ES2607681T3 - Método de pronóstico para comprobar la eficacia de inhibidores de micro ARN-122 en pacientes VHC+ - Google Patents

Abstract

Un método de pronóstico para determinar la idoneidad del tratamiento de un sujeto humano con infección por VHC con un inhibidor de microARN-122, comprendiendo dicho método las etapas de: i) determinar el nivel de al menos un biomarcador en una muestra de suero obtenida de dicho sujeto humano; ii) comparar el nivel de al menos un biomarcador con una o más muestras de referencia o valores de referencia; para determinar si el sujeto es probable que sea, o es, adecuado para el tratamiento de la infección por VHC con un inhibidor de microARN-122 (es decir, un probable respondedor al inhibidor de miR-122), en el que el al menos un biomarcador es microARN-122.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

imagen6

imagen7

imagen8

imagen9

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

microARN en una muestra, por ejemplo, miR-122. Los métodos incluyen matrices de miARN, transferencias Northern, RT-PCR, miR-Q RT-PCR, RT-PCR de tallo-bucle. Ejemplos de análisis basados en hibridación/PCR incluyen:

 Sondas de detección/matrices de microARN (miARN) MiRCURY LNA™ (Exiqon A/S)  Sistema Qiagen miScript PCR  Kit de detección de miARN Ambion mirVana™ qRT–PCR,  Ensayo AB Taqman miRNA  Mir–X miRNA qRT–PCR SYBR® Kits (Clonetech)

Otros ensayos incluyen

 Enfoque ELISA, por ejemplo mediante HFH  Signosis miRNA Plate Assay (y ensayos de quimioluminiscencia HRP con estreptavidina/biotina similares)

Cuando se utiliza qPCR (QRT-PCR), una medida del nivel de expresión de un microARN específico es el "valor de ciclo umbral", denominado Ct, obtenido mediante qRT-PCR en tiempo real, como se describe en los ejemplos. Otra medida del nivel de expresión de un microARN específico es el "valor del punto de cruce", denominado Cp, asimismo obtenido mediante qRT-PCR en tiempo real. Las medidas Ct y Cp de los niveles de expresión de microARN proporcionan medidas aproximadamente similares, véase Bustin SA (editor) A-Z de la PCR cuantitativa, IUL Biotechnology Series 5 (2004). El uso de Ct o Cp depende de la máquina en la que se realiza el ensayo. Si la amplificación se realiza en un sistema de PCR en tiempo real LightCycler 480, el nivel de expresión de un microARN específico es mediante el uso de Cp. Si la amplificación se realiza en un instrumento de Applied Biosystems ABI Prism 7900HT la expresión de un microARN específico es mediante el uso de Cp.

Muestras o valores de referencia

En algunas realizaciones, el nivel de al menos un biomarcador en la muestra de sangre obtenida del sujeto con infección por VHC se compara con el nivel de la al menos una biomarcador con una muestra o valor de referencia. Para uso en el método de pronóstico, por lo general, la muestra o valor de referencia se obtiene a partir de al menos un sujeto (una población adecuada de sujetos) con un nivel conocido o predeterminado del biomarcador y una capacidad de respuesta conocida a dicho tratamiento (tal como, el inhibidor de microARN-122, por ejemplo miravirsen). En algunas realizaciones, el nivel de al menos un biomarcador se compara con una base de datos de valores de referencia obtenidos de una población de sujetos con un nivel conocido o predeterminado del biomarcador y una capacidad de respuesta conocida a dicho tratamiento. En algunas realizaciones, el valor de referencia puede ser el valor que representa el límite superior de la normalidad, tal como se describe en el presente documento, o valores numéricos (múltiplos) de los mismos. Por lo tanto, en algunas realizaciones, el valor de referencia puede ser un valor de corte predeterminado determinado a partir de una base de datos de valores de referencia. En el presente documento se proporcionan ejemplos de valores de corte adecuados. Se debe reconocer que a medida que la base de datos se hace más amplia, la precisión por la cual los valores de corte individuales pueden asignarse mejorará. Además, como se ilustra en el presente documento, el valor de corte real asignado a cualquier biomarcador en sangre dependerá del contexto en el que se está analizando dicho nivel de biomarcador en sangre, por ejemplo la selección de otros biomarcadores de sangre y la estructura clasificadora utilizada en la etapa de comparación.

En algunos aspectos, el valor de referencia es el nivel o intervalo normal de dicho al menos un biomarcador.

En los métodos de diagnóstico descritos en el presente documento, la muestra o valor de referencia se obtiene de al menos un sujeto (una población adecuada de sujetos) con un nivel conocido o predeterminado del biomarcador y una etapa conocida de progresión de la hepatitis C en un sujeto humano, tales como el nivel de necroinflamación en el hígado (por ejemplo, tal como se evaluó por histología biopsia de hígado como se describe en el presente documento).

En algunas realizaciones, la invención se refiere a un sistema de ordenador que comprende una base de datos de dichos valores de referencia y un programa para la comparación del valor o valores del biomarcador obtenidos de la muestra de sangre obtenida del sujeto con la base de datos de valores de referencia. El programa de ordenador puede, en algunas realizaciones, comprender uno o más algoritmos clasificadores.

Ejemplos de valores de corte/clasificadores

Un supuesto no respondedor/respondedor parcial es un sujeto cuyos niveles de biomarcadores en suero son indicativos de una probabilidad (o tendencia) de que el sujeto puede ser un no respondedor o respondedor parcial. Como se describe en el presente documento, mediante la combinación de los valores de biomarcadores en suero para varios, tal como 2, 3, 4, 5 o 6 biomarcadores, el nivel de confianza logrado en la designación de los no respondedores o respondedores parciales se puede mejorar considerablemente. A este respecto, mientras que los

imagen10

imagen11

Tabla 2. Sistemas de puntuación histológica de la fibrosis Fibrosis METAVIR105 Ishak104

Ninguno 0 0

Fibrosis portal (algunos) 1 1

Fibrosis portal (la mayoría) 1 2

Fibrosis en puente (ocasional) 2 3

Fibrosis en puente (marcada) 3 4

Cirrosis incompleta 4 5

Cirrosis 4 6

Si la biopsia hepática indica una enfermedad histológica más leve, la progresión puede considerarse suficientemente

5 lenta como para justificar el seguimiento sin tratamiento con interferón inminente. Sin embargo, como se indica en la presente invención, el tratamiento de miravirsen puede ser particularmente adecuado para estadios tempranos de la enfermedad, dado que tales sujetos son más propensos a tener biomarcadores séricos indicativos de respondedores. La biopsia hepática percutánea se asocia con complicaciones potenciales, incluyendo sangrado (1 % -3 %), dolor (20 % -30 %), peritonitis biliar (< 1 %), neumotórax (< 1 %), vísceras perforadas (< 1 %) y muerte.

10 El valor pronóstico notable de la presente invención ilustra que para el tratamiento con un inhibidor de microARN122, tal como miravirsen, se puede evitar una biopsia hepática. Los datos clínicos presentados en el presente documento también indican que el tratamiento con éxito con miravirsen puede estar asociado con etapas más leves de la enfermedad del VHC y, como tal, la presente invención también puede tener un valor diagnóstico significativo

15 en la determinación de la etapa de la progresión de la enfermedad del VHC y, por lo tanto, pueden ser una alternativa no invasiva a la biopsia hepática.

En otro aspecto, la invención proporciona un método diagnóstico para determinar la etapa de progresión de la hepatitis C en un sujeto humano, tal como el nivel de necroinflamación en el hígado, comprendiendo dicho método 20 las etapas de

i) obtener una muestra de sangre del sujeto humano infectado con VHC ii) determinar el nivel de mircoRNA-122 en la muestra de sangre y al menos otro biomarcador en la muestra de sangre

25 iii) comparar el nivel de microARN y el al menos otro biomarcador, con una muestra de referencia o uno o más valores de referencia obtenidos a partir de uno o más sujetos con una etapa conocida de progresión de la hepatitis C (tal como el nivel de necroinflamación) para determinar el estadio de la progresión de la hepatitis C en el sujeto.

30 Adecuadamente, los valores de referencia están en forma de una base de datos de valores de referencia obtenidos a partir de una población de sujetos con estadio conocido de la progresión de la infección por hepatitis C.

A modo de ejemplo, al menos un biomarcador adicional se selecciona del grupo que consiste en ALT, AST, GGT, ALT y GGT, ALT y AST, AST y GGT, y ALT, AST y GGT.

35 La etapa de la progresión del VHC puede determinarse, por ejemplo, de acuerdo con la escala METAVIR o la escala de Ishak (Ishak K, et al. Histological grading and staging of chronic hepatitis. J Hepatol 1995; 22:696–699; Bedossa P y Poynard T, French METAVIR Cooperative Study Group. An algorithm for grading activity in chronic hepatitis C. Hepatology 1994;24:289–293).

40 También se reconoce que el nivel de necroinflamación puede determinarse en sujetos mamíferos que no están infectados con el VHC y, como tal, la invención proporciona un método para determinar el nivel de la función hepática en un sujeto, comprendiendo dicho método las etapas de

45 i) obtener una muestra de sangre de un sujeto mamífero, tal como un ser humano ii) determinar el nivel de mircoRNA-122 en la muestra de sangre y al menos otro biomarcador en la muestra de sangre iii) comparar el nivel de microARN y el al menos otro biomarcador con una muestra de referencia o uno o más valores de referencia obtenidos de uno o más sujetos con un nivel conocido de la función hepática para

50 determinar el nivel de la función hepática en dicho sujeto.

A modo de ejemplo, al menos un biomarcador adicional se selecciona del grupo que consiste en ALT, AST, GGT, ALT y GGT, ALT y AST, AST y GGT, y ALT, AST y GGT. Por tanto, la invención proporciona el uso de un ensayo de cuantificación de microARN-122 para determinar el grado de la función hepática en un sujeto mamífero, en el que el 55 uso es en combinación con dicho al menos otro biomarcador en la muestra de sangre. En algunas realizaciones, el

15

25

35

45

55

65

sujeto puede estar infectado con el VHC. En algunas realizaciones, el sujeto puede no estar infectado con el VHC. En algunas realizaciones, se puede diagnosticar al sujeto con un trastorno seleccionado del grupo que consiste en hepatitis, tal como hepatitis B, C y D, enfermedad del hígado graso no alcohólico y esteatohepatitis no alcohólica, infección por citomegalovirus, infección esquistosomiasis e infección Leptospirosis.

Método para determinar la dosis eficaz probable del inhibidor de microARN-122, tal como Miravirsen

Los datos obtenidos del ensayo clínico de fase 2a indica que algunos sujetos no responden al tratamiento con miravirsen, en particular a la dosis baja de miravirsen (por ejemplo, 3 mg/kg). La correlación entre la capacidad de respuesta a miravirsen y la dosis es indicativa de la heterogeneidad dentro de las poblaciones de pacientes infectados por el VHC para la capacidad de respuesta al tratamiento con miravirsen y, como tal, la presente invención proporciona un método para determinar la dosis eficaz probable de un agente inhibidor de miR-122 (inhibidor de microARN-122), tal como miravirsen, para la administración a un sujeto con infección crónica por el VHC, comprendiendo dicho método

ii) determinar el nivel de al menos un biomarcador en la muestra de suero obtenida de un sujeto humano iii) comparar el nivel del al menos una biomarcador con una o más muestras de referencia o valores de referencia;

para determinar la dosis eficaz probable del inhibidor de microARN-122 para la administración al sujeto con el fin de aliviar la infección por VHC, en la que el al menos un biomarcador es microARN-122.

