KR101889518B1 - 마이크로ＭＩＲｓ - Google Patents

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사카리 카우피넨
요아킴 엘멘
모르텐 린도우
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로슈 이노베이션 센터 코펜하겐 에이/에스
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Abstract

본 발명은 생체내에서 마이크로RNA를 표적화 및 억제하는, 고도로 변형된 매우 짧은 올리고뉴클레오타이드, 및 의약으로서의 이들의 용도 및 의약 조성물에 관한 것이다.

Description

마이크로ＭＩＲｓ{MICROMIRs}
본 발명은 생체내에서 마이크로 RNA를 표적화하여 억제하는 매우 짧은 올리고뉴클레오타이드, 및 의약으로서의 이들의 용도 및 의약 조성물에 관한 것이다.
마이크로 RNA (miRNAs)는 그의 표적 mRNA와 염기쌍을 형성함으로써, 유전자 발현의 전사 후 조절자 (post-transcriptional regulators)로서 기능하는 그 종류가 매우 풍부한 짧은 내인성 RNA이다. 이들은 RNAse III 효소 다이서 (Dicer)에 의하여 프리-miRNA로 명명된 보다 긴 (약 70-80 nt) 헤어핀형 전구체로부터 만들어진다. 마이크로RNA는 miRNP로 명명된 리보뉴클레오단백질 복합체에서 조립되어 안티센스 상보성에 의해 그들의 표적 부위를 인식함으로써 그들의 표적 유전자의 하향 조절을 매개한다. miRNA와 그의 표적 부위 사이의 상보성이 거의 완벽하거나 또는 완벽한 경우에는 표적 mRNA이 절단되는 반면, 마이크로RNA와 그의 표적 부위 사이에 상보성이 제한적일 경우에는 표적 유전자의 번역이 억제되는 결과가 초래된다.
인간의 질병에 있어서의 마이크로RNA의 역할과, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 이용한 마이크로RNA의 억제 방법이 WO2007/112754 및WO2007/112753에 개시되어 있으며, 이들 문헌은 그 내용 전부가 본 발명에 참고로 통합된다. 역시 본 발명에 참고로 통합되는 WO2008046911은 암과 연관이 있는 마이크로RNA 서열을 제공하고 있다. 수많은 마이크로RNA들이 여러가지 질병의 표현형과 연관이 있기 때문에 생체 내에서 마이크로RNA의 이용성을 조절할 수 있는 물질을 제공하는 것이 바람직하다. WO2007/112754와 WO2007/112753은 그들의 표적 miRNA와 강력한 듀플렉스를 형성하는 것으로 여겨지는 단일 가닥의 짧은 올리고뉴클레오타이드를 개시하고 있다. SEQ ID NO. 1-45는 WO2007/112754와 WO2007/112753에 개시된 항 마이크로RNA 올리고뉴클레오타이드의 예이다.
관련 출원
본 출원은 다음의 4개 출원, 즉: 2007년 10월 4일자 US 60/977497, 2007년 10월 11일자 US 60/979217, 2008년 2월 12일자 US 61/028062 및 2008년 7월 17일자 EP08104780에 기초한 우선권을 주장하며, 이들 문헌은 모두 본 발명에 참고로 통합된다. 또한, 본 출원인의 선행 출원인 WO2007/112754 및 WO2007/112753의 내용도 본 발명에 참고로 통합된다.
발명의 개요
본 발명은 마이크로RNA를 표적화하고, LNA 뉴클레오타이드와 같이 뉴클레오타이드 유사 뉴클레오타이드 비율이 높은 매우 짧은 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 것이, 생체내에서 표적화 마이크로RNA에 의해, mRNA와 같은 RNA의 억제를 경감시키는데 매우 효과적이라는 발견에 기초한 것이다.
본 발명은 세포 또는 생명체에서 마이크로RNA 표적의 유효량을 감소시키기 위한, 길이가 7, 8, 9 또는 10개 뉴클레오타이드 유닛인 인접 (contiguous) 서열로 된 올리고머를 제공하는데, 여기서 상기 올리고머의 뉴클레오타이드 유닛의 70% 이상, 예컨대 80% 이상은 LNA 유닛과 2' 치환된 뉴클레오타이드 유사체로 이루어진 군으로부터 선택된 것이다.
본 발명은 세포 또는 생명체에서 마이크로RNA 표적의 유효량을 감소시키기 위한, 길이가 7, 8, 9 또는 10개 뉴클레오타이드 유닛인 인접 서열로 된 올리고머를 제공하는데, 여기서 상기 올리고머의 뉴클레오타이드 유닛의 70% 이상은 LNA 유닛과 2' 치환된 뉴클레오타이드 유사체로 이루어진 군으로부터 선택된 것이며, 여기서 상기 올리고머의 뉴클레오타이드 유닛의 적어도 50%, 예컨대 적어도 60%, 예컨대 적어도 70%는 LNA 유닛이다.
본 발명은 예컨대 7, 8, 9개의 뉴클레오타이드 유닛과 같이 총 7 내지 10개의 뉴클레오타이드로 된 인접 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 올리고머로서, 그 올리고머 유닛의 적어도 50%는 뉴클레오타이드 유사체인 것인, 7 내지 10개 뉴클레오타이드 길이의 올리고머를 제공한다.
본 발명은 또한 7, 8, 9 또는 10개 뉴클레오타이드 유닛과 같이, 총 7 내지 10개 뉴클레오타이드의 인접 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 7 내지 10개 뉴클레오타이드 길이의 올리고머를 제공하는데, 여기서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 포유류 또는 바이러스의 마이크로RNA에서 발견되는 대응하는 뉴클레오타이드 서열과 상보적인 것이고, 상기 올리고머의 뉴클레오타이드 유닛의 적어도 50%는 뉴클레오타이드 유사체인 것이다.
본 발명은 의약으로서의 본 발명에 따른 올리고머를 제공한다.
본 발명은 본 발명에 따른 올리고머와 약학적으로 허용되는 희석제, 담체, 염 또는 아쥬반트를 포함하는 의약 조성물을 제공한다.
본 발명은, 본 발명에 따른 올리고머가 1종 이상의 스테롤, 예컨대 콜레스테롤과 같은 비뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 물질에 컨쥬게이션된 컨쥬게이트를 제공한다.
본 발명은 본문에 개시된 1종 이상의 마이크로RNA와 같은 마이크로RNA의 존재 또는 과발현과 연관된 질병 또는 의학적 장애를 치료하기 위한 의약을 제조하는데 있어서의 본 발명에 따른 올리고머 또는 컨쥬게이트의 용도를 제공한다.
본 발명은 본 발명에 따른 올리고머 또는 컨쥬게이트를 포함하는 조성물을 마이크로RNA의 존재 또는 과발현과 연관된 질병 또는 의학적 장애를 앓고 있는 환자에게 투여하는 단계를 포함하여 이루어지는, 마이크로RNA의 존재 또는 과발현과 연관된 질병 또는 의학적 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 본 발명의 올리고머 또는 본 발명에 따른 올리고머나 컨쥬게이트를 포함하는 조성물 (예컨대 의약 조성물)을 세포 또는 생명체에게 투여하는 것을 포함하여 이루어지는, 세포 또는 생명체에서 마이크로RNA 표적의 유효량을 감소시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 본 발명에 따른 올리고머 또는 컨쥬게이트 또는 의약 조성물을 세포 또는 생명체에게 투여하는 것을 포함하여 이루어지는, 세포 또는 생명체에서 마이크로RNA 표적의 유효량을 감소시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 본 발명에 따른 올리고머, 또는 상기 올리고머나 컨쥬게이트를 함유하는 조성물을 세포 또는 생명체에게 투여하는 것을 포함하여 이루어지는, 상기 세포 또는 생명체에 있어서 표적 mRNA (또는 1 이상의 RNA)를 탈억제 (de-repression)시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 인간 세포와 같이, 마이크로RNA를 포함하는 세포에서, 상기 마이크로RNA를 억제하기 위한, 본 발명에 따른 올리고머 또는 컨쥬게이터의 용도를 제공한다. 이러한 용도는 생체내 또는 시험관내의 경우를 모두 포괄할 수 있다.
LNA가 통합되어 이는 짧은 올리고뉴클레오타이드는 시험관내 시약 분야에 알려져 있다 (예컨대 WO2005/098029 및WO2006/069584 참조). 그러나 진단 또는 시약 용도로서 설계된 분자들은 생체내 또는 의약 용도로 사용되는 것들과는 그 구조가 매우 다르다. 예를 들어, 시약 올리고의 말단 뉴클레오타이드는 일반적으로 LNA가 아니라 DNA이고, 인터뉴클레오사이드 결합 (internucleoside linkages)은 일반적으로 본 발명의 올리고뉴클레오타이드에서 바람직한 결합으로서 사용되는 것인 포스포로티오에이트가 아니다. 본 발명은 따라서 그 자체가 새로운 부류인 올리고뉴클레오타이드 (본 발명에서 올리고머로 칭한다)를 제공한다.
다음의 구체예들은 의약 조성물에서 사용될 수 있는 본 발명의 올리고머의 특정 구체예에 관한다. 본 발명의 올리고머에 관한 설명들은 인접 뉴클레오타이드 서열에 관한 것이기도 하고 그 역도 성립한다.
올리고머
본 발명의 올리고머는 LNA와 같은 뉴클레오타이드 유사체를 포함하는 단일 가닥의 올리고뉴클레오타이드로서 여기서 상기 LNA와 같은 뉴클레오타이드 유사체는 상기 올리고뉴클레오타이드의 인접 뉴클레오타이드 서열의 일부 또는 전체를 형성한다.
"올리고뉴클레오타이드" (또는 간단히 "올리고")라는 용어는 본 발명에서 "올리고머"라는 용어와 호환적으로 사용되며, 2개 이상의 뉴클레오타이드의 공유 결합에 의해 형성되는 분자를 지칭하는 것이다. 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 (단일 가닥의 올리고뉴클레오타이드라고도 칭함)라는 용어의 의미상, "올리고뉴클레오타이드"라는 용어는 한 가지 실시 상태에서, 7 내지 10개의 뉴클레오타이드, 예컨대 각각의 실시 상태로는 7, 8, 9 또는 10개의 뉴클레오타이드를 갖는 것이다.
"뉴클레오타이드"라는 용어는 DNA 및 RNA와 같은 뉴클레오타이드, 및 뉴클레오타이드 유사체를 가리킨다. 어느 측면에서는, 뉴클레오염기 (nucleobase)라는 용어 역시도 자연 발생적이거나 자연 발생적이지 않은 뉴클레오타이드를 가리키는데 이용될 수 있다 - 이러한 관점에서 뉴클레오염기 및 뉴클레오타이드라는 용어는 본 발명에서 호환적으로 사용될 수 있다.
어떤 실시 상태에서, 인접 뉴클레오타이드 서열은 7개의 뉴클레오타이드 유사체로 구성된다. 어떤 실시 상태에서, 인접 뉴클레오타이드 서열은 8개의 뉴클레오타이드 유사체로 구성된다. 어떤 실시 상태에서, 인접 뉴클레오타이드 서열은 9개의 뉴클레오타이드 유사체로 구성된다.
한가지 실시 상태에서, 올리고머의 뉴클레오타이드의 적어도 약 50%, 예컨대 적어도 약 55%, 예컨대 적어도 약 60%, 또는 예컨대 적어도 약 65% 또는 예컨대 적어도 약 70%, 예컨대 적어도 약 75%, 예컨대 적어도 약 80%, 예컨대 적어도 약 85%, 예컨대 적어도 약 90%, 예컨대 적어도 약 95%, 또는 예컨대 100%는 뉴클레오타이드 유사체이다. 올리고뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 유사체만으로 이루어진 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수도 있다는 것이 자명하다. 본 발명의 올리고머는 적어도 하나의 LNA 모노머, 예컨대 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9 또는 10개의 LNA 모노머를 포함하여 이루어질 수 있다. 전술한 바와 같이, 인접 뉴클레오타이드 서열은 LNA 유닛 (포스포로티오에이트 결합과 같은 결합기를 포함한다)만으로 구성될 수도 있고, 또는 LNA와 다른 뉴클레오타이드 유사체로 구성될 수도 있다. 어떤 실시 상태에서, 인접 뉴클레오타이드 서열은 하나 또는 두개의 DNA 뉴클레오타이드를 포함하고, 나머지 뉴클레오타이드는 LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체일 수도 있다.
어떤 실시 상태에 있어서, 인접 뉴클레오타이드 서열은 6개의 뉴클레오타이드 유사체와 하나의 DNA 뉴클레오타이드로 구성된다. 어떤 실시 상태에서는, 인접 뉴클레오타이드는 7개의 뉴클레오타이드 유사체와 하나의 DNA 뉴클레오타이드로 이루어진다. 어떤 실시 상태에서는, 인접 뉴클레오타이드는 8개의 뉴클레오타이드 유사체와 하나의 DNA 뉴클레오타이드로 이루어진다. 어떤 실시 상태에서는, 인접 뉴클레오타이드는 9개의 뉴클레오타이드 유사체와 하나의 DNA 뉴클레오타이드로 이루어진다. 어떤 실시 상태에서는, 인접 뉴클레오타이드는 7개의 뉴클레오타이드 유사체와 두개의 DNA 뉴클레오타이드로 이루어진다. 어떤 실시 상태에서는, 인접 뉴클레오타이드는 8개의 뉴클레오타이드 유사체와 두개의 DNA 뉴클레오타이드로 이루어진다.
올리고머는 인접 뉴클레오타이드 서열로 이루어질 수 있다.
특히 바람직한 실시 상태에서, 모든 뉴클레오타이드 유사체는 LNA인 것이 좋다. 또 다른 바람직한 실시 상태에서, 올리고머의 모든 뉴클레오타이드는 LNA인 것이 좋다. 또 다른 바람직한 실시 상태에서, 올리고머의 모든 뉴클레오타이드는 LNA이고, 모든 인터뉴클레오사이드 결합기는 포스포티오에이트인 것이 좋다.
본문에서, "질소계 염기 (nitrogenous base)"라는 용어는 퓨린 및 피리미딘, 예컨대 DNA 뉴클레오염기 A, C, T 및 G 및 RNA 뉴클레오염기 A, C, U 및 G 뿐만 아니라 비 DNA/RNA 뉴클레오염기, 예컨대 5-메틸시토신 (MeC), 이소시토신, 슈도이소시토신, 5-브로모우라실, 5-프로피닐우라실, 5-프로피닐-6-플루오로우라실, 5-메틸티아졸우라실, 6-아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 이노신, 2,6-디아미노퓨린, 7-프로핀-7-데아자아데닌, 7-프로핀-7-데아자구아닌 및 2-클로로-6-아미노퓨린, 특히 MeC를 모두 포괄한다. 비 DNA/RNA 뉴클레오염기의 실질적인 선택은 그 올리고뉴클레오타이드가 표적화하고자 하는 마이크로RNA 가닥 내에 존재하는 대응 (또는 맷칭) 뉴클레오타이드에 따라 달라진다. 예를 들어서, 대응하는 뉴클레오타이드가 G이면, 일반적으로, G에 대한 수소 결합을 수립할 수 있는 비 DNA/RNA 뉴클레오염기를 선택하는 것이 필요할 것이다. 대응하는 뉴클레오타이드가 G인 이 특수한 경우에 있어서, 바람직한 비 DNA/RNA 뉴클레오염기는 MeC이다.
"한가지 실시 상태"라는 표현은 오직 하나의 특정 실시 상태만을 가리키는 것이 아니라, "몇몇 실시 상태"에 존재할 수 있는 특성, 또는 본 발명의 일반적인 특성을 지칭할 수 있는 것임을 이해하여야 한다. 마찬가지로, "어떤 (몇몇) 실시 상태"라는 표현은 어떤 특정 실시 상태, 또는 그러한 실시 상태의 집합의 특성 또는 심지어는 본 발명의 일반적인 특성을 설명하는데 이용될 수 있다.
"대응하다"와 "대응하는"이라는 표현은 올리고머의 뉴클레오타이드 서열 또는 인접 뉴클레오타이드 서열 (제1 서열)을, i) 마이크로RNA 핵산 표적 (예컨대 SEQ ID 40 - SEQ ID 976 중에서 선택된 마이크로RNA 표적)의 역 상보적인 서브 서열, 및/또는 ii) SEQ ID NO 977-1913 또는 SEQ ID NO 1914-2850, 또는 SEQ ID NO 2851-3787로 이루어진 군 중에서 제공된 뉴클레오타이드 서열 중에서 선택된 또 다른 서열의 동등한 인접적 뉴클레오타이드 서열과 비교하는데 사용된다. 뉴클레오타이드 유사체는 그와 균등하거나 그에 대응하는 뉴클레오타이드와 직접 비교된다. i) 또는 ii) 하에서 또 다른 서열과 대응하는 (인접 뉴클레오타이드 서열과 같은) 제1 서열은 일반적으로 제1 서열의 길이 전반에 걸쳐 그 서열과 동일하다
본 명세서에서 뉴클레오타이드 분자의 길이에 관하여 설명할 때, 그 길이는 모노모 유닛, 즉 뉴클레오타이드의 수에 대응하는 것으로서, 여기서 상기 모노머 유닛이 뉴클레오타이드인지 뉴클레오타이드 유사체인지는 관계없다. 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오염기와 관련하여, 이들 용어 모노머와 유닛은 본 발명에서 호환적으로 사용된다.
"약"이라는 용어는 특정한 값 또는 값의 범위를 가리키는 것으로, 특정한 값 또는 관련 범위를 포괄하는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명에서 "하이브리다이제이션"이라는 용어는 수소 결합을 의미하며, 이는 다시 상보적인 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드 염기들 사이의 왓슨-크릭 (Watson-Crick) 결합, 훅스틴 (Hoogsteen) 결합, 역 훅스틴 수소 결합 등일 수 있다. DNA에서 흔히 발견되는 네가지 뉴클레오염기는 G, A, T 및 C로서 G는 C와, A는 T와 쌍을 이룬다. RNA에서 T는 우라실 (U)로 대체되는데, 이것은 A와 쌍을 이룬다. 표준적인 이중가닥 형성에 참여하는 뉴클레오염기에 있어서 이들 화학 기들은 왓슨-크릭 페이스 (Watson-Crick face)를 구성한다. 몇 년 후에 훅스틴은 그들의 왓슨-크릭 페이스에 더해서 퓨린 뉴클레오염기가 이중가닥의 외부로부터 인식될 수 있음으로 해서 수소 결합을 통해 피리미딘 올리고뉴클레오타이드에 결합하는데 이용되어, 삼중 나선 구조를 형성할 수 있음을 입증한 바 있다.
본 발명의 내용상 "상보적(complementary)"이라는 용어는 두개의 뉴클레오타이드 서열이 서로 정확한 쌍을 이룰 수 있는 능력을 가리킨다. 예컨대, 올리고뉴클레오타이드의 어떤 특정 위치에서 하나의 뉴클레오타이드가 DNA 또는 RNA 분자의 대응하는 위치에 있는 뉴클레오타이드와 수소 결합을 할 수 있다면, 상기 올리고뉴클레오타이드와 상기 DNA 또는 RNA는 그 위치에서 서로 상보적인 것으로 간주된다. DNA 또는 RNA 가닥은, 올리고뉴클레오타이드 중의 충분한 수의 뉴클레오타이드들이 표적 DNA 또는 RNA 중의 대응하는 뉴클레오타이드와 수소 결합을 형성하여 안정한 복합체를 형성하는 경우, 서로 상보적인 것으로 간주된다. 시험관내 또는 생체내에서 안정하기 위해서 올리고뉴클레오타이드 서열이 그의 표적 마이크로RNA와 100% 상보적인 필요는 없다. "상보적" 및 "특이적으로 하이브리다이제이션 가능한"이라는 표현은 따라서, 비표적 RNA의 기능에는 하등 영향을 미침이 없이, 표적 RNA의 정상적인 기능만을 원하는대로 간섭하도록, 그 올리고뉴클레오타이드가 표적 분자와 충분히 강하고 특이적인 결합을 형성하는 것을 의미한다. 그러나, 한가지 바람직한 실시 상태에서, 상보적이라는 용어는 100% 상보적 또는 전적으로 상보적임을 의미하는 것이다.
바람직한 한가지 예에서 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 miRNA 서열, 예컨대 인간의 마이크로RNA 서열, 또는 본문에 언급된 마이크로RNA 서열들 중 하나와 100% 상보적이다.
바람직한 한가지 예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 인간의 마이크로RNA 서열의 씨드 영역 (seed region)과 100% 상보적인 인접 서열을 포함한다.
바람직하게는, "마이크로RNA" 또는 "miRNA"라는 용어는 본 발명의 내용 상, 18 내지 25개 뉴클레오타이드 길이로 이루어진 RNA 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 기능적 용어 측면에서 miRNA는 일반적으로 조절적인 내인성 RNA 분자이다.
"표적 마이크로RNA" 또는 "표적 miRNA"라는 용어는 인간의 질병에 있어서 생물학적 역할을 함으로 해서, 문제의 질환의 치료 매개 과정에서 표적이 되는 마이크로RNA를 가리키는 것으로, 예컨대 암에 있어서 상향 조절된, 발암성 (oncogenic) miRNA 또는 종양 억제자 miRNA가 그 예이다.
"표적 유전자" 또는 "표적 mRNA"라는 용어는 마이크로RNA의 조절적인 mRNA 표적을 가리키는데, 여기서 상기 "표적 유전자" 또는 "표적 mRNA"는 miRNA와 그의 표적 부위 사이의 완전하거나 거의 완전한 상보성에 기초한 마이크로RNA에 의해 전사후 (post-transcriptionally) 적으로 조절되어 표적 mRNA 절단; 또는 제한적인 상보성을 결과시키는데, 이는 종종 소위 씨드 서열 (miRNA의 뉴클레오타이드 2-7) 및 표적 mRNA의 번역 억제를 초래하는 표적 부위 사이의 상보성에 종종 기인한다.
본 발명의 내용상, 올리고뉴클레오타이드는 단일 가닥이며, 이는 그 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 올리고뉴클레오타이드가 부재함을 의미한다 - 즉, 그 올리고뉴클레오타이드가 siRNA와 같이, 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드 복합체가 아님을 의미한다. 한가지 실시 상태에서, 본 발명의 조성물은 8개 이상, 예컨대 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개의 인접 뉴클레오타이드와 같이 5개 이상의 뉴클레오타이드의 올리고머와 상보 영역을 갖는 부가적인 올리고뉴클레오타이드를 포함하지 않는다.
길이
놀랍게도 본 발명자들은 이러한 짧은 '항miRs'가 생체내에서 마이크로RNA의 특이적 억제를 향상시키주는 한편, 마이크로RNA 표적에 대한 현저한 특이성을 유지시켜준다는 것을 발견하였다. 또 다른 장점은 마이크로RNA 종들 - 예컨대 본 명세서에 설명된 바와 같은 씨드 영역들 사이의 상동적인 짧은 서열들의 보존으로 인해, 몇몇 마이크로RNA를 동시적으로 억제할 수 있다는 것이다. 본 발명에 따라, 7, 8, 9, 10 뉴클레오타이드, 예컨대 7, 8 또는 9 뉴클레오타이드의 짧은 올리고뉴클레오타이드를 갖는 것이 특히 유리한 것으로 밝혀졌다.
서열
인접 뉴클레오타이드 서열은 포유동물, 인간 또는 바이러스의 마이크로RNA (miRNA) 서열, 바람직하게는 인간 또는 바이러스의 miRNA 서열의 대응 영역에 상보적이다 (예컨대 100% 상보적-즉, 완전히 상보적).
마이크로RNA 서열은 성숙한 마이크로RNA인 것이 적합할 수 있다. 어떤 실시 상태에서 마이크로RNA는 마이크로RNA 전구체일 수 있다.
인간의 마이크로RNA 서열은 본 발명에 그 내용 전부가 참고로 통합된 WO2008/046911에 개시된 바와 같은 SEQ ID NO 1-558 중에서 선택될 수 있다. WO2008/047911에 설명된 바와 같이, 이들 마이크로RNA는 암과 연관이 있다.
바이러스의 마이크로RNA 서열은 어떤 실시 상태에서는 헤르페스 심플렉스 바이러스 1, 카포시 육종 관련 헤르페스바이러스, 엡스타인 바 바이러스 및 인간의 시토메갈로바이러스로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.
한가지 실시 상태에 있어서, 인접 뉴클레오타이드 서열은 표 1에 수록되니 miRNA의 군으로부터 선택된 miRNA 서열의 대응하는 영역과 상보적이다 (예컨대 100% 상보적). 표 1에는 miRBase (Release 12.0-http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/)에 공개된, 인간 및 바이러스의 마이크로RNA를 표적으로 하는 7mer, 8mer 및9mer 올리고머가 제시되어 있다.
어떤 실시 상태에서, 본 발명에 따른 올리고머는 miR-1, miR-10b, miR-17-3p, miR-18, miR-19a, miR-19b, miR-20, miR-21, miR-34a, miR-93, miR-106a, miR-106b, miR-122, miR-133, miR-134, miR-138, miR-155, miR-192, miR-194, miR-221, miR-222, miR-375로 이루어진 군 중에서 선택된 대응하는 마이크로RNA 서열에 상보적인 인접 뉴클레오타이드 서열로(을) 구성되거나 포함할 수 있다.
따라서, 한가지 실시 상태에서, miRNA (즉, 표적 miRNA)는 miR-1, miR-10b, miR-17-3p, miR-18, miR-19a, miR-19b, miR-20, miR-21, miR-34a, miR-93, miR-106a, miR-106b, miR-122, miR-133, miR-134, miR-138, miR-155, miR-192, miR-194, miR-221, miR-222, 및 miR-375로 이루어진 군 중에서 선택된다.
한가지 실시 상태에서, miRNA 표적은 miR 17, miR 106a, miR 106b, miR 18, miR 19a, miR 19b/1, miR 19b/2, miR20/93, miR92/1, miR92/2 및 miR25와 같은 miR 17 - 92 클러스터의 일원일 수 있다.
한가지 실시 상태에서, 인접 뉴클레오타이드 서열은 miR-21, miR-155, miR-221, mir-222, 및 mir-122 중에서 선택된 마이크로RNA (mRNA) 서열의 대응하는 영역과 상보적이다.
어떤 실시 상태에서 상기 miRNA는 miR-1, miR-10miR-29, miR-125b,miR-126, miR-133, miR-141, miR-143, miR-200b, miR-206, miR-208, miR-302, miR-372, miR-373, miR-375, 및 miR-520c/e로 이루어진 군 중에서 선택된다.
어떤 실시 상태에서, 인접 뉴클레오타이드 서열은 miR-17-5p, miR-20a/b, miR-93, miR-106a/b, miR-18a/b, miR-19a/b, miR-25, miR-92a, miR-363로 이루어진 군 중에서 선택된 마이크로RNA와 같은 miR 17-92 클러스터 내에 존재하는 마이크로RNA (miRNA) 서열의 대응하는 영역과 상보적이다.
한가지 실시 상태에서, miRNA (즉, 표적 miRNA)는 hsa-miR-21와 같은 miR-21이다. 한 가지 실시 상태에서, miRNA (즉, 표적 miRNA)는 hsa-miR-122와 같은 miR-122이다. 한 가지 실시 상태에서, miRNA (즉, 표적 miRNA)는 hsa-miR-19b와 같은 miR-19b이다. 한 가지 실시 상태에서, miRNA (즉, 표적 miRNA)는 hsa-miR-155와 같은 miR-155이다. 한 가지 실시 상태에서, miRNA (즉, 표적 miRNA)는 hsa-miR-375와 같은 miR-375이다. 한 가지 실시 상태에서, miRNA (즉, 표적 miRNA)는 hsa-miR-106b와 같은 miR-375이다.
인접 뉴클레오타이드 서열이 19b, 21, 122, 155 및 375 중에서 선택된 hsa-miR과 같은 대응하는 영역과 상보적인 것이 적합할 수 있다.
씨드 (seed) 영역 및 씨드머 ( seedmers )
본 발명자들은 잠금 핵산 (LNA: locked nucleic acid) 유닛과 같은 고친화성 뉴클레오타이드 유사체와 같은 뉴클레오타이드 유사체를(로) 포함하거나 구성된 신중하게 설계된 짧은 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드가, 마이크로RNA의 유의적인 사일런싱을 일으킴으로 해서, 마이크로RNA 수준을 감소시킨다는 것을 발견하였다. 상기 올리고뉴클레오타이드와, 표적 마이크로RNA의 5' 말단부터 세어서, 일반적으로 뉴클레오타이드 2 내지 8 또는 뉴클레오타이드 2 내지 7에 해당하는 소위 씨드 서열과의 강한 결합이 중요하다는 것이 밝혀졌다. 표적 마이크로RNA의 뉴클레오타이드 1은 쌍을 이루지 않는 염기이며 Ago2 단백질 중의 결합 포켓 중에 숨어있을 것으로 강하게 추정된다. 특정 이론에 구애되는 것은 아니나, 본 발명자들은 씨드 영역 서열을 선택하고, 특히 LNA, 바람직하게는 상기 씨드 영역에 상보적인 영역 중의 LNA 유닛을 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 이용함으로써, miRNA와 올리고뉴클레오타이드 간의 듀플렉스가 오프 표적 효과를 회피하면서 miRNA를 표적화하는데 특히 효과적인 한편, RISC 지향성 miRNA 기능을 방지하는 추가적인 특성도 제공할 수 있다고 여기고 있다.
본 발명자들은, LNA-변형된 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드가 쌍을 이루지 않는 이 뉴클레오타이드 1에 대응하는 뉴클레오타이드를 3' 말단에 함유하지 않을 경우, 마이크로RNA 사일런싱 효과가 훨씬 더 증대됨을 발견하였다. 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단의 적어도 2개의 LNA 유닛은, 뉴클레아제에 대한 상기 올리고뉴클레오타이드의 내성을 높였다는 것이 추가로 밝혀졌다.
한 가지 실시 상태에 있어서, 올리고머의 첫번째 또는 두번째 3' 뉴클레오타이드는 마이크로RNA 서열의 두번째 5' 뉴클레오타이드에 대응하며, LNA와 같은 뉴클레오타이드 유사체일 수 있다.
한 가지 실시 상태에 있어서, 올리고머의 뉴클레오타이드 유닛 1 내지 6 (1과 6을 모두 포함)은 올리고머의 3' 말단 영역으로부터 측정된 바와 같이 마이크로RNA 씨드 영역 서열에 상보적이며, 이들 모두는 LNA와 같은 뉴클레오타이드 유사체일 수 있다.
한 가지 실시 상태에 있어서, 올리고머의 뉴클레오타이드 유닛 1 내지 7 (1과 7을 모두 포함)은 올리고머의 3' 말단 영역으로부터 측정된 바와 같이 마이크로RNA 씨드 영역 서열에 상보적이며, 이들 모두는 LNA와 같은 뉴클레오타이드 유사체일 수 있다.
한 가지 실시 상태에 있어서, 올리고머의 뉴클레오타이드 유닛 2 내지 7 (2와 7을 모두 포함)은 올리고머의 3' 말단 영역으로부터 측정된 바와 같이 마이크로RNA 씨드 영역 서열에 상보적이며, 이들 모두는 LNA와 같은 뉴클레오타이드 유사체일 수 있다.
한 가지 실시 상태에 있어서, 올리고머는 miRNA 씨드 영역에 상보적인 영역 중의 위치에서, 적어도 하나의 LNA 유닛과 같은, 적어도 하나의 뉴클레오타이드 유사체 유닛을 포함한다. 한가지 실시 상태에서, 이 올리고머는 miR 씨드 영역에 상보적인 영역 중의 위치에서, 1 내지6 LNA 유닛 및 1 내지 7 LNA 유닛과 같이, 1 내지 6 또는 1 내지 7 뉴클레오타이드 유사체 유닛을 포함할 수 있다.
한 가지 실시 상태에 있어서, 연속 뉴클레오타이드 서열은 상기 마이크로RNA의 씨드 서열에 대하여 상보적인 (예컨대 100% 상보적) 서열을(로) 포함하거나 이루어질 수 있다.
한 가지 실시 상태에 있어서, 연속 뉴클레오타이드 서열은 표 1에 제시된 씨드머 서열들 중에서 선택된 서열을(로) 포함하거나 이루어질 수 있다.
한 가지 실시 상태에 있어서, 씨드머의 3' 뉴클레오타이드는 인접 뉴클레오타이드 서열의 최말단 3' 뉴클레오타이드를 형성하는데, 여기서 상기 인접 뉴클레오타이드 서열은 필요에 따라, 씨드머 서열에 더해 하나 또는 두개의 추가적인 뉴클레오타이드 5'를 포함할 수 있다.
한 가지 실시 상태에 있어서, 올리고머는 5' 말단으로부터 세어서 마이크로RNA 서열 중에 존재하는 첫번째 뉴클레오타이드에 대응하는 뉴클레오타이드를 갖지 않는다.
한 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드는 표적 마이크로RNA의 5' 말단 뉴클레오타이드에 대응하는 뉴클레오타이드를 3' 말단에 갖지 않는다.
뉴클레오타이드 유사체
본 발명에 따라, 예컨대 7, 8 또는 9 뉴클레오타이드와 같이 7, 8, 9, 10 뉴클레오타이드로 된 짧은 올리고뉴클레오타이드로서, 상기 올리고머의 뉴클레오타이드 유닛의 적어도 50%, 예컨대 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 예컨대 100%가 잠금 핵산 (LNA: Locked Nucleic Acid) 뉴클레오타이드 유닛과 같은 (바람직하게는 고친화성) 뉴클레오타이드 유사체인 것인, 짧은 올리고뉴클레오타이드가 특히 유리한 것으로 밝혀졌다.
어떤 실시 상태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 7, 8, 또는 9개 뉴클레오타이드 길이이며, 인간 또는 바이러스의 마이크로RNA의 씨드 영역과 상보적인 인점 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 여기서 상기 뉴클레오타이드의 적어도 75%, 예컨대 적어도 80%, 예컨대 적어고 85%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 95%, 예컨대 100%는 잠금 핵산 (LNA) 뉴클레오타이드 유닛이다.
어떤 실시 상태에서, 이러한 올리고머에서는, 결합기가 포스포디에스테르 결합이 아니며, 예를 들면 포스포로티오에이트 결합이다.
어떤 실시 상태에서, 상기 인접 뉴클레오타이드 서열의 뉴클레오타이드 유닛은 모두 LNA 뉴클레오타이드 유닛이다.
어떤 실시 상태에서, 인접 뉴클레오타이드 서열은 7, 8, 9 또는 10개의, 바람직하게는 인접하는 LNA 뉴클레오타이드 유닛으로(을) 구성되거나 포함한다.
또 다른 바람직한 실시 상태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 7, 8 또는 9개 뉴클레오타이드 길이로서, 인간 또는 바이러스의 마이크로RNA의 씨드 영역에 상보적인 인접 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 여기서 뉴클레오타이드의 적어도 80%는 LNA이고, 인터뉴클레오타이드 결합 (internucleotide linkage)의 적어도 80%, 예컨대 85%, 예컨대 90%, 예컨대 95%, 예컨대 100%는 포스포로티오에이트 결합이다. 상기 올리고머의 인접 뉴클레오타이드 서열 (씨드머)는 씨드 영역 밖으로 연장될 수 있다.
어떤 실시 상태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 7개 뉴클레오타이드 길이이며 이들 7개 모두는 LNA이다.
어떤 실시 상태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 8개 뉴클레오타이드 길이이며 여기서 최대 1개의 뉴클레오타이드는 LNA가 아닌 것일 수 있다. 어떤 실시 상태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 9개 뉴클레오타이드 길이이며 여기서 최대 1개 또는 2개의 뉴클레오타이드는 LNA가 아닌 것일 수 있다. 어떤 실시 상태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 10개 뉴클레오타이드 길이이며 여기서 최대 1개, 2개 또는 3개의 뉴클레오타이드는 LNA가 아닌 것일 수 있다. LNA가 아닌 다른 뉴클레오타이드는 예를 들면 DNA이거나, 또는 2' 치환된 뉴클레오타이드 유사체일 수 있다.
고친화성 뉴클레오타이드 유사체는 이와 동등한 DNA 뉴클레오타이드가 상보적인 RNA 뉴클레오타이드에 대하여 갖는 결합 친화성보다, 상기 상보적인 RNA 뉴클레오타이드에 대하여 더 높은 듀플렉스 열안정성을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 결과시키는 뉴클레오타이드 유사체이다. 이것은 Tm을 측정함으로써 결정할 수 있다.
어떤 실시 상태에서, 인접 뉴클레오타이드 서열에 존재하는 뉴클레오타이드 유사체 유닛은 2'-O_알킬-RNA 유닛, 2'-OMe-RNA 유닛, 2'-아미노-DNA 유닛, 2'-플루오로-DNA 유닛, LNA 유닛, PNA 유닛, HNA 유닛, INA 유닛, 및 2'MOE RNA 유닛으로 이루어진 군 중에서, 필요에 따라 독립적으로 선택된다.
어떤 실시 상태에서, 인접 뉴클레오타이드 서열 중에 존재하는 뉴클레오타이드 유사체 유닛은 2'-O_알킬-RNA 유닛, 2'-OMe-RNA 유닛, 2'-아미노-DNA 유닛, 2'-플루오로-DNA 유닛, LNA 유닛, 및 2'MOE RNA 유닛으로 이루어진 군 중에서 필요에 따라 독립적으로 선택된다.
2'플루오로-DNA라는 용어는 2' 위치에서 불소로 치환된 (2'F) DNA 유사체를 가리킨다. 2'플루오로-DNA는 2'플루오로-뉴클레오타이드의 바람직한 형태이다.
어떤 실시 상태에서, 올리고머는 적어도 4개의 뉴클레오타이드 유사체 유닛, 예컨대 적어도 5개의 뉴클레오타이드 유사체 유닛, 예컨대 적어도 6개의 뉴클레오타이드 유사체 유닛, 예컨대 적어도 7개의 뉴클레오타이드 유사체 유닛, 예컨대 적어도 8개의 뉴클레오타이드 유사체 유닛, 예컨대 적어도 9개의 뉴클레오타이드 유사체 유닛, 예컨대 적어도 10개의 뉴클레오타이드 유사체 유닛을 포함한다.
한 가지 실시 상태에 있어서, 올리고머는 LNA 유닛을 적어도 3개, 예컨대 LNA 유닛을 적어도 4개, 예컨대 LNA 유닛을 적어도 5개, 예컨대 LNA 유닛을 적어도 6개, 예컨대 LNA 유닛을 적어도 7개, 예컨대 LNA 유닛을 적어도 8개, 예컨대 LNA 유닛을 적어도 9개, 예컨대 LNA 유닛을 적어도 10개 포함한다.
한 가지 실시 상태에 있어서 LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체들 중 적어도 하나는 시토신 또는 구아닌이며, 예컨대 LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체 1-10은 시토신이거나 구아닌이다. 예컨대 LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체들 중 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9개는 시토신 또는 구아닌이다.
한 가지 실시 상태에 있어서 LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체들 중 적어도 2개는 시토신 또는 구아닌이다. 한 가지 실시 상태에서, LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체들 중 적어도 3개는 시토신 또는 구아닌이다. LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체들 중 적어도 4개는 시토신 또는 구아닌이다. LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체들 중 적어도 5개는 시토신 또는 구아닌이다. LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체들 중 적어도 6개는 시토신 또는 구아닌이다. LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체들 중 적어도 7개는 시토신 또는 구아닌이다. LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체들 중 적어도 8개는 시토신 또는 구아닌이다.
바람직한 한 가지 실시 상태에서, 뉴클레오타이드 유사체는 이와 동등한 DNA 뉴클레오타이드가 상기 상보적인 RNA 뉴클레오타이드에 대하여 갖는 결합 친화성보다 더 높은 듀플렉스 열안정성을 상보적인 RNA 뉴클레오타이드에 대하여 갖는다.
