TW202111124A - 用於抑制ｓｃａｐ表現之ｒｎａｉ構建體及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本發明關於用於降低SCAP基因的表現之RNAi構建體。還描述了使用這類RNAi構建體來治療或預防肝臟疾病、非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）之方法。

Description

用於抑制SCAP表現之RNAI構建體及其使用方法
本發明關於用於調節固醇調控元件結合蛋白（SREBP）裂解激活蛋白（SCAP）的肝臟表現之組成物及方法。特別地，本發明關於藉由RNA干擾（RNAi）降低SCAP表現的基於核酸之治療劑、及利用這類基於核酸的治療劑來治療或預防諸如非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的肝臟疾病之方法。
包括一系列肝臟病理的非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）係世界上最常見之慢性肝病，在過去的20年中其患病率增加了一倍，目前估計大約影響到世界人口之20%（Sattar等人 (2014) BMJ 349:g4596；Loomba和Sanyal (2013) Nature Reviews Gastroenterology & hepatology [自然綜述 腸病學與肝臟病學] 10(11):686-690；Kim和Kim (2017) Clin Gastroenterol Hepatol [臨床胃腸病學與肝臟病學] 15(4):474-485；Petta等人 (2016) Dig Liver Dis [消化疾病與肝病] 48(3):333-342）。NAFLD開始於甘油三酸酯在肝臟中的累積，其定義為在如下個體的超過5%的肝細胞中存在細胞質脂滴：(1) 沒有大量飲酒史且 (2) 其中已排除其他類型肝臟疾病的診斷（Zhu等人 (2016) World J Gastroenterol[世界胃腸病學雜誌] 22(36):8226-33；Rinella (2015) JAMA [美國醫學會雜誌] 313(22):2263-73；Yki-Jarvinen (2016) Diabetologia [糖尿病學] 59(6):1104-11）。在一些個體中，異位脂肪在肝臟中的累積（被稱為脂肪變性）引起炎症和肝細胞損傷，從而導致疾病的更晚期階段，這被稱為非酒精性脂肪性肝炎（NASH）（Rinella，見上文）。截至2015年，預計有7千5百萬至一億美國人患有NAFLD；NASH大約占NAFLD診斷的10%至30%（Rinella，見上文；Younossi等人 (2016) Hepatology [肝臟病學] 64(5):1577-1586）。
SCAP（SREBP裂解激活蛋白）係SREBP家族的轉錄因子的僅有的已知轉錄後調控因子。SREBP（固醇反應元件結合蛋白）家族在對於從頭脂肪生成和TG在肝臟內累積的調控中發揮了重要作用。在ER中，SREBP係以無活性先質的形式而合成。在合成後SCAP立即與SREBP形成複合體，並護送SREBP向高基小胞的轉運。然後，SREBP被進一步加工，以釋放轉錄因子的活性胺基末端。活性SREBP易位至細胞核並與SREBP反應元件結合，以驅動靶基因的轉錄激活（Brown, M.S.和Goldstein, J.L. (1997) Cell [細胞] 89, 331-340）。有人提出了SCAP的靶向緘默，用以防止對活性SREBP的加工和下游轉錄變化。
蛋白質的SREBP家族包括三種同功型：SREBP-1a、SREBP-1c和SREBP-2，它們具有不同但相互重疊的功能。SREPB-1c在肝臟中含量豐富，並且主要激活脂肪酸和TG合成。SREBP-1的種系缺失展現出SREBP-2水平的相伴增加，這彌補了SREBP-1的損失。
SREBP-2藉由激活LDL受體（LDLR）來驅動膽固醇產生和低密度脂蛋白（LDL）加工。SREBP-2還調控PCSK9，這係一種與LDLR相互作用以促進其降解並減少膽固醇攝取的分泌性蛋白。SCAP/SREBP的損失維持LDLR的蛋白水平。SREBP1c亦為PNPLA3的僅有的已知轉錄調控因子。PNPLA3多型性rs738409（I148M）係NASH/NAFLD之主要遺傳定子，存在於50%的患者中。有人提出了使SCAP活性緘默以使攜帶此突變的個體受益。因此，靶向SCAP功能的新治療劑代表了降低SCAP水平並治療肝病（如非酒精性脂肪性肝病）之新方法。
本發明部分地是基於RNAi構建體的設計和產生，該RNAi構建體靶向SCAP基因並降低SCAP在肝細胞中之表現。SCAP表現的序列特異性抑制可用於治療或預防與SCAP表現相關的病症，如肝相關疾病，例如像單純性脂肪肝（脂肪變性）、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、肝硬化（不可逆的晚期肝臟瘢痕形成）、或SCAP相關性肥胖症。因此，在一個實施方式中，本發明提供一種包含有義股和反義股的RNAi構建體，其中反義股包含具有與SCAP mRNA序列為互補的序列的區域。在某些實施方式中，反義股包含具有來自在表1或表2中所列出的反義序列的至少15個連續核苷酸的區域。
在一些實施方式中，本文所描述RNAi構建體的有義股包含如下序列，其與反義股的序列充分地互補以形成長度為約15至約30個鹼基對的雙股體區。在這些和其他實施方式中，有義股和反義股各自之長度為約15至約30個核苷酸。在一些實施方式中，RNAi構建體包含至少一個平端。在其他實施方式中，RNAi構建體包含至少一個核苷酸突出端。這類核苷酸突出端可包含至少1至6個未配對核苷酸，並且可以位於有義股之3'端、反義股之3'端、或者有義股和反義股兩者之3'端。在某些實施方式中，RNAi構建體在有義股之3'端和反義股之3'端包含具有兩個未配對核苷酸之突出端。在其他實施方式中，RNAi構建體在反義股之3'端和有義股之3'端/反義股之5'端包含具有兩個未配對核苷酸之突出端。
本發明之RNAi構建體可包含一個或多個經修飾的核苷酸，包括具有針對核糖環、核鹼基、或磷酸二酯主鏈的修飾的核苷酸。在一些實施方式中，RNAi構建體包含一個或多個2'-修飾的核苷酸。這類2'-修飾的核苷酸可以包括：2'-氟修飾的核苷酸、2'-O-甲基修飾的核苷酸、2'-O-甲氧基乙基修飾的核苷酸、2'-O-烯丙基修飾的核苷酸、二環核酸（BNA）、乙二醇核酸（GNA）、反向鹼基（例如，反向腺苷）或其組合。在一個特定實施方式中，RNAi構建體包含一個或多個2'-氟修飾的核苷酸、2'-O-甲基修飾的核苷酸、或其組合。在一些實施方式中，RNAi構建體的有義股和反義股中的全部核苷酸皆為經修飾的核苷酸。
在一些實施方式中，RNAi構建體包含至少一個主鏈修飾，如經修飾的核苷酸間鍵或核苷間鍵。在某些實施方式中，本文所描述的RNAi構建體包含至少一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵。在特定實施方式中，硫代磷酸酯核苷酸間鍵可位於有義股和/或反義股之3'或5'端。
在一些實施方式中，本發明之RNAi構建體的反義股和/或有義股可包含來自在表1或表2中所列出的反義股和有義序列的序列或者由其組成。在某些實施方式中，RNAi構建體可為在表1至表2的任一項中所列出的雙股體化合物中的任一種。
相關申請的交叉引用
本申請要求於2019年5月30日提交的美國臨時專利申請案號62/854,433之權益，該臨時專利申請藉由引用以其全文併入本文。
本發明關於用於調控SREBP裂解激活蛋白（SCAP）基因的表現的組成物及方法。在一些實施方式中，該基因可在細胞或受試者內，如哺乳動物（例如人）。在一些實施方式中，本發明之組成物包含靶向SCAP mRNA並降低SCAP在細胞或哺乳動物中之表現的RNAi構建體。這類RNAi構建體可用於治療或預防各種形式的肝相關疾病，例如單純性脂肪肝（脂肪變性）、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、肝硬化（不可逆的晚期肝瘢痕形成）、或SCAP相關性肥胖症。
NASH/NAFLD患者群體展現出SREBP1c及其靶基因的表現和轉錄活性的增加（Higuchi等人 (2008) Hepatol Res [肝臟病學研究] 38, 1122-1129）。利用小鼠遺傳學和siRNA介導的緘默，研究已表明SCAP活性的肝特異性去除顯著地降低野生型Ob/Ob小鼠和高脂飲食飼養倉鼠的肝臟TG含量。與之相伴的為在SCAP緘默後VLDL分泌的減少和血漿TG水平的降低。然而，體重、胰島素和葡萄糖水平保持不變（Moon等人 (2012) Cell Metab [細胞代謝] 15, 240-246）。最近，已發表的研究結果表明，在小鼠和血脂異常恆河猴中SCAP的siRNA緘默顯著地降低TG水平（Jensen等人 (2016) J Lipid Res[脂質研究雜誌] 57, 2150-2162；Murphy等人 (2017) Metabolism [代謝] 71, 202-212）。基於這些已發表的報告，我們假設在NASH患者中siSCAP的投與將減少肝臟脂肪變性並防止纖維化的進一步進展。
RNA干擾（RNAi）係將外源性RNA引入細胞中從而導致編碼所靶向的蛋白質的mRNA發生特異性降解，結果使得蛋白表現下降的過程。RNAi技術和肝遞送兩者中的進步及採用其他基於RNAi的療法的不斷增加的積極結果，表明RNAi為藉由直接地靶向SCAP而治療性治療NAFLD至有效手段。藉由對Hep3B細胞進行篩選而證實了這些序列的抑制作用。然後，我們使用C57Bl6小鼠證明了用SCAP siRNA進行處理降低SCAP在小鼠中之表現。
如本文使用的，術語「RNAi構建體」係指包含RNA分子的活性劑，當被引入細胞中時該活性劑能夠利用RNA干擾機制下調靶基因（例如SCAP）的表現。RNA干擾係核酸分子以序列特異性方式，例如經過RNA誘導的緘默複合體（RISC）通路，來誘導靶RNA分子（例如傳訊RNA或mRNA分子）的裂解和降解之過程。在一些實施方式中，RNAi構建體包含雙股RNA分子，該雙股RNA分子包含彼此充分地互補以便雜交形成雙股體區的連續核苷酸的兩條反向平行股。「雜交（hybridize）」或「雜交（hybridization）」係指互補多核苷酸的配對，典型地是藉由在兩個多核苷酸中的互補鹼基之間的氫鍵合（例如Watson-Crick氫鍵合、Hoogsteen氫鍵合、或反向Hoogsteen氫鍵合）而配對。包含具有與靶序列（例如靶mRNA）基本上互補的序列的區域的股被稱為「反義股」。「有義股」係指包括與反義股的區域基本上互補的區域的股。在一些實施方式中，有義股可包含具有與靶序列基本上相同的序列的區域。
在一些實施方式中，本發明提供針對SCAP的RNAi構建體。在一些實施方式中，本發明包括含有在表1或表2中所發現的任何序列的RNAi構建體。
雙股RNA分子可包含針對核糖核苷酸的化學修飾，包括針對核糖核苷酸的核糖、鹼基或主鏈組分的修飾，如本文所描述或在本領域中已知的修飾。為了本揭露的目的，術語「雙股RNA」包括在雙股RNA分子（例如siRNA、shRNA等）中所採用的任何這類修飾。
如本文使用的，如果包含第一序列的多核苷酸可以在某些條件（如生理條件）下與包含第二序列的多核苷酸雜交形成雙股體區，則第一序列與第二序列為「互補」。其他的這類條件可包括熟悉該項技術者已知的中等或嚴格的雜交條件。如果包含第一序列鹼基對的多核苷酸與包含第二序列的多核苷酸在一個或兩個核苷酸序列的整個長度上配對並且沒有任何錯配，則認為第一序列與第二序列完全地互補（100%互補）。如果一個序列與靶序列至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%互補，則該序列與靶序列「基本上互補」。可以藉由將第一序列中與第二序列或靶序列中相應位置的鹼基為互補的鹼基數除以第一序列的總長度來計算互補性百分率。當使兩個序列雜交時，如果在30個鹼基對雙股體區上存在不超過5個、4個、3個、2個或1個的錯配，則一個序列也可以說與另一序列基本上互補。通常，如果存在如本文所定義的任何核苷酸突出端，則在確定兩個序列之間的互補程度時不考慮這類突出端的序列。舉例來說，雜交而形成在各股的3'端具有2個核苷酸突出端的19個鹼基對雙股體區的、長度為21個核苷酸的有義股與長度為21個核苷酸的反義股將會被認為如本文所使用術語那樣完全地互補。
在一些實施方式中，反義股的區域包含與靶RNA序列的區域（例如SCAP mRNA）完全地互補的序列。在這類實施方式中，有義股可包含與反義股的序列完全地互補的序列。在其他的這類實施方式中，有義股可包含與反義股的序列基本上互補的序列，例如在由有義股和反義股形成的雙股體區中具有1、2、3、4、或5個錯配。在某些實施方式中，較佳的是任何錯配發生在末端區內（例如，在股的5'和/或3'端的6、5、4、3、2、或1個核苷酸內）。在一個實施方式中，在由有義股和反義股形成的雙股體區中的任何錯配發生在反義股的5'端的6、5、4、3、2、或1個核苷酸內。
在某些實施方式中，雙股RNA的有義股和反義股可為兩個單獨的分子，這兩個分子雜交而形成雙股體區，否則係未連接的。由兩條單獨股形成的這類雙股RNA分子被稱為「小干擾RNA」或「短干擾RNA」（siRNA）。因此，在一些實施方式中，本發明之RNAi構建體包含siRNA。
如果dsRNA的兩條基本上互補股係由單獨的RNA分子所組成，這些分子無需但可以共價連接。如果兩條股藉由以除了在一條股的3'端與相應的另一條股的5'端之間的不間斷核苷酸鏈以外的方式共價連接從而形成一條雙股結體構，則該連接結構被稱為「連接子（linker）」。RNA股可以具有相同或不同數量之核苷酸。雙股體中鹼基對的最大數量係dsRNA的最短股中的核苷酸數量減去存在於雙股體中的任何突出端。除了雙股體結構外，RNAi構建體還可包含一個或多個核苷酸突出端。
在其他實施方式中，雜交而形成雙股體區的有義股和反義股可為單個RNA分子的一部分，即有義股和反義股係單個RNA分子的自我互補區的一部分。在這種情況下，單個RNA分子包含雙股體區（也稱為莖區）和環區。有義股的3'端經由未配對核苷酸的連續序列而連接至反義股的5'端，這將形成環區。環區典型地具有足夠之長度從而允許RNA分子向後折疊到其自身上，使得反義股可以與有義股發生鹼基配對而形成雙股體區或莖區。環區可以包含約3至約25、約5至約15、或約8至約12個未配對核苷酸。具有至少部分地自我互補區的這類RNA分子被稱為「短髮夾RNA」（shRNA）。在一些實施方式中，環區可包含至少1、2、3、4、5、10、20、或25個未配對核苷酸。在一些實施方式中，環區可具有10、9、8、7、6、5、4、3、2、或更少的未配對核苷酸。在某些實施方式中，本發明之RNAi構建體包含shRNA。單個的至少部分自我互補的RNA分子之長度可為約35個核苷酸至約100個核苷酸、約45個核苷酸至約85個核苷酸、或約50至約60個核苷酸，並且包含雙股體區和環區，各區具有本文所列舉之長度。
在一些實施方式中，本發明之RNAi構建體包含有義股和反義股，其中反義股包含具有與SCAP傳訊RNA（mRNA）序列基本上或完全地互補的序列的區域。如本文使用的，「SCAP mRNA序列」係指編碼SCAP蛋白的任何傳訊RNA序列，包括剪接變異體，包括來自任何物種（例如小鼠、大鼠、非人靈長類動物、人）的SCAP蛋白變異體或同功型。
SCAP mRNA序列還包括被表現為其互補DNA（cDNA）序列的轉錄物序列。cDNA序列係指以DNA鹼基（例如鳥嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶）而不是以RNA鹼基（例如鳥嘌呤、腺嘌呤、尿嘧啶和胞嘧啶）形式而表現的mRNA轉錄物的序列。因此，本發明之RNAi構建體的反義股可包含具有與靶SCAP mRNA序列或SCAP cDNA序列基本上或完全地互補的序列的區域。SCAP mRNA或cDNA序列可以包括但不限於任何SCAP mRNA或cDNA序列，例如可以來源於人SCAP（NM_012235）或小鼠SCAP（NM_001001144）的NCBI參考序列。
反義股的區域可以與SCAP mRNA序列的至少15個連續核苷酸基本上互補或完全地互補。在一些實施方式中，反義股包含與之互補區域的SCAP mRNA序列的靶區域的範圍可以為約15至約30個連續核苷酸、約16至約28個連續核苷酸、約18至約26個連續核苷酸、約17至約24個連續核苷酸、約19至約25個連續核苷酸、約19至約23個連續核苷酸、或大約19至約21個連續核苷酸。在某些實施方式中，包含與SCAP mRNA序列基本上或完全地互補的序列的反義股的區域，在一些實施方式中，可以包含來自在表1或表2中所列出的反義序列的至少15個連續核苷酸。在其他實施方式中，反義序列包含來自在表1或表2中所列出的反義序列的至少16個、至少17個、至少18個或至少19個連續核苷酸。在一些實施方式中，有義序列和/或反義序列包含來自表1或表2中所列出的序列的至少15個核苷酸，並且具有不超過1、2、或3個的核苷酸錯配。
RNAi構建體的有義股典型地包含與反義股的序列充分地互補的序列，使得這兩條股在生理條件下雜交而形成雙股體區。「雙股體區」係指在兩個互補或基本上互補的多核苷酸中的區域，這些多核苷酸藉由沃森-克裡克鹼基配對或其他氫鍵合相互作用而相互形成鹼基對，從而在兩個多核苷酸之間形成雙股體。RNAi構建體的雙股體區應具有足夠之長度從而允許RNAi構建體進入RNA干擾通路，例如藉由使Dicer酶和/或RISC複合體接合。例如，在一些實施方式中，雙股體區之長度為約15至約30個鹼基對。在此範圍內的雙股體區的其他長度也合適，例如約15至約28個鹼基對、約15至約26個鹼基對、約15至約24個鹼基對、約15至約22個鹼基對、約17至約28個鹼基對、約17至約26個鹼基對、約17至約24個鹼基對、約17至約23個鹼基對、約17至約21個鹼基對、約19至約25個鹼基對、約19至約23個鹼基、或約19至約21個鹼基對。在一個實施方式中，雙股體區之長度為約17至約24個鹼基對。在另一個實施方式中，雙股體區之長度為約19至約21個鹼基對。
在一些實施方式中，本發明之RNAi構建體含有約24至約30個核苷酸的雙股體區，該雙股體區與靶RNA序列（例如，SCAP靶mRNA序列）相互作用以指導靶RNA的裂解。不希望受到理論的束縛，利用被稱為Dicer的III型內切核酸酶，可以將引入細胞中的長雙股RNA分解成siRNA（Sharp等人 (2001) Genes Dev. [基因與發育] 15:485）。Dicer（核糖核酸酶-III樣酶）將dsRNA加工成具有特徵性兩鹼基3'突出端的19-23個鹼基對的短干擾RNA（Bernstein等人 (2001) Nature [自然] 409:363）。然後將siRNA併入RNA誘導的緘默複合體（RISC）中，其中一種或多種解旋酶解開siRNA雙股體，從而使互補的反義股能夠指導靶識別（Nykanen等人 (2001) Cell [細胞] 107:309）。在與適當的靶mRNA結合後，RISC內的一種或多種內切核酸酶使靶裂解，以誘導緘默（Elbashir等人 (2001) Genes Dev. [基因與發育] 15:188）。
對於有義股和反義股係兩個獨立分子（例如RNAi構建體包含siRNA）的實施方式而言，有義股和反義股之長度無需與雙股體區之長度相同。例如，一條或兩條股可能比雙股體區更長，並且具有在雙股體區側面的一個或多個未配對核苷酸或錯配。因此，在一些實施方式中，RNAi構建體包含至少一個核苷酸突出端。如本文使用的，「核苷酸突出端」係指延伸超過在股末端的雙股體區的未配對的一個或多個核苷酸。當一條股的3'端延伸超過另一條股的5'端時或者當一條股的5'端延伸超過另一條股的3'端時，典型地形成核苷酸突出端。核苷酸突出端之長度通常是在1與6個核苷酸之間、1與5個核苷酸之間、1與4個核苷酸之間、1與3個核苷酸之間、2與6個核苷酸之間、2與5個核苷酸之間、或2與4個核苷酸之間。在一些實施方式中，核苷酸突出端包含1、2、3、4、5或6個核苷酸。在一個特定實施方式中，核苷酸突出端包含1至4個核苷酸。在某些實施方式中，核苷酸突出端包含2個核苷酸。突出端中的核苷酸可為如本文所描述的核糖核苷酸、去氧核糖核苷酸或經修飾的核苷酸。在一些實施方式中，突出端包含5'-尿苷-尿苷-3'（5'-UU-3'）二核苷酸。在這類實施方式中，UU二核苷酸可以包含核糖核苷酸或經修飾的核苷酸，例如2'-修飾的核苷酸。在其他實施方式中，突出端包含5'-去氧胸苷-去氧胸苷-3'（5'-dTdT-3'）二核苷酸。
核苷酸突出端可以在一條或兩條股的5'端或3'端。例如，在一個實施方式中，RNAi構建體在反義股之5'端和3'端包含核苷酸突出端。在另一個實施方式中，RNAi構建體在有義股之5'端和3'端包含核苷酸突出端。在一些實施方式中，RNAi構建體在有義股之5'端和反義股的5'端包含核苷酸突出端。在其他實施方式中，RNAi構建體在有義股之3'端和反義股之3'端包含核苷酸突出端。
RNAi構建體可在雙股RNA分子的一端包含單一核苷酸突出端，而在另一端包含平端。「平端」意味著有義股與反義股在分子末端完全地鹼基配對，並且不存在延伸超出雙股體區的未配對核苷酸。在一些實施方式中，RNAi構建體在有義股之3'端包含核苷酸突出端，而在有義股之5'端和反義股之3'端包含平端。在其他實施方式中，RNAi構建體在反義股之3'端包含核苷酸突出端，而在反義股之5'端和有義股之3'端包含平端。在某些實施方式中，RNAi構建體在雙股RNA分子的兩端包含平端。在這類實施方式中，有義股和反義股具有相同的長度，並且雙股體區之長度與有義股和反義股相同（即該分子在其整個長度上是雙股的）。
有義股和反義股之長度可以各自獨立地為約15至約30個核苷酸之長度、約18至約28個核苷酸之長度、約19至約27個核苷酸之長度、約19至約25個核苷酸之長度、約19至約23個核苷酸之長度、約21至約25個核苷酸之長度、或約21至約23個核苷酸。在某些實施方式中，有義股和反義股之長度各自為約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24、或約25個核苷酸。在一些實施方式中，有義股和反義股具有相同的長度，但形成比這些股更短的雙股體區，使得RNAi構建體具有兩個核苷酸突出端。例如，在一個實施方式中，RNAi構建體包含 (i) 長度各自為21個核苷酸的有義股和反義股、(ii) 長度為19個鹼基對的雙股體區、和 (iii) 具有在有義股之3'端和反義股之3'端的2個未配對核苷酸的核苷酸突出端。在另一個實施方式中，RNAi構建體包含 (i) 長度各自為23個核苷酸的有義股和反義股、(ii) 長度為21個鹼基對的雙股體區、和 (iii) 具有在有義股的3'端和反義股之3'端的2個未配對核苷酸的核苷酸突出端。在其他實施方式中，有義股和反義股具有相同的長度，並且在它們的整個長度上形成雙股體區，使得在該雙股分子的任一端沒有核苷酸突出端。在一個這類實施方式中，RNAi構建體是平端的，並且包含 (i) 有義股和反義股（其中每條股之長度為21個核苷酸）、和 (ii) 長度為21個鹼基對的雙股體區。在另一個這類實施方式中，RNAi構建體是平端的，並且包含 (i) 有義股和反義股（其中每條股之長度為23個核苷酸）、和 (ii) 長度為23個鹼基對的雙股體區。
在其他實施方式中，有義股或反義股比另一條股更長並且這兩條股形成雙股體區，該雙股體區具有與較短股相等之長度，使得RNAi構建體包含至少一個核苷酸突出端。例如，在一個實施方式中，RNAi構建體包含 (i) 長度為19個核苷酸的有義股、(ii) 長度為21個核苷酸的反義股、(iii) 長度為19個鹼基對的雙股體區、和(iv) 具有在反義股之3'端的2個未配對核苷酸的單個核苷酸突出端。在另一個實施方式中，RNAi構建體包含 (i) 長度為21個核苷酸的有義股、(ii) 長度為23個核苷酸的反義股、(iii) 長度為21個鹼基對的雙股體區、和 (iv) 具有在反義股之3'端的2個未配對核苷酸的單個核苷酸突出端。
本發明之RNAi構建體的反義股可包含在表1或表2中所列出的反義序列中的任一個反義序列的序列、或者任何這些反義序列的核苷酸1-19或1-21的序列。在表1和表2中所列出的每個反義序列包含與SCAP mRNA序列為互補的19個連續核苷酸（從5'端開始計數的前19個核苷酸）的序列、外加兩個核苷酸的突出端序列。因此，在一些實施方式中，反義股包含核苷酸序列，例如偶數編號序列SEQ ID NO: 2-160、162-320、322-462或464-604中任一個的核苷酸1-19。在一些實施方式中，有義股包含核苷酸序列，例如奇數編號序列SEQ ID NO: 1-159、161-319、321-461或463-603中任一個的核苷酸1-19。在一個特定實施方式中，反義序列具有SEQ ID NO: 82。在一個特定實施方式中，反義序列具有SEQ ID NO: 242。在一個特定實施方式中，反義序列具有SEQ ID NO: 84。在一個特定實施方式中，反義序列具有SEQ ID NO: 244。在一個特定實施方式中，反義序列具有SEQ ID NO: 86。在一個特定實施方式中，反義序列具有SEQ ID NO: 246。在一個特定實施方式中，反義序列具有SEQ ID NO: 88。在一個特定實施方式中，反義序列具有SEQ ID NO: 248。在一個特定實施方式中，反義序列具有SEQ ID NO: 90。在一個特定實施方式中，反義序列具有SEQ ID NO: 250。經修飾的核苷酸
