JP2010539959A - マイクロｍｉｒ - Google Patents

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Abstract

本発明は、インビボでマイクロRNAをターゲットとし、それを阻害する、極めて短い、高度に修飾されたオリゴヌクレオチド、ならびに医薬および医薬組成物におけるそれらの使用に関する。

Description

［発明の分野］
本発明は、インビボでマイクロRNAをターゲットとし、それを阻害する、極めて短いオリゴヌクレオチド、ならびに医薬および医薬組成物におけるそれらの使用に関する。
［発明の背景］
マイクロRNA（miRNA）は、そのターゲットmRNAとの塩基対形成によって遺伝子発現の転写後調節因子として作用する、豊富に存在する一群の短い内在性RNAである。これらは、プレ-miRNAと呼ばれる、より長い（約70〜80ntの）ヘアピン様前駆体から、RNAse III酵素ダイサー（Dicer）によってプロセシングされる。マイクロRNAはmiRNPと呼ばれるリボ核タンパク質複合体に組み立てられ、そのターゲット部位をアンチセンス相補性によって認識することにより、そのターゲット遺伝子のダウンレギュレーションを媒介する。miRNAとそのターゲット部位の間のほぼ完全なまたは完全な相補性が、ターゲットmRNAの切断をもたらすのに対し、マイクロRNAとターゲット部位の間の限定された相補性は、ターゲット遺伝子の翻訳阻害をもたらす。
ヒト疾患におけるマイクロRNAの役割および一本鎖オリゴヌクレオチドを使ったマイクロRNAの阻害は、WO2007/112754およびWO2007/112753に要約されており、これらの文献はどちらも参照によりそのすべてが本明細書に組み込まれる。参照により本明細書に組み込まれるWO2008046911には、がんに関連するマイクロRNA配列が記載されている。数多くのマイクロRNAが疾患表現型と関連づけられているので、インビボでマイクロRNAの利用可能性を調整する能力を持つ物質を提供することは望ましい。WO2007/112754およびWO2007/112753には、そのターゲットmiRNAと強い二重鎖を形成すると考えられる短い一本鎖オリゴヌクレオチドが開示されている。配列番号 1〜45はWO2007/112754およびWO2007/112753に開示されている抗マイクロRNAオリゴヌクレオチドの例である。
［関連出願］
本願は次に挙げる4つの出願に基づく優先権を主張する：US 60/977497（出願日2007年10月4日）、US 60/979217（出願日2007年10月11日）、US 61/028062（出願日2008年2月12日）、およびEP08104780（出願日2008年7月17日）（これらはすべて参照により本明細書に組み込まれる）。さらにまた、我々は、同じ出願人による先の出願であるWO2007/112754およびWO2007/112753を参照し、それらを参照により本明細書に組み込む。
［発明の概要］
本発明は、マイクロRNAをターゲットとし、かつLNAヌクレオチドなどのヌクレオチド類似ヌクレオチド（nucleotide analogue nucleotide）の比率が高い、極めて短いオリゴヌクレオチドの使用が、インビボでのターゲットマイクロRNAによるmRNAなどのRNAの抑制を軽減するのに、極めて有効であるという発見に基づく。
本発明は、細胞または生物におけるマイクロRNAターゲットの有効量を減少させるのに使用するための、7、8、9または10ヌクレオチド単位長の連続（contiguous）配列のオリゴマーであって、そのオリゴマーのヌクレオチド単位の少なくとも70％、例えば少なくとも80％が、LNA単位および2'置換ヌクレオチド類似体からなる群より選択されるものを提供する。
本発明は、細胞または生物におけるマイクロRNAターゲットの有効量を減少させるのに使用するための、7、8、9または10ヌクレオチド単位長の連続配列のオリゴマーであって、そのオリゴマーのヌクレオチド単位の少なくとも70％が、LNA単位および2'置換ヌクレオチド類似体からなる群より選択され、かつそのオリゴマーのヌクレオチド単位の少なくとも50％、例えば少なくとも60％、例えば少なくとも70％が、LNA単位であるものを提供する。
本発明は、全部で7〜10ヌクレオチド、例えば7、8、9ヌクレオチド単位の連続ヌクレオチド配列を含む、7〜10ヌクレオチド長のオリゴマーであって、そのオリゴマーのヌクレオチド単位の少なくとも50％がヌクレオチド類似体であるものを提供する。
本発明は、さらに、全部で7〜10ヌクレオチド、例えば7、8、9、または10ヌクレオチド単位の連続ヌクレオチド配列を含む、7〜10ヌクレオチド長のオリゴマーであって、そのヌクレオチド配列が、哺乳動物またはウイルスのマイクロRNAに見いだされる対応するヌクレオチドに相補的であり、かつそのオリゴマーのヌクレオチド単位の少なくとも50％がヌクレオチド類似体であるものを提供する。
本発明は医薬としての本発明のオリゴマーを提供する。
本発明は、本発明のオリゴマーと医薬上許容される希釈剤、担体、塩またはアジュバントとを含む医薬組成物を提供する。
本発明は、少なくとも1つの非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド物質（例えばコレステロールなどのステロール）にコンジュゲートされた本発明のオリゴマーを含むコンジュゲートを提供する。
本発明は、マイクロRNA（例えば本明細書で言及するマイクロRNAの1つまたはそれ以上）の存在または過剰発現に関連する疾患または医学的障害を処置するための医薬を製造するための、本発明のオリゴマーまたはコンジュゲートの使用を提供する。
本発明は、マイクロRNAの存在または過剰発現に関連する疾患または医学的障害の処置であって、本発明のオリゴマーまたはコンジュゲートを含む組成物（例えば医薬組成物）を、前記疾患または医学的障害を患っている患者または患いそうな患者に投与するステップを含む処置を提供する。
本発明は、細胞または生物におけるマイクロRNAターゲットの有効量を減少させるための方法であって、本発明のオリゴマー、または本発明のオリゴマーもしくはコンジュゲートを含む組成物（例えば医薬組成物）を、その細胞または生物に投与することを含む方法を提供する。
本発明は、細胞または生物におけるマイクロRNAターゲットの有効量を減少させるための方法であって、本発明のオリゴマーまたはコンジュゲートまたは医薬組成物を、その細胞または生物に投与することを含む方法を提供する。
本発明は、細胞または生物におけるターゲットmRNA（または1つ以上のRNA）の抑制解除方法であって、本発明のオリゴマーもしくはコンジュゲート、または前記オリゴマーもしくはコンジュゲートを含む組成物を、前記細胞または生物に投与することを含む方法を提供する。
本発明は、マイクロRNAを含む細胞（例えばヒト細胞）において、そのマイクロRNAを阻害するための、本発明のオリゴマーまたはコンジュゲートの使用を提供する。この使用はインビボまたはインビトロであることができる。
完全にLNA修飾されホスホロチオレート化された（phosphorothiolated）LNA-アンチmiR（antimiR）によるターゲティング位置を示す、miR-21、miR-155およびmiR-122 8マーLNA-アンチmiRの概略図。成熟マイクロRNA上の、7マー、8マー、9マーおよび10マーLNAオリゴヌクレオチドの好ましいハイブリダイゼーション位置も、示されている。 ルシフェラーゼセンサーアッセイを使った、MCF-7細胞における、SEQ ID #3205およびSEQ ID #3204 LNA-アンチmiRによる、miR-21拮抗作用の評価。MCF-7細胞に、miR-21用の完全マッチターゲット部位またはミスマッチターゲット部位（.mm2）を含有するルシフェラーゼセンサープラスミドと、異なる濃度のLNA-アンチmiRとを、同時トランスフェクトした。24時間後に細胞を収集し、ルシフェラーゼ活性を測定した。3回の独立した実験についてウミシイタケ/ホタル比の平均を示す（バー＝s.e.m）。これらはすべて、0nM/psiCHECK2（＝対照）に対して標準化されている。 ルシフェラーゼセンサーアッセイを使った、HeLa細胞における、SEQ ID #3205およびSEQ ID #3204 LNA-アンチmiRによる、miR-21拮抗作用の評価。HeLa細胞に、miR-21用の完全マッチターゲット部位（mir-21）またはミスマッチターゲット部位（mm2）を含有するルシフェラーゼセンサープラスミドと、異なる濃度のLNA-アンチmiRとを、同時トランスフェクトした。24時間後に細胞を収集し、ルシフェラーゼ活性を測定した。3回の独立した実験についてウミシイタケ/ホタル比の平均を示す（バー＝s.e.m）。これらはすべて、0nM/psiCHECK2（＝対照）に対して標準化されている。 ルシフェラーゼセンサーアッセイを使った、LPS処置マウスRAW細胞における、SEQ ID #3206およびSEQ ID #3207 LNA-アンチmiRによる、miR-155拮抗作用の評価。RAW細胞に、miR-155と、異なる濃度の異なるLNA-アンチmiRとを、同時トランスフェクトした。24時間後に細胞を収集し、ルシフェラーゼ活性を測定した。ウミシイタケ/ホタルの平均を示す。これらはすべて、0nM/psiCHECK2に対して標準化されている。 ルシフェラーゼセンサーアッセイを使った、HuH-7細胞における、SEQ ID #3208およびSEQ ID #4 LNA-アンチmiRによる、miR-122拮抗作用の評価。HuH-7細胞に、完全マッチmiR-122ターゲット部位を含有するmiR-122ルシフェラーゼセンサーと、異なる濃度の異なるLNA-アンチmiRとを、同時トランスフェクトした。24時間後に細胞を収集し、ルシフェラーゼ活性を測定した。3回の独立した実験についてウミシイタケ/ホタル比の平均を示す（バー＝s.e.m）。これらはすべて、0nM/psiCHECK2（＝対照）に対して標準化されている。 miR-21ルシフェラーゼレポーターコンストラクトの概略図。 ルシフェラーゼレポーターアッセイを使った、PC3細胞における、8マーLNA-アンチmiR（SEQ ID #3205）および15マーLNA-アンチmiR（SEQ ID #3204）による、miR-21拮抗作用の対比評価。PC3細胞に、miR-21用の完全マッチターゲット部位またはミスマッチターゲット部位を含有するルシフェラーゼレポータープラスミドと、異なる濃度のLNA-アンチmiRとを、同時トランスフェクトした。24時間後に細胞を収集し、ルシフェラーゼ活性を測定した。3回の独立した実験の平均値（バー＝s.e.m）を示す。これらのウミシイタケ/ホタル比は、0nM/ターゲット部位を持たない空ベクター（＝対照）に対して標準化されている。miR-21配列ならびにLNA-アンチmiRのデザインおよび位置の概略図も示す。LNAヌクレオチドを楕円で示し、DNA残基をバーで示す。 ルシフェラーゼレポーターアッセイを使った、HeLa細胞における、8マーLNA-アンチmiRによるmiR-21拮抗作用の特異性評価。HeLa細胞に、miR-21用の完全マッチまたはミスマッチターゲット部位を含有するルシフェラーゼレポータープラスミドと、異なる濃度のLNA-アンチmiR（SEQ ID #3205）または8マーLNAミスマッチ対照オリゴ（SEQ ID #3218）とを、同時トランスフェクトした。24時間後に細胞を収集し、ルシフェラーゼ活性を測定した。3回の独立した実験の平均値（バー＝s.e.m）を示す。これらのウミシイタケ/ホタル比は、0nM/ターゲット部位を持たない空ベクター（＝対照）に対して標準化されている。miR-21配列ならびにLNA-アンチmiRのデザインおよび位置の概略図も示す。ミスマッチを塗りつぶした楕円で示す。 miR-21の効果的な拮抗作用を媒介する完全にLNA修飾されたLNA-アンチmiRの、考えうる最も短い長さの評価。HeLa細胞に、miR-21用の完全マッチまたはミスマッチターゲット部位を含有するルシフェラーゼレポータープラスミドと、異なる濃度のLNA-アンチmiR（SEQ ID #3209＝6マーおよびSEQ ID #3210＝7マー）とを、同時トランスフェクトした。24時間後に細胞を収集し、ルシフェラーゼ活性を測定した。3回の独立した実験の平均値（バー＝s.e.m）を示す。これらのウミシイタケ/ホタル比は、0nM/ターゲット部位を持たない空ベクター（＝対照）に対して標準化されている。miR-21配列ならびにLNA-アンチmiRのデザインおよび位置の概略図も示す。 miR-21を拮抗する完全にLNA置換されたLNA-アンチmiRの長さ評価。HeLa細胞に、miR-21用の完全マッチまたはミスマッチターゲット部位を含有するルシフェラーゼレポータープラスミドと、異なる濃度のLNA-アンチmiR（SEQ ID #3211＝9マー、SEQ ID #3212＝10マー、SEQ ID #3213＝12マーおよびSEQ ID #3214＝14マー）とを、同時トランスフェクトした。24時間後に細胞を収集し、ルシフェラーゼ活性を測定した。3回の独立した実験の平均値（バー＝s.e.m）を示す。これらのウミシイタケ/ホタル比は、0nM/ターゲット部位を持たない空ベクター（＝対照）に対して標準化されている。miR-21配列ならびにLNA-アンチmiRのデザインおよび位置の概略図も示す。 miRターゲット認識配列内での、8マーLNA-アンチmiRにとって最適な位置の決定。HeLa細胞に、miR-21用の完全マッチまたはミスマッチターゲット部位を含有するルシフェラーゼレポータープラスミドと、異なる濃度のLNA-アンチmiRとを、同時トランスフェクトした。24時間後に細胞を収集し、ルシフェラーゼ活性を測定した。3回の独立した実験の平均値（バー＝s.e.m）を示す。これらのウミシイタケ/ホタル比は、0nM/ターゲット部位を持たない空ベクター（＝対照）に対して標準化されている。miR-21配列ならびにLNA-アンチmiRのデザインおよび位置の概略図も示す。 8マーSEQ ID #3205 LNA-アンチmiRによるPdcd4-3'-UTRとmiR-21の相互作用の実証。HeLa細胞に、Pdcd4遺伝子の3'UTRの一部を含有するルシフェラーゼレポータープラスミドと、異なる濃度のLNA-アンチmiR（SEQ ID #3205＝8マー、完全マッチ；SEQ ID #3218＝8マー、ミスマッチ；SEQ ID #3204＝15マー、LNA/DNA混成；SEQ ID #3220＝15マー、ギャップマー（gapmer））とを、同時トランスフェクトした。24時間後に細胞を収集し、ルシフェラーゼ活性を測定した。0nMに対して標準化されたウミシイタケ/ホタル比を示す。miR-21配列ならびにLNA-アンチmiRのデザインおよび位置の概略図も示す。 マウスRAW細胞におけるmiR-155の拮抗に関する8マーLNA-アンチmiR（SEQ ID #3207）と15マーLNA-アンチmiR（SEQ ID #3206）との比較。マウスRAW細胞に、miR-155用の完全マッチを含有するルシフェラーゼレポータープラスミドと、異なる濃度の異なるLNA-アンチmiRとを、同時トランスフェクトした。24時間後に細胞を収集し、ルシフェラーゼ活性を測定した。3回の独立した実験の平均値（バー＝s.e.m）を示す。これらのウミシイタケ/ホタル比は、0nM/miR-155ターゲット部位を持たない空ベクター（＝対照）に対して標準化されている。miR-155配列ならびにLNA-アンチmiRのデザインおよび位置の概略図も示す。 マウスRAW細胞における、8マーLNA-アンチmiR（SEQ ID #3207）および15マーLNA-アンチmiR（SEQ ID #3206）による、miR-155拮抗作用に関する機能的読出しとしての、c/EBPβタンパク質レベルの評価。マウスRAW細胞に、miR-155用の完全マッチを含有するルシフェラーゼレポータープラスミドと、異なるLNA-アンチmiRとを、同時トランスフェクトした。20時間後に、細胞を収集し、RAW細胞から得られるタンパク質抽出物のウェスタンブロット解析を行なった。c/EBPβの異なるアイソフォームを示し、c/EBPβ LIPとβ-チューブリンについて算出した比を下に示す。 完全にLNA修飾された8マー（SEQ ID #3221）LNA-アンチmiRまたは15マーミックスマー（mixmer）（SEQ ID #3228）アンチmiRによる、miR-106bの拮抗作用。HeLa細胞に、miR-106b用の完全マッチを含有するルシフェラーゼレポータープラスミドと、異なる濃度の異なるLNA-アンチmiRとを、同時トランスフェクトした。24時間後に細胞を収集し、ルシフェラーゼ活性を測定した。4つのレプリケートの平均値を示す。これらのウミシイタケ/ホタル比は、0nM/miRNAターゲット部位を持たない空ベクター（＝対照）に対して標準化されている。miR-106b配列ならびにLNA-アンチmiRのデザインおよび位置の概略図も示す。 完全にLNA修飾された8マー（SEQ ID #3222）LNA-アンチmiRおよび15マー（SEQ ID #3229）ミックスマーアンチmiRによるmiR-19bの拮抗作用。HeLa細胞に、miR-19a用の完全マッチを含有するルシフェラーゼレポータープラスミドと、異なる濃度の上記2つのLNA-アンチmiRとを、同時トランスフェクトした。24時間後に細胞を収集し、ルシフェラーゼ活性を測定した。4つのレプリケート実験の平均値を示す。これらのウミシイタケ/ホタル比は、0nM/miR-19aターゲット部位を持たない空ベクター（＝対照）に対して標準化されている。miR-19a配列ならびにLNA-アンチmiRのデザインおよび位置の概略図も示す。 成熟ヒトmiR-221およびmiR-222配列を示す概略図。両方のmiRNA配列に保存されているシード（seed）配列（7マー）を枠内に示す。 完全にLNA置換された短いLNA-アンチmiRを使ったマイクロRNAファミリーのターゲティング。PC3細胞に、miR-221用およびmiR-222用のルシフェラーゼレポータープラスミド（個別に、または一緒に）と、さまざまな濃度の異なるLNA-アンチmiRとを、同時トランスフェクトした。LNA-アンチmiR（15マー）SEQ ID #3223（miR-221に対するもの）およびSEQ ID #3224（miR-222に対するもの）を同時トランスフェクトする場合、合計濃度は2nM（各1nM）とし、細胞にSEQ ID #3225（7マー）をトランスフェクトする際は、濃度を0、1、5、10または25nMとした。24時間後に細胞を収集し、ルシフェラーゼ活性を測定した。3回の独立した実験の平均値（バー＝s.e.m）を示す。これらのウミシイタケ/ホタル比は、0nM/miRNAターゲット部位を持たない空ベクター（＝対照）に対して標準化されている。miR-221/222配列ならびにLNA-アンチmiRのデザインおよび位置の概略図も示す。 7マーSEQ ID #3225 LNA-アンチmiRによるmiR-221/222ファミリーの拮抗作用に関する機能的読出し（functional readout）としての、p27タンパク質レベルの評価。PC3細胞に、miR-221とmiR-222の両方をターゲットとする7マーLNA-アンチmiR SEQ ID #3225を、さまざまな濃度でトランスフェクトした。24時間後に細胞を収集し、タンパク質レベルをウェスタンブロットで測定した。p27/チューブリンの比を示す。 ルシフェラーゼレポーターアッセイを使った、HepG2細胞における、8マーLNA-アンチmiR（SEQ ID #3205）ならびに15マーLNA-アンチmiR（SEQ ID #3204）および2つのミスマッチを持つ8マー（SEQ ID #3218）による、miR-21拮抗作用の対比評価。HepG2細胞に、miR-21用の完全マッチターゲット部位を含有するルシフェラーゼレポータープラスミドと、異なる濃度のLNA-アンチmiRとを、同時トランスフェクトした。24時間後に細胞を収集し、ルシフェラーゼ活性を測定した。3回の独立した実験の平均値（バー＝s.e.m）を示す。これらのウミシイタケ/ホタル比は、0nM/ターゲット部位を持たない空ベクター（＝対照）に対して標準化されている。miR-21配列ならびにLNA-アンチmiRのデザインおよび位置の概略図も示す。 8マーSEQ ID #3205 LNA-アンチmiRならびに15マー（SEQ ID #3204）および2つのミスマッチを持つ8マー（SEQ ID #3218）による、Pdcd4 3'UTRとmiR-21の相互作用の実証。Huh-7細胞に、Pdcd4遺伝子の3'UTRの一部を含有するルシフェラーゼレポータープラスミド、プレ-miR-21（10nM）および異なる濃度のLNA-アンチmiRを、同時トランスフェクトした。24時間後に細胞を収集し、ルシフェラーゼ活性を測定した。3回の独立した実験の平均値（バー＝s.e.m）を示す。これらのウミシイタケ/ホタル比は、0nM/ターゲット部位を持たない空ベクター（＝対照）に対して標準化されている。miR-21配列ならびにLNA-アンチmiRのデザインおよび位置の概略図も示す。 SEQ ID #3205によるmiR-21の拮抗作用は、Pdcd4タンパク質レベルのレベルの増加につながる。HeLa細胞に、5nMのLNA-アンチmiR SEQ ID #3205（完全マッチ）、またはSEQ ID #3219のLNAスクランブル（scrambled）（8マー）もしくはSEQ ID #3218（8マーミスマッチ）をトランスフェクトした。細胞を24時間後に収集し、Pdcd4抗体によるウェスタンブロットに付した。 SEQ ID #3205（完全マッチ）またはSEQ ID #3218（ミスマッチ対照）で処置したマウスにおけるALTおよびASTレベル。1日おきに25mg/kgを投与して、14日後に、マウスを屠殺した。 短いLNA-アンチmiR（SEQ ID #3207）によるmiR-155拮抗作用に関する機能的読出しとしてのPU.1タンパク質レベルの評価。THP-1細胞にプレ-miR-155（5nmol）と異なるLNAオリゴヌクレオチド（5nM）とを同時トランスフェクトし、100ng/mlのLPSを加えた。24時間後に細胞を収集し、THP-1細胞から得られるタンパク質抽出物のウェスタンブロット解析を行なった。PU.1およびチューブリンを示す。 7マーSEQ ID #3225 LNA-アンチmiRによる、miR-221/222ファミリーの拮抗作用に関する機能的読出しとしての、p27タンパク質レベルの評価。PC3細胞に、miR-221とmiR-222の両方をターゲットとする7マーLNA-アンチmiR SEQ ID #3225およびLNAスクランブル対照を、5nMおよび25nMでトランスフェクトした。24時間後に細胞を収集し、タンパク質レベルをウェスタンブロットで測定した。p27/チューブリンの比を示す。 7マーSEQ ID #3225（完全マッチ）LNA-アンチmiRによるmiR-221/222のノックダウンは、PC3細胞において、軟寒天でのコロニー形成を減少させる。PC3細胞に、25nMの、miR-221とmiR-222の両方をターゲットとする7マーLNA-アンチmiR SEQ ID #3225 または7マーのスクランブル対照（SEQ ID #3231）をトランスフェクトした。24時間後に細胞を収集し、軟寒天上に播種した。12日後にコロニーを計数した。1回の実験を3重に行なった。 ヒトlet-7ファミリーおよび試験したアンタゴニストの概要。（上）配列は各メンバーについての成熟miRNAを表し、枠は、LNA-アンチmiRによって典型的に拮抗される位置であるヌクレオチド2〜16を表す。右側の欄は、それぞれシード（S：位置2〜8）、拡張シード（extended seed）（ES；位置2〜9）、およびLNA-アンチmiRが典型的にターゲットとする残りの配列（NE；位置9〜16）内での、let-7aと比較したヌクレオチド相違の数を示す。色が反転しているヌクレオチドはlet-7aと比較して異なっている。（下）試験した、let-7ファミリーに対するアンタゴニストの要約であって、デザイン、長さおよび完全に相補的なターゲットに関する情報を含む。化合物はすべて完全にホスホロチオレート化される。 ルシフェラーゼセンサーアッセイを使った、Huh-7細胞における、6つの異なるLNA-アンチmiRによる、let-7拮抗作用の評価。Huh-7細胞に、部分HMGA2 3'UTR（4つのlet-7結合部位を持つ）を含有するルシフェラーゼセンサープラスミドを、let-7a前駆体と共に、またはlet-7a前駆体を伴わずに（それぞれ灰色および黒色のバー）、増加する一連の濃度の6つの異なるLNA-アンチmiRと共に、同時トランスフェクトした。24時間後に細胞を収集し、ルシフェラーゼ活性を測定した。各アッセイについて、二重に測定したウミシイタケ/ホタル比の平均および標準偏差を示す。各LNA-アンチmiR群内では、すべての比が、let-7a前駆体を含有しないウェル（黒色のバー）の平均に対して標準化されている。 HMGA2 3'UTRセンサープラスミド、LNA-アンチmiR SEQ ID #3226（左）およびSEQ ID #3227（右）、ならびにlet-7a（A）、let-7d（B）、let-7e（C）、およびlet-7i（D）のプレ-miRをトランスフェクトしたHuh-7細胞から得られるルシフェラーゼ結果。灰色のバーはプレ-miR投入後のターゲット抑制解除を示し、一方、黒色の対照バーは、プレ-miRを添加しなかった場合の相当するレベルを表す。各比は4重の測定に基づき、各処置群内での前駆体を含有しないウェル（黒色のバー）の平均に対して標準化されている。 HMGA2 3'UTRセンサープラスミドまたは対照ベクターおよびさまざまな濃度のLNA-アンチmiR SEQ ID #3227をトランスフェクトしたHeLa細胞から得られるルシフェラーゼ結果。各比は、無処理（0nM）の空対照ベクター（psi-CHECK-2；灰色のバー）に対して標準化された4重の測定に基づく。 ルシフェラーゼセンサーアッセイを使った、HCT116細胞における、8マー（#3205）による、miR-21拮抗作用の評価。HCT116細胞に、miR-21用の完全マッチターゲット部位を含有するルシフェラーゼセンサープラスミド（灰色のバー）と、異なる濃度のLNA-アンチmiRおよび対照オリゴヌクレオチドとを、同時トランスフェクトした。24時間後に細胞を収集し、ルシフェラーゼ活性を測定した。2つのうち一つの典型例を示す。これらのウミシイタケ/ホタル比は、0nM/空ベクター（＝黒色のバー）に対して標準化されている。 8マー#3205 LNA-アンチmiRによるmiR-21のサイレンシングは、PC3細胞において、軟寒天でのコロニー形成を減少させる。PC3細胞に、25nMの、miR-21をターゲットとする8マーLNA-アンチmiR #3205をトランスフェクトした。24時間後に細胞を収集し、軟寒天上に播種した。12日後にコロニーを計数した。それぞれ3重に行なって、0nM対照（すなわちトランスフェクションは行なうが、LNAなし）に対して標準化した、3回の独立した実験の平均を示す。#3205に関してp＝0.01898。 8マー#3205 LNA-アンチmiRによるmiR-21のノックダウンは、HepG2細胞において、軟寒天でのコロニー形成を減少させる。HepG2細胞に、25nMの、miR-21をターゲットとする8マーLNA-アンチmiR #3205をトランスフェクトした。24時間後に細胞を収集し、軟寒天上に播種した。17日後にコロニーを計数した。1回の実験から得られる3つのレプリケートの平均を示す（バー＝SEM）。 #3205による処理後の浸潤性ヒト前立腺細胞株PC3における創傷閉鎖（wound closure）。（A）3日目に、PC3細胞に、25nMのLNA-アンチmiRおよび対照オリゴヌクレオチド、#3205（8マー、完全マッチ）および#3219（8マー、ミスマッチ）をトランスフェクトし、翌日、引っ掻き傷（scratch）を付けた。移動をモニターするために、24時間後に、写真を撮った。（B）各時点における面積を、ソフトウェアプログラムImage Jで測定し、それぞれの0時間時点に対して標準化した。 miR-155を拮抗する完全にLNA置換されたLNA-アンチmiRの長さ評価。RAW細胞に、miR-155用の完全マッチターゲット部位を含有するルシフェラーゼレポータープラスミドと、異なる濃度のLNA-アンチmiRオリゴヌクレオチドとを、同時トランスフェクトした。24時間後に細胞を収集し、ルシフェラーゼ活性を測定した。3回の独立した実験の平均値（バー＝s.e.m）を示す。これらのウミシイタケ/ホタル比は、0nM/ターゲット部位を持たない空ベクター（＝モック）に対して標準化されている。miR配列ならびにLNA-アンチmiRのデザインおよび位置の概略図も示す。 マウス血漿タンパク質への5'-FAM標識LNA-アンチmiR-21（#3205）の結合。（A）マウス血漿中のオリゴヌクレオチド濃度の関数としての％未結合LNA-アンチmiR-21化合物。（B）マウス血漿中の#3205濃度の関数としての未結合LNA-アンチmiR-21化合物#3205の濃度。 ウェスタンブロット解析によるRasタンパク質レベルの定量。 A．処置（アンチ-let-7；8マー）および無処置（食塩水）の肺および腎臓試料中のRasおよびチューブリン（内部標準）タンパク質を示すゲルイメージ。B．LNA-アンチmiR処置マウス（黒色のバー）の、それぞれ肺および腎臓におけるRasタンパク質レベルの定量（チューブリンをイコールローディングコントロール（equal-loading control）として使用して、食塩水対照（灰色のバー）に対して標準化したもの）。 B．#3205によるmiR-21のサイレンシングは、インビボで、Pdcd4タンパク質レベルのレベルの増加につながる。 C．マウスに食塩水または25mg/kgのLNA-アンチmiR（#3205）を14日間にわたって1日おきに全部で5回注射した。マウスを屠殺し、腎臓からタンパク質を単離し、Pdcd4抗体によるウェスタンブロット解析に付した。A．処置（アンチmiR-21；8マー）対無処置（食塩水）の腎臓試料（M1、マウス1；M2、マウス2）中のPdcd4およびGapdh（内部標準）タンパク質を示すゲルイメージ。B．LNA-アンチmiR処置マウス（暗灰色のバー）の腎臓におけるPdcd4タンパク質レベルの定量（Gapdhをローディングコントロールとして使用して、相当する食塩水対照（明灰色のバー）の平均に対して標準化したもの）。
［発明の詳細な説明］
LNAを組み込んだ短いオリゴヌクレオチドはインビトロ試薬領域では知られている（例えばWO2005/098029およびWO2006/069584参照）。しかし、診断用または試薬用に設計される分子は、インビボ用または薬学用の分子とは、デザインが著しく異なる。例えば、試薬オリゴの末端ヌクレオチドは典型的にはLNAではなくDNAであり、ヌクレオシド間結合は典型的には、本発明のオリゴヌクレオチドで使用される好ましい結合であるホスホロチオエート（phosphorothioate）ではない。したがって本発明は、それ自体、新しい種類のオリゴヌクレオチド（以下、オリゴマーという）を提供する。
下記の実施形態は、医薬組成物に使用することができる本発明のオリゴマーのいくつかの実施形態を表す。オリゴマーに当てはまる諸態様は、連続ヌクレオチド配列にも当てはまり、逆もまた同様である。
（オリゴマー）
本発明のオリゴマーは、LNAなどのヌクレオチド類似体を含み、それがそのオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列の一部または全体を形成している、一本鎖オリゴヌクレオチドである。オリゴマーのヌクレオチド配列は、連続ヌクレオチド配列からなる。
用語「オリゴヌクレオチド」（単に「オリゴ」ともいう）は、用語「オリゴマー」と可換的に使用され、本発明においては、2つ以上のヌクレオチドの共有結合によって形成される分子を指す。本発明のオリゴヌクレオチド（一本鎖オリゴヌクレオチドともいう）に関連して使用される場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は、ある実施形態では、例えば7〜10ヌクレオチド、例えば個別の実施形態においては、7、8、9、または10個のヌクレオチドを持ちうる。
「ヌクレオチド」という用語は、DNAおよびRNAなどのヌクレオチドと、ヌクレオチド類似体を指す。いくつかの態様では、核酸塩基という用語もヌクレオチド（これは天然物でも非天然物でもよい）に言及するために使用される場合があり、この点において、核酸塩基およびヌクレオチドという用語は、本明細書では可換的に使用されうると認識すべきである。
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列が7個のヌクレオチド類似体からなる。いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列が8個のヌクレオチド類似体からなる。いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列が9個のヌクレオチド類似体からなる。
ある実施形態では、オリゴマーのヌクレオチドの少なくとも約50％、例えば少なくとも約55％、例えば少なくとも約60％、または少なくとも約65％もしくは少なくとも約70％、例えば少なくとも約75％、例えば少なくとも約80％、例えば少なくとも約85％、例えば少なくとも約90％、例えば少なくとも約95％、または例えば100％が、ヌクレオチド類似体である。オリゴヌクレオチドが、ヌクレオチド類似体だけからなるヌクレオチド配列から構成されうることも、明白であるだろう。好適には、オリゴマーは、少なくとも1つのLNAモノマー、例えば2、3、4、5、6、7、8、9または10個のLNAモノマーを含みうる。後述のとおり、連続ヌクレオチド配列は、LNA単位（ホスホロチオエート結合などの連結基を含む）だけからなるか、LNA単位とDNA単位、またはLNAと他のヌクレオチド類似体からなることができる。いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列が、1個または2個のDNAヌクレオチドを含み、残りのヌクレオチドはLNA単位などのヌクレオチド類似体である。
