BR112020018752A2 - Micro-rna e obesidade - Google Patents

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Abstract

a presente divulgação fornece um método para tratar ou prevenir distúrbios metabólicos administrando agentes que inibem a atividade de micrornas que modulam metabolismo.

Description

“MICRO-RNA E OBESIDADE” PRIORIDADE
[0001] Este pedido reivindica o benefício e a prioridade do Pedido Provisório U.S. 62/642.934, depositado em 14 de março de 2018, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência em sua totalidade.
CAMPO DA DIVULGAÇÃO
[0002] A divulgação se refere ao tratamento e prevenção de distúrbios metabólicos pela administração de agentes que modulam a atividade ou expressão de microRNAs.
DESCRIÇÃO DO ARQUIVO DE TEXTO ENVIADO ELETRONICAMENTE
[0003] O conteúdo do arquivo de texto enviado eletronicamente com este é incorporado aqui por referência em sua totalidade: Uma cópia em formato legível por computador da Listagem de Sequências (nome do arquivo: BID-005PC1_ST25.txt; data de criação: 14 de março de 2019; tamanho do arquivo: 323.976 bytes)
FUNDAMENTOS
[0004] MicroRNAs (miRNA ou miR) são moléculas de ácido nucleico que regulam a expressão de genes alvo. MiRNAs são tipicamente curtos (tipicamente 18-24 nucleotídeos) e agem como repressores de mRNAs alvo, promovendo sua degradação, quando suas sequências são perfeitamente complementares, e/ou inibindo a tradução, quando suas sequências contêm incompatibilidades. As análises funcionais de miRNAs revelaram que esses pequenos RNAs não codificantes contribuem para diferentes processos fisiológicos e metabólicos, incluindo genes reguladores associados a distúrbios metabólicos. Os distúrbios metabólicos são caracterizados por uma ou mais anormalidades na função metabólica do corpo. Os distúrbios metabólicos também são caracterizados por obesidade e ganho de peso, deficiência na produção de insulina ou deficiência na sensibilidade à insulina. Alguns distúrbios metabólicos estão relacionados a defeitos no uso da glicose no sangue pelo corpo, resultando em níveis anormalmente elevados de glicose no sangue. Os distúrbios metabólicos afetam milhões de pessoas em todo o mundo e podem ser fatais. Com o aumento da incidência de obesidade nos Estados Unidos, há uma necessidade crítica de desenvolver terapias mais eficazes para reduzir os riscos à saúde e aliviar os sintomas associados à obesidade, alimentação excessiva, ganho excessivo de peso corporal ou acúmulo excessivo de gordura. Como tal, existe a necessidade de métodos e composições para tratar, prevenir ou retardar o aparecimento de distúrbios metabólicos.
SUMÁRIO
[0005] A presente divulgação fornece novos métodos para o tratamento ou prevenção de distúrbios metabólicos pela administração de agentes que modulam a atividade ou expressão de microRNAs, por exemplo, inibindo a expressão e/ou atividade de microRNAs. Tal inibição pode ser mediada por oligonucleotídeos quimicamente modificados de sequência específica, incluindo, por exemplo, ácido nucleico bloqueado (LNA). Os inibidores baseados na tecnologia de LNA, entre outros, quando dirigidos aos miRNAs que regulam o gene metabólico aqui divulgados, fornecem um método eficaz de tratamento ou prevenção de distúrbios metabólicos.
[0006] Em um aspecto, a presente divulgação fornece um método para tratar ou prevenir um distúrbio metabólico, compreendendo administrar uma quantidade eficaz de um inibidor de miR-22 a um sujeito em necessidade do mesmo.
[0007] Em algumas modalidades, a expressão e/ou atividade de miR-22 é reduzida no sujeito após a administração do inibidor.
[0008] Em algumas modalidades, o inibidor de miR-22 é um inibidor à base de oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, o inibidor à base de oligonucleotídeo compreende uma sequência que é pelo menos cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99% ou cerca de 100%
complementar a uma sequência madura de miR-22. Em algumas modalidades, o inibidor à base de oligonucleotídeo compreende desoxinucleotídeos ou ribonucleotídeos. Em algumas modalidades, o inibidor à base de oligonucleotídeo é de fita simples. Em algumas modalidades, em que o inibidor à base de oligonucleotídeo é de fita dupla.
[0009] Em algumas modalidades, o inibidor à base de oligonucleotídeo compreende um ou mais nucleotídeos modificados quimicamente.
[0010] Em algumas modalidades, os nucleotídeos modificados quimicamente são nucleotídeos bloqueados (LNAs).
[0011] Em algumas modalidades, o inibidor à base de oligonucleotídeo compreende cerca de 25, cerca de 20, cerca de 15, cerca de 10, cerca de 9, cerca de 8, cerca de 7, cerca de 6 ou cerca de 5 ou menos nucleotídeos. Em algumas modalidades, o inibidor à base de oligonucleotídeo é conjugado a uma ou mais frações N-acetilgalactosamina (GalNAc).
[0012] Em algumas modalidades, o inibidor à base de oligonucleotídeo é um inibidor de oligonucleotídeo antissentido. Em algumas modalidades, o inibidor à base de oligonucleotídeo é um pequeno RNA interferente (siRNA). Em algumas modalidades, o inibidor à base de oligonucleotídeo é um aptâmero.
[0013] Em algumas modalidades, o inibidor de miR-22 é um inibidor à base de peptídeo ou à base de proteína. Em algumas modalidades, o inibidor à base de proteína em um anticorpo ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo. Em algumas modalidades, o inibidor de miR-22 é um inibidor baseado em molécula pequena.
[0014] Em algumas modalidades, o distúrbio metabólico é a obesidade.
[0015] Em algumas modalidades, o sujeito sofre de Síndrome de Prader-Willi.
[0016] Em algumas modalidades, o sujeito sofre de hipercolesterolemia.
[0017] Em algumas modalidades, o sujeito abriga uma variante de proteína associada a massa gorda e obesidade (FTO) e/ou mostra uma suprarregulação de expressão e/ou atividade de FTO.
[0018] Em algumas modalidades, o sujeito é obeso e tem um índice de massa corporal superior a cerca de 30. Em algumas modalidades, o sujeito está acima do peso e tem um índice de massa corporal de cerca de 25- 29,9.
[0019] Em algumas modalidades, o método induz perda de peso. Em algumas modalidades, o método induz uma perda de peso total de cerca de 1%, cerca de 5%, cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 20% ou cerca de 25% ou mais no sujeito. Em algumas modalidades, o método evita o ganho de peso.
[0020] Em algumas modalidades, o método reduz ou previne o crescimento do tecido adiposo. Em algumas modalidades, o método prejudica a diferenciação de adipócitos.
[0021] Em algumas modalidades, o distúrbio metabólico é uma doença hepática gordurosa. Em algumas modalidades, a doença hepática gordurosa é selecionada de doença hepática com ácido graxo não alcoólico (NAFLD) ou esteato-hepatite não alcoólica (NASH). Em algumas modalidades, o método reduz ou previne a esteatose hepática.
[0022] Em algumas modalidades, o método reduz ou evita a fibrose hepática.
[0023] Em algumas modalidades, o método reduz a atividade e/ou expressão de FTO, ALKB Homólogo 5 (ALKBH5), CCAAT/intensificador de ligação de proteína de alfa (CEBP), receptor gama ativado por proliferador de peroxissoma (PPAR) e/ou ATP citrato liase (ACLY).
[0024] Em algumas modalidades, o método aumenta a atividade e/ou expressão de fosfatase e homólogo de tensina (PTEN) e/ou tet metilcitosina dioxigenase 2 (TET2).
[0025] Em algumas modalidades, o método altera a atividade e/ou expressão do coativador-α de PPAR (PGC1-α), Proteína Específica 1 (SP1), Fator de Crescimento de Fibroblastos 21 (FGF-21), Proteína Não Acoplada 1 (UCP1), Transcrito Incluído de Danos de DNA 4 (DDIT-4, REDD1), proteína tumoral p63 (TP63), fator de crescimento de fibroblastos 1 (FGF1) e/ou semelhante à Metiltransferase 3 (METTL3). Em algumas modalidades, o método altera o nível de metilação do DNA ou RNA, ou afeta o nível de m6A no nível do RNA.
[0026] Qualquer aspecto ou modalidade aqui descrita pode ser combinada com qualquer outro aspecto ou modalidade, como aqui divulgado.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0027] O arquivo de pedido ou patente contém pelo menos uma figura executada em cor. Cópias dessa patente ou publicação de pedido de patente com figuras coloridas serão providas pelo Escritório mediante solicitação e pagamento da taxa necessária.
[0028] A Figura 1A-C são esquemas que mostram o perfil de regulação de miR-22. A Figura 1A é um esquema que mostra a posição de miR-22 no 3º éxon no transcrito não codificante MGC14376. A Figura 1B mostra miRNAs de direcionamento de PTEN e a Figura 1C mostra que miR-22 direciona diretamente PTEN e TET para promover a tumorigênese e metástase.
[0029] As Figuras 2A-D mostram que a superexpressão de miR- 22 afeta o peso dos camundongos. A Figura 2A é uma imagem que mostra o regime de alimentação de camundongos de Tipo Selvagem (WT) e Transgênicos (Tg). A Figura 2B é uma coloração imuno-histoquímica de fígado WT e fígado de camundongo miR-22 Tg. A Figura 2C é um gráfico que mostra o peso médio de WT versus camundongos Tg miR-22 e a Figura 2D é um gráfico de barras que mostra o peso médio da colônia de camundongos WT e miR-22 T. Esses dados indicam que a superexpressão de miR-22 afeta o peso dos camundongos. Os dados nas barras direitas (vermelhas) em cada par de dados são para os camundongos miR-2 Tg.
[0030] As Figuras 3A-C são um par de gráficos de barras e um gráfico de linha mostrando que camundongos nulos miR-22 não conseguem ganhar peso com Dieta Rica em Gordura (HFD). A Figura 3A mostra a porcentagem de aumento de massa corporal em toda a colônia após 2 semanas na HFD e a Figura 3B mostra a porcentagem de aumento de massa corporal em toda a colônia após 4 semanas na HFD. A Figura 3C mostra a mudança em gramas de KO vs WT da semana 1 a 8 desde o início da HFD.
[0031] As Figura 4A-F são uma série de gráficos de barras que mostram que os camundongos nulos miR-22 não conseguem ganhar peso em HFD. A Figura 4A mostra a porcentagem de aumento da massa corporal em camundongos fêmeas após 2 semanas na HFD. A Figura 4B mostra a porcentagem de aumento da massa corporal em camundongos fêmeas após 4 semanas na HFD. A Figura 4C mostra a porcentagem de aumento da massa corporal em camundongos fêmeas após 8 semanas na HFD. A Figura 4D mostra a mudança em gramas em camundongos KO vs WT após 2 semanas. A Figura 4E mostra a mudança em gramas em camundongos KO vs WT após 4 semanas. A Figura 4F mostra a mudança em gramas em camundongos KO vs WT após 8 semanas.
[0032] A Figura 5A-D são uma série de gráficos que mostram que os camundongos nulos miR-22 mostram um metabolismo diferente em comparação com WT quando alimentados com HFD. A Figura 5A mostra a porcentagem de gordura e massa magra (Figura 5B), (% da massa corporal total) de camundongos miR-22 KO e WT antes (dia 0) e após 8 semanas em HFD. A coorte miR-22 KO tem uma massa de gordura inferior estatisticamente significativa em comparação com WT após 8 semanas em HFD. A massa magra na coorte miR-22 KO não é afetada por HFD, ao contrário da coorte WT superior que aumenta a % de massa gorda e diminui a % de massa magra após HFD. As Figuras 5C e 5D mostram uma série de parâmetros coletados em gaiolas metabólicas. No estado estacionário, ambos os camundongos miR- 22KO e WT têm o mesmo metabolismo. Uma vez que os camundongos são desafiados com HFD miR-22KO, a coorte é capaz de não reduzir seu gasto de energia, enquanto a coorte WT o faz. Tanto o VCO2 quanto o VO2 são significativamente maiores na coorte miR-22KO em comparação com o WT, mesmo se os camundongos KO forem menos ativos do que o WT. Os dados nas barras à direita (vermelhas) em cada gráfico de barras das Figuras 5C e 5D são para os camundongos com miR-22KO.
[0033] A Figura 6 é um gráfico de barras que mostra nenhuma diferença entre a coorte WT e KO no consumo de alimentos (HFD).
[0034] A Figura 7A-B é um gráfico de barras e coloração Oil-Red- O mostrando que a infrarregulação de miR-22 prejudica a capacidade de Fibroblastos Embrionários de Camundongo (MEF) de se diferenciar em adipócitos. A Figura 7A é um gráfico de barras que mostra a diferenciação de adipócitos em MEFs, indicando que miR-22-/- MEFs mostra 27% menos adipócitos do que WT. A Figura 7B é uma coloração Oil-Red-O mostrando MEF de WT, miR-22+/- e miR-22-/-, cultivado em meio Adipo-diferencial por 5 dias.
[0035] A Figura 8 mostra o projeto do LNA anti-miR-22.
[0036] A Figura 9 é um gráfico que mostra o planejamento experimental in vivo e as condições para camundongos miR-22 -/- e WT em HFD após transfecção de Veículo (VCH), RNA de Controle de Embaralhamento (SCR) e Ácido Nucleico Boqueado (LNA).
[0037] A Figura 10 é um gráfico de barras que mostra que não há diferença entre camundongos tratados e não tratados no consumo de alimentos para (∆) Veículo, (◊) SCR, (□) anti-miR-22.
[0038] A Figura 11A-B são gráficos de linha que mostram uma inibição farmacológica in vivo de miR-22 evita que os camundongos se tornem obesos. A Figura 11A mostra o aumento percentual final do corpo. A Figura 11B mostra o silenciamento in vivo de miR-22 em camundongos DIO. Em ambas as figuras, nos pontos de tempo finais, a ordem dos dados indo de cima para baixo é Veículo (em verde), SCR (em vermelho) e anti-miR-22 (em azul).
[0039] A Figura 12 é um western blot que mostra que a terapia anti-miR-22 in vivo é capaz de aumentar o nível de proteína dos principais alvos de miR-22 no fígado.
[0040] A Figura 13A-B é uma série de gráficos de barras (Figura 13A) e coloração imuno-histoquímica (Figura 13B), mostrando que o tratamento com anti-miR-22 não afeta a composição lipídica do fígado, mas suprime profundamente a esteatose hepática.
[0041] A Figura 14A-B é uma série de gráficos de barras que mostram o nível relativo de mRNA no fígado de camundongos tratados com VHL, SCR LNA ou LNA anti-miR-22. A Figura 14A mostra a expressão de mRNA de TET2 e PTEN. A Figura 14B mostra a expressão de mRNA de FTO, FTO e CEBPa.
