JP2021518841A - マイクロrnaと肥満症 - Google Patents
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Abstract
本開示は、代謝を調節するマイクロRNAの活性を阻害する薬剤を投与することにより、代謝障害を治療又は予防する方法を提供する。
Description
関連出願の相互参照
本願は、2018年3月14日に出願された米国仮特許出願第62/642,934号の利益とそれに基づく優先権を主張するものであり、当該米国仮特許出願はその内容全体が参照によって本明細書に援用されるものとする。
本願は、2018年3月14日に出願された米国仮特許出願第62/642,934号の利益とそれに基づく優先権を主張するものであり、当該米国仮特許出願はその内容全体が参照によって本明細書に援用されるものとする。
開示の分野
本開示は、マイクロRNAの活性又はマイクロRNAの発現を調節する薬剤を投与することによる、代謝障害の治療及び予防に関する。
本開示は、マイクロRNAの活性又はマイクロRNAの発現を調節する薬剤を投与することによる、代謝障害の治療及び予防に関する。
電子ファイルで提出されたテキストファイルの説明
本願で電子ファイルで提出されたテキストファイルの全内容は参照によって本明細書に援用される:コンピュータで読み取り可能な書式の配列表コピー(ファイル名:BID−005PC1_ST25.txt;作成日:2019年3月14日;ファイルサイズ:323,976バイト)。
本願で電子ファイルで提出されたテキストファイルの全内容は参照によって本明細書に援用される:コンピュータで読み取り可能な書式の配列表コピー(ファイル名:BID−005PC1_ST25.txt;作成日:2019年3月14日;ファイルサイズ:323,976バイト)。
マイクロRNA(miRNA又はmiR)は、標的遺伝子の発現を調節する核酸分子である。miRNAは通常は短く(通常18〜24ヌクレオチド)、miRNAと標的mRNAの配列が完全相補である場合は標的mRNAの分解を促進することによって、且つ/又は、miRNAと標的mRNAの配列がミスマッチを含む場合は翻訳を阻害することによって、標的mRNAの抑制因子として働く。miRNAの機能解析により、これらの低分子ノンコーディングRNAが、代謝障害関連遺伝子の調節をはじめとした、様々な生理的及び代謝的プロセスに寄与していることが明らかとなっている。代謝障害は、身体の代謝機能における1又は複数の異常を特徴とする。代謝障害はまた、肥満症と体重増加、インスリン産生の欠乏、又はインスリン感受性の欠陥を特徴とする。いくつかの代謝障害は身体による血糖使用の異常と関係があり、異常に高い血糖値をもたらす。代謝障害は世界中で数百万人に発症しており、生命を脅かす障害にもなり得る。合衆国で肥満症の発生は増加の一途を辿っており、健康リスクを低減し、肥満症、過食、過剰な体重増加、又は過剰な脂肪蓄積と関連した症状を改善する、より効果的な治療法の開発が強く求められている。したがって、代謝障害を治療する、予防する、又はその発症を遅延するための、方法及び組成物が求められている。
本開示は、マイクロRNAの活性又は発現を調節する薬剤を投与することによる、例えばマイクロRNAの発現及び/又は活性を阻害することによる、代謝障害を治療又は予防するための新規方法を提供する。このような阻害は、配列特異的な化学修飾オリゴヌクレオチドを介して行うことができ、例えば、LNA(locked nucleic acid)が挙げられる。LNA技術に基づいた阻害剤は、特に本明細書で開示される代謝関連遺伝子を制御しているmiRNAを標的とする場合、代謝障害を治療又は予防する効果的な方法を可能にする。
一つの態様において、本開示は、有効量のmiR−22阻害剤の投与を必要とする対象に、有効量のmiR−22阻害剤を投与することを含む、代謝障害を治療又は予防する方法を提供する。
いくつかの実施形態では、上記阻害剤の投与後の対象においてmiR−22の発現及び/又は活性が低減される。
いくつかの実施形態では、miR−22阻害剤はオリゴヌクレオチド系阻害剤である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド系阻害剤は、miR−22の成熟配列に対して少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、又は約100%の相補性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド系阻害剤はデオキシヌクレオチド又はリボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド系阻害剤は一本鎖である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド系阻害剤は二本鎖である。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド系阻害剤は1又は複数の化学修飾ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、化学修飾ヌクレオチドはLNA(locked nucleotide)である。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド系阻害剤は、約25個以下、約20個以下、約15個以下、約10個以下、約9個以下、約8個以下、約7個以下、約6個以下、又は約5個以下のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド系阻害剤は、1又は複数のN−アセチルガラクトサミン(GalNAc)部分に結合している。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド系阻害剤はアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド系阻害剤は低分子干渉RNA(siRNA)である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド系阻害剤はアプタマーである。
いくつかの実施形態では、miR−22阻害剤はペプチド系阻害剤又はタンパク質系阻害剤である。いくつかの実施形態では、タンパク質系阻害剤は抗体又はその抗原結合部分である。いくつかの実施形態では、miR−22阻害剤は小分子系阻害剤である。
いくつかの実施形態では、代謝障害は肥満症である。
いくつかの実施形態では、対象はプラダー・ウィリー症候群に罹患している。
いくつかの実施形態では、対象は高コレステロール血症に罹患している。
いくつかの実施形態では、対象は、脂肪量・肥満関連タンパク質(FTO;fat mass and obesity−associated protein)のバリアントを有しており、並びに/又は、FTOの発現及び/若しくは活性のアップレギュレーションを示す。
いくつかの実施形態では、対象は肥満であり、肥満度指数が約30超である。いくつかの実施形態では、対象は過体重であり、肥満度指数は約25〜29.9である。
いくつかの実施形態では、上記方法は体重減少を誘発する。いくつかの実施形態では、上記方法は、対象において約1%以上、約5%以上、約10%以上、約15%以上、約20%以上、又は約25%以上の総体重減少を誘発する。いくつかの実施形態では、上記方法は体重増加を予防する。
いくつかの実施形態では、上記方法は脂肪組織の増殖を低減又は予防する。いくつかの実施形態では、上記方法は脂肪細胞分化を障害する。
いくつかの実施形態では、代謝障害は脂肪性肝疾患である。いくつかの実施形態では、脂肪性肝疾患は、非アルコール性脂肪酸肝疾患(non−alcoholic fatty acid liver disease)(NAFLD)及び非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)から選択される。いくつかの実施形態では、上記方法は脂肪肝(liver steatosis)を低減又は予防する。
いくつかの実施形態では、上記方法は肝線維症を低減又は予防する。
いくつかの実施形態では、上記方法は、FTO、ALKBホモログ5(ALKBH5)、CCAAT/エンハンサー結合タンパク質α(CEBPα)、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ(PPARγ)、及び/又はATPクエン酸リアーゼ(ACLY)の活性及び/又は発現を低減する。
いくつかの実施形態では、上記方法は、ホスファターゼ・テンシン・ホモログ(PTEN)及び/又はtetメチルシトシンジオキシゲナーゼ2(TET2)の活性及び/又は発現を増強する。
いくつかの実施形態では、上記方法は、PPARγコアクチベーターα(PGC1−α)、特異性タンパク質1(SP1)、線維芽細胞増殖因子21(FGF−21)、脱共役タンパク質1(UCP1)、DNA損傷包含転写物4(DNA Damage Included Transcript 4)(DDIT−4、REDD1)、腫瘍タンパク質p63(TP63)、線維芽細胞増殖因子1(FGF1)、及び/又はメチルトランスフェラーゼ様タンパク質3(METTL3)の活性及び/又は発現を変化させる。いくつかの実施形態では、上記方法は、DNA若しくはRNAのメチル化レベルを変化させるか、又はRNAレベルでm6Aのレベルに影響を与える。
本明細書に記載のいずれの態様又は実施形態も、本明細書において開示されるいずれの他の態様又は実施形態と組み合わせることができる。
本特許又は出願ファイルは、少なくとも1つのカラー図面を含んでいる。カラー図面を含む本特許又は特許出願公開の写しは、請求に応じて、必要な手数料が支払われた場合に、米国特許商標庁により提供される。
本開示は、miR−22をはじめとするmiRNAが、肥満、プラダー・ウィリー症候群、高コレステロール血症、脂肪性肝疾患、非脂肪酸肝疾患(Non−Fatty Acid Liver Disease)(NAFLD)、及び/又は非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)を包含する種々の代謝障害と関連がある標的を制御可能であるという発見に基づくものである。
本開示は、肥満、プラダー・ウィリー症候群、高コレステロール血症、NAFLD及び/又はNASHを包含する代謝障害などの、その病因が代謝調節によって影響を受け得る疾患の治療及び/又は予防のための、種々の阻害剤によるmiR−22をはじめとするmiRNAのターゲティングを包含する。
miR−22は、ホスファターゼ・テンシン・ホモログ(PTEN)及びtetメチルシトシンジオキシゲナーゼ(TET)を直接標的とすることで、腫瘍形成、転移及び代謝障害を増進する。PTENを標的とする60種類を超えるmiRNAと少なくとも30種の新規の癌原遺伝子座がヒト癌で研究されている。PTENを標的とするmiRNAは進化的に脊椎動物間で高度に保存されており、種々の組織で普遍的に発現されている(Lagos−Quintana et al., 2001, 2002; Neely et al., 2006)。PTENの減少はワールブルグ効果と関連した代謝状態を惹起し、PTENの増加は抗ワールブルグ効果と関連した代謝状態を惹起するため、miR−22は、PTENを標的とすることで、代謝において意味のある存在であり続けている。いくつかの実施形態では、miR−22を標的とする遺伝子は、代謝と脂肪酸の酸化又は生合成を制御するものである。
一つの態様において、本開示の方法は、有効量のmiR−22阻害剤の投与を必要とする対象に有効量のmiR−22阻害剤を投与することを含む、代謝障害を治療又は予防する方法を提供する。
例えば、このような阻害は、配列特異的な化学修飾オリゴヌクレオチドを介して行うことができる。例示的な修飾物としてLNA(locked nucleic acid)が挙げられ、LNAにおいては、核酸のリボース部分が2’位の酸素と4’位の炭素を接続する外部架橋で修飾されており、この外部架橋によって、当該リボースが3’−エンド型構造に固定される。このLNA阻害剤は、特に本明細書で開示される代謝遺伝子を制御するmiRNAを標的とする場合に、種々の代謝障害の治療及び予防のために、効率的な送達が可能であり、十分な生物学的利用能を有する、対費用効果の高い薬剤を実現する。
本開示はさらに、疾患を治療するための医薬の製造における、本明細書に記載の任意の方法又は組み合わせの使用を提供する。そのような疾患として、例えば、代謝(例えば、脂肪関連代謝及び合成経路)の調節によって影響を受ける代謝障害又は代謝疾患が挙げられる。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、miR−22をはじめとするmiRNAは、脂肪関連性の代謝及び合成経路の標的及び/又は遺伝子を制御するものである。いくつかの実施形態では、脂肪関連性の代謝及び合成遺伝子としては、例えば、脂肪量・肥満関連タンパク質(FTO)、CCAAT/エンハンサー結合タンパク質α(CEBPα)、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ(PPARγ)、ホスファターゼ・テンシン・ホモログ(PTEN)、tetメチルシトシンジオキシゲナーゼ2(TET2)、ATPクエン酸リアーゼ(ACLY)、骨形成タンパク質7(BMP−7)、及び/又はサーチュイン1(SIRT−1)が挙げられる。
いくつかの実施形態では、脂肪関連性の代謝及び合成遺伝子はFTOを包含する。いくつかの実施形態では、上記方法は、脂肪量・肥満関連タンパク質(FTO)、CEBPα、及び/又はPPARγの活性及び/又は発現を低減する。
いくつかの実施形態では、上記方法は、ALKBホモログ5(ALKBH5)の活性及び/又は発現を低減する。いくつかの実施形態では、上記方法は、PTEN及び/又はTET2の活性及び/又は発現を増強する。
いくつかの実施形態では、上記方法は、PPARγコアクチベーターα(PGC1−α)、特異性タンパク質1(SP1)、線維芽細胞増殖因子21(FGF−21)、脱共役タンパク質1(UCP1)、DNA損傷包含転写物4(DNA Damage Included Transcript 4)(DDIT−4、REDD1)、メチルトランスフェラーゼ様タンパク質3(METTL3)、腫瘍タンパク質p63(TP63)、及び/又は線維芽細胞増殖因子1(FGF1)の活性及び/又は発現を変化させる。
いくつかの実施形態では、上記方法は、DNA若しくはRNAのメチル化レベルを変化させるか、又はRNAレベルでm6Aのレベルに影響を与える。
いくつかの実施形態では、本開示は、miRNAの阻害を介して、対象における代謝障害(特に限定されないが、例えば、肥満、プラダー・ウィリー症候群、高コレステロール血症、脂肪性肝疾患、NAFLD及び/又はNASH)を治療又は予防する。miRNAは、標的遺伝子の発現を制御することができる短い核酸分子である。Carringtonらによるレビュー、Science, Vol. 301(5631):336−338, 2003を参照されたい。miRNAは18〜24ヌクレオチド長程度である場合が多い。miRNAは、miRNAと標的mRNAの配列が完全相補である場合は標的mRNAの分解を促進することによって、且つ/又は、miRNAと標的mRNAの配列がミスマッチを含む場合は翻訳を阻害することによって、標的mRNAの抑制因子として働く。
