JP2024012386A - PNPLA3発現を阻害するためのRNAiコンストラクト - Google Patents

PNPLA3発現を阻害するためのRNAiコンストラクト Download PDF

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Abstract

【課題】PNPLA3遺伝子の発現を低減するためのRNAiコンストラクト、及び該RNAiコンストラクトを使用する肝臓疾患、非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)を治療又は予防する方法を提供する。【解決手段】センス鎖及びアンチセンス鎖を含むRNAiコンストラクトであって、前記アンチセンス鎖が、特定の配列を有するアンチセンス配列から3ヌクレオチド以下異なる少なくとも15個の連続したヌクレオチドを有する領域を含み、且つ前記RNAiコンストラクトが、パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有3(PNPLA3)の発現を阻害する、RNAiコンストラクトとする。【選択図】なし

Description

関連出願
本願は2017年12月12日に出願された米国仮特許出願第62/597,841号の優先権を主張するものであり、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
本願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出された配列表を包含し、その配列表は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。2018年12月12日に作成された前記ASCIIの複製は、A-2219-WO-PCT_SL.txtと命名され、サイズは708,961バイトである。電子フォーマットの配列表における情報は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有3(PNPLA3)の肝臓発現を調節するための組成物及び方法に関し、特に、本発明は、RNA干渉によりPNPLA3発現を低減するための核酸に基づく治療薬及び非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)などの肝疾患を治療又は予防するためのそのような核酸に基づく治療薬を使用する方法に関する。
本願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出された配列表を包含し、その配列表は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。2018年12月12日に作成された前記ASCIIの複製は、A-2219-WO-PCT_SL.txtと命名され、サイズは708,961バイトである。
非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)は、様々な肝臓病理を含む世界で最も一般的な慢性肝疾患であり、その有病率は過去20年間で倍増し、現在では世界人口の約20%が罹患していると推定される(Sattar et al.(2014)BMJ 349:g4596;Loomba and Sanyal(2013)Nature Reviews Gastroenterology & hepatology 10(11):686-690;Kim and Kim(2017)Clin Gastroenterol Hepatol 15(4):474-485;Petta et al.(2016)Dig Liver Dis 48(3):333-342)。NAFLDは、肝臓中におけるトリグリセリドの蓄積から始まり、1)著しい飲酒歴がなく、且つ2)他の種類の肝疾患の診断が除外されている個体において、5%を超える肝細胞中において細胞質脂質小滴が存在することによって定義される(Zhu et al(2016)World J Gastroenterol 22(36):8226-33;Rinella(2015)JAMA 313(22):2263-73;Yki-Jarvinen(2016)Diabetologia 59(6):1104-11)。一部の個体において、脂肪症と呼ばれる肝臓への異所性脂肪の蓄積が、炎症及び肝細胞損傷を誘発し、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)と呼ばれるより進行した段階の疾患を引き起こす(Rinella、前掲)。2015年の時点で、7500万~1億人のアメリカ人がNAFLDを有すると予測され;NASHは、NAFLD診断のおよそ10~30%を占める(Rinella、前掲;Younossi et al(2016)Hepatology 64(5):1577-1586)。
以前にアディポニュートリン(ADPN)及びカルシウム非依存性ホスホリパーゼA2-イプシロン(iPLA(2)ε)として知られるパタチン様ホスホリパーゼドメイン含有3(PNPLA3)は、II型膜貫通タンパク質である(Wilson et al(2006)J Lipid Res 47(9):1940-9;Jenkins et al(2004)J Biol Chem 279(47):48968-75)。マウスにおいて脂肪生成中に誘導される膜結合型の脂肪に富むタンパク質として脂肪細胞で最初に同定されたが、現在では肝臓を含む他の組織において発現していることが明らかになっている(Wilson et al、前掲;Baulande et al(2001)J Biol Chem 276(36):33336-44;Moldes et al.(2006)Eur J Endocrinol 155(3):461-8;Faraj et al.(2006)J Endocrinol 191(2):427-35;Liu et al(2004)J Clin Endocrinol Metab 89(6):2684-9;Lake et al(2005)J Lipid Res 46(11):2477-87)。無細胞生化学系において、組換え体PNPLA3タンパク質は、トリアシルグリセロールリパーゼ又はアシル交換反応活性のいずれかを示すことができる(Jenkins et al.,前掲;Kumari et al(2012)Cell Metab 15(5):691-702;He et al (2010)J Biol Chem 285(9):6706-15)。肝細胞において、PNPLA3は、小胞体及び脂質膜上に発現され、主にトリアシルグリセロールヒドロラーゼ活性を示す(He et al.,前掲;Huang et al(2010)Proc Natl Acad Sci USA 107(17):7892-7;Ruhanen et al(2014)J Lipid Res 55(4):739-46;Pingitore et al.(2014)Biochim Biophys Acta 1841(4):574-80)。分泌性シグナルを欠いているが、データは、PNPLA3が分泌され、且つジスルフィド結合依存性多量体としてヒト血漿において見出され得ることを示す(Winberg et al.(2014)Biochem Biophys Res Commun 446(4):1114-9)。したがって、PNPLA3機能を標的とする新規の治療薬は、PNPLA3レベルを低減し、且つ非アルコール性脂肪性肝疾患などの肝臓学的疾患を治療する新規の手法となる。
Sattar et al.(2014)BMJ 349:g4596 Loomba and Sanyal(2013)Nature Reviews Gastroenterology & hepatology 10(11):686-690 Kim and Kim(2017)Clin Gastroenterol Hepatol 15(4):474-485 Petta et al.(2016)Dig Liver Dis 48(3):333-342 Zhu et al(2016)World J Gastroenterol 22(36):8226-33 Rinella(2015)JAMA 313(22):2263-73 Yki-Jarvinen(2016)Diabetologia 59(6):1104-11 Younossi et al(2016)Hepatology 64(5):1577-1586 Wilson et al(2006)J Lipid Res 47(9):1940-9 Jenkins et al(2004)J Biol Chem 279(47):48968-75 Baulande et al(2001)J Biol Chem 276(36):33336-44 Moldes et al.(2006)Eur J Endocrinol 155(3):461-8 Faraj et al.(2006)J Endocrinol 191(2):427-35 Liu et al(2004)J Clin Endocrinol Metab 89(6):2684-9 Lake et al(2005)J Lipid Res 46(11):2477-87 Kumari et al(2012)Cell Metab 15(5):691-702 He et al (2010)J Biol Chem 285(9):6706-15 Huang et al(2010)Proc Natl Acad Sci USA 107(17):7892-7 Ruhanen et al(2014)J Lipid Res 55(4):739-46 Pingitore et al.(2014)Biochim Biophys Acta 1841(4):574-80 Winberg et al.(2014)Biochem Biophys Res Commun 446(4):1114-9
本発明は、PNPLA3遺伝子を標的化し、且つ肝臓細胞におけるPNPLA3発現を低減するRNAiコンストラクトの設計及び生成に部分的に基づく。PNPLA3発現の配列特異的阻害は、例えば、単純性脂肪肝(脂肪症)、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬変(肝臓の不可逆的な進行した瘢痕)、又はPNPLA3関連肥満などの肝臓関連疾患などのPNPLA3発現に関連する状態を治療又は予防するのに有用である。したがって、一実施形態では、本発明は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含むRNAiコンストラクトであって、アンチセンス鎖がPNPLA3のmRNA配列と相補的な配列を有する領域を含む、RNAiコンストラクトを提供する。ある種の実施形態では、アンチセンス鎖は、表1又は表2に列記されるアンチセンス配列から少なくとも15個の連続したヌクレオチドを有する領域を含む。いくつかの実施形態では、本発明のRNAiは、PNPLA3-rs738409、PNPLA3-rs738408、及び/又はPNPLA3-rs738409-rs738408マイナーアレルを、これらの変化を含有しない参照アレルよりも選択的に阻害する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のRNAiコンストラクトのセンス鎖は、約15~約30塩基対長の二重鎖領域を形成するアンチセンス鎖の配列と十分に相補的な配列を含む。これら及び他の実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖の各々は、約15~30ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、RNAiコンストラクトは、少なくとも1つの平滑末端を含む。他の実施形態では、RNAiコンストラクトは、少なくとも1つのヌクレオチドオーバーハングを含む。このようなヌクレオチドオーバーハングは、少なくとも1~6個の不対ヌクレオチドを含み得、且つセンス鎖の3’末端、アンチセンス鎖の3’末端、又はセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方の3’末端に位置し得る。ある種の実施形態では、RNAiコンストラクトは、センス鎖の3’末端及びアンチセンス鎖の3’末端に2個の不対ヌクレオチドのオーバーハングを含む。他の実施形態では、RNAiコンストラクトは、アンチセンス鎖の3’末端に2個の不対ヌクレオチドのオーバーハングを含み、且つセンス鎖の3’末端/アンチセンス鎖の5’末端に平滑末端を含む。
本発明のRNAiコンストラクトは、リボース環、核酸塩基、又はホスホジエステル骨格への修飾を有するヌクレオチドを含む1つ以上の修飾ヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、RNAiコンストラクトは、1つ以上の2’-修飾ヌクレオチドを含む。このような2’-修飾ヌクレオチドは、2’-フルオロ修飾ヌクレオチド、2’-O-メチル修飾ヌクレオチド、2’-O-メトキシエチル修飾ヌクレオチド、2’-O-アリル修飾ヌクレオチド、二環式核酸(BNA)、グリコール核酸(GNA)、反転塩基(例えば、反転アデノシン)又はその組み合わせを含み得る。特定の一実施形態では、RNAiコンストラクトは、1つ以上の2’-フルオロ修飾ヌクレオチド、2’-O-メチル修飾ヌクレオチド、又はその組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、RNAiコンストラクトのセンス鎖及びアンチセンス鎖中の全てのヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、RNAiコンストラクトは、ヌクレオチド間又はヌクレオシド間の修飾された結合などの少なくとも1つの骨格修飾を含む。ある種の実施形態では、本明細書に記載のRNAiコンストラクトは、少なくとも1つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。特定の実施形態では、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合は、センス鎖及び/又はアンチセンス鎖の3’又は5’末端に配置され得る。
いくつかの実施形態では、本発明のRNAiコンストラクトのアンチセンス鎖及び/又はセンス鎖は、表1又は2に列記されるアンチセンス配列及びセンス配列からの配列を含むか又はそれからなり得る。ある種の実施形態では、RNAiコンストラクトは、表1~2のいずれか1つに列記される二重鎖化合物のいずれか1つであり得る。
インビボでの用量依存的mRNAノックダウン及び機能上の耐久性の両方に関する5つのsiRNA分子のスクリーニングを示す。 インビボでの用量依存的mRNAノックダウン及び機能上の耐久性の両方に関する5つのsiRNA分子のスクリーニングを示す。 インビボでの用量依存的mRNAノックダウン及び機能上の耐久性の両方に関する5つのsiRNA分子のスクリーニングを示す。 インビボでの用量依存的mRNAノックダウン及び機能上の耐久性の両方に関する5つのsiRNA分子のスクリーニングを示す。 マウスにおけるインビボでのPNPLA3 siRNA分子の効果、肝臓重量、ヒトPNPLA3発現の確認、肝臓のトリグリセリド含量、血清TIMP1レベル、及び脂肪症又は炎症の組織学的徴候を示す。 マウスにおけるインビボでのPNPLA3 siRNA分子の効果、肝臓重量、ヒトPNPLA3発現の確認、肝臓のトリグリセリド含量、血清TIMP1レベル、及び脂肪症又は炎症の組織学的徴候を示す。 マウスにおけるインビボでのPNPLA3 siRNA分子の効果、肝臓重量、ヒトPNPLA3発現の確認、肝臓のトリグリセリド含量、血清TIMP1レベル、及び脂肪症又は炎症の組織学的徴候を示す。 マウスにおけるインビボでのPNPLA3 siRNA分子の効果、肝臓重量、ヒトPNPLA3発現の確認、肝臓のトリグリセリド含量、血清TIMP1レベル、及び脂肪症又は炎症の組織学的徴候を示す。 マウスにおけるインビボでのPNPLA3 siRNA分子の効果、肝臓重量、ヒトPNPLA3発現の確認、肝臓のトリグリセリド含量、血清TIMP1レベル、及び脂肪症又は炎症の組織学的徴候を示す。 マウスにおけるインビボでのPNPLA3 siRNA分子の効果、肝臓重量、ヒトPNPLA3発現の確認、肝臓のトリグリセリド含量、血清TIMP1レベル、及び脂肪症又は炎症の組織学的徴候を示す。 マウスにおけるインビボでのPNPLA3 siRNA分子の効果、肝臓重量、ヒトPNPLA3発現の確認、肝臓のトリグリセリド含量、血清TIMP1レベル、及び脂肪症又は炎症の組織学的徴候を示す。 インビボでのPNPLA3 siRNA分子の効果、肝臓重量、ヒトPNPLA3発現の確認、肝臓のトリグリセリド含量、血清TIMP1レベル、及び脂肪症又は炎症の組織学的徴候を示す。 インビボでのPNPLA3 siRNA分子の効果、肝臓重量、ヒトPNPLA3発現の確認、肝臓のトリグリセリド含量、血清TIMP1レベル、及び脂肪症又は炎症の組織学的徴候を示す。 インビボでのPNPLA3 siRNA分子の効果、肝臓重量、ヒトPNPLA3発現の確認、肝臓のトリグリセリド含量、血清TIMP1レベル、及び脂肪症又は炎症の組織学的徴候を示す。 インビボでのPNPLA3 siRNA分子の効果、肝臓重量、ヒトPNPLA3発現の確認、肝臓のトリグリセリド含量、血清TIMP1レベル、及び脂肪症又は炎症の組織学的徴候を示す。 インビボでのPNPLA3 siRNA分子の効果、肝臓重量、ヒトPNPLA3発現の確認、肝臓のトリグリセリド含量、血清TIMP1レベル、及び脂肪症又は炎症の組織学的徴候を示す。 インビボでのPNPLA3 siRNA分子の効果、肝臓重量、ヒトPNPLA3発現の確認、肝臓のトリグリセリド含量、血清TIMP1レベル、及び脂肪症又は炎症の組織学的徴候を示す。 インビボでのPNPLA3 siRNA分子の効果、肝臓重量、ヒトPNPLA3発現の確認、肝臓のトリグリセリド含量、血清TIMP1レベル、及び脂肪症又は炎症の組織学的徴候を示す。 PNPLA3rs738409-rs738408の過剰発現によるPNPLA3rs738409-rs738408特異的siRNA分子の疾患関連表現型をレスキューする能力、肝臓のトリグリセリド含量、血清TIMP1レベル、及び脂肪症又は炎症の組織学的徴候を示す。 PNPLA3rs738409-rs738408の過剰発現によるPNPLA3rs738409-rs738408特異的siRNA分子の疾患関連表現型をレスキューする能力、肝臓のトリグリセリド含量、血清TIMP1レベル、及び脂肪症又は炎症の組織学的徴候を示す。 PNPLA3rs738409-rs738408の過剰発現によるPNPLA3rs738409-rs738408特異的siRNA分子の疾患関連表現型をレスキューする能力、肝臓のトリグリセリド含量、血清TIMP1レベル、及び脂肪症又は炎症の組織学的徴候を示す。 PNPLA3rs738409-rs738408の過剰発現によるPNPLA3rs738409-rs738408特異的siRNA分子の疾患関連表現型をレスキューする能力、肝臓のトリグリセリド含量、血清TIMP1レベル、及び脂肪症又は炎症の組織学的徴候を示す。 PNPLA3rs738409-rs738408特異的siRNA分子の初期線維症の発症を予防する能力を示す。 PNPLA3rs738409-rs738408特異的siRNA分子の初期線維症の発症を予防する能力を示す。 PNPLA3rs738409-rs738408特異的siRNA分子の初期線維症の発症を予防する能力を示す。 PNPLA3rs738409-rs738408特異的siRNA分子の初期線維症の発症を予防する能力を示す。 PNPLA3rs738409-rs738408特異的siRNA分子の初期線維症の発症を予防する能力を示す。 PNPLA3rs738409-rs738408特異的siRNA分子の初期線維症の発症を予防する能力を示す。 PNPLA3rs738409-rs738408特異的siRNA分子の初期線維症の発症を予防する能力を示す。 PNPLA3rs738409-rs738408特異的siRNA分子の初期線維症の発症を予防する能力を示す。 PNPLA3rs738409-rs738408特異的siRNA分子の初期線維症の発症を予防する能力を示す。 PNPLA3rs738409-rs738408特異的siRNA分子の初期線維症の発症を予防する能力を示す。 PNPLA3rs738409-rs738408特異的siRNA分子の初期線維症の発症を予防する能力を示す。 PNPLA3rs738409-rs738408特異的siRNA分子の初期線維症の発症を予防する能力を示す。
本発明は、パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有3(PNPLA3)遺伝子の発現を調節するための組成物及び方法に関する。いくつかの実施形態では、その遺伝子は、細胞又は哺乳動物(例えば、ヒト)などの対象内にあり得る。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、PNPLA3のmRNAを標的化し、且つ細胞又は哺乳動物におけるPNPLA3発現を低減するRNAiコンストラクトを含む。そのようなRNAiコンストラクトは、例えば、単純性脂肪肝(脂肪症)、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬変(肝臓の不可逆的な進行した瘢痕)、又はPNPLA3関連肥満などの肝臓関連疾患の様々な形態を治療又は予防するのに有用である。
2008年に、NAFLDと関連する非同義の配列変異、又は一塩基多型(SNP)を探索するゲノムワイド関連解析(GWAS)により、PNPLA3のバリアント(rs738409[G]、I148Mをコードする;PNPLA3-rs738409、PNPLA3-ma又はPNPLA3-マイナーアレルとして参照され得る)が肝臓の脂肪含量と有意に関連していることが明らかになった。この最初の報告以来、その後のGWASでは、PNPLA3 rs738409が、1)肝損傷の血清バイオマーカーであるアラニントランスアミナーゼ(ALT)のレベルの上昇、2)NAFLDの発病率、進行度及び重症度、3)肥満個体と痩せ型の個体の両方、並びに4)NAFLD:脂肪症、NASH、肝硬変及び肝細胞癌の全ての段階と有意に関連していることが示されている唯一の既知のSNPと有意に関連するNAFLDの主要な遺伝的決定因子であることが確認されている。多数のGWASのコンセンサスは、PNPLA3 rs738409とNAFLDの関連は、年齢、性別、民族、メタボリックシンドローム、肥満度指数、インスリン抵抗性、及び血清脂質に依存しないことを示している。さらに、複数の情報源からの統計解析では、NAFLD患者の約50%がPNPLA3 rs738409変異を保有すると推定されている。患者は、PNPLA3 rs738409変異のホモ接合体又はヘテロ接合体であり得る。さらに、PNPLA3 rs738409変異を有する患者は、多くの場合3塩基対離れたrs738408変異も保有していることが発見されている(Tian et al(2010)Nature Genetics 42:21-23)。したがって、患者は、PNPLA3-rs738409マイナーアレル、PNPLA3-rs738408マイナーアレル又はPNPLA3-rs738409-rs738408二重マイナーアレル変異(PNPLA3-dma)を有し得る。
発明者らは、インビボでのPNPLA3機能を探索するためのマウスモデルを開発した。現在まで、Pnpla3欠損又はPnpla3過剰発現の結果としての検出可能な代謝表現型は同定されていない。対照的に、トランスジェニックマウス及びノックインマウスの両方におけるPnpla3I148Mの発現により、NAFLDに類似した肝臓トリグリセリドレベルの上昇がもたらされた。したがって、合わせると、インビボマウスモデルのデータは、野生型タンパク質の過剰発現ではなく、変異体Pnpla3I148Mタンパク質の発現が疾患表現型のドライバーであることを示唆している。これらの知見は、NAFLDに罹患した個体におけるマイナーアレルの頻度の高さ及び疾患との有力な関連に加えて、PNPLA3 rs738409がNAFLDの主要な治療標的であることを強調している。
RNA干渉(RNAi)は、細胞内に外来のRNAを導入して、標的とするタンパク質をコードするmRNAの特異的な分解をもたらし、その結果としてタンパク質の発現を低減させるプロセスである。RNAi技術及び肝臓への送達の両方の進歩並びに他のRNAiに基づく療法による好結果の増加は、PNPLA3I148Mを直接的に標的化することによってNAFLDを治療するための説得力のある手段としてのRNAiを示唆している。多数のGWASは、NAFLDの発病率、進行度及び重症度に対するPNPLA3 rs738409の用量依存的効果を示している(GWAS);オッズ比は、ホモ接合体キャリアとヘテロ接合体キャリアに関しては少なくとも2倍、ヘテロ接合体と野生型個体に関してはさらに少なくとも2倍を超える傾向がある。したがって、アレルの識別特異性を利用してPNPLA3をサイレンシングすることは、PNPLA3I148Mキャリアの肝臓トリグリセリドを減少させるための潜在的な手段であると同時に、さらに野生型アレルをサイレンシングすることなくヘテロ接合体が利益を得る場合があるシナリオを提示し得る。これらに沿って、本発明者らは、PNPLA3I148Mに対するSNP特異的な短い干渉RNA(siRNA)を同定し、インビトロでの概念証明を示す。Hep3B(参照アレルPNPLA3I148Iのホモ接合体)及びHEPG2(マイナーアレルPNPLA3I148Mのホモ接合体)の両方の肝細胞癌細胞株を用いて、本発明者らは、特異的にPNPLA3I148M遺伝子の発現を阻害することができるsiRNA配列を同定した。これらの配列の阻害効果は、PNPLA3I148I又はPNPLA3I148Mのいずれかを過剰発現するチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞に対するスクリーニングによって確認された。次に、インビボでヒトPNPLA3I148Mを過剰発現するアデノ随伴ウイルス(AAV)を使用して、本発明者らは、マウスにおいてヒトPNPLA3I148Mの発現を特異的に低減するだけでなく、ヒトPNPLA3I148Mの過剰発現により誘導される肝臓のトリグリセリド蓄積を著しく逆転させるマイナーアレルに特異的なSNPによる治療を実証した。
本明細書で使用する場合、用語「RNAiコンストラクト」は、細胞に導入された際にRNA干渉機構を介して標的遺伝子(例えば、PNPLA3)の発現を下方制御することができるRNA分子を含む薬剤を指す。RNA干渉は、核酸分子が、例えば、RNA誘導サイレンシング複合体(RISC)経路を介して、配列特異的な様式で標的のRNA分子(例えば、メッセンジャーRNA又はmRNA分子)の切断及び分解を誘導するプロセスである。いくつかの実施形態では、RNAiコンストラクトは、互いに十分に相補的であり、ハイブリダイズして二重鎖領域を形成する連続したヌクレオチドの2本の逆平行鎖を含む二重鎖RNA分子を含む。「ハイブリダイズする」又は「ハイブリダイゼーション」は、典型的には、2つのポリヌクレオチドにおける相補的な塩基間の水素結合(例えば、ワトソン-クリック、フーグスティーン又は逆フーグスティーン水素結合)を介した相補的なポリヌクレオチドの対合を指す。標的配列(例えば、標的mRNA)と実質的に相補的な配列を有する領域を含む鎖は、「アンチセンス鎖」と称される。「センス鎖」は、アンチセンス鎖の領域と実質的に相補的な領域を含む鎖を指す。いくつかの実施形態では、センス鎖は、標的配列と実質的に同一の配列を有する領域を含み得る。
いくつかの実施形態では、本発明は、PNPLA3に向けられるRNAiである。いくつかの実施形態では、本発明は、PNPLA3 rs738409部位で結合するRNAiである。いくつかの実施形態では、本発明は、PNPLA3 rs738408部位で結合するRNAiである。いくつかの実施形態では、本発明は、両方のPNPLA3 rs738409 rs738408部位で結合するRNAiである。いくつかの実施形態では、本発明は、天然PNPLA3配列(PNPLA3-ref)より優先的にPNPLA3 rs738409に結合するRNAiである。いくつかの実施形態では、本発明は、PNPLA3-ref配列より優先的にPNPLA3 rs738408に結合するRNAiである。いくつかの実施形態では、本発明は、PNPLA3-maより優先的にPNPLA3-dmaに結合するRNAiである。いくつかの実施形態では、本発明は、表1又は2において見出される配列のいずれかを含有するRNAi分子である。
二重鎖RNA分子は、本明細書に記載のもの又は当技術分野で知られるものなど、リボース糖、塩基、又はリボヌクレオチドの骨格構成要素に対する修飾を含む、リボヌクレオチドに対する化学修飾を含み得る。二重鎖RNA分子(例えば、siRNA、shRNAなど)で使用されるような任意のそのような修飾は、本開示の目的のための用語「二重鎖RNA」によって包含される。