[0042] A Figura 15A-C é uma série de gráficos de barras que mostram o nível relativo de mRNA em tecido adiposo marrom (BAT) de camundongos tratados com VHL, SCR LNA ou LNA anti-miR-22. A Figura 15A mostra a expressão de mRNA de TET2 e PTEN. A Figura 15B mostra a expressão de mRNA de FTO, CEBPa e PPARg e a Figura 15C mostra a expressão de mRNA de UCP1 e CD36.
[0043] A Figura 16A-C é uma série de gráficos de barras que mostram os níveis relativos de mRNA em tecido adiposo branco (WAT) de camundongos tratados com VHL, SCR LNA ou LNA anti-miR-22. A Figura 16A são gráficos de barras que mostram os níveis de expressão de mRNA de TET2 e PTEN. A Figura 16B são gráficos de barras que mostram os níveis de expressão de mRNA de FTO, CEBPa e PPARg e a Figura 16C são gráficos de barras que mostram os níveis de expressão de UCP1 e CD36.
[0044] A Figura 17 é uma ilustração de uma abordagem curativa que mostra camundongos miR-22 -/- e WT em uma HFD tratados com um anti- miR-22-LNA, SCR e um VHL e colocados em um segundo regime de HFD.
[0045] A Figura 18 é um gráfico de linha que mostra os resultados da abordagem curativa em que há uma redução significativa no peso corporal em camundongos já obesos e alimentados com uma HFD. Após 3 meses e meio de tratamento, uma redução significativa no peso corporal foi observada em camundongos obesos (peso médio >40 g) e alimentados com HFD. Os camundongos foram sacrificados, tiveram o tecido coletado, RNA de fígados usado para RNAseq.
[0046] A Figura 19A-C são três imagens que mostram que a inibição farmacológica do miR-22 reverte o fenótipo obeso em camundongos. A Figura 19A mostra a almofada de gordura de camundongos tratados com VHL, a Figura 19B mostra a almofada de gordura de camundongos tratados com anti-miR-22 e a Figura 19C mostra a almofada de gordura de camundongos tratados com SCR.
[0047] A Figura 20 é um gráfico de RNA-seq que mostra a análise de agrupamento de hierarquia do fígado de camundongos indicando que a inibição farmacológica do miR-22 e o Knockout genético (KO) se agrupam, indicando que o tratamento está no alvo e que o fenótipo KO pode ser imitado usando o construto LNA.
[0048] A Figura 21 é um gráfico de RNA-Seq que mostra a análise da ontologia do gene no fígado de camundongos, indicando que a via infrarregulada em camundongos tratados com KO e LNA está relacionada ao metabolismo de lipídeos e à biossíntese.
[0049] A Figura 22 é um western blot que mostra que a terapia com anti-miR-22 in-vivo infrarregula fortemente a ATP-citrato lisase (ACL). A terapia anti-miR-22 in vivo infrarregula fortemente a ACL.
[0050] A Figura 23 é uma coloração Oil-Red-O que mostra que a inibição farmacológica de miR-22 é eficaz em impedir a diferenciação adipocítica de MEFs.
[0051] A Figura 24 é uma coloração Oil-Red O (Figura 24A) e um gráfico de barras (Figura 24B) mostrando que o tratamento anti-miR-22 em células mesenquimais primárias humanas cultivadas em meio de diferenciação Adipo por 2 semanas com ou sem LNA anti-miR- 22 Captação não assistida 500nM (LNAs adicionados a cada 2 dias). Na Figura 24B, os dados nas barras direitas (vermelhas) em cada gráfico de barras são para as células tratadas com LNA #10.
[0052] A Figura 25 é um gráfico de barras que mostra que a inibição farmacológica de miR-22 é eficaz em impedir a diferenciação adipocítica de MEFs. A ordem dos dados nos gráficos de barras, ao ler da esquerda para a direita, corresponde à legenda (à direita do gráfico) ao ler de cima para baixo.
[0053] Figura 26 Representação esquemática da rede metabólica que é orquestrada pelo miR-22. miR-22 pode ter como alvo múltiplos jogadores metabólicos (direta ou indiretamente) ao mesmo tempo.
[0054] A Figura 27A-B mostra que a expressão da massa de gordura e da proteína associada à obesidade (FTO) é profundamente infrarregulada durante a diferenciação induzida por gordura em MEF deficiente em miR-22, mas não em MEF WT. A Figura 27A é uma representação do gene FTO e a Figura 27B é um gráfico de barras que mostra o nível de expressão de mRNA de FTO em estado estacionário e condições de meio de diferenciação. Na Figura 27B, a ordem dos dados nos gráficos de barras, lendo da esquerda para a direita, é WT (em preto), miR-22+/- (em cinza) e miR-22-/- (em azul).
[0055] A Figura 28A-D mostra que a infrarregulação de miR-22 (genética ou farmacológica) aumenta o nível de RNA m6A. A Figura 28A mostra a reação química. A Figura 28B, a Figura 28C e a Figura 28D são gráficos de barras que mostram a porcentagem e a quantidade relativa de níveis de m6A em camundongos em uma HFD.
[0056] A Figura 29 é uma série de imagens imuno-histoquímicas que mostram que a depleção genética de miR-22 não afeta a função hepática em camundongos de 2 meses; n=8.
[0057] A Figura 30 é uma série de imagens imuno-histoquímicas que mostram que a depleção genética de miR-22 não afeta a função hepática e que os camundongos miR-22 KO não apresentam nenhuma doença ou disfunção hepática na velhice.
[0058] A Figura 31 é uma série de imagens imuno-histoquímicas que mostram que o tratamento com anti-miR-22 LNA previne a esteatose hepática em camundongos obesos induzidos por dieta. As imagens têm ampliação de 10x.
[0059] A Figura 32 é uma série de imagens imuno-histoquímicas que mostram os efeitos da Superexpressão e Subexpressão de miR-22 na fibrose hepática.
[0060] A Figura 33A-C mostra que a superexpressão de miR-22 afeta a alimentação da função hepática com ração normal: Fígado gorduroso e fibrose em camundongos WT (Figura 33A) e camundongos miR-22 Tg (Figura 33B). A Figura 33C mostra células FSP-1 positivas no fígado de camundongo em uma dieta normal em camundongos WT e miR-22 Tg.
[0061] A Figura 34A-C mostra que a superexpressão de miR-22 afeta a função hepática: fígado gorduroso e fibrose em camundongos WT (Figura 34A) e camundongos miR-22 +/- (Figura 34B). A Figura 34C mostra as células FSP-1 positivas no fígado de camundongo em um HFD em camundongos WT e miR-22 +/-.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA DIVULGAÇÃO
[0062] A presente divulgação é baseada na descoberta de que miRNAs, incluindo miR-22, podem regular alvos que estão ligados a uma variedade de distúrbios metabólicos, incluindo Obesidade, Síndrome de Prader-Willi, Hipercolesterolemia, Doença Hepática Gordurosa, Doença Hepática Não-Gordurosa (NAFLD) e/ou esteato-hepatite não alcoólica (NASH).
[0063] A presente divulgação inclui direcionar miRNAs, incluindo miR-22, com vários inibidores para o tratamento e/ou prevenção de doenças cuja causa pode ser influenciada pela modulação do metabolismo, por exemplo, distúrbios metabólicos, incluindo Obesidade, Síndrome de Prader-
Willi, Hipercolesterolemia, NAFLD e/ou NASH.
[0064] MiR-22 diretamente direciona fosfatase e homólogo de tensina (PTEN) e tet metilcitosina dioxigenase (TET) para promover tumorigênese, metástase e distúrbios metabólicos. Mais de 60 miRNAs direcionados a PTEN e não menos que 30 novos loci genéticos proto- oncogênicos são estudados no câncer humano. Os miRNAs direcionados a PTEN são altamente conservados evolutivamente entre os vertebrados e expressos de forma ubíqua em vários tecidos (Lagos-Quintana et al., 2001, 2002; Neely et al., 2006). Ao direcionar PTEN, miR-22 permanece metabolicamente relevante, pois a redução de PTEN ou sua elevação desencadeia um estado metabólico Warburg ou anti-Warburg, respectivamente. Em algumas modalidades, os genes de direcionamento miR- 22 regulam o metabolismo e a oxidação ou biogênese de ácidos graxos.
[0065] Em um aspecto, os métodos da presente divulgação fornece um método para tratar ou prevenir um distúrbio metabólico, compreendendo administrar uma quantidade eficaz de um inibidor de miR-22 a um sujeito em necessidade do mesmo.
[0066] Por exemplo, tal inibição pode ser mediada por oligonucleotídeos quimicamente modificados de sequência específica. Uma modificação exemplificativa é um ácido nucleico bloqueado (LNA) em que a fração ribose do ácido nucleico é modificada com uma ponte extra conectando o oxigênio 2' e o carbono 4', que bloqueia a ribose na conformação 3'-endo. Os inibidores de LNA, entre outros, quando dirigidos aos miRNAs reguladores de genes do metabolismo divulgados neste documento, fornecem agentes de baixo custo que podem ser administrados de forma eficiente e possuem biodisponibilidade suficiente para o tratamento e prevenção de vários distúrbios metabólicos.
[0067] A presente divulgação fornece ainda o uso de quaisquer métodos ou combinações aqui descritos na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença. Tais doenças incluem, por exemplo,
distúrbios metabólicos ou uma doença influenciada pela modulação do metabolismo (por exemplo, metabolismo relacionado à gordura e via de síntese).
[0068] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, miRNAs, incluindo miR-22, regulam o metabolismo relacionado à gordura e os alvos e/ou genes da via de síntese. Em algumas modalidades, o metabolismo relacionado à gordura e os genes de síntese incluem proteína associada a massa gorda e obesidade (FTO), CCAAT/proteína de ligação de intensificador alfa (CEBPa), receptor gama ativado por proliferador de peroxissoma (PPARg), fosfatase e homólogo de tensina (PTEN), tet metilcitosina dioxigenase 2 (TET2), ATP citrato liase (ACLY), proteína morfogenética óssea 7 (BMP-7) e/ou sirtuína 1 (SIRT-1).
[0069] Em algumas modalidades, os genes de metabolismo relacionado à gordura e síntese incluem FTO. Em algumas modalidades, o método reduz a atividade e/ou expressão de proteína associada à massa gorda e obesidade (FTO), CEBPe/ou PPAR.
[0070] Em algumas modalidades, o método reduz a atividade e/ou expressão de ALKB Homólogo 5 (ALKBH5). Em algumas modalidades, o método aumenta a atividade e/ou expressão de PTEN e/ou TET2.
[0071] Em algumas modalidades, o método altera a atividade e/ou expressão do coativador-α de PPAR (PGC1-α), Proteína Específica 1 (SP1), Fator de Crescimento de Fibroblastos 21 (FGF-21), Proteína Não Acoplada 1 (UCP1), Transcrito Incluído de Danos de DNA 4 (DDIT-4, REDD1), semelhante à Metiltransferase 3 (METTL3), proteína tumoral p63 (TP63) e/ou fator de crescimento de fibroblastos 1 (FGF1).
[0072] Em algumas modalidades, o método altera o nível de metilação do DNA ou RNA, ou afeta o nível de m6A no nível do RNA.
[0073] Em algumas modalidades, a presente divulgação trata ou previne distúrbios metabólicos (a título de exemplo não limitativo, Obesidade,
Síndrome de Prader-Willi, Hipercolesterolemia, Doença Hepática Gordurosa, NAFLD e/ou NASH) em um sujeito por meio da inibição de um miRNA. MiRNAs são moléculas curtas de ácido nucleico que são capazes de regular a expressão de genes-alvo. Ver revisão por Carrington et al., Science, Vol. 301(5631):336-338, 2003. MiRNAs têm frequentemente entre cerca de 18 a 24 nucleotídeos de comprimento. Os miRNAs atuam como repressores dos mRNAs alvo, promovendo sua degradação, quando suas sequências são perfeitamente complementares, e/ou inibindo a tradução, quando suas sequências contêm incompatibilidades.
[0074] Sem estar limitado pela teoria, acredita-se que miRNAs maduros sejam gerados por pol II ou pol III e surjam de transcritos iniciais denominados pri-miRNAs. Esses pri-miRNAs têm frequentemente vários milhares de bases de comprimento e, portanto, são processados para fazer miRNAs maduros muito mais curtos. Esses pri-miRNAs podem ser multicistrônicos e resultar da transcrição de várias sequências agrupadas que organizam o que pode se desenvolver em muitos miRNAs. O processamento para produzir miRNAs pode ser feito em duas etapas. Em primeiro lugar, os pri- miRNAs podem ser processados no núcleo pela RNase Drosha em precursores em forma de hairpin de cerca de 70 a cerca de 100 nucleotídeos (pré-miRNAs). Em segundo lugar, após a transposição para o citoplasma, os pré-miRNAs em hairpin podem ser posteriormente processados pelo RNase Dicer para produzir um miRNA de fita dupla. A fita de miRNA madura pode então ser incorporada no complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC), onde pode se associar com seus mRNAs alvo por complementaridade de pares de bases e levar à supressão da expressão da proteína. A outra fita do duplex de miRNA que não é preferencialmente selecionada para entrada em um complexo de silenciamento RISC é conhecida como fita passageira ou miRNA menor ou fita estrela (*). Esta fita pode ser degradada. Entende-se que, a menos que especificado, como utilizado neste documento, um miRNA pode se referir à fita primária e/ou pré e/ou madura e/ou menor (estrela) e/ou versão duplex de miRNA.
[0075] Em algumas modalidades, os genes de miRNA podem estar localizados dentro de íntrons de genes que codificam proteínas ou dentro de íntrons ou éxons de unidades de transcrição não codificantes. A expressão de miRNAs intrônicos pode coincidir com a das unidades de transcrição hospedeiras porque eles são tipicamente orientados na mesma direção e são expressos de forma coordenada com os pré-mRNAs em que residem.
[0076] Em algumas modalidades, os miRNAs podem se ligar a sequências dentro da região 3' não traduzida (3'UTR) dos transcritos do gene alvo. Em algumas modalidades, os miRNAs podem se ligar a sequências fora do 3'UTR dos transcritos do gene alvo. Em algumas modalidades, os miRNAs podem se ligar tanto dentro quanto fora da 3'UTR dos transcritos do gene alvo.
[0077] Em algumas modalidades, o emparelhamento de nucleotídeos entre o segundo e o sétimo nucleotídeos do miRNA (a sequência de semente de miRNA) e a sequência correspondente ao longo da 3'UTR alvo (correspondência de semente) pode ocorrer para o reconhecimento do alvo. Por conseguinte, a ligação entre miRNA e alvo pode compreender um par de bases de cerca de 5 nucleotídeos. Além disso, a ligação entre o miRNA e o alvo pode compreender mais do que um par de bases de 5 nucleotídeos. Em algumas modalidades, a ligação entre um miRNA e o gene que ele regula pode ser mediada pela ligação do miRNA em até 2, até 4, até 6, até 8 ou até 10 sítios do ácido nucleico alvo.
