CN111918968B - Micro-RNA 22的抑制剂 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了抑制microRNA例如miR‑22的活性的组合物和方法。

Description

Micro-RNA 22的抑制剂
优先权
本申请要求2018年3月14日提交的美国临时申请号为62/642,934的权益和优先权，其内容通过引用以其全文并入本文。
技术领域
本公开涉及调节microRNA的活性或表达的试剂。
电子提交的文本文件的说明
所附电子提交的文本文件的内容通过引用以其全文并入本文：序列表的计算机可读格式副本(文件名：BID-005PC2_ST25.txt；创建日期：2019年3月14日；文件大小：2,976字节)。
背景技术
microRNA(miRNA或miR)是调节靶基因表达的核酸分子。miRNA通常是短的(通常为18至24个核苷酸)；并且，当miRNA和其靶mRNA的序列完全互补时，miRNA通过促进靶mRNA的降解来充当其阻遏物，和/或当miRNA含有错配时，miRNA通过抑制翻译来充当靶mRNA的阻遏物。miRNA的功能分析已显示，这些小的非编码RNA有助于不同的生理和代谢过程，包括调节与各种疾病或病症有关的基因。如此，需要调节miR的组合物和方法。
发明概述
本公开提供了用于抑制miR-22，例如通过抑制microRNA的表达和/或活性来抑制miR-22的新的组合物和方法。序列特异的化学修饰的寡核苷酸，包括例如锁核酸(LNA)，可以介导这种抑制。
在一个方面，本发明提供了miR-22抑制组合物。所述组合物包含核酸，该核酸具有包含tggcagct(SEQ ID NO:2)和包含至少一个锁核酸(LNA)修饰的序列。
在一些实施方案中，核酸在tggcagct(SEQ ID NO:2)的位置7和8包含LNA修饰。在一些实施方案中，核酸包含约8至约12个LNA修饰。在一些实施方案中，核酸包含不少于4个LNA修饰。在一些实施方案中，核酸包含不超过4个连续LNA修饰。
在一些实施方案中，核酸包含具有选自以下的序列的核酸：tggcagct(SEQ ID NO:2)、cttcaactggcagct(SEQ ID NO:3)、tcttcaactggcagct(SEQ ID NO:4)、ttcttcaactggcagct(SEQ ID NO:5)和gttcttcaactggcagct(SEQ ID NO:6)。在一些实施方案中，核酸包含约8至约12个LNA修饰，例如，约8至约10个LNA修饰。在一些实施方案中，核酸包含约8、或约9、或约10、或约11或约12个LNA修饰。
在一些实施方案中，核酸包含tggcagct(SEQ ID NO:2)和至少6个LNA修饰。
在一些实施方案中，核酸包含tggcagct(SEQ ID NO:2)和至少8个LNA修饰。
在一些实施方案中，核酸包含cttcaactggcagct(SEQ ID NO:3)和至少6个LNA修饰、至少8个LNA修饰或至少10个LNA修饰。在一些实施方案中，核酸包含cttcaactggcagct(SEQ ID NO:3)和8个LNA修饰，所述修饰位于位置1、3、6、7、10、12、14和15。在一些实施方案中，核酸包含cttcaactggcagct(SEQ ID NO:3)和10个LNA修饰，所述修饰位于位置1、2、3、6、7、10、11、12、14和15。
在一些实施方案中，核酸包含tcttcaactggcagct(SEQ ID NO:4)和至少8个LNA修饰、至少10个LNA修饰或至少11个LNA修饰。在一些实施方案中，核酸包含tcttcaactggcagct(SEQ ID NO:4)和10个LNA修饰，所述修饰位于位置1、2、4、8、10、11、12、13、15和16。在一些实施方案中，核酸包含tcttcaactggcagct(SEQ ID NO:4)和11个LNA修饰，所述修饰位于位置1、2、4、5、6、8、11、12、13、15和16。在一些实施方案中，核酸包含tcttcaactggcagct(SEQID NO:4)和11个LNA修饰，所述修饰位于位置1、2、4、5、6、9、11、12、13、15和16。
在一些实施方案中，核酸包含ttcttcaactggcagct(SEQ ID NO:5)和至少10个LNA修饰或至少11个LNA修饰。在一些实施方案中，核酸包含ttcttcaactggcagct(SEQ ID NO:5)和11个LNA修饰，所述修饰位于位置1、2、5、6、7、10、12、13、14、16和17。
在一些实施方案中，核酸包含gttcttcaactggcagct(SEQ ID NO:6)和至少9个LNA修饰或至少10个LNA修饰。在一些实施方案中，核酸包含gttcttcaactggcagct(SEQ ID NO:6)和9个LNA修饰，所述修饰位于位置1、2、6、10、13、14、16、17和18。
在另一个方面，本发明提供了药物组合物，其包含以上方面或任何以上实施方案的核酸以及药学上可接受的赋形剂或载体。
