JP2023528608A - ＨＳＤ１７Ｂ１３発現を阻害するためのＲＮＡｉコンストラクト及びその使用方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現を低減するためのＲＮＡｉコンストラクトに関する。このようなＲＮＡｉコンストラクトを使用して、肝疾患、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を治療又は予防する方法も記載される。

Description

本発明は、１７β－ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ１３型（ＨＳＤ１７Ｂ１３）の肝臓発現を調節するための組成物及び方法に関し、特に、本発明は、ＲＮＡ干渉によりＨＳＤ１７Ｂ１３発現を低減するための核酸に基づく治療薬及び非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）などの肝疾患を治療又は予防するためのそのような核酸に基づく治療薬を使用する方法に関する。

非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、様々な肝臓病理を含む世界で最も一般的な慢性肝疾患であり、その有病率は過去２０年間で倍増し、現在では世界人口の約２０％が罹患していると推定される（Ｓａｔｔａｒ ｅｔ ａｌ．（２０１４）ＢＭＪ ３４９：ｇ４５９６；Ｌｏｏｍｂａ ａｎｄ Ｓａｎｙａｌ（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ＆ ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １０（１１）：６８６－６９０；Ｋｉｍ ａｎｄ Ｋｉｍ（２０１７）Ｃｌｉｎ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ １５（４）：４７４－４８５；Ｐｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｄｉｇ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ ４８（３）：３３３－３４２）。ＮＡＦＬＤは、肝臓中におけるトリグリセリドの蓄積から始まり、１）著しい飲酒歴がなく、且つ２）他の種類の肝疾患の診断が除外されている個体において、５％超の肝細胞に細胞質脂質小滴が存在することによって定義される（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ（２０１６）Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ ２２（３６）：８２２６－３３；Ｒｉｎｅｌｌａ（２０１５）ＪＡＭＡ ３１３（２２）：２２６３－７３；Ｙｋｉ－Ｊａｒｖｉｎｅｎ（２０１６）Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ５９（６）：１１０４－１１）。一部の個体では、脂肪症と呼ばれる肝臓への異所性脂肪の蓄積により、炎症及び肝細胞損傷が誘発され、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）と呼ばれるより進行した段階の疾患が引き起こされる（Ｒｉｎｅｌｌａ、前掲）。２０１５年の時点で、７５００万～１億人のアメリカ人がＮＡＦＬＤを有すると予測されており、ＮＡＳＨは、ＮＡＦＬＤ診断のおよそ１０～３０％を占めている（Ｒｉｎｅｌｌａ、前掲；Ｙｏｕｎｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ（２０１６）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ６４（５）：１５７７－１５８６）。

１７β－ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ１３型（ＨＳＤ１７Ｂ１３）は、１７β－ＨＳＤ１３型としても知られており、１７－ケトステロイドと１７－水酸化ステロイドとの間の転換を触媒する酵素のファミリーを含む、１７β－ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（ＨＳＤ１７Ｂ）ファミリーのメンバーである（Ｓｕ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ；４８９：１１９－１２５）。ＨＳＤ１７Ｂ１３は、元々はＳＣＤＲ９という名称であり、２００７年にヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーから最初にクローニングされたものである（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈｉｍ ５４：２１３－２１８）。２００８年には、ＨＳＤ１７Ｂ１３は、発現が主に肝臓に限定される新規のＬＤ関連タンパク質として、Ｈｏｒｉｇｕｃｈｉによって同定されている（Ｈｏｒｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ３７０：２３５－２３８）。ＨＳＤ１７Ｂ１３が肝臓で過剰発現すると、肝臓内で脂質の蓄積が促進される。ＨＳＤ１７Ｂ１３の発現は、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）患者及びマウスにおいて顕著に上方制御される（Ｓｕ ｅｔ ａｌ．（２０１４）ＰＮＡＳ １１１：１１４３７－１１４４２）。従って、ＨＳＤ１７Ｂ１３を標的とする新規の治療薬は、ＨＳＤ１７Ｂ１３レベルを低減し、且つ非アルコール性脂肪性肝疾患などの肝臓学的疾患を治療する新たな手法を提示するものである。

Ｓａｔｔａｒ ｅｔ ａｌ．（２０１４）ＢＭＪ ３４９：ｇ４５９６ Ｌｏｏｍｂａ ａｎｄ Ｓａｎｙａｌ（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ＆ ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １０（１１）：６８６－６９０ Ｋｉｍ ａｎｄ Ｋｉｍ（２０１７）Ｃｌｉｎ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ １５（４）：４７４－４８５ Ｐｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｄｉｇ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ ４８（３）：３３３－３４２） Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ（２０１６）Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ ２２（３６）：８２２６－３３ Ｒｉｎｅｌｌａ（２０１５）ＪＡＭＡ ３１３（２２）：２２６３－７３ Ｙｋｉ－Ｊａｒｖｉｎｅｎ（２０１６）Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ５９（６）：１１０４－１１ Ｙｏｕｎｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ（２０１６）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ６４（５）：１５７７－１５８６ Ｓｕ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ；４８９：１１９－１２５ Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈｉｍ ５４：２１３－２１８ Ｈｏｒｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ３７０：２３５－２３８ Ｓｕ ｅｔ ａｌ．（２０１４）ＰＮＡＳ １１１：１１４３７－１１４４２