[0078] MiRNAs da presente divulgação podem regular ácidos nucleicos, incluindo, mas não se limitando a genes metabólicos críticos, como genes de um marcador ligado a uma etiologia de distúrbio metabólico, por ligação direta. Esta ligação pode ser perfeitamente complementar ao ácido nucleico alvo ou conter incompatibilidades. O efeito desta ligação pode ser o de promover a degradação e/ou inibir a tradução do alvo.
[0079] Em algumas modalidades, a presente invenção trata ou previne distúrbios metabólicos em um sujeito por meio da inibição de miRNAs,
como miR-22. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica mir-22 compreende ou consiste em AAGCUGCCAGUUGAAGAACUGU (SEQ ID NO: 1).
[0080] O precursor em hairpin de miR-22 previsto está contido inteiramente no éxon 2 de um transcrito não codificante, Cl7orf91, e o padrão de emenda é geralmente conservado em humanos e camundongos, apesar da falta de potencial de codificação de proteínas. Ver Rodriguez et al., Identification of mammalian microRNA host genes and transcription units. Genome Res. 2004 Oct;14(10A):1902-10. A deleção do éxon 2 de C17orf91 englobando mir-22 em modelos de camundongos revelou que miR-22 pode desempenhar um papel na hipertrofia cardíaca e remodelação ao direcionar SIRT1 (deacetilase sirtuína-1 dependente de NAD), HDAC4 (histona desacetilase 4), PURB (proteína B de ligação ao elemento rico em purinas) e PTEN. Ver Gurha et al., Targeted deletion of microRNA-22 promotes stress- induced cardiac dilation and contractile dysfunction. Circulation. 2012 Jun 5;125(22):2751-61; Huang et al., MicroRNA-22 regulates cardiac hypertrophy and remodeling in response to stress. Circ Res. 2013 Apr 26;112(9):1234-43.
[0081] Além disso, foi observado que AKT, um alvo a jusante de PTEN, ativou a transcrição de mir-22, sugerindo um laço regulatório na via de sinalização PI3K/AKT oncogênica. Ver Bar et al., miR-22 forms a regulatory loop in PTEN/AKT pathway and modulates signaling kinetics. PLoS One. 2010;5(5): e10859.
[0082] A presente invenção, em algumas modalidades, mostra que miR-22 pode funcionar como um modificador epigenético e promotor EMT, independentemente de sua capacidade de direcionar Pten. Em algumas modalidades, a presente divulgação inclui tratamento ou prevenção de distúrbio metabólico em um sujeito através da prevenção de um aumento e/ou causando uma diminuição na variante de proteína associada a massa gorda e obesidade (FTO) e/ou mostra uma infrarregulação de expressão e/ou atividade de FTO. FTO é uma enzima que em humanos é codificada pelo gene FTO localizado no cromossomo 16. Como um homólogo nas proteínas da família AlkB, é a primeira mRNA desmetilase que foi identificada. Certas variantes do gene FTO estão associadas à obesidade em humanos.
[0083] Em algumas modalidades, a sequência do inibidor é conservada entre as espécies. Em algumas modalidades, a sequência do inibidor é retirada, em parte, da sequência de um transcrito humano. Em algumas modalidades, o inibidor é selecionado para reduzir a expressão e/ou atividade do miRNA alvo, a título de exemplo não limitativo, miR-22, em um sujeito.
[0084] Em algumas modalidades, um inibidor de miRNA é um oligonucleotídeo antissentido. Os oligonucleotídeos antissentido podem incluir ribonucleotídeos ou desoxirribonucleotídeos ou uma combinação dos mesmos. Os oligonucleotídeos antissentido podem ter pelo menos uma modificação química (exemplos não limitativos são açúcar ou modificações de espinha dorsal).
[0085] Em algumas modalidades, a modificação química é um ou mais de um fosforotioato, 2'-0-Metil ou 2'-O-Metoxietil, unidade 2'-0-alquil-RNA, unidade 2'-OMe-RNA, unidade 2'-amino-DNA, unidade 2'-fluoro-DNA (incluindo, mas não se limitando a, um análogo de DNA com uma substituição por um flúor na posição 2' (2' F)), unidade LNA, unidade PNA, unidade HNA, unidade INA e uma unidade 2' MOE RNA.
[0086] Os oligonucleotídeos antissentido adequados podem ser constituídos por uma ou mais modificações conformacionalmente restritas ou bicíclicas de nucleosídeos de açúcar (BSN) que conferem estabilidade térmica aprimorada para complexos formados entre o oligonucleotídeo contendo BSN e sua fita alvo de miRNA complementar. Por exemplo, em uma modalidade, os oligonucleotídeos antissentido contêm pelo menos um ácido nucleico bloqueado. Os ácidos nucleicos bloqueados (LNAs) contêm um ribonucleosídeo 2'-0, 4'-C-metileno (estrutura A), em que a fração de açúcar da ribose está em uma conformação bloqueada. Em outra modalidade, os oligonucleotídeos antissentido contêm pelo menos um 2' desoxirribonucleosídeo em ponte 2', 4'-C (CDNA, estrutura B). Ver, por exemplo, Patente U.S. 6.403.566 e Wang et al., (1999) Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, Vol. 9: 1147-1150, ambos os quais são aqui incorporados por referência na sua totalidade. Em ainda outra modalidade, os oligonucleotídeos antissentido contêm pelo menos um nucleosídeo modificado com a estrutura mostrada na estrutura C. Os oligonucleotídeos antissentido direcionados a miRNAs que regulam o metabolismo relacionado à gordura e alvos da via de síntese podem conter combinações de BSN (LNA, CDNA e semelhantes) ou outros nucleotídeos modificados e ribonucleotídeos ou desoxirribonucleotídeos. A. B. C.
[0087] Alternativamente, os oligonucleotídeos antissentido podem compreender ácidos nucleicos de peptídeo (PNAs), que contêm uma espinha dorsal baseada em peptídeo em vez de uma espinha dorsal de açúcar-fosfato. Outras modificações modificadas de açúcar ou fosfodiéster para o oligonucleotídeo antissentido também são contempladas. A título de exemplos não limitativos, outras modificações químicas podem incluir modificações 2'-o- alquil (por exemplo, 2'-0-metil, 2'-o-metoxietil), 2'-fluoro e 4'-tio, e modificações da espinha dorsal, tais como uma ou mais ligações fosforotioato, morfolino ou fosfonocarboxilato (ver, por exemplo, Patentes U.S. 6.693.187 e 7.067.641, que são aqui incorporadas por referência em sua totalidade). Em uma modalidade, os oligonucleotídeos antissentido direcionados a miRNAs oncogênicos contêm modificações de açúcar 2'-0-metil em cada base e estão ligados por ligações fosforotioato. Os oligonucleotídeos antissentido, particularmente aqueles de comprimentos mais curtos (por exemplo, menos de 16 nucleotídeos, 7-8 nucleotídeos) podem compreender uma ou mais modificações de aumento de afinidade, tais como, mas não se limitando a, LNAs, nucleosídeos bicíclicos, fosfonoformatos, modificações 2'o-alquil e semelhantes. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos antissentido adequados são gapmers 2'-0- metoxietil que contêm ribonucleotídeos modificados com 2'-O-metoxietil em ambas as extremidades 5' e 3' com pelo menos dez desoxirribonucleotídeos no centro. Esses gapmers são capazes de desencadear mecanismos de degradação de alvos de RNA dependentes de RNase H. Outras modificações de oligonucleotídeos antissentido para aumentar a estabilidade e melhorar a eficácia, tais como aquelas descritas na Patente U.S. 6.838.283, que é aqui incorporada por referência em sua totalidade, são conhecidas na técnica e são adequadas para uso nos métodos da invenção. Por exemplo, e não pretendendo ser limitativo, para facilitar a distribuição e estabilidade in vivo, o oligonucleotídeo antissentido pode ser ligado a um esteroide, tal como uma porção de colesterol, uma vitamina, um ácido graxo, um carboidrato ou glicosídeo, um peptídeo ou outro ligando de molécula pequena em sua extremidade 3'.
[0088] Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos antissentido úteis para inibir a atividade de miRNAs, incluindo, por exemplo, miR-22, têm cerca de 5 a cerca de 25 nucleotídeos de comprimento, cerca de 10 a cerca de 30 nucleotídeos de comprimento ou cerca de 20 a cerca de 25 nucleotídeos de comprimento. Em certas modalidades, os oligonucleotídeos antissentido direcionados a miRNAs oncogênicos têm cerca de 8 a cerca de 18 nucleotídeos de comprimento, em outras modalidades cerca de 12 a cerca de 16 nucleotídeos de comprimento e em outras modalidades cerca de 7 a cerca de 8 nucleotídeos de comprimento. Qualquer 7-mer ou mais complementar a um miRNA oncogênico pode ser usado, ou seja, qualquer anti-miR complementar à extremidade 5' do miRNA e progredindo em toda a sequência complementar do miRNA. A título de exemplo não limitativo, os oligonucleotídeos antissentido que direcionam miRNAs oncogênicos, incluindo, por exemplo, miR-22, são cerca de 5, ou cerca de 6, ou cerca de 7, ou cerca de 8, ou cerca de 9, ou cerca de 10, ou cerca de 11 ou cerca de 12 ou cerca de 13 ou cerca de 14 ou cerca de 15 ou cerca de 16 ou cerca de 17 ou cerca de 18 ou cerca de 19 ou cerca de 20 ou cerca de 21 ou cerca de 22 ou cerca de 23 ou cerca de 24 ou cerca de 25, ou cerca de 26, ou cerca de 27, ou cerca de 28, ou cerca de 29, ou cerca de 30 nucleotídeos de comprimento.
[0089] Os oligonucleotídeos antissentido podem compreender uma sequência que é pelo menos parcialmente complementar a uma sequência de miRNA oncogênico madura ou secundária (ou seja, estrela), por exemplo, pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% complementar a uma sequência de miRNA oncogênico madura ou secundária (ou seja, estrela). Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo antissentido pode ser substancialmente complementar a uma sequência de miRNA oncogênico madura ou menor, que é pelo menos cerca de 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% complementar a uma sequência polinucleotídica alvo. Em uma modalidade, o oligonucleotídeo antissentido compreende uma sequência que é 100% complementar a uma sequência de miRNA oncogênico madura ou secundária.
[0090] Como usado neste documento, substancialmente complementar refere-se a uma sequência que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% complementar a uma sequência polinucleotídica alvo (exemplos não limitativos são miRNA precursor maduro, menor, ou sequência pri-miRNA de, por exemplo, miR-22).
[0091] Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos antissentido são antagomirs. Os antagomirs são ribonucleotídeos quimicamente modificados de fita simples que são pelo menos parcialmente complementares aos miRNAs e, portanto, podem silenciá-los. Ver, por exemplo, Kriitzfeldt, et al., Nature (2005) 438 (7068): 685-9. Os antagomirs podem compreender um ou mais nucleotídeos modificados, tais como modificações 2'-0-metil-açúcar. Em algumas modalidades, os antagomirs compreendem apenas nucleotídeos modificados. Os antagomirs também podem compreender uma ou mais ligações fosforotioato, resultando em uma espinha dorsal de fosforotioato parcial ou total. Para facilitar a distribuição e estabilidade in vivo, o antagomir pode ser ligado a um colesterol ou outra porção em sua extremidade 3'. Os antagomirs adequados para inibir podem ter cerca de 15 a cerca de 50 nucleotídeos de comprimento, cerca de 18 a cerca de 30 nucleotídeos de comprimento e cerca de 20 a cerca de 25 nucleotídeos de comprimento. Os antagomirs podem ser pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% complementares a uma sequência de miRNA oncogênico madura ou menor. Em algumas modalidades, o antagomir pode ser substancialmente complementar a uma sequência de miRNA oncogênico madura ou menor, que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% complementar a uma sequência polinucleotídica alvo. Em outras modalidades, os antagomirs são 100% complementares a uma sequência de miRNA oncogênico madura ou secundária.
[0092] Os oligonucleotídeos antissentido ou antagomirs podem compreender uma sequência que é substancialmente complementar a uma sequência de miRNA precursor (pré-miRNA) ou sequência de miRNA primária (pri-miRNA) de um miRNA oncogênico. Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo antissentido compreende uma sequência que está localizada fora da região 3' não traduzida de um alvo desse miRNA. Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo antissentido compreende uma sequência que está localizada dentro da região 3' não traduzida de um alvo desse miRNA.
[0093] Qualquer dos inibidores ou agonistas dos miRNAs oncogênicos descritos neste documento, incluindo, mas não se limitando a miR-22, pode ser distribuído a uma célula alvo por meio da distribuição à célula de um vetor de expressão que codifica os inibidores ou agonistas de miRNA. Um vetor é uma composição de matéria que pode ser usada para distribuir um ácido nucleico de interesse ao interior de uma célula. Numerosos vetores são conhecidos na técnica, incluindo, mas não se limitando a, polinucleotídeos lineares, polinucleotídeos associados a compostos iônicos ou anfifílicos, plasmídeos e vírus. Assim, o termo vetor inclui um plasmídeo de replicação autônoma ou um vírus. Exemplos de vetores virais incluem, mas não estão limitados a, vetores adenovirais, vetores de vírus adeno-associados, vetores retrovirais e semelhantes. Um construto de expressão pode ser replicado em uma célula viva ou pode ser feito sinteticamente. Para os fins deste pedido, os termos construto de expressão, vetor de expressão e vetor são usados indistintamente para demonstrar a aplicação da invenção em um sentido ilustrativo geral e não se destinam a limitar a invenção.
[0094] Em uma modalidade, um vetor de expressão para expressar um inibidor de um miRNA oncogênico, por exemplo, miR-22, compreende um promotor operacionalmente ligado a um polinucleotídeo que codifica um oligonucleotídeo antissentido. A sequência do oligonucleotídeo antissentido expresso pode ser parcial ou perfeitamente complementar a uma sequência madura ou secundária de um miRNA oncogênico. A frase operacionalmente ligado ou sob controle da transcrição, como usado neste documento, significa que o promotor está na localização e orientação corretas em relação a um polinucleotídeo para controlar a iniciação da transcrição pela RNA polimerase e a expressão do polinucleotídeo.
[0095] Como usado neste documento, um promotor refere-se a uma sequência de DNA reconhecida pela maquinaria sintética da célula, ou maquinaria sintética introduzida, necessária para iniciar a transcrição específica de um gene. Os promotores adequados incluem, mas não estão limitados a, RNA pol I, pol II, pol III e promotores virais (por exemplo, promotor de gene precoce imediato do citomegalovírus humano (CMV), o promotor precoce SV40 e a repetição terminal longa do vírus do sarcoma de Rous).