在还另一个方面，本发明提供了载体或质粒，其包含以上方面或任何以上实施方案的核酸。
本发明的一个方面提供了宿主细胞，其包含以上方面或任何以上实施方案的核酸。
本发明的另一个方面提供了用于抑制miR-22的方法。该方法包括使miR-22与包含miR-22抑制剂的组合物接触，该miR-22抑制剂为以上方面或任何以上实施方案的核酸。
本文描述的任何方面或实施方案可以与如本文公开的任何其他方面或实施方案组合。
附图简要说明
本专利或申请文件含有至少一张彩色附图。带有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本将在请求并支付必要费用后由专利局提供。
图1显示了anti-miR-22 LNA的设计。显示了SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:7至SEQ ID NO:15。
图2A-C为一系列条形图和线形图，其显示了anti-miR-22寡核苷酸的设计空间。
图3A-B显示了经由计算机的可能anti-miR设计的产生(11228)，并预测了用于选择最佳anti-miR-22设计(长度为8至18nt)的性质。图3B的图例从上到下显示了SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:7至SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ IDNO:1。
图4显示了MCF7中FAM标记的LNA的无辅助摄取。
图5为蛋白质印迹，其显示了MCF7细胞中anti-miR-22 LNA的验证。
图6A-C显示了MCF7中anti-miR-22 LNA的无辅助摄取影响了靶蛋白水平。
图6A和6B为蛋白质印迹图像，其显示了相对于HSP-90对照的TET2表达。
图6C的条形图显示了TET2蛋白表达。在图6C中，条形图中的数据顺序从左到右为SCR(黑色)、25nM(浅灰色)和100nM(深灰色)。
图7为一对点印迹图像，其显示了anti-miR-22 LNA增加了MCF7中5-hmC的水平。
图8的图显示了在媒介物(VCH)、秩乱对照RNA(SCR)和锁核酸(LNA)的转染后，HFD的miR-22-/-和WT小鼠的体内实验计划和条件。
图9的条形图显示了对于(Δ)媒介物、SCR、(□)anti-miR-22，，处理和未处理的小鼠在食物消耗上没有差异。
图10A-B的线形图显示了miR-22的体内药理学抑制阻止了小鼠变得肥胖。图10A显示了最终的身体增加百分比。图10B显示了DIO小鼠中miR-22的体内沉默。在两个图中，在最终的时间点，数据顺序从上到下为媒介物(绿色)、SCR(红色)和anti-miR-22(蓝色)。
图11为治疗方法的图，其显示了用anti-miR-22-LNA、SCR和VHL处理HFD下的miR-22-/-和WT小鼠，并将这些小鼠置于第二HFD方案。
图12为显示治疗方法的结果的线形图，由此已肥胖并被喂食HFD的小鼠的体重有显著降低。在31/2个月的治疗后，在肥胖(平均体重>40g)并被喂食HFD的小鼠中观察到体重的显著降低。处死小鼠，收集组织，将来自肝的RNA用于RNAseq。
图13为油红-O染色，其显示了miR-22的药理学抑制有效地损害了MEF的脂肪细胞分化。
图14为油红O染色(图14A)和条形图(图14B)，其显示在有或无LNA anti-miR-22下在Adipo分化培养基中培养2周的人原始间充质细胞中的anti-miR-22处理。无辅助摄取500nM(每2天加入LNA)。在图14B中，每个条形图中右侧条(红色)中的数据为经LNA#10处理的细胞的数据。
图15的条形图显示了miR-22的药理学抑制有效地损害了MEF的脂肪细胞分化。条形图中的数据顺序，当从左到右读取时，对应于从上到下读取时的图例(位于图右)。
发明详述
本公开提供了用于抑制miR-22的新的组合物和方法，例如通过抑制microRNA的表达和/或活性而抑制miR-22。
不受理论的束缚，成熟miRNA被认为由pol II或pol III产生，并起源于被称为pri-miRNA的初始转录物。这些pri-miRNA通常为几千个碱基长，因此经加工被制成短得多的成熟miRNA。这些pri-miRNA可以是多顺反子的，并产生于以可形成许多miRNA的方式组构的若干簇状序列(clustered sequence)的转录。产生miRNA的过程可为两步。首先，pri-miRNA在细胞核中可被RNase Drosha加工成约70个至约100个核苷酸的发夹形前体(pre-miRNA)。然后，在转位至细胞质后，发夹pre-miRNA可进一步被RNase Dicer加工以产生双链miRNA。成熟miRNA链随后可引入到RNA诱导沉默复合物(RISC)中，在此成熟miRNA可通过碱基对互补性与其靶mRNA结合，并导致蛋白表达的抑制。没有被优先选择进入RISC沉默复合物的miRNA双链体的另一条链是过客链(passenger strand)或次要miRNA(minor miRNA)或星(*)链。该链可被降解。应当理解，除非另有说明，否则如本文所用，miRNA可指pri-miRNA和/或pre-miRNA和/或成熟miRNA和/或次要(星)链和/或miRNA的双链体形式。