本發明之RNAi構建體可包含一個或多個經修飾的核苷酸。「經修飾的核苷酸」係指具有針對核苷、核鹼基、戊糖環、或磷酸基團的一個或多個經化學修飾的核苷酸。如本文使用的，經修飾的核苷酸不包括：含有腺苷單磷酸酯、鳥苷單磷酸酯、尿苷單磷酸酯和胞苷單磷酸酯的核糖核苷酸；及含有去氧腺苷單磷酸酯、去氧鳥苷單磷酸酯、去氧胸苷單磷酸酯、和去氧胞苷單磷酸酯的去氧核糖核苷酸。然而，該RNAi構建體可包含經修飾的核苷酸、核糖核苷酸和去氧核糖核苷酸的組合。將經修飾的核苷酸併入雙股RNA分子的一條或兩條股中，可以例如藉由降低分子對核酸酶和其他降解過程的敏感性來改善RNA分子的體內穩定性。RNAi構建體降低靶基因表現的效能也可以藉由經修飾的核苷酸的併入而增強。
在某些實施方式中，經修飾的核苷酸具有核糖的修飾。這些糖修飾可以包括在戊糖環的2'和/或5'位置的修飾、以及二環糖修飾。2'-修飾的核苷酸係指具有戊糖環的核苷酸，該戊糖環在2'位置具有除H或OH以外的取代基。這類2'修飾包括但不限於：2'-O-烷基（例如O-C1-C10或O-C1-C10取代烷基）、2'-O-烯丙基（O-CH2CH=CH2）、2'-C-烯丙基、2'-氟、2'-O-甲基（OCH3）、2'-O-甲氧基乙基（O-(CH2)2OCH3）、2'-OCF3、2'-O(CH2)2SCH3、2'-O-胺基烷基、2'-胺基（例如NH2）、2'-O-乙胺和2'-疊氮基。在戊糖環的5'位置的修飾包括但不限於：5'-甲基（R或S）；5'-乙烯基和5'-甲氧基。
「二環糖修飾」係指戊糖環的修飾，其中橋將環的兩個原子連接而形成第二環從而得到二環糖結構。在一些實施方式中，二環糖修飾包含在戊糖環的4'和2'碳之間的橋。包含具有二環糖修飾的糖部分的核苷酸在本文中被稱為二環核酸或BNA。示例性的二環糖修飾包括但不限於：α-L-亞甲基氧(4'-CH2-O-2')二環核酸(BNA)；β-D-亞甲氧基(4'-CH2-O-2')BNA（也稱為鎖核酸或LNA）；伸乙基氧(4'-(CH2)2-O-2')BNA；胺基氧(4'-CH2-O-N(R)-2')BNA；羥亞胺基(4'-CH2-N(R)-O-2')BNA；甲基(亞甲基氧)(4'-CH(CH3)-O-2')BNA（也稱為受限乙基或cEt）；亞甲基硫代(4'-CH2-S-2')BNA；亞甲基胺基(4'-CH2-N(R)-2')BNA；甲基碳環(4'-CH2-CH(CH3)-2')BNA；丙烯碳環(4'-(CH2)3-2')BNA；和甲氧基(伸乙基氧)(4'-CH(CH2OMe)-O-2')BNA（也稱為受限MOE或cMOE）。可以併入本發明RNAi構建體中的這些和其他糖修飾核苷酸在美國專利案號9,181,551、美國專利公開案號2016/0122761及Deleavey和Damha, Chemistry and Biology [化學與生物學], 第19卷: 937-954, 2012年中有描述，這些的全部特此藉由引用以其全文併入。
在一些實施方式中，RNAi構建體包含一個或多個2'-氟修飾的核苷酸、2'-O-甲基修飾的核苷酸、2'-O-甲氧基乙基修飾的核苷酸、2'-O-烯丙基修飾的核苷酸、二環核酸（BNA）、乙二醇核酸、或其組合。在某些實施方式中，RNAi構建體包含一個或多個2'-氟修飾的核苷酸、2'-O-甲基修飾的核苷酸、2'-O-甲氧基乙基修飾的核苷酸、或其組合。在一個特定實施方式中，RNAi構建體包含一個或多個2'-氟修飾的核苷酸、2'-O-甲基修飾的核苷酸、或其組合。
RNAi構建體的有義股和反義股兩者均可以包含一個或多個經修飾的核苷酸。例如，在一些實施方式中，有義股包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個經修飾的核苷酸。在某些實施方式中，有義股中的所有核苷酸均為經修飾的核苷酸。在一些實施方式中，反義股包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個經修飾的核苷酸。在其他實施方式中，反義股中的所有核苷酸均為經修飾的核苷酸。在某些其他實施方式中，有義股中的所有核苷酸和反義股中的所有核苷酸均為經修飾的核苷酸。在這些和其他實施方式中，經修飾的核苷酸可為2'-氟修飾的核苷酸、2'-O-甲基修飾的核苷酸、或其組合。
在一些實施方式中，在有義股、反義股或兩種股中，在腺苷核苷酸前面的所有嘧啶核苷酸均為經修飾的核苷酸。例如，在序列5'-CA-3'或5'-UA-3'出現於任一條股中的情況下，胞苷核苷酸和尿苷核苷酸係經修飾的核苷酸，較佳的2'-O-甲基修飾的核苷酸。在某些實施方式中，有義股中的所有嘧啶核苷酸均為經修飾的核苷酸（例如2'-O-甲基修飾的核苷酸），並且在反義股中在所有序列5'-CA-3'或5'-UA-3'中出現的5'核苷酸均為經修飾的核苷酸（例如2'-O-甲基修飾的核苷酸）。在其他實施方式中，雙股體區中的所有核苷酸均為經修飾的核苷酸。在這類實施方式中，經修飾的核苷酸較佳的是2'-O-甲基修飾的核苷酸、2'-氟修飾的核苷酸、或其組合。
在RNAi構建體包含核苷酸突出端的實施方式中，突出端中的核苷酸可為核糖核苷酸、去氧核糖核苷酸、或經修飾的核苷酸。在一個實施方式中，突出端中的核苷酸係去氧核糖核苷酸，例如去氧胸苷。在另一個實施方式中，突出端中的核苷酸係經修飾的核苷酸。例如，在一些實施方式中，突出端中的核苷酸係2'-O-甲基修飾的核苷酸、2'-氟修飾的核苷酸、2'-甲氧基乙基修飾的核苷酸、或其組合。
本發明之RNAi構建體還可包含一個或多個經修飾的核苷酸間鍵。如本文使用的，術語「經修飾的核苷酸間鍵」係指除天然3'至5'磷酸二酯鍵以外的核苷酸間鍵。在一些實施方式中，經修飾的核苷酸間鍵係含磷的核苷酸間鍵，諸如磷酸三酯、胺基烷基磷酸三酯、烷基膦酸酯（例如甲基膦酸酯、3'-伸烷基膦酸酯）、次膦酸酯、胺基磷酸酯（例如3'-胺基胺基磷酸酯和胺基烷基胺基磷酸酯）、硫代磷酸酯（P=S）、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硫代磷醯胺酯、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基磷酸三酯、和硼烷磷酸酯。在一個實施方式中，經修飾的核苷酸間鍵係2'至5'磷酸二酯鍵。在其他實施方式中，經修飾的核苷酸間鍵係不含磷的核苷酸間鍵，因此可以被稱為經修飾的核苷間鍵。這類不含磷的鍵包括但不限於：𠰌啉基鍵（morpholino linkage）（部分地由核苷的糖部分形成）；矽氧烷鍵（-O-Si(H)2-O-）；硫化物、亞碸和碸鍵；甲醯基和硫代甲醯基鍵；含烯烴的主鏈；胺基磺酸酯主鏈；亞甲基甲亞胺基（-CH2-N(CH3)-O-CH2-）和亞甲基肼基鍵；磺酸酯和磺醯胺鍵；醯胺鍵；及具有混合的N、O、S和CH2組成部分的其他鍵。在一個實施方式中，經修飾的核苷間鍵係用於形成肽核酸或PNA的基於肽的鍵（例如胺基乙基甘胺酸），如在美國專利案號5,539,082；5,714,331；和5,719,262中所描述的。可在本發明RNAi構建體中所採用的其他合適的經修飾的核苷酸間鍵和核苷間鍵在美國專利案號6,693,187、美國專利案號9,181,551、美國專利公開案號2016/0122761、及Deleavey和Damha, Chemistry and Biology[化學與生物學], 第19卷: 937-954, 2012中有描述，這些文獻特此藉由引用以其全文併入。
在某些實施方式中，RNAi構建體包含一個或多個硫代磷酸酯核苷酸間鍵。硫代磷酸酯核苷酸間鍵可存在於RNAi構建體的有義股、反義股、或兩種股中。例如，在一些實施方式中，有義股包含1、2、3、4、5、6、7、8、或更多個硫代磷酸酯核苷酸間鍵。在其他實施方式中，反義股包含1、2、3、4、5、6、7、8、或更多個硫代磷酸酯核苷酸間鍵。在仍其他實施方式中，兩條股均包含1、2、3、4、5、6、7、8、或更多個硫代磷酸酯核苷酸間鍵。RNAi構建體可以在有義股、反義股、或兩條股的3'-末端、5'-末端、或者3'-和5'-末端兩者包含一個或多個硫代磷酸酯核苷酸間鍵。例如，在某些實施方式中，RNAi構建體在有義股、反義股、或兩條股之3'端包含約1至約6或更多個（例如，約1、2、3、4、5、6或更多個）連續硫代磷酸酯核苷酸間鍵。在其他實施方式中，RNAi構建體在有義股、反義股、或兩條股的5'端包含約1至約6或更多個（例如，約1、2、3、4、5、6或更多個）連續硫代磷酸酯核苷酸間鍵。在一個實施方式中，RNAi構建體在有義股的3'端包含單一硫代磷酸酯核苷酸間鍵，並且在反義股之3'端包含單一硫代磷酸酯核苷酸間鍵。在另一個實施方式中，RNAi構建體在反義股的3'端包含兩個連續硫代磷酸酯核苷酸間鍵（即，在反義股之3'端的第一和第二核苷酸間鍵處的硫代磷酸酯核苷酸間鍵）。在另一個實施方式中，RNAi構建體在反義股的3'和5'端均包含兩個連續硫代磷酸酯核苷酸間鍵。在又另一個實施方式中，RNAi構建體在反義股的3'和5'端均包括兩個連續硫代磷酸酯核苷酸間鍵，在有義股的5'端包括兩個連續硫代磷酸酯核苷酸間鍵。在仍另一個實施方式中，RNAi構建體在反義股之3'和5'端均包含兩個連續硫代磷酸酯核苷酸間鍵，在有義股之3'端和5'端均包含兩個連續硫代磷酸酯核苷酸間鍵（即，在反義股之5'和3'端兩者的第一和第二核苷酸間鍵處的硫代磷酸酯核苷酸間鍵、及在有義股之5'和3'端兩者的第一和第二核苷酸間鍵處的硫代磷酸酯核苷酸間鍵）。在其中一個或兩條股包含一個或多個硫代磷酸酯核苷酸間鍵的任何實施方式中，在各股內的其餘核苷酸間鍵可為天然的3'至5'磷酸二酯鍵。例如，在一些實施方式中，有義股和反義股的各核苷酸間鍵選自磷酸二酯和硫代磷酸酯，其中至少一個核苷酸間鍵係硫代磷酸酯。
在其中RNAi構建體包含核苷酸突出端的實施方式中，突出端中的兩個或更多個未配對核苷酸可以經由硫代磷酸酯核苷酸間鍵而連接。在某些實施方式中，在反義股和/或有義股之3'端的核苷酸突出端中的所有未配對核苷酸係經由硫代磷酸酯核苷酸間鍵而連接。在其他實施方式中，在反義股和/或有義股之5'端的核苷酸突出端中的所有未配對核苷酸係經由硫代磷酸酯核苷酸間鍵而連接。在仍其他實施方式中，在任何核苷酸突出端中的所有未配對核苷酸係經由硫代磷酸酯核苷酸間鍵而連接。
在某些實施方式中，併入本發明RNAi構建體的一條或兩條股中的經修飾的核苷酸具有核鹼基（在本文中也稱為「鹼基」）的修飾。「經修飾的核鹼基」或「經修飾的鹼基」係指除天然存在的嘌呤鹼基腺嘌呤（A）和鳥嘌呤（G）和嘧啶鹼基胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）和尿嘧啶（U）以外的鹼基。經修飾的核鹼基可為合成的或天然存在的修飾，包括但不限於：通用鹼基（universal base）、5-甲基胞嘧啶（5-me-C）、5-羥甲基胞嘧啶、黃嘌呤（X）、次黃嘌呤（I）、2-胺基腺嘌呤、6-甲基腺嘌呤、6-甲基鳥嘌呤、及腺嘌呤和鳥嘌呤的其他烷基衍生物、腺嘌呤和鳥嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-鹵代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶（假尿嘧啶）、4-硫尿嘧啶、8-鹵代、8-胺基、8-巰基、8-硫代烷基、8-羥基和其他8-取代腺嘌呤和鳥嘌呤、5-鹵代、特別是5-溴、5-三氟甲基和其他5-取代尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鳥嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮雜鳥嘌呤和8-氮雜腺嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤和7-脫氮腺嘌呤和3-脫氮鳥嘌呤和3-脫氮腺嘌呤、和無鹼基殘基（缺乏嘌呤或缺乏嘧啶鹼基從而在核糖的1位置缺乏核鹼基的無嘌呤/無嘧啶殘基）、和反向核苷酸（具有3'-3'鍵的核苷酸，並且可為上述中的任一個的反向核苷酸，包括反向無鹼基核苷酸和反向去氧核苷酸）。
在一些實施方式中，經修飾的鹼基是通用鹼基。「通用鹼基」係指在不改變所得到的雙股體區的雙螺旋結構的情況下，與RNA和DNA中的全部天然鹼基不加選擇地形成鹼基對的鹼基類似物。通用鹼基對於熟悉該項技術者而言係已知的，包括但不限於：肌苷、C-苯基、C-萘基和其他芳香族衍生物、唑醯胺類、和硝基唑衍生物（諸如3-硝基吡咯、4-硝基吲哚、5-硝基吲哚和6-硝基吲哚）。
可以併入本發明RNAi構建體中的其他合適的修飾鹼基包括在Herdewijn, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. [反義核酸藥物開發], 第10卷: 297-310, 2000和Peacock等人, J. Org. Chern. [有機化學雜誌], 第76卷: 7295-7300, 2011中所描述的，這些文獻特此藉由引用以其全文併入。熟悉該項技術者眾所周知的是，鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶可以被其他核鹼基（如上述的經修飾的核鹼基）替代，而基本上不改變包含帶有這類替代核鹼基的核苷酸的多核苷酸的鹼基配對性質。
在本發明之RNAi構建體之一些實施方式中，有義股、反義股或者反義股和有義股兩者的5'端均包含磷酸酯部分。如本文使用的，術語「磷酸酯部分」係指包含未修飾的磷酸酯(-O-P=O)(OH)OH)以及經修飾的磷酸酯的末端磷酸酯基。經修飾的磷酸酯包括如下的磷酸酯，其中一個或多個O和OH基被H、O、S、N(R)或烷基所替代，其中R係H、胺基保護基或者未取代或經取代的烷基。示例性的磷酸酯部分包括但不限於：5'-單磷酸酯；5'-二磷酸酯；5'-三磷酸酯；5'-鳥苷帽（7-甲基化或非甲基化）；5'-腺苷帽或者任何其他經修飾的或未修飾的核苷酸帽結構；5'-單硫代磷酸酯（硫代磷酸酯）；5'-單二硫代磷酸酯（二硫代磷酸酯）；5'-α-硫代三磷酸酯；5'-γ-硫代三磷酸酯、5'-胺基磷酸酯；5'-乙烯基磷酸酯；5'-烷基膦酸酯（例如，烷基 = 甲基、乙基、異丙基、丙基等）；和5'-烷基醚膦酸酯（例如，烷基醚 = 甲氧基甲基、乙氧基甲基等）。
可以併入本發明之RNAi構建體中的經修飾的核苷酸可具有多於一種的本文所描述的化學修飾。例如，經修飾的核苷酸可具有針對核糖的修飾以及針對核鹼基的修飾。舉例來說，經修飾的核苷酸可包含2'糖修飾（例如2'-氟或2'-甲基）並且包含經修飾的鹼基（例如5-甲基胞嘧啶或假尿嘧啶）。在其他實施方式中，經修飾的核苷酸可包含糖修飾組合針對5'磷酸酯的修飾，當將經修飾的核苷酸併入多核苷酸中時這將會形成經修飾的核苷酸間鍵或核苷間鍵。例如，在一些實施方式中，經修飾的核苷酸可包含糖修飾，諸如2'-氟修飾、2'-O-甲基修飾或二環糖修飾、以及5'硫代磷酸酯基。因此，在一些實施方式中，本發明之RNAi構建體的一條或兩條股包含2'修飾的核苷酸或BNA與硫代磷酸酯核苷酸間鍵的組合。在某些實施方式中，本發明之RNAi構建體的有義股和反義股兩者均包含2'-氟修飾的核苷酸、2'-O-甲基修飾的核苷酸、與硫代磷酸酯核苷酸間鍵之組合。表2中示出了包含經修飾的核苷酸和核苷酸間鍵的示例性RNAi構建體。RNAi 構建體的功能
較佳的是，本發明之RNAi構建體降低或抑制SCAP在細胞（特別是肝細胞）中的表現。因此，在一個實施方式中，本發明提供一種藉由使細胞與本文所描述的任何RNAi構建體接觸來降低SCAP在細胞中表現之方法。該細胞可為體外或體內的。可以藉由測量SCAP mRNA、SCAP蛋白、或者與SCAP表現有關的另一種生物標記物的量或水平來對SCAP表現進行評估。相對於在未用RNAi構建體進行處理或未用對照RNAi構建體進行處理的細胞或動物中的SCAP表現，可以確定在用本發明之RNAi構建體進行處理的細胞或動物中SCAP表現的降低。例如，在一些實施方式中，藉由如下方式對SCAP表現的降低進行評估：(a) 測量在用本發明之RNAi構建體進行處理的肝細胞中SCAP mRNA的量或水平；(b) 測量用對照RNAi構建體（例如，針對肝細胞中未表現的RNA分子的RNAi構建體、或者具有無義序列或錯義序列的RNAi構建體）進行處理或者不用構建體進行處理的肝細胞中SCAP mRNA的量或水平；和 (c) 對來自 (a) 中經處理細胞的測量SCAP mRNA水平與來自 (b) 中對照細胞的測量SCAP mRNA水平進行比較。在比較之前，可以將經處理細胞和對照細胞中的SCAP mRNA水平歸一化為對照基因（例如18S核糖體RNA）的RNA水平。可以藉由多種方法來測量SCAP mRNA水平，包括Northern印跡分析、核酸酶保護測定、螢光原位雜交（FISH）、逆轉錄聚合酶（RT）-PCR、即時RT-PCR、定量PCR等。
在其他實施方式中，藉由如下方式對SCAP表現的降低進行評估：(a) 測量用本發明之RNAi構建體進行處理的肝細胞中SCAP蛋白的量或水平；(b) 測量用對照RNAi（例如針對肝細胞中未表現的RNA分子的RNAi構建體、或者具有無義序列或錯義序列的RNAi構建體）進行處理的肝細胞中SCAP蛋白的量或水平；和 (c) 對來自 (a) 中經處理細胞的測量SCAP蛋白水平與來自 (b) 中對照細胞的測量SCAP蛋白水平進行比較。測量SCAP蛋白水平的方法對於熟悉該項技術者而言係已知的，並且包括Western印跡、免疫測定（例如ELISA）和流動式細胞測量術。實例3描述了利用RNA FISH測量SCAP mRNA的示例性方法。能夠測量SCAP mRNA或蛋白質的任何方法都可以用於對本發明之RNAi構建體的效力進行評估。
在一些實施方式中，評估SCAP表現水平之方法係在天然地表現SCAP的細胞（例如肝細胞）或者已被工程設計成表現SCAP的細胞中體外執行。在某些實施方式中，這些方法係在肝細胞中體外執行。合適的肝細胞包括但不限於：原代肝細胞（例如人、非人靈長類動物或齧齒動物的肝細胞）、HepAD38細胞、HuH-6細胞、HuH-7細胞、HuH-5-2細胞、BNLCL2細胞、Hep3B細胞或HepG2細胞。
在其他實施方式中，評估SCAP表現水平的方法係在體內執行。可以將RNAi構建體和任何對照RNAi構建體投與至動物（例如齧齒動物或非人靈長類動物）進行投與，並且在處理後在由該動物所收穫的肝組織中對SCAP mRNA或蛋白水平進行評估。替代性地或另外地，可以在經處理的動物中對與SCAP表現相關的生物標記物或功能表型進行評估。
在某些實施方式中，本發明之RNAi構建體將SCAP在肝細胞中的表現降低至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、或至少50%。在一些實施方式中，本發明之RNAi構建體將SCAP在肝細胞中的表現降低至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、或至少85%。在其他實施方式中，本發明之RNAi構建體將SCAP在肝細胞中的表現降低約90%或更多，例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多。可以利用本文所描述的任何方法以及本領域中已知的其他方法來測量SCAP表現的降低百分比。例如，在某些實施方式中，本發明之RNAi構建體在體外抑制至少45%的SCAP在Hep3B細胞（包括野生型SCAP）中的表現，如在實例2和實例4中所描述。在相關的實施方式中，本發明之RNAi構建體在體外抑制至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%或至少75%的SCAP在Hep3B細胞中的表現，如在實例2和實例4中所描述。在其他實施方式中，本發明之RNAi構建體在體外抑制至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少94%、至少96%或至少98%的SCAP在Hep3B細胞中的表現，如在實例2和實例4中所描述。在某些實施方式中，本發明之RNAi構建體抑制至少45%的SCAP在C57Bl6小鼠肝中的表現，如在各實例中所描述。在相關的實施方式中，本發明之RNAi構建體抑制至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%或至少75%的SCAP在C57Bl6小鼠肝中的表現，如在各實例中所描述。在其他實施方式中，本發明之RNAi構建體抑制至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少94%、至少96%或至少98%的SCAP在C57Bl6小鼠肝中的表現，如在各實例中所描述。可以利用多種技術來測量SCAP的降低，包括如在實例2和實例4中所描述的RNA FISH或微滴式數字PCR，或者如在實例3、5、6、7和8中所描述的體內研究。
在一些實施方式中，計算IC50值，以便對本發明之RNAi構建體抑制SCAP在肝細胞中的表現的效能進行評估。「IC50值」係實現生物或生化功能的50%抑制所需的劑量/濃度。任何特定物質或拮抗劑的IC50值均可以藉由如下方式來確定：繪製劑量-反應曲線並且在任何測定中檢查不同濃度物質或拮抗劑對表現水平或功能活性的影響。藉由測定抑制一半的最大生物反應或天然表現水平所需的濃度，可以計算出給定拮抗劑或物質的IC50值。因此，任何RNAi構建體的IC50值可以藉由如下方式來計算：在任何測定（如在各實例中所描述的免疫測定或RNA FISH測定或微滴式數位PCR測定）中，確定抑制一半的肝細胞中天然SCAP表現水平（例如在對照SCAP在肝細胞中的表現水平）所需的RNAi構建體的濃度。本發明之RNAi構建體可以以小於約100 nM的IC50抑制SCAP在肝細胞（例如Hep3B細胞）中之表現。例如，RNAi構建體以約0.001 nM至約100 nM、約0.001 nM至約20 nM、約0.001 nM至約10 nM、約0.001 nM至約5 nM、約0.001 nM至約1 nM、約0.1 nM至約10 nM、約0.1 nM至約5 nM、或約0.1 nM至約1 nM的IC50抑制SCAP在肝細胞中之表現。在某些實施方式中，RNAi構建體以約1 nM至約10 nM的IC50抑制SCAP在肝細胞（例如Hep3B細胞）中之表現。在某些實施方式中，RNAi構建體以約0.1 nM至約5 nM的IC50抑制SCAP在肝細胞（例如Hep3B細胞）中之表現。本發明之RNAi構建體可以以小於約20 nM的IC50抑制SCAP在肝細胞（例如Hep3B細胞）中之表現。例如，RNAi構建體以約0.001 nM至約20 nM、約0.001 nM至約10 nM、約0.001 nM至約5 nM、約0.001 nM至約1 nM、約0.1 nM至約10 nM、約0.1 nM至約5 nM、或約0.1 nM至約1 nM的IC50抑制SCAP在肝細胞中之表現。在某些實施方式中，RNAi構建體以約1 nM至約10 nM的IC50抑制SCAP在肝細胞（例如Hep3B細胞）中之表現。
在一些實施方式中，本發明之RNAi構建體在體內可以具有延長時間的SCAP緘默，如在實例8中所描述的ob/ob小鼠中。在一些實施方式中，在ob/ob小鼠中將該構建體投與的20天後，本發明之RNAi構建體可以使至少50%、至少70%或至少80%的SCAP表現緘默，如在實例8中所描述。在一些實施方式中，在ob/ob小鼠中將該構建體投與的30天後，本發明之RNAi構建體可以使至少50%、至少60%或至少70%的SCAP表現緘默，如在實例8中所描述。
利用本領域中已知的技術（例如，利用常規的核酸固相合成），可以容易地製作本發明之RNAi構建體。可以使用標準核苷酸或核苷先質（例如亞磷醯胺類），在合適的核酸合成儀上，組裝RNAi構建體的多核苷酸。自動核酸合成儀是由若干供應商商業銷售，包括來自應用生物系統公司（Applied Biosystems）（加利福尼亞州福斯特城）的DNA/RNA合成儀、來自生物自動化公司（BioAutomation）（德克薩斯州歐文市）的MerMade合成儀、和來自GE保健生命科學公司（GE Healthcare Life Sciences）（賓夕法尼亞州匹茲堡市）的OligoPilot合成儀。
2'矽基保護基可以在核糖核苷的5'位置與酸不穩定的二甲氧基三苯甲基（DMT）結合使用，從而利用亞磷醯胺化學來合成寡核苷酸。已知最終去保護條件不會使RNA產物顯著地降解。可以在任何自動或手動合成儀中，以大、中或小規模執行所有合成。合成也可在多個孔板、柱或載玻片中執行。
可以藉由暴露於氟離子來去除2'-O-矽基，這些氟離子可以包括任何氟離子源，例如含有與無機反離子配對的氟離子的鹽（例如氟化銫和氟化鉀）、或者含有與有機反離子配對的氟離子的鹽（例如氟化四烷基銨）。在去保護反應中，可以將冠醚催化劑與無機氟化物組合使用。較佳的氟離子源係氟化四丁基銨、或胺基氫氟化物（例如，在偶極非質子溶劑例如二甲基甲醯胺中，將水性HF與三乙胺合併）。
對使用於亞磷酸三酯和磷酸三酯的保護基的選擇，可以改變三酯對氟化物的穩定性。磷酸三酯或亞磷酸三酯的甲基保護作用可以使與氟離子的鍵穩定，並且改善製程產率。
因為核糖核苷具有反應性2'羥基取代基，所以可能理想的是用與5'-O-二甲氧基三苯甲基保護基垂直的保護基（例如，一個對使用酸的處理為穩定的保護基）來保護RNA中的反應性2'位置。矽基保護基滿足這個標準，並且可以在最後的氟化物去保護步驟中容易地去除，這可以導致最小的RNA降解。
在標準的亞磷醯胺偶合反應中，可以使用四唑催化劑。較佳的催化劑包括例如：四唑、S-乙基-四唑、苄基巰基四唑、對硝基苯基四唑。