理論に制限されるものではないが、成熟miRNAは、Pol II又はPol IIIによって生成され、pri−miRNAと呼ばれる一次転写産物から生じると考えられている。これらのpri−miRNAは、多くの場合、数千塩基長であるため、プロセシングされてより短い成熟miRNAが作製される。これらのpri−miRNAはマルチシストロン性である場合があり、多くのmiRNAへと発生し得るものを構築する、いくつかのクラスター化した配列の転写によって生じる。miRNAを生み出すためのプロセシングは二段階であり得る。1段階目に、pri−miRNAが核内でRNaseのDroshaによってプロセシングされ、約70〜約100ヌクレオチド長のヘアピン形前駆物質(pre−miRNA)が産生され得る。2段階目に、細胞質に移動後、このヘアピン形pre−miRNAが、RNaseのDicerによってさらなるプロセシングを受けて、二本鎖miRNAが産生され得る。その後、この成熟miRNA鎖が、RNA誘導サイレンシング複合体(RISC)に組み込まれ、塩基対相補性によってその標的mRNAと結合することで、タンパク質発現が抑制され得る。RISCサイレンシング複合体への進入用に優先的に選択されないmiRNA二本鎖の他方の鎖は、パッセンジャー鎖(passenger strand)又はマイナーmiRNA(minor miRNA)又はスター(*)鎖(star strand)として知られている。この鎖は分解される場合がある。特に明記されていない限り、本明細書で使用される場合、miRNAは、pri−miRNA及び/又はpre−miRNA及び/又は成熟miRNA及び/又はmiRNAのマイナー(スター)鎖及び/又は二本鎖型miRNAを指し得ると理解されたい。
いくつかの実施形態では、miRNA遺伝子は、タンパク質コード遺伝子のイントロン内、又はノンコーディング転写単位のイントロン内若しくはエクソン内に位置するものであり得る。イントロン性miRNAの発現はホスト転写単位の発現と同時に起こり得るが、これは、イントロン性miRNAとホスト転写単位が同じ向きをしており、これらを内包するRNA前駆体と協調的に発現されるからである。
いくつかの実施形態では、miRNAは、標的遺伝子転写物の3’非翻訳領域(3’UTR)内の配列に結合するものであり得る。いくつかの実施形態では、miRNAは、標的遺伝子転写物の3’UTRの外側の配列に結合するものであり得る。いくつかの実施形態では、miRNAは、標的遺伝子転写物の3’UTRの内側及び外側の両方に結合するものであり得る。
いくつかの実施形態では、標的認識において、miRNAの第2〜第7ヌクレオチド(miRNAのシード配列(seed sequence))と、標的3’UTR沿いの対応配列とのヌクレオチド対合(シードマッチ(seed match))が起こり得る。従って、miRNAと標的との結合は、5ヌクレオチド程度の塩基対合を含み得る。さらに、miRNAと標的との結合は、5ヌクレオチドよりも多い塩基対合を含み得る。いくつかの実施形態では、miRNAとそれが制御する遺伝子との結合は、miRNAが、2以下、4以下、6以下、8以下、又は10以下の標的核酸部位と結合することを介して行われ得る。
本開示のmiRNAは、直接的な結合により、代謝障害の病因に関連したマーカーの遺伝子などの代謝において非常に重要な遺伝子を含むがこれらに限定されない核酸を制御するものであり得る。この結合は、標的核酸に対して完全相補であってもよいし、ミスマッチを含んでいてもよい。この結合の作用は、標的の分解促進及び/又は翻訳阻害であり得る。
いくつかの実施形態では、本発明は、miR−22などのmiRNAの阻害を介して、対象における代謝障害を治療又は予防する。いくつかの実施形態では、miR−22をコードする核酸は、AAGCUGCCAGUUGAAGAACUGU(配列番号1)を含むか、それからなる。
miR−22のヘアピン形前駆物質と予想されるものは、その全体が、ノンコーディング転写物Cl7orf91のエクソン2内に含まれており、タンパク質をコードする能力を欠くにもかかわらず、そのスプライシングパターンはヒト及びマウスで概して保存されている。Rodriguez et al., Identification of mammalian microRNA host genes and transcription units. Genome Res. 2004 Oct;14(10A):1902−10を参照されたい。マウスモデルにおいてmir−22を内包するC17orf91のエクソン2を欠失させることより、miR−22が、SIRT1(NAD−dependent deacetylase sirtuin−1)、HDAC4(histone deacetylase 4)、PURB (purine−rich element binding protein B)、及びPTENを標的とすることで、心臓の肥大とリモデリングに関与している可能性が明らかとなった。Gurha et al., Targeted deletion of microRNA−22 promotes stress−induced cardiac dilation and contractile dysfunction. Circulation. 2012 Jun 5;125(22):2751−61;Huang et al., MicroRNA−22 regulates cardiac hypertrophy and remodeling in response to stress. Circ Res. 2013 Apr 26;112(9):1234−43を参照されたい。
さらに、PTENの下流標的であるAKTがmir−22転写を活性化することが確認され、発癌性PI3K/AKTシグナル経路における調節ループが示唆された。Bar et al., miR−22 forms a regulatory loop in PTEN/AKT pathway and modulates signaling kinetics. PLoS One. 2010;5(5): e10859を参照されたい。
本発明は、いくつかの実施形態において、miR−22が、Ptenを標的とする能力とは独立して、エピジェネティック修飾因子及びEMT促進因子として機能し得ることを示している。いくつかの実施形態では、本開示は、脂肪量・肥満関連タンパク質(FTO)バリアントの増加の予防及び/又はFTOバリアントの減少の誘発を介した、対象における代謝障害の治療又は予防を包含し、且つ/あるいは、FTOの発現及び/又は活性のダウンレギュレーションを示す。FTOは、ヒトにおいては16番染色体に位置するFTO遺伝子にコードされる酵素である。AlkBファミリータンパク質中の1つのホモログとして、FTOは、最初に同定されたmRNAデメチラーゼである。特定のFTO遺伝子バリアントはヒトの肥満症と関連している。
いくつかの実施形態では、阻害剤の配列は種間で保存されたものである。いくつかの実施形態では、阻害剤の配列は、部分的に、ヒト転写物の配列から取り出されたものである。いくつかの実施形態では、阻害剤は、対象における標的miRNA(特に限定されないが、例えば、miR−22)の発現及び/又は活性を低減するように選択される。
いくつかの実施形態では、miRNAの阻害剤はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチド若しくはデオキシリボヌクレオチド又はその組み合わせを含んでもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、化学修飾(特に限定されないが、例えば、糖又は主鎖の修飾)を少なくとも1つ有してもよい。
いくつかの実施形態では、上記の化学修飾は、ホスホロチオエート、2’−O−メチル、又は2’−O−メトキシエチル、2’−O−アルキル−RNAユニット、2’−OMe−RNAユニット、2’−アミノ−DNAユニット、2’−フルオロ−DNAユニット(例えば、限定されないが、2’位にフッ素への置換(2’F)を有するDNA類似体)、LNAユニット、PNAユニット、HNAユニット、INAユニット、及び2’MOE RNAユニットのうちの1又は複数である。
好適なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、高次構造が制限される二環式の糖ヌクレオシド修飾(BSN)を1又は複数含むものとすることができ、これは当該BSNを含むオリゴヌクレオチドとそれに相補的なmiRNA標的鎖との間で形成された複合体の熱安定性を増強する。例えば、1つの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドはLNA(locked nucleic acid)を少なくとも1つ含む。LNAは、2’−O、4’−C−メチレンリボヌクレオシド(構造A)を含み、そのリボース糖部分の高次構造が固定されている。別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、2’、4’−C−架橋2’デオキシリボヌクレオシド(CDNA、構造B)を少なくとも1つ含む。例えば、米国特許第6,403,566号及びWang et al., (1999) Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, Vol. 9: 1147−1150(共にその全体が参照によって本明細書に援用される)を参照されたい。さらに別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、構造Cに示される構造を有する修飾ヌクレオシドを少なくとも1つ含む。脂肪関連性の代謝及び合成経路の標的を制御するmiRNAを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドには、BSN(LNA、CDNAなど)又は他の修飾ヌクレオチドと、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドとの組み合わせを含ませることができる。
あるいは、アンチセンスオリゴヌクレオチドには、糖−リン酸骨格ではなくペプチドベースの骨格を有するペプチド核酸(PNA)を含ませることができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドに対する他の修飾糖又はリン酸ジエステル修飾も企図される。他の化学修飾としては特に限定されないが、例えば、2’−O−アルキル修飾(例えば、2’−O−メチル修飾、2’−O−メトキシエチル修飾)、2’−フルオロ修飾、及び4’−チオ修飾、並びに1又は複数のホスホロチオエート結合、モルフォリノ結合、又はホスホノカルボン酸結合などの主鎖修飾(例えば、その全体が参照によって本明細書に援用される米国特許第6,693,187号及び同第7,067,641号を参照)を挙げることができる。1つの実施形態では、発癌性miRNAを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、各塩基に2’−O−メチル糖修飾を含み、ホスホロチオエート結合によって連結されている。アンチセンスオリゴヌクレオチド、特にヌクレオチド長がより短い(例えば、16ヌクレオチド長未満、7〜8ヌクレオチド長)のアンチセンスオリゴヌクレオチドには、LNA修飾、二環式ヌクレオシド修飾、ホスホノギ酸修飾、2’O−アルキル修飾などを含むがこれらに限定されない、親和性を増強する修飾を1又は複数を含ませることができる。いくつかの実施形態では、好適なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、2’−O−メトキシエチル修飾リボヌクレオチドを5’末端と3’末端の両方に含み、少なくとも10個のデオキシリボヌクレオチドを中央に有する、2’−O−メトキシエチルギャップマーである。これらのギャップマーは、RNA標的のRNase H依存型分解機構を惹起することが可能である。安定性を増強し有効性を向上させる他のアンチセンスオリゴヌクレオチド修飾は、その全体が参照によって本明細書に援用される米国特許第6,838,283号に記載される修飾など、当該技術分野において公知であり、本発明の方法における使用に適したものである。例えば、限定されることを意図するものではないが、インビボにおける送達と安定性を促すために、アンチセンスオリゴヌクレオチドには、その3’末端に、ステロイド(コレステロール部分など)、ビタミン、脂肪酸、炭水化物若しくはグリコシド、ペプチド、又は他の小分子リガンドを連結することができる。
いくつかの実施形態では、miRNA、例えばmiR−22、の活性阻害に有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、約5〜約25ヌクレオチド長、約10〜約30ヌクレオチド長、又は約20〜約25ヌクレオチド長である。ある実施形態では、発癌性miRNAを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは約8〜約18ヌクレオチド長であり、他の実施形態では約12〜約16ヌクレオチド長であり、他の実施形態では約7〜約8ヌクレオチド長である。発癌性miRNAに対し相補性を有する7塩基長以上の任意のアンチセンスオリゴヌクレオチド、すなわち、当該miRNAの5’末端に相補的であり、且つ当該miRNAの完全相補配列を横切る、任意の抗miRを使用してよい。特に限定されないが、例えば、発癌性miRNA、例えばmiR−22を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、約5ヌクレオチド長、又は約6ヌクレオチド長、又は約7ヌクレオチド長、又は約8ヌクレオチド長、又は約9ヌクレオチド長、又は約10ヌクレオチド長、又は約11ヌクレオチド長、又は約12ヌクレオチド長、又は約13ヌクレオチド長、又は約14ヌクレオチド長、又は約15ヌクレオチド長、又は約16ヌクレオチド長、又は約17ヌクレオチド長、又は約18ヌクレオチド長、又は約19ヌクレオチド長、又は約20ヌクレオチド長、又は約21ヌクレオチド長、又は約22ヌクレオチド長、又は約23ヌクレオチド長、又は約24ヌクレオチド長、又は約25ヌクレオチド長、又は約26ヌクレオチド長、又は約27ヌクレオチド長、又は約28ヌクレオチド長、又は約29ヌクレオチド長、又は約30ヌクレオチド長である。
アンチセンスオリゴヌクレオチドには、成熟鎖側又はマイナー鎖側(すなわち、スター鎖側)の発癌性miRNA配列に対し少なくとも部分的に相補的な配列、例えば、成熟鎖側又はマイナー鎖側(すなわち、スター鎖側)の発癌性miRNA配列に対し少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%相補的な配列、を含ませることができる。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、成熟鎖側又はマイナー鎖側の発癌性miRNA配列に対して実質的に相補的な、すなわち、標的ポリヌクレオチド配列に対し少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%相補的なものとすることができる。1つの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、成熟鎖側又はマイナー鎖側の発癌性miRNA配列に対し100%相補的な配列を含む。