한 가지 실시 상태에 있어서, 뉴클레오타이드 유사체는 단일 가닥의 올리고뉴클레오타이드에 대하여 증대된 혈청 안정성을 부여한다.
서열목록 및 표 1 중의 특이적인 SEQ IDs는 LNA 모노머와 포스포로티오에이트 (PS) 백본을 갖는 LNA 모노머의 올리고머를 나타내는 것인 반면, 본 발명은 LNA를 대체하여 또는 LNA와 병합하여 다른 뉴클레오타이드 유사체 및/또는 결합을 사용하는 것을 포괄하는 것임을 이해하여야 한다. 따라서, 서열 목록에 나타난 뉴클레오타이드 (염기) 서열은 LNA/PS, LNA와 같은 LNA의 것일 수 있거나, 또는 동일한 염기 서열 (A, T, C 또는 G)을 보유하는, 슈가/결합 화학과 같은 대체 백본 화학을 함유하는 올리고머일 수 있다.
2'-MOE RNA 또는 2'-플루오로 뉴클레오타이드와 같은 다른 뉴클레오타이드 유사체가 본 발명에 따른 올리고머에서 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대되지만, 올리고머는 LNA를 높은 비율로, 예컨대 그의 뉴클레오타이드의 적어도 50%를 LNA로서 함유하는 것이 바람직하다. 뉴클레오타이드 유사체는 2'-H기가 -OH (RNA) 이외의 것, 예컨대 -O-CH3, -O-CH2-CH2-O-CH3, -O-CH2-CH2-CH2-NH2, -O-CH2-CH2-CH2-OH 또는 -F에 의해 치환된 DNA 유사체와 같은 DNA 유사체일 수 있다. 뉴클레오타이드 유사체는 체는 예컨대 -O-CH3, -O-CH2-CH2-O-CH3, -O-CH2-CH2-CH2-NH2, -O-CH2-CH2-CH2-OH 또는 -F와 같이, -H (DNA)가 아닌 다른 기에 의해 그의 2'-OH 기가 치환되어 변형된 RNA 유사체와 같은 RNA 유사체일 수 있다. 하나의 실시 상태에서, 뉴클레오타이드 유사체는 "ENA" 이다.
LNA
본 발명의 내용상, "LNA 유닛", "LNA 모노머", "LNA 잔기", "잠금 핵산 유닛", '잠금 핵산 모노머" 또는 "잠금 핵산 잔기"라는 용어는 바이시클릭 뉴클레오사이드 유사체를 가리키는 것이다. LNA 유닛은 그 중에서도 WO 99/14226, WO 00/56746, WO 00/56748, WO 01/25248, WO 02/28875, WO 03/006475 및 WO 03/095467에 설명되어 있다. LNA 유닛은 또한 그의 화학식으로 정의될 수도 있다. 따라서, "LNA 유닛"은 본 명세서에서 다음 화학식 1에 도시된 화학 구조를 갖는다.
화학식 1
Figure 112010028980901-pct00001
식 중,
X는 O, S 및 NRH이고, 여기서 RH는 H 또는 C1 -4-알킬; Y는 (-CH2)r이고, 여기서 r은 1-4의 정수이며; B는 질소계 염기이다.
본 발명의 한가지 바람직한 실시 상태에서, r은 1 또는 2, 특히 1이다. 즉, 바람직한 LNA 유닛은 다음 화학식 2의 화학 구조를 갖는다:
화학식 2
Figure 112010028980901-pct00002
식 중 X와 B는 상기 정의한 바와 같다.
흥미로운 한가지 구체예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드에 통합된 LNA 유닛은 티오-LNA 유닛, 아미노-LNA 유닛 및 옥시-LNA 유닛으로 이루어진 군 중에서 독립적으로 선택된다.
따라서, 티오-LNA는 다음 화학식 3의 화학 구조를 가질 수 있다:
화학식 3
Figure 112010028980901-pct00003
식 중, B는 상기 정의한 바와 같다.
바람직하게는, 티오-LNA 유닛은 베타-D형으로 존재하는 것이, 즉 상기 3A의 화학 구조를 갖는 것이 좋다. 마찬가지로, 아미노-LNA 유닛은 다음 화학식 4의 화학 구조를 가질 수 있다.
화학식 4
Figure 112010028980901-pct00004
식 중 B와 RH는 상기 정의한 바와 같다.
바람직하게는, 아미노-LNA 유닛은 베타-D형으로 존재하는 것이, 즉 상기 4A의 화학 구조를 갖는 것이 좋다. 옥시-LNA 유닛은 다음 화학식 4의 화학 구조를 가질 수 있다.
화학식 5
Figure 112010028980901-pct00005
식 중 B는 상기 정의한 바와 같다.
바람직하게는, 옥시-LNA는 베타-D형으로 존재하는 것이, 즉 상기 5A의 화학 구조를 갖는 것이 좋다. 상기 표시된 바와 같이, B는 천연 또는 비천연 기원의 것일 수 있는 질소계 염기이다. 질소계 염기의 특수한 예로는 아데닌 (A), 시토신 (C), 5-메틸시토신(MeC), 이소시토신, 슈도이소시토신, 구아닌 (G), 티민 (T), 우라실 (U), 5-브로모우라실, 5-프로피닐우라실, 5-프로피닐-6,5-메틸티아졸우라실, 6-아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 이노신, 2,6-디아미노퓨린, 7-프로핀-7-데아자아데닌, 7-프로핀-7-데아자구아닌 및 2-클로로-6-아미노퓨린을 들 수 있다.
"티오-LNA 유닛"이라는 용어는 상기 화학식 1에서 X가 S인 LNA 유닛을 가리킨다. 티오-LNA 유닛은 베타-D형과 알파-L형의 두가지 모두로 존재할 수 있다. 일반적으로, 티오-LNA 유닛의 베타-D형이 바람직하다. 티오-LNA 유닛의 베타-D형과 알파-L형은 화학식 3에서 각각 화합물 3A와 3B로 표시되어 있다.
"아미노-LNA 유닛"이라는 용어는 화학식 1에서 X가 NH 또는 NRH이고, RH는 수소 또는 C1 -4-알킬인 LNA 유닛을 가리키는 것이다. 아미노-LNA 유닛은 베타-D형으로도, 알파 L-형으로도 있을 수 있다. 일반적으로, 아미노-LNA 유닛의 베타-D형이 바람직하다. 아미노-LNA 유닛의 베타-D형과 알파-L형은 상기 화학식 4에서 각각 화합물 4A 및 4B이다.
"옥시-LNA 유닛"이라는 용어는 화학식 1에서 LNA X가 O인 LNA 유닛을 가리킨다. 옥시-LNA 유닛은 베타-D형과 알파-L형 두가지 모두로 존재할 수 있다. 일반적으로 옥시-LNA 유닛의 베타-D형이 바람직하다. 옥시-LNA 유닛의 베타-D형과 알파-D형은 상기 화학식 5에서 각각 화합물 5A와 5B이다.
본 발명의 내용상, "C1 -6-알킬"이라는 용어는 선형 또는 분지형 포화 탄화수소사슬을 의미하는 것으로서, 최장 사슬은 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, 펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸 및 헥실과 같이 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 것이다. 분지형 탄화수소 사슬은 어떤 탄소에서든 탄화수소 사슬로 치환된 C1 -6-알킬을 의미하는 것이다.
본 발명의 내용상, "C1 -4-알킬"이라는 용어는 선형 또는 분지형 포화 탄화수소사슬을 의미하는 것으로서, 최장 사슬은 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸과 같이 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 것이다. 분지형 탄화수소 사슬은 어떤 탄소에서든 탄화수소 사슬로 치환된 C1 -4-알킬을 의미하는 것이다.
본 발명에서 "C1 -6-알콕시"라는 용어는 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시, n-부톡시, 이소부톡시, sec-부톡시, tert-부톡시, 펜톡시, 이소펜톡시, 네오펜톡시 및 헥속시와 같은 C1 -6-알킬-옥시를 의미하는 것이다.
본 발명의 내용상, "C2 -6-알케닐"이라는 용어는 2 내지 6개의 탄소 원자와 1개 이상의 이중 결합을 갖는 선형 또는 분지형 탄화수소기를 의미하는 것이다. C2 -6-알케닐기의 예로는 알릴, 호모-알릴, 비닐, 크로틸, 부테닐, 부타디에닐, 펜테닐, 펜타디에닐, 헥세닐 및 헥사디에닐을 들 수 있다. 불포화 (이중 결합) 위치는 탄소 사슬의 어느 위치든 가능하다.
본 발명의 내용상, "C2 -6-알키닐"이라는 용어는 2 내지 6개의 탄소 원자와 1개 이상의 삼중 결합을 갖는 선형 또는 분지형 탄화수소기를 의미하는 것이다. C2 -6-알키닐기의 예로는, 아세틸렌, 프로피닐, 부티닐, 펜티닐 및 헥시닐을 들 수 있다. 불포화 (삼중 결합) 위치는 탄소 사슬의 어느 위치든 가능하다. 당업자에게 잘 알려진 바와 같이, 두개 이상의 결합이 불포화될 수 있으며, 예컨대, "C2 -6-알키닐"은 디-인 (di-yne) 또는 엔디-인 (enedi-yne)이다.
본 발명의 내용상 DNA 유닛을 그의 대응하는 LNA 유닛으로 치환한다고 할 때, "대응하는 LNA 유닛"이라 함은 어떤 DNA 유닛이, 그 DNA 유닛이 함유하는 질소계 염기와 동일한 질소계 염기를 함유하는 LNA 유닛에 의해 대체된다는 것으로서, 예컨대 질소계 염기 A를 함유하는 어떤 DNA 유닛의 대응하는 LNA 유닛 역시도 질소계 염기 A를 함유함을 의미한다. 예외가 있다면, 어떤 DNA 유닛이 염기 C를 함유할 경우, 대응하는 LNA 유닛은 염기 C, 염기 MeC, 바람직하게는 MeC를 함유할 수 있다는 것이다.
본 발명에서, "비LNA 유닛 (non-LNA unit)"이라는 용어는 LNA 유닛과는 다른 뉴클레오사이드를 가리키는 것으로, "비LNA 유닛"이라는 용어에는 RNA 유닛 뿐만 아니라 DNA 유닛도 포함된다. 바람직한 비LNA 유닛은 DNA 유닛이다.
"유닛", "잔기" 및 "모노머"라는 용어들은 본 발명에서 상호 호환적으로 사용된다.
"적어도 하나"라는 용어는 1과 같거나 더 큰 정수, 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 등을 포함한다.
"a" 및 "an"과 같은 관사가 뉴클레오타이드, 시약, LNA 유닛 등에 관하여 사용될 경우, 하나 이상을 의미한다. 특히, "...로 이루어진 군 중에서 선택된 성분 (예컨대 뉴클레오타이드, 시약, LNA 유닛 등)"이라는 표현은 인용된 성분들 중 하나 이상이 선택될 수 있음을 의미하는 것이다. 따라서, "A, B 및 C로 이루어진 군 중에서 선택된 성분"이라는 표현은 A, B 및 C의 가능한 모든 조합, 즉, A, B, C, A+B, A+C, B+C 및 A+B+C를 포함한다.
인터뉴클레오사이드 결합 ( Internuleoside Linkages)
"인터뉴클레오사이드 결합기"라는 용어는 예컨대 DNA 유닛들 간, DNA 유닛과 뉴클레오타이드 유사체 간, 두개의 비LNA 유닛 간, 비LNA 유닛과 LNA 유닛 간, 및 두개의 LNA 유닛 사이 등 처럼, 두개의 뉴클레오타이드를 서로 공유적으로 커플링시킬 수 있는 기를 의미한다. 일예컨대 포스페이트, 포스포디에스테르기 및 포스포티오에이트기를 들 수 있다.
어떤 실시 상태에서는, 올리고머 내의 인터뉴클레오사이드 결합들 중 적어도 하나, 예컨대 모두가 포스포디에스테르이다. 그러나, 생체내 용도에 있어서는, 포스포로티오에이트 결합이 바람직할 수 있다.
올리고뉴클레오타이드에 있어서 전형적인 인터뉴클레오사이드 결합은 포스페이트기이지만, 이들은 포스페이트와는 다른 인터뉴클레오사이드기에 의해 대체될 수 있다. 또 다른 흥미로운 본 발명의 실시 상태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 그의 인터뉴클레오사이드 결합기 구조가 변형된 것인데, 즉, 이러한 변형된 올리고뉴클레오타이드는 포스페이트와는 다른 인터뉴클레오사이드 결합을 포함한다. 따라서, 바람직한 한가지 실시 상태에서, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드는 포스페이트와는 다른 인터뉴클레오사이드 결합기를 적어도 하나 포함한다.
포스페이트 (-O-P(O)2-O-)와 다른 인터뉴클레오사이드 결합기의 특정 예로는 -O-P(O,S)-O-, -O-P(S)2-O-, -S-P(O)2-O-, -S-P(O,S)-O-, -S-P(S)2-O-, -O-P(O)2-S-, -O-P(O,S)-S-, -S-P(O)2-S-, -O-PO(RH)-O-, O-PO(OCH3)-O-, -O-PO(NRH)-O-, -O-PO(OCH2CH2S-R)-O-, -O-PO(BH3)-O-, -O-PO(NHRH)-O-, -O-P(O)2-NRH-, -NRH-P(O)2-O-, -NRH-CO-O-, -NRH-CO-NRH-, -O-CO-O-, -O-CO-NRH-, -NRH-CO-CH2-, -O-CH2-CO-NRH-, -O-CH2-CH2-NRH-, -CO-NRH-CH2-, -CH2-NRH-CO-, -O-CH2-CH2-S-, -S-CH2-CH2-O-, -S-CH2-CH2-S-, -CH2-SO2-CH2-, -CH2-CO-NRH-, -O-CH2-CH2-NRH-CO -, -CH2-NCH3-O-CH2-를 들 수 있으며, 여기서, RH는 수소 또는 C1 -4-알킬이다.
인터뉴클레오사이드 결합기가 변형된 것인 경우, 그 인터뉴클레오사이드 결합기는 포스포로티오에이트기 (-O-P(O,S)-O- )인 것이 바람직하다. 바람직한 한가지 실시 상태에서, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드의 모든 인터뉴클레오사이드 결합기는 포스포로티오에이트이다.
인터뉴클레오사이드 결합은: -O-P(O)2-O-, -O-P(O,S)-O-, -O-P(S)2-O-, -S-P(O)2-O-, -S-P(O,S)-O-, -S-P(S)2-O-, -O-P(O)2-S-, -O-P(O,S)-S-, -S-P(O)2-S-, -O-PO(RH)-O-, O-PO(OCH3)-O-, -O-PO(NRH)-O-, -O-PO(OCH2CH2S-R)-O-, -O-PO(BH3)-O-, -O-PO(NHRH)-O-, -O-P(O)2-NRH-, -NRH-P(O)2-O-, -NRH-CO-O-, -NRH-CO-NRH-로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있으며 및/또는 인터뉴클레오사이드 결합은: -O-CO-O-, -O-CO-NRH-, -NRH-CO-CH2-, -O-CH2-CO-NRH-, -O-CH2-CH2-NRH-, -CO-NRH-CH2-, -CH2-NRH-CO-, -O-CH2-CH2-S-, -S-CH2-CH2-O-, -S-CH2-CH2-S-, -CH2-SO2-CH2-, -CH2-CO-NRH-, -O-CH2-CH2-NRH-CO -, -CH2-NCH3-O-CH2-, (여기서 RH는 수소 및 C1 -4-알킬 중에서 선택된다)로 이루어진 군 중에서 선택될 수도 있다. 어떤 실시 상태에서는 황(S)을 함유하는 전술한 인터뉴클레오사이드 결합을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 인터뉴클레오사이드 결합은 독립적으로 선택될 수 있거나 또는 모두 동일할 수 있다. 예컨대, 모두 포스포로티오에이트 결합일 수도 있다. 한가지 실시 상태에서, 인접 뉴클레오타이드 서열의 뉴클레오타이드 유닛들 사이에 존재하는 인터뉴클레오사이드 결합의 적어도 75%, 예컨대 80% 또는 85% 또는 90% 또는 95% 또는 모두는 포스포로티오에이트 인터뉴클레오사이드 결합이다.
두개 이상의 마이크로RNA를 표적화하는 마이크로 mir 올리고뉴클레오타이드
한 가지 실시 상태에 있어서, 인접 뉴클레오타이드 서열은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 miRNA 서열과 같이 적어도 2개의 miRNA 서열들로 된 대응하는 서열에 상보적이다. 단일의 유니버설 염기 (universal base)를 사용하면, 본 발명의 단일 올리고머를 이용하여 두개의 독립적인 마이크로RNA를 표적화할 수 있는데 여기서 이들 두개의 독립적인 마이크로RNA 중 어느 하나 또는 두가지 모두는, 그 유니버설 뉴클레오타이드가 위치하는 자리의 올리고머에 대응하는 영역에서 하나의 미스맷치를 갖는 것이다.
한 가지 실시 상태에 있어서, 인접 뉴클레오타이드 서열은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 miRNA 씨드 영역 서열과 같은 적어도 두개의 miRNA 씨드 영역 서열에 상보적인 서열을(로) 포함하거나 이루어진다.
한 가지 실시 상태에 있어서, 인접 뉴클레오타이드 서열은 miR-221 및 miR-222 두가지 모두의 대응하는 영역에 상보적이다.
한 가지 실시 상태에 있어서, 인접 뉴클레오타이드 서열은 miR-17-92 클러스터의 멤버 두개 이상의 대응하는 영역 - 예컨대, miR-17-5p, miR-20a/b, miR-93, miR-106a/b 중 두개 이상 또는 모두; miR-25, miR-92a 및 miR-363 중 두개 이상 또는 모두의 대응하는 영역에 상보적이다.
한 가지 실시 상태에 있어서, 인접 뉴클레오타이드 서열은 5'GCTACAT3'에 상보적인 서열로(을) 구성되거나 포함한다.
올리고머 설계
한 가지 실시 상태에 있어서, 3' 말단으로부터 세어서, 본 발명에 따른 올리고머의 첫번째 뉴클레오타이드는 LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체이다. 한 가지 실시 상태에 있어서, 3' 말단으로부터 세어서, 본 발명에 따른 올리고머의 마지막 뉴클레오타이드는 LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체인데 이는 첫번째 뉴클레오타이드와 같거나 다를 수 있다.
한 가지 실시 상태에 있어서, 3' 말단으로부터 세어서, 본 발명에 따른 올리고머의 두번째 뉴클레오타이드는 LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체이다.
한 가지 실시 상태에 있어서, 3' 말단으로부터 세어서, 본 발명에 따른 올리고머의 9번째 및/또는 10번째 뉴클레오타이드는 LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체이다.
한 가지 실시 상태에 있어서, 3' 말단으로부터 세어서, 본 발명에 따른 올리고머의 9번째 뉴클레오타이드는 LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체이다.
한 가지 실시 상태에 있어서, 3' 말단으로부터 세어서, 본 발명에 따른 올리고머의 10번째 뉴클레오타이드는 LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체이다.
한 가지 실시 상태에 있어서, 3' 말단으로부터 세어서, 본 발명에 따른 올리고머의 9번째와 10번째 뉴클레오타이드는 두개 모두 LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체이다.
한 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명의 올리고머는 3개를 초과하는 연속 DNA 뉴클레오타이드 유닛으로 된 영역을 포함하지 않는다. 한 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명의 올리고머는 2개를 초과하는 연속 DNA 뉴클레오타이드 유닛으로 된 영역을 포함하지 않는다.
한 가지 실시 상태에 있어서, 올리고머는 적어도 두개의 연속 LNA 유닛과 같은 적어도 두개의 연속 뉴클레오타이드 유사체 유닛으로 이루어진 영역을 적어도 포함한다. 한 가지 실시 상태에서, 올리고머는 적어도 세개의 연속 LNA 유닛과 같은 적어도 세개의 연속 뉴클레오타이드 유사체 유닛으로 이루어진 영역을 적어도 포함한다.
올리고머 중 LNA와 같은 뉴클레오타이드 유사체의 다른 패턴
적어도 6개의 LNA, 예컨대 적어도 7개의 뉴클레오타이드 유닛을 함유하는 올리고머들이 바람직할 것으로 여겨지고 있지만, 생체내에서 마이크로RNA를 표적화하는데 있어서 짧은 올리고머가 매우 효율적이라는 이러한 발견은, 고친화성 뉴클레오타이드 유사체와 같은 다른 뉴클레오타이드 유사체를 포함하는, 본 발명의 보다 짧은 올리고머를 제조하는데 이용될 수 있다.
3' 말단으로부터 세어서 1 내지 2 위치의 뉴클레오타이드를 변형시킨다. 위치 1 및/또는 2의 뉴클레오타이드는 LNA와 같은 고친화성 뉴클레오타이드 유사체이거나 또는 2'-O-알킬-RNA 유닛, 2'-OMe-RNA 유닛, 2'-아미노-DNA 유닛, 2'-플루오로-DNA 유닛, 2'-MOE-RNA 유닛, LNA 유닛, PNA 유닛, HNA 유닛, INA 유닛으로 이루어진 군 중에서 선택된 뉴클레오타이드 유사체일 수 있다. 따라서, 두개의 3' 뉴클레오타이드는 Xx, xX, XX 또는 xx일 수 있다. 여기서: 한 가지 실시 상태에 있어서 X는 LNA이고 x는 DNA 또는 예컨대 2'-O_알킬-RNA 유닛, 2'-OMe-RNA 유닛, 2'-아미노-DNA 유닛, 2'-플루오로-DNA 유닛, LNA, 및 2-MOE RNA 유닛으로 이루어진 군 중에서 선택된 2' 치환 뉴클레오타이드 유사체와 같은 다른 뉴클레오타이드 유사체이다. 또는 X는 뉴클레오타이드 유사체이고 x는 DNA이다.
2개의 3' 말단 뉴클레오타이드에서의 전술한 변형은 후술하는 바와 같이, 3' 말단으로부터 세어서 위치 3-8에 있는 뉴클레오타이드의 변형과 조합될 수 있다. 이와 관련하여, X 및 x로 표시된 뉴클레오타이드는 그 올리고머 중에서 동일할 수 있다. 만일 올리고머의 길이가 오직 7 뉴클레오타이드 길이라면, 3' 말단부터 세어서 8번째 뉴클레오타이드는 페기되어야 한다. 3' 말단부터 세어서 위치 3 내지 8의 뉴클레오타이드가 변형된 다음의 실시 상태에서, LNA 유닛은 하나의 실시 상태에서 본 발명에 예시된 ㅂ와 같은 다른 뉴클레오타이드 유사체로 대체될 수 있다. 따라서, "X"는 2'-O-알킬-RNA 유닛, 2'-OMe-RNA 유닛, 2'-아미노-DNA 유닛, 2'-플루오로-DNA 유닛, 2'-MOE-RNA 유닛, LNA 유닛, PNA 유닛, HNA 유닛, INA 유닛으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다. "x"는 바람직하게는 DNA 또는 RNA인 것이 좋고, DNA인 것이 가장 좋다. 그러나, X는 LNA인 것이 바람직하다.
본 발명의 한 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 3' 말단으로부터 세어서 위치 3 내지 8에서 변형된다. 이러한 서열의 설계는 존재하는 비LNA 유닛의 수나 또는 존재하는 LNA 유닛의 수에 따라 정의될 수 있다. 전자의 바람직한 한가지 실시 상태에서, 3' 말단부터 세어서 위치 3 내지 8의 뉴클레오타이드들 중 적어도 하나, 예컨대 하나는 비LNA 유닛이다. 또 다른 실시 상태에 있어서, 3' 말단부터 세어서 위치 3 내지 8의 뉴클레오타이드들 중 적어도 두개, 예컨대 두개는 비LNA 유닛이다. 또 다른 실시 상태에 있어서, 3' 말단부터 세어서 위치 3 내지 8의 뉴클레오타이드들 중 적어도 세개, 예컨대 세개는 비LNA 유닛이다. 또 다른 실시 상태에 있어서, 3' 말단부터 세어서 위치 3 내지 8의 뉴클레오타이드들 중 적어도 네개, 예컨대 네개는 비LNA 유닛이다. 또 다른 실시 상태에 있어서, 3' 말단부터 세어서 위치 3 내지 8의 뉴클레오타이드들 중 적어도 다섯개, 예컨대 다섯개는 비LNA 유닛이다. 또 다른 실시 상태에 있어서, 3' 말단부터 세어서 위치 3 내지 8의 뉴클레오타이드들 6개는 모두 비LNA 유닛이다.
달리 정의하면, 한가지 실시 상태에서, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드는 3' 말단부터 세어서 위치 3 내지 8에 적어도 3개의 LNA 유닛을 포함한다. 그 한가지 실시 상태에서, 본 발명의 올리고뉴클레타이드는 3' 말단부터 세어서 위치 3 내지 8에 3개의 LNA 유닛을 포함한다. 3' 말단부터 세어서 위치 3 내지 8 중의 뉴클레오타이드의 치환 패턴은 XXXxxx, xXXXxx, xxXXXx, xxxXXX, XXxXxx, XXxxXx, XXxxxX, xXXxXx, xXXxxX, xxXXxX, XxXXxx, XxxXXx, XxxxXX, xXxXXx, xXxxXX, xxXxXX, xXxXxX 및 XxXxXx으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있고, 여기서, "X"는 LNA 유닛을, "x"는 비LNA 유닛을 가리키는 것이다. 한가지 바람직한 실시 상태에서, 3' 말단부터 세어서 위치 3 내지 8 중의 뉴클레오타이드의 치환 패턴은 XXxXxx, XXxxXx, XXxxxX, xXXxXx, xXXxxX, xxXXxX, XxXXxx, XxxXXx, XxxxXX, xXxXXx, xXxxXX, xxXxXX, xXxXxX 및 XxXxXx로 이루어진 군 중에서 선택되며, 여기서 "X"는 LNA 유닛을, "x"는 비LNA 유닛을 가리키는 것이다. 더욱 바람직한 한가지 실시 상태에 있어서, 3' 말단부터 세어서 위치 3 내지 8 중의 뉴클레오타이드들의 치환 패턴은 xXXxXx, xXXxxX, xxXXxX, xXxXXx, xXxxXX, xxXxXX 및 xXxXxX로 이루어진 군 중에서 선택되며, 여기서 "X"는 LNA 유닛을, "x"는 비LNA 유닛을 가리키는 것이다. 한가지 실시 상태에서, 3' 말단부터 세어서 위치 3 내지 8 중의 뉴클레오타이드들의 치환 패턴은 xXxXxX 또는 XxXxXx이며, 여기서 "X"는 LNA 유닛을, "x"는 비LNA 유닛을 가리키는 것이다. 한가지 실시 상태에서, 3' 말단부터 세어서 위치 3 내지 8 중의 뉴클레오타이드의 치환 패턴은 xXxXxX이며 여기서 "X"는 LNA 유닛을, "x"는 비LNA 유닛을 가리키는 것이다.
또 다른 실시 상태에서, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드는 3' 말단부터 세어서 위치 3 내지 8 중에 적어도 4개의 LNA 유닛을 포함한다. 그의 한가지 실시 상태에서, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드는 3' 말단부터 세어서 위치 3 내지 8 중에 4개의 LNA 유닛을 포함한다. 3' 말단부터 세어서 위치 3 내지 8 중의 뉴클레오타이드들의 치환 패턴은 xxXXXX, xXxXXX, xXXxXX, xXXXxX, xXXXXx, XxxXXX, XxXxXX, XxXXxX, XxXXXx, XXxxXX, XXxXxX, XXxXXx, XXXxxX, XXXxXx 및 XXXXxx로 이루어진 군 중에서 선택되며, 여기서 "X"는 LNA 유닛을, "x"는 비LNA 유닛을 가리킨다.
또 다른 실시 상태에서, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드는 3' 말단부터 세어서 위치 3 내지 8 중에 적어도 5개의 LNA 유닛을 포함한다. 그의 한가지 실시 상태에서, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드는 3' 말단부터 세어서 위치 3 내지 8 중에 5개의 LNA 유닛을 포함한다. 3' 말단부터 세어서 위치 3 내지 8 중의 뉴클레오타이드들의 치환 패턴은 xXXXXX, XxXXXX, XXxXXX, XXXxXX, XXXXxX 및 XXXXXx로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있으며, 여기서, "X"는 LNA 유닛을, "x"는 비LNA 유닛을 가리킨다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드는 3' 말단부터 세어서 위치 3 내지 8 중에 하나 또는 두개의 LNA 유닛을 포함한다. 이는, 구조상 RNA:RNA 듀플렉스와 닮은 듀플렉스인 올리고:마이크로RNA 듀플렉스에 의해 형성되는 A-헬릭스에 의한 안정성 측면에서 유리하다.
또 다른 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드는 3' 말단부터 세어서 위치 3 내지 8 중에 적어도 6개의 LNA 유닛을 포함한다. 그의 한가지 실시 상태에서, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드는 3' 말단부터 세어서 위치 3 내지 6 중에 3 내지 6개의 LNA 유닛과, 이에 더해서, 동일 영역에서 0 내지 3개의 다른 고친화성 뉴클레오타이드 유사체를 포함하며, 이에 따라, 3' 말단부터 세어서 위치 3 내지 8 중의 고친화성 뉴클레오타이드 유사체 (LNA 유닛을 포함한다)의 총량은 6개 이하가 된다.
어떤 실시 상태에서, X가 LNA이면, 상기 비LNA 유닛 (x)는 2'-O_알킬-RNA 유닛, 2'-OMe-RNA 유닛, 2'-아미노-DNA 유닛, 2'-플루오로-DNA 유닛, LNA, 및 2'MOE RNA 유닛으로 이루어진 군 중에서 선택된 2' 치환된 뉴클레오타이드 유사체와 같은, 다른 뉴클레오타이드 유사체 유닛이다.
9 또는 10개의 뉴클레오타이드를 갖는 올리고머의 경우, 위치 9 및/ 또는 10의 뉴클레오타이드는 LNA와 같은 고친화성 뉴클레오타이드 유사체와 같은 뉴클레오타이드 유사체이거나, 또는 2'-O-알킬-RNA 유닛, 2'-OMe-RNA 유닛, 2'-아미노-DNA 유닛, 2'-플루오로-DNA 유닛, 2'-MOE-RNA 유닛, LNA 유닛, PNA 유닛, HNA 유닛, 및 INA 유닛으로 이루어진 군 중에서 선택된 뉴클레오타이드 유사체일 수 있다. 따라서 두개의 5' 뉴클레오타이드는 Xx, xX, XX 또는 xx일 수 있고, 여기서: 한 가지 실시 상태에 있어서 X는 LNA이고 x는 DNA이거나 또는 2'-O_알킬-RNA 유닛, 2'-OMe-RNA 유닛, 2'-아미노-DNA 유닛, 2'-플루오로-DNA 유닛, LNA, 및 2'MOE RNA 유닛으로 이루어진 군 중에서 선택된 2' 치환된 뉴클레오타이드 유사체와 같은 다른 뉴클레오타이드 유사체이다. 따라서, 상기 비LNA 유닛 (x)은 2'MOE RNA 또는 2'-플루오로-DNA일 수 있다. 다른 한편, X는 뉴클레오타이드 유사체이고, x는 DNA이다.
2개의 5' 말단 뉴클레오타이드에 있어서의 전술한 변형은 전술한 바와 같이 3' 말단부터 세어서 위치 3 - 8 중의 뉴클레오타이드, 및/또는 2개의 3' 뉴클레오타이드의 변형과 조합될 수 있다. 이와 관련하여, X 및 x로 표시된 뉴클레오타이드는 그 올리고머 중에서 같을 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시 상태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 5' 말단에 LNA 유닛을 함유한다. 또 다른 바람직한 실시 상태에서, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드는 5' 말단부터 세어서 처음 두 위치에서 LNA 유닛을 포함한다.
한가지 실시 상태에서, 본 발명은 본 발명의 약학적 조성물 측면, 또는 생물체의 생체내에서의, 예컨대 의약으로서의 용도를 갖는 올리고머를 제공하며, 여기서 상기 올리고머 (또는 인접 뉴클레오타이드 서열)는
i) 적어도 하나의 포스포로티오에이트 결합 및/또는
ii) 적어도 하나의 3' 말단 LNA 유닛, 및/또는
iii) 적어도 하나의 5' 말단 LNA 유닛
중 어느 하나를 포함하는 것이다.
올리고머는 따라서 모든 결합이 포스포로티오에이트인 것과 같이, 적어도 하나의 포스포로티오에이트 결합과, 적어도 하나의 3' 말단 LNA 유닛 및 적어도 하나의 5' 말단 LNA 유닛을 함유한다.
대부분의 치료 용도에 있어서, 올리고뉴클레오타이드는 완전히 포스포로티올화된 것이 바람직하다 - 단, 뉴클레아제의 부재로 인하여, 포스포로티오에이트화가 독성적일 수 있는 뇌 또는 척수와 같은 CNS에서 사용될 경우의 치료적 올리고뉴클레오타이드는 예외인데, 이 경우 연속적인 DNA 유닛 사이에 조차 포스포디에스테르 결합을 사용할 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드에서 두개의 3' 뉴클레오타이드, 및/또는 만일 존재할 경우 9번째 및 10번째 (3' 말단부터 세어서)의 뉴클레오타이드 역시도 LNA일 수 있다.
한가지 실시 상태에서, 올리고머는 miRNA 씨드 영역에 상보적인 위치에서, 적어도 5개의 LNA 유닛과 같은 적어도 5개의 뉴클레오타이드 유사체를 포함한다.
한가지 실시 상태에서, 마이크로RNA 씨드 영역의 서열에 상보적인 올리고머의 뉴클레오타이드 서열은 (X)xXXXXX, (X)XxXXXX, (X)XXxXXX, (X)XXXxXX, (X)XXXXxX 및 (X)XXXXXx로 이루어진군 중에서 선택되며, 여기서 "X"는 LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체, (X)는 LNA 유닛과 같은 임의의 뉴클레오타이드 유사체를 나타내고, "x"는 DNA 또는 RNA 뉴클레오타이드 유닛을 가리킨다.
한 가지 실시 상태에 있어서, 올리고머는 miRNA 씨드 영역에 상보적인 위치에서, 6개 또는 7개 뉴클레오타이드 유사체 유닛, 예컨대 6개 또는 7개의 LNA 유닛을 포함한다.
한가지 실시 상태에서, 마이크로RNA 씨드 영역의 서열에 상보적인 올리고머의 뉴클레오타이드 서열은 XXXXXX, XxXXXXX, XXxXXXX, XXXxXXX, XXXXxXX, XXXXXxX 및 XXXXXXx로 이루어진 군 중에서 선택되며, 여기서 "X"는 LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체를 나타내고, "x"는 DNA 또는 RNA 뉴클레오타이드 유닛을 나타낸다.
한 가지 실시 상태에 있어서, 올리고머의 3' 말단부터 세어서 위치 7 내지 8의 2개의 뉴클레오타이드 모티프는 xx, XX, xX 및 Xx로 이루어진 군 중에서 선택되며, 여기서 "X"는 LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체를 나타내고, "x"는 DNA 또는 RNA 뉴클레오타이드 유닛을 가리킨다.
한 가지 실시 상태에 있어서, 올리고머의 3' 말단부터 세어서 위치 7 내지 8의 2개의 뉴클레오타이드 모티프는 XX, xX 및 Xx로 이루어진 군 중에서 선택되며, 여기서 "X"는 LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체를 나타내고, "x"는 DNA 또는 RNA 뉴클레오타이드 유닛을 가리킨다.
한 가지 실시 상태에 있어서, 올리고머는 12개의 뉴클레오타이드를 포함하며 여기서 올리고머의 3' 말단부터 세어서 위치 11 내지 12의 두개의 뉴클레오타이드 모티프는 xx, XX, xX 및 Xx로 이루어진 군 중에서 선택되며, 여기서 "X"는 LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체를 나타내고, "x"는 DNA 또는 RNA 뉴클레오타이드 유닛을 나타낸다.
한 가지 실시 상태에 있어서, 올리고머는 12개의 뉴클레오타이드를 포함하며 여기서 올리고머의 3' 말단부터 세어서 위치 11 내지 12의 두개의 뉴클레오타이드 모티프는 XX, xX 및 Xx로 이루어진 군 중에서 선택되며, 여기서 "X"는 LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체를 나타내고, "x"는 DNA 또는 RNA 뉴클레오타이드 유닛을 나타낸다.
한가지 실시 상태에서, 올리고머는 5' 말단에서 LNA 유닛과 같은 뉴클레오타이드 유사체 유닛을 포함한다.
한 가지 실시 상태에 있어서, X와 같은 뉴클레오타이드 유사체 유닛은 다음으로 이루어진 군 중에서 선택된다: 2'-O-알킬-RNA 유닛, 2'-OMe-RNA 유닛, 2'-아미노-DNA 유닛, 2'-플루오로-DNA 유닛, 2'-MOE-RNA 유닛, LNA 유닛, PNA 유닛, HNA 유닛, INA 유닛.
한 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명의 올리고머의 모든 뉴클레오타이드들은 뉴클레오타이드 유사체 유닛이다.
한 가지 실시 상태에 있어서, X와 같은 뉴클레오타이드 유사체 유닛은 독립적으로: 2'-OMe-RNA 유닛, 2'-플루오로-DNA 유닛, 및 LNA 유닛으로 이루어진 군 중에서 선택된다.
한 가지 실시 상태에 있어서, 올리고머는 상기 적어도 하나의 LNA 유사체 유닛과 LNA 이외의 적어도 하나의 또 다른 뉴클레오타이드 유사체를 포함한다.
한 가지 실시 상태에 있어서, 비LNA 뉴클레오타이드 유사체 유닛 또는 유닛들은 독립적으로 2'-OMe RNA 유닛 및 2'-플루오로 DNA 유닛이다.
한 가지 실시 상태에 있어서, 올리고머는 적어도 하나의 서열 XYX 또는 YXY로 구성되며, 여기서 X는 LNA이고 Y는 2'-OMe RNA 유닛이거나 2'-플루오로 DNA 유닛이다.
한 가지 실시 상태에서, 올리고머의 뉴클레오타이드 서열은 또 다른 X 및 Y 유닛으로 구성된다.
한가지 실시 상태에서, 올리고머는 LNA 유닛과 DNA 유닛이 번갈아 나타나는 (Xx) 또는 (xX) 배열을 갖는다. 한가지 실시 상태에서, 올리고머는 LNA 다음에 2개의 DNA 유닛이 번갈아 배치되는 모티프 (Xxx), xXx 또는 xxX의 코티프를 갖는다.
한 가지 실시 상태에 있어서, DNA 또는 비LNA 뉴클레오타이드 유사체 유닛들 중 적어도 하나는 전술한 실시 상태들에 있어서 LNA 뉴클레오타이드로서 동정되는 위치에서 선택된 위치에서 LNA 뉴클레오타이드로 대체된다. 한가지 실시 상태에서, "X"는 LNA 유닛을 공여한다.
본 발명의 올리고머를 위한 또 다른 디자인
하기 표 1은 본 발명의 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 유리하게 표적화될 수 있는 짧은 마이크로RNA 서열의 비제한적인 예들을 제공한다.