El método anterior se puede combinar con el método de pronóstico, por ejemplo, los sujetos con una o más puntuaciones de biomarcadores en sangre que están fuera del intervalo normal, pero no están por encima del valor de corte establecido para su designación como no respondedor, pueden ser tratados eficazmente utilizando una dosis más alta de miravirsen, por ejemplo, a la dosis de 5 mg/kg o de 7 mg/kg. Como alternativa, el período de tratamiento puede extenderse.

El término “cantidad [terapéuticamente] eficaz” en general se refiere a una cantidad requerida para reducir los síntomas de la enfermedad en un individuo. La dosis se ajustará a los requisitos individuales en cada caso particular. Esa dosificación puede variar dentro de amplios límites dependiendo de numerosos factores, tales como la gravedad de la enfermedad a tratar, la edad y el estado de salud general del paciente, otros medicamentos con los que se está tratando al paciente, la vía y la forma de administración y las preferencias y la experiencia del médico implicado. Generalmente, en algunas realizaciones, el tratamiento se inicia con dosis más pequeñas por debajo de la dosis óptima del compuesto. Después, la dosis se puede aumentar en pequeños incrementos hasta que se alcanza el efecto óptimo para el paciente individual. Un experto en el tratamiento de las enfermedades que se describen en el presente documento será capaz, sin excesiva experimentación y sobre la base de su conocimiento personal, la experiencia y las divulgaciones de la presente solicitud, de determinar una cantidad terapéuticamente eficaz de los compuestos de la presente invención para una enfermedad y un paciente dados.

Una (por ejemplo, dosis diaria/semanal/mensual) puede, por ejemplo, estar entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 500 mg/kg de peso corporal, tal como entre 0,1 y aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, tal como entre 0,1 y 1 mg/kg de peso corporal peso al día, o entre 1,0 y aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal al día. Por lo tanto, para la administración a una persona de 70 kg, en algunas realizaciones, el intervalo de dosificación puede ser de aproximadamente 7 mg a 0,7 g al día. En algunas realizaciones, cada dosis del oligómero, tal como miravirsen puede, por ejemplo, ser de entre aproximadamente 0,1 mg/kg o 1 mg/kg y aproximadamente 10 mg/kg de 20 mg/kg, (es decir, un intervalo de entre, por ejemplo, 0,1 y 20 mg/kg, tal como entre 1 mg/kg y 12 mg/kg). Por lo tanto, las dosis individuales pueden ser, por ejemplo, aproximadamente 0,5 mg/kg, tal como aproximadamente 0,6 mg/kg, tal como aproximadamente 0,7 mg/kg, tal como aproximadamente 0,8 mg/kg, tal como aproximadamente 0,9 mg/kg, tal como aproximadamente 1 mg/kg, tal como aproximadamente 2 mg/kg, tal como aproximadamente 3 mg/kg, tal como aproximadamente 4 mg/kg, tal como aproximadamente 5 mg/kg, tal como aproximadamente 6 mg/kg, tal como aproximadamente 7 mg/kg, tal como aproximadamente 8 mg/kg, tal como aproximadamente 9 mg/kg, tal como aproximadamente 10 mg/kg. En algunas realizaciones, la dosis del oligómero está por debajo de 7 mg/kg, tal como por debajo de 5 mg/kg o por debajo de 3 mg/kg. En algunas realizaciones, la dosis del oligómero está por encima de 0,5 mg/kg, tal como por encima de 1 mg/kg.

En algunas realizaciones, el intervalo de tiempo entre cada administración del inhibidor de miR-122, tal como miravirsen durante el período de tratamiento puede seleccionarse, por ejemplo, del grupo que consiste en 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, cinco días, seis días y semanalmente. En algunas realizaciones, el intervalo de tiempo entre la administración es, por lo menos, cada dos días, tal como, al menos cada tres días, tal como al menos cada 4 días, tal como, al menos cada 5 días, tal como al menos cada 6 días, tal como semanalmente, tal como al menos cada dos semanas (bisemanalmente) o al menos cada 3 o 4 semanas, o al menos mensualmente.

El oligómero, por ejemplo, miravirsen, puede administrarse, por ejemplo, por vía parenteral. Para administración parenteral, subcutánea, intradérmica o transdérmica, la formulación puede incluir un diluyente estéril, tampones, reguladores de la tonicidad y antibacterianos. El oligómero puede ser, por ejemplo, administrarse i.v.i o s.c. en una

imagen12

imagen13

Los valores numéricos hacen referencia a la expresión de luciferasa debido a la desrrepresión de miR-122 y los valores superiores a 1 indican inhibición de miR-122.

imagen14

15

25

35

45

55

65

terapéuticos, sobre todo cuando el objetivo es un microARN (antimiR) o como oligómeros de cambio de corte y empalme (SSO).

En algunas realizaciones, el totalmer comprende o consiste en al menos un motivo de la secuencia XYX o YXY, tal como una secuencia repetida XYX o YXY, en el que X es LNA e Y es un análogo de nucleótidos alternativo (es decir, no LNA), tal como una unidad de 2'-OMe ARN y una unidad de 2.’-fluoro-ADN. El motivo de la secuencia anterior puede, en algunas realizaciones, ser XXY, XYX, YXY o YYX, por ejemplo.

En algunas realizaciones, el totalmer puede comprender o consistir en una secuencia de nucleótidos contigua de entre 8 y 16 nucleótidos, tal como 9, 10, 11, 12, 13, 14, o 15 nucleótidos, tal como entre 8 y 12 nucleótidos.

En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos contigua del totalmer comprende al menos 30 %, tal como al menos 40 %, tal como al menos 50 %, tal como al menos 60 %, tal como al menos 70 %, tal como al menos 80 %, tal como al menos 90 %, tal como 95 %, tal como 100 % de unidades de LNA. Las unidades restantes pueden seleccionarse a partir de los análogos de nucleótidos no LNA a los que se hace referencia en el presente documento, tales como los seleccionados del grupo que consiste en la unidad 2'-O-alquil-ARN, la unidad de 2'-OMe-ARN, la unidad de 2'-amino-ADN, la unidad 2'-fluoro-ADN, la unidad de LNA, la unidad de PNA, la unidad de HNA, la unidad de INA y una unidad de 2'MOE ARN, o la unidad del grupo 2'-OMe ARN y la unidad de 2'-fluoro ADN.

En algunas realizaciones, el totalmer consiste en o comprende una secuencia de nucleótidos contiguos que solo consiste en unidades de LNA.

En algunas realizaciones, el totalmer puede estar dirigido contra un micro ARN (es decir, ser antimiR), como se hace referencia en las solicitudes provisionales de Estados Unidos 60/979217 y 61/028062 y PCT/DK2008/000344.

Mixmer

El término 'mixmer' se refiere a oligómeros que comprenden nucleótidos de origen tanto natural como no natural, en los que, a diferencia de los gapmer, tailmer, headmer y blockmer, no hay una secuencia contigua de más de 5 nucleótidos de origen natural, tales como unidades de ADN.

El oligómero de acuerdo con la invención puede ser un mixmer, de hecho varios diseños de mixmers son altamente eficaces como oligómeros terapéuticos, sobre todo cuando el objetivo es un microARN (antimiR), sitios de unión a microARN en ARNm (Blockmirs) o como oligómeros de cambio de corte y empalme (SSO).

El oligómero puede ser, en algunas realizaciones, también un mixmer y, de hecho, debido a la capacidad de los mixmers para unirse de manera eficaz y específica a su diana, el uso de mixmers como oligómeros terapéuticos se considera que son particularmente eficaces en la disminución del ARN diana.

En algunas realizaciones, el mixmer comprende o consiste en una secuencia de nucleótidos contiguos de patrón de repetición de análogo de nucleótidos y nucleótidos de origen natural, o un tipo de análogo de nucleótido y un segundo tipo de análogos de nucleótidos. El patrón de repetición puede, por ejemplo, ser cada segundo o cada tercer nucleótido es un análogo de nucleótido, tal como LNA, y los nucleótidos restantes son nucleótidos de origen natural, tales como ADN, o son un análogo de nucleótido sustituido en 2', tal como análogos 2'MOE o 2'fluoro análogos como se hace referencia en el presente documento, o, en algunas realizaciones, seleccionados de los grupos de análogos de nucleótidos a los que se hace referencia en el presente documento. Se reconoce que el patrón de repetición de los análogos de nucleótidos, tales como unidades de LNA, puede combinarse con análogos de nucleótidos en posiciones fijas, por ejemplo, en los extremos 5 'o 3'.

En algunas realizaciones, el primer nucleótido del oligómero, contando desde el extremo 3’, es un análogo de nucleótidos, tal como un nucleótido LNA.

En algunas realizaciones, que pueden ser iguales o diferentes, el segundo nucleótido del oligómero, contando desde el extremo 3’, es un análogo de nucleótidos, tal como un nucleótido LNA. En algunas realizaciones, que pueden ser iguales o diferentes, el séptimo y/u octavo nucleótido del oligómero, contando desde el extremo 3’, son análogos de nucleótidos, tal como nucleótidos LNA.

En algunas realizaciones, que pueden ser iguales o diferentes, el noveno y/o décimo nucleótidos del oligómero, contando desde el extremo 3’, son análogos de nucleótidos, tal como nucleótidos LNA.

En algunas realizaciones, que pueden ser iguales o diferentes, el extremo 5’ del oligómero es un análogo nucleotídico, tal como un nucleótido LNA.

Las características del diseño anteriores pueden, en algunas realizaciones, incorporarse en el diseño de mixmer, tal como antimiR. En algunas realizaciones, el mixmer no comprende una región de más de 4 unidades de nucleótidos de ADN

15

25

35

45

55

65

consecutivos o 3 unidades de nucleótidos de ADN consecutivos. En algunas realizaciones, el mixmer no comprende una región de más de 2 unidades de nucleótidos de ADN consecutivos.

En algunas realizaciones, el mixmer comprende una región que consiste en al menos dos unidades de análogos de nucleótidos consecutivos, tal como al menos dos unidades de LNA consecutivas.

En algunas realizaciones, el mixmer comprende una región que consiste en al menos tres unidades de análogos de nucleótidos consecutivos, tal como al menos tres unidades de LNA consecutivas.

En algunas realizaciones, el mixmer de la invención no comprende una región de más de 7 unidades de análogos de nucleótidos consecutivos, tales como unidades de LNA. En algunas realizaciones, el mixmer de la invención no comprende una región de más de 6 unidades de análogos de nucleótidos consecutivos, tales como unidades de LNA. En algunas realizaciones, el mixmer de la invención no comprende una región de más de 5 unidades de análogos de nucleótidos consecutivos, tales como unidades de LNA. En algunas realizaciones, el mixmer de la invención no comprende una región de más de 4 unidades de análogos de nucleótidos consecutivos, tales como unidades de LNA. En algunas realizaciones, el mixmer de la invención no comprende una región de más de 3 unidades de análogos de nucleótidos consecutivos, tales como unidades de LNA. En algunas realizaciones, el mixmer de la invención no comprende una región de más de 2 unidades de análogos de nucleótidos consecutivos, tales como unidades de LNA.

En las realizaciones del mixmer, que se refieren a la modificación de nucleótidos en las posiciones 3 a 8, contando desde el extremo 3', las unidades de LNA pueden reemplazarse por otros análogos nucleótidos, tales como los mencionados en el presente documento. Por tanto, "X" puede seleccionarse del grupo que consiste en unidad de 2'-O-alquil-ARN, unidad de 2'-OMe-ARN, unidad de 2'-amino-ADN, unidad de 2'-fluoro-ADN (2'fluoro), unidad 2'-MOE-ARN (2'MOE), unidad de LNA, unidad de PNA, unidad de HNA, unidad de INA. “X" es, preferiblemente, ADN o ARN, más preferiblemente ADN.

