-122а, НеЬа для т1К-19Ь, 518Α2 для т1К-155), котрансфицировали олигонуклеотидами ^NΑ-аη!^т^Кз или другими т1К-связывающими олигонуклеотидами (полностью комплементарными, т.е. полноразмерными) и соответствующей репортерной плазмидой, комплементарной микроРНК-мишени, с использованием липофектамина 2000 (1пуйгодеп). Трансфекцию и измерение люциферазной активности осуществляли в соответствии с инструкциями производителей (с помощью набора, содержащего липофектамин 2000, 1пуйгодеп/две люциферазы Рготеда) с использованием 150000-300000 клеток на лунку в 6-луночных планшетах. Для компенсации различий в плотности клеток и эффективностей трансфекции сигнал люциферазы коралла КепШа нормализовали по отношению к сигналу люциферазы светляка. Все эксперименты проводили с тремя повторностями.
Неожиданно было обнаружено, что новая конструкция и улучшенная новая конструкция являются наилучшими функциональными ингибиторами всех трех микроРНК-мишеней, т1К-155, т1К-19Ь и т1К122 (фиг. 27, 28, 29). Полученные результаты систематизированы в табл. 3.
Систематизированные результаты.
Таблица 3
Степень дерепрессии функции эндогенных т1К-155, т1К-19Ь и т1К-122а под действием различных конструкций ^NΑ-аη!^т^К
Конструкция πιίΚ-155 т1К-19Ь т1К-122а
Улучшенная новая * * * ★ * * данные
конструкция отсутствуют
Новая конструкция * * * ★ * * ***
Полный комплемент, ΕΝΑ 3 * * *** * *
Полный комплемент, блок * * ★ А * *
Полный комплемент, гэп * не значимый не значимый
Библиография
Α^^^ б.Р. е! а1., 2005. 8с^епсе. 310: 317-20.
Ваг!е1, Б.Р. 2004. Се11, 116: 281-297.
Воейт, М., 81аск, Р. 2005. 8с1епсе. 310: 1954-7.
Вгеппеске, 1. е! а1., 2003. Се11, 113: 25-36.
Сайп, Ο.Α. е! а1., 2002. Ргос. Ка!1. Αсаб. 8с1. ϋ8Α, 99: 15524-15529. Сайп, Ο.Α. е! а1., 2004. Ргос. Ка!1. Αсаб. 8с1. ϋ8Α, 101: 2999-3004. Сайп, Ο.Α. е! а1., 2005. Ν. Ε^1. 1. Меб. 353: 1793-801.
Сйап, 6.Α^! а1., 2005. Сапсег Кез. 65: 6029-33.
Сйеп, С.2., е! а1., 2004. 8с1епсе. 303: 83-86.
Сйеп, 6.Г., е! а1., 2005. Ка!. Оепе!. Эес. 25, абуапсе опйпе риЬйсайоп. Εΐδ, Р.8. е! а1., 2005. Ргос. Ма!1. Αсаб. 8с1. ϋ8Α. 102: 3627-32.
О1га1бе7, Α.6. е! а1., 2005. 8с^епсе. 308: 833-838.
^ηГГΐ!йз-^опез. 8. е! а1,. 2004. МисЫс Α^δ Кез. 32: Ό109-Ό111. ^^^ГГΐ!йз-^опез. 8., е! а1., 2006. МисЫс Α^δ Кез. 34: Ό140-4 Не, Ь. е! а1., 2005. МаШте, 435: 828-833.
Нотз!ет, Ε. е! а1., 2005. Ν^ηιό, 438: 671-4.
НШуадпег, О. е! а1., 2001. 8с^епсе. 293: 834-838.
НШуадпег, О. е! а1., 2004. Р1,о8 Вю1оду, 2: 1-11.
1опо, М.У. е! а1., 2005. Сапсег Кез. 65: 7065-70.
Лп, Р. е! а1., 2004, Ν! Се11 Вю1. 6: 1048-53. бойпзоп, 8.М. е! а1., 2005. Се11, 120: 635-647. борйпд, С.Ь. е! а1., 2005. 8с1епсе, 309: 1577-81.
Кейтд, К.Р. е! а1., 2001. Оепез Эеу. 15: 2654-2659.
Куоп, С. е! а1., 2005. Ргос. ΝΟ. Αсаб. 8с1. ϋ8Α. 102: 18986-91. Еапб!йа1ег, М. е! а1., 2004. Сигг. Вю1. 14: 2162-2167.
Ьеатап, Ό. е! а1., 2005. Се11, 121: 1097-108.
Лее, Υ., е! а1., 2003. 425: 415-419.
Ь1, X. и СагШе^, К.А. 2005. Се11, 123: 1267-77.
Ен. б. е! а1., 2005. Ν^π^, 435: 834-838.
М1сйае1, М.2. е! а1., 2003. Мо1. Сапсег Кез. 1: 882-891.
- 58 015570 №1§оп, Р. е! а1., 2003. Т1В8, 28: 534-540.
Раикйкт, 8., е! а1., 2002. Сшт. 0ρίη. Се11 Вю1. 14: 305-312. Роу, Μ.Ν. е! а1., 2004. Уинге, 432: 226-230.
^енНоИ^ Е. е! а1., 2005. 8^1^, 309: 310-311.
Υекίа, 8. е! а1., 2004. 8^1^, 304: 594-596.
/Уо, Υ. е! а1., 2005. Уинге, 436: 214-220.
- 59 015570 <110>
Список последовательностей
ЗапЬагхз А/3
<120> ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ
<130> 16870РСТ00
<160> 109
<170> РаЕепЫп νετ^ίοη 3.3
<210> 1
<211> 23
<212> РНК
<213> Ното зархепз
<400> 1
иддадидида сааиддидии иди 23
<210>
<211>
<212>
<213>
РНК
Ното зархепз <400>
идидсаааис саидсаааас ида <210>
<211>
<212>
<213>
ΡΗΚ
Нотоз заргепз <400>
ииааидсиаа исдидаиадд <210>
<211>
<212>
<213>
РНК
Ното заргепз <400>
иадсииаиса дасидаидии да <210>
<211>
<212>
<213>
ζζ
РНК
Ьото заргепз <400>
ииидиисдии сддсисдсди да <210>
<211>
<212>
<213>
ДНК
Ьото зархепз
- 60 015570
<400> ббрдса 6 6
<210> <211> <212> <213> 7 6 ДНК Ното зартепз
<400> асасбс 7 6
<210> <211> <212> <213> 8 6 ДНК Ното зар1епз
<4 00> адсабб 8 6
<210> <211> <212> <213> 9 6 ДНК Ното зартепз
<400> 9
сдааса 6
<210> <211> <212> <213> 10 6 ДНК Ното зартепз
<400> абаадс 10 6
<210> <211> <212> <213> 11 23 ДНК Искусственная последовательность
<220> <223> Полный комплемент гэп-мер, ЬЫА в положениях 1-4 и 20-23
<4 00> 11
асааасасса РбдЬсасас! сса 23
<210> <211> <212> <213> 12 23 ДНК Искусственная последовательность
<220> <223> Полный комплемент, блок-мер, ЬИА в положениях 7-14
<400> 12
асааасасса брдбсасасб сса 23
- 61 015570 <210> <211>
<212>
<213>
днк
Искусственная последовательность <220>
<223>
Полный комплемент, ЬЫА смешанный мономер-ЬЖ, в 3-положении, а затем в каждом третьем положении <400> асааасасса ВЪдксасасЬ сса <210>
<211>
<212>
<213>
ДНК
Искусственная последовательность <220>
<223>
Остатки ЬЫА в положениях 1,3,6,7,10,12,14 и 15 <400> ссаРРдксас асксс <210>
<211>
<212>
<213>
ДНК
Искусственная последовательность <220>
<223>
Остатки ЬЫА в положениях 1, 3, 5, 6, 7, 10, 11, 12, 14, 15 <400> ссаккдксас асбсс <210>
<211>
<212>
<213>
ДНК
Искусственная последовательность <220>
<223>
Остатки Ι,ΝΑ в положениях 1-5, 7-10, 12 и 13.
<400> аЪВд-Ьсасас 5сс <210>
<211>
<212>
<213>
ДНК
Искусственная последовательность <220>
<223>
Остатки ΠΝΑ в положениях 1-3, 5-8, 10 и 11.
<400>
БдЬсасасЪс с
- 62 015570 <210> 18 <211> 15 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Все остатки ЬЫА, за исключением остатков в положениях 2, 4, 5, 8, 9, 11, 13, которые представляют собой 2'-ОМе <400>18 ссаббдбсас асбсс15 <210>19 <211> 15· <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Все остатки Ы4А, за исключением остатков в положениях 2, 4, 5, 8, 9, 11, 13, которые представляют собой 2'-фтор <400>19 ссаббдбсас асбсс 15 <210> 20 <211>23 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Полный комплемент гэп-мер, ΠΝΑ в положениях 1-4 и 20-23 <400>20 бсадббббдс абддабббдс аса23 <210> 21 <211>23 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Полный комплемент, блок-мер, ЬЫА в положениях 7-14 <400>21
БсадББББдс абддабббдс аса23 <210> 22 <211>23 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Полный комплемент, ЬЫА смешанный мономер-ΣΝΑ, в 3-положении, а затем в каждом третьем положении <400> 22
- 63 015570 бсадббЪРдс абддабРбдс аса <210> 23 <211> 15 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Остатки Ι,ΝΑ в положениях 1, 3, 6, 7, 10, 12, 14 и 15 <400>23
ЪдсабддаЪЪ Ьдсас15 <210>24 <211>15 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Остатки ЬЫА в положениях 1, 3, 5, 6, 7, 10, 11, 12, 14, 15 <400>24
Одсабддабб бдсас <210>25 <211>13 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Остатки ΣΝΑ в положениях 1, 3-5, 7-10, 12 и 13 <400> 25 сакддайкЪд сас <210> 26 <211> 11 <212> ДНК <213 > Искусственная последователь ноеть <220>
<223> Остатки ΗΝΑ в положениях 1-3, 5-8, 10 и 11 <400>26
ЬддаЪГГдса с <210>27 <211>15 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Все остатки ЬЫА, за исключением остатков в положениях 2, 4, 5, 8, 9, 11, 13, которые представляют собой 2'-ОМе <400> 27
Ъдсабддабб бдсас 15
- 64 015570 <210> 28 <211> 15 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Все остатки ΣΝΑ, за исключением остатков в положениях 2, 4, 5, 8, 9, 11, 13, которые представляют собой 2'-фтор <400>28
Рдсабддабб бдсас15 <210>29 <211> 22 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Полный комплемент гэп-мер, ΣΝΑ в положениях 1-4 и 20-23 <400>29 ссссбабсас даббадсабб аа22 <210>30 <211> 22 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Полный комплемент, блок-мер, ΣΝΑ в положениях 7-14 <400>30 ссссбабсас даббадсабб аа22 <210>31 <211> 22 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Полный комплемент, ΣΝΑ смешанный мономер-ΣΝΑ, в 3-положении, а затем в каждом третьем положении <400>31 ссссбабсас даббадсабб аа22 <210>32 <211>15 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Остатки ΣΝΑ в положениях 1, 3, 6, 7, 10, 12, 14, 15 <400> 32
- 65 015570
- 66 015570 <400> 37 бсасдаббад сабба <210> <211>
<212>
<213>
ДНК
Искусственная последовательность <220>
<223>
Полный комплемент гэп-мер, ЬИА в положениях 1-4 и 20-23 <400> 38 бсаасабсад бсбдабаадс ба <210> <211>
<212>
<213>
ДНК
Искусственная последовательность <220>
<223>
Полный комплемент, блок-мер, ЬЫА в положениях 7-14 <400> бсаасабсад бсбдабаадс ба
ДНК
Искусственная последовательность <220>
<223>
Полный комплемент, ЬЫА смешанный каждом третьем положении мономер-ЬИА, в 3-положении, а затем в <400> 40 бсабсабсад бсбдабаадс бб <210>
<211>
<212>
<213>
ДНК
Искусственная последовательность <220>
<223>
<400> бсадбсбдаб аадсб
Остатки ЬМА в положениях 1,3,6,7,10,12,14 и 15 <210>
<211>
<212>
<213>
ДНК
Искусственная последовательность <220>
<223>
Остатки 6ΝΑ в положениях 1, 3, 5, 6, 7, 10, 11, 12, 14, 15 <400>
бсадбсбдаб аадсб
- 67 015570 <210>
<211>
<212>
<213>
ДНК
Искусственная последовательность <220>
<223>
Остатки ЬЫА в положениях 1-5, 7-10, 12 и 13, <400> адбсбдабаа дсб <210>
<211>
<212>
<213>
ДНК
Искусственная последовательность <220>
<223>
Остатки ЬЫА в положениях 1-3, 5, 7-11 <400> 44 бсадбсбдаб аадсб <210> <211>
<212>
<213>
ДНК
Искусственная последовательность <220>
<223>
Все
И, остатки ЬЫА, за исключением остатков в положениях 2, 4,
13, которые представляют собой 2'-ОМе <400> бсадбсбдаб аадсб <210>
<211>
<212>
<213>
ДНК
Искусственная последовательность <220>
<223>
Все
И, остатки 1ΝΑ, за исключением остатков в положениях 2, 4,
13, которые представляют собой 2'-фтор <400> бсадбсбдаб аадсб <210> 47 <211> 22 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Полный комплемент гэп-мер, ЬМА в положениях 1-4 и 20-23 <400> 47
- 68 015570
ЕсЕсдсдЕдс сдЕЕсдЕЕсЕ СЕ 22 <210> 48 <211> 22 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Полный комплемент, блок-мер, ЬИА в положениях 7-14 <400> 48
ЕсЕсдсдЕдс сдЕЕсдЕЕсЕ ЕЕ 22 <210>
<211>
<212>
<213>
ДНК
Искусственная последовательность <220>
<223>
Полный комплемент, ΠΝΑ смешанный мономер-Ι,ΝΑ, в каждом третьем положении
3-положении, а затем в <400>
ЕсЕсдсдЕдс сдЕЕсдЕЕсЕ ЕЕ <210>
<211>
<212>
<213>
ДНК
Искусственная последовательность <220>
<223>
Остатки ЬИА в положениях 1, 3, 6, 7, 10, 12, 14, <400>
дЕдссдЕЕсд ЕЕсЕЕ <220>
<223>
ДНК
Искусственная
Остатки ЬИА в последовательность положениях 1, 3, 5-7, 10-12, 14 и <400>
дЕдссдЕЕсд ЕЕсЕЕ
<210> 52
<211> 13
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220> <223> Остатки ЬЫА в
<400> 52
последовательность положениях 1-5, 7, 9-13
- 69 015570 дссдЪЪсдкб сбб 13 <210> 53 <211> 11 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Остатки 1ΝΑ в положениях 1-4, 6-11 <400>53 сд'ЬНсдНЬс·!: ϋ11 <210>54 <211>15 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Все остатки ЪИА, за исключением остатков в положениях 2, 4, 5, 8, 9,
11, 13, которые представляют собой 2'-ОМе <400>54 дбдссдббсд ббсбб15 <210>55 <211>15 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Все остатки ЬЫА, за исключением остатков в положениях 2, 4, 5, 8, 9,
11, 13, которые представляют собой 2'-фтор <400>55 дрдссдббсд ббсбб15 <210>56 <211> 16 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Фосфортиоатный остов, ΗΝΑ в положении 2, а затем в каждом третьем положении <400>56 ссаббдбсас асбсса16 <210>57 <211> 16 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