本明細書で使用する場合、生理的条件などのある種の条件下において、第1の配列を含むポリヌクレオチドが、第2の配列を含むポリヌクレオチドにハイブリダイズして二重鎖領域を形成することができる場合、第1の配列は、第2の配列に「相補的」である。他のそのような条件は、当業者に知られる中程度の又はストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を含むことができる。第1の配列を含むポリヌクレオチドが、第2の配列を含むポリヌクレオチドとミスマッチすることなく1つ又は両方のヌクレオチド配列の全長にわたって塩基対形成する場合、第1の配列は、第2の配列と完全に相補的(100%相補的)であるとみなされる。配列が少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%標的配列と相補的である場合、配列は、標的配列と「実質的に相補的」である。相補性パーセントは、第2の配列又は標的配列の対応する位置の塩基と相補的な第1の配列の塩基の数を第1の配列の全体長で割ることによって計算することができる。2つの配列がハイブリダイズするとき、30塩基対の二重鎖領域にわたって5、4、3、2又は1個以下のミスマッチが存在する場合、配列は他方の配列に対して実質的に相補的であると言われ得る。一般に、本明細書に定義される任意のヌクレオチドオーバーハングが存在する場合、このようなオーバーハングの配列は、2つの配列間の相補性の程度の決定において考慮されない。例として、ハイブリダイズして、各鎖の3’末端に2ヌクレオチドのオーバーハングを有する19塩基対二重鎖領域を形成する、21ヌクレオチド長のセンス鎖及び21ヌクレオチド長のアンチセンス鎖は、この用語が本明細書に使用される場合、完全に相補的であるとみなされることになる。
いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の領域は、標的RNA配列(例えば、PNPLA3のmRNA)の領域と完全に相補的な配列を含む。このような実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖の配列と完全に相補的な配列を含み得る。他のこのような実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖の配列と実質的に相補的な配列、例えばセンス鎖及びアンチセンス鎖によって形成される二重鎖領域に1、2、3、4又は5個のミスマッチを有する配列を含み得る。ある種の実施形態では、任意のミスマッチが末端領域内(例えば、鎖の5’及び/又は3’末端の6、5、4、3、2、又は1ヌクレオチド以内)に生じることが好ましい。一実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖から形成される二重鎖領域における任意のミスマッチは、アンチセンス鎖の5’末端の6、5、4、3、2、又は1ヌクレオチド以内に生じる。
ある種の実施形態では、二重鎖RNAのセンス鎖及びアンチセンス鎖は、ハイブリダイズして二重鎖領域を形成するが、この領域を除いて繋がっていない2つの別々の分子であり得る。2本の別々の鎖から形成されるこのような二重鎖RNA分子は、「低分子干渉RNA」又は「短い干渉RNA」(siRNA)と称される。したがって、いくつかの実施形態では、本発明のRNAiコンストラクトは、siRNAを含む。
dsRNAの2本の実質的に相補的な鎖が別個のRNA分子によって構成される場合、それらの分子は、共有結合される必要はないが、共有結合することができる。2本の鎖が、一方の鎖の3’末端と二重鎖構造を形成する各々の他方の鎖の5’末端との間のヌクレオチドの中断されていない鎖以外の方法で共有結合されている場合、その結合構造は「リンカー」と称される。RNA鎖は、同じ又は異なる数のヌクレオチドを有してもよい。二重鎖における塩基対の最大数は、dsRNAの最短の鎖のヌクレオチドの数から二重鎖に存在する任意のオーバーハングを引いた数である。二重鎖構造に加えて、RNAiは、1つ以上のヌクレオチドオーバーハングを含んでもよい。
他の実施形態では、ハイブリダイズして二重鎖領域を形成するセンス鎖及びアンチセンス鎖は、単一RNA分子の一部であってもよく、すなわち、センス鎖及びアンチセンス鎖は、単一RNA分子の自己相補的領域の一部である。そのような場合、単一RNA分子は、二重鎖領域(ステム領域とも称される)及びループ領域を含む。センス鎖の3’末端は、ループ領域を形成することになる不対ヌクレオチドの隣接配列によってアンチセンス鎖の5’末端に結合される。アンチセンス鎖がセンス鎖と塩基対形成して二重鎖又はステム領域を形成することができるように、ループ領域は、通常、RNA分子がそれ自体で折り返すことを可能にする十分な長さのものである。ループ領域は、約3~約25、約5~約15又は約8~約12個の不対ヌクレオチドを含むことができる。少なくとも部分的に自己相補的な領域を有するこのようなRNA分子は、「低分子ヘアピン型RNA」(shRNA)と称される。いくつかの実施形態では、ループ領域は、少なくとも1、2、3、4、5、10、20、又は25個の不対ヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、ループ領域は、10、9、8、7、6、5、4、3、2個以下の不対ヌクレオチドを含み得る。ある種の実施形態では、本発明のRNAiコンストラクトは、shRNAを含む。単一の少なくとも部分的に自己相補的なRNA分子の長さは、約35ヌクレオチド~約100ヌクレオチド、約45ヌクレオチド~約85ヌクレオチド又は約50~約60ヌクレオチドであり得、本明細書に列挙される長さをそれぞれ有する二重鎖領域及びループ領域を含むことができる。
いくつかの実施形態では、本発明のRNAiコンストラクトは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、PNPLA3のメッセンジャーRNA(mRNA)配列と実質的に又は完全に相補的な配列を有する領域を含む。本明細書で使用する場合、「PNPLA3のmRNA配列」は、任意の種(例えば、マウス、ラット、非ヒト霊長類、ヒト)に由来するPNPLA3タンパク質のバリアント又はアイソフォームを含むPNPLA3タンパク質をコードするスプライスバリアントを含む任意のメッセンジャーRNA配列を指す。PNPLA3タンパク質は、アディポニュートリン(ADPN)及びカルシウム非依存性ホスホリパーゼA2-イプシロン(iPLA(2)ε))としても知られる。
PNPLA3のmRNA配列は、その相補的DNA(cDNA)配列として発現される転写物配列も含む。cDNA配列は、RNA塩基(例えば、グアニン、アデニン、ウラシル及びシトシン)ではなく、DNA塩基(例えば、グアニン、アデニン、チミン及びシトシン)として表されるmRNA転写物の配列を指す。したがって、本発明のRNAiコンストラクトのアンチセンス鎖は、標的のPNPLA3のmRNA配列又はPNPLA3のcDNA配列と実質的に又は完全に相補的な配列を有する領域を含み得る。PNPLA3のmRNA又はcDNA配列は、NCBI参照配列NM_025225.2に由来し得るような任意のPNPLA3のmRNA又はcDNA配列を含み得るが、これらに限定されない。
アンチセンス鎖の領域は、PNPLA3のmRNA配列の少なくとも15個の連続したヌクレオチドと実質的に相補的又は完全に相補的であり得る。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖が相補性の領域を含むPNPLA3のmRNA配列の標的領域は、約15~約30個の連続したヌクレオチド、約16~約28個の連続したヌクレオチド、約18~約26個の連続したヌクレオチド、約17~約24個の連続したヌクレオチド、約19~約25個の連続したヌクレオチド、約19~約23個の連続したヌクレオチド又は約19~約21個の連続したヌクレオチドの範囲であり得る。ある種の実施形態では、PNPLA3のmRNA配列と実質的に又は完全に相補的な配列を含むアンチセンス鎖の領域は、いくつかの実施形態では、表1又は表2に列記されるアンチセンス配列からの少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含み得る。他の実施形態では、アンチセンス配列は、表1又は表2に列記されるアンチセンス配列からの少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、又は少なくとも19個の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、センス及び/又はアンチセンス配列は、1、2、又は3個以下のヌクレオチドミスマッチを伴って、表1又は表2に列記される配列からの少なくとも15個のヌクレオチドを含む。
RNAiコンストラクトのセンス鎖は、通常、2本の鎖が生理的条件下でハイブリダイズして二重鎖領域を形成するようにアンチセンス鎖の配列と十分に相補的な配列を含む。「二重鎖領域」は、ワトソン-クリック塩基対合又は他の水素結合相互作用のいずれかによって互いに塩基対形成して、2つのポリヌクレオチド間で二重鎖を生成する2つの相補的又は実質的に相補的なポリヌクレオチドの領域を指す。RNAiコンストラクトの二重鎖領域は、例えば、ダイサー酵素及び/又はRISC複合体が結合することにより、RNAiコンストラクトがRNA干渉経路に入ることを可能にする十分な長さのものであるべきである。例えば、いくつかの実施形態では、二重鎖領域は、約15~約30塩基対長である。この範囲内の二重鎖領域の他の長さ、例えば約15~約28塩基対、約15~約26塩基対、約15~約24塩基対、約15~約22塩基対、約17~約28塩基対、約17~約26塩基対、約17~約24塩基対、約17~約23塩基対、約17~約21塩基対、約19~約25塩基対、約19~約23塩基対、又は約19~約21塩基対も好適である。一実施形態では、二重鎖領域は、約17~約24塩基対長である。別の実施形態では、二重鎖領域は、約19~約21塩基対長である。
いくつかの実施形態では、本発明のRNAi薬剤は、標的RNA配列、例えば、PNPLA3標的mRNA配列と相互作用して、標的RNAの切断を誘導する約24~約30個のヌクレオチドの二重鎖領域を含有する。理論に束縛されるものではないが、細胞に導入される長い二重鎖RNAは、ダイサーとして知られるIII型エンドヌクレアーゼによって分解されてsiRNAになることができる(Sharp et al.(2001)Genes Dev.15:485)。ダイサー、リボヌクレアーゼIII様酵素、15は、dsRNAをプロセシングして、特徴的な2塩基の3’オーバーハングを有する19~23塩基対の短い干渉RNAにする(Bernstein,et al.,(2001)Nature 409:363)。次に、siRNAは、RNA誘導サイレンシング複合体(RISC)に組み込まれるが、ここで、1つ以上のヘリカーゼがsiRNA二重鎖を巻き戻して、相補的なアンチセンス鎖が標的認識を誘導することを可能にする(Nykanen,et al.,(2001)Cell107:309)。適切な標的の20のmRNAに結合すると、RISC内の1つ以上のエンドヌクレアーゼが標的を切断してサイレンシングを誘導する(Elbashir,et al.,(2001)Genes Dev.15:188)。
センス鎖及びアンチセンス鎖が2種の別々の分子である(例えば、RNAiコンストラクトがsiRNAを含む)実施形態について、センス鎖及びアンチセンス鎖は、二重鎖領域の長さと同じ長さである必要はない。例えば、一方又は両方の鎖は、二重鎖領域より長くてもよく、二重鎖領域に隣接している1個以上の不対ヌクレオチド又はミスマッチを有してもよい。したがって、いくつかの実施形態では、RNAiコンストラクトは、少なくとも1つのヌクレオチドオーバーハングを含む。本明細書で使用する場合、「ヌクレオチドオーバーハング」は、鎖の末端における不対ヌクレオチド又は二重鎖領域を越えて延在するヌクレオチドを指す。ヌクレオチドオーバーハングは、通常、一方の鎖の3’末端が他方の鎖の5’末端を越えて延在する場合又は一方の鎖の5’末端が他方の鎖の3’末端を越えて延在する場合に生成される。ヌクレオチドオーバーハングの長さは、一般に、1~6ヌクレオチド、1~5ヌクレオチド、1~4ヌクレオチド、1~3ヌクレオチド、2~6ヌクレオチド、2~5ヌクレオチド、又は2~4ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドオーバーハングは、1、2、3、4、5、又は6ヌクレオチドを含む。特定の一実施形態では、ヌクレオチドオーバーハングは、1~4ヌクレオチドを含む。ある種の実施形態では、ヌクレオチドオーバーハングは、2ヌクレオチドを含む。オーバーハングにおけるヌクレオチドは、本明細書に記載されるとおりのリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド又は修飾ヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態では、オーバーハングは、5’-ウリジンウリジン-3’(5’-UU-3’)ジヌクレオチドを含む。このような実施形態では、UUジヌクレオチドは、リボヌクレオチド又は修飾ヌクレオチド、例えば2’-修飾ヌクレオチドを含み得る。他の実施形態では、オーバーハングは、5’-デオキシチミジン-デオキシチミジン-3’(5’-dTdT-3’)ジヌクレオチドを含む。
ヌクレオチドオーバーハングは、一方又は両方の鎖の5’末端又は3’末端に存在してもよい。例えば、一実施形態では、RNAiコンストラクトは、アンチセンス鎖の5’末端及び3’末端にヌクレオチドオーバーハングを含む。別の実施形態では、RNAiコンストラクトは、センス鎖の5’末端及び3’末端にヌクレオチドオーバーハングを含む。いくつかの実施形態では、RNAiコンストラクトは、センス鎖の5’末端及びアンチセンス鎖の5’末端にヌクレオチドオーバーハングを含む。他の実施形態では、RNAiコンストラクトは、センス鎖の3’末端及びアンチセンス鎖の3’末端にヌクレオチドオーバーハングを含む。
RNAiコンストラクトは、二重鎖RNA分子の一方の末端に単一ヌクレオチドオーバーハングを含み、且つ他の末端に平滑末端を含み得る。「平滑末端」は、分子の末端においてセンス鎖及びアンチセンス鎖が完全に塩基対形成しており、二重鎖領域を越えて延在する不対ヌクレオチドが存在しないことを意味する。いくつかの実施形態では、RNAiコンストラクトは、センス鎖の3’末端にヌクレオチドオーバーハングを含み、且つセンス鎖の5’末端及びアンチセンス鎖の3’末端に平滑末端を含む。他の実施形態では、RNAiコンストラクトは、アンチセンス鎖の3’末端にヌクレオチドオーバーハングを含み、且つアンチセンス鎖の5’末端及びセンス鎖の3’末端に平滑末端を含む。ある種の実施形態では、RNAiコンストラクトは、二重鎖RNA分子の両端に平滑末端を含む。このような実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖は、同じ長さを有し、二重鎖領域は、センス鎖及びアンチセンス鎖と同じ長さである(すなわち、分子は、その全長にわたって二重鎖である)。
センス鎖及びアンチセンス鎖は、それぞれ独立して、約15~約30ヌクレオチド長、約18~約28ヌクレオチド長、約19~約27ヌクレオチド長、約19~約25ヌクレオチド長、約19~約23ヌクレオチド長、約21~約25ヌクレオチド長、又は約21~約23ヌクレオチド長であり得る。ある種の実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖は、それぞれ約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24、又は約25ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、RNAiコンストラクトが2つのヌクレオチドオーバーハングを有するように、センス鎖及びアンチセンス鎖は、同じ長さを有するが、これらの鎖よりも短い二重鎖領域を形成する。例えば、一実施形態では、RNAiコンストラクトは、(i)それぞれ21ヌクレオチド長であるセンス鎖及びアンチセンス鎖、(ii)19塩基対長である二重鎖領域、並びに(iii)センス鎖の3’端及びアンチセンス鎖の3’端の両方における2個の不対ヌクレオチドのヌクレオチドオーバーハングを含む。別の実施形態では、RNAiコンストラクトは、(i)それぞれ23ヌクレオチド長であるセンス鎖及びアンチセンス鎖、(ii)21塩基対長である二重鎖領域並びに(iii)センス鎖の3’端及びアンチセンス鎖の3’端の両方における2個の不対ヌクレオチドのヌクレオチドオーバーハングを含む。他の実施形態では、二重鎖分子のいずれの末端にもヌクレオチドオーバーハングが存在しないように、センス鎖及びアンチセンス鎖は、同じ長さを有し、その長さ全体にわたって二重鎖領域を形成する。このような一実施形態では、RNAiコンストラクトは、平滑末端であり、(i)それぞれ21ヌクレオチド長であるセンス鎖及びアンチセンス鎖、並びに(ii)21塩基対長である二重鎖領域を含む。別のこのような実施形態では、RNAiコンストラクトは、平滑末端であり、(i)それぞれ23ヌクレオチド長であるセンス鎖及びアンチセンス鎖、並びに(ii)23塩基対長である二重鎖領域を含む。
他の実施形態では、RNAiコンストラクトが少なくとも1つのヌクレオチドオーバーハングを含むように、センス鎖又はアンチセンス鎖は、他方の鎖よりも長く、この2つの鎖は、短い方の鎖の長さに等しい長さを有する二重鎖領域を形成する。例えば、一実施形態では、RNAiコンストラクトは、(i)19ヌクレオチド長であるセンス鎖、(ii)21ヌクレオチド長であるアンチセンス鎖、(iii)19塩基対長の二重鎖領域、及び(iv)アンチセンス鎖の3’端における2個の不対ヌクレオチドの単一ヌクレオチドオーバーハングを含む。別の実施形態では、RNAiコンストラクトは、(i)21ヌクレオチド長であるセンス鎖、(ii)23ヌクレオチド長であるアンチセンス鎖、(iii)21塩基対長の二重鎖領域、及び(iv)アンチセンス鎖の3’端における2個の不対ヌクレオチドの単一ヌクレオチドオーバーハングを含む。
本発明のRNAiコンストラクトのアンチセンス鎖は、表1若しくは表2に列記されるアンチセンス配列又はこれらのアンチセンス配列のいずれかのヌクレオチド1~19の配列のいずれか1つの配列を含み得る。表1及び6に列記されるアンチセンス配列の各々は、2ヌクレオチドのオーバーハング配列に加えて、PNPLA3のmRNA配列と相補的な19個の連続したヌクレオチド(5’末端から数えて最初の19個のヌクレオチド)の配列を含む。したがって、いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号1~166又は167~332のいずれか1つのヌクレオチド1~19の配列を含む。
修飾ヌクレオチド
本発明のRNAiコンストラクトは、1つ以上の修飾ヌクレオチドを含み得る。「修飾ヌクレオチド」は、ヌクレオシド、核酸塩基、ペントース環、又はホスフェート基に対する1つ以上の化学修飾を有するヌクレオチドを指す。本明細書で使用する場合、修飾ヌクレオチドは、アデノシン一リン酸、グアノシン一リン酸、ウリジン一リン酸、及びシチジン一リン酸を含有するリボヌクレオチド、並びにデオキシアデノシン一リン酸、デオキシグアノシン一リン酸、デオキシチミジン一リン酸、及びデオキシシチジン一リン酸を含有するデオキシリボヌクレオチドを包含しない。しかしながら、RNAiコンストラクトは、修飾ヌクレオチド、リボヌクレオチド、及びデオキシリボヌクレオチドの組み合わせを含み得る。二重鎖RNA分子の一方又は両方の鎖への修飾ヌクレオチドの組み込みは、例えば、ヌクレアーゼ及び他の分解プロセスに対する分子の感受性を低下させることにより、RNA分子のインビボ安定性を向上させることができる。標的遺伝子の発現を低減するためのRNAiコンストラクトの効力を修飾ヌクレオチドの組み込みによって増強することもできる。
ある種の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、リボース糖の修飾を有する。これらの糖修飾は、ペントース環の2’及び/又は5’位における修飾並びに二環性糖修飾を含むことができる。2’-修飾ヌクレオチドは、H又はOH以外の置換基を2’位に有するペントース環を有するヌクレオチドを指す。このような2’修飾としては、2’-O-アルキル(例えば、O-C1~C10又はO-C1~C10置換アルキル)、2’-O-アリル(O-CH2CH=CH2)、2’-C-アリル、2’-フルオロ、2’-O-メチル(OCH3)、2’-O-メトキシエチル(O-(CH2)2OCH3)、2’-OCF3、2’-O(CH2)2SCH3、2’-O-アミノアルキル、2’-アミノ(例えば、NH2)、2’-O-エチルアミン、及び2’-アジドが挙げられるが、これらに限定されない。ペントース環の5’位置における修飾としては、5’-メチル(R又はS)、5’-ビニル、及び5’-メトキシが挙げられるが、これらに限定されない。
「二環性糖修飾」は、ペントース環の修飾を指し、この場合、架橋が環の2つの原子を接続して、二環性糖構造をもたらす第2の環を形成する。いくつかの実施形態では、二環性糖修飾は、ペントース環の4’及び2’炭素間の架橋を含む。二環性糖修飾を有する糖部分を含むヌクレオチドは、本明細書では二環性核酸又はBNAと称される。例示的な二環性糖修飾としては、α-L-メチレンオキシ(4’-CH2-O-2’)二環性核酸(BNA);β-D-メチレンオキシ(4’-CH2-O-2’)BNA(ロックド核酸又はLNAとも称される);エチレンオキシ(4’-(CH2)2-O-2’)BNA;アミノオキシ(4’-CH2-O-N(R)-2’)BNA;オキシアミノ(4’-CH2-N(R)-O-2’)BNA;メチル(メチレンオキシ)(4’-CH(CH3)-O-2’)BNA(拘束エチル(constrained ethyl)又はcEtとも称される);メチレン-チオ(4’-CH2-S-2’)BNA;メチレン-アミノ(4’-CH2-N(R)-2’)BNA;メチル炭素環式(4’-CH2-CH(CH3)-2’)BNA;プロピレン炭素環式(4’-(CH2)3-2’)BNA;及びメトキシ(エチレンオキシ)(4’-CH(CH2OMe)-O-2’)BNA(拘束MOE(constrained MOE)又はcMOEとも称される)が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のRNAiコンストラクトに組み込むことができるこれら及び他の糖修飾ヌクレオチドは、米国特許第9,181,551号明細書、米国特許出願公開第2016/0122761号明細書、及びDeleavey and Damha,Chemistry and Biology,Vol.19:937-954,2012に記載されており、これらの文献は、全て参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、RNAiコンストラクトは、1つ以上の2’-フルオロ修飾ヌクレオチド、2’-O-メチル修飾ヌクレオチド、2’-O-メトキシエチル修飾ヌクレオチド、2’-O-アリル修飾ヌクレオチド、二環性核酸(BNA)、又はこれらの組み合わせを含む。ある種の実施形態では、RNAiコンストラクトは、1つ以上の2’-フルオロ修飾ヌクレオチド、2’-O-メチル修飾ヌクレオチド、2’-O-メトキシエチル修飾ヌクレオチド、又はこれらの組み合わせを含む。特定の一実施形態では、RNAiコンストラクトは、1つ以上の2’-フルオロ修飾ヌクレオチド、2’-O-メチル修飾ヌクレオチド又はこれらの組み合わせを含む。
RNAiコンストラクトのセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方は、1つ又は複数の修飾ヌクレオチドを含むことができる。例えば、いくつかの実施形態では、センス鎖は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個以上の修飾ヌクレオチドを含む。ある種の実施形態では、センス鎖中の全てのヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個以上の修飾ヌクレオチドを含む。他の実施形態では、アンチセンス鎖中の全てのヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドである。ある種の他の実施形態では、センス鎖中の全てのヌクレオチド及びアンチセンス鎖中の全てのヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドである。これら及び他の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、2’-フルオロ修飾ヌクレオチド、2’-O-メチル修飾ヌクレオチド、又はこれらの組み合わせであり得る。
いくつかの実施形態では、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の鎖におけるアデノシンヌクレオチドの前にある全てのピリミジンヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドである。例えば、いずれかの鎖で配列5’-CA-3’又は5’-UA-3’が現れる場合、シチジン及びウリジンヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドであり、好ましくは2’-O-メチル修飾ヌクレオチドである。ある種の実施形態では、センス鎖中の全てのピリミジンヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド(例えば、2’-O-メチル修飾ヌクレオチド)であり、アンチセンス鎖において存在する全ての配列5’-CA-3’又は5’-UA-3’の5’ヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド(例えば、2’-O-メチル修飾ヌクレオチド)である。他の実施形態では、二重鎖領域における全てのヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドである。このような実施形態では、修飾ヌクレオチドは、好ましくは、2’-O-メチル修飾ヌクレオチド、2’-フルオロ修飾ヌクレオチド又はこれらの組み合わせである。
RNAiコンストラクトがヌクレオチドオーバーハングを含む実施形態では、オーバーハング中のヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、又は修飾ヌクレオチドであり得る。一実施形態では、オーバーハング中のヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、例えばデオキシチミジンである。別の実施形態では、オーバーハング中のヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドである。例えば、いくつかの実施形態では、オーバーハング中のヌクレオチドは、2’-O-メチル修飾ヌクレオチド、2’-フルオロ修飾ヌクレオチド、2’-メトキシエチル修飾ヌクレオチド、又はこれらの組み合わせである。