En algunas realizaciones, el mixmer, tale como un mixmer antimiR, se modifica en las posiciones 3 a 8, es decir, comprende al menos un análogo de nucleótido en las posiciones 3 a 8, contando desde el extremo 3'. El diseño de esta secuencia se puede definir con el número de unidades no LNA presentes o con el número de unidades de LNA presentes. En algunas realizaciones del anterior, al menos uno, tal como uno, de los nucleótidos en las posiciones de tres a ocho, contando desde el extremo 3', es una unidad no LNA. En algunas realizaciones, al menos dos, tal como dos, de los nucleótidos en las posiciones de tres a ocho, contando desde el extremo 3', son unidades no LNA. En algunas realizaciones, al menos tres, tal como res, de los nucleótidos en las posiciones de tres a ocho, contando desde el extremo 3', son unidades no LNA. En algunas realizaciones, al menos cuatro, tal como cuatro, de los nucleótidos en las posiciones de tres a ocho, contando desde el extremo 3', son unidades no LNA. En algunas realizaciones, al menos cinco, tal como cinco, de los nucleótidos en las posiciones de tres a ocho, contando desde el extremo 3', son unidades no LNA. En algunas realizaciones, los seis nucleótidos en las posiciones de tres a ocho, contando desde el extremo 3', son unidades no LNA.

El oligómero puede, en algunas realizaciones, ser o bien i) totalmente complementario de una subsecuencia de nucleótidos contiguos presentes en el miARN diana, o ii) comprende no más de una sola falta de coincidencia con la complementaria de una subsecuencia de nucleótidos contiguos presentes en dicho ARN diana. Como tal, el oligonucleótido es un oligonucleótido antisentido, en cuanto a que es totalmente complementario a la región correspondiente de la secuencia diana, o comprende no más que una sola falta de coincidencia con la región correspondiente de la secuencia diana. El ARN diana se asocia típicamente con una afección médica o enfermedad y, en algunas realizaciones, puede ser un microARN o un ARNm, por ejemplo. Por consiguiente, el oligómero puede ser, por ejemplo, un antimiR, un mimético de microARN, un blockmir de microARN, o un oligómero antisentido.

Por consiguiente, el oligómero puede ser un antimir que está dirigido (es decir, comprende o consiste en una secuencia de nucleótidos contiguos que es totalmente complementaria de (a región correspondiente de) microARN122 o comprende no más de una sola falta de coincidencia al mismo. Tales oligonucleótidos pueden denominarse oligonucleótidos anti-microARN.

Ejemplos de moduladores de microARN-122 útiles en la invención

Los compuestos especialmente preferidos para su uso en la presente invención son aquellos que están dirigidos a microARN-122. La secuencia de miR-122 se puede encontrar en la base de datos de microARN "mirbase" (http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/). Se han descrito inhibidores de microARN-122 en numerosas patentes y artículos y son bien conocidos para el experto en la materia. En algunas realizaciones, los ejemplos de dichos documentos que describen moduladores útiles de microRNA–122 son WO2007/112754, WO2007/112753, o WO2009/043353. En algunas realizaciones, tales moduladores de microARN–122 son los descritos en los documentos WO2009/20771, WO2008/91703, WO2008/046911, WO2008/074328, WO2007/90073, WO2007/27775, WO2007/27894, WO2007/21896, WO2006/93526, WO2006/112872, WO2005/23986, o WO2005/13901, o WO2010/122538.

Miravirsen (SPC3649)

imagen15

nucleótidos bicíclicos o nucleótidos modificados en 2’, tales como nucleótidos sustituidos en 2’.

“Análogos de nucleótidos" son variantes de los nucleótidos naturales, tales como nucleótidos ADN o ARN nucleótidos, en virtud de las modificaciones los restos de azúcar y/o de bases. En principio, los análogos podrían ser 5 simplemente "silenciosos" o "equivalentes" a los nucleótidos naturales en el contexto del oligonucleótido, es decir no tienen ningún efecto funcional sobre la forma en que el oligonucleótido funciona para inhibir la expresión del gen diana. Sin embargo, dichos análogos "equivalentes" pueden ser útiles si, por ejemplo, son más fáciles o más baratos de fabricar, o son más estables en condiciones de almacenamiento o fabricación, o representan a una marca o marcador. Preferiblemente, sin embargo, los análogos tendrán un efecto funcional sobre la forma en la que el 10 oligómero funciona para inhibir la expresión; por ejemplo, produciendo una mayor afinidad de unión a la diana y/o un aumento de la resistencia a las nucleasas intracelulares y/o una mayor facilidad de transporte al interior de la célula. Los ejemplos específicos de análogos nucleosídicos se describen en, por ejemplo, Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429–4443 y Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293–213, y en el esquema 1:

imagen16

15

El oligómero puede, por tanto, comprender o consistir en una secuencia simple de nucleótidos de origen natural, preferiblemente 2'-desoxinucleótidos (denominado en el presente documento en general "ADN"), pero también, posiblemente, ribonucleótidos (denominado en el presente documento en general "ARN"), o una combinación de

20 tales nucleótidos de origen natural y uno o más nucleótidos de origen no natural, es decir análogos de nucleótidos. Dichos ejemplos de análogos de nucleótidos pueden potenciar adecuadamente la afinidad del oligómero la secuencia diana.

Los ejemplos de análogos de nucleótidos adecuados y preferidos se proporcionan en el documento 25 WO2007/031091 o son referencias en el mismo.

La incorporación de análogos de nucleótidos que potencian la afinidad en el oligómero, tal como LNA o azúcares

imagen17

10

15

20

25

30

35

40

45

50

hipoxantina, 5-metilcitosina, isocitosina, pseudoisocitosina, 5-bromouracilo, 5-propiniluracilo, 6-aminopurina, 2aminopurina, inosina, diaminopurina, y 2-cloro-6-aminopurina.

En algunas realizaciones, al menos una de las bases nucleotídicas presentes en el oligómero es una base nucleotídica modificada seleccionada del grupo que consiste en 5-metilcitosina, isocitosina, pseudoisocytosine, 5bromouracilo, 5-propiniluracilo, 6-aminopurina, 2-aminopurina, inosina, diaminopurina, y 2-cloro-6-aminopurina.

LNA

El término "LNA" se refiere a un análogo de nucleósido bicíclico, conocido como "ácido nucleico bloqueado". Puede hacer referencia a un monómero de LNA, o, cuando se utiliza en el contexto de un "oligonucleótido de LNA", LNA se refiere a un oligonucleótido que contiene uno o más de tales análogos de nucleótidos bicíclicos. Los nucleótidos de LNA se caracterizan por la presencia de un grupo enlazador (tal como un puente) entre C2' y C4' del anillo de azúcar ribosa, por ejemplo como se muestra como el birradical R4* -R2* como se describe más adelante.

El LNA usado en los compuestos de oligonucleótidos de la invención tiene, preferiblemente, la estructura de la

imagen18

en la que para todos los centros quirales, los grupos asimétricos pueden encontrarse en cualquier orientación R

o S; en la que X se selecciona de -O-, -S-, -N (RN*) -, -C (R6R6*) -, tal como, en algunas realizaciones -O-; B se selecciona de hidrógeno, alcoxi C1-4 opcionalmente sustituido, alquilo C1-4 opcionalmente sustituido, aciloxi C1-4 opcionalmente sustituido, incluyendo las bases nucleotídicas de origen natural y análogos de bases nucleotídicas, intercaladores de ADN, grupos fotoquímicamente activos, grupos termoquímicamente activos, grupos quelantes, grupos indicadores y ligandos; preferiblemente, B es una base nucleotídica o análogo de base nucleotídica; P designa un enlace internucleotídico de un monómero adyacente, o un grupo 5'-terminal, incluyendo tal enlace internucleotídico o grupo 5'-terminal opcionalmente el sustituyente R5 o igualmente aplicable el sustituyente R5; P* designa un enlace internucleotídico de un monómero adyacente, o un grupo 3'-terminal; R4* y R2* juntos designan un grupo enlazador bivalente que consiste en 1 -4 grupos/átomos seleccionados de entre –C(RaRb)–, –C(Ra)=C(Rb)–, –C(Ra)=N–, –O–, –Si(Ra)2–, –S–, –SO2–, –N(Ra)–, y > C=Z, en el que Z se selecciona de –O–, –S–, y –N(Ra)–, y Ra y Rb cada uno se selecciona de forma independiente de hidrógeno,, alquilo C1-12 opcionalmente sustituido, alquenilo C2-12 opcionalmente sustituido, alquinilo C2-12 opcionalmente sustituido, hidroxi, alcoxi C1-12 opcionalmente sustituido, alcoxialquilo C2-12, alqueniloxi C2-12, carboxi, alcoxicarbonilo C1-12, alquilcarbonilo C1-12, formilo, arilo, ariloxi–carbonilo, ariloxi, arilcarbonilo, heteroarilo, heteroariloxi–carbonilo, heteroariloxi, heteroarilcarbonilo, amino, mono– y di(C1-6–alquil)amino, carbamoilo, mono– y di(alquilo C1-6)–amino–carbonilo, amino–alquilo C1-6–aminocarbonilo, mono– y di(alquilo C1-6)aminO– alquilo C1-6––aminocarbonilo, alquilo C1-6–carbonilamino, carbamido, alcanoiloxi C1-6, sulfono, alquilsulfoniloxi C16, nitro, azido, sulfanilo, alquiltio C1-6, halógeno, intercaladores de ADN, grupos fotoquímicamente activos, grupos termoquímicamente activos, grupos quelantes, grupos indicadores, y ligandos, en los arilo y heteroarilo pueden estar opcionalmente sustituidos y en los que dos sustituyentes geminales Ra y Rb juntos pueden designar metileno (CH =2) opcionalmente sustituido, en el que para todos los centros quirales, los grupos asimétricos pueden encontrarse en cualquiera orientación R o S, y; cada uno de los sustituyentes de R1*, R2, R3, R5, R5*, R6 y R6*, que están presentes se selecciona de forma independiente de hidrógeno, alquilo C1-12 opcionalmente sustituido, alquenilo C2-12 opcionalmente sustituido, alquinilo C2-12 opcionalmente sustituido, hidroxi, alcoxi C1-12, alcoxicalquilo C2-12, alqueniloxi C2-12, carboxi, alcoxicarbonilo C1-12, alquilcarbonilo C1-12, formilo, arilo ariloxi-carbonilo, ariloxi, arilcarbonilo, heteroarilo, heteroariloxi-carbonilo, heteroariloxi, heteroarilcarbonilo, amino, mono y di alquil C1-6-mino, carbamoílo, mono y di(alquil C1-6)-amino-carbonilo, amino-alquilo C1-6-aminocarbonilo, mono y di(alquil C1-6)amino-alquil C1-6-aminocarbonilo, alquil C1-6-carbonilamino, carbamido, alcaloiloxi C1-6, sulfono, alquilo C1-6-sulfoniloxi, nitro, azido, sulfanilo, alquil

C1-6-tio, halógeno, intercalantes de ADN, grupos fotoquímicamente activos, grupos quelantes, grupos indicadores y ligandos, en los que arilo y heteroarilo pueden estar sustituidos opcionalmente y en los que dos sustituyentes geminales Ra y Rb juntos pueden designar oxo, tioxo, imino o metileno opcionalmente sustituido en los que RN se selecciona de hidrógeno, alquilo C1-4, y en el que dos sustituyentes adyacentes (no geminales) pueden designar

5 un enlace adicional resultante en un enlace doble; y RN*, cuando está presente y no implicado en un birradical, se selecciona de hidrógeno y alquilo C1-4, y sales básicas y sales de adición de ácido de los mismos. Para todos los centros quirales, los grupos asimétricos pueden encontrarse en cualquier orientación R o S.