- 70 015570 <223> Фосфортиоатный остов, Ι,ΝΑ в положении 3, а затем в каждом третьем положении <400>57 ссаЕЕдЕсас асЕсса16 <210>58 <211> 16 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Фосфортиоатный остов - гэп-мерная конструкция, содержащая ΕΝΑ в положениях 1-3 и 13-15 <400> 58' ссаЕЕдЕсас асЕсса16 <210>59 <211>15 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Фосфортиоатный остов, ΕΝΑ в положениях 1, 3, 6, 7, 10, 12, 14 и 15 <400>59 ссаЕЕдЕсас асЕсс15 <210> 60 <211>15 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Фосфортиоатный остов, ЬЫА в положениях 1, 3, 6, 7, 10, 12, 14 и 15, цитозины ΕΝΑ являются метилированными <400> 60 ссаЕЕсЕдас ссЕас 15 <210> 61 <211> 16 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Фосфортиоатный остов, ΕΝΑ в положении 3, а затем в каждом третьем положении <400> 61 ссаЕЕдЕсЕс ааЕсса 16
- 71 015570 <210> 62 <211> 13 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Фосфортиоатный остов, ЬЫА в положениях 1, 4, 5, 8, 10, 12 и 13 <400>62 аббдбсасас Вес13 <210>63 <211>15 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Полностью фосфортиоатный остов, ΣΝΑ в положениях 1, 3, 6, 7, 10, 12, 14 и 16, все цитозины ΠΝΑ являются метилированными. ΠΝΑ предпочтительно представляют собой бета-О-окси-ΠΝΑ.
<400>63 ссаббсбдас ссбас15 <210>64 <211> 22 <212> РНК <213> Ното зараепз <400>64 иадсииаиса дасидаидии да22 <210>65 <211> 16 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Гэп-мерная конструкция, необязательная ЕАМ-метка у 5'-конца, ЬЫА в положениях 1-3 и 13-15 <400> 65 бсадбсбдаЪ аадсба 16 <210> 66 <211> 16 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Гэп-мерная конструкция, необязательная ЕАМ-метка у 5'-конца, 1.ΝΆ в положениях 1-3 и 13-15 <400> 66
- 72 015570 бссдбсббад аадаба <210> 67 <211> 15 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Необязательная РАМ-метка у 5'-конца, 12, 13 и 15 <400> 67 бсбдбсадаб асдаб
ΣΝΑ в положениях 1,
3,
6,
Ю, <210> 68 <211> 15 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Необязательная ЕАМ-метка у 5'-конца,
12, 13 и 15
ΣΝΑ в положениях 1,
3,
6, 7,
10, <400> 68 бсадбсбдаб аадсб <210> 69 <211> 15 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Необязательная РАМ-метка у 5'-конца,
8, 10, 12, 14 и 15
ΣΝΑ в положениях 1,
3, 4,
6, 7, <400>69 бсадбсбдаб аадсб
<210> 70
<211> 7
<212> ДНК
<213> Ното зарФепз
<400> 70
абббдса <210>71 <211> 8 <212> ДНК <213> Ното зархепз <400>71 дабббдса <210>72 <211>9 <212> ДНК
- 73 015570 <213> Ното зархепз <400>72 ддсБЪЕдса
<210> 73
<211> 7
<212> ДНК
<213> Ното зархепз
<400>73 сасасБс <210>74 <211> 8 <212> ДНК <213> Ното зархепз <400>74
ЕсасасЬс
<210> 75
<211> 9
<212> ДНК
<213> Ното
<400> 75
дбсасасБс
<210> 76
<211> 7
<212> ДНК
<213> Ното
<400> 76
ЕадсаББ
епз
<210> 77
<211> 8
<212> ДНК
<213> Ното
<400> 77
ЕБадса ББ
епз
<210> 78
<211> 9
<212> ДНК
<213> Ното
<4 00> 78
аббадса-Ы:
хепз <210> 79 <211> 7 <212> ДНК
- 74 015570
<213> <400> асдаасг Ното 79 1 заргепз 7
<210> 80
<211> 8
<212> ДНК
<213> Ното заргепз
<400> 80
аасдааса 8
<210> 81
<211> 9
<212> ДНК
<213> Ното зар1епз
<400> 81
даасдааса 9
<210> 82
<211> 16
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК/ЬЫА-олигонуклеотид, ЬЫА в положении 3, а затем в каждом третьем
положении. Предпочтительно, фосфортиоат, предпочтительно, окси-ΕΝΆ. Цитозины ΏΝΑ предпочтительно являются метилированными <400>82
ЕдсаЕддаЫ: Едсаса .16
<210> <211> <212> 83 15 ДНК
<220> <223> ДНК/ЬЫА-олигонуклеотид, ЬЫА в положении 3, а затем в каждом третьем положении. Предпочтительно, фосфортиоат, предпочтительно, окси-ЬЫА. Цитозины ЬЫА предпочтительно являются метилированными
<400>83
ЪдсаЕддаЕЪ Едсас15
<210> <211> <212> <213> 84 13 ДНК Искусственная последовательность
<220> <223> ДНК/ЬЫА-олигонуклеотид, ЬЫА в положении 1, а затем в каждом третьем положении. Предпочтительно, фосфортиоат, предпочтительно, окси-ΈΝΑ. Цитозины ЬЫА предпочтительно являются метилированными
- 75 015570 <400>84 саОддабОЕд сас13 <210>85 <211>15 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ДНК/ПЫА-олигонуклеотид, ЬЫА в положении 2, а затем в каждом третьем положении. Предпочтительно, фосфортиоат, предпочтительно, окси-ША. Цитозины ЬЫА предпочтительно являются метилированными <400> 85
ЕдсаЕддаЕЬ. Едсас 15 <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
ДНК
Искусственная последовательность
ДНК/ЬЦА-олигонуклеотид, ША в положении 2, а затем в каждом третьем положении. Предпочтительно, фосфортиоат, предпочтительно, окси-ЬЫА. Цитозины ЬЫА предпочтительно являются метилированными <400> 86 саОддаОООд сас <210>
<211>
<212>
<213>
ДНК
Искусственная последовательность <220>
<223>
ДНК/ЬЫА-олигонуклеотид, ЦЫА в положениях 1, 4, Предпочтительно, фосфортиоат, предпочтительно, предпочтительно являются метилированными
5, 8, 10, окси-ЦЦА.
и 13. Цитозины
ША <400> саОддаОЪЬд сас <210>
<211>
<212>
<213>
ДНК
Искусственная последовательность <220>
<223>
ДНК/ЬЦА-олигонуклеотид, ЬЫА в положениях 1, 3 Предпочтительно, фосфортиоат, предпочтительно предпочтительно, являются метилированными
6, 7, 10, окси-ΠΝΑ.
12, 14 и
Цитозины
15.
ЬИА <400>
- 76 015570
ЕдсаЕддаЬЬ Едсас 15 <210> 89 <211> 16 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ДНК/ЬЫА-олигонуклеотид, ЬЫА в положениях 1, 3, 5, Ί, 9, 10, 14 и 15. Предпочтительно, фосфортиоат, предпочтительно, окси-ЬЫА. Цитозины ЬЫА предпочтительно являются метилированными <400>89
ЪдсаЪддаЦЪ Едсаса16 <210>90 <211> 16 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ДНК/ЬЫА-олигонуклеотид, ΙιΝΑ в положении 2, а затем в каждом втором положении. Предпочтительно, фосфортиоат, предпочтительно, окси-ЬЫА. Цитозины ЬЫА предпочтительно являются метилированными <400> 90 ссаЬЬдЬсас асЬсса 16 < ζ ι и > а ι <211> 16 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ДНК/ЬЫА-олигонуклеотид, ЬЫА в положении 2, а затем в каждом третьем положении. Предпочтительно, фосфортиоат, предпочтительно, окси-ΙιΝΑ. Цитозины ЬЫА предпочтительно являются метилированными <400>91 ссабЕдРаас ЪсЕсса16 <210>92 <211> 16 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ДНК/ЬЫА-олигонуклеотид, ЬЫА в положении 3, а затем в каждом третьем положении. Предпочтительно, фосфортиоат, предпочтительно, окси-ЬЫА. Цитозины ЬЫА предпочтительно являются метилированными <400>92 ссаЕЬдЕсас асбсса16 <210>93 <211>15
- 77 015570 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ДНК/ЬЫА-олигонуклеотид, 1·ΝΑ в положении 2, а затем в каждом третьем положении. Предпочтительно, фосфортиоат, предпочтительно, окси-ЬЫА. Цитозины 1ΝΆ предпочтительно являются метилированными <400>93 ссакбдбсас асбсс15 <210>94 <211>13 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ДИК/ЦЫЛ-олигонуклеотид, ЬИА в положении 3, а затем в каждом третьем положении. Предпочтительно, фосфортиоат, предпочтительно, окси-ЬЫА. Цитозины ЬЫА предпочтительно являются метилированными <400>94 аЦЦдбсасас Ъсс13 <210>95 <211>15 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ДНК/ЦЦА-олигонуклеотид, ΠΝΑ в положении 3, а затем в каждом третьем положении. Предпочтительно, фосфортиоат, предпочтительно, окси-ΗΝΑ. Цитозины ΠΝΑ предпочтительно являются метилированными <400>95 ссабрдрсас асбсс15 <210>96 <211>13 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ДНК/ЬЖ-олигонуклеотид, Ι3ΝΑ в положении 1, а затем в каждом третьем положении. Предпочтительно, фосфортиоат, предпочтительно, окси-ЬЫА. Цитозины ЬИА предпочтительно являются метилированными <400>96 аЪЪдЪсасас Рсс13 <210>97 <211>13 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
- 78 015570 <220>
<223>
ДНК/ЬЫА-олигонуклеотид, ΠΝΑ в положении 2, а затем в каждом втором положении. Предпочтительно, фосфортиоат, предпочтительно, окси-ЬЫА. Цитозины ША предпочтительно являются метилированными <400> аббдбсасас Осс <210>
<211>
<212>
<213>
ДНК
Искусственная последовательность <220>
<223>
ДНК/ЬИА-олигонуклеотид, ΠΝΑ в положениях 1, 4, Предпочтительно, фосфортиоат, предпочтительно, предпочтительно являются метилированными
5, 8, 10, окси-ША, и 13.
Цитозины
ША <400> аббдбсасас Осс <210>
<211>
<212>
<213>
ДНК .
Искусственная последовательность
ПШ/ /Т МЙ_АПТЛПГ>ЬИ7Ъ-П^х>тт/П ТЫЛ о η л пл , гтх/ 1 цшчхл-и! νυπαι. χν^χч-ж ух^А < иип и χ х о а х илхд; л. гх лл χ г
Предпочтительно, фосфортиоат, предпочтительно, предпочтительно являются метилированными с з 1 η '-'А ' ! г окси-ЬЫА.
П 1 Л
- I ХЧ VI
Цитозины
ΠΝΑ <400> ссаббдбсас асбсс <210>
<211>
<212>
<213>
100
ДНК
Искусственная последовательность <220>
<223>
ДНК/ЬЫА-олигонуклеотид, ΣΝΑ в положениях 1, 4, Предпочтительно, фосфортиоат, предпочтительно, предпочтительно являются метилированными
7, 11, 15. окси-ЬЫА. Цитозины
ЬИА
100 <400> ссаббдбсас асбсса <210>
<211>
<212>
<213>
101
ДНК
Искусственная последовательность <220>
<223>
ДНК/ЬЫА-олигонуклеотид, ЬЫА в положениях 1-3 и Предпочтительно, фосфортиоат, предпочтительно,
13-15.
окси-ΠΝΑ. Цитозины
ЬЫА
- 79 015570 предпочтительно являются метилированными <400> 101 ссаГЕдксас асбсса . 16 <210> 102 <211> 16 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ДНК/ЬЦА-олигонуклеотид, ΠΝΑ в положении 2, а затем в каждом третьем положении. Предпочтительно, фосфортиоат, предпочтительно, окси-ША. Цитозины ЬЫА предпочтительно являются метилированными <400> 102' бсасдаббад саДбаа16 <210>103 <211> 16 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ДНК/ЬЫА-олигонуклеотид, ША в положении 3, а затем в каждом третьем положении. Предпочтительно, фосфортиоат, предпочтительно, окси-ЬЫА. ЦИТОЗИНЫ ЦЫА ПрОДПОЧТИТОЛЬ НО ЯВЛЯЮТСЯ МОТИЛИрОБЗ-ННЫМИ <400>103 абсасдабЪа дсаЪба16 <210>104 <211> 16 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ДНК/ЬЫА-олигонуклеотид, ЬМА в положении 1, а затем в каждом втором положении. Предпочтительно, фосфортиоат, предпочтительно, окси-ЬЫА. Цитозины 1ДА предпочтительно являются метилированными <400>104
РсасдаСЪад саОСаа16 <210>105 <211> 16 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ДНК/ЬЫА-олигонуклеотид, ЬЫА в положениях 1, 4, 6, 8, 10, 12, 14 и 16.
Предпочтительно, фосфортиоат, предпочтительно, окси-ΣΝΑ. Цитозины ЬИА предпочтительно являются метилированными.
- 80 015570 <400>105 аЕсасдаЕЕа дсаЕЕа ·16 <210> 106 <211>15 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ДНК/ЬЦА-олигонуклеотид, 1.ΝΑ в положении 2, а затем в каждом третьем положении. Предпочтительно, фосфортиоат, предпочтительно, окси-ЬЫА. Цитозины ЬЫА предпочтительно являются метилированными <400>106 дадссдаасд аасаа15 <210>107 <211>13 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ДНК/ЬЫА-олигонуклеотид, ЬЫА в положении 3, а затем в каждом третьем положении. Предпочтительно, фосфортиоат, предпочтительно, окси-ΠΝΑ. Цитозины ЬЫА предпочтительно являются метилированными <400>107 дссдаасдаа саа13 <210> 108 <211>15 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ДНК/ЬЦА-олигонуклеотид, ЬЫА в положении 1, а затем в каждом, втором положении. Предпочтительно, фосфортиоат, предпочтительно, окси-ША. Цитозины ЬЫА предпочтительно являются метилированными <400>108 дадссдаасд аасаа15 <210>109 <211>13 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ДНК/ЬЫА-олигонуклеотид, ЬЫА в положении 1, а затем в каждом втором положении. Предпочтительно, фосфортиоат, предпочтительно, окси-ЦЦА. Цитозины 1ΝΑ предпочтительно являются метилированными <400> 109 дссдаасдаа саа 13