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列が、6個のヌクレオチド類似体と1個のDNAヌクレオチドとからなる。いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチドが、7個のヌクレオチド類似体と1個のDNAヌクレオチドとからなる。いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列が、8個のヌクレオチド類似体と1個のDNAヌクレオチドとからなる。いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列が、9個のヌクレオチド類似体と1個のDNAヌクレオチドとからなる。いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列が、7個のヌクレオチド類似体と2個のDNAヌクレオチドとからなる。いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列が、8個のヌクレオチド類似体と2個のDNAヌクレオチドとからなる。
オリゴマーは連続ヌクレオチド配列からなりうる。
特に好ましいある実施形態では、ヌクレオチド類似体がすべてLNAである。さらにもう一つの好ましい実施形態では、オリゴマーのヌクレオチドがすべてLNAである。さらにもう一つの好ましい実施形態では、オリゴマーのヌクレオチドがすべてLNAであり、ヌクレオシド間連結基がすべてホスホチオエート（phosphothioate）である。
本明細書において「含窒素塩基」という用語は、例えばDNA核酸塩基A、C、TおよびG、RNA核酸塩基A、C、UおよびG、ならびに非DNA/RNA核酸塩基、例えば5-メチルシトシン（MeC）、イソシトシン、プソイドイソシトシン、5-ブロモウラシル、5-プロピニルウラシル、5-プロピニル-6-フルオロウラシル、5-メチルチアゾールウラシル、6-アミノプリン、2-アミノプリン、イノシン、2,6-ジアミノプリン、7-プロピン-7-デアザアデニン、7-プロピン-7-デアザグアニンおよび2-クロロ-6-アミノプリン（特にMeC）などのプリン類およびピリミジン類を包含するものとする。非DNA/RNA核酸塩基の実際の選択が、そのオリゴヌクレオチドがターゲットにしようとするマイクロRNA鎖中に存在する、対応する（またはマッチする）ヌクレオチドに依存することは、理解されるだろう。例えば、対応するヌクレオチドがGである場合、通常は、Gに対して水素結合を樹立する能力を持つ非DNA/RNA核酸塩基を選択する必要があるだろう。対応するヌクレオチドがGであるというこの具体例の場合、好ましい非DNA/RNA核酸塩基の典型例はMeCである。
「ある実施形態」という用語は、必ずしも、一つの具体的実施形態を指すだけでなく、「いくつかの実施形態」に存在しうる特徴も、さらには本発明の一般的特徴も、指しうると認識すべきである。同様に、「いくつかの実施形態」という用語は、一つの具体的実施形態の特徴、または実施形態の集合の特徴、さらには本発明の一般的特徴を説明するために用いられる。
「に対応する」（「corresponding to」および「corresponds to」）という用語は、オリゴマーまたは連続ヌクレオチド配列の配列（第1配列）と、i）マイクロRNA核酸ターゲット（例えばSEQ ID 40〜SEQ ID 976から選択されるマイクロRNAターゲット）の逆相補配列の部分配列、および/またはii）本明細書に記載のヌクレオチド配列、例えば配列番号 977〜1913、または配列番号 1914〜2850、または配列番号 2851〜3787からなる群、のいずれかから選択される、もう一つの配列の相当する連続ヌクレオチド配列との比較を指す。ヌクレオチド類似体は、それぞれの相当するまたは対応するヌクレオチドと、直接的に比較される。i）またはii）に記載のもう一つの配列に対応する第1配列は、典型的には、第1配列（例えば連続ヌクレオチド配列）の全長にわたって、その配列と同一である。
本明細書において言及されるヌクレオチド分子の長さに言及する場合、その長さは、モノマー単位の数、すなわちヌクレオチドの数に対応し、それらのモノマー単位がヌクレオチドであるか、ヌクレオチド類似体であるかは問わない。ヌクレオチドまたは核酸塩基に関して、モノマーおよび単位という用語は、本明細書では可換的に使用される。
具体的な値または値域に関して「約」という用語を使用する場合、その開示は、言及されたその具体的な値または範囲を含むと読解すべきである、と理解すべきである。
本明細書にいう「ハイブリダイゼーション」とは、相補的ヌクレオシドまたはヌクレオチド塩基間の水素結合（これは、ワトソン-クリック型、フーグスティーン型、逆フーグスティーン型水素結合などであることができる）を意味する。DNA中によく見いだされる4つの核酸塩基はG、A、TおよびCであり、このうち、GはCと対になり、AはTと対になる。RNAでは、Tがウラシル（U）で置き換えられ、それがAと対になる。標準的二重鎖形成に参加する核酸塩基中の化学基はワトソン-クリック面を構成する。フーグスティーンは、数年後に、プリン核酸塩基（GおよびA）が、そのワトソン-クリック面に加えて、フーグスティーン面を持つことを示した。このフーグスティーン面は、二重鎖の外側から認識されることが可能であり、これを使ってピリミジンオリゴヌクレオチドを水素結合で結合することにより、3重らせん構造が形成される。
本明細書に関して「相補的」とは、2つのヌクレオチド配列間で互いに正確に対形成できることを指す。例えば、あるオリゴヌクレオチドの、ある位置に存在するヌクレオチドが、あるDNAまたはRNA分子の対応する位置に存在するヌクレオチドと水素結合する能力を持つ場合、そのオリゴヌクレオチドとそのDNAまたはRNAとは、その位置において、互いに相補的であるとみなされる。DNAまたはRNA鎖は、安定な複合体の形成が可能になるように、オリゴヌクレオチド中の十分な数のヌクレオチドが、ターゲットDNAまたはRNA中の対応するヌクレオチドと水素結合を形成できる場合に、互いに相補的であるとみなされる。インビトロまたはインビボで安定であるために、オリゴヌクレオチドの配列は、そのターゲットマイクロRNAに対して100％相補的である必要はない。したがって、「相補的」および「特異的にハイブリダイズ可能」という用語は、オリゴヌクレオチドがターゲット分子に十分に強くかつ特異的に結合して、非ターゲットRNAの機能には影響を及ぼすことなく、ターゲットの正常な機能の望ましい妨害をもたらすことを含意する。しかし、好ましい一実施形態では、相補的という用語が、100％相補的または完全に相補的であることを意味するものとする。
ある好ましい実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドが、miRNA配列、例えばヒトマイクロRNA配列、または本明細書で言及するマイクロRNA配列の一つに対して、100％相補的である。
ある好ましい実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドが、ヒトマイクロRNA配列のシード領域に100％相補的な連続配列を含む。
好ましくは、「マイクロRNA」または「miRNA」という用語は、本発明においては、長さが18〜25個のヌクレオチドからなるRNAオリゴヌクレオチドを意味する。機能面では、miRNAは、典型的には、調節機能を持つ内在性RNA分子である。
「ターゲットマイクロRNA」または「ターゲットmiRNA」という用語は、例えば、がんにおける、アップレギュレートされた腫瘍原性miRNAまたは腫瘍抑制性miRNAなど、ヒト疾患において生物学的役割を持ち、それゆえに当該疾患の治療的介入のためのターゲットになるマイクロRNAを指す。
「ターゲット遺伝子」または「ターゲットmRNA」という用語は、マイクロRNAの調節性mRNAターゲットを指し、この場合、前記「ターゲット遺伝子」または「ターゲットmRNA」は、miRNAとそのターゲット部位の間のほぼ完全なまたは完全な相補性に基づき（この場合はターゲットmRNA切断が起こる）、または限定された相補性（これは、多くの場合、いわゆるシード配列（miRNAのヌクレオチド2〜7）とターゲット部位の間の相補性に付与される）に基づき（この場合はターゲットmRNAの翻訳阻害が起こる）、マイクロRNAによって、転写後調節される。
本発明に関して、オリゴヌクレオチドは一本鎖である。これは、そのオリゴヌクレオチドが相補的オリゴヌクレオチドを伴っていない状況、すなわち、そのオリゴヌクレオチドがsiRNAなどの二本鎖オリゴヌクレオチド複合体ではないことを指す。ある実施形態において、本発明の組成物は、5個以上の、例えば6、7、8、9、または10個の、例えば8個以上の連続ヌクレオチドのオリゴマーと相補的な領域を持つ他のオリゴヌクレオチドを含まない。
（長さ）
驚いたことに、本発明者らは、上述の短い「アンチmiR」が、マイクロRNAターゲットに対する顕著な特異性を保ったまま、インビボで、マイクロRNAの、改善された特異的阻害をもたらすことを見いだした。もう一つの利点として、マイクロRNA種の間では相同な短い配列（例えば本明細書で説明するシード領域）が保存されているので、いくつかのマイクロRNAを同時に阻害できることがわかった。本発明によれば、7、8、9、10ヌクレオチド、例えば7、8または9ヌクレオチドの短いオリゴヌクレオチドが、特に有利であることがわかった。
（配列）
連続ヌクレオチド配列は、哺乳動物、ヒトまたはウイルスのマイクロRNA（miRNA）配列、好ましくはヒトまたはウイルスのmiRNA配列の対応する領域に対して、相補的（例えば100％相補的−すなわち完全に相補的）である。
マイクロRNA配列は、好適には、成熟マイクロRNAであることができる。いくつかの実施形態では、マイクロRNAがマイクロRNA前駆体でありうる。
ヒトマイクロRNA配列は、WO2008/046911に開示されている配列番号 1〜558から選択することができ、これらはすべて、参照により具体的に本明細書に組み込まれる。WO2008/046911で述べられているとおり、これらのマイクロRNAは、がんに関連する。
ウイルスのマイクロRNA配列は、いくつかの実施形態では、単純ヘルペスウイルス1、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、エプスタイン・バーウイルスおよびヒトサイトメガロウイルスからなる群より選択することができる。
ある実施形態では、連続ヌクレオチド配列が、表1に列挙するmiRNAの群から選択されるmiRNA配列の対応する領域に対して、相補的（例えば100％相補的）である。表1には、miRBase（リリース12.0−http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/）に公開されたヒトおよびウイルスのマイクロRNAをターゲットとする7マー、8マーおよび9マーオリゴマーが記載されている。
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴマーが、miR-1、miR-10b、miR-17-3p、miR-18、miR-19a、miR-19b、miR-20、miR-21、miR-34a、miR-93、miR-106a、miR-106b、miR-122、miR-133、miR-134、miR-138、miR-155、miR-192、miR-194、miR-221、miR-222、miR-375からなる群より選択される対応するマイクロRNA配列に相補的な連続ヌクレオチド配列からなるか、それら連続ヌクレオチド配列を含みうる。
したがって、ある実施形態では、miRNA（すなわちターゲットmiRNA）が、miR-1、miR-10b、miR-17-3p、miR-18、miR-19a、miR-19b、miR-20、miR-21、miR-34a、miR-93、miR-106a、miR-106b、miR-122、miR-133、miR-134、miR-138、miR-155、miR-192、miR-194、miR-221、miR-222、およびmiR-375からなる群より選択される。
ある実施形態では、miRNAターゲットが、miR 17-92クラスターのメンバー、例えばmiR 17、miR 106a、miR 106b、miR 18、miR 19a、miR 19b/1、miR 19b/2、miR20/93、miR92/1、miR92/2およびmiR25である。
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列が、miR-21、miR-155、miR-221、mir-222、およびmir-122からなる群より選択されるマイクロRNA（miRNA）の対応する領域に相補的である。
いくつかの実施形態では、前記miRNAが、miR-1、miR-10、miR-29、miR-125b、miR-126、miR-133、miR-141、miR-143、miR-200b、miR-206、miR-208、miR-302、miR-372、miR-373、miR-375、およびmiR-520c/eからなる群より選択される。
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列が、miR 17-92クラスター中に存在するマイクロRNA（miRNA）の対応する領域、例えばmiR-17-5p、miR-20a/b、miR-93、miR-106a/b、miR-18a/b、miR-19a/b、miR-25、miR-92a、miR-363からなる群より選択されるマイクロRNAの対応する領域に相補的である。
ある実施形態では、miRNA（すなわちターゲットmiRNA）がmiR-21、例えばhsa-miR-21である。ある実施形態では、miRNA（すなわちターゲットmiRNA）がmiR-122、例えばhsa-miR-122である。ある実施形態では、miRNA（すなわちターゲットmiRNA）がmiR-19b、例えばhsa-miR-19bである。ある実施形態では、miRNA（すなわちターゲットmiRNA）がmiR-155、例えばhsa-miR-155である。ある実施形態では、miRNA（すなわちターゲットmiRNA）がmiR-375、例えばhsa-miR-375である。ある実施形態では、miRNA（すなわちターゲットmiRNA）がmiR-375、例えばhsa-miR-106bである。
好適には、連続ヌクレオチド配列が、マイクロRNAの対応する領域、例えば19b、21、122、155および375からなる群より選択されるhsa-miRの対応する領域に相補的でありうる。
（シード領域およびシードマー（Seedmer））
本発明者らは、ヌクレオチド類似体（例えばロックト核酸（LNA）単位などの高アフィニティーヌクレオチド類似体）を含むか、そのようなヌクレオチド類似体からなる、注意深く設計された短い一本鎖オリゴヌクレオチドが、マイクロRNAの著しいサイレンシングを示し、マイクロRNAレベルの低下をもたらすことを見いだした。ターゲットマイクロRNAのいわゆるシード配列（典型的には5'端から数えてヌクレオチド2〜8または2〜7）に対する前記オリゴヌクレオチドのタイトな結合が重要であることがわかった。ターゲットマイクロRNAのヌクレオチド1は非対形成塩基であり、おそらくAgo2タンパク質中の結合ポケットに隠されるだろう。特定の理論に束縛されることは望まないが、シード領域配列を選択すれば、特にLNAを含むオリゴヌクレオチド、好ましくはシード領域に相補的な領域にLNA単位を含むオリゴヌクレオチドを使用すれば、miRNAとオリゴヌクレオチドの間の二重鎖は、miRNAをターゲットとし、オフターゲット効果を回避し、おそらくは、RISC指向的（RISC directed）miRNA機能を妨げるさらにもう一つの特徴を得るのに、特に有効であると、本発明者らは考える。
本発明者らは、LNA修飾一本鎖オリゴヌクレオチドが、この非対形成ヌクレオチド1に対応する3'端のヌクレオチドを含有しない場合には、マイクロRNAサイレンシングが、さらに強化されることを見いだした。さらに、本発明のオリゴヌクレオチドの3'端にある少なくとも2つのLNA単位が、そのオリゴヌクレオチドに高いヌクレアーゼ耐性を付与することもわかった。
ある実施形態では、オリゴマーの1番目または2番目の3'ヌクレオチドが、マイクロRNA配列の2番目の5'ヌクレオチドに対応し、それはLNAなどのヌクレオチド類似体であることができる。
ある実施形態では、オリゴマーの3'端から計ってオリゴマーのヌクレオチド単位1〜6（両端を含む）が、マイクロRNAシード領域配列に相補的であり、それらはすべて、LNAなどのヌクレオチド類似体であることができる。
ある実施形態では、オリゴマーの3'端から計ってオリゴマーのヌクレオチド単位1〜7（両端を含む）が、マイクロRNAシード領域配列に相補的であり、それらはすべて、LNAなどのヌクレオチド類似体であることができる。
ある実施形態では、オリゴマーの3'端から計ってオリゴマーのヌクレオチド単位2〜7（両端を含む）が、マイクロRNAシード領域配列に相補的であり、それらはすべて、LNAなどのヌクレオチド類似体であることができる。
ある実施形態では、オリゴマーが、少なくとも1つのヌクレオチド類似体単位、例えば少なくとも1つのLNA単位を、miRNAシード領域に相補的な領域内にある位置に含む。オリゴマーは、ある実施形態では、1〜6個または1〜7個のヌクレオチド類似体単位、例えば1〜6個および1〜7個のLNA単位を、miRNAシード領域に相補的な領域内にある位置に含みうる。
ある実施形態では、連続ヌクレオチド配列が、前記マイクロRNAのシード配列に相補的（例えば100％相補的）な配列からなるか、または前記マイクロRNAのシード配列に相補的（例えば100％相補的）な配列を含む。
ある実施形態では、連続ヌクレオチド配列が、表1に列挙するシードマー配列のいずれか一つから選択される配列からなるか、またはそのような配列を含む。
ある実施形態では、シードマーの3'ヌクレオチドが、連続ヌクレオチド配列の最も3'側のヌクレオチドを形成し、ここで、連続ヌクレオチド配列は、場合によっては、1つまたは2つのさらなるヌクレオチドを、シードマー配列の5'側に含んでもよい。
ある実施形態では、オリゴマーが、5'端から数えてマイクロRNA配列中に存在する1番目のヌクレオチドに対応するヌクレオチドを含まない。
ある実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドが、ターゲットマイクロRNAの1番目の5'端ヌクレオチドに対応するヌクレオチドを、3'端に含まない。
（ヌクレオチド類似体）
本発明によれば、7、8、9、10ヌクレオチド、例えば7、8または9ヌクレオチドの短いオリゴヌクレオチドであって、オリゴマーのヌクレオチド単位の少なくとも50％、例えば55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、または例えば100％が（好ましくは高アフィニティー）ヌクレオチド類似体、例えばロックト核酸（LNA）ヌクレオチド単位であるものは、特に有利であることがわかった。
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドが、7、8または9ヌクレオチド長であって、ヒトまたはウイルスのマイクロRNAのシード領域に相補的な連続ヌクレオチド配列を含み、ここでは、ヌクレオチドの少なくとも75％、例えば少なくとも80％、例えば少なくとも85％、例えば少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば100％が、ロックト核酸（LNA）ヌクレオチド単位である。
そのようなオリゴマーにおいて、いくつかの実施形態では、連結基がホスホジエステル結合ではなく、例えばホスホロチオエート結合である。
ある実施形態では、連続ヌクレオチド配列のヌクレオチド単位のすべてがLNAヌクレオチド単位である。
ある実施形態では、連続ヌクレオチド配列が、7、8、9または10個の、好ましくは連続した、LNAヌクレオチド単位を含むか、そのようなLNAヌクレオチド単位からなる。
さらにもう一つの好ましい実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドが7、8または9ヌクレオチド長であり、ヒトまたはウイルスのマイクロRNAのシード領域に相補的な連続ヌクレオチド配列を含み、ここで、ヌクレオチドの少なくとも80％はLNAであり、ヌクレオチド間結合の少なくとも80％、例えば85％、例えば90％、例えば95％、例えば100％はホスホロチオエート結合である。オリゴマー（シードマー）の連続ヌクレオチド配列がシード領域外に及んでもよいことは認識されるだろう。
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドが7ヌクレオチド長であり、それらがすべてLNAである。
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドが8ヌクレオチド長であり、そのうち、LNAでなくてもよいのは、最大1ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドが9ヌクレオチド長であり、そのうち、LNAでなくてもよいのは、最大1または2ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドが10ヌクレオチド長であり、そのうち、LNAでなくてもよいのは、1、2または3ヌクレオチドである。LNA以外のヌクレオチドは、例えばDNAまたは2'置換ヌクレオチド類似体であることができる。
高アフィニティーヌクレオチド類似体は、相当するDNAヌクレオチドの結合アフィニティよりも高い、相補的RNAとの熱的二重鎖安定性を持つオリゴヌクレオチドをもたらす、ヌクレオチド類似体である。これはTmを測定することによって決定することができる。
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列中に存在するヌクレオチド類似体単位が、2'-O-アルキル-RNA単位、2'-OMe-RNA単位、2'-アミノ-DNA単位、2'-フルオロ-DNA単位、LNA単位、PNA単位、HNA単位、INA単位、および2'MOE RNA単位からなる群より、場合によっては独立して、選択される。
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列中に存在するヌクレオチド類似体単位が、2'-O-アルキル-RNA単位、2'-OMe-RNA単位、2'-アミノ-DNA単位、2'-フルオロ-DNA単位、LNA単位、および2'MOE RNA単位からなる群より、場合によっては独立して、選択される。
2'フルオロ-DNAという用語は、2'位にフッ素への置換（2'F）を持つDNA類似体を指す。2'フルオロ-DNAは2'フルオロ-ヌクレオチドの好ましい一形態である。
いくつかの実施形態では、オリゴマーが、少なくとも4個のヌクレオチド類似体単位、例えば少なくとも5個のヌクレオチド類似体単位、例えば少なくとも6個のヌクレオチド類似体単位、例えば少なくとも7個のヌクレオチド類似体単位、例えば少なくとも8個のヌクレオチド類似体単位、例えば少なくとも9個のヌクレオチド類似体単位、例えば10個のヌクレオチド類似体単位を含む。
ある実施形態では、オリゴマーが、少なくとも3個のLNA単位、例えば少なくとも4個のLNA単位、例えば少なくとも5個のLNA単位、例えば少なくとも6個のLNA単位、例えば少なくとも7個のLNA単位、例えば少なくとも8個のLNA単位、例えば少なくとも9個のLNA単位、例えば10個のLNAを含む。
ある実施形態では、LNA単位などのヌクレオチド類似体のうち、少なくとも1個がシトシンまたはグアニン、例えばLNA単位などのヌクレオチド類似体のうち、1〜10個がシトシンまたはグアニン、例えばLNA単位などのヌクレオチド類似体のうち、2、3、4、5、6、7、8、または9個がシトシンまたはグアニンである。
ある実施形態では、LNA単位などのヌクレオチド類似体のうち、少なくとも2個がシトシンまたはグアニンである。ある実施形態では、LNA単位などのヌクレオチド類似体のうち、少なくとも3個がシトシンまたはグアニンである。ある実施形態では、LNA単位などのヌクレオチド類似体のうち、少なくとも4個がシトシンまたはグアニンである。ある実施形態では、LNA単位などのヌクレオチド類似体のうち、少なくとも5個がシトシンまたはグアニンである。ある実施形態では、LNA単位などのヌクレオチド類似体のうち、少なくとも6個がシトシンまたはグアニンである。ある実施形態では、LNA単位などのヌクレオチド類似体のうち、少なくとも7個がシトシンまたはグアニンである。ある実施形態では、LNA単位などのヌクレオチド類似体のうち、少なくとも8個がシトシンまたはグアニンである。
ある好ましい実施形態では、ヌクレオチド類似体が、相補的RNAヌクレオチドに対して、相当するDNAヌクレオチドの前記相補的RNAヌクレオチドへの結合アフィニティーよりも高い、熱的二重鎖安定性を持つ。
ある実施形態では、ヌクレオチド類似体が、一本鎖オリゴヌクレオチドに、強化された血清安定性を付与する。
配列表および表1中の具体的SEQ IDはホスホロチオエート（PS）バックボーンを持つLNAモノマーのオリゴマーを指すが、本発明が、LNAの代替として、またはLNAと組み合わせて、他のヌクレオチド類似体および/または結合の使用も包含することはわかるだろう。したがって、配列表に示すヌクレオチド（塩基）の配列は、LNA/PSなどのLNAの配列であってもよいし、同じ塩基配列（A、T、CまたはG）を保ったまま、代替的なバックボーンケミストリー（例えば糖/結合ケミストリー）を持つオリゴマーであってもよい。
他のヌクレオチド類似体、例えば2'-MOE RNAまたは2'-フルオロヌクレオチドなども、本発明のオリゴマーにおいて有用でありうると予想されるが、オリゴマーは、高い比率の、例えば少なくとも50％の、LNAヌクレオチドを持つことが好ましい。
ヌクレオチド類似体は、DNA類似体、例えば2'-H基が-OH（RNA）以外の置換基で（例えば-O-CH3、-O-CH2-CH2-O-CH3、-O-CH2-CH2-CH2-NH2、-O-CH2-CH2-CH2-OHまたは-Fによる置換で）置換されているDNA類似体であることができる。ヌクレオチド類似体は、RNA類似体、例えばその2'-OH基が、例えば-H（DNA）以外の基（例えば-O-CH3、-O-CH2-CH2-O-CH3、-O-CH2-CH2-CH2-NH2、-O-CH2-CH2-CH2-OHまたは-F）による置換などで、修飾されているRNA類似体であることができる。ある実施形態では、ヌクレオチド類似体が「ENA」である。
（LNA）
本明細書で使用される「LNA単位」「LNAモノマー」「LNA残基」「ロックト(locked)核酸単位」「ロックト核酸モノマー」または「ロックト核酸残基」という用語は、二環式ヌクレオシド類似体を指す。LNA単位は、とりわけ、WO 99/14226、WO 00/56746、WO 00/56748、WO 01/25248、WO 02/28875、WO 03/006475およびWO 03/095467に記載されている。LNA単位はその化学式に関して定義することもできる。例えば、本明細書にいう「LNA単位」は、下記のスキーム1に示す化学構造を持つ。
スキーム１
Figure 2010539959
 ここで、Xは、O、SおよびNRHからなる群より選択され、RHは、HまたはC1-4-アルキルである；Yは、(-CH2)rであり、rは1〜4の整数である；そしてBは含窒素塩基である。
本発明のある好ましい実施形態では、rが1または2、特に1である。すなわち、好ましいLNA単位は、下記のスキーム2に示す化学構造を持つ。
スキーム2
Figure 2010539959
 ここで、XおよびBは上に定義したとおりである。
興味深い一実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドに組み込まれるLNA単位が、チオ-LNA単位、アミノ-LNA単位およびオキシ-LNA単位からなる群より、独立して選択される。
例えば、チオ-LNA単位は、下記のスキーム3に示す化学構造を持ちうる。
スキーム3
Figure 2010539959
 ここで、Bは上に定義したとおりである。好ましくは、チオ-LNA単位はそのβ-D-型である。すなわち、上記3Aに示す構造を持つ。
同様に、アミノ-LNA単位は、下記のスキーム4に示す化学構造を持ちうる。
スキーム4
Figure 2010539959
 ここで、BおよびRHは上に定義したとおりである。好ましくは、アミノ-LNA単位はそのβ-D-型である。すなわち、上記4Aに示す構造を持つ。
オキシ-LNA単位は下記のスキーム5に示す化学構造を持ちうる。
スキーム5
Figure 2010539959
 ここで、Bは上に定義したとおりである。
好ましくは、オキシ-LNA単位は、そのβ-D-型である。すなわち、上記5Aに示す構造を持つ。上に示したとおり、Bは含窒素塩基（天然由来でも非天然由来でもよい）である。含窒素塩基の具体例には、アデニン（A）、シトシン（C）、5-メチルシトシン（MeC）、イソシトシン、プソイドイソシトシン、グアニン（G）、チミン（T）、ウラシル（U）、5-ブロモウラシル、5-プロピニルウラシル、5-プロピニル-6（5-propyny-6）、5-メチルチアゾールウラシル（5-methylthiazoleuracil）、6-アミノプリン、2-アミノプリン、イノシン、2,6-ジアミノプリン、7-プロピン-7-デアザアデニン、7-プロピン-7-デアザグアニンおよび2-クロロ-6-アミノプリンが含まれる。
「チオ-LNA単位」という用語は、スキーム1におけるXがSであるLNA単位を指す。チオ-LNA単位はβ-D型とα-L型の両方をとりうる。一般にチオ-LNA単位のβ-D型が好ましい。チオ-LNA単位のβ-D型およびα-L型をスキーム3にそれぞれ化合物3Aおよび3Bとして示す。
「アミノ-LNA単位」という用語は、スキーム1におけるXがNHまたはNRHであるLNA単位を指し、ここで、RHは水素またはC1-4-アルキルである。アミノ-LNA単位はβ-D型とα-L型の両方をとりうる。一般にアミノ-LNA単位のβ-D型が好ましい。アミノ-LNA単位のβ-D型およびα-L型をスキーム4にそれぞれ化合物4Aおよび4Bとして示す。
「オキシ-LNA単位」という用語は、スキーム1におけるXがOであるLNA単位を指す。オキシ-LNA単位はβ-D型とα-L型の両方をとりうる。一般にオキシ-LNA単位のβ-D型が好ましい。オキシ-LNA単位のβ-D型およびα-L型をスキーム5にそれぞれ化合物5Aおよび5Bとして示す。
本明細書において、「C1-6-アルキル」という用語は、最も長い鎖が1〜6個の炭素原子を持つ線状または分岐飽和炭化水素鎖、例えばメチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチルおよびヘキシルを意味するものとする。分岐炭化水素鎖とは、任意の炭素が炭化水素鎖で置換されたC1-6-アルキルを意味するものとする。
本明細書において、「C1-4-アルキル」という用語は、最も長い鎖が1〜4個の炭素原子を持つ線状または分岐飽和炭化水素鎖、例えばメチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチルおよびtert-ブチルを意味するものとする。分岐炭化水素鎖とは、任意の炭素において炭化水素鎖で置換されているC1-4-アルキルを意味するものとする。
本明細書で使用される「C1-6-アルコキシ」という用語は、C1-6-アルキル-オキシ、例えばメトキシ、エトキシ、n-プロポキシ、イソプロポキシ、n-ブトキシ、イソブトキシ、sec-ブトキシ、tert-ブトキシ、ペントキシ、イソペントキシ、ネオペントキシおよびヘキソキシを意味するものとする。
本明細書において「C2-6-アルケニル」という用語は、2〜6個の炭素原子を持ち、1個以上の二重結合を含む線状または分岐炭化水素基を意味するものとする。C2-6-アルケニル基の説明となる例には、アリル、ホモ-アリル、ビニル、クロチル、ブテニル、ブタジエニル、ペンテニル、ペンタジエニル、ヘキセニルおよびヘキサジエニルが含まれる。不飽和（二重結合）の位置は、炭素鎖上のどの位置にあってもよい。
本発明に関して、「C2-6-アルキニル」という用語は、2〜6個の炭素原子を持ち、1個以上の三重結合を含む線状または分岐炭化水素基を意味するものとする。C2-6-アルキニル基の説明となる例には、アセチレン、プロピニル、ブチニル、ペンチニルおよびヘキシニルが含まれる。不飽和（三重結合）の位置は、炭素鎖上のどの位置にあってもよい。当業者には知られているように、2個以上の結合が不飽和であって、「C2-6-アルキニル」が、ジ-イン（di-yne）またはエンジ-イン（enedi-yne）であることもできる。
本発明に関して、DNA単位を、それに対応するLNA単位で置換するという場合、「対応するLNA単位」という用語は、置き換えられたDNA単位と同じ含窒素塩基を含むLNA単位によって、DNA単位が置き換えられていることを意味し、例えば含窒素塩基Aを含有するDNA単位の対応するLNA単位は、同様に含窒素塩基Aを含有する。例外は、DNA単位が塩基Cを含有する場合に、対応するLNA単位は塩基Cを含有しても塩基MeCを含有してもよく、好ましくはMeCを含有することである。
本明細書において、「非LNA単位」という用語は、LNA単位ではないヌクレオシドを指す。すなわち、「非LNA単位」という用語には、DNA単位ならびにRNA単位が含まれる。好ましい非LNA単位はDNA単位である。
「単位」「残基」および「モノマー」という用語は、本明細書では可換的に使用される。「少なくとも1つの」という用語は、1以上の整数、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20などを包含する。
ヌクレオチド、薬剤（agent）、LNA単位などに関して使用される「ある」および「１つの」という用語は、1つまたはそれ以上を意味するものとする。特に、「…からなる群より選択される構成要素（例えばヌクレオチド、薬剤、LNA単位など）」という表現は、言及された構成要素の1つまたはそれ以上を選択しうることを意味するものとする。したがって、「A、BおよびCからなる群より選択される構成要素」のような表現には、A、BおよびCのあらゆる組合せ、すなわち、A、B、C、A+B、A+C、B+CおよびA+B+Cが含まれるものとする。
（ヌクレオシド間結合）
「ヌクレオシド間連結基」とは、2つのヌクレオチドを一つに共有結合させる能力を持つ基、例えばDNA単位間、DNA単位とヌクレオチド類似体の間、2つの非LNA単位間、非LNA単位とLNA単位の間、および2つのLNA単位間などを共有結合させる能力を持つ基を意味するものとする。その例には、ホスフェート基、ホスホジエステル基およびホスホロチオエート基が含まれる。
いくつかの実施形態では、オリゴマー中のヌクレオシド間結合の少なくとも1つ、例えばすべてが、ホスホジエステルである。しかし、インビボ使用には、ホスホロチオエート結合が好ましいかもしれない。