En algunas realizaciones, R4* y R2* juntos designan un birradical que consiste en un grupo seleccionado del grupo

10 que consiste en C (RaRb) -C (RaRb) -, C (RaRb) -O-, C (RaRb) -NRa-, C (RaRb) -S-, Y C (RaRb) -C (RaRb) -O-, en el que cada Ra y Rb puede estar opcionalmente independientemente seleccionado. En algunas realizaciones, Ra y Rb pueden seleccionarse opcionalmente independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y alquilo C1-6, tal como metilo, tal como hidrógeno.

15 En algunas realizaciones, R4* y R2* juntos designan el birradical -O-CH (CH2OCH3) -(2O-metoxietilo ácido nucleico bicíclico – Seth at al., 2010, J. Org. Chem) – en la configuración R– o S–.

En algunas realizaciones, R4* y R2* juntos designan el birradical –O–CH(CH2CH3)–(2'O-etilbicíclico ácido nucleico – Seth at al., 2010, J. Org. Chem). -en la configuración R– o S–.

20 En algunas realizaciones, R4* y R2* juntos designan el birradical –O–CH(CH3)–. -en la configuración R– o S–. En algunas realizaciones, R4* y R2* juntos designan el birradical –O–CH2–O–CH2– – Seth at al., 2010, J. Org. Chem).

En algunas realizaciones, R4* y R2* juntos designan el birradical –O–NR–CH3–(Seth at al., 2010, J. Org. Chem). 25 En algunas realizaciones, las unidades de LNA tienen una estructura seleccionada del siguiente grupo:

imagen19

30 En algunas realizaciones, R1*, R2, R3, R5, R5* se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, alquilo C1-6, alquilo C1-6 sustituido, alquenilo C2-6, alquenilo C2-6 sustituido, alquinilo C2-6 o alquinilo C2-6 sustituido, alcoxilo C1-6, alcoxilo C1-6 sustituido, acilo, acilo sustituido, aminoalquilo C1-6 o aminoalquilo C1-6 sustituido. Para todos los centros quirales, los grupos asimétricos pueden encontrarse en cualquier orientación R o S.

35 En algunas realizaciones, R1*, R2, R3, R5, R5* son hidrógeno.

En algunas realizaciones, R1*, R2, R3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, alquilo C1-6, alquilo C1-6 sustituido, alquenilo C2-6, alquenilo C2-6 sustituido, alquinilo C2-6 alkynyl o alquinilo

40 C2-6 sustituido, alcoxilo C1-6, alcoxilo C1-6 sustituido, acilo, acilo sustituido, aminoalquilo C1-6 o aminoalquilo C1-6 sustituido. Para todos los centros quirales, los grupos asimétricos pueden encontrarse en cualquier orientación R o

S.

En algunas realizaciones, R1*, R2, R3 son hidrógeno.

45 En algunas realizaciones, R5 y R5* se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en H, -CH3, -CH2-CH3, -CH2-O-CH3, y -CH = CH2. Adecuadamente, en algunas realizaciones, R5 o R5* son hidrógeno, en donde como el otro grupo (R5 o R5* respectivamente) se selecciona del grupo que consiste en alquilo C1-5, alquenilo C2-6, alquinilo C2-6, alquilo C1-6 sustituido, alquenilo C2-6 sustituido, alquinilo C2-6 sustituido o acilo sustituido (–C(=O)–); en

50 los que cada grupo sustituido está mono o poli sustituido con grupos sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, alquilo C1-6, alquilo C1-6 sustituido, alquenilo C2-6, alquenilo C2-6 sustituido, alquinilo C2-6, alquinilo C2-6 sustituido, OJ1, SJ1, NJ1J2, N3, COOJ1, CN, O–C(=O)NJ1J2, N(H)C(=NH)NJ,J2 o N(H)C(=X)N(H)J2 en las que X es O o S; y cada J1 y J2 es, de forma independiente, H, alquilo C1-6, alquilo C1-6 sustituido, alquenilo C26, alquenilo C2-6 sustituido, alquinilo C2-6, alquinilo C2-6 sustituido, aminoalquilo C1-6, aminoalquilo C1-6 sustituido o un

55 grupo protector. En algunas realizaciones, R5 o R5* es alquilo C1-6 sustituido. En algunas realizaciones, R5 o R5* es metileno sustituido, en el que los grupos sustituyentes preferidos incluyen uno o más grupos seleccionados independientemente de F, NJ1J2, N3, CN, OJ1, SJ1, O–C(=O)NJ1J2, N(H)C(=NH)NJ, J2 o N(H)C(O)N(H)J2. En algunas realizaciones cada uno de J1 y J2 es, independientemente, H o alquilo C1-6. En algunas realizaciones, R5 o

15

25

35

45

55

65

R5* es metilo, etilo o metoximetilo. En algunas realizaciones, R5 o R5* es metilo. En una realización adicional, R5 o R5* es etilenilo. En algunas realizaciones, R5 o R5* es acilo sustituido. En algunas realizaciones, R5 o R5* es C(=O)NJ1J2. Para todos los centros quirales, los grupos asimétricos pueden encontrarse en cualquier orientación R o S. Dichos 5' nucleótidos bicíclicos modificados se divulgan en el documento WO 2007/134181.

En algunas realizaciones, B es una base nucleotídica, incluyendo análogos de bases nucleotídicas y bases nucleotídicas de origen natural, tales como una purina o pirimidina, o una purina sustituida o pirimidina sustituida, tal como una base nucleotídica a la que se hace referencia en el presente documento, tal como una base nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en adenina, citosina, timina, adenina, uracilo, y/o una base nucleotídica modificada o sustituida, tal como 5-tiazolo-uracilo, 2-tio-uracilo, 5-propinil-uracilo, 2’-tio-timina, 5-metilcitosina, 5 tiozolo-citosina, 5-propinil-citosina y 2,6-diaminopurina.

En algunas realizaciones, R4* y R2* juntos designan un birradical seleccionado de – C(RaRb)–O–, –C(RaRb)–C(RcRd)– O–, –C(RaRb)–C(RcRd)–C(ReRf)–O–, –C(RaRb)–O–C(RcRd)–,–C(RaRb)–O–C(RcRd)–O–, –C(RaRb)–C(RcRd)–, – C(RaRb)–C(RcRd)–C(ReRf)–,–C(Ra)=C(Rb)–C(RcRd)–, –C(RaRb)–N(Rc)–, –C(RaRb)–C(RcRd)– N(Re)–, –C(RaRb)– N(Rc)–O–, y – C(RaRb)–S–, –C(RaRb)–C(RcRd)–S–, en los que Ra, Rb, Rc, Rd, Re, y Rf cada uno se selecciona de forma independiente de hidrógeno, alquilo C1-12, opcionalmente sustituido, alquenilo C2-12 opcionalmente sustituido alquinilo C2-12 opcionalmente sustituido, hidroxi, alcoxi C1-12, alcoxialquilo C2-12, alqueniloxi C2-12, carboxi, alcoxicarbonilo C1-12, alquilcarbonilo C1-12, formilo, arilo, ariloxi-carbonilo, ariloxi, arilcarbonilo, heteroarilo, heteroariloxi-carbonilo, heteroariloxi, heteroarilcarbonilo, amino, mono-y di (alquil C1-6)amino, carbamoílo, mono-y di (alquilo C1-6)–amino–carbonilo, amino–alquilo C1-6–aminocarbonilo, mono– y di(alquilo C1-6)amino–alquilo C1-6– aminocarbonilo, alquilo C1-6–carbonylamino, carbamido, alcanoiloxi C1-6, sulfono, alquilsulfoniloxi C1-6, nitro, azido, sulfanilo, alquiltio C1-6, halógeno, intercaladores de ADN, grupos fotoquímicamente activos, grupos termoquímicamente activos, grupos quelantes, grupos indicadores y ligandos, en los que arilo y heteroarilo pueden estar opcionalmente sustituidos y en los que dos sustituyentes geminales Ra y Rb juntos pueden designar metileno opcionalmente sustituido (CH =2). Para todos los centros quirales, los grupos asimétricos pueden encontrarse en cualquier orientación R o S.

En una realización adicional R4* y R2* juntos designan un birradical (grupo bivalente) seleccionado de –CH2–O–, – CH2–S–, –CH2–NH–, –CH2–N(CH3)–, –CH2–CH2–O–, –CH2–CH(CH3)–,–CH2–CH2–S–, –CH2–CH2–NH–, –CH2– CH2–CH2–, –CH2–CH2–CH2–O–, –CH2–CH2–CH(CH3)–,–CH=CH–CH2–, –CH2–O–CH2–O–, –CH2–NH–O–, –CH2– N(CH3)–O–, –CH2–O–CH2–, –CH(CH3)–O–, y –CH(CH2–O–CH3)–O–, y/o, –CH2–CH2–, y –CH=CH– Para todos los centros quirales, los grupos asimétricos pueden encontrarse en cualquier orientación R o S.

En algunas realizaciones, R4* y R2* junto designan el birradical C(RaRb)–N(Rc)–O–, en la que Ra y Rb se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, alquilo C1-6, alquilo C1-6 sustituido, alquenilo C26, alquenilo C2-6 sustituido, alquinilo C2-6 o alquinilo C2-6 sustituido, alcoxilo C1-6, alcoxilo C1-6 sustituido, acilo, acilo sustituido, aminoalquilo C1-6 o aminoalquilo C1-6 sustituido, como hidrógeno, y; en la que Rc se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, alquilo C1-6 sustituido, alquenilo C2-6, alquenilo C2-6 sustituido, alquinilo C2-6 o alquinilo C2-6 sustituido, alcoxilo C1-6, alcoxilo C1-6 sustituido, acilo, acilo sustituido, aminoalquilo C1-6 o aminoalquilo C1-6 sustituido, tal como hidrógeno.

En algunas realizaciones, R4* y R2* junto designar el birradical C(RaRb)–O–C(RcRd) –O–, en la que Ra, Rb, RcY Rd se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, alquilo C1-6, alquilo C1-6 sustituido, alquenilo C2-6, alquenilo C2-6 sustituido, alquinilo C2-6 alkynyl o alquinilo C2-6 sustituido, alcoxilo C1-6, alcoxilo C1-6 sustituido, acilo, acilo sustituido, aminoalquilo C1-6 o aminoalquilo C1-6 sustituido, tal como hidrógeno.

En algunas realizaciones, R4* y R2* forman el birradical –CH(Z)–O–, en el que Z se selecciona del grupo que consiste en alquilo C1-6, alquenilo C2-6, alquinilo C2-6, alquilo C1-6 sustituido, alquenilo C2-6 sustituido, alquinilo C2-6 sustituido, acilo, acilo sustituido, amida sustituida, tiol o tiol sustituido; y en el que cada uno de los grupos sustituidos, están, de forma independiente, mono o poli sustituidos con grupos sustituyentes opcionalmente protegidos seleccionados independientemente de halógeno, oxo, hidroxilo, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)J1, OC(=X)NJ1J2, NJ3C(=X)NJ1J2 y CN, en el que cada uno de J1, J2 y J3 es, de forma independiente, H o alquilo C1-6, y X es O, S o NJ1.. En algunas realizaciones Z es alquilo C1-6 o alquilo C1-6 sustituido. En algunas realizaciones, Z es metilo. En algunas realizaciones Z es alquilo C1-6 sustituido. En algunas realizaciones dicho grupo sustituyente es alcoxi C1-6. En algunas realizaciones, Z es CH3OCH2–. Para todos los centros quirales, los grupos asimétricos pueden encontrarse en cualquier orientación R o S. Tales nucleótidos bicíclicos se divulgan en el documento US 7,399,845. En algunas realizaciones, R1*, R2, R3, R5, R5* son hidrógeno. En algunos algunas realizaciones, R1*, R2, R3* son hidrógeno, y uno

o ambos de R5, R5* pueden ser distintos de hidrógeno como se ha hecho referencia anteriormente y en el documento WO 2007/134181.