本発明は、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を標的化し、且つ肝臓細胞におけるＨＳＤ１７Ｂ１３発現を低減するＲＮＡｉコンストラクトの設計及び生成に部分的に基づく。ＨＳＤ１７Ｂ１３発現の配列特異的阻害は、例えば、単純性脂肪肝（脂肪症）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変（肝臓の不可逆的な進行した瘢痕）、又はＨＳＤ１７Ｂ１３関連肥満などの肝臓関連疾患などの、ＨＳＤ１７Ｂ１３発現に関連する状態を治療又は予防するのに有用である。従って、一実施形態では、本発明は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含むＲＮＡｉコンストラクトであって、アンチセンス鎖がＨＳＤ１７Ｂ１３のｍＲＮＡ配列と相補的な配列を有する領域を含む、ＲＮＡｉコンストラクトを提供する。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、表１又は表２に列記されるアンチセンス配列から少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを有する領域を含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖は、約１５～約３０塩基対長の二重鎖領域を形成するアンチセンス鎖の配列と十分に相補的な配列を含む。これら及び他の実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖の各々は、約１５～３０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、少なくとも１つの平滑末端を含む。他の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、少なくとも１つのヌクレオチドオーバーハングを含む。このようなヌクレオチドオーバーハングは、少なくとも１～６個の不対ヌクレオチドを含み得、且つセンス鎖の３’末端、アンチセンス鎖の３’末端、又はセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方の３’末端に位置し得る。特定の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖の３’末端及びアンチセンス鎖の３’末端に２個の不対ヌクレオチドのオーバーハングを含む。他の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端に２個の不対ヌクレオチドのオーバーハングを含み、且つセンス鎖の３’末端／アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む。

本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、リボース環、核酸塩基、又はホスホジエステル骨格への修飾を有するヌクレオチドを含む１つ以上の修飾ヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、１つ以上の２’－修飾ヌクレオチドを含む。このような２’－修飾ヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、二環式核酸（ＢＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、反転塩基（例えば、反転アデノシン）又はこれらの組み合わせを含み得る。特定の一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、１つ以上の２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、又はこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖及びアンチセンス鎖の全てのヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドである。

いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、ヌクレオチド間又はヌクレオシド間の修飾された結合などの少なくとも１つの骨格修飾を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトは、少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。特定の実施形態では、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合は、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の３’末端又は５’末端に配置されてもよい。

いくつかの実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトのアンチセンス鎖及び／又はセンス鎖は、表１又は２に列記されるアンチセンス配列及びセンス配列からの配列を含むか又はそれからなり得る。特定の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、表１～２のいずれか１つに列記される二重鎖化合物のいずれか１つであり得る。

本発明は、１７β－ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ１３型（ＨＳＤ１７Ｂ１３）遺伝子の発現を調節するための組成物及び方法に関する。いくつかの実施形態では、この遺伝子は、細胞又は哺乳動物（例えば、ヒト）などの対象内に存在し得る。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、ＨＳＤ１７Ｂ１３のｍＲＮＡを標的化し、且つ細胞又は哺乳動物におけるＨＳＤ１７Ｂ１３発現を低減するＲＮＡｉコンストラクトを含む。このようなＲＮＡｉコンストラクトは、例えば、単純性脂肪肝（脂肪症）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変（肝臓の不可逆的な進行した瘢痕）、又はＨＳＤ１７Ｂ１３関連肥満などの肝臓関連疾患の様々な形態を治療又は予防するのに有用である。

ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、細胞内に外来のＲＮＡを導入して、標的とするタンパク質をコードするｍＲＮＡの特異的な分解をもたらし、その結果としてタンパク質の発現を低減させるプロセスである。ＲＮＡｉ技術及び肝臓への送達の両方の進歩、並びに他のＲＮＡｉに基づく療法により増大する良好なアウトカムは、ＲＮＡｉがＨＳＤ１７Ｂ１３を直接標的化することによりＮＡＦＬＤを治療するための説得力のある手段であることを示唆している。