在一些实施方案中，miRNA基因可位于蛋白编码基因的内含子内或非编码转录单位的内含子或外显子内。内含子miRNA的表达可与宿主转录单元的表达同时发生，因为它们通常朝向相同的方向并与其所寄宿的pre-mRNA协同表达。
在一些实施方案中，miRNA可结合靶基因转录物的3’非翻译区(3’UTR)内的序列。在一些实施方案中，miRNA可结合靶基因转录物的3’UTR外的序列。在一些实施方案中，miRNA可结合靶基因转录物的3’UTR内和外的序列。
在一些实施方案中，miRNA的第二至第七核苷酸(miRNA种子序列)与沿靶标3’UTR的相应序列(种子匹配)间可发生核苷酸配对，用于靶标识别。因此，miRNA与靶标间的结合可包含约5个核苷酸的碱基配对。另外，miRNA与靶标间的结合可包含多于5个核苷酸的碱基配对。在一些实施方案中，miRNA与该miRNA调节的基因间的结合可通过miRNA结合靶核酸的多达2个、多达4个、多达6个、多达8个或多达10个位置介导。
MiR-22
MiR-22在许多脊椎动物物种间高度保守，这些物种包括黑猩猩、小鼠、大鼠、狗和马。这种保守水平表明了功能重要性。先前确定MiR-22在红细胞成熟中起作用，后来确定MiR-22在肿瘤发生中起作用。MiR-22直接靶向磷酸酶和张力蛋白同源蛋白(PTEN)以及tet甲基胞嘧啶二氧化酶(TET)，以促进肿瘤发生、转移和代谢失调。在一些实施方案中，本发明的核酸增加了PTEN和/或TET2的活性和/或表达。
预测的miR-22发夹前体完全包含在非编码转录物C17orf91的外显子2内，并且尽管缺乏蛋白编码的潜力，但剪接模式通常在人和小鼠中保守。参见Rodriguez等人，Identification of mammalian microRNA host genes and transcriptionunits.Genome Res.2004年10月；14(10A):1902-10。小鼠模型中包含mir-22的Cl7orf9l的外显子2的缺失已显示：miR-22通过靶向SIRT1(NAD依赖的脱乙酰基酶sirtuin-1)、HDAC4(组蛋白脱乙酰基酶4)、PURB(富含嘌呤的元件结合蛋白B)和PTEN可在心脏肥大和重塑中起作用。参见Gurha等人,Targeted deletion of microRNA-22 promotes stress-inducedcardiac dilation and contractile dysfunction.Circulation.2012年6月5日；125(22):2751-61；Huang等人,MicroRNA-22regulates cardiac hypertrophy andremodeling in response to stress.Circ Res.2013年4月26日；112(9):1234-43。
miR-22的抑制剂
在一些实施方案中，miRNA的抑制剂为充当反义寡核苷酸的核酸。本发明的核酸可包括核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或其组合。本发明的核酸可具有至少一个化学修饰(非限制性示例为糖或骨架修饰，例如锁核酸(LNA))。
在一些实施方案中，抑制miR-22的核酸的序列在物种间保守。
在一些实施方案中，核酸序列与人miR-22的序列部分互补。在一些实施方案中，选择抑制剂以减少细胞或受试者中靶miR-22的表达和/或活性。
在一些实施方案中，本发明的核酸抑制人miR-22。在一些实施方案中，人miR-22包含AAGCUGCCAGUUGAAGAACUGU(SEQ ID NO:1)或由其组成。
在一些实施方案中，本发明的核酸的长度为约8至约20个残基(例如，长度为约8-18个、或约8-16个、或约8-14个、或约8-12个、或约8-10个、或约10-18个、或约10-16个、或约10-14个、或约10-12个残基)。在一些实施方案中，核酸的长度为约8个、或约9个、或约10个、或约11个、或约12个残基。
在一些实施方案中，本发明的核酸完全同源地与miR-22的部分结合。例如，本发明的核酸的长度可为18个残基，并且18个残基中的每一个都与miR-22的核苷酸互补。或者，本发明的核酸完全同源地与miR-22的部分结合。例如，本发明的核酸的长度可为16个残基，并且仅15个或更少的残基与miR-22的核苷酸互补。
在一些实施方案中，本发明的核酸在一个位置、在两个位置、在三个位置、在四个位置、在五个位置或在五个以上的位置不同于miR-22的部分。
在一些实施方案中，本发明的核酸以足以抑制miR-22的亲和力与miR-22结合。在一些实施方案中，核酸以高亲和力(例如nM级的亲和力)与miR-22结合。因此，本发明的核酸以高亲和力与miR-22结合，即使其在一个或多个位置不同于miR-22的部分。