En algunas realizaciones, R4* y R2* juntos designan un birradical que comprende un grupo amino sustituido en el puente de forma que consisten en o comprenden el birradical –CH2–N(Rc)–, en el que Rc es alquiloxi C1-12. En algunas realizaciones R4* y R2* juntos designan un birradical –Cq3q4–NOR –, en el que q3 y q4 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, alquilo C1-6, alquilo C1-6 sustituido, alquenilo C26, alquenilo C2-6 sustituido, alquinilo C2-6 o alquinilo C2-6 sustituido, alcoxi C1-6, alcoxi C1-6 sustituido, acilo, acilo

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

sustituido, aminoalquilo C1-6 o aminoalquilo C1-6 sustituido; en el que cada grupo sustituido es, independientemente, mono o poli sustituido con grupos sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, OJ1, SJ1, NJ1J2, COOJ1, CN, O–C(=O)NJ1J2, N(H)C(=NH)N J1J2 o N(H)C(=X=N(H)J2 en el que X es O o S; y cada uno de J1 y J2 es, independientemente, H, alquilo C1-6, alquenilo C2-6, alquinilo C2-6, aminoalquilo C1-6 o un grupo protector. Para todos los centros quirales, los grupos asimétricos pueden encontrarse en cualquier orientación R o S. Tales nucleótidos

R2 R3 R5 R5*

bicíclicos se divulgan en el documento WO2008/150729. En algunas realizaciones, R1*, , , , se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, alquilo C1-6, alquilo C1-6 sustituido, alquenilo C2-6, alquenilo C2-6 sustituido, alquinilo C2-6 o alquinilo C2-6 sustituido, alcoxilo C1-6, alcoxilo C1-6 sustituido, acilo, acilo sustituido, aminoalquilo C1-6 o aminoalquilo C1-6 sustituido. En algunas realizaciones, R1*, R2, R3, R5, R5* son hidrógeno. En algunas realizaciones, R1*, R2, R3 son hidrógeno y uno o ambos de R5 R5* pueden ser distintos de hidrógeno como se ha hecho referencia anteriormente y en el documento WO 2007/134181. En algunas realizaciones R4* y R2* juntos designan un birradical (grupo bivalente) C(RaRb)–O–, en el que Ra y Rb son cada uno independientemente halógeno, halógeno, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, alcoxi C1-C1, alcoxi C1-C12 sustituido, OJ1 SJ1, SOJ1, SO2J1, NJ1J2, N3, CN, C(=O)OJ1, C(=O)NJ1J2, C(=O)J1, O–C(=O)NJ1J2, N(H)C(=NH)NJ1J2, N(H)C(=O)NJ1J2 o N(H)C(=S)NJ1J2; o Ra y Rb juntos son = C(q3)(q4);; q3 y q4 son cada uno, independientemente, H, halógeno, alquilo C1-C12 o alquilo C1-C12 sustituido; cada grupo sustituido es, independientemente, mono o poli sustituido con grupos sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6, alquinilo C2-C6 sustituido, OJ1, SJ1, NJ1J2, N3, CN, C(=O)OJ1, C(=O)NJ1J2, C(=O)J1, O–C(=O)NJ1J2, N(H)C(=O)NJ1J2 o N(H)C(=S)NJ1J2. y cada uno de J1 y J2 es, independientemente, H, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6, alquinilo C2-C6 sustituido, aminoalquilo C1-C6, aminoalquilo C1-C6 sustituido o un grupo protector. Tales compuestos se divulgan en el documento WO2009006478A.

In En algunas realizaciones, R4* y R2* forman el birradical – Q –, en el que Q es C(q1)(q2)C(q3)(q4), C(q1)=C(q3), C[=C(q1)(q2)]–C(q3)(q4) o C(q1)(q2)–C[=C(q3)(q4)]; q1, q2, q3, q4 q4 son cada uno independientemente. H, halógeno, alquilo C1-12, alquilo C1-12, sustituido, alquenilo C2-12, alcoxi C1-12 sustituido, OJ1, SJ1, SOJ1, SO2J1, NJ1J2, N3, CN, C(=O)OJ1, C(=O)–NJ1J2, C(=O) J1, –C(=O)NJ1J2, N(H)C(=NH)NJ1J2, N(H)C(=O)NJ1J2 o N(H)C(=S)NJ1J2; cada J1 y J2 es, independientemente, H, alquilo C1-6, alquenilo C2-6, alquinilo C2-6, aminoalquilo C1-6 o un grupo protector; y, opcionalmente, en el que cuando Q es C (q1)(q2)(q3)(q4) y uno de q3 o q4 es CH3 entonces al menos uno del otro de q3 o q4 o uno de q1 y q2 es distinto de H. En algunas realizaciones, R1*, R2, R3, R5, R5* son hidrógeno. Para todos los centros quirales, los grupos asimétricos pueden encontrarse en cualquier orientación R o S. Tales nucleótidos

R5*

bicíclicos se divulgan en el documento WO2008/154401. En algunas realizaciones, R1*, R2, R3, R5, se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, alquilo C1-6, alquilo C1-6 sustituido, alquenilo C2-6, alquenilo C2-6 sustituido, alquinilo C2-6 o alquinilo C2-6 sustituido, alcoxilo C1-6, alcoxilo C1-6 sustituido, acilo, acilo sustituido, aminoalquilo C1-6 o aminoalquilo C1-6 sustituido. En algunas realizaciones, R1*, R2, R3, R5, R5* son hidrógeno. En algunas realizaciones, R1*, R2, R3 son hidrógeno y uno o ambos de R5, R5* pueden ser distintos de hidrógeno como se ha hecho referencia anteriormente y en el documento WO 2007/134181 o WO2009/067647 (análogos de ácidos nucleicos alfa-L-bicíclicos).

En algunas realizaciones, el LNA usado en los compuestos de oligonucleótidos de la invención tiene, preferiblemente, la estructura de la fórmula general II:

imagen20

en la que Y se selecciona del grupo que consiste en –O–, –CH2O–, –S–, –NH–, N(Re) y/o –CH2–; Z y Z* se seleccionan independientemente entre un enlace internucleotídico, RH, Un grupo terminal o un grupo protector; B constituye un resto de base nucleotídica (base nucleotídica) natural o no natural y RH se selecciona de hidrógeno y alquilo C1-4; Ra, RbRc, Rd y Re se seleccionan, opcionalmente de forma independiente, del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C1-12 opcionalmente sustituido, alquenilo C2-12 opcionalmente sustituido, alquinilo C2-12 opcionalmente sustituido, hidroxi, alcoxi C1-12, alcoxialquilo C2-12, alqueniloxi C2-12, carboxi, alcoxicarbonilo C1-12, alquilcarbonilo C1-12, formilo, arilo, ariloxi-carbonilo, ariloxi, arilcarbonilo, heteroarilo, heteroariloxi-carbonilo, heteroariloxi, heteroarilcarbonilo, amino, mono-y di (alquilo C1-6) amino, carbamoílo, mono-y di (alquilo C1-6)-aminocarbonilo, amino-alquil C1-6-aminocarbonilo, mono-y di (alquilo C1-6)amino-alquil C1-6-aminocarbonilo, alquilo C1-6carbonilamino, carbamido, alcanoiloxi C1-6, sulfono, alquilsulfoniloxi C1-6, nitro, azido, sulfanilo, alquiltio C1-6,

halógeno, intercaladores de ADN, grupos fotoquímicamente activos, grupos termoquímicamente activos, grupos quelantes, grupos indicadores y ligandos, en los que arilo y heteroarilo pueden estar opcionalmente sustituidos y en los que dos sustituyentes geminales Ra y Rb juntos pueden designar metileno opcionalmente sustituido (CH =2); y RH se selecciona de hidrógeno y alquilo C1-4. En algunas realizaciones, Ra, RbRc, Rd y Re se seleccionan, opcionalmente independientemente, del grupo que consiste en hidrógeno y alquilo C1-6, tal como metilo. Para todos los centros quirales, los grupos asimétricos pueden encontrarse en orientación R o S, por ejemplo, dos isómeros estereoquímicos de ejemplo incluyen las isoformas beta-D y alfa-L, que se pueden ilustrar como sigue:

imagen21

Unidades de LNA de ejemplo específicas se muestran a continuación:

imagen22

20 El término "tio-LNA" comprende un nucleótido bloqueado en el que Y en la fórmula general anterior se selecciona de S o -CH2-S-. Tio-LNA puede estar en la configuración tanto beta-D como alfa-L.

El término "amino-LNA" comprende un nucleótido bloqueado en el que Y en la fórmula general anterior se selecciona de N(H)–, N(R)–, CH2–N(H)–, y –CH2–N(R)– en el que R se selecciona de hidrógeno y alquilo C1-4. Amino-LNA 25 puede estar en la configuración tanto beta-D como alfa-L.

El término "oxi-LNA" comprende un nucleótido bloqueado en el que Y en la fórmula general anterior representa -O-. Oxi-LNA puede estar en la configuración tanto beta-D como alfa-L.

30 El término "ENA" comprende un nucleótido bloqueado en el que Y en la fórmula general anterior es -CH2-O-(en la que el átomo de oxígeno de -CH2-O-está unido a la posición 2' con respecto a la base B). Re es hidrógeno o metilo. En algunas realizaciones de ejemplo, LNA se selecciona de beta-D-oxi-LNA, alfa-L-oxi-LNA, beta-D-amino-LNA y

15

25

35

45

55

65

beta-D-tio-LNA, en particular beta-D-oxi-LNA.

Enlaces internucleotídicos

Los monómeros de los oligómeros descritos en el presente documento están acoplados entre sí a través de grupos de enlace. Adecuadamente, cada monómero está unido al monómero adyacente en 3' a través de un grupo de enlace.

El experto versado en la materia entenderá que, en el contexto de la presente invención, el monómero en 5’ al final de un oligómero no comprende un grupo de unión en 5’, aunque puede o no comprender un grupo terminal en 5’.

Los términos "grupo de enlace" o "enlace internucleotídico” se pretende que signifiquen un grupo capaz de acoplar covalentemente dos nucleótidos. Los ejemplos específicos y preferidos incluyen grupos fosfato y grupos fosforotioato.

Los nucleótidos del oligómero de la invención o nucleótidos contiguos de secuencia de los mismos están acoplados entre sí a través de grupos de enlace. Adecuadamente, cada monómero está unido al monómero adyacente en 3' a través de un grupo de enlace.

Enlaces internucleotídicos adecuados incluyen los indicados en el documento WO2007/031091, por ejemplo, los enlaces internucleotídicos indicados en el primer párrafo de la página 34 del documento WO2007/031091.

En algunas realizaciones, se prefiere modificar el enlace internucleotídico de su fosfodiéster normal a uno que es más resistente al ataque de la nucleasa, tales como fosforotioato o boranofosfato, estos dos, siendo escindibles por la RNasa H, también permiten la vía de la inhibición antisentido en la reducción de la expresión del gen diana.

En algunas realizaciones, tales como las realizaciones mencionadas anteriormente, cuando sea apropiado y no esté específicamente indicado, todos los grupos de enlace restantes son fosfodiéster o fosforotioato, o una mezcla de los mismos.

En algunas realizaciones, todos los grupos de enlace internucleotídicos son fosforotioato.