正如熟悉該項技術者可以理解的，合成本文所描述RNAi構建體的其他方法對於熟悉該項技術者而言將是顯而易見的。另外，各合成步驟可以以交替順序或次序執行，從而得到所需化合物。在合成本文所描述RNAi構建體中有用的其他合成化學轉化、保護基（例如，存在於鹼基上的羥基、胺基等）和保護基方法（保護和去保護）在本領域中是已知的，並且包括例如像在R.Larock, Comprehensive Organic Transformations [綜合有機轉化] VCH出版社 (1989)；T.W.Greene和P.G.M.Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis [有機合成中的保護基] 第2版, John Wiley and Sons [約翰·威利父子公司] (1991)；L.Fieser和M.Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis [Fieser和Fieser有機合成試劑] John Wiley and Sons [約翰·威利父子公司] (1994)；和L. Paquette編, Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis [用於有機合成的試劑全書], John Wiley and Sons [約翰·威利父子公司] (1995) 及其後續版本中所描述的那些。也可從包括達摩昆公司（Dharmacon, Inc.）（科羅拉多州拉斐特市）、阿克索實驗室（AxoLabs GmbH）（德國庫爾姆巴赫市）、和阿姆賓公司（Ambion, Inc.）（加利福尼亞州福斯特市）的幾家商業供應商那裡實現RNAi構建體的定制合成。
本發明之RNAi構建體可包含配位基。如本文使用的，「配位基」係指能夠與另一種化合物或分子直接地或間接地相互作用的任何化合物或分子。配位基與另一種化合物或分子的相互作用會引起生物反應（例如引發訊息傳導級聯反應、誘導受體介導的內吞作用）或者僅僅是物理結合。配位基可以改變與雙股RNA分子相附接的一種或多種性質，如RNA分子的藥效學、藥物動力學、結合、吸收、細胞分佈、細胞攝取、電荷和/或清除性質。
配位基可包括血清蛋白（例如，人血清白蛋白、低密度脂蛋白、球蛋白）、膽固醇部分、維生素（生物素、維生素E、維生素B12）、葉酸部分、類固醇、膽汁酸（例如膽酸）、脂肪酸（例如，棕櫚酸、肉豆蔻酸）、碳水化合物（例如，右旋糖酐、聚三葡萄糖、甲殼素、殼聚糖、菊糖、環糊精或透明質酸）、糖苷、磷脂、或者抗體或其結合片段（例如將RNAi構建體靶向到特定細胞類型（如肝臟）的抗體或其結合片段）。配位基的其他實例包括：染料、嵌入劑（例如吖啶）、交聯劑（例如補骨脂素、絲裂黴素C）、卟啉（TPPC4、四非丁（texaphyrin）、Sapphyrin）、多環芳烴（例如，啡𠯤、二氫啡𠯤）、人工內切核酸酶、親脂分子（例如金剛烷乙酸、1-芘丁酸、二氫睾酮、1,3-雙O(十六烷基)甘油、香葉基氧己基、十六烷基甘油、茨醇（borneol）、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、03-(油醯基)石膽酸、03-(油醯基)膽酸、二甲氧基三苯甲基、或啡㗁𠯤）、肽類（例如，黑腹果蠅觸足肽、Tat肽、RGD肽）、烷化劑、聚合物如聚乙二醇（PEG）（例如，PEG-40K）、聚胺基酸、和多胺（例如精胺、亞精胺）。
在某些實施方式中，配位基具有內體溶解（endosomolytic）性質。內體溶解配位基促進內體的溶解和/或本發明之RNAi構建體或其組分從細胞的內體到細胞質的轉運。內體溶解配位基可為顯示pH依賴性膜活性和融合性的多聚陽離子肽或肽模擬物。在一個實施方式中，內體溶解配位基在內體pH下呈現其活性構象。「活性」構像是其中內體溶解配位基促進內體的溶解和/或本發明之RNAi構建體或其組分從內體到細胞質的轉運的構象。示例性的內體溶解配位基包括GALA肽（Subbarao等人, Biochemistry [生物化學], 第26卷: 2964-2972, 1987）、EALA肽（Vogel等人, J. Am. Chem. Soc. [美國化學社雜誌] 第118卷: 1581-1586, 1996）、及它們的衍生物（Turk等人, Biochem. Biophys. Acta [生物化學與生物物理學學報], 第1559卷: 56-68, 2002）。在一個實施方式中，內體溶解組分可含有化學基團（例如，胺基酸），該化學基團將隨著pH的變化而經歷電荷或質子化的變化。內體溶解組分可為線性的或分支的。
在一些實施方式中，配位基包含脂質或其他疏水性分子。在一個實施方式中，配位基包含膽固醇部分或其他類固醇。曾有報導膽固醇軛合（conjugated）寡核苷酸比它們的未軛合寡核苷酸更具活性（Manoharan, Antisense Nucleic Acid Drug Development [反義核酸藥物開發], 第12卷: 103-228, 2002）。在美國專利案號7,851,615；7,745,608；和7,833,992中已描述了包含膽固醇部分和用於與核酸分子軛合的其他脂質的配位基，這些專利特此藉由引用以其全文併入。在另一個實施方式中，配位基包含葉酸部分。與葉酸部分軛合的多核苷酸可以經由受體介導的內吞通路被細胞攝取。這類葉酸-多核苷酸軛合物描述於美國專利案號8,188,247，該專利特此藉由引用以其全文併入。
考慮到SCAP在肝細胞（例如肝細胞）中被表現，在某些實施方式中，期望是將RNAi構建體特異性地遞送至這些肝細胞。在一些實施方式中，藉由使用與在肝細胞表面上所表現蛋白質結合或相互作用的配位基，可以將RNAi構建體特異性靶向至肝臟。例如，在某些實施方式中，配位基可包含與在肝細胞上所表現受體特異性結合的抗原結合蛋白（例如抗體或其結合片段（例如Fab、scFv））。
在某些實施方式中，配位基包含碳水化合物。「碳水化合物」係指由具有至少6個碳原子的一個或多個單糖單元（可為線性的、分支的或環狀的）所組成的化合物，其中氧、氮或硫原子鍵合至各碳原子。碳水化合物包括但不限於：糖類（例如，單糖類、二糖類、三糖類、四糖類、和含有約4、5、6、7、8、或9個單糖單元的寡糖類）、及多糖類（諸如澱粉類、糖原、纖維素和多糖膠）。在一些實施方式中，併入配位基中的碳水化合物選自戊糖、己糖、或庚糖的單糖及包括這類單糖單元的二糖和三糖。在其他實施方式中，併入配位基中的碳水化合物是胺基糖，諸如半乳糖胺、葡萄胺糖、N-乙醯基半乳糖胺、和N-乙醯葡萄胺糖。
在一些實施方式中，配位基包括己糖或己糖胺。己糖可選自葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、或果糖。己糖胺可選自果糖胺、半乳糖胺、葡萄胺糖、或甘露糖胺。在某些實施方式中，配位基包括葡萄糖、半乳糖、半乳糖胺、或葡萄胺糖。在一個實施方式中，配位基包括葡萄糖、葡萄胺糖、或N-乙醯葡萄胺糖。在另一個實施方式中，配位基包括半乳糖、半乳糖胺、或N-乙醯基-半乳糖胺。在特定實施方式中，配位基包括N-乙醯基-半乳糖胺。包括葡萄糖、半乳糖、和N-乙醯基-半乳糖胺（GalNAc）的配位基在將化合物靶向至肝細胞方面特別有效。參見例如，D'Souza和Devarajan, J.Control Release [控制釋放雜誌], 第203卷: 126-139, 2015。可以併入本發明RNAi構建體中的含GalNAc或半乳糖配位基的實例在美國專利案號7,491,805；8,106,022；和8,877,917；美國專利公開案號20030130186；和WIPO公開案號WO 2013166155中有描述，這些專利特此藉由引用以其全文併入。
在某些實施方式中，配位基包含多價碳水化合物部分。如本文使用的，「多價碳水化合物部分」係指包含能夠獨立地與其他分子結合或相互作用的兩個或更多個碳水化合物單元的部分。例如，多價碳水化合物部分包含兩個或更多個結合域，這些結合域是由可以與兩個或更多個不同分子或者同一分子上的兩個或更多個不同部位結合的碳水化合物所組成。碳水化合物部分的價表示在碳水化合物部分內的單獨結合結構域的數目。例如，關於碳水化合物部分的術語「一價」、「二價」、「三價」和「四價」分別是指具有一個、兩個、三個和四個結合域的碳水化合物部分。多價碳水化合物部分可包含：多價乳糖部分、多價半乳糖部分、多價葡萄糖部分、多價N-乙醯基-半乳糖胺部分、多價N-乙醯基-葡萄胺糖部分、多價甘露糖部分、或多價岩藻糖部分。在一些實施方式中，配位基包含多價半乳糖部分。在其他實施方式中，配位基包含多價N-乙醯基-半乳糖胺部分。在這些和其他實施方式中，多價碳水化合物部分係二價、三價或四價的。在這類實施方式中，多價碳水化合物部分可為雙觸角或三觸角的。在一個特定實施方式中，多價N-乙醯基-半乳糖胺部分係三價或四價的。在另一個特定實施方式中，多價半乳糖部分係三價或四價的。下面詳細描述了用於併入本發明RNAi構建體中的示例性三價和四價的含GalNAc配位基。
配位基可以直接地或間接地附接或軛合至RNAi構建體的RNA分子。例如，在一些實施方式中，配位基直接地共價附接至RNAi構建體的有義股或反義股。在其他實施方式中，配位基經由連接子共價附接至RNAi構建體的有義股或反義股。配位基可以附接至本發明RNAi構建體的多核苷酸（例如有義股或反義股）的核鹼基、糖部分、或核苷酸間鍵。與嘌呤核鹼基或其衍生物的軛合或附接，可以發生在包括環內和環外原子的任意位置。在某些實施方式中，嘌呤核鹼基的2位置、6位置、7位置或8位置附接至配位基。與嘧啶核鹼基或其衍生物的軛合或附接也可以在任意位置發生。在一些實施方式中，嘧啶核鹼基的2位置、5位置和6位置可以附接至配位基。與核苷酸的糖部分的軛合或附接可以在任何碳原子處發生。可以附接至配位基的糖部分的碳原子的實例包括2'、3'和5'碳原子。1'位置也可以附接至配位基，如在鹼性殘基中。核苷酸間鍵也可以支持配位基附接。就含磷鍵（例如，磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、胺基磷酸酯等）而言，配位基可以直接地附接至磷原子或者附接至與磷原子結合的O、N或S原子。就含有胺或醯胺的核苷間鍵（例如，PNA）而言，配位基可以附接至胺或醯胺的氮原子或者附接至相鄰的碳原子。
在某些實施方式中，配位基可以附接至有義股或反義股中的任一條股之3'端或5'端。在某些實施方式中，配位基共價附接至有義股的5'端。在其他實施方式中，配位基共價附接至有義股之3'端。例如，在一些實施方式中，配位基附接至有義股的3'-末端核苷酸。在某些這類實施方式中，配位基係在有義股的3'-末端核苷酸的3'位置附接。在替代實施方式中，配位基係在有義股之3'端附近附接，但在一個或多個末端核苷酸之前（即在1、2、3或4個末端核苷酸之前）。在一些實施方式中，配位基係在有義股的3'-末端核苷酸的糖的2'位置附接。
在某些實施方式中，配位基經由連接子附接至有義股或反義股。「連接子」 係使配位基共價連接至RNAi構建體的多核苷酸組分的原子或基團。連接子可為約1至約30個原子之長度、約2至約28個原子之長度、約3至約26個原子之長度、約4至約24個原子之長度、約6至約20個原子之長度、約7至約20個原子之長度、約8至約20個原子之長度、約8至約18個原子之長度、約10至約18個原子之長度、以及約12至約18個原子之長度。在一些實施方式中，連接子可包含雙官能連接部分，該連接部分通常包含具有個官能基的烷基部分。選擇官能基中的一個使其與目的化合物（例如RNAi構建體的有義股或反義股）結合，並且選擇另一個官能基使其與任何所選基團（如本文所描述的配位基）實質地結合。在某些實施方式中，連接子包含重複單元（諸如乙二醇或胺基酸單元）的鏈結構或低聚物。典型地在雙官能連接部分中所採用官能基的實例包括但不限於：用於與親核基團發生反應的親電體、和用於與親電基團發生反應的親核體。在一些實施方式中，雙官能連接部分包括胺基、羥基、羧酸、硫醇、不飽和鍵（例如，雙鍵或三鍵）等。
可用於將配位基附接至本發明RNAi構建體中的有義股或反義股的連接子包括但不限於：吡咯啶、8-胺基-3,6-二氧雜辛酸、4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸琥珀醯亞胺酯、6-胺基己酸、取代的C1-C10烷基、取代的或未取代的C2-C10烯基、或者取代的或未取代的C2-C10炔基。用於這類連接子的較佳的取代基包括但不限於：羥基、胺基、烷氧基、羧基、苄基、苯基、硝基、硫醇、硫代烷氧基、鹵素、烷基、芳基、烯基和炔基。
在某些實施方式中，連接子係可裂解的。可裂解連接子是在細胞外部充分地穩定的連接子，但在進入靶細胞後被裂解以釋放連接子將它們保持在一起的兩個部分。在一些實施方式中，可裂解連接子在靶細胞中或者在第一參考條件（例如，可以選擇該條件來模擬或代表細胞內條件）下，比在受試者的血液中或者在第二參考條件（例如，可以選擇該條件來模擬或代表在血液或血清中所發現的條件）下快至少10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或更高、或者至少100倍被裂解。
可裂解連接子易受裂解劑的影響，例如pH、氧化還原電勢或降解性分子的存在。通常，裂解劑在細胞內部比在血清或血液中更普遍或者以更高的水平或更高的活性被發現。這類降解劑的實例包括：為特定底物所選擇的或沒有底物特異性的氧化還原劑，包括例如可以藉由還原作用而使氧化可還原裂解連接子降解的存在於細胞中的氧化酶或還原酶或還原劑（如硫醇）；酯酶；可以形成酸性環境的內體或試劑，例如，導致5或更低的pH的那些；藉由起廣義酸、肽酶（其可為底物特異性的）、和磷酸酶的作用而使酸可裂解連接子發生水解或降解的酶。
可裂解連接子可包含對pH敏感的部分。人血清之pH為7.4，而平均細胞內pH略較低，在約7.1-7.3之範圍內。內體具有在5.5-6.0範圍內的更加酸性pH，溶酶體具有在5.0附近的更加酸性pH。一些連接子將具有在較佳的pH下被裂解的可裂解基團，從而將RNA分子從在細胞內部的配位基中釋放出或者釋放到期望的細胞室內。
連接子可以包括可被特定酶裂解的可裂解基團。併入連接子中的可裂解基團的類型可以取決於待靶向的細胞。例如，靶向肝的配位基可以經由包括酯基的連接子而連接至RNA分子。肝細胞富含酯酶，因此與不富含酯酶的細胞類型相比，該連接子在肝細胞中更高效地被裂解。富含酯酶的其他類型細胞包括肺、腎皮質、和睾丸的細胞。當靶向富含肽酶的細胞（諸如肝細胞和滑膜細胞）時，可以使用含有肽鍵的連接子。
通常，可以藉由對降解劑（或條件）裂解候選連接子的能力進行測試來評估候選可裂解連接子的適合性。也將期望對候選可裂解連接子在血液中或者與其他非靶組織接觸時的抵抗裂解的能力進行測試。因此，可以確定在第一條件與第二條件之間的相對裂解敏感性，其中選擇第一條件作為在靶細胞中裂解的指示並且選擇第二條件作為在其他組織或生物流體（例如，血液或血清）中裂解的指示。可以在無細胞系統、細胞、細胞培養物、器官或組織培養物、或者整個動物中進行評估。可能有用的在無細胞或培養條件下進行初步評估，並且藉由在整個動物中的進一步評估而加以確認。在一些實施方式中，有用候選連接子在細胞中（或者在被選擇用於模擬細胞內條件的體外條件下）的裂解，與在血液或血清中（或者在模擬細胞外條件的體外條件下）相比，至少快2、4、10、20、50、70或100倍。
在其他實施方式中，使用氧化可還原裂解連接子。氧化可還原裂解連接子在還原或氧化時被裂解。可還原裂解基團的一個實例係二硫連接基團（-S-S-）。為了確定候選可裂解連接子是否是合適的「可還原裂解連接子」或者例如是否適合與特定RNAi構建體和特定配位基一起使用，可以採用本文所描述的一種或多種方法。例如，藉由與二硫蘇糖醇（DTT）或者模仿將會在細胞（例如，靶細胞）中所觀察的裂解速率的本領域中已知的其他還原劑一起進行孵化，可以對候選連接子進行評估。也可以在被選擇以模擬血液或血清條件的條件下，對候選連接子進行評估。在一個具體實施方式中，候選連接子在血液中被裂解至多10%。在其他實施方式中，有用候選連接子在細胞中（或者在被選擇以模擬細胞內條件的體外條件下）的降解，與在血液中（或者在被選擇以模仿細胞外條件的條件下）相比，至少快2、4、10、20、50、70、或100倍。
在又其他實施方式中，基於磷酸酯的可裂解連接子被使磷酸酯基發生降解或水解的裂解劑所裂解。使細胞中的磷酸酯基發生水解的裂解劑的實例為酶，諸如細胞中的磷酸酯酶。基於磷酸酯的可裂解基團的實例係：-O-P(O)(ORk)-O-、-O-P(S)(ORk)-O-、-O-P(S)(SRk)-O-、-S-P(O)(ORk)-O-、-O-P(O)(ORk)-S-、-S-P(O)(ORk)-S-、-O-P(S)(ORk)-S-、-S-P(S)(ORk)-O-、-O-P(O)(Rk)-O-、-O-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-O-、-S-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-S-、-O-P(S)(Rk)-S-。具體實施方式包括：-O-P(O)(OH)-O-、-O-P(S)(OH)-O-、-O-P(S)(SH)-O-、-S-P(O)(OH)-O-、-O-P(O)(OH)-S-、-S-P(O)(OH)-S-、-O-P(S)(OH)-S-、-SP(S)(OH)-O-、-O-P(O)(H)-O-、-O-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-O-、-S-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-S-、-O-P(S)(H)-S-。另一個具體實施方式係-O-P(O)(OH)-O-。可以利用與上述方法類似的方法對這些候選連接子進行評估。
在其他實施方式中，連接子可包含酸可裂解基團，它們是在酸性條件下被裂解的基團。在一些實施方式中，酸可裂解基團在pH約為6.5或更低（例如，約6.0、5.5、5.0或更低）的酸性環境中被裂解，或者被裂解劑（諸如可以起廣義酸作用的酶）所裂解。在細胞中，特定的低pH細胞器（諸如內體和溶酶體）可以為酸可裂解基團提供裂解環境。酸可裂解的連接基的實例包括但不限於：腙、酯、胺基酸的酯。酸可裂解基團可具有通式-C=NN-、C(O)O、或-OC(O)。當附接至酯的氧(烷氧基)的碳是芳基時，一個具體實施方式是取代烷基、或三級烷基（諸如二甲基、戊基或三級丁基）。可以利用與上述方法類似的方法，對這些候選對象進行評估。
在其他實施方式中，連接子可以包含基於酯的可裂解基團，它們被酶（諸如細胞中的酯酶和醯胺酶）所裂解。基於酯的可裂解基團的實例包括但不限於：伸烷基、伸烯基和伸炔基的酯。酯可裂解基團具有通式-C(O)O-、或-OC(O)-。可以利用與上述方法類似的方法對這些候選連接子進行評估。
在進一步的實施方式中，連接子可包含基於肽的可裂解基團，它們被酶（諸如細胞中的肽酶和蛋白酶）所裂解。基於肽的可裂解基團是在胺基酸之間所形成的肽鍵，用以產生寡肽（例如，二肽、三肽等）和多肽。基於肽的可裂解基團不包括醯胺基（-C(O)NH-）。醯胺基可以在任何的伸烷基、伸烯基或伸炔基之間形成。肽鍵係在胺基酸之間形成的特殊類型的醯胺鍵，用於產生肽和蛋白質。基於肽的裂解基團通常限於在產生肽的胺基酸和蛋白質之間所形成的肽鍵（即，醯胺鍵），並且不包括整個醯胺官能基。基於肽的可裂解連接基具有通式-NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-，其中RA和RB是兩個相鄰胺基酸的R基團。可以利用與上述方法類似的方法，對這些候選對象進行評估。
適於將配位基附接至本發明RNAi構建體中的有義股或反義股的其他類型連接子在本領域中是已知的，並且可以包括在美國專利案號7,723,509；8,017,762；8,828,956；8,877,917；和9,181,551（全部這些專利特此藉由引用以其全文併入）中所描述的連接子。
在某些實施方式中，與本發明RNAi構建體的有義股或反義股共價附接的配位基包含GalNAc部分，例如多價GalNAc部分。在一些實施方式中，多價GalNAc部分係三價GalNAc部分，並且附接至有義股之3'端。在其他實施方式中，多價GalNAc部分係三價GalNAc部分，並且附接至有義股的5'端。在又其他實施方式中，多價GalNAc部分係四價GalNAc部分，並且附接至有義股之3'端。在仍其他實施方式中，多價GalNAc部分係四價GalNAc部分，並且附接至有義股的5'端。在一些實施方式中，GalNAc部分附接至奇數編號序列SEQ ID NO: 1-159、161-319、321-461、或463-603的有義股的5'端。
在一些實施方式中，藉由投與編碼並控制RNAi構建體的細胞內表現的載體，可以將本發明之RNAi構建體遞送至目的細胞或組織。「載體」（在本文中也稱為「表現載體」）係可以用於將目的核酸遞送至細胞內部的物質的組成物。許多載體在本領域中是已知的，包括但不限於：線性多核苷酸、與離子性或兩親性化合物相關的多核苷酸、質體、和病毒。因此，術語「載體」包括自主複製的質體或病毒。病毒載體的實例包括但不限於：腺病毒載體、腺相關病毒載體、逆轉錄病毒載體等。載體可以在活細胞中複製，或者也可以藉由合成而製備。
通常，用於表現本發明RNAi構建體的載體將包含可操作地連接至編碼RNAi構建體的序列的一個或多個啟動子。如本文使用的，短語「可操作地連接」或「在轉錄控制下」意味著啟動子處在相對於多核苷酸序列正確的位置和取向上，以便控制RNA聚合酶的轉錄起始和多核苷酸序列的表現。「啟動子」係指被細胞的合成機制所識別或者藉由合成機制被引入、啟動基因序列的特異性轉錄所需的序列。合適的啟動子包括但不限於：RNA pol I、pol II、HI或U6 RNA pol III、和病毒啟動子（例如人巨細胞病毒（CMV）即早期基因啟動子、SV40早期啟動子、和勞斯肉瘤病毒長末端重複序列）。在一些實施方式中，HI或U6RNA pol III啟動子係較佳的。該啟動子可為組織特異性或誘導型啟動子。令人特別感興趣的是肝特異性啟動子，諸如來自人α-1抗胰蛋白酶基因、白蛋白基因、凝血酵素基因、和肝脂酶基因的啟動子序列。誘導型啟動子包括由蛻皮素、雌激素、助孕素、四環素、和異丙基-PD1-硫代半乳糖苷（IPTG）所調控的啟動子。
在其中RNAi構建體包含siRNA之一些實施方式中，兩條單獨的股（有義股和反義股）可以從單個載體或兩個單獨的載體中被表現。例如，在一個實施方式中，編碼有義股的序列可操作地連接至第一載體上的啟動子，編碼反義股的序列可操作地連接至第二載體上的啟動子。在這類實施方式中，例如藉由感染或轉染而將第一載體和第二載體共引入靶細胞中，使得有義股和反義股一旦被轉錄便將在細胞內雜交以形成siRNA分子。在另一個實施方式中，有義股和反義股從位於單個載體中的兩個單獨啟動子中被轉錄。在一些這類實施方式中，編碼有義股的序列可操作地連接至第一啟動子，編碼反義股的序列可操作地連接至第二啟動子，其中第一啟動子和第二啟動子位於單一載體中。在一個實施方式中，載體包含可操作地連接至編碼siRNA分子的序列的第一啟動子、和在相反方向上可操作地連接至相同序列的第二啟動子，使得來自第一啟動子的序列的轉錄導致siRNA分子的有義股的合成並且來自第二個啟動子的序列的轉錄導致siRNA分子的反義股的合成。
在其中RNAi構建體包含shRNA的其他實施方式中，將編碼單一至少部分自我互補的RNA分子的序列可操作地連接至啟動子以產生單一轉錄物。在一些實施方式中，編碼shRNA的序列包含經由連接子多核苷酸序列連接的反向重複序列，從而在轉錄後產生shRNA的莖環結構。
在一些實施方式中，編碼本發明RNAi構建體的載體係病毒載體。適合於表現本文所描述RNAi構建體的各種病毒載體系統包括但不限於：腺病毒載體、逆轉錄病毒載體（例如，慢病毒載體、馬婁尼鼠白血病病毒）、腺相關病毒載體；單純皰疹病毒載體；SV 40載體；多瘤病毒載體；乳頭狀瘤病毒載體；小核糖核酸病毒載體；和痘病毒載體（例如牛痘病毒）。在某些實施方式中，病毒載體係逆轉錄病毒載體（例如慢病毒載體）。
適用於本發明之各種載體、用於將編碼siRNA或shRNA分子的核酸序列插入載體的方法、及將載體遞送至目的細胞的方法係在熟悉該項技術者之範圍內。參見例如，Dornburg, Gene Therap. [基因療法], 第2卷: 301-310, 1995；Eglitis, Biotechniques [生物技術], 第6卷: 608-614, 1988；Miller, HumGene Therap. [人類基因療法], 第1卷: 5-14, 1990；Andseson, Nature [自然], 第392卷: 25-30, 1998年；Rubinson D A等人, Nat.Genet. [自然遺傳學], 第33卷: 401-406, 2003；Brummelkamp等人, Science [科學], 第296卷: 550-553, 2002；Brummelkamp等人, Cancer Cell [癌細胞], 第2卷: 243-247, 2002；Lee等人, Nat Biotechnol [自然生物技術], 第20卷: 500-505, 2002；Miyagishi等人, Nat Biotechnol [自然生物技術], 第20卷: 497-500, 2002；Paddison等人, GenesDev [基因與發育], 第16卷: 948-958, 2002；Paul等人, Nat Biotechnol [自然生物技術], 第20卷: 505-508, 2002；Sui等人, ProcNatl Acad Sci USA [美國國家科學院院刊], 第99卷: 5515-5520, 2002；和Yu等人, Proc Natl Acad Sci USA [美國國家科學院院刊], 第99卷: 6047-6052, 2002，這些文獻的全部特此藉由引用以其全文併入。
本發明還包括藥物組成物和配製物，它們包含本文所描述的RNAi構建體及藥學上可接受的載體、賦形劑/或稀釋劑。這類組成物和配製物可用於在有需要的受試者中降低SCAP的表現。在考慮臨床應用的情況下，藥物組成物和配製物將以適合於預期應用的形式而製備。通常，這將需要製備基本上沒有熱原以及可能對人或動物有害的其他雜質的組成物。