Claims (26)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Олигонуклеотид, имеющий в длину 8-26 нуклеотидов, где олигонуклеотид содержит коровую ДНК-последовательность в положениях 2-7 или в положениях 3-8, считая от 3'-конца
    3'-с!саса-5' (8Ερ ΙΌ ΝΟ: 7), где по меньшей мере один остаток ДНК в указанной последовательности заменен соответствующим остатком ΕΝΑ, где нуклеотидная последовательность олигонуклеотида комплементарна человеческой микро-РНК-последовательности тЖ-122 (8ΕΡ ΙΌ ΝΟ: 1), и где олигонуклеотид не содержит область из более чем 5 смежных нуклеотидных остатков ДНК, и где олигонуклеотид содержит по меньшей мере одну фосфортиоатную межнуклеозидную связь.
  2. 2. Олигонуклеотид по п.1, где олигонуклеотид имеет длину от 10 до 17 нуклеотидов.
  3. 3. Олигонуклеотид по п.1, где олигонуклеотид имеет длину 15 или 16 нуклеотидов.
  4. 4. Олигонуклеотид по любому из пп.1-3, где по меньшей мере два остатка ДНК в положениях 1-6, 2-7 или 3-8 олигонуклеотида, считая от 3'-конца, заменены соответствующими остатками ΕΝΑ и где указанные остатки ΕΝΑ разделены по меньшей мере одним остатком ДНК.
  5. 5. Олигонуклеотид по любому из пп.1-3, где по меньшей мере три остатка ДНК в положениях 1-6,
    2- 7 или 3-8 олигонуклеотида, считая от 3'-конца, заменены соответствующими остатками ΕΝΑ и где указанные остатки ΕΝΑ разделены по меньшей мере одним остатком ДНК.
  6. 6. Олигонуклеотид по п.4 или 5, где число смежных остатков ДНК в положениях 1-6, 2-7 или 3-8 указанного олигонуклеотида, считая от 3'-конца, составляет максимум два.
  7. 7. Олигонуклеотид по любому из пп.1-6, где общее число остатков ΕΝΑ в положениях 1-6, 2-7 или
    3- 8 указанного олигонуклеотида, считая от 3'-конца, составляет от 2 до 6.
  8. 8. Олигонуклеотид по любому из пп.1-7, где первое нуклеотидное основание олигонуклеотида, считая от 3'-конца, представляет собой нуклеотидный аналог, такой как остаток ΕΝΑ.
  9. 9. Олигонуклеотид по любому из пп.1-8, где олигонуклеотид содержит по меньшей мере одну область, состоящую по меньшей мере из двух смежных остатков ΕΝΑ.
  10. 10. Олигонуклеотид по любому из пп.1-9, где олигонуклеотид не содержит область из более чем 7 смежных остатков ΕΝΑ.
  11. 11. Олигонуклеотид по п.10, где олигонуклеотид не содержит область из более чем 3 смежных остатков ΕΝΑ.
  12. 12. Олигонуклеотид по любому из пп.1-11, где нуклеотидный мотив для трех крайних нуклеотидов с 5'-конца выбран из группы, состоящей из Ххх, хХх, ххХ, ХХх, ХхХ, хХХ и XXX, где X обозначает остаток ΕΝΑ, а х обозначает остаток ДНК.
  13. 13. Олигонуклеотид по любому из пп.1-12, где олигонуклеотид не опосредует основанное на РНКазе Н расщепление комплементарной одноцепочечной молекулы РНК.
  14. 14. Олигонуклеотид по любому из пп.1-13, где нуклеотид способен образовывать дуплекс с комплементарной одноцепочечной молекулой РНК с фосфодиэфирными межнуклеозидными связями, где дуплекс имеет Тш по меньшей мере приблизительно 70°С.
  15. 15. Олигонуклеотид по любому из пп.1-14, где остаток или остатки ΕΝΑ представляют собой β-ϋокси-ΕΝΑ.
  16. 16. Олигонуклеотид по любому из пп.1-15, где все межнуклеозидные связи представляют собой фосфортиоатные связи.
  17. 17. Олигонуклеотид по п.1 формулы
    5' -СсАШзбТсаСаСОСС-З' (ЗЕ<2 10 N0 99), где строчные буквы обозначают азотистые основания нуклеотидов ДНК, прописные буквы обозначают азотистые основания остатков ΕΝΑ;
    цитозины ΕΝΑ являются необязательно метилированными.
  18. 18. Олигонуклеотид по п.17, где все межнуклеозидные связи представляют собой фосфортиоатные связи.
  19. 19. Олигонуклеотид по п.17 или 18, где цитозины ΕΝΑ представляют собой 5-метилцитозин.
  20. 20. Олигонуклеотид по любому из пп.17-19, где остатки ΕΝΑ представляют собой остатки β-Όокси-ΕΝΑ.
  21. 21. Олигонуклеотид по п.1 формулы где строчные буквы обозначают нуклеотид ДНК, прописные буквы обозначают остатки ΕΝΑ, шС обозначает 5-метилцитозин-^NΑ, подстрочный индекс з обозначает фосфортиоатную межнуклеозидную связь и где остатки ΕΝΑ представляют собой β-ϋ-окси, на что указывает надстрочный индекс О после остатка ΕΝΑ.
  22. 22. Применение олигонуклеотида длиной 8-17 нуклеотидов в отношении клетки или организма, где
    - 82 015570 олигонуклеотид комплементарен человеческой последовательности т1К-122 (8ΕΡ Ш ΝΟ: 1), для получения лекарственного средства для лечения заболевания или патологического расстройства, ассоциированного с присутствием или повышенной экспрессией микроРНК, такого как заболевание, выбранное из группы, состоящей из повышенного уровня холестерина в плазме, атеросклероза, гиперхолестеринемии или гиперлипидемии и гепатита С.
  23. 23. Применение по п.22, где олигонуклеотид представляет собой олигонуклеотид, определенный в любом из пп.1-21.
  24. 24. Применение по п.23, где заболевание представляет собой гепатит С.
  25. 25. Применение по п.24, где олигонуклеотид представляет собой олигонуклеотид, определенный в п.21.
  26. 26. Фармацевтическая композиция, содержащая олигонуклеотид по п.21 и фармацевтически приемлемые разбавители, носитель или адъювант.
    Ингибирование т1Е-122а молекулой 1ЩА-апйтИ3122а в клеточной линии НиЬ-7 контроль 8РС3370 ЗРС3372 5РС3375 8|’С3343 5РС3350 (контроль с несоответствиями)
EA200870402A 2006-04-03 2007-03-30 Фармацевтическая композиция EA015570B1 (ru)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US78899506P 2006-04-03 2006-04-03
DKPA200600478 2006-04-03
US79681306P 2006-05-01 2006-05-01
DKPA200600615 2006-05-01
US83871006P 2006-08-18 2006-08-18
DKPA200601401 2006-10-30
PCT/DK2007/000168 WO2007112753A2 (en) 2006-04-03 2007-03-30 Pharmaceutical composition comprising anti-mirna antisense oligonucleotides