オリゴヌクレオチド中の典型的なヌクレオシド間連結基はホスフェート基であるが、これらはホスフェートとは異なるヌクレオチシド間連結基で置き換えることができる。本発明のもう一つの興味深い実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、そのヌクレオシド間連結基構造が修飾される。すなわち、修飾オリゴヌクレオチドは、ホスフェートとは異なるヌクレオシド間連結基を含む。したがって、ある好ましい実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドが、ホスフェートとは異なるヌクレオシド間連結基を少なくとも1つは含む。
ホスフェート（-O-P(O)2-O-）とは異なるヌクレオシド間連結基の具体例には、-O-P(O,S)-O-、-O-P(S)2-O-、-S-P(O)2-O-、-S-P(O,S)-O-、-S-P(S)2-O-、-O-P(O)2-S-、-O-P(O,S)-S-、-S-P(O)2-S-、-O-PO(RH)-O-、O-PO(OCH3)-O-、-O-PO(NRH)-O-、-O-PO(OCH2CH2S-R)-O-、-O-PO(BH3)-O-、-O-PO(NHRH)-O-、-O-P(O)2-NRH-、-NRH-P(O)2-O-、-NRH-CO-O-、-NRH-CO-NRH-、-O-CO-O-、-O-CO-NRH-、-NRH-CO-CH2-、-O-CH2-CO-NRH-、-O-CH2-CH2-NRH-、-CO-NRH-CH2-、-CH2-NRH-CO-、-O-CH2-CH2-S-、-S-CH2-CH2-O-、-S-CH2-CH2-S-、-CH2-SO2-CH2-、-CH2-CO-NRH-、-O-CH2-CH2-NRH-CO-、-CH2-NCH3-O-CH2-が含まれ、ここで、RHは水素またはC1-4-アルキルである。
ヌクレオシド間連結基が修飾される場合、ヌクレオシド間連結基は好ましくはホスホロチオエート基（-O-P(O,S)-O-）である。ある好ましい実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドのすべてのヌクレオシド間連結基がホスホロチオエートである。
ヌクレオシド間結合は、-O-P(O)2-O-、-O-P(O,S)-O-、-O-P(S)2-O-、-S-P(O)2-O-、-S-P(O,S)-O-、-S-P(S)2-O-、-O-P(O)2-S-、-O-P(O,S)-S-、-S-P(O)2-S-、-O-PO(RH)-O-、O-PO(OCH3)-O-、-O-PO(NRH)-O-、-O-PO(OCH2CH2S-R)-O-、-O-PO(BH3)-O-、-O-PO(NHRH)-O-、-O-P(O)2-NRH-、-NRH-P(O)2-O-、-NRH-CO-O-、-NRH-CO-NRH-からなる群より選択することができ、かつ/またはヌクレオシド間結合は、-O-CO-O-、-O-CO-NRH-、-NRH-CO-CH2-、-O-CH2-CO-NRH-、-O-CH2-CH2-NRH-、-CO-NRH-CH2-、-CH2-NRH-CO-、-O-CH2-CH2-S-、-S-CH2-CH2-O-、-S-CH2-CH2-S-、-CH2-SO2-CH2-、-CH2-CO-NRH-、-O-CH2-CH2-NRH-CO-、-CH2-NCH3-O-CH2-からなる群より選択することができ、ここで、RHは、水素およびC1-4-アルキルから選択される。好適には、いくつかの実施形態では、上記の硫黄（S）含有ヌクレオシド間結合が好ましいだろう。ヌクレオシド間結合は、独立して選択してもよいし、すべてが同じ、例えばホスホロチオエート結合であってもよい。ある実施形態では、連続ヌクレオチド配列のヌクレオチド単位間に存在するヌクレオシド間結合の少なくとも75％、例えば80％または85％または90％または95％またはすべてが、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
（2つ以上のマイクロRNAをターゲットとするマイクロmir（micromir）オリゴヌクレオチド）
ある実施形態では、連続ヌクレオチド配列が、少なくとも2つのmiRNA配列、例えば2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のmiRNA配列の対応する配列に相補的である。単一のユニバーサル塩基を使用することにより、本発明の単一オリゴマーは、2つの別個のマイクロRNA（その一方または両方が、そのユニバーサルヌクレオチドが配置される位置で、オリゴマーに対応する領域中に単一のミスマッチを持つもの）をターゲットとすることができる。
ある実施形態では、連続ヌクレオチド配列が、少なくとも2つのmiRNAシード領域配列（例えば2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のmiRNAシード領域配列）の配列に相補的である配列からなる、または、それを含む。
ある実施形態では、連続ヌクレオチド配列が、miR-221とmiR-222の両方の対応する領域に相補的である。
ある実施形態では、連続ヌクレオチド配列が、miR-17-92クラスターの2つ以上のメンバー（例えばmiR-17-5p、miR-20a/b、miR-93、miR-106a/bの2つ以上もしくはすべて；またはmiR-25、miR-92aおよびmiR-363の2つ以上もしくはすべて）の対応する領域に相補的である。
ある実施形態では、連続ヌクレオチド配列が、5'GCTACAT3'に相補的な配列からなる、または、それを含む。
（オリゴマーデザイン）
ある実施形態では、3'端から数えて本発明のオリゴマーの1番目のヌクレオチドが、LNA単位などのヌクレオチド類似体である。同じであっても異なってもよい一実施形態では、3'端から数えて本発明のオリゴマーの最後のヌクレオチドが、LNA単位などのヌクレオチド類似体である。
ある実施形態では、3'端から数えて本発明のオリゴマーの2番目のヌクレオチドが、LNA単位などのヌクレオチド類似体である。
ある実施形態では、3'端から数えて本発明のオリゴマーの9番目および/または10番目のヌクレオチドが、LNA単位などのヌクレオチド類似体である。
ある実施形態では、3'端から数えて本発明のオリゴマーの9番目のヌクレオチドが、LNA単位などのヌクレオチド類似体である。
ある実施形態では、3'端から数えて本発明のオリゴマーの10番目のヌクレオチドが、LNA単位などのヌクレオチド類似体である。
ある実施形態では、3'端から計算して本発明のオリゴマーの9番目と10番目のヌクレオチドがどちらも、LNA単位などのヌクレオチド類似体である。
ある実施形態では、本発明のオリゴマーが、3個を超えて連続するDNAヌクレオチド単位の領域を含まない。ある実施形態では、本発明のオリゴマーが、2個を超えて連続するDNAヌクレオチド単位の領域を含まない。
ある実施形態では、オリゴマーが、少なくとも2つの連続するヌクレオチド類似体単位からなる領域、例えば少なくとも2つの連続するLNA単位からなる領域を、少なくとも1つは含む。
ある実施形態では、オリゴマーが、少なくとも3つの連続するヌクレオチド類似体単位からなる領域、例えば少なくとも3つの連続するLNA単位からなる領域を、少なくとも1つは含む。
（オリゴマーにおけるLNAなどのヌクレオチド類似体の他のパターン）
少なくとも6個のLNAを含有するオリゴマー、例えば少なくとも7個のヌクレオチド単位を含有するオリゴマーが好ましいだろうと予想されるが、そのような短いオリゴマーがインビボで極めて効果的にマイクロRNAをターゲットとするという発見は、他のヌクレオチド類似体、例えば高アフィニティーヌクレオチド類似体を含む、短い本発明のオリゴマーを作製するために使用することができる。実際、LNAと他の高アフィニティーヌクレオチド類似体との組合せは、本発明の一部であるとみなされる。
3'端から数えて位置1または2にあるヌクレオチドの修飾。位置1および/または2のヌクレオチドは、ヌクレオチド類似体、例えば高アフィニティーヌクレオチド類似体、例えばLNA、または、2'-O-アルキル-RNA単位、2'-OMe-RNA単位、2'-アミノ-DNA単位、2'-フルオロ-DNA単位、2'-MOE-RNA単位、LNA単位、PNA単位、HNA単位、INA単位からなる群より選択されるヌクレオチド類似体であることができる。したがって、これら2つの3'ヌクレオチドは、Xx、xX、XXまたはxxであることができ、ここで、ある実施形態では、XはLNAであり、xはDNAまたは別のヌクレオチド類似体、例えば2'-O-アルキル-RNA単位、2'-OMe-RNA単位、2'-アミノ-DNA単位、2'-フルオロ-DNA単位、LNA、および2'MOE RNA単位からなる群より選択される2'置換ヌクレオチド類似体である。したがって、前記非LNA単位（x）は、2'MOE RNAまたは2'-フルオロ-DNAであることができる。あるいは、Xはヌクレオチド類似体であり、xはDNAである。
2つの3'末端ヌクレオチドにおける上記の修飾は、後述のように、3'端から数えて位置3〜8にあるヌクレオチドの修飾と組み合わせることができる。この点において、Xおよびxと呼ばれるヌクレオチドは、オリゴマー全体を通して同じであることができる。オリゴマーが7ヌクレオチド長しかない場合は、3'端から数えて8番目のヌクレオチドを捨てるべきであることはわかるだろう。位置3〜8にあるヌクレオチドの修飾に関する下記の実施形態では、LNA単位を、ある実施形態では、他のヌクレオチド類似体、例えば本明細書で言及するもので置き換えることができる。したがって、「X」は、2'-O-アルキル-RNA単位、2'-OMe-RNA単位、2'-アミノ-DNA単位、2'-フルオロ-DNA単位、2'-MOE-RNA単位、LNA単位、PNA単位、HNA単位、INA単位からなる群より選択することができる。「x」は、好ましくは、DNAまたはRNA、最も好ましくはDNAである。しかしXはLNAであることが好ましい。
本発明のある実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドが、3'端から数えて位置3〜8で修飾される。この配列のデザインは、存在する非LNA単位の数または存在するLNA単位の数によって定義することができる。前者の好ましい一実施形態では、3'端から数えて位置3〜8にあるヌクレオチドのうち、少なくとも1つ（例えば1つ）が非LNA単位である。もう一つの実施形態では、3'端から数えて位置3〜8にあるヌクレオチドのうち、少なくとも2つ（例えば2つ）が非LNA単位である。さらにもう一つの実施形態では、3'端から数えて位置3〜8にあるヌクレオチドのうち、少なくとも3つ（例えば3つ）が非LNA単位である。さらにもう一つの実施形態では、3'端から数えて位置3〜8にあるヌクレオチドのうち、少なくとも4つ（例えば4つ）が非LNA単位である。さらにもう一つの実施形態では、3'端から数えて位置3〜8にあるヌクレオチドのうち、少なくとも5つ（例えば5つ）が非LNA単位である。さらにもう一つの実施形態では、3'端から数えて位置3〜8にある6つのヌクレオチドがすべて非LNA単位である。
もう一つの定義では、ある実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、3'端から数えて位置3〜8に、少なくとも3つのLNA単位を含む。本発明のオリゴヌクレチドは、その一実施形態において、3'端から数えて位置3〜8に3つのLNA単位を含む。3'端から数えて位置3〜8にあるヌクレオチド関する置換パターンは、XXXxxx、xXXXxx、xxXXXx、xxxXXX、XXxXxx、XXxxXx、XXxxxX、xXXxXx、xXXxxX、xxXXxX、XxXXxx、XxxXXx、XxxxXX、xXxXXx、xXxxXX、xxXxXX、xXxXxXおよびXxXxXxからなる群より選択することができ、ここで「X」はLNA単位を表し、「x」は非LNA単位を表す。ある好ましい実施形態では、3'端から数えて位置3〜8にあるヌクレオチドに関する置換パターンが、XXxXxx、XXxxXx、XXxxxX、xXXxXx、xXXxxX、xxXXxX、XxXXxx、XxxXXx、XxxxXX、xXxXXx、xXxxXX、xxXxXX、xXxXxXおよびXxXxXxからなる群より選択され、ここで「X」はLNA単位を表し、「x」は非LNA単位を表す。より好ましい一実施形態では、3'端から数えて位置3〜8にあるヌクレオチドに関する置換パターンが、xXXxXx、xXXxxX、xxXXxX、xXxXXx、xXxxXX、xxXxXXおよびxXxXxXからなる群より選択され、ここで「X」はLNA単位を表し、「x」は非LNA単位を表す。ある実施形態では、3'端から数えて位置3〜8にあるヌクレオチドに関する置換パターンが、xXxXxXまたはXxXxXxであり、ここで「X」はLNA単位を表し、「x」は非LNA単位を表す。ある実施形態では、3'端から数えて位置3〜8にあるヌクレオチドに関する置換パターンがxXxXxXであり、ここで「X」はLNA単位を表し、「x」は非LNA単位を表す。
さらにもう一つの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドが、3'端から数えて位置3〜8に少なくとも4つのLNA単位を含む。その一実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、3'端から数えて位置3〜8に4つのLNA単位を含む。3'端から数えて位置3〜8にあるヌクレオチドに関する置換パターンは、xxXXXX、xXxXXX、xXXxXX、xXXXxX、xXXXXx、XxxXXX、XxXxXX、XxXXxX、XxXXXx、XXxxXX、XXxXxX、XXxXXx、XXXxxX、XXXxXxおよびXXXXxxからなる群より選択することができ、ここで「X」はLNA単位を表し、「x」は非LNA単位を表す。
さらにもう一つの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドが3'端から数えて位置3〜8に少なくとも5つのLNA単位を含む。その一実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、3'端から数えて位置3〜8に5つのLNA単位を含む。3'端から数えて位置3〜8にあるヌクレオチドに関する置換パターンは、xXXXXX、XxXXXX、XXxXXX、XXXxXX、XXXXxXおよびXXXXXxからなる群より選択することができ、ここで「X」はLNA単位を表し、「x」は非LNA単位を表す。
好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドは、3'端から数えて位置3〜8に、1つまたは2つのLNA単位を含む。これは、オリゴ：マイクロRNA二重鎖（RNA:RNA二重鎖と似た構造を持つ二重鎖）によって形成されるA-ヘリックスの安定性にとって有利であると考えられる。
さらにもう一つの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドが、3'端から数えて位置3〜8に少なくとも6個のLNA単位を含む。その一実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、3'端から数えて位置3〜8に3〜6個のLNA単位を含むと共に、3'端から数えて位置3〜8の領域において高アフィニティーヌクレオチド類似体（LNA単位を含む）の総量が6になるように、同じ領域に0〜3個の他の高アフィニティーヌクレオチド類似体を含む。
いくつかの実施形態では、例えばXがLNAである場合に、前記非LNA単位（x）が、別のヌクレオチド類似体単位、例えば2'-O-アルキル-RNA単位、2'-OMe-RNA単位、2'-アミノ-DNA単位、2'-フルオロ-DNA単位、LNA、および2'MOE RNA単位からなる群より選択される2'置換ヌクレオチド類似体である。したがって前記非LNA単位（x）は2'MOE RNAまたは2'-フルオロ-DNAであることができる。
9個または10個のヌクレオチドを持つオリゴマーの場合、位置9および/または10にあるヌクレオチドは、ヌクレオチド類似体、例えばLNAなどの高アフィニティーヌクレオチド類似体であるか、2'-O-アルキル-RNA単位、2'-OMe-RNA単位、2'-アミノ-DNA単位、2'-フルオロ-DNA単位、2'-MOE-RNA単位、LNA単位、PNA単位、HNA単位、INA単位からなる群より選択されるヌクレオチド類似体であることができる。したがって、それら2つの5'ヌクレオチドは、Xx、xX、XXまたはxxであることができ、ここで、ある実施形態においては、XはLNAであり、xはDNAまたは別のヌクレオチド類似体、例えば2'-O-アルキル-RNA単位、2'-OMe-RNA単位、2'-アミノ-DNA単位、2'-フルオロ-DNA単位、LNA、および2'MOE RNA単位からなる群より選択される2'置換ヌクレオチド類似体である。したがって、前記非LNA単位（x）は、2'MOE RNAまたは2'-フルオロ-DNAであることができる。あるいは、Xはヌクレオチド類似体であり、xはDNAである。
2つの5'末端ヌクレオチドにおける上記の修飾は、3'端から数えて位置3〜8にあるヌクレオチドおよび/または2つの3'ヌクレオチドの、上述した修飾と組み合わせることができる。これに関して、Xおよびxと呼ばれるヌクレオチドは、オリゴマー全体を通して同じであることができる。
本発明のある好ましい実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、5'端にLNA単位を含有する。もう一つの好ましい実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、5'端から数えて最初の2つの位置にLNA単位を含有する。
ある実施形態では、本発明は、さらに、本発明の医薬組成物に関連して説明するオリゴマー、または生物でインビボ使用するための、例えば医薬用の、オリゴマーであって、前記オリゴマー（または連続ヌクレオチド配列）が、
i）少なくとも1個のホスホロチオエート結合、および/または
ii）少なくとも1個の3'末端LNA単位、および/または
iii）少なくとも1個の5'末端LNA単位
を含むものを提供する。
したがって本オリゴマーは、少なくとも1個のホスホロチオエート結合（例えばすべての結合がホスホロチオエートである）および少なくとも1個の3'末端LNA単位、および少なくとも1個の5'末端LNA単位を含有しうる。
大半の治療用途にとって、オリゴヌクレオチドは完全にホスホロチオレート化されることが好ましい。例外は、ヌクレアーゼが存在しないために、連続するDNA単位間であってもホスホジエステル結合を使用することができ、ホスホロチオエート化（phosphorothioation）が毒性を持ちうる、脳または脊髄などといったCNSで使用するための治療オリゴヌクレオチドである。
本明細書で言及するとおり、本発明のオリゴヌクレオチドのもう一つの態様は、2番目の3'ヌクレオチド、および/または（3'端から）9番目および10番目（存在する場合）も、LNAでありうることである。
ある実施形態では、オリゴマーが、少なくとも5個のヌクレオチド類似体単位、例えば少なくとも5個のLNA単位を、miRNAシード領域に相補的な位置に含む。
ある実施形態では、マイクロRNAシード領域の配列に相補的なオリゴマーのヌクレオチド配列が、(X)xXXXXX、(X)XxXXXX、(X)XXxXXX、(X)XXXxXX、(X)XXXXxXおよび(X)XXXXXxからなる群より選択され、ここで、「X」はヌクレオチド類似体、例えばLNA単位を表し、(X)は、随意のヌクレオチド類似体、例えばLNA単位を表し、「x」はDNAまたはRNAヌクレオチド単位を表す。
ある実施形態では、オリゴマーが6個または7個のヌクレオチド類似体単位、例えば6個または7個のLNA単位を、miRNAシード領域に相補的な位置に含む。
ある実施形態では、マイクロRNAシード領域の配列に相補的なオリゴマーのヌクレオチド配列が、XXXXXX、XxXXXXX、XXxXXXX、XXXxXXX、XXXXxXX、XXXXXxXおよびXXXXXXxからなる群より選択され、ここで、「X」はヌクレオチド類似体、例えばLNA単位、例えばLNA単位を表し、「x」はDNAまたはRNAヌクレオチド単位を表す。
ある実施形態では、オリゴマーの3'端から数えて位置7〜8にある2ヌクレオチドモチーフが、xx、XX、xXおよびXxからなる群より選択され、ここで、「X」はヌクレオチド類似体、例えばLNA単位、例えばLNA単位を表し、「x」はDNAまたはRNAヌクレオチド単位を表す。
ある実施形態では、オリゴマーの3'端から数えて位置7〜8にある2ヌクレオチドモチーフが、XX、xXおよびXxからなる群より選択され、ここで、「X」はヌクレオチド類似体、例えばLNA単位、例えばLNA単位を表し、「x」はDNAまたはRNAヌクレオチド単位を表す。
ある実施形態では、オリゴマーが少なくとも12個のヌクレオチドを含み、オリゴマーの3'端から数えて位置11〜12にある2ヌクレオチドモチーフが、xx、XX、xXおよびXxからなる群より選択される。ここで「X」はヌクレオチド類似体、例えばLNA単位、例えばLNA単位を表し、「x」はDNAまたはRNAヌクレオチド単位を表す。
ある実施形態では、オリゴマーが12個のヌクレオチドを含み、オリゴマーの3'端から数えて位置11〜12にある2ヌクレオチドモチーフが、XX、xXおよびXxからなる群より選択され、ここで「X」はヌクレオチド類似体、例えばLNA単位、例えばLNA単位であり、「x」はDNAまたはRNAヌクレオチド単位、例えばDNA単位である。
ある実施形態では、オリゴマーがヌクレオチド類似体単位、例えばLNA単位を、5'端に含む。
ある実施形態では、ヌクレオチド類似体単位、例えばXが、2'-O-アルキル-RNA単位、2'-OMe-RNA単位、2'-アミノ-DNA単位、2'-フルオロ-DNA単位、2'-MOE-RNA単位、LNA単位、PNA単位、HNA単位、INA単位からなる群より独立して選択される。
ある実施形態では、本発明のオリゴマーのすべてのヌクレオチドがヌクレオチド類似体単位である。
ある実施形態では、ヌクレオチド類似体単位、例えばXが、2'-OMe-RNA単位、2'-フルオロ-DNA単位、およびLNA単位からなる群より独立して選択される。
ある実施形態では、オリゴマーが、前記少なくとも1つのLNA類似体単位と、少なくとも1つの、LNAではないさらなるヌクレオチド類似体単位とを含む。
ある実施形態では、1つまたは複数の非LNAヌクレオチド類似体単位が、2'-OMe RNA単位および2'-フルオロDNA単位から独立して選択される。
ある実施形態では、オリゴマーが少なくとも1つの配列XYXまたはYXYからなり、ここで、XはLNAであり、Yは2'-OMe RNA単位および2'-フルオロDNA単位のどちらかである。
ある実施形態では、オリゴマーのヌクレオチドの配列が、交互するX単位とY単位からなる。
ある実施形態では、オリゴマーが交互するLNA単位とDNA単位（Xx）または（xX）を含む。ある実施形態では、オリゴマーが、交互するLNAとそれに続く2つのDNA単位というモチーフ（Xxx）、xXxまたはxxXを含む。
ある実施形態では、DNAまたは非LNAヌクレオチド類似体単位の少なくとも1つが、上で言及した実施形態のいずれか一つにおいてLNAヌクレオチド単位であると特定された位置から選択された位置において、LNAヌクレオチドで置き換えられる。ある実施形態では「X」がLNA単位を表す。
（本発明のオリゴマーのさらなるデザイン）
下記の表1に、本発明のオリゴヌクレオチドの有利なターゲットとなりうる短いマイクロRNA配列の限定でない例を記載する。
本発明のオリゴヌクレオチド、例えば表1に開示するものは、7、8、9または10LNAヌクレオチドの配列5'-3'LLLLLLL(L)(L)(L)(L)を持つか、次に挙げるモチーフの最初の7、8、9または10ヌクレオチドからなる群より選択されるヌクレオチドの配列を持つことができる：
LdLddL(L)(d)(d)(L)(d)(L)(d)(L)(L)、LdLdLL(L)(d)(d)(L)(L)(L)(d)(L)(L)、LMLMML(L)(M)(M)(L)(M)(L)(M)(L)(L)、LMLMLL(L)(M)(M)(L)(L)(L)(M)(L)(L)、LFLFFL(L)(F)(F)(L)(F)(L)(F)(L)(L)、LFLFLL(L)(F)(F)(L)(L)(L)(F)(L)(L)、3つ周期のデザイン（every third design）、例えばLddLdd(L)(d)(d)(L)(d)(d)(L)(d)(d)(L)(d)、dLddLd(d)(L)(d)(d)(L)(d)(d)(L)(d)(d)(L)、ddLddL(d)(d)(L)(d)(d)(L)(d)(d)(L)(d)(d)、LMMLMM(L)(M)(M)(L)(M)(M)(L)(M)(M)(L)(M)、MLMMLM(M)(L)(M)(M)(L)(M)(M)(L)(M)(M)(L)、MMLMML(M)(M)(L)(M)(M)(L)(M)(M)(L)(M)(M)、LFFLFF(L)(F)(F)(L)(F)(F)(L)(F)(F)(L)(F)、FLFFLF(F)(L)(F)(F)(L)(F)(F)(L)(F)(F)(L)、FFLFFL(F)(F)(L)(F)(F)(L)(F)(F)(L)(F)(F)、およびdLdLdL(d)(L)(d)(L)(d)(L)(d)(L)(d)(L)(d)、ならびに2つ周期のデザイン（every second design）、例えばLdLdLd(L)(d)(L)(d)(L)(d)(L)(d)(L)(d)(L)、MLMLML(M)(L)(M)(L)(M)(L)(M)(L)(M)(L)(M)、LMLMLM(L)(M)(L)(M)(L)(M)(L)(M)(L)(M)(L)、FLFLFL(F)(L)(F)(L)(F)(L)(F)(L)(F)(L)(F)、およびLFLFLF(L)(F)(L)(F)(L)(F)(L)(F)(L)(F)(L)；ここで、L＝LNA単位、d＝DNA単位、M＝2'MOE RNA、F＝2'フルオロであり、括弧内の残基は随意である。
（医薬組成物および医学的応用）
本発明は、本発明のオリゴマーと医薬上許容される希釈剤、担体、塩またはアジュバントとを含む医薬組成物を提供する。
本発明はさらに、マイクロRNAの存在または過剰発現（アップレギュレーション）に関連する疾患または医学的障害を処置するための医薬を製造するための、本発明のオリゴヌクレオチド、例えば医薬組成物の一部を形成しうるものの使用を提供する。
本発明はさらに、マイクロRNAの存在または過剰発現に関連する疾患または医学的障害を処置するための方法であって、本発明の組成物（例えば医薬組成物）を処置を必要とする人に投与するステップを含む方法を提供する。
本発明は、さらに、細胞または生物におけるmiRNAの有効量を減少させるための方法であって、本発明の組成物（例えば医薬組成物）または本発明のオリゴマーをその細胞または生物に投与することを含む方法を提供する。この文脈において、有効量を減少させるとは、その細胞または生物中に存在する機能的miRNAの減少を指す。本発明の好ましいオリゴヌクレオチドは、必ずしも、その細胞または生物におけるmiRNAの実際の量を著しく減少させるとは限らないと理解される。というのも、それらは、典型的には、それぞれのmiRNAターゲットと極めて安定な二重鎖を形成するからである。ある細胞におけるmiRNAの有効量の減少は、ある実施形態では、その細胞におけるmiRNAのターゲットの抑制解除のレベルを検出することによって、測定することができる。
本発明はさらに、ある細胞または生物におけるmiRNAのターゲットmRNAを抑制解除するための方法であって、その細胞または生物に、本発明の組成物（例えば医薬組成物）またはオリゴマーを投与することを含む方法を提供する。
本発明はさらに、マイクロRNAの存在または過剰発現に関連する疾患または医学的障害を処置するための医薬を製造するための、7〜10ヌクレオチド長、例えば7、8、9、または10ヌクレオチド長のオリゴマーの使用を提供する。
ある実施形態では、医学的状態（または疾患）がC型肝炎（HCV）であり、miRNAがmiR-122である。
ある実施形態では、本発明の医薬組成物が、C型肝炎ウイルス感染ならびに高コレステロール血症および関連障害、ならびにがんからなる群より選択される医学的障害または疾患の処置用である。
ある実施形態では、医学的障害または疾患がCNS疾患、例えば1つ以上のマイクロRNAが示されることが知られているCNS疾患である。
高コレステロール血症に関して、関連障害とは、アテローム性動脈硬化または高脂質血症などの疾患を指す。関連疾患のさらなる例には、異なるタイプのHDL/LDLコレステロール不均衡；異常脂質血症、例えば家族性複合型高脂質血症（FCHL）、後天性高脂質血症、スタチン抵抗性高コレステロール血症；冠状動脈疾患（CAD）、冠動脈心疾患（CHD）、アテローム性動脈硬化も含まれる。
ある実施形態では、本発明の医薬組成物がさらに、VLDLアセンブリー経路の阻害剤、例えばApoB阻害剤、またはMTP阻害剤（例えば参照により本明細書に組み込まれるUS 60/977,497に開示されているもの）である、第2の独立した活性成分を含む。
本発明はさらに、マイクロRNAの存在または過剰発現に関連する疾患または医学的障害を処置するための方法であって、処置を必要とする人に、7〜10ヌクレオチド長、例えば7、8、9、または10ヌクレオチド長のオリゴマーを含む組成物（例えば医薬組成物）を投与するステップを含む方法を提供する。
本発明はさらに、ある細胞または生物におけるmiRNAターゲットの有効量（すなわち「利用可能な」miRNA）を減少させるための方法であって、その細胞または生物に、6または7〜10ヌクレオチド長、例えば7、8、9、または10ヌクレオチド長のオリゴマーを含む組成物（例えば医薬組成物）を投与することを含む方法を提供する。
ある細胞または生物における1つ以上のマイクロRNAの「有効量を減少させる」とは、その細胞または生物におけるマイクロRNA機能の阻害を指すと認識すべきである。細胞は好ましくはその1つ以上のマイクロRNAを発現させる哺乳動物細胞またはヒト細胞である。
本発明はさらに、ある細胞または生物におけるmiRNAのターゲットmRNAを抑制解除するための方法であって、その細胞または生物に、7〜10ヌクレオチド長、例えば7、8、9、または10ヌクレオチド長のオリゴマー、または前記オリゴヌクレオチドを含む組成物を投与することを含む方法を提供する。
上述のように、マイクロRNAはいくつかの疾患に関係する。したがって、本発明の第4の態様は、脊髄性筋萎縮症、トゥーレット症候群、C型肝炎、脆弱X精神遅滞、ディジョージ症候群およびがん、例えば限定でない例として、慢性リンパ球性白血病、乳がん、肺がんおよび大腸がんからなる群より選択される、マイクロRNAの発現に関連する疾患、特にがんを処置するための医薬を製造するための、本明細書に記載するオリゴヌクレオチドの使用に関する。
（合成方法）
本発明は、さらに、ヒトマイクロRNAをターゲットとするオリゴマー、例えば本明細書に記載のオリゴマーを合成するための方法であって、
a．場合によっては、3'端から数えて1番目の、LNAヌクレオチドなどのヌクレオチド類似体であるヌクレオチドを選択するステップ、
b．場合によっては、3'端から数えて2番目の、LNAヌクレオチドなどのヌクレオチド類似体であるヌクレオチドを選択するステップ、
c．本明細書に記載するmiRNAシード領域に対応するオリゴマーの領域を選択するステップ、
d．本明細書に記載する7番目および場合によっては8番目のヌクレオチドを選択するステップ、
e．場合によっては、本明細書に記載するとおり、オリゴマーのさらなる5'末端を1個または2個選択するステップ
を含み、合成がステップa〜eに記載の領域の逐次的合成によって行なわれる方法を提供し、ここで、前記合成は、3'-5'（aからf）方向または5'-3'（eからa）方向に行なうことができ、前記オリゴマーはmiRNAターゲットの配列に相補的である。
本発明はさらに、オリゴマー（例えば本発明のオリゴマー）を製造するための方法であって、a）2つ以上のmiRNA配列を比較して、少なくとも7ヌクレオチド長、例えば7、8、9または10ヌクレオチド長の共通する連続ヌクレオチド配列（すなわちどちらの非同一miRNAにも見いだされる配列）を含む、2つ以上のmiRNA配列を同定するステップ、b）前記共通する連続ヌクレオチド配列に相補的な連続ヌクレオチド配列からなる、または、から構成される（consists or comprises of）オリゴマー配列を製造するステップを含み、前記オリゴマーが本発明のオリゴマーである方法を提供する。好ましい一例では、共通する連続ヌクレオチド配列が、前記2つ以上のmiRNA配列（少なくとも6ヌクレオチド長の共通する連続ヌクレオチド配列を含むもの）のシード領域からなる、または、から構成される。ある実施形態では、2つ以上のmiRNAのシード領域が同一である。好適には、オリゴマーが、前記2つ以上のmiRNAに相補的な配列から構成される7または8ヌクレオチド長のシードマー配列からなる、または、から構成される。この方法は、上述した方法のステップcと共に使用することができる。
本発明のオリゴマーを合成するための方法は、標準的な固相オリゴヌクレオチド合成を使って行なうことができる。
ある実施形態では、ヒトマイクロRNAをターゲットとするオリゴマーを合成するための方法が、3'から5'への方向（a−e）に行なわれる。本発明のもう一つの態様は、ターゲットマイクロRNAを本明細書に記載するオリゴヌクレオチドと接触させることによって、そのターゲットマイクロRNAのレベルを減少させるための方法であり、ここで、オリゴヌクレオチドは（i）ターゲットマイクロRNA配列に相補的であり、（ii）3'端に、ターゲットマイクロRNAの1番目の5'端ヌクレオチドに対応するヌクレオチドを持たない。
（二重鎖の安定性およびTm）
ある実施形態において、本発明のオリゴマーは、ホスホジエステルヌクレオシド間結合を持つ相補的一本鎖RNA核酸分子（典型的には前記一本鎖オリゴヌクレオチドとほぼ同じ長さであるもの）と、二重鎖を形成する能力を持ち、ここで、その二重鎖は、30℃〜70℃または80℃、例えば30℃〜60℃もしくは70℃、または30〜50℃もしくは60℃のTmを持つ。ある実施形態では、Tmが少なくとも40℃である。Tmは、オリゴマーと相補的RNAターゲットとのTmを次のバッファー条件で決定することによって決定することができる：100mM NaCl、0.1mM EDTA、10mM Na-ホスフェート、pH 7.0（詳細なプロトコールについては実施例参照）。高アフィニティー類似体は、本発明のオリゴマー中に使用した場合に、DNA塩基だけを含有する同一オリゴマーと比較して、そのオリゴマーのTmを増加させる類似体と定義することができる。
（コンジュゲート）