Conjugados

En el contexto, con el término “conjugado” se pretende indicar una molécula heterogénea formada por la unión covalente (“conjugación”) del oligómero como se describe en el presente documento a uno o más restos no nucleotídicos o no polinucleotídicos. Ejemplos de más restos no nucleotídicos o no polinucleotídicos incluyen agentes macromoleculares, tales como proteínas, cadenas de ácidos grasos, residuos de azúcares, glucoproteínas, polímeros o combinaciones de los mismos. Normalmente, las proteínas pueden ser anticuerpos frente a una proteína diana. Los polímeros típicos pueden ser polietilenglicol.

Por tanto, en varias realizaciones el oligómero de la invención puede comprender una región polinucleotídica que normalmente consiste en una secuencia contigua de nucleótidos y una región no nucleotídica adicional. En referencia al oligómero de la invención que consiste en una secuencia contigua de nucleótidos, el compuesto puede comprender componentes no nucleotídicos, tales como un componente conjugado.

En varias realizaciones de la invención, el compuesto oligomérico está unido a ligandos/conjugados, que pueden usarse para, por ejemplo, aumentar la captación celular de compuestos oligoméricos. El documento WO2007/031091 proporciona ligandos y conjugados adecuados.

La invención también proporciona un conjugado que comprende el compuesto de acuerdo con la invención como se describe en el presente documento y al menos un resto no nucleotídico o no polinucleotídico unido covalentemente a dicho compuesto. Por tanto, en varias realizaciones en las que el compuesto de la invención consiste en un ácido nucleico o una secuencia nucleotídica especificados, como se divulga en el presente documento, el compuesto puede comprender también al menos un resto no nucleotídico o no polinucleotídico (p. ej., que no comprende uno o más nucleótidos o análogos de nucleótidos) unido covalentemente a dicho compuesto.

La conjugación (a un resto conjugado) puede potenciar la actividad, la distribución celular o la captación celular del oligómero de la invención. Dichos restos incluyen, entre otros, anticuerpos, polipéptidos, restos lipídicos tales como un resto de colesterol, ácido cólico, un tioéter, por ejemplo hexil-s-tritiltiol, un tiocolesterol, una cadena alifática, por ejemplo dodecadiol o residuos de undecilo, un fosfolípidos, por ejemplo di-hexadecil-rac-glicerol o trietilamonio 1,2di-o-hexadecil-rac-glicero-3-h-fosfonato, una poliaminas o una cadena de polietilenglicol, Un ácido adamantano acético, un resto de palmitilo, una octadecilamina o un resto de hexilamino-carbonil-oxicolesterol.

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Los oligómeros de la invención también pueden estar conjugados con sustancias farmacólogicas activas, por ejemplo aspirina, ibuprofeno, un fármaco sulfa, un antidiabético, un antibacteriano o un antibiótico.

En ciertas realizaciones, el resto conjugado es un esterol, tal como colesterol.

En varias realizaciones, el resto conjugado comprende o cosiste en un polímero cargado positivamente, tal como péptidos cargados positivamente de una longitud de, por ejemplo, de 1-50, tal como 2-20, tal como 310 residuos aminoácidos y/u óxido de polialquileno tal como polietilglicol (PEG) o polipropilenglicol, véase el documento WO 2008/034123. Idóneamente, el polímero cargado positivamente, tal como un óxido de polialquileno puede estar unido al oligómero de la invención a través de un ligador tal como el ligador liberable descrito en el documento WO 2008/034123.

A modo de ejemplo, en los conjugados de la invención se pueden usar los siguientes restos conjugados:

imagen23

Oligómeros activados

La expresión “oligómero activado”, como se usa en el presente documento, hace referencia a un oligómero de la invención que está unido covalentemente (es decir, funcionalizado) a al menos un resto funcional que permite la unión covalente del oligómero a uno o más restos conjugados, es decir restos que no son en sí mismos ácidos nucleicos o monómeros, para formar los conjugados descritos en el presente documento. Normalmente, un resto funcional comprenderá un grupo químico que es capaz de unirse de forma covalente al oligómero a través de, por ejemplo, un grupo 3’-hidroxilo o el grupo NH2 exocíclico de la base adenina, un espaciador que es, preferentemente, un grupo hidrofílico y terminal que es capaz de unirse a un resto conjugado (p. ej., un grupo amino, sulfhidrilo o hidroxilo). En algunas realizaciones, este grupo terminal no está protegido, por ejemplo es un grupo NH2. En otras realizaciones, el grupo terminal está protegido, por ejemplo mediante cualquier grupo protector adecuado tal como los descritos en ’Protective Groups in Organic Synthesis’, de Theorodora W. Greene y Peter G. M. Wuts, 3ª Edición (John Wiley & Sons, 1999). Ejemplos de grupos protectores hidroxilo adecuados incluyen ésteres tales como éster de acetato, grupos aralquilo tal como bencilo, difenilmetilo o trifenilmetilo y tetrahidropiranilo. Ejemplos de grupos protectores amino adecuados incluyen bencilo, alfa-metilbencilo, difenilmetilo, trifenilmetilo, benciloxicarbonilo, tercbutoxicarbonilo y grupos acilo tales como tricloroacetilo o trifluoroacetilo. En algunas realizaciones, el resto funcional es de autoescisión. En otras realizaciones, el resto funcional es biodegradable. Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. Nº 7.087.229.

En algunas realizaciones, los oligómeros de la invención están funcionarizados en el extremo 5’ con el fin de permitir la unión covalente del resto conjugado al extremo 5’ del oligómero. En otras realizaciones de la invención, los oligómeros de la invención pueden estar funcionarizados en el extremo 3’. En otras realizaciones más, los oligómeros de la invención pueden estar funcionarizados a lo largo de la estructura o en el resto de base heterocíclica. En otras realizaciones más, los oligómeros de la invención pueden estar funcionalizados en más de una posición seleccionada de forma independiente del extremo 5’. El extremo 3’, la estructura y la base.

En algunas realizaciones, los oligómeros activados de la invención se sintetizan incorporando durante la síntesis uno

o más monómeros que están unidos covalentemente a un resto funcional. En otras realizaciones, los oligómeros activados de la invención se sintetizan con monómeros que no se han funcionalizado y el oligómero se funcionaliza tras la finalización de la síntesis. En algunas realizaciones, los oligómeros están funcionalizados con un éster impedido que contiene un ligador aminoalquilo, en el que la porción alquilo tiene la fórmula (CH2)w, en la que w es un número entero que varía de 1 a 10, preferentemente aproximadamente 6, en el que la porción alquilo del grupo alquilamino puede ser de cadena lineal o de cadena ramificada, y en el que el grupo funcional está unido al oligómero a través de un grupo éster (-O-C(O)-(CH2)wNH).

En otras realizaciones, los oligómeros están funcionalizados con un éster impedido que contiene un ligador (CH2wsulfhidrilo (SH), en el que w es un número entero que varía de 1 a 10, preferentemente aproximadamente 6, en el que la porción alquilo del grupo alquilamino puede ser de cadena lineal o de cadena ramificada, y en el que el grupo funcional está unido al oligómero a través de un grupo éster (-O-C(O)-(CH2)wNH).

15

25

35

45

55

65

En algunas realizaciones, los oligonucleótidos activados por sulfhidrilo están conjugados con restos poliméricos tales como polietilenglicol o péptidos (mediante la formación de un puente disulfuro).

Los oligómeros activados que contienen ésteres impedidos como se ha descrito con anterioridad se pueden sintetizar mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica y, en concreto, mediante procedimientos divulgados en la publicación PCT Nº WO 2008/034122 y los ejemplos en la misma.

En otras realizaciones más, los oligómeros de la invención se funcionalizan introduciendo grupos sulfhidrilo, amino o hidroxilo en el oligómeros por medio de un reactivo de funcionalización sustancialmente como se describe en las patentes de EE.UU. Nº 4.962.029 y 4.914.210, es decir un reactivo sustancialmente lineal que tiene una fosforoamidita en un extremo unida a través de una cadena espacidorahidrofilica al extremo opuesto, que comprende un grupo sulfhidrilo, amino o hidroxilo protegido o no protegido. Dichos reactivos reaccionan principalmente con grupos hidroxilo del oligómeros. En algunas realizaciones, dichos oligómeros activados tienen un reactivo de funcionalización acoplado a un grupo 5’-hidroxilo del oligómero. En otras realizaciones, los oligómeros activados tienen un reactivo de funcionalización acoplado a un grupo 3’-hidroxilo. En otras realizaciones más, los oligómeros activados de la invención tienen un reactivo de funcionalización acoplado a un grupo hidroxilo sobre la estructura del oligómero. En otras realizaciones adicionales, el oligómeros de la invención está funcionalizado con más de uno de los reactivos de funcionalización como se describe en las patentes de EE.UU. Nº 4.962.029 y

4.914.210. Procedimientos de sintetizar dichos reactivos de funcionalización y de incorporarlos en monómeros y oligómeros se divulgan en las patentes de Estados Unidos n.º 4.962.029 y 4.914.210.

En algunas realizaciones, el extremo 5’ de un oligómeros unido en fase sólida está funcionalizado con un derivado dienilfosforoamidita, seguido de la conjugación del oligómeros desprotegido con, por ejemplo, un aminoácido o péptido mediante una reacción de cicloadición de Diels-Alder.

En varias realizaciones, la incorporación de monómeros que contienen modificaciones de 2'-azúcar, tal como un azúcar sustituido con 2'-carbamato o un azúcar desoxirribosa-2'-(O-fenil-N-ftalimido) en el oligómero facilita la unión covalente de restos conjugados a los azúcares de oligómero. En otras realizaciones se prepara un oligómeros con un ligador que contiene amino en la posición 2’ de uno o más monómeros usando un reactivo tal como, por ejemplo, 5'-dimetoxitritil-2'-O-(e-ftalimidilaminopentil)-2'-desoxiadenosina-3'--N,N-diisopropil-cianoetoxi fosforoamidita. Véase, por ejemplo, Manoharan, y col., Tetrahedron Letters, 1991, 34, 7171.

En otras realizaciones adicionales, los oligómeros de la invención pueden tener restos funcionales que contienen amina sobre la base nucleotídica, incluido sobre los grupos amino de purina N6, sobre el N2 exocíclico de la guanina

o sobre las posiciones N4 o 5 de la citosina. En varias realizaciones, dicha funcionalización se puede conseguir usando un reactivo comercial que ya está funcionalizado en la síntesis del oligómero.

Algunos restos funcionales están disponibles comercialmente, por ejemplo restos de unión heterobifuncional y homobifuncional están disponibles en Pierce Co. (Rockford, III.). Otros grupos de unión disponibles comercialmente son los reactivos 5’-amino-modificador C6 y 3’-amino-modificador, ambos disponibles en Glen Research Corporation (Sterling, Va.). El 5’-amino-modificador también está disponible en ABI (Applied Biosystems Inc., Foster City, Calif.) como Aminolink-2, y 3'-Amino-Modificador también está disponible en Clontech Laboratories Inc. (Palo Alto, Calif.). En algunas realizaciones En algunas realizaciones

Composiciones

El oligómero de la invención se puede usar en formulaciones y composiciones farmacéuticas. Adecuadamente, tales composiciones comprenden un diluyente, vehículo, sal o adyuvante farmacéuticamente aceptable. PCT/DK2006/000512 proporciona diluyentes, vehículos y adyuvantes farmacéuticamente aceptables adecuados y preferidos. Las dosis, formulaciones, vías de administración, composiciones, formas de dosificación, combinaciones con otros agentes terapéuticos, formulaciones de profármacos adecuados también se proporcionan en el documento WO2007/031091.