本明細書で使用する場合、用語「ＲＮＡｉコンストラクト」は、細胞に導入された際にＲＮＡ干渉機構を介して標的遺伝子（例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３）の発現を下方制御することができるＲＮＡ分子を含む薬剤を指す。ＲＮＡ干渉は、核酸分子が、例えば、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）経路を介して、配列特異的な様式で標的のＲＮＡ分子（例えば、メッセンジャーＲＮＡ又はｍＲＮＡ分子）の切断及び分解を誘導するプロセスである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、互いに十分に相補的であり、ハイブリダイズして二重鎖領域を形成する連続したヌクレオチドの２本の逆平行鎖を含む二重鎖ＲＮＡ分子から構成される。「ハイブリダイズする」又は「ハイブリダイゼーション」は、典型的には、２つのポリヌクレオチドにおける相補的な塩基間の水素結合（例えば、ワトソン－クリック、フーグスティーン又は逆フーグスティーン水素結合）を介した相補的なポリヌクレオチドの対合を指す。標的配列（例えば、標的ｍＲＮＡ）と実質的に相補的な配列を有する領域を含む鎖は、「アンチセンス鎖」と称される。「センス鎖」は、アンチセンス鎖の領域と実質的に相補的な領域を含む鎖を指す。いくつかの実施形態では、センス鎖は、標的配列と実質的に同一の配列を有する領域を含み得る。

いくつかの実施形態では、本発明は、ＨＳＤ１７Ｂ１３を対象としたＲＮＡｉである。いくつかの実施形態では、本発明は、表１又は表２において見出される配列のいずれかを含有するＲＮＡｉコンストラクトを含む。

二重鎖ＲＮＡ分子は、リボヌクレオチドに対する化学修飾を含んでよく、リボース糖、塩基、又はリボヌクレオチドの骨格構成要素に対する修飾、例えば、本明細書に記載されるもの又は当該技術において知られているものが挙げられる。二本鎖ＲＮＡ分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなど）に用いられるようなあらゆる修飾が、本開示の目的のために用語「二本鎖ＲＮＡ」によって包含される。

本明細書で使用する場合、生理的条件などのある種の条件下において、第１の配列を含むポリヌクレオチドが、第２の配列を含むポリヌクレオチドにハイブリダイズして二重鎖領域を形成することができる場合、第１の配列は、第２の配列に「相補的」である。他のこのような条件は、当業者に知られる中程度の又はストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を含むことができる。第１の配列を含むポリヌクレオチドが、第２の配列を含むポリヌクレオチドとミスマッチすることなく一方又は両方のヌクレオチド配列の全長にわたって塩基対形成する場合、第１の配列は、第２の配列と完全に相補的（１００％相補的）であるとみなされる。配列が少なくとも標的配列と約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％相補的である場合、配列は、標的配列と「実質的に相補的」である。相補性の割合は、第２の配列又は標的配列の対応する位置の塩基と相補的な第１の配列の塩基の数を第１の配列の全体長で割ることによって計算することができる。２つの配列がハイブリダイズするとき、３０塩基対の二重鎖領域にわたって５、４、３、２又は１個以下のミスマッチが存在する場合、配列は他方の配列に対して実質的に相補的であると言うこともできる。一般に、本明細書で定義されるようなヌクレオチドオーバーハングが存在する場合、そのようなオーバーハングの配列は、２つの配列間の相補性の程度を判断する際に考慮されない。例として、ハイブリダイズして各鎖の３’末端に２ヌクレオチドオーバーハングを有する１９塩基対二重鎖領域を形成する、２１ヌクレオチド長のセンス鎖及び２１ヌクレオチド長のアンチセンス鎖は、この用語が本明細書に使用される場合、完全に相補的であるとみなされることになる。

いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の領域は、標的ＲＮＡ配列（例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３のｍＲＮＡ）の領域と完全に相補的な配列を含む。このような実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖の配列と完全に相補的な配列を含み得る。他のこのような実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖の配列と実質的に相補的な配列、例えばセンス鎖及びアンチセンス鎖によって形成される二重鎖領域に１、２、３、４又は５個のミスマッチを有する配列を含み得る。特定の実施形態では、任意のミスマッチが、末端領域内（例えば、鎖の５’及び／又は３’末端の６、５、４、３、２又は１個のヌクレオチド以内）に生じることが好ましい。一実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖から形成される二重鎖領域内の任意のミスマッチが、アンチセンス鎖の５’末端の６、５、４、３、２、又は１ヌクレオチド以内に生じる。

特定の実施形態では、二本鎖ＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖は、ハイブリダイズして二重鎖領域を形成するが、そうでなければ分離している２つの別個の分子であり得る。２本の別々の鎖から形成されるこのような二重鎖ＲＮＡ分子は、「低分子干渉ＲＮＡ」又は「短い干渉ＲＮＡ」（ｓｉＲＮＡ）と称される。従って、いくつかの実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、ｓｉＲＮＡを含む。