本发明的核酸可具有包含tggcagct(SEQ ID NO:2)并包含至少一个锁核酸(LNA)修饰的序列。
在锁核酸(LNA)中，核酸的核糖部分被连接2’氧和4’碳的额外桥修饰，该桥将核糖锁在3'-内部(3'-endo)构象中。本发明的包含LNA的核酸提供了有成本效益的试剂，该试剂可被高效地递送并具有足够的生物利用度以用于各种病症的治疗和预防。
在一些实施方案中，本发明的核酸朝向其3’末端包含至少2个LNA修饰(例如，在朝向其3’末端的约2个、或约3个、或约4个、或约5个修饰)。在一些实施方案中，核酸包含tggcagct(SEQ ID NO:2)和至少6个LNA修饰或至少8个LNA修饰。
例如，核酸在tggcagct(SEQ ID NO:2)的位置7和8包含LNA修饰。在一些实施方案中，本发明的核酸包含不超过4个连续LNA修饰(例如，仅2个、或3个、或4个连续LNA修饰)。在一些实施方案中，本发明的核酸包含不超过3个连续未修饰残基(例如，仅3个、或2个、或1个未修饰残基)。在一些实施方案中，本发明的核酸包含不少于4个LNA修饰。在一些实施方案中，核酸包含约8至约12个LNA修饰，例如约8个、或约9个、或约10个、或约11个、或约12个LNA修饰。
在一些实施方案中，核酸包含具有选自以下的序列的核酸或由其组成：tggcagct(SEQ ID NO:2)、cttcaactggcagct(SEQ ID NO:3)、tcttcaactggcagct(SEQ ID NO:4)、ttcttcaactggcagct(SEQ ID NO:5)和gttcttcaactggcagct(SEQ ID NO:6)。在一些实施方案中，核酸包含具有选自以下的序列的核酸：tggcagct(SEQ ID NO:2)、cttcaactggcagct(SEQ ID NO:3)、tcttcaactggcagct(SEQ ID NO:4)、ttcttcaactggcagct(SEQ ID NO:5)和gttcttcaactggcagct(SEQ ID NO:6)，并包含约8至约12个LNA修饰，例如，约8个、或约9个、或约10个、或约11个、或约12个LNA修饰。
在一些实施方案中，核酸包含cttcaactggcagct(SEQ ID NO:3)和至少6个LNA修饰、至少8个LNA修饰或至少10个LNA修饰，或由其组成。在一些实施方案中，核酸包含cttcaactggcagct(SEQ ID NO:3)和8个LNA修饰，或由其组成，所述修饰位于位置1、3、6、7、10、12、14和15；例如，核酸包含序列CtTcaACtgGcAgCT(SEQ ID NO:7)或由其组成，其中大写字母为LNA修饰的且小写字母为未修饰的。在一些实施方案中，核酸包含cttcaactggcagct(SEQ ID NO:3)和10个LNA修饰，或由其组成，所述修饰位于位置1、2、3、6、7、10、11、12、14和15；例如，核酸包含序列CTTcaACtgGCAgCT(SEQ ID NO:8)或由其组成，其中大写字母为LNA修饰的且小写字母为未修饰的。
在一些实施方案中，核酸包含tcttcaactggcagct(SEQ ID NO:4)和至少8个LNA修饰、至少10个LNA修饰或至少11个LNA修饰，或由其组成。在一些实施方案中，核酸包含tcttcaactggcagct(SEQ ID NO:4)和10个LNA修饰，或由其组成，所述修饰位于位置1、2、4、8、10、11、12、13、15和16；例如，核酸包含序列TCtTcaaCtGGCAgCT(SEQ ID NO:10)或由其组成，其中大写字母为LNA修饰的且小写字母为未修饰的。在一些实施方案中，核酸包含tcttcaactggcagct(SEQ ID NO:4)和11个LNA修饰，或由其组成，所述修饰位于位置1、2、4、5、6、8、11、12、13、15和16；例如，核酸包含序列TCtTCAaCtgGCAgCT(SEQ ID NO:9)或由其组成，其中大写字母为LNA修饰的且小写字母为未修饰的。
在一些实施方案中，核酸包含tcttcaactggcagct(SEQ ID NO:4)和11个LNA修饰，或由其组成，所述修饰位于位置1、2、4、5、6、9、11、12、13、15和16；例如，核酸包含序列TCtTCAacTgGCAgCT(SEQ ID NO:11)或由其组成，其中大写字母为LNA修饰的且小写字母为未修饰的。
在一些实施方案中，核酸包含ttcttcaactggcagct(SEQ ID NO:5)和至少10个LNA修饰或至少11个LNA修饰，或由其组成。在一些实施方案中，核酸包含ttcttcaactggcagct(SEQ ID NO:5)和11个LNA修饰，或由其组成，所述修饰位于位置1、2、5、6、7、10、12、13、14、16和17；例如，核酸包含序列TTctTCAacTgGCAgCT(SEQ ID NO:12)或由其组成，其中大写字母为LNA修饰的且小写字母为未修饰的。