[0096] Em certas modalidades, o promotor operacionalmente ligado a um polinucleotídeo que codifica um inibidor de miRNA ou um polinucleotídeo que codifica um gene do metabolismo que regula miRNA e/ou genes de direcionamento de miRNA de marcadores ligados a etiologias metabólicas pode ser um promotor indutível. Os promotores induzíveis são conhecidos na técnica e incluem, mas não estão limitados a, o promotor da tetraciclina, o promotor da metalotioneína IIA, o promotor do choque térmico, os elementos de resposta de esteroide/hormônio tireoidiano/ácido retinoico, o promotor tardio de adenovírus e o vírus induzível de tumor mamário de camundongo LTR.
[0097] Métodos de distribuição de construtos de expressão e ácidos nucleicos para células são conhecidos na técnica e podem incluir, a título de exemplo não limitativo, coprecipitação de fosfato de cálcio, eletroporação, microinjeção, DEAE-dextrano, lipofecção, transfecção empregando reagentes de transfecção de poliamina, sonicação celular, bombardeio de genes usando microprojéteis de alta velocidade e transfecção mediada por receptor.
[0098] A presente invenção também inclui o sequestro ou a eliminação de inibidores de miRNAs oncogênicos após o tratamento. Os sequestrantes podem incluir ácidos nucleicos isolados que são complementares aos inibidores de miRNA ou vetores que os expressam. Portanto, eles podem se ligar a inibidores de miRNA ou vetores que os expressem e, ao fazer isso, impedir a ligação entre o miRNA e o alvo.
[0099] Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece um método de tratamento ou prevenção de um distúrbio metabólico em um sujeito em necessidade do mesmo. Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece um método de tratamento ou prevenção de distúrbio metabólico, incluindo Obesidade, Síndrome de Prader-Willi, Hipercolesterolemia, Doença Hepática Gordurosa, Doença Hepática Gordurosa Não Alcoólica (NAFLD) e/ou Esteato-Hepatite Não Alcoólica (NASH) em um sujeito. Distúrbios metabólicos
[00100] O termo "distúrbio metabólico", conforme usado no contexto desta invenção, refere-se a uma doença ou condição que é impactada pela presença, nível ou atividade do tecido adiposo marrom, concentração de glicose no plasma, nível de insulina no plasma e/ou teor de gordura corporal. Em algumas modalidades, o distúrbio ou condição metabólica também inclui, mas não está limitado a, síndrome metabólica, tolerância à glicose diminuída, concentrações elevadas de insulina no plasma e resistência à insulina, dislipidemia, hiperglicemia, hiperlipidemia, hipertensão, lipodistrofia, doença cardiovascular, problemas ou condições respiratórias. Os distúrbios metabólicos de particular interesse são Obesidade, Síndrome de Prader-Willi, Hipercolesterolemia, Doença Hepática Gordurosa, incluindo Doença Hepática Não Gordurosa (NAFLD) e/ou Esteato-hepatite Não Alcoólica (NASH). Obesidade
[00101] Em algumas modalidades, a presente divulgação se refere à obesidade. A obesidade é uma doença crônica altamente prevalente na sociedade moderna e associada não apenas a um estigma social, mas também à diminuição da expectativa de vida e a vários problemas médicos, incluindo diabetes mellitus, resistência à insulina, hipertensão, hipercolesterolemia, colelitíase, osteoartrite, lesão ortopédica, doença tromboembólica, câncer e doença cardíaca coronária. Rissanen et al., British Medical Journal, 301: 835- 837 (1990). Em algumas modalidades, a Obesidade pode ser calculada usando o índice de massa corporal (IMC: peso corporal por altura em metros quadrados). Em algumas modalidades, a obesidade é definida como um sujeito de outra forma saudável que tem um IMC maior ou igual a 30 kg/m2, ou uma condição em que um sujeito com pelo menos uma comorbidade tem um IMC maior ou igual a 27 kg/m2. Em algumas modalidades do método da divulgação, o sujeito é obeso e tem um índice de massa corporal superior a cerca de 30. Em algumas modalidades, o sujeito está acima do peso e tem um índice de massa corporal de cerca de 25-29,9. Em algumas modalidades, o método induz perda de peso. Em algumas modalidades, o método evita o ganho de peso. Em algumas modalidades, o método evita o crescimento do tecido adiposo e prejudica a diferenciação dos adipócitos.
[00102] Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece métodos de tratamento compreendendo administrar um inibidor de miR-22 (e compostos relacionados a miR-22) e/ou usos de miR-22 (e compostos relacionados a miR-22) no tratamento de, ou fabricação de um medicamento para obesidade e sobrepeso e condições relacionadas. Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece um método para tratar ou prevenir a obesidade, compreendendo administrar uma quantidade eficaz de miR-22 (e compostos relacionados à inibição de miR-22) a um paciente em necessidade do mesmo. Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece um método para gerenciamento de peso, compreendendo administrar uma quantidade eficaz de um inibidor de miR-22 (e compostos relacionados à inibição de miR- 22) para induzir perda de peso e/ou evitar ganho de peso em um paciente em necessidade do mesmo.
[00103] Em algumas modalidades, a presente divulgação se refere a um método para induzir perda de peso ou prevenir o ganho de peso (ou tratamento ou prevenção de obesidade ou indução de perda de peso ou prevenção de ganho de peso em um paciente que não altera substancialmente a ingestão calórica), compreendendo administrar uma quantidade eficaz de um inibidor de miR-22 (e compostos relacionados a miR-22) a um paciente que: realizou ou fará uma cirurgia do sistema digestivo; é maior do que cerca de 80- 100 libras acima do peso; tem um IMC superior a cerca de 35; ou tem um problema de saúde relacionado à obesidade.
[00104] Em algumas modalidades, a cirurgia do sistema digestivo é uma ou mais daquelas classificadas em ICD-9-CM: Operações no Sistema Digestivo e, portanto, pode incluir Operações no esôfago; Incisão e excisão do estômago; Outras operações no estômago; Incisão, excisão e anastomose do intestino; Outras operações no intestino; Operações no apêndice; Operações no reto, retossigmoide e tecido perirretal; Operações no ânus; Operações no fígado; Operações na vesícula biliar e trato biliar; Operações no pâncreas;
Reparação de hérnia; e Outras operações na região abdominal.
[00105] Em algumas modalidades, a cirurgia do sistema digestivo é uma ou mais de uma cirurgia restritiva e/ou procedimento de má absorção, incluindo, por exemplo, gastroplastia vertical com faixas (VBG, por exemplo, grampeamento do estômago); banda gástrica (por exemplo, LAP-BAND ou REALIZE); gastrectomia vertical; cirurgia de bypass gástrico (por exemplo, bypass gástrico em Y de Roux), desvio biliopancreático e uma cirurgia estética (por exemplo, lipoaspiração, como, por exemplo, lipoaspiração assistida por sucção (SAL); lipoaspiração assistida por ultrassom (UAL); lipoaspiração assistida (PAL); lipoaspiração com cânula dupla (assistida) (TCAL ou TCL); lipoaspiração externa assistida por ultrassom (XUAL ou EUAL); lipoaspiração assistida por água (WAL); lipoaspiração assistida por laser; lipoaspiração tumescente; e criolipólise).
[00106] Em algumas modalidades, o problema de saúde relacionado à obesidade é selecionado de doenças cardiovasculares (por exemplo, colesterol alto, hipercolesterolemia, HDL baixo, HDL alto, hipertensão, doença arterial coronariana, insuficiência cardíaca), apneia do sono (incluindo apneia obstrutiva do sono), osteoartrite, problemas de tireoide, demência, gota, asma, doença do refluxo gastroesofágico e insuficiência renal crônica. Em algumas modalidades, o problema de saúde relacionado à obesidade é uma doença cardíaca, apneia do sono ou colesterol alto.
[00107] Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece usos e métodos para induzir perda de peso ou prevenir ganho de peso, compreendendo administrar uma quantidade eficaz de um inibidor de miR-22 (e compostos relacionados à inibição de miR-22) a um paciente em necessidade do mesmo; em que o paciente não altera substancialmente a ingestão calórica. Em algumas modalidades, a ingestão calórica é alta, em relação às diretrizes, como as tabelas do USDA. Em algumas modalidades, a ingestão calórica do paciente é de 2.000 a 10.000 calorias/dia, ou superior a cerca de 2.000 calorias/dia, ou cerca de 2.200 calorias/dia, ou cerca de 2.400 calorias/dia, ou cerca de 2.600 calorias/dia, ou cerca de 2.800 calorias/dia, ou cerca de 3.000 calorias/dia, ou cerca de 3.200 calorias/dia, ou cerca de 3.400 calorias/dia, ou cerca de 3.600 calorias/dia, ou cerca de 3.800 calorias/dia, ou cerca de 4.000 calorias/dia, ou cerca de 5.000 calorias/dia, ou cerca de 6.000 calorias/dia. Em algumas modalidades, o paciente tem uma alta ingestão calórica e não ganha peso ou mesmo perde peso. Portanto, a presente divulgação fornece um efeito sem mudanças no estilo de vida que muitas vezes reduzem a adesão do paciente (por exemplo, falha na dieta). Em algumas modalidades, a ingestão calórica do paciente não é restrita em mais de cerca de 20%, ou não em mais de cerca de 10%, ou não em mais de cerca de 5% da ingestão calórica do paciente no início do tratamento. Em algumas modalidades, uma alta proporção da ingestão calórica do paciente é de "calorias vazias", ou seja, calorias de gorduras sólidas e/ou açúcares adicionados. Em algumas modalidades, mais do que cerca de 15%, ou 20%, ou 25%, ou 30%, ou 35% ou 50% da ingestão calórica do paciente são calorias vazias. Mesmo nessas modalidades, um paciente pode não ganhar peso ou mesmo perder peso.
[00108] Em algumas modalidades, o paciente da presente divulgação está com sobrepeso ou obeso. Em algumas modalidades, o paciente da presente divulgação sofre de obesidade central. Em algumas modalidades, a obesidade de uma de obesidade simples (obesidade alimentar; geralmente resultante do consumo de mais calorias do que o corpo pode utilizar), obesidade secundária (geralmente resultante de uma condição médica subjacente, como, por exemplo, síndrome de Cushing e síndrome do ovário policístico) e obesidade infantil. Em algumas modalidades, a obesidade é classificada como: Classe I, que inclui um IMC entre 30 e 34,99; Classe II, que inclui IMC de 35 a 39,99; e Classe III, que inclui IMC acima de 40. Além disso, a presente divulgação fornece obesidade de qualquer uma das classes I, II ou III que é ainda classificada como severa, mórbida e superobesidade. Em algumas modalidades, o paciente está em risco de ganho de peso adicional, conforme avaliado, por exemplo, pela ingestão calórica diária.
[00109] Em algumas modalidades, os efeitos de controle de peso/perda de peso/antiobesidade de um inibidor de miR-22 (e compostos relacionados a miR-22) podem ser avaliados usando várias técnicas e índices. Em algumas modalidades, a avaliação antes, durante e depois do tratamento é realizada. Em algumas modalidades, o índice de massa corporal (IMC), uma medida do peso de uma pessoa levando em consideração a altura, pode ser usado. Em algumas modalidades, um paciente aqui descrito tem um IMC que fornece uma classificação de "excesso de peso", ou seja, 25-29,9, tal como, por exemplo, cerca de 25, ou cerca de 25,5, ou cerca de 26, ou cerca de 26,5, ou cerca de 27, ou cerca de 27,5, ou cerca de 28, ou cerca de 28,5, ou cerca de 29, ou cerca de 29,5. Em algumas modalidades, um paciente aqui descrito tem um IMC que fornece uma classificação de "obeso", ou seja, maior do que 30, como, por exemplo, cerca de 30 ou cerca de 31, ou cerca de 32, ou cerca de 33, ou cerca de 34, ou cerca de 35 ou cerca de 36 ou cerca de 37 ou cerca de 38 ou cerca de 39 ou cerca de 40 ou cerca de 50. Em algumas modalidades, o índice de volume corporal (BVI) é usado. O BVI usa software 3D para criar uma imagem 31) de uma pessoa, de modo que o BVI possa diferenciar entre pessoas com a mesma classificação de IMC, mas que têm uma forma diferente e distribuição de peso diferente. O BVI mede onde o peso e a gordura de uma pessoa estão localizados no corpo, em vez do peso total ou do teor de gordura total, e enfatiza o peso carregado pelo abdômen, comumente conhecido como obesidade central. Em algumas modalidades, a pletismografia de deslocamento de ar de corpo inteiro (ADP) é usada para avaliar o controle de peso/perda de peso/efeitos antiobesidade de miR-22 (e compostos relacionados a miR-22). Em algumas modalidades, a pesagem simples é usada na presente invenção. Em algumas modalidades, calibradores de dobras cutâneas ou "teste de pinça", análise de impedância bioelétrica, pesagem hidrostática ou absorciometria de raio-X de energia dupla (DEXA) podem ser usados.
[00110] Em algumas modalidades, a medição circunferencial simples do corpo pode ser usada. Em algumas modalidades, um paciente da presente divulgação tem uma circunferência da cintura superior a cerca de 35 polegadas, ou cerca de 36 polegadas, ou cerca de 37 polegadas, ou cerca de 38 polegadas, ou cerca de 39 polegadas, ou cerca de 40 polegadas ou cerca de 41 polegadas, ou cerca de 42 polegadas ou cerca de 43 polegadas ou cerca de 44 polegadas ou cerca de 45 polegadas ou cerca de 46 polegadas ou cerca de 47 polegadas ou cerca de 48 polegadas ou cerca de 50 polegadas ou cerca de 55 polegadas ou cerca de 60 polegadas. Em algumas modalidades, o paciente é um ser humano do sexo masculino com uma circunferência da cintura superior a 40 polegadas. Em algumas modalidades, o paciente é um ser humano do sexo feminino com uma circunferência da cintura superior a 35 polegadas.
[00111] Os métodos da divulgação podem ser usados para tratar humanos com um percentual de gordura corporal acima do percentual de gordura corporal recomendado, ou seja, pelo menos na faixa de "sobrepeso", ou pelo menos na faixa de "obesidade". O percentual de gordura corporal será diferente entre mulheres e homens. Especificamente, para mulheres, os métodos da divulgação podem ser usados para tratar um ser humano do sexo feminino com uma porcentagem de gordura corporal de pelo menos cerca de 25%, acima de 25%, pelo menos cerca de 32% ou acima de 32%. Para os homens, os métodos da divulgação podem ser usados para tratar um ser humano do sexo masculino com uma porcentagem de gordura corporal de pelo menos cerca de 14%, acima de 14%, pelo menos cerca de 18%, acima de 18%, pelo menos cerca de 25% ou acima de 25%. A porcentagem de gordura corporal pode ser estimada usando qualquer método aceito na técnica, incluindo, por exemplo, interatividade próximo ao infravermelho, absorciometria de raios-X de energia dupla, medição de densidade corporal, análise de impedância bioelétrica e semelhantes.