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200870402A1 EA200870402A1 (ru) 2009-04-28
EA015570B1 true EA015570B1 (ru) 2011-10-31

Family

ID=38564007

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200870402A EA015570B1 (ru) 2006-04-03 2007-03-30 Фармацевтическая композиция

Country Status (12)

Country Link
US (8) US20100004320A1 (ru)
EP (3) EP2007889A2 (ru)
JP (5) JP5198430B2 (ru)
KR (1) KR101407707B1 (ru)
AU (1) AU2007234191B2 (ru)
CA (4) CA3024953A1 (ru)
DK (1) DK2666859T3 (ru)
EA (1) EA015570B1 (ru)
ES (1) ES2715625T3 (ru)
IL (1) IL194007A0 (ru)
MX (1) MX2008012219A (ru)
WO (2) WO2007112753A2 (ru)

Families Citing this family (247)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7683036B2 (en) 2003-07-31 2010-03-23 Regulus Therapeutics Inc. Oligomeric compounds and compositions for use in modulation of small non-coding RNAs
PL1747023T5 (pl) 2004-05-04 2017-05-31 Univ Leland Stanford Junior Sposób i kompozycje do zmniejszania ilości genomu wirusowego HCV w komórkach docelowych
US8592384B2 (en) 2005-04-04 2013-11-26 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Micro-RNA's that regulate muscle cells
EP1937845B1 (en) 2005-08-01 2015-06-10 The Ohio State University Research Foundation Micro-rna-based methods and compositions for the diagnosis, prognosis and treatment of breast cancer
CA2620856C (en) 2005-08-29 2017-11-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for use in modulating mir-122a
EP1937280B1 (en) 2005-09-12 2014-08-27 The Ohio State University Research Foundation Compositions for the therapy of bcl2-associated cancers
EP2487253B1 (en) 2006-01-05 2015-06-24 The Ohio State University Research Foundation MicroRNA-based methods and compositions for the diagnosis and treatment of solid cancers
EP2591794A1 (en) 2006-01-05 2013-05-15 The Ohio State University Research Foundation MicroRNA expressions abnormalities in pancreatic endocrine and acinar tumors
US7943318B2 (en) 2006-01-05 2011-05-17 The Ohio State University Research Foundation Microrna-based methods and compositions for the diagnosis, prognosis and treatment of lung cancer
EP1996731A2 (en) 2006-03-20 2008-12-03 The Ohio State University Research Foundation Microrna fingerprints during human megakaryocytopoiesis
EA201100811A1 (ru) 2006-04-03 2012-06-29 Сантарис Фарма А/С Фармацевтическая композиция
KR101407707B1 (ko) * 2006-04-03 2014-06-19 산타리스 팔마 에이/에스 Ａｎｔｉ-ｍｉｒｎａ 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 약학적 조성물
DK2015758T3 (da) 2006-05-05 2014-06-23 Isis Pharmaceuticals Inc Forbindelser og fremgangsmåder til modulering af ekspression af apob
EP2455494B1 (en) 2006-07-13 2013-12-18 The Ohio State University Research Foundation Micro-RNA-based methods and compositions for the diagnosis and treatment of colon related diseases
NZ574563A (en) 2006-08-01 2012-02-24 Univ Texas IDENTIFICATION OF A MICRO-RNA (miR-208) THAT ACTIVATES EXPRESSION OF BETA-MYOSIN HEAVY CHAIN FOR USE IN CARDIAC HYPERTROPHY CONDITIONS
EP2090665A2 (en) 2006-10-20 2009-08-19 Exiqon A/S Novel human microRNAs associated with cancer
US8188255B2 (en) 2006-10-20 2012-05-29 Exiqon A/S Human microRNAs associated with cancer
US20100021914A1 (en) 2006-11-23 2010-01-28 Querdenker Aps Oligonucleotides for modulating target rna activity
CN103555825B (zh) 2007-01-31 2015-09-30 俄亥俄州立大学研究基金会 用于急性髓细胞白血病(aml)的诊断、预后和治疗的基于微rna的方法和组合物
WO2008113830A1 (en) 2007-03-22 2008-09-25 Santaris Pharma A/S Rna antagonist compounds for the inhibition of apo-b100 expression
DK2149605T3 (da) 2007-03-22 2013-09-30 Santaris Pharma As Korte RNA antagonist forbindelser til modulering af det ønskede mRNA
AU2008232316A1 (en) * 2007-03-26 2008-10-02 Newcastle Innovation Limited Therapeutic targets and molecules
AU2008248319B2 (en) * 2007-04-30 2013-09-05 The Ohio State University Research Foundation Methods for differentiating pancreatic cancer from normal pancreatic function and/or chronic pancreatitis
US8691965B2 (en) 2007-06-14 2014-04-08 Mirx Therapeutics Aps Oligonucleotides for modulating target RNA activity
CN101918424A (zh) * 2007-06-15 2010-12-15 俄亥俄州立大学研究基金会 用于靶向由Drosha介导的微小RNA加工的致癌ALL-1融合蛋白
EP2808398A1 (en) 2007-07-31 2014-12-03 The Ohio State University Research Foundation Methods for reverting methylation by targeting DNMT3A and DNMT3B
AU2008283795B2 (en) 2007-07-31 2013-11-21 Board Of Regents, The University Of Texas System A micro-RNA family that modulates fibrosis and uses thereof
NZ583025A (en) * 2007-07-31 2012-06-29 Univ Texas Micro-rnas that control myosin expression and myofiber identity
ES2627059T3 (es) 2007-08-03 2017-07-26 The Ohio State University Research Foundation Regiones ultraconservadas que codifican ARNnc
CA2696887C (en) 2007-08-22 2016-06-28 The Ohio State University Research Foundation Methods and compositions for inducing deregulation of epha7 and erk phosphorylation in human acute leukemias
WO2009043354A2 (en) * 2007-10-04 2009-04-09 Santaris Pharma A/S Combination treatment for the treatment of hepatitis c virus infection
AU2013273821B2 (en) * 2007-10-04 2016-03-10 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Micromirs
JP5723156B2 (ja) * 2007-10-11 2015-05-27 ジ・オハイオ・ステイト・ユニバーシティ・リサーチ・ファウンデイションＴｈｅ Ｏｈｉｏ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ 食道腺癌の診断及び治療のための方法及び組成物
JP2011504093A (ja) 2007-10-26 2011-02-03 ジ・オハイオ・ステイト・ユニバーシティ・リサーチ・ファウンデイション 脆弱性ヒスチジン三連構造（ｆｈｉｔ）相互作用を同定するための方法およびその使用
CA2704043C (en) 2007-10-29 2018-09-18 Rosetta Genomics Ltd. Targeting micrornas for the treatment of liver cancer
US8513209B2 (en) * 2007-11-09 2013-08-20 The Board Of Regents, The University Of Texas System Micro-RNAS of the MIR-15 family modulate cardiomyocyte survival and cardiac repair
GB0802754D0 (en) * 2008-02-14 2008-03-26 Inst Superiore Di Sanito Antisense RNA targetting CXCR4
WO2009105759A2 (en) * 2008-02-21 2009-08-27 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Micro-rnas that modulate smooth muscle proliferation and differentiation and uses thereof
EP2096171A1 (en) 2008-02-27 2009-09-02 Julius-Maximilians-Universität Würzburg MicroRNA (miRNA) and down-stream targets for diagnostic and therapeutic purposes
JP5662166B2 (ja) * 2008-02-28 2015-01-28 ジ・オハイオ・ステイト・ユニバーシティ・リサーチ・ファウンデイションＴｈｅ Ｏｈｉｏ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ 胃癌の診断、予後診断及び治療のためのマイクロｒｎａに基づいた方法及び組成物
WO2009109665A1 (en) * 2008-03-07 2009-09-11 Santaris Pharma A/S Pharmaceutical compositions for treatment of microrna related diseases
CA2718520C (en) 2008-03-17 2020-01-07 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Identification of micro-rnas involved in neuromuscular synapse maintenance and regeneration
EP2105145A1 (en) 2008-03-27 2009-09-30 ETH Zürich Method for muscle-specific delivery lipid-conjugated oligonucleotides
JP5750710B2 (ja) 2008-04-30 2015-07-22 日本電気株式会社 癌マーカー、それを用いた癌の評価方法および評価試薬
US9125923B2 (en) 2008-06-11 2015-09-08 The Ohio State University Use of MiR-26 family as a predictive marker for hepatocellular carcinoma and responsiveness to therapy
EP2288703B1 (en) * 2008-06-16 2012-08-15 Universiteit Maastricht Means and methods for counteracting, delaying and/or preventing heart disease
EP2297357B1 (en) 2008-06-27 2012-10-31 Novartis Forschungsstiftung, Zweigniederlassung Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research Prediction of antiviral therapy response
US8492357B2 (en) 2008-08-01 2013-07-23 Santaris Pharma A/S Micro-RNA mediated modulation of colony stimulating factors
EP2191834A1 (en) * 2008-11-26 2010-06-02 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Compositions and methods for treating retrovirus infections
CA2745329C (en) * 2008-12-04 2022-07-12 Opko Curna, Llc Treatment of erythropoietin (epo) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to epo
US9132147B2 (en) 2008-12-31 2015-09-15 Roche Innovation Center Copenhagen Use of LNA ApoB antisense oligomers for the treatment of acute coronary syndromes
CA2751489A1 (en) 2009-02-04 2010-08-12 Board Of Regents, The University Of Texas System Dual targeting of mir-208 and mir-499 in the treatment of cardiac disorders
EP2218458A1 (en) * 2009-02-13 2010-08-18 Fondazione Telethon Molecules able to modulate the expression of at least a gene involved in degradative pathways and uses thereof
CA2754412A1 (en) 2009-03-31 2010-10-14 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Departmen T Of Health And Human Services Differentially expressed micrornas as biomarkers for the diagnosis and treatment of sjogren's syndrome
US9034837B2 (en) * 2009-04-24 2015-05-19 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Pharmaceutical compositions for treatment of HCV patients that are poor-responders to interferon
WO2010133970A1 (en) * 2009-05-20 2010-11-25 Eth Zurich Targeting micrornas for metabolic disorders
WO2010135714A2 (en) * 2009-05-22 2010-11-25 The Methodist Hospital Research Institute Methods for modulating adipocyte expression using microrna compositions
WO2011009697A1 (en) 2009-07-21 2011-01-27 Santaris Pharma A/S Antisense oligomers targeting pcsk9
US20110190372A1 (en) * 2009-08-07 2011-08-04 New York University Compositions and methods for treating inflammatory disorders
US8507195B2 (en) 2009-08-20 2013-08-13 The Regents Of The University Of Colorado MiRNAs dysregulated in triple-negative breast cancer
CN102002493B (zh) * 2009-09-01 2013-04-10 中国科学院上海生命科学研究院 小rna-326制备药物的应用
WO2011032100A1 (en) * 2009-09-11 2011-03-17 Government Of The U.S.A., As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Inhibitors of kshv vil6 and human il6
US8975019B2 (en) * 2009-10-19 2015-03-10 University Of Massachusetts Deducing exon connectivity by RNA-templated DNA ligation/sequencing
US9364495B2 (en) 2009-10-20 2016-06-14 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Oral delivery of therapeutically effective LNA oligonucleotides
US8916533B2 (en) 2009-11-23 2014-12-23 The Ohio State University Materials and methods useful for affecting tumor cell growth, migration and invasion
WO2011069100A2 (en) 2009-12-04 2011-06-09 Duke University Microrna and use thereof in identification of b cell malignancies
WO2012148373A1 (en) * 2010-01-20 2012-11-01 Board Of Regents, The University Of Texas System Antimir-451 for the treatment of polycythemias
WO2011111715A1 (ja) * 2010-03-09 2011-09-15 協和発酵キリン株式会社 細胞周期を制御する核酸
EP2544703A4 (en) 2010-03-12 2013-09-18 Brigham & Womens Hospital METHODS OF TREATING VASCULAR INFLAMMATORY DISORDERS
US20130079505A1 (en) * 2010-03-24 2013-03-28 Mirrx Therapeutics A/S Bivalent antisense oligonucleotides
KR20130069633A (ko) * 2010-04-21 2013-06-26 아카데미쉬 메디쉬 센트륨 심혈관 질환의 위험도를 측정하기 위한 수단 및 방법
WO2011134474A1 (en) * 2010-04-30 2011-11-03 Exiqon A/S In situ hybridization method and buffer