在一些实施方案中，核酸包含gttcttcaactggcagct(SEQ ID NO:6)和至少9个LNA修饰或至少10个LNA修饰，或由其组成。在一些实施方案中，核酸包含gttcttcaactggcagct(SEQ ID NO:6)和9个LNA修饰，或由其组成，所述修饰位于位置1、2、6、10、13、14、16、17和18；例如，核酸包含序列GTtctTcaaCtgGCaGCT(SEQ ID NO:13)或由其组成，其中大写字母为LNA修饰的且小写字母为未修饰的。
在一些实施方案中，包含上列序列的核酸可进一步包含在本文所列序列5’的另外的核苷酸，和/或在本文所列序列3’的另外的核苷酸。另外的核苷酸可为未修饰的或可为修饰的，例如，LNA或另外的化学修饰。
在一些实施方案中，本发明的核酸可进一步包含另外的化学修饰。例如，化学修饰为以下的一种或多种：硫代磷酸酯、2’-0-甲基、或2’-O-甲氧乙基、2’-0-烷基-RNA单元、2’-OMe-RNA单元、2’-氨基-DNA单元、2’-氟-DNA单元(包括，但不限于，在位置2’取代为氟(2’F)的DNA类似物)、LNA单元、PNA单元、HNA单元、INA单元和2’MOE RNA单元。
合适的核酸可包含一种或多种构象约束的或二环的糖核苷修饰(BSN)，该糖核苷修饰赋予强的热稳定性给含有BSN的寡核苷酸和他们的互补miRNA靶链之间形成的复合物。例如，在一个实施方案中，核酸含有至少一个锁核酸。锁核酸(LNA)含有2’-0,4’-C-亚甲基核糖核苷(结构A)，其中核糖糖部分处于锁的构象。在另一个实施方案中，核酸含有至少一个2’,4’-C-桥连的2’脱氧核糖核苷(CDNA，结构B)。参见，例如，美国专利号6,403,566和Wang等人，(1999)Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters,第9卷:1147-1150，两者均通过引用以其全文并入本文。在还另一个实施方案中，核酸含有至少一个具有结构C中所示结构的修饰的核苷。靶向调节脂肪相关代谢和合成途径靶标的miRNA的核酸可含有BSN的组合(LNA、CDNA等)或其他修饰的核苷酸，以及核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。
另外，核酸可包含肽核酸(PNA)，该肽核酸含有基于肽的骨架而非糖-磷酸骨架。还考虑对核酸的其他的修饰的糖或磷酸二酯修饰。其他化学修饰可以非限制性示例的方式包括2’-o-烷基(例如，2’-0-甲基、2’-o-甲氧乙基)、2’-氟和4’-硫代修饰，以及骨架修饰，如一个或多个硫代磷酸酯、吗啉代或膦酰基羧酸酯键(参见，例如，美国专利号6,693,187和7,067,641，其通过引用以其全文并入本文)。在一个实施方案中，靶向致癌miRNA的核酸在每个碱基上含有2'-0-甲基糖修饰，并通过硫代磷酸酯键连接。核酸，特别是较短长度的那些(例如，少于16个核苷酸，7至8个核苷酸)可包含一个或多个增强亲和力的修饰，例如，但不限于LNA、二环核苷、膦酰基甲酸酯、2’o-烷基修饰等。在一些实施方案中，合适的核酸为2’-0-甲氧乙基间隔体(gapmer)，该间隔体在5’和3’端均含有2’-O-甲氧乙基修饰的核糖核苷酸，且在其中心具有至少十个脱氧核糖核苷酸。这些间隔体能触发RNA靶标的RNase H依赖的降解机制。增强稳定性和提高效率的核酸的其他修饰，如描述于美国专利号6,838,283(其通过引用以其全文并入本文)中的那些，是本领域中已知的，并且适合用于本发明的方法中。例如，且不旨在为限制性地，为促进体内递送和稳定性，可使核酸在其3’端连接至类固醇如胆固醇部分、维生素、脂肪酸、碳水化合物或糖苷、肽或其他小分子配体。
如本文所用，基本上互补指序列与靶多核苷酸序列为至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％互补(非限制性示例为例如miR-22的成熟miRNA、次要miRNA、前体miRNA或pri-miRNA序列)。
在一些实施方案中，本发明的核酸是antagomir。antagomir为单链的、化学修饰的核糖核苷酸，其与miRNA至少部分互补，因此可沉默这些miRNA。参见，例如，Kriitzfeldt等人，Nature(2005)438(7068)：685-9。antagomir可包含一个或多个修饰的核苷酸，如2’-0-甲基-糖修饰。在一些实施方案中，antagomir仅包含修饰的核苷酸。antagomir还可包含一个或多个硫代磷酸酯连接，形成部分或完全的硫代磷酸酯骨架。为促进体内递送和稳定性，可使antagomir在其3’端连接胆固醇或其他部分。适用于抑制的antagomir的长度可为约15至约50个核苷酸、约18至约30个核苷酸和约20至约25个核苷酸。antagomir可与成熟的或次要的致癌miRNA序列为至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％互补。在一些实施方案中，antagomir可与成熟的或次要的致癌miRNA序列基本互补，即与靶多核苷酸序列为至少约95％、96％、97％、98％或99％互补。在其他实施方案中，antagomir与成熟的或次要的致癌miRNA序列为100％互补。