[00112] Os métodos da divulgação podem ser usados para tratar um paciente que é um homem com mais de 100 libras de excesso de peso e/ou tem circunferência da cintura superior a 40 polegadas. Os métodos da divulgação podem ser usados para tratar uma paciente que é uma mulher com mais de 80 libras de excesso de peso e/ou circunferência da cintura superior a 35 polegadas.
[00113] Em algumas modalidades, a divulgação fornece um inibidor de miR-22 (e compostos relacionados à inibição de miR-22) sendo usado para tratar e/ou prevenir certos distúrbios associados ao excesso de peso. Por exemplo, miR-22 (e compostos relacionados a miR-22) encontram uso em doenças cardiovasculares (por exemplo, colesterol alto, hipercolesterolemia, HDL baixo, HDL alto, hipertensão, doença arterial coronariana, insuficiência cardíaca), apneia do sono (incluindo apneia obstrutiva do sono), osteoartrite, problemas de tireoide, demência, gota, asma, doença do refluxo gastroesofágico e insuficiência renal crônica.
[00114] Em algumas modalidades, a administração e/ou uso do inibidor de miR-22 (e compostos relacionados a miR-22) evita ou reduz o crescimento de tecido adiposo. Em algumas modalidades. miR-22 (e compostos relacionados a miR-22) afeta um ou mais de tecido adiposo branco (WAT) e tecido adiposo marrom (BAT), incluindo, por exemplo, tecido adiposo visceral (VAT), tecido adiposo subcutâneo abdominal (ASAT), ou gordura ectópica. Tal efeito pode ser avaliado, por exemplo, usando qualquer uma das técnicas aqui descritas (por exemplo, IMC, índices de peso para estatura, medidas de dobras cutâneas, análise de bioimpedância elétrica, etc.), bem como várias técnicas de imageamento, incluindo tomografia computadorizada (CT), imageamento de ressonância magnética (MRI, incluindo varreduras de corpo transversal), absorciometria de raios-X de energia dupla (DXA).
[00115] miR-22 (e compostos relacionados a miR-22) também podem ser usados em combinação com terapia dietética, terapia comportamental, fisioterapia, exercício e cirurgia para perda de peso, ou uma combinação de duas ou mais terapias. Em algumas modalidades, o sujeito está em uma dieta com restrição calórica. Em algumas modalidades, o sujeito se envolve ou deve se envolver em um exercício físico ou regime de fisioterapia. Em algumas modalidades, o sujeito foi submetido ou será submetido à cirurgia para perda de peso. Em algumas modalidades, um inibidor de miR-22 (e compostos relacionados à inibição de miR-22) pode estar em combinação com agentes adicionais ou pode ser administrado a um paciente em tratamento com vários agentes.
[00116] Por exemplo, incluindo, mas não se limitando a, modalidades relativas à obesidade e/ou redução/perda de peso, os agentes adicionais podem incluir um ou mais de orlistat (por exemplo, ALLI, XENICAL), loracaserina (por exemplo, BELVIQ), fentermina-topiramato (por exemplo, QSYMIA), sibutramina (por exemplo, REDUCTIL ou MERIDIA), rimonabanto (ACOMPLIA), exenatida (por exemplo, BYETTA), pramlintida (por exemplo, SYMLIN) fentermina, benzfetamina, dietilpropiona, fendimetrazina, bupropiona e metformina.
[00117] Os agentes que interferem na capacidade do corpo de absorver nutrientes específicos nos alimentos estão entre os agentes adicionais, por exemplo, orlistat (por exemplo, ALLI, XENICAL), glucomanano e goma de guar. Os agentes que suprimem o apetite também estão entre os agentes adicionais, por exemplo, catecolaminas e seus derivados (como fentermina e outras drogas à base de anfetaminas), vários antidepressivos e estabilizadores de humor (por exemplo, bupropiona e topiramato), anorexígenos (por exemplo, dexedrina, digoxina). Os agentes que aumentam o metabolismo do corpo também estão entre os agentes adicionais.
[00118] Em algumas modalidades, os agentes adicionais podem ser selecionados entre supressores de apetite, inibidores de recaptação de neurotransmissores, agonistas dopaminérgicos, agonistas serotonérgicos, moduladores de sinalização GABAcrgic, anticonvulsivantes, antidepressivos, inibidores de monoamina oxidase, antagonistas do receptor de substância P (NKl) e antagonistas do receptor de melonocortina, inibidores de lipase, inibidores de absorção de gordura, reguladores de ingestão de energia ou metabolismo, moduladores de receptores canabinoides, agentes para o tratamento da dependência, agentes para o tratamento da síndrome metabólica, moduladores do receptor ativado por proliferador de peroxissoma (PPAR); antagonistas da dipeptidil peptidase 4 (DPP-4), agentes para o tratamento de doenças cardiovasculares, agentes para o tratamento de níveis elevados de triglicerídeos, agentes para o tratamento de HDL baixo, agentes para o tratamento da hipercolesterolemia e agentes para o tratamento da hipertensão. Alguns agentes para doenças cardiovasculares incluem estatinas (por exemplo, lovastatina, atorvastatina, fluvastatina, rosuvastatina, sinvastatina e pravastatina) e agentes ômega-3 (por exemplo, LOVAZA, EPANOVA, VASCEPA, ômega-3 esterificados em geral, óleos de peixe, óleos de krill, óleos de alga). Em algumas modalidades, os agentes adicionais podem ser selecionados entre anfetaminas, benzodiazepinas, sulfonilureias, meglitinidas, tiazolidinedionas, biguanidas, beta-bloqueadores. Inibidores da ACE, diuréticos, nitratos, bloqueadores dos canais de cálcio, fenlermina, sibutramina, lorcaserina, cetilistate, rimonabanto, taranabanto, topiramato, gabapentina, valproato, vigabatrina, bupropiona, tiagabina, sertralina, lorcaserina, cetilistate, rimonabanto, taranabanto, topiramato, gabapentina, valproato, vigabatrina, bupropiona, tiagabina, sertralina, fluoxetina, trazodona, zonisamida, nexilenofenilamida, dietilenofenilamida, dietilenexamida, metilenidona, fluoxetina, fendimetrazina, repaglinida, nateglinida, glimepirida, metformina, pioglitazona, rosiglilazona e sitagliptina. Síndrome de Prader-Willi
[00119] Em algumas modalidades, o método se refere à síndrome de Prader-Willi. A síndrome de Prader-Willi é uma doença genética complexa que afeta muitas partes do corpo. Na infância, a condição é caracterizada por tônus muscular fraco (hipotonia), dificuldades de alimentação, crescimento deficiente e atraso no desenvolvimento. Começando na infância, os indivíduos afetados desenvolvem um apetite insaciável, que leva à alimentação crônica (hiperfagia) e obesidade. Em algumas modalidades, o sujeito sofre de síndrome de Prader-Willi. Em algumas modalidades, a síndrome de Prader- Willi, particularmente aqueles com obesidade, também desenvolvem diabetes mellitus tipo 2. Doença do Fígado Gorduroso
[00120] Em algumas modalidades, o método da divulgação se refere à Doença do Fígado Gorduroso. Uma fração substancial da população é afetada por doença hepática gordurosa, também conhecida como esteato- hepatite não alcoólica (NASH). NASH é frequentemente associada à obesidade e diabetes. A esteatose hepática, a presença de gotículas de triglicerídeos com os hepatócitos, predispõe o fígado à inflamação crônica (detectada em amostras de biópsia como infiltração de leucócitos inflamatórios), que pode levar à fibrose e cirrose. A doença hepática gordurosa é geralmente detectada pela observação de níveis séricos elevados de enzimas específicas do fígado, como as transaminases ALT e AST, que servem como índices de lesão de hepatócitos, bem como pela apresentação de sintomas que incluem fadiga e dor na região do fígado, embora o diagnóstico definitivo frequentemente exija uma biópsia. O benefício esperado é uma redução na inflamação do fígado e no teor de gordura, resultando em atenuação, interrupção ou reversão da progressão de NASH para fibrose e cirrose. Em algumas modalidades, o método reduz ou previne a esteatose hepática. Em algumas modalidades, o método reduz ou evita a fibrose hepática.
[00121] Em algumas modalidades, o método é um método de tratamento de NASH pela administração do inibidor de miR-22 aqui descrito. O paciente NASH pode ser um paciente NASH de alto risco. Um “paciente NASH de alto risco” refere-se à caracterização por um ou mais de: NAS≧ 4; fibrose basal estágio 2 ou 3; ou fibrose de linha de base estágio 1 com uma comorbidade (diabetes tipo 2, IMC ≧ 30 kg / m2 ou ALT ≧ 60 U/L).
[00122] Em algumas modalidades, o inibidor de miR-22 reduz um ou mais dentre esteatose, inflamação acinar mista e balonamento hepatocelular e/ou fibrose pericelular.
[00123] Em algumas modalidades, o inibidor de miR-22 reduz um ou mais de esteatose.
[00124] Em algumas modalidades, o inibidor de miR-22 trata NASH de grau 1 leve, ou NASH de grau 2 moderado, ou NASH de grau 3 grave, conforme descrito em Brunt, et al. Am. J. Gastroenterology, Vol. 94, No. 9 (1999), cuja totalidade é incorporada por referência em sua totalidade: Leve, grau 1 Esteatose (predominantemente macrovesicular) envolvendo até 66% da biópsia; pode ver hepatócitos com inchaço da zona 3 ocasionais; taxa dispersa de pmn intra-acinares ± linfócitos intra-acinares; nenhuma ou leve inflamação crônica portal.
Moderado, grau 2 Esteatose de qualquer grau; inchaço dos hepatócitos (predominantemente zona 3) óbvio; observados pmn intra-acinares, podem estar associados à fibrose pericelular da zona 3; inflamação crônica portal e intra- acinar observada, leve a moderada.
Grave, grau 3 Esteatose panacinar; inchaço e desordem óbvio, predominantemente na zona 3; inflamação intra-acinar observada como pmn's dispersos, pms's associados a hepatócitos inchados ± inflamação crônica leve; inflamação crônica portal leve ou moderada, não marcada.
[00125] Em algumas modalidades, o inibidor de miR-22 trata NASH de qualquer um dos seguintes estágios: Estágio 0, Sem fibrose; Estágio 1, Zona 3 fibrose pericelular/sinusoidal, focal ou extensa; Estágio 2, como no estágio 1 mais fibrose portal, focal ou extensa; Estágio 3, fibrose em ponte, focal ou extensa; e cirrose de Estágio 4 (+/- fibrose pericelular residual).
[00126] Em algumas modalidades, o inibidor de miR-22 trata NASH de qualquer pontuação de atividade (NAS), conforme descrito em Kleiner, et al., Hepatology, 2005. 41 (6): p. 1313-21, cuja totalidade é incorporada por referência em sua totalidade: Característica histológica Definição Pontuação Esteatose <5% 0 5-33% 1 33-66% 2 >66% 3 Inflamação lobular* Nenhuma 0 <2 focos 1 2-4 focos 2 >4 focos 3 Inchaço** Nenhum 0 Algumas células 1 Proeminente 2 * O número de focos foi contado por campo de 200x para inflamação lobular ** Algumas células inchadas indicam hematócitos raros, mas definitivos, assim como casos que estão diagnosticamente na linha de fronteira.
[00127] Em algumas modalidades, o inibidor de miR-22 reduz NASH a menos que 8, ou menos que 7, ou menos de 6, ou menos que 5, ou menos que 4, ou menos que 3, ou menos que 2, ou menos que 1. Em algumas modalidades, o baseado em AP reduz NAS a cerca de 7 ou a cerca de 6, ou menos de 5, ou menos de 4, ou a cerca de 3, a cerca de 2 ou a cerca de 1.
[00128] Em algumas modalidades, o inibidor de miR-22 reduz a esteatose em cerca de 5% ou cerca de 10%, ou cerca de 15%, ou cerca de 20%, ou cerca de 25%, ou cerca de 30%, ou cerca de 35%, ou cerca de 40%,
ou cerca de 45%, ou cerca de 50%, ou cerca de 55%, ou cerca de 60%, ou cerca de 65%, ou cerca de 70%, ou cerca de 75%, ou cerca de 80%, ou cerca de 85%, ou cerca de 90% ou cerca de 95%.
[00129] Em algumas modalidades, o inibidor de miR-22 reduz a inflamação lobular para menos de 4 focos, ou menos de 3 focos, ou menos de 2 focos, ou menos de 1 foco.
[00130] Em algumas modalidades, o inibidor de miR-22 reduz o inchaço para uma pontuação de 0 ou 1 de acordo com a escala acima.
[00131] Em algumas modalidades, o inibidor de miR-22 trata um sujeito em risco de NASH, como um sujeito que sofre de várias doenças metabólicas adquiridas, como obesidade, diabetes (por exemplo, tipo 2), hipertrigliceridemia, perda rápida de peso e desnutrição. Em algumas modalidades, o inibidor de miR-22 trata um sujeito em risco de NASH, como um sujeito que sofre de várias doenças metabólicas genéticas, como doença de Wilson, tirosinemia e abetalipoproteinemia. Em algumas modalidades, o inibidor de miR-22 trata um sujeito em risco de NASH, como um sujeito que sofre de vários outros fatores, como lipodistrofia e desvio jejunoileal. Em algumas modalidades, o inibidor de miR-22 trata um sujeito em risco de NASH, como um sujeito em tratamento com um ou mais de amiodarona, agentes quimioterápicos (por exemplo, irinotecano), tamoxifeno, esteroides, estrogênios, dietilestilbestrol, metotrexato, cálcio bloqueadores de canais (por exemplo, nifedipina, verapamil e diltiazem).
[00132] Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece métodos que reduzem ou evitam a fibrose. Os marcadores diretos de fibrose incluem o tipo de procolágeno (I, III, IV), metaloproteinases de matriz, citocinas e quimiocinas. Em algumas modalidades, a presente invenção fornece métodos que reduzem ou previnem a intensificação da síntese da matriz extracelular, por exemplo, por células estreladas ativadas. Em algumas modalidades, a presente invenção fornece métodos que modulam os níveis de TIMP-1. Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece métodos que reduzem ou evitam os níveis séricos de ácido hialurônico.
[00133] Em algumas modalidades, o efeito do inibidor de miR-22 é monitorado usando testes que monitoram uma ou mais combinações de ácido hialurônico, inibidor de tecido de uma metaloproteinase-1 (TIMP-1) e alfa-2- macroglobulina (por exemplo, FIBROSpect II).
[00134] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece métodos que reduzem ou previnem a cirrose.