本明細書で使用される場合、実質的に相補的とは、標的ポリヌクレオチド配列(特に限定されないが、例えば、miR−22などの、成熟miRNA配列、マイナーmiRNA配列、miRNA前駆体配列、又はpri−miRNA配列)に対し、配列が少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、又は100%相補的であること表す。
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドはアンタゴミルである。アンタゴミルは一本鎖の化学的に修飾されたリボヌクレオチドであり、miRNAに対し少なくとも部分的に相補的であることで、そのmiRNAをサイレンシングし得る。例えば、Kriitzfeldt, et al., Nature (2005) 438 (7068): 685−9を参照されたい。アンタゴミルは、2’−O−メチル−糖修飾などの修飾ヌクレオチドを1又は複数含み得る。いくつかの実施形態では、アンタゴミルは、修飾ヌクレオチドのみを含む。アンタゴミルには、1又は複数のホスホロチオエート結合を含ませることで、部分的又は完全なホスホロチオエート骨格を与えることもできる。インビボにおける送達及び安定性を促すために、上記のアンタゴミルを、その3’末端において、コレステロール部分又は他の部分と連結することができる。阻害に適したアンタゴミルは、約15〜約50ヌクレオチド長のアンタゴミル、約18〜約30ヌクレオチド長のアンタゴミル、及び約20〜約25ヌクレオチド長のアンタゴミルであり得る。アンタゴミルは、成熟鎖側又はマイナー鎖側の発癌性miRNA配列に対し少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%相補的なものとすることができる。いくつかの実施形態では、アンタゴミルは、成熟鎖側又はマイナー鎖側の発癌性miRNA配列に対して実質的に相補的な、すなわち、標的ポリヌクレオチド配列に対し少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%相補的なものとしてもよい。他の実施形態では、アンタゴミルは、成熟鎖側又はマイナー鎖側の発癌性miRNA配列に対し100%相補的である。
アンチセンスオリゴヌクレオチド又はアンタゴミルには、発癌性miRNAのmiRNA前駆体配列(pre−miRNA)又はプライマリーmiRNA配列(pri−miRNA)に対し実質的に相補的な配列を含ませてもよい。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、上記miRNAの標的の3’非翻訳領域の外側に位置する配列を含む。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、上記miRNAの標的の3’非翻訳領域の内側に位置する配列を含む。
miR−22を含むがこれに限定されない本明細書に記載の発癌性miRNAの阻害剤又は作動剤のいずれも、miRNAの阻害剤又は作動剤をコードする発現ベクターの細胞への送達によって、標的細胞に送達することができる。ベクターは目的の核酸を細胞の内部に送達するために使用され得る組成物である。多数のベクターが当該技術分野において公知であり、例えば、直鎖ポリヌクレオチド、イオン性又は両親媒性の化合物と結合したポリヌクレオチド、プラスミド、及びウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。すなわち、ベクターという用語には、自己複製するプラスミド、ウイルスが包含される。ウイルスベクターの例としては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。発現コンストラクトは、生細胞において複製可能なものであっても、合成によって作製可能なものであってもよい。これを適用する目的のために、発現コンストラクト、発現ベクター、及びベクターという用語は、一般的で実例的な意味での本発明における適用を示すため、同義的に用いられ、本発明を限定する意図はない。
1つの実施形態では、発癌性miRNA、例えばmiR−22、の阻害剤を発現するための発現ベクターは、アンチセンスオリゴヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーターを含む。発現されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列は、発癌性miRNAの成熟側又はマイナー側配列に対し部分的に相補的であっても、完全に相補的であってもよい。機能的に連結した、又は転写調節下の、という表現は、本明細書で使用される場合、RNAポリメラーゼによる転写及びポリヌクレオチドの発現の開始を制御するために、プロモーターがポリヌクレオチドに対して正しい位置と向きにあることを意味している。
本明細書で使用される場合、プロモーターとは、細胞の合成機構又は導入された合成機構によって認識される、特定の遺伝子転写を開始するために必要とされるDNA配列を指す。好適なプロモーターとしては、RNA Pol I、RNA Pol II、RNA Pol III、及びウイルス性プロモーター(例えば、ヒトサイトメガロウイルス(CMV)前初期遺伝子プロモーター、SV40初期プロモーター、及びラウス肉腫ウイルス末端反復配列)が挙げられるが、これらに限定されない。
ある実施形態では、miRNA阻害物質をコードするポリヌクレオチド、又は代謝遺伝子を制御するmiRNA及び/若しくは代謝性病因に関連したマーカーの遺伝子を標的とするmiRNAをコードするポリヌクレオチド、に機能的に連結したプロモーターは、誘導性プロモーターであり得る。誘導性プロモーターは、当該技術分野において公知であり、例えば、テトラサイクリンプロモーター、メタロチオネインIIAプロモーター、熱ショックプロモーター、ステロイド/甲状腺ホルモン/レチノイン酸応答エレメント、アデノウイルス後期プロモーター、及び誘導性マウス乳癌ウイルスLTRが挙げられるが、これらに限定されない。
発現コンストラクトや核酸を細胞に送達する方法は当該技術分野において公知であり、特に限定されないが、例えば、リン酸カルシウム共沈法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、DEAE−デキストラン法、リポフェクション法、ポリアミン系トランスフェクション試薬を用いたトランスフェクション法、細胞超音波処理法、高速度微粒子を用いた遺伝子銃法(gene bombardment)、及び受容体介在性トランスフェクション法を挙げることができる。
本発明は、治療後に発癌性miRNAの阻害剤を捕捉又は除去することも包含する。捕捉剤としては、miRNA阻害物質又はそれを発現するベクターに相補的な単離核酸を挙げることができる。すなわち、捕捉剤は、miRNA阻害物質又はそれを発現するベクターに結合することで、miRNAと標的との結合を阻止することができる。
いくつかの実施形態では、本開示は、代謝障害の治療又は予防を必要とする対象の、代謝障害を治療又は予防する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、対象における、肥満、プラダー・ウィリー症候群、高コレステロール血症、脂肪性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)、及び/又は非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)を含む代謝障害を治療又は予防する方法を提供する。
代謝障害
用語「代謝障害」とは、本発明に関連して用いられる場合、褐色脂肪組織、血漿グルコース濃度、血漿インスリン値、及び/又は体脂肪含有量の有無、値、又は活性に影響を受ける疾患又は異常を指す。いくつかの実施形態では、代謝障害又は代謝異常としてはまた、例えば、メタボリックシンドローム、耐糖能障害、血漿インスリン濃度及びインスリン抵抗性の上昇、脂質異常症、高血糖症、高脂血症、高血圧症、脂肪異栄養症、心血管疾患、呼吸器系の問題又は異常等が挙げられるが、これらに限定されない。特に重要な代謝障害は、肥満、プラダー・ウィリー症候群、高コレステロール血症、脂肪性肝疾患、例えば、非脂肪酸肝疾患(Non−Fatty Acid Liver Disease)(NAFLD)及び/又は非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)である。
用語「代謝障害」とは、本発明に関連して用いられる場合、褐色脂肪組織、血漿グルコース濃度、血漿インスリン値、及び/又は体脂肪含有量の有無、値、又は活性に影響を受ける疾患又は異常を指す。いくつかの実施形態では、代謝障害又は代謝異常としてはまた、例えば、メタボリックシンドローム、耐糖能障害、血漿インスリン濃度及びインスリン抵抗性の上昇、脂質異常症、高血糖症、高脂血症、高血圧症、脂肪異栄養症、心血管疾患、呼吸器系の問題又は異常等が挙げられるが、これらに限定されない。特に重要な代謝障害は、肥満、プラダー・ウィリー症候群、高コレステロール血症、脂肪性肝疾患、例えば、非脂肪酸肝疾患(Non−Fatty Acid Liver Disease)(NAFLD)及び/又は非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)である。
肥満症
いくつかの実施形態では、本開示は肥満症に関する。肥満は、現代社会において高度に蔓延した慢性疾患であり、社会的不名誉を伴うだけでなく、寿命の短縮や、さらには真性糖尿病、インスリン抵抗性、高血圧症、高コレステロール血症、胆石症、変形性関節症、整形外科的外傷、血栓塞栓性疾患、がん、及び冠動脈心疾患をはじめとした多くの医学的問題とも関連付けられている。Rissanen et al., British Medical Journal, 301: 835−837 (1990)。いくつかの実施形態では、肥満は、肥満度指数(BMI:体重/身長(m)2)を用いて算出され得る。いくつかの実施形態では、肥満症は、他の点では健常な対象が30kg/m2以上のBMIを有していること、又は、少なくとも1つの合併性を有する対象が27kg/m2以上のBMIを有している状態と定義される。本開示の方法のいくつかの実施形態では、対象は、肥満であり、約30超の肥満度指数を有する。いくつかの実施形態では、対象は過体重であり、肥満度指数は約25〜29.9である。いくつかの実施形態では、上記方法は体重減少を誘発する。いくつかの実施形態では、上記方法は体重増加を予防する。いくつかの実施形態では、上記方法は、脂肪組織の増殖を予防し、脂肪細胞分化を障害する。
いくつかの実施形態では、本開示は肥満症に関する。肥満は、現代社会において高度に蔓延した慢性疾患であり、社会的不名誉を伴うだけでなく、寿命の短縮や、さらには真性糖尿病、インスリン抵抗性、高血圧症、高コレステロール血症、胆石症、変形性関節症、整形外科的外傷、血栓塞栓性疾患、がん、及び冠動脈心疾患をはじめとした多くの医学的問題とも関連付けられている。Rissanen et al., British Medical Journal, 301: 835−837 (1990)。いくつかの実施形態では、肥満は、肥満度指数(BMI:体重/身長(m)2)を用いて算出され得る。いくつかの実施形態では、肥満症は、他の点では健常な対象が30kg/m2以上のBMIを有していること、又は、少なくとも1つの合併性を有する対象が27kg/m2以上のBMIを有している状態と定義される。本開示の方法のいくつかの実施形態では、対象は、肥満であり、約30超の肥満度指数を有する。いくつかの実施形態では、対象は過体重であり、肥満度指数は約25〜29.9である。いくつかの実施形態では、上記方法は体重減少を誘発する。いくつかの実施形態では、上記方法は体重増加を予防する。いくつかの実施形態では、上記方法は、脂肪組織の増殖を予防し、脂肪細胞分化を障害する。
いくつかの実施形態では、本開示は、肥満症及び過体重、並びに関連疾患の治療における、又はそれらに対する医薬の製造における、miR−22阻害剤(及びmiR−22に関連した化合物)を投与することを含む治療方法、及び/又はmiR−22(及びmiR−22に関連した化合物)の使用を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、有効量のmiR−22(及びmiR−22の阻害に関連した化合物)の投与を必要とする患者に、有効量のmiR−22(及びmiR−22の阻害に関連した化合物)を投与することを含む、肥満症を治療又は予防する方法を提供する。いくつかの態様において、本開示は、体重減少の誘発及び/又は体重増加の予防を必要とする患者において、体重減少を誘発するため、及び/又は体重増加を予防するために、有効量のmiR−22阻害剤(及びmiR−22の阻害に関連した化合物)を投与することを含む、体重管理法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、消化器系の外科手術を受けたことがある又は受けることとなる患者;約80〜100ポンドを超えて過体重である患者;約35超のBMIを有する患者;又は肥満症に関連した健康問題を有する患者に、有効量のmiR−22阻害剤(及びmiR−22に関連した化合物)を投与することを含む、体重減少を誘発又は体重増加を予防する方法(又は、カロリー摂取量を実質的に変化させない患者において、肥満症を治療若しくは予防、若しくは体重減少を誘発若しくは体重増加を予防する方法)に関する。
いくつかの実施形態では、前記消化器系の外科手術は、ICD−9−CMに基づいて消化器系への手術に分類されるもののうちの1又は複数であり、すなわち例えば、食道への手術;胃の切開及び切除;胃への他の手術;腸の切開、切除、及び吻合;腸への他の手術;虫垂への手術;直腸、直腸S状部、及び直腸周囲組織への手術;肛門への手術;肝臓への手術;胆嚢及び胆道への手術;膵臓への手術;ヘルニアの修復;並びに腹部への他の手術が挙げられる。
いくつかの実施形態では、消化器系の外科手術は、食事量制限手術(restrictive surgery)及び/又は吸収阻害手術(malabsorptive procedure)のうちの1又は複数であり、例えば、垂直遮断胃形成術(VBG、例えば、胃のステープリング);胃バンディング術(例えば、LAP−BAND又はREALIZE);スリーブ状胃切除術;胃バイパス術(例えば、ルーワイ胃バイパス術)、胆膵路転換手術及び美容外科(例えば、吸引アシスト脂肪吸引(SAL);超音波アシスト脂肪吸引(UAL);パワーアシスト吸引(PAL);ツインカニューレ(アシスト)脂肪吸引(TCAL又はTCL);外部超音波アシスト脂肪吸引(XUAL又はEUAL);水アシスト脂肪吸引(WAL);レーザーアシスト脂肪吸引;チューメセント脂肪吸引;及びクライオリポライシス、などの脂肪吸引)が挙げられる。
いくつかの実施形態では、肥満症に関連した健康問題は、心血管疾患(例えば、高コレステロール、高コレステロール血症、低HDL、高HDL、高血圧症、冠動脈疾患、心不全)、睡眠時無呼吸(閉塞性睡眠時無呼吸を含む)、変形性関節症、甲状腺の問題、認知症、痛風、喘息、胃食道逆流性疾患、及び慢性腎不全から選択される。いくつかの実施形態では、肥満症に関連した健康問題は、心疾患、睡眠時無呼吸、又は高コレステロールである。