本発明のRNAiコンストラクトは、1つ以上の修飾されたヌクレオチド間結合も含み得る。本明細書で使用する場合、用語「修飾されたヌクレオチド間結合」は、元から存在する3’-5’ホスホジエステル結合以外のヌクレオチド間の結合を指す。いくつかの実施形態では、修飾されたヌクレオチド間結合は、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、アルキルホスホナート(例えば、メチルホスホナート、3’-アルキレンホスホナート)、ホスフィナート、ホスホロアミダート(例えば、3’-アミノホスホロアミダート及びアミノアルキルホスホロアミダート)、ホスホロチオエート(P=S)、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、チオノホスホロアミダート、チオノアルキルホスホナート、チオノアルキルホスホトリエステル、及びボラノホスフェートなどのリン含有ヌクレオチド間結合である。一実施形態では、修飾されたヌクレオチド間結合は、2’-5’ホスホジエステル結合である。他の実施形態では、修飾されたヌクレオチド間結合は、リン非含有ヌクレオチド間結合であり、したがって、修飾されたヌクレオシド間結合と称される場合もある。このようなリン非含有結合は、モルホリノ結合(一部はヌクレオシドの糖部分から形成される);シロキサン結合(-O-Si(H)2-O-);スルフィド、スルホキシド及びスルホン結合;ホルムアセチル及びチオホルムアセチル結合;アルケン含有骨格;スルファマート骨格;メチレンメチルイミノ(-CH2-N(CH3)-O-CH2-)及びメチレンヒドラジノ結合;スルホナート及びスルホンアミド結合;アミド結合;並びに混合されたN、O、S及びCH2構成要素部分を有する他のものを含むが、これらに限定されない。一実施形態では、修飾されたヌクレオシド間結合は、米国特許第5,539,082号明細書;同第5,714,331号明細書;及び同第5,719,262号明細書に記載されているものなど、ペプチド核酸又はPNAを生成するためのペプチドに基づく結合(例えば、アミノエチルグリシン)である。本発明のRNAiコンストラクトにおいて使用され得る他の好適な修飾されたヌクレオチド間及びヌクレオシド間結合は、米国特許第6,693,187号明細書、同第9,181,551号明細書、米国特許出願公開第2016/0122761号明細書、及びDeleavey and Damha,Chemistry and Biology,Vol.19:937-954,2012に記載されており、これらの文献は、全て参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ある種の実施形態では、RNAiコンストラクトは、1つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。ホスホロチオエートヌクレオチド間結合は、RNAiコンストラクトのセンス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の鎖において存在し得る。例えば、いくつかの実施形態では、センス鎖は、1、2、3、4、5、6、7、8個以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。他の実施形態では、アンチセンス鎖は、1、2、3、4、5、6、7、8個以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。さらに他の実施形態では、両方の鎖は、1、2、3、4、5、6、7、8個以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。RNAiコンストラクトは、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の鎖の3’末端、5’末端又は3’末端及び5’末端の両方に1つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むことができる。例えば、ある種の実施形態では、RNAiコンストラクトは、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の鎖の3’末端に約1個~約6個以上(例えば、約1、2、3、4、5、6個以上)の連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。他の実施形態では、RNAiコンストラクトは、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の鎖の5’末端に約1個~約6個以上(例えば、約1、2、3、4、5、6個以上)の連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。一実施形態では、RNAiコンストラクトは、センス鎖の3’末端に単一のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、且つアンチセンス鎖の3’末端に単一のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。別の実施形態では、RNAiコンストラクトは、アンチセンス鎖の3’末端に2つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む(すなわちアンチセンス鎖の3’末端の第1及び第2のヌクレオチド間結合におけるホスホロチオエートヌクレオチド間結合)。別の実施形態では、RNAiコンストラクトは、アンチセンス鎖の3’末端及び5’末端の両方に2つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。さらに別の実施形態では、RNAiコンストラクトは、アンチセンス鎖の3’末端及び5’末端の両方に2つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、且つセンス鎖の5’末端に2つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。さらに別の実施形態では、RNAiコンストラクトは、アンチセンス鎖の3’末端及び5’末端の両方に2つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、且つセンス鎖の3’末端及び5’末端の両方に2つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む(すなわちアンチセンス鎖の5’末端及び3’末端の両方の第1及び第2のヌクレオチド間結合におけるホスホロチオエートヌクレオチド間結合、並びにセンス鎖の5’末端及び3’末端の両方の第1及び第2のヌクレオチド間結合におけるホスホロチオエートヌクレオチド間結合)。一方又は両方の鎖が1つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む実施形態のいずれかにおいて、鎖内の残りのヌクレオチド間結合は、元から存在する3’-5’ホスホジエステル結合であり得る。例えば、いくつかの実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖の各ヌクレオチド間結合は、ホスホジエステル及びホスホロチオエートから選択され、少なくとも1つのヌクレオチド間結合がホスホロチオエートである。
RNAiコンストラクトがヌクレオチドオーバーハングを含む実施形態では、オーバーハング中の不対ヌクレオチドの2つ以上は、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合によって結合され得る。ある種の実施形態では、アンチセンス鎖及び/又はセンス鎖の3’末端のヌクレオチドオーバーハングにおける全ての不対ヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合によって結合される。他の実施形態では、アンチセンス鎖及び/又はセンス鎖の5’末端のヌクレオチドオーバーハングにおける全ての不対ヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合によって結合される。さらに他の実施形態では、任意のヌクレオチドオーバーハングにおける全ての不対ヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合によって結合される。
ある種の実施形態では、本発明のRNAiコンストラクトの一方又は両方の鎖に組み込まれる修飾ヌクレオチドは、核酸塩基(本明細書では「塩基」とも称される)の修飾を有する。「修飾核酸塩基」又は「修飾塩基」は、天然に存在するプリン塩基であるアデニン(A)及びグアニン(G)並びにピリミジン塩基であるチミン(T)、シトシン(C)及びウラシル(U)以外の塩基を指す。修飾核酸塩基は、合成的な修飾又は天然に存在する修飾であってもよく、且つユニバーサル塩基、5ーメチルシトシン(5-me-C)、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン(X)、ヒポキサンチン(I)、2-アミノアデニン、6-メチルアデニン、6-メチルグアニン並びにアデニン及びグアニンの他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの2-プロピル並びに他のアルキル誘導体、2-チオウラシル、2-チオチミン及び2-チオシトシン、5-ハロウラシル及びシトシン、5-プロピニルウラシル及びシトシン、6-アゾウラシル、シトシン及びチミン、5-ウラシル(プソイドウラシル)、4-チオウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオ、8-チオアルキル、8-ヒドロキシル及び他の8-置換アデニン及びグアニン、5-ハロ、特に5-ブロモ、5-トリフルオロメチル及び他の5-置換ウラシル及びシトシン、7-メチルグアニン及び7-メチルアデニン、8-アザグアニン及び8-アザアデニン、7-デアザグアニン及び7-デアザアデニン(daazaadenine)並びに3-デアザグアニン及び3-デアザアデニンを含むことができるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、修飾塩基は、ユニバーサル塩基である。「ユニバーサル塩基」は、結果として生じる二重鎖領域の二重らせん構造を変えることなく、RNA及びDNAの天然の塩基の全てと無差別に塩基対を形成する塩基類似体を指す。ユニバーサル塩基は、当業者に知られており、イノシン、C-フェニル、C-ナフチル及び他の芳香族誘導体、アゾールカルボキサミド、並びに3-ニトロピロール、4-ニトロインドール、5-ニトロインドール、及び6-ニトロインドールなどのニトロアゾール誘導体を含むが、これらに限定されない。
本発明のRNAiコンストラクトに組み込むことができる他の好適な修飾塩基は、Herdewijn,Antisense Nucleic Acid Drug Dev.,Vol.10:297-310,2000及びPeacock et al.,J.Org.Chern.,Vol.76:7295-7300,2011に記載されているものを含み、これらの文献の両方は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。グアニン、シトシン、アデニン、チミン、及びウラシルは、上述の修飾核酸塩基などの他の核酸塩基により、そのような置換核酸塩基を有するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの塩基対特性を実質的に変えることなく置換され得ることを当業者は十分に認識している。
本発明のRNAiコンストラクトのいくつかの実施形態では、センス鎖、アンチセンス鎖、又はアンチセンス鎖及びセンス鎖の両方の5’末端は、ホスフェート部分を含む。本明細書で使用する場合、用語「ホスフェート部分」は、非修飾ホスフェート(-O-P=O)(OH)OH)及び修飾ホスフェートを含む末端ホスフェート基を指す。修飾ホスフェートは、O及びOH基の1つ以上がH、O、S、N(R)又はアルキルで置換されており、RがH、アミノ保護基又は非置換若しくは置換アルキルであるホスフェートを含む。例示的なホスフェート部分は、5’-モノホスフェート;5’ジホスフェート;5’-トリホスフェート;5’-グアノシンキャップ(7-メチル化若しくは非メチル化);5’-アデノシンキャップ又は任意の他の修飾若しくは非修飾ヌクレオチドキャップ構造;5’-モノチオホスフェート(ホスホロチオエート);5’-モノジチオホスフェート(ホスホロジチオエート);5’-α-チオトリホスフェート;5’-γ-チオトリホスフェート;5’-ホスホロアミダート;5’-ビニルホスフェート;5’-アルキルホスホナート(例えば、アルキル=メチル、エチル、イソプロピル、プロピルなど);及び5’-アルキルエーテルホスホナート(例えば、アルキルエーテル=メトキシメチル、エトキシメチルなど)を含むが、これらに限定されない。
本発明のRNAiコンストラクトに組み込むことができる修飾ヌクレオチドは、本明細書に記載の2つ以上の化学修飾を有し得る。例えば、修飾ヌクレオチドは、リボース糖への修飾及び核酸塩基への修飾を有し得る。例として、修飾ヌクレオチドは、2’糖修飾(例えば、2’-フルオロ又は2’-メチル)を含んでもよく、修飾塩基(例えば、5-メチルシトシン又はプソイドウラシル)を含んでもよい。他の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドがポリヌクレオチドに組み込まれたとき、修飾されたヌクレオチド間又はヌクレオシド間結合を生成するであろう、5’ホスフェートへの修飾と組み合わされた糖修飾を含んでもよい。例えば、いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、2’-フルオロ修飾、2’-O-メチル修飾又は二環性糖修飾及び5’ホスホロチオエート基などの糖修飾を含んでもよい。したがって、いくつかの実施形態では、本発明のRNAiコンストラクトの一方又は両方の鎖は、2’修飾ヌクレオチド又はBNA及びホスホロチオエートヌクレオチド間結合の組み合わせを含む。ある種の実施形態では、本発明のRNAiコンストラクトのセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方の鎖は、2’-フルオロ修飾ヌクレオチド、2’-O-メチル修飾ヌクレオチド、及びホスホロチオエートヌクレオチド間結合の組み合わせを含む。修飾ヌクレオチド及びヌクレオチド間結合を含む例示的なRNAiコンストラクトを表2に示す。
RNAiコンストラクトの機能
好ましくは、本発明のRNAiコンストラクトは、細胞内、特に肝臓細胞内でのPNPLA3の発現を低減又は阻害する。したがって、一実施形態では、本発明は、細胞を本明細書に記載の任意のRNAiコンストラクトと接触させることにより、細胞内でのPNPLA3発現を低減する方法を提供する。細胞は、インビトロ又はインビボにあり得る。PNPLA3発現は、PNPLA3のmRNA、PNPLA3のタンパク質、又はPNPLA3発現と関連する別のバイオマーカーの量又はレベルを測定することによって評価することができる。本発明のRNAiコンストラクトで処理された細胞又は動物におけるPNPLA3発現の低減は、RNAiコンストラクトで処理されていないか又は対照RNAiコンストラクトで処理された細胞又は動物におけるPNPLA3発現と比較して決定することができる。例えば、いくつかの実施形態では、PNPLA3発現の低減は、(a)本発明のRNAiコンストラクトで処理された肝臓細胞におけるPNPLA3のmRNAの量又はレベルを測定すること、(b)対照RNAiコンストラクト(例えば、肝臓細胞において発現しないRNA分子又はナンセンス若しくはスクランブル配列を有するRNAiコンストラクトを対象とするRNAi薬剤)又はコンストラクトなしで処理された肝臓細胞におけるPNPLA3のmRNAの量又はレベルを測定すること、及び(c)(a)において処理された細胞から測定されたPNPLA3のmRNAレベルと、(b)における対照細胞から測定されたPNPLA3のmRNAレベルとを比較することによって評価される。比較前に、処理された細胞及び対照細胞におけるPNPLA3のmRNAレベルは、対照遺伝子(例えば、18S リボソームRNA)に対するRNAレベルに正規化され得る。PNPLA3のmRNAレベルは、ノーザンブロット分析、ヌクレアーゼプロテクションアッセイ、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(FISH)、逆転写酵素(RT)-PCR、リアルタイムRT-PCR、定量PCRなどを含む様々な方法によって測定することができる。
他の実施形態では、PNPLA3発現の低減は、(a)本発明のRNAiコンストラクトで処理された肝臓細胞におけるPNPLA3のタンパク質の量又はレベルを測定すること、(b)対照RNAiコンストラクト(例えば、肝臓細胞において発現しないRNA分子又はナンセンス若しくはスクランブル配列を有するRNAiコンストラクトを対象とするRNAi薬剤)又はコンストラクトなしで処理された肝臓細胞におけるPNPLA3のタンパク質の量又はレベルを測定すること、及び(c)(a)において処理された細胞から測定されたPNPLA3のタンパク質レベルと、(b)における対照細胞から測定されたPNPLA3のタンパク質レベルとを比較することによって評価される。PNPLA3のタンパク質レベルを測定する方法は、当業者に知られており、ウエスタンブロット、イムノアッセイ(例えば、ELISA)、及びフローサイトメトリーを含む。PNPLA3のタンパク質発現を評価するための例示的なイムノアッセイに基づく方法を実施例2に記載する。実施例3は、RNA FISHを使用してPNPLA3のmRNAを測定するための例示的な方法を記載する。PNPLA3のmRNA又はタンパク質を測定することができる任意の方法を使用して、本発明のRNAiコンストラクトの有効性を評価することができる。
いくつかの実施形態では、PNPLA3の発現レベルを評価するための方法は、自然にPNPLA3を発現する細胞(例えば、肝臓細胞)又はPNPLA3を発現するように操作された細胞においてインビトロで実施される。ある種の実施形態では、これらの方法は、肝臓細胞においてインビトロで実施される。好適な肝臓細胞は、初代肝細胞(例えば、ヒト、非ヒト霊長類、又は齧歯類の肝細胞)、HepAD38細胞、HuH-6細胞、HuH-7細胞、HuH-5-2細胞、BNLCL2細胞、Hep3B細胞、又はHepG2細胞を含むが、これらに限定されない。一実施形態では、肝臓細胞は、Hep3B細胞である。別の実施形態では、肝臓細胞は、HepG2細胞である。
他の実施形態では、PNPLA3の発現レベルを評価するための方法は、インビボで実施される。RNAiコンストラクト及び任意の対照RNAiコンストラクトを動物(例えば、齧歯類又は非ヒト霊長類)に投与することができ、PNPLA3のmRNA又はタンパク質レベルを、処理後の動物から採取した肝臓組織において評価することができる。代わりに又は加えて、PNPLA3発現と関連するバイオマーカー又は機能的表現型を、処理された動物において評価することができる。
ある種の実施形態では、PNPLA3の発現は、本発明のRNAiコンストラクトにより、肝臓細胞において少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、又は少なくとも50%低減する。いくつかの実施形態では、PNPLA3の発現は、本発明のRNAiコンストラクトにより、肝臓細胞において少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、又は少なくとも85%低減する。他の実施形態では、PNPLA3の発現は、本発明のRNAiコンストラクトにより、肝臓細胞において約90%以上、例えば91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上低減する。PNPLA3発現の低減パーセントは、本明細書に記載の方法のいずれか及び当技術分野で知られる他の方法によって測定することができる。例えば、ある種の実施形態では、本発明のRNAiコンストラクトは、インビトロのHep3B細胞(野生型PNPLA3を含有する)において5nMでPNPLA3発現の少なくとも45%を阻害する。関連する実施形態では、本発明のRNAiコンストラクトは、インビトロのHep3B細胞において5nMでPNPLA3発現の少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、又は少なくとも75%を阻害する。他の実施形態では、本発明のRNAiコンストラクトは、インビトロのHep3B細胞において5nMでPNPLA3発現の少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも94%、少なくとも96%、又は少なくとも98%を阻害する。ある種の実施形態では、本発明のRNAiコンストラクトは、インビトロのHepG2細胞(PNPLA3-rs738409-rs738408二重マイナーアレルを含有する)において5nMでPNPLA3発現の少なくとも45%を阻害する。関連する実施形態では、本発明のRNAiコンストラクトは、インビトロのHepG2細胞において5nMでPNPLA3発現の少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、又は少なくとも75%を阻害する。他の実施形態では、本発明のRNAiコンストラクトは、インビトロのHepG2細胞において5nMでPNPLA3発現の少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも94%、少なくとも96%、又は少なくとも98%を阻害する。ある種の実施形態では、本発明のRNAiコンストラクトは、インビトロのヒトPNPLA3 I148I又はI148Mを発現するCHOトランスフェクト細胞において5nMでPNPLA3発現の少なくとも45%を阻害する。関連する実施形態では、本発明のRNAiコンストラクトは、インビトロのヒトPNPLA3 I148I又はI148Mを発現するCHOトランスフェクト細胞において5nMでPNPLA3発現の少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、又は少なくとも75%を阻害する。他の実施形態では、本発明のRNAiコンストラクトは、インビトロのヒトPNPLA3 I148I又はI148Mを発現するCHOトランスフェクト細胞において5nMでPNPLA3発現の少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも94%、少なくとも96%、又は少なくとも98%を阻害する。PNPLA3の低減は、実施例2及び3において記載されるとおり、RNA FISH又はドロップレットデジタルPCRを含む様々な手法を使用して測定され得る。
いくつかの実施形態では、IC50値を計算して、肝臓細胞におけるPNPLA3発現の阻害に対する本発明のRNAiコンストラクトの効力を評価する。「IC50値」は、生物学的又は生化学的機能の50%阻害を達成するのに要求される用量/濃度である。任意の特定の物質又はアンタゴニストのIC50値を、用量反応曲線を作成すること、及び任意のアッセイにおける発現レベル又は機能活性に対する異なる濃度の物質又はアンタゴニストの効果を試験することによって決定することができる。最大の生物学的応答又は本来の発現レベルの半分を阻害するのに必要とされる濃度を決定することにより、IC50値を所与のアンタゴニスト又は物質について計算することができる。したがって、実施例に記載のイムノアッセイ又はRNA FISHアッセイ又はドロップレットデジタルPCRアッセイなどの任意のアッセイにおいて、肝臓細胞における本来のPNPLA3の発現レベル(例えば、対照肝臓細胞におけるPNPLA3の発現レベル)の半分を阻害するのに必要とされるRNAiコンストラクトの濃度を決定することにより、任意のRNAiコンストラクトについてIC50値を計算することができる。本発明のRNAiコンストラクトは、約20nM未満のIC50で肝臓細胞(例えば、Hep3B細胞)におけるPNPLA3発現を阻害し得る。例えば、RNAiコンストラクトは、約0.001nM~約20nM、約0.001nM~約10nM、約0.001nM~約5nM、約0.001nM~約1nM、約0.1nM~約10nM、約0.1nM~約5nM、又は約0.1nM~約1nMのIC50で肝臓細胞におけるPNPLA3発現を阻害する。ある種の実施形態では、RNAiコンストラクトは、約1nM~約10nMのIC50で肝臓細胞(例えば、Hep3B細胞)におけるPNPLA3発現を阻害する。本発明のRNAiコンストラクトは、約20nM未満のIC50で肝臓細胞(例えば、HepG2細胞)におけるPNPLA3発現を阻害し得る。例えば、RNAiコンストラクトは、約0.001nM~約20nM、約0.001nM~約10nM、約0.001nM~約5nM、約0.001nM~約1nM、約0.1nM~約10nM、約0.1nM~約5nM、又は約0.1nM~約1nMのIC50で肝臓細胞におけるPNPLA3発現を阻害する。ある種の実施形態では、RNAiコンストラクトは、約1nM~約10nMのIC50で肝臓細胞(例えば、HepG2細胞)におけるPNPLA3発現を阻害する。本発明のRNAiコンストラクトは、約20nM未満のIC50で肝臓細胞(例えば、ヒトPNPLA3 I148I又はI148Mを発現するCHOトランスフェクト細胞)におけるPNPLA3発現を阻害し得る。例えば、RNAiコンストラクトは、約0.001nM~約20nM、約0.001nM~約10nM、約0.001nM~約5nM、約0.001nM~約1nM、約0.1nM~約10nM、約0.1nM~約5nM、又は約0.1nM~約1nMのIC50で肝臓細胞におけるPNPLA3発現を阻害する。ある種の実施形態では、RNAiコンストラクトは、約1nM~約10nMのIC50で肝臓細胞(例えば、ヒトPNPLA3 I148I又はI148Mを発現するCHOトランスフェクト細胞)におけるPNPLA3発現を阻害する。
本発明のRNAiコンストラクトは、当技術分野で知られる手法、例えば従来の核酸固相合成を使用して容易に作製することができる。RNAiコンストラクトのポリヌクレオチドは、標準のヌクレオチド又はヌクレオシド前駆体(例えば、ホスホラミダイト)を利用する好適な核酸合成装置上で構築することができる。自動核酸合成装置は、Applied Biosystems(Foster City、CA)のDNA/RNA合成装置、BioAutomation(Irving、TX)のMerMade合成装置、及びGE Healthcare Life Sciences(Pittsburgh、PA)のOligoPilot合成装置を含む、いくつかのベンダーによって市販されている。
リボヌクレオシドの5’位で酸解離性ジメトキシトリチル(DMT)とともに2’シリル保護基を使用して、ホスホラミダイト化学を介してオリゴヌクレオチドを合成することができる。最終脱保護条件は、RNA産物を著しく分解しないことが知られている。全ての合成は、大規模、中規模又は小規模で任意の自動又は手動合成装置において行うことができる。合成は、複数のウェルプレート、カラム、又はスライドガラスにおいて実行され得る。
2’-O-シリル基は、フッ化物イオンへの曝露を介して除去することができ、フッ化物イオンは、フッ化物イオンの任意の供給源、例えば無機対イオンと対になるフッ化物イオンを含有する塩、例えばフッ化セシウム及びフッ化カリウム又は有機対イオンと対になるフッ化物イオンを含有する塩、例えばフッ化テトラアルキルアンモニウムを含むことができる。クラウンエーテル触媒は、脱保護反応において無機フッ化物と組み合わせて利用することができる。好ましいフッ化物イオン供給源は、フッ化テトラブチルアンモニウム又はアミンヒドロフルオライド(例えば、双極性非プロトン溶媒、例えばジメチルホルムアミドにおいてトリエチルアミンと水性HFとを組み合わせる)である。
亜リン酸トリエステル及びホスホトリエステルに対して使用するための保護基の選択により、フッ化物に対するトリエステルの安定性を変えることができる。ホスホトリエステル又は亜リン酸トリエステルのメチル保護は、フッ化物イオンに対する結合を安定化し、プロセス収率を向上させることができる。
リボヌクレオシドは、反応性の2’ヒドロキシル置換基を有するため、RNAにおける反応性の2’位を、5’-O-ジメトキシトリチル保護基に対して直交性である保護基、例えば酸処理に対して安定であるもので保護することが望ましい場合がある。シリル保護基は、この条件を満たし、最小のRNA分解をもたらし得る最終のフッ化物脱保護ステップにおいて容易に除去することができる。
テトラゾール触媒は、標準的なホスホラミダイトカップリング反応において使用することができる。好ましい触媒は、例えば、テトラゾール、S-エチル-テトラゾール、ベンジルチオテトラゾール、p-ニトロフェニルテトラゾール(pnitrophenyltetrazole)を含む。
当業者によって理解され得るように、本明細書に記載のRNAiコンストラクトを合成するさらなる方法は、当業者に明らかである。加えて、様々な合成ステップを代替の順番又は順序で実施して、所望の化合物を得てもよい。本明細書に記載のRNAiコンストラクトの合成において有用な他の合成化学転換、保護基(例えば、塩基に存在するヒドロキシル、アミノなどのための)及び保護基の手法(保護及び脱保護)は、当技術分野で知られており、例えばR.Larock,Comprehensive Organic Transformations,VCH Publishers(1989);T.W.Greene and P.G.M.Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis,2d.Ed.,John Wiley and Sons(1991);L.Fieser and M.Fieser,Fieser and Fieser’s Reagents for Organic Synthesis,John Wiley and Sons(1994);並びにL.Paquette,ed.,Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis,John Wiley and Sons(1995)、並びにそれらの後続版に記載のものなどを含む。RNAi薬剤のカスタム合成もまた、Dharmacon,Inc.(Lafayette、CO)、AxoLabs GmbH(Kulmbach、Germany)及びAmbion,Inc.(Foster City、CA)を含むいくつかの民間のベンダーから入手可能である。