短語「藥學上可接受的」或「藥理學上可接受的」係指在投與動物或人類時不產生不良反應、過敏反應或其他不利反應的分子實體和組成物。如本文使用的，「藥學上可接受的載體、賦形劑、或稀釋劑」包括可接受的用於配製藥物（如適合於向人投與的藥物）的溶劑、緩衝劑、溶液、分散介質、包衣、抗菌劑和抗真菌劑、等張劑和吸收延遲劑等。將這類介質和試劑用於藥學活性物質的用途在本領域中是眾所周知的。除非任何常規介質或試劑與本發明RNAi構建體不相容，可考慮將其使用於治療組成物。補充的活性成分也可以併入組成物中，只要它們不使組成物的載體或RNAi構建體失去活性。
用於配製藥物組成物的組成物及方法取決於一些條件，包括但不限於：投與途徑、待治療的疾病或障礙的類型和程度、或待投與的劑量。在一些實施方式中，基於預期的遞送途徑來配製藥物組成物。例如，在某些實施方式中，藥物組成物被配製用於腸胃外遞送。腸胃外遞送形式包括：靜脈內、動脈內、皮下、鞘內、腹膜內或肌內注射或輸注。在一個實施方式中，藥物組成物被配製用於靜脈內遞送。在這類實施方式中，藥物組成物可包含基於脂質的遞送媒介物。在另一個實施方式中，藥物組成物被配製用於皮下遞送。在這類實施方式中，藥物組成物可包含靶向配位基（例如本文所描述的含有GalNAc的配位基）。
在一些實施方式中，藥物組成物包含有效量之本文所描述的RNAi構建體。「有效量」係足以產生有益或期望的臨床結果的量。在一些實施方式中，有效量係足以降低SCAP在受試者肝細胞中的表現之量。在一些實施方式中，有效量可為足以僅部分降低SCAP表現的量，例如，降低至與人雜合子中野生型SCAP對偶基因的表現相當的水平。
本發明RNAi構建體之有效量可為約0.01 mg/kg體重至約100 mg/kg體重、約0.05 mg/kg體重至約75mg/kg體重、約0.1 mg/kg體重至約50 mg/kg體重、約1 mg/kg至約30 mg/kg體重、約2.5 mg/kg體重至約20 mg/kg體重、或約5 mg/kg體重至約15 mg/kg體重。在某些實施方式中，本發明RNAi構建體的單次有效劑量可為約0.1 mg/kg、約0.5 mg/kg、約1 mg/kg、約2 mg/kg、約3 mg/kg、約4 mg/kg、約5 mg/kg、約6 mg/kg、約7 mg/kg、約8 mg/kg、約9 mg/kg、或約10 mg/kg。包含有效量的RNAi構建體之藥物組成物可以每週、每兩週、每月、每季度或每半年投與一次。精確確定特定有效劑量和投與頻率應考慮的情況可以基於幾個因素，這些因素包括患者的尺寸、年齡和一般狀況、待治療的障礙類型（例如心肌梗塞、心臟衰竭、冠狀動脈疾病、高膽固醇血症）、所採用的RNAi構建體和投與途徑。可以利用常規方法和/或在適當動物模型中的測試來確定本發明之任何特定RNAi構建體的有效劑量和體內半衰期的估計量。
本發明藥物組成物的投與可以經由任何普通途徑進行，只要經由該途徑可到達靶組織即可。這類途徑包括但不限於：腸胃外（例如，皮下、肌內、腹膜內或靜脈內）、口腔、鼻腔、頰部、皮內、透皮和舌下途徑、或者藉由直接注射入肝組織中或經過肝門靜脈而遞送。在一些實施方式中，藥物組成物係腸胃外投與。例如，在某些實施方式中，藥物組成物係靜脈內投與。在其他實施方式中，藥物組成物係皮下投與。
膠體分散系統（諸如大分子複合體、奈米囊、微球、珠和基於脂質的系統，包括水包油乳劑、微團、混合微團和脂質體）可用作本發明RNAi構建體的遞送媒介物或者編碼這類構造體的載體。適合於遞送本發明之核酸的市售脂肪乳劑包括：Intralipid®、Liposyn®、Liposyn®II、Liposyn®III、Nutrilipid、和其他類似的脂質乳劑。用作體內遞送媒介物的較佳的膠體系統係脂質體（即，人工膜囊）。本發明之RNAi構建體可被包封於脂質體內或者可與其形成複合體，特別是陽離子脂質體。替代性地，本發明之RNAi構建體可與脂質特別是陽離子脂質形成複合體。合適的脂質和脂質體包括中性（例如，二油醯基磷脂醯乙醇胺（DOPE）、二肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼（DMPC）和二棕櫚醯磷脂醯膽鹼（DPPC））、二硬脂醯磷脂醯膽鹼）、及陰性（例如，二豆蔻醯磷脂醯甘油基甘油（DMPG）、和陽離子型（例如，二油醯基四曱基胺基丙基（DOTAP）和二油醯基磷脂醯乙醇胺（DOTMA））。這類膠體分散系統的製備和使用在本領域中是眾所周知的。示例性的配製物還揭露於美國專利案號5,981,505；美國專利案號6,217,900；美國專利案號6,383,512；美國專利案號5,783,565；美國專利案號7,202,227；美國專利案號6,379,965；美國專利案號6,127,170；美國專利案號5,837,533；美國專利案號6,747,014；和WO 03/093449中。
在一些實施方式中，本發明之RNAi構建體被完全地封裝於脂質配製物中，例如，以形成SPLP（穩定的質體-脂質顆粒）、pSPLP、SNALP（穩定核酸脂質奈米粒）、或其他核酸-脂質顆粒。如本文使用的，術語「SNALP」係指穩定的核酸-脂質顆粒，包括SPLP。如本文使用的，術語「SPLP」係指包含被包封於脂質囊泡內的質體DNA的核酸-脂質顆粒。SNALP和SPLP典型地含有陽離子脂質、非陽離子脂質、和防止顆粒聚集的脂質（例如，PEG-脂質軛合物）。SNALP和SPLP對於全身應用特別有用，因為它們在靜脈注射後展現出循環壽命延長，並且在遠端部位（例如，與投與部位物理分離的部位）累積。SPLP包括「pSPLP」，其包括如在PCT公開案號WO 00/03683中所陳述的封裝縮合劑-核酸複合體。核酸-脂質顆粒典型地具有約50 nm至約150 nm、約60 nm至約130 nm、約70 nm至約110 nm或約70 nm至約90 nm的平均直徑，並且基本上無毒。另外，當存在於核酸-脂質顆粒中時，核酸在水溶液中對核酸酶的降解有抵抗力。核酸-脂質顆粒及其製備方法揭露於例如美國專利案號5,976,567；5,981,501；6,534,484；6,586,410；6,815,432；和PCT公開案號WO 96/40964。
適於注射使用的藥物組成物包括例如無菌水溶液或分散液、及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液的無菌粉末。通常，這些製劑係無菌的，並且在易於注射的程度上是流體。製劑應在製造和貯存的條件下穩定，並且應防止微生物（如細菌和真菌）的污染作用。適當的溶劑或分散介質可包括例如：水、乙醇、多元醇（例如，甘油、丙二醇、和液體聚乙二醇等）、它們的合適的混合物、和植物油。恰當的流動性可以（例如）藉由使用包衣（如卵磷脂）來維持，在分散體的情況下藉由維持所需的粒徑來維持，以及藉由使用表面活性劑來維持。對微生物作用的防止可以藉由各種抗細菌劑和抗真菌劑來實現，例如對羥苯甲酸酯、氯丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞等。在許多情況下，包括等張劑（例如，糖或氯化鈉）將是更較佳的。可注射組成物的延長吸收可以藉由在組成物中使用吸收延遲劑（例如，單硬脂酸鋁和明膠）來實現。
可藉由將活性化合物以適當的量與根據需要的任何其他成分（例如上面所列舉的）一同併入溶劑中接著進行過濾滅菌，來製備無菌注射溶液。通常，分散液係藉由如下方式而製備：將各種經滅菌活性成分併入無菌媒介物中，該無菌媒介物含有基本分散介質和例如上面所列舉的所需的其他成分。在用於製備無菌注射溶液的無菌粉末情況下，較佳的製備方法包括真空乾燥和冷凍乾燥技術，這些技術產生一種或多種活性成分加來自其先前無菌過濾溶液的任何其他所需成分的粉末
本發明之組成物通常可以以中性或鹽的形式來配製。藥學上可接受的鹽包括例如：源自無機酸（例如，鹽酸或磷酸）或有機酸（例如，乙酸、草酸、酒石酸、苦杏仁酸等）（與游離胺基形成）的酸加成鹽。與游離羧基所形成的鹽也可以源自無機鹼（例如，鈉、鉀、銨、鈣、或鐵的氫氧化物）或有機鹼（例如，異丙胺、三甲胺、組胺酸、普魯卡因等）。
例如，就在水溶液中的腸胃外投與而言，通常將溶液適當地緩衝，並且首先例如用充分的鹽水或葡萄糖使液體稀釋劑變為等張。這類水溶液可以用於例如靜脈內、肌內、皮下和腹膜內投與。較佳的是，如熟悉該項技術者已知的，特別地根據本揭露，使用無菌水性介質。藉由舉例說明，可將單劑量溶解於1 ml的等張NaCl溶液中，或者添加到1000 ml的皮下灌注液中，或者在建議的輸注部位進行注射（參見例如，Remington's Pharmaceutical Sciences [雷明頓藥物科學], 第15版, 1035-1038頁和1570-1580頁）。就人類投與而言，製劑應符合FDA標準所要求的無菌度、致熱性、一般安全性和純度標準。在某些實施方式中，本發明之藥物組成物包含無菌鹽溶液和本文所描述的RNAi構建體或者由其組成。在其他實施方式中，本發明之藥物組成物包含本文所描述的RNAi構建體和無菌水（例如注射用水，WFI）或者由其組成。在仍其他實施方式中，本發明之藥物組成物包含本文所描述的RNAi構建體和磷酸鹽緩衝鹽水（PBS）或者由其組成。
在一些實施方式中，將本發明之藥物組成物包裝或貯存在裝置中用以投與。用於注射配製物的裝置包括但不限於：注射口、預充式注射器、自動注射器、注射泵、在體注射器、和注射筆。用於霧化或粉末配製物的裝置包括但不限於：吸入器、吹入器、吸氣器等。因此，本發明包括用於治療或預防本文所描述的一種或多種障礙的、包含本發明藥物組成物的投與裝置。用於抑制 SCAP 表現之方法
本發明還提供抑制SCAP基因在細胞中的表現之方法。這些方法包括使細胞與有效抑制SCAP在細胞中的表現從而抑制SCAP在細胞中表現的量之RNAi構建體（例如，雙股RNAi構建體）接觸。細胞與RNAi構建體（例如，雙股RNAi構建體）之接觸可在體外或體內進行。使細胞在體內與RNAi構建體接觸包括使受試者（例如，人受試者）內的細胞或細胞群組與RNAi構建體接觸。與細胞接觸的體外和體內方法的組合也是可能的。
本發明提供用於降低或抑制SCAP在有需要的受試者中的表現之方法、以及用於治療或預防與SCAP表現或活性相關的病症、疾病、或障礙之方法。「與SCAP表現相關的病症、疾病、或障礙」係指其中SCAP表現水平被改變或者其中SCAP表現水平升高與發展該病症、疾病或障礙的風險增加相關的病症、疾病、或障礙。
如上所述，與細胞接觸可為直接的或間接的。此外，與細胞接觸可藉由靶向配位基來實現，該靶向配位基包括本文所描述的或在本領域中已知的任何配位基。在較佳的實施方式中，靶向配位基係碳水化合物部分，例如，GalNAc配位基、或三價GalNAc部分、或者將RNAi構建體引導至目的部位的任何其他配位基。
在一個實施方式中，使細胞與RNAi構建體接觸包括藉由促進或實現進入細胞的攝取或吸收來「將RNAi構建體引入或遞送入細胞中」。RNAi構建體的吸收或攝取可以藉由獨立的擴散或主動細胞過程、或者利用輔助劑或裝置而發生。將RNAi構建體引入細胞中可在體外和/或在體內進行。例如，就體內引入而言，可以將RNAi構建體注射入組織部位或者全身投與。在體外引入細胞中包括在本領域中已知的方法，諸如電穿孔和脂質體轉染。其他方法在下文中有描述和/或在本領域中是已知的。
如本文使用的，術語「抑制（inhibiting）」與「減少（reducing）」、「使緘默（silencing）」、「下調（downregulating）」、「抑制（suppressing）」和其他類似術語可互換地使用，並且包括任意水平的抑制。
短語「抑制SCAP的表現」旨在表示在對任何SCAP基因（例如，小鼠SCAP基因、大鼠SCAP基因、猴SCAP基因、或人SCAP基因）以及SCAP基因的變異體或突變異體之抑制。因此，在基因操縱的細胞、細胞群組、或生物體的上下文中，SCAP基因可為野生型SCAP基因、突變型SCAP基因（諸如引起甘油三酸酯沈積的突變型SCAP基因）、或轉基因SCAP基因。
「抑制SCAP基因之表現」包括任意水平的SCAP基因之抑制，例如，SCAP基因表現之至少部分抑制。可基於與SCAP基因表現相關的任何變數的水平或者水平的變化（例如SCAP mRNA水平、SCAP蛋白水平、或者甘油三酸酯沈積的數量或程度），對SCAP基因的表現進行評估。該水平可在單獨細胞中或者在細胞群組（包括例如源自受試者的樣本）中進行評估。
可藉由與對照水平相比與SCAP表現相關的一個或多個變數的絕對或相對水平的降低，對抑制進行評估。對照水平可為本領域中所採用的任何類型的對照水平，例如投與前的基線水平、或者從未用對照或用對照進行處理（例如，僅有緩衝劑的對照或者非活性劑的對照）的類似受試者、細胞或樣本中所確定的水平。在本發明方法之一些實施方式中，SCAP基因的表現被抑制至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%。
SCAP基因表現之抑制可藉由減少由第一細胞或細胞群組（這類細胞可存在於例如源自受試者的樣本中）所表現mRNA的量來表現，在這些細胞中SCAP被轉錄並且已經經過處理（例如，藉由使一個或多個細胞與本發明之RNAi構建體接觸，或者藉由向正存在或已存在這些細胞的受試者投與本發明之RNAi構建體），使得與基本上與第一細胞或細胞群組組相同但尚未經過如此處理的第二細胞或細胞群組（對照細胞）相比，SCAP基因的表現被抑制。在較佳的實施方式中，利用以下公式，藉由以對照細胞中mRNA水平的百分比的方式表示經處理細胞中的mRNA水平，而對抑制進行評估： （對照細胞中的mRNA）-（經處理細胞中的mRNA） ——————————————————————— · 100% （對照細胞中的mRNA）
替代性地，可用在功能上與SCAP基因表現有關的參數（例如，SCAP蛋白表現或SREBP通路蛋白活性的降低）對SCAP基因表現的抑制進行評估。可在組成上或者基因組工程設計的任何表現SCAP的細胞中，藉由在本領域中已知的任何測定來確定SCAP基因緘默。
SCAP蛋白表現之抑制可藉由降低由細胞或細胞群組所表現SCAP蛋白的水平（例如，在源自受試者的樣本中所表現的蛋白質水平）而表現。如上所述，為了對mRNA抑制進行評估，可以類似地以對照細胞或細胞群組中蛋白質水平的百分比來表示對經處理細胞或細胞群組中蛋白表現水平的抑制。
可用於對SCAP基因表現的抑制進行評估的對照細胞或細胞群組包括尚未與本發明RNAi構建體接觸的細胞或細胞群組。例如，在用RNAi構建體對受試者進行治療之前，對照細胞或細胞群組可來源於單獨受試者（例如，人或動物受試者）。
可利用本領域中已知的用於對mRNA表現進行評估的任何方法來確定由細胞或細胞群組所表現SCAP mRNA的水平或者循環SCAP mRNA的水平。在一個實施方式中，藉由對轉錄的多核苷酸或其部分（例如SCAP基因的mRNA）進行檢測來確定樣本中SCAP之表現水平。可利用RNA提取技術從細胞中提取RNA，該RNA提取技術包括例如使用酸酚/異硫氰酸胍提取（RNAzol B；生物起源公司（Biogenesis））、RNeasy RNA製備套組（kit）（凱傑公司（Qiagen））或PAXgene（PreAnalytix，瑞士）。應用核糖核酸雜交的典型檢測方法包括：核連綴測定（nuclear run-on assay）、RT-PCR、RNA酶保護測定（Melton等人, Nuc. Acids Res. [核酸研究] 12:7035）、Northern印跡、原位雜交、和微陣列分析。可利用在PCT/US 2012/043584中描述的方法對循環SCAP mRNA進行檢測，該專利文件特此藉由引用以其全文併入本文。
在一個實施方式中，用核酸探針來測定SCAP的表現水平。如本文使用的，術語「探針」係指能夠與特定SCAP選擇性結合的任何分子。探針可以由熟悉該項技術者合成，或者來源於適當的生物製品。探針可被特別地設計成加上標記。可以用作探針的分子的實例包括但不限於：RNA、DNA、蛋白質、抗體、和有機分子。
分離的mRNA可以用於雜交或擴增測定，包括但不限於：Northern分析、聚合酶鏈式反應（PCR）分析和探針陣列。測定mRNA水平的一種方法包括使分離的mRNA與可以與SCAP mRNA雜交的核酸分子（探針）接觸。在一個實施方式中，例如藉由使分離的mRNA在瓊脂糖凝膠上行進並將mRNA從凝膠中轉移至膜（如硝酸纖維素膜）來使mRNA固定於固體表面上並與探針接觸。在一個替代實施方式中，使該一個或多個探針固定於固體表面上並使mRNA與該一個或多個探針接觸，例如在艾菲矩陣公司（Affymetrix）的基因晶片陣列中。熟悉該項技術者可以容易地適應用於測定SCAP mRNA水平之已知mRNA檢測方法。
測定樣本中SCAP表現水平的一個替代方法包括例如對樣本中的mRNA進行核酸擴增和/或應用逆轉錄酶（以製備cDNA）的過程，例如藉由RT-PCR（Mullis, 1987，美國專利案號4,683,202中所陳述的實驗例）、連接酶鏈式反應（Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國國家科學院學報] 88:189-193）、自我持續序列複製（Guatelli等人 (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國國家科學院學報] 87:1874-1878）、轉錄擴增系統（Kwoh等人 (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國國家科學院學報] 86:1173-1177）、Q-β複製酶（Lizardi等人 (1988) Bio/Technology [生物技術] 6:1197）、滾環複製（Lizardi等人，美國專利案號5,854,033）或者任何其他核酸擴增方法，接著利用熟悉該項技術者熟知的技術對擴增分子進行檢測。如果這類分子以非常低的數量存在，那麼這些檢測方案對於核酸分子的檢測係尤其有用的。在本發明之特定方面，藉由螢光定量RT-PCR（即，TaqMan™系統）測定SCAP的表現水平。可利用膜印跡（如在諸如Northern雜交分析、點雜交分析等的雜交分析中所採用的）、或者微孔、樣本管、凝膠、珠或纖維（或者包含結合核酸的任何固體支持體）來監測SCAP mRNA的表現水平。參見美國專利案號5,770,722、5,874,219、5,744,305、5,677,195和5,445,934，這些專利文件的內容藉由引用併入本文。SCAP表現水平的測定還可包括使用溶液中的核酸探針。
在較佳的實施方式中，利用分支DNA（bDNA）測定或即時PCR（qPCR）對mRNA表現的水平進行評估。在本文所提供的實例中，描述並例示了這些方法的使用。
可利用本領域中已知的用於測量蛋白水平的任何方法來測定SCAP蛋白表現之水平。這類方法包括例如：電泳、毛細管電泳、高效液相層析法（HPLC）、薄層層析法（TLC）、超擴散層析法、流體或凝膠沈澱素反應、吸收光譜法、比色檢定、分光光度測定、流動式細胞測量術、免疫擴散（單向或雙向）、免疫電泳法、Western印跡、放射免疫測定（RIA）、酶聯免疫吸附測定（ELISA）、免疫螢光測定、電化學發光測定等。
在一些實施方式中，可以藉由如下方式來監測本發明方法之效力：檢測或監測SCAP疾病的症狀，諸如四肢、面部、喉、上呼吸道、腹部、軀幹、和生殖器的水腫、前驅症狀；喉腫；非瘙癢性皮疹；噁心；嘔吐；或腹痛的減輕。可利用本領域中已知的任何方法，在體外或體內對這些症狀進行評估。
在本發明方法之一些實施方式中，將RNAi構建體投與給受試者，從而將RNAi構建體遞送至在受試者內的特定部位。可藉由測量來源於受試者特定部位的液體或組織的樣本中SCAP mRNA或SCAP蛋白的水平或水平的變化，來評估SCAP表現的抑制。在較佳的實施方式中，該部位選自由以下組成之群組：肝臟、脈絡叢、視網膜、和胰腺。該部位也可為來自任一前述部位的細胞的亞組或亞群。該部位還可包括表現特定類型受體的細胞。用於治療或預防 SCAP 相關疾病之方法
本發明提供治療和預防方法，包括將包含RNAi的組成物、或包含RNAi構建體的藥物組成物、或包含本發明RNAi構建體的載體投與給患有SCAP相關疾病、障礙和/或病症或者易於發展SCAP相關疾病、障礙和/或病症之受試者。SCAP相關疾病的非限制性例包括例如：脂肪肝（脂肪變性）、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、肝硬化、肝臟內脂肪累積、肝的炎症、肝細胞壞死、肝細胞癌、肝纖維化、肥胖症、心肌梗塞、心臟衰竭、冠狀動脈疾病、高膽固醇血症、或非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）。在一個實施方式中，SCAP相關性疾病係NAFLD。在另一個實施方式中，SCAP相關性疾病係NASH。在另一個實施方式中，SCAP相關性疾病係脂肪肝（脂肪變性）。在另一個實施方式中，SCAP相關性疾病係胰島素抗性。在另一個實施方式中，SCAP相關性疾病不是胰島素抗性。在一些實施方式中，SCAP RNAi可以用於治療肝細胞癌。在人類HCC樣本中已有文件記錄了SREBP活性的增加，並且有證據表明在肝細胞肝癌（HCC）生長中起因果作用。在HCC的齧齒動物模型中的SCAP RNAi（例如siRNA）治療（例如，HCC細胞的異種移植或癌基因的肝表現）可以導致肝腫瘤負荷（即腫瘤體積）的減少。
在某些實施方式中，本發明提供一種在有需要的患者中減少SCAP表現之方法，該方法包括將本文所描述的任何RNAi構建體向該患者進行投與。如本文使用的，術語「患者」係指哺乳動物（包括人），並且可以與術語「受試者」互換使用。較佳的是，與不接受RNAi構建體的患者中的SCAP表現水平相比，在RNAi構建體的投與後在患者中SCAP在肝細胞中的表現水平降低。
本發明之方法可用於治療患有SCAP相關疾病的受試者，例如將會從SCAP基因表現和/或SCAP蛋白產生減少中受益的受試者。在一個方面，本發明提供降低患有非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的受試者中SREBP裂解激活蛋白（SCAP）基因的表現水平之方法。在另一方面，本發明提供在患有NAFLD的受試者中降低SCAP蛋白質水平之方法。本發明還提供在患有NAFLD的受試者中降低刺蝟通路（hedgehog pathway）的活性水平之方法。
在另一方面，本發明提供對患有NAFLD的受試者進行治療之方法。在一個方面，本發明提供對患有SCAP相關疾病（例如脂肪肝（脂肪變性）、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、肝硬化、肝臟內脂肪累積、肝臟的炎症、肝細胞壞死、肝纖維化、肥胖症、肝細胞癌、心肌梗塞、心臟衰竭、冠狀動脈疾病、高膽固醇血症或非酒精性脂肪肝（NAFLD））之受試者進行治療之方法。本發明之治療方法（和用途）包括將治療有效量之本發明之靶向SCAP基因的RNAi構建體或者包含本發明之靶向SCAP基因的RNAi構建體的藥物組成物、或者本發明之包含靶向SCAP基因的RNAi構建體的載體向受試者（例如人）進行投與。
在一個方面，本發明提供預防患有NAFLD的受試者中的至少一種症狀（例如，訊息傳導通路升高、疲勞、虛弱、體重減輕、食欲不振、噁心、腹痛、蜘蛛狀血管、皮膚和眼睛發黃（黃疸）、瘙癢、腿部的積水和腫脹（水腫）、腹部腫脹（腹水）和精神錯亂的存在）之方法。該等方法包括將治療有效量之本發明之RNAi構建體（例如RNAi構建體）、dsRNA、藥物組成物或載體向受試者投與，從而預防患有可得益於SCAP基因表現降低的障礙的受試者中的至少一種症狀。
在另一方面，本發明提供治療有效量之本發明RNAi構建體用於治療受試者，例如受益於減少和/或抑制SCAP基因表現的受試者之用途。在另一方面，本發明提供本發明之靶向SCAP基因的RNAi構建體（例如，dsRNA）、或者包含靶向SCAP基因的RNAi構建體的藥物組成物在製備用於治療受試者（例如將會從SCAP基因表現和/或SCAP蛋白產生的降低和/或抑制受益的受試者，如患有將會從SCAP基因表現的降低中受益的障礙（例如SCAP相關疾病）的受試者）的藥物中之用途。
在另一方面，本發明提供本發明之RNAi（例如dsRNA）用於預防將會從SCAP基因表現和/或SCAP蛋白產生的減少和/或抑制中受益的患有障礙的受試者中的至少一種症狀之用途。
在另一方面，本發明提供本發明之RNAi構建體在藥物製備中的用途，該藥物係用於預防患有將會從SCAP基因表現和/或SCAP蛋白的產生的減少和/或抑制中受益的障礙（如SCAP相關疾病）的受試者中的至少一種症狀。
在一個實施方式中，將靶向SCAP的RNAi構建體向患有SCAP相關疾病（例如非酒精性脂肪性肝病（NAFLD））的受試者進行投與，使得當向受試者投與dsRNA劑時，SCAP基因在受試者的細胞、組織、血液或其他組織或體液中的表現減少至少約10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、62%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或者至少約99%或更高。
本發明之方法和用途包括將本文所描述的組成物進行投與，使得在如約1、2、3、4、5、6、7、8、12、16、18、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72、76、或約80小時內，靶SCAP基因之表現降低。在一個實施方式中，靶SCAP基因的表現在延長的持續時間（例如至少約2、3、4、5、6、7天或更長時間，例如約1週、2週、3週、或者約4週或更長時間）內降低。