いくつかの態様において、本開示は、有効量のmiR−22阻害剤(及びmiR−22の阻害に関連する化合物)の投与を必要とする患者に、有効量のmiR−22阻害剤(及びmiR−22の阻害に関連した化合物)を投与することを含む、体重減少を誘発又は体重増加を予防するための使用又は方法であって;上記患者がカロリー摂取量を実質的に変化させない、上記の使用及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、上記のカロリー摂取量は、米農務省の表などの基準に対して高い。いくつかの実施形態では、患者のカロリー摂取量は、2000〜10000カロリー/日、又は、約2000カロリー/日超、若しくは約2200カロリー/日超、若しくは約2400カロリー/日超、若しくは約2600カロリー/日超、若しくは約2800カロリー/日超、若しくは約3000カロリー/日超、若しくは約3200カロリー/日超、若しくは約3400カロリー/日超、若しくは約3600カロリー/日超、若しくは約3800カロリー/日超、若しくは約4000カロリー/日超、若しくは約5000カロリー/日超、若しくは約6000カロリー/日超である。いくつかの実施形態では、患者は高カロリーを摂取しても体重を増加させず、又はむしろ減少させさえする。従って、本開示は、患者のアドヒアランスをしばしば減じる生活様式の変化(例えば、ダイエットの失敗)なしに効果を奏することができる。いくつかの実施形態では、患者のカロリー摂取量は、治療開始時の患者のカロリー摂取量の約20%を超えて、又は約10%を超えて、又は約5%を超えては制限されない。いくつかの実施形態では、患者のカロリー摂取量は高い割合で「エンプティカロリー」であり、すなわち、固形脂肪及び/又は添加された糖類からのカロリーである。いくつかの実施形態では、患者のカロリー摂取量の約15%超、又は約20%超、又は約25%超、又は約30%超、又は約35%超、又は約50%超がエンプティカロリーである。これらの実施形態においても、患者は、体重を増加させず、又はむしろ減少させさえする。
いくつかの実施形態では、本開示の患者は過体重又は肥満である。いくつかの実施形態では、本開示の患者は中心性肥満に罹患している。いくつかの実施形態では、肥満は、単純性肥満(食事性肥満;通常、身体が利用できるよりも多くのカロリーを消費することによるもの)、症候性肥満(通常、根底にある医学的状態によって引き起こされるもの、例えば、クッシング症候群及び多嚢胞性卵巣症候群など)、及び小児肥満のうちの1つである。いくつかの実施形態では、肥満症は、BMI30〜34.99が含まれるクラス1;BMI35〜39.99が含まれるクラス2;BMI40超が含まれるクラス3に分類される。さらに、本開示は、クラス1、クラス2、又は重度肥満、病的肥満、及び超肥満にさらに分類されるクラス3のいずれかの肥満症、を対象とする。いくつかの実施形態では、患者は、例えば一日カロリー摂取量などで評価した場合に、さらなる体重増加のリスクがある。
いくつかの実施形態では、miR−22阻害剤(及びmiR−22に関連した化合物)の体重管理効果/体重減少効果/抗肥満効果は、種々の手法及び指標を用いて評価することができる。いくつかの実施形態では、治療の前、間、及び後に評価が行われる。いくつかの実施形態では、身長を考慮に入れた人の体重の尺度である肥満度指数(BMI)が使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の患者は「過体重」に分類されるBMI、すなわち、25〜29.9のBMIを有し、例えば、約25、又は約25.5、又は約26、又は約26.5、又は約27、又は約27.5、又は約28、又は約28.5、又は約29、又は約29.5などのBMIを有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の患者は、「肥満」に分類されるBMI、すなわち、30超のBMIを有し、例えば、約30、又は約31、又は約32、又は約33、又は約34、又は約35、又は約36、又は約37、又は約38、又は約39、又は約40、又は約50などのBMIを有する。いくつかの実施形態では、ボディ体積指数(BVI)が用いられる。BVIは3Dソフトウェアを用いて人の3Dイメージを作成するため、BVIは、BMI評点は同じであるが体つきが異なり重量分布も異なる人々を区別することが可能である。BVIは、総重量や総脂肪含有量ではなく、人の体重及び脂肪が身体のどこに位置しているかを測定するものであり、中心性肥満として一般に知られている腹部周辺の体重に重点を置いている。いくつかの実施形態では、miR−22(及びmiR−22に関連した化合物)の体重管理効果/体重減少効果/抗肥満効果を評価するために、全身空気置換プレチスモグラフィー(whole−body air displacement plethysmography)(ADP)が用いられる。本発明のいくつかの実施形態では、単純な計量法が用いられる。いくつかの実施形態では、皮下脂肪計すなわち「ピンチ検査法」、生体電気インピーダンス法、水中体重測定、又は二重エネルギーX線吸収測定法(DEXA)が使用され得る。
いくつかの実施形態では、単純な身体円周測定が用いられ得る。いくつかの実施形態では、本開示の患者の腹囲は、約35インチ超、又は約36インチ超、又は約37インチ超、又は約38インチ超、又は約39インチ超、又は約40インチ超、又は約41インチ超、又は約42インチ超、又は約43インチ超、又は約44インチ超、又は約45インチ超、又は約46インチ超、又は約47インチ超、又は約48インチ超、又は約50インチ超、又は約55インチ超、又は約60インチ超である。いくつかの実施形態では、患者は腹囲40インチ超のヒト男性である。いくつかの実施形態では、患者は腹囲35インチ超のヒト女性である。
本開示の方法は、推奨される体脂肪率を上回る体脂肪率を有するヒト、すなわち、少なくとも「過体重」の範囲内、又は少なくとも「肥満」の範囲内にあるヒト、を治療するために用いることができる。体脂肪率は女性と男性では異なるものである。具体的に、女性については、本開示の方法は、少なくとも約25%、25%超、少なくとも約32%、又は32%超の体脂肪率を有するヒト女性を治療するために用いることができる。男性については、本開示の方法は、少なくとも約14%、14%超、少なくとも約18%、18%超、少なくとも約25%、又は25%超の体脂肪率を有するヒト男性を治療するために用いることができる。体脂肪率は、当該技術分野に受け入れられている任意の方法を用いて評価することができ、例えば、近赤外インタラクタンス法、二重エネルギーX線吸収測定法、身体密度測定法、生体電気インピーダンス法などが挙げられる。
本開示の方法は、100ポンドを超えて過体重である、且つ/又は40インチ超の腹囲を有する男性患者を治療するために用いることができる。本開示の方法は、80ポンドを超えて過体重である、且つ/又は35インチ超の腹囲を有する女性患者を治療するために用いることができる。
いくつかの実施形態では、本開示は、miR−22阻害剤(及びmiR−22の阻害に関連した化合物)の、過体重であることに関連した特定の障害を治療及び/又は予防するための使用を提供する。例えば、miR−22(及びmiR−22に関連した化合物)は、心血管疾患(例えば、高コレステロール、高コレステロール血症、低HDL、高HDL、高血圧症、冠動脈疾患、心不全)、睡眠時無呼吸(閉塞性睡眠時無呼吸を含む)、変形性関節症、甲状腺の問題、認知症、痛風、喘息、胃食道逆流性疾患、及び慢性腎不全に用いられる。
いくつかの実施形態では、miR−22阻害剤(及びmiR−22に関連した化合物)の投与及び/又は使用により、脂肪組織の増殖が阻止又は低減される。いくつかの実施形態では、miR−22(及びmiR−22に関連した化合物)は、内臓脂肪組織(VAT)、腹部皮下脂肪組織(ASAT)、又は異所性脂肪などの、白色脂肪組織(WAT)及び褐色脂肪組織(BAT)のうちの1又は複数に作用する。このような作用は、例えば、本明細書に記載される任意の手法(例えば、BMI、身長対体重指数、皮下脂肪測定、電気的生体インピーダンス分析など)、並びにコンピュータ断層撮影法(CT)、磁気共鳴画像法(MRI;水平ボディスキャンなど)、二重エネルギーX線吸収測定法(DXA)などの種々の画像処理技術を用いて、評価することができる。
miR−22(及びmiR−22に関連した化合物)は、食事療法、行動療法、理学療法、運動、及び減量手術、又は2つ以上のこのような治療法の組み合せと組み合わせて用いることもできる。いくつかの実施形態では、対象はカロリー制限食下にある。いくつかの実施形態では、対象は、身体運動又は理学療法レジメンに参加している、又は参加予定である。いくつかの実施形態では、対象は、減量手術を受けた経験又は受ける予定がある。いくつかの実施形態では、miR−22阻害剤(及びmiR−22の阻害に関連した化合物)は、追加の薬剤と組み合わされてもよく、各種薬剤を用いて治療を受けている患者に投与されてもよい。
上記の追加の薬剤としては、例えば、肥満症及び/又は体重減少/減量に係る実施形態を含むがこれらに限定されず、オルリスタット(例えば、アライ(ALLI)、ゼニカル(XENICAL))、ロルカセリン(例えば、ベルヴィーク(BELVIQ))、フェンテルミン/トピラマート(例えば、キューシミア(QSYMIA))、シブトラミン(例えば、リダクティル(REDUCTIL)又はメリディア(MERIDIA))、リモナバン(アコンプリア(ACOMPLIA))、エクセナチド(例えば、バイエッタ(BYETTA))、プラムリンチド(例えば、シムリン(SYMLIN))、フェンテルミン、ベンズフェタミン、ジエチルプロピオン、フェンジメトラジン、ブプロピオン、及びメトホルミンのうちの1又は複数を挙げることができる。
上記の追加の薬剤としては、身体が食物中の特定の栄養分を吸収する能力に干渉する薬剤も挙げられ、例えば、オルリスタット(例えば、アライ(ALLI)、ゼニカル(XENICAL))、グルコマンナン、及びグアーガムなどが挙げられる。上記の追加の薬剤としては、食欲を抑制する薬剤も挙げられ、例えば、カテコールアミン類及びそれらの誘導体(フェンテルミン及び他のアンフェタミン系薬剤など)、種々の抗うつ薬及び気分安定剤(例えば、ブプロピオン及びトピラマート)、食欲低下薬(例えば、デキセドリン、ジゴキシン)などが挙げられる。上記の追加の薬剤としては、身体の代謝を増進する薬剤も挙げられる。
いくつかの実施形態では、追加の薬剤は、食欲抑制薬、神経伝達物質再取り込み阻害剤、ドパミン作動薬、セロトニン作動薬、GABA作動性シグナル伝達の調節薬、抗痙攣薬、抗うつ薬、モノアミンオキシダーゼ阻害剤、サブスタンスP(NKl)受容体拮抗薬、メラノコルチン受容体の作動薬及び拮抗薬、リパーゼ阻害薬、脂肪吸収の阻害薬、エネルギー摂取又は代謝の調節薬、カンナビノイド受容体調節薬、嗜癖治療薬、メタボリックシンドローム治療薬、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体(PPAR)調節薬;ジペプチジルペプチダーゼ4(DPP−4)拮抗薬、心血管疾患治療薬、高レベルトリグリセリド治療薬、低HDL治療薬、高コレステロール血症治療薬、並びに高血圧症治療薬の中から選択されてもよい。いくつかの心血管疾患薬として、スタチン系薬剤(例えば、ロバスタチン、アトルバスタチン、フルバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチン及びプラバスタチン)、及びω−3系薬剤(例えば、ロバザ(LOVAZA)、エパノバ(EPANOVA)、バスセパ(VASCEPA)、エステル化ω−3、通常、魚油、クリルオイル、藻類油)が挙げられる。いくつかの実施形態では、追加の薬剤は、アンフェタミン類、ベンゾジアゼピン類、スルホニル尿素類、メグリチニド類、チアゾリジンジオン類、ビグアナイド類、β遮断薬、ACE阻害剤、利尿薬、硝酸塩薬、カルシウムチャネル遮断薬、フェンテルミン、シブトラミン、ロルカセリン、セチリスタット、リモナバン、タラナバント、トピラマート、ガバペンチン、バルプロ酸塩、ビガバトリン、ブプロピオン、チアガビン、セルトラリン、フルオキセチン、トラゾドン、ゾニサミド、メチルフェニデート、バレニクリン、ナルトレキソン、ジエチルプロピオン、フェンジメトラジン、レパグリニド、ナテグリニド、グリメピリド、メトホルミン、ピオグリタゾン、ロシグリタゾン、及びシタグリプチンの中から選択されてもよい。
プラダー・ウィリー症候群
いくつかの実施形態では、上記方法はプラダー・ウィリー症候群に関する。プラダー・ウィリー症候群は多くの身体部位に影響を与える複雑な遺伝学的状態である。乳児期において、この状態は、筋緊張の弱さ(筋緊張低下)、哺乳困難、成長不良、及び発達遅延を特徴とする。小児期初期では、罹患した個体は満足のできない食欲を発症し始め、これが慢性的な過食(過食症)及び肥満症につながる。いくつかの実施形態では、対象はプラダー・ウィリー症候群に罹患した対象である。いくつかの実施形態では、プラダー・ウィリー症候群、特に肥満症を伴う対象は、2型糖尿病も発症している対象である。
いくつかの実施形態では、上記方法はプラダー・ウィリー症候群に関する。プラダー・ウィリー症候群は多くの身体部位に影響を与える複雑な遺伝学的状態である。乳児期において、この状態は、筋緊張の弱さ(筋緊張低下)、哺乳困難、成長不良、及び発達遅延を特徴とする。小児期初期では、罹患した個体は満足のできない食欲を発症し始め、これが慢性的な過食(過食症)及び肥満症につながる。いくつかの実施形態では、対象はプラダー・ウィリー症候群に罹患した対象である。いくつかの実施形態では、プラダー・ウィリー症候群、特に肥満症を伴う対象は、2型糖尿病も発症している対象である。
脂肪性肝疾患
いくつかの実施形態では、本開示の方法は脂肪性肝疾患に関する。人口のかなりの割合が脂肪性肝疾患、別名非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)に罹患している。NASHは肥満症及び糖尿病としばしば関連している。トリグリセリド小滴が肝細胞と共に存在する脂肪肝(hepatic steatosis)は、肝臓を慢性炎症(生検標本で炎症性白血球浸潤として検出)に罹り易くし、線維症と肝硬変に繋がるおそれがある。脂肪性肝疾患は、通常、肝細胞傷害の指標となる、アミノ基転移酵素のALTやASTなどの肝臓特異的酵素の血清中濃度の上昇が確認されること、並びに、疲労及び肝臓領域の疼痛を含む症状が現れること、によって発見され、確定的な診断には生検がしばしば必要とされる。肝臓の炎症及び脂肪含有量を低減することで、NASHの線維症及び肝硬変への進行を減衰、停止、又は回復することが、恩恵として期待されるものである。いくつかの実施形態では、上記方法は脂肪肝を低減又は予防する。いくつかの実施形態では、上記方法は肝線維症を低減又は予防する。
いくつかの実施形態では、本開示の方法は脂肪性肝疾患に関する。人口のかなりの割合が脂肪性肝疾患、別名非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)に罹患している。NASHは肥満症及び糖尿病としばしば関連している。トリグリセリド小滴が肝細胞と共に存在する脂肪肝(hepatic steatosis)は、肝臓を慢性炎症(生検標本で炎症性白血球浸潤として検出)に罹り易くし、線維症と肝硬変に繋がるおそれがある。脂肪性肝疾患は、通常、肝細胞傷害の指標となる、アミノ基転移酵素のALTやASTなどの肝臓特異的酵素の血清中濃度の上昇が確認されること、並びに、疲労及び肝臓領域の疼痛を含む症状が現れること、によって発見され、確定的な診断には生検がしばしば必要とされる。肝臓の炎症及び脂肪含有量を低減することで、NASHの線維症及び肝硬変への進行を減衰、停止、又は回復することが、恩恵として期待されるものである。いくつかの実施形態では、上記方法は脂肪肝を低減又は予防する。いくつかの実施形態では、上記方法は肝線維症を低減又は予防する。