ある実施形態では、前記オリゴマーが、1つ以上の非ヌクレオチド（またはポリ-ヌクレオチド）化合物とコンジュゲートされる。
この文脈において、「コンジュゲート」という用語は、本明細書に記載するオリゴマーと1つ以上の非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分との共有結合（「コンジュゲーション」）によって形成される不均質な（heterogenous）分子を示すものとする。非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分の例には、高分子剤、例えばタンパク質、脂肪酸鎖、糖残基、糖タンパク質、ポリマー、またはそれらの組合せが含まれる。典型的には、タンパク質として、ターゲットタンパク質に対する抗体が挙げられる。典型的なポリマーとして、ポリエチレングリコールが挙げられる。
したがって、さまざまな実施形態において、本発明のオリゴマーは、典型的にはヌクレオチドの連続配列からなるポリヌクレオチド領域と、さらなる非ヌクレオチド領域との両方を含みうる。連続ヌクレオチド配列からなる本発明のオリゴマーに言及する場合、その化合物は、非ヌクレオチド構成要素、例えばコンジュゲート構成要素を含みうる。
本発明のさまざまな実施形態において、オリゴマー化合物は、例えばオリゴマー化合物の細胞取り込みを増加させるために使用することができるリガンド/コンジュゲートに連結される。WO2007/031091には、適切なリガンドおよびコンジュゲートが記載されており、それらは参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、本明細書に記載する本発明の化合物と、前記化合物に共有結合された少なくとも1つの非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分とを含む、コンジュゲートも提供する。したがって、本発明の化合物が本明細書に開示する指定された核酸またはヌクレオチド配列からなるさまざまな実施形態において、本化合物は、前記化合物に共有結合された少なくとも1つの非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分（例えば1つ以上のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を含まないもの）も含みうる。
（コンジュゲート部分への）コンジュゲーションは、本発明のオリゴマーの活性、細胞分布または細胞取り込みを強化しうる。そのような部分には、抗体、ポリペプチド、脂質部分、例えばコレステロール部分、コール酸、チオエーテル、例えばヘキシル-s-トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えばドデカンジオールまたはウンデシル残基、リン脂質、例えばジ-ヘキサデシル-rac-グリセロールまたはトリエチルアンモニウム1,2-ジ-o-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-h-ホスホネート、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖、アダマンタン酢酸、パルミチル部分、オクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ-カルボニル-オキシコレステロール部分が含まれるが、これらに限るわけではない。
本発明のオリゴマーは、活性薬物、例えばアスピリン、イブプロフェン、サルファ剤、抗糖尿病薬、抗菌剤または抗生物質にコンジュゲートすることもできる。
一定の実施形態では、コンジュゲートされる部分がステロール、例えばコレステロールである。
さまざまな実施形態において、コンジュゲートされる部分は、陽荷電ポリマー、例えば1〜50、例えば2〜20、例えば3〜10アミノ酸残基長の陽荷電ペプチド、および/またはポリアルキレンオキシド、例えばポリエチルグリコール（PEG）またはポリプロピレングリコールなどを含む、または、それからなる−参照により本明細書に組み込まれるWO 2008/034123参照。好適には、陽荷電ポリマー、例えばポリアルキレンオキシドを、本発明のオリゴマーに、リンカー（例えばWO 2008/034123に記載の切り離し可能なリンカー）を介して取付けることができる。
例えば、本発明のコンジュゲートには、以下のコンジュゲート部分を使用することができる。
Figure 2010539959
（活性化オリゴマー）
本明細書で使用する「活性化オリゴマー」という用語は、オリゴマーを1つ以上の、コンジュゲートされる部分（すなわちそれ自身は核酸またはモノマーでない部分）に共有結合して、本明細書に記載のコンジュゲートを形成させることを可能にする、少なくとも1つの官能部分に共有結合（すなわち官能化）された本発明のオリゴマーを指す。典型的には、官能部分は、例えばアデニン塩基の3'-ヒドロキシル基または環外NH2基を介してオリゴマーに共有結合する能力を持つ化学基、好ましくは親水性であるスペーサー、およびコンジュゲートされる部分に結合する能力を持つ末端基（例えばアミノ、スルフヒドリルまたはヒドロキシル基）を含むだろう。いくつかの実施形態では、この末端基が保護されず、例えばNH2基である。別の実施形態では、末端基が、例えば任意の適切な保護基（例えば「Protective Groups in Organic Synthesis」Theodora W Greene and Peter G M Wuts, 第3版（John Wiley & Sons, 1999）に記載されているもの）で保護される。適切なヒドロキシル保護基の例には、酢酸エステルなどのエステル、ベンジル、ジフェニルメチル、またはトリフェニルメチルなどのアラルキル基、およびテトラヒドロピラニルが含まれる。適切なアミノ保護基の例には、ベンジル、α-メチルベンジル、ジフェニルメチル、トリフェニルメチル、ベンジルオキシカルボニル、tert-ブトキシカルボニル、およびアシル基、例えばトリクロロアセチルまたはトリフルオロアセチルが含まれる。いくつかの実施形態では、官能部分が自己切断性である。別の実施形態では、官能部分が生分解性である。例えば参照によりそのまま本明細書に組み込まれる米国特許第7,087,229号参照。
いくつかの実施形態では、コンジュゲートされる部分をオリゴマーの5'端に共有結合することができるように、本発明のオリゴマーが5'端で官能化される。別の実施形態では、本発明のオリゴマーを、3'端で官能化することができる。さらに別の実施形態では、本発明のオリゴマーをバックボーン上で官能化するか、複素環式塩基部分上で官能化することができる。さらに別の実施形態では、5'端、3'端、バックボーンおよび塩基から独立して選択される2箇所以上の位置で、本発明のオリゴマーを官能化することができる。
いくつかの実施形態では、本発明の活性化オリゴマーが、官能部分に共有結合された1つ以上のモノマーを合成時に組み込むことによって合成される。別の実施形態では、本発明の活性化オリゴマーが、官能化されていないモノマーを使って合成され、合成の完了後に、そのオリゴマーが官能化される。いくつかの実施形態では、アミノアルキルリンカー（ここで、アルキル部分は式(CH2)wを持ち、wは1〜10の範囲の整数、好ましくは約6であり、アルキルアミノ基のアルキル部分は直鎖または分岐鎖であることができる）を含有するヒンダードエステルで官能化され、この場合、官能基はオリゴマーにエステル基（-O-C(O)-(CH2)wNH）を介して取付けられる。
別の実施形態では、オリゴマーが、(CH2)w-スルフヒドリル（SH）リンカーを含有するヒンダードエステル（ここで、wは1〜10の範囲の整数、好ましくは約6であり、アルキルアミノ基のアルキル部分は直鎖または分岐鎖であることができる）で官能化され、この場合、官能基は、オリゴマーにエステル基（-O-C(O)-(CH2)wSH）を介して取付けられる。
いくつかの実施形態では、スルフヒドリル活性化オリゴヌクレオチドが、ポリエチレングリコールまたはペプチドなどのポリマー部分と（ジスルフィド結合の形成を介して）コンジュゲートされる。
上述のようにヒンダードエステルを含有する活性化オリゴマーは、当技術分野で知られる任意の方法によって、特に、参照によりそのまま本明細書に組み込まれるPCT公開番号WO 2008/034122とその実施例に開示されている方法によって、合成することができる。
さらに別の実施形態では、米国特許第4,962,029号および同第4,914,210号に実質的に記載されている官能化試薬、すなわち、一端にホスホルアミダイト基を持ち、それが、親水性スペーサー鎖を介して、保護されたまたは保護されていないスルフヒドリル、アミノまたはヒドロキシル基を含む他端に連結されている、実質的に線状の試薬を使って、スルフヒドリル、アミノまたはヒドロキシル基をオリゴマー中に導入することにより、本発明のオリゴマーが官能化される。そのような試薬は、主として、オリゴマーのヒドロキシル基と反応する。いくつかの実施形態では、そのような活性化オリゴマーが、オリゴマーの5'-ヒドロキシル基にカップリングされた官能化試薬を持つ。別の実施形態では、活性化オリゴマーが、3'-ヒドロキシル基にカップリングされた官能化試薬を持つ。さらに別の実施形態では、本発明の活性化オリゴマーが、オリゴマーのバックボーン上のヒドロキシル基にカップリグされた官能化試薬を持つ。さらなる実施形態では、本発明のオリゴマーが、参照により本明細書にそのまま組み込まれる米国特許第4,962,029号および同第4,914,210号に記載されているように、2つ以上の官能化試薬で官能化される。そのような官能化試薬を合成し、それらをモノマーまたはオリゴマーに組み込む方法は、米国特許第4,962,029号および同第4,914,210号に開示されている。
いくつかの実施形態では、固相に結合されたオリゴマーの5'末端をジエチルホスホルアミダイト誘導体で官能化した後、脱保護されたオリゴマーを例えばDiels-Alder付加環化反応によってアミノ酸またはペプチドとコンジュゲートする。
さまざまな実施形態では、2'-糖修飾を持つモノマー、例えば2'-カルバメート置換糖または2'-(O-ペンチル-N-フタルイミド)-デオキシリボース糖をオリゴマーに組み込むことにより、コンジュゲートされる部分をオリゴマーの糖に共有結合させることが容易になる。別の実施形態では、1つ以上のモノマーの2'位にアミノ含有リンカーを持つオリゴマーが、例えば5'-ジメトキシトリチル-2'-O-(e-フタルイミジルアミノペンチル)-2'-デオキシアデノシン-3'-N,N-ジイソプロピル-シアノエトキシホスホルアミダイトなどの試薬を使って製造される。例えばManoharanら, Tetrahedron Letters, 1991, 34, 7171参照。
さらなる実施形態において、本発明のオリゴマーは、ヌクレオチド上、例えばN6プリンアミノ基上、グアニンの環外N2上、シトシンのN4または5位上に、アミン含有官能部分を持ちうる。さまざまな実施形態において、そのような官能化は、既に官能化されている市販の試薬をオリゴマー合成で使用することによって達成することができる。
いくつかの官能部分は市販されており、例えばヘテロ二官能性およびホモ二官能性連結部分は、Pierce Co.（イリノイ州ロックフォード）から入手することができる。他の市販連結基に、5'-Amino-Modifier C6および3'-Amino-Modifier試薬があり、これらはどちらもGlen Research Corporation（バージニア州スターリング）から入手できる。5'-Amino-Modifier C6は、ABI（Applied Biosystems Inc.、カリフォルニア州フォスターシティ）からAminolink-2として入手することもでき、3'-Amino-Modifierは、Clontech Laboratories Inc.（カリフォルニア州パロアルト）からも入手することができる。
（治療および医薬組成物−製剤および投与）
最初に説明したように、本発明のオリゴヌクレオチドは、改善された特性を持つ適切な薬を構成するだろう。強力で安全な薬の設計には、アフィニティ/特異性、生物学的液体における安定性、細胞取り込み、作用様式、薬物動態特性および毒性など、さまざまなパラメータの微調整が必要である。
したがって、さらにもう一つの態様において、本発明は、本発明のオリゴヌクレオチドと医薬上許容される希釈剤、担体またはアジュバントとを含む医薬組成物に関する。好ましくは、前記担体は食塩水または緩衝食塩水である。
さらにもう一つの態様において、本発明は、医薬として使用するための本発明のオリゴヌクレオチドに関する。
理解されるであろうが、投薬は、処置されるべき疾患状態の重症度および応答性に依存し、一連の処置は、数日から数ヶ月、または治癒が達成されるまで、もしくは疾患状態の減退が達成されるまで続けられる。最適な投薬スケジュールは、患者の身体における薬蓄積の測定から算出することができる。最適な投薬量は、個々のオリゴヌクレオチドの相対的力価に依存して変動しうる。これは、一般的には、インビトロおよびインビボ動物モデルで有効であることがわかったEC50に基づいて、見積ることができる。一般的に、投薬量は、体重1kgあたり0.01μg〜1gであり、1日、1週間、1ヶ月または1年に1回以上投与するか、2〜10年ごとに1回投与するか、数時間〜数ヶ月間にわたる持続注入によって投与することができる。投薬の反復率は、体液または組織におけるその薬の測定された滞留時間および濃度に基づいて見積ることができる。処置が成功した後、疾患状態の再発を防ぐために、患者は維持療法を受けることが望ましいかもしれない。
上述のように、本発明は、少なくとも1つの本発明のオリゴヌクレオチドを活性成分として含む医薬組成物にも関係する。本発明の医薬組成物が、場合によっては、医薬担体を含むこと、および本医薬組成物が、場合によっては、化学療法用化合物、抗炎症化合物、抗ウイルス化合物および/または免疫調整化合物などのさらなる化合物を含むことを理解すべきである。
本発明のオリゴヌクレオチドは「そのまま」使用するか、さまざまな医薬上許容される塩の形態で使用することができる。本明細書で使用する「医薬上許容される塩」という用語は、本明細書で特定するオリゴヌクレオチドの望ましい生物学的活性を保っていて、望ましくない毒性効果はごくわずかしか示さない塩を指す。そのような塩の限定でない例は有機アミノ酸で形成させることができ、また、例えば亜鉛、カルシウム、ビスマス、バリウム、マグネシウム、アルミニウム、銅、コバルト、ニッケル、カドミウム、ナトリウム、カリウムなどの金属カチオン、またはアンモニア、N,N-ジベンジルエチレン-ジアミン、D-グルコサミン、テトラエチルアンモニウム、もしくはエチレンジアミンから形成されるカチオンを使って形成される塩基付加塩であることができる。
本発明のある実施形態では、オリゴヌクレオチドが、プロドラッグの形態をとりうる。オリゴヌクレオチドは、本質的に陰性荷電イオンである。細胞膜の親油性ゆえに、オリゴヌクレオチドの細胞取り込みは、相当する中性または親水性の物質と比較すると低下する。この極性「障害（hindrance）」は、プロドラッグアプローチを使って回避することができる（例えばCrooke, R. M. (1998) in Crooke, S. T.「Antisense research and Application」Springer-Verlag、ドイツ・ベルリン、vol. 131, pp. 103-140を参照されたい）。
医薬上許容される結合剤およびアジュバントは、製剤された薬の一部を構成しうる。
本明細書に記載する治療剤を送達するための送達方法の例、ならびに医薬製剤、塩の詳細は、どこか他に、例えば参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第60/838,710号および同第60/788,995号、ならびにやはり参照により本明細書に組み込まれるデンマーク出願PA 2006 00615に詳しく記載されるだろう。
本発明の医薬組成物には、溶液剤、乳剤、およびリポソーム含有製剤が含まれるが、これらに限るわけではない。これらの組成物は、既製の液体、自己乳化性固体、および自己乳化性半固体を含む（ただしこれらに限るわけではない）、さまざまな構成要素から調製することができる。腫瘍組織への薬の送達は、カチオン性リポソーム、シクロデキストリン、ポルフィリン誘導体、分岐鎖デンドリマー、ポリエチレンイミンポリマー、ナノ粒子およびマイクロスフェアを含む（ただしこれらに限るわけではない）担体を介した送達によって強化されうる（Dass CR. J Pharm Pharmacol 2002; 54(1):3-27）。本発明の医薬組成物は、単位剤形で好都合に提示することができ、医薬産業においてよく知られる従来の技法に従って製造することができる。そのような技法には、活性成分を医薬担体または賦形剤と混合するステップが含まれる。一般に、製剤は、活性成分を液状担体もしくは微細な固形担体またはその両方と均一かつ緊密に混合した後、必要であれば、その生成物を付形することによって製造される。本発明の組成物は、例えば限定するわけではないが、錠剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、液状シロップ剤、ソフトゲル剤および坐剤など、数多くの考えうる剤形のどれにでも製剤することができる。本発明の組成物は、水性、非水性または混合溶媒中の懸濁剤として製剤することもできる。水性懸濁剤は、その懸濁液の粘度を増加させる物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび/またはデキストランなどをさらに含有しうる。懸濁剤は安定剤も含有しうる。本発明の化合物は、活性薬物、例えばアスピリン、イブプロフェン、サルファ剤、抗糖尿病薬、抗細菌剤または抗生物質にコンジュゲートすることもできる。
もう一つの実施形態では、本発明の組成物が、第1のマイクロRNAにターゲティングされる1つ以上のオリゴヌクレオチド化合物と、第2のマイクロRNAターゲットにターゲティングされる1つ以上の追加オリゴヌクレオチド化合物とを含有しうる。2つ以上の組み合わされた化合物は、一緒にまたは逐次的に使用することができる。
本明細書に開示する化合物は、上に示したとおり、いくつかの治療的応用に役立つ。一般に、本発明の治療方法には、哺乳動物、特にヒトへの、治療有効量のオリゴヌクレオチドの投与が含まれる。ある特定の実施形態において、本発明は（a）1つ以上の本発明の化合物と（b）1つ以上の化学療法剤とを含有する医薬組成物を提供する。本発明の化合物と共に使用する場合、そのような化学療法剤は、個別に、逐次的に、または1つ以上の他の同様の化学療法剤と組み合わせて、または放射線療法と組み合わせて使用することができる。当業者に知られている化学療法剤はすべて、本発明の化合物との併用処置として、ここに組み込まれる。他の活性剤、例えば抗炎症薬（非ステロイド系抗炎症薬およびコルチコステロイドを含むが、これらに限るわけではない）、抗ウイルス薬、および免疫調整薬も、本発明の組成物で組み合わせることができる。2つ以上の組み合わされた化合物は、一緒にまたは逐次的に使用することができる。
本発明の医薬組成物で処置しうる治療的適応の例を以下に挙げる。
Figure 2010539959
腫瘍抑制遺伝子トロポミオシン（tropomysin）1（TPM1）mRNAは、miR-21のターゲットであることが示されている。ミオトロフィン（mtpn）mRNAはmiR 375のターゲットであることが示されている。
さらなる一態様において、本発明は、アテローム性動脈硬化、高コレステロール血症および高脂質血症；がん、膠芽腫、乳がん、リンパ腫、肺がん；糖尿病、代謝障害；筋芽細胞分化；免疫障害からなる群より選択される疾患を処置するための医薬を製造するための、本発明のオリゴヌクレオチドの使用に関する。
本発明はさらに、アテローム性動脈硬化、高コレステロール血症および高脂質血症；がん、膠芽腫、乳がん、リンパ腫、肺がん；糖尿病、代謝障害；筋芽細胞分化；免疫障害からなる群より選択される疾患の処置に使用するための、本発明のオリゴヌクレオチドに向けられる。
本発明は、アテローム性動脈硬化、高コレステロール血症および高脂質血症；がん、膠芽腫、乳がん、リンパ腫、肺がん；糖尿病、代謝障害；筋芽細胞分化；免疫障害からなる群より選択される疾患または状態を患っている対象を処置する方法であって、その必要がある対象に、本発明のオリゴヌクレオチドまたは医薬組成物を投与するステップを含む方法を提供する。
本発明はさらに、本発明の医薬組成物と、VLDLアセンブリー経路の阻害剤、例えばApoB阻害剤、またはMTP阻害剤である第2の独立した活性成分とを含むキットを提供する。
（がん）
さらにもう一つの態様において、本発明は、がんを処置するための医薬を製造するための、本発明のオリゴヌクレオチドの使用に関する。もう一つの態様において、本発明は、がんを処置または予防するための方法であって、本発明のオリゴヌクレオチドまたは本発明の医薬組成物を、その必要がある患者に投与することを含む方法に関する。
そのようながんには、リンパ細網性新生物、リンパ芽球性白血病、脳腫瘍、胃腫瘍、形質細胞腫、多発性骨髄腫、白血病、結合組織腫瘍、リンパ腫、および固形腫瘍を含めることができる。
がんを処置するための医薬を製造するための、本発明の化合物の使用において、そのがんは、好適には、固形腫瘍の形態をとりうる。同様に、本明細書に開示するがんを処置するための方法では、そのがんが、好適には、固形腫瘍の形態をとりうる。
さらにまた、前記がんは、好適には、癌である。癌は、典型的には、悪性黒色腫、基底細胞癌、卵巣癌、乳癌、非小細胞肺がん、腎細胞癌、膀胱癌、再発表在性膀胱がん、胃癌、前立腺癌、膵癌、肺癌、子宮頸癌、子宮頚部異形成、咽頭乳頭腫症、大腸癌、結腸直腸癌およびカルチノイド腫瘍からなる群より選択される。より典型的には、前記癌は、悪性黒色腫、非小細胞肺がん、乳癌、大腸癌および腎細胞癌からなる群より選択される。悪性黒色腫は、典型的には、表在性拡大型黒色腫、結節型黒色腫、悪性黒子型黒色腫、肢端黒色腫、メラニン欠乏性黒色腫および線維形成性黒色腫からなる群より選択される。
あるいは、がんは、好適には、肉腫であることもできる。肉腫は、典型的には、骨肉腫、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、悪性線維性組織球腫、線維肉腫およびカポジ肉腫からなる群より選択される形態をとる。
あるいは、がんは、好適には、神経膠腫であることもできる。
さらにもう一つの実施形態は、がんを処置するための医薬を製造するための、本発明のオリゴヌクレオチドの使用であって、前記医薬がさらに、副腎皮質ステロイド、例えばプレドニゾン、デキサメタゾンまたはデカドロン；アルトレタミン（ヘキサレン、ヘキサメチルメラミン（HMM））；アミフォスチン（エチオール）；アミノグルテチミド（シタドレン）；アムサクリン（M-AMSA）；アナストロゾール（アリミデックス）；アンドロゲン、例えばテストステロン；アスパラギナーゼ（エルスパー（elspar））；カルメット-ゲラン菌；ビカルタミド（カソデックス）；ブレオマイシン（ブレノキサン）；ブスルファン（ミレラン）；カルボプラチン（パラプラチン）；カルムスチン（BCNU、BiCNU）；クロラムブシル（リューケラン（leukeran））；クロロデオキシアデノシン（2-CDA、クラドリビン、ロイスタチン）；シスプラチン（プラチノール）；シトシンアラビノシド（シタラビン）；ダカルバジン（DTIC）；ダクチノマイシン（アクチノマイシン-D、コスメゲン）；ダウノルビシン（セルビジン（cerubidine））；ドセタキセル（タキソテール）；ドキソルビシン（アドリアマイシン（adriomycin））；エピルビシン；エストラムスチン（エムサイト（emcyt））；エストロゲン、例えばジエチルスチルベストロール（DES）；エトポシド（etopside）（VP-16、VePesid、エトポホス）；フルダラビン（フルダラ）；フルタミド（ユーレキシン（eulexin））；5-FUDR（フロクスウリジン）；5-フルオロウラシル（5-FU）；ゲムシタビン（ジェムザール）；ゴセレリン（ゾダレックス（zodalex））；ハーセプチン（トラスツズマブ）；ヒドロキシ尿素（ハイドレア）；イダルビシン（イダマイシン）；イホスファミド；IL-2（プロリューキン、アルデスロイキン）；インターフェロン・アルファ（イントロンA、ロフェロンA）；イリノテカン（カンプトサール）；ロイプロリド（ルプロン）；レバミソール（エルガミゾール（ergamisole））；ロムスチン（CCNU）；メクロレタミン（mechlorathamine）（マスタージェン（mustargen）、ナイトロジェンマスタード）；メルファラン（アルケラン）；メルカプトプリン（プリネトール、6-MP）；メトトレキサート（メキセート）；マイトマイシン-C（ムタマイシン（mutamucin））；ミトキサントロン（ノバントロン）；オクトレオチド（サンドスタチン）；ペントスタチン（2-デオキシコホルマイシン、ニペント）；プリカマイシン（ミトラマイシン、ミトラシン）；プロカルバジン（prorocarbazine）（マチュレン（matulane））；ストレプトゾシン；タモキシフェン（ノルバデックス）；タキソール（パクリタキセル）；テニポシド（ビュウモン、VM-26）；チオテパ；トポテカン（ハイカムチン）；トレチノイン（ベサノイド、全トランス型レチノイン酸）；ビンブラスチン（バルバン）；ビンクリスチン（オンコビン）およびビノレルビン（ナベルビン）からなる群より選択される化学療法剤を含むものに向けられる。好適には、さらなる化学療法剤が、タキサン類、例えばタキソール、パクリタキセルまたはドセタキセルから選択される。
同様に、本発明はさらに、がんを処置するための医薬を製造するための、本発明のオリゴヌクレオチドの使用であって、前記処置が、副腎皮質ステロイド、例えばプレドニゾン、デキサメタゾンまたはデカドロン；アルトレタミン（ヘキサレン、ヘキサメチルメラミン（HMM））；アミフォスチン（エチオール）；アミノグルテチミド（シタドレン）；アムサクリン（M-AMSA）；アナストロゾール（アリミデックス）；アンドロゲン、例えばテストステロン；アスパラギナーゼ（エルスパー）；カルメット-ゲラン菌；ビカルタミド（カソデックス）；ブレオマイシン（ブレノキサン）；ブスルファン（ミレラン）；カルボプラチン（パラプラチン）；カルムスチン（BCNU、BiCNU）；クロラムブシル（リューケラン）；クロロデオキシアデノシン（2-CDA、クラドリビン、ロイスタチン）；シスプラチン（プラチノール）；シトシンアラビノシド（シタラビン）；ダカルバジン（DTIC）；ダクチノマイシン（アクチノマイシン-D、コスメゲン）；ダウノルビシン（セルビジン）；ドセタキセル（タキソテール）；ドキソルビシン（アドリアマイシン）；エピルビシン；エストラムスチン（エムサイト）；エストロゲン、例えばジエチルスチルベストロール（DES）；エトポシド（VP-16、VePesid、エトポホス）；フルダラビン（フルダラ）；フルタミド（ユーレキシン）；5-FUDR（フロクスウリジン）；5-フルオロウラシル（5-FU）；ゲムシタビン（ジェムザール）；ゴセレリン（ゾダレックス）；ハーセプチン（トラスツズマブ）；ヒドロキシ尿素（ハイドレア）；イダルビシン（イダマイシン）；イホスファミド；IL-2（プロリューキン、アルデスロイキン）；インターフェロン・アルファ（イントロンA、ロフェロンA）；イリノテカン（カンプトサール）；ロイプロリド（ルプロン）；レバミソール（エルガミゾール）；ロムスチン（CCNU）；メクロレタミン（マスタージェン、ナイトロジェンマスタード）；メルファラン（アルケラン）；メルカプトプリン（プリネトール、6-MP）；メトトレキサート（メキセート）；マイトマイシン-C（ムタマイシン）；ミトキサントロン（ノバントロン）；オクトレオチド（サンドスタチン）；ペントスタチン（2-デオキシコホルマイシン、ニペント）；プリカマイシン（ミトラマイシン、ミトラシン）；プロカルバジン（マチュレン）；ストレプトゾシン；タモキシフェン（ノルバデックス）；タキソール（パクリタキセル）；テニポシド（ビュウモン、VM-26）；チオテパ；トポテカン（ハイカムチン）；トレチノイン（ベサノイド、全トランス型レチノイン酸）；ビンブラスチン（バルバン）；ビンクリスチン（オンコビン）およびビノレルビン（ナベルビン）からなる群より選択されるさらなる化学療法剤の投与を、さらに含むものに向けられる。好適には、前記処置は、タキサン類、例えばタキソール、パクリタキセルまたはドセタキセルから選択されるさらなる化学療法剤の投与を、さらに含む。
言い換えると、本発明はさらに、癌を処置するための方法であって、本発明のオリゴヌクレオチドまたは本発明の医薬組成物をその必要がある患者に投与することを含み、さらなる化学療法剤の投与も含む方法に向けられる。前記さらなる投与は、さらなる化学療法剤が、本発明の化合物にコンジュゲートされるか、本医薬組成物中に存在するか、または別個の製剤として投与されるような投与であることができる。
（感染性疾患）
本発明の化合物は、広範囲にわたる感染性疾患、例えばジフテリア、破傷風、百日咳、ポリオ、B型肝炎、C型肝炎、インフルエンザ菌（hemophilus influenza）、麻疹、ムンプス、および風疹に、広く適用可能であるだろう。
hsa-miR122はC型肝炎感染において示されるので、miR-122をターゲットとする本発明のオリゴヌクレオチドはC型肝炎感染を処置するために使用することができる。
したがって、さらにもう一つの態様において、本発明は、感染性疾患を処置するための医薬を製造するための、本発明のオリゴヌクレオチドの使用に関すると共に、感染性疾患を処置するための方法であって、本発明のオリゴヌクレオチドまたは本発明の医薬組成物をその必要がある患者に投与することを含む方法に関する。
ある好ましい実施形態において、本発明は、抗miR-122オリゴマーをVLDLアセンブリーの阻害剤、例えばapoBまたはMTPの阻害剤と組み合わせて投与する併用処置を提供する。
（炎症性疾患）
炎症応答は、感染性因子の攻撃に対する生物の基本的防御機構であり、自己免疫障害を含む多くの急性および慢性疾患の病理発生にも関連づけられている。病原体と闘うことが必要とされているにもかかわらず、炎症バースト(inflammatory burst）の効果は壊滅的になる場合がある。したがって、抗炎症薬の使用により炎症の総体的症状を制限することがしばしば必要になる。炎症は、通常は組織損傷によってトリガーされる、複雑なプロセスであり、このプロセスには、数多くの一連の酵素の活性化、血管透過性の増大および血液（blood fluids）の血管外遊出、細胞移動および化学伝達物質の放出が含まれ、これらはすべて、損傷した組織の破壊と修復の両方を目的としている。
さらにもう一つの態様において、本発明は、炎症性疾患を処置するための医薬を製造するための、本発明のオリゴヌクレオチドの使用に関すると共に、炎症性疾患を処置するための方法であって、本発明のオリゴヌクレオチドまたは本発明の医薬組成物をその必要がある患者に投与することを含む方法に関する。
本発明の好ましい一実施態様では、炎症性疾患が、リウマチ疾患および/または結合組織疾患、例えば慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（SLE）もしくは狼蒼、強皮症、多発性筋炎、炎症性腸疾患、皮膚筋炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、血管炎、乾癬性関節炎、剥脱性乾癬性皮膚炎、尋常性天疱瘡およびシェーグレン症候群、特に炎症性腸疾患およびクローン病である。
あるいは、炎症性疾患は、滑液包炎、滑膜炎、被膜炎、腱炎、および/または外傷性および/またはスポーツ性（sportive）の他の炎症性病変のような、非リウマチ性炎症であってもよい。
（代謝性疾患）
代謝性疾患は、体内で自然に産生される化学物質の蓄積によって引き起こされる障害である。これらの疾患は、通常、深刻であり、生死に関わるものさえある。他にも、身体発育を遅らせたり、精神遅滞を引き起こすものがある。これらの障害を持つ乳幼児の大半は、最初は、明白な疾患の徴候を示さない。これらの問題は、多くの場合、適正な出生時スクリーニングによって発見することができる。早期診断および早期処置によって、代謝性疾患は効果的に管理できることが多い。
さらにもう一つの態様において、本発明は、代謝性疾患を処置するための医薬を製造するための、本発明のオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲートの使用に関すると共に、代謝性疾患を処置するための方法であって、本発明のオリゴヌクレオチドもしくはそのコンジュゲートまたは本発明の医薬組成物をその必要がある患者に投与することを含む方法に関する。
本発明の好ましい一実施形態では、代謝性疾患が、アミロイドーシス、ビオチニダーゼ、OMIM（Online Mendelian Inheritance in Man）、クリグラー-ナジャー症候群、糖尿病、ファブリ病支援情報グループ（Fabry Support & Information Group）、脂肪酸酸化障害、ガラクトース血症、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ（G6PD）欠損症、グルタル酸尿症、国際グルタル酸血症機構（International Organization of Glutaric Acidemia）、グルタル酸血症I型、グルタル酸血症II型、グルタル酸血症I型、グルタル酸血症II型、F-HYPDRR−家族性低リン酸血症、ビタミンD抵抗性くる病、クラッベ病、長鎖3-ヒドロキシアシルCoAデヒドロゲナーゼ欠損症（LCHAD）、マンノシドーシス群、メープルシロップ尿症、ミトコンドリア障害、ムコ多糖症候群：ニーマンピック病、有機酸血症、PKU、ポンペ病、ポルフィリン症、メタボリック症候群、高脂質血症および遺伝性脂質障害、トリメチルアミン尿症：漁臭症候群、および尿素回路障害からなる群より選択される。
（肝臓障害）
さらにもう一つの態様において、本発明は、肝臓障害を処置するための医薬を製造するための、本発明のオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲートの使用に関すると共に、肝臓障害を処置するための方法であって、本発明のオリゴヌクレオチドもしくはそのコンジュゲート、または本発明の医薬組成物をその必要がある患者に投与することを含む方法に関する。
本発明の好ましい一実施形態では、肝臓障害が、胆道閉鎖症、アラジール症候群、α-1アンチトリプシン、チロシン血症、新生児肝炎、およびウィルソン病からなる群より選択される。
（他の用途）