US20110281933A1 (en) * 2010-05-13 2011-11-17 Saint Louis University Methods and compositions for the management of cardiovascular disease with oligonucleotides
US20130210883A1 (en) 2010-05-21 2013-08-15 Johannes Grillari Lipase inhibitors
CA2800018C (en) 2010-05-21 2021-09-28 Universitaet Fuer Bodenkultur Wien Compositions for use in treating or diagnosing bone disorders and/or cardiovascular disorders
FR2960130B1 (fr) 2010-05-21 2013-11-01 Dominique Cingotti Agent edulcorant contenant un extrait de stevia rebaudiana bertoni
WO2011153542A2 (en) 2010-06-04 2011-12-08 Board Of Regents, The University Of Texas System Regulation of metabolism by mir-378
WO2011154553A2 (en) 2010-06-11 2011-12-15 Cellartis Ab Novel micrornas for the detection and isolaton of human embryonic stem cell-derived cardiac cell types
EP2594644B1 (en) 2010-07-12 2016-08-10 National University Corporation Tottori University Method for preparing novel hipsc by means of mirna introduction
WO2012012716A2 (en) 2010-07-23 2012-01-26 Regulus Therapeutics, Inc. Targeting micrornas for the treatment of fibrosis
WO2012027601A2 (en) 2010-08-25 2012-03-01 The General Hospital Corporation Methods targeting mir-33 micrornas for regulating lipid metabolism
WO2012027704A1 (en) 2010-08-27 2012-03-01 New York University Mir-33 inhibitors and uses thereof
EP2625292B1 (en) 2010-10-07 2018-12-05 The General Hospital Corporation Biomarkers of cancer
CN102031261B (zh) * 2010-10-27 2015-04-22 南京医科大学 一种与妊娠期糖尿病相关的血清/血浆miRNA标志物及其应用
EP2638159B1 (en) * 2010-11-11 2019-04-24 University of Miami Compositions, kits and methods for treatment of cardiovascular, immunological, and inflammatory diseases
JP6336755B2 (ja) 2010-11-12 2018-06-06 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション ポリコームに関連する非コードｒｎａ
US9920317B2 (en) 2010-11-12 2018-03-20 The General Hospital Corporation Polycomb-associated non-coding RNAs
EP2638912A4 (en) 2010-11-12 2015-01-21 Nat Univ Corp Ehime Univ COMPOSITIONS WITH AN ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDE AGAINST MICRO RNA
CN103648505B (zh) 2010-11-12 2016-09-28 俄亥俄州立大学研究基金会 与微rna-21、错配修复和结肠直肠癌相关的材料和方法
BR112013011942A2 (pt) 2010-11-15 2016-11-01 Univ Michigan formulação, forma de dosagem de droga para administração transmucosa oral, sistema transmucoso de fornecimento de droga, método de tratamento e profilaxia de uma doença ou distúrbio, método de tratamento, formulação, método para tratamento ou prevenção de carcinoma de célula escamosa de cabeça e pescoço (hnscc), método para quimioprevenção de um câncer oral ou condição pré-cancerosa, método para aumentar a concentração de uma composição de retinida, método de tratamento e profilaxia de uma doença ou condição, método de ratamento de um sujeito apresentando uma condição médica sintomática, método de tratamento de um câncer oral ou condição pré-cancerosa num paciente, método para fazer um sistema de fornecimento de droga bucal, método para aumentar a liberação e permeação de uma composição de retinida.
CN102041316A (zh) * 2010-11-30 2011-05-04 华东师范大学 miRNA-219化合物作为脑胶质瘤标志物的应用
JP2014504857A (ja) * 2010-12-15 2014-02-27 ミラゲン セラピューティクス ロックドヌクレオチドを含むｍｉｃｒｏＲＮＡ阻害剤
WO2012087242A1 (en) 2010-12-20 2012-06-28 Agency For Science, Technology And Research Targeting glioma stem cells by sequence-specific functional inhibition of pro-survival oncomir-138
EP2663323B1 (en) 2011-01-14 2017-08-16 The General Hospital Corporation Methods targeting mir-128 for regulating cholesterol/lipid metabolism
CN102174516A (zh) * 2011-01-20 2011-09-07 中南大学 一种与ebv感染相关的鼻咽癌诊断和治疗的分子靶标及其应用
AU2012225506B2 (en) * 2011-03-07 2016-11-17 The Ohio State University Mutator activity induced by microRNA-155 (miR-155) links inflammation and cancer
EP3159410A2 (en) 2011-04-12 2017-04-26 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Micro-rna inhibitors and their uses in disease
WO2012145374A1 (en) 2011-04-19 2012-10-26 Regulus Therapeutics Inc. TARGETING miR-378 FAMILY MEMBERS FOR THE TREATMENT OF METABOLIC DISORDERS
LT3211082T (lt) 2011-04-25 2021-05-10 Sanofi Mikro rnr junginiai ir būdai mir-21 aktyvumui moduliuoti
WO2012149557A1 (en) 2011-04-28 2012-11-01 New York University miR-33 INHIBITORS AND USES THEREOF TO DECREASE INFLAMMATION
JP2014522814A (ja) 2011-06-23 2014-09-08 ステラ・アンパルトセルスカブ Ｈｃｖ併用療法
US20140194491A1 (en) * 2011-06-24 2014-07-10 Syddansk Universitet Modulation of microrna-138 for the treatment of bone loss
KR20140064765A (ko) 2011-06-30 2014-05-28 스텔라 에이피에스 Hcv 조합 치료
EP2726611A1 (en) 2011-06-30 2014-05-07 Stella ApS Hcv combination therapy
CN102908621A (zh) * 2011-08-02 2013-02-06 中国科学院上海生命科学研究院 miRNAs作为调节胰岛素敏感性的靶标的新用途
US9434944B2 (en) 2011-08-31 2016-09-06 University Of Zurich Modulators of miR-323-3p for the prevention or treatment of rheumatoid arthritis
CN102978278B (zh) * 2011-09-07 2016-09-28 中国科学院动物研究所 内源性的非编码小RNAs及其应用
EP2756080B1 (en) 2011-09-14 2019-02-20 Translate Bio MA, Inc. Multimeric oligonucleotide compounds
US9428749B2 (en) 2011-10-06 2016-08-30 The Board Of Regents, The University Of Texas System Control of whole body energy homeostasis by microRNA regulation
CA2851280C (en) 2011-10-11 2021-05-18 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Micrornas in neurodegenerative disorders
GB201117482D0 (en) * 2011-10-11 2011-11-23 Univ Dundee Targetiing of miRNA precursors
CA2852066A1 (en) 2011-10-14 2013-04-18 The Ohio State University Methods and materials related to ovarian cancer
WO2013068348A1 (en) 2011-11-07 2013-05-16 Santaris Pharma A/S Lna oligomers for improvement in hepatic function
AU2012334214A1 (en) 2011-11-07 2014-05-22 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Prognostic method for checking efficacy of micro RNA-122 inhibitors in HCV+ patients
JP2015501843A (ja) * 2011-12-13 2015-01-19 オハイオ・ステイト・イノベーション・ファウンデーション ｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−２９ａ、エキソソーム阻害、およびがん転移に関する方法および組成物
EP2791337A1 (en) * 2011-12-15 2014-10-22 Oncostamen S.r.l. Micrornas and uses therof
US9447471B2 (en) * 2011-12-29 2016-09-20 Quest Diagnostics Investments Incorporated Microrna profiling for diagnosis of dysplastic nevi and melanoma
CN104685065B (zh) 2012-01-20 2017-02-22 俄亥俄州立大学 浸润性和预后的乳腺癌生物标志物标签
AU2013251696B2 (en) * 2012-04-25 2018-11-15 Sanofi MicroRNA compounds and methods for modulating miR-21 activity
WO2013170146A1 (en) 2012-05-10 2013-11-14 Uab Research Foundation Methods and compositions for modulating mir-204 activity
EP2850189B8 (en) 2012-05-16 2019-01-23 Translate Bio MA, Inc. Compositions and methods for modulating gene expression
WO2013173645A1 (en) 2012-05-16 2013-11-21 Rana Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating utrn expression
JP2015523853A (ja) 2012-05-16 2015-08-20 ラナ セラピューティクス インコーポレイテッド Ａｔｐ２ａ２発現を調節するための組成物及び方法
JP2015518710A (ja) 2012-05-16 2015-07-06 ラナ セラピューティクス インコーポレイテッド ヘモグロビン遺伝子ファミリー発現を調節するための組成物及び方法
KR20150030205A (ko) 2012-05-16 2015-03-19 라나 테라퓨틱스, 인크. Smn 유전자 패밀리 발현을 조절하기 위한 조성물 및 방법
US10837014B2 (en) 2012-05-16 2020-11-17 Translate Bio Ma, Inc. Compositions and methods for modulating SMN gene family expression
WO2013173608A1 (en) 2012-05-16 2013-11-21 Rana Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating mecp2 expression
US9163235B2 (en) * 2012-06-21 2015-10-20 MiRagen Therapeutics, Inc. Inhibitors of the miR-15 family of micro-RNAs
WO2013190091A1 (en) * 2012-06-21 2013-12-27 Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg CIRCULATING miRNAs AS MARKERS FOR BREAST CANCER
WO2013192576A2 (en) * 2012-06-21 2013-12-27 Miragen Therapeutics Oligonucleotide-based inhibitors comprising locked nucleic acid motif
ES2708624T3 (es) 2012-08-15 2019-04-10 Univ Virginia Patent Foundation Composiciones y métodos para tratar la enfermedad arterial periférica
EP2886122B1 (en) * 2012-08-20 2019-02-27 National Cancer Center Agent for treating cancer
JP2015529469A (ja) 2012-09-14 2015-10-08 ラナ セラピューティクス インコーポレイテッド 多量体オリゴヌクレオチド化合物
UA116639C2 (uk) 2012-10-09 2018-04-25 Рег'Юлес Терап'Ютікс Інк. Способи лікування синдрому альпорта
EP2914344B1 (en) * 2012-10-31 2020-01-15 The Rockefeller University Treatment of metastatic colon cancer
US10077443B2 (en) 2012-11-15 2018-09-18 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Oligonucleotide conjugates
WO2014082644A1 (en) * 2012-11-30 2014-06-05 WULFF, Peter, Samuel Circular rna for inhibition of microrna
DK2951305T3 (en) 2013-01-30 2018-10-29 Hoffmann La Roche LNA oligonucleotide KULHYDRATKONJUGATER
WO2014118272A1 (en) 2013-01-30 2014-08-07 Santaris Pharma A/S Antimir-122 oligonucleotide carbohydrate conjugates
DK2970968T3 (en) * 2013-03-15 2018-03-05 Miragen Therapeutics Inc CONNECTED BICYCLIC Nucleosides
WO2014151835A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-25 Miragen Therapeutics, Inc Locked nucleic acid inhibitor of mir-145 and uses thereof
WO2014144844A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University tRNA DERIVED SMALL RNAs (tsRNAs) INVOLVED IN CELL VIABILITY
CN105164261B (zh) 2013-05-01 2022-03-18 莱古路斯治疗法股份有限公司 用于增强的细胞摄取的化合物和方法
TW201446791A (zh) 2013-05-01 2014-12-16 Regulus Therapeutics Inc 用於調節mir-122之微小rna化合物及方法
CN103293318B (zh) * 2013-05-22 2014-10-29 吉林大学 利用地高辛标记EDC交联桥连法检测miRNAs方法
EP3007706A4 (en) * 2013-06-12 2017-05-17 New York University Anti-mir-27b and anti-mir-148a oligonucleotides as therapeutic tools for treating dyslipidemias and cardiovascular diseases
WO2014201314A1 (en) 2013-06-14 2014-12-18 Joslin Diabetes Center, Inc. Microrna and uses in brown fat differentiation
CN112263682A (zh) 2013-06-27 2021-01-26 罗氏创新中心哥本哈根有限公司 靶向pcsk9的反义寡聚体和缀合物
WO2015013363A2 (en) * 2013-07-24 2015-01-29 The General Hospital Corporation Agents and methods for inhibiting mir-148a for the modulation of cholesterol levels
JP6443889B2 (ja) * 2013-08-08 2018-12-26 国立大学法人大阪大学 尿路上皮癌の診断または治療剤
US9994846B2 (en) 2013-10-25 2018-06-12 Regulus Therapeutics Inc. MicroRNA compounds and methods for modulating miR-21 activity
US9458458B2 (en) * 2013-11-11 2016-10-04 Emory University Manipulating microRNA for the management of neurological diseases or conditions and compositions related thereto
JP2017511694A (ja) * 2014-02-12 2017-04-27 トーマス・ジェファーソン・ユニバーシティ マイクロｒｎａ阻害剤を使用するための組成物および方法
WO2015175545A1 (en) 2014-05-12 2015-11-19 The Johns Hopkins University Highly stable biodegradable gene vector platforms for overcoming biological barriers
JP6763780B2 (ja) 2014-05-12 2020-09-30 ザ・ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティー 合成脳浸透遺伝子ベクターの操作
WO2015200697A1 (en) 2014-06-25 2015-12-30 The General Hospital Corporation Targeting human satellite ii (hsatii)
JP6819907B2 (ja) * 2014-07-31 2021-01-27 エイジェンシー・フォー・サイエンス，テクノロジー・アンド・リサーチ 修飾抗ｍｉｒ−１３８オリゴヌクレオチド
SG11201610877PA (en) 2014-08-07 2017-02-27 Regulus Therapeutics Inc Targeting micrornas for metabolic disorders