표 1에 개시된 것과 같은 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 한가지 실시 상태에서, 7, 8, 9 또는 10개의 LNA 뉴클레오타이드 서열 5'-3' LLLLLLL(L)(L)(L)(L)을 갖거나, 또는 다음의 모티프를 갖는 또는 최초 7, 8, 9 또는 10개의 뉴클레오타이드 서열을 가질 수 있다:
LdLddL(L)(d)(d)(L)(d)(L)(d)(L)(L), LdLdLL(L)(d)(d)(L)(L)(L)(d)(L)(L), LMLMML(L)(M)(M)(L)(M)(L)(M)(L)(L), LMLMLL(L)(M)(M)(L)(L)(L)(M)(L)(L), LFLFFL(L)(F)(F)(L)(F)(L)(F)(L)(L), LFLFLL(L)(F)(F)(L)(L)(L)(F)(L)(L), 및 다음과 같은 매 3번째 디자인; LddLdd(L)(d)(d)(L)(d)(d)(L)(d)(d)(L)(d)dLddLd(d)(L)(d)(d)(L)(d)(d)(L)(d)(d)(L), ddLddL(d)(d)(L)(d)(d)(L)(d)(d)(L)(d)(d), LMMLMM(L)(M)(M)(L)(M)(M)(L)(M)(M)(L)(M), MLMMLM(M)(L)(M)(M)(L)(M)(M)(L)(M)(M)(L), MMLMML(M)(M)(L)(M)(M)(L)(M)(M)(L)(M)(M), LFFLFF(L)(F)(F)(L)(F)(F)(L)(F)(F)(L)(F), FLFFLF(F)(L)(F)(F)(L)(F)(F)(L)(F)(F)(L), FFLFFL(F)(F)(L)(F)(F)(L)(F)(F)(L)(F)(F), 및 dLdLdL(d)(L)(d)(L)(d)(L)(d)(L)(d)(L)(d) 및 다음과 같은 매 4번째 디자인; LdLdLd(L)(d)(L)(d)(L)(d)(L)(d)(L)(d)(L), MLMLML(M)(L)(M)(L)(M)(L)(M)(L)(M)(L)(M), LMLMLM(L)(M)(L)(M)(L)(M)(L)(M)(L)(M)(L), FLFLFL(F)(L)(F)(L)(F)(L)(F)(L)(F)(L)(F), 및 LFLFLF(L)(F)(L)(F)(L)(F)(L)(F)(L)(F)(L); 여기서 L = LNA 유닛, d= DNA 유닛, M = 2'MOE RNA, F = 2'-플루오로이며, 괄호 안의 잔기는 임의의 것이다.
의약 조성물 및 의학적 응용
본 발명은 본 발명에 따른 올리고머, 및 약학적으로 서용되는 희석제, 담체, 염 또는 아쥬반트를 포함하는 의약 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 의약 조성물의 일부를 형성하는데 있어서, 마이크로RNA의 과발현 (상향조절) 또는 존재와 관련된 질환 또는 의학적 장애의 치료용 약제를 제조하는데 있어서의 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 치료를 필요로 하는 사람에게 본 발명에 따른 조성물 (예컨대 의약 조성물)을 투여하는 단계를 포함하여 이루어지는, 마이크로RNA의 존재 또는 과발현과 연관된 질환 또는 의학적 장애를 치료하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 조성물 (예컨대 의약 조성물) 또는 본 발명에 따른 올리고머를 세포 또는 장기에 투여하는 것을 포함하여 이루어지는, 세포 또는 장기에 있어서 miRNA의 유효량을 감소시키는 방법을 제공한다. 문맥상 유효량을 저감시킨다 함은 그 세포 또는 장기 중에 존재하는 기능적인 miRNA를 감소시킨다는 것이다. 본 발명에 따른 바람직한 올리고뉴클레오타이드는 일반적으로 그들의 miRNA 표적과 매우 안정한 듀플렉스를 형성하기 때문에, 그 세포 또는 장기 중의 miRNA의 실제량을 항상 유의적으로 감소시키는 것이 아니다. 한가지 실시 상태에서, 어떤 세포 중의 miRNA의 유효량의 감소는 그 세포에 있어서 miRNA의 표적의 탈억제 (de-repression) 수준을 검색함으로써 측정될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 조성물 (예컨대 의약 조성물) 또는 올리고머를 세포 또는 장기에 투여하는 것을 포함하여 이루어지는, 세포 또는 장기에서 miRNA의 표적 mRNA의 탈억제 방법도 제공한다.
본 발명은 또한 마이크로RNA의 존재 또는 과발현과 연관이 있는 질환 또는 의학적 장애의 치료용 약제를 제조하는데 있어서의, 7 - 10, 예컨대, 7, 8, 9, 또는 10 뉴클레오타이드 길이를 갖는 올리고머의 용도도 제공한다.
한가지 실시 상태에서, 상기 의학적 상황 (또는 질병)은 C형 간염 (HCV)이고, miRNA는 miR-122이다.
한 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명의 의약 조성물은 C형 간염 바이러스 및 고콜레스테롤혈증 및 관련 질환, 및 암으로 이루어진 군 중에서 선택된 의학적 장애 또는 질환을 치료하기 위한 용도를 갖는다.
한가지 실시 상태에 있어서, 의학적 장애 또는 질환은 CNS 질환, 예컨대 하나 이상의 마이크로RNA가 지시되는 것으로 알려진 CNS 질환이다.
고콜레스테롤혈증 관련 질환이라 함은 죽상동맥경화증 또는 고지혈증과 같은 질환을 의미한다. 관련 질환의 또 다른 예로는 여러 유형의 HDL/LDL 콜레스테롤 불균형; 디스리피데미아, 예컨대 가족고지혈증 (FCHL), 후천성 고지혈증, 스타틴 내성 고콜레스테롤혈증; 관상 동맥 질환 (CAD), 관상 심장 질환 (CHD), 죽상동맥경화증 등을 들 수 있다.
한 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명의 의약 조성물은 ApoB 억제제, 또는 MTP 억제제 (예컨대 본 발명에 참고 통합된 US 60/977,497에 개시된 것들)과 같이, VLDL 어셈블리 경로의 억제제인 제2의 독립적인 활성 성분을 추가로 포함한다.
본 발명은 또한 길이가 7, 8, 9, 또는 10 뉴클레오타이드 인 것과 같이 7 - 10개 길이의 올리고머를 포함하는 조성물 (예컨대 의약 조성물)을 치료를 필요로 하는 사람에게 투여하는 단계를 포함하여 이루어지는, 마이크로RNA의 존재 또는 과발현과 연과이 있는 질환 또는 의학적 장애의 치료 방법도 제공한다.
본 발명은 또한 길이가 7, 8, 9, 또는 10 뉴클레오타이드 인 것과 같이 7-10개 길이의 올리고머를 포함하는 조성물 (예컨대 의약 조성물)을 세포 또는 장기에 투여하는 것을 포함하여 이루어지는, 세포 또는 장기에 있어서, miRNA 표적의 유효량 (즉, '이용가능한 (available)' miRNA)을 감소시키는 방법 역시도 제공한다.
세포 또는 장기에서 하나 이상의 마이크로RNA의 "유혀량을 감소시킨다"라는 것은 그 세포 도는 장기에서 마이크로RNA 기능을 억제하는 것을 가리킨다. 세포는 바람직하게는 마이크로RNA 또는 마이크로RNA들을 발현하는 포유동물의 세포 또는 인간 세포인 것이 좋다.
본 발명은 또한 길이가 7, 8, 9, 또는 10 뉴클레오타이드 인 것과 같이 7-10개 길이의 올리고머를 세포 또는 장기에 투여하는 것을 포함하여 이루어지는, 세포 또는 장기에 이어서, miRNA의 표적 mRNA의 탈억제 방법 역시도 제공한다.
전술한 바와 같이, 마이크로RNA는 몇몇 질환과 관련이 있다. 따라서, 본 발명의 네번째 측면은 척수근육위축증, 투렛 (Tourette) 증후군, C형 간염, 취약 X 정신 지체증, 디죠지 (DiGeorge) 증후군 및 암, 예컨대 비제한적인 예로서 만성 임파구성 백혈병, 유방암, 폐암 및 결장암, 특히 암으로 이루어진 군 중에서 선택된, 마이크로RNA의 발현과 연관된 질환의 치료용 약제를 제조하는데 있어서의 본 발명의 올리고뉴클레오타이드의 용도에 관한 것이다.
합성 방법
본 발명은 또한 본 발명에 설명된 올리고머와 같은, 인간 마이크로RNA에 대하여 표적화된 올리고머의 합성 방법을 제공하는데, 상기 방법은 다음 단계를 포함하여 이루어진다:
a. 3' 말단으로부터 세어서 LNA 뉴클레오타이드와 같은, 뉴클레오타이드 유사체인 제1 뉴클레오타이드를 임의로 선택하는 단계.
b. 3' 말단으로부터 세어서 LNA 뉴클레오타이드와 같은, 뉴클레오타이드 유사체인 제2 뉴클레오타이드를 임의로 선택하는 단계.
c. miRNA 씨드 영역에 대응하는 올리고머 영역을 선택하는 단계 (여기서 상기 영역은 본 발명에서 정의된 바와 같다)
d. 본 발명에서 정의된 7번째 및 임의로 8번째 뉴클레오타이드를 선택하는 단계.
e. 본 발명에서 정의된 바와 같은 올리고머의 1개 또는 2개의 부가적인 5' 말단을 임의로 선택하는 단계.
여기서 상기 합성법은 a - e 단계에 정의된 영역의 순차적인 합성에 의해 수행되는데, 여기서 상기 합성은 3'-5' 방향 (a 에서 f로) 또는 5'-3' 방향 (e에서 a로)으로 수행될 수 있고, 상기 올리고머는 miRNA 표적 서열에 상보적이다.
본 발명은 또한 올리고머 (예컨대 본 발명에 따른 올리고머)의 제조 방법도 제공하는데, 상기 방법은 a) 길이가 7, 8, 9 또는 10 뉴클레오타이드인 것과 같이 길이가 적어도 7 뉴클레오타이드인 공통 인접 뉴클레오타이드 서열 (즉, 동일하지 않은 두개의 miRNA에서 모두 발견되는 서열)을 포함하는 2개 이상의 miRNA 서열을 동정하기 위하여 2개 이상의 miRNA 서열들의 서열을 비교하는 단계, b) 상기 공통 인접 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 인접 뉴클레오타이드 서열로(을) 구성되거나 포함하는 올리고머 서열을 포함하는 단계 (여기서 상기 올리고머는 본 발명에 따른 올리고머임)를 포함하여 이루어지는 것이다. 바람직한 구체예에서, 공통 인접 뉴클레오타이드 서열은 상기 2개 이상의 miRNA 서열 (길이가 적어도 6 뉴클레오타이드인 공통 인접 뉴클레오타이드 서열을 포함한다)의 각각의 씨드 영역으로(을) 구성되거나 포함하는 것이다. 한가지 실시 상태에 있어서, 이들 2 이상의 miRNA의 씨드 영역은 동일하다. 적절하게는, 상기 올리고머는 상기 2 이상의 miRNA에 대해 상보적인 서열을 포함하며 길이가 7 또는 8 뉴클레오타이드인 씨드머 서열로(을) 구성되거나 포함하는 것이다. 이 방법은 상기 방법의 단계 c)와 병합하여 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 올리고머의 합성 방법은 표준 고상 올리고뉴클레오타이드 합성법을 사용하여 수행될 수 있다.
한가지 실시 상태에서, 인간의 마이크로RNA에 대하여 표적화된 올리고머의 합성 방법은 3'로부터 5'로의 방향으로 a-e로 수행된다.
본 발명의 또 다른 구체예는 표적 마이크로RNA를 본 발명에서 정의된 바와 같은 올리고뉴클레오타이드와 접촉시킴으로써, 표적 마이크로RNA의 수준을 감소시키는 방법인데, 이 방법에서 상기 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 (i) 표적 마이크로RNA 서열에 상보적이면서 (ii) 표적 마이크로RNA의 첫번째 5' 말단 뉴클레오타이드에 대응하는 3' 말단에서의 뉴클레오타이드는 함유하지 않는 것이다.
듀플렉스 안정성 및 T m
한 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명의 올리고머는 포스포디에스테르 인터뉴클레오사이드 결합을 갖는, 상보적인 단일 가닥의 RNA 핵산 분자와 듀플렉스를 형성할 수 있는 것으로서 (상기 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드와 대략 동일한 길이를 가짐) 여기서 상기 듀플렉스의 Tm은 30℃ 내지 70℃, 또는 80℃, 예컨대 30℃ 내지 60℃ 또는 70℃, 또는 30℃ 내지 50℃ 또는 60℃이다. 한 가지 실시 상태에 있어서 상기 Tm은 적어도 40℃이다. Tm은 다음의 완충 조건, 즉: 100mM NaCl, 0.1mM EDTA, 10mM Na-포스페이트, pH 7.0 (실시예 및 상세한 프로토콜 참조)에서, 올리고머의 Tm 및 상보적인 RNA 표적의 Tm을 측정함으로써 측정할 수 있다. 고친화성 유사체는 본 발명의 올리고머에서 사용될 경우, DNA 염기만을 함유하는 동일한 올리고머와 비교할 때, 그 올리고머의 Tm을 증가시키는 결과를 초래하는 유사체인 것으로 정의될 수 있다.
컨쥬게이트
한 가지 실시 상태에 있어서, 상기 올리고머는 하나 이상의 비뉴클레오타이드 (또는 폴리뉴클레오타이드) 화합물과 컨쥬게이트된다.
본 발명의 내용상 "컨쥬게이트(conjugate)"라는 용어는 본 발명에 설명된 바와 같은 올리고머가 하나 이상의 비뉴클레오타이드, 또는 비폴리뉴클레오타이드 부분 (moieties)과 공유 부착 ("컨쥬게이션")함으로써 형성된 이종 분자를 가리키는 것이다. 비뉴클레오타이드 또는 비폴리뉴클레오타이드 부분의 예로는 단백질, 지방산 사슬, 당 잔기 (sugar residues), 당단백질, 폴리머 또는 이들의 조합과 같은 마크로분자 제제를 들 수 있다. 일반적으로 단백질은 표적 단백질에 대한 항체일 수 있다. 전형적인 폴리머는 폴리에틸렌 글리콜일 수 있다.
따라서, 다양한 실시 상태에서, 본 발명의 올리고머는 뉴클레오타이드의 인접 서열로 주로 구성된 폴리뉴클레오타이드 영역과, 추가적인 비뉴클레오타이드 영역의 두가지 모두를 포함할 수 있다. 인접 뉴클레오타이드 서열로 구성된 본 발명의 올리고머를 말할 때, 상기 화합물은 컨쥬게이트 성분과 같은, 비뉴클레오타이드 성분들을 포함할 수 있다.
본 발명의 다양한 실시 상태에 있어서, 올리고머 화합물은 예컨대, 올리고머성 화합물의 세포 흡수를 증가시키는데 사용되리 수 있는 리간드/컨쥬게이트에 결합된다. WO2007/031091은 적절한 리간드와 컨쥬게이트를 제공하는데, 이는 본 발명에 참고로 통합된다.
본 발명은 또한 전술한 바와 같은 본 발명에 따른 화합물, 및 상기 화합물에 공유적으로 부착된 적어도 하나의 비뉴클레오타이드 또는 비폴리뉴클레오타이드 부분을 포함하여 이루어지는 컨쥬게이트를 제공한다. 따라서, 본 발명의 화합물이 전술한 바와 같은 특정 핵산 또는 뉴클레오타이드 서열로 구성된 것인 여러가지 실시 사태에서, 상기 화합물 역시도 상기 화합물에 공유적으로 부착된 적어도 하나의 비뉴클레오타이드 또는 비폴리뉴클레오타이드 부분 (예컨대 하나 이상의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체를 포함하지 않는다) 을 포함할 수도 있다.
(컨쥬게이트 부분에 대한) 컨쥬게이션은 본 발명의 올리고머의 세포 흡수, 활성, 세포 분포를 향상시킬 수 있다. 이러한 부분의 예로는 항체, 폴리펩타이드, 지질 부분, 예컨대 콜레스테롤 부분, 콜산, 티오에테르, 예컨대 헥실-s-트리틸티올, 티오콜레스테롤, 지방족 사슬, 예컨대, 도데칸디올 또는 운데실 잔기, 인지질, 예컨대, 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸암모늄 1,2-디-o-헥사데실-rac-글리세로-3-h-포스페이트, 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 아다만탄 아세트산, 팔미틸 부분, 옥다데실아민 또는 헥실아미노-카르보닐-옥시콜레스테롤 부분을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 올리고머는 또한 예컨대, 아스피린, 이부프로펜, 설파제, 항당뇨병제, 항균제 또는 항생제와 같은 활성 약물과 컨쥬게이트될 수도 있다.
특정 실시 상태에서, 컨쥬게이트된 부분은 스테롤, 예컨대 콜레스테롤이다.
다양한 실시 상태에서, 이러한 컨쥬게이트된 부분은 양하전 폴리머, 예컨대 길이가 1-50, 예컨대 2-20, 예컨대 3-10 아미노산 잔기인 양하전 펩티드, 및/또는 폴리알킬렌 옥사이드, 예컨대 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 또는 폴리프로필렌글리콜을(로) 포함하거나 구성될 수 있다 - 본 발명에 참고로 통합된 WO 2008/034123의 내용을 참고. 적절하게는, 폴리알킬렌 옥사이드와 같은 양하전된 폴리머는 WO 2008/034123에 설명된 방출가능한 링커와 같은 링커를 통하여 본 발명의 올리고머에 부착될 수 있다.
일례로서, 본 발명의 컨쥬게이트에는 다음과 같은 컨쥬게이트 부분을 사용할 수 있다:
Figure 112010028980901-pct00006
활성화된 올리고머들
본 발명에서 "활성화된 올리고머"라는 용어는 그 올리고머로 하여금 하나 이상의 컨쥬게이트된 부분, 즉 그 자신은 핵산 또는 모노머가 아닌 부분과 공유 결합 (즉, 관능화됨)을 형성하게 해줌으로써, 본 발명에 설명된 컨쥬게이트를 형성하는, 본 발명의 올리고머를 칭한다. 일반적으로, 관능기 부분은 예컨대 아데닌 염기의 엑소시클릭 NH2기 또는 3'-히드록실기, 바람직하게는 친수성인 것이 좋은 스페이서 및 컨쥬게이트된 부분 (예컨대 아미노기, 설프히드릴기 또는 히드록실기)에 결합될 수 있는 발단기를 통하여 상기 올리고머에 공유 결합할 수 있는 화학기르르 포함할 것이다. 어떤 실시 상태에서, 이러한 말단기는 보호되지 않으며, 예컨대 NH2기이다. 또 다른 실시 상태에서, 말단기는 예컨대 "Protective Groups in Organic Synthesis" (Theodora W Greene 및 Peter G M Wuts, 제3판 (John Wiley μ Sons, 1999)에 설명된 바와 같은 적절한 보호기에 의해 보호된다. 적절한 히드록실 보호기의 예로는 아세테이트 에스테르와 같은 에스테르, 벤질과 같은 아르알킬기, 디페닐메틸, 또는 트리페닐메틸, 및 테트라히드로피라닐과 같은 에스테르를 들 수 있다. 적절한 아미노 보호기의 예로는 벤질, 알파-메틸벤질, 디페닐메틸, 트리페닐메틸, 벤질옥시카르보닐, 3차-부톡시카르보닐, 및 아실기, 예컨대 트리클로로아세틸 또는 트리플루오로아세틸을 들 수 있다. 어떤 실시 상태에서, 관능기 부분은 자가-절단된다. 또 다른 실시 사태에서, 관능기 부분은 생분해가능한 것이다. 예컨대, 본 발명에 그 내용 전체가 참고로 통합된 미국특허제7,087,229호.
어떤 실시 상태에서, 본 발명의 올리고머는 컨쥬게이트된 부분을 올리고머의 5' 말단에 공유 부착시키도록, 5' 말단에서 관능화된다. 다른 실시 상태에서, 본 발명의 올리고머는 3' 말단에서 관능화될 수 있다. 또 다른 실시 상태에서, 본 발명의 올리고머는 백본을 따라 관능화되거나 또는 헤테로사이클릭 염기 부분 상에서 관능화될 수 있다. 또 다른 실시 상태에서, 본 발명의 올리고머는 5' 말단, 3' 말단, 백본 및 염기 중에서 독립적으로 선택된 두개 이상의 위치에서 관능화될 수 있다.
어떤 실시 상태에서, 본 발명의 활성화된 올리고머는 그의 합성이 진행되는 동안, 관능기 부분에 공유적으로 부착된 하나 이상의 모노머를 인코포레이팅함으로써 합성된다. 또 다른 실시 상태에서, 본 발명의 활성화된 올리고머는 관능화되지 않은 모노머를 이용하여 합성되어, 합성 완료 후에 관능화된다. 어떤 실시 상태에서, 올리고머는 아미노알킬 링커를 함유하는 힌더드 에스테르에 의해 관능화되는데, 여기서 알킬 부분은 식 (CH2)w로 표시되고, 여기서 w는 1 내지 10, 바람직하게는 약 6의 정수이며, 여기서 알킬아미노기의 알킬 부분은 직쇄 또는 분지쇄일 수 있고, 여기서 관능기 부분은 에스테르기 (-O-C(O)-(CH2)wNH)를 통해 올리고머에 부착된다.
또 다른 실시 상태에서, 올리고머는 (CH2)w-설프히드릴 (SH) 링커를 함유하는 힌더드 에스테르에 의해 관능화되는데, 여기서 w는 1 내지 10, 바람직하게는 약 6의 정수이고, 여기서 알킬아미노기의 알킬 부분은 직쇄 또는 분지쇄일 수 있으며, 여기서 관능기는 에스테르기 (-O-C(O)-(CH2)wSH)를 통해 올리고머에 부착된다.
어떤 실시 상태에 있어서, 설프히드릴-활성화된 올리고뉴클레오타이드는 폴리에틸렌 글리콜 또는 펩타이드와 같은 폴리머 부분과 함께 컨쥬게이트된다 (디설파이드 결합의 형성을 통함).
전술한 바와 같이 힌더드 에스테르를 함유하는 활성화된 올리고머는 종래 기술에 알려진 방법, 특히, PCT 공개번호 WO 2008/034122에 개시된 방법 및, 이 특허문헌에 개시된 실시예에 의해 합성될 수 있으며 이 문헌의 내용은 그 전체가 본 발명에 참고 통합된다.
또 다른 실시 상태에 있어서, 본 발명의 올리고머는 미국특허 제4,962,029호 및 제4,914,210호에 실질적으로 설명된 관능화 시약, 즉, 즉 한쪽 말단에, 포스포로아미다이트를 갖되, 이 포스포로아미다이트는 친수성 스페이서 사슬을 통해 반대쪽 말단에 결합되어 있는 것이고, 이 반대쪽 말단은 보호되거나 보호되지 않은 설프히드릴기, 아미노기 또는 히드록실기를 포함하는 것인, 실질적으로 선형인 시약에 의하여, 설프히드릴기, 아미노기 또는 히드록실기를 올리고머 내로 도입함으로써 관능화된다. 이러한 시약은 일차적으로 올리고머의 히드록실기와 반응한다. 어떤 실시 상태에 있어서, 이러한 활성화된 올리고머는 그 올리고머의 5'-히드록실기에 커플링된 관능화 시약을 갖는다. 또 다른 실시 상태에서, 활성화된 올리고머는 3'-히드록실기에 커플링된 관능화 시약을 갖는다. 또 다른 실시 상태에 있어서, 본 발명의 활성화된 올리고머는 올리고머의 백본 상에 히드록실기에 커플링된 관능화 시약을 갖는다. 또 다른 실시 상태에서, 본 발명의 올리고머는 미국특허 제4,962,029호 및 제4,914,210호에 설명된 바와 같은 2종 이상의 관능화 시약에 의해 관능화되며, 상기 문헌들의 내용은 그 전체가 본 발명에 참고로 통합된다. 이러한 관능화 시약의 합성 방법 및 이들을 모노머 또는 올리고머 내로 통합시키는 방법은 미국특허 제4,962,029호 및 제4,914,210호에 기재되어 있다.
또 다른 실시 상태에 있어서는, 고상 결합된 올리고머의 5'-말단을 디에닐 포스포로아미다이트 유도체로 관능화시킨 다음, 이 탈보호된 올리고머를, 딜스-알더 사이클로부가반응을 경유하여 예컨대 아미노산 또는 펩타이드와 컨쥬게이션시킨다.
여러가지 실시 상태에서, 2'-카르바메이트 치환된 당 또는 2'-(O-펜틸-N-프탈이미도)-데옥시리보스 당과 같은 2'-당 변형체를 함유하는 모노머를 올리고머 내로 인코포레이션시키면, 컨쥬게이션된 부분이 올리고머의 당과 공유 부착하는 것이 용이해진다. 또 다른 실시 상태에서는, 하나 이사의 모노머의 2'-위치에 아미노-함유 링커를 갖는 올리고머를, 예컨대, 5'-디메톡시트리틸-2'-O-(e-프탈이미딜아미노펜틸0-2'-데옥시아데노신-3'--N,N-디이소프로필-시아노에톡시 포스포로아미다이트와 같은 시약을 이용하여 제조한다. 예컨대, Manoharan 외, Tetrahedron Letters, 1991, 34, 7171 참조.
또 다른 실시 상태에서, 본 발명의 올리고머는 N6 퓨린 아미노기 상에, 구아닌의 엑소사이클릭 N2 상에, 또는 시토신의 N4 또는 N5 위치를 비롯한, 뉴클레오타이드 상에 아미노-함유 관능기 부분을 가질 수 있다. 다양한 실시 상태에서, 이러한 관능화는 올리고머 합성시 이미 관능화된 시판 시약을 이용함으로써 달성할 수 있다.
몇몇 관능기 부분은 시중에서 구입가능한데, 예컨대 헤테로이관능기 및 동종이관능기 링킹 부분은 Pierce Co. (Rockford, Ill.)로부터 입수가능하다. 또 다른 시판 링킹기로서 5'-아미노-모디파이어 C6 및 3'-아미노-모디파이어 시약을 들 수 있는데 이들 두가지 모두 Glen Research Corporation (Sterling, Va.)로부터 입수할 수 있다. 5'-아미노-모디파이어 C6은 ABI (Applied Biosystems Inc., Foster City, Calif.)로부터 아미노링크-2로서도 입수가능하며, 3'-아미노-모디파이어 역시도 Clontech Laboratories Inc. (Palo Alto, Calif.)로부터 구입할 수 있다.
치료 및 의약 조성물 - 포뮬레이션 및 투여
처음 설명한 바와 같이, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 개선된 효능을 갖는 적절한 약물을 구성한다. 강력하고도 안전한 약물을 설계하기 위해서는 체액 중에서의 친화성/특이성, 안정성, 세포 흡수력, 작용 방식, 약동학적 특성 및 독성과 같은 다양한 변수를 미세하게 조정할 필요가 있다.
따라서, 또 다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드 및 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 아쥬반트를 함유하는 의약 조성물에 관한 것이다. 바람직하게는 상기 담체는 염수 또는 완충 염수인 것이 좋다.
또 다른 측면에서 본 발명은, 의약 용도를 위한 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다.
투약은 치료하고자 하는 질병 상태의 위중도와 응답성, 수일 내지 수개월간 지속되거나, 또는 치료가 효과를 거둘 때까지, 또는 질병 상태가 호전될 때까지 지속되는 치료 경과에 따라 달라진다는 것은 잘 알려진 사실이다. 최적의 투약 스케쥴은 환자 체내의 약물 축적량을 측정함으로써 산출할 수 있다. 최적 투여량은 개개의 올리고뉴클레오타이드의 상대 강도에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로 시험관내 및 생체내 동물 모델에서 효과적인 것으로 밝혀진 EC50에 기초하여 평가될 수 있다. 일반적으로, 투여량은 체중 1 kg 당 0.01 ㎍ 내지 1 g이며, 하루, 일주일, 월간, 또는 연간 단위로 한번 이상, 심지어는 2년 내지 10년 마다 한번씩 투여하거나, 또는 수시간 내지 최대 수개월 동안 연속 주입할 수도 있다. 투약의 반복 속도는 체액 또는 조직 중에서 측정된 약물의 체류 시간 및 농도에 따라 평가할 수 있다. 성공적인 치료에 이어서, 질병 상태가 재발되지 않도록, 환자들에게 유지 요법을 실시하는 것이 요망될 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명은 또한 활성 성분으로서 본 발명의 1종 이상의 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 의약 조성물에 관한 것이기도 하다. 본 발명에 따른 의약 조성물은 약학적 담체를 함유하여도 좋고, 필요에 따라서는 추가의 화합물, 예컨대, 화학요법용 화합물, 항염 화합물, 항바이러스 화합물 및/또는 면역조절 화합물을 추가로 함유할 수도 있는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 "그대로" 또는 약학적으로 허용가능한 다양한 염 형태로 사용될 수 있다. 본 명세서에서, "약학적으로 허용가능한 염"이라는 용어는 본 발명에서 동정된 올리고뉴클레오타이드의 목적하는 생물학적 활성을 유지하면서 바람직하지 않은 독성 효과는 최소 한도로 나타내는 염들을 가리킨다. 이러한 염들은 유기 아미노산, 아연, 칼슘, 비스무쓰, 바륨, 마그네슘, 알루미늄, 구리, 코발트, 니켈, 카드뮴, 나트륨, 칼륨 등과 같은 금속 양이온과 함께 형성된 염기 부가염, 또는 암모니아, N,N-디벤질에틸렌-디아민, D-글루코사민, 테트라에틸암모늄 또는 에틸렌디아민으로부터 형성된 양이온과 함께 형성될 수 있으며 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 한가지 실시 상태에서, 올리고뉴클레오타이드는 전구약물 형태일 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 실제로 음하전된 이온이다. 세포막은 친지 특성을 갖기 때문에 올리고뉴클레오타이드의 세포 흡수는 중성 또는 친지성 등가물에 비해 감소된다. 이 극성 "장해 (hindrance)"는 전구약물 접근법을 이용함으로써 회피할 수 있다. (예컨대, Crooke, R. M. (1998) 참조, Crooke, S. T. Antisense research and Application. Springer-Verlag, Berlin, Germany, vol. 131, pp. 103-140).
약학적으로 허용가능한 결합제 및 아쥬반트는 조제된 약물의 일부를 구성할 수 있다.
본 발명에 설명된 치료제의 전달을 위한 전달 방법의 예 및 약학적 포뮬레이션, 염의 상세는 예컨대, 미국 가특허출원 60/838,710 및 60/788,995와 덴마크 출원 PA 2006 00615에 설명되어 있으며, 이들 문헌의 내용은 본 발명에 참고로 통합된다.
본 발명의 의약 조성물은 용액, 에멀젼 및 리포좀-함유 포뮬레이션일 수 있으며 이에 한정되지 않는다. 이러한 조성물은 미리 형성된 액체, 자가유화성 고체 및 자가유화성 반고체를 비롯한 여러가지 성분들로부터 제조될 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 종양 조직 내로의 약물 전달은 비제한적인 예로서 양이온성 리포좀, 사이클로덱스트린, 포스피린 유도체, 분지쇄 덴드리머, 폴리에틸렌이민 폴리머, 나노입자 및 마이크로스피어를 비롯한 담체-매개형 전달에 의해 개선될 수 있다 (Dass CR. J Pharm Pharmacol 2002; 54(1):3-27). 단위 투여 제형으로서 제공될 수 있는 본 발명의 의약 포뮬레이션은 제약 산업 분야에서 잘 알려진 통상적인 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 이러한 기술은 활성 성분들을 약학적 담체(들) 또는 부형제(들)과 한데 조합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 이러한 포뮬레이션은 활성 성분들과 액상 담체 또는 미분 고상 담체 또는 두가지 모두를 균일하고 치밀하게 잘 혼합한 다음, 필요에 따라, 이 생성물을 성형함으로써 제조한다. 본 발명의 조성물은 정제, 캡슐제, 젤 캡슐제, 액사 시럽, 연질 젤 및 좌약과 같은 가능한 투여 형태로 조제될 수 있으나 이들로 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 또한 수성, 비수성 또는 혼합 매질 중 현탁액으로서 조제될 수도 있다. 수성 현탁액은 추가로 예컨대, 카르복시메틸셀룰로스 나트륨, 소르비톨 및/또는 덱스트란과 같이, 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 추가로 함유할 수 있다. 이러한 현탁액은 또한 안정화제를 추가로 함유할 수 있다. 본 발명의 화합물은 또한 예컨대 아스피린, 이부프로펜, 설파제, 항당뇨병제, 항균제 또는 항생제와 같은 활성 약물 물질에 컨쥬게이트될 수도 있다.
또 다른 실시 상태에서, 본 발명의 조성물은 제1 마이크로RNA에 표적화된 1종 이상의 올리고뉴클레오타이드 화합물 및 제2 마이크로RNA 표적에 표적화된 1종 이상의 부가적인 올리고뉴클레오타이드 화합물을 함유할 수 있다. 2종 이상의 결합된 화합물들은 함꼐 사용되거나 또는 순차적으로 사용될 수 있다.
본 발명에 개시된 화합물들은 전술한 바와 같은 몇가지 치료제 용도에 유용하다. 일반적으로, 본 발명의 치료 방법은 포유동물, 특히 인간에게 치료적 유효량의 올리고뉴클레오타이드를 토여하는 것을 포함한다. 특정 실시 상태에서, 본 발명은 (a) 본 발명의 화합물 1종 이상 및 (b) 화학요법제 1종 이상을 포함한다. 본 발명의 화합물을 사용하는 경우, 이러한 화학요법제들은 개별적으로 또는 순차적으로 사용되거나 또는, 1종 이상의 이러한 다른 화학요법제와 함께 또는 병합적으로 사용될 수 있으며, 또는 방사능 요법과 병용될 수 있다. 본 발명이 속한 기술 분야의 당업자에게 알려진 모든 화학치료제는 본 발명의 화합물과 병용 치료시 통합적으로 사용될 수 있다. 비제한적인 예로서 비스테로이드계 항염 약물 및 코르티코스테로이드계 항염 약물을 포함하는 항염 약물, 항바이러스 약물 및 면역 조절 약물과 같은 기타 활성 물질 역시 본 발명의 조성물과 병용될 수 있다. 2종 이상의 병용 화합물들을 함께 또는 순차적으로 사용할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물에 의해 치료될 수 있는 치료 응용예는 다음과 같다:
Figure 112010028980901-pct00007
종양 억제 유전자 트로포마이신 1 (TPM1) mRNA는 miR-21의 표적으로서 알려져 왔다. 미오트로핀 (mtpn) mRNA는 miR 375의 표적인 것으로서 알려져 왔다..
또 다른 구체에에서, 본 발명은 죽상동맥경화증, 고콜레스테롤혈증 및 고지혈증; 암; 교모세포종, 유방암, 임파종, 폐암; 당뇨병, 대사성 질환; 근육모세포 분화; 면역 질환으로 이루어진 군 중에서 선택된 질환을 치료하는데 사용되기 위한 본 발명의 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다.
본 발명은 죽상동맥경화증, 고콜레스테롤혈증 및 고지혈증; 암; 교모세포종, 유방암, 임파종, 폐암; 당뇨병, 대사성 질환; 근육모세포 분화; 면역 질환으로 이루어진 군 중에서 선택된 질환 또는 증상을 앓는 대상자의 치료 방법을 제공하는데, 이 방법은 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 또는 의약 조성물을 이를 필요로 하는 대상자에게 투여하는 것을 포함하여 이루어진다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 의약 조성물, 및 ApoB 억제제 또는 MTP 억제제와 같은 VLDL 어셈블리 경로의억제제인 제2의 독립적인 활성 성분을 함유하는 키트를 제공한다.
암
또 다른 구체예에서, 본 발명은 암 치료용 약제의 제조를 위한, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드의 용도에 관한 것이다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 암의 치료 또는 예방을 위한 방법에 곤한 것으로서, 상기 방법은 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 또는 본 발명의 의약 조성물을, 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하여 이루어진다.
이러한 암은 림프세망 신생물, 림프아구성 백혈병, 뇌종양, 위종양, 형질세포종, 다발성 골수종, 백혈병, 연결 조직 종양, 임파종 및 고형 종양을 포함할 수 있다.
암 치료용 약제의 제조를 위한 본 발명의 화합물의 용도에 있어서, 상기 암은 적절하게는 고형 종양일 수 있다. 마찬가지로, 본 발명에 개시된 암 치료법에 있어서, 상기 암은 적절하게는 고형 종양일 수 있다.
또한, 상기 암은 암종인 것이 적합하다. 암종은 일반적으로 악성 흑색종, 기조 세포 암종, 남소 암종, 유방 암종, 비소세포 폐암, 신장 세포 암종, 방광 암종, 재발성 표재성 방관암, 위암종, 전립선 암종, 췌장 암종, 폐 암종, 자궁경부 암종, 자궁목 형성이상증, 후두유두종증, 결장암종, 결장 직장 암종 및 카르시노이드 종양으로 이루어진 군 중에서 선택된다. 더욱 일반적으로, 상기 암종은 악성 흑색종, 비소세포 폐암, 유방암종, 결장 암종 및 신장 세포 암종으로 이루어진 군 중에서 선택된다. 악성 흑색종은 일반적으로 표재성 확산성 흑색종, 결절성 흑색종, 악성흑자 흑색종, 원위치 흑색종, 비멜라노성 흑색종 및 결합조직 형성 흑색종으로 이루어진 군 중에서 선택된다.
또는, 암은 육종인 것이 적합할 수 있다. 육종은 대개 골육종, 어윙 육종, 연골육종, 악성 섬유성 조직구종, 섬유육종 및 카포시 육종으로 이루어진 군 중에서 선택된다.
또는 암은 신경아교종인 것이 적합할 수 있다.
그 밖의 실시 상태는 본 발명의 올리고뉴클레오타이드의 암치료용 약제의 제조 용도에 관한 것으로, 여기서 상기 약제는 아드레노코르티코스테로이드, 예컨대, 프레드니손, 덱사메타손 또는 데카드론; 알트레타민 (헥살렌, 헥사메틸멜라민(HMM)); 아미포스틴 (에티올); 아미노글루테티미드 (시타드렌); 암사크린 (M-AMSA); 아나스트로졸 (아리미덱스); 안드로겐, 예컨대 테스토스테론; 아스파라기나제 (엘스파); 바실러스 칼메트-구린; 비칼루타미드 (카소덱스); 브레오마이신 (블레녹산); 부술판 (밀레란); 카르보플라틴 (파라플라틴); 카르부스틴 (BCNU, BiCNU); 클로람부실 (류케란); 클로로데옥시아데노신 (2-CDA, 클라드리빈, 류스타틴); 시스플라틴 (플라티놀); 시토신 아라비노사이드 (시타라빈); 데카르바진 (DTIC); 닥티노마이신 (악티노마이신-D, 코스메겐); 다우노루비신 (세루비딘); 도세탁셀 (탁소테레); 독소루비신(아드리오마이신); 에피루비신; 에스트라무스틴 (엠시트); 에스트로겐, 예컨대 디에틸스틸베스트롤 (DES); 에토포시드 (VP-16, 베프시드, 에토포스); 플루다라빈 (플루다라); 플루타미드 (율렉신); 5-FUDR (플록스우리딘); 5-플루오로우라실 (5--FU); 겜시타빈 (겜자르); 고세렐린 (조달렉스); 헤르셉틴 (트라스투주맙); 히드록시우레아 (히드레아); 이다루비신 (이다마이신); 이포스파미드; IL-2 (프로류킨, 알데스류킨); 인터페론 알파 (인트론 A, 로페론 A): 이리노테칸 (캄토사르); 류프롤리드 (류프론); 레바미솔 (에르가미솔); 로무스틴 (CCNU); 메클로라타민 (무스타르겐, 질소 머스타드); 멜팔란 (알케란); 머캅토퓨린 (퓨리네톨, 6-MP); 메토트렉세이트 (멕세이트); 미토마이신-C (뮤타뮤신); 미토잔트론 (노반트론); 옥트레오타이드 (산도스타틴); 펜토스타틴 (2-데옥시코포르마이신, 니펜트); 플리카마이신 (미트라마이신, 키트라신); 프로카르바진 (마툴란); 스트렙토조신; 타목시펜 (놀바덱스); 탁솔 (파클리탁셀); 테니포시드 (부몬, VM-26); 티오테파; 토포테칸 (히캄틴); 트레티노인 (베사노이드, 올-트랜스 레틴산); 빈블라스틴 (발반); 빈크리스틴 (온코빈) 및 비노렐빈 (나벨빈)으로 이루어진 군 중에서 선택된 화학치료제를 추가로 포함한다. 적당하게는 또 다른 화학치료제는 탁솔, 파클리탁셀 또는 도세탁셀과 같은 탁산 중에서 선택된다.
