CN110609142A - 一种检测外周血fto蛋白与自身调控元件结合能力的方法与应用 - Google Patents

一种检测外周血fto蛋白与自身调控元件结合能力的方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种DNA探针，所述探针的5′端有生物素标记物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明还提供了一种检测外周血FTO蛋白与自身调控元件结合能力的方法，包括以下步骤：(1)从检测对象的外周静脉血中提取血细胞蛋白；(2)将所述的DNA探针进行变性和退火变为双链DNA探针；(3)将双链DNA探针与血细胞蛋白混合后进行孵育，通过EMSA技术获得EMSA阻滞迁移条带的灰度值；(4)通过灰度值判断是否干预检测对象。通过检测人的外周血FTO蛋白与自身调控元件结合能力来预测高血脂肥胖人群的发展情况。为高血脂肥胖的早期诊断及发生发展的机制研究提供新检测方法。

Description

一种检测外周血FTO蛋白与自身调控元件结合能力的方法与 应用
技术领域
本发明涉及神经内分泌和分子生物学领域，具体涉及一种检测外周血FTO蛋白与自身调控元件结合能力的方法，可应用于肥胖及代谢异常的早期干预。
背景技术
随着生活水平不断提升，近年来肥胖发生率在不断增长，成为全球范围内可预防的主要死亡原因。肥胖最大危害是导致一系列严重的并发症，尤其是心脑血管疾病、糖尿病、神经精神疾病及恶性肿瘤等重大疾病。因此肥胖人群的早期诊断及干预对预防肥胖相关并发症的发生具有重要意义。
导致肥胖发生的机制十分复杂，涉及到遗传与环境因素。迄今为止，多项重复研究证实多个信号通路及大量基因与肥胖发生密切相关，另外肥胖发生发展还涉及到神经系统与多个组织器官的相互协同作用。这给肥胖的早期诊断及干预造成很大的困难。因此，目前还缺少有显著效果的早期诊断技术。近年来多项研究发现肥胖相关FTO(Fat mass andobesity associated)基因是肥胖发生的关键基因。这在动物模型中得到证实：FTO过表达小鼠表现出肥胖，而FTO敲除小鼠表现瘦的特征。可见FTO的表达水平对体重控制非常关键。
本发明人研究发现FTO在短期高脂饮食小鼠中的表达不发生改变；而在长期高脂饮食诱导的肥胖小鼠的下丘脑中FTO表达上调，而在其他组织器官如大脑、小脑、肝脏及脂肪等均表现为稳态表达。通过进一步研究，发明人发现FTO通过与自身基因启动子调控元件相结合参与自身负反馈调控，因此，通过这种调控机制长期高脂饮食诱导的肥胖小鼠下丘脑中这种自身负反馈调控机制受到破坏，造成FTO表达上调。
本发明人通过研究证实小鼠下丘脑中特异性负反馈调控机制在代谢调控中枢(即下丘脑)中表达水平决定了体重的变化。由于FTO负反馈调控元件在人与小鼠中具有高度保守性(参见附图1)，因此推测人体中同样存在这一调控机制。研究发现，与肥胖小鼠的下丘脑相类似，在高血脂肥胖人群外周血细胞中FTO基因自我负反馈机制被打破导致FTO蛋白表达上调。因此外周血FTO蛋白与自身调控元件结合能力的检测可作为高血脂肥胖人群早期监测的重要手段，并且可用于进一步探索血细胞FTO上调在肥胖条件下高血脂的发生发展过程中的作用机制。
迄今为止，利用这种调控制剂可作为高血脂肥胖人群早期监测的重要手段，对肥胖进行预测和干预，国内外尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供检测外周血FTO蛋白与自身调控元件结合能力的方法与应用。通过检测人的外周血FTO蛋白与自身调控元件结合能力来预测高血脂肥胖人群的发展情况，从而为高血脂肥胖的早期诊断及发生发展的机制研究提供新检测方法，为肥胖易感人群早期采用干预措施提供有效的监测手段。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
本发明提供了一种DNA探针，所述探针的5′端有标记物，其核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示。
优选地的，所述标记物为生物素。
本发明还提供了如上所述DNA探针在制备用于检测肥胖的试剂中的应用。
优选地的，所述肥胖为高血脂肥胖。
在本发明还提供了如上所述DNA探针在检测外周血FTO蛋白与自身调控元件结合能力中应用。
本发明还提供了一种检测外周血FTO蛋白与自身调控元件结合能力的方法，包括以下步骤：
(1)从检测对象的外周静脉血中提取血细胞蛋白；
(2)将本发明的探针进行变性和退火变为双链DNA探针；
(3)将双链DNA探针与血细胞蛋白混合后进行孵育，通过凝胶迁移(EMSA)技术获得EMSA阻滞迁移条带的灰度值；
(4)通过灰度值判断是否干预检测对象。
本发明还提供了如上所述的方法在检测外周血FTO蛋白与自身调控元件结合能力中的应用。
本发明的有益效果：本发明采用外周静脉血FTO的EMSA检测可作为肥胖及相关代谢异常疾病早期诊断的重要措施，对心脑血管疾病、神经精神相关疾病及多种类型恶性肿瘤等重大疾病提供预警信息，有助于尽早采取干预措施，降低发病率。还为进一步探索血细胞中FTO蛋白表达上调在肥胖及相关疾病的作用机制提供研究技术。