EP3230453B1 (en) 2014-09-21 2020-05-20 Yissum Research and Development Company of the Hebrew University of Jerusalem Ltd. Downregulating mir-132 for the treatment of lipid related disorders
CN104306988B (zh) * 2014-09-25 2017-02-15 中国医学科学院基础医学研究所 miR‑431在制备治疗肌肉疾病的药物中的用途
CA2966044A1 (en) 2014-10-30 2016-05-06 The General Hospital Corporation Methods for modulating atrx-dependent gene repression
EP3218517B1 (en) * 2014-11-10 2024-05-01 The Regents of the University of California Mir-214 as a diagnostic and prognostic biomarker specific for ulcerative colitis and a mir-214 inhibitor for treatment of ulcerative colitis and colitis-associated colorectal cancer
MX2017006216A (es) 2014-11-14 2018-08-29 Voyager Therapeutics Inc Composiciones y métodos para tratar la esclerosis lateral amiotrófica (ela).
CA2975583A1 (en) * 2014-11-14 2016-05-19 Voyager Therapeutics, Inc. Modulatory polynucleotides
EP3020813A1 (en) 2014-11-16 2016-05-18 Neurovision Pharma GmbH Antisense-oligonucleotides as inhibitors of TGF-R signaling
SG10201906716QA (en) 2015-01-20 2019-08-27 Miragen Therapeutics Inc Mir-92 inhibitors and uses thereof
US10758558B2 (en) 2015-02-13 2020-09-01 Translate Bio Ma, Inc. Hybrid oligonucleotides and uses thereof
WO2016149455A2 (en) 2015-03-17 2016-09-22 The General Hospital Corporation The rna interactome of polycomb repressive complex 1 (prc1)
WO2016164463A1 (en) 2015-04-07 2016-10-13 The General Hospital Corporation Methods for reactivating genes on the inactive x chromosome
RU2718534C2 (ru) * 2015-06-05 2020-04-08 Мираджен Терапьютикс, Инк. Ингибиторы mir-155 для лечения кожной t-клеточной лимфомы (ctcl)
JP2018517704A (ja) * 2015-06-05 2018-07-05 ミラゲン セラピューティクス， インコーポレイテッド 筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を処置するためのｍｉＲ−１５５阻害剤
AU2016282986A1 (en) 2015-06-26 2018-02-01 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Cancer therapy targeting tetraspanin 33 (tspan33) in myeloid derived suppressor cells
WO2017021963A1 (en) 2015-08-03 2017-02-09 Biokine Therapeutics Ltd. Cxcr4 binding agents for treatment of diseases
CN107922945A (zh) 2015-08-24 2018-04-17 罗氏创新中心哥本哈根有限公司 Lna‑g 方法
JP2018528967A (ja) * 2015-09-22 2018-10-04 ミラゲン セラピューティクス， インコーポレイテッド Ｍｉｒ−１９調節物質およびその使用
WO2017055423A1 (en) 2015-10-02 2017-04-06 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Oligonucleotide conjugation process
EP3359553A4 (en) * 2015-10-06 2019-04-03 University Of Virginia Patent Foundation COMPOSITIONS AND METHODS OF TREATING DIABETIC RETINOPATHY
JP6666002B2 (ja) 2015-10-07 2020-03-13 国立大学法人京都大学 Ｔｄｐ−４３プロテノパシーの予防又は治療用組成物
WO2017066712A2 (en) 2015-10-16 2017-04-20 The Children's Medical Center Corporation Modulators of telomere disease
EP3394258B1 (en) 2015-10-22 2021-09-22 Roche Innovation Center Copenhagen A/S In vitro toxicity screening assay
CA3005878A1 (en) 2015-11-19 2017-05-26 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Lymphocyte antigen cd5-like (cd5l)-interleukin 12b (p40) heterodimers in immunity
JOP20200228A1 (ar) 2015-12-21 2017-06-16 Novartis Ag تركيبات وطرق لخفض تعبير البروتين tau
CN107012199A (zh) * 2016-01-28 2017-08-04 上海市东方医院 一种在血浆和血清中检测miRNA的方法
EP3419665A4 (en) 2016-02-25 2019-10-16 The Brigham and Women's Hospital, Inc. METHODS OF TREATING FIBROSIS BY TARGETING SMOC2
CN108779139A (zh) 2016-03-18 2018-11-09 罗氏创新中心哥本哈根有限公司 酰基保护的l-lna-鸟嘌呤核苷单体
EP3455232B1 (en) 2016-05-12 2020-05-06 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Enhanced coupling of stereodefined oxazaphospholidine phosphoramidite monomers to nucleoside or oligonucleotide
CA3024448A1 (en) 2016-05-18 2017-11-23 Voyager Therapeutics, Inc. Modulatory polynucleotides
KR102427379B1 (ko) 2016-05-18 2022-08-02 보이저 테라퓨틱스, 인크. 헌팅톤 질환을 치료하기 위한 조성물 및 방법
US11015196B2 (en) 2016-05-20 2021-05-25 The General Hospital Corporation Using microRNAs to control activation status of hepatic stellate cells and to prevent fibrosis in progressive liver diseases
WO2017216340A1 (en) 2016-06-17 2017-12-21 F. Hoffmann-La Roche Ag In vitro nephrotoxicity screening assay
WO2017216325A1 (en) 2016-06-17 2017-12-21 F. Hoffmann-La Roche Ag In vitro nephrotoxicity screening assay
WO2018013525A1 (en) 2016-07-11 2018-01-18 Translate Bio Ma, Inc. Nucleic acid conjugates and uses thereof
EP3484526A4 (en) 2016-07-18 2020-04-15 Jaan Biotherapeutics, LLC COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE TREATMENT OF HEART DISEASE
US20220354888A1 (en) 2016-08-03 2022-11-10 Aalborg Universitet ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES (ASOs) DESIGNED TO INHIBIT IMMUNE CHECKPOINT PROTEINS
WO2018080658A1 (en) * 2016-10-27 2018-05-03 Aalborg University Therapeutic targeting of a microrna to treat duchenne muscular dystrophy
EP3532638A4 (en) 2016-10-31 2020-07-29 University of Massachusetts TARGETING MICROARN-101-3 P IN CARCINOTHERAPY
BR112019008810A2 (pt) 2016-11-01 2019-07-16 Univ New York State Res Found micrornas modificadas com 5-halouracila e seu uso no tratamento de câncer
AU2017379880A1 (en) 2016-12-22 2019-07-04 Ohio State Innovation Foundation Compositions and methods for reprogramming somatic cells into induced vasculogenic cells
KR20190133173A (ko) 2017-03-29 2019-12-02 로슈 이노베이션 센터 코펜하겐 에이/에스 유니링커 신속 절단
WO2018177825A1 (en) 2017-03-29 2018-10-04 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Orthogonal protecting groups for the preparation of stereodefined phosphorothioate oligonucleotides
US20200384115A1 (en) 2017-04-21 2020-12-10 The Broad Institute , Inc. Targeted delivery to beta cells
AU2018261003A1 (en) 2017-05-05 2019-11-14 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating Huntington's Disease
EP3618839A4 (en) 2017-05-05 2021-06-09 Voyager Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS AND TREATMENT METHODS FOR AMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS (ALS)
WO2019002237A1 (en) 2017-06-28 2019-01-03 Roche Innovation Center Copenhagen A/S METHOD OF MULTIPLE COUPLING AND OXIDATION
JP2021502059A (ja) 2017-10-13 2021-01-28 ロシュ イノベーション センター コペンハーゲン エーエス 部分的に立体定義されたオリゴヌクレオチドのサブライブラリーを使用することによる、アンチセンスオリゴヌクレオチドの、改良された立体定義されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチド変異体を同定するための方法
EP3697908A1 (en) 2017-10-16 2020-08-26 Voyager Therapeutics, Inc. Treatment of amyotrophic lateral sclerosis (als)
CN111479924A (zh) 2017-10-16 2020-07-31 沃雅戈治疗公司 肌萎缩性侧索硬化症(als)的治疗
WO2019089216A1 (en) 2017-11-01 2019-05-09 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods of treating cancers
CN108272815B (zh) * 2017-12-06 2020-09-11 南方医科大学深圳医院 EB病毒miR-BART10-5p抑制剂的应用
CN108220381A (zh) * 2017-12-07 2018-06-29 国家卫生计生委科学技术研究所 试剂在制备药物中的用途以及筛选药物的方法
EP4092118A1 (en) 2017-12-22 2022-11-23 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Novel thiophosphoramidites
JP7476102B2 (ja) 2017-12-22 2024-04-30 ロシュ イノベーション センター コペンハーゲン エーエス ホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチド
AU2018386527A1 (en) 2017-12-22 2020-04-30 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Gapmer oligonucleotides comprising a phosphorodithioate internucleoside linkage
JP2021518841A (ja) * 2018-03-14 2021-08-05 ベス イスラエル デアコネス メディカル センター マイクロｒｎａと肥満症
CN108220427B (zh) * 2018-03-20 2021-09-28 南京大学 一种用于鉴别诊断BHD综合征与原发性自发性气胸的血浆microRNA标记物及应用
EP3793685A1 (en) * 2018-05-18 2021-03-24 F. Hoffmann-La Roche AG Pharmaceutical compositions for treatment of microrna related diseases
US11679100B2 (en) 2018-05-30 2023-06-20 The Regents Of The University Of California Methods of enhancing immunity
CN110777199B (zh) * 2018-07-24 2023-11-14 长庚医疗财团法人高雄长庚纪念医院 干癣性关节炎的诊断及治疗及其相应的试剂盒
TW202020155A (zh) 2018-07-31 2020-06-01 丹麥商羅氏創新中心哥本哈根有限公司 含有三硫代磷酸酯核苷間連結之寡核苷酸
CN112236439A (zh) 2018-07-31 2021-01-15 罗氏创新中心哥本哈根有限公司 包含三硫代磷酸酯核苷间键的寡核苷酸
JP2021534759A (ja) 2018-08-23 2021-12-16 ロシュ・イノベーション・センター・コペンハーゲン・アクティーゼルスカブRoche Innovation Center Copenhagen A/S Ｍｉｃｒｏｒｎａ−１３４バイオマーカー
CA3110661A1 (en) 2018-08-29 2020-03-05 University Of Massachusetts Inhibition of protein kinases to treat friedreich ataxia
EP3620519A1 (en) 2018-09-04 2020-03-11 F. Hoffmann-La Roche AG Use of isolated milk extracellular vesicles for delivering oligonucleotides orally
CN110468202A (zh) * 2019-01-18 2019-11-19 宁夏医科大学 一种靶向TIGIT的miR-206作为肝癌诊断和治疗新型分子的用途
EP3914232A1 (en) 2019-01-25 2021-12-01 F. Hoffmann-La Roche AG Lipid vesicle for oral drug delivery
CA3130431A1 (en) 2019-02-20 2020-08-27 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Phosphonoacetate gapmer oligonucleotides
CA3129646A1 (en) 2019-02-20 2020-08-27 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Novel phosphoramidites
CN113474633A (zh) 2019-02-26 2021-10-01 罗氏创新中心哥本哈根有限公司 寡核苷酸配制方法
JP2022522660A (ja) * 2019-02-26 2022-04-20 ソウル大学校産学協力団 Ｔｕｔ４／７発現調節因子を含む癌予防又は治療用薬学的組成物
US11466274B2 (en) 2019-05-31 2022-10-11 Aligos Therapeutics, Inc. Modified gapmer oligonucleotides and methods of use
PE20220902A1 (es) 2019-06-26 2022-05-30 Biorchestra Co Ltd Nanoparticulas micelares y sus usos
CN110548041A (zh) * 2019-08-30 2019-12-10 中国医科大学附属盛京医院 LNA-anti-miR-150在制备预防或治疗肾脏纤维化药物中的用途
CN111057790B (zh) * 2019-12-11 2022-08-30 石河子大学 miRNA在制备用于检测KSHV潜伏感染的试剂盒中的用途
WO2021170697A1 (en) 2020-02-28 2021-09-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Oligonucleotides for modulating cd73 exon 7 splicing
TW202146651A (zh) * 2020-03-02 2021-12-16 日商田邊三菱製藥股份有限公司 ｍｉＲ－３３ｂ阻礙物質所致之動脈瘤的預防或治療
KR102555878B1 (ko) * 2020-04-23 2023-07-17 주식회사 바이오오케스트라 하향조절된 mirna의 진단 및 치료를 위한 용도
WO2021251526A1 (ko) * 2020-06-11 2021-12-16 주식회사 프로스테믹스 신규한 mirna 유사체 및 이의 용도
CN112301130B (zh) * 2020-11-12 2021-11-30 苏州京脉生物科技有限公司 一种肺癌早期检测的标志物、试剂盒及方法
AU2022219031A1 (en) 2021-02-12 2023-09-07 Merand Pharmaceuticals, Inc. Agents, compositions, and methods for the treatment of hypoxia and ischemia-related disorders
EP4347824A1 (en) 2021-06-04 2024-04-10 Neumirna Therapeutics ApS Antisense oligonucleotides targeting adenosine kinase
WO2022260162A1 (ja) * 2021-06-11 2022-12-15 国立大学法人京都大学 Ｎａｓｈの予防及び／又は治療剤
EP4105328A1 (en) 2021-06-15 2022-12-21 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Antisense-oligonucleotides for prevention of kidney dysfunction promoted by endothelial dysfunction by ephrin-b2 suppression
KR102329524B1 (ko) * 2021-08-06 2021-11-23 주식회사 네오나 변형된 rt-let7을 유효성분으로 포함하는 간암의 예방 또는 치료용 조성물
WO2023013818A1 (ko) * 2021-08-06 2023-02-09 주식회사 네오나 변형된 rt-let7을 유효성분으로 포함하는 간암의 예방 또는 치료용 조성물
AU2022329462A1 (en) 2021-08-19 2024-03-28 Neumirna Therapeutics Aps Antisense oligonucleotides targeting adenosine kinase
CA3233014A1 (en) * 2021-10-08 2023-04-13 Denis Drygin Methods and compositions for avoiding off-target effects
WO2024026474A1 (en) 2022-07-29 2024-02-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for transferrin receptor (tfr)-mediated delivery to the brain and muscle