本発明のRNAiコンストラクトは、リガンドを含み得る。本明細書で使用する場合、「リガンド」は、別の化合物又は分子と直接的又は間接的に相互作用することができる任意の化合物又は分子を指す。別の化合物又は分子とリガンドとの相互作用は、生物学的応答を誘発し得るか(例えば、シグナル伝達カスケードを惹起する、受容体媒介性のエンドサイトーシスを誘導する)、又はまさに物理的会合であり得る。リガンドは、結合する二重鎖RNA分子の1つ以上の特性、例えばRNA分子の薬力学、薬物動態、結合、吸収、細胞分布、細胞内取り込み、電荷及び/又はクリアランス特性を改変することができる。
リガンドは、血清タンパク質(例えば、ヒト血清アルブミン、低密度リポタンパク質、グロブリン)、コレステロール部分、ビタミン(ビオチン、ビタミンE、ビタミンB12)、葉酸部分、ステロイド、胆汁酸(例えば、コール酸)、脂肪酸(例えば、パルミチン酸、ミリスチン酸)、炭水化物(例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン若しくはヒアルロン酸)、グリコシド、リン脂質、又は抗体若しくはその結合断片(例えば、肝臓などの特定の細胞型に対するRNAiコンストラクトを標的化する抗体若しくは結合断片)を含み得る。リガンドの他の例は、色素、挿入剤(例えば、アクリジン)、架橋剤(例えば、プソラレン、マイトマイシンC)、ポルフィリン(TPPC4、テキサフィリン、サフィリン)、多環芳香族炭化水素(例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン)、人工エンドヌクレアーゼ(例えば、EDTA)、親油性分子、例えばアダマンタン酢酸、1-ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、1,3-ビスO(ヘキサデシル)グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、1,3-プロパンジオール、ヘプタデシル基、03-(オレオイル)リトコール酸、03-(オレオイル)コレン酸、ジメトキシトリチル又はフェノキサジン)、ペプチド(例えば、アンテナペディアペプチド、Tatペプチド、RGDペプチド)、アルキル化剤、ポリマー、例えばポリエチレングリコール(PEG)(例えば、PEG-40K)、ポリアミノ酸及びポリアミン(例えば、スペルミン、スペルミジン)を含む。
ある種の実施形態では、リガンドは、エンドソーム不安定化特性を有する。エンドソーム不安定化リガンドは、エンドソームの溶解及び/又は本発明のRNAiコンストラクト若しくはその構成要素のエンドソームから細胞の細胞質への輸送を促進する。エンドソーム不安定化リガンドは、pH依存性膜活性及び膜融合性を示すポリカチオンペプチド又はペプチド模倣体であり得る。一実施形態では、エンドソーム不安定化リガンドは、エンドソームのpHでその活性型コンフォメーションをとる。「活性型」コンフォメーションは、エンドソーム不安定化リガンドが、エンドソームの溶解及び/又は本発明のRNAiコンストラクト若しくはその構成要素のエンドソームから細胞の細胞質への輸送を促進するコンフォメーションである。例示的なエンドソーム不安定化リガンドは、GALAペプチド(Subbarao et al.,Biochemistry,Vol.26:2964-2972,1987)、EALAペプチド(Vogel et al.,J.Am.Chern.Soc.,Vol.118:1581-1586,1996)、及びそれらの誘導体(Turk et al.,Biochem.Biophys.Acta,Vol.1559:56-68,2002)を含む。一実施形態では、エンドソーム不安定化構成要素は、pHの変化に応答して電荷又はプロトン化に変化を起こすことになる化学基(例えば、アミノ酸)を含有し得る。エンドソーム不安定化構成要素は、直鎖状又は分枝状であり得る。
いくつかの実施形態では、リガンドは、脂質又は他の疎水性分子を含む。一実施形態では、リガンドは、コレステロール部分又は他のステロイドを含む。コレステロールコンジュゲート型オリゴヌクレオチドは、それらの非コンジュゲート型の対応物よりも活性であると報告されている(Manoharan,Antisense Nucleic Acid Drug Development,Vol.12:103-228,2002)。核酸分子へのコンジュゲーションのためのコレステロール部分及び他の脂質を含むリガンドは、米国特許第7,851,615号明細書;同第7,745,608号明細書;及び同第7,833,992号明細書にも記載されており、これらの文献は、全て参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。別の実施形態では、リガンドは、葉酸部分を含む。葉酸部分とコンジュゲートしたポリヌクレオチドは、受容体媒介性のエンドサイトーシス経路を介して細胞に取り込まれ得る。このような葉酸-ポリヌクレオチドコンジュゲートは、米国特許第8,188,247号明細書に記載されており、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
PNPLA3が肝臓細胞(例えば、肝細胞)において発現されることを考慮すると、ある種の実施形態では、それらの肝臓細胞にRNAiコンストラクトを特異的に送達することが望ましい。いくつかの実施形態では、RNAiコンストラクトは、肝臓細胞の表面に発現されるタンパク質と結合又は相互作用するリガンドを採用することにより、肝臓に特異的に標的化され得る。例えば、ある種の実施形態では、リガンドは、肝細胞で発現される受容体に特異的に結合する抗原結合タンパク質(例えば、抗体又はその結合断片(例えば、Fab、scFv))含み得る。
ある種の実施形態では、リガンドは、炭水化物を含む。「炭水化物」は、各炭素原子に結合される酸素、窒素又は硫黄原子を伴う少なくとも6個の炭素原子(直鎖状、分岐状又は環状であり得る)を有する1つ以上の単糖単位で構成される化合物を指す。炭水化物は、糖(例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、及び約4、5、6、7、8又は9個の単糖単位を含有するオリゴ糖)、並びにデンプン、グリコーゲン、セルロース及び多糖類ガムなどの多糖を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、リガンドに組み込まれる炭水化物は、ペントース、ヘキソース、又はヘプトースから選択される単糖並びにこのような単糖単位を含む二糖及び三糖である。他の実施形態では、リガンドに組み込まれる炭水化物は、ガラクトサミン、グルコサミン、N-アセチルガラクトサミン、及びN-アセチルグルコサミンなどのアミノ糖である。
いくつかの実施形態では、リガンドは、ヘキソース又はヘキソサミンを含む。ヘキソースは、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、又はフルクトースから選択され得る。ヘキソサミンは、フルクトサミン、ガラクトサミン、グルコサミン、又はマンノサミンから選択され得る。ある種の実施形態では、リガンドは、グルコース、ガラクトース、ガラクトサミン、又はグルコサミンを含む。一実施形態では、リガンドは、グルコース、グルコサミン、又はN-アセチルグルコサミンを含む。別の実施形態では、リガンドは、ガラクトース、ガラクトサミン、又はN-アセチル-ガラクトサミンを含む。特定の実施形態では、リガンドは、N-アセチル-ガラクトサミンを含む。グルコース、ガラクトース、及びN-アセチル-ガラクトサミン(GalNAc)を含むリガンドは、肝臓細胞において化合物を標的化するのに特に有効である。例えば、D’Souza and Devarajan,J.Control Release,Vol.203:126-139,2015を参照されたい。本発明のRNAiコンストラクトに組み込むことができるGalNAc又はガラクトース含有リガンドの例は、米国特許第7,491,805号明細書;同第8,106,022号明細書;及び同第8,877,917号明細書;米国特許出願公開第20030130186号明細書;並びに国際公開第2013166155号パンフレットに記載されており、これらの文献は、全て参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ある種の実施形態では、リガンドは、多価炭水化物部分を含む。本明細書で使用する場合、「多価炭水化物部分」は、独立して他の分子と結合又は相互作用することができる2つ以上の炭水化物単位を含む部分を指す。例えば、多価炭水化物部分は、2つ以上の異なる分子又は同じ分子の2つ以上の異なる部位に結合することができる炭水化物で構成される2つ以上の結合ドメインを含む。炭水化物部分の価数は、炭水化物部分内の個々の結合ドメインの数を意味する。例えば、炭水化物部分に関する用語「一価」、「二価」、「三価」、及び「四価」は、それぞれ1、2、3、及び4個の結合ドメインを有する炭水化物部分を指す。多価炭水化物部分は、多価ラクトース部分、多価ガラクトース部分、多価グルコース部分、多価N-アセチル-ガラクトサミン部分、多価N-アセチル-グルコサミン部分、多価マンノース部分、又は多価フコース部分を含み得る。いくつかの実施形態では、リガンドは、多価ガラクトース部分を含む。他の実施形態では、リガンドは、多価N-アセチル-ガラクトサミン部分を含む。これら及び他の実施形態では、多価炭水化物部分は、二価、三価、又は四価である。このような実施形態では、多価炭水化物部分は、二分岐又は三分岐であり得る。特定の一実施形態では、多価N-アセチル-ガラクトサミン部分は、三価又は四価である。別の特定の実施形態では、多価ガラクトース部分は、三価又は四価である。本発明のRNAiコンストラクトへの組み込みのための例示的な三価又は四価のGalNAc含有リガンドは、以下に詳述される。
リガンドは、RNAiコンストラクトのRNA分子に直接的又は間接的に結合又はコンジュゲートされ得る。例えば、いくつかの実施形態では、リガンドは、RNAiコンストラクトのセンス鎖又はアンチセンス鎖に共有結合的に直接結合される。他の実施形態では、リガンドは、RNAiコンストラクトのセンス鎖又はアンチセンス鎖にリンカーを介して共有結合的に結合される。リガンドは、本発明のRNAiコンストラクトのポリヌクレオチド(例えば、センス鎖若しくはアンチセンス鎖)の核酸塩基、糖部分又はヌクレオチド間結合に結合され得る。プリン核酸塩基又はその誘導体へのコンジュゲーション又は結合は、環内及び環外の原子を含む任意の位置で起こり得る。ある種の実施形態では、プリン核酸塩基の2位、6位、7位、又は8位がリガンドに結合される。ピリミジン核酸塩基又はその誘導体へのコンジュゲーション又は結合も任意の位置で起こり得る。いくつかの実施形態では、ピリミジン核酸塩基の2位、5位、及び6位がリガンドに結合され得る。ヌクレオチドの糖部分へのコンジュゲーション又は結合は、任意の炭素原子で起こり得る。リガンドに結合され得る糖部分の例示的な炭素原子は、2’、3’、及び5’の炭素原子を含む。1’位も塩基性残基などにおいてリガンドに結合され得る。ヌクレオチド間結合もリガンドの結合を促進し得る。リン含有結合(例えば、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミダートなど)について、リガンドは、リン原子又はリン原子に結合したO、N若しくはS原子に直接結合され得る。アミン又はアミド含有ヌクレオシド間結合(例えば、PNA)について、リガンドは、アミン若しくはアミドの窒素原子又は隣接する炭素原子に結合され得る。
ある種の実施形態では、リガンドは、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかの3’又は5’末端に結合され得る。ある種の実施形態では、リガンドは、センス鎖の5’末端に共有結合的に結合される。他の実施形態では、リガンドは、センス鎖の3’末端に共有結合的に結合される。例えば、いくつかの実施形態では、リガンドは、センス鎖の3’末端ヌクレオチドに結合される。このようなある種の実施形態では、リガンドは、センス鎖の3’末端ヌクレオチドの3’位で結合される。代替的な実施形態では、リガンドは、センス鎖の3’末端近傍であるが、1つ以上の末端ヌクレオチドの前(すなわち1、2、3、又は4個の末端ヌクレオチドの前)に結合される。いくつかの実施形態では、リガンドは、センス鎖の3’末端ヌクレオチドの糖の2’位で結合される。
ある種の実施形態では、リガンドは、リンカーを介してセンス鎖又はアンチセンス鎖に結合される。「リンカー」は、リガンドをRNAiコンストラクトのポリヌクレオチド構成要素に共有結合的に結合する原子又は原子の基である。リンカーは、約1~約30の原子長、約2~約28の原子長、約3~約26の原子長、約4~約24の原子長、約6~約20の原子長、約7~約20の原子長、約8~約20の原子長、約8~約18の原子長、約10~約18の原子長、及び約12~約18の原子長であり得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、通常、2個の官能基を有するアルキル部分を含む二官能性の結合部分を含み得る。官能基の一方が選択されて目的の化合物(例えば、RNAiコンストラクトのセンス鎖又はアンチセンス鎖)に結合し、さらに他方が選択されて、本明細書に記載のようなリガンドなどの任意の選択された基に基本的に結合する。ある種の実施形態では、リンカーは、エチレングリコール又はアミノ酸単位などの繰り返し単位の鎖構造又はオリゴマーを含む。二官能性結合部分において通常採用される官能基の例は、求核性基と反応するための求電子剤及び求電子性基と反応するための求核剤を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、二官能性結合部分は、アミノ、ヒドロキシル、カルボン酸、チオール、不飽和(例えば、二重結合又は三重結合)などを含む。
リガンドを本発明のRNAiコンストラクトにおけるセンス鎖又はアンチセンス鎖に結合するために使用され得るリンカーは、ピロリジン、8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸、スクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシラート、6-アミノヘキサン酸、置換C1~C10アルキル、置換若しくは非置換C2~C10アルケニル又は置換若しくは非置換C2~C10アルキニルを含むが、これらに限定されない。このようなリンカーのための好ましい置換基は、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル及びアルキニルを含むが、これらに限定されない。
ある種の実施形態では、リンカーは、切断可能である。切断可能なリンカーは、細胞外部で十分に安定であるが、標的細胞内への進入後に切断されて、リンカーが一体に保持している2つの部分を放出するものである。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、標的細胞中又は第1の参照条件(例えば、細胞内条件を模倣するか、又はそれに相当するように選択され得る)下において、対象の血液中又は第2の参照条件(例えば、血液若しくは血清に見出される条件を模倣するか、又はそれに相当するように選択され得る)下よりも少なくとも10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍若しくは90倍以上又は少なくとも100倍速く切断される。
切断可能なリンカーは、切断剤、例えばpH、酸化還元電位又は分解性分子の存在に対して感受性である。一般に、切断剤は、血清又は血液中よりも細胞内部において優勢であるか又は高いレベル若しくは活性で見出される。このような分解性薬剤の例は、例えば、細胞内に存在して還元によって酸化還元切断可能なリンカーを分解することができる、メルカプタンなどの酸化酵素若しくは還元酵素又は還元性薬剤を含む、特定の基質のために選択されるか又は基質特異性がない酸化還元剤;エステラーゼ;エンドソーム又は酸性環境を作ることができる薬剤、例えば5以下のpHをもたらすもの;一般的な酸として作用することにより酸切断可能なリンカーを加水分解又は分解することができる酵素、ペプチダーゼ(基質特異的であり得る)及びホスファターゼを含む。
切断可能なリンカーは、pHに対して感受性のある部分を含み得る。ヒト血清のpHは、7.4であるが、平均的な細胞内pHは、わずかにより低く、約7.1~7.3の範囲である。エンドソームは、5.5~6.0の範囲のより酸性のpHを有し、リソソームは、およそ5.0のさらにより酸性であるpHを有する。一部のリンカーは、好ましいpHで切断される切断可能な基を有し、それにより細胞内部又は細胞の所望の区画内にリガンドからRNA分子を放出することになる。
リンカーは、特定の酵素によって切断可能である切断可能な基を含むことができる。リンカーに組み込まれる切断可能な基の種類は、標的化される細胞に依存する場合がある。例えば、肝臓標的化リガンドは、エステル基を含むリンカーを介してRNA分子に結合され得る。肝臓細胞は、エステラーゼに富んでおり、したがって、リンカーは、エステラーゼに富んでいない細胞型においてよりも肝臓細胞において効率的に切断されることになる。エステラーゼに富む他の種類の細胞としては、肺、腎皮質、及び精巣の細胞が挙げられる。ペプチド結合を含有するリンカーは、肝臓細胞及び滑膜細胞などのペプチダーゼに富む細胞を標的化する場合に使用され得る。
一般に、切断可能なリンカー候補の適合性は、リンカー候補を切断する分解性薬剤(又は条件)の能力を試験することによって評価することができる。血液中又は他の非標的組織と接触する場合の切断に抵抗する能力に関しても切断可能なリンカー候補を試験することが望ましい。したがって、標的細胞における切断を示すように選択される第1の条件と、他の組織又は生体液、例えば血液又は血清における切断を示すように選択される第2の条件との間で切断に対する相対的感受性を決定することができる。評価は、無細胞系、細胞、細胞培養、臓器若しくは組織培養又は動物全体において実行することができる。無細胞又は培養条件において初期評価を行い、動物全体におけるさらなる評価によって確認することが有用であり得る。いくつかの実施形態では、有用なリンカー候補は、血液又は血清(又は細胞外条件を模倣するように選択されるインビトロ条件下)と比較して細胞(又は細胞内条件を模倣するように選択されるインビトロ条件下)において少なくとも2倍、4倍、10倍、20倍、50倍、70倍、又は100倍速く切断される。
他の実施形態では、酸化還元切断可能なリンカーが利用される。酸化還元切断可能なリンカーは、還元又は酸化に際して切断される。還元的に切断可能な基の一例は、ジスルフィド連結基(-S-S-)である。切断可能なリンカー候補が、好適な「還元的に切断可能なリンカー」であるかどうか、又は例えば特定のRNAiコンストラクト及び特定のリガンドとともに使用するのに好適であるかどうかを判定するために、本明細書に記載の1つ以上の方法を使用することができる。例えば、ジチオスレイトール(DTT)又は例えば標的細胞などの細胞中で観察されるであろう切断速度を模倣する当技術分野で知られる他の還元剤とともにインキュベーションすることにより、リンカー候補を評価することができる。リンカー候補は、血液又は血清条件を模倣するように選択される条件下でも評価することができる。特定の実施形態では、リンカー候補は、血液中において最大で10%切断される。他の実施形態では、有用なリンカー候補は、血液(又は細胞外条件を模倣するように選択されるインビトロ条件下)と比較して細胞(又は細胞内条件を模倣するように選択されるインビトロ条件下)において少なくとも2倍、4倍、10倍、20倍、50倍、70倍、又は100倍速く分解される。
さらに他の実施形態では、ホスフェート系の切断可能なリンカーは、ホスフェート基を分解又は加水分解する薬剤によって切断される。細胞内でホスフェート基を加水分解する薬剤の一例は、細胞内におけるホスファターゼなどの酵素である。ホスフェート系の切断可能な基の例は、-O-P(O)(ORk)-O-、-O-P(S)(ORk)-O-、-O-P(S)(SRk)-O-、-S-P(O)(ORk)-O-、-O-P(O)(ORk)-S-、-S-P(O)(ORk)-S-、-O-P(S)(ORk)-S-、-S-P(S)(ORk)-O-、-O-P(O)(Rk)-O-、-O-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-O-、-S-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-S-、-O-P(S)(Rk)-S-である。特定の実施形態は、-O-P(O)(OH)-O-、-O-P(S)(OH)-O-、-O-P(S)(SH)-O-、-S-P(O)(OH)-O-、-O-P(O)(OH)-S-、-S-P(O)(OH)-S-、-O-P(S)(OH)-S-、-SP(S)(OH)-O-、-O-P(O)(H)-O-、-O-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-O-、-S-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-S-、-O-P(S)(H)-S-を含む。別の特定の実施形態は、-O-P(O)(OH)-O-である。これらのリンカー候補は、上に記載されているものに類似した方法を用いて評価することができる。
他の実施形態では、リンカーは、酸性条件下で切断される基である、酸切断可能な基を含み得る。いくつかの実施形態では、酸切断可能な基は、pH約6.5以下(例えば、約6.0、5.5、5.0以下)の酸性環境中において、又は一般的な酸として作用し得る酵素などの作用物質によって切断される。細胞内において、エンドソーム及びリソソームなどの特定の低pHオルガネラは、酸切断可能な基のための切断環境をもたらし得る。酸切断可能な連結基の例は、ヒドラゾン、エステル、及びアミノ酸のエステルを含むが、これらに限定されない。酸切断可能な基は、一般式-C=NN-、C(O)O、又は-OC(O)を有し得る。特定の実施形態は、エステルの酸素(アルコキシ基)に結合した炭素がアリール基、置換アルキル基、又はジメチル、ペンチル若しくはt-ブチルなどの三級アルキル基である場合である。これらの候補は、上に記載されているものに類似した方法を用いて評価することができる。
他の実施形態では、リンカーは、細胞中のエステラーゼ及びアミダーゼなどの酵素によって切断されるエステル系の切断可能な基を含み得る。エステル系の切断可能な基の例は、アルキレン、アルケニレン及びアルキニレン基のエステルを含むが、これらに限定されない。エステル切断可能な基は、一般式-C(O)O-又は-OC(O)-を有する。これらのリンカー候補は、上に記載されているものに類似した方法を用いて評価することができる。
さらなる実施形態では、リンカーは、細胞中のペプチダーゼ及びプロテアーゼなどの酵素によって切断されるペプチド系の切断可能な基を含み得る。ペプチド系の切断可能な基は、アミノ酸間で形成されてオリゴペプチド(例えば、ジペプチド、トリペプチドなど)及びポリペプチドを生じるペプチド結合である。ペプチド系の切断可能な基は、アミド基(-C(O)NH-)を含まない。アミド基は、任意のアルキレン、アルケニレン又はアルキニレン間で形成され得る。ペプチド結合は、アミノ酸間で形成されてペプチド及びタンパク質を生じる特殊なタイプのアミド結合である。ペプチド系の切断基は、一般に、アミノ酸間で形成されてペプチド及びタンパク質を生じるペプチド結合(すなわちアミド結合)に限定され、アミド官能基全体を含むわけではない。ペプチド系の切断可能な連結基は、一般式-NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-を有し、式中、RA及びRBは、2つの隣接するアミノ酸のR基である。これらの候補は、上に記載されているものに類似した方法を用いて評価することができる。
リガンドを本発明のRNAiコンストラクトにおけるセンス鎖又はアンチセンス鎖に結合するのに好適な他の種類のリンカーが当技術分野で知られており、米国特許第7,723,509号明細書;同第8,017,762号明細書;同第8,828,956号明細書;同第8,877,917号明細書;及び同第9,181,551号明細書に記載されるリンカーを含むことができ、これらの文献は、全て参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ある種の実施形態では、本発明のRNAiコンストラクトのセンス鎖又はアンチセンス鎖に共有結合的に結合されるリガンドは、GalNAc部分、例えば多価のGalNAc部分を含む。いくつかの実施形態では、多価のGalNAc部分は、三価のGalNAc部分であり、且つセンス鎖の3’末端に結合される。他の実施形態では、多価のGalNAc部分は、三価のGalNAc部分であり、且つセンス鎖の5’末端に結合される。さらに他の実施形態では、多価のGalNAc部分は、四価のGalNAc部分であり、且つセンス鎖の3’末端に結合される。さらに他の実施形態では、多価のGalNAc部分は、四価のGalNAc部分であり、且つセンス鎖の5’末端に結合される。
いくつかの実施形態では、本発明のRNAiコンストラクトは、RNAiコンストラクトの細胞内発現をコードし、且つ制御するベクターを投与することにより、目的の細胞又は組織に送達され得る。「ベクター」(本明細書では「発現ベクター」とも称される)は、目的の核酸を細胞の内部に送達するために使用することができる物質の組成物である。多数のベクターが当技術分野で知られており、線状ポリヌクレオチド、イオン性又は両親媒性化合物と結合したポリヌクレオチド、プラスミド、及びウイルスを含むが、これらに限定されない。したがって、用語「ベクター」は、自律的に複製するプラスミド又はウイルスを含む。ウイルスベクターの例は、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどを含むが、これらに限定されない。ベクターは、生細胞内で複製され得るか又は合成的に作製され得る。
一般に、本発明のRNAiコンストラクトを発現するためのベクターは、RNAiコンストラクトをコードする配列に作動可能に連結された1つ以上のプロモーターを含むことになる。本明細書で使用する場合、語句「作動可能に連結」又は「転写制御下」は、プロモーターが適切な位置及びポリヌクレオチド配列に対して適切な向きにあり、RNAポリメラーゼによる転写の開始及びポリヌクレオチド配列の発現を制御することを意味する。「プロモーター」は、細胞の合成装置によって認識されるか又は合成装置に導入され、特定の遺伝子配列の転写を開始するのに必要とされる配列を指す。好適なプロモーターは、RNA polI、polII、HI又はU6 RNA polIII、及びウイルスプロモーター(例えば、ヒトサイトメガロウイルス(CMV)最初期遺伝子プロモーター、SV40初期プロモーター及びラウス肉腫ウイルス長い末端反復配列)を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、HI又はU6RNA polIIIプロモーターが好ましい。そのプロモーターは、組織特異的又は誘導性プロモーターであり得る。特に興味深いのは、ヒトα1-アンチトリプシン遺伝子、アルブミン遺伝子、ヘモペキシン遺伝子、及び肝性リパーゼ遺伝子由来のプロモーター配列などの肝臓特異的なプロモーターである。誘導性プロモーターは、エクジソン、エストロゲン、プロゲステロン、テトラサイクリン、及びイソプロピル-PD1-チオガラクトピラノシド(IPTG)によって調節されるプロモーターを含む。
RNAiコンストラクトがsiRNAを含むいくつかの実施形態では、2つの別々の鎖(センス鎖及びアンチセンス鎖)は、単一のベクター又は2つの別々のベクターから発現され得る。例えば、一実施形態では、センス鎖をコードする配列は、第1のベクターのプロモーターに作動可能に連結され、アンチセンス鎖をコードする配列は、第2のベクターのプロモーターに作動可能に連結される。このような実施形態では、第1及び第2のベクターは、例えば、感染又はトランスフェクションによって標的細胞に同時に導入され、その結果、センス鎖及びアンチセンス鎖が転写されると、細胞内でハイブリダイズしてsiRNA分子を形成することになる。別の実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖は、単一のベクター中に配置される2つの別々のプロモーターから転写される。いくつかのこのような実施形態では、センス鎖をコードする配列は、第1のプロモーターに作動可能に連結され、アンチセンス鎖をコードする配列は、第2のプロモーターに作動可能に連結され、第1及び第2のプロモーターは、単一のベクター中に配置される。一実施形態では、ベクターは、siRNA分子をコードする配列に作動可能に連結される第1のプロモーター及び逆方向の同じ配列に作動可能に連結される第2のプロモーターを含み、その結果、第1のプロモーターからの配列の転写がsiRNA分子のセンス鎖の合成をもたらし、第2のプロモーターからの配列の転写がsiRNA分子のアンチセンス鎖の合成をもたらす。