마찬가지로, 본 발명은 암치료용 약제의 제조를 위한 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드의 용도에도 관한 것인데, 여기서 상기 치료는 아드레노코르티코스테로이드, 예컨대, 프레드니손, 덱사메타손 또는 데카드론; 알트레타민 (헥살렌, 헥사메틸멜라민(HMM)); 아미포스틴 (에티올); 아미노글루테티미드 (시타드렌); 암사크린 (M-AMSA); 아나스트로졸 (아리미덱스); 안드로겐, 예컨대 테스토스테론; 아스파라기나제 (엘스파); 바실러스 칼메트-구린; 비칼루타미드 (카소덱스); 브레오마이신 (블레녹산); 부술판 (밀레란); 카르보플라틴 (파라플라틴); 카르부스틴 (BCNU, BiCNU); 클로람부실 (류케란); 클로로데옥시아데노신 (2-CDA, 클라드리빈, 류스타틴); 시스플라틴 (플라티놀); 시토신 아라비노사이드 (시타라빈); 데카르바진 (DTIC); 닥티노마이신 (악티노마이신-D, 코스메겐); 다우노루비신 (세루비딘); 도세탁셀 (탁소테레); 독소루비신(아드리오마이신); 에피루비신; 에스트라무스틴 (엠시트); 에스트로겐, 예컨대 디에틸스틸베스트롤 (DES); 에토포시드 (VP-16, 베프시드, 에토포스); 플루다라빈 (플루다라); 플루타미드 (율렉신); 5-FUDR (플록스우리딘); 5-플루오로우라실 (5--FU); 겜시타빈 (겜자르); 고세렐린 (조달렉스); 헤르셉틴 (트라스투주맙); 히드록시우레아 (히드레아); 이다루비신 (이다마이신); 이포스파미드; IL-2 (프로류킨, 알데스류킨); 인터페론 알파 (인트론 A, 로페론 A): 이리노테칸 (캄토사르); 류프롤리드 (류프론); 레바미솔 (에르가미솔); 로무스틴 (CCNU); 메클로라타민 (무스타르겐, 질소 머스타드); 멜팔란 (알케란); 머캅토퓨린 (퓨리네톨, 6-MP); 메토트렉세이트 (멕세이트); 미토마이신-C (뮤타뮤신); 미토잔트론 (노반트론); 옥트레오타이드 (산도스타틴); 펜토스타틴 (2-데옥시코포르마이신, 니펜트); 플리카마이신 (미트라마이신, 키트라신); 프로카르바진 (마툴란); 스트렙토조신; 타목시펜 (놀바덱스); 탁솔 (파클리탁셀); 테니포시드 (부몬, VM-26); 티오테파; 토포테칸 (히캄틴); 트레티노인 (베사노이드, 올-트랜스 레틴산); 빈블라스틴 (발반); 빈크리스틴 (온코빈) 및 비노렐빈 (나벨빈)으로 이루어진 군 중에서 선택된 화학치료제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 적절하게는, 상기 치료는 추가로 탁솔, 파클리탁셀 또는 도세탁셀과 같은 탁산 중에서 선택된 화학치료제를 추가로 투여하는 것을 포함하는 것이다.
달리 언급하면, 본 발명은 또한 암의 치료 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드나 본 발명에 따른 의약 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것과 추가로 또 다른 화학치료제를 투여하는 것을 포함하여 이루어진다. 상기 추가 투여는 또 다른 화학치료제를 본 발명의 화합물과 컨쥬게이트시켜서 상기 의약 조성물에 포함시켜 투여하거나 또는 별도 포뮬레이션으로서 투여하는 것일 수 있다.
감염성 질환
본 발명의 화합물은 디프테리아, 파상푼, 백일해, 소아마비, B형 간염, C형 간염, 헤로필루스 인플레운자, 홍역, 볼거니, 풍진과 같은 광범위한 감염성 질환에 광범위하게 적용할 수 있는 것으로 생각된다.
Hsa-miR122는 C형 간염에서 나타나므로 miR-122를표적화하는 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 C형 간염의 감염을 치료하는데 이용될 수 있을 것이다.
따라서, 또 다른 측면에서 본 발명은, 감염성 질환의 치료용 약제를 제조하는데 있어서의 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드의 용도 뿐만 아니라 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드 또는 본 발명에 따른 의약 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하여 이루어지는, 감염성 질환을 치료하는 방법도 제공한다.
바람직한 실시 상태에 있어서, 본 발명은 apoB 또는 MTP의 억제제와 같은, VLDL 어셈블리의 억제제와 조합하여, 항miR-122 올리고머를 제공하는 복합 치료법을 제공한다.
염증성 질환
염증성 반응은 감염성 물질의 공격에 대한 생체의 기본적인 방오 메카니즘으로서, 자가 면역 질환을 비롯한, 많은 급성 및 만성 질환의 발병기전에 관여하는 것이기도 하다. 병원체와 싸울 필요가 있음에도 불구하고, 염증성 파열의 효과는 대단히 파괴적이다. 따라서 항염제를 이용함으로써, 염증의 증상학을 제한할 필요가 종종 있다. 염증은 다수의 관련 효소들의 활성화, 혈관 침투성의 증가 및 혈액의 관외, 세포 이동 및 화학적 매개체의 방출을 비롯한 조직 손상에 의해 일반적으로 촉발되는 복합적인 프로세스로서, 손상된 조직의 파괴와 복구를 목표로 한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 염증성 질환의 치료용 약제를 제조하는데 있어서의 본 발명의 올리고뉴클레오타이드의 용도 뿐만 아니라, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 또는 본 발명의 의약 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하여 이루어지는, 염증성 질환의 치료 방법에 관한 것이기도 하다.
본 발명의 바람직한 한가지 실시 상태에서, 염증성 질환은 류마티스성 질환 및/또는 연결 조직 질환, 예컨대 류마티스성 관절염, 전신성 홍반성 루푸스 (SLE) 또는 루푸스, 공피증, 다발성 근염, 염증성 장 질환, 피부근염, 궤양성 대장염, 크론씨병, 혈관염, 건선성 관절염, 박리성 건선 피부염, 보통천포창 및 쇠르그렌 증후군, 특히 염증성 장질환 및 크론씨병인 것이 좋다.
또는 염증성 질환은 윤활낭염, 윤활막염, 피막염, 건염 및/또는 외상성 및/또는 스포츠 기원의 기타 염증성 병변과 같은, 비류마티스성 염증 일 수도 있다.
대사성 질환
대사성 질환은 신체에서 자연적으로 생산되는 화학물질의 축적에 기인하는 질환이다. 이러한 질환은 대개 심각하며, 심지어는 생명을 위협하기도 한다. 기타는 서서히 신체적으로 발병하거나 정신 지체를 일으킬 수도 있다. 이 질환에 걸린 대부분의 영유아는 처음에는 이렇다할 증상을 나타내지 않는다. 태어날 때 적절히 스크리닝 함으로써 이러한 문제를 종종 발견할 수 있다. 조기 진단 및 치료에 의해, 대사성 질환은 효과적으로 관리될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 대사성 질환의 치료용 약제를 제조하는데 있어서의 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 컨쥬게이트의 용도 뿐만 아니라, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 컨쥬게이트 또는 본 발명의 의약 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하여 이루어지는, 대사성 질환의 치료 방법에도 관한 것이다.
본 발명의 한가지 바람직한 실시 상태에서, 대사성 질환은 아밀로이드증, 비오티니다제, OMIM(인간에 있어서 온라인 멘델 유전), 크리글러 나자르 증후군, 당뇨병, 패브리 서포트 μ 인포메이션 그룹, 지방산 산화 증상, 갈락토스혈증, 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제 (G6PD) 결핍증, 글루타르산뇨증, 글루타르산혈증의 국제기구, II형 글루타르산혈증, I형 글루타르산혈증, II형 글루타르산혈증, F-HYPDRR-가족성 저인산염혈증, 비타민 D 내성 구루병, 만노시도시스군, 단풍나무 시럽뇨 질환, 미토콘드리아성 질환, 뮤코다당류혈증 증후군: 니만 픽, 유기산혈증, PKU, 폼페병, 포르피린증, 대사성 증후군, 고지질혈증 및 유전성 지질 질환, 트리메틸아미뉴리아: 생선 구취 증후군, 및 요소 순환성 질환으로 이루어진 군 중에서 선택된다.
간 질환
또 다른 측면에서, 본 발명은 간 질환 치료용 약제를 제조하는데 있어서의 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 컨쥬게이트의 용도 뿐만 아니라, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 컨쥬게이트 또는 본 발명의 의약 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하여 이루어지는, 간 질환 치료 방법이 제공된다.
본 발명의 한가지 바람직한 실시 상태에서, 간 질환은 담도폐쇄증, 알라길 증후군, 알파-1 안티트립신, 티로신혈증, 신생아간염, 및 윌슨병으로 이루어진 군 중에서 선택된다.
기타 용도
본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 진단, 치료 및 예방을 위한 연구용 시약으로서 사용될 수 있다. 연구에 있어서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 세포 및 실험용 동물에서 표적 유전자의 합성을 특이적으로 억제하는데 이용할 수 있기 때문에 표적의 기능 분석이나, 치료적 개재를 위한 표적으로서의 그의 유용성의 평가를 용이하게 해준다. 진단학에 있어서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 노던 블라팅, 인시투 하이브리다이제이션 또는 이와 유사한 기술에 의해 세포와 조직에서의 표적의 발현을 검출 및 정량화하는데 이용될 수 있다. 치료에 있어서는, 표적 발현을 조절함으로써 치료될 수 있는 어떤 질환이나 장애를 앓는 것으로 의심되는 동물이나 인간에게 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드 화합물 투여에 의해, 상기 질병이나 장애를 치료할 수 있다. 또한, 표적 발현과 연관이 있는 질환이나 장애를 앓고 있거나 앓기 쉬운 것으로 의심되는 동물 특히 마우스와 래트 및 인간에게, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 화합물 1종 이상 또는 본 발명의 조성물의 치료학적 또는 예방학적 유효량을 투여함으로써 상기 질환을 치료하는 방법도 제공된다.
miR -122a를 표적화하는 올리고뉴클레오타이드의 치료학적 용도
본 발명자들은 miR-122a를 표적화하는 LNA-항miR이 혈장의 콜레스테롤 수준을 저하시킴을 입증하였다. 따라서, 본 발명의 또 다른 구체예는 miR-122a를 표적화하는 전술한 올리고뉴클레오타이드의 의약으로서으 용도에 관한다.
본 발명의 또 다른 구체예는 혈장 콜레스테롤 수준의 증가 (또는 고콜레스테롤혈증 및 관련 질환)를 치료하기위한 의약을 제조하는데 있어서의 miR-122a를 표적화하는 전술한 올리고뉴클레오타이드의 용도에 관한 것이다. 당업자라면 혈장 콜레스테롤의 증가는 예컨대 죽상동맥경화증과 같은 여러가지 증상을 일으킬 위험이 크기 때문에 바람직하지 못하다는 것을 인지하고 있을 것이다.
본 발명의 또 다른 구체예는 Nrdg3, Aldo A, Bckdk 또는 CD320의 mRNA 수준을 상향조절하기 위한 miR-122a를 표적화하는 전술한 올리고뉴클레오타이드의 용도에 관한 것이다.
도 1. 완전히 LNA-변형 및 포스포로티올화된 LNA-항miR를 이용하여 표적화 부위를 나타낸 miR-21, miR-155 및 miR-122 8-mer LNA 항miR를 도시한 도면이다.
도 2. 루시페라제 센서 분석을 이용한 MCF-7 세포에 있어서의 SEQ ID # 3205 및 SEQ ID #3204 LNA-항miR에 의한 miR-21 길항성을 분석한 도면. miR-21에 대해 완벽하게 맷치되는 표적 부위 또는 미스맷치 표적 부위 (.mm2) 및 LNA-항miR를 여러 가지 농도로 함유하는 루시페라제 센서 플라스미드로 MCF-7 세포를 공형질감염 (co-transfection)시켰다. 24시간 후, 세포들을 수확하여 루시페라제 활성을 측정하였다. 3가지 서로 다른 별개 실험에 있어서 레닐라/파이어플라이 비율의 평균값을 도시하였으며 (막대=s.e.m.), 이들 값들은 모두 0 nM psiCHECK2 (=대조군)에 대해 정규화킨 값이다.
도 3. 루시페라제 센서 분석을 이용한 HeLa 세포에 있어서의 SEQ ID # 3205 및 SEQ ID #3204 LNA-항miR에 의한 miR-21 길항성을 분석한 도면. miR-21에 대해 완벽하게 맷치되는 표적 부위 (mir-21) 또는 미스맷치 표적 부위 (mm2) 및 LNA-항miR를 여러 가지 농도로 함유하는 루시페라제 센서 플라스미드로 HeLa 세포를 공형질감염 시켰다. 24시간 후, 세포들을 수확하여 루시페라제 활성을 측정하였다. 3가지 서로 다른 별개 실험에 있어서 레닐라/파이어플라이 비율의 평균값을 도시하였으며 (막대=s.e.m.), 이들 값들은 모두 0 nM psiCHECK2 (=대조군)에 대해 정규화시킨 값이다.
도 4. 루시페라제 센서 분석을 이용한 LPS-처리된 마우스 RAW 세포에 있어서의 SEQ ID # 3206 및 SEQ ID #3207 LNA-항miR에 의한 miR-155 길항성을 분석한 도면. miR-21에 대해 완벽하게 맷치되는 표적 부위 또는 RAW 세포들을 여러 가지 농도의 miR-155 및 다른 LNA-항miR로 공형질감염시켰다. 24시간 후, 세포들을 수확하여 루시페라제 활성을 측정하였다. 레닐라/파이어플라이 비율의 평균값을 도시하였으며, 이들 값들은 모두 0 nM psi CHECK2 (=대조군)에 대해 정규화시킨 값이다.
도 5. 루시페라제 센서 분석을 이용한 HuH-7 세포에 있어서의 SEQ ID # 3208 및 SEQ ID #4 LNA-항miR에 의한 miR-122 길항성을 분석한 도면. 완벽히 맷치되는 miR-122 표적 부위와 상이한 LNA-항miR를 여러 가지 농도로 함유하는 miR-122 루시페라제 센서로 HuH-7 세포를 공형질감염시켰다. 24시간 후, 세포를 수확하고, 루시페라제 활성을 측정하였다. 3가지 서로 다른 별개 실험에 있어서 레닐라/파이어플라이 비율의 평균값을 도시하였으며 (막대=s.e.m.), 이들 값들은 모두 0 nM psi CHECK2 (=대조군)에 대해 정규화시킨 값이다.
도 6. miR-21 루시페라제 리포터 구축물의 개략도.
도 7. 루시페라제 리포터 분석을 이용한 PC3 세포에 있어서의 8-mer LNA-항miR (SEQ ID # 3205) 대 15-mer LNA-항miR (SEQ ID #3204)에 의한 miR-21 길항성을 분석한 도면. miR-21에 대해 완벽히 맷치되는 표적 부위 또는 미스맷치 표적 부위 및 LNA-항miR를 여러 가지 농도로 함유하는 루시페라제 리포터 플라스미드로 PC3 세포를 공형질감염시켰다. 24시간 후, 세포를 수확하고, 루시페라제 활성을 측정하였다. 3가지 서로 다른 독립적인 실험에 있어서 레닐라/파이어플라이 비율의 평균값을 도시하였으며 (막대=s.e.m.), 이들 값들을 모두 표적 부위가 없는 0 nM 공벡터 (empty vector) (=대조군)에 대해 정규화시켰다. 또한 miR-21 서열 및 LNA- 항miR의 디자인과 위치도 도식적으로 나타내었다. LNA 뉴클레오타이드는 타원형으로, DNA 잔기는 막대로 표시하였다.
도 8. 루시페라제 리포터 분석을 이용한 HeLa 세포에 있어서의 8-mer LNA-항miR에 의한 miR-21 길항성의 특이성 분석 도면. miR-21에 대해 완벽히 맷치되는 표적 부위 또는 미스맷치된 표적 부위 및 LNA-항miR (SEQ ID # 3205)를 여러 가지 농도로 함유하는 루시페라제 리포터 플라스미드로 HeLa 세포를 공형질감염시켰다. 24시간 후, 세포들을 수확하고 루시페라제 활성을 측정하였다. 3가지 서로 다른 독립적인 실험에 대하여 평균값을 도시하고 (막대=s.e.m.) 레닐라/파이어플라이 비율을 표적 부위가 없는 0 nM 공벡터 (=대조군)에 대해 정규화시켰다. miR-21 서열과 LNA-항miR의 디자인 및 위치도 도식적으로 도시하였다. 미스맷치는 색칠한 타원형으로 나타내었다.
도 9. miR-21의 유효한 길항성을 매개하는 완전히 LNA-변형된 LNA-항miR의 가능한 최단 길이를 분석한 도면. miR-21에 대한 완벽한 맷치 표적 부위 또는 미스맷치 표적 부위 및 LNA-항miR를 여러가지 농도로 함유하는 루시페라제 리포터 플라스미드로 HeLa 세포를 공형질감염시켰다 (SEQ ID # 3209=6 mer 및 SEQ ID # 3207=7-mer). 24시간 후, 세포를 수확하고, 루시페라제 활성을 측정하였다. 3가지 서로 다른 독립적인 실험에 있어서 레닐라/파이어플라이 비율의 평균값을 도시하였으며 (막대=s.e.m.), 이들 값들을 모두 표적 부위가 없는 0 nM 공벡터 (empty vector) (=대조군)에 대해 정규화시켰다. 또한 miR-21 서열 및 LNA- 항miR의 디자인과 위치도 도식적으로 나타내었다.
도 10. miR-21을 길항시키는 완전히 LNA-치환된 LNA-항miR의 길이 분석. miR-21에 대한 완벽한 맷치 표적 부위 또는 미스맷치 표적 부위 및 LNA-항miR를 여러가지 농도로 함유하는 루시페라제 리포터 플라스미드로 HeLa 세포를 공형질감염시켰다 (SEQ ID # 3211=9-mer, SEQ ID # 3212=10-mer, SEQ ID #3213=12-mer 및 SEQ ID # 3214=14-mer). 24시간 후, 세포를 수확하고, 루시페라제 활성을 측정하였다. 3가지 서로 다른 독립적인 실험의 평균값 (막대=s.e.m.)을 도시하였으며, 여기서 레닐라/파이어플라이 비율을 표적 부위가 없는 0 nM 공벡터 (=대조군)에 대해 정규화시켰다. 또한 miR-21 서열 및 LNA-항miR의 디자인과 위치도 도식적으로 나타내었다.
도 11. miR 표적 인식 서열 중 8-mer LNA-항miR에 대한 최적 위치 결정. miR-21에 대한 완벽한 맷치 또는 미스맷치 표적 부위 및 LNA-항miR를 여러가지 농도로 함유하는 루시페라제 리포터 플라스미드로 HeLa 세포를 공형질감염시켰다. 24시간 후, 세포를 수확하고 루시페라제 활성을 측정하였다. 3가지 서로 다른 독립적인 실험의 평균값 (막대=s.e.m.)을 도시하였으며 여기서 레닐라/파이어플라이 비율을 표적 부위가 없는 0 nM 공벡터 (=대조군)에 대해 정규화시켰다. 또한 miR-21 서열 및 LNA-항miR의 디자인과 위치도 도식적으로 나타내었다.
도 12. 8-mer SEQ ID #3205 LNA-항miR에 의한 Pdcd4-3'-UTR 및 miR-21의 상호반응 검정. HeLa 세포를 Pdcd4 유전자의 3'UTR 부분과 LNA-항miR를 여러가지 농도로 함유하는 루시페라제 리포터 플라스미드 (SEQ ID #3205=8 mer, 완전한 맷치; SEQ ID #3218=8 mer, 미스맷치; SEQ ID #3204=15 mer, LNA/DNA 믹스; SEQ ID #3220=15 mer, gapmer)로 공형질감염시켰다. 24시간 후, 세포들을 수확하고 루시페라제 활성을 측정하였다. 레닐라/파이어플라이 비율을 0 nM에 대해 정규화시킨 결과를 나타내었다. 또한 miR-21 서열과 LNA-항miR의 디자인 및 위치도 도시하였다.
도 13. 마우스의 RAW 세포에서 miR-155를 길항시키는데 있어서의 8-mer LNA-항miR (SEQ ID #3207)와 15-mer LNA-항miR (SEQ ID #3206)의 비교 도면. 마우스 RAW 세포를 miR-155에 대한 완전 맷치 및 상이한 LNA-항miR를 여러 농도로 함유하는 루시페라제 리포터 플라스미드들로 공형질감염시켰다. 24 시간 후, 세포들을 수확하여 루시페라제 활성을 측정하였다. 3번의 독립적 실험으로부터 얻은 평균값 (막대 = s.e.m)을 나타냈으며, 여기서 miR-155 표적 부위가 없는 0 nM 공벡터 (=대조군)에 대하여 레닐라/파이어플라이 비율을 정규화시켰다. 또한, miR-155 서열을 도식적으로 표현하고 LNA-항miRs의 디자인과 위치도 도시하였다.
도 14. c/EBP의 평가 miR-155 마우스 RAW 세포를 길항하는데 있어서, c/EBPer LNA-항miR (SEQ ID #3207)과 15-mer LNA-항miR (SEQ ID #3206)의 평가. 마우스 RAW 세포를 miR-155에 대한 완전 맷치를 함유하는 루시페라제 리포터 플라스미드로 공형질전환시키고, 20 시간, 세포들을 수확하여 RAW 세포로부터의 단백질 추출물에 대한 웨스턴 블랏 분석을 실시하였다. c/EBPβ의 여러가지 이소형태가 나타났으며, c/EBPβ LIP 및 베타-튜불린에 대하여 산출된 비율을 아래에 나타내었다.
도 15. 완전히 LNA-변형된 8-mer (SEQ ID #3221) LNA-항miR 또는 15-mer 믹스머 (SEQ ID #3228) 항miR에 의한 miR-106b의 길항. HeLa 세포를 miR-106b에 대한 완전 맷치와 상이한 LNA-항miR들을 여러가지 농도로 함유하는 루시페라제 리포터 플라스미드로 공형질감염시켰다. 24시간 후, 세포를 수확하여 루시페라제 활성을 측정하였다. 4가지 복제물에 대한 평균값 (막대 = s.e.m)을 나타냈으며, 여기서 miRNA 표적 부위가 없는 0 nM 공벡터 (=대조군)에 대하여 레닐라/파이어플라이 비율을 정규화시켰다. 또한, miR-106b 서열을 도식적으로 표현하고 LNA-항miRs의 디자인과 위치도 도시하였다.
Figure 16. 완전히 LNA-변형된 8-mer (SEQ ID #3222) LNA-항miR 및 15-mer (SEQ ID #3229) 믹스머 항miR에 의한 miR-19b의 길항. HeLa 세포들을 miR-19a에 대한 완전 맷치 및 두가지 LNA-항miRs를 서로 다른 농도로 함유하는 루시페라제 리포터 플라스미드로 공형질감염시켰다. 24시간 후, 루시페라제 활성 측정을 위해 세포들을 수확하였다. 4가지 복제물에 대한 평균값 (막대 = s.e.m)을 나타냈으며, 여기서 miR-19a 표적 부위가 없는 0 nM 공벡터 (=대조군)에 대하여 레닐라/파이어플라이 비율을 정규화시켰다. 또한, miR-19a 서열을 도식적으로 표현하고 LNA-항miRs의 디자인과 위치도 도시하였다.
도 17. 성숙한 인간의 miR-221 및 miR-222 서열을 도식적으로 나타낸 도면. 두가지 모두의 miRNA 서열에서 보존된 씨드 서열 (7-mer)을 네모 박스 안에 나타내었다.
도 18. 완전히 LNA-치환된 짧은 LNA-항miR을 이용한 마이크로RNA 패밀리의 표적화. PC3 세포들을 miR-221과 miR-222에 대한 루시페라제 리포터 플라스미드를 ㅇ이용하여 개별적으로 또는 함께, 그리고, 농도를 달리하는 여러가지 LNA-항miR들을 이용하여 공형질감염시켰다. LNA-항miRs (15-mers) SEQ ID #3223 (miR-221에 대한 것) 및 SEQ ID #3224 (miR-222에 대한 것)으로 공형질감염시키는 경우, 총 농도는 2 nM (각각 1 nM)였으며, 세포를 SEQ ID #3225 (7-mer)로 형질감염시킨 경우의 농도는 0, 1, 5, 10 또는 25 nM였다. 24시간 후, 세포들을 수확하여 루시페라제 활성을 측정하였다. 3번의 독립적 실험으로부터 얻은 평균값 (막대 = s.e.m)을 나타냈으며, 여기서 miRNA 표적 부위가 없는 0 nM 공벡터 (=대조군)에 대하여 레닐라/파이어플라이 비율을 정규화시켰다. 또한, miR-221/222 서열을 도식적으로 표현하고 LNA-항miRs의 디자인과 위치도 도시하였다.
도 19. 7-mer SEQ ID #3225 LNA-항miR에 의한 miR-221/222 패밀리의 ㄱ길항성에 대한 기능적 판독값으로서의 p27 단백질 수준의 평가. PC3 세포들을 miR-221와 miR-222 두가지 모두를 표적으로 하는 7-mer LNA-항miR SEQ ID #3225를 이용하여 여러가지 농도로 형질감염시켰다. 24시간 후, 세포들을 수확하고 웨스턴 블랏으로 단백질 수준을 측정하였다. p27/튜불린 비율을 나타내었다.
도 20. HepG2 세포에 있어서, 8-mer LNA-항miR (SEQ ID #3205) 대 15-mer LNA-항miR (SEQ ID #3204) 및 2개의 미스맷치를 갖는 8-mer (SEQ ID #3218)에 의한 miR-21 길항성의 루시페라제 리포터 분석을 이용한 평가.
HepG2 세포들을 miR-21에 대한 완전 맷치 표적 부위 및 LNA-항miR들을 여러가지 농도로 함유하는 루시페라제 리포터 플라스미드로 공형질감염시켰다. 24 시간 후, 세포들을 수확하여 루시페라제 활성을 측정하였다. 3번의 독립적 실험으로부터 얻은 평균값 (막대 = s.e.m)을 나타냈으며, 여기서 표적 부위가 없는 0 nM 공벡터 (=대조군)에 대하여 레닐라/파이어플라이 비율을 정규화시켰다. 또한, miR-21 서열을 도식적으로 표현하고 LNA-항miRs의 디자인과 위치도 도시하였다.
도 21. 8-mer SEQ ID #3205 LNA-항miR 대 15-mer (SEQ ID #3204) 및 2개의 미스맷치를 갖는 8-mer (SEQ ID #3218)에 의한 Pdcd4 3'UTR 및 miR-21의 상호반응 검정.
Huh-7 세포들을 Pdcd4 유전자의 3'UTR 부분, pre-miR-21 (10 nM) 및 LNA-항miR들을 여러가지 농도로 함유하는 루시페라제 리포터 플라스미드로 공형질감염시켰다. 24시간 후, 세포를 수확하여 루시페라제 활성을 측정하였다. 3번의 독립적 실험으로부터 얻은 평균값 (막대 = s.e.m)을 나타냈으며, 여기서 표적 부위가 없는 0 nM 공벡터 (=대조군)에 대하여 레닐라/파이어플라이 비율을 정규화시켰다. 또한, miR-21 서열을 도식적으로 표현하고 LNA-항miRs의 디자인과 위치도 도시하였다.
도 22. SEQ ID #3205에 의한 miR-21의 길항성은 Pdcd4 단백질 수준을 증가시킨다.
HeLa 세포들을 5 nM LNA-항miR SEQ ID #3205 (완전 맷치), 또는 SEQ ID #3219 LNA 스크램블형 (8mer) 또는 SEQ ID #3218 (8-mer 미스맷치)로 형질감염시켰다. 세포들을 24시간 후에 수확하고 Pdcd4 항체를 이용하여 웨스턴 블랏을 실시하였다.
도 23. SEQ ID #3205 (완전 맷치) 또는 SEQ ID #3218 (미스맷치 대조군)으로 처리된 마우스에 있어서 ALT 및 AST 수준. 하루 걸러 25 mg/kg을 투여한 후 마우스들을 14일 후에 희생시켰다.
도 24. 짧은 LNA-항miR (SEQ ID #3207)에 의한 miR-155 길항성에 대한 기능적 판독값으로서의 PU.1 단백질 수준의 평가.
THP-1 세포들을 pre-miR-155 (5 nmol) 및 여러가지 LNA 올리고뉴클레오타이드 (5 nM)로 공형질감염시키고 100 ng/ml LPS를 첨가하였다. 24시간 후, 세포들을 수확하고 THP-1 세포로부터의 단백질 추출물에 대한 웨스턴 블랏 분석을 실시하였다. PU.1 및 튜불린을 표시하였다.
도 25. 7-mer SEQ ID #3225 LNA-항miR에 의한 miR-221/222 패밀리의 길항성에 대한 기능적 판독값으로서의 p27 단백질 수준의 평가.
PC3 세포들을, miR-221와 miR-222를 모두 표적화하는 7-mer LNA-항miR SEQ ID #3225 및 LNA 스크램블형 대조군으로 5 및 25 nM의 농도로 형질감염시켰다. 24시간 후, 세포를 수확하여 웨스턴 블랏법으로 단백질 수준을 측정하였다. p27/튜불린 비율을 나타내었다.
도 26. 7-mer SEQ ID #3225 (완전 맷치)에 의한 miR-221/222의 녹-다운은 PC3 세포의 연질 한천 상에서의 콜로니 형성을 저감시킨다.
PC3 세포들을, miR-221와 miR-222 두가지 모두를 표적화하는 25 nM의 7-mer LNA-항miR SEQ ID #3225 또는 7-mer 스크램블형 대조군 (SEQ ID #3231)으로 형질감염시켰다. 24시간 후, 세포들을 수확하고 연질 한천 상에서 접종하였다. 12일 후, 콜로니들을 계수하였다. 하나의 실험을 삼중으로 실시하였다.
도 27. 인간의 let-7 패밀리 및 테스트된 안타고니스트에 대한 개요.
(상부 도면) 이 서열들은 각각의 멤버에 대한 성숙한 miRNA를 도시하며, 박스는 LNA-항miRs에 의해 전형적으로 길항되는 위치인 뉴클레오타이드 2-16을 나타낸다. 그 오른쪽의 컬럼들은 각각 씨드 (S: 위치 2-8), 확장된 씨드(ES; 위치 2-9), 및 LNA-항miRs에 의해 일반적으로 표적화되는 나머지 서열 (NE; 위치 9-16)에 있어서, let-7a와 비교할 때 상이한 뉴클레오타이드의 갯수를 나타낸다. 색깔이 칠해진 뉴클레오타이드들은 let-7a에 비하여 변형된 부분이다. (하부 도면) 디자인, 길이 및 완전히 상보적인 표적을 비롯하여, let-7 패밀리에 대한 테스트된 안타고니스트에 대한 요약 내용. 모든 화합물들은 완전히 포스포로티올화된 것이다.
도 28. Huh-7 세포에 있어서 6종의 서로 다른 LNA-항miR에 의한 let-7 길항성의 루시페라제 센서 분석을 이용한 평가.
Huh-7 세포들을 let-7a 전구체 존재 또는 부재 하 (각각 회색 및 흑색 막대)에 부분적인 HMGA2 3'UTR (4개의 let-7 결합 부위) 및 6종의 서로 다른 LNA-항miRs를 농도를 증가시키면서 함유하는 루시페라제 센서 플라스미드로 공형질감염시켰다. 24시간 후, 세포들을 수확하여 루시페라제 활성을 측정하였다. 두번의 측정에서 얻은 레닐라/파이어플라이 비율의 평균값과 각각의 분석에 있어서의 표준 ㅍ펴편차를 나타냈다. let-7a 전구체를 함유하지 않는 웰 (흑색 막대)의 평균값에 대하여 각각의 LNA-항miR 군에서 모든 비율을 정규화시켰다.
도 29. let-7a (A), let-7d (B), let-7e (C), 및 let-7i (D)에 대한 pre-miRs 및 HMGA2 3'UTR 센서 플라스미드, LNA-항miRs SEQ ID #3226 (왼쪽) 및 SEQ ID #3227 (오른쪽)에 의해 형질감염된 Huh-7 세포로부터의 루시페라제 결과. 회색 막대는 pre-mis 투입 후의 표적 탈억제를 나타내는 반면, 흑색 대조군 막대는 pre-miR 첨가 없는 경우 동등한 수준을 나타낸다. 각각의 비율은 4회 측정에 기초하며 각각의 처리군 중 전구체를 함유하지 않는 웰 (흑색 막대)의 평균값에 대하여 정규화시켰다.
도 30. 여러가지 농도의 LNA-항miR SEQ ID #3227 및 HMGA2 3'UTR 센서 플라스미드 또는 대조군 벡터에 의해 형질감염된 HeLa 세포. 각각의 비율은 4회 측정에 기초하며, 미처리 (0 nM) 대조군 공벡터 (psi-CHECK-2; 회색 막대)에 대하여 정규화시켰다.
도 31. 루시페라제 센서 분석을 이용한 HCT116 세포에 있어서 8mer (#3205)에 의한 mir-21 길항성의 평가. HCT116 세포들을, miR-21에 대한 완전 맷치 표적 부위 (회색 막대) 및 LNA-항miR 및 대조군 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 루시페라제 센서 플라스미드로 공형질감염시켰다. 24시간 후, 세포들을 수확하고 루시페라제 활성을 측정하였다. 하나의 전형적인 예를 2회 실시하였으며, 여기서 레닐라/파이어플라이 비율을 0 nM 공벡터(=흑색 막대)에 대하여 정규화시켰다.
도 32. 8-mer #3205 LNA-항miR에 의한 miR-21의 사일런싱은 PC3 세포에 있어서, 연질 한청 상의 콜로니 형성을 감소시킨다. PC3 세포들을 miR-21을 표적화하는 25 nM의 8-mer LNA-항miR #3205로 형질감염시켰다. 24시간 후, 세포들을 수확하고 연질 한천에 접종하였다. 12일 후, 콜로니들을 계수하였다. 3번의 별도 실험들의 평균값을 나타내었으며, 각 실험은 3번 실시하였고, 0 nM 대조군 (즉 LNA 없이 형질감염된 군)에 대하여 정규화시켰다. #3205에 대한 p=0.01898.
도 33. 8-mer #3205 LNA-항miR에 의한 miR-21의 녹-다운은 HepG2 세포에 있어서 연질 한천 상의 콜로니 형성을 감소시킨다. HepG2 세포들을 miR-21을 표적화하는 25 nM의 8-mer LNA-항miR #3205로 형질감염시켰다. 24시간 후, 세포들을 수확하여 연질 한천에 접종하였다. 17일 후, 콜로니 수를 세었다. 한가지 실험을 3회 반복한 평균값을 나타내었다 (막대=SEM).
도 34. Wound closure in the invasive human prostate 세포주 PC3 after treatment with #3205로 처리한 후 침습성 인간 전립선 세포주 PC3에 있어서의 상처 아뭄. (A) PC3 세포들을 제3일에 LNA-항miR 및 25 nM의 대조군 올리고뉴클레오타이드, #3205 (8mer, 완전 맷치) 및 #3219 (8mer, 미스맷치)로 형질감염시키고 그 다음 날 스크래치를 만들었다. 세포 이동을 모니터링하기 위해 24시간 후에 사진을 찍었다. (B) 각 시점에서의 면적을 소프트웨어 프로그램 Image J를 이용하여 측정하고 각각의 0 h 시점에 대하여 정규화시켰다.
도 35. miR-155을 길항하는 완전히 LNA-치환된 LNA-항miR의 길이 평가.
RAW 세포들을 miR-155에 대한 완전 맷치 표적 부위를 함유하는 루시페라제 리포터 플라스미드 및 LNA-항miR 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 플라스미드로 여러 농도로 공형질감염시켰다. 24시간 후, 세포들을 수확하여 루시페라제 활성을 측정하였다. 3가지 독립적인 실험에 대한 평균값 (막대=s.e.m)을 나타내었으며, ㅇ여기서 레닐라/파이어플라이 비율을 표적 부위를 갖지 않는 0 nM 공벡터 (=모방체)에 대하여 정규화시켰다. 또한, miR 서열을 도식적으로 나타내고 LNA-항miRs의 디자인과 위치도 나타내었다.
도 36. 마우스 혈장 단백질에 대한 5'-FAM 표지된 LNA-항miR-21 (#3205)의 결합.
(A) 마우스 혈장 중 올리고뉴클레오타이드 농도의 함수로서의 % 미결합 LNA-항miR-21 화합물 올리고뉴클레오타이드. (B) 마우스 혈장 중 #3205 농도의 함수로서의 미결합 LNA-항miR-21 화합물 #3205의 농도.
도 37. 웨스턴 블랏 분석에 의한 Ras 단백질 수준의 정량.
A. 처리된 (항-let-7; 8-mer) 대 미처리된 (염수) 폐 및 신장 샘플에 있어서 Ras 및 튜불린 (내부 표준) 단백질을 나타내는 겔 영상. B. LNA-항miR-처리 마우스 (흑색 막대)의 폐와 신장에 있어서의 각각의 단백질 수준의 정량화. 동량의 염수 대조군 (회색 막대)에 대하여 정규화시켰으며, 동등한 로딩 대조군으로서 튜불린을 이용하였다.
B. #3205에 의한 miR-21의 사일런싱은 생체내에서 Pdcd4 단백질 수준의 증가를 초래한다.
C. 마우스에게 14일 동안 하루 걸러 염수 또는 25 mg/kg LNA-항miR (#3205)을 총 5회 주사하여다. 마우스들을 희생시키고 신장으로부터 단백질을 분리하여 Pdcd4 항체를 이용하여 웨스턴 블랏 분석을 실시하였다. A. 처리된 (항miR-21; 8-mer) 신장 샘플 대 미처리 (염수) 신장 샘플에 있어서 Pdcd4 및 Gapdh (내부 표준) 단백질을 나타내는 겔 영상 (M1, 마우스 1; M2, 마우스 2). B. LNA-항miR-처리된 마우스 (암회색 막대)의 신장에 있어서 Pdcd4 단백질 수준의 정량화. 로딩 대조군으로서 Gapdh를 이용하여, 동등한 염수 대조군 (연회색 막대)에 대하여 정규화시켰다.
실시 상태
본 발명의 다음의 실시 상태는 본 발명의 다른 실시 상태와 조합적으로 사용될 수 있다.
1. 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 뉴클레오타이드 유닛 등 총 6 - 12개의 뉴클레오타이드의 인접 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 길이가 6 - 12 뉴클레오타이드인 올리고머로서, 상기 올리고머의 뉴클레오염기 중 적어도 50%는 고친화성 뉴클레오타이드 유사체 유닛인 올리고머 및 약학적으로 허용되는 희석제, 담체, 염 또는 아쥬반트를 포함하여 이루어지는 의약 조성물.
2. 실시 상태 1에 있어서, 상기 인접 뉴클레오타이드 서열은 포유동물, 인간 또는 바이러스의 마이크로RNA (miRNA) 서열의 대응하는 영역과 상보적인 것인 의약 조성물.
3. 실시 상태 2에 있어서, 상기 인접 뉴클레오타이드 서열은 표 3, 4, 또는 5 중 어느 하나에 기재된 miRNA들 중에서 선택된 miRNA 서열의 대응하는 영역과 상보적인 것인 의약 조성물.
4. 실시 상태 2 또는 3에 있어서, 상기 인접 뉴클레오타이드 서열은 상기 마이크로RNA의 씨드 서열과 상보적인 서열로(을) 구성되거나 포함하는 것인 의약 조성물.
5. 실시 상태 2 - 4 중 어느 하나에 있어서, 상기 인접 뉴클레오타이드 서열은 표 3 또는 4에 기재된 서열들 중에서 선태고딘 서열로(을) 구성되거나 포함하는 것인 의약 조성물.