いくつかの実施形態では、上記方法は、本明細書に記載のmiR−22阻害剤を投与することによりNASHを治療する方法である。NASH患者はハイリスクNASH患者であり得る。「ハイリスクNASH患者」とは、以下のうちの1又は複数を特徴とするものを指す:NAS≧4;ベースライン時の線維症がステージ2又は3;又はベースライン時の線維症がステージ1であり、合併性(2型糖尿病、BMI≧30kg/m2又はALT≧60U/L)を有する。
いくつかの実施形態では、miR−22阻害剤は、脂肪変性(steatosis)、混合性の細葉炎症、及び肝細胞の風船様化、並びに/又は細胞周囲線維化のうちの1又は複数を低減する。
いくつかの実施形態では、miR−22阻害剤は脂肪変性の1又は複数を低減する。
いくつかの実施形態では、miR−22阻害剤は、その全体が参照によって援用されるBrunt, et al. Am. J. Gastroenterology, Vol. 94, No. 9 (1999)に記載されているような、軽度のグレード1 NASH、又は中等度のグレード2 NASH、又は重度のグレード3 NASHを治療する。
いくつかの実施形態では、miR−22阻害剤は下記の任意のステージのNASHを治療する:ステージ0、線維化無し;ステージ1、ゾーン3における細胞周囲/類洞周囲の線維化、局所的又は広範囲;ステージ2、ステージ1の状態に加え、門脈の線維化、局所的又は広範囲;ステージ3、架橋線維化(bridging fibrosis)、局所的又は広範囲;ステージ4、肝硬変(±残りの細胞周囲線維化)。
いくつかの実施形態では、miR−22阻害剤は、その全体が参照によって援用されるKleiner, et al., Hepatology, 2005. 41(6): p. 1313−21に記載されているような、任意の活性スコア(NAS)のNASHを治療する。
いくつかの実施形態では、miR−22阻害剤は、NASHを、8未満、又は7未満、又は6未満、又は5未満、又は4未満、又は3未満、又は2未満、又は1未満に低減する。いくつかの実施形態では、APをベースとするもの(AP−based)が、NASを約7、又は約6、又は5未満、4未満、又は約3、又は約2、又は約1に低減する。
いくつかの実施形態では、miR−22阻害剤は、脂肪変性を約5%、又は約10%、又は約15%、又は約20%、又は約25%、又は約30%、又は約35%、又は約40%、又は約45%、又は約50%、又は約55%、又は約60%、又は約65%、又は約70%、又は約75%、又は約80%、又は約85%、又は約90%、又は約95%低減する。
いくつかの実施形態では、miR−22阻害剤は、小葉炎症を4病巣未満、又は3病巣未満、又は2病巣未満、又は1病巣未満に減少させる。
いくつかの実施形態では、miR−22阻害剤は、風船様化を上記のスコアで0又は1のスコアに低減させる。
いくつかの実施形態では、miR−22阻害剤は、肥満症、糖尿病(例えば、2型)、高トリグリセリド血症、急速な体重減少、及び栄養失調などの種々の後天性代謝疾患に罹患した対象などの、NASHのリスクがある対象を治療する。いくつかの実施形態では、miR−22阻害剤は、ウィルソン病、チロシン血症、及び無βリポタンパク質血症などの種々の遺伝的代謝疾患に罹患した対象などの、NASHのリスクがある対象を治療する。いくつかの実施形態では、miR−22阻害剤は、脂肪異栄養症及び空腸回腸バイパスなどの種々の他の要因を患っている対象などの、NASHのリスクがある対象を治療する。いくつかの実施形態では、miR−22阻害剤は、アミオダロン、化学療法剤(例えば、イリノテカン)、タモキシフェン、ステロイド類、エストロゲン類、ジエチルスチルベストロール、メトトレキサート、カルシウムチャネル遮断薬(例えば、ニフェジピン、ベラパミル、及びジルチアゼム)のうちの1又は複数による治療を受けている対象などの、NASHのリスクがある対象を治療する。
いくつかの実施形態では、本開示は、線維症を低減又は予防する方法を提供する。線維症の直接的なマーカーには、例えば、プロコラーゲン(I型、III型、IV型)、マトリックスメタロプロテアーゼ、サイトカイン、及びケモカインが挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明は、活性化した星細胞などによる細胞外マトリックス合成を低減する、又はその増強を予防する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、TIMP−1のレベルを調節する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、血清中ヒアルロン酸濃度を減少又は予防する方法を提供する。
いくつかの実施形態では、miR−22阻害剤の効果は、ヒアルロン酸、組織メタロプロテアーゼ阻害物質1(TIMP−1)、及びα−2−マクログロブリンを組み合わせた1又は複数をモニターする検査(例えば、FIBROSpect II)を用いてモニターされる。
いくつかの実施形態では、本発明は、肝硬変を低減又は予防する方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、血小板数、プロトロンビン時間、アルブミン、総ビリルビン、及び血清アミノトランスフェラーゼのうちの1又は複数を調節する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、ヒアルロン酸(HA)及びα−2−マクログロブリンなどの血清中線維症マーカーを調節する方法を提供する。
高コレステロール血症
いくつかの実施形態では、本開示の方法は高コレステロール血症に関する。高コレステロール血症は血清コレステロール上昇を特徴とする状態である。血清コレステロール値の上昇は人口のかなりの割合に見られ、アテローム性動脈硬化及び心筋梗塞の重要なリスク因子である。本発明の薬剤に加えて、HMG−CoA還元酵素阻害剤(スタチン系薬剤)などのコレステロール降下剤を、所望により同じ医薬品に組み入れて、高コレステロール血症患者に投与することができる。いくつかの実施形態では、低コレステロール血症は、単一遺伝子変異の結果ではない血清コレステロール上昇を特徴とする状態である、オン家族性高コレステロール血症(on−familial hypercholesterolemia)である。いくつかの実施形態では、高コレステロール血症は、種々の遺伝因子の影響を原因とするコレステロール上昇を特徴とする状態である、多遺伝子性高コレステロール血症である。ある実施形態では、多遺伝子性高コレステロール血症は、脂質の食事摂取によって悪化し得る。いくつかの実施形態では、高コレステロール血症は、LDL受容体(LDL−R)遺伝子の変異、LDL−Cの顕著な増加、及びアテローム性動脈硬化の早発を特徴とする常染色体優性代謝障害である、家族性高コレステロール血症(FH)である。個人が下記の基準のうちの1又は複数を満たしている場合に、家族性高コレステロール血症の診断がなされる:遺伝子検査により2つの変異型LDL受容体遺伝子が確認される;遺伝子検査により1つの変異型LDL受容体遺伝子が確認される;未治療の500mg/dL超の血清LDL−コレステロールの病歴の報告;10歳より前に腱黄色腫及び/若しくは皮膚黄色腫が見られる;又は、家族性高コレステロール血症ヘテロ接合体と一致して、両方の親で、脂質低下治療前に血清LDL−コレステロールの上昇が報告されている。いくつかの実施形態では、高コレステロール血症は、母系及び父系の両方のLDL−R遺伝子の変異を特徴とする状態である、家族性高コレステロール血症ホモ接合体、すなわちHoFHである。いくつかの実施形態では、高コレステロール血症は、母系又は父系のいずれかのLDL−R遺伝子変異を特徴とする状態である、家族性高コレステロール血症ヘテロ接合体、すなわちHeFHである。
いくつかの実施形態では、本開示の方法は高コレステロール血症に関する。高コレステロール血症は血清コレステロール上昇を特徴とする状態である。血清コレステロール値の上昇は人口のかなりの割合に見られ、アテローム性動脈硬化及び心筋梗塞の重要なリスク因子である。本発明の薬剤に加えて、HMG−CoA還元酵素阻害剤(スタチン系薬剤)などのコレステロール降下剤を、所望により同じ医薬品に組み入れて、高コレステロール血症患者に投与することができる。いくつかの実施形態では、低コレステロール血症は、単一遺伝子変異の結果ではない血清コレステロール上昇を特徴とする状態である、オン家族性高コレステロール血症(on−familial hypercholesterolemia)である。いくつかの実施形態では、高コレステロール血症は、種々の遺伝因子の影響を原因とするコレステロール上昇を特徴とする状態である、多遺伝子性高コレステロール血症である。ある実施形態では、多遺伝子性高コレステロール血症は、脂質の食事摂取によって悪化し得る。いくつかの実施形態では、高コレステロール血症は、LDL受容体(LDL−R)遺伝子の変異、LDL−Cの顕著な増加、及びアテローム性動脈硬化の早発を特徴とする常染色体優性代謝障害である、家族性高コレステロール血症(FH)である。個人が下記の基準のうちの1又は複数を満たしている場合に、家族性高コレステロール血症の診断がなされる:遺伝子検査により2つの変異型LDL受容体遺伝子が確認される;遺伝子検査により1つの変異型LDL受容体遺伝子が確認される;未治療の500mg/dL超の血清LDL−コレステロールの病歴の報告;10歳より前に腱黄色腫及び/若しくは皮膚黄色腫が見られる;又は、家族性高コレステロール血症ヘテロ接合体と一致して、両方の親で、脂質低下治療前に血清LDL−コレステロールの上昇が報告されている。いくつかの実施形態では、高コレステロール血症は、母系及び父系の両方のLDL−R遺伝子の変異を特徴とする状態である、家族性高コレステロール血症ホモ接合体、すなわちHoFHである。いくつかの実施形態では、高コレステロール血症は、母系又は父系のいずれかのLDL−R遺伝子変異を特徴とする状態である、家族性高コレステロール血症ヘテロ接合体、すなわちHeFHである。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトFTO遺伝子は、核酸配列(Genbank登録番号:NM_001080432.2;配列番号13)からなるか、又はそれを含む。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトFTO遺伝子は、アミノ酸配列(Genbank登録番号:NP_001073901.1;配列番号14)からなるか、又はそれを含む。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトCEBPα遺伝子は、核酸配列(Genbank登録番号:NM_004364.4、転写バリアント1;配列番号15)からなるか、又はそれを含む。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトCEBPα遺伝子は、アミノ酸配列(Genbank登録番号:NP_004355.2、転写バリアント1;配列番号16)からなるか、又はそれを含む。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトCEBPα遺伝子は、核酸配列(Genbank登録番号:NM_001285829.1、転写バリアント2;配列番号17)からなるか、又はそれを含む。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトCEBPα遺伝子は、アミノ酸配列(Genbank登録番号:NM_001285829.1、転写バリアント2;配列番号18)からなるか、又はそれを含む。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトCEBPα遺伝子は、核酸配列(Genbank登録番号:NM_001287424.1、転写バリアント3;配列番号19)からなるか、又はそれを含む。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトCEBPα遺伝子は、アミノ酸配列(Genbank登録番号:NP_001274353.1、転写バリアント3;配列番号20)からなるか、又はそれを含む。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトCEBPα遺伝子は、核酸配列(Genbank登録番号:NM_001287435.1、転写バリアント4;配列番号21)からなるか、又はそれを含む。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトCEBPα遺伝子は、アミノ酸配列(Genbank登録番号:NP_001274364.1、転写バリアント4;配列番号22)からなるか、又はそれを含む。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトPPARγ遺伝子は、核酸配列(Genbank登録番号:NM_138712.3、転写バリアント1;配列番号23)からなるか、又はそれを含む。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトPPARγ遺伝子は、アミノ酸配列(Genbank登録番号:NP_619726.2、転写バリアント1;配列番号24)からなるか、又はそれを含む。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトPPARγ遺伝子は、核酸配列(Genbank登録番号:NM_015869.4、転写バリアント2;配列番号25)からなるか、又はそれを含む。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトPPARγ遺伝子は、アミノ酸配列(Genbank登録番号:NP_056953.2、転写バリアント2;配列番号26)からなるか、又はそれを含む。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトPPARγ遺伝子は、核酸配列(Genbank登録番号:NM_138711.3、転写バリアント3;配列番号27)からなるか、又はそれを含む。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトPPARγ遺伝子は、アミノ酸配列(Genbank登録番号:NP_619725.2、転写バリアント3;配列番号28)からなるか、又はそれを含む。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトPPARγ遺伝子は、核酸配列(Genbank登録番号:NM_005037.5、転写バリアント4;配列番号29)からなるか、又はそれを含む。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトPPARγ遺伝子は、アミノ酸配列(Genbank登録番号:NP_005028.4、転写バリアント4;配列番号30)からなるか、又はそれを含む。