RNAiコンストラクトがshRNAを含む他の実施形態では、単一の少なくとも部分的に自己相補的RNA分子をコードする配列は、単一の転写物を生成するプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、shRNAをコードする配列は、リンカーポリヌクレオチド配列によって結合される逆方向反復を含み、転写後にshRNAのステム及びループ構造を生成する。
いくつかの実施形態では、本発明のRNAiコンストラクトをコードするベクターは、ウイルスベクターである。本明細書に記載のRNAiコンストラクトを発現するのに好適な様々なウイルスベクター系は、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター(例えば、レンチウイルスベクター、モロニーマウス白血病ウイルス)、アデノ随伴ウイルスベクター;単純ヘルペスウイルスベクター;SV40ベクター;ポリオーマウイルスベクター;パピローマウイルスベクター;ピコルナウイルスベクター;及びポックスウイルスベクター(例えば、ワクシニアウイルス)を含むが、これらに限定されない。ある種の実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター(例えば、レンチウイルスベクター)である。
本発明における使用に好適な様々なベクター、siRNA又はshRNA分子をコードする核酸配列をベクターに挿入する方法及びベクターを目的の細胞に送達する方法は、当業者の技術の範囲内である。例えば、Dornburg,Gene Therap.,Vol.2:301-310,1995;Eglitis,Biotechniques,Vol.6:608-614,1988;Miller,HumGene Therap.,Vol.1:5-14,1990;Anderson,Nature,Vol.392:25-30,1998;Rubinson D A et al.,Nat.Genet.,Vol.33:401-406,2003;Brummelkamp et al.,Science,Vol.296:550-553,2002;Brummelkamp et al.,Cancer Cell,Vol.2:243-247,2002;Lee et al.,Nat Biotechnol,Vol.20:500-505,2002;Miyagishi et al.,Nat Biotechnol,Vol.20:497-500,2002;Paddison et al.,GenesDev,Vol.16:948-958,2002;Paul et al.,Nat Biotechnol,Vol.20:505-508,2002;Sui et al.,ProcNatl Acad Sci USA,Vol.99:5515-5520,2002;及びYu et al.,Proc Natl Acad Sci USA,Vol.99:6047-6052,2002を参照されたい(これらの全ては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。
本発明は、本明細書に記載のRNAiコンストラクト及び薬学的に許容される担体、賦形剤、又は希釈剤を含む医薬組成物及び製剤も含む。このような組成物及び製剤は、必要とする対象においてPNPLA3の発現を低減するのに有用である。臨床上の用途を考える場合、医薬組成物及び製剤は、目的の用途に適切な形態で作製されることになる。一般に、これは、パイロジェン、及びヒト又は動物に有害になる可能性のある他の不純物を本質的に含まない組成物を作製することを必然的に伴うことになる。
「薬学的に許容される」又は「薬理学的に許容される」という語句は、動物又はヒトに投与される場合に、有害な、アレルギー性の又は他の不都合な反応をもたらさない分子実体及び組成物を指す。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤」は、ヒトへの投与に好適な薬剤などの薬剤の製剤化における使用に許容される溶媒、緩衝液、溶液、分散媒体、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張化剤及び吸収遅延剤などを含む。薬学的に活性な物質に対するこのような媒体及び薬剤の使用は、当技術分野でよく知られている。任意の従来の媒体又は薬剤が本発明のRNAiコンストラクトと適合しない場合を除いて、治療用組成物におけるその使用が想定される。補助的な活性成分は、それらが組成物のベクター又はRNAiコンストラクトを不活性化しないという条件で組成物に組み込むこともできる。
医薬組成物の製剤の組成及び方法は、投与経路、治療される疾患若しくは障害の種類及び程度又は投与される用量を含むがこれらに限定されない、いくつかの条件に依存する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、目的の送達経路に基づいて製剤化される。例えば、ある種の実施形態では、医薬組成物は、非経口送達のために製剤化される。非経口の送達形態は、静脈内、動脈内、皮下、髄腔内、腹腔内又は筋肉内の注射又は注入を含む。一実施形態では、医薬組成物は、静脈内送達のために製剤化される。このような実施形態では、医薬組成物は、脂質ベースの送達ビヒクルを含み得る。別の実施形態では、医薬組成物は、皮下送達のために製剤化される。このような実施形態では、医薬組成物は、標的化リガンド(例えば、本明細書に記載のGalNAc含有リガンド)を含み得る。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載のRNAiコンストラクトを有効量含む。「有効量」は、有利な又は所望の臨床結果をもたらすのに十分な量である。いくつかの実施形態では、有効量は、対象の肝細胞におけるPNPLA3発現を低減するのに十分な量である。いくつかの実施形態では、有効量は、PNPLA3発現を、例えばヒトヘテロ接合体における野生型PNPLA3アレルの発現に相当するレベルまで部分的にのみ低減するのに十分な量であり得る。機能欠損型のPNPLA3バリアントアレルのヘテロ接合性ヒト保因者は、非保因者と比べて非HDLコレステロールの血清レベルが低く、且つ冠動脈疾患及び心筋梗塞のリスクが低いと報告された(Nioi et al.,New England Journal of Medicine,Vol.374(22):2131-2141,2016)。したがって、理論に束縛されることなく、PNPLA3発現の部分的な低減は、有利な血清非HDLコレステロールの低減並びに冠動脈疾患及び心筋梗塞のリスクの低減を実現するのに十分であり得ると考えられる。
本発明のRNAiコンストラクトの有効量は、約0.01mg/kg体重~約100mg/kg体重、約0.05mg/kg体重~約75mg/kg体重、約0.1mg/kg体重~約50mg/kg体重、約1mg/kg~約30mg/kg体重、約2.5mg/kg体重~約20mg/kg体重、又は約5mg/kg体重~約15mg/kg体重であり得る。ある種の実施形態では、本発明のRNAiコンストラクトの1回の有効量は、約0.1mg/kg、約0.5mg/kg、約1mg/kg、約2mg/kg、約3mg/kg、約4mg/kg、約5mg/kg、約6mg/kg、約7mg/kg、約8mg/kg、約9mg/kg、又は約10mg/kgであり得る。有効量のRNAiコンストラクトを含む医薬組成物は、毎週、隔週、毎月、3ヶ月毎、又は半年毎に投与され得る。有効な投与量及び投与頻度であろうと考えられるものの正確な決定は、患者の大きさ、年齢及び全身状態、治療される障害の種類(例えば、心筋梗塞、心不全、冠動脈疾患、高コレステロール血症)、採用される特定のRNAiコンストラクト、並びに投与経路を含むいくつかの要因に基づき得る。本発明の任意の特定のRNAiコンストラクトについての有効用量及びインビボ半減期の推定値は、適切な動物モデルにおける従来の方法及び/又は試験を用いて確認することができる。
本発明の医薬組成物の投与は、標的組織がその経路を介して利用できる限り、任意の一般的な経路を介するものであり得る。このような経路は、非経口(例えば、皮下、筋肉内、腹腔内又は静脈内)、経口、経鼻、頬側、皮内、経皮、及び舌下経路、又は肝臓組織への直接注射若しくは肝門脈を介する送達を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、非経口で投与される。例えば、ある種の実施形態では、医薬組成物は、静脈内に投与される。他の実施形態では、医薬組成物は、皮下に投与される。
水中油型エマルション、ミセル、混合ミセル及びリポソームを含む高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、及び脂質ベースの系などのコロイド分散系は、本発明のRNAiコンストラクト又はそのようなコンストラクトをコードするベクターのための送達ビヒクルとして使用され得る。本発明の核酸を送達するのに好適な市販の脂肪乳剤としては、Intralipid(登録商標)、Liposyn(登録商標)、Liposyn(登録商標)II、Liposyn(登録商標)III、及び他の同様の脂肪乳剤が挙げられる。インビボにおける送達ビヒクルとして使用するための好ましいコロイド系は、リポソーム(すなわち、人工膜小胞)である。本発明のRNAiコンストラクトは、リポソーム内に封入され得るか、又はそれと、特に、カチオン性リポソームと複合体を形成し得る。代わりに、本発明のRNAiコンストラクトは、脂質、特にカチオン性脂質と複合体を形成し得る。好適な脂質及びリポソームは、中性(例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、ジミリストイルホスファチジルコリン(DMPC)、及びジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC))、ジステアロイルホスファチジルコリン)、陰性(例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロール(DMPG))並びにカチオン性(例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピル(DOTAP)及びジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOTMA))を含む。このようなコロイド分散系の調製及び使用は、当技術分野でよく知られている。例示的な製剤は、米国特許第5,981,505号明細書;米国特許第6,217,900号明細書;米国特許第6,383,512号明細書;米国特許第5,783,565号明細書;米国特許第7,202,227号明細書;米国特許第6,379,965号明細書;米国特許第6,127,170号明細書;米国特許第5,837,533号明細書;米国特許第6,747,014号明細書;及び国際公開第03/093449号パンフレットにおいても開示される。
いくつかの実施形態では、本発明のRNAiコンストラクトは、脂質製剤に完全に封入されて、例えばSPLP、pSPLP、SNALP、又は他の核酸-脂質粒子を形成する。本明細書で使用する場合、用語「SNALP」は、SPLPを含む安定な核酸-脂質粒子を指す。本明細書で使用する場合、用語「SPLP」は、脂質小胞に封入されたプラスミドDNAを含む核酸-脂質粒子を指す。SNALP及びSPLPは通常、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、及び粒子の凝集を防ぐ脂質(例えば、PEG-脂質コンジュゲート)を含有する。SNALP及びSPLPは、静脈内注射後に長期間の循環寿命を示し、且つ遠位部位(例えば、投与部位から物理的に離れた部位)に蓄積するため、全身投与のために極めて有用である。SPLPは、国際公開第00/03683号パンフレットに記載の封入された縮合剤-核酸複合体を含む「pSPLP」を含む。核酸-脂質粒子は、通常、約50nm~約150nm、約60nm~約130nm、約70nm~約110nm、又は約70nm~約90nmの平均直径を有し、実質的に非毒性である。加えて、核酸-脂質粒子中に存在する場合の核酸は、水溶液中においてヌクレアーゼによる分解に対して耐性がある。核酸-脂質粒子及びそれらの調製方法は、例えば、米国特許第5,976,567号明細書;同第5,981,501号明細書;同第6,534,484号明細書;同第6,586,410号明細書;同第6,815,432号明細書;及び国際公開第96/40964号パンフレットにおいて開示される。
注射用途に好適な医薬組成物は、例えば、滅菌水溶液又は分散体及び注射用滅菌溶液又は分散体の即時調製のための滅菌粉末を含む。一般に、これらの調製物は、滅菌済みであり、容易に注射可能である程度の流体である。調製物は、製造及び貯蔵の条件下で安定であるべきであり、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されているべきである。適切な溶媒又は分散媒体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど)、好適なその混合物、及び植物油を含有し得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用、分散体の場合に必要とされる粒径の維持及び界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物作用の予防は、様々な抗菌剤、抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらすことができる。多くの場合、等張化剤、例えば糖又は塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延する作用物質、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの組成物中での使用によってもたらすことができる。
注射用滅菌溶液は、活性化合物を適切な量で所望の任意の他の成分(例えば、上で列挙されるとおり)とともに溶媒に組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製され得る。一般的に、分散体は、塩基性分散媒体及び所望の他の成分、例えば上で列挙された成分を含有する滅菌ビヒクルに滅菌された様々な活性成分を組み込むことによって調製される。注射用滅菌溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分及び任意の追加の所望の成分の粉末を予め滅菌濾過されたその溶液から生じさせる真空乾燥及びフリーズドライの手法を含む。
本発明の組成物は、一般に、中性又は塩形態で製剤化され得る。薬学的に許容される塩は、例えば、無機酸(例えば、塩酸若しくはリン酸)又は有機酸(例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸など)に由来する酸付加塩(遊離アミノ基によって形成される)を含む。遊離カルボキシル基によって形成される塩は、無機塩基(例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム若しくは水酸化第二鉄)又は有機塩基(例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなど)から誘導することもできる。
水溶液における非経口投与のために、例えば、溶液は、通常、適切に緩衝化され、液体希釈剤は、例えば、十分な生理食塩水又はグルコースにより最初に等張にされる。このような水溶液は、例えば、静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内投与に使用され得る。好ましくは、特に本開示を考慮すれば、当業者に知られるような滅菌水性媒体が採用される。実例として、単回用量が等張NaCl溶液1ml中に溶解され、皮下注入液1000mlに添加されるか、又は提案された注入部位に注射され得る(例えば、“Remington’s Pharmaceutical Sciences”15th Edition,pages 1035-1038及び1570-1580を参照されたい)。ヒトへの投与に関して、調製物は、FDA標準が要件とする無菌性、発熱性、全般的安全性及び純度標準を満たすべきである。ある種の実施形態では、本発明の医薬組成物は、滅菌生理食塩水及び本明細書に記載のRNAiコンストラクトを含むか又はそれらからなる。他の実施形態では、本発明の医薬組成物は、本明細書に記載のRNAiコンストラクト及び滅菌水(例えば、注射用水、WFI)を含むか又はそれらからなる。さらに他の実施形態では、本発明の医薬組成物は、本明細書に記載のRNAiコンストラクト及びリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を含むか又はそれらからなる。
いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、投与用デバイスでパッケージ化されるか又はその中に保存される。注射用製剤のためのデバイスは、注射ポート、プレフィルドシリンジ、自動注入装置、注射ポンプ、装着型注射器、及び注射ペンを含むが、これらに限定されない。エアロゾル化又は粉末製剤のためのデバイスは、インヘラー、吸入器、吸引器などを含むが、これらに限定されない。したがって、本発明は、本明細書に記載の障害の1つ以上を治療又は予防するための本発明の医薬組成物を含む投与デバイスを含む。
PNPLA3発現を阻害するための方法
本発明はまた、細胞におけるPNPLA3遺伝子の発現を阻害する方法を提供する。方法は、細胞をRNAi薬剤、例えば、二重鎖RNAi薬剤と、細胞におけるPNPLA3の発現を阻害するのに有効な量で接触させることによって、細胞におけるPNPLA3の発現を阻害することを含む。RNAi薬剤、例えば、二重鎖RNAi薬剤と細胞の接触は、インビトロ又はインビボで行われ得る。細胞をインビボでRNAi薬剤と接触させることは、対象、例えばヒト対象内の細胞又は細胞群をRNAi薬剤と接触させることを含む。細胞を接触させるインビトロ及びインビボでの方法の組み合わせもまた、可能である。
本発明は、PNPLA3の発現の低減又は阻害を、それを必要とする対象において行う方法、及びPNPLA3発現若しくは活性と関連する状態、疾患又は障害を治療又は予防する方法を提供する。「PNPLA3発現と関連する状態、疾患又は障害」は、PNPLA3の発現レベルが変化するか、又はPNPLA3の上昇した発現レベルがその状態、疾患又は障害の増大した発症リスクと関連する状態、疾患又は障害を指す。
細胞の接触は、上記のとおり直接的又は間接的であり得る。さらに、細胞の接触は、本明細書で記載されるか又は当技術分野で知られるいずれかのリガンドを含む標的化リガンドを介して達成され得る。好ましい実施形態では、標的化リガンドは、炭水化物部分、例えば、GalNAc3リガンド、又は目的の部位にRNAi薬剤を誘導する任意の他のリガンドである。
一実施形態では、細胞とRNAiの接触は、細胞への取り込み又は細胞への吸収を促進するか又は引き起こすことによって、「導入すること」又は「細胞にRNAiを送達すること」を含む。RNAiの吸収又は取り込みは、補助なしの拡散性若しくは活性細胞性プロセスによって、又は補助剤若しくはデバイスによって起こすことができる。RNAiの細胞への導入は、インビトロ及び/又はインビボであり得る。例えば、インビボでの導入のために、RNAiを組織部位に注射してもよいし、全身投与してもよい。細胞へのインビトロでの導入としては、エレクトロポレーション及びリポフェクションなどの当技術分野で知られる方法が挙げられる。さらなる手法は、本明細書の下記に記載され、且つ/又は当技術分野で知られる。
本明細書で使用する場合、用語「阻害する」は、「低減する」、「サイレンシングする」、「下方制御する」、「抑制する」、及び他の類似用語と互換的に使用され、あらゆるレベルの阻害を含む。
語句「PNPLA3の発現を阻害する」は、任意のPNPLA3遺伝子(例えば、マウスPNPLA3遺伝子、ラットPNPLA3遺伝子、サルPNPLA3遺伝子、又はヒトPNPLA3遺伝子など)及びPNPLA3遺伝子のバリアント又は変異体の発現の阻害を指すものとする。したがって、PNPLA3遺伝子は、野生型PNPLA3遺伝子、変異体PNPLA3遺伝子(アミロイド沈着を引き起こす変異体PNPLA3遺伝子など)、又は遺伝子操作細胞、細胞群、若しくは生物の文脈におけるトランスジェニックPNPLA3遺伝子であってもよい。
「PNPLA3遺伝子の発現を阻害する」は、PNPLA3遺伝子のあらゆるレベルの阻害、例えば、PNPLA3遺伝子の発現の少なくとも一部の抑制を含む。PNPLA3遺伝子の発現は、例えば、PNPLA3のmRNAレベル、PNPLA3タンパク質レベル、又はアミロイド沈着物の数若しくは程度などのPNPLA3遺伝子発現と関連する任意の変数のレベル、又はレベルの変化に基づいて評価され得る。このレベルは、例えば、対象に由来する試料を含む、個々の細胞又は細胞群において評価され得る。
阻害は、対照レベルと比較して、PNPLA3発現に関連する1つ以上の変数の絶対又は相対レベルの減少によって評価され得る。対照レベルは、例えば、投与前のベースラインレベル、又は治療されていないか若しくは対照(例えば、緩衝剤のみの対照又は不活性薬剤対照)で治療された類似対象、細胞、若しくは試料から決定されるレベルなどの当技術分野で利用される任意のタイプの対照レベルであり得る。本発明の方法のいくつかの実施形態では、PNPLA3遺伝子の発現は、少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%,少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%阻害される。
PNPLA3遺伝子の発現の阻害は、第1の細胞又は細胞群と実質的に同一であるが、同様に処理されていない第2の細胞又は細胞群(対照細胞)と比較した場合の、PNPLA3遺伝子の発現が阻害されるように、PNPLA3遺伝子が転写され、且つ処理された(例えば、細胞を本発明のRNAi薬剤と接触させることにより、又は当該細胞が存在する、若しくは存在した対象に本発明のRNAi薬剤を投与することにより)第1の細胞又は細胞群(このような細胞は、例えば、対象に由来する試料中に存在し得る)により発現されるmRNAの量の減少によって明らかにされ得る。好ましい実施形態では、阻害は、以下の式:
Figure 2024012386000001
を使用して、対照細胞中のmRNAのレベルのパーセンテージとして処理された細胞中のmRNAのレベルを表すことにより評価される。
或いは、PNPLA3遺伝子の発現の阻害は、PNPLA3遺伝子発現、例えば、PNPLA3タンパク質発現又はヘッジホッグ経路タンパク質活性に機能的に関連するパラメーターの低下に関して評価されてもよい。PNPLA3遺伝子サイレンシングは、構成的に又はゲノム操作によりPNPLA3を発現する任意の細胞において、当技術分野で知られる任意のアッセイにより決定され得る。
PNPLA3タンパク質の発現の阻害は、細胞又は細胞群により発現されるPNPLA3タンパク質のレベル(例えば、対象に由来する試料中で発現されるタンパク質のレベル)の低減によって明らかにされ得る。上に説明されるとおり、mRNA抑制の評価のために、処理された細胞又は細胞群におけるタンパク質発現レベルの阻害は、対照細胞又は細胞群におけるタンパク質のレベルのパーセンテージとして同様に表され得る。
PNPLA3遺伝子の発現の阻害を評価するために使用され得る対照細胞又は細胞群としては、本発明のRNAi薬剤とまだ接触していない細胞又は細胞群が挙げられる。例えば、対照細胞又は細胞群は、RNAi薬剤による対象の治療の前に、個別の対象(例えば、ヒト又は動物対象)から得てもよい。
細胞又は細胞群により発現されるPNPLA3のmRNAのレベル、又は循環しているPNPLA3のmRNAのレベルは、mRNA発現を評価するための当技術分野で知られる任意の方法を用いて決定され得る。一実施形態では、試料中のPNPLA3の発現レベルは、例えば、PNPLA3遺伝子のmRNAなどの転写ポリヌクレオチド、又はその部分を検出することにより決定される。RNAは、例えば、酸性フェノール/グアニジンイソチオシアネート抽出(RNAzol B;Biogenesis)、RNeasy RNA調製キット(Qiagen)又はPAXgene(PreAnalytix、Switzerland)の使用を含むRNA抽出技術を用いて、細胞から抽出され得る。リボ核酸ハイブリダイゼーションを利用する典型的なアッセイ形式としては、核ランオンアッセイ、RT-PCR、RNase保護アッセイ(Melton et al.,Nuc.Acids Res.12:7035)、ノーザンブロッティング、インサイチュハイブリダイゼーション、及びマイクロアレイ分析が挙げられる。循環しているPNPLA3のmRNAは、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる、PCT/US2012/043584号明細書に記載される方法を用いて検出され得る。
一実施形態では、PNPLA3の発現のレベルは、核酸プローブを使用して決定される。用語「プローブ」は、本明細書で使用する場合、特定のPNPLA3に選択的に結合することができる任意の分子を指す。プローブは、当業者によって合成することができるか、又は適切な生物学的調製物から誘導することができる。プローブは、標識されるように特異的に設計されてもよい。プローブとして利用され得る分子の例としては、RNA、DNA、タンパク質、抗体、及び有機分子が挙げられるが、これらに限定されない。
単離されたmRNAは、サザン又はノーザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)分析及びプローブアレイを含むが、これらに限定されないハイブリダイゼーション又は増幅アッセイに使用することができる。mRNAレベルの1つの決定方法は、単離されたmRNAを、PNPLA3のmRNAとハイブリダイズすることができる核酸分子(プローブ)と接触させることを含む。一実施形態では、例えば、アガロースゲル上で単離mRNAを泳動させ、mRNAをゲルからニトロセルロースなどの膜に移すことによって、mRNAを固体表面上に固定化し、プローブと接触させる。代替的な実施形態では、プローブは、例えば、Affymetrix遺伝子チップアレイにおいて、固体表面上に固定化し、mRNAをプローブと接触させる。当業者は、既知のmRNA検出法を、PNPLA3のmRNAのレベルの決定に使用するために容易に適合させることができる。
試料中のPNPLA3の発現のレベルを決定するための代替的な方法は、例えば、RT-PCR(Mullis,1987,米国特許第4,683,202号明細書に記載の実験的な実施形態)、リガーゼ連鎖反応(Barany(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:189-193)、自家持続配列複製法(Guatelli et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:1874-1878)、転写増幅系(Kwoh et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1173-1177)、Q-ベータレプリカーゼ(Lizardi et al.(1988)Bio/Technology 6:1197)、ローリングサークル複製(Lizardi et al.,米国特許第5,854,033号明細書)又は任意の他の核酸増幅法による、例えば、試料中のmRNAの核酸増幅及び/又は逆転写酵素(cDNAを調製するための)の工程の後、当業者によく知られる手法を使用する増幅された分子の検出を含む。これらの検出スキームは、特に、核酸分子が非常に少ない数で存在する場合、核酸分子の検出に有用である。本発明の具体的な態様では、PNPLA3の発現のレベルは、定量蛍光RT-PCR(すなわち、TaqMan(商標)System)により決定される。PNPLA3のmRNAの発現レベルは、メンブレンブロット(ノーザン、サザン、ドットなどのハイブリダイゼーション分析に使用されているものなど)、又はマイクロウェル、サンプルチューブ、ゲル、ビーズ若しくはファイバー(又は結合核酸を含む任意の固体支持体)を使用してモニターされ得る。参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第5,770,722号明細書、同第5,874,219号明細書、同第5,744,305号明細書、同第5,677,195号明細書及び同第5,445,934号明細書を参照されたい。PNPLA3の発現レベルの決定は、溶液中の核酸プローブの使用も含み得る。