6. 실시 상태 4 또는 5에 있어서, 씨드머의 3' 뉴클레오염기는 상기 인접 뉴클레오타이드 서열의 3' 최말단 뉴클레오염기를 형성하며, 여기서 상기 인접 뉴클레오타이드 서열은 하나 또는 두개의 5' 뉴클레오염기를 추가로 포함하여도 좋은 것인 의약 조성물.
7. 실시 상태 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 상기 인접 뉴클레오타이드 서열은 5' 말단으로부터 세어서 마이크로 RNA 서열 중에 존재하는 첫번째 뉴클레오타이드에 대응하는 뉴클레오타이드는 포함하지 않는 것인 의약 조성물.
8. 실시 상태 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 상기 인접 뉴클레오타이드 서열은 표 3 또는 4 또는 5에 기재된 것들 중에서 선택된 miRNA 중에 존재하는 대응하는 뉴클레오타이드 서열과 상보적인 것인 의약 조성물.
9. 실시 상태 8에 있어서, 상기 miRNA는 miR-1, miR-10b, miR-17-3p, miR-18, miR-19a, miR-19b, miR-20, miR-21, miR-34a, miR-93, miR-106a, miR-106b, miR-122, miR-133, miR-134, miR-138, miR-155, miR-192, miR-194, miR-221, miR-222, 및 miR-375로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 의약 조성물.
10. 실시 상태 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 상기 인접 뉴클레오타이드 서열의 뉴클레오염기 유닛의 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 모든 뉴클레오염기 유닛은 뉴클레오타이드 유사체 유닛인 것인 의약 조성물.
11. 실시 상태 10에 있어서, 뉴클레오타이드 유사체 유닛은 2'-O_알킬-RNA 유닛, 2'-OMe-RNA 유닛, 2'-아미노-DNA 유닛, 2'-플루오로-DNA 유닛, LNA 유닛, PNA 유닛, HNA 유닛, INA 유닛, 및 2'MOE RNA 유닛으로 이루어진 군 중에서 선택된 것인 의약 조성물.
12. 실시 상태 10 또는 11에 있어서, 상기 인접 뉴클레오타이드 서열의 뉴클레오염기의 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 모든 뉴클레오염기 유닛은 잠금 핵산 (LNA:Locked Nucleic Acid) 뉴클레오염기 유닛인 것인 의약 조성물.
13. 실시 상태 12에 있어서, 인접 뉴클레오타이드 서열의 모든 뉴클레오염기 유닛은 LNA 뉴클레오염기 유닛인 것인 의약 조성물.
14. 실시 상태 1-13 중 어느 하나에 있어서, 상기 인접 뉴클레오타이드 서열은 7, 8, 9 또는 10개의, 바랍직하게는 인접하는 LNA 뉴클레오염기 유닛을(으로) 포함하거나 구성된 것인 의약 조성물.
15. 실시 상태 1 -14 중 어느 하나에 있어서, 상기 올리고머는 7, 8, 9 또는 10개의 인접 뉴클레오염기 유닛으로 구성되며 여기서 적어도 7개의 뉴클레오염기 유닛은 뉴클레오타이드 유사체 유닛인 것인 의약 조성물.
16. 실시 상태 15에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 유사체 유닛은 잠금 핵산 (LNA) 뉴클레오염기 유닛인 것인 의약 조성물.
17. 실시 상태 15에 있어서, 분자 내의 뉴클레오타이드 유사체 유닛은 적어도 50% LNA 유닛과 최대 50%의 다른 뉴클레오타이드 유사체 유닛과의 혼합물로 이루어진 것인 의약 조성물.
18. 실시 상태 1 - 17 중 어느 하나에 있어서, 인접 뉴클레오타이드 서열의 뉴클레오염기 유닛들 사이에 존재하는 인터뉴클레오사이드 결합의 적어도 75%, 예컨대, 80% 또는 85% 또는 90% 또는 95% 또는 모두는 포스포로티오에이트 인터뉴클레오사이드 결합인 것인 의약 조성물.
19. 실시 상태 1 - 18 중 어느 하나에 있어서, 상기 올리고머는 하나 이상의 비뉴클레오염기 화합물과 컨쥬게이트된 것인 의약 조성물.
20. 실시 상태 1 - 19 중 어느 하나에 있어서, 상기 인접 뉴클레오타이드 서열은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 miRNA 서열과 같은 적어도 2개의 miRNA 서열의 대응하는 서열과 상보적인 것인 의약 조성물.
21. 실시 상태 1 - 20 중 어느 하나에 있어서, 상기 인접 뉴클레오타이드 서열은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 miRNA 씨드 영역 서열과 같은 적어도 2개의 miRNA 씨드 영역 서열로 된 서열과 상보적인 서열로(을) 구성되거나 포함하는 것인 의약 조성물.
22. 실시 상태 20 또는 21에 있어서, 상기 인접 뉴클레오타이드 서열은 miR-221과 miR-222 두가지 모두의 대응하는 영역과 상보적인 것인 의약 조성물.
23. 실시 상태 22에 있어서, 상기 인접 뉴클레오타이드 서열은 5'GCUACAU3'에 상보적인 서열로(을) 구성되거나 포함하는 것인 의약 조성물.
24. 실시 상태 1 - 23 중 어느 하나에 있어서, 상기 올리고머는 전구약물을 구성하는 것인 의약 조성물.
25. 실시 상태 1 - 24 중 어느 하나에 있어서, 상기 인접 뉴클레오타이드 서열은 has-miR-122의 대응하는 영역과 상보적인 것인 의약 조성물.
26. 실시 상태 25에 있어서, C형 간염 바이러스 간염 및 고콜레스테롤혈증 및 관련 질환으로 이루어진 군 중에서 선택된 질환 또는 의학적 장애의 치료를 위해 사용되는 것인 의약 조성물.
27. 실시 상태 25 또는 26에 있어서, 상기 조성물은 ApoB 억제제 또는 MTP 억제제와 같은 VLDL 어셈블리 경로의 억제제인 제2의 독립적인 활성 성분을 추가로 포함하는 것인 의약 조성물.
28. 실시 상태 25 또는 26에 따른 의약 조성물 및 ApoB 억제제 또는 MTP 억제제와 같은 VLDL 어셈블리 경로의 억제제인 제2의 독립적인 활성 성분을 포함하여 이루어진는 키트.
29. 실시 상태 1 - 28 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물을, 마이크로RNA의 존재 또는 과발현과 관련이 있는 질환 또는 의학적 장애를 앓고 있거나 앓을 위험이 있는 환자에게 투여하는 단계를 포함하여 이루어지는 마이크로RNA의 존재 또는 과발현과 관련이 있는 질환 또는 의학적 장애의 치료 방법.
30. 실시 상태 1 - 25 중 어느 하나에 정의된 올리고머.
31. 실시 상태 30에 기재된 올리고머 및 적어도 1종의 비뉴클레오염기 화합물을 포함하여 이루어지는 컨쥬게이트.
32. 마이크로RNA의 존재 또는 과발현과 관련이 있는 질환 또는 의학적 장애의 치료용 약제의 제조를 위한, 실시 상태 30 또는 31 중 어느 하나에 기재된 올리고머 또는 컨쥬게이트의 용도.
33. 전술한 실시 상태 중 어느 하나에 따른 올리고머, 컨쥬게이트 또는 의약 조성물을, miRNA를 발현시키는 세포에 투여함으로써, 상기 세포에서의 상기 miRNA의 양 또는 유효량을 감소시키기 위한 방법.
34. 세포 내에서 miRNA에 의해 그의 발현이 억제되는 mRNA을 탈억제하기 위한 방법으로서, 상기 mRNA의 발현을 탈억제하기 위하여, 전술한 실시 상태 중 어느 하나에 따른 올리고머, 컨쥬게이트 또는 의약 조성물을 상기 mRNA와 상기 miRNA의 두가지 모두를 발현시키는 세포에 투여하는 것을 포함하여 이루어지는 방법.
참고자료: 참고자료의 상세는 우선권 서류에 기재되어 있다.
실시예
실시예
LNA Monomer 및 올리고뉴클레오타이드의 합성은 WO2007/112754의 실시예 1 및 2에 개시된 방법에 따라 실시하였다. 인간 또는 래트의 혈장 중에서의 LNA 올리고뉴클레오타이드의 안정성을 WO2007/112754의 실시예 4에 설명된 방법학에 따라 시함하였다. WO2007/112754의 실시예 6에 설명된 방법학에 따라 LNA 항miR 안티센스 올리고뉴클레오타이드 (miR-122를 표적화함)를 이용하여 시험관내에서 세포들을 처리하였다. 시험관내 모델과 생체내 모델 모두에서 마이크로RNA 특이적인 정량적 PCR에 의한 miR 발현의 올리고뉴클레오타이드 억제 분석을 WO2007/112754의 실시예 7에 설명된 방법에 따라 수행하였다. WO2007/112754의 실시예 8에 설명된 방법에 따라, miRNA 마이크로어레이 발현 프로파일링을 이용하여 LNA 항miR 녹다운 특이성을 평가한다. WO2007/112754의 실시예 9에 설명된 방법학에 따라, 인 시튜 하이브리다이제이션에 의한 마이크로RNA의 검출을 실시한다. WO2007/112754의 실시예 10에 설명된 방법학을 이용하여 시험관내 모델과 생체내 모델 두가지 모두에 있어서의 mRNA 발현의 분리 및 분석 (mRNA 분석을 위한 총 RNA 분리 및 cDNA 합성)을 실시한다. WO2007/112754의 실시예 11 - 27에 설명된 방법을 이용하여, 마이크로RNA-122를 표적화하는 본 발명의 올리고머를 이용한 생체내 실험 및 후속적인 분석을 실시한다. 전술한 WO2007/112754의 실시예들은 본 발명에 참고로 통합된다.
실시예 1: LNA 항 miR 올리고뉴클레오타이드의 디자인 및 융점
Figure 112010028980901-pct00008

Figure 112010028980901-pct00009
실시예 2: 시험관내 모델: 세포 배양
표적 핵산 발현 (양)에 미치는 LNA 올리고뉴클레오타이드의 효과 는, 그 표적 핵산이 측정가능한 수준으로 존재하기만 한다면, 어떤 종류의 세포에서든 테스트할 수 있다. 표적은 상기 핵산을 코딩하는 핵산을 임시로 또는 안정하게 형질감염시키거나 또는 내재적으로 발현될 수 있다.
표적 핵산의 발현 수준은 예컨대, 노던 블랏 분석 (마이크로RNA 노던을 포함), 정량적 PCR (마이크로RNA qPCR을 포함) 리보뉴클레아제 보호 분석법을 비롯한 통상적인 방법으로 측정할 수 있다. 설명 목적 상 다음의 세포 종류들을 제시하였으나, 선택된 세포 종류에서 표적이 발현되기만 하면 다른 종류의 세포들도 마찬기자로 사용가능하다.
후술하는 바와 같이 적절한 매질에서 세포들을 배양하여, 37℃에서 95-98%의 습도 및 5% CO2 하에서 유지시킨다. 세포들을 보통 1주일에 2-3회 계대시킨다.
15 PC3 : 인간의 전립선 암세포주 15PC3를 Dr. F. Baas (Neurozintuigen Laboratory, AMC, The Netherlands)에서 기증받아, DMEM (Sigma) + 10% 소태아 혈청 (FBS) + 글루타맥스 I + 젠타마이신 중에서 배양하였다.
PC3 : 인간의 전립선 암세포주 PC3를 ATCC에서 구입하여 글루타민 (Gibco) + 10% FBS + 젠타마이신과 함께 F12 Coon 배지에서 배양하였다.
518A2: 인간의 흑색종 암세포주 518A2를 Dr. B. Jansen (비엔나 대학교, 임상약학부 분자약학과 발암실험 섹션)로부터 기증 받아 DMEM (Sigma) + 10% 소의 태아 혈청 (FBS) + 글루타맥스 I + 젠타마이신에서 배양하였다.
HeLa: 자궁경부암종 세포주 HeLa를 10% 소의 태아 혈청 겐타마이신을 함유하는 MEM (Sigma)에서 37℃, 95% 습도 및 5% CO2 조건 하에서 배양하였다.
MPC -11: 쥐의 다발성 골수종 세포주 MPC-11를 ATCC로부터 구입하여 DMEM 중에서 4mM 글루타맥스+ 10% 말의 혈청과 함께 배양하였다.
DU-145: 인간의 전립선암 세포주 DU-145를 ATCC로부터 구입하여 글루타맥스 + 10% FBS와 함께 RPMI에서 배양하였다.
RCC -4 +/- VHL : 인간의 신장암 세포주 RCC4를 VHL을 발현하는 플라스미드로 안정적으로 형질감염시키거나 또는 공플라스미드를 ECACC로부터 구입하여 제조자 지침에 따라 유지하였다.
786-0: 인간의 신장암종 세포주 786를 ATCC로부터 구입하여 제조자 지침에 따라 유지하였다.
HUVEC : 인간의 제대 정맥 상피 세포주 HUVEC를 Camcrex로부터 구입하여 EGM-2 배지에서 유지시켰다.
K562 : 인간의 만성 골수성 백혈병 세포주 K562를 ECACC로부터 구입하여 RPMI 에서 글루타맥스 + 10% FBS와 함께 배양하였다. U87MG : 인간의 아교모세포종 세포주 U87MG를 ATCC로부터 구입하여 제조자의 지침에 따라 유지시켰다.
B16: 쥐의 흑색종 세포주 B16을 ATCC로부터 구입하여 제조자의 지침에 따라 유지시켰다.
LNCap : 인간의 전립선암 세포주 LNCap를 ATCC로부터 구입하여 RPMI에서 글루타맥스 + 10% FBS와 함께 배양하였다.
Huh-7: 인간의 간, 상피 유사 세포를 Eagles MEM에서 10 % FBS, 2mM 글루타맥스 I, 1x 비필수 아미노산, 젠타마이신 25 ㎍/ml와 함께 배양하였다.
L428 : (Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen (DSM, Braunschwieg, Germany)): 인간의 B 세포 임파구를 10% FCS, L-글루타민 및 항생제가 보강된 RPMI 1640 배지에서 유지시켰다.
L1236 : (Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen (DSM, Braunschwieg, Germany)): 인간의 B 세포 임파종을 10% FCS, L-글루타민 및 항생제가 보강된 RPMI 1640 배지에서 유지시켰다.
실시예 3: miRBase 마이크로RNA 데이터베이스 중 모든 인간의 마이크로RNA 서열에 대한 LNA 항 miR 라이브러리의 설계.
사용된 miRBase 버젼은 Griffiths-Jones, S., Grocock, R.J., van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A.J. 2006. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Res. 34: D140-4에 보고된 바와 같은 버젼 12였으며, 이것은 http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/index.shtml을 통해 입수가능하다.
표 1에는 miRBase 마이크로 RNA 데이타베이스에 따른 마이크로RNA의 씨드머 서열을 포함하는 7, 8 및 9mer 뉴클레오타이드 서열들이 제시되어 있다. 이들 씨드머 서열은 마이크로RNA 씨드 영역의 역 상보물을 포함한다. 어떤 실시 상태에서 본 발명의 올리고머는 7mer, 8mer 또는 9mer 서열 중에서 선택된 인접 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 어떤 실시 상태에서, 7mer, 8mer 및 9mer 서열들과 관련하여 모든 인터뉴클레오사이드 결합은 포스포로티오에이트이다. 7mer, 8mer 및 9mer 뉴클레오타이드 서열은 LNA 뉴클레오타이드 유사체와 같은 본 발명에 설명된 뉴클레오타이드 유사체의 서열로 구성될 수 있다. LNA 시토신은 메틸-시토신 (5'-메틸-시토신)일 수 있다. 몇몇 구체예에서, LNA는 베타-D-옥시-LNA이다.
표 3은 본 발명에 제공된 (표 1 참조) 7, 8 또는 9mer와 같은 동일한 씨드머 올리고머에 의해 표적화될 수 있는 것들로 그룹지어지는 마이크로RNA 리스트를 제공한다.
Figure 112010028980901-pct00010

Figure 112010028980901-pct00011
Figure 112010028980901-pct00012
본 발명자들은 miR-21, miR-155 및 miR-122 (본 발명에서 마이크로miR라 칭함)에 대한 8-mer LNA-항miR를 구축하였는데 이것은 완전히 LNA 변형되고 포스포로티올화된 것이다 (도 1 및 표 6 참조). miR-21, miR-155 및 miR-122에 대한 루시페라제 센서 플라스미드를 이용하여 MCF-7, HeLa, Raw 및 Huh-7 세포들로부터 얻은 본 발명자들의 결과는 완전히 LNA-변형된 짧은 LNA-항miRs가 마이크로RNA를 길항시키는데 대단히 강력하다는 것을 입증해준다.
Figure 112010028980901-pct00013
합성 마이크로RNA 올리고뉴클레오타이드 (일반적으로 포스포디에스테르 백본과 RNA 뉴클레오타이드로 구성됨)를 이용하여, 성숙한 마이크로RNA 서열에 대한 융점을 평가할 수 있다. 전형적으로 측정된 Tm은 RNA 표적에 대하여 LNA 올리고머를 사용한 경우, 예측된 Tm 보다 높다.
실시예 4: 루시페라제 센서 분석을 이용한, MCF -7 세포 중 SEQ ID #3205 LNA-항 miR 에 의한 miR -21 길항성 평가.
완전히 LNA-변형된 8-mer LNA-항miR (SEQ ID #3205) 올리고뉴클레오타이드가 miR-21을 표적화 및 길항화시키는 능력을 평가하기 위하여, 성숙한 miR-21에 대한 완전 맷치 표적 부위와 대조군으로서, 씨드 중 두개의 돌연변이를 갖는 표적 부위를 함유하는 루시페라제 센서 구축물을 만들었다 (도 6). 마이크로RNA-21 억제를 모니터링하기 위하여, 유방암종 세포주 MCF-7을 여러가지 농도의 miR-21 안타고니스트 SEQ ID #3205를 갖는 상이한 루시페라제 구축물들로 형질감염시키고, 이를 miR-21에 대한 15-mer LNA-항miR SEQ ID #3204의 경우와 비교하였다. 24시간 후, 루시페라제 활성을 측정하였다.
결과: 도 2에서, 루시페라제 활성이 탈억제 (de-repression)된 것으로부터 에 알 수 있는 바와 같이, 새로운 완전히 LNA-변형된 8-mer LNA-항miR (SEQ ID #3205)는 SEQ ID #3204에 비해 2배 더 강력한 활성을 나타내었다. 이와 대조적으로, miR-21 씨드에 2개의 미스맷치를 갖는 대조군 miR-21 센서 구축물은 파이어플라이 루시페라제 활성의 탈억제를 전혀 나타내지 않았기 때문에, 이는 세포에서 miR-21 활성을 모니터링하는데 있어서 완전히 맷치된 miR-21 센서의 특이성을 입증하는 것이다. 8-mer LNA-항miR에 의한 루시페라제 활성의 탈억제는 명백히 투여량 의존적이었으며, 이는 SEQ ID #3204에서는 관찰되지 않았다. 뿐만 아니라, 이 새로운 8-mer는 SEQ ID #3204에 비해 더 낮은 투여량에서도 훨씬 더 강력하다.
결론적으로, 이 8-mer LNA-항miR (SEQ ID #3205)은 miR-21을 표적으로 하는 15-mer LNA-항miR SEQ ID #3204와 비교할 때 시험관 내에서 miR-21을 억제하는데 있어 현저히 향상된 강도를 보여주는 것이다.
재료 및 방법:
세포주: 유방암종 세포주 MCF-7을 ATCC (#HTB-22TM)으로부터 구입하였다. MCF-7 세포들을, 10% 소의 태아 혈청, 2 mM 글루타맥스, 1x NEAA 및 25 ug/ml 젠타마이신이 강화된 EMEM 배지에서 배양하였다.
형질감염: 형질감염하기 전 날, 6-웰 플레이트에 웰 당 400,000 세포들을 접종하여 그 다음 날 50-70% 컨플루언시를 얻었다. 형질감염 당일, MCF-7 세포를 0.8 ug miR-21 완전 맷치/psiCHECK2, miR-21.mm2/psiCHECK2 또는 psiCHECK2 공벡터 (SDS Promega)를 이용하여 1 ml 리포펙타민2000 (Invitrogen)과 함께 제조자 지침에 따라 형질감염시켰다. 24시간 후, 루시페라제 측정을 위해 세포들을 수확하였다.
루시페라제 분석: 세포들을 PBS로 세척하고 세포 스크레이퍼를 이용하여 수확한 다음, 10,000 rpm에서 5분간 원심분리하였다. 상등액을 폐기하고, 50 μl 1 x 수동 용해 완충액 (Passive Lysis Buffer: Promega)를 세포 펠릿에 첨가한 다음, 세포들을 얼음 위에 30분간 정치시켰다. 용해된 세포들을 10,000 rpm에서 30분간 회전시킨 다음 20 μl를 96 웰 플레이트에 옮기고 제조자 (Promega) 지침에 따라 루시페라제를 측정하였다.
실시예 5: 루시페라제 센서 분석을 이용한 HeLa 세포에서의 SEQ ID #3205 LNA-항 miR 에 의한 miR -21 길항성의 평가.
miR-21를 표적화하는데 있어서, 완전히 LNA-변형된 8-mer LNA-항miR SEQ ID #3205의 효능을 더욱 평가하기 위해, 상기 섹션에 설명된 바와 같이, 자궁경부암종 세포주 HeLa 역시도, 여러 농도의 SEQ ID #3205와 함께 전술한 miR-21 루시페라제 센서 구축물로 형질감염시켰다 (도 3).
결과: SEQ ID #3205는 5 nM에서도 HeLa 세포에서 miR-21 루시페라제 센서 구축물을 완전히 탈억제시켰는데, 이는 최고 농도 (50 nM)에서도 완전한 탈억제를 나타내지 않은 SEQ ID #3204와 대조되는 것이다. 또한, 8-mer SEQ ID #3205 LNA-항miR에 대한 miR-21의 길항성은 투여량-의존적이다. miR-21 루시페라제 센서 분석의 특이성을 입증하기 위해, 미스맷치된 miR-21 표적 부위 (씨드 중 2개의 미스맷치) 역시도 HeLa 세포 내로 형질감염시켰으나, 파이어플라이 루시페라제 활성을 전혀 탈억제시키지 않은 것으로 나타났다.
결론적으로, 완전히 LNA-변형된 SEQ ID #3205는 15-mer LNA-항miR SEQ ID #3204와는 대조적으로, MCF-7 및 HeLa 세포의 두가지 세포 모두에서 시험관내에서 miR-21을 억제하는데 있어서 유의적으로 증강된 활성을 나타내었다.
재료 및 방법:
세포주: 인간의 자궁경부암종 세포주 HeLa를 ECACC (#93021013)로부터 구입하였다. HeLa 세포를 10% 소의 태아 혈청 2 mM 글루타맥스, 1x NEAA 및 25 ug/ml 젠타마이신이 강화된 EMEM 배지에서 배양하였다.
형질감염: 형질감염 전 날, 24 웰 플레이트에 웰 당 60,000개의 세포를 접종하여 다음 날 50-70% 컨플루언시가 되도록 하였다. 형질감염 당일에, HeLa 세포를 0.2 ug miR-21 완전 맷치/psiCHECK2, miR-21.mm2/psiCHECK2 또는 psiCHECK2 공벡터를 이용하여, 0.7 μl 리포펙타민 2000 (Invitrogen)과 함께 제조자 지침에 따라 형질감염시켰다. 24시간 후, 루시페라제 측정을 위해 세포를 수확하였다.
루시페라제 분석: 세포들을 PBS로 세척하고 100 ml 1 x 수동 용해 완충액 (Promega)을 각각의 웰에 첨가한 다음 24 웰 플레이트를 오비탈 진탕기로 30분간 처리하였다. 세포들을 수집하고 에펜도르프 튜브에 넣은 다음 10,000 rpm에서 30분간 회전시킨 후, 10 μl를 96 웰 플레이트에 넣고 제조자 (Promega) 지침에 따라 루시페라제 측정을 실시하였다.
실시예 6: 루시페라제 센서 분석을 이용한 마우스 RAW 세포에서의 SEQ ID #3207 LNA-항 miR 에 의한 miR -155 길항성의 평가.
완전히 LNA-변형된 8-mer LNA-항miR가 miR-155를 효과적으로 길항시킬 수 있는지 알아보기 위하여, miR-155에 대한 완전 맷치 표적 부위를 동일한 루시페라제 벡터 (psiCHECK2) 내로 클로닝시키고 이를 마우스 백혈병 단핵구 대식세포인 RAW 세포주에 형질감염시켰다. RAW 세포주에서는 miR-155의 내인성 수준이 낮기 때문에, miR-155 축적을 유도하기 위해, 24시간에 걸쳐 세포들을 100 ng/ml LPS로 처리하였다.
결과: 루시페라제 측정 결과, miR-155를 표적화하는, 완전히 LNA-변형된 8-mer LNA-항miR SEQ ID #3207은 15-mer LNA-항miR SEQ ID #3206와 비교할 때 miR-155를 길항하는데 있어 비슷하게 효과적인 것으로 나타났다 (도 4). 두가지 LNA-항miR 모두 0.25 nM 농도에서 miR-155 루시페라제 센서를 >50% 탈억제시켰으며 miR-155를 투여량 의존 방식으로 억제하였다.
결론: 이러한 데이타는 실시예 1 및 2에 나타낸 바와 같은 miR-21 길항 시험 결과를 뒷받침 하는 것으로서, 완전히 티올화된 8-mer LNA-항miR가 마이크로RNA ㅍ표적화에 매우 효과적임을 입증하는 것이다.
재료 및 방법:
세포주: 마우스 백혈병 단핵구 대식세포 RAW 264.7을 ATCC (TIB-71)로부터 구입하였다. RAW 세포를 10% 소의 태아 혈청, 4 mM 글루타맥스 및 25 ug/ml 젠타마이신이 보강된 DMEM 배지에서 배양하였다.
형질감염: 형질감염 전 날, 6 웰 플레이트의 웰 당 500,000개의 ㅅ세포를 접종하여 다음날 50% 컨플루언시가 되도록 하였다. 형질감염 당일에, MCF-7 세포를0.3 ug miR-155 또는 psiCHECK2 공벡터를 이용하여 제조자 지침에 따라 10 ml 리포펙타민 2000 (Invitrogen)과 함께 형질감염시켰다. miR-155 축적을 유도하기 유도하기 위하여, 형질감염 컴플렉스와 함께 4시간 인큐베이션시킨 후, LPS (100 ng/ml)를 RAW 세포에 첨가하였다. 다시 24시간 후, 루시페라제 측정을 위해 세포들을 수확하였다.
루시페라제 분석: 세포들을 PBS로 세척하고 세포 스크레이퍼로 수확한 후, 세포들을 2,500 rpm에서 5분간 원심분리하였다. 상등액을 폐기하고, 세포 펠릿에 50 μl 1 x 수동 용해 완충액 (Promega)을 첨가한 후, 세포들을 얼음 위에서 30분간 유지시켰다. 용해된 세포들을 10,000에서 30분간 스핀시킨 후, 20 μl를 95 웰 플레이트에 넣고 제조자 (Promega) 지침에 따라 루시페라제 측정을 실시하였다.
실시예 7: 루시페라제 센서 분석을 이용한 HuH -7 세포에서의 SEQ ID #3208 LNA-항 miR 에 의한 miR -122 길항성의 평가.
miR-122에 대한 완전히 변형된 8-mer LNA-항miR SEQ ID #3208의 효능을 인간의 간암종 세포주 HuH-7에서 평가하였다. 완전 맷치 miR-122 표적 부위를 함유하는 루시페라제 센서 구축물로 HuH-7 세포를 형질감염시켰다. 24시간 후, 루시페라제 측정을 실시하였다 (도 5).
결과: miR-122 루시페라제 센서의 탈억제에 의해 입증되는 바와 같이,
완전히 LNA-변형된 8-mer LNA-항miR SEQ ID #3208은 저농도에서도 15-mer LNA-항miR SEQ ID #4는 보다 더 강력하다. 두가지 모두의 LNA-항miRs는 투여량 의존 방식으로 miR-122를 억제한다 (도 5).
결론: miR-122를 표적화하는, 완전히 LNA-변형된 8-mer LNA-항miR SEQ ID #3208은 시험관 내에서 miR-122를 억제하는데 있어서 개선된 활성을 나타낸다.
재료 및 방법:
세포주: 인간의 간암종 세포주 HuH-7를 R. Bartenschlager, Heidelberg로부터 기증받았다. Huh-7 세포들을 10% 소의 태아 혈청, 2 mM 글루타맥스, 1x NEAA 및 25 ug/ml 젠타마이신이 보강된 EMEM 배지에서 배양하였다.
형질감염: 8.000 cells 형질감염 전 날, 96 웰 플레이트의 각 웰 당 8,000ㄱwere 개의 세포를 접종하여 다음날 50-70%의 컨플루언시가 되도록 하였다. 형질감염 당일, HuH-7 세포를 1 μl 리포펙타민2000 (Invitrogen)과 함께 57 ng miR-122 또는 psiCHECK2 공벡터를 이용하여, 형질감염시켰다. 24시간 후, 루시페라제 측정을 위해 세포들을 수확하였다.
루시페라제 분석: 50 μl 1 x 수동 용해 완충액 (Promega)을 각각의 웰에 첨가한 다음 96 웰 플레이트를 30분간 오비탈 진탕기로 처리하였다. 각각의 웰에 ㄷ듀얼-루시페라제 리포터 분석 시스템 (Promega)을 첨가하고 제조자 (Promega) 지침에 따라 루시페라제 측정을 실시하였다.
실시예 8. 인간 전립선암종 세포 ( PC3 )에 있어서 8-mer ( SEQ ID #3205) 대 15-mer ( SEQ ID #3204) LNA-항 miR 의 비교에 의한 miR -21 길항성의 평가.
본 발명자들은 앞서 (특허출원 1051), 완전히 LNA-변형되고 포스포로티올화된 8-mer LNA-항miR이 인간의 자궁경부암종 세포주 HeLa에서 miR-21 루시페라제 리포터 수준을 완전히 탈억제하고, 인간의 유방암종 세포주 MCF-7에 있어서는 miR-21 루시페라제 리포터 수준을 부분적으로 탈억제할 수 있음을 보여준 바 있다. 본 발명자들은 이러한 스크리닝 접근법을 인간의 전립선암 세포주 PC3에까지 연장하려는 시도를 하였다. miR-21에 대한 서로 다른 LNA-항miR 올리고뉴클레오타이드의 효능을 평가하기 위해, 씨드에 2개의 미스맷치를 갖는 표적 부위와 성숙한 miR-21에 대한 완전 맷치 표적 부위를 레닐라 루시페라제 유전자의 3'UTR에 클로닝시킨 루시페라제 리포터 구축물을 제작하였다 (도 7). miR-21 억제를 모니터링하기 위해, PC3 세포들을, miR-21 안타고니스트 SEQ ID #3205 (8-mer) 및 비교를 위해 15-mer LNA-항miR 완전 맷치 SEQ ID #3204를 여러 농도로 함유하는 여러가지 루시페라제 구축물로 형질감염시켰다. 24 시간 후, 루시페라제 활성을 측정하였다.
결과: 이 루시페라제 리포터 실험은 miR-21에 대한 15-mer LNA-항miR (SEQ ID #3204)가 루시페라제 miR-21 리포터 활성을 투여량 의존 방식으로 탈억제하였음을 보여주었다. 그러나, 최고 농도에서도 루시페라제 리포터의 완전한 탈억제는 관찰되지 않았다 (도 7). 이와 대조적으로, 8-mer 완전히 LNA 치환된 LNA-항miR은 1 nM에서 조차 완전한 탈억제를 나타내었는데, 이는 15-mer LNA-항miR보다 그 강도가 훨씬 증가되었음을 가리키는 것이다. miR-21에 대한 미스맷치 표적 부위를 갖는 루시페라제 대조군 리포터는 어느 LNA-항miR에 의해서도 영향을 받지 않았으며, 이는 두가지 LNA-항miRs 모두의 높은 특이성을 입증하는 것이다.
결론: 이 마이크로머는 miR-21을 표적화시키는데 있어서 15-mer LNA-항miR보다 훨씬 더 강력하며, 전립선암종 세포에 대해 이제까지의 것들 중 가장 강력한 것이다.
재료 및 방법:
세포주: 인간의 전립선 암종 PC3 세포주를 ECACC (#90112714)로부터 구입하였다. PC3 세포를 10% 소의 태아 혈청, 2 mM 글루타맥스 및 25 ug/ml 젠타마이신이 보강된 DMEM 배지에서 배양하였다.
형질감염: 100.000 형질감염 전날 12-웰 플레이트의 각각의 웰 당 100,000개의 세포들을 접종하여, 다음 날 50% 컨플루언시를 얻도록 하였다. 형질감염 당일에, PC3 세포를, 제조자 지침에 따라 1.2 ml 리포펙타민 2000 (Invitrogen)과 함께 0.3 mg miR-21 또는 psiCHECK2 공벡터를 이용하여 형질감염시켰다. LNA-항miRs의 농도를 변화시키면서 형질감염시켰다. 24시간 후, 루시페라제 측정을 위해 세포들을 수확하였다.
루시페라제 분석: 세포들을 PBS로 세척하고 250 μl 1 x 수동 용해 완충액 (Promega)을 웰에 첨가하였다. 플레이트를 30분간 진탕기 상에서 처리한 후, 세포 용해물을 에펜도르프 튜브에 넣었다. 세포 용해물을 2,500 rpm에서 10분간 원심분리시킨 후, 20 μl를 96 웰 플레이트에 넣고 제조자 (Promega) 지침에 따라 루시페라제 측정을 실시하였다.
실시예 9. 8-mer LNA-항 miR 에 의한 miR -21 길항성의 특이성 평가
To investigate the specificity of miR-21을 표적화하는 본 발명의 짧은 LNA-항miR의 특이성을 조사하기 위하여, 본 발명자들은 씨드 인식 서열에 2개의 미스맷치를 함유하는 8-mer 미스맷치 대조군 LNA-항miR (SEQ ID #3218)을 설계하였다 (도 8 참조). 실시예 1에 설명된 루시페라제 리포터 구축물을 LNA 미스맷치 대조군 올리고 SEQ ID # 3218과 함께 인간의 자궁경부암종 세포주 HeLa 내로 형질감염시키고 그의 효능을 miR-21을 표적화하는 8-mer LNA-항miR (SEQ ID #3205)와 비교하였다. 24시간 후, 루시페라제 활성을 측정하였다.
결과: 도 8에 도시된 바와 같이, Hela 세포에서의 완전히 LNA-변형된 8-mer LNA-항miR의 형질감염은 5 nMdptjeh 루시페라제 miR-21 리포터를 완전히 탈억제시켰다. 이와 대조적으로, 세포들을 8-mer LNA 미스맷치 대조군 올리고는 miR-21 씨드에 2개의 미스맷치를 갖는 대조군 miR-21 루시페라제 리포터를 이용한 결과와 조합할 때, 이들 데이타는 HeLa 세포에서 miR-21을 표적화하는데 있어서 완전히 LNA-치환된 8-mer LNA-항miR가 높은 특이성을 갖는다는 것을 보여준다.
miRBase 마이크로RNA 서열 데이타베이스를 분석한 결과, LNA-항miR SEQ ID #3205의 miR-21 인식 서열은 마이크로RNA-21에 대해 특이적인 것으로 나타났다. 그러나, 마이크로머 길이를 7 nt로 감소시키자, ath-miR-844, mmu-miR-590-3p 및 has-miR-590-3p 역시도 표적화된 것으로 보아, 이 경우는 miR-21에 대해서만 특이적이지 않았다.
결론: 8-mer LNA-항miR 중 두개의 뉴클레오타이드 위치를 3개의 미스맷칭 뉴클레오타이드로 교환시키자 miR-21에 대한 LNA-항miR의 길항 활성이 완전히 회피되었다.
재료 및 방법:
세포주: 인간의 자궁경부암종 세포주 HeLa를 ECACC (#93021013)로부터 구입하였다. HeLa 세포를 10% 소의 태아 혈청, 2 mM 글루타맥스, 1x NEAA 및 25 ug/ml 젠타마이신이 보강된 EMEM 배지에서 배양하였다.
형질감염: 형질감염 전날, 24-웰 플레이트에 각 웰 당 60,000개의 세포를 접종하여, 다음날 50-70% 컨플루언시가 되도록 하였다. 형질감염 당일에, HeLa 세포를 제조자 지침에 따라 0.7 ml 리포펙타민2000 (Invitrogen)과 함께, 0.2 ug miR-21 완전 맷치/psiCHECK2, miR-21.mm2/psiCHECK2 또는 psiCHECK2 공벡터로 형질감염시켰다. LNA-항miRs의 농도를 달리하면서 형질감염시켰다. 24시간 후, 세포들을 루시페라제 측정을 위해 수확하였다.
루시페라제 분석: 세포들을 PBS로 세척하고 100 ml 1 x 수동 용해 완충액(Promega)을 각각의 웰에 첨가한 다음, 24-웰 플레이트를 오비탈 진탕기 상에서 30분간 처리하였다. 세포들을 수집하고 에펜도르프 튜브에 넣은 다음 10,000 rpm 에서 30분간 스핀시킨 후 10 μl를 96-웰 플레이트에 넣고 제조자 (Promega) 지침에 따라 루시페라제 측정을 실시하였다.
실시예 10. miR -21의 효과적인 길항성을 매개하는 완전히 LNA-변형된 LNA-항miR의 가능한 최단 길이 평가.
LNA-항miR 길이와 관련한 요구성을 추가로 조사하기 위하여, 본 발명자들은 miR-21를 표적화하는 7-mer 및 6-mer LNA-항miR를 설계하였는데, 이들 두가지는 모두 완전히 LNA-변형되고 포스포로티올화된 올리고뉴클레오타이드이다. 이 miR-21 루시페라제 리포터 구축물을 여러 농도의 LNA-항miRs와 함께 HeLa 세포 내로 형질감염시켰다. 24시간 후 루시페라제 측정을 실시하였다.
결과: 도 9에 도시된 바와 같이, 7-mer LNA-항miR는 miR-21 루시페라제 리포터 플라스미드의 탈억제를 매개하지만, 8-mer LNA-항miR (SEQ ID #3205)에 비해 그 강도는 낮다. 그럼에도 불구하고, 투여량 의존 방식으로 기능한다는 것을 여전히 관찰할 수 있다. 이와 대조적으로, 6-mer LNA-항miR는 억제 활성을 나타내지 않았다.
결론: 결론적으로, miR-21 억제를 매개할 수 있는 LNA-항miR의 가능한 최단 길이는 7 뉴클레오타이드이다. 그러나, 7-mer LNA-항miR는 8-mer LNA-항miR에 비해 miR-21에 대해 효능이 낮다.
재료 및 방법:
세포주: 인간의 자궁경부암종 세포주 HeLa를 ECACC (#93021013)로부터 구입하였다. HeLa 세포를 10% 소의 태아 혈청, 2 mM 글루타맥스, 1x NEAA 및 25 ug/ml 젠타마이신이 보강된 EMEM 배지에서 배양하였다.
형질감염: 형질감염 전 날, 24 웰 플레이트의 각 웰 당 60,000개의 세포를 접종하여 그 다음날 50-70% 컨플루언시에 도달하도록 하였다. 형질감염 당일에, HeLa 세포들을 제조자 지침에 따라 (Invitrogen) 0.7 μl 리포펙타민2000과 함께, 0.2 ug miR-21 완전 맷치/psiCHECK2, miR-21.mm2/psiCHECK2 또는 psiCHECK2 공벡터를 이용하여 형질감염시켰다. LNA-항miRs의 농도를 달리하여서도 형질감염시켰다. 24시간 후, 루시페라제 측정을 위하여 세포들을 수확하였다.