Realizaciones

1. Un método de pronóstico para determinar la idoneidad del tratamiento de un sujeto humano con infección por VHC con un inhibidor de microARN-122, comprendiendo dicho método las etapas de

determinar el nivel de al menos un biomarcador en la muestra de suero comparar el nivel de la al menos una biomarcador con una o más muestras de referencia o valores de referencia,

para determinar si el sujeto 1 – 3 es probable que sea o es adecuado para el tratamiento de la infección por VHC con un inhibidor de microARN-122. (es decir, un probable respondedor al inhibidor de miR-122), en el que el al menos un biomarcador es microARN-122.

2. El método de acuerdo con la realización 1, en el que el inhibidor del micro-ARN-122 es un oligonucleótido

15

25

35

45

55

65

antisentido que es complementario a microARN-122 o a una subsecuencia del mismo, en toda la longitud del oligonucleótido.

3.

El método de acuerdo con la realización 1 o 2, en el que el sujeto infectado con VHC no ha recibido tratamiento previo y/o es asintomático y/o ha sido diagnosticado con VHC en los 3 años anteriores.

4.

El método de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1 -3, en el que el al menos un biomarcador es discriminatorio con la capacidad de respuesta al tratamiento de la infección por VHC.

5.

El método de acuerdo con la realización 4, en el que el al menos un biomarcador es un biomarcador de la función hepática.

6.

El método de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1 -5, en el que el al menos un biomarcador comprende además un biomarcador seleccionado del grupo que consiste en: un microARN sérico, GammaGT, AST y ALT.

7.

El método de acuerdo con realizaciones 1 -6, en el que el microARN es miR-122 maduro.

8.

El método de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1 -7, en el que el nivel del biomarcador de microARN se compara con el nivel de al menos un microARN de referencia en la muestra de suero, tal como un microARN cuyos niveles son invariables en el suero.

9.

El método de acuerdo con la realización 8, en el que el microARN de referencia se selecciona de uno o más del grupo que cosiste en miR-17, miR-18a, miR-345 y miR-16.

10.

El método de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1 -7 en el que el al menos un biomarcador comprende además un biomarcador que es un biomarcador de la función hepática, tal como una enzima hepática.

11.

El método de acuerdo con la realización 10, en el que la enzima hepática se selecciona del grupo que consiste en ASAT, ALAT, y GGT.

12.

El método de acuerdo con la realización 10 u 11, en el que se determinan los niveles de al menos 2 biomarcadores de enzimas hepáticas.

13.

El método de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1 -12, en el que se determinan los niveles de al menos 2, 3, o 4 biomarcadores.

14.

El método de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1 – 13, en el que se determinan los niveles de al menos 2 biomarcadores de enzimas hepáticas, así como los niveles del biomarcador de microARN 122.

15.

El método de acuerdo con la realización 14, en el que se seleccionan al menos 2 biomarcadores de enzima hepática del grupo que consiste en ASAT, ALAT, y gammaGT.

16.

El método de acuerdo con la realización 15, en el que el método comprende las etapas de determinar los niveles de ALAT y/o miR122 y/o GGT en la muestra de sangre, en el que una elevación de ALAT y/o miR-122, ALAT y/o GGT, o ALAT y miR-122 y/o GGT es indicativa de un sujeto que no es adecuado para el tratamiento con el inhibidor de miR-122.

17.

El método de acuerdo con la realización 15 o 16, en el que el método comprende las etapas de determinar los niveles de ALAT y/o miR122 y/o GGT en la muestra de sangre, en el que una elevación de ALAT y/o miR122, ALAT y/o GGT, o ALAT y miR-122 y/o GGT es indicativa de un sujeto que no es adecuado para el tratamiento con el inhibidor de miR-122 (un respondedor [probable].

18.

El método de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1 -17, en el que la muestra o valor de referencia se obtiene a partir de uno o más sujetos que no están infectados con el VHC, tal como un valor promedio de una población comparativa sana no infectada por el VHC.

19.

Un kit de pronóstico para uso como un diagnóstico in vitro, comprendiendo dicho kit un ensayo de cuantificación para miR-122 humano y al menos un ensayo de cuantificación más durante al menos un biomarcador adicional seleccionado del grupo que consiste en GammaGT, ASAT y ALAT.

20.

Un método de determinación de la dosis eficaz probable de un agente inhibidor de miR-122, tal como miravirsen, para la administración a un sujeto con infección por el VHC, comprendiendo dicho método

i) determinar el nivel de al menos un biomarcador en la muestra de sangre ii) comparar el nivel de la al menos una biomarcador con una o más muestras de referencia o valores de referencia,

para determinar la dosis eficaz probable del inhibidor de microARN-122 para la administración al sujeto con el fin de aliviar la infección por VHC, en la que el al menos un biomarcador es microARN-122.

21.

Una sonda de detección para microARN-122, para su uso como compañero de diagnóstico para una terapéutica del VHC, tal como un inhibidor de microARN-122.

22.

La sonda de detección de acuerdo con la realización 21, en la que la sonda es para su uso en un ensayo pronóstico para determinar la idoneidad de un sujeto en necesidad de tratamiento de VHC (por ejemplo crónica) para el tratamiento con el agente terapéutico del VHC.

23.

La sonda de detección de acuerdo con la realización 21 o 22 en la que el nivel de microARN específico del hígado en suero se correlaciona de forma inversa con la idoneidad de la materia para el tratamiento.

Ejemplos

Ensayos de biomarcadores de transaminasas:

15

25

35

45

55

65

Los protocolos de biomarcadores utilizados para la medición de ALT fue el ensayo de Advia Chemistry Systems ALT assay (03903166 Rev. B 2007–05); el protocolo para la medición de ALT fue el ensayo de ALT Advia Chemistry Systems ALT assay (03815151 Rev. B 2007–05), el protocolo para la medición de la GGT fue el ensayo de Advia Chemistry Systems ALT assay (04130756 Rev. B 2007–05). Los microARN se detectaron utilizando ensayos TaqMan de ABI. Ejemplos de proveedores alternativos de microARN se proporcionan en el presente documento e incluyen, por ejemplo, reactivos Exiqon A/S mercury LNA®.

Ejemplo 1: clasificación de la respuesta virológica al tratamiento con miravirsen

Se realizó un estudio aleatorizado, doble ciego, controlado con placebo de varias dosis ascendentes de Fase 2a con 36 pacientes no tratados previamente con infección crónica por VHC de genotipo 1. Los pacientes se reclutaron de forma secuencial a una de tres cohortes (9 fármaco activo: 3 placebo por cohorte). Miravirsen se administró como inyecciones subcutáneas semanales, durante 29 días (5 inyecciones en total), en dosis de 3 mg/kg en la cohorte 1,5 mg/kg en la cohorte 2, y 7 mg/kg en la cohorte 3.

De todos los pacientes incluidos en el estudio, se tomaron muestras de sangre dos veces antes del inicio del tratamiento: en una visita de selección para evaluar la idoneidad para su inclusión en el estudio, y en la visita basal justo antes de la primera dosis de tratamiento. Después de iniciar el tratamiento, se tomaron muestras de sangre semanalmente, hasta, e incluyendo, la semana 18 después de la primera dosis de tratamiento.

Se aisló el suero de cada muestra y el título viral del VHC se cuantificó mediante la evaluación de los niveles de ARN de VHC utilizando QRT-PCR en las muestras.

La respuesta al tratamiento con miravirsen en cada paciente se clasifica en una escala de 0 a 4. Este grado se asigna en base a la máxima reducción de log en base 10 del ARN del VHC en comparación con el valor basal.

Específicamente,

(i)

Grado 0: disminución menor de 1 log

(ii)

Grado 1: disminución de más de 1 log y de menos de 2 log

(iii) Grado 2: disminución de más de 2 log y de menos de 3 log

(iv)

Grado 3: disminución de más de 3 log y de menos de 4 log

(v)

Grado 4: disminución de más de 4 log

Algunos pacientes no completaron el período completo de estudio de 18 semanas, sino que salieron del estudio antes de tiempo por varias razones. Además, en la cohorte 3, no todos los pacientes alcanzaron la semana 18 en el momento de redactar este texto. Dado que el grado de respuesta para un paciente dado se basa en la respuesta máxima observada durante todo el período de estudio para ese paciente, los inventores se preguntaron si los diferentes periodos de estudio sesgarían el grado de respuesta. Con este fin, se evaluó si existe tal conexión entre el grado de respuesta y el período de estudio (es decir, número de semanas completas). La figura 1 muestra los diagramas de caja de los grados de respuesta como una función del número de semanas completadas. Como puede apreciarse en la Figura 1, no hay conexión entre el grado de respuesta y el período de estudio. Esto demuestra que el grado no está sesgado por los períodos de estudio más cortos de 18 semanas para un subconjunto de los pacientes.

El comité asesor de productos antivirales de la FDA define respondedores nulos al tratamiento de la infección crónica por hepatitis C a los pacientes con reducción < 1 log10 en el ARN del VHC en la semana 12 (Sherman et al., 2007 Hepatology Vol. 46 No. 6). Del mismo modo, los respondedores parciales se definen como Reducción > 1 pero <2 log10 del ARN del VHC a las 12 semanas. Para la comparación, el grado 0 tal como se define en el presente documento, es, por tanto, n subconjunto de los respondedores nulos y el grado 1 es un subconjunto de los respondedores parciales.

Ejemplo 2: Dependencia del grado de respuesta en el nivel de dosis de miravirsen

A continuación, se planteó la hipótesis de que la respuesta virológica al tratamiento con miravirsen cuantificada por la simple calificación de cinco niveles presentados en el Ejemplo 1, podría depender del nivel de dosis del compuesto.

Por lo tanto, para los tres niveles de dosis utilizadas en el estudio de fase 2 bis (ejemplo 1), se evaluó si existía una asociación entre el grado de respuesta y nivel de dosis.

Para cada grado de respuesta, el número de pacientes en cada nivel de dosis se muestra en la Figura 2A. En los grados más bajos (0 y 1), el nivel de dosis de 3 mg/kg está sobrerrepresentado. Por el contrario, en los altos grados (3 y 4), no hay niveles de dosis de 3 mg/kg. La comparación de los niveles de dosis de 5 y 7 mg/kg no muestra ninguna diferencia clara. El análisis estadístico de estos datos mediante la prueba exacta de Fisher confirma que no hay diferencia significativa en los grados de respuesta entre los niveles de dosis de 5 y 7 mg/kg (P = 0,78). Si

10

15

20

25

30

agrupamos los niveles de dosis 5 y 7 mg/kg y se compara con la dosificación de 3 mg/kg, la distribución de los grados de respuesta están en el límite significativamente diferentes (P = 0,09).

La distribución de los grados de respuesta como una función de la dosis de tratamiento se presenta también como una tabla de contingencia en la figura 2B. Aquí, los grados de respuesta se agrupan en 0 y 1 frente a 2, 3, y 4, y las dosis de tratamiento a 3 mg/kg en comparación con 5 y 7 mg/kg, para tener suficientes pacientes en cada combinación de dosis-respuesta al tratamiento. Como se ve, la mayoría de los grados de respuesta (2, 3 y 4) se alcanzan con las altas dosis de tratamiento (5 y 7 mg/kg). Esta asociación entre la dosis de tratamiento y el grado de respuesta es estadísticamente significativa (p <0,05 por la prueba exacta de Fisher).

Ambos enfoques implican que al menos algunos de los malos respondedores (grado 0) a los que se ha dado la dosis baja de 3 mg/kg podrían mostrar una respuesta si dosificado con concentraciones más altas de miravirsen. Por consiguiente, los inventores han concluido que los 3 pacientes a los que se han administrado las dosis de 5 o 7 mg/kg con un grado 0 (véase la Figura 2A) representan más claramente pacientes que responden mal al tratamiento con miravirsen.