好ましい実施形態では、mRNAの発現のレベルは、分岐状DNA(bDNA)アッセイ又はリアルタイムPCR(qPCR)を使用して評価される。これらの方法の使用は、本明細書に提示される実施例に記載及び例示される。
PNPLA3タンパク質発現のレベルは、タンパク質レベルの測定のための当技術分野で知られる任意の方法を使用して決定され得る。このような方法としては、例えば、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、薄層クロマトグラフィー(TLC)、高拡散クロマトグラフィー、液体又はゲル沈降素反応、吸収分光法、比色アッセイ、分光光度アッセイ、フローサイトメトリー、免疫拡散法(一元又は二元)、免疫電気泳動、ウエスタンブロッティング、放射性免疫アッセイ(RIA)、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)、免疫蛍光アッセイ、電気化学発光アッセイなどが挙げられる。
いくつかの実施形態では、本発明の方法の有効性は、四肢、顔、喉頭、上気道、腹部、躯幹、及び性器の浮腫状腫脹、前駆症;喉頭部浮腫;非掻痒性発疹;吐き気;嘔吐;又は腹痛の低減などのPNPLA3疾患の症状の低減を検出又はモニターすることにより、モニターすることができる。これらの症状は、当技術分野で知られる任意の方法を使用してインビトロ又はインビボで評価され得る。
本発明の方法のいくつかの実施形態では、RNAi薬剤が対象内の特定の部位に送達されるように、RNAi薬剤は対象に投与される。PNPLA3の発現の阻害は、対象内の特定の部位からの体液又は組織に由来する試料中のPNPLA3のmRNA又はPNPLA3タンパク質のレベル又はレベルの変化の測定を使用して評価され得る。好ましい実施形態では、その部位は、肝臓、脈絡叢、網膜、及び膵臓からなる群から選択される。その部位は、前述の部位のいずれか1つからの細胞の小単位又は部分群であってもよい。その部位はまた、特定の型の受容体を発現する細胞を含んでもよい。
PNPLA3関連疾患を治療又は予防する方法
本発明は、PNPLA3関連疾患、障害、及び/若しくは状態を有する、又はPNPLA3関連疾患、障害、及び/若しくは障害を発症しやすい対象に、RNAi薬剤を含む組成物、又はRNAi薬剤を含む医薬組成物、又は本発明のRNAiを含むベクターを投与することを含む、治療及び予防方法を提供する。PNPLA3関連疾患の非限定的な例として、例えば、脂肪肝(脂肪症)、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬変、肝臓内での脂肪の蓄積、肝臓の炎症、肝細胞壊死、肝線維症、肥満、又は非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)が挙げられる。一実施形態では、PNPLA3関連疾患は、NAFLDである。別の実施形態では、PNPLA3関連疾患は、NASHである。別の実施形態では、PNPLA3関連疾患は、脂肪肝(脂肪症)である。別の実施形態では、PNPLA3関連疾患は、インスリン抵抗性である。別の実施形態では、PNPLA3関連疾患は、インスリン抵抗性ではない。
ある種の実施形態では、本発明は、本明細書に記載のRNAiコンストラクトのいずれかを患者に投与することを含む、PNPLA3の発現の低減を、それを必要とする患者において行う方法を提供する。本明細書で使用する場合、用語「患者」は、ヒトを含む哺乳動物を指し、用語「対象」と互換的に使用することができる。好ましくは、患者の肝細胞におけるPNPLA3の発現レベルは、RNAiコンストラクトを受容していない患者のPNPLA3の発現レベルと比較してRNAiコンストラクトの投与後に低減される。
本発明の方法は、PNPLA3関連疾患を有する対象、例えば、PNPLA3遺伝子発現及び/又はPNPLA3タンパク質産生の低減から利益を受けることになる対象を治療するのに有用である。一態様では、本発明は、非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)を有する対象におけるパタチン様ホスホリパーゼドメイン含有3(PNPLA3)遺伝子発現のレベルを低減する方法を提供する。別の態様では、本発明は、NAFLDを有する対象においてPNPLA3タンパク質のレベルを低減する方法を提供する。本発明はまた、NAFLDを有する対象におけるヘッジホッグ経路の活性のレベルを低減する方法も提供する。
別の態様では、本発明は、NAFLDを有する対象を治療する方法を提供する。一態様では、本発明は、PNPLA3関連疾患、例えば、脂肪肝(脂肪症)、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬変、肝臓内での脂肪蓄積、肝臓の炎症、肝細胞壊死、肝線維症、肥満、又は非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)を有する対象を治療する方法を提供する。本発明の治療方法(及び使用)は、対象、例えば、ヒトに、治療有効量のPNPLA3遺伝子を標的化する本発明のRNAi薬剤又はPNPLA3遺伝子を標的化する本発明のRNAi薬剤若しくはPNPLA3遺伝子を標的化するRNAi薬剤を含む本発明のベクターを含む医薬組成物を投与することを含む。
一態様では、本発明は、例えば、高められたヘッジホッグシグナル伝達経路の存在、疲労、衰弱、減量、食欲不振、吐き気、腹痛、クモ状血管、皮膚及び眼の黄色化(黄疸)、かゆみ、水分蓄積及び脚の腫脹(浮腫)、腹部膨満(腹水)、及び精神錯乱など、NAFLDを有する対象の少なくとも1つの症状を予防する方法を提供する。この方法は、治療有効量のRNAi薬剤、例えば、本発明のdsRNA、医薬組成物、又はベクターを対象に投与することにより、PNPLA3遺伝子発現の低減から利益を受けることになる障害を有する対象の少なくとも1つの症状を予防することを含む。
別の態様では、本発明は、対象、例えば、PNPLA3遺伝子発現の低減及び/又は阻害から利益を受けることになる対象を治療するための、治療有効量の本発明のRNAi薬剤の使用を提供する。さらなる態様では、本発明は、PNPLA3遺伝子発現の低減から利益を受けることになる障害、例えば、PNPLA3関連疾患を有する対象などの対象、例えば、PNPLA3遺伝子発現及び/又はPNPLA3タンパク質産生の低減及び/又は阻害から利益を受けることになる対象を治療するための医薬の製造における、PNPLA3遺伝子を標的化する本発明のRNAi薬剤、例えば、dsRNA、又はPNPLA3遺伝子を標的化するRNAi薬剤を含む医薬組成物の使用を提供する。
別の態様では、本発明は、PNPLA3遺伝子発現及び/又はPNPLA3タンパク質産生の低減及び/又は阻害から利益を受けることになる障害に罹患している対象の少なくとも1つの症状を予防するための本発明のRNAi、例えば、dsRNAの使用を提供する。
さらなる態様では、本発明は、PNPLA3関連疾患などのPNPLA3遺伝子発現及び/又はPNPLA3タンパク質産生の低減及び/又は阻害から利益を受けることになる障害に罹患している対象の少なくとも1つの症状を予防するための医薬の製造における本発明のRNAi薬剤の使用を提供する。
一実施形態では、PNPLA3を標的化するRNAi薬剤は、dsRNA薬剤が対象に投与されるとき、例えば、対象の細胞、組織、血液又は他の組織若しくは体液においてPNPLA3遺伝子の発現が、少なくとも約10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、62%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は少なくとも約99%以上低減されるように、PNPLA3関連疾患、例えば、非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)を有する対象に投与される。
本発明の方法及び使用は、標的PNPLA3遺伝子の発現が、例えば、約1、2、3、4、5、6、7、8、12、16、18、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72、76、又は約80時間減少されるように、本明細書に記載の組成物を投与することを含む。一実施形態では、標的PNPLA3遺伝子の発現は、長期間、例えば、少なくとも約2、3、4、5、6、7日以上、例えば、約1週間、2週間、3週間、又は約4週間以上低減される。
本発明の方法及び使用に従うdsRNAの投与は、PNPLA3関連疾患、例えば、非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)を有する患者におけるそのような疾患又は障害の重症度、徴候、症状、及び/又はマーカーの低減をもたらし得る。この文脈における「低減」は、このようなレベルの統計的に有意な低減を意味する。低減は、例えば、少なくとも約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、又は約100%であり得る。疾患の治療又は予防の有効性は、例えば、疾患進行、疾患寛解、症状重症度、疼痛の減少、生活の質、治療効果を維持するのに必要な医薬の用量、疾病マーカーのレベル又は治療されているか若しくは予防の標的となる所与の疾患に適した任意の他の測定可能パラメーターレベルを測定することによって評価することができる。このようなパラメーターのいずれか1つ、又はパラメーターの任意の組み合わせを測定することによって、治療又は予防の有効性をモニターすることは、十分に当業者の能力の範囲内である。例えば、NAFLDの治療の有効性は、例えば、NAFLD症状、肝臓脂肪レベル、又は下流遺伝子の発現の定期的なモニタリングによって評価され得る。最初の読み取りと後の読み取りの比較は、治療が有効かどうかの指標を医師に提供する。このようなパラメーターのいずれか1つ、又はパラメーターの任意の組み合わせを測定することによって、治療又は予防の有効性をモニターすることは、十分に当業者の能力の範囲内である。PNPLA3を標的化するRNAi又はその医薬組成物の投与と関連して、PNPLA3関連疾患「に対して有効」とは、臨床的に適切な様式での投与が、少なくとも統計学的に有意な割合の患者に、症状の改善、治癒、疾患の低減、延命、生活の質の改善、又はNAFLD及び/若しくはPNPLA3関連疾患並びに関連原因の治療に精通している医者によって、好ましいと一般に認められている他の効果などの有益な効果をもたらすことを示す。
病状の1つ以上のパラメーターにおいて統計的に有意な改善がある場合、又はそうでない場合に予期されるであろう症状悪化又は発症の欠如によって、治療又は予防効果は明らかである。一例として、疾患の測定可能なパラメーターの少なくとも10%の、好ましくは少なくとも20%、30%、40%、50%以上の好ましい変化は、有効な治療を意味し得る。所与のRNAi薬物又はその薬物の製剤の有効性はまた、当技術分野で知られる所与の疾患のための実験動物モデルを使用して判定され得る。実験動物モデルを使用する場合、治療の有効性は、マーカー又は症状の統計的に有意な低減が観察される場合に証明される。
対象には、約0.01mg/kg、0.02mg/kg、0.03mg/kg、0.04mg/kg、0.05mg/kg、0.1mg/kg、0.15mg/kg、0.2mg/kg、0.25mg/kg、0.3mg/kg、0.35mg/kg、0.4mg/kg、0.45mg/kg、0.5mg/kg、0.55mg/kg、0.6mg/kg、0.65mg/kg、0.7mg/kg、0.75mg/kg、0.8mg/kg、0.85mg/kg、0.9mg/kg、0.95mg/kg、1.0mg/kg、1.1mg/kg、1.2mg/kg、1.3mg/kg、1.4mg/kg、1.5mg/kg、1.6mg/kg、1.7mg/kg、1.8mg/kg、1.9mg/kg、2.0mg/kg、2.1mg/kg、2.2mg/kg、2.3mg/kg、2.4mg/kg、2.5mg/kg dsRNA、2.6mg/kg dsRNA、2.7mg/kg dsRNA、2.8mg/kg dsRNA、2.9mg/kg dsRNA、3.0mg/kg dsRNA、3.1mg/kg dsRNA、3.2mg/kg dsRNA、3.3mg/kg dsRNA、3.4mg/kg dsRNA、3.5mg/kg dsRNA、3.6mg/kg dsRNA、3.7mg/kg dsRNA、3.8mg/kg dsRNA、3.9mg/kg dsRNA、4.0mg/kg dsRNA、4.1mg/kg dsRNA、4.2mg/kg dsRNA、4.3mg/kg dsRNA、4.4mg/kg dsRNA、4.5mg/kg dsRNA、4.6mg/kg dsRNA、4.7mg/kg dsRNA、4.8mg/kg dsRNA、4.9mg/kg dsRNA、5.0mg/kg dsRNA、5.1mg/kg dsRNA、5.2mg/kg dsRNA、5.3mg/kg dsRNA、5.4mg/kg dsRNA、5.5mg/kg dsRNA、5.6mg/kg dsRNA、5.7mg/kg dsRNA、5.8mg/kg dsRNA、5.9mg/kg dsRNA、6.0mg/kg dsRNA、6.1mg/kg dsRNA、6.2mg/kg dsRNA、6.3mg/kg dsRNA、6.4mg/kg dsRNA、6.5mg/kg dsRNA、6.6mg/kg dsRNA、6.7mg/kg dsRNA、6.8mg/kg dsRNA、6.9mg/kg dsRNA、7.0mg/kg dsRNA、7.1mg/kg dsRNA、7.2mg/kg dsRNA、7.3mg/kg dsRNA、7.4mg/kg dsRNA、7.5mg/kg dsRNA、7.6mg/kg dsRNA、7.7mg/kg dsRNA、7.8mg/kg dsRNA、7.9mg/kg dsRNA、8.0mg/kg dsRNA、8.1mg/kg dsRNA、8.2mg/kg dsRNA、8.3mg/kg dsRNA、8.4mg/kg dsRNA、8.5mg/kg dsRNA、8.6mg/kg dsRNA、8.7mg/kg dsRNA、8.8mg/kg dsRNA、8.9mg/kg dsRNA、9.0mg/kg dsRNA、9.1mg/kg dsRNA、9.2mg/kg dsRNA、9.3mg/kg dsRNA、9.4mg/kg dsRNA、9.5mg/kg dsRNA、9.6mg/kg dsRNA、9.7mg/kg dsRNA、9.8mg/kg dsRNA、9.9mg/kg dsRNA、9.0mg/kg dsRNA、10mg/kg dsRNA、15mg/kg dsRNA、20mg/kg dsRNA、25mg/kg dsRNA、30mg/kg dsRNA、35mg/kg dsRNA、40mg/kg dsRNA、45mg/kg dsRNA、又は約50mg/kg dsRNAなどの、治療量のRNAiが投与され得る。一実施形態では、対象には、0.5mg/kgのdsRNAが投与され得る。列挙された値の中間の値及び範囲もまた、本発明の一部であることが意図される。
RNAiの投与は、例えば、患者の細胞、組織、血液、尿又は他のコンパートメント中において、PNPLA3タンパク質レベルの存在を少なくとも約5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は少なくとも約99%以上低減し得る。
RNAiの総用量の投与前に、5%の注入液などのより少ない用量を患者に投与し、アレルギー反応などの有害作用についてモニターしてもよい。別の実施例では、患者は、サイトカイン(例えば、TNF-アルファ又はINF-アルファ)レベルの上昇などの望まれない免疫賦活性効果についてモニターされ得る。
PNPLA3発現に対する阻害効果によって、本発明による組成物又はそれから調製される医薬組成物は、生活の質を高めることができる。
本発明のRNAiは、「裸の」形態で投与されてもよく、この場合、修飾又は未修飾RNAi薬剤は、「遊離RNAi」として、水性又は好適な緩衝溶媒中に直接的に懸濁される。遊離RNAiは、医薬組成物の非存在下で投与される。遊離RNAiは、好適な緩衝溶液中にあってもよい。緩衝溶液は、酢酸塩、クエン酸塩、プロラミン、炭酸塩、若しくはリン酸塩、又はそれらの任意の組み合わせを含んでもよい。一実施形態では、緩衝溶液は、リン酸緩衝食塩水(PBS)である。RNAiを含有する緩衝溶液のpH及び重量オスモル濃度は、対象への投与に好適であるように調節され得る。
或いは、本発明のRNAiは、dsRNAリポソーム製剤などの医薬組成物として投与され得る。
PNPLA3遺伝子発現の低減及び/又は阻害から利益を受けるとこになる対象は、本明細書に記載されるとおりの非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)及び/又はPNPLA3関連疾患若しくは障害を有するものである。
PNPLA3遺伝子発現の低減及び/又は阻害から利益を受けることになる対象の治療は、治療的及び予防的治療を含む。
本発明はさらに、例えば、これらの障害を治療するために現在利用されているものなどの、例えば既知の医薬品及び/又は既知の治療法などと他の医薬品及び/又は他の治療法を組み合わせて、PNPLA3遺伝子発現の低減及び/又は阻害から利益を受けることになる対象、例えば、PNPLA3関連疾患を有する対象を治療するための方法、並びにRNAi薬剤又はその医薬組成物の使用を提供する。
例えば、ある種の実施形態では、PNPLA3遺伝子を標的化するRNAiは、本明細書の他の箇所で記載されるとおりの、例えば、PNPLA3関連疾患を治療するのに有用な薬剤と組み合わせて投与される。例えば、PNPLA3発現の低減から利益を受けることになる対象、例えば、PNPLA3関連疾患を有する対象を治療するのに好適な追加の治療薬及び治療法としては、PNPLA3遺伝子の異なる部分を標的化するRNAi薬剤、PNPLA3関連疾患を治療するための治療剤、及び/若しくは処置、又は前述のいずれかの組み合わせが挙げられる。
ある種の実施形態では、PNPLA3遺伝子を標的化する第1のRNAi薬剤は、PNPLA3遺伝子の異なる部分を標的化する第2のRNAi薬剤と組み合わせて投与される。例えば、第1のRNAi薬剤は、二重鎖領域を形成する第1のセンス鎖及び第1のアンチセンス鎖を含み、ここで、前記第1のセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全て及び第1のアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが、修飾ヌクレオチドであり、前記第1のセンス鎖は、3’末端で結合したリガンドにコンジュゲートされ、このリガンドは、二価又は三価の分岐状リンカーを介して結合された1つ以上のGalNAc誘導体であり;且つ第2のRNAi薬剤は、二重鎖領域を形成する第2のセンス鎖及び第2のアンチセンス鎖を含み、ここで、第2のセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全て及び第2のアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全ては、修飾ヌクレオチドであり、第2のセンス鎖は、3’末端で結合したリガンドにコンジュゲートされ、このリガンドは、二価又は三価の分岐状リンカーを介して結合された1つ以上のGalNAc誘導体である。
一実施形態では、第1及び第2のセンス鎖のヌクレオチドの全て並びに/又は第1及び第2のアンチセンス鎖のヌクレオチドの全ては、修飾を含む。
一実施形態では、少なくとも1つの修飾ヌクレオチドは、3’-末端デオキシ-チミン(dT)ヌクレオチド、2’-O-メチル修飾ヌクレオチド、2’-フルオロ修飾ヌクレオチド、2’-デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、アンロックドヌクレオチド、立体配座が制限されたヌクレオチド、拘束エチルヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、2’-アミノ修飾ヌクレオチド、2’-O-アリル修飾ヌクレオチド、2’-C-アルキル修飾ヌクレオチド、2’-ヒドロキシ修飾ヌクレオチド、2’-メトキシエチル修飾ヌクレオチド、2’-O-アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミダート、非天然塩基を含むヌクレオチド、テトラヒドロピラン修飾ヌクレオチド、1,5-アンヒドロヘキシトール修飾ヌクレオチド、シクロヘキセニル修飾ヌクレオチド、ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、メチルホンスホン酸基を含むヌクレオチド、5’-リン酸塩を含むヌクレオチド、及び5’-リン酸塩模倣体を含むヌクレオチドからなる群から選択される。
ある種の実施形態では、PNPLA3遺伝子を標的化する第1のRNAi薬剤は、PNPLA3遺伝子とは異なる遺伝子を標的化する第2のRNAi薬剤と組み合わせて投与される。例えば、PNPLA3遺伝子を標的化するRNAi薬剤は、SCAP遺伝子を標的化するRNAi薬剤と組み合わせて投与され得る。PNPLA3遺伝子を標的化する第1のRNAi薬剤及びPNPLA3遺伝子とは異なる遺伝子、例えば、SCAP遺伝子を標的化する第2のRNAi薬剤は、同じ医薬組成物の一部として投与され得る。或いは、PNPLA3遺伝子を標的化する第1のRNAi薬剤及びPNPLA3遺伝子とは異なる遺伝子、例えば、SCAP遺伝子を標的化する第2のRNAi薬剤は、異なる医薬組成物の一部として投与され得る。
RNAi薬剤及び追加の治療剤並びに/又は治療は、同時に且つ/又は同じ配合において、例えば、非経口的に投与されてもよいし、或いは追加の治療剤が、別々の組成物の一部として若しくは別々に、且つ/又は当技術分野で知られるか若しくは本明細書に記載される別の方法により投与されてもよい。
本発明はまた、細胞内のPNPLA3発現を低減及び/又は阻害するために、本発明のRNAi薬剤及び/又は本発明のRNAi薬剤を含有する組成物を使用する方法も提供する。他の態様では、本発明は、細胞内のPNPLA3遺伝子発現を低減及び/又は阻害するのに使用するための、本発明のRNAi及び/又は本発明のRNAiを含む組成物を提供する。さらに他の態様では、細胞内のPNPLA3遺伝子発現を低減及び/又は阻害する医薬の製造のための、本発明のRNAi及び/又は本発明のRNAiを含む組成物の使用が提供される。さらに他の態様では、本発明は、細胞内のPNPLA3タンパク質産生を低減及び/又は阻害するのに使用するための、本発明のRNAi及び/又は本発明のRNAiを含む組成物を提供する。さらに他の態様では、細胞内のPNPLA3タンパク質産生を低減及び/又は阻害する医薬の製造のための、本発明のRNAi及び/又は本発明のRNAiを含む組成物の使用が提供される。本方法及び使用は、細胞を本発明のRNAi、例えば、dsRNAと接触させ、PNPLA3遺伝子のmRNA転写物の分解を得るのに十分な時間にわたり細胞を維持し、それにより細胞内のPNPLA3遺伝子の発現を阻害するか又はPNPLA3タンパク質産生を阻害することを含む。
遺伝子発現の低減は、当技術分野で知られる任意の方法によって評価され得る。例えば、PNPLA3の発現の低減は、当業者にとって通例の方法、例えば、ノーザンブロッティング、qRT-PCRを使用して、PNPLA3のmRNA発現レベルを決定することにより、ウエスタンブロッティング、免疫学的手法、フローサイトメトリー法、ELISAなどの当業者にとって通例の方法を使用して、PNPLA3のタンパク質レベルを決定することにより、及び/又はPNPLA3の生物活性を決定することにより決定され得る。
本発明の方法及び使用において、細胞は、インビトロ又はインビボで接触されてもよく、すなわち、細胞は対象内にあってもよい。
本発明の方法を使用する治療に好適な細胞は、PNPLA3遺伝子を発現する任意の細胞、例えば、NAFLDを有する対象からの細胞、又はPNPLA3遺伝子若しくはPNPLA3遺伝子の部分を含む発現ベクターを含む細胞であり得る。本発明の方法及び使用で使用するのに好適な細胞は、哺乳動物細胞、例えば、霊長類細胞(ヒト細胞又は非ヒト霊長類細胞、例えば、サル細胞又はチンパンジー細胞など)、非霊長類細胞(ウシ細胞、ブタ細胞、ラクダ細胞、ラマ細胞、ウマ細胞、ヤギ細胞、ウサギ細胞、ヒツジ細胞、ハムスター、モルモット細胞、ネコ細胞、イヌ細胞、ラット細胞、マウス細胞、ライオン細胞、トラ細胞、クマ細胞、又はバッファロー細胞など)、鳥類細胞(例えば、アヒル細胞又はガチョウ細胞)、又はクジラ細胞であってもよい。一実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。
PNPLA3遺伝子発現は、細胞中において、少なくとも約5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は約100%阻害され得る。
PNPLA3タンパク質産生は、細胞中において、少なくとも約5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は約100%阻害され得る。
本発明のインビボでの方法及び使用は、RNAiを含有する組成物を対象に投与することを含んでもよく、RNAiは、治療されることになる哺乳動物のPNPLA3遺伝子のRNA転写物の少なくとも一部と相補的なヌクレオチド配列を含む。治療されることになる生物がヒトである場合、組成物は、皮下、静脈内、経口、腹腔内、又は頭蓋内(例えば、脳室内、実質内及び髄腔内)、筋肉内、経皮、気道(噴霧剤)、経鼻、直腸を含む非経口経路、並びに局所(頬側及び舌下を含む)投与を含むが、これらに限定されない、当技術分野で知られる任意の手段によって投与され得る。ある種の実施形態では、組成物は、皮下又は静脈内注入若しくは注射によって投与される。一実施形態では、組成物は、皮下注射によって投与される。
いくつかの実施形態では、投与は、デポ注射を介する。デポ注射は、長期間にわたり一貫してRNAiを放出し得る。したがって、デポ注射は、所望の効果、例えば、所望のPNPLA3の阻害、又は治療効果若しくは予防効果を得るのに必要な投与頻度を減少させ得る。デポ注射はまた、より一貫した血清濃度を提供し得る。デポ注射は、皮下注射又は筋肉内注射を含み得る。好ましい実施形態では、デポ注射は皮下注射である。
いくつかの実施形態では、投与は、ポンプを介する。ポンプは、外部ポンプ又は外科的に植え込まれたポンプであってもよい。ある種の実施形態では、ポンプは、皮下に植え込まれた浸透圧ポンプである。他の実施形態では、ポンプは、注入ポンプである。注入ポンプは、静脈内、皮下、動脈、又は硬膜外注入のために使用してもよい。好ましい実施形態では、注入ポンプは、皮下注入ポンプである。他の実施形態では、ポンプは、RNAiを対象に送達する外科的に植え込まれたポンプである。
投与様式は、局所性又は全身性の治療が所望されるかどうかに基づいて、及び治療されることになる領域に基づいて選択され得る。投与経路及び部位は、標的化を向上させるように選択され得る。
一態様では、本発明はまた、例えば、ヒトなどの哺乳動物中においてPNPLA3遺伝子の発現を阻害するための方法も提供する。本発明はまた、哺乳動物中でPNPLA3遺伝子の発現を阻害するのに使用するためのRNAi、例えば、哺乳動物の細胞内でPNPLA3遺伝子を標的化するdsRNAを含む組成物を提供する。別の態様では、本発明は、哺乳動物中でPNPLA3遺伝子の発現を阻害する医薬の製造における、RNAi、例えば、哺乳動物の細胞内でPNPLA3遺伝子を標的化するdsRNAの使用を提供する。
方法及び使用は、RNAi、例えば、哺乳動物の細胞内でPNPLA3遺伝子を標的化するdsRNAを含む組成物を、哺乳動物、例えば、ヒトに投与すること、及びPNPLA3遺伝子のmRNA転写物の分解を得るのに十分な時間にわたり哺乳動物を維持し、それにより哺乳動物内のPNPLA3遺伝子の発現を阻害することを含む。
遺伝子発現の低減は、当技術分野で知られる任意の方法、例えば、本明細書で記載されるqRT-PCRによって、RNAi投与対象の末梢血試料中で評価され得る。タンパク質産生の低減は、当技術分野で知られる任意の方法及び方法、例えば、本明細書に記載されるELISA又はウエスタンブロッティングによって評価され得る。一実施形態では、組織試料は、PNPLA3遺伝子及び/又はタンパク質発現の低減をモニターするための組織材料としての役割を果たす。別の実施形態では、血液試料は、PNPLA3遺伝子及び/又はタンパク質発現の低減をモニターするための組織材料としての役割を果たす。
一実施形態では、RNAi薬剤の投与後のインビボでの標的のRISC媒介性切断の検証は、5’-RACE又は当技術分野で知られるプロトコルの改変(Lasham A et al.,(2010)Nucleic Acid Res.,38(3)p-e19)(Zimmermann et al.(2006)Nature 441:111-4)を実施することによって行われる。