루시페라제 분석: 세포들을 PBS로 세척하고 100 μl 1 x 수동 용해 완충액 (Promega)을 각각의 웰에 첨가한 다음, 24-웰 플레이트를 오비탈 진탕기에서 30분간 처리하였다. 세포들을 수집하고 에펜도르프 튜브에 넣은 다음 10,000 rpm에서 30분간 스핀시킨 후, 10 μl를 96-웰 플레이트에 넣고 제조자 (Promega) 지침에 따라 루시페라제 활성을 측정하였다.
실시예 11. miR -21을 길항하는 완전히 LNA-치환된 LNA-항 miRs 의 길이 평가
이어서, 본 발명자들은 HeLa 세포 내에서 miR-21을 길항시키는데 있어서, 완전히 LNA 치환된 LNA-항miR의 길이를 9-mer에서 14-mer로 증가시킨데 따른 효과를 조사하였다. 결과적인 LNA-항miR를 miR-21 루시페라제 리포터 구축물과 함께 HeLa 세포 내로 형질감염시켰다 (도 10). 24시간 후 루시페라제 측정을 실시하였다.
결과: 9-mer LNA-항miR SEQ ID #3211 (9-mer)는 투여량 의존 방식으로 miR-21 루시페라제 리포터를 탈억제하였는데, 7-mer LNA-항miR (SEQ ID #3210)의 경우 입증된 바와 달리, 완전한 탈억제에 이르지는 못하였다. 길이를 10-mer로부터 14-mer (SEQ ID #3212, SEQ ID #3213 및 SEQ ID #3214)로 증가시키자, miR-21 리포터의 탈억제 효과가 덜 효과적인 것으로부터 알 수 있는 바와 같이 그 효능이 감소하였다.
결론: 도 10에 도시된 바와 같이, miR-21 억제를 매개할 수 있는, 완전히 LNA-변형되고 포스포로티올화된 최장의 LNA-항miR는 9-mer LNA-항miR SEQ ID #3211이다. 그러나, 이것은 7-mer 및 8-mer LNA-항miRs에 비해서 명백히 그 효능이 낮다.
재료 및 방법: 세포주: 인간의 자궁경부암종 세포주 HeLa를 ECACC (#93021013)로부터 구입하였다. HeLa 세포를 10% 소의 태아 혈청, 2 mM 글루타맥스, 1x NEAA 및 25 ug/ml 젠타마이신이 보강된 EMEM 배지에서 배양하였다.
형질감염: 형질감염 전 날, 24-웰 플레이트 내의 각 웰 당 60,000개의 세포들을 접종하여 다음날 50-70% 컨플루언시에 도달하게 하였다. 형질감염 당일에, HeLa 세포들을 제조자 지침에 따라 0.7 μl 리포펙타민2000 (Invitrogen)과 함께, 0.2 ug miR-21 퍼펙트 맷치/psiCHECK2, miR-21.mm2/psiCHECK2 또는 표적 부위가 ㄷ들어 있지 않은 psiCHECK2 공벡터 대조군으로 형질감염시켰다. 또한 LNA-항miRs의 농도를 변화시키면서도 형질감염시켰다. 24시간 후, 세포들을 수확하여 루시페라제를 측정하였다.
루시페라제 분석: 세포들을 PBS으로 세척하고 각각의 웰에 100 ml 1 x 수동 용해 완충액 (Promega)을 첨가한 다음, 24-웰 플레이트를 오비탈 진탕기에서 30분간 처리하였다. 세포들을 수집하고 에펜도르프 튜브에 넣은 다음 10,000 rpm에서 30분간 스핀시킨 후 10 μl를 96-웰 플레이트에 옮긴 후 제조자 (Promega) 지침에 따라, 루시페라제 측정을 실시하였다.
실시예 12. miR 표적 인식 서열 중에서의 8-mer LNA-항 miR 의 최적 위치 결정.
본 발명자들의 실험 결과 완전히 LNA-변형되고 포스포로티올화된 LNA-항miR 중 가장 강력한 것은 그 길이가 8 뉴클레오타이드인 것으로 나타났다. miR 표적 인식 서열에서의 8-mer LNA-항miR의 최적 위치를 평가하기 위하여, 본 발명자들은 도 11에 도시된 바와 같이 성숙한 miR-21 서열에 타일된 (tiled) 네가지 서로 다른 완전히 LNA-변형된 8-mer LNA-항miRs를 설계하였다. 이들 서로 다른 LNA-항miR들을 miR-21 루시페라제 리포터 구축물을 이용하여 HeLa 세포 내로 형질감염시켰다. ㄹ루시페라제 측정은 24 시간 후에 실시하였다.
결과: 루시페라제 리포터에 의해 측정된 바와 같이 miR-21의 효과적인 사일런싱을 매개한 유일한 LNA-항miR은 SEQ ID #3205였는데, 이것은 miR-21의 씨드 영역을 표적화하는 것이다. 씨드의 3' 말단을 커버하도록 설계된 (50% 씨드 표적화) SEQ ID #3215는 어떠한 효과도 나타내지 않았고, 성숙한 miR-21의 중심 영역과 3' 말단을 각각 표적화하도록 위치된, 다른 두개의 LNA-항miRs SEQ ID #3216 또는 SEQ ID #3217도 아무런 효과를 나타내지 않았다.
결론: miR-21의 강력한 사일런싱을 매개하는 유일한 8-mer LNA-항miR는 miR-21의 씨드를 표적화하는 것이다.
재료 및 방법:
세포주: 인간의 자궁경부암종 세포주 HeLa를 ECACC (#93021013)로부터 구입하였다. HeLa 세포를 10% 소의 태아 혈청, 2 mM 글루타맥스, 1x NEAA 및 25 ug/ml 젠타마이신이 보강된 EMEM 배지에서 배양하였다.
형질감염: 형질감염 전 날에 24-웰 플레이트 중 각각의 웰에 60,000개의 세포를 접종하여, 다음 날 50-70% 컨플루언시를 얻었다. 형질감염 당일에, HeLa 세포들을 제조자 지침 (Invitrogn)에 따라 0.7 μl 리포펙타민2000 (Invitrogen)과 함께, 0.2 ug miR-21 퍼펙트 맷치/psiCHECK2, miR-21.mm2/psiCHECK2 또는 psiCHECK2 공벡터로 형질감염시켰다. 형질감염은 LNA-항miRs의 농도를 달리 하여서도 실시하였다. 24시간 후, 루시페라제 측정을 위하여 세포를 수확하였다.
루시페라제 분석: 세포들을 PBS으로 세척하고 각각의 웰에 100 ml 1 x 수동 용해 완충액 (Promega)을 첨가한 다음, 24-웰 플레이트를 오비탈 진탕기에서 30분간 처리하였다. 세포들을 수집하고 에펜도르프 튜브에 넣은 다음 10,000 rpm에서 30분간 스핀시킨 후 10 μl를 96-웰 플레이트에 옮긴 후 제조자 (Promega) 지침에 따라, 루시페라제 측정을 실시하였다.
실시예 13. 8-mer SEQ ID #3205 LNA-항 miR 을 이용한 miR - 21와 Pdcd4 -3'- UTR 에 있어서 miR -21 표적 부위와의 상호반응의 검정
종양 억제 단백질 Pdcd4는 TPA-유도형 신생 형질전환, 종양 촉진 및 진행을 억제한다. Pdcd4는 또한 여러가지 인듀서들에 반응하여 세포자멸사에서 상향조절되는 것으로도 나타났다. 뿐만 아니라, 폐암과 직장결장암 중에서 Pdcd4의 하향 조절은 환자의 예후가 나쁜 것과 연관이 있었다. 최근, Asangani 등과 Frankel 등은Pdcd4-3'-UTR이 miR-21에 대한 보존된 표적 부위를 함유하여 세포들을 항miR-21로 형질감염시킴으로써, Pdcd4 단백질의 증가를 초래한다는 것을 보여주었다. 따라서 본 발명자들은 전술한 miR-21 표적 부위를 포괄하며 Pdcd4의 3'UTR 영역의 313 nt를 산생하는 루시페라제 리포터 플라스미드를 제작하고, 이를 여러가지 서로 다른 LNA-항miR와 함께 HeLa 세포 내로 공형질감염시켰다. 이들 여러가지 서로 다른 LNA-항miR들; SEQ ID #3205 (8-mer, 퍼펙트 맷치) 또는 SEQ ID #3218 (8-mer, 미스맷치)였다. 24시간 후 루시페라제 측정을 실시하였다.
결과: 도 12에 도시된 바와 같이, Pdcd4 3'UTR 루시페라제 리포터 및 SEQ ID #3205dp 의해 형질감염된 세포들에 있어서는, 루시페라제 활성이 증가된 것으로 관찰되었는데, 이는 Pdcd4 3'UTR과 miR-21 사이에 상호반응이 일어났음을 가리키는 것이다. 그러나, 미스맷치 화합물인 SEQ ID #3218로 형질감염된 세포의 경우, 루시페라제 활성은 아무런 변화를 나타내지 않았는데, 이는 상기 미스맷치 화합물이 miR-21을 길항하지 않았던 것으로부터 예상되었던 것이다. 8-mer LNA-항miR을 더 긴 길이를 갖도록 설계된 두개의 다른 LNA-항miR와 비교하자, 완전히 LNA-변형되고 포스포로티올화된 짧은 LNA-항miR이 훨씬 더 효과적이었는데, 이는 앞서의 루시페라제 분석 데이타를 확인해주는 것이다.
결론: 이들 데이타로부터 miR-21를 길항시키는 SEQ ID #3205는 Pdcd4 3'UTR과 miR-21 사이의 상호반응을 조절할 수 있다고 결론지어진다.
재료 및 방법:
세포주: 인간의 자궁경부암종 세포주 HeLa를 ECACC (#93021013)로부터 구입하였다. HeLa 세포를 10% 소의 태아 혈청, 2 mM 글루타맥스, 1x NEAA 및 25 ug/ml 젠타마이신이 보강된 EMEM 배지에서 배양하였다.
형질감염: 형질감염 전 날에 24-웰 플레이트 중 각각의 웰에 60,000개의 세포를 접종하여, 다음 날 50-70% 컨플루언시를 얻었다. 형질감염 당일에, HeLa 세포들을 제조자 지침 (Invitrogn)에 따라 0.7 μl 리포펙타민2000 (Invitrogen)과 함께, 0.2 ug Pdcd4-3'-UTR/psiCHECK2 또는 psiCHECK2 공벡터로 형질감염시켰다. 형질감염은 LNA-항miR 올리고뉴클레오타이드의 농도를 달리 하여서도 실시하였다. 24시간 후, 루시페라제 측정을 위하여 세포를 수확하였다.
루시페라제 분석: 세포들을 PBS으로 세척하고 각각의 웰에 100 ml 1 x 수동 용해 완충액 (Promega)을 첨가한 다음, 24-웰 플레이트를 오비탈 진탕기에서 30분간 처리하였다. 세포들을 수집하고 에펜도르프 튜브에 넣은 다음 10,000 rpm에서 30분간 스핀시킨 후 10 μl를 96-웰 플레이트에 옮긴 후 제조자 (Promega) 지침에 따라, 루시페라제 측정을 실시하였다.
실시예 14. 마우스 RAW 세포에 있어서 miR -155를 길항시키는데 있어서의 8-mer LNA-항 miR ( SEQ ID #3207)와 15-mer LNA-항 miR ( SEQ ID #3206)와의 비교
짧은 LNA-항miR를 이용하는 본 발명자들의 접근법이 다른 miRNA를 표적화하는데도 적용될 수 있을지 조사하기 위하여, 본 발명자들은 마이크로RNA-155에 대한 완전히 LNA-변형된 8-mer LNA-항miR를 설계하였다. miR-155에 대한 완전 맷치 표적 부위를 리포터 플라스미드 psiCHECK2의 루시페라제 유전자 내의 3'-UTR 내로 클로닝시키고, 8-mer 또는 15-mer LNA-항miR과 함께 마우스 RAW 대식 세포주 내로 형질감염시켰다. miR-155의 내인성 수준은 RAW 세포주에서는 낮기 때문에, miR-155 축적을 유도하기 위하여, 이 세포들을 100 ng/ml LPS로 24 시간 동안 처리하였다. 24시간 후, 루시페라제 분석을 실시하였다.
결과: 루시페라제 측정 결과, miR-155를 표적화하는 완전히 LNA-변형된 8-mer LNA-항miR SEQ ID #3207은 15-mer LNA-항miR SEQ ID #3206와 비교할 때 miR-155를길항시키는데 있어서 비슷하게 효과적이었다 (도 13). 두가지 LNA-항miR는 모두 0.25 nM 농도에서 miR-155 루시페라제 센서를 >50% 탈억제시켰으며 투여량 의존 방식으로 miR-155를 억제하였다.
miRBase 마이크로RNA 서열 데이타베이스의 분석 결과 LNA-항miR SEQ ID #3207의 miR-155 인식 서열은 마이크로RNA-155에 대하여 특이적인 것으로 나타났다. 그러나, LNA-항miR 길이를 7 nt로 줄이자, miR-155에만 특이적이지 않고, mdv1-miR-M4 및 kshv-miR-K12-11 역시도 표적화되었다.
결론: 완전히 LNA-변형되어 포스포로티올화된 8-mer LNA-항miR는 miR-155를 길항시키는데 있어서, 혼합형 LNA/DNA 디자인의 15-mer LNA-항miR과 비교할때 동등한 효능을 갖는다. 따라서, 짧은 LNA-항miR를 이용한 본 발명자들의 접근법은 다른miRNA들을 표적화시키는데도 용이하게 접목시킬 수 있다.
재료 및 방법:
세포주: 마우스의 대식세포 RAW 264.7 세포주를 ATCC (TIB-71)로부터 구입하였다. RAW 세포를 10% 소의 태아 혈청, 4 mM 글루타맥스 및 25 ug/ml 젠타마이신이 보강된 DMEM 배지에서 배양하였다.
형질감염: 형질감염 전 날에, 6-웰 플레이트의 각각의 웰에 500,000개의 세포를 접종하여, 다음 날 50% 컨플루언시가 되도록 하였다. 형질감염 당일에, RAW 264.7 세포들을 제조자 (Invetrogen) 지침 에 따라 10 μl 리포펙타민2000 과 함께 0.3 ug miR-155 완전 맷치/psiCHECK2 또는 psiCHECK2 공벡터를 이용하여 형질감염시켰다. 형질감염은 LNA-항miR의 농도를 변화시켜서도 수행하였다. miR-155 축적을 유도하기 위하여, 트랜스펙션 복합체와 4 시간 동안 인큐베이션시킨 후, LPS (100 ng/ml)를 RAW 세포에 첨가하였다. 다시 24시간 후, 루시페라제 측정을 위하여 세포들을 수확하였다.
루시페라제 분석: 세포들을 PBS로 세척하고 세포 스크레이퍼로 수확한 다음, 세포들을 2,500 rpm으로 5분간 스핀시켰다. 상등액을 폐기하고 50 μl 1 x 수동 용해 완충액 (Promega)을 세포 펠릿에 첨가한 다음, 세포들을 얼음 위에서 30분간 유지시켰다. 용해된 세포들을 10,000 rpm에서 30분간 스핀시킨 후, 20 μl를 96-웰 플레이트에 넣고 제조자 지침(Promega)에 따라 루시페라제 측정을 실시하였다.
실시예 15. 짧은 LNA-항 miR ( SEQ ID #3207)에 의한 miR -155 길항성의 기능적 판독값으로서의 c/ EBP β 단백질 수준의 평가.
짧은 LNA-항miR (SEQ ID #3207)에 의한 miR-155 길항성의 기능적 판독값으로서, 본 발명자들은 신규한 miR-155 표적, c/EBPβ의 단백질 수준을 측정하였다. 마우스 대식세포 RAW 세포주를 pre-miR-155의 존재 또는 부재 하에 8-mer (SEQ ID #3207) 또는 15-mer (SEQ ID #3206) LNA-항miR로 형질감염시켰다. 15-mer에 대한 미스맷치 대조군으로는, miR-122를 표적화하는 SEQ ID #4를 사용하였고, 8-mer에 대한 미스맷치 대조군으로는, miR-21를 표적화하는 SEQ ID #3205를 사용하였다. 이들 두가지 대조군 miRNA는 c/EBPb 발현 수준을 조절하지 않는다. LPS를 사용하여miR-155 축적을 유도시키고 세포들을 16 시간 후에 LPS와 함께 수확하였다. c/EBPβ는 웨스턴 블랏 분석에 의해검출가능한 3종의 이소형, 즉: LIP, LAP 및 LAP*를 가지며, 동일한 막들을 로딩 대조군으로서 베타-튜불린으로 다시 프로빙시켰다
결과: 도 14에 도시된 바와 같이, c/EBPβ LIP 및 베타-튜불린에 대한 비율을 산출하였다. 15-mer LNA-항miR에 의해 형질감염되고 pre-miR-155를 갖지 않는 RAW 세포들은 모두 동등한 c/EBPβ LIP/베타-튜불린 비율을 나타내었는데, 이는 miR-155의 억제가 c/EBPβ LIP 수준을 증가시키는데 기인한다 (도 14, 왼쪽 패널). 이와 대조적으로 LNA 또는 미스맷치로 처리되지 않은 RAW 세포로부터의 단백질 추출물을 이용한 레인에 도시된 바와 같이, 만일 c/EBPβ가 miR-155 표적이면, 예상된 바와 같이 RAW 세포에서의 pre-miR-155의 형질감염은 c/EBPβ LIP 수준을 증가시켰다. 그러나, miR-155에 대한 LNA-항miR로 형질감염된 RAW 세포로부터의 단백질 추출물을, c/EBPβ LIP 수준을 증가시켰다. 동일한 실험을 8-mer LNA-항miR-155 (SEQ ID #3207)에 대하여도 실시하였으며 도 14 (오른쪽 패널)에 도시된 바와 같이, 15-mer LNA-항miR SEQ ID #3206의 경우에 필적할만한 결과가 관찰되었다.
결론: 8-mer 또는15-mer LNA-항miR를 이용한 miR-155의 길항은 직접 표적c/EBPβ의 탈억제를 일으킨다.
재료 및 방법:
세포주: 마우스 대식세포 RAW 264.7 세포주를 ATCC (TIB-71)로부터 구입하였다. RAW 세포들을 10% 소의 태아 혈청, 4 mM 글루타맥스 및 25 ug/ml 젠타마이신이 보강된 DMEM 배지에서 배양하였다.
형질감염: 형질감염 전 날에 6-웰 플레이트의 각 웰마다 500,000개의 세포를 접종하여, 다음 날 50% 컨플루언시를 얻었다. 형질감염 당일에, RAW 264.7 세포들을 제조자 지침에 따라 10 μl 리포펙타민2000 (Invitrogen)과 함께 5 nmol pre-miR-155 (Ambion) 및/또는 5 nM LNA-항miR과 함께 형질감염시켰다. 형질감염은 LNA-항miR의 농도를 변화시키면서도 실시하였다. miR-155 축적을 유도하기 위하여, 형질감염 복합체와 함께 4 시간 인큐베이션시킨 후, LPS (100 ng/ml)를 RAW 세포에 첨가하였다. 16 시간 후, 세포들을 단백질 추출을 위해 수확하고 웨스턴 블랏으로 분석하였다.
웨스턴 블랏 : 세포들을 PBS로 세척하고, 트립신화시킨 다음 에펜도르프 튜브에 넣고 250 μl 용해 완충액 (1xRIPA)을 첨가하였다. 세포 용해물을 얼음 위에 20분간 유지시키고, 10,000 rpm에서 10분간 스핀시켰다. 제조자 지침에 따라 쿠마씨 플러스를 이용하여 단백질 농도를 측정하고 80 ug을 4-12% BIS-TRIS 젤 상에 로딩시켰다. 막을 4℃에서 일차 모노클로날 마우스 항체 C/EBP b (Santa Cruz)와 함께 1:100 농도로 인큐베이션시켰다. 면역반응 밴드를 ECL 플러스 (Amersham)로 가시화시켰다.
실시예 16. 완전히 LNA-변형된 8-mer ( SEQ ID #3221) LNA-항 miR 에 의한 miR -106b의 길항성
짧은 LNA-항miRs를 이용한 본 발명자들의 접근법을 다른 miRNA들에 대해서도 적용시킬 수 있는지 확인하기 위하여, 본 발명자들은 마이크로RNA-106b에 대하여 완전히 LNA-변형된 8-mer LNA-항miR를 설계하였다. miR-106b에 대한 완전 맷치 표적 부위를 벡터 (psiCHECK2) 중의 루시페라제 유전자의 3'-UTR 내로 클로닝시키고 여러가지 농도의 짧은 LNA-항miR (SEQ ID #3221) 또는 15-mer LNA-항miR (SEQ ID #3228)와 함께 인간 자궁경부암종 HeLa 세포주 내로 트랜스펙션시켰다.
결과: 루시페라제 리포터의 탈억제로부터 알 수 있는 바와 같이 (1 nM LNA-항miR 농도에서 완전히 탈억제되었음), miR-106b에 대한 8-mer LNA-항miR SEQ ID #3221의 형질감염은 투여량 의존 방식으로 miR-106b를 억제시켰다 (도 15). 15-mer LNA-항miR SEQ ID #3228을 이용하자 이와 필적할만한 결과가 얻어졌는데, 이는 8-mer LNA-항miR가 15-mer와 유사한 정도로 효능이 있음을 입증하는 것이다.
결론: HeLa 세포에서의 miR-106b의 표적화로부터, 완전히 LNA-변형되고 포스포로티올화된 8 mer LNA-항miR는 15-mer LNA/DNA 믹스머 LNA-항miR와 비교할 때 유사한 효능을 갖는다는 것을 알 수 있다.
재료 및 방법:
세포주: 인간의 자궁경부암종 세포주 HeLa를 ECACC (#93021013)로부터 구입하였다. HeLa 세포를 10% 소의 태아 혈청, 2 mM 글루타맥스, 1x NEAA 및 25 ug/ml 젠타마이신이 보강된 EMEM 배지에서 배양하였다.
형질감염: 형질감염 전 날에, 96-웰 플레이트의 각각의 웰에 5,200개의 세포를 접종하여, 다음 날 50-70% 컨플루언시가 되도록 하였다. 형질감염 당일에, HeLa 세포들을 제조자 (Invetrogen) 지침에 따라 0.14 μl 리포펙타민2000과 함께 57 ng miR-21 완전 맷치/psiCHECK2, miR-21.mm2/psiCHECK2 또는 psiCHECK2 공벡터를 이용하여 형질감염시켰다. 형질감염은 LNA-항miR의 농도를 변화시켜서도 수행하였다. 24시간 후, 루시페라제 측정을 위하여 세포들을 수확하였다.
루시페라제 분석: 세포들을 PBS로 세척하고 30 μl 1 x 수동 용해 완충액 (Promega)을 각각의 웰에 첨가한 다음, 24-웰 플레이트를 오비탈 진탕기 상에서 30분간 처리하였다. 세포들을 수집하고 에펜도르프 튜브에 넣은 다음 10,000 rpm에서 30분간 스핀시킨 후, 제조자 지침(Promega)에 따라 루시페라제 측정을 실시하였다.
실시예 17. 완전히 LNA-변형된 8-mer ( SEQ ID #3222) LNA-항 miR 에 의한 miR -19a의 길항
짧은 LNA-항miR를 이용한 본 발명자들의 접근법을 다른 miRNAs에도 적용시킬 수 있는지 더 확인해보기 위하여, 본 발명자들은 마이크로RNA-19a에 대하여 완전히 LNA-변형된 8-mer LNA-항miR를 설계하였다. miR-19a에 대한 완전 맷치 표적 부위를 psiCHECK2 벡터 내 루시페라제 유전자의 3'-UTR 내로 클로닝시켰다. 이 리포터 플라스미드를 miR-19a를 표적화하는 여러가지 농도의 15-mer LNA-항miR (SEQ ID #3229) 또는 짧은 LNA-항miR (SEQ ID #3222)와 함께 인간의 자궁경부암종 HeLa 세포주 내로 형질감염시켰다. 24시간 후에 루시페라제 측정을 수행하였다.
결과: 도 16에 도시된 바와 같이, HeLa 내로의 15-mer LNA-항miR SEQ ID #3229의 형질감염은 miR-19a를 효과적으로 길항시키는데, 이는 1 nM LNA-항miR 농도에서도 완전한 탈억제가 일어난 것에 의해서 입증된다. 이와 대조적으로, 8-mer LNA-항miR SEQ ID #3222에 의한 형질감염은 0.5 nM 농도에서도 효과적인 miR-19a 길항을 초래하였는데, 이는 이 8-mer LNA-항miR가 HeLa 세포에서 15-mer LNA-항miR와 적어도 동등한 효능을 갖는다는 것을 나타내는 것이다.
결론: HeLa 세포에서의 miR-19a 표적화 결과, 완전히 LNA-변형되고 포스포로티올화된 8-mer LNA-항miR가 15-mer LNA/DNA 믹스머 LNA-항miR와 비교할 때 적어도 동등한 효능을 나타냄을 보여준다.
재료 및 방법: 세포주: 인간의 자궁경부암종 세포주 HeLa를 ECACC (#93021013)로부터 구입하였다. HeLa 세포를 10% 소의 태아 혈청, 2 mM 글루타맥스, 1x NEAA 및 25 ug/ml 젠타마이신가 보강된 EMEM 배지에서 배양하였다.
형질감염: 형질감염 전 날에, 96-웰 플레이트의 각각의 웰에 5,200개의 세포를 접종하여, 다음 날 50-70% 컨플루언시가 되도록 하였다. 형질감염 당일에, HeLa 세포들을 제조자 (Invetrogen) 지침 에 따라 0.14 μl 리포펙타민2000 과 함께 57 ng miR-21 완전 맷치/psiCHECK2, miR-21.mm2/psiCHECK2 또는 psiCHECK2 공벡터를 이용하여 형질감염시켰다. 형질감염은 LNA-항miR의 농도를 변화시켜서도 수행하였다. 24시간 후, 루시페라제 측정을 위하여 세포들을 수확하였다.
루시페라제 분석: 세포들을 PBS로 세척하고 30 μl 1 x 수동 용해 완충액 (Promega)을 각각의 웰에 첨가한 다음, 24-웰 플레이트를 오비탈 진탕기 상에서 30분간 처리하였다. 세포들을 수집하고 에펜도르프 튜브에 넣은 다음 10,000 rpm에서 30분간 스핀시킨 후, 제조자 지침(Promega)에 따라 루시페라제 측정을 실시하였다.
실시예 18. 완전히 LNA-치환된 짧은 LNA-항 miR 을 이용한 마이크로RNA 패밀리 의 표적화 .
다음으로, 본 발명자들은 모든 패밀리 멤버에 공통적인 씨드 서열과 상보적인 단일의 짧은 7-mer LNA-항miR를 이용함으로써 마이크로RNA 패밀리를 표적화하는 것이 가능한지를 조사하였다 (도 17 참조). 이 실험에서, 본 발명자들은 결장, ㅊ췌장, 전립선 및 위장의 고체 종양에서 과발현되는 R-221 및 miR-222에 촛점을 맞추었다. miR-221 및 miR-222는 다형성 교모세포증에서 가장 현저하게 상향조절되는 마이크로RNA들이라는 것이 이미 알려져 있다. 뿐만 아니라, miR-221과 miR-222의 과발현은 적어도 부분적으로 종양 억제 단백질 p27을 차단함으로써, 전립선 암종의 성장 및 진행에 기여하는 듯 하다. miR-221 및 miR-222 두가지 모두에 대한 각각의 완전한 맷치 표적 부위를 루시페라제 유전자의 3'UTR 내로 클로닝시켜 2개의 리포터 구축물을 만들었다. 이어서, 이 구축물들을 각각 별도로 또는 조합하여, 전립선 암종 세포주인 PC3 내로 형질감염시켰다. miR-221 및 miR-222의 두가지 모두를 표적화하는 7-mer에 더하여, 본 발명자들은 miR-221 (SEQ ID #3223) 또는 miR-222 (SEQ ID #3224)를 표적화하는 15-mer LNA-항miR (15mer) 역시도 공형질전환시켰는데, 이들 각각은 단독으로 또는 함께 형질전환된다 (도 18 좌측 참고).
결과: 도 18로부터 알 수 있는 바와 같이, PC3 세포를 miR-221에 대한 LNA-항miR SEQ ID #3223으로 형질감염시키자 1 nM LNA-항miR 농도에서도 miR-221이 효과적으로 억제되었다. 또한, miR-222에 대한 루시페라제 리포터 플라스미드를 사용한 경우 뿐만 아니라, miR-221 및miR-222에 대한 루시페라제 리포터 두가지 모두를 PC3 세포 내로 동시에 공형질감염시킨 경우에도 억제 효과가 관찰되었다. 이러한 억제 효과는 miR-221과 miR-222 간에 공통적인 씨드 서열에 기인하는 것일 가능성이 가장 크다. 마찬가지로, miR-222에 대한 루시페라제 리포터의 완전한 탈억제에 의해 나타나는 바와 같이, PC3 세포를 miR-222에 대한 LNA-항miR SEQ ID #3224로 형질감염시키자 1 nM LNA-항miR 농도에서도 miR-222가 효과적으로 억제되었다. 억제 효과는 miR-222에 대한 루시페라제 리포터 플라스미드를 사용한 경우 뿐만 아니라, miR-221과 miR-222에 대한 루시페라제 리포터 두가지 모두를 PC3 세포 내로 동시에 공형질감염시킨 경우에도 관찰되었다. miR-221과 miR-222 각각에 대한 LNA-항miR 화합물들인 SEQ ID #3223 및 SEQ ID #3224 두가지 모두를 이용한 공형질감염은, 두가지 모두의 miRNA를 효과적으로 억제하는 결과를 초래하였는데, 이는, PC3 세포내로 개별적으로 형질감염되거나 또는 공형질감염되는 두가지 모두의 경우에서 루시페라제 리포터 유전자의 완전한 탈억제가 일어나는 것으로부터 입증되는 바와 같다. 흥미롭게도, PC3 세포내로 개별적으로 형질감염될 때 및 공형질감염될 때의 두가지 모든 경우에서 루시페라제 리포터 플라스미드가 완전히 탈억제되는 것에 의해 나타나는 바와 같이, miR-221과 miR-222의 씨드 서열을 표적화하는 단일의 완전히 LNA-변형된 7-mer LNA-항miR (SEQ ID #3225)을 PC3 세포 내로 형질감염시키자 투여량 의존 방식으로 효과적으로 miR-221과 miR-222를 길항시키는 것으로 나타났다. 이는, 단일의 짧은 LNA-치환된 LNA-항miR가 표적 씨드 서열을 효과적으로 표적화시킬 수 있음으로 해서, 마이크로RNA 패밀리 전체를 동시에 길항시킬 수 있음을 입증하는 것이다. miRBase 마이크로RNA 서열 데이타베이스의 분석 결과, LNA-항miR SEQ ID #3225의 miR-221/222 씨드 인식 서열은 두가지 miRNA 모두에 대하여 특이적인 것으로 나타났다.
결론: 본 발명자들의 상기 결과는 LNA를 이용함으로써 마이크로RNA 씨드 서열을 효과적으로 표적화할 수 있는, 완전히 LNA-치환된 짧은 LNA-항miR 올리고뉴클레오타이드를 디자인 합성할 수 있음으로 해서, 마아ㅣ크로RNA 패밀리 전체를 동시에 길항시키는 것이 가능함을 입증하는 것이다.
재료 및 방법:
세포주: 인간의 전립선 암종 PC3 세포주를 ECACC (#90112714)로부터 구입하였다. PC3 세포를 10% 소의 태아 혈청, 2 mM 글루타맥스 및 25 ug/ml 젠타마이신이 보강된 DMEM 배지에서 배양하였다.
형질감염: 100.000 형질감염 전 날에 12-웰 플레이트의 각 웰 당 100,000개의 세포를 접종하여, 다음 날 50% 컨플루언시가 되도록 하였다. 형질감염 당일에, PC3 세포를 제조자 지침에 따라 (Invitrogen) 1.2 μl 리포펙타민2000와 함께, miR-221 또는 miR-222에 대한 0.3 ug의 루시페라제 리포터 플라스미드 또는 대조군으로서 miRNA 표적 부위가 없는 psiCHECK2 공벡터를 이용하여 형질감염시켰다. 24시간 후, 세포들을 루시페라제 측정을 위해 수확하였다.
실시예 19. 7-mer SEQ ID #3225 LNA-항 miR 에 의한 miR -221/222 패밀리의 길항성을 위한 기능성 판독값으로서의 p27 단백질 수준의 평가.
이전의 연구 결과 (le Sage 외 2007, Galardi 외 2007)로부터, miR-221 및 miR-222가 세포 순환 조절에 관여하는 종양 억제 유전자 p27를 전사후 (post-transcriptionally)적으로 조절하는 것으로 나타났다. 이러한 연구 결과, miR-221 및 miR-222를 하향 조절하면 p27의 발현 수준이 증가하는 것으로 나타났다. 따라서, 7-mer SEQ ID #3225 LNA-항miR에 의한 miR-221/222 패밀리의 길항성에 대한 기능성 판독값으로서, 본 발명자들은 8-mer LNA 미스맷치 대조군과 비교하여, PC3 세포 내로의 LNA-항miR SEQ ID #3225의 형질감염 후 p27의 단백질 수준을 측정하였다. 24시간 후, 웨스턴 블랏 분석을 위해 세포들을 수확하였다 (도 19).
결과: 도 19에 도시된 바와 같이, miR-221 및 miR-222 중 씨드 서열을 표적화하는 7-mer LNA-항miR SEQ ID #3225을 형질감염하면 형질감염되지 않거나 또는 LNA 미스맷치 대조군에 의해 형질감염된 PC3 세포에 비해 p27 단백질 수준이 투여량 의존적으로 증가하는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 7-mer LNA-항miR이 miR-221/222 패밀리를 효과적으로 길항함으로 해서, 직접 표적인 p27을 단백질 수준에서 탈억제함을 명백히 입증해주는 것이다.
결론: miR-221/222 패밀리 중 씨드 서열을 표적으로 하는 완전히 LNA-변형된 7-mer LNA-항miR는 상기한 miRNA 두가지 모두를 효과적으로 길항시켜 직접 표적 p27를 단백질 수준에서 탈억제시켰다.
재료 및 방법:
세포주: 인간의 전립선 암종 PC3 세포주를 ECACC (#90112714)로부터 구입하였다. PC3 세포를 10% 소의 태아 혈청, 2 mM 글루타맥스 및 25 ug/ml 젠타마이신이 보강된 DMEM 배지에서 배양하였다.
형질감염: 형질감염 전 날에 6-웰 플레이트의 각각의 웰에 250,000개의 세포를 접종하여 다음 날 50% 컨플루언시에 도달하게 하였다. 형질감염 당일에, PC3 세포들을 리포펙타민2000과 함께 여러가지 농도의 LNA-항miR들로 형질감염시켰다. 24시간 후 단백질 추출 및 웨스턴 블랏 분석을 위해 세포들을 수확하였다.
웨스턴 블랏 : 세포들을 PBS로 세척하고 트립신화 한 다음, 에펜도르프 튜브에 넣고 250 μl 용해 완충액 (1xRIPA)을 첨가하였다. 세포 용해물을 얼음 위에서 20 분간 유지시킨 다음, 10,000 rpm에서 10분간 스핀시켰다. 제조자 지침에 따라 쿠마씨 플러스를 이용하여 단백질 농도를 측정하고 100 ug을 4-12% BIS-TRIS 젤 ㅅ상에 로딩시켰다. 막을 4℃에서 일차 모노클로날 마우스 항체 p27 (BD Biosciences)과 함께 1:1000의 희석 비율로 인큐베이션시켰다. 면역반응성 밴드를 ECL Plus (Amersham)을 이용하여 시각화시켰다.
실시예 20. LNA-항 miR 의 듀플렉스 융점 ( T m ).
표 5에 나타낸 바와 같이, Tm 값은 완전히 변형된 짧은 LNA-항miR의 길이가 증가함에 따라 같이 증가한다 (표 7의 SEQ ID #3205, SEQ ID #3209-3214에 대한 Tm 값 참조). 대부분의 최적 억제 효과는 miR-21에 대한 8-mer LNA-항miR SEQ ID #3205의 경우 획득된 반면, 6-mer SEQ ID #3209의 극히 낮은 Tm은 miR-21 표적의 길항을 매개시키기에 가장 불충분한 것으로 보인다. 한편, 길이를 10-mer (SEQ ID #3212) 이상 증가시키자 Tm이 크게 증가하는 반면, 루시페라제 miR-21 리포터를 이용하여 측정되는 바와 같이 억제 활성은 크게 감소하였는데, 이는 완전히 변형된 12- 및 14-mer LNA-항miR들이 호모다이머를 형성하려는 강한 성향에 기인하는 것일 가능성이 가장 크다. mir-21 인식 서열에 걸친 완전히 LNA-변형된 8-mer LNA-항miR의 슬라이딩 창을 이용한 실험 결과는 LNA-항miR의 적절한 Tm 값에 더해서, 씨드 영역이 miRNA 기능에 가장 중요하다는 것과, 그에 따라 씨드 영역이 LNA-항miR에 의해 표적화되는데 최적의 영역이라는 것을 명백히 입증해준다.
Figure 112010028980901-pct00014
결론: Tm 값은, 루시페라제 리포터를 이용하여 얻은 실험 결과와 더불어서 along with experimental data obtained with s show that potent antagonism by LNA-항miR에 의한 강력한 길항성은 Tm에 의존할 뿐만 아니라, 마이크로RNA 인식 서열 내에서의 LNA-항miR의 위치 선정에도 의존함을 보여준다.
재료 및 방법:
T m 측정 : 올리고뉴클레오타이드:miR-21 RNA 듀플렉스를 500 μl RNase 유리 H20 중에서 3 μM이 되도록 희석하고 500 μl 2x Tm-완충액 (200 mM NaCl, 0.2 mM EDTA, 20 mM Na-포스페이트, pH 7,0)과 함께 혼합하였다. 이 용액을 95℃에서 3분간 가열한 다음 RT에서 30분간 어닐링시켰다. 이 듀플렉스의 융점 (Tm)을 PE Templab 소프트웨어 (Perkin Elmer)를 이용하여 펠티에 온도 프로그래머 PTP6이 구비된 Lambda 40 UV/VIS 스펙트로포토미터 상에서 측정하였다. 온도를 20℃에서 95℃로 승온시킨 다음 25℃로 내리고, 260 nm에서의 흡수도를 기록하였다. 멜팅 및 어닐링 두가지 모두의 제1 편차 및 국소 최대치를 이용하여 듀플렉스 융점을 평가하였다.
실시예 21. 인간 간세포 세포주 HepG2 에 있어서의 8-mer ( SEQ ID #3205) 대 15-mer ( SEQ ID #3204) LNA-항 miR 비교에 의한 miR -21 길항성의 평가.
본 발명자들은 본 출원에서 완전히 LNA-변형되고 포스포로티올화된 8-mer LNA-항miR이 인간의 자궁경부암종 세포주 HeLa, 인간의 유방암종 세포주 MCF-7 및 인간 전립선암 세포주 PC3에서 miR-21을 효과적으로 길항시킨다는 것을 앞서 설명한 바 있다. 본 발명자들은 이러한 스크리닝 접근법을 인간 간세포 암세포주 HepG2로 연장하였다. miR-21에 대한 8-mer LNA-항miR 올리고뉴클레오타이드의 효능을 평가하기 위하여, 성숙한 miR-21에 대한 완전 맷치 표적 부위가 레닐라 루시페라제 유전자의 3'UTR 내로 클로닝된, 루시페라제 리포터 구축물을 제작하였다. miR-21 억제를 모니터링하기 위해, HepG2 세포들을 miR-21 안타고니스트 SEQ ID #3205 (8-mer)와 함께 루시페라제 구축물로 형질감염시키고, 특이성 비교를 위해 8-mer LNA-항miR 미스맷치 (SEQ ID #3218)와 함께, 그리고 효능 비교를 위해, 15-mer (SEQ ID #3204)와 함께 이들의 농도를 달리하면서 형질감염시켰다. 24시간 후, 루시페라제 활성을 측정하였다.