本発明のオリゴヌクレオチドは、診断、治療および予防のための研究試薬として利用することができる。研究では、細胞および実験動物におけるターゲット遺伝子の合成を特異的に阻害し、それによってそのターゲットの機能解析を容易にするために、または治療的介入のターゲットしてのその有用性の査定を容易にするために、本オリゴヌクレオチドを使用することができる。診断においては、ノーザンブロット法、インサイチューハイブリダイゼーションまたは同様の技法によって細胞および組織におけるターゲット発現を検出し定量するために、本オリゴヌクレオチドを使用することができる。治療においては、ターゲットの発現を調整することによって処置することができる疾患または障害を持つと疑われる動物またはヒトが、本発明に従ってオリゴヌクレオチド化合物を投与することによって処置される。さらに、ターゲットの発現に関連する疾患または状態を持つと疑われる、またはそのような疾患または状態に陥りやすいと疑われる、動物、特にマウスおよびラット、ならびにヒトを、治療的または予防的に有効な量の1つ以上の本発明のオリゴヌクレオチド化合物または組成物を投与することによって処置する方法も提供される。
（miR-122aをターゲットとするオリゴヌクレオチドの治療的使用）
本発明者らは、miR-122aをターゲットとするLNA-アンチmiRが、血漿中コレステロールレベルを低下させることを証明した。それゆえ、本発明のもう一つの態様は、miR-122aをターゲットとする上記オリゴヌクレオチドの医薬品としての使用である。
本発明のさらにもう一つの態様は、増加した血漿中コレステロールレベル（または高コレステロール血症および関連障害）を処置するための医薬を製造するための、miR-122aをターゲットとする上記オリゴヌクレオチドの使用である。増加した血漿中コレステロールレベルはさまざまな状態、例えばアテローム性動脈硬化のリスクを増加させるので、それが望ましくないことは、当業者には理解されるだろう。
本発明のさらにもう一つの態様は、Nrdg3、Aldo A、BckdkまたはCD320のmRNAレベルをアップレギュレートするための、miR-122aをターゲットとする上記オリゴヌクレオチドの使用である。
（実施形態）
本発明の以下の実施形態は、本明細書に記載する他の実施形態と組み合わせて使用することができる。
1．6〜12ヌクレオチド長のオリゴマー、ここで、前記オリゴマーは全部で6〜12ヌクレオチド単位、例えば6、7、8、9、10、11または12ヌクレオチド単位の連続ヌクレオチド配列を含み、オリゴマーの核酸塩基単位の少なくとも50％は高アフィニティーヌクレオチド類似体単位である、と、医薬上許容される希釈剤、担体、塩またはアジュバントとを含む医薬組成物。
2．連続ヌクレオチド配列が、哺乳動物、ヒトまたはウイルスのマイクロRNA（miRNA）配列の対応する領域に相補的である、実施形態1の医薬組成物。
3．連続ヌクレオチド配列が、表3、4または5のいずれか一つに列挙するmRNAの群から選択されるmiRNA配列の対応する領域に相補的である、実施形態2の医薬組成物。
4．連続ヌクレオチド配列が前記マイクロRNAのシード配列に相補的な配列からなる、または、それを含む、実施形態2または3の医薬組成物。
5．連続ヌクレオチド配列が、表3または4に列挙する配列のいずれか一つから選択される配列からなる、または、それを含む、実施形態2〜4のいずれか一つの医薬組成物。
6．シードマーの3'核酸塩基が、連続ヌクレオチド配列の最も3'側の核酸塩基を形成し、ここで、連続ヌクレオチド配列は、場合によっては、1個または2個のさらなる5'核酸塩基を含んでもよい、実施形態4または5の医薬組成物。
7．前記連続ヌクレオチド配列が、5'端から数えてマイクロRNA配列中に存在する1番目のヌクレオチドに対応するヌクレオチドを含まない、実施形態1〜6のいずれか一つの医薬組成物。
8．連続ヌクレオチド配列が、表3または4または5に示すものから選択されるmiRNA中に存在する、対応するヌクレオチド配列に相補的である、実施形態1〜7のいずれか一つの医薬組成物。
9．前記miRNAが、miR-1、miR-10b、miR-17-3p、miR-18、miR-19a、miR-19b、miR-20、miR-21、miR-34a、miR-93、miR-106a、miR-106b、miR-122、miR-133、miR-134、miR-138、miR-155、miR-192、miR-194、miR-221、miR-222、およびmiR-375からなる群より選択される、実施形態8の医薬組成物。
10．連続ヌクレオチド配列の核酸塩基単位の少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％またはすべてがヌクレオチド類似体単位である、実施形態1〜9のいずれか一つの医薬組成物。
11．ヌクレオチド類似体単位が、2'-O-アルキル-RNA単位、2'-OMe-RNA単位、2'-アミノ-DNA単位、2'-フルオロ-DNA単位、LNA単位、PNA単位、HNA単位、INA単位、および2'MOE RNA単位からなる群より選択される、実施形態10の医薬組成物。
12．連続ヌクレオチド配列の核酸塩基単位の少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％またはすべてがロックト核酸（LNA）核酸塩基単位である、実施形態10または11の医薬組成物。
13．連続ヌクレオチド配列の核酸塩基単位のすべてがLNA核酸塩基単位である、実施形態12の医薬組成物。
14．連続ヌクレオチド配列が7、8、9または10個の、好ましくは連続した、LNA核酸塩基単位を含む、または、それからなる、実施形態1〜13のいずれか一つの医薬組成物。
15．オリゴマーが7、8、9または10個の連続核酸塩基単位からなり、少なくとも7個の核酸塩基単位がヌクレオチド類似体単位である、実施形態1〜14のいずれか一つの医薬組成物。
16．ヌクレオチド類似体単位がロックト核酸（LNA）核酸塩基単位である、実施形態15の医薬組成物。
17．分子中のヌクレオチド類似体単位が少なくとも50％のLNA単位と50％までの他のヌクレオチド類似体単位との混合物からなる、実施形態15の医薬組成物。
18．連続ヌクレオチド配列の核酸塩基単位間に存在するヌクレオシド間結合の少なくとも75％、例えば80％または85％または90％または95％またはすべてが、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、実施形態1〜17のいずれか一つの医薬組成物。
19．前記オリゴマーが1つ以上の非核酸塩基化合物とコンジュゲートされる、実施形態1〜18のいずれか一つの医薬組成物。
20．連続ヌクレオチド配列が、少なくとも2個のmiRNA配列、例えば2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のmiRNA配列の、対応する配列に相補的である、実施形態1〜19のいずれか一つの医薬組成物。
21．連続ヌクレオチド配列が、少なくとも2個のmiRNAシード領域配列、例えば2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のmiRNAシード領域配列の配列に相補的である配列からなる、または、から構成される、実施形態1〜20のいずれか一つの医薬組成物。
22．連続ヌクレオチド配列がmiR-221とmiR-222の両方の対応する領域に相補的である、実施形態20または21のいずれか一つの医薬組成物。
23．連続ヌクレオチド配列が、5'GCUACAU3'に相補的な配列からなる、または、から構成される、実施形態22の医薬組成物。
24．オリゴマーがプロドラッグとして構成される、実施形態1〜23のいずれか一つの医薬組成物。
25．連続ヌクレオチド配列がhas-miR-122の対応する領域に相補的である、実施形態1〜24のいずれか一つの医薬組成物。
26．C型肝炎ウイルス感染ならびに高コレステロール血症および関連障害からなる群より選択される医学的障害または疾患の処置に使用するための、実施形態25の医薬組成物。
27．組成物が、VLDLアセンブリー経路の阻害剤、例えばApoB阻害剤、またはMTP阻害剤である、第2の独立した活性成分をさらに含む、実施形態25または26の医薬組成物。
28．実施形態25または26の医薬組成物と、VLDLアセンブリー経路の阻害剤、例えばApoB阻害剤、またはMTP阻害剤である第2の独立した活性成分とを含むキット。
29．マイクロRNAの存在または過剰発現と関連する疾患または医学的障害を処置するための方法であって、実施形態1〜28のいずれか一つの医薬組成物を、前記疾患または医学的障害を患っている、または患いそうな、患者に投与することを含む方法。
30．実施形態1〜25のいずれか一つに記載されているオリゴマー。
31．実施形態30のオリゴマーと、少なくとも1つの非核酸塩基化合物とを含むコンジュゲート。
32．マイクロRNAの存在または過剰発現に関連する疾患または医学的障害を処置するための医薬を製造するための、実施形態30〜31のいずれか一つに記載されているオリゴマーまたはコンジュゲートの使用。
33．細胞におけるmiRNAの量または有効量を減少させるための方法であって、上記実施形態のいずれか一つのオリゴマー、コンジュゲートまたは医薬組成物を、前記miRNAを発現させている細胞に、その細胞におけるそのmiRNAの量または有効量が減少するように投与することを含む方法。
34．ある細胞においてあるmiRNAによってその発現が抑制されるmRNAを抑制解除するための方法であって、上記実施形態のいずれか一つのオリゴマー、コンジュゲートまたは医薬組成物を、前記mRNAと前記miRNAの両方を発現させる細胞に、そのmRNAの発現が抑制解除されるように投与することを含む方法。
（参考文献）参考文献の詳細は優先権文書に記載されている。
（実施例）
LNAモノマーおよびオリゴヌクレオチド合成は、WO2007/112754の実施例1および2で言及されている方法を使って行なった。ヒトまたはラット血漿におけるLNAオリゴヌクレオチドの安定性は、WO2007/112754の実施例4で言及されている方法を使って測定される。LNAアンチmiRアンチセンスオリゴヌクレオチド（miR-122をターゲットとするもの）によるインビトロ細胞の処置は、WO2007/112754の実施例6で言及されている方法を使って行なわれる。マイクロRNA特異的定量PCRによるmiR発現のオリゴヌクレオチド阻害の解析は、インビトロモデルでもインビボモデルでも、WO2007/112754の実施例7で言及されている方法を使って行なわれる。miRNAマイクロアレイ発現プロファイリングを使ったLNAアンチmirノックダウン特異性の評価は、WO2007/112754の実施例8で言及されている方法を使って行なわれる。インサイチューハイブリダイゼーションによるマイクロRNAの検出は、WO2007/112754の実施例9で言及されている方法を使って行なわれる。単離およびmRNA発現の解析（mRNA解析のための全RNA単離およびcDNA合成）は、インビトロモデルでもインビボモデルでも、WO2007/112754の実施例10で言及されている方法を使って行なわれる。マイクロRNA-122をターゲットとする本発明のオリゴマーを使ったインビボ実験と、その後の解析は、WO2007/112754の実施例11〜27に開示されている方法を使って行なわれる。上で言及したWO2007/112754の実施例は、特に、参照により本明細書に組み込まれる。
LNAアンチmiRオリゴヌクレオチドのデザインおよび融解温度
（表2）−実施例および図面で使用されるオリゴマー。SEQ#は、実施例および図面の全体を通して使用される識別子である。配列表で使用される配列番号も記載する。
Figure 2010539959














Figure 2010539959
 大文字および小文字はそれぞれLNAおよびDNAを表す。
LNAシトシンは、好ましくは、メチルシトシン/5'メチル-シトシン*である。
ヌクレオシド間結合はすべて、好ましくはホスホロチオエート*である。
LNAはすべて、例えばβ-D-オキシLNA*であることができる。
*特定の実施例で使用。
インビトロモデル：細胞培養
ターゲット核酸発現（量）に対するLNAオリゴヌクレオチドの影響は、ターゲット核酸が測定可能なレベルで存在する限り、さまざまな細胞タイプのどれにおいても試験することができる。ターゲットは、内在性に発現されるか、前記核酸をコードする核酸の一過性または安定トランスフェクションによって発現されうる。
ターゲット核酸の発現レベルは、例えばノーザンブロット解析（マイクロRNAノーザンを含む）、定量PCR（マイクロRNA qPCRを含む）、リボヌクレアーゼ保護アッセイなどを使って、定型的に決定することができる。以下の細胞タイプは例示であり、選択した細胞タイプ中でターゲットが発現される限り、他の細胞タイプも定型的に使用することができる。
細胞は、以下に述べる適当な培地中で培養し、37℃、湿度95〜98％および5％CO2で維持した。細胞は通例、週に2〜3回継代した。
15PC3：ヒト前立腺がん細胞株15PC3はF. Baas博士（AMC神経感覚研究所（Neurozintuigen Laboratory）、オランダ）から寄贈され、DMEM（Sigma）＋10％ウシ胎仔血清（FBS）＋Glutamax I＋ゲンタマイシンで培養した。
PC3：ヒト前立腺がん細胞株PC3はATCCから購入し、グルタミン（Gibco）＋10％FBS＋ゲンタマイシンを含むF12 Coon's培地で培養した。
518A2：ヒト黒色腫がん細胞株518A2はB. Jansen博士（ウィーン大学臨床薬理学科分子薬理学実験腫瘍学部門（Section of experimental Oncology、Molecular Pharmacology、Department of Clinical Pharmacology、University of Vienna））から寄贈され、DMEM（Sigma）＋10％ウシ胎仔血清（FBS）＋Glutamax I＋ゲンタマイシンで培養した。
HeLa：子宮頸癌細胞株HeLaは、10％ウシ胎仔血清およびゲンタマイシンを含有するMEM（Sigma）中、37℃、湿度95％および5％CO2で培養した。
MPC-11：マウス多発性骨髄腫細胞株MPC-11はATCCから購入し、4mM Glutamax＋10％ウマ血清を含むDMEMで維持した。
DU-145：ヒト前立腺がん細胞株DU-145はATCCから購入し、Glutamax＋10％FBSを含むRPMIで維持した。
RCC-4+/-VHL：VHLを発現させるプラスミドまたは空プラスミドで安定にトランスフェクトされたヒト腎がん細胞株RCC4はECACCから購入し、製造者の指示に従って維持した。
786-0：ヒト腎細胞癌細胞株786-0はATCCから購入し、製造者の指示に従って維持した。
HUVEC：ヒト臍静脈内皮細胞株HUVECはCamcrexから購入し、EGM-2培地で維持した。
K562：ヒト慢性骨髄性白血病細胞株K562はECACCから購入し、Glutamax＋10％FBSを含むRPMIで維持した。
U87MG：ヒト膠芽腫細胞株U87MGはATCCから購入し、製造者の指示に従って維持した。
B16：マウス黒色腫細胞株B16はATCCから購入し、製造者の指示に従って維持した。
LNCap：ヒト前立腺がん細胞株LNCapはATCCから購入し、Glutamax＋10％FBSを含むRPMIで維持した。
Huh-7：10％FBS、2mM Glutamax I、1×非必須アミノ酸、ゲンタマイシン25μg/mlを含むイーグルMEMで培養されたヒト肝臓、上皮様。
L428：(Deutsche Sammlung fuer Mikroorganismen（DSM、ドイツ・ブラウンシュヴァイク）：10％FCS、L-グルタミンおよび抗生物質を補足したRPMI 1640で維持されたヒトB細胞リンパ腫。
L1236：(Deutsche Sammlung fuer Mikroorganismen（DSM、ドイツ・ブラウンシュヴァイク））：10％FCS、L-グルタミンおよび抗生物質を補足したRPMI 1640で維持されたヒトB細胞リンパ腫。
miRBaseマイクロRNAデータベース中のすべてのヒトマイクロRNA配列に対するLNAアンチmiRライブラリーのデザイン
使用したmiRBaseバージョンは、Griffiths-Jones, S., Grocock, R.J., van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A.J. 2006 "miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature" Nucleic Acids Res. 34：D140-4に報告されたバージョン12であり、http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/index.shtmlを通して利用することができる。
表1は、miRBaseマイクロRNAデータベースによるマイクロRNAのシードマー配列を含む、7、8および9マーヌクレオチド配列を表す。シードマー配列はマイクロRNAシード領域の逆相補配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴマーが、これらの7マー、8マーまたは9マー配列から選択される連続ヌクレオチド配列を持つ。これらの7マー、8マーおよび9マー配列に関して、いくつかの実施形態では、ヌクレオシド間結合がすべてホスホロチオエートである。これらの7マー、8マーおよび9マーヌクレオチド配列は、本明細書に記載するヌクレオチド類似体（例えばLNAヌクレオチド類似体）の配列からなりうる。LNAシトシンはメチル-シトシン（5'メチル-シトシン）であることができる。いくつかの実施形態では、LNAがβ-D-オキシ-LNAである。
表3は、同じシードマーオリゴマー（例えば本明細書に記載の7、8または9マー（表1参照））によってターゲットとされうるものにグループ分けしたマイクロRNAの一覧表である。
（表3）
Figure 2010539959



Figure 2010539959
本発明者らは、完全にLNA修飾されホスホロチオレート化された、miR-21、miR-155およびmiR-122に対する8マーLNA-アンチmiR（本明細書では、これをマイクロmiR（micromiR）と呼ぶ）を構築した（図1および表6参照）。miR-21、miR-155およびmiR-122用のルシフェラーゼセンサープラスミドを使ったMCF-7、HeLa、RawおよびHuh-7細胞での反復実験から我々が得た結果は、完全にLNA修飾された短いLNA-アンチmiRが、マイクロRNAを極めて強力に拮抗することを証明している。
（表4）LNAアンチmiRおよびマイクロmiR配列ならびに予想Tm
Figure 2010539959
 大文字はβ-D-オキシLNAなどのLNA単位である。小文字はDNA単位である。ヌクレオシド間結合は好ましくはホスホロチオエートである。LNAシトシンはすべて、好ましくは、メチル化/5-メチルシトシンである。
融解温度は、合成マイクロRNAオリゴヌクレオチド（典型的にはホスホジエステルバックボーンを持つRNAヌクレオチドからなるもの）を使って、成熟マイクロRNA配列に対して評価することができる。典型的に測定されるTmは、RNAターゲットに対してLNAオリゴマーを使った場合、予想されるTmよりも高い。
ルシフェラーゼセンサーアッセイを使った、MCF-7細胞における、SEQ ID #3205 LNA-アンチmiRによるmiR-21拮抗作用の評価
miR-21をターゲットとしてそれを拮抗する、完全にLNA修飾された8マーLNA-アンチmiR（SEQ ID #3205）の効率を評価するために、成熟miR-21用の完全マッチターゲット部位および対照としてシード内に2つの突然変異を持つターゲット部位を含有するルシフェラーゼセンサーコンストラクトを作製した（図6）。マイクロRNA-21阻害をモニターするために、乳癌細胞株MCF-7に、異なるルシフェラーゼコンストラクトを、さまざまな濃度のmiR-21アンタゴニストSEQ ID #3205と共にトランスフェクトし、miR-21に対する15マーLNA-アンチmiR SEQ ID #3204と比較した。24時間後に、ルシフェラーゼ活性を測定した。
（結果）図2に示すように、新しい完全にLNA修飾された8マーLNA-アンチmiR（SEQ ID #3205）は、ルシフェラーゼ活性の抑制解除によって示されるように、SEQ ID #3204と比較して2倍高い力価を示した。これに対して、miR-21シード中に2つのミスマッチを持つ対照miR-21センサーコンストラクトはホタルルシフェラーゼ活性の抑制解除を何も示さなかったことから、細胞中のmiR-21活性のモニタリングにおける完全マッチmiR-21センサーの特異性が証明された。8マーLNA-アンチmiRによるルシフェラーゼ活性の抑制解除は明確に用量依存的であり、そのような用量依存性はSEQ ID #3204では見られなかった。そのうえ、この新しい8マーは、SEQ ID #3204より低い用量で、はるかに強力でもあった。
結論として、8マーLNA-アンチmiR（SEQ ID #3205）は、インビトロでのmiR-21の阻害に関して、miR-21をターゲットとする15マーLNA-アンチmiR SEQ ID #3204と比較して、著しく改善された力価を示す。
（材料と方法）
細胞株：乳癌細胞株MCF-7はATCCから購入した（#HTB-22（商標））。MCF-7細胞は、10％ウシ胎仔血清、2mM Glutamax、1×NEAAおよび25μg/mlゲンタマイシンを補足したEMEM培地で培養した。
トランスフェクション：トランスフェクションの前日に、6穴プレートに、1ウェルあたり400,000個の細胞を播種して、翌日には50〜70％コンフルエントになるようにした。トランスフェクションの日に、MCF-7細胞に、0.8μgのmiR-21完全マッチ/psiCHECK2、miR-21.mm2/psiCHECK2または空psiCHECK2ベクター（SDS Promega）を、1μlのLipofectamine2000（Invitrogen）と共に、製造者の指示に従ってトランスフェクトした。24時間後に、ルシフェラーゼ測定のために細胞を収集した。
ルシフェラーゼアッセイ：細胞をPBSで洗浄し、セルスクレーパーで収集した後、細胞を10,000rpmで5分間遠心分離した。上清を捨て、50μlの1×Passive Lysis Buffer（Promega）を細胞ペレットに加えてから、細胞を氷上に30分間置いた。溶解した細胞を10,000rpmで30分間遠心した後、20μlを96穴プレートに移し、製造者の指示（Promega）に従ってルシフェラーゼ測定を行なった。
ルシフェラーゼセンサーアッセイを使った、HeLa細胞における、SEQ ID #3205 LNA-アンチmiRによるmiR-21拮抗作用の評価
miR-21をターゲットとする完全にLNA修飾された8マーLNA-アンチmiR SEQ ID #3205の効率をさらに評価するために、子宮頸癌細胞株HeLaにも、上述のmiR-21ルシフェラーゼセンサーコンストラクトを、上記の項で説明したように、さまざまな濃度のSEQ ID #3205と共にトランスフェクトした（図3）。
（結果）SEQ ID #3204が最も高い用量（50nM）まで完全な抑制解除を示さなかったのと比較して、SEQ ID #3205は、HeLa細胞では、早くも5nMで、miR-21ルシフェラーゼセンサーコンストラクトの完全な抑制解除を示す。さらにまた、8マーSEQ ID #3205 LNA-アンチmiRによるmiR-21の拮抗作用は、用量依存的である。miR-21ルシフェラーゼセンサーアッセイの特異性を証明するために、ミスマッチmiR-21ターゲット部位（シード中に2つのミスマッチ）もHeLa細胞にトランスフェクトしたが、ホタルルシフェラーゼ活性の抑制解除は示さなかった。
結論として、完全にLNA修飾されたSEQ ID #3205は、インビトロでのmiR-21の阻害において、MCF-7細胞でも、HeLa細胞でも、15マーLNA-アンチmiR SEQ ID #3204と比較して、著しく改善された力価を示す。
（材料と方法）
細胞株：ヒト子宮頸癌細胞株HeLaはECACCから購入した（#93021013）。HeLa細胞は、10％ウシ胎仔血清、2mM Glutamax、1×NEAAおよび25μg/mlゲンタマイシンを補足したEMEM培地で培養した。
トランスフェクション：トランスフェクションの前日に、24穴プレートに、1ウェルあたり60,000個の細胞を播種して、翌日には50〜70％コンフルエントになるようにした。トランスフェクションの日に、HeLa細胞に、0.2μgのmiR-21完全マッチ/psiCHECK2、miR-21.mm2/psiCHECK2または空psiCHECK2ベクターを、0.7μlのLipofectamine2000（Invitrogen）と共に、製造者の指示に従ってトランスフェクトした。24時間後に、ルシフェラーゼ測定のために細胞を収集した。
ルシフェラーゼアッセイ：細胞をPBSで洗浄し、100μlの1×Passive Lysis Buffer（Promega）を各ウェルに加えた後、その24穴プレートをオービタルシェーカー上に30分間置いた。細胞を集め、エッペンドルフチューブに移し、10,000rpmで30分間遠心分離した後、10μlを96穴プレートに移し、製造者の指示（Promega）に従ってルシフェラーゼ測定を行なった。
ルシフェラーゼセンサーアッセイを使った、マウスRAW細胞における、SEQ ID #3207 LNA-アンチmiRによるmiR-155拮抗作用の評価
完全にLNA修飾された8マーLNA-アンチmiRがmiR-155を効果的に拮抗できるかどうかを調べるために、miR-155用の完全マッチターゲット部位を同じルシフェラーゼベクター（psiCHECK2）にクローニングし、マウス白血病単球マクロファージRAW細胞株にトランスフェクトした。miR-155の内在性レベルはRAW細胞株では低いので、miR-155蓄積を誘発するために、細胞を100ng/ml LPSで24時間処理した。
（結果）ルシフェラーゼ測定により、miR-155をターゲットとする完全にLNA修飾された8マーLNA-アンチmiR SEQ ID #3207は、15マーLNA-アンチmiR SEQ ID #3206と比較して、同じように有効にmiR-155を拮抗することが証明された（図4）。どちらのLNA-アンチmirも、0.25nMで、miR-155ルシフェラーゼセンサーの＞50％抑制解除を示し、miR-155を用量依存的に阻害した。
（結論）これらのデータは、実施例1および2で示したmiR-21の拮抗から得られた結果をさらに裏付けて、完全にチオレート化された（thiolated）8マーLNA-アンチmiRがマイクロRNAターゲティングに関して極めて強力であることを証明している。
（材料と方法）
細胞株：マウス白血病単球マクロファージRAW 264.7はATCCから購入した（TIB-71）。RAW細胞は、10％ウシ胎仔血清、4mM Glutamaxおよび25μg/mlゲンタマイシンを補足したDMEM培地で培養した。
トランスフェクション：トランスフェクションの前日に、6穴プレートに、1ウェルあたり500,000個の細胞を播種して、翌日には50％コンフルエントになるようにした。トランスフェクションの日に、MCF-7細胞に、0.3μgのmiR-155または空psiCHECK2ベクターを、10μlのLipofectamine2000（Invitrogen）と共に、製造者の指示に従ってトランスフェクトした。miR-155蓄積を誘発するために、トランスフェクション複合体と共に4時間インキュベートしてから、LPS（100ng/ml）をRAW細胞に加えた。さらに24時間の後、ルシフェラーゼ測定のために細胞を収集した。
ルシフェラーゼアッセイ：細胞をPBSで洗浄し、セルスクレーパーで収集した後、細胞を2,500rpmで5分間遠心分離した。上清を捨て、50μlの1×Passive Lysis Buffer（Promega）を細胞ペレットに加えてから、細胞を氷上に30分間置いた。溶解した細胞を10,000rpmで30分間遠心した後、20μlを96穴プレートに移し、製造者の指示（Promega）に従ってルシフェラーゼ測定を行なった。
ルシフェラーゼセンサーアッセイを使った、HuH7細胞における、SEQ ID #3208 LNA-アンチmiRによるmiR-122拮抗作用の評価
miR-122に対する完全に修飾された8マーLNA-アンチmiR SEQ ID #3208の力価を、ヒトヘパトーマ細胞株HuH-7で評価した。HuH-7細胞に、完全マッチmiR-122ターゲット部位を含有するルシフェラーゼセンサーコンストラクトをトランスフェクトした。24時間後にルシフェラーゼ測定を行なった（図5）。
（結果）完全にLNA修飾された8マーLNA-アンチmiR SEQ ID #3208は、miR-122ルシフェラーゼセンサーの抑制解除によって示されるとおり、低濃度では、15マーLNA-アンチmiR SEQ ID #4より強力である。どちらのLNA-アンチmiRも、miR-122を用量依存的に阻害する（図5）。
（結論）miR-122をターゲットとする完全にLNA修飾された8マーLNA-アンチmiR SEQ ID #3208は、インビトロでのmiR-122の阻害において、改善された力価を示す。
（材料と方法）
細胞株：ヒトヘパトーマ細胞株HuH-7は、R. Bartenschlager（ハイデルベルク）から寄贈された。Huh-7細胞は、10％ウシ胎仔血清、2mM Glutamax、1×NEAAおよび25μg/mlゲンタマイシンを補足したEMEM培地で培養した。
トランスフェクション：トランスフェクションの前日に、96穴プレートに、1ウェルあたり8,000個の細胞を播種して、翌日には50〜70％コンフルエントになるようにした。トランスフェクションの日に、HuH-7細胞に、57ngのmiR-122または空psiCHECK2ベクターを、1μlのLipofectamine2000（Invitrogen）と共にトランスフェクトした。24時間後に、ルシフェラーゼ測定のために細胞を収集した。
ルシフェラーゼアッセイ：50μlの1×Passive Lysis Buffer（Promega）を各ウェルに加えた後、その96穴プレートをオービタルシェーカー上に30分間置いた。各ウェルに、Dual-luciferase Reporterアッセイシステム（Promega）を加え、ルシフェラーゼ測定を製造者の指示（Promega）に従って行なった。
ヒト前立腺癌細胞（PC3）において8マー（SEQ ID #3205）と15マー（SEQ ID #3204）のLNA-アンチmiRを比較することによる、miR-21拮抗作用の評価
本発明者らは、完全にLNA修飾されホスホロチオレート化された8マーLNA-アンチmiRが、ヒト子宮頸癌細胞株HeLaにおいてmiR-21ルシフェラーゼレポーターレベルを完全に抑制解除することができ、ヒト乳癌細胞株MCF-7においてmiR-21ルシフェラーゼレポーターレベルを部分的に抑制解除することができるということを、先に示した（特許出願1051）。本発明者らは次にこのスクリーニングアプローチをヒト前立腺がん細胞株PC3に拡張した。miR-21に対する異なるLNA-アンチmiRオリゴヌクレオチドの効率を評価するために、成熟miR-21用の完全マッチターゲット部位およびシード中に2つのミスマッチを持つターゲット部位がウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子の3'UTR中にクローニングされたルシフェラーゼレポーターコンストラクトを作製した（図7）。miR-21阻害をモニターするために、PC3細胞に、異なるルシフェラーゼコンストラクトを、さまざまな濃度のmiR-21アンタゴニストSEQ ID #3205（8マー）および比較のための15マーLNA-アンチmiR完全マッチSEQ ID #3204と共にトランスフェクトした。24時間後に、ルシフェラーゼ活性を測定した。
（結果）ルシフェラーゼレポーター実験は、miR-21に対する15マーLNA-アンチmiR（SEQ ID #3204）によるルシフェラーゼmiR-21レポーター活性の用量依存的抑制解除を示した。しかし、ルシフェラーゼレポーターの完全な抑制解除は、最も高い濃度でさえ得られなかった（図7）。対照的に、8マーの完全にLNA置換されたLNA-アンチmiRをトランスフェクトした細胞は、1nMで早くも完全な抑制解除を見せて、15マーLNA-アンチmiRと比較して著しく改善された力価を示した。miR-21に関してミスマッチターゲット部位を保持するルシフェラーゼ対照レポーターは、どちらのLNA-アンチmiRによる影響も受けなかったことから、両LNA-アンチmiRの高い特異性が証明された。
（結論）このマイクロマー（micromer）は、miR-21のターゲティングに関して、15マーLNA-アンチmiRよりも、はるかに強力であり、今のところ、前立腺癌細胞において最も強力であることを示した。
（材料と方法）
細胞株：ヒト前立腺癌PC3細胞株はECACCから購入した（#90112714）。PC3細胞は、10％ウシ胎仔血清、2mM Glutamaxおよび25μg/mlゲンタマイシンを補足したDMEM培地で培養した。
トランスフェクション：トランスフェクションの前日に、12穴プレートに、1ウェルあたり100,000個の細胞を播種して、翌日には50％コンフルエントになるようにした。トランスフェクションの日に、PC3細胞に、0.3μgのmiR-21または空psiCHECK2ベクターを、1.2μlのLipofectamine2000（Invitrogen）と共に、製造者の指示に従ってトランスフェクトした。さまざまな濃度のLNA-アンチmiRもトランスフェクトした。24時間後に、ルシフェラーゼ測定のために細胞を収集した。
ルシフェラーゼアッセイ：細胞をPBSで洗浄し、250μlの1×Passive Lysis Buffer（Promega）をウェルに加えた。プレートを振盪機上に30分間置いた後、細胞溶解物をエッペンドルフチューブに移した。細胞溶解物を2,500rpmで10分間遠心分離した後、20μlを96穴プレートに移し、製造者の指示（Promega）に従ってルシフェラーゼ測定を行なった。
8マーLNA-アンチmiRによるmiR-21拮抗作用の特異性評価
miR-21をターゲットとする、本発明者らの短いLNA-アンチmiRの特異性を調べるために、シード認識配列中に2つのミスマッチを含有する8マーのミスマッチ対照LNA-アンチmiR（SEQ ID #3218）を設計した（図8参照）。実施例1で説明したルシフェラーゼレポーターコンストラクトを、ヒト子宮頸癌細胞株HeLaに、LNAミスマッチ対照オリゴSEQ ID #3218と共にトランスフェクトし、その効力を、miR-21をターゲットとする8マーLNA-アンチmiR（SEQ ID #3205）と比較した。24時間後に、ルシフェラーゼ活性を測定した。