本明細書に開示される全てのリボ核酸配列は、配列中のウラシル塩基をチミン塩基で置換することにより、デオキシリボ核酸配列に変換することができることが理解される。同様に、本明細書に開示される全てのデオキシリボ核酸配列は、配列中のチミン塩基をウラシル塩基で置換することにより、リボ核酸配列に変換することができる。デオキシリボ核酸配列、リボ核酸配列、並びに本明細書に開示される全ての配列のデオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドの混合物を含有する配列が本発明に含まれる。
加えて、本明細書に開示される任意の核酸配列は、化学修飾の任意の組み合わせによって修飾され得る。当業者は、特定の場合、修飾ポリヌクレオチドを記載するための「RNA」又は「DNA」のこのような指定が任意であることを容易に理解するであろう。例えば、リボース糖の2’-OH置換基及びチミン塩基を有するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは、修飾糖を有するDNA分子(DNAの天然の2’-Hについて2’-OH)又は修飾塩基を有するRNA分子(RNAの天然のウラシルについてチミン(メチル化ウラシル))と記載され得る。
したがって、配列表のものを含むがこれらに限定されない本明細書に提供される核酸配列は、修飾核酸塩基を有するそのような核酸を含むが、これらに限定されない天然若しくは修飾RNA及び/又はDNAの任意の組み合わせを含有する核酸を包含するように意図される。さらなる例として、限定するものではなく、配列「ATCGATCG」を有するポリヌクレオチドは、修飾又は非修飾にかかわらず、RNA塩基、例えば配列「AUCGAUCG」を有するもの、並びに「AUCGATCG」などのいくつかのDNA塩基及びRNA塩基を有するもの、並びに「ATmeCGAUCG」などの他の修飾塩基を有するポリヌクレオチドを含むそのような化合物を含むが、これらに限定されないそのような配列を有する任意のポリヌクレオチドを包含し、配列中、meCは、5位にメチル基を含むシトシン塩基を示す。
実施された実験及び達成された結果を含む以下の実施例は、例示の目的のみのために提供されるものであり、添付の特許請求の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
参照による組み込み
本明細書において言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、各々の個々の刊行物、特許、又は特許出願が具体的且つ個別に参照により組み込まれることが示された場合と同程度に参照により本明細書に組み込まれる。しかしながら、本明細書における参考文献の引用は、そのような参考文献が本発明の先行技術であることを認めるものとして解釈されるべきではない。参照により組み込まれる参考文献において提供される定義又は用語が、本明細書において提供される用語及び考察と異なる限り、本用語及び定義が優先される。
均等物
前述の本明細書は、当業者が本発明を実施するのに十分であると考えられる。前述の説明及び実施例は、本発明の特定の好ましい実施形態を詳細に説明し、本発明者らによって考えられた最良の形態を記載するものである。しかし、前述の内容がいかに詳細に記載されていたとしても、本発明は、多くの方法で実施されてもよく、添付の特許請求の範囲及びその均等物に従って本発明が解釈されるべきであることが理解されるであろう。
実施された実験及び達成された結果を含む以下の実施例は、例示の目的のみのために提供されるものであり、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
実施例1:修飾PNPLA3 siRNA分子の選択、設計及び合成
パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有3(PNPLA3)を標的化する治療用siRNA分子のための最適な配列の同定及び選択は、ヒトPNPLA3転写物(NM_025225.2)のバイオインフォマティクス分析を使用して確認された。表1は、治療特性を有すると同定された配列を示す。様々な配列全体にわたって、{INVAB}は反転脱塩基であり、{INVDA}は反転デオキシチミジンであり、GNAはグリコール核酸であり、dTはデオキシチミジンであり、dCはデオキシシトシンである。
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PNPLA3 siRNA配列の効力及びインビボ安定性を向上させるために、化学修飾をPNPLA3 siRNA分子に組み込んだ。具体的には、リボース糖の2’-O-メチル及び2’-フルオロ修飾をPNPLA3 siRNA内の特定の位置に組み込んだ。ホスホロチオエートヌクレオチド間結合もアンチセンス配列及び/又はセンス配列の末端に組み込んだ。下の表2は、修飾PNPLA3 siRNAの各々のセンス配列及びアンチセンス配列における修飾を示す。表Xのヌクレオチド配列は、以下の表記法に従って列記される。A、U、G、及びC=対応するリボヌクレオチド;dT=デオキシチミジン;a、u、g、及びc=対応する2’-O-メチルリボヌクレオチド;Af、Uf、Gf、及びCf=対応する2’-デオキシ-2’-フルオロ(「2’-フルオロ」)リボヌクレオチドである。配列中の「s」の挿入は、2つの隣接するヌクレオチドがホスホロチオジエステル基(例えば、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合)によって結合されることを示す。特に指示がない限り、全ての他のヌクレオチドは、3’-5’ホスホジエステル基によって結合される。表2のsiRNA化合物の各々は、両方の鎖の3’末端に2ヌクレオチドのオーバーハング又は一方若しくは両方の末端に平滑末端を有する19塩基対の二重鎖領域を含む。GalNAc3K2AhxC6は、
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である。
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実施例2:RNA FISHアッセイにおける選択したPNPLA3 siRNA分子の有効性
PNPLA3におけるrs738409及び/又はrs738408 SNPに及ぶsiRNAを含む一連の十分に化学修飾されたsiRNAが調製され、インビトロでmRNAノックダウンの効力及び選択性に関して試験された。各siRNA二重鎖は、2つの鎖であるセンス鎖又は「パッセンジャー」鎖及びアンチセンス鎖又は「ガイド」鎖からなった。鎖は21又は23ヌクレオチド長であり、19の相補的塩基対を有する。いくつかの場合において、2塩基対の3’オーバーハングがある。siRNAは、各ヌクレオチドのリボースにおける天然の2’-OHの2’-OMe又は2’-F基のいずれかによる置換により調製された。任意選択により、一方又は両方の鎖でのホスホジエステルヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエートで置き換えられて、エキソヌクレアーゼによる分解が低減された。
PNPLA3発現を低減する際のsiRNA分子の各々の有効性を、384ウェル形式のインビトロsiRNAトランスフェクションアッセイ、それに続くリボ核酸分子を標的化する蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(RNA FISH)アッセイを使用して評価して、IC50及び最大活性値を決定した。このアッセイは、ヒトPNPLA3 I148Iを発現するヒト肝細胞癌細胞株Hep3B細胞(ATCC HB-8064)及びチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞上で実施された。ヒト肝細胞癌HepB3は、10%ウシ胎仔血清及び1%抗生物質/抗真菌剤を補充したEMEM培地(ATCC 30-2003)中において37℃及び5%CO2で維持された。ヒトPNPLA3 I148Iを発現するCHO細胞は、50%CD-CHO(Life Technologies)、50%Ex-Cell CHO5培地(Sigma)、8mM L-グルタミン、1xHT、1%抗生物質/抗真菌剤、及び10μg/mLピューロマイシンを含有する培地中において37℃及び5%CO2で維持された。
Hep3B細胞アッセイのために、EMEM培地(ATCC 30-2003)中のsiRNA分子及びリポフェクタミンRNAiMaxトランスフェクション試薬(Life Technologies)のトランスフェクション複合体を、製造業者の推奨に従って384ウェルプレート(PerkinElmer)においてウェル当たり10μgで調製した。CHOヒト細胞アッセイのために、F12K培地(Mediatech)中のsiRNA分子及びリポフェクタミンRNAiMaxトランスフェクション試薬のトランスフェクション複合体を、製造業者の推奨に従って384ウェルプレートにおいてウェル当たり10μgで調製した。細胞を抗生物質/抗真菌剤を含まない培地において67,000細胞/mlに希釈し、30μlを各ウェルに加え、40μl培地中の2000細胞/ウェルの最終密度にした。室温での20分間のインキュベーションの後、プレートを37℃及び5%CO2のインキュベーターに移した。Hep3B細胞トランスフェクションアッセイを72時間インキュベートし、CHOヒトPNPLA3 I148Iトランスフェクションアッセイを48時間インキュベートした。
収集時、細胞を8%ホルムアルデヒド固定液(Thermo Scientific)中において室温で15分間固定した。次に、プレートを、連続的な50%、70%、及び100%のエタノール洗浄による脱水に付した。次に、プレートを密閉し、-20℃で保存した。
RNA FISHアッセイは、Affymetrix QuantiGene(登録商標)View RNA HCスクリーニングアッセイキット(QVP0011)、Affymetrix View HCシグナル増幅キット3-プレックス(QVP0213)、及びAffymetrix遺伝子特異的プローブ:PNPLA3 Human 0.33mL View RNA Type 6(650ラベル)VA6-20279-01及びPPIB Human 0.44mL View RNA Type 1(488ラベル)VA1-10148-01を使用して実施された。
最初に、プレートを連続的な100%、70%、及び50%エタノール洗浄により再水和した。次に、細胞をPBSで洗浄し、続いてキットの指示書に従って透過処理し、プロテアーゼ消化した。目的のWorking Probe Setを、製造業者のプロトコルに従って調製し、ウェルに加え、40℃で3時間インキュベートした。製造業者のプロトコルは、Working Probe Set、Working PreAmp、Working Amp、及びWorking LPによる連続的なハイブリダイゼーションのために採用された。最後に、核対比染色が適用された(Hoechst 33342及びCell Mask Blue;Molecular Probes)。プレートを室温で30分間インキュベートし、PBSで洗浄し、80μlのPBSで重層し、続いてプレートをイメージングのために密閉した。
全てのプレートが、Hoechst 33342及びCell Mask Blueに関してはUVチャネル、Type1プローブに関しては488チャネル、並びにType6プローブに関しては647チャネルを使用して、Opera Phenixハイコンテントスクリーニングシステム(PerkinElmer)上で画像化された。
RNA FISHデータはColumbusソフトウェアを使用して分析され、画像はGenedata Screenerを使用して生成された。PNPLA3 I148IでトランスフェクトされたCHOに関するアッセイの結果は、表3において示される。PNPLA3 I148MでトランスフェクトされたCHOに関するアッセイの結果は、表4において示される。PNPLA3ノックダウンは、対照と比較したノックダウンのパーセンテージを提供する。負の値は、PNPLA3レベルの低減を示す。
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RNA FISHもまた、二重変異体PNPLA3-rs738408-rs738409を含有する肝細胞株、及び対照野生型細胞株、Hep3Bに対して行われた。Hep3B及びHepG2細胞(ATCCから購入された)は、10%ウシ胎仔血清(FBS、Sigma)及び1%ペニシリン-ストレプトマイシン(P-S、Corning)を補充した最小必須培地(Hep3Bに関してはCorningからのMEM及びHepG2に関してはATCCからのEMEM)中で培養された。siRNAトランスフェクションは次のとおりに実施された:1μLの試験siRNA及び細胞株に応じて4μLの単純MEM又はEMEMを、BioMek FX(Beckman Coulter)によって、PDLでコーティングされたCellCarrier-384 Ultraアッセイプレート(PerkinElmer)に加えた。次に、単純MEM又はEMEM(具体的には、Hep3Bに関しては5μL中0.035μLのRNAiMAX及びHepG2に関しては5μLのEMEM中の0.06μLのRNAiMAX)中で予め希釈された5μLのリポフェクタミンRNAiMAX(Thermo Fisher Scientific)を、Multidrop Combi試薬ディスペンサー(Thermo Fisher Scientific)によってアッセイプレートに分注した。室温(RT)でのsiRNA/RNAiMAX混合物の20分のインキュベーションの後、10%FBS及び1%P-Sを補充したMEM又はEMEM中の30μLのHep3B又はHepG2細胞(ウェル当たり2000細胞)のいずれかを、Multidrop Combi試薬ディスペンサーを使用してトランスフェクション複合体に加えた。アッセイプレートを、インキュベーターに置く前にRTで20分間インキュベートした。次に、細胞を37℃及び5%のCO2で72時間インキュベートした。ViewRNA ISH細胞アッセイを、リキッドハンドリングのための内製の自動FISHアッセイプラットフォームを使用して製造業者のプロトコル(Thermo Fisher Scientific)に従って実施した。手短に言えば、細胞を4%ホルムアルデヒド(Thermo Fisher Scientific)中においてRTで15分間固定し、界面活性剤によりRTで3分間透過処理し、続いてプロテアーゼ溶液によりRTで10分間処理した。標的特異的プローブペア(Thermo Fisher Scientific)のインキュベーションが3時間行われたが、Preamplifier、Amplifier及びLabel Probe(Thermo Fisher Scientific)に関してはそれぞれ1時間であった。全てのハイブリダイゼーション工程は、Cytomat 2 C-LIN自動インキュベーター(Thermo Fisher Scientific)において40℃で行われた。ハイブリダイゼーション反応の後、細胞をHoechst及びCellMask Blue(Thermo Fisher Scientific)で30分間染色し、続いてOpera Phenix(PerkinElmer)上で画像化した。画像を、Columbusイメージデータ保存・解析システム(PerkinElmer)を使用して分析して、細胞当たりの平均スポットカウントを得た。スポットカウントは、高用量(リン酸緩衝生理食塩水を含有する、Corning)及び低用量(目的のプローブペアを含まない)の対照ウェルを使用して正規化された。総siRNA濃度に対して正規化された値をプロットし、データをGenedata Screener(Genedata)において4パラメーターのシグモイドモデルに当てはめて、IC50及び最大活性を得た。HepG2細胞に関するアッセイの結果は表5に示され、Hep3B細胞に関するアッセイの結果は表6に示される。PNPLA3ノックダウンは、対照と比較したノックダウンのパーセンテージを提供する。負の値は、PNPLA3レベルの低減を示す。二重鎖が2回以上行われた場合において、平均IC50が標準偏差とともに示される。
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実施例3:PNPLA3-rs738409及びPNPLA3-rs738409-rs738408に関するsiRNAのドロップレットデジタルPCRアッセイ
製造業者のプロトコルに従って、ヒト初代肝細胞(Xenotech/Sekisui ドナーロット#HC3-38)をOptiThaw培地(Xenotech cat#K8000)中に解凍し、細胞を遠心分離し、培地吸引後、OptiPlate肝細胞培地(Xenotech cat#K8200)に再懸濁し、96ウェルのコラーゲンコーティングプレート(Greiner cat#655950)に蒔いた。2~4時間のインキュベーション期間の後、培地を除去し、OptiCulture肝細胞培地(Xenotech cat#K8300)で置き換えた。OptiCulture培地の添加の2~4時間後、GalNAcコンジュゲートsiRNAを自由取り込み(トランスフェクション試薬なし)によって細胞に送達した。細胞を37℃及び5%のCO2で24~72時間インキュベートした。続いて、1%2-メルカプトエタノール(Sigma、M-3148)を加えたQiagenのRLT緩衝液(79216)で細胞を溶解し、溶解物を-20℃で保存した。QiagenのQIACube HT機器(9001793)及びQiagenのRNeasy 96 QIACube HTキット(74171)を使用して、製造業者の指示書に従ってRNAを精製した。試料は、QIAxpertシステム(9002340)を使用して分析された。Applied BiosystemsのHigh Capacity cDNA逆転写キット(4368813)を使用してRNA試料からcDNAを合成し、反応を製造業者の指示書に従って組み立て、投入するRNA濃度は、試料によって変動した。逆転写は、BioRadの4つ組のサーマルサイクラー(モデル番号PTC-0240G)上において以下の条件で実行した:25℃で10分、37℃で120分、85℃で5分、その後(任意選択)4℃で保持し続ける。
ドロップレットデジタルPCR(ddPCR)を、製造業者の指示書に従ってBioRadのQX200 AutoDGドロップレットデジタルPCRシステムを使用して実施した。BioRadのプローブ用ddPCRスーパーミックス(1863010)、並びにPNPLA3のための蛍光標識されたqPCRアッセイ(IDT Hs.PT.58.21464637、プライマー対プローブ比3.6:1及びTBP(IDT Hs.PT.53a.20105486、プライマー対プローブ比3.6:1)、並びにRNaseフリー水(Ambion、AM9937)を使用して、反応をEppendorfのクリア96ウェルPCRプレート(951020303)に組み立てた。プライマー/プローブの最終濃度は、それぞれ900nM/250nMであり、投入するcDNA濃度は、ウェル間で変動した。ドロップレットは、製造業者によって推奨される消耗品(BioRadのDG32カートリッジ1864108、BioRadのチップ864121、Eppendorfの青色96ウェルPCRプレート951020362、BioRadのプローブ用ドロップレット生成オイル1864110及びBioRadのドロップレットプレート組立品)とともに設置されたBioRad Auto DGドロップレット生成器(1864101)を使用して形成された。ドロップレットは、BioRadのC1000 touchサーマルサイクラー(1851197)上で次の条件を用いて増幅した:酵素活性化95℃で10分、変性94℃で30秒、その後60℃で1分間のアニーリング/エクステンション、2℃/秒のランプ速度を用いる40サイクル、酵素活性解除98℃で10分、その後(任意選択)4℃で保持し続ける。続いて、PNPLA3又はTBP濃度に相関するFAM/HEXシグナルを測定するBioRadのQX200ドロップレットリーダー上で試料を読み取った。データを、BioRadのQuantaSoftソフトウェアパッケージを使用して分析した。試料をチャネル(蛍光標識)によってゲート制御して、1試料当たりの濃度を決定する。続いて、各試料を、異なる試料負荷量に関して、対照に対する目的の遺伝子(PNPLA3)の濃度/ハウスキーピング遺伝子(TBP)の濃度の比として表す。続いて、データをGenedata Screenerにインポートし、ここで、各試験siRNAを中立対照ウェル(緩衝液のみ)の中央値に正規化する。IC50値は表7において報告される。
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実施例4:ヒト化マウスモデルにおける選択したPNPLA3 siRNA分子の有効性スクリーニング
リン酸緩衝生理食塩水(Thermo Fisher Scientific、14190-136)中で動物当たり4e11から1e12個のウイルス粒子まで希釈されたアデノ随伴ウイルス(AAV;血清型AAV8又はAAV7;エンドトキシンフリー、Amgenによる内製)を、C57BL/6NCrl雄マウス(Charles River Laboratories Inc.)の尾静脈に静脈内注射して、肝臓におけるヒトPNPLA3WT(PNPLA3-WT)、PNPLA3rs738409(PNPLA3-I148M)、又はPNPLA3rs738409-rs738408(PNPLA3-I148M DM)のいずれかの発現をドライブした。マウスは一般に10~12週齢であり、一群当たりn=4~6の動物が含まれた。スクリーニングのどのラウンドも、少なくとも2つの溶媒処理対照群:溶媒で処理されたAAV-空ベクター及びAAV-PNPLA3WT又はPNPLA3rs738409及びPNPLA3rs738409-rs738408を含んだ。全てのsiRNAが、AAV-PNPLA3WT、PNPLA3rs738409、及び/又はPNPLA3rs738409-rs738408に対して試験された。AAV注射の2週間後、マウスを、リン酸緩衝生理食塩水(Thermo Fisher Scientific、14190-136)中で希釈された単一用量のsiRNA D-2324(0.5mM)により動物の1キログラム当たり0.5、1.0、3.0又は5.0ミリグラムで皮下注射を介して処理した。siRNA注射後の8、15、22、28又は42日目に肝臓を動物から収集し、液体窒素中で急速凍結させ、QIACube HT機器(Qiagen、9001793)及びRNeasy 96 QIACube HTキット(Qiagen、74171)を使用して製造業者の指示書に従って精製RNAに関して処理した。試料は、QIAxpertシステム(Qiagen、9002340)を使用して分析された。RNAは、RQ1 RNase-フリーDNase(Promega、M6101)で処理され、TaqMan(商標)RNA-to-CT(商標)1-ステップキット(Applied Biosystems、4392653)を使用してリアルタイムqPCRのために調製された。リアルタイムqPCRは、QuantStudioリアルタイムPCR装置上で実施された。結果は、マウスGapdh(InvitrogenからのTaqMan(商標)アッセイ、それぞれhs00228747_m1及び4352932E)に正規化されたヒトPNPLA3の遺伝子発現を基準とし、溶媒処理対照動物と比較したヒトPNPLA3 mRNA発現の相対的ノックダウンとして示される。内在性マウスPnpla3発現が、比較のために決定された(Invitrogen、Mm00504420_m1)。
肝臓のトリグリセリド含量分析のために、動物に由来するおよそ0.05~0.1ミリグラムの凍結肝臓を、1ミリリットルのイソプロパノール中でホモジナイズした。氷上での1時間のインキュベーションの後、試料を微量遠心管中において10,000rpmで回転させ、上清を透明のディープウェル96ウェルプレートに移した。トリグリセリド含量は、比色分析Infinityトリグリセリド試薬(Thermo Fisher Scientific、TR22421)及びトリグリセリド標準(Pointe Scientific、T7531-STD)を使用して、製造業者の指示書に従って決定された。結果は、組織1ミリグラム当たりトリグリセリドのミリグラムとして示される。
本明細書に記載される全ての動物実験は、Amgenの動物実験委員会(IACUC)により承認され、Guide for the Care and Use of Laboratory Animals,8th Edition(National Research Council(U.S.)Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.の更新のための委員会、Institute for Laboratory Animal Research(U.S.)及びNational Academies Press(U.S.)(2011)Guide for the care and use of laboratory animals.8th Ed.,National Academies Press,Washington,D.C.に従って管理された。マウスは、空調された空間において22±2℃で12時間の光;12時間の暗やみの周期(0600~1800時間)により単独飼育された。動物は、別段の指示がない限り、適宜通常の固形飼料食餌(Envigo、2920X)及び自動給水システムによる水(逆浸透精製)の利用を有した。終了時に、血液が深麻酔下で心臓穿刺により回収され、その後Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care(AAALAC)ガイドラインに従って、二次的な物理的方法によって安楽死させられた。図1A~D。インビボでの用量依存的mRNAノックダウン及び機能上の耐久性の両方に関してスクリーニングされた5つのsiRNA分子の一例。ヒトPNPLA3rs738409-rs73840を発現するマウスは、静脈内AAV注射の2週間後にsiRNAで処理された。一群当たりN=6のマウス;平均及び平均値の標準誤差として表されるデータ。(A)siRNAは、1キログラムの体重当たり0.5、1.0、3.0、又は5.0ミリグラムでマウスの腹部に皮下注射された。siRNA処理の4週間後、マウスを屠殺し、肝臓を回収し、遺伝子発現分析に関して処理した。データは、溶媒処理対照群に対して設定された各群におけるヒトPNPLA3rs738409-rs738408の平均の相対的ノックダウンを表す。(B)同じ4週間の処理群に由来する肝臓もまた、機能上の有効性を入手するためにトリグリセリド含量に関して処理された。データは、処理された組織の1グラム当たりのトリグリセリドの平均のミリグラムを表す。(C)siRNAは、体重1キログラム当たり1.0及び3.0ミリグラムで並行コホートの動物の腹部に皮下注射された。マウスをsiRNA処理の6週間後に収集して、インビボでのsiRNA分子の耐久性を比較した。肝臓を回収し、遺伝子発現分析のために処理した。データは、溶媒処理対照群に対して設定された各群におけるヒトPNPLA3rs738409-rs738408の平均の相対的ノックダウンを表す。(D)同じ6週間の処理群に由来する肝臓もまた、経時的な機能上の有効性を入手するためにトリグリセリド含量に関して処理された。データは、処理された組織の1グラム当たりのトリグリセリドの平均のミリグラムを表す。
相対的ノックダウンに関するデータは表8~12に示され、これはそれぞれ8、15、22、28、及び42日目及び様々な用量での相対的ノックダウンを示している。PNPLA3ノックダウンは、PNPLA3レベルの低減を示す負の値を伴うパーセンテージである。
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実施例5:ヒト化PNPLA3rs738409-rs738408マウスモデルにおけるsiRNA分子によるNAFLDの予防及びレスキュー
NAFLD/NASHのための「アメリカ人のライフスタイルに誘導される肥満症」、又はALIOSマウスモデルは、トランス脂肪(脂肪の総量の45%)及び糖の高い食餌をマウスに供給することによって発症される(Tetri 2008)。これらの試験のために、8~10週齢のC57BL/6NCrl雄マウス(Charles River Laboratories Inc.)は、前述のとおりのAAV空ベクター又はAAV8-PNPLA3rs738409-rs738408を注射された。AAV注射時に、マウスは、収集されるまで通常の固形飼料食餌で維持されたか又は55%フルクトース及び45%グルコース(それぞれSigma、F0127及びG7021)で構成される飲料水を完全に含むALIOS食餌(Envigo、TD.06303)に対して置かれた。前述の実験において、PNPLA3rs738409-rs738408の過剰発現がこの文脈においてNAFLD表現型を促進し且つ悪化させることを確立した(データは示さず)。