결과: 루시페라제 리포터 실험 결과, miR-21에 대한 15-mer LNA-항miR (SEQ ID #3204)의 경우 투여량 의존 방식으로 루시페라제 miR-21 리포터 활성이 탈억제되는 것으로 나타났다. 그러나, 최고 농도에서조차 루시페라제 리포터의 완전한 ㅌ탈억제는 관찰되지 않았다 (도 20). 이와 대조적으로, 8-mer 완전히 LNA 변형된LNA-항miR (SEQ ID #3205)는 5 nM에서도 완전한 탈억제를 보였는데, 이는, 15-mer LNA-항miR와 비교할 때 현저한 강도 향상을 가리키는 것이다. 8-mer 완전 맷치를 8-mer 미스맷치와 비교하면, 미스맷치 LNA-항miR (SEQ ID #3218)은 탈억제를 전혀 나타내지 않았는데, 이는 miR-21에 대한 LNA-항miR 화합물의 높은 특이성을 입증하는 것이다.
결론: miR-21을 표적화하는데 있어서, 8-mer (SEQ ID #3205)는 15-mer LNA-항miR보다 더 강력하고, SEQ ID #3205에 의한 miR-21의 길항성은 특이적이다.
재료 및 방법:
세포주: 인간의 간세포 HepG2 세포주를 ECACC (#85011430)로부터 구입하였다. HepG2 세포들을 10% 소의 태아 혈청, 2 mM 글루타맥스 및 25 ug/ml 젠타마이신이 보강된 EMEM 배지에서 배양하였다.
형질감염: 6-웰 플레이트의 각 웰마다 650,000개의 세포들을 접종하고, 역형질감염 (reverse transfection)을 실시하였다. HepG2 세포를 제조자 (Invetrogen) 지침에 따라, 2.55 μl 리포펙타민2000과 함께, 0.6 #g miR-21 또는 psiCHECK2 공벡터로 형질감염시켰다. LNA-항miR의 농도를 달리하면서 형질감염시켰다. 24시간 후, 루시페라제 측정을 위해 세포들을 수확하였다.
루시페라제 분석: 세포들을 PBS로 세척하고 300 μl 1 x 수동 용해 완충액 (Promega)을 웰에 첨가하였다. 플레이트를 진탕기 상에서 30분간 진탕시킨 다음, 세포 용해물을 에펜도르프 튜브에 담았다. 세포 용해물을 2,500 rpm에서 10분간 원심분리시킨 후, 50 μl를 96 웰 플레이트에 넣고 제조자 (Promega) 지침에 따라 루시페라제 측정을 실시하였다.
실시예 22. 인간의 간암세포 세포주 Huh-7에 있어서 8-mer SEQ ID #3205 LNA-항 miR 를 이용함에 따른, Pdcd4 3' UTR 중의 miR -21 표적 부위와 miR -21과의 상호반응 검정.
종양 억제자 단백질 Pdcd4는 종양 성장 및 진행을 억제한다. 나아가, 폐암과 직장결장암에서의 Pdcd4의 하향 조절은 환자의 나쁜 예후와 연관이 있다. 최근, Asangani 등 (Oncogene 2007) 및 Frankel 등 (J Biol Chem 2008)은 Pdcd4 3'UTR이miR-21에 대한 보존된 표적 부위를 함유함으로 해서, 항miR-21로 세포를 형질감염시킬 경우 Pdcd4 단백질이 증가한다는 것을 보여준 바 있다. 본 발명자들은 따라서 전술한 miR-21 표적 부위를 포괄하는 Pdcd4의 3'UTR 영역의 313 nt를 산생하는, 루시페라제 리포터 플라스미드를 구축하고, 이를 여러가지 LNA-항miRs 및 pre-miR-21 (10 nM)와 함께 Huh-7 세포 내로 공형질감염시켰다. 이들 여러가지 LNA-항miR들은: SEQ ID #3205 (8-mer, 퍼펙트 맷치), SEQ ID #3218 (8-mer, 미스맷치) 및 SEQ ID #3204 (15-mer, DNA/LNA 믹스머)였다. 루시페라제 측정은 24시간 후에 실시하였다.
결과: 도 21에 도시된 바와 같이, Pdcd4 3'UTR 루시페라제 리포터 및 SEQ ID #3205로 형질감염된 세포의 경우, 루시페라제 활성이 증가된 것으로 관찰되었는데, 이는 Pdcd4 3'UTR과 miR-21 간의 상호반응을 가리키는 것이다. 그러나, 세포를 미스맷치 화합물인 SEQ ID #3218로 형질감염시킨 경우에는, 루시페라제 활성에 아무런 변화도 관찰되지 않았으며, 이는, 이 화합물이 miR-21을 길항하지 않은 사실로부터도 예견된 것이었다. 8-mer LNA-항miR를 15-mer LNA-항miR (SEQ ID #3204)와 비교하면, 완전히 LNA-변형되고 포스포로티올화된 짧은 LNA-항miR이 훨씬 더 강한 활성을 나타내는 것으로 나타나서, 전술한 데이타를 뒷받침하였다.
재료 및 방법:
세포주: 인간의 간암종 세포주 Huh-7를 R. Bartinschlager (Dept Mol Virology, University of Heidelberg)로부터 기증받았다. 10% 소의 태아 혈청, 2 mM 글루타맥스, 1x NEAA 및 25 ug/ml 젠타마이신이 보강된 DMEM 배지에서 Huh-7 세포를 배양하였다.
형질감염: 형질감염 전 날에 96-웰 플레이트의 각 웰 당 11,000개의 세포를 접종하여 다음 날 50-70% 컨플루언시가 되도록 하였다. 형질감염 당일에, Huh-7 세포를, 제조자 지침에 따라 (Invitrogen) 0.14 μl 리포펙타민2000과 함께 20 ng Pdcd4 3'UTR/psiCHECK2 또는 psiCHECK2 공벡터로 형질감염시켰다. LNA-항miR 올리고뉴클레오타이드를 변화시키면서도 형질감염시켰다. 24시간 후, 루시페라제 측정을 위해 세포들을 수확하였다.
루시페라제 분석: 세포들을 세척하고 30 μl 1 x 수동 용해 완충액 (Promega)을 각각의 웰에 첨가한 후, 96-웰 플레이트를 오비탈 진탕기에서 진탕시켰다. 30분 후, 루시페라제 분석용 완충액 II (Dual-루시페라제 리포터 분석 시스템, Promega, Cat# E1910)에 용해시킨 50 μl 루시페라제 기질을, 용해된 세포들과 함께 ㅇ우웨웰at에 첨가하고 제조자 지침에 따라 (Promega) 루시페라제 측정을 수행하였다.
실시예 23. 8-mer LNA-항 miR ( SEQ ID #3205)에 의한 miR -21 길항성의 기능적 판독값으로서의 Pdcd4 단백질 수준의 평가.
또한, 본 발명자들은 HeLa 세포를 SEQ ID #3205 (퍼펙트 맷치), SEQ ID #3218 (미스맷치), SEQ ID #3219 (스크램블형)으로 형질감염시키고, 24 시간 후, 웨스턴 블랏을 이용하여 Pdcd4 단백질 수준을 분석하였다 (도 22). 도시된 바와 같이, SEQ ID #3205가 첨가된 세포로부터의 단백질 추출물에서는 두개의 대조군 LNA 올리고뉴클레오타이드와는 대조적으로 SEQ ID #3205에 의한 mir-21의 길항성으로 인하여, Pdcd4 단백질 수준이 증가한다.
결론: 8-mer (SEQ ID #3205)를 이용한 miR-21의 길항성은 miR-21의 직접 표적 Pdcd4 길항성의 탈억제를 초래한다.
재료 및 방법:
세포주: 인간의 자궁경부암종 세포주 HeLa를 ECACC (#93021013)로부터 구입하였다. HeLa 세포를 10% 소의 태아 혈청, 2 mM 글루타맥스, 1x NEAA 및 25 ug/ml 젠타마이신이 보강된 EMEM 배지에서 배양하였다.
형질감염: 형질감염 전 날에 6-웰 플레이트의 각 웰에 200,000개의 세포들을 접종하여 그 다음 날 50-70% 컨플루언시가 되도록 하였다. 형질감염 당일, HeLa 세포들을 제조자 지침에 따라, 5 nM LNA 올리고뉴클레오타이드과 2.5 ㎍/ml 리포펙타민 2000 (Invitrogen)으로 형질감염시켰다. 24시간 후, 세포들을 웨스턴 블랏 분석법을 실시하기 위해 수확하였다.
웨스턴 블랏 : 세포들을 PBS로 세척하고, 트립신화시킨 다음, 에펜도르프 튜브에 넣고 50 ml 용해 완충액 (1xRIPA)을 첨가하였다. 세포 용해물을 얼음 위에 20분간 정치시킨 다음, 10,000에서 10분가 원심분리시켰다. 동량 (15 ml 세포 용해물)을 4-12% BIS-TRIS 겔 상에 로딩시켰다. 제조자 지침에 따라, iBlot (Invitrogen)을 이용하여 단백질을 니트로셀룰로스막에 이동시켰다. 상기 막을 4℃에서 일차 친화 정제된 토끼의 혈청 항체 Pdcd4 (Rockland)와 함께 1:2000 농도로 밤새 인큐베이션시켰다. 대조군으로서, 항베타 튜불린 항체 (Thermo Scientific)를 1:5000배로 희석한 것을 사용하였다. 면역반응성 밴드를 ECL Plus (Amersham)를 이용하여 시각화시켰다.
실시예 24. 8-mer 퍼펙트 맷치 LNA-항 miR SEQ ID #3205 및 LNA 미스맷치 대조군 SEQ ID #3218의 잠재적인 간독성 평가.
각각의 화합물을 2주일 동안 하루 걸러, 25 mg/kg, 5 mg/kg 및 1 mg/kg의 투여량으로 암컷 NMRI 마우스에게 주사하였다. ALT 및 AST 분석을 위해 이 동물들을 희생시켜서 전혈로부터 혈청을 수집하였다. 도 23에 도시된 바와 같이, ALT 및 AST 수준은 염수나 또는 SEQ ID #3218 (미스맷치 대조군)과 비교할 때, SEQ ID #3205의 경우 상승하지 않았다. 그러나, 마우스들중 한마리에서는 그 수준이 증가되었는데, 이는, 혈장에 비해 ALT와 AST를 6-8배 더 고농도로 함유하는 적혈구 세포에 의해 그 혈청 샘플이 오염되었기 때문이었다. 5 mg/kg 및 1 mg/kg의 양을 투여받음 마우스들에 대해서도 ALT 및 AST 수준을 분석하였는데, 염수처리 대조군 동물과 비교할 때 아무런 변화도 나타내지 않았다 (데이타 제시하지 않음).
재료 및 방법:
실험 디자인:
Figure 112010028980901-pct00015
희생: 동물은 경부 탈구에 의해 희생시켰다.
ALT/ AST 용 혈청 채취; 동물들을 70% CO2-30% O2로 마취시킨 다음 눈뒤굴 혈액 (retro orbital sinus blood)을 채취하였다. 혈액을 S-모노벳 혈청-젤- 바이알 내로 수집하였다. 혈청 샘플을 수확하고 각각의 개별적인 마우스로부터 저장하였다. 혈액 샘플을 실온에서 2시간 보관한 후 실온에서 10분간, 3,000 rpm에서 원심분리시켰다. 혈청 분획을 젖은 얼음 상에서 에펜도르프 튜브 내로 수확하였다.
ALT 및 AST 측정; 제조자 지침에 따라, ABX Pentra (A11A01627-ALT, A11A01629-AST)사의 ALT 및 AST 시약을 이용하여 96-웰 플레이트에서 ALT 및 AST 측정을 실시하였다. 요약하면, 혈청 샘플을 H2O를 이용하여 2.5배로 희석하고 각각의 샘플을 두번씩 분석하였다. 각각의 웰에 50 μl의 희석 샘플 또는 표준품 (ABX Pentra사의 멀티칼 - A11A01652)을 첨가한 후, 37℃에서 200 μl의 AST 또는 ALT 시약 혼합물을 각각의 웰에 첨가하였다. 37℃, 340 nm에서 30초 간격으로 동력학을 5분간 측정하였다.
실시예 25. 짧은 LNA-항 miR ( SEQ ID #3207)에 의한 miR -155 길항성에 대한 기능 판독값으로서의 PU.1 단백질 수준의 평가.
본 발명자들은 miR-155를 길항하는 8-mer (SEQ ID #3207)가 마우스의 대식세포 RAW 세포에서 miR-155 표적 c/EBP베타를 탈억제한다는 것을 설명한 바 있다. SEQ ID #3207의 효능을 추가로 입증하기 위해, 본 발명자들은 또 다른 miR-155 표적인 PU.1의 단백질 수준을 측정하였다. 짧은 LNA-항miR (SEQ ID #3207)에 의한 miR-155 길항성의 기능적 판독을 위해, 본 발명자들은 웨스턴 블랏을 실시하였다. pre-miR-155의 존재 또는 부재 하에, 8-mer (SEQ ID #3207) 완전 맷치 또는 8-mer ㄷ대조군 LNA 중 어느 하나로 형질감염된 인간의 단핵구 THP-1 세포주에서 길항성을 확인하였다. LPS를 이용하여 miR-155 축적을 유도하고 세포들을 24시간 후에 수확하였다.
결과: pre-miR-155로 형질감염된 THP-1 세포들은 PU.1 수준이 감소된 것으로 나타났다 (도 24). 완전히 LNA-변형되고 포스포로티올화된 SEQ ID #3207에 의해 세포를 형질감염시킬 경우 miR-155를 효과적으로 길항시킴으로 해서, PU.1 단백질 수준이 ㅂ벼변하지 않는 것으로 나타났다. 비교를 위해, 세포들을 8-mer LNA 대조구으로 형질감염시키자, PU.1 수준이 감소하였는데, 이는, SEQ ID #3207 LNA-항miR에 의한 miR-155의 길항성이 특이적임을 가리키는 것이다.
결론: Antagonism 8-mer를 이용한 miR-155의 길항성은 인간 THP-1 세포에 있어서, 직접 표적 PU.1의 탈억제를 결과시킨다.
재료 및 방법:
세포주: 인간의 단핵구 THP-1 세포주를 ECACC (#88081201)로부터 구입하였다. THP-1 세포들을 L-글루타민, 10% 소의 태아 혈청이 보강된 RPMI에서 배양하였다.
형질감염: 형질감염 전 날, 12-웰 플레이트의 각 웰에 200,000개의 세포를 접종하였다. 형질감염 당일, 제조자 지침에 따라 리포펙타민2000 (Invitrogen)과 함께, THP-1 세포들을 5 nmol pre-miR-155 (Ambion) 및/또는 5 nM LNA-항miR을 이용하여 형질감염시켰다. 형질감염 복합체와 함께 4 시간 인큐베이션시킨 후,LPS (100 ng/ml)를 세포에 첨가하였다. 24시간 후, 단백질 추출 및 웨스턴 블랏 분석을 위하여 세포들을 수확하였다.
웨스턴 블랏 : 세포를 PBS로 세척하고, 트립신화시킨 다음 에펜도르프 튜브에 넣고 50 μl 용해 완충액 (1xRIPA)을 첨가하였다. 세포 용해물을 얼음 상에서 20분간 유지시키고 10,000 rpm에서 10분간 스핀시켰다. 동량 (15 ml 세포 용해물)을 4-12% BIS-TRIS 겔 상에 로딩시켰다. 단백질을 제조자 지침에 따라 iBlot (Invitrogen)을 이용하여 니트로셀룰로스 막에 옮겼다. 이 막을 4℃에서 토끼의 모노클로날 PU.1 항체 (Cell Signaling)와 함께 1:2000 농도로 인큐베이션시켰다. 동량의 튜불린 (Thermo Scientific)을 1:5000 희석액으로서 로딩시켰다. 면역반응성 밴드를 ECL Plus (Amersham)를 이용하여 시각화시켰다.
실시예 26. 7-mer SEQ ID #3225 LNA-항 miR 에 의한 miR -221/222 패밀리의 길항성에 대한 기능적 판독값으로서의 p27 단백질 수준의 평가
이전의 연구 결과 (le Sage 외 2007, Galardi 외 2007)로부터, miR-221 및 miR-222가 세포 순환 조절에 관여하는 종양 억제 유전자 p27를 전사후 (post-transcriptionally)적으로 조절하는 것으로 나타났다. 이러한 연구 결과, miR-221 및 miR-222를 하향 조절하면 p27의 발현 수준이 증가하는 것으로 나타났다. 따라서, 7-mer SEQ ID #3225 LNA-항miR에 의한 miR-221/222 패밀리의 길항성에 대한 기능성 판독값으로서, 본 발명자들은 PC3 세포 내로의 LNA-항miR SEQ ID #3225의 형질감염 후 p27의 단백질 수준을 측정하였다.
결과: 도 25에 도시된 바와 같이, miR-221 및 miR-222의 씨드 서열을 표적화하는 7-mer LNA-항miR SEQ ID #3225을 형질감염하면, 형질감염되지 않거나 또는 ㅂ본 발명자들의 LNA 스크램블형 대조군에 의해 형질감염된 PC3 세포에 비해 p27 단백질 수준이 투여량 의존적으로 증가하는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 7-mer LNA-항miR이 miR-221/222 패밀리를 효과적으로 길항함으로 해서, 5 nM의 적은 농도에서도, 직접 표적인 p27을 단백질 수준에서 탈억제함을 명백히 입증해주는 것이다.
결론: miR-221/222 패밀리 중 씨드 서열을 표적으로 하는 완전히 LNA-변형된 7-mer LNA-항miR는 5 nM에서도, 두가지 모두의 miRNA를 효과적으로 길항시켜 직접 표적 p27를 단백질 수준에서 탈억제시켰다.
재료 및 방법:
세포주: 인간의 전립선 암종 PC3 세포주를 ECACC (#90112714)로부터 구입하였다. PC3 세포를 10% 소의 태아 혈청, 2 mM 글루타맥스 및 25 ug/ml 젠타마이신이 보강된 DMEM 배지에서 배양하였다.
형질감염: 형질감염 전 날에 6-웰 플레이트의 각각의 웰에 250,000개의 세포를 접종하여 다음 날 50% 컨플루언시에 도달하게 하였다. 형질감염 당일에, PC3 세포들을 리포펙타민2000과 함께 여러가지 농도의 LNA-올리고뉴클레오타이드들로 형질감염시켰다. 24시간 후 단백질 추출 및 웨스턴 블랏 분석을 위해 세포들을 수확하였다.
웨스턴 블랏 : 세포들을 PBS로 세척하고 트립신화 한 다음, 에펜도르프 튜브에 넣고 50 μl 용해 완충액 (1xRIPA)을 첨가하였다. 세포 용해물을 얼음 위에서 20 분간 유지시킨 다음, 10,000 rpm에서 10분간 스핀시켰다. 동량 (15 μl 세포 용해물)을 4-12% BIS-TRIS 젤 상에 로딩시켰다. 제조자 지침에 따라 iBlot (Invitrogen)을 이용하여 니트로셀룰로스 막에 단백질을 옮겼다. 막을 4℃에서 일차 모노클로날 마우스 항체 p27 (BD Biosciences)과 함께 1:1000의 희석 비율로 인큐베이션시켰다. 로딩 대조군으로서, 튜불린 (Thermo Scientific)을 1:50000 희석 배수로 이용하였다. 면역반응성 밴드를 ECL Plus (Amersham)을 이용하여 시각화시켰다.
실시예 27. 7-mer SEQ ID #3225 LNA-항 miR 에 의한 miR -221/222의 녹-다운은 PC3 세포의 콜로니 형성을 감소시킨다.
종양 세포가 반고체 배지에서 비부착증식 방식으로 증식하면 세포의 형질전환이 잘 일어났다는 증거이다. 본 발명자들은 따라서 암에 적합한 표현형 분석인 연질 한천 분석을 실시하였다 (이 방법이 종양 세포 감소를 측정함을 전제로 함). 본 발명자들은 SEQ ID #3225 (완전 맷치) 및 SEQ ID #3231 (스크램블형)을 PC3 세포 내로 형질감염시키고 24시간 후 세포를 연질 한천 상에 도말하였다. 12일 후 콜로니 수를 세었다. 본 발명자들은 도 26에서 SEQ ID #3225에 의한 miR-221 및 miR-222의 억제가 대조군 LNA-항miR에 비해 연질 한천에서 증식하는 콜로니 갯수를 감소시킬 수 있음을 입증하였는데, 이는, 종양 세포가 감소하였음을 가리키는 것이다..
결론: miR-221/222 패밀리를 표적으로 하는 7-mer (SEQ ID #3225)는 연질 한천 상에서 콜로니 수를 감소시키는데, 이는 PC3 세포의 증식 억제를 가리키는 것이다.
재료 및 방법:
세포주: 인간 전립선암종 PC3 세포주를 ECACC (#90112714)로부터 구입하였다. PC3 세포를 10% 소의 태아 혈청, 2 mM 글루타맥스 및 25 ug/ml 젠타마이신이 보강된 DMEM 배지에서 배양하였다.
형질감염: 형질감염 전 날에 6-웰 플레이트의 각각의 웰에 250,000개의 세포를 접종하여 다음 날 50% 컨플루언시에 도달하게 하였다. 형질감염 당일에, PC3 세포들을 리포펙타민2000과 함께 25 nM의 상이한 LNA-올리고뉴클레오타이드들로 형질감염시켰다.
연질 한천 상에서의 클론 성장: 0.5% 한천을 함유하는 기저층 상부의 0.35% 한천에 2.5x103개의 PC3 세포를 접종하였다. 형질감염 24시간 후에 세포를 도말하였다. 플레이트를 가습 인큐베이터 중 37℃, 5% CO2에서 12일간 인큐베이션시킨 다음 0.005% 크리스탈 바이올렛으로 1시간 염색시킨 후, 세포를 계수하였다. 분석은 3번 실시하였다.
실시예 28: let-7a 전구체 miRNA 으로 형질감염된 Huh-7 세포에 있어서의 6-9-mer LNA-항 miRs 에 의한 let-7 길항성 평가 및 루시페라제 센서 분석.
완전히 LNA-변형된 6-9-mer 올리고뉴클레오타이드가 miRNA의 let-7 패밀리를 표적화 및 길항시키는 능력을 평가하기 위하여, HMGA2 3'UTR의 800 bp를 함유하는 루시페라제 센서 구축물을 제작하였다. 벡터 내로 클로닝된 서열은 Mayr 등과 (Science, 2007) Lee 및 Dutta (Genes Dev, 2007)에 의해 이미 입증된 바와 같이, 7개의 기능성 let-7 결합 부위 (부위 2-5) 중 4개를 함유한다. let-7 억제를 모니터링하기 위해, 간세포 암종 세포주 Huh-7 (내인성 let-7이 거의 또는 전혀 존재하지 않음)를 루시페라제 센서 구축물, let-7a 전구체 miRNA, 및 6-9 mer let-7 안타고니스트 SEQ ID #3232, -3233, -3227, -3234, -3235; 도 27 참조)로 농도를 증가시키면서 형질감염시켰다. 6-9-mer LNA-항miR는 SEQ ID #3226와 대조하고, 15-mer는 양성 대조군으로서 let-7a와 비교하였다. 24시간 후, 루시페라제 활성을 측정하였다.
결과: 도 28에 도시된 바와 같이, 완전히 LNA-변형된 8- 및 9-mer LNA-항miRs (SEQ ID #3227, SEQ ID #3234, 및 SEQ ID #3235)는 루시페라제 센서 분석에서 let-7 표적을 탈억제시키는데 있어서, 양성 대조군인 15-mer SEQ ID #3226과 유사한 효능을 나타내었다. 이들 고강도 화합물의 완전한 표적 탈억제는 1-5 nM의 저농도에서 달성된 반면, 7-mer SEQ ID #3233은 동일한 효과를 달성하기 위해서는 좀 더 높은 농도 (10 nM)를 필요로 하였다. 그러나, 6-mer SEQ ID #3232는 50 nM라는 고농도에서도 효과를 보이지 않았다. 7-9- 및 15-mer LNA-항miR에 의한 루시페라제 활성의 탈억제는 투여량 의존적이며, 이는, 특히 강도가 좀 낮은 SEQ ID #3233에서 더욱 자명하다.
결론: 결론적으로, 8-9-mer LNA-항miRs (SEQ ID #3227, SEQ ID #3234, 및 SEQ ID #3235)은 let-7a를 표적화하는 15-mer LNA-항miR SEQ ID #3226와 비교할 때, 시험관 내에서 let-7a를 억제하는데 있어서 동등한 길항 효능을 나타낸다. 7-mer SEQ ID #3233의 경우 약간 높은 농도에서 강력한 효과가 나타난 반면 6-mer는 시험 농도에서 전혀 효과를 나타내지 않는다.
재료 및 방법:
세포주: 간세포암종 세포주 Huh-7를 R. Bartinschlager (Dept Mol Virology, University of Heidelberg)로부터 기증받았다. Huh-7 세포를 10% 소의 태아 혈청, 2 mM 글루타맥스, 1x NEAA 및 25 ug/ml 젠타마이신이 보강된 DMEM 배지에서 배양하였다.
형질감염: 형질감염 전 날에 96-웰 플레이트의 각각의 웰에 8,000개의 세포를 접종하여 다음 날 60-80%의 컨플루언시가 되도록 하였다. 형질감염 당일에, 각각의 웰에 들어 있는 Huh-7 세포들을 제조자 지침에 따라 0.17 μl 리포펙타민2000 (Invitrogen)과 함께, 20 ng HMGA2 3'UTR/psiCHECK2 플라스미드, let-7a 전구체 miRNA (Dharmacon; 10 nM 최종 농도), LNA-항miRs SEQ ID #3232, -3233, -3227, -3234, -3235, -3226; 0-50 nM 최종 농도)로 형질감염시켰다. 24 시간 후, 루시페라제 측정을 위해 세포들을 수확하였다.
루시페라제 분석: 증식용 배지를 폐기하고 30 μl 1x 수동 용해 완충액 (Promega)을 각 웰에 첨가하였다. 오비탈 진탕기 상에서 15-30분간 인큐베이션시킨 후, 제조자 지침에 따라 (Promega) 레닐라 및 파이어플라이 루시페라제를 측정하였다.
실시예 29: 형질감염된 Huh-7 세포에 있어서 8-, 및 15-mer LNA-항 miR 에 의한 전체 let-7 패밀리 길항성의 루시페라제 센서 분석을 이용한 평가
miRNA의 전체 let-7 패밀리를 길항하는데 있어서의 완전히 LNA-변형된 8-mer 올리고뉴클레오타이드의 효능을 평가하기 위하여, 전술한 실시예에서 설명된 것과 동일한 루시페라제 센서 구축물을 사용하였다. 이 실시예에서도, Huh-7 세포 (내인성 let-7을 거의 또는 전혀 갖지 않음)를 센서 구축물, 패밀리를 대표하는 let-7a, let-7d, let-7e, 또는 let-7i 전구체들 중 하나, 및 안타고니스트 SEQ ID #3227를 사용하여 이들의 농도를 증가시키면서 형질감염시켰다. 양성 및 강력 대조군으로서 8-mer LNA-항miR은 SEQ ID #3226와 비교하고, 15-mer는 let-7a와 비교하였다. 24시간 후, 루시페라제 활성을 측정하였다.
결과: 도 29에 도시된 바와 같이, 완전히 LNA-변형된 8-mer LNA-항miRs (SEQ ID #3227)은 루시페라제 센서 분석에 있어서 다양한 let-7 표적을 탈억제시키는데 있어서 양성 대조군인 15-mer SEQ ID #3226와 유사한 강도를 나타내었다. SEQ ID #3227의 8개의 뉴클레오타이드 중 7개만이 표적에 하이브리다이즈한 let-7e premiR (도 29C)의 경우를 제외하고, 8-mer의 경우 0.5-1 nM의 저농도에서 거의 완전한 표적의 탈억제가 달성된다. 그러나, 이 경우 말단 미스맷치에도 불구하고, SEQ ID #3227은 5 nM에서도 완전한 표적 탈억제를 나타낸다. 양성 대조군 15-mer는 모든 전구체를 강력하게 길항시키며 0.5 nM에서도 표적을 완전히 탈억제시킨다. 4개의 패널 모두로부터 알 수 있는 바와 같이 (도 29A-D), 8- 및 15-mer LNA-항miR의 두가지 모두에 의한 루시페라제 활성의 탈억제는 명백히 투여량 의존적이다.
결론: 결론적으로, 8-mer LNA-항miR (SEQ ID #3227)은 시험관내에서 4개의 대표적인 let-7 패밀리 멤버에 대한 강한 안타고니스트이며, 따라서, 패밀리 전체에 대하여도 길항 작용을 나타낼 것으로 여겨진다. 15-mer 양성 대조군 안타고니스트 SEQ ID #3226와 비교할 때, 8-mer인 SEQ ID #3226은 4개의 표적 중 3개에 대해서는 동등한 강도를 나타내나 4번째 표적인 let-7e에 대하여는 강도가 덜한데, 이는 말단 미스맷치에 의해 설명된다.
재료 및 방법:
세포주: 간암종 세포주 Huh-7를 R. Bartinschlager (Dept Mol Virology, University of Heidelberg)로부터 기증받았다. Huh-7 세포를 10% 소의 태아 혈청, 2 mM 글루타맥스, 1x NEAA 및 25 ug/ml 젠타마이신이 보강된 DMEM 배지에서 배양하였다.
형질감염: 형질감염 전 날에 96-웰 플레이트의 각각의 웰에 8,000개의 세포를 접종하여 다음 날 60-80%의 컨플루언시가 되도록 하였다. 형질감염 당일에, 각각의 웰에 들어 있는 Huh-7 세포들을 제조자 지침에 따라 0.17 μl 리포펙타민2000 (Invitrogen)과 함께, 20 ng HMGA2 3'UTR/psiCHECK2 플라스미드, let-7a, -7d, -7e, 또는 -7i 전구체 miRNA (Dharmacon; 10 nM 최종 농도) 및 LNA-항miRs SEQ ID #3227 및 SEQ ID#3226 (0-50 nM 최종 농도)로 형질감염시켰다. 24 시간 후, 루시페라제 측정을 위해 세포들을 수확하였다.
루시페라제 분석: 증식용 배지를 폐기하고 30 μl 1x 수동 용해 완충액 (Promega)을 각 웰에 첨가하였다. 오비탈 진탕기 상에서 15-30분간 인큐베이션시킨 후, 제조자 지침에 따라 (Promega) 레닐라 및 파이어플라이 루시페라제를 측정하였다.
실시예 30. 형질감염된 HeLa 세포에 있어서, SEQ ID #3227, 8-mer LNA-항miRs에 의한 내인성 let-7 길항성의 루시페라제 센서 분석에 의한 평가.
let-7을 표적화 및 길항시키는데 있어서, 완전히 LNA-변형된 8-mer 올리고뉴클레오타이드의 효능을 평가하기 위하여, 전술한 두개의 실시예에 설명된 바와 가은 동일한 루시페라제 센서 구축물을 자궁경부암 세포주 HeLa (Q-PCR에 의하여 측정시, let-7을 중간 내지 높은 수준으로 발현시킴: 데이타 표시하지 않음) 내로 SEQ ID #3227로 형질전환시켰다.
결과: 도 30에 도시된 바와 같이, 완전히 LNA-변형된 8-mer LNA-항miR SEQ ID #3227은 내인성 let-7을 완전히 길항시키고, 5-10 nM의 농도에서도 완전한 표적 탈억제를 나타낸다. 루시페라제 활성의 탈억제는 약 1 nM에서 시작되어 약 10 nM에 일정수준 (plateau)에 도달하는 방식으로 투여량 의존적이었다.
결론: 결론적으로, 8-mer LNA-항miR (SEQ ID #3227)은 시험관내에서 내인성 let-7에 대하여도 강력한 안타고니스트이므로, 이는 전체 miRNA 패밀리가 짧고 완전히LNA-변형된 안타고니스트에 의해 성공적으로 표적화될 수 있음을 나타내는 명백한 증거이다.
재료 및 방법:
세포주: 자궁경부암 세포주 HeLa를 ATCC (#CCL-2TM)으로부터 구입하였다. HeLa 세포들을 10% 소의 태아 혈청, 2 mM 글루타맥스, 1x NEAA 및 25 ug/ml 젠타마이신이 보강된 Eagle MEM 배지에서 배양하였다.
형질감염: 형질감염 전 날에 96-웰 플레이트의 각각의 웰에 8,000개의 세포를 접종하여 다음 날 60-80%의 컨플루언시가 되도록 하였다. 형질감염 당일에, 각각의 웰에 들어 있는 HeLa 세포들을 제조자 지침에 따라 0.17 μl 리포펙타민2000 (Invitrogen)과 함께, 20 ng HMGA2 3'UTR/psiCHECK2 플라스미드, 또는 psiCHECK-2 (공벡터) 및 LNA-항miRs SEQ ID #3227 (0-50 nM 최종 농도)로 형질감염시켰다. 24 시간 후, 루시페라제 측정을 위해 세포들을 수확하였다.
루시페라제 분석: 증식용 배지를 폐기하고 30 μl 1x 수동 용해 완충액 (Promega)을 각 웰에 첨가하였다. 오비탈 진탕기 상에서 15-30분간 인큐베이션시킨 후, 제조자 지침에 따라 (Promega) 레닐라 및 파이어플라이 루시페라제를 측정하였다.
실시예 31. 인간 결장암종 세포주 HCT116 에 있어서, 8-mer LNA-항 miR -21 (#3205) 대 8-mer (#3219) 스크램블형 대조군 LNA에 의한 miR -21 길항성의 평가.
본 발명자들은 본 출원 발명의 앞부분에서, 완전히 LNA-변형되고 포스포로티올화된 8-mer LNA-항miR가, 인간 자궁경부암종 세포주 HeLa, 인간 유방암종 세포주 MCF-7, 인간 전립선암 세포주 PC3 및 인간 간세포암종 HepG2 세포주에서 miR-21을 효과적으로 길항시킨다는 것을 입증한 바 있다. 본 발명자들은 이 스크리닝 접근법을 인간 결장암종 세포주 HCT116으로 연장하였다. miR-21에 대한 8-mer LNA-항miR 올리고뉴클레오타이드의 효능을 평가하기 위하여, 성숙한 miR-21에 대한 완전 맷치 표적 부위가 레닐라 루시페라제 유전자의 3'UTR 내로 클로닝된 루시페라제 리포터 구축물을 제작하였다. miR-21 억제를 모니터링하기 위해, HCT116 세포를 miR-21 안타고니스트 #3205 (8-mer)와 함께 루시페라제 구축물로 형질감염시키고, 특이성 비교를 위해, 8-mer LNA 스크램블형 대조군 (#3219)으로 형질감염시켰다. 24 시간 후, 루시페라제 활성을 측정하였다.
결과: 루시페라제 리포터 실험 결과 miR-21에 대한 8-mer LNA-항miR (#3205)의 경우 루시페라제 miR-21 리포터 활성이 투여량 의존 방식으로 탈억제된 것으로 나타났고, 5 nM에서 완전히 탈억제가 일어난 것으로 관찰되었다 (도 31). 8-mer 완전 맷치와 8-mer 스크램블형 대조군의 특이성을 비교하자, 스크램블형 대조군 LNA-항miR (#3219)은 탈억제 활성을 전혀 나타내지 않았는데, 이는 miR-21에 대한 LNA-항miR 화합물의 높은 특이성을 입증하는 것이다.
결론: 8-mer (#3205)는 miR-21를 표적화하는데 있어서 효능이 높고, #3205에 의한 miR-21의 길항성은 특이적이다.
재료 및 방법:
세포주: 인간 결장암종 HCT116 세포주를 ATCC (CCL-247)로부터 구입하였다. HCT116 세포를 10% 소의 태아 혈청, 및 25 ug/ml 젠타마이신이 보강된 RPMI 배지에서 배양하였다.
형질감염: 12-웰 플레이트의 각 웰에 110,000개의 세포를 접종하고 형질감염을 실시하였다. HCT116 세포를 제조자 지침에 따라 1.2 μl 리포펙타민2000 (Invitrogen)과 함께 0.3 mg miR-21 루시페라제 센서 플라스미드 또는 psiCHECK2 공벡터로 형질감염시켰다. LNA-항miR 및 대조군 올리고뉴클레오타이드의 농도를 변화시키면서 형질감염시켰다. 24시간 후, 루시페라제 측정을 위해 세포를 수확하였다.
루시페라제 분석: 세포들을 PBS로 세척하고 250 μl 1 x 수동 용해 완충액 (Promega)을 웰에 첨가하였다. 플레이트를 30분간 진탕기 상에서 처리한 다음, 세포 용해물을 에펜도르프 튜브에 넣었다. 세포 용해물을 2,500 rpm에서 10분간 원심분리시킨 다음, 50 μl를 96 웰 플레이트에 넣고 제조자 (Promega) 지침에 따라 루시페라제 측정을 실시하였다.
실시예 32. 8-mer #3205 LNA-항 miR 에 의한 miR -21의 녹-다운은 PC3 세포들의 콜로니 형성을 감소시킨다.
종양 세포가 반고체 배지에서 비부착증식 방식으로 증식하면 세포의 형질전환이 잘 일어났다는 증거이다. 본 발명자들은 따라서 암에 적합한 표현형 분석인 연질 한천 분석을 실시하였다 (이 방법이 종양 세포 감소를 측정함을 전제로 함). 본 발명자들은 SEQ ID #3205 (완전 맷치) 및 SEQ ID #3219 (스크램블형)을 PC3 세포 내로 형질감염시키고 24시간 후 세포를 연질 한천 상에 도말하였다. 12일 후 콜로니 수를 세었다. 본 발명자들은 도 32에서 SEQ ID #3205에 의한 miR-21의 억제가 처리된 스크램블형 대조군 LNA-항miR 또는 미처리 대조군 (형질감염되되, LNA에 의하지 않음)에 비해 연질 한천에서 증식하는 콜로니 갯수를 감소시킬 수 있음을 입증하였는데, 이는, 종양 세포가 감소하였음을 가리키는 것이다.
결론: miR-21 패밀리를 표적으로 하는 8-mer (SEQ ID #3205)는 연질 한천 상에서 콜로니 수를 감소시키는데, 이는 PC3 세포의 증식 억제를 가리키는 것이다.
재료 및 방법:
세포주: 인간 전립선암종 PC3 세포주를 ECACC (#90112714)로부터 구입하였다. PC3 세포를 10% 소의 태아 혈청, 2 mM 글루타맥스 및 25 ug/ml 젠타마이신이 보강된 DMEM 배지에서 배양하였다.
형질감염: 형질감염 전 날에 6-웰 플레이트의 각각의 웰에 250,000개의 세포를 접종하여 다음 날 50% 컨플루언시에 도달하게 하였다. 형질감염 당일에, PC3 세포들을 리포펙타민2000과 함께 25 nM의 상이한 LNA-올리고뉴클레오타이드들로 형질감염시켰다.
연질 한천 상에서의 클론 성장: 0.5% 한천을 함유하는 기저층 상부의 0.35% 한천에 2.5x103개의 PC3 세포를 접종하였다. 형질감염 24시간 후에 세포를 도말하였다. 플레이트를 가습 인큐베이터 중 37℃, 5% CO2에서 12일간 인큐베이션시킨 다음 0.005% 크리스탈 바이올렛으로 1시간 염색시킨 후, 세포를 계수하였다. 분석은 3번 실시하였다.