附图说明
图1为FTO自我负反馈调控的示意图及关键调控序列在人与小鼠中的保守性的示意图(A为FTO自我负反馈调控的示意图；B为人与小鼠FTO基因启动子序列保守性分析显示FTO结合的调控元件及其附近序列高度保守，其中TSS表示转录起始点，阴影部分的碱基为保守序列；binding site为FTO结合序列)。
图2为免疫印迹法检测FTO在对照组和高血脂肥胖人群外周血细胞中表达水平示意图。
图3为对照组和高血脂肥胖人群外周血细胞中FTO与自身调控元件结合能力示意图。
具体实施方式
为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例及其附图对本发明做进一步的详细描述。
实施例1检测体重正常与高血脂肥胖人群外周血FTO蛋白水平
1、选择研究对象：根据所在医院体检中心提供的体检资料确定研究对象，研究对象要求年龄在40-50岁，男性、女性各一半，共分为两组(每组30例)：对照组及高血脂肥胖组的入组标准见表1。
表1：高血脂肥胖组及对照组的体重指数、血清甘油三酯及总胆固醇水平
2、提取外周静脉血细胞总蛋白：抽取2ml的静脉血于加有肝素的离心管中(由体检中心完成)，进行常温离心(4000转/分)分离血细胞(上清即为血浆，沉淀即为血细胞)。然后采用贝博公司生产的血细胞蛋白提取试剂盒(货号：BB-3139)提取血细胞总蛋白，具体操作过程参考试剂盒所提供的详细说明进行；最后采用BCA法对血细胞总蛋白进行定量分析。
3、检测FTO蛋白水平：采用免疫印迹(Western blot)法鉴定上述各组人群的血细胞中FTO蛋白水平。大致过程如下：将20μg的外周血细胞总蛋白进行变性聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)胶电泳，采用湿转法将PAGE胶上的蛋白转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上；将PVDF膜进行封闭，并分别用FTO抗体或对照(β-actin)蛋白抗体孵育，然后辣根过氧化物酶(HRP)耦联二抗孵育3小时，最后将孵育完的PVDF膜进行显色和X光片压片曝光，获得FTO在外周血细胞中的表达水平。采用Photoshop软件分析FTO条带与内参(β-actin)条带的相对灰度值，最后采用SPSS13.0软件分析不同组之间的统计学差异。
结果显示：高血脂肥胖组FTO相对平均表达(FTO/β-actin)水平是正常组的5.8倍，P<0.001，n＝30(图2)。表明FTO在高血脂肥胖人群的外周血细胞中表达显著性上调。
实施例2检测外周血细胞FTO与调控元件结合能力
委托上海生工公司合成5′端生物素标记的FTO自我负反馈调控关键元件序列(5′-CAGGAGGCGGGGTCCAGGGCGAGGG-3′)及其互补DNA序列。以生物素标记的调控关键元件序列作为DNA探针。
具体操作如下：首先将标记的DNA探针与非标记的其互补DNA序列进行变性和退火变为双链DNA；然后将外周血细胞蛋白与双链DNA探针混合后进行孵育，将孵育的样品进行非变性聚丙烯酰胺胶(SDS-PAGE)电泳，将PAGE胶上的蛋白转移至尼龙膜上，将尼龙膜分别进行封闭、辣根过氧化物酶(HRP)耦联抗体孵育，进一步进行化学发光及X光片压片曝光，获得FTO与其自身调控元件结合后导致的阻滞迁移条带；最后采用Photoshop软件计算阻滞迁移条带的灰度值，采用SPSS13.0软件分析不同组之间的统计学差异，根据阻滞迁移条带的灰度值可判断FTO与调控元件的结合能力。表2为本发明所测试30例高血脂肥胖人群及30例对照人群的阻滞迁移条带灰度值。
表2：高血脂肥胖组及对照组的EMSA阻滞迁移条带的灰度值
结果如表2、图3所示，高血脂肥胖人群外周血EMSA阻滞迁移条带的灰度值17.8±6.1，而对照人群为117.8±12.8，高血脂肥胖人仅为对照人群的0.15倍左右；图3中显示两组部分实验的EMSA结果(3例)，结果显示：高血脂肥胖人群外周血FTO与启动子调控元件结合能力显著性低于正常人群P<0.001，n＝30。从而说明高血脂肥胖人群外周血细胞中FTO基因自我负反馈调控机制被破坏导致FTO表达显著上调。
综上所述，通过本发明的探针以及利用该探针可以检测出，外周血细胞FTO与调控元件结合能力，当其结合能力强时自我负反馈调控机制未被破坏，FTO表达稳定，当其结合能力差时自我负反馈调控机制被破坏，FTO表达显著上调。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州医科大学附属第二医院
<120> 一种检测外周血FTO蛋白与自身调控元件结合能力的方法与应用
<130> 6.14
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
caggaggcgg ggtccagggc gaggg 25