AAV注射及び食餌の開始の2週間後、マウスを、リン酸緩衝生理食塩水(Thermo Fisher Scientific、4190-136)中で希釈された単一用量のsiRNA D-2324(0.5mM)により動物の1キログラム当たり5.0ミリグラムで又は溶媒対照で皮下注射を介して処理した。投与は収集まで2週間に1回繰り返された。収集時に、体重を回収し、その後イソフルラン麻酔下で心臓穿刺を介して血清を回収し、続いて肝臓重量を回収した。中葉を10%の中性緩衝ホルマリンにより固定し、続いてパラフィン処理し、包埋した。肝臓の残部は、前述のとおりの含量及び遺伝子発現分析のために急速凍結された。
急速凍結された肝臓組織を、前述のとおりのRNA及び遺伝子発現分析のために処理した。結果は、未加工のCt値及びマウスGapdhに正規化された指定の遺伝子の相対的なmRNA発現の両方として示される。(InvitrogenからのTaqMan(商標)アッセイ:ヒトPNPLA3、hs00228747_m1;マウスPnpla3、Mm00504420_m1;マウスGapdh、4352932E)。
ホルマリン固定組織は、製造業者の指示書に従ってヘモトキシリン及びエオシン染色(それぞれDako、CS70030-2、CS70130-2)のために処理された。脂肪症及び炎症に関するスコア化は、委員会認定の病理学者によって実施された。
血清分析は、TIMP1、NASH及びNASH関連線維症と関連するバイオマーカーを含んだ(Youssani 2011)。TIMP1 ELISA(R&D Systems、MTM100)は、製造業者の指示書に従って実施された。
図2A-G。NAFLD及びPNPLA3rs738409-rs738408の過剰発現と関連する表現型の発症を予防するPNPLA3rs738409-rs738408特異的siRNA分子D-2324の能力を評価するために、マウスは、AAV8空ベクター(EV)、又はAAV8-PNPLA3rs738409-rs738408、又は溶媒を受容し、通常の固形飼料食餌で維持されたか、又はALIOS食餌に移行された。AAV注射の2週間後、マウスを、隔週で6週間(合計で3回の注射ラウンド)siRNA又は溶媒で処理した。マウスは8週目の時点で収集された。結果は、群平均及び標準誤差、一群当たりN=8として示される。アスタリスクは、ダネット多重比較検定を利用する一方向ANOVAにより生成された、AAV8-PNPLA3rs738409-rs738408コホートに対する統計的有意性を表す。(A)収集時の肝臓重量(グラム)と体重(グラム)の比率。調整されたP値:AAVなし+溶媒群、****<0.0001、AAV-EV+溶媒、**=0.0018、AAV-PNPLA3rs738409-rs738408+siRNA、****<0.0001。(B)qPCRによる肝臓におけるヒトPNPLA3 mRNA発現及びサイレンシングの確認。(左)未加工のCt値及び(右)マウスGapdhに正規化された相対的な倍率のmRNA発現;ALIOS摂取PNPLA3rs738409-rs738408+溶媒及びPNPLA3rs738409-rs738408+siRNA群を比較する。(C)qPCRによる肝臓におけるマウスPnpla3 mRNA発現の分析は、内在性のPnpla3がAAV媒介性の過剰発現又はsiRNAサイレンシングによって有意に変化しないことを示す。(左)未加工のCt値及び(右)マウスGapdhに正規化された相対的な倍率のmRNA発現;固形飼料摂取AAVなしの群とALIOS摂取PNPLA3rs738409-rs738408+溶媒及びPNPLA3rs738409-rs738408+siRNA群を比較する。(D)肝臓組織1グラム当たりのトリグリセリドのミリグラムとして示される肝臓トリグリセリド含量。調整されたP値:AAVなし+溶媒群、****<0.0001、AAV-EV+溶媒、*=0.0393、AAV-PNPLA3rs738409-rs738408+siRNA、**=0.0063。(E)血清1ミリリットル当たりのピコグラムとして示される血清TIMP1。調整されたP値:AAVなし+溶媒群、****<0.0001、AAV-EV+溶媒、****<0.0001、AAV-PNPLA3rs738409-rs738408+siRNA、****<0.0001。(F)H&E染色に基づく脂肪症の組織学的徴候、正常な規制値内(0)、最小(1)、軽症(2)、中等症(3)、及び重症(4)としてスコア化される。調整されたP値:AAVなし+溶媒群、****<0.0001、AAV-EV+溶媒、有意性なし、AAV-PNPLA3rs738409-rs738408+siRNA、**=0.0012。(G)H&E染色に基づく炎症の組織学的徴候、正常な規制値内(0)、最小(1)、軽症(2)、中等症(3)、及び重症(4)としてスコア化される。調整されたP値:AAVなし+溶媒群、****<0.0001、AAV-EV+溶媒、****<0.0001、AAV-PNPLA3rs738409-rs738408+siRNA、****<0.0001。
図3A-G。疾患発症後のPNPLA3rs738409-rs738408媒介性疾患のさらなる進行を予防するPNPLA3rs738409-rs738408特異的siRNA分子の能力を評価するために、マウスは、AAV8空ベクター(EV)、又はAAV8-PNPLA3rs738409-rs738408、又は溶媒を受容し、通常の固形飼料食餌で維持されたか、又はALIOS食餌に移行された。AAV注射及び食餌変化の8週間後、マウスを、隔週で8週間(合計で4回の注射ラウンド)siRNA又は溶媒で処理した。マウスは16週目の時点で収集された。脂肪症において変化は観察されなかったが、siRNA処理が疾患誘導後に開始された場合、いくつかの他の疾患関連の評価項目は有意に低減した。結果は、平均及び標準誤差、一群当たりN=8として示される。アスタリスクは、ダネット多重比較検定を利用する一方向ANOVAにより生成された、AAV8-PNPLA3rs738409-rs738408コホートに対する統計的有意性を表す。(A)収集時の肝臓重量(グラム)と体重(グラム)の比率。調整されたP値:AAVなし+溶媒群、****<0.0001、AAV-EV+溶媒、有意性なし、AAV-PNPLA3rs738409-rs738408+siRNA、***=0.0006。(B)qPCRによる肝臓におけるヒトPNPLA3 mRNA発現及びサイレンシングの確認。(左)未加工のCt値及び(右)マウスGapdhに正規化された相対的な倍率のmRNA発現;ALIOS摂取PNPLA3rs738409-rs738408+溶媒及びPNPLA3rs738409-rs738408+siRNA群を比較する。(C)qPCRによる肝臓におけるマウスPnpla3 mRNA発現の分析は、内在性のPnpla3がAAV媒介性の過剰発現又はsiRNAサイレンシングによって有意に変化しないことを示す。(左)未加工のCt値及び(右)マウスGapdhに正規化された相対的な倍率のmRNA発現;固形飼料摂取AAVなしの群とALIOS摂取PNPLA3rs738409-rs738408+溶媒及びPNPLA3rs738409-rs738408+siRNA群を比較する。(D)肝臓組織1グラム当たりのトリグリセリドのミリグラムとして示される肝臓トリグリセリド含量。調整されたP値:AAV-EV+溶媒、有意性なし、AAV-PNPLA3rs738409-rs738408+siRNA、*=0.0403。(E)血清1ミリリットル当たりのピコグラムとして示される血清TIMP1。調整されたP値:AAVなし+溶媒群、****<0.0001、AAV-EV+溶媒、**=0.0027、AAV-PNPLA3rs738409-rs738408+siRNA、**=0.002。(F)H&E染色に基づく脂肪症の組織学的徴候、正常な規制値内(0)、最小(1)、軽症(2)、中等症(3)、及び重症(4)としてスコア化される。調整されたP値:AAVなし+溶媒群、****<0.0001、AAV-EV+溶媒、有意性なし、AAV-PNPLA3rs738409-rs738408+siRNA、有意性なし。(G)H&E染色に基づく炎症の組織学的徴候、正常な規制値内(0)、最小(1)、軽症(2)、中等症(3)、及び重症(4)としてスコア化される。調整されたP値:AAVなし+溶媒群、****<0.0001、AAV-EV+溶媒、有意性なし、AAV-PNPLA3rs738409-rs738408+siRNA、**=0.0068。
図4A-D。PNPLA3rs738409-rs738408の過剰発現に起因する疾患関連表現型をレスキューするPNPLA3rs738409-rs738408特異的siRNA分子の能力を評価するために、ALIOS摂取8週AAV8-PNPLA3rs738409-rs738408-溶媒処理マウス由来の肝臓及び血清を、ALIOS摂取16週溶媒-又はsiRNA処理AAV8-PNPLA3rs738409-rs738408マウス由来の肝臓及び血清と比較した。siRNA処理によりこの時点での脂肪症における変化は観察されなかったが、肝臓グリセリド、血清TIMP1、及び炎症は全て、8週目の溶媒対照と比較して16週目で統計的に低かった。結果は、平均及び標準誤差、一群当たりN=8として示される。アスタリスクは、ダネット多重比較検定を利用する一方向ANOVAにより生成された、8週AAV8-PNPLA3rs738409-rs738408溶媒処理コホートに対する統計的有意性を表す。(A)肝臓組織1グラム当たりのトリグリセリドのミリグラムとして示される肝臓トリグリセリド含量。調整されたP値:16週AAV-PNPLA3rs738409-rs738408+溶媒、有意性なし;16週AAV-PNPLA3rs738409-rs738408+siRNA、**=0.0011。(B)血清1ミリリットル当たりのピコグラムとして示される血清Timp1。調整されたP値:16週AAV-PNPLA3rs738409-rs738408+溶媒、有意性なし;16週AAV-PNPLA3rs738409-rs738408+siRNA、*=0.0134。(C)H&E染色に基づく脂肪症の組織学的徴候、正常な規制値内(0)、最小(1)、軽症(2)、中等症(3)、及び重症(4)としてスコア化される。調整されたP値:16週AAV-PNPLA3rs738409-rs738408+溶媒、有意性なし;16週AAV-PNPLA3rs738409-rs738408+siRNA、有意性なし。(D)H&E染色に基づく炎症の組織学的徴候、正常な規制値内(0)、最小(1)、軽症(2)、中等症(3)、及び重症(4)としてスコア化される。調整されたP値:16週AAV-PNPLA3rs738409-rs738408+溶媒、有意性なし;16週AAV-PNPLA3rs738409-rs738408+siRNA、*=0.0112。
実施例6:ヒト化PNPLA3rs738409-rs738408マウスモデルにおけるsiRNA分子による肝線維症の予防
Amylin Pharmaceuticals(Clapper 2013)により開発された「AMLN」食餌は、ALIOS食餌の改変バージョンである。飼料は、コレステロール(2%)の10倍増加及び追加のスクロースを含む。「AMLN」食餌に置かれたマウスは、20~30週後に軽症~中等症の線維症を発症する(Clapper、Mells and Kristiansen papers)。この試験のために、8~10週齢のC57BL/6NCrl雄マウス(Charles River Laboratories Inc.)は、上記のとおりのAAV空ベクター又はAAV-PNPLA3rs738409-rs738408を注射されて、疾患発症が加速された。AAV注射時に、マウスは、収集されるまで通常の固形飼料食餌で継続されたか又は55%フルクトース及び45%グルコース(それぞれSigma、F0127及びG7021)で構成される飲料水を完全に含むEnvigo食餌、TD.170748に対して置かれた。
AAV注射及び食餌の開始の2週間後、マウスを、リン酸緩衝生理食塩水(Thermo Fisher Scientific、14190-136)中で希釈された単一用量のsiRNA D-2324(0.5mM)により動物の1キログラム当たり5.0ミリグラムで又は溶媒対照で皮下注射を介して処理した。投与は収集まで2週間に1回繰り返された。収集時に、体重を回収し、その後イソフルラン麻酔下で心臓穿刺を介して血清を回収し、続いて肝臓重量を回収した。中葉を10%の中性緩衝ホルマリンにより固定し、続いてパラフィン処理し、包埋した。肝臓の残部は、遺伝子発現分析のために急速凍結された。
急速凍結された肝臓組織を、前述のとおりのRNA及び遺伝子発現分析のために処理した。結果は、未加工のCt値及びマウスGapdhに正規化された指定の遺伝子の相対的なmRNA発現の両方として示される。(InvitrogenからのTaqMan(商標)アッセイ:ヒトPNPLA3、hs00228747_m1;マウスPnpla3、Mm00504420_m1;マウスCol1a1、Mm00801666_g1;マウスCol3a1、Mm01254471_g1;Col4a1、Mm01210125_m1;マウスGapdh、4352932E)。Col1a1、Col3a1及びCol4a1は、肝星細胞活性化及び肝線維症と関連する細胞外マトリックスマーカーである(Baiocchini 2016)。
ホルマリン固定組織は、製造業者の指示書に従ってヘモトキシリン、エオシン、及びマッソン・トリクローム染色(それぞれDako、CS70030-2、CS70130-2、AR17311-2)のために処理された。抗平滑筋アクチン染色は、抗原賦活化を伴わず且つDAKO自動染色装置を使用して実施された。スライドは、Peroxidazed 1及びSniper(Biocare、それぞれPX968及びBS966)を使用して処理し、モノクローナル抗アクチン、α-平滑筋抗体(Sigma、F3777)、続いてウサギ抗FITC(Invitrogen、711900)、Envision-ウサギHRPポリマー(Dako、K4003)、DAB+(Dako、K3468)、及びヘモトキシリンで染色した。脂肪症、炎症、卵形細胞/胆管過形成、及びaSMA陽性細胞の量に関するスコア化は、委員会認定の病理学者によって実施された。
血清は、製造業者の指示書に従ってマウスTIMP1(R&D Systems、MTM100)及びマウスサイトケラチン18-M30(Cusabio、CSB-E14265m)について分析された。TIMP1に加えて、サイトカイン18-M30は、初期線維症を含むNAFLD/NASHに関する潜在的なバイオマーカーとして同定された(Neuman 2014及びYang 2015)。図5A-L。初期線維症の発症を予防するPNPLA3rs738409-rs738408特異的siRNA分子の能力を評価するために、マウスは、AAV8空ベクター(EV)、又はAAV8-PNPLA3rs738409-rs738408、又は溶媒を受容し、通常の固形飼料食餌で維持されたか、又はAMLN食餌に移行された。AAV注射の2週間後、マウスを、隔週でさらに10週間(合計で6回の注射ラウンド)siRNA D-2324又は溶媒で処理した。マウスは10週目の時点で収集された。結果は、平均及び標準誤差として表される、固形飼料摂取AAVなし+溶媒及びAMLN摂取AAV8-PNPLA3rs738409-rs738408+溶媒、一群当たりN=8;AMLN摂取AAV8-PNPLA3rs738409-rs738408+溶媒及びAAV8-PNPLA3rs738409-rs738408+siRNA、一群当たりN=12。アスタリスクは、ダネット多重比較検定を利用する一方向ANOVAにより生成された、AAV8-PNPLA3rs738409-rs738408溶媒処理コホートに対する統計的有意性を表す。(A)収集時の肝臓重量(グラム)と体重(グラム)の比率。調整されたP値:AAVなし+溶媒群、****<0.0001、AAV-EV+溶媒、有意性なし、AAV-PNPLA3rs738409-rs738408+siRNA、****<0.0001。(B)qPCRによる肝臓におけるヒトPNPLA3 mRNA発現及びサイレンシングの確認。(左)未加工のCt値及び(右)マウスGapdhに正規化された相対的な倍率のmRNA発現;PNPLA3rs738409-rs738408+溶媒及びPNPLA3rs738409-rs738408+siRNA群を比較する。(C)qPCRによる肝臓におけるマウスPnpla3 mRNA発現の分析は、内在性のPnpla3がAAV媒介性の過剰発現又はsiRNAサイレンシングによって有意に変化しないことを示す。(左)未加工のCt値及び(右)マウスGapdhに正規化された相対的な倍率のmRNA発現;固形飼料摂取AAVなしの群とAMLN摂取PNPLA3rs738409-rs738408+溶媒及びPNPLA3rs738409-rs738408+siRNA群を比較する。(D)血清1ミリリットル当たりのピコグラムとして示される血清Timp1。調整されたP値:AAVなし+溶媒群、****<0.0001、AAV-EV+溶媒、****<0.0001、AAV-PNPLA3rs738409-rs738408+siRNA、****<0.0001。(E)血清1ミリリットル当たりのピコグラムとして示される血清CK18m30。調整されたP値:AAVなし+溶媒群、****<0.0001、AAV-EV+溶媒、****<0.0001、AAV-PNPLA3rs738409-rs738408+siRNA、****<0.0001。(F)H&E染色に基づく炎症の組織学的徴候、正常な規制値内(0)、最小(1)、軽症(2)、中等症(3)、及び重症(4)としてスコア化される。調整されたP値:AAVなし+溶媒群、****<0.0001、AAV-EV+溶媒、*=0.0108、AAV-PNPLA3rs738409-rs738408+siRNA、****<0.0001。(G)H&E染色に基づく卵形細胞/胆管過形成の組織学的徴候、正常な規制値内(0)、最小(1)、軽症(2)、中等症(3)、及び重症(4)としてスコア化される。調整されたP値:AAVなし+溶媒群、****<0.0001、AAV-EV+溶媒、有意性なし、AAV-PNPLA3rs738409-rs738408+siRNA、**=0.0081。(H)抗平滑筋アクチンに関する免疫組織化学的染色、正常な規制値内(0)、最小(1)、軽症(2)、中等症(3)、及び重症(4)としてスコア化される。調整されたP値:AAVなし+溶媒群、****<0.0001、AAV-EV+溶媒、*=0.0101、AAV-PNPLA3rs738409-rs738408+siRNA、***=0.0002。(I)線維症に関するマッソン・トリクローム染色、正常な規制値内(0)、最小(1)、軽症(2)、中等症(3)、及び重症(4)としてスコア化される。調整されたP値:AAVなし+溶媒群、****<0.0001、AAV-EV+溶媒、有意性なし、AAV-PNPLA3rs738409-rs738408+siRNA、有意性なし。(J)qPCRによる肝臓におけるマウスCol1a1 mRNA発現。マウスGapdhに正規化された相対的な倍率のmRNA発現。調整されたP値:AAVなし+溶媒群、****<0.0001、AAV-EV+溶媒、****<0.0001、AAV-PNPLA3rs738409-rs738408+siRNA、****<0.0001。(K)qPCRによる肝臓におけるマウスCol3a1 mRNA発現。マウスGapdhに正規化された相対的な倍率のmRNA発現。調整されたP値:AAVなし+溶媒群、****<0.0001、AAV-EV+溶媒、****<0.0001、AAV-PNPLA3rs738409-rs738408+siRNA、****<0.0001。(L)qPCRによる肝臓におけるマウスCol4a1 mRNA発現。マウスGapdhに正規化された相対的な倍率のmRNA発現。調整されたP値:AAVなし+溶媒群、****<0.0001、AAV-EV+溶媒、***<0.0005、AAV-PNPLA3rs738409-rs738408+siRNA、**<0.0041。

Claims (41)

  1. センス鎖及びアンチセンス鎖を含むRNAiコンストラクトであって、前記アンチセンス鎖が、表1又は2に列記されるアンチセンス配列から3ヌクレオチド以下異なる少なくとも15個の連続したヌクレオチドを有する領域を含み、且つ前記RNAiコンストラクトが、パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有3(PNPLA3)の発現を阻害する、RNAiコンストラクト。
  2. 前記アンチセンス鎖が、PNPLA3のmRNA配列と相補的である領域を含む、請求項1に記載のRNAiコンストラクト。
  3. 前記センス鎖が、表1又は2に列記されるアンチセンス配列から3ヌクレオチド以下異なる少なくとも15個の連続したヌクレオチドを有する領域を含む、請求項1又は2のいずれかに記載のRNAiコンストラクト。
  4. 前記コンストラクトが、優先的にPNPLA3-rs738409マイナーアレルを阻害する、請求項1~3のいずれかに記載のRNAiコンストラクト。
  5. 前記コンストラクトが、メジャーアレルと比較して少なくとも10%高くPNPLA3-rs738409マイナーアレルを阻害する、請求項4に記載のRNAiコンストラクト。
  6. 前記コンストラクトが、優先的にPNPLA3-rs738408マイナーアレルを阻害する、請求項1~5のいずれかに記載のRNAiコンストラクト。
  7. 前記コンストラクトが、メジャーアレルと比較して少なくとも10%高くPNPLA3-rs738409-rs738408二重マイナーアレルを阻害する、請求項6に記載のRNAiコンストラクト。
  8. 前記センス鎖が、前記アンチセンス鎖の配列と十分に相補的な配列を含み、約15~約30塩基対長の二重鎖領域を形成する、請求項1~7のいずれかに記載のRNAiコンストラクト。
  9. 前記二重鎖領域が、約17~約24塩基対長である、請求項8に記載のRNAiコンストラクト。
  10. 前記二重鎖領域が、約19~約21塩基対長である、請求項8に記載のRNAiコンストラクト。
  11. 前記二重鎖領域が、19塩基対長である、請求項10に記載のRNAiコンストラクト。
  12. 前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖が、それぞれ約15~約30ヌクレオチド長である、請求項8~11のいずれか一項に記載のRNAiコンストラクト。
  13. 前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖が、それぞれ約19~約27ヌクレオチド長である、請求項12に記載のRNAiコンストラクト。
  14. 前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖が、それぞれ約21~約25ヌクレオチド長である、請求項12に記載のRNAiコンストラクト。
  15. 前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖が、それぞれ約21~約23ヌクレオチド長である、請求項12に記載のRNAiコンストラクト。
  16. 前記RNAiコンストラクトが、少なくとも1つの平滑末端を含む、請求項1~15のいずれか一項に記載のRNAiコンストラクト。
  17. 前記RNAiコンストラクトが、1~4個の不対ヌクレオチドの少なくとも1つのヌクレオチドオーバーハングを含む、請求項1~15のいずれか一項に記載のRNAiコンストラクト。
  18. 前記ヌクレオチドオーバーハングが、2個の不対ヌクレオチドを有する、請求項17に記載のRNAiコンストラクト。
  19. 前記RNAiコンストラクトが、前記センス鎖の3’末端、前記アンチセンス鎖の3’末端、又は前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖の両方の3’末端にヌクレオチドオーバーハングを含む、請求項17又は18に記載のRNAiコンストラクト。
  20. 前記ヌクレオチドオーバーハングが、5’-UU-3’ジヌクレオチド又は5’-dTdT-3’ジヌクレオチドを含む、請求項17~19のいずれか一項に記載のRNAiコンストラクト。
  21. 前記RNAiコンストラクトが、少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項1~20のいずれか一項に記載のRNAiコンストラクト。
  22. 前記修飾ヌクレオチドが、2’-修飾ヌクレオチドである、請求項21に記載のRNAiコンストラクト。
  23. 前記修飾ヌクレオチドが、2’-フルオロ修飾ヌクレオチド、2’-O-メチル修飾ヌクレオチド、2’-O-メトキシエチル修飾ヌクレオチド、2’-O-アリル修飾ヌクレオチド、二環性核酸(BNA)、グリコール核酸、反転塩基又はこれらの組み合わせである、請求項21に記載のRNAiコンストラクト。
  24. 前記修飾ヌクレオチドが、2’-O-メチル修飾ヌクレオチド、2’-O-メトキシエチル修飾ヌクレオチド、2’-フルオロ修飾ヌクレオチド、又はこれらの組み合わせである、請求項23に記載のRNAiコンストラクト。
  25. 前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖中の前記ヌクレオチドの全てが、修飾ヌクレオチドである、請求項21に記載のRNAiコンストラクト。
  26. 前記修飾ヌクレオチドが、2’-O-メチル修飾ヌクレオチド、2’-フルオロ修飾ヌクレオチド、又はこれらの組み合わせである、請求項25に記載のRNAiコンストラクト。
  27. 前記RNAiコンストラクトが、少なくとも1つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項1~26のいずれか一項に記載のRNAiコンストラクト。
  28. 前記RNAiコンストラクトが、前記アンチセンス鎖の3’末端に2つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項27に記載のRNAiコンストラクト。
  29. 前記RNAiコンストラクトが、前記アンチセンス鎖の3’末端及び5’末端の両方に2つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、且つ前記センス鎖の5’末端に2つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項27に記載のRNAiコンストラクト。
  30. 前記アンチセンス鎖が、表1又は表2に列記される前記アンチセンス配列から選択される配列を含む、請求項1~29のいずれか一項に記載のRNAiコンストラクト。
  31. 前記センス鎖が、表1又は表2に列記される前記センス配列から選択される配列を含む、請求項30に記載のRNAiコンストラクト。
  32. 前記RNAiコンストラクトが、表1~2のいずれか1つに列記される二重鎖化合物のいずれか1つである、請求項1~31のいずれか一項に記載のRNAiコンストラクト。
  33. 対照RNAiコンストラクトとインキュベートされた肝臓細胞におけるPNPLA3発現レベルと比較して、前記RNAiコンストラクトが、前記RNAiコンストラクトとのインキュベーション後の肝臓細胞におけるPNPLA3の発現レベルを低減する、請求項1~32のいずれか一項に記載のRNAiコンストラクト。
  34. 前記肝臓細胞が、Hep3B細胞又はHepG2細胞である、請求項27に記載のRNAiコンストラクト。
  35. 前記RNAiコンストラクトが、インビトロのHep3B細胞において、5nMでPNPLA3発現の少なくとも10%を阻害する、請求項1~26のいずれか一項に記載のRNAiコンストラクト。
  36. 前記RNAiコンストラクトが、インビトロのHepG2細胞において、5nMでPNPLA3発現の少なくとも10%を阻害する、請求項1~26のいずれか一項に記載のRNAiコンストラクト。
  37. 前記RNAiコンストラクトが、約1nM未満のIC50でHep3B細胞におけるPNPLA3発現を阻害する、請求項1~26のいずれか一項に記載のRNAiコンストラクト。
  38. 前記RNAiコンストラクトが、約1nM未満のIC50でHepG2細胞におけるPNPLA3発現を阻害する、請求項1~26のいずれか一項に記載のRNAiコンストラクト。
  39. 請求項1~38のいずれか一項に記載のRNAiコンストラクト及び薬学的に許容される担体、賦形剤、又は希釈剤を含む医薬組成物。
  40. PNPLA3の発現の低減を必要とする患者において、PNPLA3の発現の低減を行う方法であって、請求項1~38のいずれか一項に記載のRNAiコンストラクトを前記患者に投与することを含む方法。
  41. 肝細胞におけるPNPLA3の発現レベルが、前記RNAiコンストラクトを投与されていない患者のPNPLA3発現レベルと比較して、前記RNAiコンストラクトの投与後に前記患者において低減される、請求項40に記載の方法。
JP2023183884A 2017-12-12 2023-10-26 PNPLA3発現を阻害するためのRNAiコンストラクト Pending JP2024012386A (ja)

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