根據本發明之方法和用途的RNAi構建體的投與，可導致在患有SCAP相關疾病（例如非酒精性脂肪肝病（NAFLD））的患者的這類疾病或障礙的嚴重性、體征、症狀和/或標記物之降低。在本上下文中，「降低」係指這類水平的統計顯著性下降。降低可為例如至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、或約100%。例如藉由對疾病進展、疾病緩解、症狀嚴重程度、疼痛的減輕、生活品質、維持治療效果所需的藥物劑量、疾病標記物的水平、或者適合於正在進行治療或靶向進行預防的給定疾病的任何其他可測量參數進行測量，可以評估治療或預防疾病的效力。藉由測量這類參數中的任一參數或者各參數的任意組合來監測治療或預防的效力，完全是在熟悉該項技術者之能力範圍內。例如，可藉由定期監測NAFLD症狀、肝脂肪水平、或下游基因的表現，來對NAFLD的治療效力進行評估。隨後的讀數與初始讀數的比較給醫生提供了治療是否有效的一個指示。藉由測量這類參數中的任一參數或者各參數的任意組合來監測治療或預防的效力，完全是在熟悉該項技術者之能力範圍內。關於靶向SCAP的RNAi構建體或其藥物組成物的投與，「有效」對抗SCAP相關性疾病表明以臨床上適當的方式投與導致在至少統計學上顯著部分的患者中獲得有益作用，諸如症狀的改善、治癒、疾病的減輕、生命的延長、生活品質的改善、或者被熟悉治療NAFLD和/或SCAP相關疾病及相關原因的醫生普遍認為係積極的其他效果。
當在一個或多個疾病狀態參數中有統計顯著性改善時，或者在另外預計將會發生的情況下未能加重或發展症狀時，治療或預防的效果係顯而易見的。例如，在疾病的可測量參數中至少10%、較佳的至少20%、30%、40%、50%或更多的有利變化可為有效治療之指示。也可以使用本領域中已知的針對給定疾病的實驗動物模型來判斷給定RNAi藥物或該藥物的配製物之效力。在使用實驗動物模型的情況下，當觀察到標記物或症狀中的統計顯著性減少時證明治療的效力。
RNAi構建體的投與可以將例如在患者的細胞、組織、血液、尿液或其他區室中的SCAP蛋白水平的存在減少至少約5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或者至少約99%或更高。
在投與全劑量的RNAi構建體前，可以給患者投與將較小劑量之藥物（如5%輸注），並監測不良作用（如過敏反應）。在另一個實例中，可以監測患者的不良免疫刺激作用，如細胞介素（例如，TNF-α或IFN-α）水平之增加。
由於對SCAP表現的抑制作用，因而根據本發明之組成物或由其製備的藥物組成物可以增強生活品質。
本發明之RNAi構建體可以以「裸露」的形式投與，其中將經修飾的或未修飾的RNAi構建體以「游離RNAi」之方式直接懸浮於水性溶劑或合適的緩衝溶劑中。在藥物組成物不存在的情況下，投與游離RNAi。
RNAi可以在含有合適緩衝溶液之藥物組成物中。緩衝溶液可包括：乙酸鹽、檸檬酸鹽、穀醇溶蛋白、碳酸鹽、或磷酸鹽、或其任意組合。在一個實施方式中，緩衝溶液是磷酸鹽緩衝鹽水（PBS）。可以對包含RNAi構建體的緩衝溶液的pH和滲透壓度進行調節，使得該緩衝溶液適合於向受試者投與。
替代性地，可將本發明之RNAi構建體以藥物組成物（如RNAi構建體脂質體配製物）的形式進行投與。
受益於SCAP基因表現的降低和/或抑制的受試者係，患有非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）和/或如本文所描述SCAP相關疾病或障礙的受試者。
對將會受益於SCAP基因表現減少和/或抑制的受試者的治療包括治療性和預防性治療。
本發明還提供RNAi構建體或其藥物組成物用於治療將會受益於SCAP基因表現的降低和/或抑制連同其他藥物和/或其他治療方法例如目前被用於治療這些障礙的已知藥物和/或治療方法的受試者（例如患有SCAP相關疾病的受試者）之方法和用途。
例如，在某些實施方式中，將靶向SCAP基因的RNAi構建體與例如如本文其他地方所描述的可用於治療SCAP相關疾病的藥劑組合投與。例如，適用於對將會受益於SCAP表現降低的受試者（例如，患有SCAP相關疾病的受試者）進行治療的其他治療劑和治療方法包括：靶向SCAP基因的不同部分的RNAi構建體、治療劑、和/或用於治療SCAP相關疾病的程序、或任何前述項的組合。
在某些實施方式中，將靶向SCAP基因的第一RNAi構建體連同靶向SCAP基因的不同部分的第二RNAi構建體進行組合投與。例如，第一RNAi構建體包含形成雙股區的第一有義股和第一反義股，其中所述第一有義股的基本上全部的核苷酸和第一反義股的基本上全部的核苷酸係經修飾的核苷酸，其中所述第一有義股軛合至在3'-末端所附接的配位基，並且其中該配位基係經由二價或三價分支狀連接子而附接的一種或多種GalNAc衍生物；並且第二RNAi構建體包含形成雙股區的第二有義股和第二反義股，其中第二有義股的基本上全部的核苷酸和第二反義股的基本上全部的核苷酸係經修飾的核苷酸，其中第二有義股軛合至在3'-末端所附接的配位基，並且其中配位基係經由二價或三價分支狀連接子而附接的一種或多種GalNAc衍生物。
在一個實施方式中，第一和第二有義股的全部核苷酸和/或第一和第二反義股的全部核苷酸都包含修飾。
在一個實施方式中，經修飾的核苷酸中的至少一個選自由以下組成之群組：：3'-末端去氧胸腺嘧啶（dT）核苷酸、2'-O-甲基修飾的核苷酸、2'-氟修飾的核苷酸、鎖核苷酸、非鎖核苷酸、構象限制性核苷酸、限制性乙基核苷酸、無鹼基核苷酸、2'-胺基修飾的核苷酸、2'-O-烯丙基修飾的核苷酸、2'-C-烷基修飾的核苷酸、2'-羥基修飾的核苷酸、2'-甲氧基乙基修飾的核苷酸、2'-0-烷基修飾的核苷酸、𠰌啉基核苷酸、胺基磷酸酯、包含核苷酸的非天然鹼基、四氫哌喃修飾的核苷酸、1,5-失水己糖醇修飾的核苷酸、環己烯基修飾的核苷酸、包含硫代磷酸酯基的核苷酸、包含甲基膦酸酯基的核苷酸、包含5'-磷酸酯的核苷酸、和包含5'-磷酸酯模擬物的核苷酸。
在某些實施方式中，將靶向SCAP基因的第一RNAi構建體連同靶向不同於SCAP基因的基因的第二RNAi構建體進行組合投與。例如，可將靶向SCAP基因的RNAi構建體連同靶向SCAP基因的RNAi構建體進行組合投與。可將靶向SCAP基因的第一RNAi構建體和靶向不同於SCAP基因的基因（例如SCAP基因）的第二RNAi構建體作為相同藥物組成物的一部分而投與。替代性地，可將靶向SCAP基因的第一RNAi構建體和靶向不同於SCAP基因的基因（例如SCAP基因）的第二RNAi構建體作為不同藥物組成物的一部分而投與。
RNAi構建體和另外的治療劑和/或治療可在相同時間和/或以相同組合例如進行腸胃外投與，或者可以將另外的治療劑作為單獨組成物的一部分或者在單獨的時間和/或利用本領域中已知或本文所描述的另一種方法而投與。
本發明還提供使用本發明之RNAi構建體和/或含有本發明之RNAi構建體的組成物來減少和/或抑制SCAP在細胞中的表現之方法。在其他方面，本發明提供用於降低和/或抑制SCAP基因在細胞中的表現的本發明之RNAi構建體和/或包含本發明RNAi構建體之組成物。在又其他方面，提供本發明之RNAi構建體和/或包含本發明RNAi構建體的組成物在製備用於降低和/或抑制SCAP基因在細胞中的表現之藥物中的用途。在仍其他方面，本發明提供用於減少和/或抑制細胞中SCAP蛋白產生的本發明之RNAi構建體和/或包含本發明RNAi構建體之組成物。在又其他方面，提供本發明之RNAi構建體和/或包含本發明RNAi構建體的組成物在製備用於減少和/或抑制細胞中SCAP蛋白產生的藥物中的用途。該等方法和用途包括使細胞與本發明之RNAi構建體接觸，並且維持細胞達足以獲得SCAP基因的mRNA轉錄物的降解的時間，從而抑制SCAP基因的表現或者抑制細胞中SCAP蛋白的產生。
可以藉由本領域中已知的任何方法，對基因表現的降低進行評估。例如，可藉由使用對於熟悉該項技術者而言常規的方法（例如，Northern印跡、qRT-PCR）測定SCAP的mRNA表現水平，藉由使用對熟悉該項技術者而言常規的方法（如Western印跡、免疫學技術、流動式細胞測量術方法、ELISA）測定SCAP的蛋白水平，和/或藉由測定SCAP的生物活性，來確定SCAP的表現降低。
在本發明之方法和用途中，可在體外或體內使細胞接觸，即，細胞可以在受試者內。
適合於使用本發明方法的治療的細胞可為表現SCAP基因的任何細胞，例如來自患有NAFLD的受試者的細胞或者包含表現載體的細胞，該表現載體包含SCAP基因或SCAP基因的一部分。適用於本發明之方法和用途的細胞可為哺乳動物細胞，例如，靈長類動物細胞（如人類細胞或非人靈長類動物細胞，例如，猴細胞或黑猩猩細胞）、非靈長類動物細胞（諸如母牛細胞、豬細胞、駱駝細胞、美洲駝細胞、馬細胞、山羊細胞、兔細胞、綿羊細胞、倉鼠細胞、天竺鼠細胞、貓細胞）、狗細胞、大鼠細胞、小鼠細胞、獅子細胞、老虎細胞、熊細胞、或水牛細胞）、鳥類細胞（例如，鴨細胞或鵝細胞）、或鯨魚細胞。在一個實施方式中，細胞是人類細胞。
在細胞中SCAP基因表現可被抑制至少約5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或約100%。
在細胞中SCAP蛋白質產生可被抑制至少約5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或約100%。
本發明之體內方法和用途可包括將含有RNAi構建體的組成物向受試者投與，其中RNAi構建體包括與待治療哺乳動物的SCAP基因的RNA轉錄物的至少一部分為互補的核苷酸序列。當待治療生物體係人時，可以藉由本領域中已知的任何方式投與該組成物，包括但不限於：皮下、靜脈內、口腔、腹膜內、或腸胃外途徑，包括顱內（例如，腦室內、腦實質內和鞘內）、肌內、透皮、氣道（氣霧劑）、鼻腔、直腸、和局部（包括頰和舌下）投與。在某些實施方式中，該等組成物係藉由皮下或靜脈輸注或注射而投與。在一個實施方式中，該等組成物係藉由皮下注射而投與。
在一些實施方式中，投與係藉由貯存注射（depot injection）而進行。貯存注射可在延長的時間內以一致的方式釋放出RNAi。因此，貯存注射可減少獲得期望效果（例如，期望的SCAP抑制或治療或預防效果）所需的投與頻率。貯存注射還可提供更一致的血清濃度。貯存注射可包括皮下注射或肌內注射。在較佳的實施方式中，貯存注射係皮下注射。
在一些實施方式中，投與係藉由泵進行。該泵可為外部泵或手術植入泵。在某些實施方式中，泵為皮下植入滲透泵。在其他實施方式中，泵為輸液泵。輸液泵可用於靜脈內、皮下、動脈、或硬膜外輸注。在較佳的實施方式中，輸液泵係皮下輸液泵。在其他實施方式中，該泵係將RNAi構建體遞送至受試者之手術植入泵。
可基於是否需要局部治療或全身治療並基於待治療的區域來選擇投與方式。可選擇投與途徑和部位，以增強靶向。
在一個方面，本發明還提供用於在哺乳動物（例如，人）中抑制SCAP基因表現之方法。本發明還提供一種包含靶向哺乳動物細胞中的SCAP基因的RNAi構建體的組成物，該RNAi構建體係用於抑制SCAP基因在哺乳動物中之表現。在另一方面，本發明提供靶向哺乳動物細胞中的SCAP基因的RNAi構建體在製備用於抑制SCAP基因在哺乳動物中表現的藥物中之用途。
該等方法和用途包括將包含靶向哺乳動物細胞中的SCAP基因的RNAi構建體的組成物向哺乳動物（例如人）投與，並且維持哺乳動物達足以獲得SCAP的mRNA轉錄物降解的時間，從而抑制SCAP基因在哺乳動物中的表現。
可以藉由在本領域中已知的任何方法（例如本文所描述的qRT-PCR），在投與RNAi的受試者的外周血樣本中，對基因表現的降低進行評估。可以藉由在本領域中已知的任何方法和本文所描述的方法（例如，ELISA或Western印跡），對蛋白質產生的減少進行評估。在一個實施方式中，組織樣本充當用於監測SCAP基因和/或蛋白表現降低的組織材料。在另一個實施方式中，血液樣本充當用於監測SCAP基因和/或蛋白表現降低的組織材料。
在一個實施方式中，藉由執行5'-RACE或者如在本領域中已知的方案的修改，來完成在RNAi構建體投與後對RISC介導的靶標裂解的體內驗證（Lasham A等人 (2010) Nucleic Acid Res. [核酸研究], 38(3) p-el9）（Zimmermann等人 (2006年) Nature [自然] 441:111-4）。
應當理解的是，本文所揭露的所有核糖核酸序列都可以藉由用胸腺嘧啶鹼基取代序列中的尿嘧啶鹼基而轉化為去氧核糖核酸序列。同樣地，本文所揭露的所有去氧核糖核酸序列都可以藉由用尿嘧啶鹼基取代序列中的胸腺嘧啶鹼基而轉化為核糖核酸序列。去氧核糖核酸序列、核糖核酸序列、及含有本文揭露的所有序列的去氧核糖核苷酸與核糖核苷酸的混合物的序列被包括在本發明中。
另外，本文揭露的任何核酸序列都可用化學修飾的任意組合進行修飾。熟悉該項技術者將容易理解的是，在某些情況下，諸如「RNA」或「DNA」的用於描述經修飾的多核苷酸的這類名稱是任意的。例如，包含在核糖上具有2'-OH取代基的核苷酸和胸腺嘧啶鹼基的多核苷酸可被描述為具有修飾糖（用於DNA的天然2'-H的2'-OH）的DNA分子，或者被描述為具有經修飾的鹼基（用於RNA的天然尿嘧啶的胸腺嘧啶（甲基化尿嘧啶））的RNA分子。
因此，本文所提供的核酸序列（包括但不限於序列表中的核酸）意圖包括含有天然或修飾RNA和/或DNA的任意組合的核酸，包括但不限於具有修飾核酸鹼基的這類核酸。藉由另外舉例並且不加限制，具有序列「ATCGATCG」的多核苷酸包括具有這類序列的任何多核苷酸，無論是經修飾的還是未修飾的，包括但不限於包含RNA鹼基的這類化合物，例如具有序列「AUCGAUCG」的化合物及具有一些DNA鹼基和一些RNA鹼基（如「AUCGATCG」）的化合物，及具有其他經修飾的鹼基（如「ATmeCGAUCG」）的多核苷酸，其中meC表示在5位置包括甲基的胞嘧啶鹼基。
提供以下實例，包括進行的實驗和獲得的結果，僅出於說明的目的且不應解釋為限制所附申請專利範圍之範疇。藉由引用併入
本說明書中提到的所有出版物、專利和專利申請都藉由引用併入本文，如同每一單獨的出版物、專利或專利申請具體且單獨地藉由引用併入本文。然而，在此的參考文獻的引用不能理解為承認此類參考文獻係本發明之先前技術。藉由引用併入的參考文獻中提供的任何定義或術語與本文提供的術語和討論發生衝突的程度上，以為本術語和定義為准。等同物
前述書面說明書被認為滿足能使熟悉該項技術者實踐本發明。本發明之某些較佳的實施方式中詳細描述了前述描述和實例並描述了諸位發明人考慮的最佳模式。然而，將領會到的是，不論前述事項可以在文中看起來如何詳盡，本發明可以按多種方式進行實踐，並且應該依據所附申請專利範圍及其任何等同物來解釋。
以下實例，包括進行的實驗和實現的結果，僅提供解釋說明目的，並且不應被解釋為限制本發明。實例 1 ：經修飾的 SCAP siRNA 分子的選擇、設計和合成
利用人SCAP轉錄物（NM_012235）的生物資訊學分析，確認了靶向固醇調控元件結合蛋白（SREBP）裂解激活蛋白（SCAP）的治療性siRNA分子的最佳序列的鑒定和選擇。表1示出了被鑒定為具有治療特性的序列。在各種序列中，「invAb」係反向無鹼基核苷酸。 [表1]. 針對SCAP的siRNA序列
雙股體編號 有義序列（5'-3'） SEQ ID NO: （有義） 反義序列（5'-3'） SEQ ID NO: （反義）
D-1000 UGGAUUGGCAUCCUGGUAUUU 1 AUACCAGGAUGCCAAUCCAUU 2
D-1001 GGCUGUGUCUCCUUUUGGUUU 3 ACCAAAAGGAGACACAGCCUU 4
D-1002 GCCUACAUCUACUUCUCCAUU 5 UGGAGAAGUAGAUGUAGGCUU 6
D-1003 UUGGCAUCCUGGUAUACAUUU 7 AUGUAUACCAGGAUGCCAAUU 8
D-1004 GUGCAAGCUUGGGUGUCAUUU 9 AUGACACCCAAGCUUGCACUU 10
D-1005 CCUACAUCUACUUCUCCAUUU 11 AUGGAGAAGUAGAUGUAGGUU 12
D-1006 UUCCUUCCGAAACCUGCGUUU 13 ACGCAGGUUUCGGAAGGAAUU 14
D-1007 CUUCCUUCCGAAACCUGCUUU 15 AGCAGGUUUCGGAAGGAAGUU 16
D-1008 GGACCUGUUACAGACAGUUUU 17 AACUGUCUGUAACAGGUCCUU 18
D-1009 GACCUGUUACAGACAGUCUUU 19 AGACUGUCUGUAACAGGUCUU 20
D-1010 GGGACCUGUUACAGACAGUUU 21 ACUGUCUGUAACAGGUCCCUU 22
D-1011 CCAUCUUCCCACCUGAUGUUU 23 ACAUCAGGUGGGAAGAUGGUU 24
D-1012 GUGGUGCAAGCUUGGGUGUUU 25 ACACCCAAGCUUGCACCACUU 26
D-1013 ACCGCAGCACAGGCAUCAAUU 27 UUGAUGCCUGUGCUGCGGUUU 28
D-1014 GGGGACCUGUUACAGACAUUU 29 AUGUCUGUAACAGGUCCCCUU 30
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D-1019 UGGCCAGUGGAGGACAAGAUU 39 UCUUGUCCUCCACUGGCCAUU 40
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D-1021 AGGAAAUUGUCCUUCCGCUUU 43 AGCGGAAGGACAAUUUCCUUU 44
D-1022 UCCAUCUUCCCACCUGAUUUU 45 AAUCAGGUGGGAAGAUGGAUU 46
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D-1024 AGCUGGUCCAUCAUGAAGAUU 49 UCUUCAUGAUGGACCAGCUUU 50
D-1025 GCGGCCGGCUGGAGGUGUUUU 51 AACACCUCCAGCCGGCCGCUU 52
D-1026 UGGAGGAAAUUGUCCUUCUUU 53 AGAAGGACAAUUUCCUCCAUU 54
D-1027 AGAGCUGGUCCAUCAUGAAUU 55 UUCAUGAUGGACCAGCUCUUU 56
D-1028 CUGUGGUGCAAGCUUGGGUUU 57 ACCCAAGCUUGCACCACAGUU 58
D-1029 UGUGGUGCAAGCUUGGGUUUU 59 AACCCAAGCUUGCACCACAUU 60
D-1030 GGCCAGUGGAGGACAAGAUUU 61 AUCUUGUCCUCCACUGGCCUU 62
D-1031 UCUUCCUUCCGAAACCUGUUU 63 ACAGGUUUCGGAAGGAAGAUU 64
D-1032 GCUGUGGUGCAAGCUUGGUUU 65 ACCAAGCUUGCACCACAGCUU 66
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D-1038 CCAGUGGAGGACAAGAUGUUU 77 ACAUCUUGUCCUCCACUGGUU 78
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D-1040 UCUGGAUUGGCAUCCUGGUAinvAb 81 AUACCAGGAUGCCAAUCCAGAUU 82
D-1041 AGGGCUGUGUCUCCUUUUGGinvAb 83 ACCAAAAGGAGACACAGCCCUUU 84
D-1042 UUGCCUACAUCUACUUCUCCinvAb 85 UGGAGAAGUAGAUGUAGGCAAUU 86
D-1043 GAUUGGCAUCCUGGUAUACAinvAb 87 AUGUAUACCAGGAUGCCAAUCUU 88
D-1044 UGGUGCAAGCUUGGGUGUCAinvAb 89 AUGACACCCAAGCUUGCACCAUU 90
D-1045 UGCCUACAUCUACUUCUCCAinvAb 91 AUGGAGAAGUAGAUGUAGGCAUU 92
D-1046 UCUUCCUUCCGAAACCUGCGinvAb 93 ACGCAGGUUUCGGAAGGAAGAUU 94
D-1047 GUCUUCCUUCCGAAACCUGCinvAb 95 AGCAGGUUUCGGAAGGAAGACUU 96
D-1048 GGGGACCUGUUACAGACAGUinvAb 97 AACUGUCUGUAACAGGUCCCCUU 98
D-1049 GGGACCUGUUACAGACAGUCinvAb 99 AGACUGUCUGUAACAGGUCCCUU 100
D-1050 CGGGGACCUGUUACAGACAGinvAb 101 ACUGUCUGUAACAGGUCCCCGUU 102
D-1051 CUCCAUCUUCCCACCUGAUGinvAb 103 ACAUCAGGUGGGAAGAUGGAGUU 104
D-1052 CUGUGGUGCAAGCUUGGGUGinvAb 105 ACACCCAAGCUUGCACCACAGUU 106
D-1053 GGACCGCAGCACAGGCAUCAinvAb 107 UUGAUGCCUGUGCUGCGGUCCUU 108
D-1054 ACGGGGACCUGUUACAGACAinvAb 109 AUGUCUGUAACAGGUCCCCGUUU 110
D-1055 CCAUUGUCUGCAACUUUGGCinvAb 111 UGCCAAAGUUGCAGACAAUGGUU 112
D-1056 AUCCAUGGUCACUUUCCGGGinvAb 113 UCCCGGAAAGUGACCAUGGAUUU 114
D-1057 UGUCUACUUCCUGGCCCGCAinvAb 115 AUGCGGGCCAGGAAGUAGACAUU 116
D-1058 GAUGACCCUGACUGAAAGGCinvAb 117 AGCCUUUCAGUCAGGGUCAUCUU 118
D-1059 GCUGGCCAGUGGAGGACAAGinvAb 119 UCUUGUCCUCCACUGGCCAGCUU 120
D-1060 GAGCUGGUCCAUCAUGAAGAinvAb 121 UUCUUCAUGAUGGACCAGCUCUU 122
D-1061 GGAGGAAAUUGUCCUUCCGCinvAb 123 AGCGGAAGGACAAUUUCCUCCUU 124
D-1062 UCUCCAUCUUCCCACCUGAUinvAb 125 AAUCAGGUGGGAAGAUGGAGAUU 126
D-1063 UGGCCAGUGGAGGACAAGAUinvAb 127 AAUCUUGUCCUCCACUGGCCAUU 128
D-1064 AGAGCUGGUCCAUCAUGAAGinvAb 129 UCUUCAUGAUGGACCAGCUCUUU 130
D-1065 CAGCGGCCGGCUGGAGGUGUinvAb 131 AACACCUCCAGCCGGCCGCUGUU 132
D-1066 UUUGGAGGAAAUUGUCCUUCinvAb 133 AGAAGGACAAUUUCCUCCAAAUU 134
D-1067 CGAGAGCUGGUCCAUCAUGAinvAb 135 UUCAUGAUGGACCAGCUCUCGUU 136
D-1068 GGCUGUGGUGCAAGCUUGGGinvAb 137 ACCCAAGCUUGCACCACAGCCUU 138
D-1069 GCUGUGGUGCAAGCUUGGGUinvAb 139 AACCCAAGCUUGCACCACAGCUU 140
D-1070 CUGGCCAGUGGAGGACAAGAinvAb 141 AUCUUGUCCUCCACUGGCCAGUU 142
D-1071 CGUCUUCCUUCCGAAACCUGinvAb 143 ACAGGUUUCGGAAGGAAGACGUU 144
D-1072 GGGCUGUGGUGCAAGCUUGGinvAb 145 ACCAAGCUUGCACCACAGCCCUU 146
D-1073 UCCAUGGUCACUUUCCGGGAinvAb 147 AUCCCGGAAAGUGACCAUGGAUU 148
D-1074 GCGAGAGCUGGUCCAUCAUGinvAb 149 UCAUGAUGGACCAGCUCUCGCUU 150
D-1075 UGGGCUGUGGUGCAAGCUUGinvAb 151 ACAAGCUUGCACCACAGCCCAUU 152
D-1076 CGGAGCUGGGCAUCAUCCUCinvAb 153 UGAGGAUGAUGCCCAGCUCCGUU 154
D-1077 UGGUCUCCUACACCAUCACCinvAb 155 AGGUGAUGGUGUAGGAGACCAUU 156
D-1078 GGCCAGUGGAGGACAAGAUGinvAb 157 ACAUCUUGUCCUCCACUGGCCUU 158
D-1079 UGGUCACUUUCCGGGAUGGCinvAb 159 UGCCAUCCCGGAAAGUGACCAUU 160
D-1080 UGUGUGCCAGGGUGAUCCinvAb 321 UGGAUCACCCUGGCACACAUU 322
D-1081 AUAUCUCGGGCCUUCUACinvAb 323 UGUAGAAGGCCCGAGAUAUUU 324
D-1082 GGACCUGUGGAAUUCACCinvAb 325 UGGUGAAUUCCACAGGUCCUU 326
D-1083 UCUACUUCUCCACGCGGAinvAb 327 UUCCGCGUGGAGAAGUAGAUU 328
D-1084 GCGAGAUUUUCCCCUACCinvAb 329 AGGUAGGGGAAAAUCUCGCUU 330