（結果）図8に示すように、完全にLNA修飾された8マーLNA-アンチmiRをHeLa細胞にトランスフェクトすると、5nMで早くも、ルシフェラーゼmiR-21レポーターの完全な抑制解除が起こった。対照的に、細胞に8マーLNAミスマッチ対照オリゴをトランスフェクトした場合、miR-21シード中に2つのミスマッチを持つ対照miR-21ルシフェラーゼレポーターで得られる結果と合わせて、これらのデータは、Hela細胞におけるmiR-21のターゲティングに関して、完全にLNA置換された8マーLNA-アンチmiRの高い特異性を証明している。
miRBaseマイクロRNA配列データベースを解析したところ、LNA-アンチmiR SEQ ID #3205のmiR-21認識配列はマイクロRNA-21にユニークであることが示された。しかし、マイクロマーの長さを7ntに減らすと、ath-miR-844、mmu-miR-590-3pおよびhas-miR-590-3pもターゲットになるので、miR-21だけに特異的ではなくなる。
（結論）2つのミスマッチヌクレオチドを持つ8マーLNA-アンチmiR内での2つのヌクレオチド位置の交換は、miR-21に対するLNA-アンチmiRの拮抗活性を完全に消滅させた。
（材料と方法）
細胞株：ヒト子宮頸癌細胞株HeLaはECACCから購入した（#93021013）。HeLa細胞は、10％ウシ胎仔血清、2mM Glutamax、1×NEAAおよび25μg/mlゲンタマイシンを補足したEMEM培地で培養した。
トランスフェクション：トランスフェクションの前日に、24穴プレートに、1ウェルあたり60,000個の細胞を播種して、翌日には50〜70％コンフルエントになるようにした。トランスフェクションの日に、HeLa細胞に0.2μgのmiR-21完全マッチ/psiCHECK2、miR-21.mm2/psiCHECK2または空psiCHECK2ベクターを、0.7μlのLipofectamine2000（Invitrogen）と共に、製造者の指示に従ってトランスフェクトした。さまざまな濃度のLNA-アンチmiRもトランスフェクトした。24時間後に、ルシフェラーゼ測定のために細胞を収集した。
ルシフェラーゼアッセイ：細胞をPBSで洗浄し、100μlの1×Passive Lysis Buffer（Promega）を各ウェルに加えた後、その24ウェルプレートをオービタルシェーカー上に30分間置いた。細胞を集め、エッペンドルフチューブに移し、10,000rpmで30分間遠心分離した後、10μlを96穴プレートに移し、製造者の指示（Promega）に従ってルシフェラーゼ測定を行なった。
miR-21の効果的拮抗作用を媒介する完全にLNA修飾されたLNA-アンチmiRの、考えうる最も短い長さの評価
LNA-アンチmiRの長さの要件をさらに調べるために、miR-21をターゲットとする、7マーおよび6マーのLNA-アンチmiR（どちらも完全にLNA修飾されホスホロチオレート化されたオリゴヌクレオチド）を設計した。miR-21ルシフェラーゼレポーターコンストラクトを、さまざまな濃度のLNA-アンチmiRと共に、HeLa細胞にトランスフェクトした。ルシフェラーゼ測定を24時間後に行なった。
（結果）図9に示すように、7マーLNA-アンチmiRは、miR-21ルシフェラーゼレポータープラスミドの抑制解除を媒介するが、その力価は8マーLNA-アンチmiR（SEQ ID #3205）と比べて低い。それでもなお、用量依存的傾向は依然として観察することができる。対照的に、6マーLNA-アンチmiRは何の阻害活性も示さなかった。
（結論）結論として、miR-21阻害を媒介することができるLNA-アンチmiRの、考えうる最短の長さは、7ヌクレオチドである。ただし、7マーLNA-アンチmiRは、miR-21に関して、8マーLNA-アンチmiRほど強力ではない。
（材料と方法）
細胞株：ヒト子宮頸癌細胞株HeLaはECACCから購入した（#93021013）。HeLa細胞は、10％ウシ胎仔血清、2mM Glutamax、1×NEAAおよび25μg/mlゲンタマイシンを補足したEMEM培地で培養した。
トランスフェクション：トランスフェクションの前日に、24穴プレートに、1ウェルあたり60,000個の細胞を播種して、翌日には50〜70％コンフルエントになるようにした。トランスフェクションの日に、HeLa細胞に、0.2μgのmiR-21完全マッチ/psiCHECK2、miR-21.mm2/psiCHECK2または空psiCHECK2ベクターを、0.7μlのLipofectamine2000（Invitrogen）と共に、製造者の指示に従ってトランスフェクトした。さまざまな濃度のLNA-アンチmiRもトランスフェクトした。24時間後に、ルシフェラーゼ測定のために細胞を収集した。
ルシフェラーゼアッセイ：細胞をPBSで洗浄し、100μlの1×Passive Lysis Buffer（Promega）を各ウェルに加えた後、その24穴プレートをオービタルシェーカー上に30分間置いた。細胞を集めてエッペンドルフチューブに移し、10,000rpmで30分間遠心分離した後、10μlを96穴プレートに移し、製造者の指示（Promega）に従ってルシフェラーゼ測定を行なった。
miR-21を拮抗する完全にLNA置換されたLNA-アンチmiRの長さ評価
次に、本発明者らは、完全にLNA置換されたLNA-アンチmiRの長さを9マーから14マーまで増加させることが、HeLa細胞におけるmiR-21の拮抗に及ぼす影響を調べた。得られたLNA-アンチmiRをHeLa細胞に、miR-21ルシフェラーゼレポーターコンストラクトと共にトランスフェクトした（図10）。ルシフェラーゼ測定を24時間後に行なった。
（結果）9マーLNA-アンチmiR SEQ ID #3211（9マー）は、miR-21ルシフェラーゼレポーターの用量依存的な抑制解除を示したが、それは、7マーLNA-アンチmiR（SEQ ID #3210）について証明されたのと同様に、完全な抑制解除には達しなかった。長さを10マー〜14マーまで増加させると（SEQ ID #3212、SEQ ID #3213およびSEQ ID #3214）、miR-21レポーターの抑制解除効率の低下によって示されるとおり、力価は低下した。
（結論）図10に示すように、miR-21阻害を依然として媒介することができる最も長い完全にLNA修飾されホスホロチオレート化されたLNA-アンチmiRは、9マーLNA-アンチmiR SEQ ID #3211である。しかし、その効率は、7マーおよび8マーLNA-アンチmiRよりも、明らかに低い。
（材料と方法）
細胞株：ヒト子宮頸癌細胞株HeLaはECACCから購入した（#93021013）。HeLa細胞は、10％ウシ胎仔血清、2mM Glutamax、1×NEAAおよび25μg/mlゲンタマイシンを補足したEMEM培地で培養した。
トランスフェクション：トランスフェクションの前日に、24穴プレートに、1ウェルあたり60,000個の細胞を播種して、翌日には50〜70％コンフルエントになるようにした。トランスフェクションの日に、HeLa細胞に、0.2μgのmiR-21完全マッチ/psiCHECK2、miR-21.mm2/psiCHECK2またはターゲット部位を持たない空psiCHECK2対照ベクターを、0.7μlのLipofectamine2000（Invitrogen）と共に、製造者の指示に従ってトランスフェクトした。さまざまな濃度のLNA-アンチmiRもトランスフェクトした。24時間後に、ルシフェラーゼ測定のために細胞を収集した。
ルシフェラーゼアッセイ：細胞をPBSで洗浄し、100μlの1×Passive Lysis Buffer（Promega）を各ウェルに加えた後、その24ウェルプレートをオービタルシェーカー上に30分間置いた。細胞を集め、エッペンドルフチューブに移し、10,000rpmで30分間遠心分離した後、10μlを96穴プレートに移し、製造者の指示（Promega）に従ってルシフェラーゼ測定を行なった。
miRターゲット認識配列内で8マーLNA-アンチmiRにとって最適な位置の決定
本発明者らの実験により、最も強力な完全にLNA修飾されたホスホロチオレート化LNA-アンチmiRは、8ヌクレオチド長であることが示された。miRターゲット認識配列内で8マーLNA-アンチmiRにとって最適な位置を評価するために、図11に示すように、成熟miR21-配列の全体を覆う、4つの異なる完全にLNA修飾された8マーLNA-アンチmiRを設計した。異なるLNA-アンチmiRを、miR-21ルシフェラーゼレポーターコンストラクトと共に、HeLa細胞に同時トランスフェクトした。ルシフェラーゼ測定を24時間後に行なった。
（結果）ルシフェラーゼレポーターによる測定で、miR-21の効率のよいサイレンシングを媒介した唯一のLNA-アンチmiRは、miR-21のシード領域をターゲットとするSEQ ID #3205だった。シードの3'端をカバーするように設計されたSEQ ID #3215（50％シードターゲティング）には効果がなく、成熟miR-21の中央領域および3'端をそれぞれターゲットとするように配置された他の2つのLNA-アンチmiR、SEQ ID #3216またはSEQ ID #3217にも効果はなかった。
（結論）miR-21の強力なサイレンシングを媒介する唯一の8マーLNA-アンチmiRは、miR-21のシードをターゲットとするものである。
（材料と方法）
細胞株：ヒト子宮頸癌細胞株HeLaはECACCから購入した（#93021013）。HeLa細胞は、10％ウシ胎仔血清、2mM Glutamax、1×NEAAおよび25μg/mlゲンタマイシンを補足したEMEM培地で培養した。
トランスフェクション：トランスフェクションの前日に、24穴プレートに、1ウェルあたり60,000個の細胞を播種して、翌日には50〜70％コンフルエントになるようにした。トランスフェクションの日に、HeLa細胞に、0.2μgのmiR-21完全マッチ/psiCHECK2、miR-21.mm2/psiCHECK2または空psiCHECK2ベクターを、0.7μlのLipofectamine2000（Invitrogen）と共に、製造者の指示に従ってトランスフェクトした。さまざまな濃度のLNA-アンチmiRもトランスフェクトした。24時間後に、ルシフェラーゼ測定のために細胞を収集した。
ルシフェラーゼアッセイ：細胞をPBSで洗浄し、100μlの1×Passive Lysis Buffer（Promega）を各ウェルに加えた後、その24穴プレートをオービタルシェーカー上に30分間置いた。細胞を集め、エッペンドルフチューブに移し、10,000rpmで30分間遠心分離した後、10μlを96穴プレートに移し、製造者の指示（Promega）に従ってルシフェラーゼ測定を行なった。
8マーSEQ ID #3205 LNA-アンチmiRを使った、Pdcd4-3'-UTR中のmiR-21ターゲット部位とmiR-21との相互作用の実証
腫瘍抑制因子タンパク質Pdcd4は、TPAが誘発する新生物トランスフォーメーション、腫瘍の促進および進行を阻害する。Pdcd4は、異なる誘導因子に呼応して起こるアポトーシスに際して、アップレギュレートされることも示されている。さらにまた、肺がんおよび結腸直腸がんにおけるPdcd4のダウンレギュレーションは、患者の予後不良とも関連づけられている。最近、AsanganiらとFrankelらは、Pdcd4-3'-UTRにはmiR-21用のターゲット部位が保存されていること、および細胞にアンチmiR-21をトランスフェクトすることにより、Pdcd4タンパク質の増加が起こることを示した。そこで本発明者らは、前述のmiR-21ターゲット部位を包含するPdcd4の3'UTR領域の313ntを保持しているルシフェラーゼレポータープラスミドを構築し、それを、異なるLNA-アンチmiRと共に、HeLa細胞に同時トランスフェクトした。異なるLNA-アンチmiRとは、SEQ ID #3205（8マー、完全マッチ）またはSEQ ID #3218（8マー、ミスマッチ）である。ルシフェラーゼ測定を24時間後に行なった。
（結果）図12に示すように、Pdcd4 3'UTRルシフェラーゼレポーターおよびSEQ ID #3205をトランスフェクトした細胞では、ルシフェラーゼ活性の増加が観察され、Pdcd4 3'UTRとmiR-21の間の相互作用が示される。しかし、ミスマッチ化合物SEQ ID #3218を細胞にトランスフェクトしても、ルシフェラーゼ活性の変化は観察されなかった。この化合物はmiR-21を拮抗しないので、これは、予想されることだった。8マーLNA-アンチmiRを、2つのより長いデザインのLNA-アンチmiRと比較したところ、完全にLNA修飾されホスホロチオレート化された短いLNA-アンチmiRの方が著しく強力であり、先のルシフェラーゼアッセイデータが確認された。
（結論）これらのデータから、miR-21を拮抗するSEQ ID #3205は、Pdcd4 3'UTRとmiR-21の間の相互作用を調節することができると結論される。
（材料と方法）
細胞株：ヒト子宮頸癌細胞株HeLaはECACCから購入した（#93021013）。HeLa細胞は、10％ウシ胎仔血清、2mM Glutamax、1×NEAAおよび25μg/mlゲンタマイシンを補足したEMEM培地で培養した。
トランスフェクション：トランスフェクションの前日に、24穴プレートに、1ウェルあたり60,000個の細胞を播種して、翌日には50〜70％コンフルエントになるようにした。トランスフェクションの日に、HeLa細胞に、0.2μgのPdcd4-3'UTR/psiCHECK2または空psiCHECK2ベクターを、0.7μlのLipofectamine2000（Invitrogen）と共に、製造者の指示に従ってトランスフェクトした。さまざまな濃度のLNA-アンチmiRオリゴヌクレオチドもトランスフェクトした。24時間後に、ルシフェラーゼ測定のために細胞を収集した。
ルシフェラーゼアッセイ：細胞をPBSで洗浄し、100μlの1×Passive Lysis Buffer（Promega）を各ウェルに加えた後、その24穴プレートをオービタルシェーカー上に30分間置いた。細胞を集め、エッペンドルフチューブに移し、10,000rpmで30分間遠心分離した後、10μlを96穴プレートに移し、製造者の指示（Promega）に従ってルシフェラーゼ測定を行なった。
マウスRAW細胞における、miR-155の拮抗に関する、8マーLNA-アンチmiR（SEQ ID #3207）と15マーLNA-アンチmiR（SEQ ID #3206）の比較
短いLNA-アンチmiRを使用する本発明者らのアプローチを他のmiRNAのターゲティングに適合させることができるかどうかを調べるために、マイクロRNA-155に対する完全にLNA修飾された8マーLNA-アンチmiRを設計した。miR-155用の完全マッチターゲット部位をレポータープラスミドpsiCHECK2中のルシフェラーゼ遺伝子の3'UTR内にクローニングし、それを、マウスRAWマクロファージ細胞株に、8マーまたは15マーのLNA-アンチmiRと共にトランスフェクトした。miR-155の内在性レベルはRAW細胞株では低いので、miR-155蓄積を誘発するために、細胞を100ng/ml LPSで24時間処理した。24時間後に、ルシフェラーゼ解析を行なった。
（結果）ルシフェラーゼ測定により、完全にLNA修飾された8マーLNA-アンチmiR SEQ ID #3207は、miR-155のターゲティングに関して、15マーLNA-アンチmiR SEQ ID #3206と比較して同様に有効であることが示された（図13）。どちらのLNA-アンチmiRも、0.25nMの濃度で、miR-155ルシフェラーゼセンサーの＞50％抑制解除を示し、miR-155を用量依存的に阻害した。
miRBaseマイクロRNA配列データベースの解析により、LNA-アンチmiR SEQ ID #3207のmiR-155認識配列は、マイクロRNA-155にユニークであることが示された。しかし、LNA-アンチmiRの長さを7ntに減らすと、miR-155だけに特異的なわけではなくなり、mdv1-miR-M4およびkshv-miR-K12-11もターゲットになる。
（結論）完全にLNA修飾されホスホロチオレート化された8マーLNA-アンチmiRは、miR-155の拮抗に関して、混成LNA/DNAデザインの15マーLNA-アンチmiRと比較して同等に強力である。したがって、短いLNA-アンチmiRを使用する本発明者らのアプローチは、他のmiRNAのターゲティングに、容易に適合させることができる。
（材料と方法）
細胞株：マウスマクロファージRAW 264.7細胞株はATCCから購入した（TIB-71）。RAW細胞は、10％ウシ胎仔血清、4mM Glutamaxおよび25μg/mlゲンタマイシンを補足したDMEM培地で培養した。
トランスフェクション：トランスフェクションの前日に、6穴プレートに、1ウェルあたり500,000個の細胞を播種して、翌日には50％コンフルエントになるようにした。トランスフェクションの日に、RAW 264.7細胞に、0.3μgのmiR-155完全マッチ/psiCHECK2または空psiCHECK2ベクターを、10μlのLipofectamine2000（Invitrogen）と共に、製造者の指示に従ってトランスフェクトした。さまざまな濃度のLNA-アンチmiRもトランスフェクトした。miR-155蓄積を誘発するために、トランスフェクション複合体と共に4時間インキュベートしてから、LPS（100ng/ml）をRAW細胞に加えた。さらに24時間の後、ルシフェラーゼ測定のために細胞を収集した。
ルシフェラーゼアッセイ：細胞をPBSで洗浄し、セルスクレーパーで収集した後、細胞を2,500rpmで5分間遠心した。上清を捨て、50μlの1×Passive Lysis Buffer（Promega）を細胞ペレットに加えてから、細胞を氷上に30分間置いた。溶解した細胞を10,000rpmで30分間遠心した後、20μlを96穴プレートに移し、製造者の指示（Promega）に従ってルシフェラーゼ測定を行なった。
短いLNA-アンチmiR（SEQ ID #3207）によるmiR-155拮抗作用に関する機能的読出しとしてのc/EBPβタンパク質レベルの評価
短いLNA-アンチmiR（SEQ ID #3207）によるmiR-155拮抗作用に関する機能的読出しとして、新規miR-155ターゲットc/EBPβのタンパク質レベルを決定した。マウスマクロファージRAW細胞株に、8マー（SEQ ID #3207）または15マー（SEQ ID #3206）のLNA-アンチmiRを、プレ-miR-155の存在下または非存在下でトランスフェクトした。15マー用のミスマッチ対照として、miR-122をターゲットとするSEQ ID #4を使用し、8マー用には、miR-21をターゲットとするSEQ ID #3205を使用した。これら2つの対照miRNAはc/EBPβ発現レベルを調節しない。LPSを使ってmiR-155蓄積を誘発し、LPSで16時間処理した後に、細胞を収集した。c/EBPβは3つのアイソフォームLIP、LAPおよびLAP*を持つ。それらをウェスタンブロット解析で検出し、同じメンブレンをローディングコントロールとしてのβ-チューブリンで再プローブした。
（結果）図14に示すように、c/EBPβ LIPとβ-チューブリンについて、比を算出した。15マーLNA-アンチmiRをトランスフェクトしたRAW細胞およびプレ-miR-155をトランスフェクトしなかったRAW細胞はすべて、miR-155の阻害がc/EBPβ LIPレベルを増加させるので、等しいc/EBPβ LIP/β-チューブリン比を示した（図14、左パネル）。これに対し、RAW細胞へのプレ-miR-155のトランスフェクションは、LNAで処理されていないまたはミスマッチで処理されたRAW細胞から得たタンパク質抽出物を含むレーンに示されるように、c/EBPβがmiR-155ターゲットであるとすれば予想されるとおり、c/EBPβ LIPレベルを低下させた。しかし、miR-155に対するLNA-アンチmiRをトランスフェクトしたRAW細胞から得られるタンパク質抽出物は、c/EBPβ LIPレベルの増加を示した。同じ実験を8マーLNA-アンチmiR-155（SEQ ID #3207）でも行ったところ、図14（右パネル）に示すように、15マーLNA-アンチmiR SEQ ID #3206の場合に匹敵する結果が得られた。
（結論）8マーまたは15マーのLNA-アンチmiRを使ったmiR-155の拮抗作用は、直接のターゲットc/EBPβの抑制解除をもたらす。
（材料と方法）
細胞株：マウスマクロファージRAW 264.7細胞株はATCCから購入した（TIB-71）。RAW細胞は、10％ウシ胎仔血清、4mM Glutamaxおよび25μg/mlゲンタマイシンを補足したDMEM培地で培養した。
トランスフェクション：トランスフェクションの前日に、6穴プレートに、1ウェルあたり500,000個の細胞を播種して、翌日には50％コンフルエントになるようにした。トランスフェクションの日に、RAW 264.7細胞に、5nmolのプレ-miR-155（Ambion）および/または5nM LNA-アンチmiRを、10μlのLipofectamine2000（Invitrogen）と共に、製造者の指示に従ってトランスフェクトした。さまざまな濃度のLNA-アンチmiRもトランスフェクトした。miR-155蓄積を誘発するために、トランスフェクション複合体と共に4時間インキュベートしてから、LPS（100ng/ml）をRAW細胞に加えた。16時間後に、タンパク質抽出およびウェスタンブロット解析のために、細胞を収集した。
ウェスタンブロット：細胞をPBSで洗浄し、トリプシン処理し、エッペンドルフチューブに移し、250μlの溶解バッファー（1×RIPA）を加えた。細胞溶解物を氷上に20分間置き、10,000rpmで10分間遠心した。Coomassie Plusを使用し、製造者の指示に従って、タンパク質濃度を測定し、80μgを4-12％BIS-TRISゲルにのせた。メンブレンを1:100濃度の一次モノクローナルマウス抗体C/EBPβ（Santa Cruz）と共に4℃で終夜インキュベートした。免疫活性バンドをECL Plus（Amersham）で可視化した。
完全にLNA修飾された8マー（SEQ ID #3221）LNA-アンチmiRによるmiR-106bの拮抗作用
短いLNA-アンチmiRを使用する本発明者らのアプローチを他のmiRNAのターゲティングに適合させることができることを確認するために、マイクロRNA-106bに対する完全にLNA修飾された8マーLNA-アンチmiRを設計した。miR-106b用の完全マッチターゲット部位を、ベクター（psiCHECK2）中のルシフェラーゼ遺伝子の3'UTR内にクローニングし、それを、ヒト子宮頸癌HeLa細胞株に、さまざまな濃度の短いLNA-アンチmiR（SEQ ID #3221）または15マーLNA-アンチmiR（SEQ ID #3228）と共にトランスフェクトした。ルシフェラーゼ測定を24時間後に行なった。
（結果）miR-106bに対する8マーLNA-アンチmiR SEQ ID #3221のトランスフェクションは、1nM LNA-アンチmiRの濃度で完全に抑制解除されたルシフェラーゼレポーターの抑制解除によって示されるように、miR-106bの用量依存的阻害をもたらした（図15）。匹敵する結果が、15マーLNA-アンチmiR SEQ ID #3228を使って得られたことから、8マーLNA-アンチmiRは15マーと同様に強力であることが証明された。
（結論）HeLa細胞におけるmiR-106bのターゲティングにより、8マーの完全にLNA修飾されホスホロチオレート化されたLNA-アンチmiRは、15マーLNA/DNAミックスマーLNA-アンチmiRと比較して、同等に強力であることが示される。
（材料と方法）
細胞株：ヒト子宮頸癌細胞株HeLaはECACCから購入した（#93021013）。HeLa細胞は、10％ウシ胎仔血清、2mM Glutamax、1×NEAAおよび25μg/mlゲンタマイシンを補足したEMEM培地で培養した。
トランスフェクション：トランスフェクションの前日に、96穴プレートに、1ウェルあたり5,200個の細胞を播種して、翌日には50〜70％コンフルエントになるようにした。トランスフェクションの日に、HeLa細胞に、57ngのmiR-21完全マッチ/psiCHECK2、miR-21.mm2/psiCHECK2または空psiCHECK2ベクターを、0.14μlのLipofectamine2000（Invitrogen）と共に、製造者の指示に従ってトランスフェクトした。さまざまな濃度のLNA-アンチmiRもトランスフェクトした。24時間後に、ルシフェラーゼ測定のために細胞を収集した。
ルシフェラーゼアッセイ：細胞をPBSで洗浄し、30μlの1×Passive Lysis Buffer（Promega）を各ウェルに加えた後、その24穴プレートをオービタルシェーカー上に30分間置いた。細胞を集め、エッペンドルフチューブに移し、10,000rpmで30分間遠心した後、ルシフェラーゼ測定を製造者の指示（Promega）に従って行なった。
完全にLNA修飾された8マー（SEQ ID #3222）LNA-アンチmiRによるmiR-19aの拮抗作用
短いLNA-アンチmiRを使用する本発明者らのアプローチを他のmiRNAのターゲティングに容易に適合させることができることをさらに確認するために、マイクロRNA-19aに対する完全にLNA修飾された8マーLNA-アンチmiRを設計した。miR-19a用の完全マッチターゲット部位を、psiCHECK2ベクター中のルシフェラーゼ遺伝子の3'UTR内にクローニングした。そのレポータープラスミドを、ヒト子宮頸癌HeLa細胞株に、miR-19aをターゲットとするさまざまな濃度の短いLNA-アンチmiR（SEQ ID #3222）または15マーLNA-アンチmiR（SEQ ID #3229）と共にトランスフェクトした。ルシフェラーゼ測定を24時間後に行なった。
（結果）図16に示すように、HeLaへの15マーLNA-アンチmiR SEQ ID #3229のトランスフェクションは、1nM LNA-アンチmiRの濃度における完全な抑制解除によって証明されるように、miR-19aを効率よく拮抗する。これに対し、8マーLNA-アンチmiR SEQ ID #3222のトランスフェクションは、0.5nM濃度で早くも効果的なmiR-19a拮抗作用をもたらし、この8マーLNA-アンチmiRがHeLa細胞において15マーLNA-アンチmiRと少なくとも同等に強力であることを示した。
（結論）HeLa細胞におけるmiR-19aのターゲティングにより、8マーの完全にLNA修飾されホスホロチオレート化されたLNA-アンチmiRは、15マーのLNA/DNAミックスマーLNA-アンチmiRと比較して少なくとも同等に強力であることが示される。
（材料と方法）
細胞株：ヒト子宮頸癌細胞株HeLaはECACCから購入した（#93021013）。HeLa細胞は、10％ウシ胎仔血清、2mM Glutamax、1×NEAAおよび25μg/mlゲンタマイシンを補足したEMEM培地で培養した。
トランスフェクション：トランスフェクションの前日に、96穴プレートに、1ウェルあたり5,200個の細胞を播種して、翌日には50〜70％コンフルエントになるようにした。トランスフェクションの日に、HeLa細胞に、57ngのmiR-21完全マッチ/psiCHECK2、miR-21.mm2/psiCHECK2または空psiCHECK2ベクターを、0.14μlのLipofectamine2000（Invitrogen）と共に、製造者の指示に従ってトランスフェクトした。さまざまな濃度のLNA-アンチmiRもトランスフェクトした。24時間後に、ルシフェラーゼ測定のために細胞を収集した。
ルシフェラーゼアッセイ：細胞をPBSで洗浄し、30μlの1×Passive Lysis Buffer（Promega）を各ウェルに加えた後、その24穴プレートをオービタルシェーカー上に30分間置いた。細胞を集め、エッペンドルフチューブに移し、10,000rpmで30分間遠心した後、ルシフェラーゼ測定を製造者の指示（Promega）に従って行なった。
完全にLNA置換された短いLNA-アンチmiRを用いるマイクロRNAファミリーのターゲティング
次に、本発明者らは、すべてのファミリーメンバーに共通するシード配列に相補的な単一の短い7マーLNA-アンチmiRを使ってマイクロRNAファミリーをターゲットとすることが可能かどうかを調べた（図17参照）。この実験では、結腸、膵臓、前立腺および胃の固形腫瘍において過剰発現されるmiR-221およびmiR-222に的を絞った。miR-221とmiR-222は多形性神経膠芽腫において最も著しくアップレギュレートされるマイクロRNAであることも示されている。さらにまた、miR-221とmiR-222の過剰発現は、少なくとも一つには、腫瘍抑制因子タンパク質p27をブロックすることにより、前立腺癌の成長と進行の一因にもなりうる。それぞれmiR-221用およびmiR-222用である完全マッチターゲット部位を、どちらもルシフェラーゼ遺伝子の3'UTR内にクローニングして、2つのレポーターコンストラクトを得た。次に、これらのコンストラクトを、別々に、または組み合わせて、前立腺癌細胞株PC3にトランスフェクトした。miR-221とmiR-222の両方をターゲットとする7マーの他に、miR-221（SEQ ID #3223）またはmiR-222（SEQ ID #3224）のどちらか一方をターゲットとする15マーのLNA-アンチmiR（15マー）も、それぞれ別個に、または一緒に、同時トランスフェクトした（図18左参照）。
（結果）図18に示すように、miR-221に対するLNA-アンチmiR SEQ ID #3223によるPC3細胞のトランスフェクションは、1nMのLNA-アンチmiR濃度で、効率のよいmiR-221の阻害をもたらした。miR-222用のルシフェラーゼレポータープラスミドを使った場合にも、そしてまた、miR-221用とmiR-222用のルシフェラーゼレポーターを両方とも同時にPC3細胞に同時トランスフェクトした場合にも、阻害効果が観察される。この阻害効果は、おそらく、miR-221とmiR-222の間で共有されているシード配列によるものだろう。同様に、miR-222に対するLNA-アンチmiR SEQ ID #3224によるPC3細胞のトランスフェクションは、miR-222用ルシフェラーゼレポーターの完全な抑制解除によって示されるように、1nMのLNA-アンチmiR濃度で、効率のよいmiR-222の阻害をもたらした。miR-222用のルシフェラーゼレポータープラスミドを使った場合にも、そしてまた、miR-221用とmiR-222用のルシフェラーゼレポーターを両方とも同時にPC3細胞に同時トランスフェクトした場合にも、阻害効果が観察される。それぞれmiR-221およびmiR-222に対するLNA-アンチmiR化合物であるSEQ ID #3223とSEQ ID #3224を両方とも同時トランスフェクトすると（図18左参照）、PC3細胞に別々にトランスフェクトした場合にも、同時トランスフェクトした場合にも、ルシフェラーゼレポータープラスミドの完全な抑制解除によって示されるとおり、両miRNAの効果的な阻害が起こった。興味深いことに、miR-221とmiR-222のシード配列をターゲットとする単一の完全にLNA修飾された7マーLNA-アンチmiR（SEQ ID #3225）をPC3細胞にトランスフェクトすると、PC3細胞に別々にトランスフェクトした場合にも、同時トランスフェクトした場合にも、ルシフェラーゼレポータープラスミドの完全な抑制解除によって示されるとおり、miR-221およびmiR-222の効率のよい用量依存的拮抗作用がもたらされた。これは、単一の短いLNA置換LNA-アンチmiRが、シード配列を効果的にターゲットとし、それによってマイクロRNAファミリー全体を同時に拮抗することができるということを証明している。miRBaseマイクロRNA配列データベースの解析により、LNA-アンチmiR SEQ ID #3225のmiR-221/222シード認識配列は両miRNAにユニークであることが示された。
（結論）本発明者らの結果は、マイクロRNAシード配列を効果的にターゲットとし、それによってマイクロRNAファミリー全体を同時に拮抗することができる完全にLNA置換された短いLNA-アンチmiRオリゴヌクレオチドのデザインおよび合成を、LNAが可能にすることを証明している。
（材料と方法）
細胞株：ヒト前立腺癌PC3細胞株はECACCから購入した（#90112714）。PC3細胞は、10％ウシ胎仔血清、2mM Glutamaxおよび25μg/mlゲンタマイシンを補足したDMEM培地で培養した。
トランスフェクション：トランスフェクションの前日に、12穴プレートに、1ウェルあたり100,000個の細胞を播種して、翌日には50％コンフルエントになるようにした。トランスフェクションの日に、PC3細胞に、0.3μgのmiR-221用もしくはmiR-222用のルシフェラーゼレポータープラスミド、または対照としてmiRNAターゲット部位を持たない空psiCHECK2ベクターを、1.2μlのLipofectamine2000（Invitrogen）と共に、製造者の指示に従ってトランスフェクトした。24時間後に、ルシフェラーゼ測定のために細胞を収集した。
ルシフェラーゼアッセイ：細胞をPBSで洗浄し、250μlの1×Passive Lysis Buffer（Promega）をウェルに加えた。プレートを振盪機上に30分間置いた後、細胞溶解物をエッペンドルフチューブに移した。細胞溶解物を2,500rpmで10分間遠心した後、20μlを96穴プレートに移し、製造者の指示（Promega）に従ってルシフェラーゼ測定を行なった。
7マーSEQ ID #3225 LNA-アンチmiRによるmiR-221/222ファミリーの拮抗作用に関する機能的読出しとしてのp27タンパク質レベルの評価
先の研究（le Sageら 2007、Galardiら, 2007）により、miR-221とmiR-222は、細胞周期調節に関与する腫瘍抑制因子遺伝子p27の発現を、転写後調節することが示されている。これらの研究では、miR-221およびmiR-222のダウンレギュレーションが、p27の発現レベルを増加させることが示された。そこで、7マーSEQ ID #3225 LNA-アンチmiRによるmiR-221/222ファミリーの拮抗作用に関する機能的読出しとして、本発明者らは、PC3細胞へのLNA-アンチmiR SEQ ID #3225のトランスフェクション後に、p27のタンパク質レベルを決定し、8マーLNAミスマッチ対照と比較した。24時間後に、ウェスタンブロット解析のために細胞を収集した（図19）。