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004046160A2 (en) * 2002-11-18 2004-06-03 Santaris Pharma A/S Amino-lna, thio-lna and alpha-l-oxy-ln
WO2005013901A2 (en) * 2003-07-31 2005-02-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds and compositions for use in modulation of small non-coding rnas
WO2005061710A1 (en) * 2003-12-23 2005-07-07 Santaris Pharma A/S Oligomeric compounds for the modulation of bcl-2
WO2006069584A2 (en) * 2004-12-29 2006-07-06 Exiqon A/S NOVEL OLIGONUCLEOTIDE COMPOSITIONS AND PROBE SEQUENCES USEFUL FOR DETECTION AND ANALYSIS OF microRNAs AND THEIR TARGET mRNAs

Family Cites Families (95)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4962029A (en) 1987-10-02 1990-10-09 Cetus Corporation Covalent oligonucleotide-horseradish peroxidase conjugate
US4914210A (en) 1987-10-02 1990-04-03 Cetus Corporation Oligonucleotide functionalizing reagents
US4920115A (en) 1988-12-28 1990-04-24 Virginia Commonwealth University Method of lowering LDL cholesterol in blood
JPH06311885A (ja) 1992-08-25 1994-11-08 Mitsubishi Kasei Corp Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子に相補的なアンチセンス化合物
US6433159B1 (en) * 1992-09-10 2002-08-13 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treatment of Hepatitis C virus associated diseases
US6423489B1 (en) * 1992-09-10 2002-07-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treatment of Hepatitis C virus-associated diseases
NZ286209A (en) * 1992-09-10 2000-09-29 Isis Pharmaceuticals Inc Use of HCV RNA anti-sense nucleotide sequences for treating Hepatitis C virus related disease
WO1995030746A1 (en) 1994-05-10 1995-11-16 The General Hospital Corporation Antisense inhibition of hepatitis c virus
DE69529849T2 (de) 1995-06-07 2003-09-04 Pfizer Biphenyl-2-carbonsäure-tetrahydro-isochinolin-6-yl amid derivate, deren hestellung und deren verwendung als inhibitoren des mikrosomalen triglycerid-transfer-proteins und/oder der apolipoprotein b (apo b) sekretion
AU716151B2 (en) 1996-11-27 2000-02-17 Pfizer Inc. Apo B-secretion/MTP inhibitory amides
JP2001514508A (ja) * 1997-03-05 2001-09-11 ユニバーシティー オブ ワシントン Ｃ型肝炎ウイルスの複製を選択的に抑制する薬剤を同定するための新規なスクリーニング法
CA2303299C (en) 1997-09-12 2016-02-23 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
WO2000056748A1 (en) 1999-03-18 2000-09-28 Exiqon A/S Xylo-lna analogues
AU3418800A (en) 1999-03-24 2000-10-09 Exiqon A/S Improved synthesis of (2.2.1)bicyclo nucleosides
US7098192B2 (en) * 1999-04-08 2006-08-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of STAT3 expression
CA2372085C (en) 1999-05-04 2009-10-27 Exiqon A/S L-ribo-lna analogues
US6617442B1 (en) 1999-09-30 2003-09-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Human Rnase H1 and oligonucleotide compositions thereof
EP1224280A2 (en) 1999-10-04 2002-07-24 Exiqon A/S Design of high affinity rnase h recruiting oligonucleotide
IL139450A0 (en) 1999-11-10 2001-11-25 Pfizer Prod Inc Methods of administering apo b-secretion/mtp inhibitors
ATE325806T1 (de) 2000-10-04 2006-06-15 Santaris Pharma As Verbesserte synthese von purin-blockierten nukleinsäure-analoga
US20030068320A1 (en) 2001-03-02 2003-04-10 Christine Dingivan Methods of administering/dosing CD2 antagonists for the prevention and treatment of autoimmune disorders or inflammatory disorders
CA2442092A1 (en) 2001-03-26 2002-10-17 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide mediated inhibition of hepatitis b virus and hepatitis c virus replication
WO2003070750A2 (en) 2002-02-20 2003-08-28 Sirna Therapeutics, Inc Rna interference mediated inhibition of hepatitis c virus
US20030125241A1 (en) 2001-05-18 2003-07-03 Margit Wissenbach Therapeutic uses of LNA-modified oligonucleotides in infectious diseases
AU2002328792A1 (en) 2001-07-12 2003-01-29 Santaris Pharma A/S Method for preparation of lna phosphoramidites
US7407943B2 (en) 2001-08-01 2008-08-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of apolipoprotein B expression
EP1446412B1 (en) * 2001-09-04 2012-03-07 Exiqon A/S Novel lna compositions and uses thereof
IL161100A0 (en) 2001-09-28 2004-08-31 Max Planck Gesellschaft Identification of novel genes coding for small temporal rnas
EP1432724A4 (en) * 2002-02-20 2006-02-01 Sirna Therapeutics Inc RNA inhibition mediated inhibition of MAP KINASE GENES
JP4476802B2 (ja) 2002-05-08 2010-06-09 サンタリス ファーマ アー／エス ロックト核酸誘導体の製造
UA79300C2 (en) 2002-08-12 2007-06-11 Janssen Pharmaceutica Nv N-aryl piperidine substituted biphenylcarboxamides as inhibitors of apolipoprotein b secretion
US7183302B2 (en) * 2002-08-12 2007-02-27 Bristol-Myers Squibb Company Iminothiazolidinones as inhibitors of HCV replication
US7087229B2 (en) 2003-05-30 2006-08-08 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Releasable polymeric conjugates based on aliphatic biodegradable linkers
WO2004044181A2 (en) 2002-11-13 2004-05-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of apolipoprotein b expression
US8124582B2 (en) 2002-12-06 2012-02-28 Fibrogen, Inc. Treatment of diabetes
FR2848572B1 (fr) * 2002-12-12 2005-12-09 Univ Joseph Fourier Molecules inhibitrices de la synthese proteique du virus de l'hepatite c et procede de criblage desdites molecules inhibitrices
KR20050115231A (ko) 2003-02-10 2005-12-07 내셔날 인스티튜트 오브 어드밴스드 인더스트리얼 사이언스 앤드 테크놀로지 포유동물 세포의 조절
MXPA05008319A (es) 2003-02-10 2006-02-28 Santaris Pharma As Compuestos oligomericos para la modulacion de la expresion de survivina.
US20040248840A1 (en) * 2003-02-10 2004-12-09 Santaris Pharma A/S Oligomeric compounds for the modulation of ras expression
DK2141234T3 (en) * 2003-03-21 2016-06-20 Roche Innovation Ct Copenhagen As Short interfering RNA (siRNA) analogues
EP2664672A1 (en) * 2003-04-17 2013-11-20 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Modified iRNA agents
EP1668145A4 (en) 2003-08-07 2010-03-10 Avi Biopharma Inc SENSE ANTIVIRUS COMPOUND AND METHOD FOR TREATING SSRNA VIRUS INFECTION
US20050142581A1 (en) 2003-09-04 2005-06-30 Griffey Richard H. Microrna as ligands and target molecules
AU2004294567A1 (en) 2003-11-26 2005-06-16 University Of Massachusetts Sequence-specific inhibition of small RNA function
UA83510C2 (en) 2003-12-09 2008-07-25 Янссен Фармацевтика Н.В. N-aryl piperidine substituted biphenylcarboxamides as inhibitors of apolipoprotein b
EP1713938A2 (en) 2004-02-09 2006-10-25 Thomas Jefferson University DIAGNOSIS AND TREATMENT OF CANCERS WITH MicroRNA LOCATED IN OR NEAR CANCER-ASSOCIATED CHROMOSOMAL FEATURES
US20050182005A1 (en) * 2004-02-13 2005-08-18 Tuschl Thomas H. Anti-microRNA oligonucleotide molecules
EP1723162A4 (en) * 2004-02-13 2010-05-05 Univ Rockefeller ANTI-microRNA oligonucleotide molecules
ES2380923T3 (es) 2004-04-07 2012-05-21 Exiqon A/S Procedimientos de cuantificación de microARN y ARN interferentes pequeños
US7365058B2 (en) 2004-04-13 2008-04-29 The Rockefeller University MicroRNA and methods for inhibiting same
CA2585525A1 (en) * 2004-04-20 2005-11-03 Genaco Biomedical Products, Inc. Method for detecting ncrna
PL1747023T5 (pl) 2004-05-04 2017-05-31 Univ Leland Stanford Junior Sposób i kompozycje do zmniejszania ilości genomu wirusowego HCV w komórkach docelowych
US20080213891A1 (en) 2004-07-21 2008-09-04 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. RNAi Agents Comprising Universal Nucleobases
EP1828215A2 (en) 2004-07-21 2007-09-05 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Oligonucleotides comprising a modified or non-natural nucleobase
FR2873694B1 (fr) 2004-07-27 2006-12-08 Merck Sante Soc Par Actions Si Nouveaux aza-indoles inhibiteurs de la mtp et apob
WO2006112872A2 (en) 2004-08-04 2006-10-26 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides comprising a ligand tethered to a modified or non-natural nucleobase
ES2663810T3 (es) 2004-08-10 2018-04-17 Kastle Therapeutics, Llc Métodos para modular los niveles de lipoproteínas y colesterol en humanos
US7582744B2 (en) 2004-08-10 2009-09-01 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Chemically modified oligonucleotides
WO2006027776A1 (en) 2004-09-07 2006-03-16 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Agents, compositions and methods for treating pathologies in which regulating an ache-associated biological pathway is beneficial
NZ572403A (en) 2004-09-24 2010-03-26 Alnylam Pharmaceuticals Inc Rnai modulation of apob and uses thereof
CA2850323A1 (en) 2004-11-12 2006-12-28 Asuragen, Inc. Methods and compositions involving mirna and mirna inhibitor molecules
EP2199298A1 (en) 2004-11-17 2010-06-23 Protiva Biotherapeutics Inc. Sirna silencing of Apolipoprotein B
US20060185027A1 (en) * 2004-12-23 2006-08-17 David Bartel Systems and methods for identifying miRNA targets and for altering miRNA and target expression
NZ563009A (en) 2005-04-19 2011-05-27 Surface Logix Inc Inhibitors of microsomal triglyceride transfer protein and Apo-B secretion
US20060265771A1 (en) * 2005-05-17 2006-11-23 Lewis David L Monitoring microrna expression and function
US20090209621A1 (en) 2005-06-03 2009-08-20 The Johns Hopkins University Compositions and methods for decreasing microrna expression for the treatment of neoplasia
US20070213292A1 (en) 2005-08-10 2007-09-13 The Rockefeller University Chemically modified oligonucleotides for use in modulating micro RNA and uses thereof
US20070123482A1 (en) 2005-08-10 2007-05-31 Markus Stoffel Chemically modified oligonucleotides for use in modulating micro RNA and uses thereof
CA2620856C (en) 2005-08-29 2017-11-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for use in modulating mir-122a
EP2338992A3 (en) 2005-08-29 2011-10-12 Regulus Therapeutics, Inc Antisense compounds having enhanced anti-microRNA activity
WO2007031091A2 (en) 2005-09-15 2007-03-22 Santaris Pharma A/S Rna antagonist compounds for the modulation of p21 ras expression
JP2009507499A (ja) 2005-09-15 2009-02-26 サンタリス ファーマ アー／エス Ａｐｏ−ｂ１００発現の抑制のためのｒｎａアンタゴニスト化合物
WO2007090073A2 (en) 2006-01-27 2007-08-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds and compositions for the use in modulation of micrornas
KR101407707B1 (ko) 2006-04-03 2014-06-19 산타리스 팔마 에이/에스 Ａｎｔｉ-ｍｉｒｎａ 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 약학적 조성물
DK2015758T3 (da) 2006-05-05 2014-06-23 Isis Pharmaceuticals Inc Forbindelser og fremgangsmåder til modulering af ekspression af apob
US7547684B2 (en) 2006-05-11 2009-06-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. 5′-modified bicyclic nucleic acid analogs
US20080199961A1 (en) 2006-08-25 2008-08-21 Avi Biopharma, Inc. ANTISENSE COMPOSITION AND METHOD FOR INHIBITION OF miRNA BIOGENESIS
WO2008034122A2 (en) 2006-09-15 2008-03-20 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Hindered ester-based biodegradable linkers for oligonucleotide delivery
AU2007296055A1 (en) 2006-09-15 2008-03-20 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Polymeric conjugates containing positively-charged moieties
EP2090665A2 (en) 2006-10-20 2009-08-19 Exiqon A/S Novel human microRNAs associated with cancer
EP2086590A4 (en) 2006-10-24 2011-04-06 Univ Leland Stanford Junior MODULATION OF A T-CELL SIGNALING THRESHOLD AND THE SENSITIVITY OF T-CELLS AGAINST ANTIGENE
US20100021914A1 (en) 2006-11-23 2010-01-28 Querdenker Aps Oligonucleotides for modulating target rna activity
WO2008074328A2 (en) 2006-12-21 2008-06-26 Exiqon A/S Microrna target site blocking oligos and uses thereof
DK2149605T3 (da) 2007-03-22 2013-09-30 Santaris Pharma As Korte RNA antagonist forbindelser til modulering af det ønskede mRNA
WO2008124384A2 (en) 2007-04-03 2008-10-16 Aegerion Pharmaceuticals, Inc. Combinations of mtp inhibitors with cholesterol absorption inhibitors or interferon for treating hepatitis c
US8278425B2 (en) 2007-05-30 2012-10-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-substituted-aminomethylene bridged bicyclic nucleic acid analogs
WO2008154401A2 (en) 2007-06-08 2008-12-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Carbocyclic bicyclic nucleic acid analogs
US20090082297A1 (en) 2007-06-25 2009-03-26 Lioy Daniel T Compositions and Methods for Regulating Gene Expression
US20110009466A1 (en) 2007-08-29 2011-01-13 President And Fellows Of Harvard College Methods of increasing gene expression through rna protection
WO2009043354A2 (en) 2007-10-04 2009-04-09 Santaris Pharma A/S Combination treatment for the treatment of hepatitis c virus infection
WO2009109665A1 (en) 2008-03-07 2009-09-11 Santaris Pharma A/S Pharmaceutical compositions for treatment of microrna related diseases
WO2010000665A1 (en) 2008-06-30 2010-01-07 Santaris Pharma A/S Antidote oligomers
US8398734B2 (en) 2008-08-01 2013-03-19 Twister B.V. Cyclonic separator with a volute outlet duct
US9034837B2 (en) 2009-04-24 2015-05-19 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Pharmaceutical compositions for treatment of HCV patients that are poor-responders to interferon
US9364495B2 (en) 2009-10-20 2016-06-14 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Oral delivery of therapeutically effective LNA oligonucleotides