Claims (7)

1.一种DNA探针，其特征在于，所述探针的5′端有标记物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.如权利要求1所述的DNA探针，其特征在于，所述标记物为生物素。
3.如权利要求1或2所述的DNA探针在制备用于检测肥胖的试剂中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述肥胖为高血脂肥胖。
5.如权利要求1或2所述的DNA探针在检测外周血FTO蛋白与自身调控元件结合能力中应用。
6.一种检测外周血FTO蛋白与自身调控元件结合能力的方法，包括以下步骤：
(1)从检测对象的外周静脉血中提取血细胞蛋白；
(2)将如权利要求1或2所述的DNA探针进行变性和退火变为双链DNA探针；
(3)将双链DNA探针与血细胞蛋白混合后进行孵育，通过EMSA技术获得EMSA阻滞迁移条带的灰度值；
(4)通过灰度值判断是否干预检测对象。
7.如权利要求6所述方法在检测外周血FTO蛋白与自身调控元件结合能力中的应用。
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2019178410A1 (en) * 2018-03-14 2019-09-19 Beth Israel Deaconess Medical Center Micro-rna and obesity

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019178410A1 (en) * 2018-03-14 2019-09-19 Beth Israel Deaconess Medical Center Micro-rna and obesity

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SAEID DOAEI等: "hanges in FTO and IRX3 gene expression in obese and overweight male adolescents undergoing an intensive lifestyle intervention and the role of FTO genotype in this interaction", 《JOURNAL OF TRANSLATIONAL MEDICINE》 *
SHU-JING LIU等: "FTO is a transcriptional repressor to auto-regulate its own gene and potentially associated with homeostasis of body weight", 《JOURNAL OF MOLECULAR CELL BIOLOGY》 *

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