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトPTEN遺伝子は、核酸配列(Genbank登録番号:NM_000314.6、転写バリアント1;配列番号31)からなるか、又はそれを含む。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトPTEN遺伝子は、アミノ酸配列(Genbank登録番号:NP_000305.3、転写バリアント1;配列番号32)からなるか、又はそれを含む。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトPTEN遺伝子は、核酸配列(Genbank登録番号:NM_001304717.2、転写バリアント1;配列番号33)からなるか、又はそれを含む。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトPTEN遺伝子は、アミノ酸配列(Genbank登録番号:NP_001291646.2、転写バリアント1;配列番号34)からなるか、又はそれを含む。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトPTEN遺伝子は、核酸配列(Genbank登録番号:NM_001304718.1、転写バリアント2;配列番号35)からなるか、又はそれを含む。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトPTEN遺伝子は、アミノ酸配列(Genbank登録番号:NP_001291647.1、転写バリアント2;配列番号36)からなるか、又はそれを含む。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトTET2遺伝子は、核酸配列(Genbank登録番号:NM_001127208.2、転写バリアント1;配列番号37)からなるか、又はそれを含む。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトTET2遺伝子は、アミノ酸配列(Genbank登録番号:NP_001120680.1、転写バリアント1;配列番号38)からなるか、又はそれを含む。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトTET2遺伝子は、核酸配列(Genbank登録番号:NM_017628.4、転写バリアント2;配列番号39)からなるか、又はそれを含む。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトTET2遺伝子は、アミノ酸配列(Genbank登録番号:NP_060098.3、転写バリアント2;配列番号40)からなるか、又はそれを含む。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトBMP−7遺伝子は、核酸配列(Genbank登録番号:NM_001719.2、転写バリアント1;配列番号41)からなるか、又はそれを含む。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトBMP−7遺伝子は、アミノ酸配列(Genbank登録番号:NP_001710.1、転写バリアント1;配列番号42)からなるか、又はそれを含む。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトSIRT−1遺伝子は、核酸配列(Genbank登録番号:NM_012238.4、転写バリアント1;配列番号43)からなるか、又はそれを含む。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトSIRT−1遺伝子は、アミノ酸配列(Genbank登録番号:NP_036370.2、転写バリアント1;配列番号44)からなるか、又はそれを含む。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトSIRT−1遺伝子は、核酸配列(Genbank登録番号:NM_001142498.1、転写バリアント2;配列番号45)からなるか、又はそれを含む。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトSIRT−1遺伝子は、アミノ酸配列(Genbank登録番号:NP_001135970.1、転写バリアント2;配列番号46)からなるか、又はそれを含む。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトSIRT−1遺伝子は、核酸配列(Genbank登録番号:NM_001314049.1、転写バリアント3;配列番号47)からなるか、又はそれを含む。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトSIRT−1遺伝子は、アミノ酸配列(Genbank登録番号:NP_001300978.1、転写バリアント3;配列番号48)からなるか、又はそれを含む。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトPGC1−α遺伝子は、核酸配列(Genbank登録番号 NM_001330751、転写バリアント1;配列番号49)からなるか、又はそれを含む。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトPGC1α遺伝子は、アミノ酸配列(Genbank登録番号 NP_001317680:転写バリアント2;配列番号50)からなるか、又はそれを含む。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトPGC1−α遺伝子は、核酸配列(Genbank登録番号 NM_013261、転写バリアント2;配列番号51)からなるか、又はそれを含む。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトPGC1α遺伝子は、アミノ酸配列(Genbank登録番号 NP_037393:転写バリアント2;配列番号52)からなるか、又はそれを含む。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトPGC1−α遺伝子は、核酸配列(Genbank登録番号 NM_001330752.1、転写バリアント3;配列番号53)からなるか、又はそれを含む。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトPGC1α遺伝子は、アミノ酸配列(Genbank登録番号 NP_001317681.1、転写バリアント3;配列番号54)からなるか、又はそれを含む。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトPGC1−α遺伝子は、核酸配列(Genbank登録番号 NM_001330753.1、転写バリアント4;配列番号55)からなるか、又はそれを含む。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトPGC1α遺伝子は、アミノ酸配列(Genbank登録番号 NP_001317682、転写バリアント4;配列番号56)からなるか、又はそれを含む。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトSP−1遺伝子は、核酸配列(Genbank登録番号 NM_138473.2;配列番号57)からなるか、又はそれを含む。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトSP−1遺伝子は、アミノ酸配列(Genbank登録番号 NP_612482;配列番号58)からなるか、又はそれを含む。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトFGF−21遺伝子は、核酸配列(Genbank登録番号 NM_019113.3;配列番号59)からなるか、又はそれを含む。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトFGF−21遺伝子は、アミノ酸配列(Genbank登録番号 NP_061986.1;配列番号60)からなるか、又はそれを含む。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトUCP1遺伝子は、核酸配列(Genbank登録番号 NM_021833.4;配列番号61)からなるか、又はそれを含む。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトUCP1遺伝子は、アミノ酸配列(Genbank登録番号 NP_068605.1;配列番号62)からなるか、又はそれを含む。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトDDIT−4遺伝子は、核酸配列(Genbank登録番号 NM_019058.3;配列番号63)からなるか、又はそれを含む。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトDDIT−4遺伝子は、アミノ酸配列(Genbank登録番号 NP_061931.1;配列番号64)からなるか、又はそれを含む。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトMETTL3遺伝子は、核酸配列(Genbank登録番号 NM_019852.4;配列番号65)からなるか、又はそれを含む。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトMETTL3遺伝子は、アミノ酸配列(Genbank登録番号 NP_062826.2;配列番号66)からなるか、又はそれを含む。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトFGF1遺伝子は、核酸配列(Genbank登録番号 NM_000800.4;配列番号67)からなるか、又はそれを含む。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトFGF1遺伝子は、アミノ酸配列(Genbank登録番号 NP_000791.1;配列番号68)からなるか、又はそれを含む。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトTP63遺伝子は、核酸配列(Genbank登録番号 NM_001114978.1;配列番号69)からなるか、又はそれを含む。
本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の野生型ヒトTP63遺伝子は、アミノ酸配列(Genbank登録番号 NP_001108450.1;配列番号70)からなるか、又はそれを含む。
本明細書で使用される場合、対象又は患者という用語は、任意の脊椎動物を指し、例えば、ヒト及び他の霊長類(例えば、チンパンジー、並びに他の類人猿及びサル種)、農用動物(例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、及びウマ)、家畜哺乳類(例えば、イヌ及びネコ)、実験動物(例えば、マウス、ラット、及びモルモットなどのげっ歯類)、及び鳥類(例えば、家禽、野生鳥、及び狩猟鳥、例えば、ニワトリ、シチメンチョウ及び他のキジ類の鳥類、アヒル、ガチョウなど)が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、対象は哺乳動物である。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。
本発明の別の実施形態は、miR−22などのmiRNAの阻害剤と、薬剤的に許容できる担体とを含む、医薬組成物、又は医薬組成物の使用である。臨床応用が企図されている場合、意図された用途に適した形態の医薬組成物が調製され得る。通常、これは、発熱物質(パイロジェン)、及びヒトや動物に有害であり得る他の不純物を実質的に含まない組成物を調製することを伴う。
1つの実施形態では、医薬組成物は、miR−22を対象とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを特に限定されない例とする、有効量のmiRNA阻害剤と、薬剤的に許容できる担体と、を含む。有効量とは、有益又は所望の臨床結果を奏するのに十分な量である。本発明のmiRNA阻害剤の有効量は、約1mg/kg〜約100mg/kg、約2.5mg/kg〜約50mg/kg、又は約5mg/kg〜約25mg/kgであり得る。何を有効量と見なすかの厳密な決定は、患者のサイズ、年齢、代謝障害の種類、及び阻害剤又は作動薬(特に限定されないが、例えば、アンタゴミル、発現コンストラクト、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド二本鎖、などが挙げられる)の性質を含む、各患者の個々の要因に基づいて行われ得る。したがって、当業者は、本開示及び当該技術分野における知識から、用量を適宜確認することができる。例えば、その全体の内容が参照によって援用される医師用卓上参考書、第66版、PDRネットワーク;2012年版(2011年12月27日)を参照して、用量を決定してもよい。
有益又は所望の治療結果としては、阻害剤の投与が行われなかった場合に確認されるものと比較した場合の、特に、肥満度指数の減少、体重減少、又は代謝障害の存在と関連したマーカーの減少、が挙げられる。また、有益又は所望の治療結果としては、阻害剤の投与が行われなかった場合に確認されるものと比較した場合の、特に、代謝障害の低減と関連したマーカー又は遺伝子の存在の増加又は減少も挙げられる。いくつかの実施形態では、上記のマーカー又は遺伝子は、脂肪量・肥満関連タンパク質(FTO)、CEBPα、及び/又はPPARγ、ALKBH5、及びACLYである。いくつかの実施形態では、FTO、CEBPα、PPARα、ACLY、SP−1、PGC1α、ALKBH5、SIRT−1、TP63、FGF1、及び/又はDDIT4の活性及び/又は発現に変動が生じる。いくつかの実施形態では、上記のマーカー又は遺伝子は、脂肪量・肥満関連タンパク質(FTO)である。
発癌性miRNA機能のオリゴヌクレオチド阻害剤用、脂肪関連代謝及び合成経路標的のmiRNA作動薬をコードするポリヌクレオチド用、又は特定のmiRNA阻害物質若しくは作動薬を発現するコンストラクト用の送達媒体(送達ビヒクル)として、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、並びに、水中油型乳剤、ミセル、混合ミセル、及びリポソームなどの脂質をベースとした系、などのコロイド分散系を用いることができる。本開示の核酸を脂肪組織(例えば、脂肪細胞)に送達するのに好適な市販の脂肪乳剤として、イントラリピッド(INTRALIPIDO)、リポシン(LIPOSYN)(登録商標)、リポシン(登録商標)II、リポシン(登録商標)III、ニュートリピッド(Nutrilipid)、及び他の同様の脂質乳剤が挙げられる。インビボで送達媒体として使用されるコロイド系は、リポソーム(すなわち、人工の膜小胞)である。このような系の調製及び使用は、当該技術分野において周知である。例示的な製剤が、全体が参照によって本明細書に援用される、米国特許第5,981,505号;同第6,217,900号;同第6,383,512号;同第5,783,565号;同第7,202,227号;同第6,379,965号;同第6,127,170号;同第5,837,533号;同第6,747,014号;及び国際公開第03/093449号にも開示されている。