D-1085 CCUGUCCAUUGACAUUCGinvAb 331 ACGAAUGUCAAUGGACAGGUU 332
D-1086 CUGUCCAUUGACAUUCGCinvAb 333 AGCGAAUGUCAAUGGACAGUU 334
D-1087 GUCCAUUGACAUUCGCCGinvAb 335 ACGGCGAAUGUCAAUGGACUU 336
D-1088 UCCAUUGACAUUCGCCGGinvAb 337 UCCGGCGAAUGUCAAUGGAUU 338
D-1089 CCAUUGACAUUCGCCGGAinvAb 339 AUCCGGCGAAUGUCAAUGGUU 340
D-1090 CAUUGACAUUCGCCGGAUinvAb 341 AAUCCGGCGAAUGUCAAUGUU 342
D-1091 CCGUCUUCCUUCCGAAACinvAb 343 AGUUUCGGAAGGAAGACGGUU 344
D-1092 UGGCUGGCACCGUUGUCUinvAb 345 AAGACAACGGUGCCAGCCAUU 346
D-1093 CCCAUGCCCGUGCCUAGUinvAb 347 AACUAGGCACGGGCAUGGGUU 348
D-1094 CACUGGCCGACGCUCUUCinvAb 349 UGAAGAGCGUCGGCCAGUGUU 350
D-1095 GCGACGACUACGGCUAUGinvAb 351 ACAUAGCCGUAGUCGUCGCUU 352
D-1096 CUCAACGGUUCCCUUGAUinvAb 353 AAUCAAGGGAACCGUUGAGUU 354
D-1097 UCAACGGUUCCCUUGAUUinvAb 355 AAAUCAAGGGAACCGUUGAUU 356
D-1098 AACGGUUCCCUUGAUUUCinvAb 357 AGAAAUCAAGGGAACCGUUUU 358
D-1099 UGCAGUUUAGAGGGACCCinvAb 359 AGGGUCCCUCUAAACUGCAUU 360
D-1100 UGCACACCAAAAACCCAUinvAb 361 AAUGGGUUUUUGGUGUGCAUU 362
D-1101 UGGGAUGUACUGACUGGCinvAb 363 UGCCAGUCAGUACAUCCCAUU 364
D-1102 GGAUGUACUGACUGGCAGinvAb 365 ACUGCCAGUCAGUACAUCCUU 366
D-1103 GGACCUAAACUACGGGGAinvAb 367 AUCCCCGUAGUUUAGGUCCUU 368
D-1104 GACCUAAACUACGGGGACinvAb 369 AGUCCCCGUAGUUUAGGUCUU 370
D-1105 ACCUAAACUACGGGGACCinvAb 371 AGGUCCCCGUAGUUUAGGUUU 372
D-1106 UAAACUACGGGGACCUGUinvAb 373 AACAGGUCCCCGUAGUUUAUU 374
D-1107 GGAAAGAGCCGAGUAUCUinvAb 375 AAGAUACUCGGCUCUUUCCUU 376
D-1108 AAAGAGCCGAGUAUCUUCinvAb 377 AGAAGAUACUCGGCUCUUUUU 378
D-1109 AGCCGAGUAUCUUCCAGCinvAb 379 AGCUGGAAGAUACUCGGCUUU 380
D-1110 UCUGGAUUGGCAUCCUGGUAinvAb 381 AUACCAGGAUGCCAAUCCAGAUU 382
D-1111 UCUGGAUUGGCAUCCUGGUAinvAb 383 AUACCAGGAUGCCAAUCCAGAUU 384
D-1112 UCUGGAUUGGCAUCCUGGUAinvAb 385 AUACCAbGGAUGCCAAUCCAGAUU 386
D-1113 UCUGGAUUGGCAUCCUGGUAinvAb 387 AUACCAGGAUGCCAAUCCAGAUU 388
D-1114 UGCCUACAUCUACUUCUCCAinvAb 389 AUGGAGAAGUAGAUGUAGGCAUU 390
D-1115 UGCCUACAUCUACUUCUCCAinvAb 391 AUGGAGAAGUAGAUGUAGGCAUU 392
D-1116 UGCCUACAUCUACUUCUCCAinvAb 393 AUGGAbGAAGUAGAUGUAGGCAUU 394
D-1117 UUGCCUACAUCUACUUCUCCinvAb 395 UGGAGAAGUAGAUGUAGGCAAUU 396
D-1118 UUGCCUACAUCUACUUCUCCinvAb 397 UGGAAbAAGUAGAUGUAGGCAAUU 398
D-1119 UUGCCUACAUCUACUUCUCCinvAb 399 UGGAGAAGUAGAUGUAGGCAAUU 400
D-1120 AGGGCUGUGUCUCCUUUUGGinvAb 401 ACCAAAAGGAGACACAGCCCUUU 402
D-1121 AGGGCUGUGUCUCCUUUUGGinvAb 403 ACCAAAAGGAGACACAGCCCUUU 404
D-1122 UGGUGCAAGCUUGGGUGUCAinvAb 405 AUGACACCCAAGCUUGCACCAUU 406
D-1123 UGGUGCAAGCUUGGGUGUCAinvAb 407 AUGACAAbCCAAGCUUGCACCAUU 408
D-1124 UGGUGCAAGCUUGGGUGUCAinvAb 409 AUGACAbCCCAAGCUUGCACCAUU 410
D-1125 GCCUACAUCUACUUCUCCAUU 411 UGGAGAAGUAGAUGUAGGCUU 412
D-1126 GCCUACAUCUACUUCUCCA 413 UGGAGAAGUAGAUGUAGGCUU 414
D-1127 GCCUACAUCUACUUCUCCinvAb 415 UGGAGAAGUAGAUGUAGGCUU 416
D-1128 GCCUACAUCUACUUCUCCinvAb 417 UGGAGAAGUAGAUGUAGGCUU 418
D-1129 CCUACAUCUACUUCUCCAUUU 419 AUGGAGAAGUAGAUGUAGGUU 420
D-1130 UGCCUACAUCUACUUCUCCAinvAb 421 AUGGAGAAGUAGAUGUAGGCAUU 422
D-1131 UGCCUACAUCUACUUCUCCAinvAb 423 AUGGAGAAGUAGAUGUAGGCAUU 424
D-1132 UGCCUACAUCUACUUCUCCAinvAb 425 AUGGAGAAGUAGAUGUAGGCAUU 426
D-1133 UGGAUUGGCAUCCUGGUAinvAb 427 AUACCAGGAUGCCAAUCCAUU 428
D-1134 UCUGGAUUGGCAUCCUGGUAinvAb 429 AUACCAGGAUGCCAAUCCAGAUU 430
D-1135 UCUGGAUUGGCAUCCUGGUAinvAb 431 AUACCAGGAUGCCAAUCCAGAUU 432
D-1136 UCUGGAUUGGCAUCCUGGUAinvAb 433 AUACCAGGAUGCCAAUCCAGAUU 434
D-1137 GGCUGUGUCUCCUUUUGGUUU 435 ACCAAAAGGAGACACAGCCUU 436
D-1138 GGCUGUGUCUCCUUUUGGUUU 437 ACCAAAAGGAGACACAGCCUU 438
D-1139 GGCUGUGUCUCCUUUUGGinvAb 439 ACCAAAAGGAGACACAGCCUU 440
D-1140 GGCUGUGUCUCCUUUUGGinvAb 441 ACCAAAAGGAGACACAGCCUU 442
D-1141 GGCUGUGUCUCCUUUUGGinvAb 443 ACCAAAAGGAGACACAGCCUU 444
D-1142 GUGCAAGCUUGGGUGUCAUUU 445 AUGACACCCAAGCUUGCACUU 446
D-1143 GUGCAAGCUUGGGUGUCAUUU 447 AUGACACCCAAGCUUGCACUU 448
D-1144 GUGCAAGCUUGGGUGUCAinvAb 449 AUGACACCCAAGCUUGCACUU 450
D-1145 GUGCAAGCUUGGGUGUCAinvAb 451 AUGACACCCAAGCUUGCACUU 452
D-1146 GUGCAAGCUUGGGUGUCAinvAb 453 AUGACACCCAAGCUUGCACUU 454
D-1147 UCUGGAUUGGGUACCUGGUAinvAb 455 AUACCAGGUACCCAAUCCAGAUU 456
D-1148 GCCUACAUGAUCUUCUCCA 457 UGGAGAAGAUCAUGUAGGCUU 458
D-1149 GGCUGUGUGAGCUUUUGGinvAb 459 ACCAAAAGCUCACACAGCCUU 460
D-1150 GUGCAAGCAACGGUGUCAinvAb 461 AUGACACCGUUGCUUGCACUU 462
為了改善SCAP siRNA序列的效能和體內穩定性，而將化學修飾併入SCAP siRNA分子中。具體地，在SCAP siRNA內的特定位置併入核糖的2'-O-甲基和2'-氟修飾。硫代磷酸酯核苷酸間鍵也是在反義序列和/或有義序列的末端被併入。下面的表2描繪了在每個經修飾的SCAP siRNA的有義序列和反義序列中的修飾。根據以下符號，在表2中列出了核苷酸序列：A、U、G、和C = 相應的核糖核苷酸；dC和dG = 相應的去氧核糖核苷酸；dT = 去氧胸苷；a、u、g、和c = 相應的2'-O-甲基核糖核苷酸；Af、Uf、Gf、和Cf = 相應的2'-去氧-2'-氟（「2'-氟」）核糖核苷酸；[InvAb]係反向無鹼基殘基；[Ab]係無鹼基殘基；GNA係乙二醇核酸，其中具有GNA主鏈的鹼基顯示為AgN、UgN、CgN、和GgN。在序列中「s」的插入表明兩個相鄰的核苷酸經由硫代磷酸二酯基（例如硫代磷酸酯核苷酸間鍵）而連接。除非另有說明，所有其他的核苷酸均為經由3'-5'磷酸二酯基而連接。表2中的每個siRNA化合物均包含19-21個鹼基對的雙股體區，其在兩條股的3'端具有2個核苷酸的突出端或者在一個末端或兩個末端具有平端。各[磷酸]已連接至下列的GalNAc結構：
Figure 02_image001
，其中X = O或S。 [表2]. 帶有修飾的針對SCAP的siRNA序列
雙股體編號 有義序列（5'-3'） SEQ ID NO: （有義） 反義序列（5'-3'） SEQ ID NO: （反義）
D-2000 [磷酸] usgsgauuGfgCfAfUfCfcugguaususu 161 [磷酸] asUfsaCfcAfGfgaugCfcAfauccasusu 162
D-2001 [磷酸] gsgscuguGfuCfUfCfCfuuuuggususu 163 [磷酸] asCfscAfaAfAfggagAfcAfcagccsusu 164
D-2002 [磷酸] gscscuacAfuCfUfAfCfuucuccasusu 165 [磷酸] usGfsgAfgAfAfguagAfuGfuaggcsusu 166
D-2003 [磷酸] ususggcaUfcCfUfGfGfuauacaususu 167 [磷酸] asUfsgUfaUfAfccagGfaUfgccaasusu 168
D-2004 [磷酸] gsusgcaaGfcUfUfGfGfgugucaususu 169 [磷酸] asUfsgAfcAfCfccaaGfcUfugcacsusu 170
D-2005 [磷酸] cscsuacaUfcUfAfCfUfucuccaususu 171 [磷酸] asUfsgGfaGfAfaguaGfaUfguaggsusu 172
D-2006 [磷酸] ususccuuCfcGfAfAfAfccugcgususu 173 [磷酸] asCfsgCfaGfGfuuucGfgAfaggaasusu 174
D-2007 [磷酸] csusuccuUfcCfGfAfAfaccugcususu 175 [磷酸] asGfscAfgGfUfuucgGfaAfggaagsusu 176
D-2008 [磷酸] gsgsaccuGfuUfAfCfAfgacaguususu 177 [磷酸] asAfscUfgUfCfuguaAfcAfgguccsusu 178
D-2009 [磷酸] gsasccugUfuAfCfAfGfacagucususu 179 [磷酸] asGfsaCfuGfUfcuguAfaCfaggucsusu 180
D-2010 [磷酸] gsgsgaccUfgUfUfAfCfagacagususu 181 [磷酸] asCfsuGfuCfUfguaaCfaGfgucccsusu 182
D-2011 [磷酸] cscsaucuUfcCfCfAfCfcugaugususu 183 [磷酸] asCfsaUfcAfGfguggGfaAfgauggsusu 184
D-2012 [磷酸] gsusggugCfaAfGfCfUfugggugususu 185 [磷酸] asCfsaCfcCfAfagcuUfgCfaccacsusu 186
D-2013 [磷酸] ascscgcaGfcAfCfAfGfgcaucaasusu 187 [磷酸] usUfsgAfuGfCfcuguGfcUfgcggususu 188
D-2014 [磷酸] gsgsggacCfuGfUfUfAfcagacaususu 189 [磷酸] asUfsgUfcUfGfuaacAfgGfuccccsusu 190
D-2015 [磷酸] asusugucUfgCfAfAfCfuuuggcasusu 191 [磷酸] usGfscCfaAfAfguugCfaGfacaaususu 192
D-2016 [磷酸] cscsauggUfcAfCfUfUfuccgggasusu 193 [磷酸] usCfscCfgGfAfaaguGfaCfcauggsusu 194
D-2017 [磷酸] uscsuacuUfcCfUfGfGfcccgcaususu 195 [磷酸] asUfsgCfgGfGfccagGfaAfguagasusu 196
D-2018 [磷酸] usgsacccUfgAfCfUfGfaaaggcususu 197 [磷酸] asGfscCfuUfUfcaguCfaGfggucasusu 198
D-2019 [磷酸] usgsgccaGfuGfGfAfGfgacaagasusu 199 [磷酸] usCfsuUfgUfCfcuccAfcUfggccasusu 200
D-2020 [磷酸] gscsugguCfcAfUfCfAfugaagaasusu 201 [磷酸] usUfscUfuCfAfugauGfgAfccagcsusu 202
D-2021 [磷酸] asgsgaaaUfuGfUfCfCfuuccgcususu 203 [磷酸] asGfscGfgAfAfggacAfaUfuuccususu 204
D-2022 [磷酸] uscscaucUfuCfCfCfAfccugauususu 205 [磷酸] asAfsuCfaGfGfugggAfaGfauggasusu 206
D-2023 [磷酸] gscscaguGfgAfGfGfAfcaagauususu 207 [磷酸] asAfsuCfuUfGfuccuCfcAfcuggcsusu 208
D-2024 [磷酸] asgscuggUfcCfAfUfCfaugaagasusu 209 [磷酸] usCfsuUfcAfUfgaugGfaCfcagcususu 210
D-2025 [磷酸] gscsggccGfgCfUfGfGfagguguususu 211 [磷酸] asAfscAfcCfUfccagCfcGfgccgcsusu 212
D-2026 [磷酸] usgsgaggAfaAfUfUfGfuccuucususu 213 [磷酸] asGfsaAfgGfAfcaauUfuCfcuccasusu 214
D-2027 [磷酸] asgsagcuGfgUfCfCfAfucaugaasusu 215 [磷酸] usUfscAfuGfAfuggaCfcAfgcucususu 216
D-2028 [磷酸] csusguggUfgCfAfAfGfcuugggususu 217 [磷酸] asCfscCfaAfGfcuugCfaCfcacagsusu 218
D-2029 [磷酸] usgsugguGfcAfAfGfCfuuggguususu 219 [磷酸] asAfscCfcAfAfgcuuGfcAfccacasusu 220
D-2030 [磷酸] gsgsccagUfgGfAfGfGfacaagaususu 221 [磷酸] asUfscUfuGfUfccucCfaCfuggccsusu 222
D-2031 [磷酸] uscsuuccUfuCfCfGfAfaaccugususu 223 [磷酸] asCfsaGfgUfUfucggAfaGfgaagasusu 224
D-2032 [磷酸] gscsugugGfuGfCfAfAfgcuuggususu 225 [磷酸] asCfscAfaGfCfuugcAfcCfacagcsusu 226
D-2033 [磷酸] csasugguCfaCfUfUfUfccgggaususu 227 [磷酸] asUfscCfcGfGfaaagUfgAfccaugsusu 228
D-2034 [磷酸] gsasgagcUfgGfUfCfCfaucaugasusu 229 [磷酸] usCfsaUfgAfUfggacCfaGfcucucsusu 230
D-2035 [磷酸] gsgscuguGfgUfGfCfAfagcuugususu 231 [磷酸] asCfsaAfgCfUfugcaCfcAfcagccsusu 232
D-2036 [磷酸] gsasgcugGfgCfAfUfCfauccucasusu 233 [磷酸] usGfsaGfgAfUfgaugCfcCfagcucsusu 234
D-2037 [磷酸] gsuscuccUfaCfAfCfCfaucaccususu 235 [磷酸] asGfsgUfgAfUfggugUfaGfgagacsusu 236
D-2038 [磷酸] cscsagugGfaGfGfAfCfaagaugususu 237 [磷酸] asCfsaUfcUfUfguccUfcCfacuggsusu 238
D-2039 [磷酸] gsuscacuUfuCfCfGfGfgauggcasusu 239 [磷酸] usGfscCfaUfCfccggAfaAfgugacsusu 240
D-2040 [磷酸] ucuggauuGfgCfAfUfCfcugguas [invAb] 241 asUfsaccaGfgaugCfcAfauccagasusu 242
D-2041 [磷酸] agggcuguGfuCfUfCfCfuuuuggs [invAb] 243 asCfscaaaAfggagAfcAfcagcccususu 244
D-2042 [磷酸] uugccuacAfuCfUfAfCfuucuccs [invAb] 245 usGfsgagaAfguagAfuGfuaggcaasusu 246
D-2043 [磷酸] gauuggcaUfcCfUfGfGfuauacas [invAb] 247 asUfsguauAfccagGfaUfgccaaucsusu 248
D-2044 [磷酸] uggugcaaGfcUfUfGfGfgugucas [invAb] 249 asUfsgacaCfccaaGfcUfugcaccasusu 250
D-2045 [磷酸] ugccuacaUfcUfAfCfUfucuccas [invAb] 251 asUfsggagAfaguaGfaUfguaggcasusu 252
D-2046 [磷酸] ucuuccuuCfcGfAfAfAfccugcgs [invAb] 253 asCfsgcagGfuuucGfgAfaggaagasusu 254
D-2047 [磷酸] gucuuccuUfcCfGfAfAfaccugcs [invAb] 255 asGfscaggUfuucgGfaAfggaagacsusu 256
D-2048 [磷酸] ggggaccuGfuUfAfCfAfgacagus [invAb] 257 asAfscuguCfuguaAfcAfgguccccsusu 258
D-2049 [磷酸] gggaccugUfuAfCfAfGfacagucs [invAb] 259 asGfsacugUfcuguAfaCfaggucccsusu 260
D-2050 [磷酸] cggggaccUfgUfUfAfCfagacags [invAb] 261 asCfsugucUfguaaCfaGfguccccgsusu 262
D-2051 [磷酸] cuccaucuUfcCfCfAfCfcugaugs [invAb] 263 asCfsaucaGfguggGfaAfgauggagsusu 264
D-2052 [磷酸] cuguggugCfaAfGfCfUfugggugs [invAb] 265 asCfsacccAfagcuUfgCfaccacagsusu 266
D-2053 [磷酸]ggaccgcaGfcAfCfAfGfgcaucas [invAb] 267 usUfsgaugCfcuguGfcUfgcgguccsusu 268
D-2054 [磷酸] acggggacCfuGfUfUfAfcagacas [invAb] 269 asUfsgucuGfuaacAfgGfuccccgususu 270
D-2055 [磷酸] ccauugucUfgCfAfAfCfuuuggcs [invAb] 271 usGfsccaaAfguugCfaGfacaauggsusu 272
D-2056 [磷酸] auccauggUfcAfCfUfUfuccgggs [invAb] 273 usCfsccggAfaaguGfaCfcauggaususu 274
D-2057 [磷酸] ugucuacuUfcCfUfGfGfcccgcas [invAb] 275 asUfsgcggGfccagGfaAfguagacasusu 276
D-2058 [磷酸] gaugacccUfgAfCfUfGfaaaggcs [invAb] 277 asGfsccuuUfcaguCfaGfggucaucsusu 278
D-2059 [磷酸] gcuggccaGfuGfGfAfGfgacaags [invAb] 279 usCfsuuguCfcuccAfcUfggccagcsusu 280
D-2060 [磷酸] gagcugguCfcAfUfCfAfugaagas [invAb] 281 usUfscuucAfugauGfgAfccagcucsusu 282
D-2061 [磷酸] ggaggaaaUfuGfUfCfCfuuccgcs [invAb] 283 asGfscggaAfggacAfaUfuuccuccsusu 284
D-2062 [磷酸] ucuccaucUfuCfCfCfAfccugaus [invAb] 285 asAfsucagGfugggAfaGfauggagasusu 286
D-2063 [磷酸] uggccaguGfgAfGfGfAfcaagaus [invAb] 287 asAfsucuuGfuccuCfcAfcuggccasusu 288
D-2064 [磷酸] agagcuggUfcCfAfUfCfaugaags [invAb] 289 usCfsuucaUfgaugGfaCfcagcucususu 290
D-2065 [磷酸] cagcggccGfgCfUfGfGfaggugus [invAb] 291 asAfscaccUfccagCfcGfgccgcugsusu 292
D-2066 [磷酸] uuuggaggAfaAfUfUfGfuccuucs [invAb] 293 asGfsaaggAfcaauUfuCfcuccaaasusu 294
D-2067 [磷酸] cgagagcuGfgUfCfCfAfucaugas [invAb] 295 usUfscaugAfuggaCfcAfgcucucgsusu 296
D-2068 [磷酸] ggcuguggUfgCfAfAfGfcuugggs [invAb] 297 asCfsccaaGfcuugCfaCfcacagccsusu 298
D-2069 [磷酸] gcugugguGfcAfAfGfCfuugggus [invAb] 299 asAfscccaAfgcuuGfcAfccacagcsusu 300
D-2070 [磷酸] cuggccagUfgGfAfGfGfacaagas [invAb] 301 asUfscuugUfccucCfaCfuggccagsusu 302
D-2071 [磷酸] cgucuuccUfuCfCfGfAfaaccugs[invAb] 303 asCfsagguUfucggAfaGfgaagacgsusu 304
D-2072 [磷酸] gggcugugGfuGfCfAfAfgcuuggs [invAb] 305 asCfscaagCfuugcAfcCfacagcccsusu 306
D-2073 [磷酸] uccaugguCfaCfUfUfUfccgggas [invAb] 307 asUfscccgGfaaagUfgAfccauggasusu 308
D-2074 [磷酸] gcgagagcUfgGfUfCfCfaucaugs [invAb] 309 usCfsaugaUfggacCfaGfcucucgcsusu 310
D-2075 [磷酸] ugggcuguGfgUfGfCfAfagcuugs [invAb] 311 asCfsaagcUfugcaCfcAfcagcccasusu 312
D-2076 [磷酸] cggagcugGfgCfAfUfCfauccucs [invAb] 313 usGfsaggaUfgaugCfcCfagcuccgsusu 314
D-2077 [磷酸] uggucuccUfaCfAfCfCfaucaccs [invAb] 315 asGfsgugaUfggugUfaGfgagaccasusu 316
D-2078 [磷酸] ggccagugGfaGfGfAfCfaagaugs [invAb] 317 asCfsaucuUfguccUfcCfacuggccsusu 318
D-2079 [磷酸] uggucacuUfuCfCfGfGfgauggcs [invAb] 319 usGfsccauCfccggAfaAfgugaccasusu 320
D-2080 [磷酸] usgsugugCfcAfGfGfGfugaucscs [invAb] 463 usGfsgaucAfcccuGfgCfacacasusu 464
D-2081 [磷酸] asusaucuCfgGfGfCfCfuucuascs[invAb] 465 usGfsuagaAfggccCfgAfgauaususu 466
D-2082 [磷酸] gsgsaccuGfuGfGfAfAfuucacscs [invAb] 467 usGfsgugaAfuuccAfcAfgguccsusu 468
D-2083 [磷酸] uscsuacuUfcUfCfCfAfcgcggsas [invAb] 469 usUfsccgcGfuggaGfaAfguagasusu 470
D-2084 [磷酸] gscsgagaUfuUfUfCfCfccuacscs[invAb] 471 asGfsguagGfggaaAfaUfcucgcsusu 472
D-2085 [磷酸] cscsugucCfaUfUfGfAfcauucsgs [invAb] 473 asCfsgaauGfucaaUfgGfacaggsusu 474
D-2086 [磷酸] csusguccAfuUfGfAfCfauucgscs [invAb] 475 asGfscgaaUfgucaAfuGfgacagsusu 476
D-2087 [磷酸] gsusccauUfgAfCfAfUfucgccsgs [invAb] 477 asCfsggcgAfauguCfaAfuggacsusu 478
D-2088 [磷酸] uscscauuGfaCfAfUfUfcgccgsgs [invAb] 479 usCfscggcGfaaugUfcAfauggasusu 480
D-2089 [磷酸] cscsauugAfcAfUfUfCfgccggsas [invAb] 481 asUfsccggCfgaauGfuCfaauggsusu 482
D-2090 [磷酸] csasuugaCfaUfUfCfGfccggasus [invAb] 483 asAfsuccgGfcgaaUfgUfcaaugsusu 484
D-2091 [磷酸] cscsgucuUfcCfUfUfCfcgaaascs [invAb] 485 asGfsuuucGfgaagGfaAfgacggsusu 486
D-2092 [磷酸] usgsgcugGfcAfCfCfGfuugucsus [invAb] 487 asAfsgacaAfcgguGfcCfagccasusu 488
D-2093 [磷酸] cscscaugCfcCfGfUfGfccuagsus [invAb] 489 asAfscuagGfcacgGfgCfaugggsusu 490
D-2094 [磷酸] csascuggCfcGfAfCfGfcucuuscs [invAb] 491 usGfsaagaGfcgucGfgCfcagugsusu 492
D-2095 [磷酸] gscsgacgAfcUfAfCfGfgcuausgs [invAb] 493 asCfsauagCfcguaGfuCfgucgcsusu 494
D-2096 [磷酸] csuscaacGfgUfUfCfCfcuugasus [invAb] 495 asAfsucaaGfggaaCfcGfuugagsusu 496
D-2097 [磷酸] uscsaacgGfuUfCfCfCfuugausus [invAb] 497 asAfsaucaAfgggaAfcCfguugasusu 498
D-2098 [磷酸] asascgguUfcCfCfUfUfgauuuscs [invAb] 499 asGfsaaauCfaaggGfaAfccguususu 500
D-2099 [磷酸] usgscaguUfuAfGfAfGfggaccscs [invAb] 501 asGfsggucCfcucuAfaAfcugcasusu 502
D-2100 [磷酸] usgscacaCfcAfAfAfAfacccasus [invAb] 503 asAfsugggUfuuuuGfgUfgugcasusu 504
D-2101 [磷酸] usgsggauGfuAfCfUfGfacuggscs [invAb] 505 usGfsccagUfcaguAfcAfucccasusu 506
D-2102 [磷酸] gsgsauguAfcUfGfAfCfuggcasgs [invAb] 507 asCfsugccAfgucaGfuAfcauccsusu 508
D-2103 [磷酸] gsgsaccuAfaAfCfUfAfcggggsas [invAb] 509 asUfsccccGfuaguUfuAfgguccsusu 510
D-2104 [磷酸] gsasccuaAfaCfUfAfCfggggascs [invAb] 511 asGfsucccCfguagUfuUfaggucsusu 512
D-2105 [磷酸] ascscuaaAfcUfAfCfGfgggacscs [invAb] 513 asGfsguccCfcguaGfuUfuaggususu 514
D-2106 [磷酸] usasaacuAfcGfGfGfGfaccugsus [invAb] 515 asAfscaggUfccccGfuAfguuuasusu 516
D-2107 [磷酸] gsgsaaagAfgCfCfGfAfguaucsus [invAb] 517 asAfsgauaCfucggCfuCfuuuccsusu 518
D-2108 [磷酸] asasagagCfcGfAfGfUfaucuuscs [invAb] 519 asGfsaagaUfacucGfgCfucuuususu 520
D-2109 [磷酸] asgsccgaGfuAfUfCfUfuccagscs[invAb] 521 asGfscuggAfagauAfcUfcggcususu 522
D-2110 [磷酸] ucuggauuGfgCfAfUfCfcugguas [invAb] 523 asUfsac [CgN] aGfgaugCfcAfauccagasusu 524
D-2111 [磷酸] ucuggauuGfgCfAfUfCfcugguas [invAb] 525 asUfsaccaGf [GgN] augCfcAfauccagasusu 526
D-2112 [磷酸] ucuggauuGfgCfAfUfCfcugguas [invAb] 527 asUfsacc [Ab] GfgaugCfcAfauccagasusu 528
D-2113 [磷酸] ucuggauuGfgCfAfUfCfcugguas [invAb] 529 asUfsacca [GgN] gaugCfcAfauccagasusu 530
D-2114 [磷酸] ugccuacaUfcUfAfCfUfucuccas [invAb] 531 asUfs [GgN] gagAfaguaGfaUfguaggcasusu 532
D-2115 [磷酸] ugccuacaUfcUfAfCfUfucuccas [invAb] 533 asUfsgg [AgN] gAfaguaGfaUfguaggcasusu 534
D-2116 [磷酸] ugccuacaUfcUfAfCfUfucuccas [invAb] 535 asUfsgg [Ab] gAfaguaGfaUfguaggcasusu 536
D-2117 [磷酸] uugccuacAfuCfUfAfCfuucuccs [invAb] 537 usGfsga [GgN] aAfguagAfuGfuaggcaasusu 538
D-2118 [磷酸] uugccuacAfuCfUfAfCfuucuccs [invAb] 539 usGfsga [Ab] aAfguagAfuGfuaggcaasusu 540
D-2119 [磷酸] uugccuacAfuCfUfAfCfuucuccs [invAb] 541 usGfs [GgN] agaAfguagAfuGfuaggcaasusu 542
D-2120 [磷酸] agggcuguGfuCfUfCfCfuuuuggs [invAb] 543 asCfscaa [AgN] AfggagAfcAfcagcccususu 544
D-2121 [磷酸] agggcuguGfuCfUfCfCfuuuuggs [invAb] 545 asCfsca [AgN] aAfggagAfcAfcagcccususu 546
D-2122 [磷酸] uggugcaaGfcUfUfGfGfgugucas [invAb] 547 asUfs [GgN] acaCfccaaGfcUfugcaccasusu 548
D-2123 [磷酸] uggugcaaGfcUfUfGfGfgugucas [invAb] 549 asUfsgaca [Ab] ccaaGfcUfugcaccasusu 550
D-2124 [磷酸] uggugcaaGfcUfUfGfGfgugucas [invAb] 551 asUfsgac [Ab] CfccaaGfcUfugcaccasusu 552
D-2125 [磷酸] gccuacAfuCfUfAfCfuucuccasusu 553 usGfsgAfgAfAfguagAfuGfuaggcsusu 554
D-2126 [磷酸] gccuacAfuCfUfAfCfuucucscsa 555 usGfsgAfgAfAfguagAfuGfuaggcsusu 556
D-2127 [磷酸] gccuacAfuCfUfAfCfuucucscs [invAb] 557 usGfsgagaAfguagAfuGfuaggcsusu 558
D-2128 [磷酸] gccuacAfuCfUfAfCfuucucscs [invAb] 559 usGfsgAfgAfAfguagAfuGfuaggcsusu 560
D-2129 [磷酸] ccuacaUfcUfaCfUfucuccaususu 561 asUfsgGfaGfAfaguaGfaUfguaggsusu 562
D-2130 [磷酸] ugccuacaUfcUfaCfUfucuccas [invAb] 563 asUfsgGfaGfAfaguaGfaUfguaggcasusu 564
D-2131 [磷酸] ugccuacaUfcUfaCfUfucuccas [invAb] 565 asUfsggagAfagUfaGfaUfguaggcasusu 566
D-2132 [磷酸] ugccuacaUfcUfaCfUfucuccas [invAb] 567 asUfsggagAfaguaGfaUfguaggcasusu 568
D-2133 [磷酸] uggauuGfgCfAfUfCfcuggusas [invAb] 569 asUfsaccaGfgaugCfcAfauccasusu 570
D-2134 [磷酸] ucuggauuGfgCfaUfCfcugguas [invAb] 571 asUfsaCfcAfGfgaugCfcAfauccagasusu 572
D-2135 [磷酸] ucuggauuGfgCfaUfCfcugguas [invAb] 573 asUfsaccaGfgaugCfcAfauccagasusu 574
D-2136 [磷酸] ucuggauuGfgCfaUfCfcugguas [invAb] 575 asUfsaccaGfgaUfgCfcAfauccagasusu 576
D-2137 [磷酸] ggcuguGfuCfUfCfCfuuuuggususu 577 asCfscAfaAfAfggagAfcAfcagccsusu 578
D-2138 [磷酸] ggcuguGfuCfuCfCfuuuuggususu 579 asCfscAfaAfAfggagAfcAfcagccsusu 580
D-2139 [磷酸] ggcuguGfuCfUfCfCfuuuugsgs [invAb] 581 asCfscAfaAfAfggagAfcAfcagccsusu 582
D-2140 [磷酸] ggcuguGfuCfUfCfCfuuuugsgs [invAb] 583 asCfscaaaAfggagAfcAfcagccsusu 584
D-2141 [磷酸] ggcuguGfuCfUfdCCfuuuuggs [invAb] 585 asCfscaaaAfggagAfcAfcagccsusu 586
D-2142 [磷酸] gugcaaGfcUfUfGfGfgugucaususu 587 asUfsgAfcAfCfccaaGfcUfugcacsusu 588
D-2143 [磷酸] gugcaaGfcUfuGfGfgugucaususu 589 asUfsgAfcAfCfccaaGfcUfugcacsusu 590
D-2144 [磷酸] gugcaaGfcUfUfGfGfgugucsas [invAb] 591 asUfsgAfcAfCfccaaGfcUfugcacsusu 592
D-2145 [磷酸] gugcaaGfcUfUfGfGfgugucsas [invAb] 593 asUfsgacaCfccaaGfcUfugcacsusu 594
D-2146 [磷酸] gugcaaGfcUfUfdGGfgugucas [invAb] 595 asUfsgacaCfccaaGfcUfugcacsusu 596
D-2147 [磷酸] ucuggauuGfgGfUfAfCfcugguas [invAb] 597 asUfsaccaGfguacCfcAfauccagasusu 598
D-2148 [磷酸] gccuacAfuGfAfUfCfuucucscsa 599 usGfsgAfgAfAfgaucAfuGfuaggcsusu 600
D-2149 [磷酸] ggcuguGfuGfAfGfCfuuuugsgs [invAb] 601 asCfscaaaAfgcucAfcAfcagccsusu 602
D-2150 [磷酸] gugcaaGfcAfAfCfGfgugucsas [invAb] 603 asUfsgacaCfcguuGfcUfugcacsusu 604
實例 2 ：在 RNA FISH 測定中所選 SCAP siRNA 分子之效力
製備了一組完全化學修飾的siRNA，並在體外測試了mRNA敲減的效能和選擇性。各siRNA雙股體係由兩條股組成，即有義股或‘過客’股及反義股或‘引導’股，並且在實例1中有描述，其中在某些核苷酸的核糖中的天然2'-OH被取代。視需要地，在一條或兩條股上的磷酸二酯核苷酸間鍵被硫代磷酸酯替代，以減少核酸外切酶的降解。
執行了RNA FISH（螢光原位雜交）測定，從而用測試siRNA來測量SCAP mRNA敲減。將Hep3B細胞（購自ATCC）在補充有10%胎牛血清（FBS，西格瑪公司（Sigma））和1%青黴素-鏈黴素（P-S，康寧公司（Corning））的最低必需培養基（MEM，康寧公司））中進行培養。按如下方式執行siRNA轉染：利用BioMek FX（貝克曼庫爾特公司（Beckman Coulter）），將1 μL的測試siRNA和4 μL的普通MEM添加至塗有PDL的CellCarrier-384 Ultra測定板（珀金埃爾默公司（PerkinElmer））中。然後，用Multidrop Combi試劑分配器（賽默飛世爾科技公司（Thermo Fisher Scientific）），將在普通MEM中預稀釋的5 μL的Lipofectamine RNAiMAX（賽默飛世爾科技公司）（在5 μL MEM中0.035 μL的RNAiMAX）分配入測定板中。在將siRNA/RNAiMAX混合物於室溫（RT）下孵化20分鐘後，用Multidrop Combi試劑分配器將30 μL補充有10% FBS和1% P-S的MEM中的Hep3B細胞（2000個細胞/孔）添加至轉染複合體中並將測定板於室溫下放置20分鐘，之後將它們移至孵化器中。將細胞在37°C和5% CO2下孵化72小時。按照製造商的方案（賽默飛世爾科技公司），利用用於液體處理的內部組裝自動FISH測定平台執行ViewRNA ISH細胞測定。簡而言之，將細胞於室溫下在4%甲醛（賽默飛世爾科技公司）中固定15分鐘，於室溫下用洗滌劑透化3分鐘，然後於室溫下用蛋白酶溶液處理10分鐘。將靶特異性探針對（賽默飛世爾科技公司）孵化3小時，同時對於前置放大器、放大器和標記探針（賽默飛世爾科技公司）各自孵化1小時。所有雜交步驟均為在40°C的Cytomat 2 C-LIN自動孵化器（賽默飛世爾科技公司）中執行。在雜交反應後，將細胞用Hoechst和CellMask藍（賽默飛世爾科技公司）染色30分鐘，然後在Opera Phenix（珀金埃爾默公司）上成像。使用哥倫布圖像數據存儲與分析系統（珀金埃爾默公司）對圖像進行分析，以獲得每個細胞的平均斑點計數。利用高（含有磷酸緩衝的鹽水，康寧公司）和低（無靶探針對）對照孔，使斑點計數歸一化。標制針對總siRNA濃度的歸一化值，並將數據擬合至在Genedata篩選儀（基因數據公司（Genedata））中的四參數S形曲線模型，以獲得IC50和最大活性。
Hep3B細胞的RNA FISH測定結果示於表3中。這些值表示SCAP mRNA的敲減。 [表3].對Hep3B細胞進行的RNA FISH測定
雙股體編號 IC50（νM） 最大活性
D-2000 6.05 83
D-2001 0.26 72.8
D-2002 4.4 69.6
D-2003 2.86 81.4
D-2004 4.08 83
D-2005 1.62 84.1
D-2006 7.73 86.2
D-2007 0.91 83.8
D-2008 118 70
D-2009 3.03 86.7
D-2010 12.1 86.2
D-2011 6.71 75.5
D-2012 90.6 80.8
D-2013 1.24 75.1
D-2014 29.8 80.5
D-2015 0.58 72.3
D-2016 2.5 83.2
D-2017 2.32 78
D-2018 14.9 66.8
D-2019 90.9 69.4
D-2020 1.84 77.6
D-2021 20.9 78.4
D-2022 11.8 66
D-2023 79.8 87.8
D-2024 3.25 80.7
D-2025 93.6 79.5
D-2026 6.06 82.4
D-2027 3.36 84.3
D-2028 3.57 78.5
D-2029 3.26 69.7
D-2030 48.1 78.9
D-2031 8.12 85.1
D-2032 74.9 74.8
D-2033 9.28 64.3
D-2034 7.32 71.5
D-2035 4.85 72.9
D-2036 11.2 78.7
D-2037 67.3 80.4
D-2038 10.5 71.4
D-2039 16.3 77.3
實例 3 ：用於測試 SCAP siRNA 序列的緘默效力的體內緘默研究
從查理斯河實驗室（Charles River Laboratories）採購9-10週齡的C57Bl6雄性小鼠，並根據Amgen指南和機構動物護理與使用委員會（IACUC）的方案而收容。根據它們的體重將這些動物隨機分組，並將6隻動物隨機分配至各siRNA觸發序列（trigger sequence）。在第0天，以3 mg/kg體重的劑量，用PBS或者用特定的siRNA化合物，對該群組進行皮下單劑量給藥。在第29天，用CO2使小鼠安樂死，並從每隻動物中收穫肝左葉。將組織切成小塊，並立即在液氮中速凍，以便用於進一步的下游測定。
根據製造商的指導原則，使用TRIzol試劑（英傑公司（Invitrogen））分離出RNA。用DNA酶I（普洛麥格公司（Promega））對2 ug的RNA進行處理，並使用Taqman RNA to CT一步法套組（賽默飛世爾科技公司（Thermo Fischer Scientific））進行定量PCR反應。用於小鼠SCAP和GAPDH的基因特異性Taqman探針被用於對mRNA表現進行定量。將GAPDH用作內部對照。利用來自英傑公司的QuantStudio7柔性即時PCR系統執行qPCR實驗。利用ΔCT方法計算表現水平。
採用與為C57Bl6小鼠所描述方法相同的方法，對來自傑克遜實驗室的9-10週齡Ob/Ob小鼠（在Bl6背景中的Ob/Ob）進行體內篩選。
本文所描述的所有動物實驗均得到Amgen機構動物護理與使用委員會（IACUC）的批准，並根據Guide for the Care and Use of Laboratory Animals [實驗動物的護理與使用指南] 第8版（美國國家研究委員會）進行護理。實驗室動物護理與使用指南更新委員會、美國實驗室動物研究所、和美國國家科學院出版社 (2011) Guide for the care and use of laboratory animals [實驗室動物的護理與使用指南].第8版, 國家科學院出版社, 華盛頓特區。將小鼠在有12小時光照；12小時黑暗週期（0600-1800小時）的22°C ± 2°C空調房內單獨收容。除非另有說明，動物可以自由取得常規制式飲食（chow diet）（（恩維古公司（Envigo），2920X）並經由自動給水系統取得水（反滲透純化）。結束時，在深度麻醉下藉由心臟穿刺採集血液，然後按照實驗室動物護理的評估與認證協會（AAALAC）指南，用輔助物理方法實施安樂死。
將相對敲減的數據示於表4，該表示出了於第25天在3 mg/kg劑量下的相對敲減。SCAP敲減係SCAP mRNA水平降低的百分比。 [表4].第25天SCAP敲減測定
雙股體編號 SCAP敲減（%）
D-2040 74.5
D-2041 69.2
D-2042 66.5
D-2043 66
D-2044 64.8
D-2045 62.6
D-2046 55.9
D-2047 51.7
D-2048 50.2
D-2049 50.2
D-2050 49.3
D-2051 48.5
D-2052 47.4
D-2053 44.5
D-2054 42.4
D-2055 39.4
D-2056 37.1
D-2057 36.5
D-2058 33
D-2059 31.9
D-2060 25.4
D-2061 24.2
D-2062 21.4
D-2063 20.7
D-2064 18.8
D-2065 16.4
D-2066 16.4
D-2067 16.2
D-2068 16.2
D-2069 15.2
D-2070 14.1
D-2071 11.8
D-2072 4.9
D-2073 4.7
D-2074 -3.3
D-2075 -6.8
D-2076 -7.2
D-2077 -15.5
D-2078 -16.7
D-2079 -38.5
實例 4 ：在 RNA FISH 測定中所選 SCAP siRNA 分子的效力
製備了一組完全化學修飾的siRNA，並在體外測試了mRNA敲減的效能和選擇性。各siRNA雙股體係由兩條股組成，即有義股或‘過客’股及反義股或‘引導’股，並且在實例1中有描述，其中在某些核苷酸的核糖中的天然2'-OH被取代。視需要地，在一條或兩條股上的磷酸二酯核苷酸間鍵被硫代磷酸酯替代，以減少核酸外切酶之降解。
按照實例2中所描述的方式執行RNA FISH。將細胞在37°C和5% CO2下孵化72小時。按照製造商的方案（賽默飛世爾科技公司），利用用於液體處理的內部組裝自動FISH測定平台執行ViewRNA ISH細胞測定。簡而言之，將細胞於室溫下在4%甲醛（賽默飛世爾科技公司）中固定15分鐘，於室溫下用洗滌劑透化3分鐘，然後於室溫下用蛋白酶溶液處理10分鐘。將靶特異性探針對（賽默飛世爾科技公司）孵化3小時，同時對於前置放大器、放大器和標記探針（賽默飛世爾科技公司）各自孵化1小時。所有雜交步驟均為在40°C的Cytomat 2 C-LIN自動孵化器（賽默飛世爾科技公司）中執行。在雜交反應後，將細胞用Hoechst和CellMask藍（賽默飛世爾科技公司）染色30分鐘，然後在Opera Phenix（珀金埃爾默公司）上成像。使用哥倫布圖像數據存儲與分析系統（珀金埃爾默公司）對圖像進行分析，以獲得每個細胞的平均斑點計數。利用高（含有磷酸緩衝的鹽水，康寧公司）和低（無靶探針對）對照孔，使斑點計數歸一化。標制針對總siRNA濃度的歸一化值，並將數據擬合至在Genedata篩選儀（基因數據公司（Genedata））中的四參數S形曲線模型，以獲得IC50和最大活性。