[00135] Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece métodos que modulam um ou mais dentre contagem de plaquetas, tempo de protrombina, albumina, bilirrubina total e aminotransferase sérica. Em algumas modalidades, a presente invenção fornece métodos que modulam marcadores fibróticos séricos, como ácido hialurônico (HA) e alfa-2-macroglobulina. Hipercolesterolemia
[00136] Em algumas modalidades, o método da divulgação se refere à hipercolesterolemia. A hipercolesterolemia é uma condição caracterizada por colesterol sérico elevado. Níveis elevados de colesterol sérico afetam uma fração substancial da população e são um importante fator de risco para aterosclerose e infarto do miocárdio. Drogas para baixar o colesterol, tais como inibidores da HMG-CoA redutase (estatinas), podem ser administradas a pacientes com hipercolesterolemia, além dos agentes da invenção, opcionalmente incorporados no mesmo produto farmacêutico. Em algumas modalidades, a hipocolesterolemia é hipercolesterolemia familiar, que é uma condição caracterizada por colesterol sérico elevado que não é o resultado de uma única mutação genética única. Em algumas modalidades, a hipercolesterolemia é hipercolesterolemia poligênica, que é uma condição caracterizada por colesterol elevado que resulta da influência de uma variedade de fatores genéticos. Em certas modalidades, a hipercolesterolemia poligênica pode ser exacerbada pela ingestão alimentar de lipídeos. Em algumas modalidades, a hipercolesterolemia é hipercolesterolemia familiar (FH), que é um distúrbio metabólico autossômico dominante caracterizado por uma mutação no gene do receptor de LDL (LDL-R), LDL-C marcadamente elevado e início prematuro de aterosclerose. Um diagnóstico de hipercolesterolemia familiar é feito quando um indivíduo atende a um ou mais dos seguintes critérios: teste genético que confirma 2 genes do receptor de LDL mutados; teste genético confirmando um gene do receptor de LDL mutado; histórico documental de colesterol LDL sérico não tratado maior que 500 mg/dL; xantoma tendíneo e/ou cutâneo antes dos 10 anos; ou ambos os pais documentaram níveis elevados de colesterol LDL sérico antes da terapia para redução de lipídeos consistente com hipercolesterolemia familiar heterozigótica. Em algumas modalidades, a hipercolesterolemia é hipercolesterolemia familiar homozigótica ou HoFH, que é uma condição caracterizada por uma mutação nos genes LDL-R materno e paterno. Em algumas modalidades, a hipercolesterolemia é hipercolesterolemia familiar heterozigótica ou HeFH, que é uma condição caracterizada por uma mutação no gene LDL-R materno ou paterno.
[00137] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, o gene FTO humano de tipo selvagem da divulgação consiste em ou compreende a sequência de ácido nucleico (Número de Acessão do Genbank: NM_001080432.2; SEQ ID NO: 13).
[00138] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, o gene FTO humano de tipo selvagem da divulgação consiste em ou compreende a sequência de aminoácidos (Número de Acessão do Genbank: NP_001073901.1; SEQ ID NO: 14).
[00139] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, o gene CEBPa humano de tipo selvagem da divulgação consiste em ou compreende a sequência de ácido nucleico (Número de Acessão do Genbank: NM_004364.4, variante transcrito 1; SEQ ID NO: 15).
[00140] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, o gene CEBPa humano de tipo selvagem da divulgação consiste em ou compreende a sequência de aminoácidos (Número de Acessão do Genbank:
NP_004355.2, variante transcrito 1; SEQ ID NO: 16).
[00141] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, o gene CEBPa humano de tipo selvagem da divulgação consiste em ou compreende a sequência de ácido nucleico (Número de Acessão do Genbank: NM_001285829.1, variante transcrito 2; SEQ ID NO: 17).
[00142] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, o gene CEBPa humano de tipo selvagem da divulgação consiste em ou compreende a sequência de aminoácidos (Número de Acessão do Genbank: NM_001285829.1, variante transcrito 2; SEQ ID NO: 18).
[00143] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, o gene CEBPa humano de tipo selvagem da divulgação consiste em ou compreende a sequência de ácido nucleico (Número de Acessão do Genbank: NM_001287424.1, variante transcrito 3; SEQ ID NO: 19).
[00144] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, o gene CEBPa humano de tipo selvagem da divulgação consiste em ou compreende a sequência de aminoácidos (Número de Acessão do Genbank: NP_001274353.1, variante transcrito 3; SEQ ID NO: 20).
[00145] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, o gene CEBPa humano de tipo selvagem da divulgação consiste em ou compreende a sequência de ácido nucleico (Número de Acessão do Genbank: NM_001287435.1, variante transcrito 4; SEQ ID NO: 21).
[00146] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, o gene CEBPa humano de tipo selvagem da divulgação consiste em ou compreende a sequência de aminoácidos (Número de Acessão do Genbank: NP_001274364.1, variante transcrito 4; SEQ ID NO: 22).
[00147] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, o gene PPARg humano de tipo selvagem da divulgação consiste em ou compreende a sequência de ácido nucleico (Número de Acessão do Genbank: NM_138712.3, variante transcrito 1; SEQ ID NO: 23).
[00148] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, o gene PPARg humano de tipo selvagem da divulgação consiste em ou compreende a sequência de aminoácidos (Número de Acessão do Genbank: NP_619726.2, variante transcrito 1; SEQ ID NO: 24).
[00149] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, o gene PPARg humano de tipo selvagem da divulgação consiste em ou compreende a sequência de ácido nucleico (Número de Acessão do Genbank: NM_015869.4, variante transcrito 2; SEQ ID NO: 25).
[00150] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, o gene PPARg humano de tipo selvagem da divulgação consiste em ou compreende a sequência de aminoácidos (Número de Acessão do Genbank: NP_056953.2, variante transcrito 2; SEQ ID NO: 26).
[00151] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, o gene PPARg humano de tipo selvagem da divulgação consiste em ou compreende a sequência de ácido nucleico (Número de Acessão do Genbank: NM_138711.3, variante transcrito 3; SEQ ID NO: 27).
[00152] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, o gene PPARg humano de tipo selvagem da divulgação consiste em ou compreende a sequência de aminoácidos (Número de Acessão do Genbank: NP_619725.2, variante transcrito 3; SEQ ID NO: 28).
[00153] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, o gene PPARg humano de tipo selvagem da divulgação consiste em ou compreende a sequência de ácido nucleico (Número de Acessão do Genbank: NM_005037.5, variante transcrito 4; SEQ ID NO: 29).
[00154] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, o gene PPARg humano de tipo selvagem da divulgação consiste em ou compreende a sequência de aminoácidos (Número de Acessão do Genbank: NP_005028.4, variante transcrito 4; SEQ ID NO: 30).
[00155] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, o gene PTEN humano de tipo selvagem da divulgação consiste em ou compreende a sequência de ácido nucleico (Número de Acessão do Genbank:
NM_000314.6, variante transcrito 1; SEQ ID NO: 31).
[00156] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, o gene PTEN humano de tipo selvagem da divulgação consiste em ou compreende a sequência de aminoácidos (Número de Acessão do Genbank: NP_000305.3, variante transcrito 1; SEQ ID NO: 32).
[00157] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, o gene PTEN humano de tipo selvagem da divulgação consiste em ou compreende a sequência de ácido nucleico (Número de Acessão do Genbank: NM_001304717.2, variante transcrito 1; SEQ ID NO: 33).
[00158] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, o gene PTEN humano de tipo selvagem da divulgação consiste em ou compreende a sequência de aminoácidos (Número de Acessão do Genbank: NP_001291646.2, variante transcrito 1; SEQ ID NO: 34).
[00159] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, o gene PTEN humano de tipo selvagem da divulgação consiste em ou compreende a sequência de ácido nucleico (Número de Acessão do Genbank: NM_001304718.1, variante transcrito 2; SEQ ID NO: 35).
[00160] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, o gene PTEN humano de tipo selvagem da divulgação consiste em ou compreende a sequência de aminoácidos (Número de Acessão do Genbank: NP_001291647.1, variante transcrito 2; SEQ ID NO: 36).
[00161] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, o gene TET2 humano de tipo selvagem da divulgação consiste em ou compreende a sequência de ácido nucleico (Número de Acessão do Genbank: NM_001127208.2, variante transcrito 1; SEQ ID NO: 37).
[00162] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, o gene TET2 humano de tipo selvagem da divulgação consiste em ou compreende a sequência de aminoácidos (Número de Acessão do Genbank: NP_001120680.1, variante transcrito 1; SEQ ID NO: 38).
[00163] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, o gene TET2 humano de tipo selvagem da divulgação consiste em ou compreende a sequência de ácido nucleico (Número de Acessão do Genbank: NM_017628.4, variante transcrito 2; SEQ ID NO: 39).
[00164] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, o gene TET2 humano de tipo selvagem da divulgação consiste em ou compreende a sequência de aminoácidos (Número de Acessão do Genbank: NP_060098.3, variante transcrito 2; SEQ ID NO: 40).
[00165] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, o gene BMP-7 humano de tipo selvagem da divulgação consiste em ou compreende a sequência de ácido nucleico (Número de Acessão do Genbank: NM_001719.2, variante transcrito 1; SEQ ID NO: 41).
[00166] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, o gene BMP-7 humano de tipo selvagem da divulgação consiste em ou compreende a sequência de aminoácidos (Número de Acessão do Genbank: NP_001710.1, variante transcrito 1; SEQ ID NO: 42).
[00167] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, o gene SIRT-1 humano de tipo selvagem da divulgação consiste em ou compreende a sequência de ácido nucleico (Número de Acessão do Genbank: NM_012238.4, variante transcrito 1; SEQ ID NO: 43).
[00168] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, o gene SIRT-1 humano de tipo selvagem da divulgação consiste em ou compreende a sequência de aminoácidos (Número de Acessão do Genbank: NP_036370.2, variante transcrito 1; SEQ ID NO: 44).
[00169] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, o gene SIRT-1 humano de tipo selvagem da divulgação consiste em ou compreende a sequência de ácido nucleico (Número de Acessão do Genbank: NM_001142498.1, variante transcrito 2; SEQ ID NO: 45).
[00170] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, o gene SIRT-1 humano de tipo selvagem da divulgação consiste em ou compreende a sequência de aminoácidos (Número de Acessão do Genbank:
NP_001135970.1, variante transcrito 2; SEQ ID NO: 46).
[00171] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, o gene SIRT-1 humano de tipo selvagem da divulgação consiste em ou compreende a sequência de ácido nucleico (Número de Acessão do Genbank: NM_001314049.1, variante transcrito 3; SEQ ID NO: 47).
[00172] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, o gene SIRT-1 humano de tipo selvagem da divulgação consiste em ou compreende a sequência de aminoácidos (Número de Acessão do Genbank: NP_001300978.1, variante transcrito 3; SEQ ID NO: 48).
[00173] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, o gene PGC1-α humano de tipo selvagem da divulgação consiste em ou compreende a sequência de ácido nucleico (Número de Acessão do Genbank NM_001330751, variante transcrito 1; SEQ ID NO: 49).
[00174] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, o gene PGC1a humano de tipo selvagem da divulgação consiste em ou compreende a sequência de aminoácidos (Número de Acessão do Genbank NP_001317680: variante transcrito 2; SEQ ID NO: 50).
[00175] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, o gene PGC1-α humano de tipo selvagem da divulgação consiste em ou compreende a sequência de ácido nucleico (Número de Acessão do Genbank NM_013261, variante transcrito 2; SEQ ID NO: 51).
[00176] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, o gene PGC1a humano de tipo selvagem da divulgação consiste em ou compreende a sequência de aminoácidos (Número de Acessão do Genbank: NP_037393, variante transcrito 2; SEQ ID NO: 52).
[00177] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, o gene PGC1-α humano de tipo selvagem da divulgação consiste em ou compreende a sequência de ácido nucleico (Número de Acessão do Genbank NM_001330752.1, variante transcrito 3; SEQ ID NO: 53).
[00178] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, o gene PGC1a humano de tipo selvagem da divulgação consiste em ou compreende a sequência de aminoácidos (Número de Acessão do Genbank NP_001317681.1, variante transcrito 3; SEQ ID NO: 54).
[00179] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, o gene PGC1-α humano de tipo selvagem da divulgação consiste em ou compreende a sequência de ácido nucleico (Número de Acessão do Genbank NM_001330753.1, variante transcrito 4; SEQ ID NO: 55).
[00180] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, o gene PGC1a humano de tipo selvagem da divulgação consiste em ou compreende a sequência de aminoácidos (Número de Acessão do Genbank NP_001317682, variante transcrito 4; SEQ ID NO: 56).
[00181] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, o gene SP-1 humano de tipo selvagem da divulgação consiste em ou compreende a sequência de ácido nucleico (Número de Acessão do Genbank NM_138473.2; SEQ ID NO: 57).
[00182] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, o gene SP-1 humano de tipo selvagem da divulgação consiste em ou compreende a sequência de aminoácidos (Número de Acessão do Genbank: NP_612482; SEQ ID NO: 58).
[00183] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, o gene FGF-21 humano de tipo selvagem da divulgação consiste em ou compreende a sequência de ácido nucleico (Número de Acessão do Genbank NM_019113.3; SEQ ID NO: 59).
[00184] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, o gene FGF-21 humano de tipo selvagem da divulgação consiste em ou compreende a sequência de aminoácidos (Número de Acessão do Genbank NP_061986.1; SEQ ID NO: 60).
[00185] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, o gene UCP1 humano de tipo selvagem da divulgação consiste em ou compreende a sequência de ácido nucleico (Número de Acessão do Genbank
NM_021833.4; SEQ ID NO: 61).
[00186] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, o gene UCP1 humano de tipo selvagem da divulgação consiste em ou compreende a sequência de aminoácidos (Número de Acessão do Genbank NP_068605.1; SEQ ID NO: 62).
[00187] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, o gene DDIT-4 humano de tipo selvagem da divulgação consiste em ou compreende a sequência de ácido nucleico (Número de Acessão do Genbank NM_019058.3; SEQ ID NO: 63).
[00188] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, o gene DDIT-4 humano de tipo selvagem da divulgação consiste em ou compreende a sequência de aminoácidos (Número de Acessão do Genbank NP_061931.1; SEQ ID NO: 64).
[00189] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, o gene METTL3 humano de tipo selvagem da divulgação consiste em ou compreende a sequência de ácido nucleico (Número de Acessão do Genbank NM_019852.4; SEQ ID NO: 65).
[00190] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, o gene METTL3 humano de tipo selvagem da divulgação consiste em ou compreende a sequência de aminoácidos (Número de Acessão do Genbank NP_062826.2; SEQ ID NO: 66).
[00191] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, o gene FGF1 humano de tipo selvagem da divulgação consiste em ou compreende a sequência de ácido nucleico (Número de Acessão do Genbank NM_000800.4; SEQ ID NO: 67).