Ejemplo 3: Medición de biomarcadores en muestras de suero en la selección y basales de pacientes con VHC

Se extrajo sangre de todos los pacientes incluidos en el estudio clínico de fase 2a descrito en el ejemplo 1 se en el momento de la selección (para evaluar la inclusión/exclusión en el estudio) y en el momento basal (antes de la primera dosis de tratamiento). Había entre 6 y 34 días entre la obtención de muestras en la selección y basal para un paciente dado, siendo la diferencia un promedio de de 20 +/-6 días.

Para cada muestra, se evaluaron 40 observables diferentes. Estos incluyeron mediciones de biomarcadores, así como las pruebas de función realizadas por dos laboratorios de química clínica, excepto para la cuantificación de microARN que la realizó (Austin, Texas, EE.UU.), véase la Tabla 1. Tabla 1. Observables medidos en cada muestra. Para cada observable se indican los límites inferior y superior del intervalo normal (para varones y mujeres individualmente cuando sea pertinente), así como la unidad en la que se informa de la medición.

Observable

Sexo* Límite inferior de la normalidad ** Límite superior de la normalidad ** Unidad

ALAT (SGPT) Albúmina Fosfatasa alcalina Fosfatasa alcalina APA1 APOB APTT ASAT (SGOT)

M y V M y V F M M y V M y V M y V M y V 0 34 46 58 101 60 24 0 69 52 129 141 203 170 45 52 U/l g/l U/l U/l mg/dl mg/dl s U/l

B2–microglobulina Basófilos Bilirrubina (conjugado) Bilirrubina (total) BUN (urea) BUN (urea) Ca (calcio) Colesterol

M y V M y V M y V M y V F M M y V M y V 0 0 0 0 0 0 2,21 0 300 0,2 7 30 8,1 9,6 2,63 6,5 ng/ml 10^9/l umol/l umol/l mmol/l mmol/l mmol/l mmol/l

Cl (cloruro) Cockcroft y Gault Creatinina Creatinina Eosinófilos Factor VII GammaGT GammaGT

M y V M y V F M M y V M y V F M 99 70 0 0 0 50 0 0 110 160 115 124 0,6 150 50 79 mmol/l ml/min umol/l umol/l 10^9/l % U/l U/l

Globulina Glucosa Hemoglobina Hemoglobina ARN del VHC Hematocrito Hematocrito Fosfato inorgánico K (potasio)

M y V M y V F M M y V F M M y V M y V 20 0 7,3 8,1 0 0,34 0,38 0,8 3,6 40 6,2 9,5 11,2 0,47 0,52 1,5 5,2 g/l mmol/l mmol/l mmol/l UI/ ml L/l L/l mmol/l mmol/l

LDH

M y V 0 275 U/l

34

5

10

15

20

25

30

35

Observable Sexo* Límite inferior de la Límite superior de la Unidad normalidad ** normalidad **

Recuento de M y V 3,8 11 10^9/l

leucocitos

Linfocitos M y V 1 4,8 10^9/l

Monocitos M y V 0 0,9 10^9/l

Na (sodio M y V 137 147 mmol/l

Neutrófilos M y V 1,4 8,2 10^9/l

Recuento de M y V 150 400 10^9/l

plaquetas

Proteína (total) M y V 63 85 g/l

PT M y V10 15 s

PT (INR) M y V 0,85 3,5

PH en orina M y V 5 8

Densidad específica M y V 1,003 1,035 kg/l

en orina

microARN–122 M y V –2,4 1,0 ciclos

* M: Mujer, V: varón ** definido como la media +/-2 desviaciones estándar. Cuando se indican las diferencias entre los intervalos estándar del laboratorio de Europa y de Estados Unidos, se eligió el intervalo máximo. Para miR-122, se calcularon los intervalos estándar como se describe en el ejemplo.

Se realizaron las mediciones de laboratorio de química clínica como se describe en otro lugar.

Las mediciones de microARN se realizaron solo muestras de suero basales. En resumen, se extrajo el ARN de cada muestra de suero utilizando el método de extracción establecido por el Asuragen's Pharmacogenomics Services Group. En cada muestra de ARN, los niveles de miR-122, miR-17 y miR-18a se midieron mediante qRT-PCR. Estas mediciones se llevaron a cabo como un procedimiento RT-PCR de dos etapas utilizando ensayos TaqMan Small RNA Assays (Applied Biosystems; Foster City, C, EE.UU.). La primera etapa implicó la síntesis de ADNc a partir de ARN total utilizando un cebador de transcriptasa inversa de tallo-bucle específica de la diana, lo que da lugar a la generación de un amplicón quimérico de miARN/RT-cebador. En el segundo paso, este amplicón se amplificó en un ensayo estándar de PCR en tiempo real TaqMan utilizando cebadores directos e inversos específicos. Además de los cebadores, se usó una sonda TaqMan marcada con fluorescencia y específica del amplicón para controlar el aumento de la cantidad de amplicón a medida que avanzaba la PCR. El número ciclo en el cual la señal de fluorescencia de la sonda TaqMan excede un valor umbral por encima del ruido, que se define como el valor Ct, se utiliza como una medida de la concentración original de ADNc en la muestra (cuanto menor es el valor de Ct, menos ciclos han sido necesarios para amplificar la señal por encima del ruido, y más material de ADNc de partida debe haber habido). En un estudio independiente, se ha identificado que miR-17 y miR-18a se expresan de forma estable entre los pacientes infectados por el VHC y los sujetos control sanos. Por lo tanto, se realizó un promedio de los valores de Ct para miR-17 y miR-18a (Ct medio de de miR-17 y miR-18a), y se restó el valor Ct de miR-122 de dicho valor medio. Esto establece un valor dCt de miR-122 que es comparable en todas las muestras de suero, DCT (miR122) = (Ct (miR-17) + Ct (miR-18a))/2 -Ct (miR-122). Específicamente, cuanto mayor es el valor de dCt, mayor es la expresión de miR-122 en la muestra.

Para evaluar la solidez con el tiempo, para cada observable en cada muestra, se evaluó la relación entre las mediciones de la selección y basal. En concreto, para cada observable, se calculó la correlación entre las medidas de detección y basal detallados en los pacientes. Los resultados se muestran en la Tabla 2, primeras dos columnas. Como se ve, 20 de los observables muestran una fuerte y significativa correlación (r ≥ 0.7, P <0,0001) entre las mediciones en la selección y basales, y 6 observables muestran una correlación débil o ausente (r < 0.4, P > 0.01). Tabla 2. Comparación de las mediciones en la selección y basal. Para dichos 33 observables que se midieron en todos los pacientes, en los momentos tanto de selección como basal, se enumeran dos comparaciones. En las columnas 1 y 2 se muestran para cada observable el coeficiente de correlación y su significado asociado al comparar los valores de detección y basales en los pacientes (prueba de correlación de Spearman). En la columna 3 se muestra la importancia en la evaluación de la diferencia en los promedios en el momento de selección y basal (prueba del rango con signo de Wilcoxon).

Además de la correlación, también se evaluaron los cambios generales en los valores medidos en los tiempos de selección y basal. La importancia de este cambio en los valores se indica en la columna 3 de la Tabla 2. Solo el hematocrito, la hemoglobina, y el calcio (significación marginal) son juzgados como que muestran un cambio global en el valor (P <0,005).

Observable

r P (correlación) P (wilcoxon)

Cockcroft y Gault Globulina

0,93 0,91 1,20 E–14 3,00 E–14 0,95 0,13

Colesterol

0,9 1,00 E-13 0,017

Fosfatasa alcalina

0,87 8,50 E-12 0,44

5

10

15

20

25

Además de la correlación, también se evaluaron los cambios generales en los valores medidos en los tiempos de selección y basal. La importancia de este cambio en los valores se indica en la columna 3 de la Tabla 2. Solo el hematocrito, la hemoglobina, y el calcio (significación marginal) son juzgados como que muestran un cambio global en el valor (P <0,005).

Observable

r P (correlación) P (wilcoxon)

ARN del VHC

0,87 8,10 E-12 0,21

GammaGT

0,84 1,70 E-10 0,76

Recuento de plaquetas ALAT (SGPT) ASAT (SGOT) Hemoglobina Proteína (total) Creatinina

0,84 0,83 0,81 0,81 0,78 0,77 4,20 E-10 2,50 E-10 1,60 E–09 3,20 E–09 2,60 E–08 3,60 E–08 0,41 0,8 0,56 0,0018 0,032 0,27

Monocitos

0,75 1,70 E–07 0,32

Hematocrito

0,75 2,80 E–07 5,70 E–05

Bilirrubina (conjugado) LDH

0,74 0,71 2,90 E–07 1,50 E–06 0,54 0,3

PT

0,7 2,10 E–06 0,31

Recuento de leucocitos

0,7 2,40 E–06 0,32

Bilirrubina (total) Linfocitos

0,7 0,7 1,80 E–06 2,80 E–06 1 0,25

APTT

0,62 6,30 E–05 0,39

Neutrófilos

0,62 0,00017 0,76

Albúmina

0,62 5,50 E–05 0,021

BUN (urea) Eosinófilos

0,62 0,6 6,30 E–05 0,00013 0,043 0,52

Ca (calcio) Cl (cloruro) K (potasio) Densidad específica en orina PH en orina

0,52 0,4 0,4 0,32 0,24 0,001 0,016 0,016 0,061 0,15 0,0051 0,15 0,027 0,3 0,17

Basófilos

0,23 0,18 0,85

Glucosa

0,15 0,37 0,34

Ejemplo 4: Identificación de asociaciones entre los niveles basales de los observables y el grado de respuesta a miravirsen

Se identificaron asociaciones entre los niveles basales de los observables (véase el ejemplo 3) y la respuesta al tratamiento con miravirsen (véase el ejemplo 1) utilizando dos abordajes: bien mediante una diferencia significativa en los niveles promedio de medición entre los respondedores malos (grado 0) y el resto (grados 1 -4), tal como se evaluó mediante la prueba de suma de rangos de Wilcoxon, o por una correlación significativa entre los niveles de medición y el grado de respuesta, tal como se evaluó mediante la prueba de correlación de Spearman.

Se incluyen pacientes de las tres cohortes en este análisis, a pesar de que algunos de los respondedores de grado 0 en el grupo de dosis baja podrían haber mostrado una respuesta de grado superior si se les hubiera administrado una dosis más alta (véase el ejemplo 2).

De los 40 observables para los se dispone de datos basales, los cuatro asociados más significativamente con el grado de respuesta evaluados por la prueba de correlación de rangos y7o de suma de rangos y también mostraron una alta concordancia entre los valores en los momentos de selección y basal (r > 0,8, véase el ejemplo 3), eran de miR-122, GGT, ALAT, ASAT y, véase la figura 3 y la tabla 3.

Tabla 3. Asociaciones significativas entre los observables y los grados de respuesta. Significación de la prueba de suma de rangos de Wilcoxon (en relación con los gráficos de barras en la figura 3) y resultados de la prueba de correlación de Spearman (en relación con los diagramas de dispersión en la figura 3). Solo se muestran los 5

primeros.

Observable

P (wilcoxon) r P (correlación)

miR-122

0,005 –0,48 0,01

PT

0,14 0,44 0,02

GGT

0,31 –0,39 0,05

ALAT

0,05 –0,35 0,07

ASAT

0,13 –0,30 0,12

Estos cuatro observables se han comunicado todos ellos como biomarcadores séricos de la función hepática o de enfermedad/daño hepática (para ALAT, ASAT y GGT, bien conocido para miR-122, véase Bihrer et al., 2011, Am. J.

36

imagen24

Claims (1)

1. imagen1