本发明的核酸可包含与致癌miRNA的前体miRNA序列(pre-miRNA)或初始miRNA序列(pri-miRNA)基本互补的序列。在一些实施方案中，本发明的核酸包含位于该miRNA的靶标的3’-非翻译区外的序列。在一些实施方案中，本发明的核酸包含位于该miRNA的靶标的3’-非翻译区内的序列。
在一些实施方案中，核酸具有有限的自结合亲和力或无自结合亲和力。在一些实施方案中，核酸具有有限的双链体结构或无双链体结构。在一些实施方案中，核酸具有有限的折叠结构或无折叠结构。
通过将编码miRNA抑制剂或激动剂的表达载体递送至细胞，可将本发明的任何核酸递送至靶细胞。载体是可用于将目的核酸递送至细胞内部的物质的组合物。本领域中已知许多载体，包括，但不限于线性多核苷酸、与离子化合物或两亲化合物相连的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语载体包括自主复制的质粒或病毒。病毒载体的示例包括，但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体等。表达构建体可在活细胞中复制，也可合成制得。为了本申请的目的，术语表达构建体、表达载体和载体互换地用于以一般的、说明性的意义证明本发明的应用，并且不旨在限制本发明。
在一个实施方案中，用于表达本发明的核酸的表达载体包含启动子，该启动子可操作地连接编码本发明的核酸的多核苷酸。如本文所用，短语可操作地连接或在转录控制下意指：启动子相对于多核苷酸处于正确的位置和方向，以控制RNA聚合酶的转录起始和多核苷酸的表达。
如本文所用，启动子指被细胞的合成装置或引入的合成装置识别的DNA序列，其为启动基因的特异性转录所需的。合适的启动子包括，但不限于RNA pol I、pol II、pol III和病毒启动子(例如，人巨细胞病毒(CMV)即早基因启动子、SV40早期启动子和劳斯肉瘤病毒长末端重复)。
在某些实施方案中，可操作地连接至编码本发明的核酸的多核苷酸的启动子可为诱导型启动子。诱导型启动子是本领域中已知的，且包括，但不限于四环素启动子、金属硫蛋白IIA启动子、热休克启动子、类固醇/甲状腺激素/视黄酸应答元件、腺病毒晚期启动子和诱导型小鼠乳腺瘤病毒LTR。
递送表达构建体和核酸至细胞的方法是本领域中已知的，且可以非限制性示例的方式包括磷酸钙共沉淀、电穿孔、微注射、DEAE-葡聚糖、脂转染、采用聚胺转染试剂的转染、细胞超声处理、使用高速微粒的基因枪和受体介导的转染。
本发明的一个方面提供了包含本发明的任何本文所述核酸的宿主细胞。
本发明的另一个方面提供了用于抑制miR-22的方法。该方法包括使miR-22与miR-22抑制组合物接触，该miR-22抑制组合物为本发明的任何本文所述核酸。该方法可为体外或体内的。
在另一个方面，本发明提供了药物组合物，该药物组合物包含本发明的任何本文所述核酸和药学上可接受的赋形剂或载体。
在考虑临床应用时，可以适合于预期应用的形式制备药物组合物。通常，这需要制备基本上不含热原以及其他可对人或动物有害的杂质的组合物。
在一个实施方案中，药物组合物包含有效剂量的本发明的任何本文所述核酸。有效剂量为足够产生有益或期望的临床结果的量。有效剂量可为约1mg/kg至约100mg/kg、约2.5mg/kg至约50mg/kg或约5mg/kg至约25mg/kg。准确确定何为有效剂量可基于每个患者的个体因素，包括他们的体型大小、年龄、代谢失调的类型以及抑制剂或激动剂的性质(非限制性示例包括antagomir、表达构建体、反义寡核苷酸、多核苷酸双链体等)。因此，本领域中的普通技术人员从本公开和本领域知识可容易地确定剂量。例如，可通过参考Physicians’Desk Reference,第66版,PDR Network；2012版(2011年12月27日)确定剂量，其内容通过引用以其全文并入本文。
胶体分散系统，如高分子复合物、纳米胶囊、微球体、珠子和基于脂质的系统，包括油包水乳剂、胶束、混合胶束和脂质体，可用作本发明的任何本文所述核酸的递送媒介物。适用于将本公开的核酸递送至脂肪组织(例如脂肪细胞)的市售脂肪乳剂包括INTRALIPIDO、II、/>III、Nutrilipid和其他类似的脂质乳剂。用作体内递送媒介物的胶体系统为脂质体(即人造膜囊泡)。这种系统的制备和用途是本领域中熟知的。示例性制剂也公开于US 5,981,505、US 6,2l7,900、US 6,383,512、US 5,783,565、US 7,202,227、US 6,379,965、US 6,127,170、US 5,837,533、US 6,747,014和WO 03/093449，以上均通过引用以其全文并入本文。