[00192] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, o gene FGF1 humano de tipo selvagem da divulgação consiste em ou compreende a sequência de aminoácidos (Número de Acessão do Genbank NP_000791.1; SEQ ID NO: 68).
[00193] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, o gene TP63 humano de tipo selvagem da divulgação consiste em ou compreende a sequência de ácido nucleico (Número de Acessão do Genbank NM_001114978.1; SEQ ID NO: 69).
[00194] Em algumas modalidades dos métodos da divulgação, o gene TP63 humano de tipo selvagem da divulgação consiste em ou compreende a sequência de aminoácidos (Número de Acessão do Genbank NP_001108450.1; SEQ ID NO: 70).
[00195] Como usado neste documento, o termo sujeito ou paciente refere-se a qualquer vertebrado, incluindo, sem limitação, humanos e outros primatas (por exemplo, chimpanzés e outras espécies de símios e macacos), animais de fazenda (por exemplo, gado, ovelhas, porcos, cabras e cavalos), mamíferos domésticos (por exemplo, cães e gatos), animais de laboratório (por exemplo, roedores como camundongos, ratos e porquinhos-da-índia) e pássaros (por exemplo, pássaros domésticos, selvagens e de caça, como galinhas, perus e outras aves galináceas, patos, gansos e semelhantes). Em algumas modalidades, o sujeito é um mamífero. Em algumas modalidades, o sujeito é um humano.
[00196] Outra modalidade da presente invenção é uma composição farmacêutica, ou uso de composição farmacêutica, compreendendo um inibidor de um miRNA, tal como miR-22, e um transportador farmaceuticamente aceitável. Quando as aplicações clínicas são contempladas, as composições farmacêuticas podem ser preparadas em uma forma apropriada para a aplicação pretendida. Geralmente, isso envolverá preparar composições que são essencialmente isentas de pirogênios, bem como outras impurezas que podem ser prejudiciais a humanos ou animais.
[00197] Em uma modalidade, uma composição farmacêutica compreende uma dose eficaz de um inibidor de miRNA, a título de exemplo não limitativo, um oligonucleotídeo antissentido direcionado a miR-22 e um transportador farmaceuticamente aceitável. Uma dose eficaz é uma quantidade suficiente para afetar um resultado clínico benéfico ou desejado. Uma dose eficaz de um inibidor de miRNA da invenção pode ser de cerca de 1 mg/kg a cerca de 100 mg/kg, cerca de 2,5 mg/kg a cerca de 50 mg/kg ou cerca de 5 mg/kg a cerca de 25 mg/kg. A determinação precisa do que seria considerada uma dose eficaz pode ser baseada em fatores individuais para cada paciente, incluindo seu tamanho, idade, tipo de distúrbio metabólico e natureza do inibidor ou agonista (exemplos não limitativos incluem antagomir, construto de expressão, oligonucleotídeo antissentido, duplex de polinucleotídeo, etc.). Portanto, as dosagens podem ser facilmente determinadas por aqueles versados na técnica a partir desta divulgação e do conhecimento na técnica. Por exemplo, as doses podem ser determinadas com a referência Physicians 'Desk Reference, 66th Edition, PDR Network; Edição de 2012 (27 de dezembro de 2011), cujos conteúdos são incorporados por referência em sua totalidade.
[00198] Um resultado de tratamento benéfico ou desejado pode incluir, inter alia, uma redução do índice de massa corporal, perda de peso ou um marcador que está associado à presença de distúrbio metabólico em comparação com o que é observado sem a administração do inibidor. Um resultado de tratamento benéfico ou desejado também pode incluir, inter alia, uma presença aumentada ou diminuída de um marcador ou gene que está associado a uma redução do distúrbio metabólico em comparação com o que é observado sem a administração do inibidor. Em algumas modalidades, o marcador ou gene é proteína associada à massa gorda e obesidade (FTO), CEBPa e/ou PPARγ, ALKBH5 e ACLY. Em algumas modalidades, há uma perturbação na atividade e/ou expressão de FTO, CEBPa, PPARa, ACLY, SP- 1, PGC1a, ALKBH5, SIRT-1, TP63, FGF1 e/ou DDIT4. Em algumas modalidades, o marcador ou gene é proteína associada à massa gorda e obesidade (FTO).
[00199] Sistemas de dispersão coloidal, tais como complexos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, grânulos e sistemas à base de lipídeos, incluindo emulsões óleo-em-água, micelas, micelas mistas e lipossomas, podem ser usados como veículos de distribuição para os inibidores de oligonucleotídeo da função miRNA oncogênica, polinucleotídeos que codificam o metabolismo relacionado à gordura e a via de síntese direciona agonistas de miRNA, ou construtos que expressam inibidores ou agonistas de miRNA particulares. Emulsões de gordura comercialmente disponíveis que são adequadas para distribuir os ácidos nucleicos da divulgação aos tecidos adiposos (por exemplo, adipócitos) incluem INTRALIPIDO, LIPOSYN®, LIPOSYN® II, LIPOSYN® III, Nutrilipid e outras emulsões lipídicas semelhantes. Um sistema coloidal para uso como veículo de distribuição in vivo é um lipossoma (isto é, uma vesícula de membrana artificial). A preparação e o uso de tais sistemas são bem conhecidos na técnica. Formulações exemplificativas são também divulgadas em U.S. 5.981.505; U.S. 6.217.900; U.S. 6.383.512; U.S. 5.783.565; U.S. 7.202.227; U.S. 6.379.965; U.S.
6.127.170; U.S. 5.837.533; U.S. 6.747.014; e W003/093449, que são aqui incorporados por referência na sua totalidade.
[00200] Em geral, será desejável empregar sais e tampões apropriados para tornar os veículos de distribuição estáveis e permitir a absorção pelas células alvo. As composições aquosas da presente invenção compreendem uma quantidade eficaz do veículo de distribuição compreendendo os polinucleotídeos inibidores (por exemplo, lipossomas ou outros complexos ou vetores de expressão) dissolvidos ou dispersos em um veículo ou meio aquoso farmaceuticamente aceitável. As frases farmaceuticamente aceitáveis ou farmacologicamente aceitáveis referem-se a entidades moleculares e composições que não produzem reações adversas, alérgicas ou outras reações indesejáveis quando administradas a um animal ou humano. Como usado neste documento, o transportador farmaceuticamente aceitável inclui solventes, tampões, soluções, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de retardamento de absorção e semelhantes aceitáveis para uso na formulação de produtos farmacêuticos, tais como produtos farmacêuticos adequados para administração a humanos. A utilização de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é bem conhecida na técnica. Exceto na medida em que qualquer meio ou agente convencional seja incompatível com os ingredientes ativos da presente invenção, seu uso em composições terapêuticas é contemplado. Ingredientes ativos suplementares também podem ser incorporados nas composições, desde que não inativem os vetores ou polinucleotídeos das composições.
[00201] As composições ativas da presente invenção podem incluir preparações farmacêuticas clássicas. A administração dessas composições, de acordo com a presente invenção, pode ser através de qualquer via comum, desde que o tecido alvo esteja disponível através dessa via. Isso inclui oral, nasal ou bucal. Alternativamente, a administração pode ser por injeção intradérmica, subcutânea, intramuscular, intraperitoneal ou intravenosa, ou por injeção direta no tecido adiposo. Os agentes aqui divulgados também podem ser administrados por sistemas de cateter. Essas composições seriam normalmente administradas como composições farmaceuticamente aceitáveis, conforme descrito neste documento.
[00202] Os compostos ativos também podem ser administrados parenteralmente ou intraperitonealmente. A título de ilustração, as soluções dos compostos ativos como base livre ou sais farmacologicamente aceitáveis podem ser preparadas em água adequadamente misturada com um tensoativo, tal como hidroxipropilcelulose. As dispersões também podem ser preparadas em glicerol, polietilenoglicóis líquidos e suas misturas e em óleos. Sob condições comuns de armazenamento e uso, essas preparações geralmente contém um conservante para evitar o crescimento de micro-organismos.
[00203] As formas farmacêuticas adequadas para uso injetável ou administração por cateter incluem, por exemplo, soluções ou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. Geralmente, essas preparações são estéreis e fluidas na medida em que existe uma fácil injetabilidade. As preparações deveriam ser sob as condições de fabricação e armazenamento e deveriam ser preservada contra a ação contaminante de micro-organismos, tais como bactérias e fungos. Os solventes ou meios de dispersão apropriados podem conter, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol e polietilenoglicol líquido e semelhantes), misturas adequadas dos mesmos e óleos vegetais. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento, tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula necessário em caso de dispersão e pelo uso de tensoativos. A prevenção da ação de micro-organismos pode ser feita por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal e afins. Em muitos casos, será preferencial incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares ou cloreto de sódio. Absorção prolongada das composições injetáveis pode ser provocada pelo uso nas composições de agentes que atrasam a absorção, por exemplo, o monoestearato de alumínio e gelatina.
[00204] As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas incorporando os compostos ativos em uma quantidade apropriada em um solvente junto com quaisquer outros ingredientes (por exemplo, conforme enumerado acima) conforme desejado, seguido por esterilização por filtração. Geralmente, as dispersões são preparadas incorporando os vários ingredientes ativos esterilizados em um veículo estéril que contém o meio de dispersão básico e os outros ingredientes desejados, por exemplo, conforme enumerado acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferenciais de preparação incluem técnicas de secagem a vácuo e liofilização, as quais produzem um pó do(s) ingrediente(s) ativo(s) mais qualquer ingrediente adicional desejado a partir de uma solução estéril previamente filtrada do mesmo.
[00205] Após a formulação, as soluções podem ser administradas de uma maneira compatível com a formulação de dosagem e em uma quantidade que seja terapeuticamente eficaz. As formulações podem ser facilmente administradas em uma variedade de formas de dosagem, tais como soluções injetáveis, cápsulas de liberação de droga e semelhantes. Para administração parenteral em uma solução aquosa, por exemplo, a solução geralmente é adequadamente tamponada e o diluente líquido primeiro tornado isotônico com, por exemplo, solução salina ou glicose suficientes. Essas soluções aquosas podem ser utilizadas, por exemplo, para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea e intraperitoneal. De preferência, meios aquosos estéreis são empregados como é conhecido pelos versados na técnica, particularmente à luz da presente divulgação. A título de ilustração, uma única dose pode ser dissolvida em 1 ml de solução isotônica de NaC1 e adicionada a 1000 ml de fluido de hipodermóclise ou injetada no local proposto de infusão (ver, por exemplo, Remington Pharmaceutical Sciences, 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580, cujos conteúdos são aqui incorporados por referência). Alguma variação na dosagem ocorrerá, necessariamente, dependendo da condição do sujeito sendo tratado. O responsável pela administração, em qualquer caso, determinará a dose adequada para o sujeito individual. Além disso, para a administração a humanos, preparações devem atender a normas de esterilidade, pirogenicidade, e de segurança e pureza gerais conforme exigido pelo escritório do FDA de Padrões Biológicos.
[00206] Em algumas modalidades, a presente divulgação inclui um método de tratamento ou prevenção de distúrbio metabólico em um sujeito em necessidade do mesmo, compreendendo administrar ao sujeito: um primeiro inibidor de um primeiro miRNA, em que o miRNA é miR-22 e um segundo inibidor de um segundo miRNA, em que o miRNA é um regulador de um gene relacionado ao metabolismo. Em algumas modalidades, o segundo miRNA é um inibidor de miR conhecido, incluindo, a título de exemplo não limitativo, aqueles divulgados na Publicação de Patente Internacional WO 2012/142313, cujos conteúdos são aqui incorporados por referência na sua totalidade. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo inibidores podem ser administrados em qualquer ordem (por exemplo, primeiro depois em segundo ou segundo depois em primeiro lugar) ou simultaneamente.
[00207] Em algumas modalidades, a presente divulgação inclui um método de tratamento ou prevenção de distúrbio metabólico em um sujeito em necessidade do mesmo, compreendendo administrar ao sujeito um primeiro agente que é ou compreende um inibidor de miR-22 e um segundo agente que é ou compreende pelo menos um outro distúrbio metabólico biológico, terapêutico ou droga. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo inibidores podem ser administrados em qualquer ordem (por exemplo, primeiro depois em segundo ou segundo depois em primeiro lugar) ou simultaneamente.
[00208] A invenção também fornece kits que podem simplificar a administração de qualquer agente aqui descrito, como um inibidor de um miRNA oncogênico, incluindo um oligonucleotídeo antissentido direcionado ao miR-22. Um kit exemplificativo da invenção compreende qualquer composição aqui descrita na forma de dosagem unitária. Em uma modalidade, a forma de dosagem unitária é um recipiente, tal como uma seringa pré-preenchida, que pode ser estéril, contendo qualquer agente aqui descrito e um transportador, diluente, excipiente ou veículo farmaceuticamente aceitável. O kit pode ainda compreender um rótulo ou instruções impressas instruindo o uso de qualquer agente aqui descrito. O kit também pode incluir um espéculo de tampa, anestésico tópico e um agente de limpeza para o local de administração. O kit pode compreender ainda um ou mais agentes adicionais, como um segundo inibidor de um miRNA oncogênico, ou agente biológico, terapêutico, quimioterápico ou droga aqui descrito. Em uma modalidade, o kit compreende um recipiente contendo uma quantidade eficaz de uma composição da invenção e uma quantidade eficaz de outra composição, como as aqui descritas. EXEMPLOS:
[00209] Para que a invenção aqui divulgada possa ser mais eficientemente entendida, exemplos são fornecidos abaixo. Deve ser entendido que estes exemplos são apenas para fins ilustrativos e não devem ser interpretados como limitando a invenção de qualquer maneira. Exemplo 1: Papel do MiR-22 na obesidade
[00210] O miR-22 direciona diretamente PTEN e TET para promover tumorigênese, metástase e outros distúrbios metabólicos. Mais de 60 miRNAs direcionados a PTEN e não menos que 30 novos loci genéticos proto- oncogênicos foram estudados no câncer humano. Altamente conservado evolutivamente entre os vertebrados e expresso de forma ubíqua em vários tecidos, (Lagos-Quintana et al., 2001, 2002; Neely et al., 2006). Ao direcionar PTEN, miR-22 permanece metabolicamente relevante, pois a redução de PTEN ou sua elevação desencadeia um estado metabólico Warburg ou anti- Warburg, respectivamente. A Figura 2A-D mostra que a superexpressão de miR-22 afeta o peso dos camundongos. Abordagem Knockout de miR-22
[00211] Para avaliar se, o efeito no peso de um camundongo e no acúmulo de gordura é devido à superexpressão de miR-22 e para avaliar o aumento diferencial no peso dos camundongos durante o tempo e consumo diferencial de comida, camundongos de 2 meses de idade (dia de início), de tipo selvagem (Wt) e camundongos transgênicos miR-22 (Tg) foram colocados em uma Dieta de Alta Gordura (60%). O peso dos camundongos foi monitorado 2 vezes/semana e o consumo de alimentos monitorado 1 vez/semana. (ver a Figura 3A-C e a Figura 4A-F). Os camundongos transgênicos miR-22 (Tg) desenvolveram um fenótipo obeso em Sem Dieta (ND), enquanto os camundongos miR-22 Knockout (KO) não conseguiram ganhar peso em HFD. Células deficientes em miR-22 de fibroblasto embrionário de camundongo (MEF) mostraram uma capacidade prejudicada de se diferenciar em adipócitos. Este fenótipo está correlacionado com uma expressão de genes diferencial para um painel de diferentes genes que estão envolvidos na diferenciação de adipócitos e geralmente no metabolismo da gordura. Além disso, os resultados indicam que o efeito do miR-22 no ganho de peso é independente da leptina (ou semelhante à leptina) (ver Figuras 5A-D e Figura 6).