送達媒体に安定性を付与し、標的細胞による取り込みを可能にするために、通常、適切な塩及び緩衝液の使用が望まれることとなる。本発明の水性組成物は、薬剤的に許容できる担体又は水性媒体に溶解又は分散した、阻害剤ポリヌクレオチドを含む送達媒体(例えば、リポソーム又は他の複合体又は発現ベクター)を有効量で含む。薬剤的に許容できる、又は薬理学的に許容できるという表現は、動物又はヒトに投与された場合に、有害反応も、アレルギー反応も、他の不都合な反応も引き起こさない、分子種及び組成物を指す。本明細書で使用される場合、薬剤的に許容できる担体としては、例えば、ヒトへの投与に好適な医薬品などの医薬品の製剤化での使用に許容される、溶媒、緩衝液、溶液、分散媒、コーティング、抗細菌剤、抗真菌剤、等張化剤、吸収遅延剤などが挙げられる。薬剤的に活性な物質へのこのような媒体及び薬剤の使用は当該技術分野において周知である。任意の従来の媒体又は薬剤が本発明の有効成分と相溶性がない場合を除き、治療用組成物中のその使用が企図される。補足的な有効成分を上記組成物に組み入れることもできるが、ただし、それらは組成物のベクターやポリヌクレオチドを不活性化しないものである。
本発明の活性組成物は古典的な医薬製剤を含み得る。本発明のこれらの組成物の投与は、その経路を介して標的組織に到達可能である限り、いかなる一般的経路を介した投与であってもよい。これは、例えば、経口投与、経鼻投与、又は頬側投与が挙げられる。あるいは、投与は、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射、又は静脈内注射によるものであってもよく、あるいは、脂肪組織への直接的な注射によるものであってもよい。本明細書で開示される薬剤は、カテーテルシステムで投与されてもよい。このような組成物は、通常、本明細書に記載されているような薬剤的に許容できる組成物として投与される。
活性化合物は非経口投与又は腹腔内投与されてもよい。例として、遊離塩基又は薬理学的に許容できる塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水において調製され得る。グリセロール、液状ポリエチレングリコール、及びこれらの混合物、並びに油中に分散系を調製することもできる。通常の保存及び使用条件下で、これらの製剤は、微生物の増殖を防ぐために、保存剤を通常含有する。
注射剤用途又はカテーテル送達に好適な剤形としては、例えば、無菌注射液又は無菌分散液を即時調製するための、無菌水溶液、無菌水性分散液、及び無菌粉末が挙げられる。通常、これらの製剤は無菌であり、且つ容易な注射が可能である程度に液状である。製剤は、製造及び保存の条件下で安定であるべきであり、細菌及び真菌などの微生物の混入行為から保護されているべきである。適切な溶媒又は分散媒は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液状ポリエチレングリコールなど)、これらの好適な混合物、及び植物油を含有し得る。例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合において必要な粒径の維持によって、及び、界面活性剤の使用によって、適切な流動性を維持することができる。パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどの種々の抗細菌剤及び抗真菌剤によって、微生物の作用を防止することができる。多くの場合、糖類又は塩化ナトリウムなどの等張剤を含むことが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの吸収遅延剤を組成物に使用することで可能となる。
無菌注射液は、適切な量の活性化合物を、適宜任意の他の成分(例えば上記で列挙した成分)と一緒に溶媒に混合し、その後濾過滅菌することで、調製することができる。通常、分散液は、種々の滅菌後活性成分を、基礎となる分散媒と、例えば上記で列挙されたような所望の他の成分と、を含有する無菌媒体中に混合することによって調製される。無菌注射液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製法として、真空乾燥法及び凍結乾燥法があり、これらにより、予め滅菌濾過した溶液から、任意の追加の所望成分を加えた有効成分の粉末が得られる。
製剤後、液剤は、投与剤形に適合した方法で、且つ、治療効果のある量で、投与され得る。製剤は、注射液、薬剤放出カプセルなどの種々の剤形で容易に投与され得る。例えば、水溶液の状態での非経口投与の場合、通常、溶液は適切に緩衝化され、液体希釈剤は十分な食塩水又はグルコースなどでまず等張化される。静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、及び腹腔内投与などには、このような水溶液が使用され得る。特に本開示を踏まえると、当業者に公知の通りに、無菌の水性媒体を使用することが好ましい。例として、一回量が1mlの等張NaCl液に溶解され、1000mlの皮下注射液に添加されるか、又は予定された注入部位に注射され得る(例えば、その内容が参照によって本明細書に援用される、Remington Pharmaceutical Sciences、第15版、頁1035〜1038及び頁1570〜1580を参照)。治療される対象の状態に応じて、いくらかの用量変動は必然的に生じることとなる。いずれの場合も、投与責任者が個々の対象に適した用量を決定するものとする。さらに、ヒト投与に投与する場合、製剤は、FDA生物製剤基準(FDA Office of Biologics standards)により規定されている、無菌性、発熱原性、一般的安全性、及び純度の基準を満たしていなければならない。
いくつかの実施形態では、本開示は、代謝障害の治療又は予防を必要とする対象の、代謝障害を治療又は予防する方法であって、第一のmiRNAの第一の阻害剤と、第二のmiRNAの第二の阻害剤とを対象に投与することを含み、上記第一のmiRNAはmiR−22であり、上記第二のmiRNAは代謝関連遺伝子の制御因子である、上記方法を包含する。いくつかの実施形態では、第二のmiRNAは公知のmiR阻害剤であり、特に限定されないが、例えば、その内容の全体が参照によって本明細書に援用される国際公開第2012/142313号に開示されているものが挙げられる。いくつかの実施形態では、第一の阻害剤及び第二の阻害剤は、どのような順番(例えば、第一から第二、又は第二から第一)で投与されてもよく、あるいは同時に投与されてもよい。
いくつかの実施形態では、本開示は、代謝障害の治療又は予防を必要とする対象の、代謝障害を治療又は予防する方法であって、miR−22阻害剤であるかそれを含む第一の薬剤と、少なくとも1つの他の、代謝障害に対する生物製剤、治療薬、又は薬剤であるかそれを含む第二の薬剤と、を対象に投与することを含む、上記方法を包含する。いくつかの実施形態では、第一の阻害剤及び第二の阻害剤は、どのような順番(例えば、第一から第二、又は第二から第一)で投与されてもよく、あるいは同時に投与されてもよい。
本発明はまた、miR−22を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの発癌性miRNAの阻害剤などの、本明細書に記載の任意の薬剤の投与を簡素化することができるキットを提供する。例示的な本発明のキットは、本明細書に記載の任意の組成物を単位剤形の形態で含む。1つの実施形態では、単位剤形は、無菌とすることができるプレフィルドシリンジなどの容器に、本明細書に記載の任意の薬剤と薬剤的に許容できる担体、希釈剤、賦形剤、又は媒体とを含有させたものである。キットには、本明細書に記載の任意の薬剤の使用を指導するラベル又は印刷された説明書をさらに含ませることができる。キットには、開瞼器、局所麻酔剤、及び投与部位洗浄剤を含ませてもよい。キットには、発癌性miRNAの第二の阻害剤、又は本明細書に記載の生物製剤、治療薬、化学療法薬、若しくは薬剤などの、1又は複数の追加の薬剤をさらに含ませることができる。1つの実施形態では、キットは、有効量の本発明の組成物と、本明細書に記載されるものなどの、有効量の別の組成物と、を含有する容器を含む。
本明細書で開示される本発明をより効率的に理解できるように、実施例を以下に記載する。これらの実施例が、説明のみを目的としており、いかなる形であれ、本発明を限定するものと解釈されるべきではないことは理解されるべきである。
(実施例1:肥満症におけるmiR−22の役割)
miR−22はPTEN及びTETを直接標的とし、腫瘍形成、転移、及び他の代謝障害を促す。PTENを標的とする60種類を超えるmiRNAと少なくとも30種の新規の癌原遺伝子座がヒト癌で研究されている。PTENを標的とするmiRNAは進化的に脊椎動物間で高度に保存されており、種々の組織で普遍的に発現されている(Lagos−Quintana et al., 2001, 2002; Neely et al., 2006)。PTENの減少はワールブルグ効果と関連した代謝状態を惹起し、PTENの増加は抗ワールブルグ効果と関連した代謝状態を惹起するため、miR−22は、PTENを標的とすることで、代謝において意味のある存在であり続けている。図2A〜図2Dは、miR−22の過剰発現がマウスの体重に影響を与えることを示している。
miR−22はPTEN及びTETを直接標的とし、腫瘍形成、転移、及び他の代謝障害を促す。PTENを標的とする60種類を超えるmiRNAと少なくとも30種の新規の癌原遺伝子座がヒト癌で研究されている。PTENを標的とするmiRNAは進化的に脊椎動物間で高度に保存されており、種々の組織で普遍的に発現されている(Lagos−Quintana et al., 2001, 2002; Neely et al., 2006)。PTENの減少はワールブルグ効果と関連した代謝状態を惹起し、PTENの増加は抗ワールブルグ効果と関連した代謝状態を惹起するため、miR−22は、PTENを標的とすることで、代謝において意味のある存在であり続けている。図2A〜図2Dは、miR−22の過剰発現がマウスの体重に影響を与えることを示している。
miR−22ノックアウト法
マウスの体重及び脂肪蓄積に対する影響がmiR−22の高発現によるものかどうかを評価するために、また、その際のマウスの体重増加の差異及び食物消費の差異を評価するために、2か月齢(開始日)の野生型(Wt)マウス及びmiR−22トランスジェニック(Tg)マウスを、高脂肪(60%)食下に置いた。マウスの体重を週に2回モニターし、食物利用を週に1回モニターした。(図3A〜図3C及び図4A〜図4Fを参照)。トランスジェニックmiR−22(Tg)マウスは非食餌(Non−Diet)(ND)下で肥満表現型を発現したが、一方で、miR−22ノックアウト(KO)マウスは高脂肪食(HFD)下で体重を増加させることができなかった。miR−22欠失細胞であるマウス胎仔線維芽細胞(MEF)は、脂肪細胞に分化する能力の障害を示した。この表現型は、脂肪細胞分化や広く脂肪代謝に関連した種々の遺伝子のパネルにおける、遺伝子発現の差異と相関していた。さらに、結果から、miR−22の体重増加に対する影響がレプチン(又はレプチン様分子)に非依存的であることが示されている(図5A〜図5D及び図6を参照)。
マウスの体重及び脂肪蓄積に対する影響がmiR−22の高発現によるものかどうかを評価するために、また、その際のマウスの体重増加の差異及び食物消費の差異を評価するために、2か月齢(開始日)の野生型(Wt)マウス及びmiR−22トランスジェニック(Tg)マウスを、高脂肪(60%)食下に置いた。マウスの体重を週に2回モニターし、食物利用を週に1回モニターした。(図3A〜図3C及び図4A〜図4Fを参照)。トランスジェニックmiR−22(Tg)マウスは非食餌(Non−Diet)(ND)下で肥満表現型を発現したが、一方で、miR−22ノックアウト(KO)マウスは高脂肪食(HFD)下で体重を増加させることができなかった。miR−22欠失細胞であるマウス胎仔線維芽細胞(MEF)は、脂肪細胞に分化する能力の障害を示した。この表現型は、脂肪細胞分化や広く脂肪代謝に関連した種々の遺伝子のパネルにおける、遺伝子発現の差異と相関していた。さらに、結果から、miR−22の体重増加に対する影響がレプチン(又はレプチン様分子)に非依存的であることが示されている(図5A〜図5D及び図6を参照)。
(実施例2:肥満の治療法としてのmiR−22の阻害)
抗miR−22 LNAは全て、ヒト及びマウスの両方で有用である。宿主遺伝子はヒトとマウスの間で49%の相補性を示し、抗HG−miR−22 LNAはヒトにおいて優位に働く。
抗miR−22 LNAは全て、ヒト及びマウスの両方で有用である。宿主遺伝子はヒトとマウスの間で49%の相補性を示し、抗HG−miR−22 LNAはヒトにおいて優位に働く。
抗miR−22 LNA(Locked Nucleic Acid)の設計
LNAは、シード配列を包含し、8ヌクレオチド長〜20ヌクレオチド長であり、許容される長さ特異的なLNA部分を有し、miR−22に対する結合親和性が可能な限り高くなるように、設計した。
LNAは、シード配列を包含し、8ヌクレオチド長〜20ヌクレオチド長であり、許容される長さ特異的なLNA部分を有し、miR−22に対する結合親和性が可能な限り高くなるように、設計した。
LNAの、導入試薬補助下の取り込み(assisted uptake)(Lipo200トランスフェクション)用のプロトコルの最適化により、この配列をアッセイで確認し、接着細胞株、FAM標識LNAを使用し、その生物学的効果を、接着細胞株の、導入試薬補助下の取り込み(assisted uptake)及び導入試薬非補助下の取り込み(un−assisted uptake)において最も強力な抗miR−22を特定することにより検証した(処理前後のmiR−22レベル、並びにTET2の活性及びタンパク質レベルの分析)。この目的は、インビボ処置での使用において最も強力な抗miRを用いて、マウスモデルで抗miRを使用することであり、確認の結果については図33A〜図33Cを参照されたい。下記の配列において、大文字はLNA修飾を受けており、小文字は未修飾である。miR−22(配列番号1)及び抗miR−22オリゴヌクレオチド(配列番号2〜配列番号10)の向きは、5’→3’の向きである。図8は、miR−22へのハイブリダイゼーション時の配向となるように、抗miR−22オリゴヌクレオチドを3’→5’方向で示している。5’→3’方向の配列番号11及び配列番号12のオリゴヌクレオチドは、スクランブル配列であり、miR−22(配列番号1)にハイブリダイズしない。
インビボにおける抗miR−22療法