（結果）図19に示すように、miR-221およびmiR-222中のシード配列をターゲットとする7マーLNA-アンチmiR SEQ ID #3225のトランスフェクションは、非トランスフェクトPC3細胞またはLNAミスマッチ対照トランスフェクトPC3細胞と比較して、p27タンパク質レベルの用量依存的増加をもたらした。これらの結果は、7マーLNA-アンチmiRが、miR-221/222ファミリーを効果的に拮抗して、直接のターゲットp27の抑制解除をタンパク質レベルでもたらすことができるということを明確に証明している。
（結論）miR-221/222ファミリー中のシード配列をターゲットとする完全にLNA修飾された7マーLNA-アンチmiRは、両方のmiRNAを効果的に拮抗して、直接のターゲットp27の抑制解除をタンパク質レベルでもたらした。
（材料と方法）
細胞株：ヒト前立腺癌PC3細胞株はECACCから購入した（#90112714）。PC3細胞は、10％ウシ胎仔血清、2mM Glutamaxおよび25μg/mlゲンタマイシンを補足したDMEM培地で培養した。
トランスフェクション：トランスフェクションの前日に、6穴プレートに、1ウェルあたり250,000個の細胞を播種して、翌日には50％コンフルエントになるようにした。トランスフェクションの日に、PC3細胞に、さまざまな濃度のLNA-アンチmiRを、Lipofectamine 2000と共にトランスフェクトした。24時間後に、タンパク質抽出およびウェスタンブロット解析のために細胞を収集した。
ウェスタンブロット：細胞をPBSで洗浄し、トリプシン処理し、エッペンドルフチューブに移し、250μlの溶解バッファー（1×RIPA）を加えた。細胞溶解物を氷上に20分間置いてから、10,000rpmで10分間遠心した。Coomassie Plusを使用し、製造者の指示に従って、タンパク質濃度を測定し、100μgを4-12％BIS-TRISゲルにのせた。メンブレンを1：1000希釈の一次モノクローナルマウス抗体p27（BD Biosciences）と共に4℃で終夜インキュベートした。免疫活性バンドをECL Plus（Amersham）で可視化した。
LNA-アンチmiRの二重鎖融解温度（T m ）
表5に示すように、完全に修飾された短いLNA-アンチmiRの長さが増加するに連れて、Tm値は増加する（表7のSEQ ID #3205、SEQ ID #3209〜3214のTm値を参照）。最適な阻害効果がmiR-21に対する8マーLNA-アンチmiR SEQ ID #3205によって達成されたのに対し、6マーSEQ ID #3209の極めて低いTmは、おそらく、miR-21ターゲットの拮抗作用を媒介するには十分でないのだろう。一方、10マー（SEQ ID #3212）を上回る長さにするとTmは著しく増加するが、それと同時に、ルシフェラーゼmiR-21レポーターを使って測定される阻害活性も減少する。これはおそらく、完全に修飾された12マーおよび14マーのLNA-アンチmiRは、ホモ二量体を形成する傾向が高いからだろう。mir-21認識配列の全体にわたる完全にLNA修飾された8マーLNA-アンチmirのスライディングウインドウ（sliding window）を使った実験により、miRNA機能にとっては、LNA-アンチmiRの十分なTm値に加えて、シード領域が、したがってLNA-アンチmiRによってターゲットとされる最適な領域が、最も重要であることが、明確に証明される。
（表5）相補的RNAオリゴヌクレオチドに対して測定されたmiR-21 LNA-アンチmiRのTm値
Figure 2010539959
（結論）Tm値は、ルシフェラーゼレポーターを使って得られた実験データと共に、LNA-アンチmiRによる強力な拮抗作用が、Tmに依存するだけでなく、マイクロRNA認識配列内でのLNA-アンチmiRの位置決めにも依存することを示している。
（材料と方法）
T m 測定：オリゴヌクレオチド：miR-21 RNA二重鎖を500μlのRNaseフリーH2Oに希釈して3μMにし、500μlの2×Tm-バッファー（200mM NaCl、0.2mM EDTA、20mM Na-リン酸、pH 7.0）と混合した。その溶液を95℃に3分間加熱してから、室温で30分間アニールさせた。二重鎖融解温度（Tm）は、Peltier温度プログラマーPTP6を装備したLambda 40 UV/VIS分光測光器で、PE Templabソフトウェア（Perkin Elmer）を使って測定した。260nmでの吸収を記録しながら、温度を20℃から95℃まで昇温し、次に25℃まで降温させた。融解およびアニーリングの両方の一次導関数および極大を使って、二重鎖融解温度を評価した。
ヒト肝細胞細胞株HepG2において、8マー（SEQ ID #3205）と15マー（SEQ ID #3204）のLNA-アンチmiRを比較することによる、miR-21拮抗作用の評価
本発明者らは、本願において、完全にLNA修飾されホスホロチオレート化された8マーLNA-アンチmiRが、ヒト子宮頸癌細胞株HeLa、ヒト乳癌細胞株MCF-7およびヒト前立腺がん細胞株PC3において、miR-21を効果的に拮抗することを、先に示した。本発明者らは、このスクリーニングアプローチを、ヒト肝細胞がん細胞株HepG2に拡張した。miR-21に対する8マーLNA-アンチmiRオリゴヌクレオチドの効率を評価するために、成熟miR-21用の完全マッチターゲット部位がウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子の3'UTR内にクローニングされたルシフェラーゼレポーターコンストラクトを作製した。miR-21阻害をモニターするために、HepG2細胞に、ルシフェラーゼコンストラクトを、さまざまな濃度のmiR-21アンタゴニストSEQ ID #3205（8マー）ならびに特異性を比較するための8マーLNA-アンチmiRミスマッチ（SEQ ID #3218）および力価を比較するための15マー（SEQ ID #3204）と共に、トランスフェクトした。24時間後に、ルシフェラーゼ活性を測定した。
（結果）ルシフェラーゼレポーター実験は、miR-21に対する15マーLNA-アンチmiR（SEQ ID #3204）によるルシフェラーゼmiR-21レポーター活性の用量依存的抑制解除を示した。しかし、ルシフェラーゼレポーターの完全な抑制解除は、高濃度でさえ得られなかった（図20）。対照的に、8マーの完全にLNA修飾されたLNA-アンチmiR（SEQ ID #3205）をトランスフェクトした細胞は、5nMで早くも、完全な抑制解除を見せて、15マーLNA-アンチmiRと比較して著しく改善された力価を示した。8マー完全マッチと8マーミスマッチの特異性を比較すると、ミスマッチLNA-アンチmiR（SEQ ID #3218）は、抑制解除を全く示さなかったことから、miR-21に対するLNA-アンチmiR化合物の高い特異性が証明された。
（結論）8マー（SEQ ID #3205）は、miR-21のターゲティングに関して、15マーLNA-アンチmiRよりも強力であり、SEQ ID #3205によるmiR-21の拮抗作用は特異的である。
（材料と方法）
細胞株：ヒト肝細胞HepG2細胞株はECACCから購入した（#85011430）。HepG2細胞は、10％ウシ胎仔血清、2mM Glutamaxおよび25μg/mlゲンタマイシンを補足したEMEM培地で培養した。
トランスフェクション：6穴プレートに1ウェルあたり650,000個の細胞を播種し、リバーストランスフェクションを行なった。HepG2細胞に、0.6μgのmiR-21または空psiCHECK2ベクターを、2.55μlのLipofectamine2000（Invitrogen）と共に、製造者の指示に従ってトランスフェクトした。さまざまな濃度のLNA-アンチmiRもトランスフェクトした。24時間後に、ルシフェラーゼ測定のために細胞を収集した。
ルシフェラーゼアッセイ：細胞をPBSで洗浄し、300μlの1×Passive Lysis Buffer（Promega）をウェルに加えた。プレートを振盪機上に30分間置いた後、細胞溶解物をエッペンドルフチューブに移した。細胞溶解物を2,500rpmで10分間遠心分離した後、50μlを96穴プレートに移し、製造者の指示（Promega）に従ってルシフェラーゼ測定を行なった。
ヒト肝細胞細胞株Huh-7における、8マーSEQ ID #3205 LNA-アンチmiRを使った、Pdcd4 3'UTR中のmiR-21ターゲット部位とmiR-21との相互作用の実証
腫瘍抑制因子タンパク質Pdcd4は腫瘍の促進および進行を阻害する。さらにまた、肺がんおよび直腸結腸がんにおけるPdcd4のダウンレギュレーションは、患者の予後不良とも関連づけられている。最近、Asanganiら（Oncogene 2007）およびFrankelら（J Biol Chem 2008）は、Pdcd4 3'-UTRにはmiR-21用のターゲット部位が保存されていること、および細胞にアンチmiR-21をトランスフェクトすることにより、Pdcd4タンパク質の増加が起こることを示した。そこで本発明者らは、前述のmiR-21ターゲット部位を包含するPdcd4の3'UTR領域の313ntを保持しているルシフェラーゼレポータープラスミドを構築し、それを、異なるLNA-アンチmiRおよびプレ-miR-21（10nM）と共に、Huh-7細胞に同時トランスフェクトした。異なるLNA-アンチmiRとは、SEQ ID #3205（8マー、完全マッチ）、SEQ ID #3218（8マー、ミスマッチ）およびSEQ ID #3204（15マー、DNA/LNAミックスマー）である。ルシフェラーゼ測定を24時間後に行なった。
（結果）図21に示すように、Pdcd4 3'UTRルシフェラーゼレポーターおよびSEQ ID #3205をトランスフェクトした細胞では、ルシフェラーゼ活性の増加が観察されたことから、Pdcd4 3'UTRとmiR-21の間の相互作用が示される。しかし、ミスマッチ化合物SEQ ID #3218を細胞にトランスフェクトしても、ルシフェラーゼ活性の変化は観察されなかった。この化合物はmiR-21を拮抗しないので、これは予想されることだった。8マーLNA-アンチmiRを15マーLNA-アンチmiR（SEQ ID #3204）と比較したところ、完全にLNA修飾されホスホロチオレート化された短いLNA-アンチmiRの方が著しく強力であり、先のデータが確認された。
（材料と方法）
細胞株：ヒトヘパトーマ細胞株Huh-7は、R. Bartinschlager (ハイデルベルク大学分子ウイルス学科）から寄贈された。Huh-7細胞は、10％ウシ胎仔血清、2mM Glutamax、1×NEAAおよび25μg/mlゲンタマイシンを補足したDMEM培地で培養した。
トランスフェクション：トランスフェクションの前日に、96ウェルプレートに、1ウェルあたり11,000個の細胞を播種して、翌日には50〜70％コンフルエントになるようにした。トランスフェクションの日に、Huh-7細胞に、20ngのPdcd4 3'UTR/psiCHECK2または空psiCHECK2ベクターを、10nMプレ-miR-21（Ambion）および0.14μlのLipofectamine2000（Invitrogen）と共に、製造者の指示に従ってトランスフェクトした。さまざまな濃度のLNA-アンチmiRオリゴヌクレオチドもトランスフェクトした。24時間後に、ルシフェラーゼ測定のために細胞を収集した。
ルシフェラーゼアッセイ：細胞を洗浄し、30μlの1×Passive Lysis Buffer（Promega）を各ウェルに加えた後、その96ウェルプレートをオービタルシェーカー上に置いた。30分後に、Luciferase Assay Buffer II（Promega製のDual-Luciferase Reporter Assay System、カタログ番号E1910）に溶解した50μlのルシフェラーゼ基質を、溶解した細胞を含むウェルに加え、ルシフェラーゼ測定を製造者の指示（Promega）に従って行なった。
8マーLNA-アンチmiR（SEQ ID #3205）によるmiR-21拮抗作用の機能的読出しとしてのPdcd4タンパク質レベルの評価
さらに本発明者らは、HeLa細胞にSEQ ID #3205（完全マッチ）、SEQ ID #3218（ミスマッチ）、SEQ ID #3219（スクランブル）をトランスフェクトし、24時間後のPdcd4タンパク質レベルをウェスタンブロットで解析するということも行なった（図22）。図示するように、SEQ ID #3205が添加された細胞から得られるタンパク質抽出物では、SEQ ID #3205によるmir-21の拮抗作用ゆえに、2つの対照LNAオリゴヌクレオチドとは対照的に、Pdcd4タンパク質レベルが増加する。
（結論）8マー（SEQ ID #3205）を使ったmiR-21の拮抗作用は、miR-21の直接ターゲットPdcd4拮抗作用の抑制解除につながる。
（材料と方法）
細胞株：ヒト子宮頸癌細胞株HeLaはECACCから購入した（#93021013）。HeLa細胞は、10％ウシ胎仔血清、2mM Glutamax、1×NEAAおよび25μg/mlゲンタマイシンを補足したEMEM培地で培養した。
トランスフェクション：トランスフェクションの前日に、6穴プレートに、1ウェルあたり200,000個の細胞を播種して、翌日には50〜70％コンフルエントになるようにした。トランスフェクションの日に、HeLa細胞に、5nMのLNAオリゴヌクレオチドおよび2.5μg/mlのLipofectamine2000（Invitrogen）を、製造者の指示に従ってトランスフェクトした。24時間後に、ウェスタンブロット解析のために細胞を収集した。
ウェスタンブロット：細胞をPBSで洗浄し、トリプシン処理し、エッペンドルフチューブに移し、50μlの溶解バッファー（1×RIPA）を加えた。細胞溶解物を氷上に20分間置き、10,000rpmで10分間遠心した。等量（15μlの細胞溶解物）を4-12％BIS-TRISゲルにのせた。iBlot（Invitrogen）を使用し、製造者の指示に従って、タンパク質をニトロセルロースメンブレンに転写した。そのメンブレンを、1：2000濃度の一次アフィニティー精製ウサギ血清抗体Pdcd4（Rockland）と共に、4℃で終夜インキュベートした。対照として、抗β-チューブリン抗体（Thermo Scientific）を1：5000希釈で使用した。免疫活性バンドをECL Plus（Amersham）で可視化した。
8マー完全マッチLNA-アンチmiR SEQ ID #3205およびLNAミスマッチ対照SEQ ID #3218の潜在的肝毒性の評価
各化合物を、雌NMRIマウスに、25mg/kg、5mg/kgおよび1mg/kgの用量で、1日おきに2週間注射した。動物を屠殺し、ALTおよびAST分析のために、血清を全身から集めた。図23に示すように、ALTおよびASTレベルは、食塩水またはSEQ ID #3218（ミスマッチ対照）と比較して、SEQ ID #3205では、上昇しなかった。ただし1匹のマウスは、血漿と比較して6〜8倍高レベルのALTおよびASTを含有する赤血球が血清試料に混入したため、増加したレベル（赤色で示す）を示した。5mg/kgおよび1mg/kgを投与されたマウスも、ALTおよびASTレベルについて分析され、食塩水処置対照動物との比較で変化を示さなかった（データ未掲載）。
（材料と方法）
実験計画：
Figure 2010539959
 屠殺：動物は頸椎脱臼によって屠殺した。
ALT/AST用の血清試料採取：動物を70％CO2-30％O2で麻酔してから、後眼窩静脈洞（retro orbital sinus）血を集めた。血液はS-monovette Serum-Gelバイアルに集めた。血清試料を個々のマウスから収集し、保存した。血液試料は室温で2時間保存した後、3000rpm、室温で10分間遠心分離した。血清画分を湿った氷（wet ice）上のエッペンドルフチューブ中に収集した。
ALTおよびAST測定：ALTおよびAST測定は、96穴プレートで、ABX Pentra製のALT試薬およびAST試薬（A11A01627-ALT、A11A01629-AST）を使って、製造者の指示に従って行なった。簡単に述べると、血清試料をH2Oで2.5倍に希釈し、各試料を二重にアッセイした。50μlの希釈試料または標準（ABX Pentraのmultical-A11A01652）を各ウェルに加えた後、200μlの37℃ASTまたはALT試薬ミックスを各ウェルに加えた。速度論的測定を、340nm、37℃において、30秒間隔で5分間行なった。
短いLNA-アンチmiR（SEQ ID #3207）によるmiR-155拮抗作用に関する機能的読出しとしてのPU.1タンパク質レベルの評価
本発明者らは、miR-155を拮抗する8マー（SEQ ID #3207）が、マウスマクロファージRAW細胞において、miR-155ターゲットc/EBPベータの抑制解除をもたらすことを、先に示した。SEQ ID #3207の力価をさらに実証するために、もう一つのmiR-155ターゲットPU.1のタンパク質レベルを決定した。短いLNA-アンチmiR（SEQ ID #3207）によるmiR-155拮抗作用に関する機能的読出しとして、ウェスタンブロットを行なった。拮抗作用は、8マー（SEQ ID #3207）完全マッチまたは8マー対照LNAのどちらか一方を、プレ-miR-155の存在下または非存在下でトランスフェクトしたヒト単球THP-1細胞株で実証した。LPSを使ってmiR-155蓄積を誘発し、24時間後に細胞を収集した。
（結果）プレ-miR-155をトランスフェクトしたTHP-1細胞はPU.1レベルの低下を示す（図24）。完全にLNA修飾されホスホロチオレート化されたSEQ ID #3207を細胞にトランスフェクトすると、miR-155が効果的に拮抗され、PU.1タンパク質のレベルは変化しないことになる。これと比較して、細胞に8マーLNA対照をトランスフェクトすると、PU.1レベルが低下したことから、SEQ ID #3207 LNA-アンチmiRによるmiR-155の拮抗作用は特異的であることが示された。
（結論）8マーを使ったmiR-155の拮抗作用は、ヒトTHP-1細胞において、直接のターゲットPU.1の抑制解除をもたらす。
（材料と方法）
細胞株：ヒト単球THP-1細胞株はECACCから購入した（#88081201）。THP-1細胞は、10％ウシ胎仔血清を補足したL-グルタミン含有RPMIで培養した。
トランスフェクション：前日に、12穴プレートに、1ウェルあたり200,000個の細胞を播種した。トランスフェクションの日に、THP-1細胞に、5nmolのプレ-miR-155（Ambion）および/または5nMのLNA-アンチmiRを、Lipofectamine2000（Invitrogen）と共に、製造者の指示に従ってトランスフェクトした。トランスフェクション複合体と共に4時間インキュベートしてから、LPS（100ng/ml）を細胞に加えた。24時間後に、タンパク質抽出およびウェスタンブロット解析のために細胞を収集した。
ウェスタンブロット：細胞をPBSで洗浄し、トリプシン処理し、エッペンドルフチューブに移し、50μlの溶解バッファー（1×RIPA）を加えた。細胞溶解物を氷上に20分間置き、10,000rpmで10分間遠心した。等量（15μlの細胞溶解物）を4-12％BIS-TRISゲルにのせた。iBlot（Invitrogen）を使用し、製造者の指示に従って、タンパク質をニトロセルロースメンブレンに転写した。メンブレンを1：2000濃度のウサギモノクローナルPU.1抗体（Cell Signaling）と共に4℃で終夜インキュベートした。イコールローディングコントロールとして、チューブリン（Thermo Scientific）を1：5000希釈で使用した。免疫活性バンドをECL Plus（Amersham）で可視化した。
7マーSEQ ID #3225 LNA-アンチmiRによるmiR-221/222ファミリーの拮抗作用に関する機能的読出しとしてのp27タンパク質レベルの評価
先の研究（le Sageら 2007、Galardiら, 2007）により、miR-221とmiR-222は、細胞周期調節に関与する腫瘍抑制因子遺伝子p27の発現を、転写後調節することが示されている。これらの研究では、miR-221およびmiR-222のダウンレギュレーションが、p27の発現レベルを増加させることが示された。そこで、7マーSEQ ID #3225 LNA-アンチmiRによるmiR-221/222ファミリーの拮抗作用に関する機能的読出しとして、本発明者らは、PC3細胞へのLNA-アンチmiR SEQ ID #3225のトランスフェクション後に、p27のタンパク質レベルを決定した。
（結果）図25に示すように、miR-221およびmiR-222のシード配列をターゲットとする7マーLNA-アンチmiR SEQ ID #3225のトランスフェクションは、非トランスフェクトPC3細胞または本発明者らのLNAスクランブル対照トランスフェクトPC3細胞と比較して、p27タンパク質レベルの用量依存的増加をもたらした。これらの結果は、7マーLNA-アンチmiRが、miR-221/222ファミリーを効果的に拮抗して、わずか5nMの濃度で直接のターゲットp27の抑制解除をタンパク質レベルでもたらすことができるということを明確に証明している。
（結論）miR-221/222ファミリー中のシード配列をターゲットとする完全にLNA修飾された7マーLNA-アンチmiRは、5nMで、両方のmiRNAを効果的に拮抗して、直接のターゲットp27の抑制解除をタンパク質レベルでもたらすことができる。
（材料と方法）
細胞株：ヒト前立腺癌PC3細胞株はECACCから購入した（#90112714）。PC3細胞は、10％ウシ胎仔血清、2mM Glutamaxおよび25μg/mlゲンタマイシンを補足したDMEM培地で培養した。
トランスフェクション：トランスフェクションの前日に、6穴プレートに、1ウェルあたり250,000個の細胞を播種して、翌日には50％コンフルエントになるようにした。トランスフェクションの日に、PC3細胞に、さまざまな濃度のLNA-オリゴヌクレオチド（図25参照）をLipofectamine2000と共にトランスフェクトした。24時間後に、タンパク質抽出およびウェスタンブロット解析のために、細胞を収集した。
ウェスタンブロット：細胞をPBSで洗浄し、トリプシン処理し、エッペンドルフチューブに移し、50μlの溶解バッファー（1×RIPA）を加えた。細胞溶解物を氷上に20分間置いてから、10,000rpmで10分間遠心した。等量（15μlの細胞溶解物）を4-12％BIS-TRISゲルにのせた。iBlot（Invitrogen）を使用し、製造者の指示に従って、タンパク質をニトロセルロースメンブレンに転写した。メンブレンを1：1000希釈の一次モノクローナルマウス抗体p27（BD Biosciences）と共に4℃で終夜インキュベートした。ローディングコントロールとして、チューブリン（Thermo Scientific）を1：5000希釈で使用した。免疫活性バンドをECL Plus（Amersham）で可視化した。
7マーSEQ ID #3225 LNA-アンチmiRによるmiR-221/222のノックダウンはPC3細胞のコロニー形成を減少させる
細胞トランスフォーメーションの特徴は、半固形培地で足場非依存的に成長するという腫瘍細胞の能力である。そこで本発明者らは、がんに関連する表現型アッセイである軟寒天アッセイで腫瘍細胞の減少が測定されることから、このアッセイを行なった。本発明者らは、SEQ ID #3225（完全マッチ）およびSEQ ID #3231（スクランブル）をPC3細胞にトランスフェクトし、24時間後に、細胞を軟寒天にプレーティングした。12日後にコロニーを計数した。SEQ ID #3225によるmiR-221およびmiR-222の阻害は、スクランブル対照LNA-アンチmiRと比較して、軟寒天中で成長するコロニーの量を減少させる（これは腫瘍細胞の減少を示す）ことができるということを、図26に示す。
（結論）miR-221/222ファミリーをターゲットとする7マー（SEQ ID #3225）は、軟寒天におけるコロニーの数を減少させ、それは、PC3細胞の増殖停止を示す。
（材料と方法）
細胞株：ヒト前立腺癌PC3細胞株はECACCから購入した（#90112714）。PC3細胞は、10％ウシ胎仔血清、2mM Glutamaxおよび25μg/mlゲンタマイシンを補足したDMEM培地で培養した。
トランスフェクション：トランスフェクションの前日に、6穴プレートに、1ウェルあたり250,000個の細胞を播種して、翌日には50％コンフルエントになるようにした。トランスフェクションの日に、PC3細胞に25nMの異なるLNAオリゴヌクレオチドをLipofectamine 2000と共にトランスフェクトした。
軟寒天におけるクローン増殖：0.5％寒天を含有する基層上の0.35％寒天に2.5×103個のPC3細胞を播種した。トランスフェクションの24時間後に細胞をプレーティングした。プレートを湿潤培養器中、37℃、5％CO2で12日間インキュベートし、0.005％クリスタルバイオレットで1時間染色した後、細胞を計数した。アッセイは3重に行なった。
let-7a前駆体miRNAおよびルシフェラーゼセンサーアッセイをトランスフェクトしたHuh-7細胞における6〜9マーのLNA-アンチmiRによるlet-7拮抗作用の評価
miRNAのlet-7ファミリーのターゲティングおよび拮抗に関して、完全にLNA修飾された6〜9マーのオリゴヌクレオチドの効率を評価するために、HMGA2 3'UTRのおよそ800bpを含有するルシフェラーゼセンサーコンストラクトを作製した。ベクターにクローニングされた配列は、Mayrら（Science, 2007）ならびにLeeおよびDutta（Genes Dev, 2007）が先に証明したとおり、7つの機能的let-7結合部位のうちの4つ（部位2〜5）を含有する。let-7阻害をモニターするために、肝細胞癌細胞株Huh-7（内在性let-7のレベルは低〜非存在）に、ルシフェラーゼセンサーコンストラクト、let-7a前駆体miRNA、および増加する一連の濃度の6〜9マーlet-7アンタゴニスト（SEQ ID #3232、-3233、-3227、-3234、-3235；図27参照）をトランスフェクトした。6〜9マーLNA-アンチmiRを、陽性対照としての、let-7aに対する15マーであるSEQ ID #3226と比較した。24時間後に、ルシフェラーゼ活性を測定した。
（結果）図28に示すように、完全にLNA修飾された8マーおよび9マーのLNA-アンチmiR（SEQ ID #3227、SEQ ID #3234、およびSEQ ID #3235）は、このルシフェラーゼアッセイにおけるlet-7ターゲットの抑制解除に関して、陽性対照15マーSEQ ID #3226と同様の力価を示す。これらの極めて強力な化合物では、完全なターゲット抑制解除が、1〜5nMで早くも達成されるのに対し、7マーのSEQ ID #3233は、同じ効果を生み出すのにわずかに高い濃度（10nM）で存在する必要がある。しかし、6マーのSEQ ID #3232は、50nMという高濃度でさえ、効果を示さない。7〜9マーおよび15マーのLNA-アンチmiRによるルシフェラーゼ活性の抑制解除は用量依存的であり、わずかに力価の低いSEQ ID #3233の場合は、それが特に明確である。
（結論）結論として、8〜9マーのLNA-アンチmiR（SEQ ID #3227、SEQ ID #3234、およびSEQ ID #3235）は、インビトロでのlet-7a阻害に関し、let-7aをターゲットとする15マーLNA-アンチmiR SEQ ID #3226と比較して、同等なアンタゴニスト力価を示す。強力な効果が、わずかに高濃度においてではあるが、7マーSEQ ID #3233でも見られたのに対し、6マーは試験した濃度では効果を持たない。
（材料と方法）
細胞株：肝細胞癌細胞株Huh-7は、R. Bartinschlager（ハイデルベルク大学分子ウイルス学科）から寄贈された。Huh-7細胞は、10％ウシ胎仔血清、2mM Glutamax、1×NEAAおよび25μg/mlゲンタマイシンを補足したDMEM培地で培養した。
トランスフェクション：トランスフェクションの前日に、96穴プレートに、1ウェルあたり8,000個の細胞を播種して、翌日には60〜80％コンフルエントになるようにした。トランスフェクションの日に、各ウェル中のHuh-7細胞に、20ngのHMGA2 3'UTR/psiCHECK2プラスミド、let-7a前駆体miRNA（Dharmacon；最終濃度10nM）、LNA-アンチmiR SEQ ID #3232、-3233、-3227、-3234、-3235、-3226；最終濃度0〜50nM）を、0.17μlのLipofectamine2000（Invitrogen）と共に、製造者の指示に従ってトランスフェクトした。24時間後に、ルシフェラーゼ測定のために細胞を収集した。
ルシフェラーゼアッセイ：成長培地を捨て、30μlの1×Passive Lysis Buffer（Promega）を各ウェルに加えた。オービタルシェーカー上で15〜30分インキュベートした後、ウミシイタケおよびホタルルシフェラーゼ測定を、製造者の指示（Promega）に従って行なった。
ルシフェラーゼセンサーアッセイをトランスフェクトしたHuh-7細胞における8マーおよび15マーのLNA-アンチmiRによる全let-7ファミリー拮抗作用の評価
miRNAの全let-7ファミリーの拮抗に関して、完全にLNA修飾された8マーオリゴヌクレオチドの効率を評価するために、先の実施例で述べたものと同じルシフェラーゼセンサーコンストラクトを使用した。ここでも、Huh-7細胞（内在性let-7のレベルは低〜非存在）に、センサーコンストラクト、ファミリーを代表するlet-7a、let-7d、let-7e、またはlet-7i前駆体の一つ、および増加する一連の濃度のアンタゴニストSEQ ID #3227をトランスフェクトした。8マーLNA-アンチmiRを、強力な陽性対照としての、let-7aに対する15マーであるSEQ ID #3226と比較した。24時間後に、ルシフェラーゼ活性を測定した。
（結果）図29に示すように、完全にLNA修飾された8マーLNA-アンチmiR（SEQ ID #3227）は、ルシフェラーゼセンサーアッセイにおけるさまざまなlet-7ターゲットの抑制解除に関して、陽性対照15マーSEQ ID #3226と同様の力価を示す。8マーでは、ほぼ完全なターゲット抑制解除が、0.5〜1nMで早くも達成される。ただし、let-7eプレmiR（図29C）は例外であって、この場合は、SEQ ID #3227の8つのヌクレオチドのうちの7つがターゲットにハイブリダイズする。しかし、この場合は末端ミスマッチが存在するにもかかわらず、SEQ ID #3227は、5nMで完全なターゲット抑制解除をもたらす。陽性対照15マーは、すべての前駆体の強力な拮抗作用を示し、0.5nMでほぼ完全な抑制解除をもたらす。8マーおよび15マーのLNA-アンチmiRによるルシフェラーゼ活性の抑制解除は、4つのパネル（図29A〜D）のすべてで認められるとおり、明確に用量依存的である。
（結論）結論として、8マーLNA-アンチmiR（SEQ ID #3227）は、4つの代表的let-7ファミリーメンバーに対して、したがっておそらくはファミリー全体に対して、インビトロで強力なアンタゴニストである。15マーの陽性対照アンタゴニストであるSEQ ID #3226と比較して、8マーは、4つのターゲットのうち3つに関して、同等に強力であり、残る1つのlet-7eについては、力価がわずかに低かったが、これは、この場合における末端ミスマッチによって説明される。
（材料と方法）
細胞株：肝細胞癌細胞株Huh-7は、R. Bartinschlager (ハイデルベルク大学分子ウイルス学科）から寄贈された。Huh-7細胞は、10％ウシ胎仔血清、2mM Glutamax、1×NEAAおよび25μg/mlゲンタマイシンを補足したDMEM培地で培養した。
トランスフェクション：トランスフェクションの前日に、96穴プレートに、1ウェルあたり8,000個の細胞を播種して、翌日には60〜80％コンフルエントになるようにした。トランスフェクションの日に、各ウェル中のHuh-7細胞に、20ngのHMGA2 3'UTR/psiCHECK2プラスミド、let-7a、-7d、-7e、または-7i前駆体miRNA（Dharmacon；最終濃度10nM）、およびLNA-アンチmiR（SEQ ID #3227およびSEQ ID #3226；最終濃度0〜50nM）を、0.17μlのLipofectamine2000（Invitrogen）と共に、製造者の指示に従ってトランスフェクトした。24時間後に、ルシフェラーゼ測定のために細胞を収集した。
ルシフェラーゼアッセイ：成長培地を捨て、30μlの1×Passive Lysis Buffer（Promega）を各ウェルに加えた。オービタルシェーカー上で15〜30分インキュベートした後、ウミシイタケおよびホタルルシフェラーゼ測定を、製造者の指示（Promega）に従って行なった。
ルシフェラーゼセンサーアッセイをトランスフェクトしたHeLa細胞における、8マーLNA-アンチmiR SEQ ID #3227による、内在性let-7拮抗作用の評価
内在性let-7のターゲティングおよび拮抗に関する、完全にLNA修飾された8マーオリゴヌクレオチドの効率を決定するために、先の2つの実施例で述べたものと同じルシフェラーゼセンサーコンストラクトを、SEQ ID #3227と共に、子宮頸がん細胞株HeLa（これは、Q-PCRで決定すると、中〜高レベルのlet-7を発現させている；データ未掲載）にトランスフェクトした。空psiCHECK-2ベクターを陰性対照として含めた。
（結果）図30に示すように、完全にLNA修飾された8マーLNA-アンチmiR SEQ ID #3227は、内在性let-7の強力な拮抗作用を示し、5〜10nMの濃度で完全なターゲット抑制解除をもたらす。ルシフェラーゼ活性の抑制解除は用量依存的であり、1nM付近で始まり、約10nMでプラトーに達する。
（結論）結論として、8マーLNA-アンチmiR（SEQ ID #3227）は、インビトロで内在性let-7に対しても強力なアンタゴニストであり、したがってmiRNAファミリー全体を、短い完全にLNA修飾されたアンタゴニストでうまくターゲティングすることができるという決定的証拠になる。
（材料と方法）