실시예 33. 8-mer #3205 LNA-항 miR 에 의한 miR -21의 사일런신은 HepG2 세포의 콜로니 형성을 감소시킨다. miR-21은 인간 간암종 세포주 HepG2에서 과발현되는데 본 발명자들은 이들 세포에서 #3205로 miR-21 센서 플라스미드의 루시페라제 활성을 조절할 수 있음을 앞서 입증한 바 있다. HepG2 세포를 #3205 및 #3219 (스크램블형 8-mer)로 형질감염시킨 다음 24시간 후에 연질 한천 상에 도말하였다. 17일 후 현미경으로 콜로니 수를 세었다.
결과: 본 발명자들은 도 33에서 #3205에 의한 miR-21의 억제에 의해 연질 한천 상에서 콜로니 수를 감소시킬 수 있음을 입증하였는데, 이는 증식이 억제되었음을 가리키는 것이다. 또한, 본 발명의 스크램블형 8-mer 대조군인 #3219는 콜로니 수에 유의적인 효과를 미치지 못하였다.
결론: miR-21을 표적화하는 8-mer (#3205)는 연질 한천 상에서 miR-21을 표적화하는데, 이는 HepG2 세포의 증식이 억제된 것임을 가리킨다.
재료 및 방법:
세포주: 인간 간암종 HepG2 세포주를 ECACC (#85011430)로부터 구입하였다. HepG2 세포를 10% 소의 태아 혈청, 2 mM 글루타맥스 및 25 ug/ml 젠타마이신이 보강된 EMEM 배지에서 배양하였다.
형질감염: 6-웰 플레이트의 각 웰마다 650,000개의 세포들을 접종하고, 역형질감염시켰다. HepG2 세포를 제조자 (Invetrogen) 지침에 따라, 2.55 μl 리포펙타민2000과 함께, 0.6 #g miR-21 루시페라제 센서 플라스미드 또는 psiCHECK2 공벡터로 형질감염시켰다. LNA-항miR과 대조군 올리고뉴클레오타이드의 농도를 달리하면서도 형질감염시켰다. 24시간 후, 루시페라제 측정을 위해 세포들을 수확하였다.
연질 한천 상에서의 클론 성장: 0.5% 한천을 함유하는 기저층 상부의 0.35% 한천에 2.5x103개의 HepG2 세포를 접종하였다. 형질감염 24시간 후에 세포를 도말하였다. 플레이트를 가습 인큐베이터 중 37℃, 5% CO2에서 17일간 인큐베이션시킨 다음 0.005% 크리스탈 바이올렛으로 1시간 염색시킨 후, 세포를 계수하였다. 분석은 3번 실시하였다.
실시예 34. 8-mer #3205 LNA-항 miR 에 의한 miR -21의 사일런싱은 PC3 세포에서의 세포 이동을 억제한다.
세포의 단층에 "스크래치"를 만들어서 상처 치유 분석 (=스크래치 분석)을 수행하여, 세포 이동을 모니터링할 수 있으며, 세포 이동이 일어나는 동안 초기와 일정 간격을 두고 영상을 캡처한다. 영상을 대조함으로써, 세포의 이동 속도를 정량화할 수 있다. 이 실험은 인간 전립선암 세포주 PC3에 대하여 시시하였다. 세포들을 접종하고, 제3일에 세포들을 형질감염시킨 다음, 다음 날, 100% 컨플루언시에 도달하였으며, 스크래치 (=상처)를 만들었다. 스크래치를 만든 다음, 초기 상처를 기록하기 위해 사진을 찍었다. 그 후 무료 소프트웨어 프로그램인 Image J를 이용하여 여러 시점에서 상처가 아무는 면적을 측정한다. 도 34A에 도시된 바와 같이, PC3 세포들을 25 nM #3205 (완전 맷치, miR-21), 대조군 # 3219으로 처리하거나 또는 형질감염시키지 않은 채로 놔두었다. 24시간 후 사진을 찍고, 각각의 시점에서의 상처가 아물은 면적을 계산하였다. miR-21에 대한 본 발명의 LNA-항miR인 #3205에 비하여, 형질감염되지 않은 세포들, 대조군, # 3219 로 형질감염된 세포들에 있어서 상처가 빨리 아물었는데, 이는, #3205가 miR-21를 억제하여 세포 이동을 방지한다는 것을 가리키는 것이다 (도 34B).
결론: miR-21을 표적화하는 8-mer (#3205)는 형질감염되지 않은 세포와 대조군에 의해 형질감염된 세포에 비해, PC3 세포의 세포 이동을 억제한다.
재료 및 방법:
세포주: 인간 전립선암종 PC3 세포주를 ECACC (#90112714)로부터 구입하였다. PC3 세포들을 10% 소의 태아 혈청, 2 mM 글루타맥스 및 25 ug/ml 젠타마이신이 보강된 DMEM 배지에서 배양하였다.
스크래치 분석: 형질감염 3일 전에 6-웰 플레이트의 각 웰에 150,000개의 세포를 접종하여 다음날 100% 컨플루언시가 되도록 하였다. 형질감염 24시간 후, 200 μl 팁을 이용하여 세포 단층에 스크래치를 냈다. 현미경에 연결된 디지탈 카메라를 이용하여 제0시와 24시간 후에 사진을 찍었다. 상처가 아물었는지를 결정하기 ㅇ우위하여 소프트웨어 프로그램 Image J를 사용하였다.
실시예 35. miR -155를 길항하는 완전히 LNA-치환된 LNA-항 miRs 의 길이 평가.
본 발명자들은 앞서 완전히 LNA-치환된 LNA-항miR와 관련한 miR-21의 길이 평가 결과를 제시한 바 있으며, 가장 강력한 LNA-항miR은 그 길이가 7-, 8- 또는 9 nt인 것임을 증명한 바 있다. 이와 동일한 실험을 miR-155에 대하여 반복하였다. miR-155에 대한 완전 맷치 표적 부위를 리포터 플라스미드 psiCHECK2 내의 루시페라제 유전자의 3'UTR 내로 클로닝시키고, 길이를 달리하는 완전히 LNA-치환된 LNA-항miR들과 함께 마우스 RAW 대식 세포주 내로 형질감염시켰다. RAW 세포주에서는miR-155의 내인성 수준이 낮기 때문에, miR-155 축적을 유도하기 위하여, 세포들을 100 ng/ml LPS로 처리하였다. 24시간 후, 루시페라제 분석을 수행하였다.
결과: 도 35에 도시된 바와 같이, 가장 강력한 LNA-항miRs는 #3207(8 nt) 및 #3241 (9 nt)이며, 이들은 단지 0.25 nM LNA 농도에서도 거의 80% 탈억제를 달성한다. 6-mer (#3244)는 유의적인 탈억제를 나타내지 않는다. 길이를 12-mer 내지 14-mer (#3242 및 #3243)로 증가시키자 miR-155 리포터의 탈억제 효율이 줄어든 것으로부터 알 수 있는 바와 같이, 그 강도가 감소하였다.
결론: miR-155를 표적화하는 가장 강력한, 완전히 LNA-치환된 LNA-항miRs는8- 및 9-mer (#3207및 #3241)였다.
재료 및 방법:
세포주: 마우스의 대식세포 RAW 264.7 세포주를 ATCC (TIB-71)에서 구입하였다. RAW 세포들을 10% 소의 태아 혈청, 4 mM 글루타맥스 및 25 ug/ml 젠타마이신이 보강된 DMEM 배지에서 배양하였다.
형질감염: 500.000 형질감염 전 날에 6-웰 플레이트의 각 웰에 500,000개의 세포를 접종하여 다음 날 50% 컨플루언시를 달성하였다. 형질감염 당일에, RAW 264.7 세포를 제조자 지침에 따라 10 μl 리포펙타민2000 (Invitrogen)과 함께 0.3 ug miR-155 완전 맷치/psiCHECK2 또는 psiCHECK2 공벡터로 형질감염시켰다. LNA-항miR의 농도를 달리하면서도 형질감염시켰다. miR-155 축적을 유도하기 ㅇ우위muㅎla하여, 형질감염 복합체와 4 시간 인큐베이션시킨 후, RAW 세포에 LPS (100 ng/ml)를 첨가하였다. 다시 24시간 경과 후, 루시페라제 분석을 위해 세포들을 수확하였다.
루시페라제 분석: 세포들을 PBS로 세척하고 세포 스크레이퍼로 수확한 다음, 2,500 rpm에서 5분간 세포를 스핀시켰다. 상등액을 폐기하고 50 μl 1 x 수동 용해 완충액 (Promega)을 세포 펠릿에 첨가한 다음, 세포들을 얼음 위에서 30분간 유지시켰다. 용해된 세포들을 10,000 rpm에서 30분간 스핀시킨 후, 20 μl를 96-웰 플레이트에 넣고, 제조자 (Promega) 지침에 따라 루시페라제 측정을 실시하였다.
실시예 36. miR -21을 표적화하는 완전히 LNA-치환된 8-mer #3205 (LNA-항miR-21)에 대한 혈장 단백질 결합.
도 36A에 도시된 실험의 혈장 농도에서는 혈장 단백질이 #3205로 포화되지 않는다. 도 36B에서, 혈장 중 여러가지 농도의 #3205에서 단백질 결합은 #3205 LNA-항miR-21의 약 95%이다. 50.1 μM (174 ㎍/mL)의 #3205 농도에서, FAM-표지된 #3205에 대한 혈장 단백질의 결합 능력은 포화되지 않았다.
재료 및 방법: 마우스 혈장 (100 μL)을, FAM-표지된 #3205을 이용하여 0.167, 1.67, 5.01, 10.02, 16.7, 25.05 및 50.1 μM 농도로 스파이크시켰다. 이 용액을 37℃에서 30분간 인큐베이션시켰다. 용액을 Microcon Ultracel YM-30 필터 (재생 셀룰로스 30,000 MWCO)에 부었다. 필터를 2000g에서 20분간 스펀시키고 실온에서 마이크로원심분리시켰다. 여액을 5, 10 및 20배 희석시키고 100μL 샘플을 마이크로타이터 플레이트 (Polystyrene Black NUNC-237108)에 옮겼다. 458 nm 여기 및 520 nm 방출 하에, FLUOstar Optima 엘리사 판독기를 이용하여 형광을 측정하였다. 서로 다른 12가지 농도 (0.45-1000 nM)에서 FAM-표지된 #3205로 스파이크된 여과된 혈장으로부터 유도된 표준 곡선으로부터, 미결합 FAM-표지된 #3205의 양을 산출하였다. 여과된 혈장 중에서 0.167, 1.67, 5.01, 10.02, 16.7, 25.05 및 50.1 μM의 #3205 농도를 이용한 여과 실험으로부터 수립된 회수율로부터, 숫자를 보정하였다. FAM-표지된 #3205의 회수율은 86%였다.
실시예 37. 35 S- 표지된 #3205 LNA-항 miR -21을 일회 정맥 투여한 후, 염색된 암컷 마우스에 있어서의 정량적인 전신 자가방사선기록 연구
완전히 LNA-변형된 짧은 LNA-항miR (#3205, 8-mer)의 생체분포를 측정하기 위하여, 마우스에 있어서 방사능 표지된 화합물의 전신 조직 분포를 수행하였다. 35S-표지된 #3205를 마우스에게 일회 정맥 투여하고 마우스들을 5분 내지 21일에 이르는 여러 시점에서 희생시켰다.
Figure 112010028980901-pct00016
Figure 112010028980901-pct00017
결론: #3205는 소거 반감기 8-10 시간인 혈액 방사능 소거율을 나타낸다. 신장, 부신, 림프, 간, 골수, 비장, 난소 및 자궁에서 방사능 수준이 높게 기록되었다. 최고의 방사능 수준은 신장 피질에서 기록되었는데 이는 #3205의 간에서의 농도보다 5배나 더 높은 것이다. 신장 피질, 림프, 간, 골수 및 비장에서는 #3205 LNA-항miR-21에 대한 강한 방사능 체류가 관찰되었다.
재료 및 방법:
투여량 투여: 투약 전 모든 마우스를 칭량하였다. 9마리의 암컷 마우스의 꼬리 정맥에 10 mg/kg의 35S-#3205를 정맥 투여하였다. 각각의 동물에게 주어진 용량은 테스트 포뮬레이션 10 mL/kg이었다. 비활성 (specific activity)은 75.7 μCi/mg이었다. #3205를 투여한지 5분, 15분, 1시간, 4 시간, 24 시간, 2일, 4일, 7일 및 21일 후에 마우스들을 각각 희생시켰다. 전신 자가방사능기록: 세보플루란으로 마우스들을 마취시킨 다음, 헵탄에 즉각 침지시키고, 드라이아이스를 이용하여 -80℃로 냉각하였다, ABR-SOP-0130. 표준법 ABR-SOP-0131에 따라, 냉동된 사체를 수성 카르복시메틸 셀룰로스 (CMC) 젤 중에 내장시키고, 에탄올로 냉동시킨 다음, 드라이아이스 (-80℃)로 냉각시킨 다음, 전신 자가방사능기록을 위해 시상 절제하였다. 약 -20℃의 온도에서 냉동박절기 (Leica CM 3600)을 이용하여 각 동물의 20 μm 절편들을 여러 수준으로 절단하였다. 이렇게 하여 얻어진 절편들을 테이프 (Minnesota Mining and Manufacturing Co., No. 810) 상에 고정시키고 방사능 잉크로 연속적으로 번호를 매겼다. -20℃에서 약 24시간 동안 동결건조시킨 후, 선택된 절편들을 마일라 호일로 얇게 싼 다음 조영 플레이트 (Fuji, Japan)에 올려놓았다. -20℃의 납땜한 상자 내의 차광 카세트에서 노출을 수행하여 조영 플레이트를 주변환경의 방사능으로부터 보호하였다. ABR-SOP-0214에 설명된 바와 같이, 노출 후, 조영 플레이트를 50 μm의 픽셀 크기로 스캐닝하고 생체조영 분석 시스템 (Bas 2500, Fuji, Japan)을 이용하여 방사능발광기록계로 분석하였다. 35S 방사능의 수용성 표준 테스트 용액을 전혈과 혼합하고 보정 스케일을 생산하는데 사용하였다, ABR-SOP-0251. 그러나, 500 uL Soluene-35에는 다른 혈액 표준품을 용해시켰다. 이어서 이 용해된 샘플에 4.5 mL Ultima Gold를 첨가하였다. 35S 및 14C는 서로 매우 유사한 에너지 스펙트럼을 갖기 때문에, 서로 다른 혈액 샘플에 대한 방사능을 결정할 경우에는 표준 14C-programme (Packard 2200CA)을 사용하였다.
약동학적 계산: 전혈 및 조직에서 측정된 35S 방사능을 nCi/g 조직으로서 ㅍ표시하고 약동학적 평가를 위해 nmol 당량/g 조직으로 재산출하였다. WinNonlin Professional (Pharsight Corporation, Mountain View, CA, USA)를 이용한 비구획식 분석에 의하여 약동학적 변수 Cmax, t1 /2 및 AUC를 전혈과 조직에 대하여 측정하였다. 정맥 투여 후, 농도를 0까지 거꾸로 외삽하고 (C0)으로 표시하였다. 로그 혈장 농도-시간 곡선의 터미날 기울기를 선형 회귀 분석함으로써 소거율 상수 λ를 추정하여 보았다. 방정식 t1 /2 = ln2/λ을 이용하여 소거 반감기 t1 /2을 산출하였다. 달리 언급하지 않는 한, 소거 반감기 계산에는, LCQ을 상회하는 마지막 세개의 시점을 사용하였다.
실시예 38. 마우스의 폐 및 신장에서 Ras 단백질의 정량화를 통하여 측정된 바와 같은 8-mer LNA-항 miR 에 의한 생체내 let-7 억제의 평가
생체내에서 풍부하게 발현되는 let-7 패밀리의 길항 가능성을 조사하기 위하여, 마우스에게 8-mer LNA-항miR 안타고니스트 또는 염수를 정맥 (i.v.) 주사하였다. 처리 효과를 측정하기 위하여, 폐와 신장으로부터 단백질을 분리하였다. 단백질의 Ras 패밀리 (N-Ras, K-Ras, 및 H-Ras), 특히 N-Ras 및 K-Ras는 Johnson 등 (Cell, 2005)에 의하여 이전부터, let-7 패밀리에 의해 조절 (억제)된다는 것이 알려져 있었기 때문에, 이 실험의 목적은 이들 let-7 표적들이 생체내에서 탈억제될 수 있는지를 분석하는데 있다.
결과: 도 37에 도시된 바와 같이, 8-mer LNA-항miR는처리된 마우스의 신장에서 Ras 단백질 수준을 강력하게 탈억제하였으며, 이를 염수 대조군에 대하여 정규화하였다. 이 장기에서의 상향 조절은 3배를 상회하였으며, 이는 명백한 생체내 효과를 보이는 것이다. 그러나 폐에서는, 오직 최소의 (1.2배) Ras 탈억제만이 관찰되었는데, 이는 Johnson 등 (Cancer Research, 2007)에 의해 이미 설명된 바와 같이, 대량의 let-7을 억제하기 위하여 이 장기에서는 LNA-항miR가 불충분한 양으로 유입되었다는 것을 시사하는 것이다.
결론: 8-mer LNA-항miR은 처리된 마우스와 대조군 마우스에서의 Ras 단백질에 기초하여 평가된 바와 같이, 생체내에서 표적 let-7 miRNA를 조절하는데 명백히 효과가 있다. 반면, 이 효과는 폐에서는 더 낮은 것으로 나타났으며, 신장에서의 Ras 수준은 항miRs-처리시 실질적으로 상향조절되는 것으로 나타났다.
재료 및 방법: 동물 및 투여: C57BL/6 암컷 마우스를 10 mg/kg LNA-항miR 또는 염수로 3일 연속 (0, 1, 및 2) 처리하고 제4일에 희생시켰다. 폐와 신장으로부터의 조직 샘플을 스냅동결시키고 추가로 가공하기 전까지 -80℃에서 보관하였다.
웨스턴 블랏 분석: 염수 및 LNA-항miR-처리된 마우스로부터의 폐 단백질과 신장 단백질을 샘플 당 100 μg을 이용하여 NuPAGE Bis Tris 4-12% (Invitrogen) 상에서 분리하였다. 제조자 지침에 따라 iBlot (Invitrogen)을 이용하여, 니트로셀룰로스막에 단백질을 옮겼다. 제조자 지침에 따라 블록킹, 항체 희석 및 검출을 실시하였다. Ras 검출을 위해, 일차 토끼 항Ras 항체 (SC-3339, Santa Cruz Biotechnology) 및 이차 HRP-컨쥬게이션된 돼지의 항토끼 항체 (P0399, Dako)를 사용하고, 튜불린 검색을 위해서는, 일차 튜불린 알파 (MS-581-P1, Neomarkers) 및 이차 HRP-컨쥬게이션된 염소의 항마우스 항체 (P0447, Dako)를 사용하였다.
실시예 40. 마우스 신장에 있어서의 Pdcd4 단백질 상향 조절에 의해 측정되 는 바와 같은, miR -21을 표적화하는데 있어서 8-mer LNA-항 miR (#3205)의 생체내 효능 평가.
본 발명자들은 완전히 LNA-변형된 8-mer LNA-항miR는 miR-21을 길항시키고, 시험관 내에서 miR-21 표적 Pdcd4의 단백질 수준을 조절할 수 있음을 밝힌 바 있다. 본 발명자들은 따라서 LNA-항miR를 마우스에 주사하여 생체내에서의 LNA-항miR의 효과를 측정하였다. 마우스에게 14일간 하루걸러 #3205를 25 mg/kg 정맥 주사하였다 (총 5회 투여). 제14일에 마우스들을 희생시키고, 신장을 꺼내서, 단백질을 분리하였다. 표적 조절 여부를 측정하기 위해, 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다.
결과: 도 37에 도시된 바와 같이, 마우스를 #3205로 처리하자 염수 대조군의 경우에 비해 Pdcd4 단백질 수준이 현저히 증가한 것으로 나타났다. 정규화된 Pdcd4 대 Gapdh 비율은 두가지 염수 샘플 모두에서 일치하였으나, 두개의 LNA-항miR (#32059)-처리된 마우스에 있어서는 각각 3.3배 및 6.3배 단백질이 상향 조절된 것으로 나타났는데, 이는 #3205 8-mer LNA-항miR의 생체내 약리학적 효과를 입증하는 것이다.
결론: 완전히 LNA-변형된 8-mer LNA-항miR #3205는, 검정된 miR-21 표적인 Pdcd4의 마우스 신장 수준을 탈억제 (상향 조절)하는 그의 능력에 의해 입증되는 바와 같이, 생체내에서 miR-21을 길항시킨다.
재료 및 방법:
동물 및 투여: 최초 투여시 평균 체중이 20 g 인 C57BL/6 암컷 마우스들을 모든 실험에 사용하여, 일반적인 차우 다이어트 (Altromin no 1324, Brogaarden, Gentofte, Denmark)를 실시하였다. 물질들을 생리식염수 (0.9% NaCl)에 조성시켰다. LNA-항miR 또는 염수 (0.9% NaCl)를 동물에게 투여하고, 14일간 하루 걸러 25 mg/kg씩, 총 5회 투여하였다. 제14일에 동물을 희생시켰다.
웨스턴 블랏 분석: 염수 또는 LNA-처리된 마우스로부터의 80 ㎍ 신장 조직을 NuPAGE Bis Tris 4-12% (Invitrogen) 상에서 분리하였다. 이 단백질을 제조자 지침에 따라 iBlot (Invitrogen)을 이용하여 니트로셀룰로스 막으로 옮겼다. 이 막을 Pdcd4 항체 (Bethyl Laboratories)와 함RP, 이어서 HRP-컨쥬게이트된 돼지의 항 토끼 항체(Dako)와 함께 인큐베이션시켰다. 동등한 로딩 대조군으로서, GAPDH (Abcam)을 사용한 다음, 이어서 HRP-컨쥬게이션된 돼지의 항마우스 항체를 사용하였다. 이 막을 화학발광 (ECL, Amersham)을 이용하여 시각화시켰다.
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SEQUENCE LISTING <110> Santaris Pharma A/S <120> Micromirs <130> 1051WO <150> US 60/977497 <151> 2007-10-04 <150> US 60/979217 <151> 2007-10-11 <150> US 61/028062 <151> 2008-02-12 <150> EP08104780.5 <151> 2008-07-17 <160> 3787 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 15 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Seedmer, optionally fully LNA phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (1)..(15) <223> Phosphorothioate linkages, LNAs at positions 1, 3, 4, 6, 7, 8, 10, 12, 14 & 15 otherwise DNAnts. <400> 1 tcagtctgat aagct 15 <210> 2 <211> 8 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA Oligomer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(8) <223> Fully LNA & Phosphorothioate linkages <400> 2 gataagct 8 <210> 3 <211> 15 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA Oligomer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(15) <223> Phosphorothioate linkages, LNAs at positions 1, 3, 5, 6, 7, 10, 11, 12, 14 & 15 otherwise DNAnts. <400> 3 tcacaattag catta 15 <210> 4 <211> 8 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA 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Phosphorothioate linkages <400> 9 tgataagct 9 <210> 10 <211> 10 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA Oligomer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(10) <223> Fully LNA & Phosphorothioate linkages <400> 10 ctgataagct 10 <210> 11 <211> 12 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA Oligomer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(12) <223> Fully LNA & Phosphorothioate linkages <400> 11 gtctgataag ct 12 <210> 12 <211> 14 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA Oligomer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(14) <223> Fully LNA & Phosphorothioate linkages <400> 12 cagtctgata agct 14 <210> 13 <211> 8 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA Oligomer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(8) <223> Fully LNA & Phosphorothioate linkages <400> 13 tctgataa 8 <210> 14 <211> 8 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA Oligomer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(8) <223> Fully LNA & Phosphorothioate linkages <400> 14 atcagtct 8 <210> 15 <211> 8 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA Oligomer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(8) <223> Fully LNA & Phosphorothioate linkages <400> 15 tcaacatc 8 <210> 16 <211> 8 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA Oligomer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(8) <223> Fully LNA & Phosphorothioate linkages <400> 16 ggtaaact 8 <210> 17 <211> 8 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA Oligomer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(8) <223> Fully LNA & Phosphorothioate linkages <400> 17 cgtaatga 8 <210> 18 <211> 16 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA Oligomer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> LNA gapmer 3LNA- 9DNA-3LNA-1DNA, 5' FAM label, phosphorothioate linkages. <400> 18 tcagtctgat aagcta 16 <210> 19 <211> 8 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA Oligomer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(8) <223> Full LNA & Phosphorothioate linkages <400> 19 agcacttt 8 <210> 20 <211> 8 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA Oligomer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(8) <223> Full LNA & Phosphorothioate 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Phosphorothioate linkages <400> 28 gtagact 7 <210> 29 <211> 6 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA Oligomer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> Full LNA & Phosphorothioate linkages <400> 29 tacctc 6 <210> 30 <211> 7 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA Oligomer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(7) <223> Full LNA & Phosphorothioate linkages <400> 30 ctacctc 7 <210> 31 <211> 9 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA Oligomer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(9) <223> Full LNA & Phosphorothioate linkages, N = Universal base <400> 31 tnctacctc 9 <210> 32 <211> 9 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA Oligomer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(9) <223> Full LNA & Phosphorothioate linkages, N = Universal base <400> 32 tnctacctc 9 <210> 33 <211> 15 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA Oligomer <400> 33 gcaacctact acctc 15 <210> 34 <211> 15 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA Oligomer <400> 34 acaacctcct acctc 15 <210> 35 <211> 15 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA Oligomer <400> 35 acaaactact acctc 15 <210> 36 <211> 7 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA Oligomer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(7) <223> Full LNA & Phosphorothioate linkages, <400> 36 ctacctc 7 <210> 37 <211> 7 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA Oligomer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(7) <223> Full LNA & Phosphorothioate linkages, <400> 37 ctaactc 7 <210> 38 <211> 9 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA Oligomer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(9) <223> Full LNA & Phosphorothioate linkages, <400> 38 ttagcatta 9 <210> 39 <211> 9 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA Oligomer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(9) <223> Full LNA & Phosphorothioate linkages, <400> 39 ttagcatta 9 <210> 40 <211> 22 <212> RNA <213> Epstein Barr virus <400> 40 uagcaccgcu auccacuaug uc 22 <210> 41 <211> 24 <212> RNA <213> Epstein Barr virus <400> 41 ucuuagugga agugacgugc ugug 24 <210> 42 <211> 23 <212> RNA <213> Epstein Barr virus <400> 42 uacauaacca uggaguuggc ugu 23 <210> 43 <211> 22 <212> RNA <213> Epstein Barr virus <400> 43 gccaccucuu ugguucugua ca 22 <210> 44 <211> 21 <212> RNA <213> Epstein Barr virus <400> 44 acgcacacca ggcugacugc c 21 <210> 45 <211> 24 <212> RNA <213> Epstein Barr virus <400> 45 ucagacaguu uggugcgcua guug 24 <210> 46 <211> 22 <212> RNA <213> Epstein Barr virus <400> 46 uccuguggug uuuggugugg uu 22 <210> 47 <211> 23 <212> RNA <213> Epstein Barr virus <400> 47 uguaacuugc cagggacggc uga 23 <210> 48 <211> 22 <212> RNA <213> Epstein Barr virus <400> 48 aaccggcucg uggcucguac ag 22 <210> 49 <211> 22 <212> RNA <213> Epstein Barr virus <400> 49 uaaaugcugc aguaguaggg au 22 <210> 50 <211> 22 <212> RNA <213> Epstein Barr virus <400> 50 uacccuacgc ugccgauuua ca 22 <210> 51 <211> 22 <212> RNA <213> Epstein Barr virus <400> 51 gucagugguu uuguuuccuu ga 22 <210> 52 <211> 24 <212> RNA <213> Epstein Barr virus <400> 52 uuagauagag ugggugugug cucu 24 <210> 53 <211> 23 <212> RNA <213> Epstein Barr virus <400> 53 uguaugccug guguccccuu agu 23 <210> 54 <211> 22 <212> RNA <213> Epstein Barr virus <400> 54 uaagaggacg caggcauaca ag 22 <210> 55 <211> 22 <212> RNA <213> Epstein Barr virus <400> 55 uaucggaagu uugggcuucg uc 22 <210> 56 <211> 22 <212> RNA <213> Epstein Barr virus <400> 56 ucaaguucgc acuuccuaua ca 22 <210> 57 <211> 21 <212> RNA <213> Epstein Barr virus <400> 57 uuuuguuugc uugggaaugc u 21 <210> 58 <211> 23 <212> RNA <213> Epstein Barr virus <400> 58 acauuccccg caaacaugac aug 23 <210> 59 <211> 24 <212> RNA <213> Epstein Barr virus <400> 59 aaggagcgau uuggagaaaa uaaa 24 <210> 60 <211> 22 <212> RNA <213> Epstein Barr virus <400> 60 uauuuucugc auucgcccuu gc 22 <210> 61 <211> 22 <212> RNA <213> Epstein Barr virus <400> 61 caugaaggca cagccuguua cc 22 <210> 62 <211> 21 <212> RNA <213> Epstein Barr virus <400> 62 uagcaggcau gucuucauuc c 21 <210> 63 <211> 22 <212> RNA <213> Epstein Barr virus <400> 63 cgcaccacua gucaccaggu gu 22 <210> 64 <211> 21 <212> RNA <213> Epstein Barr virus <400> 64 accuaguguu aguguugugc u 21 <210> 65 <211> 22 <212> RNA <213> Epstein Barr virus <400> 65 gaccugaugc ugcuggugug cu 22 <210> 66 <211> 24 <212> RNA <213> Epstein Barr virus <400> 66 caaggugaau auagcugccc aucg 24 <210> 67 <211> 22 <212> RNA <213> Epstein Barr virus <400> 67 cggggaucgg acuagccuua ga 22 <210> 68 <211> 22 <212> RNA <213> Epstein Barr virus <400> 68 uaagguuggu ccaauccaua gg 22 <210> 69 <211> 22 <212> RNA <213> Epstein Barr virus <400> 69 caucauaguc caguguccag gg 22 <210> 70 <211> 22 <212> RNA <213> Epstein Barr virus <400> 70 ccuggaccuu gacuaugaaa ca 22 <210> 71 <211> 22 <212> RNA <213> Epstein Barr virus <400> 71 uacgguuucc uagauuguac ag 22 <210> 72 <211> 23 <212> RNA <213> Epstein Barr virus <400> 72 gucacaaucu auggggucgu aga 23 <210> 73 <211> 23 <212> RNA <213> Epstein Barr virus <400> 73 uaacacuuca ugggucccgu agu 23 <210> 74 <211> 22 <212> RNA <213> Epstein Barr virus <400> 74 uacuggaccc ugaauuggaa ac 22 <210> 75 <211> 22 <212> RNA <213> Epstein Barr virus <400> 75 uaaccugauc agccccggag uu 22 <210> 76 <211> 22 <212> RNA <213> Epstein Barr virus <400> 76 uaucuuuugc ggcagaaauu ga 22 <210> 77 <211> 22 <212> RNA <213> Epstein Barr virus <400> 77 aaauucuguu gcagcagaua gc 22 <210> 78 <211> 22 <212> RNA <213> Epstein Barr virus <400> 78 uaacgggaag uguguaagca ca 22 <210> 79 <211> 22 <212> RNA <213> Human cytomegalovirus <400> 79 aagugacggu gagauccagg cu 22 <210> 80 <211> 21 <212> RNA <213> Human cytomegalovirus <400> 80 ucguccuccc cuucuucacc g 21 <210> 81 <211> 20 <212> RNA <213> Human cytomegalovirus <400> 81 uaacuagccu ucccgugaga 20 <210> 82 <211> 22 <212> RNA <213> Human cytomegalovirus <400> 82 ucaccagaau gcuaguuugu ag 22 <210> 83 <211> 22 <212> RNA <213> Human cytomegalovirus <400> 83 ucguugaaga caccuggaaa ga 22 <210> 84 <211> 22 <212> RNA <213> Human cytomegalovirus <400> 84 uuuccaggug uuuucaacgu gc 22 <210> 85 <211> 20 <212> RNA <213> Human cytomegalovirus <400> 85 ggggaugggc uggcgcgcgg 20 <210> 86 <211> 21 <212> RNA <213> Human cytomegalovirus <400> 86 ugcgucucgg ccucguccag a 21 <210> 87 <211> 21 <212> RNA <213> Human cytomegalovirus <400> 87 aaccgcucag uggcucggac c 21 <210> 88 <211> 22 <212> RNA <213> Human cytomegalovirus <400> 88 uccgaacgcu aggucgguuc uc 22 <210> 89 <211> 23 <212> RNA <213> Human cytomegalovirus <400> 89 auccacuugg agagcucccg cgg 23 <210> 90 <211> 22 <212> RNA <213> Human cytomegalovirus <400> 90 agcggucugu ucagguggau ga 22 <210> 91 <211> 20 <212> RNA <213> Human cytomegalovirus <400> 91 ucacgguccg agcacaucca 20 <210> 92 <211> 22 <212> RNA <213> Human cytomegalovirus <400> 92 gauugugccc ggaccguggg cg 22 <210> 93 <211> 22 <212> RNA <213> Human cytomegalovirus <400> 93 cgacauggac gugcaggggg au 22 <210> 94 <211> 21 <212> RNA <213> Human cytomegalovirus <400> 94 ugacaagccu gacgagagcg u 21 <210> 95 <211> 22 <212> RNA <213> Human cytomegalovirus <400> 95 uuaugauagg ugugacgaug uc 22 <210> 96 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 96 ugagguagua gguuguauag uu 22 <210> 97 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens 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<400> 976 acccagcugc guaaaccccg cu 22 <210> 977 <211> 14 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA Oligomer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(14) <223> Full LNA & Phosphorothioate linkages, <400> 977 cacgattagc atta 14 <210> 978 <211> 6 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA Oligomer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> Full LNA & Phosphorothioate linkages, <400> 978 gcatta 6 <210> 979 <211> 7 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA Oligomer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(7) <223> Full LNA & Phosphorothioate linkages, <400> 979 agcatta 7 <210> 980 <211> 10 <212> DNA <213> artificial <220> <223> LNA Oligomer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(10) <223> Full LNA & Phosphorothioate linkages, <400> 980 attagcatta 10

Claims (33)

  1. 세포 또는 기관에서 마이크로RNA(miRNA) 표적의 유효량을 감소시키는데 사용하기 위한, 길이가 7, 8, 9 또는 10개의 뉴클레오타이드 단위인 콘티그 서열로 이루어진 올리고머로서,
    여기서 상기 올리고머의 뉴클레오타이드 단위 전부는 LNA 단위이고,
    콘티그 뉴클레오타이드 서열의 뉴클레오타이드 단위들 사이에 존재하는 모든 인터뉴클레오사이드 결합은 포스포로티오에이트 인터뉴클레오사이드 결합이고,
    올리고머의 상기 콘티그 뉴클레오타이드 서열은 상기 마이크로RNA의 씨드 서열에 상보적인 서열로 구성되거나 또는 이를 포함하는 것인 올리고머.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 올리고머의 길이는 7개의 콘티그 뉴클레오타이드인 것인 올리고머.
  4. 제1항에 있어서, 올리고머의 길이는 8개의 콘티그 뉴클레오타이드인 것인 올리고머.
  5. 제1항에 있어서, 올리고머의 길이는 9개의 콘티그 뉴클레오타이드인 것인 올리고머.
  6. 제1항에 있어서, 올리고머의 길이는 10개의 콘티그 뉴클레오타이드인 것인 올리고머.
  7. 제1항에 있어서, 상기 콘티그 뉴클레오타이드 서열은 miR-21, miR-155, miR-221, miR-222, 및 miR-122로 이루어진 군 중에서 선택된 마이크로RNA (miRNA) 서열의 대응하는 영역에 상보적인 것인 올리고머.
  8. 제1항에 있어서, 상기 miRNA는 miR-1, miR-10b, miR-29, miR-125b, miR-126, miR-133, miR-141, miR-143, miR-200b, miR-206, miR-208, miR-302, miR-372, miR-373, miR-375 및 miR-520c/e로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 올리고머.
  9. 제1항에 있어서, 상기 콘티그 뉴클레오타이드 서열은 miR-17-5p, miR-20a/b, miR-93, miR-106a/b, miR-18a/b, miR-19a/b, miR-25, miR-92a, miR-363으로 이루어진 군 중에서 선택된 마이크로RNA 등의 miR 17-92 중에 존재하는 마이크로RNA (miRNA) 서열의 대응하는 영역에 상보적인 것인 올리고머.
  10. 제1항에 있어서, 올리고머의 상기 콘티그 뉴클레오타이드 서열은 상기 마이크로RNA의 씨드 서열에 100% 상보적인 서열로 구성되거나 또는 이를 포함하는 것인 올리고머.
  11. 제10항에 있어서, 올리고머의 길이는 7개의 콘티그 뉴클레오타이드이고, 여기서 콘티그 뉴클레오타이드 서열의 뉴클레오타이드 단위들 사이에 존재하는 모든 인터뉴클레오사이드 결합은 포스포로티오에이트 인터뉴클레오사이드 결합인 것인 올리고머.
  12. 제10항에 있어서, 올리고머의 길이는 8개의 콘티그 뉴클레오타이드이고, 여기서 콘티그 뉴클레오타이드 서열의 뉴클레오타이드 단위들 사이에 존재하는 모든 인터뉴클레오사이드 결합은 포스포로티오에이트 인터뉴클레오사이드 결합인 것인 올리고머.
  13. 제10항에 있어서, 올리고머의 길이는 9개의 콘티그 뉴클레오타이드이고, 여기서 콘티그 뉴클레오타이드 서열의 뉴클레오타이드 단위들 사이에 존재하는 모든 인터뉴클레오사이드 결합은 포스포로티오에이트 인터뉴클레오사이드 결합인 것인 올리고머.
  14. 제10항에 있어서, 올리고머의 길이는 10개의 콘티그 뉴클레오타이드이고, 여기서 콘티그 뉴클레오타이드 서열의 뉴클레오타이드 단위들 사이에 존재하는 모든 인터뉴클레오사이드 결합은 포스포로티오에이트 인터뉴클레오사이드 결합인 것인 올리고머.
  15. 제1항에 있어서, 상기 콘티그 뉴클레오타이드 서열은 hsa-miR-122의 대응하는 영역에 상보적인 것인 올리고머.
  16. 제13항에 있어서, C형 간염바이러스 감염 및 고콜레스테롤혈증으로 이루어진 군 중에서 선택된 질환 또는 의학적 장애를 치료하는데 사용되기 위한 것인 올리고머.
  17. 제1항에 있어서, 의약으로서 사용되기 위한 것인 올리고머.
  18. 제11항에 있어서, 의약으로서 사용되기 위한 것인 올리고머.
  19. 제12항에 있어서, 의약으로서 사용되기 위한 것인 올리고머.
  20. 제13항에 있어서, 의약으로서 사용되기 위한 것인 올리고머.
  21. 제14항에 있어서, 의약으로서 사용되기 위한 것인 올리고머.
  22. 제13항에 기재된 올리고머와 약학적으로 허용되는 희석제, 담체, 염 또는 아쥬반트를 포함하는, C형 간염바이러스 감염 및 고콜레스테롤혈증으로 이루어진 군 중에서 선택된 질환 또는 의학적 장애를 치료하기 위한 의약 조성물.
  23. 제1항에 기재된 올리고머 및 적어도 하나의 비뉴클레오타이드 화합물을 포함하는 컨쥬게이트.
  24. miRNA를 발현하는 세포에 제1항에 따른 올리고머를 시험관내 투여하는 것을 포함하는, 세포 중에서 miRNA의 양 또는 유효량을 감소시키기 위한 시험관내 방법.
  25. 세포 내에서 miRNA에 의해 발현이 억제되는 1종 이상의 mRNA을 탈억제하기 위한 시험관내 방법으로서, 상기 mRNA의 발현을 탈억제하기 위하여, 제1항에 따른 올리고머를 상기 mRNA와 상기 miRNA의 두가지 모두를 발현시키는 세포에 시험관내 투여하는 것을 포함하는 시험관내 방법.
  26. 삭제
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