予防を目的としたインビボ実験計画において、図9を参照して、高脂肪食(HFD)下にある2か月齢のmiR−22−/−及びWTに、ビヒクル(VCH)、スクランブルコントロールRNA(SCR)、及びLNA(Locked Nucleic Acid)をトランスフェクトし、腹腔内(IP)投与による導入試薬非補助下の取り込み(unassisted uptake)で、初期量20mg/kg(初回)及び週1回の維持用量10mg/kgで処置した。処置マウスと非処置マウスの摂食量に差異は無かった(図10参照)。インビボにおけるmiR−22の薬理学的阻害はマウスが肥満になることを予防し、さらに、インビボにおける抗miR−22療法は肝臓内の主要なmiR−22標的のタンパク質レベルを増加させることができた。抗miR−22処置は肝臓の脂質組成に影響を与えなかったが、脂肪肝を大いに抑制した。
予防を目的としたインビボ実験計画において、図9を参照して、高脂肪食(HFD)下にある2か月齢のmiR−22−/−及びWTに、ビヒクル(VCH)、スクランブルコントロールRNA(SCR)、及びLNA(Locked Nucleic Acid)をトランスフェクトし、腹腔内(IP)投与による導入試薬非補助下の取り込み(unassisted uptake)で、初期量20mg/kg(初回)及び週1回の維持用量10mg/kgで処置した。処置マウスと非処置マウスの摂食量に差異は無かった(図10参照)。インビボにおけるmiR−22の薬理学的阻害はマウスが肥満になることを予防し、さらに、インビボにおける抗miR−22療法は肝臓内の主要なmiR−22標的のタンパク質レベルを増加させることができた。抗miR−22処置は肝臓の脂質組成に影響を与えなかったが、脂肪肝を大いに抑制した。
処置群マウス及び無処置群マウスにおける、脂肪代謝、合成、分化の遺伝子発現の可能性を評価するため、VHL、SCR LNA又は抗miR−22 LNAで処置されたマウスから、肝臓、白色脂肪組織(WAT)及び褐色脂肪組織(BAT)由来のRNAを抽出し、脂肪関連性の代謝及び合成経路に関与しているTET2、PTEN(ポジティブコントロール)、FTO、CEBPα、PPARγ、並びにUCP1及びCD36(褐色脂肪細胞マーカーとして)のmRNA発現を測定した(図12参照)。
治療アプローチでは、miR−22−/−マウス及びWTマウスを高脂肪食(HFD)下に置き、抗miR−22−LNA、SCR、及びVHLで処置し、第二のHFD処置下に置いた。治療の3.5か月後、HFDを給餌された肥満マウス(平均体重40g超)において、有意な体重減少が確認された。マウスを屠殺し、組織を摘出し、肝臓から得たRNAをRNAseqに用いた(図16A〜図16C、図17)。miR−22の薬理学的阻害によって、マウスの肥満表現型が元に戻されることが示された(図18)。図19A〜図19Cは、マウス肝臓からの階層クラスター分析を示すRNAシークエンシングプロットであり、miR−22の薬理学的阻害と遺伝子ノックアウト(KO)とが密集していることを示しており、これは、上記の処置がオンターゲットで行われていることと、LNAコンストラクトを用いることでKO表現型を模倣できることを示している。そして図20は、マウス肝臓における遺伝子オントロジー解析を示すRNAシークエンシングプロットであり、KOマウス及びLNA処置マウスにおけるトップダウンの被調節経路が、脂質の代謝及び生合成に関連したものであることが示されている。インビボにおける抗miR−22療法によってACLが強くダウンレギュレートされ、miR−22の薬理学的阻害がMEFの脂肪細胞分化を障害するのに有効であることが示された。
これらの結果は、抗miR−22療法が、高脂肪食(HFD)給餌時のマウスの体重増加を予防すること、HFDを給餌された肥満マウスの肥満表現型を元に戻すこと、摂食量には影響を与えないこと、並びに、インビボで肝臓及び白色脂肪組織(WAT)を効率的に標的とすること、を示している。さらに、抗miR−22治療は、miR−22標的遺伝子のタンパク質レベルに影響を与え、いかなる特定の脂質クラスにも影響を与えずに、マウスにおける全体的な脂質総量を減少させることができる。
(実施例3:miR−22は肥満症及び脂肪量・肥満関連タンパク質(FTO)を調節する)
miR−22はPTEN及びTETを直接標的とし、腫瘍形成及び転移を促す。PTENは、SIRT−1、BMP−7、PPAR−α、PPAR−γ、SP−1、PGC1α、FGF−21、UCP1、メチルトランスフェラーゼ様タンパク質3、及びDDIT4などを含む他の多くのmiR−22標的遺伝子と同様、代謝と脂肪酸の酸化又は生合成に関与している。脂肪分化誘導の際に、FTOの発現は、miR−22欠損MEFでは大きくダウンレギュレートされたが、WT MEFではダウンレギュレートされなかった(図26)。miR−22のダウンレギュレーション(遺伝子的又は薬理学的)は、RNA m6Aのレベルを増加させた(図27A〜図27B)。老齢時に、miR−22のダウンレギュレーションは、肝機能に影響を与えないことと、いかなる肝臓関連の疾患も機能障害も示さないことが示された(図28A〜図28B、図29)。
miR−22はPTEN及びTETを直接標的とし、腫瘍形成及び転移を促す。PTENは、SIRT−1、BMP−7、PPAR−α、PPAR−γ、SP−1、PGC1α、FGF−21、UCP1、メチルトランスフェラーゼ様タンパク質3、及びDDIT4などを含む他の多くのmiR−22標的遺伝子と同様、代謝と脂肪酸の酸化又は生合成に関与している。脂肪分化誘導の際に、FTOの発現は、miR−22欠損MEFでは大きくダウンレギュレートされたが、WT MEFではダウンレギュレートされなかった(図26)。miR−22のダウンレギュレーション(遺伝子的又は薬理学的)は、RNA m6Aのレベルを増加させた(図27A〜図27B)。老齢時に、miR−22のダウンレギュレーションは、肝機能に影響を与えないことと、いかなる肝臓関連の疾患も機能障害も示さないことが示された(図28A〜図28B、図29)。
miR−22の過剰発現が肝機能、脂肪肝及び肝線維症に影響を与えるかどうかを評価するため、8〜10か月齢のマウスに通常食を給餌した。miR−22過剰発現(OE)は、脂肪肝をもたらし、FSP−1陽性細胞の存在を増加させることが示された。FSP−1により、線維症に関連した、肝臓内のマクロファージ亜集団が同定される。
全体として、miR−22は発癌性miR(onco−miR)(PTEN標的、MEF形質転換、EMT)であり、miR−22はヒト及びマウスで100%保存されており、miR−22の過剰発現(OE)は通常食(ND)下で肥満表現型をもたらし、miR−22 KOマウスはHFD下で体重を増加させず、miR−22の薬理学的サイレンシングはMEF及びヒトMESの脂肪細胞への分化を障害し、抗miR−22 LNA処置は予防の条件下でマウスが肥満化すること予防し、抗miR−22 LNA処理はHFDを給餌された肥満マウスの肥満表現型を元に戻し、miR−22のサイレンシングはいかなる肝臓毒性も示さず、miR−22のサイレンシングは肝臓の脂肪変性及び線維症化を予防し、miR−22は代謝及び脂質の生合成に関連した複数の遺伝子を同時に標的にすることができる。
他の実施形態
本開示をその詳細な説明と関連させて説明してきたが、上記の説明は例示を意図しており、本開示の範囲の限定は意図しておらず、本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によって規定されることを理解されたい。他の態様、利点、及び変更形態も下記の特許請求の範囲に包含される。
本開示をその詳細な説明と関連させて説明してきたが、上記の説明は例示を意図しており、本開示の範囲の限定は意図しておらず、本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によって規定されることを理解されたい。他の態様、利点、及び変更形態も下記の特許請求の範囲に包含される。
参照による援用
本明細書で参照された全ての特許及び公報は、それらの全体が参照によって本明細書に援用される。
本明細書で参照された全ての特許及び公報は、それらの全体が参照によって本明細書に援用される。
本明細書に記載された刊行物は、単に本願の出願日に先立つ開示として提供されている。本明細書における何ものも、先行発明の理由で、本発明が係る刊行物に先行する権利がないことの承認と解釈されるべきではない。
本明細書で使用される場合、全ての見出しは単に構成のみを目的としており、本開示の限定は全く意図していない。
Claims (34)
- 有効量のmiR−22阻害剤の投与を必要とする対象に、有効量のmiR−22阻害剤を投与することを含む、代謝障害を治療又は予防する方法。
- 前記阻害剤の投与後の前記対象においてmiR−22の発現及び/又は活性が低減される、請求項2に記載の方法。
- 前記miR−22阻害剤がオリゴヌクレオチド系阻害剤である、請求項1又は請求項2に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチド系阻害剤が、miR−22の成熟配列に対して少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、又は約100%の相補性を有する配列を含む、請求項3に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチド系阻害剤がデオキシヌクレオチド又はリボヌクレオチドを含む、請求項3又は請求項4に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチド系阻害剤が一本鎖である、請求項3〜請求項5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチド系阻害剤が二本鎖である、請求項3〜請求項5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチド系阻害剤が1又は複数の化学修飾ヌクレオチドを含む、請求項3〜請求項7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記化学修飾ヌクレオチドがLNA(locked nucleotide)である、請求項8に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチド系阻害剤が、約25個以下、約20個以下、約15個以下、約10個以下、約9個以下、約8個以下、約7個以下、約6個以下、又は約5個以下のヌクレオチドを含む、請求項3〜請求項9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチド系阻害剤が1又は複数のN−アセチルガラクトサミン(GalNAc)部分に結合している、請求項3〜請求項10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチド系阻害剤がアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤である、請求項3〜請求項11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチド系阻害剤が低分子干渉RNA(siRNA)である、請求項3〜請求項11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチド系阻害剤がアプタマーである、請求項3〜請求項11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記miR−22阻害剤がペプチド系阻害剤又はタンパク質系阻害剤である、請求項1又は請求項2に記載の方法。
- 前記タンパク質系阻害剤が抗体又はその抗原結合部分である、請求項15に記載の方法。
- 前記miR−22阻害剤が小分子系阻害剤である、請求項1又は請求項2に記載の方法。
- 前記代謝障害が肥満症である、請求項1〜請求項17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象がプラダー・ウィリー症候群に罹患している、請求項18に記載の方法。
- 前記対象が高コレステロール血症に罹患している、請求項18に記載の方法。
- 前記対象が、脂肪量・肥満関連タンパク質(FTO)のバリアントを有している、並びに/又は、FTOの発現及び/若しくは活性のアップレギュレーションを示す、請求項18に記載の方法。
- 前記対象が肥満であり、肥満度指数が約30超である、請求項18〜請求項21のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象が過体重であり、肥満度指数が約25〜29.9である、請求項18〜請求項21のいずれか一項に記載の方法。
- 体重減少を誘発する、請求項18〜請求項23のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象において約1%以上、約5%以上、約10%以上、約15%以上、約20%以上、又は約25%以上の総体重減少を誘発する、請求項24に記載の方法。
- 体重増加を予防する、請求項18〜請求項23のいずれか一項に記載の方法。
- 脂肪組織の増殖を低減又は予防する、請求項18〜請求項26のいずれか一項に記載の方法。
- 脂肪細胞分化を障害する、請求項18〜請求項26のいずれか一項に記載の方法。
- 前記代謝障害が脂肪性肝疾患である、請求項1〜請求項28のいずれか一項に記載の方法。
- 前記脂肪性肝疾患が、非アルコール性脂肪酸肝疾患(non−alcoholic fatty acid liver disease)(NAFLD)及び非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)から選択される、請求項29に記載の方法。
- 脂肪肝を低減又は予防する、請求項29又は請求項30に記載の方法。
- 肝線維症を低減又は予防する、請求項29〜請求項31のいずれか一項に記載の方法。
- 脂肪量・肥満関連タンパク質(FTO)、ALKBホモログ5(ALKBH5)、CCAAT/エンハンサー結合タンパク質α(CEBPα)、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ(PPARγ)、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体α(PPARα)、ATPクエン酸リアーゼ(ACLY)、PPARγコアクチベーターα(PGC1−α)、特異性タンパク質1(SP1)、線維芽細胞増殖因子21(FGF−21)、脱共役タンパク質1(UCP1)、DNA損傷包含転写物4(DNA Damage Included Transcript 4)(DDIT−4、REDD1)、腫瘍タンパク質p63(TP63)、線維芽細胞増殖因子1(FGF1)、及び/又はメチルトランスフェラーゼ様タンパク質3(METTL3)の活性及び/又は発現を低減する、請求項1〜請求項32のいずれか一項に記載の方法。
- ホスファターゼ・テンシン・ホモログ(PTEN)及び/又はtetメチルシトシンジオキシゲナーゼ2(TET2)の活性及び/又は発現を増強する、請求項1〜請求項33のいずれか一項に記載の方法。
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Legal Events
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A524 | Written submission of copy of amendment under article 19 pct |
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