Exemplo 2: Inibição de miR-22 como terapia para obesidade
[00212] Todos os LNA anti-miR-22 são úteis em humanos e camundongos. O gene hospedeiro mostrou uma complementaridade de 49% entre humanos e camundongos e o LNA anti HG-miR-22 funciona predominantemente em humanos. Projeto de ácido nucleico bloqueado (LNA) anti-miR-22
[00213] O LNA foi projetado para cobrir a sequência de semente, conter entre 8 nt e 20 nt de comprimento, ter uma fração específica de comprimento de LNAs permitida e a maior afinidade de ligação possível ao miR-22.
[00214] A sequência foi validada em um ensaio por otimização do protocolo para captação assistida por LNA (transfecção Lipo200), uma linhagem celular aderente, LNA marcado com FAM foi usado e o efeito biológico validado pela identificação do anti-miR-22 mais potente na linhagem celular aderente assistida e captação não assistida (análise do nível de miR-22 pré e pós-tratamento e atividade de TET2 e nível de proteína). O objetivo era usar o anti-miR em um modelo de camundongo com o anti-miR mais potente para uso para tratamento in vivo, consulte a Figura 33A-C para resultados de confirmação. Nas sequências abaixo, as letras maiúsculas são modificadas por LNA e as letras minúsculas não são modificadas; as orientações para o miR-22 (SEQ ID NO: 1) e para os oligonucleotídeos anti-miR-22 (SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 10) são orientadas de 5' para 3'. A Figura 8 mostra os oligonucleotídeos anti-miR-22 orientados de 3' a 5' como seriam quando hibridassem com miR-
22. Os oligonucleotídeos de SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 12, orientados de 5' para 3', são sequências embaralhadas e não hibridam com o miR-22 (SEQ ID NO: 1). hsa-miR-22 AAGCUGCCAGUUGAAGAACUGU (SEQ ID NO: 1) CRM0008 TGGCAGCT (SEQ ID NO: 2) CRM0009 CtTcaACtgGcAgCT (SEQ ID NO: 4) CRM0010 CTTcaACtgGCAgCT (SEQ ID NO: 5)
CRM0011 TCtTCAaCtgGCAgCT (SEQ ID NO: 6) CRM0012 TCtTcaaCtGGCAgCT (SEQ ID NO: 7) CRM0013 TCtTCAacTgGCAgCT (SEQ ID NO: 8) CRM0014 TTctTCAacTgGCAgCT (SEQ ID NO: 9) CRM0015 GTtctTcaaCtgGCaGCT (SEQ ID NO: 10) CRM0016 CGaATAgTtaGTAgCG (SEQ ID NO: 11) CRM0017 marcado com FAM-CGaATAgTtaGTAgCG (SEQ ID NO: 12) Terapia anti-miR-22 in-vivo
[00215] Em um planejamento experimental in vivo para prevenção, consulte a Figura 9, miR-22 -/- e WT em HFD com 2 meses de idade foram transfectados com Veículo (VCH), RNA de Controle de Embaralhamento (SCR) e ácido nucleico bloqueado (LNA) e tratados com a dose de carga de 20 mg/kg (primeira vez) e uma dose de manutenção de 10 mg/kg por injeção IP semanal absorção não assistida. Não houve diferença entre camundongos tratados e não tratados no consumo de alimentos, ver Figura 10. A inibição farmacológica in vivo do miR-22 evitou que os camundongos se tornassem obesos e a terapia anti-miR-22 in vivo foi capaz de aumentar o nível de proteína dos principais alvos do miR-22 no fígado. O tratamento com anti-miR-22 não afetou a composição lipídica do fígado, mas suprimiu profundamente a esteatose hepática.
[00216] Para avaliar a potencial expressão de gene do metabolismo da gordura, síntese e diferenciação em camundongos tratados e não tratados, RNAs de Fígados, tecido adiposo branco (WAT) e tecido adiposo marrom (BAT) foram extraídos dos camundongos tratados com VHL, SCR LNA ou expressão de LNA anti-miR-22 e mRNA de TET2, PTEN (Controle Positivo), FTO, CEBPa, PPARg que estão envolvidos no metabolismo relacionado à gordura e na via de síntese e UCP1 e CD36 (como marcador de Brown) foram determinados (ver Figura 12).
[00217] Em uma abordagem curativa, camundongos miR-22-/- e WT em uma HFD tratados com um anti-miR-22-LNA, SCR e um VHL e colocados em um segundo regime de HFD. Após 3,5 meses de tratamento, houve uma redução significativa no peso corporal em camundongos já obesos (peso médio > 40g) e alimentados com HFD. Os camundongos foram sacrificados, os tecidos coletados, o RNA de Fígados usado para RNAseq (Figuras 16A-C, 17). A inibição farmacológica do miR-22 demonstrou reverter o fenótipo obeso em camundongos (Figura 18). A Figura 19A-C é um gráfico de RNA-seq que mostra a análise de agrupamento de hierarquia do fígado de camundongos indicando que a inibição farmacológica de miR-22 e o agrupamento de Knockout (KO) genético juntos, indicando que o tratamento está no alvo e que o fenótipo KO pode ser imitado usando construto de LNA e um gráfico de RNA-Seq mostrando a análise da ontologia do gene no fígado de camundongos, indicando que a via infrarregulada em camundongos tratados com KO e LNA é o metabolismo de lipídios e a biossíntese relacionada é representada na Figura 20. A terapia anti-miR-22 in vivo fortemente infrarregulada do ACL e a inibição farmacológica do miR-22 mostraram ser eficazes em impedir a diferenciação adipocítica dos MEFs.
[00218] Os resultados indicam que a terapia anti-miR-22 impede que camundongos ganhem peso quando alimentados com ração HFD, reverte o fenótipo obeso em camundongos obesos alimentados com ração HFD, não afeta o consumo de alimentos e direciona de forma eficaz o fígado e WAT in vivo. Além disso, o tratamento com anti-miR-22 afeta o nível de proteína dos genes alvo do miR-22 e não afeta nenhuma classe de lipídeos específica, mas é capaz de reduzir a quantidade total de lipídeos totais em camundongos. Exemplo 3: miR-22 controla a obesidade e a proteína associada à massa gorda e obesidade (FTO).
[00219] miR-22 direciona diretamente PTEN e TET para promover a tumorigênese e metástase. PTEN como muitos outros genes de direcionamento miR-22 estão envolvidos no metabolismo e oxidação de ácidos graxos ou biogênese incluindo, por exemplo, SIRT-1, BMP-7, PPAR-alpha, PPAR-γ, SP-1, PGC1a, FGF-21, UCP1, semelhantes à Metiltransferase 3
DDIT4. A expressão de FTO foi profundamente infrarregulada durante a diferenciação induzida por tecido adiposo em MEF deficiente em miR-22, mas não em MEF WT (Figura 26) e diminuição dos níveis de infrarregulação (genética ou farmacológica) de miR-22 de RNA m6A (Figura 27A-B). A infrarregulação de Mir-22 demonstrou não afetar a função hepática ou mostrar qualquer doença ou disfunção hepática na velhice (Figuras 28A-B, 29).
[00220] Para avaliar se a superexpressão de miR-22 afeta a função hepática, fígado gorduroso e fibrose, camundongos entre 8 e 10 meses de idade foram alimentados com dieta normal. Foi demonstrado que o miR-22 OE leva a um fígado gorduroso e aumenta a presença de células FSP-1 positivas. FSP-1 identifica uma subpopulação de macrófagos no fígado, associada à fibrose.
[00221] No geral, o miR-22 em um onco-miR (direcionamento de PTEN, transformação de MEF, EMT), o miR-22 é 100% conservado em humanos e camundongos, o miR-22 OE leva a um fenótipo obeso em ND, camundongos miR-22 KO não ganham peso em HFD, miR-22 silenciando farmacologicamente MEF prejudicado e MES humano para diferenciar em adipócitos, o tratamento com LNA anti-miR-22 impede que camundongos se tornem obesos em um ambiente de prevenção, o tratamento com LNA anti- miR-22 reverte fenótipo obeso em camundongos obesos alimentados com HFD, o silenciamento de miR-22 não mostra qualquer toxicidade hepática, o silenciamento de miR-22 previne esteatose e fibrose no fígado, miR-22 pode direcionar múltiplos genes relacionados ao metabolismo e biogênese de lipídeos ao mesmo tempo.
OUTRAS MODALIDADES
[00222] Será entendido que, embora a divulgação tenha sido descrita em conjunto com a descrição detalhada da mesma, a descrição anterior se destina a ilustrar e não limitar o escopo da invenção, o qual é definido pelo escopo das reivindicações anexas. Outros aspectos, outras vantagens e outras modificações estão dentro do escopo das reivindicações seguintes.
INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA
[00223] Todas as patentes e publicações referidas aqui são incorporadas em sua totalidade por meio deste por referência.
[00224] As publicações discutidas aqui são fornecidas unicamente pela sua divulgação antes da data de depósito do presente pedido. Nada aqui será interpretado como uma admissão de que a presente invenção não tem direito a precedência a tal publicação em virtude de invenção anterior.
[00225] Como usados neste documento, todos os títulos são simplesmente para organização e não se destinam a limitar a divulgação de maneira alguma.

Claims (34)

REIVINDICAÇÕES
1. Método para tratar ou prevenir um distúrbio metabólico, caracterizado pelo fato de que compreende administrar uma quantidade eficaz de um inibidor de miR-22 a um sujeito em necessidade do mesmo.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a expressão e/ou atividade de miR-22 é reduzida no sujeito em seguida à administração do inibidor.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o inibidor de miR-22 é um inibidor à base de oligonucleotídeo.
4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o inibidor à base de oligonucleotídeo compreende uma sequência que é pelo menos cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99% ou cerca de 100% complementar a uma sequência madura de miR-22.
5. Método, de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que o inibidor à base de oligonucleotídeo compreende desoxinucleotídeos ou ribonucleotídeos.
6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 5, caracterizado pelo fato de que o inibidor à base de oligonucleotídeo é de fita simples.
7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 5, caracterizado pelo fato de que o inibidor à base de oligonucleotídeo é de fita dupla.
8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 7, caracterizado pelo fato de que o inibidor à base de oligonucleotídeo compreende um ou mais nucleotídeos modificados quimicamente.
9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que os nucleotídeos modificados quimicamente são nucleotídeos travados (LNAs).
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 9,
caracterizado pelo fato de que o inibidor à base de oligonucleotídeo compreende cerca de 25, cerca de 20, cerca de 15, cerca de 10, cerca de 9, cerca de 8, cerca de 7, cerca de 6, ou cerca de 5, ou menos nucleotídeos.
11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 10, caracterizado pelo fato de que o inibidor à base de oligonucleotídeo é conjugado a uma ou mais frações de N-acetilgalactosamina (GalNAc).
12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 11, caracterizado pelo fato de que o inibidor à base de oligonucleotídeo é um inibidor de oligonucleotídeo antissenso.
13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 11, caracterizado pelo fato de que o inibidor à base de oligonucleotídeo é um pequeno RNA interferente (siRNA).
14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 11, caracterizado pelo fato de que o inibidor à base de oligonucleotídeo é um aptâmero.
15. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o inibidor de miR-22 é um inibidor à base de peptídeo ou à base de proteína.
16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o inibidor à base de proteína em um anticorpo ou uma fração de ligação ao antígeno do mesmo.
17. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o inibidor de miR-22 é um inibidor à base de molécula pequena.
18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o distúrbio metabólico é obesidade.
19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o sujeito está sofrendo de Síndrome de Prader-Willi.
20. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o sujeito está sofrendo de hipercolesterolemia.
21. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o sujeito abriga uma variante de proteína associada a massa gorda e obesidade (FTO) e/ou mostra uma suprarregulação de expressão e/ou atividade de FTO.
22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 21, caracterizado pelo fato de que o sujeito é obeso e tem um índice de massa corporal superior a cerca de 30.
23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 21, caracterizado pelo fato de que o sujeito está com sobrepeso e tem um índice de massa corporal de cerca de 25 a 29,9.
24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 23, caracterizado pelo fato de que o método induz perda de peso.
25. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o método induz uma perda de peso total de cerca de 1%, cerca de 5%, cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 20%, ou cerca de 25% ou mais no sujeito.
26. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 23, caracterizado pelo fato de que o método evita ganho de peso.
27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 26, caracterizado pelo fato de que o método reduz ou evita o crescimento de tecido adiposo.
28. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 26, caracterizado pelo fato de que o método prejudica diferenciação de adipócito.
29. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o distúrbio metabólico é uma doença do fígado gordo.
30. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que a doença do fígado gordo é selecionada de doença do fígado gordo de ácido graxo não alcoólica (NAFLD) ou esteato-hepatite não alcoólica
(NASH).
31. Método, de acordo com a reivindicação 29 ou 30, caracterizado pelo fato de que o método reduz ou previne esteatose do fígado.
32. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 31, caracterizado pelo fato de que o método reduz ou evita fibrose do fígado.
33. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 32, caracterizado pelo fato de que o método reduz a atividade e/ou expressão de proteína associada a massa gorda e obesidade (FTO), ALKB Homólogo 5 (ALKBH5), CCAAT/intensificador de ligação de proteína alfa (CEBP), receptor ativado do proliferador de peroxissona gama (PPAR), receptor ativado de proliferador de peroxissoma alfa (PPARa), ATP citrato liase (ACLY), coativador  PPAR (PGC1-), Proteína Específica 1 (SP1), Fator de Crescimento de Fibroblasto 21 (FGF-21), Proteína não acoplada 1 (UCP1), Transcrito Incluído de Dano de DNA 4 (DDIT-4, REDD1), proteína tumoral p63 (TP63), fator de crescimento de fibroblasto 1 (FGF1) e/ou Metiltransferase tipo 3 (METTL3).
34. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 33, caracterizado pelo fato de que o método aumenta a atividade e/ou expressão de fosfatase e homólogo de tensina (PTEN) e/ou tet metilcitosina dioxigenase 2 (TET2).
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