通常期望采用合适的盐和缓冲液以使递送媒介物稳定并可被靶细胞摄取。本发明的水性组合物包含有效量的递送媒介物(例如脂质体或其他复合物或表达载体)，该递送媒介物含有溶解或分散于药学上可接受的载体或水性介质中的本发明的任何本文所述核酸。短语药学上可接受的或药理学上可接受的指，当施用给动物或人时不产生不利的、过敏的或其他不良反应的分子实体和组合物。如本文所用，药学上可接受的载体包括可接受用于配制药物(如适合施用给人的药物)的溶剂、缓冲液、溶液、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。用于药物活性物质的这种介质和试剂的用途是本领域中熟知的。除非在任何常规介质或试剂与本发明的活性成分不相容，否则考虑这种介质或试剂在治疗组合物中的用途。也可掺入补充的活性成分到组合物中，只要它们不使组合物的载体或多核苷酸失活。
药物形式为，例如，无菌水溶液或分散体和无菌粉末，用于临时制备无菌注射溶液或分散体。通常，这些制备物为无菌流体(至容易注射的程度)。制剂在生产和储存的条件下应是稳定的，且应保存免于微生物如细菌和真菌污染。合适的溶剂或分散介质可含有，例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)、其合适的混合物和植物油。可例如通过使用包衣如卵磷脂、通过在分散体的情况下维持所需的粒径以及通过使用表面活性剂，来维持适当的流动性。通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等，可防止微生物作用。在许多情况下，优选包括等渗剂例如糖类或氯化钠。通过在组合物中使用延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)，可实现可注射组合物的延长吸收。
通过将适量的本发明的任何本文所述核酸与所需的任何其他成分(例如，如以上所列举的)一起掺入溶剂中，然后过滤灭菌，可制备无菌可注射溶液。通常，通过将各种灭菌活性成分掺入无菌媒介物中来制备分散体，该无菌媒介物含有基础分散介质和所需的其他成分，例如以上所列举的。就用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末而言，优选的制备方法包括真空干燥和冷冻干燥技术，这两种技术从其先前的无菌过滤溶液中产生活性成分和任何其他所需成分的粉末。
配制后，溶液可以与剂型相容的方式并以治疗有效量来施用。
实施例
为了更高效地理解本文公开的发明，下面提供实施例。应当理解，这些实施例仅用于示例目的，而不以任何方式被解释为限制本发明。
实施例1：anti-miR-22锁核酸(LNA)构建体的设计
所有的LNA anti-miR-22均可用于人和小鼠。宿主基因在人和小鼠间显示49％的互补性，且LNA anti-HG-miR-22主要在人体中起作用。
设计的构建体覆盖种子序列，8nt和20nt之间的长度，具有允许的LNA的长度特异的部分，和与miR-22尽可能高的结合亲和力(参见图1和2A-C)。
设计元件在构建体末端包含至少2个LNA修饰。进一步的设计元件包含不超过4个连续LNA修饰。仍进一步设计元件包含不超过3个连续的未修饰残基。
将构建体设计为以足以抑制miR-22的亲和力与miR-22结合。并且，将构建体设计为具有有限自结合亲和力或无自结合亲和力(例如无或有限的双链体或折叠结构)。参见图3A-B。
在以下序列中，大写字母为LNA修饰的且小写字母为未修饰的；miR-22(SEQ IDNO:1)和anti-miR-22寡核苷酸(SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:7至SEQ ID NO:13)的方向定向为5’至3’。图1显示，与miR-22杂交时，anti-miR-22寡核苷酸如他们应为的那样方向为3’至5’。方向为5’至3’的SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15的寡核苷酸为秩乱序列，且其不与miR-22(SEQ ID NO:1)杂交。
实施例2：miR-22的抑制
评价实施例1的构建体抑制miR-22的能力。
通过对LNA辅助摄取(Lipo200转染)方案的优化在实验中中验证了序列，使用FAM标记的LNA的贴壁细胞系，并通过在辅助摄取和无辅助摄取下贴壁细胞系中鉴定最有效的anti-miR-22(治疗前和后的miR-22水平以及TET2活性和蛋白水平的分析)，来验证生物学效应。目的为在小鼠模型中使用anti-miR，其中将最有效的anti-miR用于体内处理，对于确认结果，参见图3A-B、图4、图5、图6和图7。
在肥胖模型中体内进一步验证了实施例1的构建体抑制miR-22的能力。
在用于预防的体内实验计划中，参见图8，用实施例1的媒介物(VCH)、秩乱对照RNA(SCR)和锁核酸(LNA)转染HFD下的2个月大的miR-22-/-和WT，并用20mg/kg负荷剂量(第一次)和10mg/kg维持剂量的每周IP注射无辅助摄取来处理这些小鼠。经处理和未经处理的小鼠在食物消耗上没有差异，参见图9。miR-22的体内药理学抑制防止了小鼠变肥胖。参见图10A-B。