細胞株：子宮頸がん細胞株HeLaはATCCから購入した（#CCL-2（商標））。HeLa細胞は10％ウシ胎仔血清、2mM Glutamax、1×NEAAおよび25μg/mlゲンタマイシンを補足したイーグルMEM培地で培養した。
トランスフェクション：トランスフェクションの前日に、96穴プレートに1ウェルあたり8,000個の細胞を播種して、翌日には50〜70％コンフルエントになるようにした。トランスフェクションの日に、各ウェル中のHeLa細胞に、20ngのHMGA2 3'UTR/psiCHECK2プラスミドまたはpsiCHECK-2（空ベクター）、およびLNA-アンチmiR SEQ ID #3227（最終濃度0〜50nM）を、0.17μlのLipofectamine2000（Invitrogen）と共に、製造者の指示に従って同時トランスフェクトした。24時間後に、ルシフェラーゼ測定のために細胞を収集した。
ルシフェラーゼアッセイ：成長培地を捨て、30μlの1×Passive Lysis Buffer（Promega）を各ウェルに加えた。オービタルシェーカー上で15〜30分インキュベートした後、ウミシイタケおよびホタルルシフェラーゼ測定を、製造者の指示（Promega）に従って行なった。
ヒト大腸癌細胞株HCT116における、8マーLNA-アンチmiR-21（#3205）と8マー（#3219）スクランブル対照LNAによる、miR-21拮抗作用の評価
本発明者らは、本願において、完全にLNA修飾されホスホロチオレート化された8マーLNA-アンチmiRがヒト子宮頸癌細胞株HeLa、ヒト乳癌細胞株MCF-7、ヒト前立腺がん細胞株PC3およびヒト肝細胞癌HepG2細胞株において、miR-21を効果的に拮抗することを、先に示した。本発明者らは、このスクリーニングアプローチをヒト大腸癌細胞株HCT116に拡張した。miR-21に対する8マーLNA-アンチmiRオリゴヌクレオチドの効率を評価するために、成熟miR-21用の完全マッチターゲット部位がウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子の3'UTR中にクローニングされたルシフェラーゼレポーターコンストラクトを作製した。miR-21阻害をモニターするために、HCT116細胞に、そのルシフェラーゼコンストラクトを、miR-21アンタゴニスト#3205（8マー）および特異性を比較するための8マーLNAスクランブル対照（#3219）と共にトランスフェクトした。24時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。
（結果）ルシフェラーゼレポーター実験は、miR-21に対する8マーLNA-アンチmiR（#3205）によるルシフェラーゼmiR-21レポーター活性の用量依存的な抑制解除を示し、5nMで完全な抑制解除が得られた（図31）。8マー完全マッチと8マースクランブル対照の特異性を比較すると、スクランブル対照LNA-アンチmiR（#3219）は抑制解除を全く示さなかったことから、miR-21に対するLNA-アンチmiR化合物の高い特異性が証明された。
（結論）8マー（#3205）はmiR-21のターゲティングに関して強力であり、#3205によるmiR-21の拮抗作用は特異的である。
（材料と方法）
細胞株：ヒト大腸癌HCT116細胞株はATCCから購入した（CCL-247）。HCT116細胞は、10％ウシ胎仔血清および25μg/mlゲンタマイシンを補足したRPMI培地で培養した。
トランスフェクション：12穴プレートに、1ウェルあたり110,000個の細胞を播種し、トランスフェクションを行なった。HCT116細胞に、0.3μgのmiR-21ルシフェラーゼセンサープラスミドまたは空psiCHECK2ベクターを、1.2μlのLipofectamine2000（Invitrogen）と共に、製造者の指示に従ってトランスフェクトした。さまざまな濃度のLNA-アンチmiRおよび対照オリゴヌクレオチドもトランスフェクトした。24時間後に、ルシフェラーゼ測定のために細胞を収集した。
ルシフェラーゼアッセイ：細胞をPBSで洗浄し、250μlの1×Passive Lysis Buffer（Promega）をウェルに加えた。プレートを振盪機上に30分間置いた後、細胞溶解物をエッペンドルフチューブに移した。細胞溶解物を2,500rpmで10分間遠心分離した後、50μlを96穴プレートに移し、製造者の指示（Promega）に従ってルシフェラーゼ測定を行なった。
8マー#3205 LNA-アンチmiRによるmiR-21のノックダウンはPC3細胞のコロニー形成を減少させる
細胞トランスフォーメーションの特徴は、半固形培地で足場非依存的に成長するという腫瘍細胞の能力である。そこで本発明者らは、がんに関連する表現型アッセイである軟寒天アッセイで腫瘍細胞の減少が測定されることから、このアッセイを行なった。本発明者らは、#3205（完全マッチLNA-アンチmiR-21）および#3219（LNAスクランブル対照）をPC3細胞にトランスフェクトし、24時間後に、細胞を軟寒天にプレーティングした。12日後にコロニーを計数した。#3205によるmiR-21の阻害は、スクランブル対照LNA処理対照または無処理対照（トランスフェクトはするが、LNAを添加しないもの）と比較して、軟寒天中で成長するコロニーの量を減少させる（これは腫瘍細胞の減少を示す）ことができるということを、図32に示す。
（結論）miR-21ファミリーをターゲットとする8マー（#3205）は、軟寒天におけるコロニーの数を減少させ、それは、PC3細胞の増殖停止を示す。
（材料と方法）
細胞株：ヒト前立腺癌PC3細胞株はECACCから購入した（#90112714）。PC3細胞は、10％ウシ胎仔血清、2mM Glutamaxおよび25μg/mlゲンタマイシンを補足したDMEM培地で培養した。
トランスフェクション：トランスフェクションの前日に、6穴プレートに、1ウェルあたり250,000個の細胞を播種して、翌日には50％コンフルエントになるようにした。トランスフェクションの日に、PC3細胞に、25nMの異なるLNAオリゴヌクレオチドをLipofectamine 2000と共にトランスフェクトした。
軟寒天におけるクローン増殖：0.5％寒天を含有する基層上の0.35％寒天に2.5×103個のPC3細胞を播種した。トランスフェクションの24時間後に細胞をプレーティングした。プレートを湿潤培養器中、37℃、5％CO2で12日間インキュベートし、0.005％クリスタルバイオレットで1時間染色した後、細胞を計数した。アッセイは3重に行なった。
8マー#3205 LNA-アンチmiRによるmiR-21のサイレンシングはHepG2細胞のコロニー形成を減少させる
ヒト肝細胞癌細胞株HepG2ではmiR-21が過剰発現される。これらの細胞では#3205を使ってmiR-21センサープラスミドのルシフェラーゼ活性を調節できることを、本発明者らは先に示した。HepG2細胞に#3205および#3219（スクランブル8マー）をトランスフェクトし、24時間後に軟寒天中にプレーティングした。17日後に顕微鏡でコロニーを計数した。
（結果）#3205によるmiR-21の阻害は、軟寒天中で成長するコロニーの量を減少させる（これは増殖停止が起こったことを示す）ことができるということを、図33に示す。また、本発明者らのスクランブル8マー対照#3219はコロニーの数に有意な効果を持たなかった。
（結論）miR-21をターゲットとする8マー（#3205）は、軟寒天におけるコロニーの数を減少させ、それは、HepG2細胞の増殖停止を示す。
（材料と方法）
細胞株：ヒト肝細胞HepG2細胞株はECACCから購入した（#85011430）。HepG2細胞は、10％ウシ胎仔血清、2mM Glutamaxおよび25μg/mlゲンタマイシンを補足したEMEM培地で培養した。
トランスフェクション：6穴プレートに1ウェルあたり650,000個の細胞を播種し、リバーストランスフェクションを行なった。HepG2細胞に、0.6μgのmiR-21ルシフェラーゼセンサープラスミドまたは空psiCHECK2ベクターを、2.55μlのLipofectamine2000（Invitrogen）と一緒に、製造者の指示に従ってトランスフェクトした。LNA-アンチmiRおよび対照オリゴヌクレオチドもさまざまな濃度でトランスフェクトした。24時間後に、ルシフェラーゼ測定のために細胞を収集した。
軟寒天におけるクローン増殖：0.5％寒天を含有する基層上の0.35％寒天に2.0×103個のHepG2細胞を播種した。トランスフェクションの24時間後に細胞をプレーティングした。プレートを湿潤培養器中、37℃、5％CO2で17日間インキュベートし、0.005％クリスタルバイオレットで1時間染色した後、細胞を計数した。アッセイは3重に行なった。
8マー#3205 LNA-アンチmiRによるmiR-21のサイレンシングは、PC3細胞において、細胞移動を阻害する
細胞移動は、創傷治癒アッセイ（＝引っ掻き傷アッセイ）を行なうことによってモニターすることができる。このアッセイでは、「引っ掻き傷」を細胞単層に作り、画像を最初にキャプチャすると共に、細胞移動中も定期的にキャプチャする。画像を比較することにより、細胞の移動速度を定量化することができる。これをヒト前立腺がん細胞株PC3で行なった。細胞を播種し、3日目に、細胞にトランスフェクトし、翌日、100％コンフルエントに達したら、引っ掻き傷（＝創傷）を作った。引っ掻き傷を作ったら、初期の創傷を記録するために写真撮影をした。その後、異なる時点において、フリーソフトウェアプログラムImage Jで、創傷閉鎖の面積を測定した。図34Aに示すように、PC3細胞は、25nMの#3205（完全マッチ、miR-21）、または対照#3219で処理されていたか、トランスフェクトされていなかった。24時間後に写真を撮影し、各時点における創傷閉鎖に関して、面積を計算した。非トランスフェクト細胞および対照#3219の場合、miR-21に対する本発明者らのLNA-アンチmiR、#3205と比較して、創傷閉鎖が速かったことから、#3205はmiR-21を阻害し、細胞の移動を妨げることが示された（図34B）。
（結論）miR-21をターゲットとする8マー（#3205）は、非トランスフェクト細胞および対照トランスフェクト細胞と比較して、PC3細胞の細胞移動を阻害する。
（材料と方法）
細胞株：ヒト前立腺癌PC3細胞株はECACCから購入した（#90112714）。PC3細胞は、10％ウシ胎仔血清、2mM Glutamaxおよび25μg/mlゲンタマイシンを補足したDMEM培地で培養した。
引っ掻き傷アッセイ：トランスフェクションの3日前に、6穴プレートに、1ウェルあたり150,000個の細胞を播種して、翌日には100％コンフルエントになるようにした。トランスフェクションの24時間後に、細胞単層に200μlチップで引っ掻き傷を作った。0時間時点および24時間後に、顕微鏡に接続したデジタルカメラを使って、写真を撮影した。ソフトウェアプログラムImage Jを使って創傷閉鎖を決定した。
miR-155を拮抗する完全にLNA置換されたLNA-アンチmiRの長さ評価
本発明者らは、先に、miR-21について、完全にLNA置換されたLNA-アンチmiRに関する長さ評価を示し、最も強力なLNA-アンチmiRが7nt、8ntまたは9nt長であることを示した。同じ実験をmiR-155で繰り返した。miR-155用の完全マッチターゲット部位を、レポータープラスミドpsiCHECK2中のルシフェラーゼ遺伝子の3'UTR内にクローニングし、それを、マウスRAWマクロファージ細胞株に、異なる長さの完全にLNA置換されたLNA-アンチmiRと一緒にトランスフェクトした。RAW細胞株ではmiR-155の内在性レベルが低いので、miR-155蓄積を誘発するために、細胞を100ng/ml LPSで24時間処理した。24時間後に、ルシフェラーゼ解析を行なった。
（結果）図35に示すように、最も強力なLNA-アンチmiRは#3207（8nt）および#3241（9nt）であり、わずか0.25nMのLNA濃度で、ほぼ80％の抑制解除に達する。6マー（#3244）は有意な抑制解除を示さない。長さを12マー〜14マー（#3242および#3243）に増加させると、miR-155レポーターの抑制解除の効率が下がることによって示されるとおり、力価が減少した。
（結論）miR-155をターゲットとする最も強力な完全にLNA置換されたLNA-アンチmiRは8マーおよび9マー（#3207および#3241）だった。
（材料と方法）
細胞株：マウスマクロファージRAW 264.7細胞株はATCCから購入した（TIB-71）。RAW細胞は、10％ウシ胎仔血清、4mM Glutamaxおよび25μg/mlゲンタマイシンを補足したDMEM培地で培養した。
トランスフェクション：トランスフェクションの前日に、6穴プレートに、1ウェルあたり500,000個の細胞を播種して、翌日には50％コンフルエントになるようにした。トランスフェクションの日に、RAW 264.7細胞に、0.3μgのmiR-155完全マッチ/psiCHECK2または空psiCHECK2ベクターを、10μlのLipofectamine2000（Invitrogen）と共に、製造者の指示に従ってトランスフェクトした。さまざまな濃度のLNA-アンチmiRもトランスフェクトした。miR-155蓄積を誘発するために、トランスフェクション複合体と共に4時間インキュベートしてから、LPS（100ng/ml）をRAW細胞に加えた。さらに24時間の後、ルシフェラーゼ測定のために細胞を収集した。
ルシフェラーゼアッセイ：細胞をPBSで洗浄し、セルスクレーパーで収集した後、細胞を2,500rpmで5分間遠心した。上清を捨て、50μlの1×Passive Lysis Buffer（Promega）を細胞ペレットに加えてから、細胞を氷上に30分間置いた。溶解した細胞を10,000rpmで30分間遠心した後、20μlを96穴プレートに移し、製造者の指示（Promega）に従ってルシフェラーゼ測定を行なった。
miR-21をターゲットとする完全にLNA置換された8マー#3205（LNA-アンチmiR-21）に関する血漿タンパク質結合
図36Aに示す実験における血漿中濃度において、血漿タンパク質は#3205で飽和されない。図36Bにおいて、広範囲にわたる血漿中#3205濃度で、タンパク質結合は#3205 LNA-アンチmiR-21の約95％である。50.1μM（174μg/mL）の#3205濃度では、FAM標識#3205に関して、血漿タンパク質の結合能は飽和されていなかった。
（材料と方法）マウス血漿（100μL）に、FAM標識#3205を、濃度が0.167、1.67、5.01、10.02、16.7、25.05および50.1μMになるようにスパイクした。その溶液を37℃で30分間インキュベートした。その溶液をMicrocon Ultracel YM-30フィルター（再生セルロース30,000MWCO）に移した。フィルターを微量遠心機中、2000g、室温で、20分間遠心した。濾液を5、10および20倍に希釈し、100μLの試料をマイクロタイタープレート（Polystyrene Black NUNC-237108）に移した。FLUOstar Optima elisaリーダーを使って、励起波長458nmおよび蛍光波長520nmで蛍光を検出した。結合していないFAM標識#3205の量を、12の異なる濃度（0.45〜1000nM）でFAM標識#3205をスパイクした濾過血漿から作成した標準曲線から算出した。濾過血漿中0.167、1.67、5.01、10.02、16.7、25.05および50.1μMの#3205濃度を使った濾過実験から確定された回収率の数値で、数値を補正した。FAM標識#3205の回収率は86％だった。
35 S標識#3205 LNA-アンチmiR-21の単回静脈内投与後の雌有色マウスにおける定量的全身オートラジオグラフィー試験
完全にLNA修飾された短いLNA-アンチmiR（#3205、8マー）の体内分布を決定するために、放射標識化合物の全身組織分布をマウスで調べた。35S標識#3205を単回静脈内投与でマウスに投与し、5分から21日までにわたる異なる時点で屠殺した。
（表6(i)）雌有色マウスにおける35S標識#3205の単回静脈内投与後の個々の組織での濃度（μg#3205/g組織）。数字は各組織および比に関する3回の測定の平均値である。変動係数（CV）は一般に約10％である。
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（表6(ii)）雌有色マウスにおける35S標識#3205の単回静脈内投与後の組織対肝臓比
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（結論）#3205は、消失半減期が8〜10時間という放射能の血中クリアランスを示す。高レベルの放射能が、腎臓皮質、リンパ、肝臓、骨髄、脾臓、卵巣および子宮で記録された。最も高レベルの放射能は腎臓皮質で記録され、#3205の場合、肝臓より5倍高いレベルを示した。#3205 LNA-アンチmiR-21の場合、腎臓皮質、リンパ、肝臓、骨髄および脾臓に、放射能の強い保持が見られた。
（材料と方法）
投薬：投与前にすべてのマウスの重量を測定した。9匹の雌マウスに10mg/kgの35S-#3205を尾静脈に静脈内投与した。各動物に与える体積は10mL/kgの試験製剤とした。比活性75.7μCi/mg。個々のマウスを、#3205の投与の5分後、15分後、1時間後、4時間後、24時間後、2日後、4日後、7日後および21日後に屠殺した。全身オートラジオグラフィ：マウスをセボフルランで麻酔した後、直ちにヘプタンに浸漬し、ドライアイスで-80℃に冷却した（ABR-SOP-0130）。標準的方法ABR-SOP-0131に従って、凍結屠殺体を水性カルボキシメチルセルロース（CMC）のゲルに包埋し、エタノール中で凍結し、ドライアイス（-80℃）で冷却し、全身オートラジオグラフィー用に矢状断切片を作成した。クリオミクロトーム（Leica CM 3600）を使って、約-20℃の温度で、各動物から20μm切片を異なるレベルで切り取った。得られた切片をテープ（Minnesota Mining and Manufacturing Co., No. 810）上に捕捉し、放射性インクで連番を付した。-20℃で約24時間凍結乾燥した後、選択した切片をマイラーホイルの薄層で覆い、イメージングプレート（富士、日本）上に置いた。露光は、イメージプレートを環境放射線から保護するために、-20℃において、鉛遮蔽箱中の遮光カセットで行なった。露光後に、イメージイングプレートを50μmの画素サイズでスキャンし、生体イメージング解析システム（Bas 2500、富士、日本）を使用する、ABR-SOP-0214に記載のラジオルミノグラフィーによって解析した。35S放射能の水溶性標準試験溶液を全血と混合して、較正スケールの作成に使用した（ABR-SOP-0251）。ただし、異なる血液標準を500μLのSoluene-35に溶解した。次に、溶解した試料に4.5mLのUltima Goldを加えた。35Sと14Cは極めてよく似たエネルギースペクトルを持つので、異なる血液試料の放射能を決定する際には、標準的14C-プログラム（Packard 2200CA）を使用した。
薬物動態計算：全血および組織において測定された35S放射能を、nCi/g組織として表現し、薬物動態評価のために、nmol equiv/g組織へと再計算した。薬物動態パラメータCmax、t1/2およびAUCを、WinNonlin Professional（Pharsight Corporation、米国カリフォルニア州マウンテンビュー）を使った非コンパートメント解析により、全血および組織について決定した。静脈内投与後に、濃度をゼロまで外挿し、これを（C0）と表した。消失速度定数λは、対数血漿中濃度-時間曲線の終末相の傾き（terminal slope）の線形回帰分析によって推定した。消失半減期t1/2は、式：t1/2＝ln2/λを使って計算した。別段の明記がない限り、消失半減期の計算には、LOQを上回る最後の3時点を使用した。
マウスの肺および腎臓におけるRasタンパク質定量によって決定される8マーLNA-アンチmiRによるインビボでのlet-7阻害の評価
インビボで豊富に発現されるlet-7ファミリーを拮抗する可能性を調べ得るために、マウスに8マーLNA-アンチmiRアンタゴニストまたは食塩水を静脈内（i.v.）注射した。処置効果を測定するために、タンパク質を肺および腎臓から単離した。タンパク質のRasファミリー（N-Ras、K-Ras、およびH-Ras）、特にN-RasおよびK-Rasはlet-7ファミリによる調節（抑制）を受けることが、Johnsonら（Cell, 2005）によって先に示されているので、目標は、これらのlet-7ターゲットがインビボで抑制解除されうるかどうかを解析することだった。
（結果）図37に示すように、8マーLNA-アンチmiRは、処置されたマウスの腎臓におけるRasタンパク質レベル（食塩水対照に対して標準化したもの）を強力に抑制解除した。この臓器におけるアップレギュレーションは3倍を上回り、明確なインビボ効果を示した。しかし肺では、わずかな（1.2倍の）Ras抑制解除しか観察されず（図1B）、この臓器に進入したLNA-アンチmiRの量は、Johnsonら（Cancer Research, 2007）が先に記載したようにその大量のlet-7を阻害するには、不十分であったことが示唆される。
（結論）8マーLNA-アンチmiRは、処置マウスおよび対照マウスにおけるRasタンパク質レベルの対比に基づいて評価すると、ターゲットlet-7 miRNAのインビボでの調節に、明確な効果を示す。効果は肺ではより小さく見えるものの、腎臓でのRasレベルは、アンチmiR-処置後の実質的アップレギュレーションを示す。
（材料と方法）動物および投薬：C57BL/6雌マウスを10mg/kgのLNA-アンチmiRまたは食塩水で3日間連続して処置し（0日目、1日目、および2日目）、4日目に屠殺した。肺および腎臓から得た組織試料を瞬間凍結し、さらなる加工を行なうまで-80℃で保存した。
ウェスタンブロット解析：食塩水処置マウスおよびLNA-アンチmiR処置マウスから得た肺および腎臓タンパク質を、1試料あたり100μgを使って、NuPAGE Bis Tris 4-12％（Invitrogen）で分離した。iBlot（Invitrogen）を使用し、製造者の指示に従って、タンパク質をニトロセルロースメンブレンに転写した。ブロッキング、抗体希釈および検出は、製造者の説明書に従って行なった。Ras検出には、一次ウサギ抗Ras抗体（SC-3339、Santa Cruz Biotechnology）および二次HRPコンジュゲートブタ抗ウサギ抗体（P0399、Dako）を使用し、チューブリン検出には、一次チューブリンアルファ（MS-581-P1、Neomarkers）および二次HRPコンジュゲートヤギ抗マウス抗体（P0447、Dako）を使用した。
マウス腎臓におけるPdcd4タンパク質アップレギュレーションによって決定したmiR-21のターゲティングに関する8マーLNA-アンチmiR（#3205）のインビボ効力評価
本発明者らは、完全にLNA修飾された8マーLNA-アンチmiRがmiR-21を拮抗し、miR-21ターゲットPdcd4のタンパク質レベルをインビトロで調節する能力を持つことを示した。そこで本発明者らは、インビボでのLNA-アンチmiRの効果を決定するために、LNA-アンチmiRをマウスに注射した。マウスには、25mg/kgの#3205をi.v.注射により、1日おきに14日間（全部で5回）投与した。14日目にマウスを屠殺し、腎臓を摘出し、タンパク質を単離した。ターゲット調節を決定するために、ウェスタンブロット解析を行なった。
（結果）図37に示すように、#3205によるマウスの処置は、食塩水対照と比較して著しく増加したPdcd4タンパク質レベルを示した。標準化したPdcd4対Gapdh比は両方の食塩水試料で合致したが、2匹のLNA-アンチmiR処置（#32059マウスにおけるタンパク質アップレギュレーションは、それぞれ3.3倍および6.3倍と測定され、#3205 8マーLNA-アンチmiRのインビボ薬理効果が証明された。
（結論）完全にLNA修飾された8マーLNA-アンチmiR #3205は、実証されたmiR-21ターゲットであるPdcd4のマウス腎臓レベルを抑制解除（アップレギュレート）するその能力によって証明されるとおり、インビボでmiR-21を拮抗する。
（材料と方法）
動物および投薬：初回投薬時の体重が平均20gのC57BL/6雌マウスをすべての実験で使用し、マウスには通常飼料（Altromin no 1324、Brogaarden、デンマーク・ゲントフトテ）を与えた。物質は生理食塩水（0.9％NaCl）中に製剤した。動物には、25mg/kgを1日おきに14日間、全部で5回注射することにより、LNA-アンチmiRまたは食塩水（0.9％NaCl）を投与した。14日目に動物を屠殺した。
ウェスタンブロット解析：食塩水処置マウスまたはLNA処置マウスから得た80μgの腎臓組織を、NuPAGE Bis Tris 4-12％（Invitrogen）で分離した。iBlot（Invitrogen）を使用し、製造者の指示に従って、タンパク質をニトロセルロースメンブレンに転写した。メンブレンをPdcd4抗体（Bethyl Laboratories）と共にインキュベートした後、HRP-コンジュゲートブタ抗ウサギ抗体（Dako）と共にインキュベートした。イコールローディングコントロールとして、GAPDH（Abcam）を使用し、続いてHRP-コンジュゲートブタ抗マウス抗体を使用した。メンブレンを化学ルミネセンス（ECL、Amersham）で可視化した。
（表1）
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Claims (33)

  1. 細胞または生物におけるマイクロRNAターゲットの有効量を減少させるのに使用するための7、8、9または10ヌクレオチド単位長の連続配列のオリゴマーであって、オリゴマーのヌクレオチド単位の少なくとも70％がLNA単位および2'置換ヌクレオチド類似体からなる群より選択され、オリゴマーのヌクレオチド単位の少なくとも50％がLNA単位であり、連続ヌクレオチド配列のヌクレオチド単位間に存在するヌクレオシド間結合の少なくとも1つがホスホロチオエートヌクレオシド間結合であるオリゴマー。
  2. 連続ヌクレオチド配列のヌクレオチド単位間に存在するヌクレオシド間結合がすべてホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、請求項1に記載のオリゴマー。
  3. オリゴマーの長さが7、8または9連続ヌクレオチドであり、連続ヌクレオチド単位がLNA単位および2'置換ヌクレオチド類似体からなる群より独立して選択される、請求項2に記載のオリゴマー。
  4. オリゴマーのヌクレオチド単位の少なくとも70％がLNA単位である、請求項1〜3のいずれか一項に記載のオリゴマー。
  5. オリゴマーのヌクレオチド単位がすべてLNA単位である、請求項1〜3のいずれか一項に記載のオリゴマー。
  6. 連続ヌクレオチド配列が、miR-21、miR-155、miR-221、miR-222、およびmiR-122からなる群より選択されるマイクロRNA（miRNA）配列の対応する領域に相補的である、請求項1〜5のいずれか一項に記載のオリゴマー。
  7. 前記miRNAが、miR-1、miR-10b、miR-29、miR-125b、miR-126、miR-133、miR-141、miR-143、miR-200b、miR-206、miR-208、miR-302、miR-372、miR-373、miR-375、およびmiR-520c/eからなる群より選択される、請求項1〜5のいずれか一項に記載のオリゴマー。
  8. 連続ヌクレオチド配列が、miR 17-92クラスター中に存在するマイクロRNA（miRNA）配列、例えばmiR-17-5p、miR-20a/b、miR-93、miR-106a/b、miR-18a/b、miR-19a/b、miR-25、miR-92a、miR-363からなる群より選択されるマイクロRNAの、対応する領域に相補的である、請求項1〜5のいずれか一項に記載のオリゴマー。
  9. 連続ヌクレオチド配列が、表1に列挙するmiRNAの群から選択される哺乳動物、ヒトまたはウイルスのマイクロRNA（miRNA）配列の対応する領域に相補的である、請求項1〜5のいずれか一項に記載のオリゴマー。
  10. 連続ヌクレオチド配列が、WO2008/046911に開示されている配列番号 1〜558のmiRNAの群から選択される、哺乳動物、ヒトまたはウイルスのマイクロRNA（miRNA）配列の対応する領域に相補的である、請求項1〜5のいずれか一項に記載のオリゴマー。
  11. オリゴマーの連続ヌクレオチド配列が、前記マイクロRNAのシード配列に相補的な配列からなる、または、前記マイクロRNAのシード配列に相補的な配列を含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載のオリゴマー。
  12. オリゴマーの連続ヌクレオチド配列が、表1に列挙する7マー、8マーまたは9マーシードマー配列のいずれか一つから選択される配列からなる、または、表1に列挙する7マー、8マーまたは9マーシードマー配列のいずれか一つから選択される配列を含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載のオリゴマー。
  13. シードマーの3'ヌクレオチドが連続ヌクレオチド配列の最も3'側のヌクレオチドを形成し、連続ヌクレオチド配列が、場合によっては、1個または2個のさらなる5'ヌクレオチドを含んでもよい、請求項11または12に記載のオリゴマー。
  14. 前記オリゴマーの連続ヌクレオチド配列が、5'端から数えてマイクロ-RNA中に存在する1番目のヌクレオチドに対応するヌクレオチドを含まない、請求項1〜13のいずれか一項に記載のオリゴマー。
  15. ヌクレオチド類似体単位が、2'-O-アルキル-RNA単位、2'-OMe-RNA単位、2'-アミノ-DNA単位、2'-フルオロ-DNA単位、LNA単位、および2'-MOE RNA単位からなる群より選択される、請求項1〜14のいずれか一項に記載のオリゴマー。
  16. ヌクレオチド類似体単位がロックト核酸（LNA）ヌクレオチド類似体単位である、請求項1〜15のいずれか一項に記載のオリゴマー。
  17. オリゴマーの連続ヌクレオチド配列が、少なくとも2つのmiRNA配列、例えば2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のmiRNA配列の、対応する配列に相補的であり、場合によってはオリゴマー連続ヌクレオチド配列内に一つのユニバーサルヌクレオチドを使用してもよい、請求項1〜16のいずれか一項に記載のオリゴマー。
  18. オリゴマーの連続ヌクレオチド配列が、少なくとも2つのmiRNAシード領域配列の配列、例えば2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のmiRNAシード領域配列の配列、に相補的である配列からなる、または、少なくとも2つのmiRNAシード領域配列の配列、例えば2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のmiRNAシード領域配列の配列、に相補的である配列から構成される、請求項17に記載のオリゴマー。
  19. 連続ヌクレオチド配列がmiR-221とmiR-222の両方の対応する領域に相補的である、請求項17または18のいずれか一項に記載のオリゴマー。
  20. 連続ヌクレオチド配列が5'GCUACAU3'に相補的な配列からなる、または、5'GCUACAU3'に相補的な配列から構成される、請求項19に記載のオリゴマー。
  21. 連続ヌクレオチド配列がhsa-miR-122の対応する領域に相補的である、請求項1〜20のいずれか一項に記載のオリゴマー。
  22. C型肝炎ウイルス感染ならびに高コレステロール血症および関連障害からなる群より選択される医学的障害または疾患の処置に使用するための、請求項21に記載のオリゴマー。
  23. 医薬としての請求項1〜22のいずれか一項に記載のオリゴマー。
  24. 医学で使用するための、例えばマイクロRNAの存在または過剰発現に関連する疾患または医学的障害を処置するための、請求項1〜23のいずれか一項に記載のオリゴマー。
  25. 請求項1〜23のいずれか一項に記載のオリゴマーと、医薬上許容される希釈剤、担体、アジュバントの塩とを含む、医薬組成物。
  26. オリゴマーが請求項21または22に記載のとおりであり、組成物が、VLDLアセンブリー経路の阻害剤、例えばApoB阻害剤、またはMTP阻害剤である、第2の独立した活性成分をさらに含む、請求項25の医薬組成物。
  27. 請求項21または22に記載のオリゴマーを含む医薬組成物と、VLDLアセンブリー経路の阻害剤、例えばApoB阻害剤、またはMTP阻害剤である、第2の独立した活性成分を含むキット。
  28. マイクロRNAの存在または過剰発現と関連する疾患または医学的障害を処置するための方法であって、前記疾患または医学的障害を患っている、または患いそうな患者に、請求項25〜26のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与するステップを含む方法。
  29. 請求項1〜24のいずれか一項に記載のオリゴマーと、少なくとも1つの非ヌクレオチド化合物とを含むコンジュゲート。
  30. マイクロRNAの存在または過剰発現に関連する疾患または医学的障害を処置するための医薬を製造するための、上記請求項のいずれか一項に記載されているオリゴマーまたはコンジュゲートの使用。
  31. マイクロRNAを含む細胞においてそのマイクロRNAを阻害するための、上記請求項のいずれか一項に記載されているオリゴマーまたはコンジュゲートの使用。
  32. 細胞におけるmiRNAの量または有効量を減少させるための方法であって、上記請求項のいずれか一項に記載のオリゴマー、コンジュゲートまたは医薬組成物を、前記miRNAを発現させている細胞に、その細胞におけるそのmiRNAの量または有効量が減少するように投与することを含む方法。
  33. 細胞においてmiRNAによってその発現が抑制される1つ以上のmRNAを抑制解除するための方法であって、上記請求項のいずれか一項に記載のオリゴマー、コンジュゲートまたは医薬組成物を、前記mRNAと前記miRNAの両方を発現させる細胞に、そのmRNAの発現が抑制解除されるように投与することを含む方法。
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