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004046160A2 (en) * 2002-11-18 2004-06-03 Santaris Pharma A/S Amino-lna, thio-lna and alpha-l-oxy-ln
WO2005013901A2 (en) * 2003-07-31 2005-02-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds and compositions for use in modulation of small non-coding rnas
WO2005061710A1 (en) * 2003-12-23 2005-07-07 Santaris Pharma A/S Oligomeric compounds for the modulation of bcl-2
WO2006069584A2 (en) * 2004-12-29 2006-07-06 Exiqon A/S NOVEL OLIGONUCLEOTIDE COMPOSITIONS AND PROBE SEQUENCES USEFUL FOR DETECTION AND ANALYSIS OF microRNAs AND THEIR TARGET mRNAs

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BRENNECKE JULIUS ET AL.: "Principles of microRNA-target recognition". PLOS BIOLOGY, vol. 3, no. 3, March 2005 (2005-03), pages E85/0404-E85/0418, XP002395136, ISSN: 1545-7885 *
JEPSEN JAN STENVANG ET AL.: "Locked nucleic acid: A potent nucleic acid analog in therapeutics and biotechnology". OLIGONUCLEOTIDES, vol. 14, no. 2, 2004, pages 130-146, XP002395137, ISSN: 1545-4576 *
WEILER O. ET AL.: "Anti-miRNA oligonucleotides (AMOs): ammunition to target miRNAs implicated in human disease". GENE THERAPY, vol. 13, no. 6, March 2006 (2006-03), pages 496-502, XP002395138, ISSN: 0969-7128 *

Also Published As

Publication number Publication date
DK2666859T3 (en) 2019-04-08
AU2007234191B2 (en) 2012-07-12
KR101407707B1 (ko) 2014-06-19
WO2007112753A2 (en) 2007-10-11
CA2649045A1 (en) 2007-10-11
JP5814505B2 (ja) 2015-11-17
WO2007112753A8 (en) 2009-07-30
WO2007112754A2 (en) 2007-10-11
CA3042781A1 (en) 2007-10-11
EP2007888A2 (en) 2008-12-31
EP2007889A2 (en) 2008-12-31
US20140329883A1 (en) 2014-11-06
WO2007112753A3 (en) 2008-03-13
US9133455B2 (en) 2015-09-15
JP2009532044A (ja) 2009-09-10
CA2648132C (en) 2019-05-28
JP2013078317A (ja) 2013-05-02
CA2648132A1 (en) 2007-10-11
US20180195062A1 (en) 2018-07-12
AU2007234191A1 (en) 2007-10-11
EP2194129A3 (en) 2012-12-26
US20190071672A1 (en) 2019-03-07
MX2008012219A (es) 2008-10-02
AU2007234192A1 (en) 2007-10-11
US8729250B2 (en) 2014-05-20
CA2649045C (en) 2019-06-11
EP2194129A2 (en) 2010-06-09
JP5872603B2 (ja) 2016-03-01
IL194007A0 (en) 2011-08-01
US20210071181A1 (en) 2021-03-11
US20160060627A1 (en) 2016-03-03
JP2014128274A (ja) 2014-07-10
US20100004320A1 (en) 2010-01-07
JP5198430B2 (ja) 2013-05-15
US20120238618A1 (en) 2012-09-20
ES2715625T3 (es) 2019-06-05
CA3042781C (en) 2021-10-19
WO2007112754A3 (en) 2008-04-24
JP6326025B2 (ja) 2018-05-16
CA3024953A1 (en) 2007-10-11
EA200870402A1 (ru) 2009-04-28
JP2009532392A (ja) 2009-09-10
US20120083596A1 (en) 2012-04-05
JP2016073293A (ja) 2016-05-12
KR20080108154A (ko) 2008-12-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA015570B1 (ru) Фармацевтическая композиция
US11505569B2 (en) GalNAc phosphoramidites, nucleic acid conjugates thereof and their use
EP2261333B1 (en) Pharmaceutical composition comprising anti-miRNA antisense oligonucleotides
EP2203559B1 (en) Combination treatment for the treatment of hepatitis c virus infection
EA009670B1 (ru) МОДУЛИРОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ eIF4E
WO2016006697A1 (ja) アンチセンス抗悪性腫瘍剤
CN101437942A (zh) 包含抗微小rna反义寡核苷酸的药物组合物
CN114901821A (zh) Sept9抑制剂用于治疗乙型肝炎病毒感染的用途
CN102203255A (zh) 靶向hsp27的rna拮抗剂
JP7017193B2 (ja) Ｒｎａ作用抑制剤及びその利用
WO2020184700A1 (ja) Ｉｈｈ発現を調節するための核酸複合体
AU2012216487B2 (en) Pharmaceutical composition comprising anti-miRNA antisense oligonucleotides
JP2022120380A (ja) ｍｉＲＮＡ１３３－ｂ誘導体及びその利用
BRPI0709895A2 (pt) composição farmacêutica
AU2014208214A1 (en) Pharmaceutical composition comprising anti-miRNA antisense oligonucleotides
NZ571620A (en) Pharmaceutical composition comprising anti-miRNA antisense oligonucleotides

Legal Events

Date Code Title Description
PC4A Registration of transfer of a eurasian patent by assignment
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU