JP2022534402A - ＳＣＡＰ発現を阻害するためのＲＮＡｉコンストラクト及びその使用方法 - Google Patents

ＳＣＡＰ発現を阻害するためのＲＮＡｉコンストラクト及びその使用方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、ＳＣＡＰ遺伝子の発現を引き下げるためのＲＮＡｉコンストラクトに関する。また、そのようなＲＮＡｉコンストラクトを使用して、肝疾患、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を処置又は予防する方法が記載される。

Description

本発明は、ステロール調節要素結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）切断活性化タンパク質（ＳＣＡＰ）の肝臓発現を調節するための組成物及び方法に関する。詳細には、本発明は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介してＳＣＡＰ発現を引き下げるための核酸ベースの治療薬、及びそのような核酸ベースの治療薬を使用して、肝疾患、例えば非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を処置又は予防する方法に関する。
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年５月３０日出願の米国仮特許出願第６２／８５４，４３３号明細書の利益を主張するものであり、この出願は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、様々な肝臓病理を含む、世界中で最も一般的な慢性肝疾患であり、その有病率は過去２０年間で倍増しており、現在では世界人口の約２０％が罹患していると推定される（Ｓａｔｔａｒ ｅｔ ａｌ．（２０１４）ＢＭＪ ３４９：ｇ４５９６；Ｌｏｏｍｂａ ａｎｄ Ｓａｎｙａｌ（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ＆ ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １０（１１）：６８６－６９０；Ｋｉｍ ａｎｄ Ｋｉｍ（２０１７）Ｃｌｉｎ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ １５（４）：４７４－４８５；Ｐｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｄｉｇ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ ４８（３）：３３３－３４２）。ＮＡＦＬＤは、肝臓におけるトリグリセリドの蓄積から始まり、１）著しい飲酒歴がなく、且つ２）他の種類の肝疾患の診断が除外されている個体において、５％を超える肝細胞中に細胞質脂質小滴が存在することによって定義される（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ（２０１６）Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ ２２（３６）：８２２６－３３；Ｒｉｎｅｌｌａ（２０１５）ＪＡＭＡ ３１３（２２）：２２６３－７３；Ｙｋｉ－Ｊａｒｖｉｎｅｎ（２０１６）Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ５９（６）：１１０４－１１）。一部の個体において、脂肪症と呼ばれる肝臓内での異所性脂肪の蓄積が、炎症及び肝細胞損傷をトリガーして、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）と呼ばれるより進行したステージの疾患に至る（Ｒｉｎｅｌｌａ、前掲）。２０１５年の時点で、７５００万～１億人のアメリカ人がＮＡＦＬＤを患っていると予測されている；ＮＡＳＨは、ＮＡＦＬＤ診断のおよそ１０～３０％を占める（Ｒｉｎｅｌｌａ、前掲；Ｙｏｕｎｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ（２０１６）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ６４（５）：１５７７－１５８６）。
ＳＣＡＰ（ＳＲＥＢＰ切断活性化タンパク質）は、ＳＲＥＢＰファミリの転写因子の唯一知られている転写後調節因子である。ＳＲＥＢＰ（ステロール応答要素結合タンパク質）ファミリは、肝臓内での新規の脂質生成及びＴＧ蓄積の調節において、重要な役割を果たす。ＳＲＥＢＰは、ＥＲ内で不活性前駆体として合成される。合成後直ちに、ＳＣＡＰは、ＳＲＥＢＰとの複合体を形成して、ゴルジ小胞へのＳＲＥＢＰの輸送をエスコートする。その後、ＳＲＥＢＰはさらにプロセシングされて、転写因子の活性アミノ末端を放出する。活性ＳＲＥＢＰが、核に転座して、ＳＲＥＢＰ応答要素に結合して、標的遺伝子の転写活性化を駆動する（Ｂｒｏｗｎ，Ｍ．Ｓ．，ａｎｄ Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｌ．（１９９７）Ｃｅｌｌ ８９，３３１－３４０）。ＳＣＡＰの標的サイレンシングが、活性ＳＲＥＢＰのプロセシング及び下流の転写変化を妨げることが提唱されている。
タンパク質のＳＲＥＢＰファミリは、機能は異なるが重複する３つのアイソフォーム、ＳＲＥＢＰ－１ａ、ＳＲＥＢＰ－１ｃ、及びＳＲＥＢＰ－２を含む。ＳＲＥＰＢ－１ｃは、肝臓内で豊富であり、主に脂肪酸及びＴＧの合成を活性化する。ＳＲＥＢＰ－１の生殖細胞系欠損は、ＳＲＥＢＰ－２レベルの付随する増大を示し、これがＳＲＥＢＰ－１の消失を補償する。
ＳＲＥＢＰ－２は、ＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）を活性化することによって、コレステロール生成及びＬＤＬプロセシングを駆動する。また、ＳＲＥＢＰ－２は、分泌タンパク質ＰＣＳＫ９を調節し、これがＬＤＬＲと相互作用してその分解を促進して、コレステロール吸収を引き下げる。ＳＣＡＰ／ＳＲＥＢＰの消失は、ＬＤＬＲのタンパク質レベルを維持する。また、ＳＲＥＢＰ１ｃは、ＰＮＰＬＡ３の唯一知られている転写調節因子である。ＰＮＰＬＡ３多型ｒｓ７３８４０９（Ｉ１４８Ｍ）は、ＮＡＳＨ／ＮＡＦＬＤにとって主要な遺伝的決定因子であり、患者の５０％に存在する。ＳＣＡＰ活性のサイレンシングは、この変異を有する個体に利益を与えることが提唱されている。したがって、ＳＣＡＰ機能を標的とする新規の治療薬が、ＳＣＡＰレベルを引き下げ、且つ非アルコール性脂肪性肝疾患等の肝臓学的疾患を処置する新規のアプローチとなる。
Ｓａｔｔａｒ ｅｔ ａｌ．（２０１４）ＢＭＪ ３４９：ｇ４５９６ Ｌｏｏｍｂａ ａｎｄ Ｓａｎｙａｌ（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ＆ ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １０（１１）：６８６－６９０ Ｋｉｍ ａｎｄ Ｋｉｍ（２０１７）Ｃｌｉｎ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ １５（４）：４７４－４８５ Ｐｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｄｉｇ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ ４８（３）：３３３－３４２） Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ（２０１６）Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ ２２（３６）：８２２６－３３ Ｒｉｎｅｌｌａ（２０１５）ＪＡＭＡ ３１３（２２）：２２６３－７３ Ｙｋｉ－Ｊａｒｖｉｎｅｎ（２０１６）Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ５９（６）：１１０４－１１ Ｙｏｕｎｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ（２０１６）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ６４（５）：１５７７－１５８６ Ｂｒｏｗｎ，Ｍ．Ｓ．，ａｎｄ Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｌ．（１９９７）Ｃｅｌｌ ８９，３３１－３４０
本発明は、ＳＣＡＰ遺伝子を標的化し、且つ肝細胞におけるＳＣＡＰの発現を引き下げるＲＮＡｉコンストラクトの設計及び生成に部分的に基づく。ＳＣＡＰ発現の配列特異的阻害は、例えば、単純性脂肪肝（脂肪症）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変（肝臓の不可逆的な進行した瘢痕）、又はＳＣＡＰ関連肥満といった肝臓関連疾患等のＳＣＡＰ発現と関連する症状を処置又は予防するのに有用である。したがって、一実施形態において、本発明は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含むＲＮＡｉコンストラクトであって、アンチセンス鎖は、ＳＣＡＰ ｍＲＮＡ配列と相補的な配列を有する領域を含む、ＲＮＡｉコンストラクトを提供する。特定の実施形態において、アンチセンス鎖は、表１又は表２に列記されるアンチセンス配列から少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを有する領域を含む。
一部の実施形態において、本明細書中に記載されるＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖は、約１５～約３０塩基対長の二重鎖領域を形成するような、アンチセンス鎖の配列と十分に相補的な配列を含む。これらの、そして他の実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖は、それぞれ約１５～３０ヌクレオチド長である。一部の実施形態において、ＲＮＡｉコンストラクトは、少なくとも１つの平滑末端を含む。他の実施形態において、ＲＮＡｉコンストラクトは、少なくとも１つのヌクレオチドオーバーハングを含む。そのようなヌクレオチドオーバーハングは、少なくとも１～６個の不対ヌクレオチドを含み得、且つセンス鎖の３’末端、アンチセンス鎖の３’末端、又はセンス鎖及びアンチセンス鎖の双方の３’末端に位置し得る。特定の実施形態において、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖の３’末端及びアンチセンス鎖の３’末端に２個の不対ヌクレオチドのオーバーハングを含む。他の実施形態において、ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端に２個の不対ヌクレオチドのオーバーハングを、そしてセンス鎖の３’末端／アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む。
本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、リボース環、核酸塩基、又はホスホジエステル骨格への修飾を有するヌクレオチドを含む１つ以上の修飾ヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態において、ＲＮＡｉコンストラクトは、１つ以上の２’－修飾ヌクレオチドを含む。そのような２’－修飾ヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、二環式核酸（ＢＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、反転塩基（例えば反転アデノシン）、又はそれらの組合せを含み得る。特定の一実施形態において、ＲＮＡｉコンストラクトは、１つ以上の２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、又はそれらの組合せを含む。一部の実施形態において、ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖及びアンチセンス鎖内の全てのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである。
一部の実施形態において、ＲＮＡｉコンストラクトは、ヌクレオチド間又はヌクレオシド間の修飾された結合等の少なくとも１つの骨格修飾を含む。特定の実施形態において、本明細書中に記載されるＲＮＡｉコンストラクトは、少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。特定の実施形態において、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合は、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の３’末端又は５’末端に位置決めされ得る。
一部の実施形態において、本発明のＲＮＡｉコンストラクトのアンチセンス鎖及び／又はセンス鎖は、表１又は表２に列記されるアンチセンス配列及びセンス配列由来の配列を含むか、又はそれからなり得る。特定の実施形態において、ＲＮＡｉコンストラクトは、表１～表２のいずれか１つに列記される二重鎖化合物のいずれか１つであり得る。
図１Ａ～図１Ｆは、アミリン（ＡＭＬＮ）モデルを用いた、マウスにおけるＳＣＡＰ ｓｉＲＮＡ分子のインビボ作用を示す；（Ａ）は、肝臓ＳＣＡＰ ｍＲＮＡの発現を示す；（Ｂ）は、末期の肝臓重量／体重比を示す；（Ｃ）は、肝臓トリグリセリドを示す；（Ｄ）は、血清ＰＣＳＫ９レベルを示す；（Ｅ）は、肝線維症病理リードアウトを示す；（Ｆ）は、肝星細胞活性化のマーカーとしてのａＳＭＡ染色を示す。 図２Ａ～図２Ｆは、ＡＬＩＯＳモデルを用いた、マウスにおけるＳＣＡＰ ｓｉＲＮＡ分子のインビボ作用を示す；（Ａ）は、肝臓ＳＣＡＰ ｍＲＮＡの発現を示す；（Ｂ）は、末期の肝臓重量／体重比を示す；（Ｃ）は、肝臓トリグリセリドを示す；（Ｄ）は、血清ＰＣＳＫ９レベルを示す；（Ｅ）は、肝線維症病理リードアウトを示す；（Ｆ）は、肝星細胞活性化のマーカーとしてのａＳＭＡ染色を示す。
本発明は、ＳＲＥＢＰ切断活性化タンパク質（ＳＣＡＰ）遺伝子の発現を調節するための組成物及び方法に関する。一部の実施形態において、当該遺伝子は、細胞、又は哺乳動物（例えばヒト）等の対象内にあり得る。一部の実施形態において、本発明の組成物は、ＳＣＡＰ ｍＲＮＡを標的化し、且つ細胞又は哺乳動物におけるＳＣＡＰ発現を引き下げるＲＮＡｉコンストラクトを含む。そのようなＲＮＡｉコンストラクトは、例えば、単純性脂肪肝（脂肪症）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変（肝臓の不可逆的な進行した瘢痕）、又はＳＣＡＰ関連肥満等の肝臓関連疾患の種々の形態を処置又は予防するために有用である。
ＮＡＳＨ／ＮＡＦＬＤ患者集団は、ＳＲＥＢＰ１ｃ及びその標的遺伝子の発現及び転写活性の増大を示す（Ｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｈｅｐａｔｏｌ Ｒｅｓ ３８，１１２２－１１２９）。マウス遺伝学及びｓｉＲＮＡ媒介サイレンシングを用いた研究では、ＳＣＡＰ活性の肝臓特異的除去が、野生型、Ｏｂ／Ｏｂマウス、及び高脂肪飼料で育てたハムスターにおいて、肝臓ＴＧ含量を劇的に下げることが示された。これは、ＳＣＡＰサイレンシング後のＶＬＤＬ分泌の引下げ、及び血漿ＴＧレベルの低下が付随する。しかしながら、体重、インスリン、及びグルコースレベルは、不変のままである（Ｍｏｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ １５，２４０－２４６）。より最近の公開されている発見では、マウス、及び脂質異常症のアカゲザルにおけるＳＣＡＰのｓｉＲＮＡサイレンシングが、ＴＧレベルを有意に引き下げることが示された（Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ ５７，２１５０－２１６２；Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ７１，２０２－２１２）。これらの公開された報告に基づいて、発明者らは、ＮＡＳＨ患者におけるｓｉＳＣＡＰの投与が、肝臓脂肪症を和らげて、線維症の更なる進行を予防することとなると仮定した。
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、外来のＲＮＡを細胞中に導入して、標的とするタンパク質をコードするｍＲＮＡの特異的な分解をもたらし、その結果としてタンパク質の発現を低下させるプロセスである。ＲＮＡｉ技術及び肝臓送達の双方における進歩、並びに他のＲＮＡｉベースの治療法による好結果の増大は、ＳＣＡＰを直接的に標的化することによってＮＡＦＬＤを治療的に処置するための説得力のある手段としてのＲＮＡｉを示唆している。これらの配列の阻害効果は、Ｈｅｐ３Ｂ細胞に対するスクリーニングによって確認した。Ｃ５７Ｂｌ６マウスを用いて、発明者らは次に、ＳＣＡＰ ｓｉＲＮＡによる処置がマウスにおいてＳＣＡＰ発現を引き下げることを実証した。
本明細書中で用いられる用語「ＲＮＡｉコンストラクト」は、細胞中に導入された際にＲＮＡ干渉機構を介して標的遺伝子（例えばＳＣＡＰ）の発現を下方制御することができるＲＮＡ分子を含む剤を指す。ＲＮＡ干渉は、核酸分子が、例えばＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）経路を介して、配列特異的な様式で標的ＲＮＡ分子（例えば、メッセンジャーＲＮＡ又はｍＲＮＡ分子）の切断及び分解を誘導するプロセスである。一部の実施形態において、ＲＮＡｉコンストラクトは、ハイブリダイズして二重鎖領域を形成するのに互いに十分に相補的な、連続したヌクレオチドの２本の逆平行鎖を含む二本鎖ＲＮＡ分子を含む。「ハイブリダイズする」又は「ハイブリダイゼーション」は、典型的には２つのポリヌクレオチドにおける相補的な塩基間の水素結合（例えば、ワトソン－クリック、フーグスティーン又は逆フーグスティーン水素結合）を介した、相補的なポリヌクレオチドの対形成を指す。標的配列（例えば標的ｍＲＮＡ）と実質的に相補的な配列を有する領域を含む鎖は、「アンチセンス鎖」と称される。「センス鎖」は、アンチセンス鎖の領域と実質的に相補的な領域を含む鎖を指す。一部の実施形態において、センス鎖は、標的配列と実質的に同一の配列を有する領域を含み得る。
一部の実施形態において、本発明は、ＳＣＡＰに向けられるＲＮＡｉコンストラクトを提供する。一部の実施形態において、本発明は、表１又は表２において見出される配列のいずれかを含有するＲＮＡｉコンストラクトを含む。
二重鎖ＲＮＡ分子は、リボヌクレオチドに対する化学修飾を含んでよく、リボース糖、塩基、又はリボヌクレオチドの骨格構成要素に対する修飾、例えば、本明細書中に記載されるもの又は当該技術において知られているものが挙げられる。二本鎖ＲＮＡ分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ等）に用いられるようなあらゆる修飾が、本開示の目的のための用語「二本鎖ＲＮＡ」によって包含される。
本明細書中で用いられる第１の配列は、生理的条件等のある種の条件下で、第１の配列を含むポリヌクレオチドが、第２の配列を含むポリヌクレオチドにハイブリダイズして二重鎖領域を形成することができるならば、第２の配列に「相補的」である。他のそのような条件は、当業者に知られている中程度の、又はストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を含み得る。第１の配列を含むポリヌクレオチドが、第２の配列を含むポリヌクレオチドと、一方又は双方のヌクレオチド配列の全長にわたって、いかなるミスマッチもなく塩基対形成するならば、第１の配列は、第２の配列と完全に相補的（１００％相補的）であるとみなされる。配列が標的配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％相補的であるならば、配列は、標的配列と「実質的に相補的」である。相補性パーセントは、第２の配列又は標的配列内の対応する位置の塩基と相補的な第１の配列内の塩基の数を、第１の配列の全長で割ることによって算出することができる。２つの配列がハイブリダイズするとき、３０塩基対の二重鎖領域にわたって５、４、３、２、又は１個以下のミスマッチが存在するならば、配列は、もう一方の配列に対して実質的に相補的であると言うこともできる。一般に、本明細書中で定義されるヌクレオチドオーバーハングがいくつ存在するとしても、そのようなオーバーハングの配列は、２つの配列間の相補性の程度の判定において、考慮されない。例として、ハイブリダイズして、各鎖の３’末端にて２ヌクレオチドのオーバーハングを有する１９塩基対の二重鎖領域を形成する、２１ヌクレオチド長のセンス鎖及び２１ヌクレオチド長のアンチセンス鎖は、当該用語が本明細書中で用いられる場合、完全に相補的であるとみなされることとなる。
一部の実施形態において、アンチセンス鎖の領域は、標的ＲＮＡ配列（例えばＳＣＡＰ ｍＲＮＡ）の領域と完全に相補的な配列を含む。そのような実施形態において、センス鎖は、アンチセンス鎖の配列と完全に相補的な配列を含み得る。他のそのような実施形態において、センス鎖は、アンチセンス鎖の配列と実質的に相補的な配列、例えばセンス鎖及びアンチセンス鎖によって形成される二重鎖領域内に１、２、３、４又は５個のミスマッチを有する配列を含んでよい。特定の実施形態において、何らかのミスマッチが末端領域内（例えば、鎖の５’及び／又は３’末端の６、５、４、３、２、又は１ヌクレオチド以内）に生じることが好ましい。一実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖から形成される二重鎖領域内の何らかのミスマッチが、アンチセンス鎖の５’末端の６、５、４、３、２、又は１ヌクレオチド以内に生じる。
特定の実施形態において、二重鎖ＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖は、ハイブリダイズして二重鎖領域を形成するが、そうでなければ分離している（ｕｎｃｏｎｎｅｃｔｅｄ）２つの別個の分子であり得る。２本の別個の鎖から形成されるそのような二重鎖ＲＮＡ分子は、「低分子干渉ＲＮＡ」又は「短い干渉ＲＮＡ」（ｓｉＲＮＡ）と称される。ゆえに、一部の実施形態において、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、ｓｉＲＮＡを含む。
ｄｓＲＮＡの２本の実質的に相補的な鎖が別個のＲＮＡ分子によって構成される場合、それらの分子は、共有結合されている必要はないが、共有結合され得る。２本の鎖が、二重鎖構造を形成する一方の鎖の３’末端と他方の鎖の５’末端との間で、ヌクレオチドの中断されていない鎖以外の手段によって共有結合されている場合、その結合構造は「リンカー」と称される。ＲＮＡ鎖は、同じ数のヌクレオチドを有しても、異なる数のヌクレオチドを有してもよい。二重鎖内の塩基対の最大数は、ｄｓＲＮＡの最短の鎖のヌクレオチドから、二重鎖内に存在するあらゆるオーバーハングを引いた数である。二重鎖構造に加えて、ＲＮＡｉは、１つ以上のヌクレオチドオーバーハングを含んでもよい。
他の実施形態において、ハイブリダイズして二重鎖領域を形成するセンス鎖及びアンチセンス鎖は、単一ＲＮＡ分子の一部であってもよく、すなわち、センス鎖及びアンチセンス鎖は、単一ＲＮＡ分子の自己相補的領域の一部である。そのような場合、単一ＲＮＡ分子は、二重鎖領域（ステム領域とも称される）及びループ領域を含む。センス鎖の３’末端は、不対ヌクレオチドの隣接配列によってアンチセンス鎖の５’末端に連結されて、ループ領域を形成することとなる。ループ領域は、通常、アンチセンス鎖がセンス鎖と塩基対形成して二重鎖又はステム領域を形成することができるように、ＲＮＡ分子がそれ自体で折り返すことを可能にするのに十分な長さのものである。ループ領域は、約３～約２５、約５～約１５、又は約８～約１２個の不対ヌクレオチドを含み得る。少なくとも部分的に自己相補的な領域を有するそのようなＲＮＡ分子は、「短ヘアピンＲＮＡ」（ｓｈＲＮＡ）と称される。一部の実施形態において、ループ領域は、少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、又は２５個の不対ヌクレオチドを含んでよい。一部の実施形態において、ループ領域は、１０、９、８、７、６、５、４、３、２個以下の不対ヌクレオチドを有してよい。特定の実施形態において、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、ｓｈＲＮＡを含む。単一の、少なくとも部分的に自己相補的なＲＮＡ分子の長さは、約３５ヌクレオチド～約１００ヌクレオチド、約４５ヌクレオチド～約８５ヌクレオチド、又は約５０～約６０ヌクレオチドであり得、本明細書中に列挙される長さをそれぞれ有する二重鎖領域及びループ領域を含み得る。
一部の実施形態において、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、ＳＣＡＰメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）配列と実質的に、又は完全に相補的な配列を有する領域を含む。本明細書中で用いられる「ＳＣＡＰ ｍＲＮＡ配列」は、あらゆる種（例えば、マウス、ラット、非ヒト霊長類、ヒト）に由来するＳＣＡＰタンパク質のバリアント又はアイソフォームが挙げられるＳＣＡＰタンパク質をコードする、スプライスバリアントを含むあらゆるメッセンジャーＲＮＡ配列を指す。
また、ＳＣＡＰ ｍＲＮＡ配列は、その相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列として発現される転写物配列を含む。ｃＤＮＡ配列は、ＲＮＡ塩基（例えば、グアニン、アデニン、ウラシル、及びシトシン）ではなく、ＤＮＡ塩基（例えば、グアニン、アデニン、チミン、及びシトシン）として表される、ｍＲＮＡ転写物の配列を指す。ゆえに、本発明のＲＮＡｉコンストラクトのアンチセンス鎖は、標的のＳＣＡＰ ｍＲＮＡ配列又はＳＣＡＰ ｃＤＮＡ配列と実質的に、又は完全に相補的な配列を有する領域を含み得る。ＳＣＡＰ ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ配列として、ヒトＳＣＡＰのＮＣＢＩ参照配列（ＮＭ＿０１２２３５）又はマウスＳＣＡＰのＮＣＢＩ参照配列（ＮＭ＿００１００１１４４）に由来し得るようなあらゆるＳＣＡＰ ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ配列が挙げられ得るが、これらに限定されない。
アンチセンス鎖の領域は、ＳＣＡＰ ｍＲＮＡ配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドと実質的に、又は完全に相補的であり得る。一部の実施形態において、相補性の領域をアンチセンス鎖が含むＳＣＡＰ ｍＲＮＡ配列の標的領域は、約１５～約３０個の連続したヌクレオチド、約１６～約２８個の連続したヌクレオチド、約１８～約２６個の連続したヌクレオチド、約１７～約２４個の連続したヌクレオチド、約１９～約２５個の連続したヌクレオチド、約１９～約２３個の連続したヌクレオチド、又は約１９～約２１個の連続したヌクレオチドに及んでよい。特定の実施形態において、ＳＣＡＰ ｍＲＮＡ配列と実質的に、又は完全に相補的な配列を含むアンチセンス鎖の領域は、一部の実施形態において、表１又は表２に列記されるアンチセンス配列由来の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含み得る。他の実施形態において、アンチセンス配列は、表１又は表２に列記されるアンチセンス配列由来の少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、又は少なくとも１９個の連続したヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、センス配列及び／又はアンチセンス配列は、表１又は表２に列記される配列由来の、１、２、又は３個以下のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも１５個のヌクレオチドを含む。
ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖は典型的に、２本の鎖が生理的条件下でハイブリダイズして二重鎖領域を形成するような、アンチセンス鎖の配列と十分に相補的な配列を含む。「二重鎖領域」は、ワトソン－クリック塩基対形成又は他の水素結合相互作用のいずれかによって互いに塩基対を形成して、２つのポリヌクレオチド間で二重鎖を生成する２つの相補的な、又は実質的に相補的なポリヌクレオチド内の領域を指す。ＲＮＡｉコンストラクトの二重鎖領域は、例えば、Ｄｉｃｅｒ酵素及び／又はＲＩＳＣ複合体を係合させることによって、ＲＮＡｉコンストラクトがＲＮＡ干渉経路に入ることを可能にする十分な長さのものであるべきである。例えば、一部の実施形態において、二重鎖領域は、約１５～約３０塩基対長である。この範囲内の二重鎖領域の他の長さ、例えば約１５～約２８塩基対、約１５～約２６塩基対、約１５～約２４塩基対、約１５～約２２塩基対、約１７～約２８塩基対、約１７～約２６塩基対、約１７～約２４塩基対、約１７～約２３塩基対、約１７～約２１塩基対、約１９～約２５塩基対、約１９～約２３塩基対、又は約１９～約２１塩基対も適している。一実施形態において、二重鎖領域は、約１７～約２４塩基対長である。別の実施形態において、二重鎖領域は、約１９～約２１塩基対長である。
一部の実施形態において、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、標的ＲＮＡ配列、例えば、ＳＣＡＰ標的ｍＲＮＡ配列と相互作用して、標的ＲＮＡの切断を導く約２４～約３０個のヌクレオチドの二重鎖領域を含有する。理論に拘束されるものではないが、細胞中に導入される長い二本鎖ＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒとして知られているＩＩＩ型エンドヌクレアーゼによってｓｉＲＮＡに分解され得る（Ｓｈａｒｐ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：４８５）。Ｄｉｃｅｒ、リボヌクレアーゼＩＩＩ様酵素は、ｄｓＲＮＡをプロセシングして、特徴的な２塩基の３’オーバーハングを有する１９～２３塩基対の短い干渉ＲＮＡにする（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４０９：３６３）。次に、ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）中に組み込まれるが、ここで、１つ以上のヘリカーゼがｓｉＲＮＡ二重鎖を解いて、相補的なアンチセンス鎖が標的認識をガイドすることを可能にする（Ｎｙｋａｎｅｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｃｅｌｌ１０７：３０９）。適切な標的ｍＲＮＡに結合すると直ぐに、ＲＩＳＣ内の１つ以上のエンドヌクレアーゼが標的を切断してサイレンシングを誘導する（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：１８８）。
センス鎖及びアンチセンス鎖が２つの別個の分子である（例えば、ＲＮＡｉコンストラクトがｓｉＲＮＡを含む）実施形態について、センス鎖及びアンチセンス鎖は、二重鎖領域の長さと同じ長さである必要はない。例えば、一方の鎖又は双方の鎖が、二重鎖領域よりも長くてもよく、そして二重鎖領域の側面に位置する１個以上の不対ヌクレオチド又はミスマッチを有してもよい。ゆえに、一部の実施形態において、ＲＮＡｉコンストラクトは、少なくとも１つのヌクレオチドオーバーハングを含む。本明細書中で用いられる「ヌクレオチドオーバーハング」は、不対ヌクレオチド、又は鎖の末端にて二重鎖領域を越えて延在するヌクレオチドを指す。ヌクレオチドオーバーハングは典型的に、一方の鎖の３’末端が他方の鎖の５’末端を越えて延在する場合に、又は一方の鎖の５’末端が他方の鎖の３’末端を越えて延在する場合に生成される。ヌクレオチドオーバーハングの長さは、一般に、１～６ヌクレオチド、１～５ヌクレオチド、１～４ヌクレオチド、１～３ヌクレオチド、２～６ヌクレオチド、２～５ヌクレオチド、又は２～４ヌクレオチドである。一部の実施形態において、ヌクレオチドオーバーハングは、１、２、３、４、５、又は６ヌクレオチドを含む。特定の一実施形態において、ヌクレオチドオーバーハングは、１～４ヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、ヌクレオチドオーバーハングは、２ヌクレオチドを含む。オーバーハングにおけるヌクレオチドは、本明細書中に記載される通りのリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、又は修飾ヌクレオチドであり得る。一部の実施形態において、オーバーハングは、５’－ウリジン－ウリジン－３’（５’－ＵＵ－３’）ジヌクレオチドを含む。そのような実施形態において、ＵＵジヌクレオチドは、リボヌクレオチド又は修飾ヌクレオチド、例えば２’－修飾ヌクレオチドを含んでもよい。他の実施形態において、オーバーハングは、５’－デオキシチミジン－デオキシチミジン－３’（５’－ｄＴｄＴ－３’）ジヌクレオチドを含む。
ヌクレオチドオーバーハングは、一方の鎖又は双方の鎖の５’末端又は３’末端にあってもよい。例えば、一実施形態において、ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の５’末端及び３’末端にヌクレオチドオーバーハングを含む。別の実施形態において、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖の５’末端及び３’末端にヌクレオチドオーバーハングを含む。一部の実施形態において、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖の５’末端及びアンチセンス鎖の５’末端にヌクレオチドオーバーハングを含む。他の実施形態において、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖の３’末端及びアンチセンス鎖の３’末端にヌクレオチドオーバーハングを含む。
ＲＮＡｉコンストラクトは、二重鎖ＲＮＡ分子の一方の末端に単一ヌクレオチドオーバーハングを、そして他方の末端に平滑末端を含み得る。「平滑末端」は、分子の末端にてセンス鎖及びアンチセンス鎖が完全に塩基対形成されており、二重鎖領域を越えて延在する不対ヌクレオチドが存在しないことを意味する。一部の実施形態において、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖の３’末端にヌクレオチドオーバーハングを、そしてセンス鎖の５’末端及びアンチセンス鎖の３’末端に平滑末端を含む。他の実施形態において、ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端にヌクレオチドオーバーハングを、そしてアンチセンス鎖の５’末端及びセンス鎖の３’末端に平滑末端を含む。特定の実施形態において、ＲＮＡｉコンストラクトは、二重鎖ＲＮＡ分子の双方の末端に平滑末端を含む。そのような実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖は、同じ長さを有し、そして二重鎖領域は、センス鎖及びアンチセンス鎖と同じ長さである（すなわち、分子は、その全長にわたって二重鎖である）。
センス鎖及びアンチセンス鎖は、それぞれ独立して、約１５～約３０ヌクレオチド長、約１８～約２８ヌクレオチド長、約１９～約２７ヌクレオチド長、約１９～約２５ヌクレオチド長、約１９～約２３ヌクレオチド長、約２１～約２５ヌクレオチド長、又は約２１～約２３ヌクレオチド長であってよい。特定の実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖は、それぞれ約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、又は約２５ヌクレオチド長である。一部の実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖は、同じ長さを有するが、ＲＮＡｉコンストラクトが２つのヌクレオチドオーバーハングを有するように、これらの鎖よりも短い二重鎖領域を形成する。例えば、一実施形態において、ＲＮＡｉコンストラクトは、（ｉ）それぞれ２１ヌクレオチド長であるセンス鎖及びアンチセンス鎖、（ｉｉ）１９塩基対長である二重鎖領域、並びに（ｉｉｉ）センス鎖の３’末端及びアンチセンス鎖の３’末端の双方にある２個の不対ヌクレオチドのヌクレオチドオーバーハングを含む。別の実施形態において、ＲＮＡｉコンストラクトは、（ｉ）それぞれ２３ヌクレオチド長であるセンス鎖及びアンチセンス鎖、（ｉｉ）２１塩基対長である二重鎖領域、並びに（ｉｉｉ）センス鎖の３’末端及びアンチセンス鎖の３’末端の双方にある２個の不対ヌクレオチドのヌクレオチドオーバーハングを含む。他の実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖は、二本鎖分子のいずれの末端にもヌクレオチドオーバーハングが存在しないように、同じ長さを有し、且つその全長にわたって二重鎖領域を形成する。そのような一実施形態において、ＲＮＡｉコンストラクトは、平滑末端であり、且つ（ｉ）それぞれ２１ヌクレオチド長であるセンス鎖及びアンチセンス鎖、並びに（ｉｉ）２１塩基対長である二重鎖領域を含む。別のそのような実施形態において、ＲＮＡｉコンストラクトは、平滑末端であり、且つ（ｉ）それぞれ２３ヌクレオチド長であるセンス鎖及びアンチセンス鎖、並びに（ｉｉ）２３塩基対長である二重鎖領域を含む。
他の実施形態において、センス鎖又はアンチセンス鎖は、ＲＮＡｉコンストラクトが少なくとも１つのヌクレオチドオーバーハングを含むように、他方の鎖よりも長く、そして２本の鎖は、短い方の鎖の長さに等しい長さを有する二重鎖領域を形成する。例えば、一実施形態において、ＲＮＡｉコンストラクトは、（ｉ）１９ヌクレオチド長であるセンス鎖、（ｉｉ）２１ヌクレオチド長であるアンチセンス鎖、（ｉｉｉ）１９塩基対長の二重鎖領域、及び（ｉｖ）アンチセンス鎖の３’末端にある２個の不対ヌクレオチドの単一ヌクレオチドオーバーハングを含む。別の実施形態において、ＲＮＡｉコンストラクトは、（ｉ）２１ヌクレオチド長であるセンス鎖、（ｉｉ）２３ヌクレオチド長であるアンチセンス鎖、（ｉｉｉ）２１塩基対長の二重鎖領域、及び（ｉｖ）アンチセンス鎖の３’末端にある２個の不対ヌクレオチドの単一ヌクレオチドオーバーハングを含む。
本発明のＲＮＡｉコンストラクトのアンチセンス鎖は、表１若しくは表２に列記されるアンチセンス配列、又はこれらのアンチセンス配列のいずれかのヌクレオチド１～１９若しくは１～２１の配列のいずれか１つの配列を含み得る。表１及び表２に列記されるアンチセンス配列の各々は、２ヌクレオチドオーバーハング配列に加えて、ＳＣＡＰ ｍＲＮＡ配列と相補的な１９個の連続したヌクレオチド（５’末端から数えて最初の１９個のヌクレオチド）の配列を含む。ゆえに、一部の実施形態において、アンチセンス鎖は、ヌクレオチド、例えば、配列番号２～１６０，１６２～３２０、３２２～４６２、又は４６４～６０４の偶数の配列のいずれか１つのヌクレオチド１～１９の配列を含む。一部の実施形態において、センス鎖は、ヌクレオチド、例えば、配列番号１～１５９、１６１～３１９、３２１～４６１、又は４６３～６０３の奇数の配列のいずれか１つのヌクレオチド１～１９の配列を含む。特定の実施形態において、アンチセンス配列は、配列番号８２を有する。特定の実施形態において、アンチセンス配列は、配列番号２４２を有する。特定の実施形態において、アンチセンス配列は、配列番号８４を有する。特定の実施形態において、アンチセンス配列は、配列番号２４４を有する。特定の実施形態において、アンチセンス配列は、配列番号８６を有する。特定の実施形態において、アンチセンス配列は、配列番号２４６を有する。特定の実施形態において、アンチセンス配列は、配列番号８８を有する。特定の実施形態において、アンチセンス配列は、配列番号２４８を有する。特定の実施形態において、アンチセンス配列は、配列番号９０を有する。特定の実施形態において、アンチセンス配列は、配列番号２５０を有する。
修飾ヌクレオチド
本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含んでもよい。「修飾ヌクレオチド」は、ヌクレオシド、核酸塩基、ペントース環、又はホスファート基に対する１つ以上の化学修飾を有するヌクレオチドを指す。本明細書中で用いられる修飾ヌクレオチドは、アデノシン一リン酸、グアノシン一リン酸、ウリジン一リン酸、及びシチジン一リン酸を含有するリボヌクレオチド、並びにデオキシアデノシン一リン酸、デオキシグアノシン一リン酸、デオキシチミジン一リン酸、及びデオキシシチジン一リン酸を含有するデオキシリボヌクレオチドを包含しない。しかしながら、ＲＮＡｉコンストラクトは、修飾ヌクレオチド、リボヌクレオチド、及びデオキシリボヌクレオチドの組合せを含んでもよい。二本鎖ＲＮＡ分子の一方の鎖又は双方の鎖中への修飾ヌクレオチドの組込みは、例えば、ヌクレアーゼ及び他の分解プロセスに対する分子の感受性を低下させることによって、ＲＮＡ分子のインビボ安定性を向上させることができる。また、標的遺伝子の発現を引き下げるためのＲＮＡｉコンストラクトの効力を、修飾ヌクレオチドの組込みによって増強させることができる。
特定の実施形態において、修飾ヌクレオチドは、リボース糖の修飾を有する。これらの糖修飾は、ペントース環の２’及び／又は５’位での修飾、並びに二環式糖修飾を含んでもよい。２’－修飾ヌクレオチドは、Ｈ又はＯＨ以外の置換基を２’位に有するペントース環を有するヌクレオチドを指す。そのような２’修飾として、２’－Ｏ－アルキル（例えば、Ｏ－Ｃ１～Ｃ１０又はＯ－Ｃ１～Ｃ１０置換アルキル）、２’－Ｏ－アリル（Ｏ－ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）、２’－Ｃ－アリル、２’－フルオロ、２’－Ｏ－メチル（ＯＣＨ３）、２’－Ｏ－メトキシエチル（Ｏ－（ＣＨ２）２ＯＣＨ３）、２’－ＯＣＦ３、２’－Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、２’－Ｏ－アミノアルキル、２’－アミノ（例えばＮＨ２）、２’－Ｏ－エチルアミン、及び２’－アジドが挙げられるが、これらに限定されない。ペントース環の５’位での修飾として、５’－メチル（Ｒ又はＳ）、５’－ビニル、及び５’－メトキシが挙げられるが、これらに限定されない。
「二環式糖修飾」は、ペントース環の修飾を指し、この場合、架橋により環の２つの原子を連結して第２の環を形成して、二環式糖構造が生じる。一部の実施形態において、二環式糖修飾は、ペントース環の４’炭素と２’炭素間の架橋を含む。二環式糖修飾を有する糖部分を含むヌクレオチドは、本明細書中で二環式核酸又はＢＮＡと称される。例示的な二環性糖修飾として、α－Ｌ－メチレンオキシ（４’－ＣＨ２－Ｏ－２’）二環性核酸（ＢＮＡ）；β－Ｄ－メチレンオキシ（４’－ＣＨ２－Ｏ－２’）ＢＮＡ（ロックド核酸又はＬＮＡとも称される）；エチレンオキシ（４’－（ＣＨ２）２－Ｏ－２’）ＢＮＡ；アミノオキシ（４’－ＣＨ２－Ｏ－Ｎ（Ｒ）－２’）ＢＮＡ；オキシアミノ（４’－ＣＨ２－Ｎ（Ｒ）－Ｏ－２’）ＢＮＡ；メチル（メチレンオキシ）（４’－ＣＨ（ＣＨ３）－Ｏ－２’）ＢＮＡ（拘束（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ）エチル又はｃＥｔとも称される）；メチレン－チオ（４’－ＣＨ２－Ｓ－２’）ＢＮＡ；メチレン－アミノ（４’－ＣＨ２－Ｎ（Ｒ）－２’）ＢＮＡ；メチル炭素環式（４’－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ３）－２’）ＢＮＡ；プロピレン炭素環式（４’－（ＣＨ２）３－２’）ＢＮＡ；及びメトキシ（エチレンオキシ）（４’－ＣＨ（ＣＨ２ＯＭｅ）－Ｏ－２’）ＢＮＡ（拘束ＭＯＥ又はｃＭＯＥとも称される）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のＲＮＡｉコンストラクト中に組み込んでもよいこれらの、そして他の糖修飾ヌクレオチドが、米国特許第９，１８１，５５１号明細書、米国特許出願公開第２０１６／０１２２７６１号明細書、及びＤｅｌｅａｖｅｙ ａｎｄ Ｄａｍｈａ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１９：９３７－９５４，２０１２に記載されており、これらは、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態において、ＲＮＡｉコンストラクトは、１つ以上の２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、二環式核酸（ＢＮＡ）、グリコール核酸、又はそれらの組合せを含む。特定の実施形態において、ＲＮＡｉコンストラクトは、１つ以上の２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、又はそれらの組合せを含む。特定の一実施形態において、ＲＮＡｉコンストラクトは、１つ以上の２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、又はそれらの組合せを含む。
ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖及びアンチセンス鎖は双方とも、１つ又は複数の修飾ヌクレオチドを含んでもよい。例えば、一部の実施形態において、センス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上の修飾ヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、センス鎖内の全てのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである。一部の実施形態において、アンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上の修飾ヌクレオチドを含む。他の実施形態において、アンチセンス鎖内の全てのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである。特定の他の実施形態において、センス鎖内の全てのヌクレオチド及びアンチセンス鎖内の全てのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである。これらの、そして他の実施形態において、修飾ヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、又はそれらの組合せであってもよい。
一部の実施形態において、センス鎖、アンチセンス鎖、又は双方の鎖におけるアデノシンヌクレオチドの前にある全てのピリミジンヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである。例えば、いずれかの鎖において配列５’－ＣＡ－３’又は５’－ＵＡ－３’が現れる場合、シチジンヌクレオチド及びウリジンヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドであり、好ましくは２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドである。特定の実施形態において、センス鎖内の全てのピリミジンヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド（例えば、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド）であり、そしてアンチセンス鎖内に存在する全ての配列５’－ＣＡ－３’又は５’－ＵＡ－３’の５’ヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド（例えば２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド）である。他の実施形態において、二重鎖領域内の全てのヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドである。そのような実施形態において、修飾ヌクレオチドは、好ましくは、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、又はそれらの組合せである。
ＲＮＡｉコンストラクトがヌクレオチドオーバーハングを含む実施形態において、オーバーハング内のヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、又は修飾ヌクレオチドであってもよい。一実施形態において、オーバーハング内のヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、例えばデオキシチミジンである。別の実施形態において、オーバーハング内のヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドである。例えば、一部の実施形態において、オーバーハング内のヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、又はそれらの組合せである。
また、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、１つ以上の修飾されたヌクレオチド間結合を含んでもよい。本明細書中で用いられる用語「修飾されたヌクレオチド間結合」は、元から存在する３’－５’ホスホジエステル結合以外のヌクレオチド間結合を指す。一部の実施形態において、修飾されたヌクレオチド間結合は、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、アルキルホスホナート（例えば、メチルホスホナート、３’－アルキレンホスホナート）、ホスフィナート、ホスホロアミダート（例えば、３’－アミノホスホロアミダート、及びアミノアルキルホスホロアミダート）、ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、チオノホスホロアミダート、チオノアルキルホスホナート、チオノアルキルホスホトリエステル、及びボラノホスファート等のリン含有ヌクレオチド間結合である。一実施形態において、修飾されたヌクレオチド間結合は、２’－５’ホスホジエステル結合である。他の実施形態において、修飾されたヌクレオチド間結合は、リン非含有ヌクレオチド間結合であるので、修飾されたヌクレオシド間結合と称される場合もある。そのようなリン非含有結合として、モルホリノ結合（一部はヌクレオシドの糖部分から形成される）；シロキサン結合（－Ｏ－Ｓｉ（Ｈ）２－Ｏ－）；スルフィド、スルホキシド及びスルホン結合；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル結合；アルケン含有骨格；スルファマート骨格；メチレンメチルイミノ（－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－Ｏ－ＣＨ２－）及びメチレンヒドラジノ結合；スルホナート及びスルホンアミド結合；アミド結合；並びに混合されたＮ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２構成要素部分を有する他のものが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、修飾されたヌクレオシド間結合は、米国特許第５，５３９，０８２号明細書；米国特許第５，７１４，３３１号明細書；及び米国特許第５，７１９，２６２号明細書に記載されているもの等、ペプチド核酸又はＰＮＡを生成するためのペプチドベースの結合（例えばアミノエチルグリシン）である。本発明のＲＮＡｉコンストラクトにおいて使用され得る他の適切な修飾されたヌクレオチド間結合及びヌクレオシド間結合は、米国特許第６，６９３，１８７号明細書、米国特許第９，１８１，５５１号明細書、米国特許出願公開第２０１６／０１２２７６１号明細書、及びＤｅｌｅａｖｅｙ ａｎｄ Ｄａｍｈａ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１９：９３７－９５４，２０１２に記載されており、これらの文献は全て、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態において、ＲＮＡｉコンストラクトは、１つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。ホスホロチオエートヌクレオチド間結合は、ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖、アンチセンス鎖、又は双方の鎖において存在してもよい。例えば、一部の実施形態において、センス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８個以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。他の実施形態において、アンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８個以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。さらに他の実施形態において、双方の鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８個以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖、アンチセンス鎖、又は双方の鎖の３’末端、５’末端、又は３’末端及び５’末端の双方に、１つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含んでもよい。例えば、特定の実施形態において、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖、アンチセンス鎖、又は双方の鎖の３’末端に約１個～約６個以上（例えば、約１、２、３、４、５、６個以上）の連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。他の実施形態において、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖、アンチセンス鎖、又は双方の鎖の５’末端に約１個～約６個以上（例えば、約１、２、３、４、５、６個以上）の連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。一実施形態において、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖の３’末端に単一のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を、そしてアンチセンス鎖の３’末端に単一のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。別の実施形態において、ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合（すなわち、アンチセンス鎖の３’末端に、第１及び第２のヌクレオチド間結合でのホスホロチオエートヌクレオチド間結合）を含む。別の実施形態において、ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端及び５’末端の双方に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。さらに別の実施形態において、ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端及び５’末端の双方に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を、そしてセンス鎖の５’末端に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。さらに別の実施形態において、ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端及び５’末端の双方に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を、そしてセンス鎖の３’末端及び５’末端の双方に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端及び３’末端の双方に、第１及び第２のヌクレオチド間結合でのホスホロチオエートヌクレオチド間結合、そしてセンス鎖の５’末端及び３’末端の双方に、第１及び第２のヌクレオチド間結合でのホスホロチオエートヌクレオチド間結合）を含む。一方の鎖又は双方の鎖が１つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む実施形態のいずれかにおいて、鎖内の残りのヌクレオチド間結合は、元から存在する３’－５’ホスホジエステル結合であってよい。例えば、一部の実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖の各ヌクレオチド間結合は、ホスホジエステル及びホスホロチオエートから選択され、少なくとも１つのヌクレオチド間結合がホスホロチオエートである。
ＲＮＡｉコンストラクトがヌクレオチドオーバーハングを含む実施形態において、オーバーハング内の不対ヌクレオチドの２つ以上が、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合によって連結されていてよい。特定の実施形態において、アンチセンス鎖及び／又はセンス鎖の３’末端のヌクレオチドオーバーハングにおける全ての不対ヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合によって連結されている。他の実施形態において、アンチセンス鎖及び／又はセンス鎖の５’末端のヌクレオチドオーバーハングにおける全ての不対ヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合によって連結されている。さらに他の実施形態において、あらゆるヌクレオチドオーバーハングにおける全ての不対ヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合によって連結されている。
特定の実施形態において、本発明のＲＮＡｉコンストラクトの鎖の一方又は双方に組み込まれる修飾ヌクレオチドは、核酸塩基（本明細書中で「塩基」とも称される）の修飾を有する。「修飾核酸塩基」又は「修飾塩基」は、天然に存在するプリン塩基であるアデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、並びにピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、及びウラシル（Ｕ）以外の塩基を指す。修飾核酸塩基は、合成的な修飾又は天然に存在する修飾であってもよく、以下に限定されないが、ユニバーサル塩基、５ーメチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン（Ｘ）、ヒポキサンチン（Ｉ）、２－アミノアデニン、６－メチルアデニン、６－メチルグアニン、並びにアデニン及びグアニンの及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２－プロピル並びに他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミン及び２－チオシトシン、５－ハロウラシル及びシトシン、５－プロピニルウラシル及びシトシン、６－アゾウラシル、シトシン及びチミン、５－ウラシル（シュードウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオ、８－チオアルキル、８－ヒドロキシル及び他の８－置換アデニン及びグアニン、５－ハロ、特に５－ブロモ、５－トリフルオロメチル及び他の５－置換ウラシル及びシトシン、７－メチルグアニン及び７－メチルアデニン、８－アザグアニン及び８－アザアデニン、７－デアザグアニン及び７－デアザアデニン並びに３－デアザグアニン及び３－デアザアデニン、並びに脱塩基残基（プリン塩基又はピリミジン塩基を欠いて、リボース糖の位置１にて核酸塩基を欠くアプリン／アピリミジン残基）、並びに反転ヌクレオチド（３’－３’結合を有するヌクレオチドであり、上述のいずれかの反転ヌクレオチドであってよく、反転脱塩基ヌクレオチド及び反転デオキシヌクレオチドが挙げられる）が挙げられる。
一部の実施形態において、修飾塩基は、ユニバーサル塩基である。「ユニバーサル塩基」は、結果として生じる二重鎖領域の二重らせん構造を変えることなく、ＲＮＡ及びＤＮＡ内の元から存在する塩基の全てと塩基対を無差別に形成する塩基類似体を指す。ユニバーサル塩基が当業者に知られており、以下に限定されないが、イノシン、Ｃ－フェニル、Ｃ－ナフチル、及び他の芳香族誘導体、アゾールカルボキサミド、並びに３－ニトロピロール、４－ニトロインドール、５－ニトロインドール、及び６－ニトロインドール等のニトロアゾール誘導体が挙げられる。
本発明のＲＮＡｉコンストラクト中に組み込むことができる他の適切な修飾塩基として、Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．，Ｖｏｌ．１０：２９７－３１０，２０００及びＰｅａｃｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｒｎ．，Ｖｏｌ．７６：７２９５－７３００，２０１１に記載されているものが挙げられ、これらの文献は双方とも、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。当業者であれば、グアニン、シトシン、アデニン、チミン、及びウラシルが、上述の修飾核酸塩基等の他の核酸塩基により、そのような置換核酸塩基を有するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの塩基対形成特性を実質的に変えることなく置換され得ることを十分に認識している。
本発明のＲＮＡｉコンストラクトの一部の実施形態において、センス鎖、アンチセンス鎖、又はアンチセンス鎖及びセンス鎖の双方の５’末端は、ホスファート部分を含む。本明細書中で用いられる用語「ホスファート部分」は、非修飾ホスファート（－Ｏ－Ｐ＝Ｏ）（ＯＨ）ＯＨ）及び修飾ホスファートを含む末端ホスファート基を指す。修飾ホスファートとして、Ｏ及びＯＨ基の１つ以上がＨ、Ｏ、Ｓ、Ｎ（Ｒ）、又はアルキルで置換されており、ＲがＨ、アミノ保護基、又は非置換若しくは置換アルキルであるホスファートが挙げられる。例示的なホスファート部分として、５’－モノホスファート；５’－ジホスファート；５’－トリホスファート；５’－グアノシンキャップ（７－メチル化若しくは非メチル化）；５’－アデノシンキャップ又は他のあらゆる修飾若しくは非修飾ヌクレオチドキャップ構造；５’－モノチオホスファート（ホスホロチオエート）；５’－モノジチオホスファート（ホスホロジチオエート）；５’－アルファ－チオトリホスファート；５’－ガンマ－チオトリホスファート；５’－ホスホロアミダート；５’－ビニルホスファート；５’－アルキルホスホナート（例えば、アルキル＝メチル、エチル、イソプロピル、プロピル等）；及び５’－アルキルエーテルホスホナート（例えば、アルキルエーテル＝メトキシメチル、エトキシメチル等）が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明のＲＮＡｉコンストラクト中に組み込むことができる修飾ヌクレオチドは、本明細書中に記載される複数の化学修飾を有してもよい。例えば、修飾ヌクレオチドは、リボース糖への修飾及び核酸塩基への修飾を有し得る。例として、修飾ヌクレオチドは、２’糖修飾（例えば、２’－フルオロ又は２’－メチル）を含んでもよく、そして修飾塩基（例えば、５－メチルシトシン又はシュードウラシル）を含んでもよい。他の実施形態において、修飾ヌクレオチドは、糖修飾を、５’ホスファートへの修飾と組み合わせて含んでもよく、これは、修飾ヌクレオチドがポリヌクレオチド中に組み込まれた場合に、修飾されたヌクレオチド間結合又はヌクレオシド間結合を生成することとなる。例えば、一部の実施形態において、修飾ヌクレオチドは、糖修飾、例えば、２’－フルオロ修飾、２’－Ｏ－メチル修飾、又は二環式糖修飾、及び５’ホスホロチオエート基を含んでもよい。したがって、一部の実施形態において、本発明のＲＮＡｉコンストラクトの一方の鎖又は双方の鎖は、２’修飾ヌクレオチド又はＢＮＡ及びホスホロチオエートヌクレオチド間結合の組合せを含む。特定の実施形態において、本発明のＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖及びアンチセンス鎖は双方とも、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、及びホスホロチオエートヌクレオチド間結合の組合せを含む。修飾ヌクレオチド及びヌクレオチド間結合を含む例示的なＲＮＡｉコンストラクトを、表２に示す。
ＲＮＡｉコンストラクトの機能
好ましくは、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、細胞内、特に肝細胞内でのＳＣＡＰの発現を引き下げるか、又は阻害する。したがって、一実施形態において、本発明は、細胞を本明細書中に記載されるあらゆるＲＮＡｉコンストラクトと接触させることによって、細胞内でのＳＣＡＰ発現を引き下げる方法を提供する。細胞は、インビトロであってもインビボであってもよい。ＳＣＡＰ発現は、ＳＣＡＰ ｍＲＮＡ、ＳＣＡＰタンパク質、又はＳＣＡＰ発現と関連する別のバイオマーカーの量又はレベルを測定することによって評価することができる。本発明のＲＮＡｉコンストラクトで処理された細胞又は動物におけるＳＣＡＰ発現の引下げは、ＲＮＡｉコンストラクトで処理されていないか又は対照ＲＮＡｉコンストラクトで処理された細胞又は動物におけるＳＣＡＰ発現と比較して判定することができる。例えば、一部の実施形態において、ＳＣＡＰ発現の引下げは、（ａ）本発明のＲＮＡｉコンストラクトで処理された肝細胞におけるＳＣＡＰ ｍＲＮＡの量又はレベルを測定することと、（ｂ）対照ＲＮＡｉコンストラクト（例えば、肝細胞において発現されないＲＮＡ分子に向けられるＲＮＡｉコンストラクト、又はナンセンス配列若しくはスクランブル配列を有するＲＮＡｉコンストラクト）で、又はコンストラクトなしで処理された肝細胞におけるＳＣＡＰ ｍＲＮＡの量又はレベルを測定することと、（ｃ）（ａ）において処理された細胞由来の測定されたＳＣＡＰ ｍＲＮＡレベルを、（ｂ）における対照細胞由来の測定されたＳＣＡＰ ｍＲＮＡレベルと比較することとによって評価される。処理された細胞及び対照細胞におけるＳＣＡＰ ｍＲＮＡレベルは、比較前に、対照遺伝子（例えば、１８Ｓ リボソームＲＮＡ）について、ＲＮＡレベルに関して正規化されてもよい。ＳＣＡＰ ｍＲＮＡレベルは、ノーザンブロット分析、ヌクレアーゼプロテクションアッセイ、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、逆転写酵素（ＲＴ）－ＰＣＲ、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ、及び定量ＰＣＲが挙げられる種々の方法によって測定することができる。
他の実施形態において、ＳＣＡＰ発現の引下げは、（ａ）本発明のＲＮＡｉコンストラクトで処理された肝細胞におけるＳＣＡＰタンパク質の量又はレベルを測定することと、（ｂ）対照ＲＮＡｉコンストラクト（例えば、肝細胞において発現されないＲＮＡ分子に向けられるＲＮＡｉコンストラクト、又はナンセンス配列若しくはスクランブル配列を有するＲＮＡｉコンストラクト）で、又はコンストラクトなしで処理された肝細胞におけるＳＣＡＰタンパク質の量又はレベルを測定することと、（ｃ）（ａ）において処理された細胞由来の測定されたＳＣＡＰのタンパク質レベルを、（ｂ）における対照細胞由来の測定されたＳＣＡＰタンパク質レベルと比較することとによって評価される。ＳＣＡＰタンパク質レベルを測定する方法が、当業者に知られており、ウエスタンブロット、イムノアッセイ（例えばＥＬＩＳＡ）、及びフローサイトメトリが挙げられる。実施例３は、ＲＮＡ ＦＩＳＨを使用してＳＣＡＰ ｍＲＮＡを測定する例示的な方法を記載する。ＳＣＡＰ ｍＲＮＡ又はタンパク質を測定することができるあらゆる方法を使用して、本発明のＲＮＡｉコンストラクトの有効性を評価することができる。
一部の実施形態において、ＳＣＡＰ発現レベルを評価するための方法は、ＳＣＡＰを自然に発現する細胞（例えば肝細胞）又はＳＣＡＰを発現するように操作された細胞においてインビトロで実施される。特定の実施形態において、当該方法は、肝細胞においてインビトロで実施される。適切な肝細胞として、初代肝細胞（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、又は齧歯類の肝細胞）、ＨｅｐＡＤ３８細胞、ＨｕＨ－６細胞、ＨｕＨ－７細胞、ＨｕＨ－５－２細胞、ＢＮＬＣＬ２細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞、又はＨｅｐＧ２細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
他の実施形態において、ＳＣＡＰ発現レベルを評価する方法は、インビボで実施される。ＲＮＡｉコンストラクト及び何らかの対照ＲＮＡｉコンストラクトを、動物（例えば、齧歯類又は非ヒト霊長類）に投与して、ＳＣＡＰ ｍＲＮＡ又はタンパク質レベルを、処理後の動物から収穫した肝臓組織において評価することができる。代わりに、又は加えて、ＳＣＡＰ発現と関連するバイオマーカー又は機能表現型を、処理した動物において評価することができる。
特定の実施形態において、ＳＣＡＰの発現は、本発明のＲＮＡｉコンストラクトによって、肝細胞内で少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、又は少なくとも５０％引き下げられる。一部の実施形態において、ＳＣＡＰの発現は、本発明のＲＮＡｉコンストラクトによって、肝細胞内で少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、又は少なくとも８５％引き下げられる。他の実施形態において、ＳＣＡＰの発現は、本発明のＲＮＡｉコンストラクトによって、肝細胞内で約９０％以上、例えば９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上引き下げられる。ＳＣＡＰ発現の引下げパーセントは、本明細書中に記載される方法のいずれか、及び当該技術において知られている他の方法によって測定することができる。例えば、特定の実施形態において、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、実施例２及び４に記載されるように、Ｈｅｐ３Ｂ細胞（野生型ＳＣＡＰを含有する）内で、ＳＣＡＰ発現の少なくとも４５％をインビトロ阻害する。関連する実施形態において、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、実施例２及び４に記載されるように、Ｈｅｐ３Ｂ細胞内で、ＳＣＡＰ発現の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、又は少なくとも７５％をインビトロ阻害する。他の実施形態において、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、実施例２及び４に記載されるように、Ｈｅｐ３Ｂ細胞内で、ＳＣＡＰ発現の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、又は少なくとも９８％をインビトロ阻害する。特定の実施形態において、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、実施例に記載されるように、Ｃ５７Ｂｌ６マウス肝臓内で、ＳＣＡＰ発現の少なくとも４５％を阻害する。関連する実施形態において、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、実施例に記載されるように、Ｃ５７Ｂｌ６マウス肝臓内で、ＳＣＡＰ発現の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、又は少なくとも７５％を阻害する。他の実施形態において、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、実施例に記載されるように、Ｃ５７Ｂｌ６マウス肝臓内で、ＳＣＡＰ発現の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、又は少なくとも９８％を阻害する。ＳＣＡＰの引下げは、実施例２及び４に記載されるＲＮＡ ＦＩＳＨ若しくはドロップレットデジタルＰＣＲ、又は実施例３、５、６、７、及び８に記載されるインビトロ研究が挙げられる種々の技術を使用して、測定することができる。
一部の実施形態において、ＩＣ５０値を算出して、肝細胞内でのＳＣＡＰ発現の阻害について、本発明のＲＮＡｉコンストラクトの効力を評価する。「ＩＣ５０値」は、生物学的又は生化学的機能の５０％阻害を達成するのに必要とされる用量／濃度である。特定のあらゆる物質又はアンタゴニストのＩＣ５０値は、あらゆるアッセイにおいて、用量反応曲線を構築して、発現レベル又は機能活性に及ぼす、異なる濃度の物質又はアンタゴニストの作用を試験することによって求めることができる。最大の生物学的応答又は本来の発現レベルの半分を阻害するのに必要とされる濃度を求めることによって、所与のアンタゴニスト又は物質についてＩＣ５０値を算出することができる。ゆえに、実施例に記載されるイムノアッセイ又はＲＮＡ ＦＩＳＨアッセイ又はドロップレットデジタルＰＣＲアッセイ等のあらゆるアッセイにおいて、肝細胞における本来のＳＣＡＰの発現レベル（例えば、対照肝細胞内でのＳＣＡＰの発現レベル）の半分を阻害するのに必要とされるＲＮＡｉコンストラクトの濃度を求めることによって、あらゆるＲＮＡｉコンストラクトについてＩＣ５０値を算出することができる。本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、約１００ｎＭ未満のＩＣ５０で肝細胞（例えばＨｅｐ３Ｂ細胞）内でのＳＣＡＰ発現を阻害し得る。例えば、ＲＮＡｉコンストラクトは、約０．００１ｎＭ～約１００ｎＭ、約０．００１ｎＭ～約２０ｎＭ、約０．００１ｎＭ～約１０ｎＭ、約０．００１ｎＭ～約５ｎＭ、約０．００１ｎＭ～約１ｎＭ、約０．１ｎＭ～約１０ｎＭ、約０．１ｎＭ～約５ｎＭ、又は約０．１ｎＭ～約１ｎＭのＩＣ５０で肝細胞内でのＳＣＡＰ発現を阻害する。特定の実施形態において、ＲＮＡｉコンストラクトは、約１ｎＭ～約１０ｎＭのＩＣ５０で肝細胞（例えばＨｅｐ３Ｂ細胞）内でのＳＣＡＰ発現を阻害する。特定の実施形態において、ＲＮＡｉコンストラクトは、約０．１ｎＭ～約５ｎＭのＩＣ５０で肝細胞（例えばＨｅｐ３Ｂ細胞）内でのＳＣＡＰ発現を阻害する。本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、約２０ｎＭ未満のＩＣ５０で肝細胞（例えばＨｅｐ３Ｂ細胞）内でのＳＣＡＰ発現を阻害し得る。例えば、ＲＮＡｉコンストラクトは、約０．００１ｎＭ～約２０ｎＭ、約０．００１ｎＭ～約１０ｎＭ、約０．００１ｎＭ～約５ｎＭ、約０．００１ｎＭ～約１ｎＭ、約０．１ｎＭ～約１０ｎＭ、約０．１ｎＭ～約５ｎＭ、又は約０．１ｎＭ～約１ｎＭのＩＣ５０で肝細胞内でのＳＣＡＰ発現を阻害する。特定の実施形態において、ＲＮＡｉコンストラクトは、約１ｎＭ～約１０ｎＭのＩＣ５０で肝細胞（例えばＨｅｐ３Ｂ細胞）内でのＳＣＡＰ発現を阻害する。
一部の実施形態において、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、例えば実施例８に記載されるｏｂ／ｏｂマウスにおいて、インビボＳＣＡＰサイレンシングが長期間であり得る。一部の実施形態において、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、実施例８に記載されるように、ｏｂ／ｏｂマウスにおけるコンストラクトの投与の２０日後にて、ＳＣＡＰ発現の少なくとも５０％、少なくとも７０％、又は少なくとも８０％をサイレンシングさせ得る。一部の実施形態において、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、実施例８に記載されるように、ｏｂ／ｏｂマウスにおけるコンストラクトの投与の３０日後にて、ＳＣＡＰ発現の少なくとも５０％、少なくとも６０％、又は少なくとも７０％をサイレンシングさせ得る。
本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、当該技術において知られている技術を用いて、例えば従来の核酸固相合成を用いて容易に作製することができる。ＲＮＡｉコンストラクトのポリヌクレオチドは、標準のヌクレオチド又はヌクレオシド前駆体（例えばホスホラミダイト）を利用する適切な核酸シンセサイザで構築することができる。自動核酸シンセサイザが、いくつかのベンダーによって市販されており、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）のＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザ、ＢｉｏＡｕｔｏｍａｔｉｏｎ（Ｉｒｖｉｎｇ，ＴＸ）のＭｅｒＭａｄｅシンセサイザ、及びＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）のＯｌｉｇｏＰｉｌｏｔシンセサイザが挙げられる。
リボヌクレオシドの５’位にて酸解離性ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）と共に２’シリル保護基を使用して、ホスホラミダイト化学を介してオリゴヌクレオチドを合成することができる。最終脱保護条件は、ＲＮＡ産物を著しく分解しないことが知られている。全ての合成は、大規模、中規模、又は小規模で、あらゆる自動シンセサイザ又は手動シンセサイザで行うことができる。また、合成は、複数のウェルプレート、カラム、又はスライドガラスにおいて実行することができる。
２’－Ｏ－シリル基は、フッ化物イオンへの曝露を介して除去することができ、フッ化物イオンとして、フッ化物イオンのあらゆる源、例えば無機対イオンと対形成されるフッ化物イオンを含有する塩、例えばフッ化セシウム及びフッ化カリウム、又は有機対イオンと対形成されるフッ化物イオンを含有する塩、例えばフッ化テトラアルキルアンモニウムが挙げられ得る。クラウンエーテル触媒を、脱保護反応において無機フッ化物と組み合わせて利用してもよい。好ましいフッ化物イオン源は、フッ化テトラブチルアンモニウム又はアミンヒドロフルオリド（例えば、双極性非プロトン溶媒、例えばジメチルホルムアミド中で水性ＨＦをトリエチルアミンと組み合わせる）である。
亜リン酸トリエステル及びホスホトリエステルに対して使用するための保護基の選択により、フッ化物に対するトリエステルの安定性を変えることができる。ホスホトリエステル又は亜リン酸トリエステルのメチル保護は、フッ化物イオンに対する結合を安定化させ、且つプロセス収率を向上させることができる。
リボヌクレオシドは、反応性の２’ヒドロキシル置換基を有するので、ＲＮＡ内の反応性の２’位を、５’－Ｏ－ジメトキシトリチル保護基に対して直交性である保護基、例えば酸による処理に対して安定であるもので保護することが望ましい場合がある。シリル保護基は、この条件を満たし、そして最終のフッ化物脱保護工程において容易に除去することができ、これにより最小のＲＮＡ分解をもたらすことができる。
テトラゾール触媒を、標準的なホスホラミダイトカップリング反応に用いてもよい。好ましい触媒の例として、テトラゾール、Ｓ－エチル－テトラゾール、ベンジルチオテトラゾール、ｐ－ニトロフェニルテトラゾールが挙げられる。
当業者によって理解され得るように、本明細書中に記載されるＲＮＡｉコンストラクトを合成する更なる方法が、当業者に明らかであろう。加えて、種々の合成工程を、代替のシークエンス又は順序で実施して、所望の化合物を得てもよい。本明細書中に記載されるＲＮＡｉコンストラクトの合成に有用な他の合成化学転換、保護基（例えば、塩基上に存在するヒドロキシル、アミノ等のための）、及び保護基の方法論（保護及び脱保護）が、当該技術において知られており、例として、Ｒ．Ｌａｒｏｃｋ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９８９）；Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｄ．Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９１）；Ｌ．Ｆｉｅｓｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｆｉｅｓｅｒ，Ｆｉｅｓｅｒ ａｎｄ Ｆｉｅｓｅｒ’ｓ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９４）；及びＬ．Ｐａｑｕｅｔｔｅ，ｅｄ．，Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９５）、並びにそれらの後続版に記載されるものが挙げられる。また、ＲＮＡｉコンストラクトのカスタム合成も、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｉｎｃ．（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＣＯ）、ＡｘｏＬａｂｓ ＧｍｂＨ（Ｋｕｌｍｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）及びＡｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）が挙げられるいくつかの民間のベンダーから利用可能である。
本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、リガンドを含み得る。本明細書中で用いられる「リガンド」は、別の化合物又は分子と直接的又は間接的に相互作用することができるあらゆる化合物又は分子を指す。別の化合物又は分子とのリガンドの相互作用は、生物学的応答を誘発し得る（例えば、シグナル伝達カスケードを惹起する、受容体媒介性のエンドサイトーシスを誘導する）か、又はまさに物理的会合であり得る。リガンドは、結合する二重鎖ＲＮＡ分子の１つ以上の特性、例えば、ＲＮＡ分子の薬力学、薬物動態、結合、吸収、細胞分布、細胞取込み、電荷、及び／又はクリアランス特性を改変することができる。
リガンドは、血清タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン、低密度リポタンパク質、グロブリン）、コレステロール部分、ビタミン（ビオチン、ビタミンＥ、ビタミンＢ１２）、葉酸部分、ステロイド、胆汁酸（例えばコール酸）、脂肪酸（例えば、パルミチン酸、ミリスチン酸）、炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン、又はヒアルロン酸）、グリコシド、リン脂質、又は抗体若しくはその結合断片（例えば、肝臓等の特定の細胞型に対してＲＮＡｉコンストラクトを標的化する抗体又は結合断片）を含み得る。リガンドの他の例として、色素、挿入剤（例えばアクリジン）、架橋剤（例えば、プソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ、親油性分子、例えばアダマンタン酢酸、１－ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３－ビスＯ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３－プロパンジオール、ヘプタデシル基、０３－（オレオイル）リトコール酸、０３－（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル又はフェノキサジン）、ペプチド（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド、ＲＧＤペプチド）、アルキル化剤、ポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えばＰＥＧ－４０Ｋ）、ポリアミノ酸、及びポリアミン（例えば、スペルミン、スペルミジン）が挙げられる。
特定の実施形態において、リガンドは、エンドソーム溶解（ｅｎｄｏｓｏｍｏｌｙｔｉｃ）特性を有する。エンドソーム溶解リガンドは、エンドソームの溶解及び／又は本発明のＲＮＡｉコンストラクト若しくはその構成要素の、エンドソームから細胞の細胞質への輸送を促進する。エンドソーム溶解リガンドは、ｐＨ依存性膜活性及び膜融合性を示すポリカチオンペプチド又はペプチド模倣体であり得る。一実施形態において、エンドソーム溶解リガンドは、エンドソームのｐＨにて、その活性型コンフォメーションをとる。「活性型」コンフォメーションは、エンドソーム溶解リガンドが、エンドソームの溶解及び／又は本発明のＲＮＡｉコンストラクト若しくはその構成要素の、エンドソームから細胞の細胞質への輸送を促進するコンフォメーションである。例示的なエンドソーム溶解リガンドとして、ＧＡＬＡペプチド（Ｓｕｂｂａｒａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２６：２９６４－２９７２，１９８７）、ＥＡＬＡペプチド（Ｖｏｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｒｎ．Ｓｏｃ．，Ｖｏｌ．１１８：１５８１－１５８６，１９９６）、及びそれらの誘導体（Ｔｕｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，Ｖｏｌ．１５５９：５６－６８，２００２）が挙げられる。一実施形態において、エンドソーム溶解構成要素は、ｐＨの変化に応答して電荷又はプロトン化の変化を起こすこととなる化学基（例えばアミノ酸）を含有し得る。エンドソーム溶解構成要素は、直鎖状又は分枝状であり得る。
一部の実施形態において、リガンドは、脂質又は他の疎水性分子を含む。一実施形態において、リガンドは、コレステロール部分又は他のステロイドを含む。コレステロールコンジュゲート型オリゴヌクレオチドは、その非コンジュゲート型対応物よりも活性であると報告されている（Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｖｏｌ．１２：１０３－２２８，２００２）。核酸分子へのコンジュゲーションのためのコレステロール部分及び他の脂質を含むリガンドは、米国特許第７，８５１，６１５号明細書；米国特許第７，７４５，６０８号明細書；及び米国特許第７，８３３，９９２号明細書にも記載されており、これらの特許は全て、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。別の実施形態において、リガンドは、フォラート部分を含む。フォラート部分とコンジュゲートしたポリヌクレオチドは、受容体媒介性のエンドサイトーシス経路を介して、細胞によって取り込まれ得る。そのようなフォラート－ポリヌクレオチドコンジュゲートは、米国特許第８，１８８，２４７号明細書に記載されており、この特許は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
ＳＣＡＰが肝細胞（ｌｉｖｅｒ ｃｅｌｌ）（例えば肝細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ））において発現されることを考慮すると、特定の実施形態において、当該肝細胞にＲＮＡｉコンストラクトを特異的に送達することが望ましい。一部の実施形態において、ＲＮＡｉコンストラクトは、肝細胞の表面上に発現されるタンパク質と結合又は相互作用するリガンドを採用することによって、肝臓に特異的に標的化され得る。例えば、特定の実施形態において、リガンドは、肝細胞上で発現される受容体に特異的に結合する抗原結合タンパク質（例えば、抗体又はその結合断片（例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ））を含んでもよい。
特定の実施形態において、リガンドは、炭水化物を含む。「炭水化物」は、少なくとも６個の炭素原子（直鎖状、分枝状、又は環状であり得る）を有し、各炭素原子に酸素、窒素、又は硫黄原子が結合されている１つ以上の単糖単位で構成される化合物を指す。炭水化物として、糖（例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、及び約４、５、６、７、８、又は９個の単糖単位を含有するオリゴ糖）並びに多糖、例えば、デンプン、グリコーゲン、セルロース、及び多糖類ガムが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態において、リガンド中に組み込まれる炭水化物は、ペントース、ヘキソース、又はヘプトースから選択される単糖、並びにそのような単糖単位を含む二糖及び三糖である。他の実施形態において、リガンド中に組み込まれる炭水化物は、ガラクトサミン、グルコサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、及びＮ－アセチルグルコサミン等のアミノ糖である。
一部の実施形態において、リガンドは、ヘキソース又はヘキソサミンを含む。ヘキソースは、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、又はフルクトースから選択され得る。ヘキソサミンは、フルクトサミン、ガラクトサミン、グルコサミン、又はマンノサミンから選択され得る。特定の実施形態において、リガンドは、グルコース、ガラクトース、ガラクトサミン、又はグルコサミンを含む。一実施形態において、リガンドは、グルコース、グルコサミン、又はＮ－アセチルグルコサミンを含む。別の実施形態において、リガンドは、ガラクトース、ガラクトサミン、又はＮ－アセチル－ガラクトサミンを含む。特定の実施形態において、リガンドは、Ｎ－アセチル－ガラクトサミンを含む。グルコース、ガラクトース、及びＮ－アセチル－ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を含むリガンドは、化合物を肝細胞に標的化するのに特に有効である。例えば、Ｄ’Ｓｏｕｚａ ａｎｄ Ｄｅｖａｒａｊａｎ，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｖｏｌ．２０３：１２６－１３９，２０１５参照。本発明のＲＮＡｉコンストラクト中に組み込むことができるＧａｌＮＡｃ含有リガンド又はガラクトース含有リガンドの例が、米国特許第７，４９１，８０５号明細書；米国特許第８，１０６，０２２号明細書；及び米国特許第８，８７７，９１７号明細書；米国特許出願公開第２００３０１３０１８６号明細書；並びに国際公開第２０１３１６６１５５号パンフレットに記載されており、これらは全て、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態において、リガンドは、多価炭水化物部分を含む。本明細書中で用いられる「多価炭水化物部分」は、他の分子と独立して結合又は相互作用することができる２つ以上の炭水化物単位を含む部分を指す。例えば、多価炭水化物部分は、２つ以上の異なる分子、又は同じ分子上の２つ以上の異なる部位に結合することができる、炭水化物で構成された２つ以上の結合ドメインを含む。炭水化物部分の価数は、炭水化物部分内の個々の結合ドメインの数を意味する。例えば、炭水化物部分に関する用語「一価」、「二価」、「三価」、及び「四価」は、それぞれ１、２、３、及び４個の結合ドメインを有する炭水化物部分を指す。多価炭水化物部分は、多価ラクトース部分、多価ガラクトース部分、多価グルコース部分、多価Ｎ－アセチル－ガラクトサミン部分、多価Ｎ－アセチル－グルコサミン部分、多価マンノース部分、又は多価フコース部分を含み得る。一部の実施形態において、リガンドは、多価ガラクトース部分を含む。他の実施形態において、リガンドは、多価Ｎ－アセチル－ガラクトサミン部分を含む。これらの、そして他の実施形態において、多価炭水化物部分は、二価、三価、又は四価である。そのような実施形態において、多価炭水化物部分は、二本鎖又は三本鎖であり得る。特定の一実施形態において、多価Ｎ－アセチル－ガラクトサミン部分は、三価又は四価である。別の特定の実施形態において、多価ガラクトース部分は、三価又は四価である。本発明のＲＮＡｉコンストラクト中への組込みのための例示的な三価又は四価のＧａｌＮＡｃ含有リガンドを、以下に詳述する。
リガンドは、ＲＮＡｉコンストラクトのＲＮＡ分子に直接的又は間接的に結合又はコンジュゲートされていてよい。例えば、一部の実施形態において、リガンドは、ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖又はアンチセンス鎖に共有結合的に直接結合される。他の実施形態において、リガンドは、ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖又はアンチセンス鎖にリンカーを介して共有結合的に結合される。リガンドは、本発明のＲＮＡｉコンストラクトのポリヌクレオチド（例えば、センス鎖又はアンチセンス鎖）の核酸塩基、糖部分、又はヌクレオチド間結合に結合されていてよい。プリン核酸塩基又はその誘導体へのコンジュゲーション又は結合が、環内及び環外の原子が挙げられるあらゆる位置にて起こってよい。特定の実施形態において、プリン核酸塩基の２位、６位、７位、又は８位が、リガンドに結合される。また、ピリミジン核酸塩基又はその誘導体へのコンジュゲーション又は結合が、あらゆる位置にて起こってよい。一部の実施形態において、ピリミジン核酸塩基の２位、５位、及び６位が、リガンドに結合されてよい。ヌクレオチドの糖部分へのコンジュゲーション又は結合が、あらゆる炭素原子にて起こってよい。リガンドに結合され得る糖部分の例示的な炭素原子として、２’、３’、及び５’の炭素原子が挙げられ得る。塩基性残基等において、１’位もまた、リガンドに結合されてよい。また、ヌクレオチド間結合が、リガンドの結合を促進し得る。リン含有結合（例えば、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミダート等）について、リガンドは、リン原子に、又はリン原子に結合したＯ、Ｎ、若しくはＳ原子に直接結合されてよい。アミン含有ヌクレオシド間結合又はアミド含有ヌクレオシド間結合（例えばＰＮＡ）について、リガンドは、アミン若しくはアミドの窒素原子に、又は隣接する炭素原子に結合されてよい。
特定の実施形態において、リガンドは、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかの３’又は５’末端に結合されてよい。特定の実施形態において、リガンドは、センス鎖の５’末端に共有結合的に結合される。他の実施形態において、リガンドは、センス鎖の３’末端に共有結合的に結合される。例えば、一部の実施形態において、リガンドは、センス鎖の３’末端ヌクレオチドに結合される。このような特定の実施形態において、リガンドは、センス鎖の３’末端ヌクレオチドの３’位にて結合される。代替的な実施形態において、リガンドは、センス鎖の３’末端近傍であるが、１つ以上の末端ヌクレオチドの前（すなわち１、２、３、又は４個の末端ヌクレオチドの前）に結合される。一部の実施形態において、リガンドは、センス鎖の３’末端ヌクレオチドの糖の２’位にて結合される。
特定の実施形態において、リガンドは、リンカーを介してセンス鎖又はアンチセンス鎖に結合される。「リンカー」は、リガンドをＲＮＡｉコンストラクトのポリヌクレオチド構成要素に共有結合的に結合する原子又は原子の基である。リンカーは、約１～約３０原子長、約２～約２８原子長、約３～約２６原子長、約４～約２４原子長、約６～約２０原子長、約７～約２０原子長、約８～約２０原子長、約８～約１８原子長、約１０～約１８原子長、及び約１２～約１８原子長であり得る。一部の実施形態において、リンカーは、通常、２個の官能基を有するアルキル部分を含む、二官能性の結合部分を含んでよい。官能基の一方が、注目する化合物（例えば、ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖又はアンチセンス鎖）に結合するように選択され、そして他方が、本明細書中に記載されるようなリガンド等の選択されたいずれかの基に基本的に結合するように選択される。特定の実施形態において、リンカーは、エチレングリコール単位又はアミノ酸単位等の繰返し単位の鎖構造又はオリゴマーを含む。二官能性結合部分に通常採用される官能基の例として、求核性基と反応するための求電子剤、及び求電子性基と反応するための求核剤が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態において、二官能性結合部分は、アミノ、ヒドロキシル、カルボン酸、チオール、及び不飽和（例えば、二重結合又は三重結合）が挙げられる。
リガンドを、本発明のＲＮＡｉコンストラクト内のセンス鎖又はアンチセンス鎖に結合するために使用され得るリンカーとして、ピロリジン、８－アミノ－３，６－ジオキサオクタン酸、スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシラート、６－アミノヘキサン酸、置換Ｃ１～Ｃ１０アルキル、置換若しくは非置換Ｃ２～Ｃ１０アルケニル、又は置換若しくは非置換Ｃ２～Ｃ１０アルキニルが挙げられるが、これらに限定されない。そのようなリンカーにとって好ましい置換基として、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル、及びアルキニルが挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、リンカーは、切断可能である。切断可能なリンカーは、細胞外部で十分に安定であるが、標的細胞中へのエントリ直後に切断されて、リンカーが一体に保持している２つの部分を放出するものである。一部の実施形態において、切断可能なリンカーは、標的細胞中又は第１の参照条件（例えば、細胞内条件を模倣するか、又は細胞内条件を表すように選択され得る）下において、対象の血液中又は第２の参照条件（例えば、血液若しくは血清中に見出される条件を模倣するか、又は当該条件を表すように選択され得る）下におけるよりも、少なくとも１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、若しくは９０倍以上又は少なくとも１００倍速く切断される。
切断可能なリンカーは、切断剤、例えば、ｐＨ、酸化還元電位、又は分解性分子の存在に対して感受性である。一般に、切断剤は、血清又は血液中よりも細胞内部において優勢であるか、又は高いレベル若しくは活性で見出される。そのような分解性薬剤の例として、例えば、細胞内に存在して、還元によって酸化還元切断可能なリンカーを分解することができるメルカプタン等の酸化酵素若しくは還元酵素又は還元剤が挙げられる、特定の基質のために選択されるか、又は基質特異性がない酸化還元剤；エステラーゼ；エンドソーム又は酸性環境を作ることができる剤、例えば、５以下のｐＨをもたらすもの；一般的な酸として作用することによって酸切断可能なリンカーを加水分解又は分解することができる酵素、ペプチダーゼ（基質特異的であり得る）、及びホスファターゼが挙げられる。
切断可能なリンカーは、ｐＨに対して感受性のある部分を含み得る。ヒト血清のｐＨは７．４であるが、平均的な細胞内ｐＨは、僅かにより低く、約７．１～７．３に及ぶ。エンドソームのｐＨは、５．５～６．０の範囲のより酸性であり、リソソームのｐＨは、およそ５．０とより一層酸性である。一部のリンカーは、好ましいｐＨにて切断される切断可能な基を有することによって、リガンドから細胞内部に、又は細胞の所望の区画中にＲＮＡ分子を放出することとなる。
リンカーは、特定の酵素によって切断可能である切断可能な基を含んでもよい。リンカー中に組み込まれる切断可能な基の種類は、標的化されることとなる細胞によって決まり得る。例えば、肝臓標的化リガンドは、エステル基を含むリンカーを介してＲＮＡ分子に結合され得る。肝細胞は、エステラーゼに富んでいるので、リンカーは、エステラーゼに富んでいない細胞型においてよりも肝細胞において効率的に切断されることとなる。エステラーゼに富む他の種類の細胞として、肺、腎皮質、及び精巣の細胞が挙げられる。ペプチド結合を含有するリンカーは、肝細胞及び滑膜細胞等のペプチダーゼに富む細胞を標的化する場合に用いられ得る。
一般に、切断可能なリンカー候補の適合性は、リンカー候補を切断する分解性薬剤（又は条件）の能力を試験することによって評価することができる。また、血液中の、又は他の非標的組織と接触する場合の切断に抵抗する能力について、切断可能なリンカー候補を試験することが望ましい。ゆえに、標的細胞における切断を示すように選択される第１の条件と、他の組織又は生体液、例えば血液又は血清における切断を示すように選択される第２の条件との間で、切断に対する相対的感受性を判定することができる。評価は、無細胞系、細胞、細胞培養体、臓器若しくは組織培養体において、又は動物全体において実行することができる。無細胞又は培養条件において初期評価を行って、動物全体における更なる評価によって確認することが有用であり得る。一部の実施形態において、有用なリンカー候補は、細胞において（又は細胞内条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下で）、血液又は血清（又は細胞外条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下）と比較して少なくとも２倍、４倍、１０倍、２０倍、５０倍、７０倍、又は１００倍速く切断される。
他の実施形態において、酸化還元切断可能なリンカーが利用される。酸化還元切断可能なリンカーは、還元又は酸化があれば切断される。還元的に切断可能な基の一例として、ジスルフィド結合基（－Ｓ－Ｓ－）がある。切断可能なリンカー候補が、適切な「還元的に切断可能なリンカー」であるか、又は例えば特定のＲＮＡｉコンストラクト及び特定のリガンドに使用するのに適しているかを判定するのに、本明細書中に記載される１つ以上の方法を用いることができる。例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、又は、細胞、例えば標的細胞中で観察されるであろう切断速度を模倣する、当該技術において知られている他の還元剤とのインキュベーションによって、リンカー候補を評価することができる。また、リンカー候補は、血液条件又は血清条件を模倣するように選択された条件下で評価することができる。特定の実施形態において、リンカー候補は、血液中で最大１０％切断される。他の実施形態において、有用なリンカー候補は、細胞（又は細胞内条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下）において、血液（又は細胞外条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下）と比較して少なくとも２倍、４倍、１０倍、２０倍、５０倍、７０倍、又は１００倍速く分解される。
さらに他の実施形態において、ホスファートベースの切断可能なリンカーは、ホスファート基を分解又は加水分解する剤によって切断される。細胞内でホスファート基を加水分解する剤の一例として、細胞内のホスファターゼ等の酵素がある。ホスファートベースの切断可能な基の例として、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＳＲｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｓ－がある。特定の実施形態として、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＳＨ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｓ－、－ＳＰ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｓ－が挙げられる。別の特定の実施形態は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－である。これらのリンカー候補は、先で記載されているものに類似する方法を用いて評価することができる。
他の実施形態において、リンカーは、酸切断可能な基を含んでよく、これは、酸性条件下で切断される基である。一部の実施形態において、酸切断可能な基は、ｐＨ約６．５以下（例えば、約６．０、５．５、５．０以下）の酸性環境において、又は一般酸として作用し得る酵素等の剤によって切断される。細胞内で、エンドソーム及びリソソーム等の特定の低ｐＨオルガネラは、酸切断可能な基に切断環境を提供し得る。酸切断可能な結合基の例として、ヒドラゾン、エステル、及びアミノ酸のエステルが挙げられるが、これらに限定されない。酸切断可能な基は、一般式－Ｃ＝ＮＮ－、Ｃ（Ｏ）Ｏ、又は－ＯＣ（Ｏ）を有し得る。特定の実施形態は、エステルの酸素に結合される炭素（アルコキシ基）が、アリール基、置換アルキル基、又は三級アルキル基、例えば、ジメチル、ペンチル、又はｔ－ブチルである場合である。これらの候補は、先に記載されているものに類似する方法を用いて評価することができる。
他の実施形態において、リンカーは、エステルベースの切断可能な基を含んでよく、これは、細胞中のエステラーゼ及びアミダーゼ等の酵素によって切断される。エステルベースの切断可能な基の例として、アルキレン、アルケニレン、及びアルキニレン基のエステルが挙げられるが、これらに限定されない。エステル切断可能な基は、一般式－Ｃ（Ｏ）Ｏ－又は－ＯＣ（Ｏ）－を有する。これらのリンカー候補は、先に記載されるものに類似する方法を用いて評価することができる。
更なる実施形態において、リンカーは、ペプチドベースの切断可能な基を含んでもよく、これは、細胞内のペプチダーゼ及びプロテアーゼ等の酵素によって切断される。ペプチドベースの切断可能な基は、オリゴペプチド（例えば、ジペプチド、トリペプチド等）及びポリペプチドを生じるような、アミノ酸間で形成されたペプチド結合である。ペプチドベースの切断可能な基は、アミド基（－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－）を含まない。アミド基は、あらゆるアルキレン、アルケニレン、又はアルキニレン間で形成され得る。ペプチド結合は、ペプチド及びタンパク質を生じるような、アミノ酸間で形成される特殊なタイプのアミド結合である。ペプチドベースの切断基は、一般に、ペプチド及びタンパク質を生じるような、アミノ酸間で形成されるペプチド結合（すなわちアミド結合）に限定され、アミド官能基全体を含むわけではない。ペプチドベースの切断可能な結合基は、一般式－ＮＨＣＨＲＡＣ（Ｏ）ＮＨＣＨＲＢＣ（Ｏ）－を有し、式中、ＲＡ及びＲＢは、２つの隣接するアミノ酸のＲ基である。当該候補は、先に記載されているものに類似する方法を用いて評価することができる。
リガンドを、本発明のＲＮＡｉコンストラクト内のセンス鎖又はアンチセンス鎖に結合させるのに適した他の種類のリンカーが、当該技術において知られており、米国特許第７，７２３，５０９号明細書；米国特許第８，０１７，７６２号明細書；米国特許第８，８２８，９５６号明細書；米国特許第８，８７７，９１７号明細書；及び米国特許第９，１８１，５５１号明細書に記載されるリンカーが挙げられ得、これらの特許は全て、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態において、本発明のＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖又はアンチセンス鎖に共有結合的に結合されるリガンドは、ＧａｌＮＡｃ部分、例えば多価のＧａｌＮＡｃ部分を含む。一部の実施形態において、多価のＧａｌＮＡｃ部分は、三価のＧａｌＮＡｃ部分であり、且つセンス鎖の３’末端に結合される。他の実施形態において、多価のＧａｌＮＡｃ部分は、三価のＧａｌＮＡｃ部分であり、且つセンス鎖の５’末端に結合される。さらに他の実施形態において、多価のＧａｌＮＡｃ部分は、四価のＧａｌＮＡｃ部分であり、且つセンス鎖の３’末端に結合される。さらに他の実施形態において、多価のＧａｌＮＡｃ部分は、四価のＧａｌＮＡｃ部分であり、且つセンス鎖の５’末端に結合される。一部の実施形態において、ＧａｌＮＡｃ部分は、配列番号１～１５９、１６１～３１９、３２１～４６１、又は４６３～６０３の奇数の配列のセンス鎖の５’末端に結合される。
一部の実施形態において、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、ＲＮＡｉコンストラクトの細胞内発現をコードし且つ制御するベクターを投与することによって、注目する細胞又は組織に送達されてよい。「ベクター」（本明細書中で「発現ベクター」とも称される）は、注目する核酸を細胞の内部に送達するのに用いることができる組成物である。多数のベクターが当該技術において知られており、直鎖状ポリヌクレオチド、イオン性又は両親媒性の化合物と結合したポリヌクレオチド、プラスミド、及びウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。ゆえに、用語「ベクター」は、自律的に複製するプラスミド又はウイルスを含む。ウイルスベクターの例として、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、及びレトロウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。ベクターは、生細胞内で複製されてもよいし、合成的に作製されてもよい。
一般に、本発明のＲＮＡｉコンストラクトを発現するためのベクターは、ＲＮＡｉコンストラクトをコードする配列に作動可能に連結された１つ以上のプロモータを含むこととなる。本明細書中で用いられるフレーズ「作動可能に連結された」又は「転写制御下の」は、プロモータが、ポリヌクレオチド配列に対して、ＲＮＡポリメラーゼによる転写の開始及びポリヌクレオチド配列の発現を制御する正確な位置及び向きにあることを意味する。「プロモータ」は、細胞の合成機構、又は導入された合成機構によって認識される、遺伝子配列の特異的転写を開始するのに必要とされる配列を指す。適切なプロモータとして、ＲＮＡ ｐｏｌ Ｉ、ｐｏｌ ＩＩ、Ｈ１、又はＵ６ ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩ、及びウイルスプロモータ（例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期遺伝子プロモータ、ＳＶ４０初期プロモータ、及びラウス肉腫ウイルスの長い末端反復）が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態において、ＨＩ又はＵ６ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモータが好ましい。当該プロモータは、組織特異的プロモータであっても誘導性プロモータであってもよい。特に注目するのは、ヒトα１－アンチトリプシン遺伝子、アルブミン遺伝子、ヘモペキシン遺伝子、及び肝性リパーゼ遺伝子由来のプロモータ配列等の肝臓特異的プロモータである。誘導性プロモータとして、エクジソン、エストロゲン、プロゲステロン、テトラサイクリン、及びイソプロピル－ＰＤ１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）によって調節されるプロモータが挙げられる。
ＲＮＡｉコンストラクトがｓｉＲＮＡを含む一部の実施形態において、２つの別個の鎖（センス鎖及びアンチセンス鎖）は、単一のベクターから発現されても２つの別個のベクターから発現されてもよい。例えば、一実施形態において、センス鎖をコードする配列は、第１のベクター上のプロモータに作動可能に連結されており、そしてアンチセンス鎖をコードする配列は、第２のベクター上のプロモータに作動可能に連結されている。そのような実施形態において、第１及び第２のベクターは、例えば感染又はトランスフェクションによって標的細胞中に、センス鎖及びアンチセンス鎖が転写されると細胞内でハイブリダイズしてｓｉＲＮＡ分子を形成することとなるように、同時に導入される。別の実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖は、単一のベクター中に位置決めされた２つの別個のプロモータから転写される。一部のそのような実施形態において、センス鎖をコードする配列は、第１のプロモータに作動可能に連結されており、そしてアンチセンス鎖をコードする配列は、第２のプロモータに作動可能に連結されており、第１及び第２のプロモータは、単一のベクター中に位置決めされている。一実施形態において、ベクターは、ｓｉＲＮＡ分子をコードする配列に作動可能に連結された第１のプロモータ、及び同じ配列に逆方向に作動可能に連結された第２のプロモータを、第１のプロモータからの配列の転写がｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖の合成をもたらし、そして第２のプロモータからの配列の転写がｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖の合成をもたらすように含む。
ＲＮＡｉコンストラクトがｓｈＲＮＡを含む他の実施形態において、単一の、少なくとも部分的に自己相補的なＲＮＡ分子をコードする配列が、単一の転写物を生成するプロモータに作動可能に連結されている。一部の実施形態において、ｓｈＲＮＡをコードする配列は、転写後にｓｈＲＮＡのステム構造及びループ構造を生成するように、リンカーポリヌクレオチド配列によって結合された反転反復を含む。
一部の実施形態において、本発明のＲＮＡｉコンストラクトをコードするベクターは、ウイルスベクターである。本明細書中に記載されるＲＮＡｉコンストラクトを発現するのに適した種々のウイルスベクター系として、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター、モロニーマウス白血病ウイルス）、アデノ随伴ウイルスベクター；単純ヘルペスウイルスベクター；ＳＶ４０ベクター；ポリオーマウイルスベクター；パピローマウイルスベクター；ピコルナウイルスベクター；及びポックスウイルスベクター（例えばワクシニアウイルス）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター（例えばレンチウイルスベクター）である。
本発明に用いることに適した種々のベクター、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ分子をコードする核酸配列をベクター中に挿入する方法、及びベクターを注目する細胞に送達する方法は、当業者の技術の範囲内である。例えば、Ｄｏｒｎｂｕｒｇ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ．，Ｖｏｌ．２：３０１－３１０，１９９５；Ｅｇｌｉｔｉｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｖｏｌ．６：６０８－６１４，１９８８；Ｍｉｌｌｅｒ，ＨｕｍＧｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ．，Ｖｏｌ．１：５－１４，１９９０；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３９２：２５－３０，１９９８；Ｒｕｂｉｎｓｏｎ Ｄ Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ．，Ｖｏｌ．３３：４０１－４０６，２００３；Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２９６：５５０－５５３，２００２；Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．２：２４３－２４７，２００２；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，Ｖｏｌ．２０：５００－５０５，２００２；Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，Ｖｏｌ．２０：４９７－５００，２００２；Ｐａｄｄｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＧｅｎｅｓＤｅｖ，Ｖｏｌ．１６：９４８－９５８，２００２；Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，Ｖｏｌ．２０：５０５－５０８，２００２；Ｓｕｉ ｅｔ ａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９９：５５１５－５５２０，２００２；及びＹｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９９：６０４７－６０５２，２００２（これらの文献は全て、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
また、本発明は、本明細書中に記載されるＲＮＡｉコンストラクト、及び薬学的に許容される担体、賦形剤、又は希釈剤を含む医薬組成物及び製剤を含む。そのような組成物及び製剤は、ＳＣＡＰの発現の引下げを必要とする対象において、ＳＣＡＰの発現を引き下げるのに有用である。臨床上の用途を考える場合、医薬組成物及び製剤は、目的の用途に適切な形態で調製されることとなる。一般に、これは、パイロジェン及びヒト又は動物に有害になる可能性のある他の不純物を本質的に含まない組成物を調製することを伴うこととなる。
フレーズ「薬学的に許容される」又は「薬理学的に許容される」は、動物又はヒトに投与される場合に、有害な、アレルギー性の、又は他の不都合な反応をもたらさない分子実体及び組成物を指す。本明細書中で用いられる「薬学的に許容される担体、賦形剤、又は希釈剤」は、ヒトへの投与に適した薬剤等の薬剤の製剤化に用いるのに許容される溶媒、バッファ、溶液、分散媒体、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤、並びに吸収遅延剤等を含む。薬学的に活性な物質へのそのような媒体及び剤の使用は、当該技術において周知である。従来のあらゆる媒体又は剤は、本発明のＲＮＡｉコンストラクトと適合しない場合を除いて、治療組成物における使用が意図される。また、補助的な活性成分が、組成物のベクター又はＲＮＡｉコンストラクトを不活化しないという条件で、組成物中に組み込まれてもよい。
医薬組成物の製剤用の組成物及び方法は、投与経路、処置されることとなる疾患若しくは障害の種類及び程度、又は投与されることとなる用量が挙げられるがこれらに限定されない、いくつかの基準によって決まる。一部の実施形態において、医薬組成物は、目的の送達経路に基づいて製剤化される。例えば、特定の実施形態において、医薬組成物は、非経口送達用に製剤化される。非経口の送達形態として、静脈内、動脈内、皮下、髄腔内、腹腔内、又は筋肉内の注射又は注入が挙げられる。一実施形態において、医薬組成物は、静脈内送達用に製剤化される。そのような実施形態において、医薬組成物は、脂質ベースの送達ビヒクルを含んでよい。別の実施形態において、医薬組成物は、皮下送達用に製剤化される。そのような実施形態において、医薬組成物は、標的化リガンド（例えば、本明細書中に記載されるＧａｌＮＡｃ含有リガンド）を含み得る。
一部の実施形態において、医薬組成物は、本明細書中に記載されるＲＮＡｉコンストラクトの有効量を含む。「有効量」は、有利な、又は所望の臨床結果をもたらすのに十分な量である。一部の実施形態において、有効量は、対象の肝細胞内でＳＣＡＰ発現を引き下げるのに十分な量である。一部の実施形態において、有効量は、ＳＣＡＰ発現を、例えばヒトヘテロ接合体における野生型ＳＣＡＰ対立遺伝子の発現に匹敵するレベルにまで部分的にのみ引き下げるのに十分な量であり得る。
本発明のＲＮＡｉコンストラクトの有効量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０５ｍｇ／ｋｇ体重～約７５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重～約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ／ｋｇ～約３０ｍｇ／ｋｇ体重、約２．５ｍｇ／ｋｇ体重～約２０ｍｇ／ｋｇ体重、又は約５ｍｇ／ｋｇ体重～約１５ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。特定の実施形態において、本発明のＲＮＡｉコンストラクトの単回の有効量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ、又は約１０ｍｇ／ｋｇであり得る。有効量のＲＮＡｉコンストラクトを含む医薬組成物は、毎週、隔週、毎月、四半期毎、又は半年毎に投与されてよい。有効な投与量及び投与頻度と考えられるであろうものの正確な決定は、患者の大きさ、年齢、及び全身状態、処置されることとなる障害の種類（例えば、心筋梗塞、心不全、冠動脈疾患、高コレステロール血症）、採用される特定のＲＮＡｉコンストラクト、並びに投与経路が挙げられるいくつかの要因に基づき得る。本発明の特定のあらゆるＲＮＡｉコンストラクトについての有効投薬量及びインビボ半減期の推定値は、適切な動物モデルにおける従来の方法及び／又は試験を用いて確認することができる。
本発明の医薬組成物の投与は、標的組織がその経路を介して利用できる限り、一般的なあらゆる経路を介するものであってよい。そのような経路として、非経口（例えば、皮下、筋肉内、腹腔内、又は静脈内）、経口、経鼻、頬側、皮内、経皮、及び舌下経路、又は肝臓組織への直接注射若しくは肝門脈を介する送達が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態において、医薬組成物は、非経口投与される。例えば、特定の実施形態において、医薬組成物は、静脈内投与される。他の実施形態において、医薬組成物は、皮下投与される。
水中油型エマルション、ミセル、混合ミセル、及びリポソームが挙げられる、高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、及び脂質ベースの系等のコロイド分散系が、本発明のＲＮＡｉコンストラクト又はそのようなコンストラクトをコードするベクター用の送達ビヒクルとして用いられてよい。本発明の核酸を送達するのに適した市販の脂肪エマルジョンとして、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（登録商標）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（登録商標）ＩＩ、Ｌｉｐｏｓｙｎ（登録商標）ＩＩＩ、Ｎｕｔｒｉｌｉｐｉｄ、及び他の類似の脂肪エマルジョンが挙げられる。送達ビヒクルとしてインビボで用いられる好ましいコロイド系は、リポソーム（すなわち人工膜小胞）である。本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、リポソーム内に封入されてもよいし、リポソーム、特にカチオン性リポソームに対して複合体を形成してもよい。これ以外にも、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、脂質、特にカチオン性脂質に対して複合体形成され得る。適切な脂質及びリポソームとして、中性（例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、及びジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン）、陰性（例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ））、及びカチオン性（例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピル（ＤＯＴＡＰ）及びジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＴＭＡ））が挙げられる。そのようなコロイド分散系の調製及び使用は、当該技術において周知である。また、例示的な製剤が、米国特許第５，９８１，５０５号明細書、米国特許第６，２１７，９００号明細書；米国特許第６，３８３，５１２号明細書；米国特許第第５，７８３，５６５号明細書；米国特許第７，２０２，２２７号明細書；米国特許第６，３７９，９６５号明細書；米国特許第６，１２７，１７０号明細書；米国特許第５，８３７，５３３号明細書；米国特許６，７４７，０１４号明細書；及び国際公開第０３／０９３４４９号パンフレットに開示されている。
一部の実施形態において、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、脂質製剤内に完全に封入されて、例えば、ＳＰＬＰ、ｐＳＰＬＰ、ＳＮＡＬＰ、又は他の核酸－脂質粒子を形成する。本明細書中で用いられる用語「ＳＮＡＬＰ」は、安定な核酸－脂質粒子を指し、ＳＰＬＰが挙げられる。本明細書中で用いられる用語「ＳＰＬＰ」は、脂質小胞内に封入されたプラスミドＤＮＡを含む核酸－脂質粒子を指す。ＳＮＡＬＰ及びＳＰＬＰは典型的に、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、及び粒子の凝集を妨げる脂質（例えばＰＥＧ－脂質コンジュゲート）を含有する。ＳＮＡＬＰ及びＳＰＬＰは、静脈内注射後に長期間の循環寿命を示し、且つ遠位部位（例えば、投与部位から物理的に離れた部位）にて蓄積するため、全身投与に非常に有用である。ＳＰＬＰとして、国際公開第００／０３６８３号パンフレットに記載される封入された縮合剤－核酸複合体を含む「ｐＳＰＬＰ」が挙げられる。核酸－脂質粒子は典型的に、平均直径が約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約６０ｎｍ～約１３０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１１０ｎｍ、又は約７０ｎｍ～約９０ｎｍであり、実質的に非毒性である。加えて、核酸－脂質粒子中に存在する場合の核酸は、水溶液中で、ヌクレアーゼによる分解に対して耐性がある。核酸－脂質粒子及びその調製方法は、例えば、米国特許第５，９７６，５６７号明細書；米国特許第５，９８１，５０１号明細書；米国特許第６，５３４，４８４号明細書；米国特許第６，５８６，４１０号明細書；米国特許第６，８１５，４３２号明細書；及び国際公開第９６／４０９６４号パンフレットに開示されている。
注射用途に適した医薬組成物の例として、滅菌水溶液又は分散系、及び注射用滅菌溶液又は分散系の即時調製用の滅菌粉末が挙げられる。一般に、これらの調製物は、滅菌済みであり、容易に注射可能である程度の流体である。調製物は、製造及び貯蔵の条件下で安定しているべきであり、細菌及び真菌等の微生物の汚染作用に対して保護されているべきである。適切な溶媒又は分散媒体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール）、それらの適切な混合液、及び植物油を含有してもよい。適切な流動性は、例えば、レシチン等のコーティングの使用によって、分散系の場合に必要とされる粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物作用の予防は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、及びチメロサールによってもたらすことができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖又は塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延する剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの、組成物中での使用によってもたらすことができる。
注射用滅菌溶液は、活性化合物を適切な量で所望の他のあらゆる成分（例えば先で列挙される）と共に溶媒中に組み込んでから濾過滅菌することによって調製され得る。一般的に、分散系は、塩基性分散媒体及び所望の他の成分、例えば先で列挙される成分を含有する滅菌ビヒクル中に、滅菌された種々の活性成分を組み込むことによって調製される。注射用滅菌溶液の調製用の滅菌粉末の場合、好ましい調製方法として、活性成分及び追加の所望のあらゆる成分の粉末を、予め滅菌濾過されたその溶液から生じさせる真空乾燥及び凍結乾燥の技術が挙げられる。
本発明の組成物は、一般に、中性の、又は塩の形態で製剤化され得る。薬学的に許容される塩の例として、無機酸（例えば、塩酸又はリン酸）又は有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、及びマンデル酸）に由来する酸付加塩（遊離アミノ基により形成される）が挙げられる。また、遊離カルボキシル基により形成される塩は、無機塩基（例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、又は水酸化第二鉄）又は有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、及びプロカイン）に由来してもよい。
水溶液による非経口投与のために、例えば、溶液は、通常、適切に緩衝化され、そして液体希釈剤は最初に、例えば十分な生理食塩水又はグルコースにより、等張にされる。そのような水溶液は、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、及び腹腔内投与に用いられ得る。好ましくは、特に本開示を考慮すれば、当業者に知られているような滅菌水性媒体が採用される。例として、単回用量が、等張ＮａＣｌ溶液１ｍｌ中に溶解されて、皮下注入液１０００ｍｌに加えられてもよいし、候補注入部位に注射されてもよい（例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”１５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐａｇｅｓ １０３５－１０３８ ａｎｄ １５７０－１５８０参照）。ヒトへの投与に関して、調製物は、ＦＤＡ標準によって要求される無菌性、発熱性、一般的安全性、及び純度標準を満たすべきである。特定の実施形態において、本発明の医薬組成物は、滅菌生理食塩水、及び本明細書中に記載されるＲＮＡｉコンストラクトを含むか、又はそれらからなる。他の実施形態において、本発明の医薬組成物は、本明細書中に記載されるＲＮＡｉコンストラクト、及び滅菌水（例えば、注射用水、ＷＦＩ）を含むか、又はそれらからなる。さらに他の実施形態において、本発明の医薬組成物は、本明細書中に記載されるＲＮＡｉコンストラクト、及びリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含むか、又はそれらからなる。
一部の実施形態において、本発明の医薬組成物は、投与用デバイスによりパッケージ化されるか、又はその内部に貯蔵される。注射用製剤用のデバイスとして、注射ポート、プレフィルドシリンジ、自動インジェクタ、注射ポンプ、装着型インジェクタ、及び注射ペンが挙げられるが、これらに限定されない。エアロゾル化製剤又は粉末製剤用のデバイスとして、インヘラー、吸入器、及び吸引器が挙げられるが、これらに限定されない。ゆえに、本発明は、本明細書中に記載される障害の１つ以上を処置又は予防するための本発明の医薬組成物を含む投与デバイスを含む。
ＳＣＡＰ発現を阻害するための方法
また、本発明は、細胞内でのＳＣＡＰ遺伝子の発現を阻害する方法を提供する。当該方法は、細胞を、ＲＮＡｉコンストラクト、例えば、二重鎖ＲＮＡｉコンストラクトと、細胞内でのＳＣＡＰの発現を阻害するのに有効な量で接触させることによって、細胞内でのＳＣＡＰの発現を阻害することを含む。ＲＮＡｉコンストラクト、例えば、二重鎖ＲＮＡｉコンストラクトとの細胞の接触は、インビトロ又はインビボで行われ得る。細胞をインビボでＲＮＡｉコンストラクトと接触させることは、対象、例えばヒト対象内の細胞又は細胞群をＲＮＡｉコンストラクトと接触させることを含む。また、細胞を接触させるインビトロ及びインビボでの方法の組合せも可能である。
本発明は、ＳＣＡＰの発現の引下げ又は阻害を必要とする対象において、ＳＣＡＰの発現を引き下げるか、又は阻害する方法、及びＳＣＡＰ発現又は活性と関連する症状、疾患、又は障害を処置又は予防する方法を提供する。「ＳＣＡＰ発現と関連する症状、疾患、又は障害」は、ＳＣＡＰの発現レベルが変わるか、又はＳＣＡＰの発現レベルの上昇が、症状、疾患、若しくは障害の発症リスクの増大と関連する症状、疾患、又は障害を指す。
細胞を接触させることは、先で考察されるように、直接的であっても間接的であってもよい。さらに、細胞を接触させることは、本明細書中に記載されるか、又は当該技術において知られているあらゆるリガンドが挙げられる標的化リガンドを介して達成されてよい。好ましい実施形態において、標的化リガンドは、炭水化物部分、例えば、ＧａｌＮＡｃリガンド、三価のＧａｌＮＡｃ部分、又は注目する部位にＲＮＡｉコンストラクトを向ける他のあらゆるリガンドである。
一実施形態において、細胞をＲＮＡｉコンストラクトと接触させることは、細胞中への取込み又は吸収を促進するか、又は生じさせることによって細胞中にＲＮＡｉコンストラクトを「導入」又は「送達」することを含む。ＲＮＡｉコンストラクトの吸収又は取込みは、補助なしの拡散性若しくは活性細胞プロセスによって、又は補助剤若しくはデバイスによって起こすことができる。ＲＮＡｉコンストラクトを細胞中に導入することは、インビトロ且つ／又はインビボであり得る。例えば、インビボ導入について、ＲＮＡｉコンストラクトは、組織部位中に注射されても全身投与されてもよい。細胞中へのインビトロ導入として、エレクトロポレーション及びリポフェクション等の当該技術において知られている方法が挙げられる。更なるアプローチが、本明細書中で以下に記載されており、且つ／又は当該技術において知られている。
本明細書中で用いられる用語「阻害すること」は、「引き下げること」、「サイレンシングすること」、「下方制御すること」、「抑制すること」、及び他の類似の用語と互換的に用いられ、あらゆるレベルの阻害を含む。
フレーズ「ＳＣＡＰの発現を阻害すること」は、あらゆるＳＣＡＰ遺伝子（例えば、マウスＳＣＡＰ遺伝子、ラットＳＣＡＰ遺伝子、サルＳＣＡＰ遺伝子、又はヒトＳＣＡＰ遺伝子）及びＳＣＡＰ遺伝子のバリアント又は変異体の発現の阻害を指すことが意図される。ゆえに、ＳＣＡＰ遺伝子は、野生型ＳＣＡＰ遺伝子、変異体ＳＣＡＰ遺伝子（トリグリセリド沈着を引き起こす変異体ＳＣＡＰ遺伝子等）、又は遺伝子操作された細胞、細胞群、若しくは生物の文脈におけるトランスジェニックＳＣＡＰ遺伝子であってもよい。
「ＳＣＡＰ遺伝子の発現を阻害する」は、ＳＣＡＰ遺伝子のあらゆるレベルの阻害、例えば、ＳＣＡＰ遺伝子の発現の少なくとも一部の抑制を含む。ＳＣＡＰ遺伝子の発現は、例えば、ＳＣＡＰ ｍＲＮＡレベル、ＳＣＡＰタンパク質レベル、又はトリグリセリド沈着物の数若しくは程度といったＳＣＡＰ遺伝子発現と関連するあらゆる変数のレベル、又はレベルの変化に基づいて評価され得る。当該レベルは、例として対象に由来するサンプルが挙げられる、個々の細胞又は細胞群において評価され得る。
阻害は、対照レベルと比較して、ＳＣＡＰ発現と関連する１つ以上の変数の絶対レベル又は相対レベルの低下によって評価され得る。対照レベルは、例えば、投与前のベースラインレベル、又は処置されていないか若しくは対照（例えば、バッファのみの対照又は不活剤対照）で処置された類似対象、細胞、若しくはサンプルから判定されるレベルといった、当該技術において利用されるあらゆるタイプの対照レベルであり得る。本発明の方法の一部の実施形態において、ＳＣＡＰ遺伝子の発現は、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％，少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％阻害される。
ＳＣＡＰ遺伝子の発現の阻害は、（例えば、細胞を、本発明のＲＮＡｉコンストラクトと接触させることによって、又は当該細胞が存在する、若しくは存在した対象に本発明のＲＮＡｉコンストラクトを投与することによって）ＳＣＡＰ遺伝子が転写される、そして、ＳＣＡＰ遺伝子の発現が阻害されるように処理された第１の細胞又は細胞群（そのような細胞は、例えば、対象に由来するサンプル中に存在し得る）によって発現されるｍＲＮＡの量の、第１の細胞又は細胞群と実質的に同一であるが、そのように処理されていない第２の細胞又は細胞群（対照細胞）と比較した減少によって、明らかにされ得る。好ましい実施形態において、阻害は、以下の式：
Figure 2022534402000002
 を用いて、処理された細胞内のｍＲＮＡのレベルを、対照細胞内のｍＲＮＡのレベルのパーセンテージとして表すことによって、評価される。
これ以外にも、ＳＣＡＰ遺伝子の発現の阻害は、ＳＣＡＰ遺伝子発現、例えば、ＳＣＡＰタンパク質発現又はＳＲＥＢＰ経路タンパク質活性に機能的に関連するパラメータの引下げに関して評価され得る。ＳＣＡＰ遺伝子サイレンシングは、構成的に、又はゲノム操作によって、そして当該技術において知られているあらゆるアッセイによって、ＳＣＡＰを発現するあらゆる細胞において判定され得る。
ＳＣＡＰタンパク質の発現の阻害は、細胞又は細胞群によって発現されるＳＣＡＰタンパク質のレベル（例えば、対象に由来するサンプル内で発現されるタンパク質のレベル）の引下げによって明らかにされ得る。先で説明されるように、ｍＲＮＡ抑制の評価について、処理された細胞又は細胞群内でのタンパク質発現レベルの阻害は、同様に、対照細胞又は対照細胞群内でのタンパク質のレベルのパーセンテージとして表されてよい。
ＳＣＡＰ遺伝子の発現の阻害を評価するのに用いられ得る対照細胞又は細胞群として、本発明のＲＮＡｉコンストラクトとまだ接触していない細胞又は細胞群が挙げられる。例えば、対照細胞又は対照細胞群は、ＲＮＡｉコンストラクトによる対象の処置の前に、個々の対象（例えば、ヒト対象又は動物対象）から得てもよい。
細胞又は細胞群によって発現されるＳＣＡＰ ｍＲＮＡのレベル、又は循環しているＳＣＡＰ ｍＲＮＡのレベルは、ｍＲＮＡ発現を評価するための、当該技術において知られているあらゆる方法を用いて判定され得る。一実施形態において、サンプル内でのＳＣＡＰの発現のレベルは、例えばＳＣＡＰ遺伝子のｍＲＮＡといった、転写ポリヌクレオチド又はその一部を検出することによって判定される。ＲＮＡは、例として、酸性フェノール／グアニジンイソチオシアナート抽出（ＲＮＡｚｏｌ Ｂ；Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）、ＲＮｅａｓｙ ＲＮＡ調製キット（Ｑｉａｇｅｎ）、又はＰＡＸｇｅｎｅ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉｘ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いることが挙げられる、ＲＮＡ抽出技術を用いて、細胞から抽出され得る。リボ核酸ハイブリダイゼーションを利用する典型的なアッセイ形式として、核ランオンアッセイ、ＲＴ－ＰＣＲ、ＲＮａｓｅ保護アッセイ（Ｍｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：７０３５）、ノーザンブロッティング、インサイチュハイブリダイゼーション、及びマイクロアレイ分析が挙げられる。循環しているＳＣＡＰ ｍＲＮＡが、ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０４３５８４号明細書（その全内容は、参照によって本明細書に組み込まれる）に記載される方法を用いて検出され得る。
一実施形態において、ＳＣＡＰの発現のレベルは、核酸プローブを用いて判定される。本明細書中で用いられる用語「プローブ」は、特定のＳＣＡＰに選択的に結合することができるあらゆる分子を指す。プローブは、当業者によって合成することができるか、又は適切な生物学的調製物から得ることができる。プローブは、標識されるように特異的に設計されてもよい。プローブとして利用され得る分子の例として、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、抗体、及び有機分子が挙げられるが、これらに限定されない。
単離されたｍＲＮＡは、ノーザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析、及びプローブアレイが挙げられるがこれらに限定されないハイブリダイゼーション又は増幅アッセイに用いることができる。ｍＲＮＡレベルの一決定方法は、単離されたｍＲＮＡを、ＳＣＡＰ ｍＲＮＡにハイブリダイズすることができる核酸分子（プローブ）と接触させることを含む。一実施形態において、例えば、アガロースゲル上で単離ｍＲＮＡを泳動させて、ｍＲＮＡをゲルからニトロセルロース等のメンブレンに移すことによって、ｍＲＮＡを固体表面上に固定化して、プローブと接触させる。代替的な実施形態において、例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ遺伝子チップアレイにおいて、プローブは、固体表面上に固定化されており、そしてｍＲＮＡはプローブと接触する。当業者であれば、既知のｍＲＮＡ検出法を、ＳＣＡＰ ｍＲＮＡのレベルの判定での使用に容易に適合させることができる。
サンプル内でのＳＣＡＰの発現のレベルを判定する代替的な方法が、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ（Ｍｕｌｌｉｓ，１９８７，米国特許第４，６８３，２０２号明細書に記載される実験的な実施形態）、リガーゼ連鎖反応（Ｂａｒａｎｙ（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１８９－１９３）、自家持続配列複製法（Ｇｕａｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１８７４－１８７８）、転写増幅系（Ｋｗｏｈ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１１７３－１１７７）、Ｑ－ベータレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１１９７）、ローリングサークル複製（Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，８５４，０３３号明細書）、又は他のあらゆる核酸増幅法による、例えばサンプル内のｍＲＮＡの、核酸増幅及び／又は逆転写酵素（ｃＤＮＡを調製する）のプロセスに続く、当業者に周知の技術を用いた、増幅された分子の検出を含む。これらの検出スキームは、とりわけ、核酸分子が非常に少ない数で存在するならば、核酸分子の検出に有用である。本発明の特定の態様において、ＳＣＡＰの発現のレベルは、定量蛍光ＲＴ－ＰＣＲ（すなわち、ＴａｑＭａｎ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ）によって判定される。ＳＣＡＰ ｍＲＮＡの発現レベルは、メンブレンブロット（ノーザン及びドット等のハイブリダイゼーション分析に用いられているもの等）、又はマイクロウェル、サンプルチューブ、ゲル、ビーズ、又はファイバー（又は結合核酸を含むあらゆる固体支持体）を使用して監視され得る。米国特許第５，７７０，７２２号明細書、米国特許第５，８７４，２１９号明細書、米国特許第５，７４４，３０５号明細書、米国特許第５，６７７，１９５号明細書及び米国特許第５，４４５，９３４号明細書（これらの特許は、参照によって本明細書に組み込まれる）参照。ＳＣＡＰ発現レベルの判定は、溶液中の核酸プローブの使用を含んでもよい。
好ましい実施形態において、ｍＲＮＡ発現のレベルは、分枝状ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）アッセイ又はリアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を用いて評価される。これらの方法の使用は、本明細書中に提示される実施例に記載され且つ例示される。
ＳＣＡＰタンパク質発現のレベルは、タンパク質レベルの測定のための、当該技術において知られているあらゆる方法を用いて判定され得る。そのような方法の例として、電気泳動、キャピラリ電気泳動、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）、高拡散クロマトグラフィ、液体又はゲル沈降反応、吸収分光法、比色アッセイ、分光光度アッセイ、フローサイトメトリ、免疫拡散法（一元又は二元）、免疫電気泳動、ウエスタンブロッティング、放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ、及び電気化学発光アッセイが挙げられる。
一部の実施形態において、本発明の方法の有効性は、四肢、顔、喉頭、上気道、腹部、躯幹、及び性器の浮腫状腫脹、前駆症状；喉頭部浮腫；非掻痒性発疹；吐き気；嘔吐；又は腹痛の低減等のＳＣＡＰ疾患の病徴の低減を検出又は監視することによって監視することができる。これらの病徴は、当該技術において知られているあらゆる方法を用いて、インビトロ又はインビボで評価され得る。
本発明の方法の一部の実施形態において、ＲＮＡｉコンストラクトは、対象に、ＲＮＡｉコンストラクトが対象内の特定の部位に送達されるように投与される。ＳＣＡＰの発現の阻害は、対象内の特定の部位由来の体液又は組織に由来するサンプル内でのＳＣＡＰ ｍＲＮＡ又はＳＣＡＰタンパク質のレベル又はレベルの変化の測定を用いて評価され得る。好ましい実施形態において、当該部位は、肝臓、脈絡叢、網膜、及び膵臓からなる群から選択される。当該部位は、前述の部位のいずれか１つ由来の細胞の小単位又は部分群であってもよい。また、当該部位は、特定の型の受容体を発現する細胞を含んでもよい。
ＳＣＡＰ関連疾患を処置又は予防する方法
本発明は、ＳＣＡＰ関連疾患、障害、及び／若しくは症状がある対象、又はＳＣＡＰ関連疾患、障害、及び／若しくは症状を発症しやすい対象に、本発明のＲＮＡｉコンストラクトを含む組成物、又はＲＮＡｉコンストラクトを含む医薬組成物、又はＲＮＡｉコンストラクトを含むベクターを投与することを含む、治療及び予防方法を提供する。ＳＣＡＰ関連疾患の非限定的な例として、例えば、脂肪肝（脂肪症）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、肝臓内での脂肪の蓄積、肝臓の炎症、肝細胞壊死、肝細胞癌、肝線維症、肥満、心筋梗塞、心不全、冠状動脈疾患、高コレステロール血症、又は非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）が挙げられる。一実施形態において、ＳＣＡＰ関連疾患は、ＮＡＦＬＤである。別の実施形態において、ＳＣＡＰ関連疾患は、ＮＡＳＨである。別の実施形態において、ＳＣＡＰ関連疾患は、脂肪肝（脂肪症）である。別の実施形態において、ＳＣＡＰ関連疾患は、インスリン抵抗性である。別の実施形態において、ＳＣＡＰ関連疾患は、インスリン抵抗性ではない。一部の実施形態において、ＳＣＡＰ ＲＮＡｉは、肝細胞癌を処置するのに用いることができる。ＳＲＥＢＰ活性の増大は、ヒトＨＣＣサンプル、及びＨＣＣ増殖での原因となる役割のエビデンスポイントにおいて、記録されている。ＨＣＣの齧歯類モデル（例えば、ＨＣＣ細胞の異種移植片移植、又はオンコジーンの肝臓発現）におけるＳＣＡＰ ＲＮＡｉ（例えばｓｉＲＮＡ）処置は、肝腫瘍負荷（すなわち腫瘍容量）の引下げをもたらすことができる。
特定の実施形態において、本発明は、ＳＣＡＰの発現の引下げを必要とする患者においてＳＣＡＰの発現を引き下げる方法であって、本明細書中に記載されるＲＮＡｉコンストラクトのいずれかを患者に投与することを含む方法を提供する。本明細書中で用いられる用語「患者」は、ヒトが挙げられる哺乳動物を指し、用語「対象」と互換的に用いられ得る。好ましくは、患者の肝細胞内でのＳＣＡＰの発現レベルは、ＲＮＡｉコンストラクトを受けていない患者のＳＣＡＰの発現レベルと比較して、ＲＮＡｉコンストラクトの投与後に引き下げられる。
本発明の方法は、ＳＣＡＰ関連疾患を患っている対象、例えば、ＳＣＡＰ遺伝子発現及び／又はＳＣＡＰタンパク質産生の引下げから利益を受けることとなる対象を処置するのに有用である。一態様において、本発明は、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を患っている対象において、ＳＲＥＢＰ切断活性化タンパク質（ＳＣＡＰ）遺伝子発現のレベルを引き下げる方法を提供する。別の態様において、本発明は、ＮＡＦＬＤを患っている対象においてＳＣＡＰタンパク質のレベルを引き下げる方法を提供する。また、本発明は、ＮＡＦＬＤを患っている対象において、ヘッジホッグ経路の活性のレベルを引き下げる方法を提供する。
別の態様において、本発明は、ＮＡＦＬＤを患っている対象を処置する方法を提供する。一態様において、本発明は、ＳＣＡＰ関連疾患、例えば、脂肪肝（脂肪症）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、肝臓内での脂肪の蓄積、肝臓の炎症、肝細胞壊死、肝線維症、肥満、肝細胞癌、心筋梗塞、心不全、冠状動脈疾患、高コレステロール血症、又は非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を患っている対象を治療する方法を提供する。本発明の処置方法（及び使用）は、対象、例えば、ヒトに、治療有効量の、ＳＣＡＰ遺伝子を標的化する本発明のＲＮＡｉコンストラクト、ＳＣＡＰ遺伝子を標的化する本発明のＲＮＡｉコンストラクトを含む医薬組成物、又はＳＣＡＰ遺伝子を標的化するＲＮＡｉコンストラクトを含む本発明のベクターを投与することを含む。
一態様において、本発明は、例えば、高められたシグナル伝達経路の存在、疲労、衰弱、減量、食欲不振、吐き気、腹痛、クモ状血管、皮膚及び眼の黄色化（黄疸）、かゆみ、水分蓄積及び脚の腫脹（浮腫）、腹部膨満（腹水）、並びに精神錯乱といった、ＮＡＦＬＤを患っている対象における少なくとも１つの病徴を予防する方法を提供する。当該方法は、治療有効量のＲＮＡｉコンストラクト、例えば、本発明のｄｓＲＮＡ、医薬組成物、又はベクターを対象に投与することによって、ＳＣＡＰ遺伝子発現の引下げから利益を受けることとなる、障害を患っている対象において、少なくとも１つの病徴を予防することを含む。
別の態様において、本発明は、対象、例えば、ＳＣＡＰ遺伝子発現の引下げ及び／又は阻害から利益を受けることとなる対象を処置するための、治療有効量の本発明のＲＮＡｉコンストラクトの使用を提供する。更なる態様において、本発明は、ＳＣＡＰ遺伝子発現の引下げから利益を受けることとなる、障害、例えば、ＳＣＡＰ関連疾患を患っている対象等の対象、例えば、ＳＣＡＰ遺伝子発現及び／又はＳＣＡＰタンパク質産生の引下げ及び／又は阻害から利益を受けることとなる対象を処置するための医薬の製造における、ＳＣＡＰ遺伝子を標的化する本発明のＲＮＡｉコンストラクト、例えば、ｄｓＲＮＡ、又はＳＣＡＰ遺伝子を標的化するＲＮＡｉコンストラクトを含む医薬組成物の使用を提供する。
別の態様において、本発明は、ＳＣＡＰ遺伝子発現及び／又はＳＣＡＰタンパク質産生の引下げ及び／又は阻害から利益を受けることとなる、障害に罹患している対象において少なくとも１つの病徴を予防するための、本発明のＲＮＡｉ、例えば、ｄｓＲＮＡの使用を提供する。
更なる態様において、本発明は、ＳＣＡＰ関連疾患等の、ＳＣＡＰ遺伝子発現及び／又はＳＣＡＰタンパク質産生の引下げ及び／又は阻害から利益を受けることとなる障害に罹患している対象において少なくとも１つの病徴を予防するための医薬の製造における本発明のＲＮＡｉコンストラクトの使用を提供する。
一実施形態において、ＳＣＡＰを標的化するＲＮＡｉコンストラクトは、ｄｓＲＮＡ剤が対象に投与される場合、例えば、対象の細胞、組織、血液、又は他の組織若しくは体液におけるＳＣＡＰ遺伝子の発現が、少なくとも約１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６２％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は少なくとも約９９％以上引き下げられるように、ＳＣＡＰ関連疾患、例えば、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を患っている対象に投与される。
本発明の方法及び使用は、標的ＳＣＡＰ遺伝子の発現が、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、１２、１６、１８、２４、２８、３２、３６、４０、４４、４８、５２、５６、６０、６４、６８、７２、７６、又は約８０時間減少するように、本明細書中に記載される組成物を投与することを含む。一実施形態において、標的ＳＣＡＰ遺伝子の発現は、長期間、例えば、少なくとも約２、３、４、５、６、７日以上、例えば、約１週、２週、３週、又は約４週以上減少する。
本発明の方法及び使用に従うＲＮＡｉコンストラクトの投与は、ＳＣＡＰ関連疾患、例えば、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を患っている患者におけるそのような疾患又は障害の重症度、徴候、病徴、及び／又はマーカーの引下げをもたらし得る。この文脈における「引下げ」は、そのようなレベルの統計的に有意な低下を意味する。引下げは、例えば、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は約１００％であり得る。疾患の処置又は予防の有効性は、例えば、疾患進行、疾患寛解、病徴重症度、疼痛の引下げ、生活の質、処置効果を維持するのに必要な医薬の用量、疾患マーカーのレベル、又は処置されているか若しくは予防の標的となる所与の疾患に適した他のあらゆる測定可能パラメータのレベルを測定することによって評価され得る。そのようなパラメータのいずれか１つ、又はパラメータのあらゆる組合せを測定することによって、処置又は予防の有効性を監視することは、十分に当業者の能力の範囲内である。例えば、ＮＡＦＬＤの処置の有効性は、例えば、ＮＡＦＬＤ病徴、肝臓脂肪レベル、又は下流遺伝子の発現の定期的なモニタリングによって評価され得る。最初の読取りとの後の読取りの比較は、処置が有効であるかの指標を医師に提供する。そのようなパラメータのいずれか１つ、又はパラメータのあらゆる組合せを測定することによって、処置又は予防の有効性を監視することは、十分に当業者の能力の範囲内である。ＳＣＡＰを標的化するＲＮＡｉコンストラクト、又はその医薬組成物の投与と関連して、ＳＣＡＰ関連疾患「に対して有効」とは、臨床的に適切な様式での投与が、少なくとも統計的に有意な割合の患者にとって、病徴の改善、治癒、疾患の低減、延命、生活の質の改善、又はＮＡＦＬＤ及び／若しくはＳＣＡＰ関連疾患並びに関連原因の処置に精通している医者によって好ましいと一般に認められている他の効果等の有益な効果をもたらすことを示す。
病状の１つ以上のパラメータにおいて統計的に有意な改善がある場合、又は普通であれば予期される病徴の悪化若しくは進行の欠如によって、処置又は予防効果が明らかである。一例として、疾患の測定可能なパラメータの少なくとも１０％の、好ましくは少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％以上の好ましい変化が、有効な処置を示し得る。また、所与のＲＮＡｉ薬物又は当該薬物の製剤の有効性は、当該技術において知られている所与の疾患のための実験動物モデルを用いて判断されてもよい。実験動物モデルを使用する場合、処置の有効性は、マーカー又は病徴の統計的に有意な低減が観察される場合に証明される。
ＲＮＡｉコンストラクトの投与は、例えば、患者の細胞、組織、血液、尿、又は他のコンパートメント内のＳＣＡＰタンパク質レベルの存在を、少なくとも約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は少なくとも約９９％以上引き下げ得る。
ＲＮＡｉコンストラクトの総用量の投与前に、５％の注入液等のより少ない用量を患者に投与して、アレルギー反応等の有害作用について監視してもよい。別の実施例において、患者は、サイトカイン（例えば、ＴＮＦ－アルファ又はＩＮＦ－アルファ）レベルの増大等の望まれない免疫賦活作用について監視されてもよい。
ＳＣＡＰ発現に及ぼす阻害効果によって、本発明に従う組成物又はそれから調製される医薬組成物は、生活の質を高めることができる。
本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、「裸の」形態で投与されてもよく、この場合、修飾又は未修飾ＲＮＡｉコンストラクトは、「遊離ＲＮＡｉ」として、水性又は適切なバッファ溶液中に直接的に懸濁されている。遊離ＲＮＡｉは、医薬組成物の不在下で投与される。
ＲＮＡｉは、適切なバッファ溶液と共に医薬組成物中にあってもよい。バッファ溶液は、アセタート、シトラート、プロラミン、カルボナート、若しくはホスファート、又はそれらのあらゆる組合せを含んでもよい。一実施形態において、バッファ溶液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。ＲＮＡｉコンストラクトを含有するバッファ溶液のｐＨ及びオスモル濃度は、対象への投与に適切であるように調節されてよい。
これ以外にも、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、ＲＮＡｉコンストラクトリポソーム製剤等の医薬組成物として投与されてよい。
ＳＣＡＰ遺伝子発現の引下げ及び／又は阻害から利益を受けることとなる対象は、本明細書中に記載される非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）及び／又はＳＣＡＰ関連疾患若しくは障害を患っている対象である。
ＳＣＡＰ遺伝子発現の引下げ及び／又は阻害から利益を受けることとなる対象の処置として、治療的及び予防的処置が挙げられる。
本発明はさらに、例えば既知の医薬品及び／又は既知の治療法といった他の医薬品及び／又は他の治療法、例えば、これらの障害を処置するために現在利用されているものと組み合わせた、ＳＣＡＰ遺伝子発現の引下げ及び／又は阻害から利益を受けることとなる対象、例えば、ＳＣＡＰ関連疾患を患っている対象を処置するための方法、並びにＲＮＡｉコンストラクト又はその医薬組成物の使用を提供する。
例えば、特定の実施形態において、ＳＣＡＰ遺伝子を標的化するＲＮＡｉコンストラクトは、例えば、本明細書の他の箇所で記載されるＳＣＡＰ関連疾患を処置するのに有用な剤と組み合わせて投与される。例えば、ＳＣＡＰ発現の引下げから利益を受けることとなる対象、例えば、ＳＣＡＰ関連疾患を患っている対象を処置するのに適した追加の治療薬及び治療法として、ＳＣＡＰ遺伝子の異なる部分を標的化するＲＮＡｉコンストラクト、ＳＣＡＰ関連疾患を処置するための治療剤及び／若しくは手順、又は前述のいずれかの組合せが挙げられる。
特定の実施形態において、ＳＣＡＰ遺伝子を標的化する第１のＲＮＡｉコンストラクトは、ＳＣＡＰ遺伝子の異なる部分を標的化する第２のＲＮＡｉコンストラクトと組み合わせて投与される。例えば、第１のＲＮＡｉコンストラクトは、二重鎖領域を形成する第１のセンス鎖及び第１のアンチセンス鎖を含み、前記第１のセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全て、及び第１のアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが、修飾ヌクレオチドであり、前記第１のセンス鎖は、３’末端にて結合したリガンドにコンジュゲートされており、当該リガンドは、二価又は三価の分枝状リンカーを介して結合された１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体であり；且つ第２のＲＮＡｉコンストラクトは、二重鎖領域を形成する第２のセンス鎖及び第２のアンチセンス鎖を含み、第２のセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全て、及び第２のアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全ては、修飾ヌクレオチドであり、第２のセンス鎖は、３’末端にて結合したリガンドにコンジュゲートされており、当該リガンドは、二価又は三価の分枝状リンカーを介して結合された１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体である。
一実施形態において、第１及び第２のセンス鎖のヌクレオチドの全て、並びに／又は第１及び第２のアンチセンス鎖のヌクレオチドの全ては、修飾を含む。
一実施形態において、修飾ヌクレオチドの少なくとも１つは、３’－末端デオキシ－チミン（ｄＴ）ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、アンロックドヌクレオチド、立体配座が制限されたヌクレオチド、拘束エチルヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’－アミノ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、２’－Ｃ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－ヒドロキシ修飾ヌクレオチド、２’－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミダート、非天然塩基を含むヌクレオチド、テトラヒドロピラン修飾ヌクレオチド、１，５－アンヒドロヘキシトール修飾ヌクレオチド、シクロヘキセニル修飾ヌクレオチド、ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、メチルホスホナート基を含むヌクレオチド、５’－ホスファートを含むヌクレオチド、及び５’－ホスファート模倣体を含むヌクレオチドからなる群から選択される。
特定の実施形態において、ＳＣＡＰ遺伝子を標的化する第１のＲＮＡｉコンストラクトは、ＳＣＡＰ遺伝子とは異なる遺伝子を標的化する第２のＲＮＡｉコンストラクトと組み合わせて投与される。例えば、ＳＣＡＰ遺伝子を標的化するＲＮＡｉコンストラクトは、ＳＣＡＰ遺伝子を標的化するＲＮＡｉコンストラクトと組み合わせて投与されてよい。ＳＣＡＰ遺伝子を標的化する第１のＲＮＡｉコンストラクト、及びＳＣＡＰ遺伝子とは異なる遺伝子、例えば、ＳＣＡＰ遺伝子を標的化する第２のＲＮＡｉコンストラクトは、同じ医薬組成物の一部として投与されてよい。これ以外にも、ＳＣＡＰ遺伝子を標的化する第１のＲＮＡｉコンストラクト及びＳＣＡＰ遺伝子とは異なる遺伝子、例えば、ＳＣＡＰ遺伝子を標的化する第２のＲＮＡｉコンストラクトは、異なる医薬組成物の一部として投与されてよい。
ＲＮＡｉコンストラクト及び追加の治療剤並びに／又は処置は、同時に、且つ／又は同じ組合せで、例えば、非経口的に施されてもよいし、或いは追加の治療剤が、別個の組成物の一部として、若しくは別々に、且つ／又は当該技術において知られているか若しくは本明細書中に記載される別の方法によって投与されてもよい。
また、本発明は、細胞内のＳＣＡＰ発現を引き下げ、且つ／又は阻害するために、本発明のＲＮＡｉコンストラクト及び／又は本発明のＲＮＡｉコンストラクトを含有する組成物を使用する方法を提供する。他の態様において、本発明は、細胞内でのＳＣＡＰ遺伝子発現を引き下げ、且つ／又は阻害するのに用いられる、本発明のＲＮＡｉコンストラクト及び／又は本発明のＲＮＡｉコンストラクトを含む組成物を提供する。さらに他の態様において、細胞内のＳＣＡＰ遺伝子発現を引き下げ、且つ／又は阻害する医薬の製造のための、本発明のＲＮＡｉコンストラクト及び／又は本発明のＲＮＡｉコンストラクトを含む組成物の使用が提供される。さらに他の態様において、本発明は、細胞内のＳＣＡＰタンパク質産生を引き下げ、且つ／又は阻害するのに用いられる、本発明のＲＮＡｉコンストラクト及び／又は本発明のＲＮＡｉコンストラクトを含む組成物を提供する。さらに他の態様において、細胞内でのＳＣＡＰタンパク質産生を引き下げ、且つ／又は阻害する医薬の製造のための、本発明のＲＮＡｉコンストラクト及び／又は本発明のＲＮＡｉコンストラクトを含む組成物の使用が提供される。本方法及び使用は、細胞を本発明のＲＮＡｉコンストラクトと接触させて、細胞を、ＳＣＡＰ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間維持することによって、細胞内のＳＣＡＰ遺伝子の発現を阻害するか、又はＳＣＡＰタンパク質産生を阻害することを含む。
遺伝子発現の引下げは、当該技術において知られているあらゆる方法によって評価され得る。例えば、ＳＣＡＰの発現の引下げは、当業者にとって通例の方法、例えば、ノーザンブロッティング、ｑＲＴ－ＰＣＲを用いて、ＳＣＡＰのｍＲＮＡ発現レベルを判定することによって、ウエスタンブロッティング、免疫学的技術、フローサイトメトリ法、ＥＬＩＳＡ等の当業者にとって通例の方法を用いて、ＳＣＡＰのタンパク質レベルを判定することによって、且つ／又はＳＣＡＰの生物活性を判定することによって、判定され得る。
本発明の方法及び使用において、細胞は、インビトロで接触されてもインビボで接触されてもよい、すなわち、細胞は、対象内にあってもよい。
本発明の方法を使用する処置に適した細胞は、ＳＣＡＰ遺伝子を発現するあらゆる細胞、例えば、ＮＡＦＬＤを患っている対象由来の細胞、又はＳＣＡＰ遺伝子若しくはＳＣＡＰ遺伝子の一部を含む発現ベクターを含む細胞であり得る。本発明の方法及び使用に用いられるのに適した細胞が、哺乳動物細胞、例えば、霊長類細胞（ヒト細胞又は非ヒト霊長類細胞、例えば、サル細胞又はチンパンジー細胞等）、非霊長類細胞（ウシ細胞、ブタ細胞、ラクダ細胞、ラマ細胞、ウマ細胞、ヤギ細胞、ウサギ細胞、ヒツジ細胞、ハムスター、モルモット細胞、ネコ細胞、イヌ細胞、ラット細胞、マウス細胞、ライオン細胞、トラ細胞、クマ細胞、又はバッファロー細胞等）、鳥類細胞（例えば、アヒル細胞又はガチョウ細胞）、又はクジラ細胞であってもよい。一実施形態において、細胞はヒト細胞である。
ＳＣＡＰ遺伝子発現は、細胞内で、少なくとも約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は約１００％阻害され得る。
ＳＣＡＰタンパク質産生は、細胞内で、少なくとも約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は約１００％阻害され得る。
本発明のインビボでの方法及び使用は、ＲＮＡｉコンストラクトを含有する組成物を対象に投与することを含んでもよく、ＲＮＡｉコンストラクトは、処置されることとなる哺乳動物のＳＣＡＰ遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部と相補的なヌクレオチド配列を含む。処置されることとなる生物がヒトである場合、組成物は、皮下、静脈内、経口、腹腔内、又は頭蓋内（例えば、脳室内、実質内、及び髄腔内）、筋肉内、経皮、気道（噴霧剤）、経鼻、直腸が挙げられる非経口経路、並びに局所（口腔内及び舌下が挙げられる）投与が挙げられるがこれらに限定されない、当該技術において知られているあらゆる手段によって投与され得る。特定の実施形態において、組成物は、皮下又は静脈内の注入又は注射によって投与される。一実施形態において、組成物は、皮下注射によって投与される。
一部の実施形態において、投与は、デポ注射を介する。デポ注射は、長期間にわたってＲＮＡｉを一貫して放出し得る。ゆえに、デポ注射は、所望の効果、例えば、所望のＳＣＡＰの阻害、又は治療効果若しくは予防効果を得るのに必要な投与頻度を減少させ得る。また、デポ注射は、より一貫した血清濃度を実現し得る。デポ注射として、皮下注射又は筋肉内注射が挙げられ得る。好ましい実施形態において、デポ注射は皮下注射である。
一部の実施形態において、投与は、ポンプを介する。ポンプは、外部ポンプであっても外科的に埋め込まれるポンプであってもよい。特定の実施形態において、ポンプは、皮下に埋め込まれる浸透圧ポンプである。他の実施形態において、ポンプは、注入ポンプである。注入ポンプは、静脈内、皮下、動脈、又は硬膜外注入に用いてもよい。好ましい実施形態において、注入ポンプは、皮下注入ポンプである。他の実施形態において、ポンプは、ＲＮＡｉコンストラクトを対象に送達する、外科的に埋め込まれるポンプである。
投与様式は、局所性又は全身性の処置が所望されるかに基づいて、そして処置されることとなる領域に基づいて選択されてよい。投与経路及び投与部位は、標的化を高めるように選択されてよい。
一態様において、本発明はまた、哺乳動物、例えばヒト内でＳＣＡＰ遺伝子の発現を阻害するための方法を提供する。また、本発明は、哺乳動物内でのＳＣＡＰ遺伝子の発現を阻害するのに用いられる、哺乳動物の細胞内でＳＣＡＰ遺伝子を標的化するＲＮＡｉコンストラクトを含む組成物を提供する。別の態様において、本発明は、哺乳動物内でＳＣＡＰ遺伝子の発現を阻害する医薬の製造における、哺乳動物の細胞内でＳＣＡＰ遺伝子を標的化するＲＮＡｉコンストラクトの使用を提供する。
方法及び使用は、哺乳動物の細胞内でＳＣＡＰ遺伝子を標的化するＲＮＡｉコンストラクトを含む組成物を、哺乳動物、例えばヒトに投与することと、哺乳動物を、ＳＣＡＰ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間維持することによって、哺乳動物内でのＳＣＡＰ遺伝子の発現を阻害することとを含む。
遺伝子発現の引下げは、当該技術において知られているあらゆる方法、例えば、本明細書中に記載されるｑＲＴ－ＰＣＲによって、ＲＮＡｉ投与対象の末梢血サンプル中で評価され得る。タンパク質産生の引下げは、当該技術において知られているあらゆる方法、及び、例えば、本明細書中に記載されるＥＬＩＳＡ又はウエスタンブロッティングといった方法によって評価され得る。一実施形態において、組織サンプルは、ＳＣＡＰ遺伝子及び／又はタンパク質発現の引下げを監視するための組織材料として機能する。別の実施形態において、血液サンプルは、ＳＣＡＰ遺伝子及び／又はタンパク質発現の引下げを監視するための組織材料として機能する。
一実施形態において、ＲＮＡｉコンストラクトの投与後のインビボでの標的のＲＩＳＣ媒介性切断の検証は、５’－ＲＡＣＥ又は当該技術において知られているプロトコルの改変（Ｌａｓｈａｍ Ａ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，３８（３）ｐ－ｅｌ９）（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ ４４１：１１１－４）を実行することによって行われる。
本明細書中で開示される全てのリボ核酸配列は、配列中のウラシル塩基をチミン塩基に置換することによって、デオキシリボ核酸配列に変換することができることが理解される。同様に、本明細書中で開示される全てのデオキシリボ核酸配列は、配列中のチミン塩基をウラシル塩基と置換することによって、リボ核酸配列に変換することができる。本明細書中で開示される全ての配列のデオキシリボ核酸配列、リボ核酸配列、並びにデオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドの混合物を含有する配列が、本発明に含まれる。
加えて、本明細書中で開示されるあらゆる核酸配列は、化学修飾のあらゆる組合せによって修飾されていてよい。当業者であれば、特定の場合において、修飾ポリヌクレオチドを記載するための「ＲＮＡ」又は「ＤＮＡ」のような指定が任意であることを容易に理解するであろう。例えば、リボース糖上に２’－ＯＨ置換基、そしてチミン塩基を有するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは、修飾糖を有するＤＮＡ分子（ＤＮＡの元から存在する２’－Ｈについて、２’－ＯＨ）又は修飾塩基（ＲＮＡの元から存在するウラシルについて、チミン（メチル化ウラシル））を有するＲＮＡ分子と記載され得る。
したがって、本明細書中で提供される核酸配列は、配列表のものが挙げられるがこれらに限定されず、修飾核酸塩基を有するような核酸が挙げられるがこれらに限定されない、元から存在する、又は修飾されたＲＮＡ及び／又はＤＮＡのあらゆる組合せを含有する核酸を包含することが意図される。更なる例として、限定するものではないが、配列「ＡＴＣＧＡＴＣＧ」を有するポリヌクレオチドは、修飾されているか修飾されていないかに拘わらず、ＲＮＡ塩基、例えば配列「ＡＵＣＧＡＵＣＧ」を有するもの、並びに「ＡＵＣＧＡＴＣＧ」等の一部のＤＮＡ塩基及び一部のＲＮＡ塩基を有するもの、並びに「ＡＴｍｅＣＧＡＵＣＧ」等の他の修飾塩基を有するポリヌクレオチドを含むような化合物が挙げられるがこれらに限定されない配列を有するあらゆるポリヌクレオチドを包含し、配列中、ｍｅＣは、５位にメチル基を含むシトシン塩基を示す。
実施された実験及び達成された結果を含む以下の実施例は、例示の目的のみのために提供されるものであり、添付の特許請求の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
参照による組込み
本明細書中で言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、個々の刊行物、特許、又は特許出願が具体的且つ個別に、参照によって組み込まれることが示されているかの如く、参照によって本明細書に組み込まれる。しかしながら、本明細書における参考文献の引用は、そのような参考文献が本発明の先行技術であることを認めるものとして解釈されるべきではない。参照により組み込まれる参考文献において提供される定義又は用語のいずれかが、本明細書中で提供される用語及び考察と異なる限り、本用語及び本定義が優先される。
均等物
上述の本明細書は、当業者が本発明を実施するのに十分であると考えられる。上述の説明及び例は、本発明の特定の好ましい実施形態を詳細に説明し、そして本発明者らによって考えられた最良の形態を記載するものである。しかしながら、前述の内容がいかに詳細に説明されていたとしても、本発明は、多くの方法で実施され得、そして添付の特許請求の範囲及びそのあらゆる均等物に従って本発明が解釈されるべきであることが理解されるであろう。
実施された実験及び達成された結果を含む以下の実施例は、例示の目的のみのために提供されるものであり、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
実施例１：修飾ＳＣＡＰ ｓｉＲＮＡ分子の選択、設計、及び合成
ステロール調節要素結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ） 切断活性化タンパク質（ＳＣＡＰ）を標的化する治療用ｓｉＲＮＡ分子のための最適な配列の識別及び選択を、ヒトＳＣＡＰ転写物（ＮＭ＿０１２２３５）のバイオインフォマティクス分析を用いて識別した。表１は、治療特性を有すると識別された配列を示す。種々の配列の全体を通じて、「ｉｎｖＡｂ」は、反転脱塩基ヌクレオチドである。
Figure 2022534402000003
Figure 2022534402000004
Figure 2022534402000005
Figure 2022534402000006
Figure 2022534402000007
ＳＣＡＰ ｓｉＲＮＡ配列の効力及びインビボ安定性を向上させるために、化学修飾をＳＣＡＰ ｓｉＲＮＡ分子中に組み込んだ。具体的には、リボース糖の２’－Ｏ－メチル及び２’－フルオロ修飾を、ＳＣＡＰ ｓｉＲＮＡ内の特定の位置に組み込んだ。また、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を、アンチセンス配列及び／又はセンス配列の末端に組み込んだ。以下の表２は、修飾ＳＣＡＰ ｓｉＲＮＡの各々について、センス配列及びアンチセンス配列における修飾を示す。表２中のヌクレオチド配列は、以下の表記法に従って列記される。Ａ、Ｕ、Ｇ、及びＣ＝対応するリボヌクレオチド；ｄｃ及びｄＧ＝対応するデオキシリボヌクレオチド；ｄＴ＝デオキシチミジン；ａ、ｕ、ｇ、及びｃ＝対応する２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド；Ａｆ、Ｕｆ、Ｇｆ、及びＣｆ＝対応する２’－デオキシ－２’－フルオロ（「２’－フルオロ」）リボヌクレオチド；［ＩｎｖＡｂ］は反転脱塩基残基である；［Ａｂ］は脱塩基残基である；ＧＮＡはグリコール核酸であり、ＧＮＡ骨格を有する塩基が、ＡｇＮ、ＵｇＮ、ＣｇＮ、及びＧｇＮとして示される。配列中の「ｓ」の挿入は、２つの隣接するヌクレオチドがホスホロチオジエステル基（例えば、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合）によって連結されていることを示す。特に示されない限り、他の全てのヌクレオチドは、３’－５’ホスホジエステル基によって連結されている。表２中のｓｉＲＮＡ化合物の各々は、双方の鎖の３’末端に２ヌクレオチドのオーバーハング、又は一方若しくは双方の末端に平滑末端を有する１９～２１塩基対の二重鎖領域を含む。各［ホスファート］は、以下のＧａｌＮＡｃ構造に結合していた：
Figure 2022534402000008
 式中、Ｘ＝Ｏ又はＳである。
Figure 2022534402000009
Figure 2022534402000010
Figure 2022534402000011
Figure 2022534402000012
Figure 2022534402000013
Figure 2022534402000014
Figure 2022534402000015
Figure 2022534402000016
実施例２：ＲＮＡ ＦＩＳＨアッセイにおける選択したＳＣＡＰ ｓｉＲＮＡ分子の有効性
完全に化学修飾されたｓｉＲＮＡのパネルを調製して、ｍＲＮＡノックダウンの効力及び選択性をインビトロで試験した。各ｓｉＲＮＡ二重鎖は、２つの鎖であるセンス鎖又は「パッセンジャ」鎖、及びアンチセンス鎖又は「ガイド」鎖からなった。そして、特定のヌクレオチドのリボースにおける、元から存在する２’－ＯＨの置換と共に、実施例１に記載されている。場合によっては、一方の鎖又は双方の鎖でのホスホジエステルヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエートで置き換えられて、エキソヌクレアーゼによる分解が引き下げられた。
ＲＮＡ ＦＩＳＨ（蛍光インサイチュハイブリダイゼーション）アッセイを実行して、ＳＣＡＰ ｍＲＮＡノックダウンを試験ｓｉＲＮＡによって測定した。Ｈｅｐ３Ｂ（ＡＴＣＣから購入した）を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ，Ｓｉｇｍａ）及び１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐ－Ｓ，Ｃｏｒｎｉｎｇ）を補充した最小必須培地（ＭＥＭ，Ｃｏｒｎｉｎｇ）中で培養した。ｓｉＲＮＡトランスフェクションを、以下のように実施した：１μＬの試験ｓｉＲＮＡ及び４μＬのプレーンＭＥＭを、ＢｉｏＭｅｋ ＦＸ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）によって、ＰＤＬでコーティングしたＣｅｌｌＣａｒｒｉｅｒ－３８４ Ｕｌｔｒａアッセイプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）に加えた。次に、プレーンＭＥＭ中に予め希釈した５μＬのリポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（５μＬ ＭＥＭ中０．０３５μＬのＲＮＡｉＭＡＸ）を、Ｍｕｌｔｉｄｒｏｐ Ｃｏｍｂｉ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｄｉｓｐｅｎｓｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によってアッセイプレート中に分注した。室温（ＲＴ）でのｓｉＲＮＡ／ＲＮＡｉＭＡＸ混合物の２０分のインキュベーション後に、１０％ＦＢＳ及び１％Ｐ－Ｓを補充したＭＥＭ中３０μＬのＨｅｐ３Ｂ細胞（ウェル当たり２０００細胞）を、Ｍｕｌｔｉｄｒｏｐ Ｃｏｍｂｉ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｄｉｓｐｅｎｓｅｒを用いてトランスフェクション複合体に加えて、アッセイプレートを室温にて２０分間落ち着かせてから、インキュベータの方へ動かした。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２にて７２時間インキュベートした。ＶｉｅｗＲＮＡ ＩＳＨ細胞アッセイを、リキッドハンドリングのための社内でアセンブルした自動ＦＩＳＨアッセイプラットフォームを使用するメーカーのプロトコル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に従って実施した。手短に言えば、細胞を４％ホルムアルデヒド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中でＲＴにて１５分間固定して、界面活性剤によりＲＴにて３分間透過処理してから、プロテアーゼ溶液によりＲＴにて１０分間処理した。標的特異的プローブ対（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のインキュベーションを３時間行った一方、Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｅｒ、Ａｍｐｌｉｆｉｅｒ及びＬａｂｅｌ Ｐｒｏｂｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に関してはそれぞれ１時間であった。全てのハイブリダイゼーション工程を、Ｃｙｔｏｍａｔ ２ Ｃ－ＬＩＮ自動インキュベータ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で４０℃にて行った。ハイブリダイゼーション反応の後、細胞をＨｏｅｃｈｓｔ及びＣｅｌｌＭａｓｋ Ｂｌｕｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で３０分間染色してから、Ｏｐｅｒａ Ｐｈｅｎｉｘ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で画像化した。画像を、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ Ｉｍａｇｅ Ｄａｔａ Ｓｔｏｒａｇｅ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて分析して、細胞当たりの平均スポット数を得た。スポット数を、高い（リン酸緩衝生理食塩水を含有、Ｃｏｒｎｉｎｇ）、そして低い（標的プローブ対を含まない）対照ウェルを用いて正規化した。総ｓｉＲＮＡ濃度に対して正規化された値をプロットして、データを、Ｇｅｎｅｄａｔａ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ（Ｇｅｎｅｄａｔａ）で４パラメータのシグモイドモデルに当てはめて、ＩＣ５０及び最大活性を得た。
Ｈｅｐ３Ｂ細胞についてのＲＮＡ ＦＩＳＨアッセイの結果を、表３中に示す。値は、ＳＣＡＰ ｍＲＮＡのノックダウンを表す。
Figure 2022534402000017
実施例３：ＳＣＡＰ ｓｉＲＮＡ配列のサイレンシング有効性を試験するインビボサイレンシング研究
９～１０週齢のＣ５７Ｂｌ６雄を、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得て、Ａｍｇｅｎガイドライン及びＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓ（ＩＡＣＵＣ）プロトコルに従って収容した。当該動物を、体重に従ってランダム化して、６頭を各ｓｉＲＮＡトリガー配列に無作為に割り当てた。０日目に、コホートにＰＢＳを、又は特定のｓｉＲＮＡ化合物を３ｍｇ／ｋｇ体重にて単回皮下投薬した。２９日目に、マウスをＣＯ２下で安楽死させて、肝臓左葉を各動物から収穫した。組織を小さいピースに切り分けて、直ちに、更なる下流側アッセイのために液体窒素中で急速凍結させた。
ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、メーカーのガイドラインに従って単離した。２μｇのＲＮＡを、ＤＮａｓｅ Ｉ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で処理して、Ｔａｑｍａｎ ＲＮＡ ｔｏ ＣＴ，Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いる定量ＰＣＲ反応にかけた。マウスＳＣＡＰ及びＧＡＰＤＨのための遺伝子特異的Ｔａｑｍａｎ Ｐｒｏｂｅを用いて、ｍＲＮＡ発現を定量化した。ＧＡＰＤＨを内部標準として用いた。ｑＰＣＲ実験を、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ７ Ｆｌｅｘ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを用いて実施した。発現レベルを、デルタＣＴ法を用いて算出した。
Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓの９～１０週齢のＯｂ／Ｏｂマウス（Ｂｌ６バックグラウンドのＯｂ／Ｏｂ）によるインビボスクリーニングを、Ｃ５７Ｂｌ６マウスについて記載するのと同じ方法を用いて実施した。
本明細書中に記載される全ての動物実験は、ＡｍｇｅｎのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）によって承認されており、Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ，８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ（Ｕ．Ｓ．）Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ．，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｕ．Ｓ．）及びＮａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｉｅｓ Ｐｒｅｓｓ（Ｕ．Ｓ．）（２０１１）Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃａｒｅ ａｎｄ ｕｓｅ ｏｆ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｎｉｍａｌｓ．８ｔｈ Ｅｄ．，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｉｅｓ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）に従ってケアした。マウスを、空調された空間において２２±２℃、１２時間明；１２時間暗の周期（０６００～１８００時）にて単独飼育した。動物は、別段の指示がない限り、自由裁量で、通常の飼料食餌（Ｅｎｖｉｇｏ，２９２０Ｘ）及び自動給水システムを介した水（逆浸透精製）にアクセスした。終了時に、血液を、深麻酔下で心臓穿刺によって収集してから、Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ａｎｄ Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ（ＡＡＡＬＡＣ）ガイドラインに従って、二次的な物理的方法によって安楽死させた。
相対的ノックダウンに関するデータを表４に示しており、これは、２５日目の３ｍｇ／ｋｇの用量での相対的ノックダウンを示す。ＳＣＡＰノックダウンは、ＳＣＡＰ ｍＲＮＡレベルの低下パーセンテージである。
Figure 2022534402000018
実施例４：ＲＮＡ ＦＩＳＨアッセイにおける選択したＳＣＡＰ ｓｉＲＮＡ分子の有効性
完全に化学修飾されたｓｉＲＮＡのパネルを調製して、ｍＲＮＡノックダウンの効力及び選択性をインビトロで試験した。各ｓｉＲＮＡ二重鎖は、２つの鎖であるセンス鎖又は「パッセンジャ」鎖、及びアンチセンス鎖又は「ガイド」鎖からなった。そして、特定のヌクレオチドのリボースにおける、元から存在する２’－ＯＨの置換と共に、実施例１に記載されている。場合によっては、一方の鎖又は双方の鎖でのホスホジエステルヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエートで置き換えられて、エキソヌクレアーゼによる分解が引き下げられた。
実施例２に記載されるようにＲＮＡ ＦＩＳＨを実施した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２にて７２時間インキュベートした。ＶｉｅｗＲＮＡ ＩＳＨ細胞アッセイを、リキッドハンドリングのための社内でアセンブルした自動ＦＩＳＨアッセイプラットフォームを用いるメーカーのプロトコル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に従って実施した。手短に言えば、細胞を４％ホルムアルデヒド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中でＲＴにて１５分間固定して、界面活性剤によりＲＴにて３分間透過処理してから、プロテアーゼ溶液によりＲＴにて１０分間処理した。標的特異的プローブ対（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のインキュベーションを３時間行った一方、Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｅｒ、Ａｍｐｌｉｆｉｅｒ及びＬａｂｅｌ Ｐｒｏｂｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に関してはそれぞれ１時間であった。全てのハイブリダイゼーション工程を、Ｃｙｔｏｍａｔ ２ Ｃ－ＬＩＮ自動インキュベータ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で４０℃にて行った。ハイブリダイゼーション反応の後、細胞をＨｏｅｃｈｓｔ及びＣｅｌｌＭａｓｋ Ｂｌｕｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で３０分間染色してから、Ｏｐｅｒａ Ｐｈｅｎｉｘ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で画像化した。画像を、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ Ｉｍａｇｅ Ｄａｔａ Ｓｔｏｒａｇｅ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて分析して、細胞当たりの平均スポット数を得た。スポット数を、高い（リン酸緩衝生理食塩水を含有、Ｃｏｒｎｉｎｇ）、そして低い（標的プローブ対を含まない）対照ウェルを用いて正規化した。総ｓｉＲＮＡ濃度に対して正規化された値をプロットして、データを、Ｇｅｎｅｄａｔａ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ（Ｇｅｎｅｄａｔａ）で４パラメータのシグモイドモデルに当てはめて、ＩＣ５０及び最大活性を得た。
Ｈｅｐ３Ｂ細胞についてのＲＮＡ ＦＩＳＨアッセイの結果を、二重鎖Ｄ－２０８０～Ｄ－２１０９について表５、トリガーＤ－２１１０～Ｄ－２１２４について表６、そしてトリガーＤ－２１２５～Ｄ２１４６について表７中に示す。最大活性についての負の値は、活性のノックダウンを示す。
Figure 2022534402000019
Figure 2022534402000020
Figure 2022534402000021
実施例５：不安定化塩基で修飾したｓｉＲＮＡトリガーのスクリーニング
９～１０週齢のＣ５７Ｂｌ６／Ｊ雄マウスをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得て、社内で順応させた。マウスを秤量して、８頭の動物の群にランダム化した。これらの動物を、ｋｇ体重当たり３ｍｇにてＳＣＡＰ ｓｉＲＮＡトリガーを皮下投薬した。ストックｓｉＲＮＡ化合物を、投薬直前に、カルシウム及びマグネシウムのないリン酸バッファ溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，１４１９０－１３６）中に希釈した。ｓｉＲＮＡ処置の３０日後に、動物を安楽死させて、肝臓を収穫した。新たに単離した肝臓左葉を、直ちに、液体窒素中で急速凍結させた。ＱＩＡｃｕｂｅ ＨＴ機器ＲＮｅａｓｙ ９６ ＱＩＡｃｕｂｅ ＨＴキットを用いて、メーカーのプロトコルに従って、３０～５０ｍｇの肝臓組織を用いてＲＮＡを単離した。２～４μｇのＲＮＡを、ＲＱ１ ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍ６１０１）で処理した。１０ｎｇのＤＮａｓｅ消化ＲＮＡを、Ｑｕａｎｔ Ｓｔｕｄｉｏ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲマシンでのＴａｑＭａｎ ＲＮＡ ｔｏ ＣＴ １ステップキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）ランを用いるリアルタイムｑＰＣＲにかけた。マウスＳＣＡＰ（Ｍｍ０１２５０１７６＿ｍ１）及びＧＡＰＤＨ（４３５２９３２Ｅ）用のＴａｑＭａｎプローブを用いて、ＳＣＡＰ ｓｉＲＮＡ処置群におけるＳＣＡＰ発現の倍率変化を、ＰＢＳ（バッファ対照）群と比較して算出した。データを、ｓｉＲＮＡ処置群において、ＰＢＳ群に対するノックダウンパーセントとして表す。種々の不安定化修飾を有する５つのトリガー配列、Ｄ－２０４０、Ｄ－２０４１、Ｄ－２０４２、Ｄ－２０４４、及びＤ－２０４５を試験した。不安定化塩基修飾は、ＧＮＡ及び脱塩基修飾パターンの双方を含んだ。データを表８に示す。それぞれの場合において、不安定化塩基を含有する修飾パターンは、親トリガー修飾と比較して、より低いＳＣＡＰ ｍＲＮＡ発現をもたらした。二重鎖を、ＳＣＡＰノックダウン％で示す。
Figure 2022534402000022
実施例６：Ｃ５７Ｂｌ６／Ｊ雄マウスにおけるｓｉＲＮＡトリガーのスクリーニング
Ｄ－２０４０、Ｄ－２０４５、Ｄ－２０４２、Ｄ－２０４１、及びＤ－２０４４配列を、異なる化学修飾パターンで追加的に修飾した。これらの修飾されたトリガーを、元々のトリガー修飾パターンと比較した。群１～５は、トリガー配列Ｄ－２０４０及び修飾パターンのバリエーションを含む。群６～１０は、トリガー配列Ｄ－２０４５及び修飾パターンのバリエーションを含む。群１１～１５は、トリガー配列Ｄ－２０４２及び修飾パターンのバリエーションを含む。群１６～２１は、トリガー配列Ｄ－２０４１及び修飾パターンのバリエーションを含む。群２２～２７は、トリガー配列Ｄ－２０４４及び修飾パターンのバリエーションを含む。インビボ研究の生存フェーズについて、１３～１５週齢のＣ５７Ｂｌ６／Ｊ雄マウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得て、社内で順応させた。マウスを秤量して、それぞれ８頭の動物の群にランダム化した。これらの動物を、ｋｇ体重当たり３ｍｇにてＳＣＡＰ ｓｉＲＮＡトリガーを皮下投薬した。ストックｓｉＲＮＡ化合物を、投薬前に、カルシウム及びマグネシウムのないリン酸バッファ溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，１４１９０－１３６）中に希釈した。ｓｉＲＮＡ処置の３０日後に、動物を安楽死させて、肝臓を収穫した。新たに単離した肝臓左葉を、直ちに、液体窒素中で急速凍結させた。ＱＩＡｃｕｂｅ ＨＴ機器ＲＮｅａｓｙ ９６ ＱＩＡｃｕｂｅ ＨＴキットを用いて、メーカーのプロトコルに従って、３０～５０ｍｇの肝臓組織を用いてＲＮＡを単離した。２～４μｇのＲＮＡを、ＲＱ１ ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍ６１０１）で処理した。１０ｎｇのＤＮａｓｅ消化ＲＮＡを、Ｑｕａｎｔ Ｓｔｕｄｉｏ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲマシンでのＴａｑＭａｎ ＲＮＡ ｔｏ ＣＴ １ステップキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）ランを用いるリアルタイムｑＰＣＲにかけた。マウスＳＣＡＰ（Ｍｍ０１２５０１７６＿ｍ１）及びＧＡＰＤＨ（４３５２９３２Ｅ）用のＴａｑＭａｎプローブを用いて、ｓｉＲＮＡ処置群におけるＳＣＡＰ発現の倍率変化を、ＰＢＳ（バッファ対照）群と比較して算出した。データを表９に示しており、ｓｉＲＮＡ処置群において、ＰＢＳ群に対するノックダウンパーセントとして表す。示すように、異なる修飾パターンが、異なるレベルのサイレンシングをもたらす。
Figure 2022534402000023
実施例７：Ｏｂ／Ｏｂ動物におけるＳＣＡＰのｓｉＲＮＡトリガーサイレンシング
１０～１２週齢の雄Ｂ６．Ｖ－Ｌｅｐ ｏｂ／Ｊ（６３２）マウス（Ｏｂ／Ｏｂマウスとしても知られている）を、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得た。順化の後に、これらの動物をｎ＝８の群にランダム化した。マウスを、先の実施例におけるスクリーニング実験から識別される、化学修飾で修飾したＳＣＡＰ ｓｉＲＮＡトリガーで処置した。マウスに、Ｋｇ体重当たり３ミリグラムのｓｉＲＮＡを皮下投薬した。ｓｉＲＮＡ投与の２０日後、そして３０日後に、動物を犠牲にした。安楽死の後に、肝臓左葉を単離して、直ちに、液体窒素中で急速凍結させた。ＱＩＡｃｕｂｅ ＨＴ機器ＲＮｅａｓｙ ９６ ＱＩＡｃｕｂｅ ＨＴキットを用いて、メーカーのプロトコルに従って、３０～５０ｍｇの肝臓組織を用いてＲＮＡを単離した。２～４μｇのＲＮＡを、ＲＱ１ ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍ６１０１）で処理した。１０ｎｇのＤＮａｓｅ消化ＲＮＡを、Ｑｕａｎｔ Ｓｔｕｄｉｏ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲマシンでのＴａｑＭａｎ ＲＮＡ ｔｏ ＣＴ １ステップキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）ランを用いるリアルタイムｑＰＣＲにかけた。マウスＳＣＡＰ（Ｍｍ０１２５０１７６＿ｍ１）及びＧＡＰＤＨ（４３５２９３２Ｅ）用のＴａｑＭａｎプローブを用いて、ｓｉＲＮＡ処置群におけるＳＣＡＰ発現の倍率変化を、ＰＢＳ（バッファ対照）群と比較して算出した。データを表１０に示しており、ｓｉＲＮＡ処置群において、ＰＢＳ群に対するノックダウンパーセントとして表す。
Figure 2022534402000024
実施例８：ＳＣＡＰトリガーによる有効性研究
有効性モデルにおけるＮＡＳＨ表現型の予防及び救出
１］アミリン（ＡＭＬＮ）ＡＭＬＹＮモデル
Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、株：Ｂ６．Ｖ－Ｌｅｐ ｏｂ／Ｊ（６３２）から得た５週齢の肥満雄マウス（Ｏｂ／Ｏｂ）を、高脂肪、高コレステロール飼料で給餌することによって、アミリン肝臓ＮＡＳＨ（ＡＭＬＮ）モデルを開発した。４５％脂肪、３６％炭水化物、及び２％コレステロール飼料を、Ｅｎｖｉｇｏ、カタログ番号：ＴＤ１７０７４８から得た。通常の水を、水中５５％フルクトース及び４６％グルコースを含有する糖溶液で置き換えた。マウスを８つの群にランダム化して、Ｔｒｉｇｇｅｒ Ｄ－２０４０で、又はＴｒｉｇｇｅｒ Ｄ－２１４７で、又はＰＢＳで処理した。Ｄ－２１４７は、ヌクレオチド９～１１がスイッチされているＴｒｉｇｇｅｒ Ｄ－２０４０に対するシード配列適合対照である。マウスに、ＡＭＬＮ飼料の８週、１０週、そして１２週目のｋｇ体重当たり３ミリグラム用量をＱ２Ｄで皮下投薬した。ストックｓｉＲＮＡ化合物を、投薬直前に、カルシウム及びマグネシウムのないリン酸バッファ溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，１４１９０－１３６）中に希釈した。６週の継続的なＳＣＡＰサイレンシングの後に、マウスを、飼料の１４週目に収穫した。収穫の間、イソフルラン下での安楽死の後に、肝臓中葉を、１０％中性緩衝ホルマリン中で固定した。ホルマリン固定した中葉を、免疫組織化学（ＩＨＣ）によって、メーカーの説明書に従って、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｄａｋｏ，ＣＳ７００３０－２、ＣＳ７０１３０－２）、トリクローム染色、並びにアルファ平滑筋アクチン（ａＳＭＡ）発現用に、さらにプロセシングした。線維症及び星細胞活性化についてスコア化することによってＮＡＳＨリードアウトを行い、そして委員会認証病理医がリーディングを実施した。
肝臓左葉を、液体窒素中で急速凍結させた。急速凍結した組織を、実施例７に詳述されるように、ＲＮＡ抽出、及び遺伝子発現の評価のためにさらにプロセシングした。さらに、イソプロパノール中で５０～１００ｍｇの急速凍結肝臓組織を均質化することによって、肝臓トリグリセリド含量を測定した。サンプルを均質化して、氷中で１時間インキュベートしてから、１００００ｒｐｍにて１０分間スピンした。上清を、クリーンな深い９６ウェルプレートに移した。トリグリセリド含量を、比色アッセイ（Ｉｎｆｉｎｉｔｙ Ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＴＲ２２４２１）によって、そして標準（Ｐｏｉｎｔｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｔ７５３１－ＳＴＤ）を使用して、メーカーの指示書に従って判定した。データを、組織１ミリグラム当たりのトリグリセリドのミリグラムとして表す。
収穫中に捕捉される追加のエンドポイントは、肝臓重量を測定することを含む。全肝臓重量（グラム）及び末期の体重（グラム）の比率を分析して、肝腫瘤の変化を監視した。ＳＣＡＰサイレンシングは、ＰＣＳＫ９発現を阻害する。血清ＰＣＳＫ９レベルを、ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＰＣ９００）を用いて、バイオマーカーとして測定した。
図１Ａは、ＰＢＳ対照群に対する倍率変化として表されるＳＣＡＰ ｍＲＮＡの発現を示す。Ｔｒｉｇｇｅｒ Ｄ－２０４０処置群は、約８５％ＳＣＡＰサイレンシング（８５．３％）を達成した一方、Ｄ－２１４７処置群において有意な変化はなかった。図１Ｂは、Ｔｒｉｇｇｅｒ Ｄ－２０４０処置マウスにおいて、末期の肝臓重量：体重比の有意な引下げを示す。図１Ｃは、Ｔｒｉｇｇｅｒ Ｄ－２０４０処置マウスにおいて、肝臓トリグリセリドの低下を示す一方、Ｄ－２１４７処置群においては不変のままであった。図１Ｄにおいて、血清ＰＣＳＫ９レベルを測定した。有効なＳＣＡＰサイレンシングが、血清ＰＣＳＫ９レベルを有意に引き下げた。図１Ｅ及び図１Ｆにおいて、線維症（トリクローム染色）及び星細胞活性化（ａＳＭＡ免疫組織化学）の病理リードアウトを示す。トリガーＤ－２０４０によるＳＣＡＰサイレンシングは、線維症スコアを有意に引き下げた。このことは、ＮＡＳＨ結果の向上を示唆している。統計有意性を、Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を用いる一元配置ＡＮＯＶＡによって測定した。アスタリスクは、調整ｐ値（＊＊＊＊ｐ値＜０．０００１、＊＊＊ｐ値＜０．００１）を示す。
２］ＡＬＩＯＳモデル
また、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｌｉｆｅｓｔｙｌｅ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｏｂｅｓｉｔｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅマウスモデル（ＡＬＩＯＳ）を用いて、ＳＣＡＰトリガーの有効性を試験した。５週齢にてＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得たＣ５７Ｂｌ６雄マウスに、ＡＬＩＯＳ飼料を給餌した。これは、コレステロール含量の引下げを除いて、ＡＭＬＮ飼料に類似している。ＡＬＩＯＳ飼料は、０．２％コレステロールを含有しており、Ｅｎｖｉｇｏから得た（カタログ番号ＴＤ１３０８８５）。通常の水を、水中５５％フルクトース及び４６％グルコースを含有する糖溶液で置き換えた。動物にＡＬＩＯＳ飼料を給餌した１８週後に、マウスに６週間、１ｋｇ体重当たり３ミリグラムを隔週で皮下投薬した。マウスをｎ＝４～５の群にランダム化して、Ｔｒｉｇｇｅｒ Ｄ－２０４０、Ｔｒｉｇｇｅｒ Ｄ－２０４２、又はＰＢＳで処置した。マウスを、６ヵ月の飼料及び６週のＳＣＡＰサイレンシングの後に収穫した。以前の有効性研究と同様に、エンドポイント分析は、ＳＣＡＰメッセージレベル、末期の肝臓重量体重比、肝臓トリグリセリドレベル、血清ＰＣＳＫ９レベル、並びにトリクローム染色を用いた線維症、及びアルファ平滑筋アクチン免疫組織化学染色を用いた星細胞活性化の病理学的リードアウトを含んだ。
図２Ａは、ＳＣＡＰ ｍＲＮＡ発現を示す。データを、ＰＢＳ群に対する倍率変化として表す。ＳＣＡＰは双方とも、Ｄ－２０４０をトリガーし、そしてＤ－２０４２は、ＳＣＡＰ ｍＲＮＡの８５％超の引下げを示した。図２Ｂにおいて、有意な引下げが、ＳＣＡＰトリガーＤ－２０４０及びＤ－２０４２で処置した群における末期の肝臓重量／体重（ＬＷ／ＢＷ）比において観察された。図２Ｃは、様々な群における肝臓トリグリセリドレベルを示す。ＳＣＡＰの投与は、Ｄ－２０４０をトリガーし、そしてＤ－２０４２は、緩衝対照群と比較した場合、肝臓トリグリセリド含量を有意に引き下げた。図２Ｄにおいて、血清ＰＣＳＫ９を、先に記載されるＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。ＳＣＡＰ ｓｉＲＮＡ処置群における血清ＰＣＳＫ９のレベルは、ＰＢＳ群と比較して、有意に低下した。図２Ｅ及び図２Ｆは、トリクローム染色によって測定した線維症の病理リードアウト、及び星細胞活性化を示すアルファ平滑筋アクチンの免疫染色を示す。どちらのリードアウトも、ＳＣＡＰサイレンシング後の引下げを示す。これは、ＳＣＡＰサイレンシング後のＮＡＳＨ表現型の救出を示唆している。統計有意性を、Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を用いる一元配置ＡＮＯＶＡによって測定した。アスタリスクは、調整ｐ値（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．００５、＊＊ｐ＜０．０１、及び＊ｐ＜０．０５）を示す。
実施例９：肝細胞癌を処置するＳＣＡＰ ｓｉＲＮＡの有効性を試験するためのＤＩＡＭＯＮＤモデルの利用
肝細胞癌患者の５０％超が、非アルコール性脂肪性肝疾患を患う。ＨＣＣの更なる進行を予防するＳＣＡＰ ｓｉＲＮＡの有効性を試験するために、化学モディファイアを用いずに、長期間にわたるＮＡＳＨ飼料でＨＣＣが明示されるモデルを実行する。そのようなモデルは、ヒト病態生理学をより十分に表す。そのような一モデルは、非アルコール性脂肪性肝疾患の飼料誘導動物モデル（又はＤＩＡＭＯＮＤ）である。これは、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ及び１２９１ＳｖＩｍＪのバックグラウンドから得られる固有の同系動物株を用いて開発される。８週齢から始まって、この遺伝子間コロニー由来の雄マウスに、０．１％コレステロールを含有する高脂肪、高炭水化物飼料（脂肪由来の４２％ｋｃａｌ）を給餌する。また、飲用水を、高フルクトース－グルコース溶液で置き換える。この飼料の３２週後に、モデルはＨＣＣを発病する。５１週目までに、ＤＩＡＭＯＮＤモデル肝臓組織は、腫瘍の大きな領域、及び肝細胞内の変更の焦点を示す。また、モデルは非常に浸透（ｐｅｎｅｔｒａｎｔ）している。有効性を試験するために、ＳＣＡＰ ｓｉＲＮＡ及びビヒクル対照を、飼料の４０週目に投与する。マウスに、一定の間隔をおいて６～１０週間、ビヒクル又はＳＣＡＰ ｓｉＲＮＡを再投与して、ＳＣＡＰ遺伝子発現引下げを確実にする。エンドポイント分析は、肝細胞腫瘍負荷転移性腫瘍インデックスの病理試験、Ｋｉ６７発現を用いた腫瘍増殖の評価、及びＣＤ３１発現を用いた腫瘍血管新生の程度を含む。また、ｑＰＣＲ及びタンパク質分析を評価して、標的及び下流経路の有効なサイレンシングを確認する。
実施例１０：ＨＣＣのＨｕｈ－７肝臓異種移植片モデルにおけるＳＣＡＰ ｓｉＲＮＡの評価
ＳＣＡＰ ｓｉＲＮＡを、同所性の（ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ）Ｈｕｈ－７肝臓異種移植片モデルを利用して評価する。６週齢ＢＡＬＢ／ｃ無胸腺ヌードマウスに、３３％マトリゲル入り細胞培地中に懸濁した１００万個のＨｕｈ－７細胞を肝内注射した。その後、マウスを、ビヒクル又はＳＣＡＰ ｓｉＲＮＡによる処置用に、群に分ける。ビヒクル又はＳＣＡＰ ｓｉＲＮＡを、一定の間隔をおいて（例えば隔週に）再投与して、ＳＣＡＰ ｍＲＮＡの持続的引下げを確実にする。最初のビヒクル処理又はｓｉＲＮＡ処置の後の種々の時点（例えば４週）にて、マウスを安楽死させて、肝臓を収穫して、４％パラホルムアルデヒド中で固定する。ＳＣＡＰ ｓｉＲＮＡ処置の有効性を理解するために、腫瘍負荷を測定する。また、ｑＰＣＲ及びタンパク質分析を評価して、標的の有効なサイレンシングを確認する。

Claims (39)

  1. センス鎖及びアンチセンス鎖を含むＲＮＡｉコンストラクトであって、前記アンチセンス鎖は、表１又は表２に列記されるアンチセンス配列とは３以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを有する領域を含み、前記ＲＮＡｉコンストラクトは、ＳＲＥＢＰ切断活性化タンパク質（ＳＣＡＰ）の発現を阻害する、ＲＮＡｉコンストラクト。
  2. 前記アンチセンス鎖は、ＳＣＡＰのｍＲＮＡ配列と相補的な領域を含む、請求項１に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  3. 前記センス鎖は、表１又は表２に列記されるアンチセンス配列とは３以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを有する領域を含む、請求項１又は２に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  4. 前記センス鎖は、前記アンチセンス鎖の配列と十分に相補的であり約１５～約３０塩基対長の二重鎖領域を形成する配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  5. 前記二重鎖領域は、約１７～約２４塩基対長である、請求項４に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  6. 前記二重鎖領域は、約１９～約２１塩基対長である、請求項４に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  7. 前記二重鎖領域は、１９塩基対長である、請求項６に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  8. 前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖は、それぞれ約１５～約３０ヌクレオチド長である、請求項４～７のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  9. 前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖は、それぞれ約１９～約２７ヌクレオチド長である、請求項８に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  10. 前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖は、それぞれ約２１～約２５ヌクレオチド長である、請求項８に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  11. 前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖は、それぞれ約２１～約２３ヌクレオチド長である、請求項８に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  12. 少なくとも１つの平滑末端を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  13. １～４個の不対ヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチドオーバーハングを含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  14. 前記ヌクレオチドオーバーハングは、２個の不対ヌクレオチドを有する、請求項１３に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  15. 前記センス鎖の３’末端、前記アンチセンス鎖の３’末端、又は前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖の双方の３’末端にヌクレオチドオーバーハングを含む、請求項１３又は１４に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  16. 前記ヌクレオチドオーバーハングは、５’－ＵＵ－３’ジヌクレオチド又は５’－ｄＴｄＴ－３’ジヌクレオチドを含む、請求項１３～１５のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  17. 少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  18. 前記修飾ヌクレオチドは、２’－修飾ヌクレオチドである、請求項１７に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  19. 前記修飾ヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、二環式核酸（ＢＮＡ）、グリコール核酸、反転塩基、又はそれらの組合せである、請求項１７に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  20. 前記修飾ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、又はそれらの組合せである、請求項１９に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  21. 前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖内の全てのヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドである、請求項１７に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  22. 前記修飾ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、又はそれらの組合せである、請求項２１に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  23. 少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  24. 前記アンチセンス鎖の３’末端に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項２３に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  25. 前記アンチセンス鎖の３’末端及び５’末端の双方に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、前記センス鎖の５’末端に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項２３に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  26. 前記アンチセンス鎖は、表１又は表２に列記されるアンチセンス配列から選択される配列を含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  27. 前記センス鎖は、表１又は表２に列記されるセンス配列から選択される配列を含む、請求項２６に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  28. 表１～表２のいずれか１つに列記される二重鎖化合物のいずれか１つである、請求項１～２７のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  29. 対照ＲＮＡｉコンストラクトとインキュベートされた肝細胞内でのＳＣＡＰ発現レベルと比較して、前記ＲＮＡｉコンストラクトとのインキュベーション後の肝細胞内でのＳＣＡＰの発現レベルを引き下げる、請求項１～２８のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  30. 前記肝細胞はＨｅｐ３Ｂ細胞である、請求項２９に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  31. インビトロでＨｅｐ３Ｂ細胞におけるＳＣＡＰ発現の少なくとも１０％を５μＭで阻害する、請求項１～３０のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  32. 約１ｎＭ未満のＩＣ５０でＨｅｐ３Ｂ細胞内でのＳＣＡＰ発現を阻害する、請求項１～３０のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  33. 請求項１～３２のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト、及び薬学的に許容される担体、賦形剤、又は希釈剤を含む医薬組成物。
  34. ＳＣＡＰの発現の引下げを必要とする患者においてＳＣＡＰの発現を引き下げる方法であって、請求項１～３２のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクトを前記患者に投与することを含む方法。
  35. 肝細胞内でのＳＣＡＰの発現レベルは、前記患者において、前記ＲＮＡｉコンストラクトの投与後に、前記ＲＮＡｉコンストラクトの投与を受けていない患者におけるＳＣＡＰ発現レベルと比較して引き下げられる、請求項３４に記載の方法。
  36. ＳＣＡＰ関連疾患を患っている対象を処置する方法であって、請求項１～３２のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト又は請求項３３の医薬組成物を前記対象に投与することを含む方法。
  37. 請求項１～３２のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト又は請求項３３の医薬組成物を前記対象に投与することは、ＳＣＡＰ遺伝子の発現の、少なくとも約１０％の引下げをもたらす、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記疾患は、脂肪肝（脂肪症）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、肝臓内での脂肪の蓄積、肝臓の炎症、肝細胞壊死、肝細胞癌、肝線維症、肥満、心筋梗塞、心不全、冠状動脈疾患、高コレステロール血症、又は非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）からなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
  39. センス鎖及びアンチセンス鎖を含むＲＮＡｉコンストラクトであって、前記アンチセンス鎖は、表１又は表２に列記されるアンチセンス配列とは３以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを有する領域を含み、請求項１～３２のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト又は請求項３３の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、ＳＣＡＰ関連疾患を処置する方法に使用されるＲＮＡｉコンストラクト。
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