示出了Hep3B細胞的RNA FISH測定結果，表5關於雙股體D-2080至D-2109，表6關於觸發子D-2110至D-2124，表7關於觸發子D-2125至D2146。最大活性的負值表示活性的敲減。 [表5].對Hep3B細胞進行的RNA FISH測定
雙股體編號 IC50（nM） 最大活性
D-2080 3.31 -71.4
D-2081 7.39 -81.2
D-2082 2.16 -82.4
D-2083 0.791 -87.4
D-2084 0.524 -90.4
D-2085 2.13 -88.4
D-2086 4.55 -72.6
D-2087 3.27 -90.1
D-2088 1.92 -82.8
D-2089 1.67 -76.8
D-2090 4.43 -77.8
D-2091 1.15 -93.1
D-2092 12.7 -71.8
D-2093 8.21 -83.8
D-2094 2.01 -79.9
D-2095 14.3 -84.6
D-2096 1.63 -84.3
D-2097 4.95 -89.5
D-2098 3.02 -90.8
D-2099 2.17 -79.7
D-2100 0.561 -92.9
D-2101 3.6 -89.0
D-2102 9.75 -77.9
D-2103 6.06 -81.2
D-2104 9.87 -77.4
D-2105 2.04 -83.2
D-2106 1.79 -85.0
D-2107 3.83 -82.8
D-2108 1.06 -89.8
D-2109 0.152 -85.6
[表6].對Hep3B細胞進行的RNA FISH測定
雙股體編號 IC50（nM） 最大活性
D-2110 13.4 -74.1
D-2111 20.8 -73.8
D-2112 9.2 -71.4
D-2113 16.8 -70.2
D-2114 7.81 -80.3
D-2115 11.9 -62
D-2116 31.6 -58.5
D-2117 1.75 -79.6
D-2118 13.4 -66
D-2119 10.7 -65.5
D-2120 2.8 -56.4
D-2121 3.9 -51.7
D-2122 14.2 -67.9
D-2123 4.3 -63.3
D-2124 8.7 -62.2
[表7].對Hep3B細胞進行的RNA FISH測定
雙股體編號 IC50（nM） 最大活性
D-2125 2.77 -63.4
D-2126 5.68 -74.4
D-2127 1.21 -81
D-2128 1.52 -69.1
D-2129 9.21 -90.2
D-2130 0.691 -84.6
D-2131 1.54 -85.4
D-2132 1.5 -83.4
D-2133 4.58 -89.3
D-2134 1.35 -70
D-2135 2.37 -75.4
D-2136 1.22 -71.5
D-2137 2.87 -67.4
D-2138 2.36 -62.4
D-2139 1.46 -68
D-2140 0.942 -71.7
D-2141 0.769 -79.7
D-2142 5.57 -60.9
D-2143 3.5 -64.5
D-2144 3.39 -64.1
D-2145 3.07 -75.3
D-2146 5.77 -72
實例 5 ：對用不穩定鹼基進行修飾的 siRNA 觸發子之篩選
從查理斯河實驗室獲得9-10週齡的C57Bl6/J雄性小鼠，使它們在室內適應。將小鼠稱重並隨機分入8隻動物的組。用SCAP siRNA觸發子，按每千克體重3 mg，對這些動物進行皮下給藥。在即將給藥前，將儲備siRNA化合物在不含鈣和鎂的磷酸酯緩衝液中稀釋（賽默飛世爾科技公司，14190-136）。在siRNA處理後30天，將動物安樂死，並獲得肝臟。將新分離的肝臟左葉立即在液氮中速凍。根據製造商的方案，使用QIAcube HT儀器RNeasy 96 QIAcube HT套組，將30-50 mg肝組織用於分離RNA。用不含RQ1 RNA酶的DNA酶（普洛麥格公司（Promega），M6101）處理2-4 ug RNA。使用在Quant Studio即時PCR機上運行的TaqMan RNA to CT 1步法套組（應用生物系統公司（Applied Biosystems）），對10 ng的DNA酶消化的RNA執行即時qPCR。與PBS（緩衝液對照）組相比，將小鼠SCAP（Mm01250176_m1）和GAPDH（4352932E）的TaqMan探針用於計算SCAP siRNA處理組中SCAP表現的倍數變化。數據係以siRNA處理組相對於PBS組的敲減百分比來表示。測試了具有各種不穩定修飾的5種觸發序列D-2040、D-2041、D-2042、D-2044、和D-2045。不穩定鹼基修飾包括GNA和無鹼基修飾模式。數據示於表8中。在各情況下，與親本觸發子修飾相比，包含不穩定鹼基的修飾模式導致SCAP mRNA表現降低。雙股體顯示有% SCAP敲減。 [表8].具有不穩定鹼基修飾的siRNA中的緘默。
組 雙股體編號 %SCAP敲減
1 D-2040 65.7
2 D-2110 25.6
3 D-2111 45.44
4 D-2112 16.51
5 D-2113 25
6 D-2045 65.83
7 D-2114 38.62
8 D-2115 44.6
9 D-2116 28.37
10 D-2042 64.16
11 D-2117 39.55
12 D-2118 19.95
13 D-2119 21.54
14 D-2041 50.6
15 D-2120 24.31
16 D-2121 31.93
17 D-2044 55.27
18 D-2122 23.31
19 D-2123 29.65
20 D-2124 17.29
實例 6 ： C57Bl6/J 雄性小鼠中 siRNA 觸發子之篩選
另外，用不同的化學修飾方式，對D-2040、D-2045、D-2042、D-2041和D-2044序列進行修飾。將這些經修飾的觸發子與原始觸發子修飾模式進行比較。第1組至第5組包括觸發序列D-2040和修飾模式之變化。第6組至第10組包括觸發序列D-2045和修飾模式之變化。第11組至第15組包括觸發序列D-2042和修飾模式之變化。第16到21組包括觸發序列D-2041和修飾模式之變化。組22至27包括觸發序列D-2044和修飾模式之變化。就體內研究的活體階段而言，從查理斯河實驗室獲得13-15週齡的C57Bl6/J雄性小鼠，並使其在室內適應。將小鼠稱重，並隨機分入各自有8隻動物的組。用SCAP siRNA觸發子，按每千克體重3 mg，對這些動物進行皮下給藥。在給藥前，將儲備siRNA化合物在不含鈣和鎂的磷酸鹽緩衝液（賽默飛世爾科技公司，14190-136）中稀釋。在siRNA處理後30天，將動物安樂死，並獲得肝臟。將新分離的肝臟左葉立即在液氮中速凍。根據製造商的方案，使用QIAcube HT儀器RNeasy 96 QIAcube HT套組，將30-50 mg肝組織用於分離RNA。用不含RQ1 RNA酶的DNA酶（普洛麥格公司（Promega），M6101）處理2-4 ug RNA。使用在Quant Studio即時PCR機上運行的TaqMan RNA to CT 1步法套組（應用生物系統公司（Applied Biosystems）），對10 ng的DNA酶消化的RNA執行即時qPCR。與PBS（緩衝液對照）組相比，將小鼠SCAP（Mm01250176_m1）和GAPDH（4352932E）的TaqMan探針用於計算siRNA處理組中SCAP表現的倍數變化。數據示於表9中，並且表示為siRNA處理組相對於PBS組的敲減百分比。如所示，不同的修飾模式產生不同水平的緘默。 [表9].具有不同修飾模式的siRNA中的緘默。
組 雙股體編號 %緘默
1 D-2042 77.42
2 D-2125 89.01
3 D-2126 86.53
4 D-2127 85.41
5 D-2128 75.89
6 D-2045 79.51
7 D-2129 78.08
8 D-2130 77.45
9 D-2132 79.94
10 D-2131 77.63
11 D-2040 70.64
12 D-2133 65.37
13 D-2134 59.97
14 D-2135 66.46
15 D-2136 62.19
16 D-2041 60.59
17 D-2137 49.87
18 D-2138 47.39
19 D-2139 68.76
20 D-2140 81.5
21 D-2141 71.83
22 D-2044 72.5
23 D-2142 67.22
24 D-2143 69.74
25 D-2144 61.39
26 D-2145 75.35
27 D-2146 60.32
實例 7 ： Ob/Ob 動物中 SCAP 的 siRNA 觸發子緘默
從傑克遜實驗室獲得10-12週齡的雄性B6.V-Lep ob/J（632）小鼠，也稱為Ob/Ob小鼠。在適應後，將這些動物隨機分入n = 8的組。用從以上實例中的篩選實驗鑒定的化學修飾劑修飾的SCAP siRNA觸發子，對小鼠進行處理。按每千克體重3毫克siRNA，對小鼠進行皮下給藥。在siRNA給藥後的20天和30天，將動物處死。在安樂死後，分離肝左葉並立即在液氮中速凍。根據製造商的方案，使用QIAcube HT儀器RNeasy 96 QIAcube HT套組，將30-50 mg肝組織用於分離RNA。用不含RQ1 RNA酶的DNA酶（普洛麥格公司（Promega），M6101）處理2-4 ug RNA。使用在Quant Studio即時PCR機上運行的TaqMan RNA to CT 1步法套組（應用生物系統公司（Applied Biosystems）），對10 ng的DNA酶消化的RNA執行即時qPCR。與PBS（緩衝液對照）組相比，將小鼠SCAP（Mm01250176_m1）和GAPDH（4352932E）的TaqMan探針用於計算siRNA處理組中SCAP表現之倍數變化。數據示於表10中，並且表示為siRNA處理組相對於PBS組的敲減百分比。 [表10]. ob/ob動物中SCAP之siRNA敲減
雙股體編號 第20天收穫%緘默 第30天收穫%緘默
D-2040 80.6 71.0
D-2126 84.4 77.2
D-2140 74.0 60.4
D-2145 80.7 74.5
D-2147 16.4 -21.3
D-2148 8.3 -1.0
D-2149 -5.0 -14.9
D-2150 22.4 -14.6
實例 8 ： SCAP 觸發子之效力研究 效力模型中NASH表型之預防和恢復 1] 胰澱素（AMLN）AMLYN模型
胰澱素肝NASH（AMLN）模型之係週藉由用高脂肪、高膽固醇飲食來飼養從傑克遜實驗室（Jackson Laboratories）品系：B6.V-Lep ob/J（632）所獲得的5齡肥胖雄性小鼠（Ob/Ob）而建立。45%脂肪、36%碳水化合物和2%膽固醇飲食係從恩維古公司獲得，目錄編號：TD170748。用在水中的含有55%果糖和46%葡萄糖的糖溶液替代常規水。將小鼠隨機分入8組，並用觸發子D-2040或觸發子D-2147或PBS進行處理。D-2147是針對觸發子D-2040的種子序列匹配對照，其中核苷酸9至11已被變換。在AMLN飲食的第8週、第10週和第12週，按每千克體重3毫克用Q2D對小鼠進行皮下給藥。在即將給藥前，將儲備siRNA化合物在不含鈣和鎂的磷酸酯緩衝液中稀釋（賽默飛世爾科技公司，14190-136）。在連續SCAP緘默的6週後，在飲食的第14週收穫小鼠。在收穫期間，在用異氟烷執行安樂死後，將肝內葉固定於10%中性緩衝福馬林中。對福馬林溶液固定的內葉做進一步加工，以便根據製造商的說明書利用免疫組織化學法（IHC）獲得蘇木精和曙紅（達科公司（Dako），CS70030-2、CS70130-2）、三色染色和α平滑肌肌動蛋白（aSMA）表現。NASH讀出係激活藉由對纖維化及星狀細胞進行評分而完成，並且該讀出是由委員會認證的病理學家執行。
將肝左葉在液氮中速凍。如在實例7中詳細描述的，對經速凍的組織做進一步加工，以便用於RNA提取及對基因表現的評估。此外，藉由在異丙醇中使50-100 mg的速凍肝組織勻化來測量肝臟甘油三酸酯含量。使樣本勻化並在冰中孵化1小時，然後以10000 rpm旋轉10分鐘。將上清液轉移至清潔的深孔96孔板中。根據製造商的說明書，藉由比色檢定（Infinity甘油三酸酯試劑，賽默飛世爾科技公司，TR22421）並使用標準品（普安特科學公司（Pointe Scientific）T7531-STD）測定甘油三酸酯含量。數據係以每毫克組織甘油三酸酯的毫克數來表示。
在收穫期間捕獲的其他終點包括測量肝臟重量。對全肝重量（克）與終末體重（克）的比率進行分析，以監測肝質量之改變。SCAP緘默抑制PCSK9表現。利用ELISA測定法（R&D系統公司，MPC900）測量作為生物標記物的血清PCSK9水平。
圖1A描繪了作為相對於PBS對照組的倍數變化表示的SCAP mRNA的表現。觸發子D-2040處理組實現約了85%的SCAP緘默（85.3%），而在D-2147處理組中則沒有顯著變化。圖1B示出了觸發子D-2040處理小鼠中的終末肝重量:體重比的顯著下降。圖1C示出了在觸發子D-2040處理小鼠中的肝臟甘油三酸酯降低，而在D-2147治療組中則保持不變。在圖1D中，對血清PCSK9水平進行了測量。高效SCAP緘默顯著地降低血清PCSK9水平。在圖1E和圖1F中示出了纖維化（三色染色）和星狀細胞激活（aSMA免疫組織化學）的病理學讀出。使用觸發子D-2040的SCAP緘默顯著地降低纖維化評分，從而表明NASH結果的改善。統計顯著性係藉由採用鄧尼特多重比較檢驗的單因素ANOVA來測量，其中星號表示調整後的p值（**** p值 ＜ 0.0001.*** p值 ＜ 0.001）。 2] ALIOS模型
美國生活方式誘導的肥胖症候群小鼠模型（ALIOS）也被用於測試SCAP觸發子之效力。用ALIOS飲食來飼養從查理斯河實驗室獲得的5週齡C57Bl6雄性小鼠，該飲食除了膽固醇含量降低外其餘類似於AMLN飲食。ALIOS飲食含有0.2%的膽固醇，並且是從恩維古公司獲得（目錄編號TD130885）。用在水中的含有55%果糖和46%葡萄糖的糖溶液替代常規水。在用ALIOS飲食飼養動物後18週，每兩週按每千克體重3毫克對小鼠皮下給藥達6週。將小鼠隨機分入n = 4-5的組，並用觸發子D-2040、觸發子D-2042或PBS進行處理。在飲食的6個月和SCAP緘默的6週後，收穫小鼠。類似於先前的效力研究，終點分析包括：SCAP信使水平、終末肝重/體重比、肝臟甘油三酸酯水平、血清PCSK9水平和採用三色染色的纖維化病理學讀出、和採用α平滑肌肌動蛋白免疫組織化學染色的星狀細胞激活。
圖2A示出了SCAP mRNA表現。數據是作為相對於PBS組的倍數變化來表示。SCAP觸發子D-2040和D-2042兩者均展現出SCAP mRNA的超過85%的降低。在圖2B中，在用SCAP觸發子D-2040和D-2042處理的組中觀察到終末肝重/體重（LW/BW）比的顯著下降。圖2C示出了不同組中的肝臟甘油三酸酯水平。與緩衝劑對照組相比，SCAP觸發子D-2040和D-2042的投與顯著地降低肝臟甘油三酸酯含量。在圖2D中，使用上述的ELISA套組對血清PCSK9進行了測量。與PBS組相比，SCAP siRNA治療組中的血清PCSK9水平顯著地降低。圖2E和圖2F示出了藉由三色染色所測量的纖維化病理學讀出和表明星狀細胞激活的α平滑肌肌動蛋白免疫染色。任一個讀出均顯示在SCAP緘默後的降低，從而表明在SCAP緘默後NASH表型的恢復。藉由採用鄧尼特多重比較檢驗的單因素ANOVA對統計顯著性進行了測量，其中星號表示調整後的p值（**** p ＜ 0.0001，***p ＜ 0.005，**p ＜ 0.01和*p ＜ 0.05）實例 9 ：利用 DIAMOND 模型測試 SCAP siRNA 治療肝細胞癌之效力
超過50%的肝細胞癌患者患有非酒精性脂肪性肝病。為了測試SCAP siRNA在預防HCC進一步進展中的效力，我們實施了在不使用化學修飾劑的情況下長時間NASH飲食表現出HCC的一個模型。這類模型更好地代表人病理生理學。一個這類模型是非酒精性脂肪性肝病的飲食誘導動物模型（或DIAMOND）。它是使用從C57Bl/6J和1291SvImJ背景中獲得的唯一同系動物品系而建立。從第8週齡開始，用含有0.1%膽固醇的高脂肪、高碳水化合物飲食（來自脂肪的42%千卡）飼養來自此基因間群體的雄性小鼠。另外，飲用水也被高果糖-葡萄糖溶液替代。在此飲食的32週後，該模型發展為HCC。到第51週，DIAMOND模型肝組織展現出大面積的腫瘤和肝細胞內改變的病灶。該模型還具有高度滲透性。為了測試效力，在飲食的第40週投與SCAP siRNA和媒介物對照。按規律間隔向小鼠再次投與媒介物或SCAP siRNA達6-10週，以確保SCAP基因表現降低。終點分析包括對肝細胞腫瘤負荷轉移指數的病理學檢查、利用Ki67表現對腫瘤增殖的評估和利用CD31表現獲得的腫瘤血管生成程度。另外，對qPCR和蛋白質分析進行了評估，以確認靶標和下游通路的高效緘默。實例 10 ：在 HCC 的 Huh-7 肝異種移植模型中對 SCAP siRNA 之評估
利用原位Huh-7肝異種移植模型對SCAP siRNA進行評估。用懸浮於含有33%基質膠（Matrigel）的細胞培養基中的100萬個Huh-7細胞，對6週大的BALB/c無胸腺裸鼠進行肝內注射。隨後，將小鼠分入各組中，以便用媒介物或者SCAP siRNA進行處理。按規律間隔（例如，每兩週）再次投與媒介物或SCAP siRNA，以確保SCAP mRNA的持續降低。在初始媒介物或siRNA處理後的各時間點（例如，第4週），使小鼠安樂死，並且收穫肝臟並固定於4%多聚甲醛中。測量腫瘤負荷，以瞭解SCAP siRNA治療的效力。另外，對qPCR和蛋白質分析進行評估，以確認靶標的高效緘默。
無
[圖1A至圖1F]示出了在採用胰澱素（AMLN）模型的小鼠中SCAP siRNA分子之體內作用；(A) 示出了肝臟SCAP mRNA的表現；(B) 示出了終末期肝重/體重比；(C) 示出了肝臟甘油三酸酯；(D) 示出了血清PCSK9水平；(E) 示出了肝纖維化的病理學讀出；(F) 示出了作為肝星狀細胞激活的標記物之aSMA染色。
[圖2A至圖2F]示出了在採用ALIOS模型的小鼠中SCAP siRNA分子之體內作用；(A) 示出了肝臟SCAP mRNA的表現；(B) 示出了終末期肝重/體重比；(C) 示出了肝臟甘油三酸酯；(D) 示出了血清PCSK9水平；(E) 示出了肝纖維化的病理學讀出；(F) 示出了作為肝星狀細胞激活的標記物之aSMA染色。
無

Claims (39)

  1. 一種包含有義股和反義股的RNAi構建體，其中該反義股包含具有與在表1或表2中所列出的反義序列差異不超過3個核苷酸的至少15個連續核苷酸的區域，並且其中該RNAi構建體抑制SREBP裂解蛋白（SCAP）之激活表現。
  2. 如請求項1所述之RNAi構建體，其中該反義股包含與SCAP mRNA序列互補的區域。
  3. 如上述請求項中任一項所述之RNAi構建體，其中該有義股包含具有與在表1或表2中所列出的反義序列差異不超過3個核苷酸的至少15個連續核苷酸的區域。
  4. 如上述請求項中任一項所述之RNAi構建體，其中該有義股包含與該反義股的序列充分地互補以形成長度為約15至約30個鹼基對的雙股體區的序列。
  5. 如請求項4所述之RNAi構建體，其中該雙股體區之長度為約17至約24個鹼基對。
  6. 如請求項4所述之RNAi構建體，其中該雙股體區之長度為約19至約21個鹼基對。
  7. 如請求項6所述之RNAi構建體，其中該雙股體區之長度為19個鹼基對。
  8. 如請求項4至7中任一項所述之RNAi構建體，其中該有義股和該反義股之長度各自為約15至約30個核苷酸。
  9. 如請求項8所述之RNAi構建體，其中該有義股和該反義股之長度各自為約19至約27個核苷酸。
  10. 如請求項8所述之RNAi構建體，其中該有義股和該反義股之長度各自為約21至約25個核苷酸。
  11. 如請求項8所述之RNAi構建體，其中該有義股和該反義股之長度各自為約21至約23個核苷酸。
  12. 如請求項1至11中任一項所述之RNAi構建體，其中該RNAi構建體包含至少一個平端。
  13. 如請求項1至11中任一項所述的RNAi構建體，其中該RNAi構建體包含具有1-4個未配對核苷酸的至少一 個核苷酸突出端。
  14. 如請求項13所述之RNAi構建體，其中該核苷酸突出端具有2個未配對的核苷酸。
  15. 如請求項13或14所述之RNAi構建體，其中該RNAi構建體在該有義股之3'端、該反義股之'端、或者該有義股和該反義股兩者之3'端包含核苷酸突出端。
  16. 如請求項13至15中任一項所述之RNAi構建體，其中該核苷酸突出端包含5'-UU-3'二核苷酸或5'-dTdT-3'二核苷酸。
  17. 如請求項1至16中任一項所述的RNAi構建體，其中該RNAi構建體包含至少一個經修飾的核苷酸。
  18. 如請求項17所述之RNAi構建體，其中該經修飾的核苷酸係2'-修飾的核苷酸。
  19. 如請求項17所述之RNAi構建體，其中該經修飾的核苷酸係2'-氟修飾的核苷酸、2'-O-甲基修飾的核苷酸、2'-O-甲氧基乙基修飾的核苷酸、2'-O-烯丙基修飾的核苷酸、二環核酸（BNA）、乙二醇核酸、反向鹼基、或其組合。
  20. 如請求項19所述之RNAi構建體，其中該經修飾的核苷酸係2'-O-甲基修飾的核苷酸、2'-O-甲氧基乙基修飾的核苷酸、2'-氟修飾的核苷酸、或其組合。
  21. 如請求項17所述之RNAi構建體，其中在該有義股和該反義股中的全部核苷酸均為經修飾的核苷酸。
  22. 如請求項21所述之RNAi構建體，其中該經修飾的核苷酸係2'-O-甲基修飾的核苷酸、2'-氟修飾的核苷酸、或其組合。
  23. 如請求項1至22中任一項所述之RNAi構建體，其中該RNAi構建體包含至少一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵。
  24. 如請求項23所述之RNAi構建體，其中該RNAi構建體在該反義股之3'端包含兩個連續的硫代磷酸酯核苷酸間鍵。
  25. 如請求項23所述之RNAi構建體，其中該RNAi構建體在該反義股係3'和5'端均包含兩個連續的硫代磷酸酯核苷酸間鍵，並且在該有義股係5'端包含兩個連續的硫代磷酸酯核苷酸間鍵。
  26. 如請求項1至25中任一項所述之RNAi構建體，其中該反義股包含選自在表1或表2中所列出的反義序列的序列。
  27. 如請求項26所述之RNAi構建體，其中該有義股包含選自在表1或表2中所列出的有義序列的序列。
  28. 如請求項1至27中任一項所述的RNAi構建體，其中該RNAi構建體係在表1至表2的任一項中所列出的雙股體化合物中的任一種。
  29. 如請求項1至28中任一項所述之RNAi構建體，其中與SCAP在已經與對照RNAi構建體一起培養的肝細胞中的表現水平相比，在與該RNAi構建體一起培養後該RNAi構建體降低了該SCAP在肝細胞中的表現水平。
  30. 如請求項29所述之RNAi構建體，其中該肝細胞為Hep3B細胞。
  31. 如請求項1至30中任一項所述之RNAi構建體，其中該RNAi構建體在體外在Hep3B細胞中在5 μM下抑制至少10%的SCAP表現。
  32. 如請求項1至30中任一項所述之RNAi構建體，其中該RNAi構建體以小於約1 nM的IC50抑制SCAP在Hep3B細胞中的表現。
  33. 一種藥物組成物，其包含如請求項1至32中任一項所述之RNAi構建體，及藥學上可接受的載體、賦形劑、或稀釋劑。
  34. 一種用於在有需要的患者中降低SCAP表現之方法，其包括向該患者投與如請求項1至32中任一項所述之RNAi構建體。
  35. 如請求項34所述之方法，其中與SCAP在不接受該RNAi構建體的患者中的表現水平相比，在投與該RNAi構建體後的患者中該SCAP在肝細胞中的表現水平降低。
  36. 一種對患有SCAP相關疾病的受試者進行治療的方法，其包括向該受試者投與如請求項1至32中任一項所述之RNAi構建體或者如請求項33所述之藥物組成物。
  37. 如請求項36所述之方法，其中向該受試者投與如請求項1至32中任一項所述之RNAi構建體或者如請求項33所述之藥物組成物導致SCAP基因係表現降低至少約10%。
  38. 如請求項36所述之方法，其中所述疾病選自由以下組成之群組：脂肪肝（脂肪變性）、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、肝硬化、肝臟內脂肪累積、肝臟炎症、肝細胞壞死、肝細胞癌、肝纖維化、肥胖症、心肌梗塞、心臟衰竭、冠狀動脈疾病、高膽固醇血症、或非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）。
  39. 一種包含有義股和反義股的RNAi構建體，其中該反義股包含具有與在表1或表2中所列出的反義序列差異不超過3個核苷酸的至少15個連續核苷酸的區域，該RNAi構建體用於在治療SCAP相關疾病的方法中使用，該方法包括向該受試者投與如請求項1至32中任一項所述之RNAi構建體或者如請求項33所述之藥物組成物。
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