图11为治疗方法的图示，其显示了用anti-miR-22-LNA、SCR和VHL处理的HFD下的miR-22-/-和WT小鼠，并将这些小鼠置于第二HFD方案。如图12所示，实施例1的构建体抑制了miR-22，如体重减轻所证明。
miR-22抑制的进一步证据见于油红O染色实验中，这些实验显示MEF脂肪细胞分化受到损害。图13显示了实施例1的构建体对miR-22的药理学抑制有效地损害了MEF的脂肪细胞分化。图14为油红O染色(图14A)和条形图(图14B)，显示在有或无LNA anti-miR-22下，在培养于Adipo分化培养基中2周的人原始间充质细胞中的anti-miR-22处理。无辅助摄取500nM(每2天加入LNA)。在图14B中，每个条形图中右(红色)条中的数据为经LNA#10处理的细胞。图15的条形图显示了miR-22的药理学抑制有效地损害了MEF脂肪细胞分化。条形图中的数据顺序，当从左到右读取时，对应于从上到下读取时的图例(位于图右)。LNA的数量与上述实施例1相对应。
因此，实施例1的核酸构建体有效地抑制了miR-22。
其他实施方案
应当理解，尽管已联同本公开的详细描述描述了本公开，但在前的描述旨在说明，而非限制由所附权利要求的范围限定的本公开的范围。其他方面、优点和修饰都在以下权利要求的范围内。
通过引用并入
本文引用的所有专利和出版物均通过引用以其全文并入本文。
提供本文讨论的出版物仅因为其在本申请提交日期之前公开。本文中的任何内容均不得解释为承认本发明无权凭借在先发明而早于这些出版物。
如本文所用，所有标题仅用于组织，并不旨在以任何方式限制公开内容。
序列表
<110> 贝斯以色列女执事医疗中心（BETH ISRAEL DEACONESS MEDICAL CENTER）
奥尔堡大学（AALBORG UNIVERSITY）
<120> Micro-RNA 22的抑制剂
<130> BID-005PC2/BIDMC 1826
<150> US 62/642,934
<151> 2018-03-14
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 1
aagcugccag uugaagaacu gu 22
<210> 2
<400> 2
000
<210> 3
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<220>
<223> 合成的核酸
<400> 3
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<220>
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<210> 5
<211> 17
<212> DNA
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<220>
<223> 合成的核酸
<400> 5
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<210> 6
<211> 18
<212> DNA
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<220>
<223> 合成的核酸
<400> 6
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<210> 7
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成的核酸
<400> 7
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成的核酸
<400> 12
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<400> 13
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<220>
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<220>
<223> 合成的核酸
<400> 15
cgaatagtta gtagcg 16

Claims (6)

1.一种miR-22抑制组合物，其包含序列由CTTcaACtgGCAgCT组成的核酸，其中大写字母为锁核酸(LNA)核苷酸，小写字母是DNA核苷酸。
2.一种药物组合物，其包含权利要求1所定义的核酸和药学上可接受的赋形剂或载体。
3.一种载体，其包含权利要求1所定义的核酸。
4.根据权利要求3所述的载体，其中所述载体是质粒。
5.一种宿主细胞，其包含权利要求1所定义的核酸。
6.一种抑制miR-22的方法，包括使miR-22与权利要求1的miR-22抑制组合物接触，其中所述方法用于非诊断或治疗目的。
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