ｄｓＲＮＡの２本の実質的に相補的な鎖が別個のＲＮＡ分子によって構成される場合、それらの分子は、共有結合される必要はないが、共有結合することは可能である。２本の鎖が、二重鎖構造を形成する一方の鎖の３’末端と他方の鎖の５’末端との間で、ヌクレオチドの中断されていない鎖以外の手段によって共有結合されている場合、その結合構造は「リンカー」と称される。ＲＮＡ鎖は、同じ又は異なる数のヌクレオチドを有してもよい。二重鎖内の塩基対の最大数は、ｄｓＲＮＡの最短の鎖のヌクレオチドから、二重鎖内に存在するあらゆるオーバーハングを差し引いた数である。二重鎖構造に加えて、ＲＮＡｉコンストラクトは、１つ以上のヌクレオチドオーバーハングを含んでもよい。

他の実施形態では、ハイブリダイズして二重鎖領域を形成するセンス鎖及びアンチセンス鎖は、単一ＲＮＡ分子の一部であってもよく、すなわち、センス鎖及びアンチセンス鎖は、単一ＲＮＡ分子の自己相補的領域の一部である。そのような場合、単一ＲＮＡ分子は、二重鎖領域（ステム領域とも称される）及びループ領域を含む。センス鎖の３’末端は、不対ヌクレオチドの隣接配列によってアンチセンス鎖の５’末端に連結されて、ループ領域を形成することとなる。ループ領域は、典型的には、アンチセンス鎖がセンス鎖と塩基対を形成して二本鎖又はステム領域を形成することができるように、ＲＮＡ分子それ自体が再度折り畳まれることが可能なほど十分に長いものである。ループ領域は、約３～約２５、約５～約１５又は約８～約１２個の不対ヌクレオチドを含むことができる。少なくとも部分的に自己相補的な領域を有するこのようなＲＮＡ分子は、「低分子ヘアピン型ＲＮＡ」（ｓｈＲＮＡ）と称される。いくつかの実施形態では、ループ領域は、少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、又は２５個の不対ヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、ループ領域は、１０、９、８、７、６、５、４、３、２個以下の不対ヌクレオチドを含み得る。特定の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、ｓｈＲＮＡを含む。単一の、少なくとも部分的に自己相補的なＲＮＡ分子の長さは、約３５ヌクレオチド～約１００ヌクレオチド、約４５ヌクレオチド～約８５ヌクレオチド、又は約５０～約６０ヌクレオチドであり得、本明細書に列記される長さをそれぞれ有する二重鎖領域及びループ領域を含み得る。

いくつかの実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、ＨＳＤ１７Ｂ１３のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）配列と実質的に又は完全に相補的な配列を有する領域を含む。本明細書で使用する場合、「ＨＳＤ１７Ｂ１３のｍＲＮＡ配列」は、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質、例えば任意の種（例えば、マウス、ラット、非ヒト霊長類、ヒト）に由来するＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質のバリアント又はアイソフォームをコードするスプライスバリアントを含む任意のメッセンジャーＲＮＡ配列を指す。

ＨＳＤ１７Ｂ１３のｍＲＮＡ配列は、その相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列として発現する転写物配列も含む。ｃＤＮＡ配列は、ＲＮＡ塩基（例えば、グアニン、アデニン、ウラシル及びシトシン）ではなく、ＤＮＡ塩基（例えば、グアニン、アデニン、チミン及びシトシン）として表されるｍＲＮＡ転写物の配列を指す。従って、本発明のＲＮＡｉコンストラクトのアンチセンス鎖は、標的のＨＳＤ１７Ｂ１３のｍＲＮＡ配列又はＨＳＤ１７Ｂ１３のｃＤＮＡ配列と実質的に又は完全に相補的な配列を有する領域を含み得る。ＨＳＤ１７Ｂ１３のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ配列は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿１７８１３５．４又はＮＭ＿００１１３６２３０．２に由来し得るような任意のＨＳＤ１７Ｂ１３のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ配列を含み得るが、これらに限定されない。

アンチセンス鎖の領域は、ＨＳＤ１７Ｂ１３のｍＲＮＡ配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドと実質的に又は完全に相補的であり得る。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖が相補性領域を含むＨＳＤ１７Ｂ１３のｍＲＮＡ配列の標的領域は、約１５～約３０個の連続したヌクレオチド、約１６～約２８個の連続したヌクレオチド、約１８～約２６個の連続したヌクレオチド、約１７～約２４個の連続したヌクレオチド、約１９～約２５個の連続したヌクレオチド、約１９～約２３個の連続したヌクレオチド又は約１９～約２１個の連続したヌクレオチドの範囲であり得る。特定の実施形態では、ＨＳＤ１７Ｂ１３のｍＲＮＡ配列と実質的に又は完全に相補的な配列を含むアンチセンス鎖の領域は、いくつかの実施形態では、表１又は表２に列記されるアンチセンス配列からの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含み得る。他の実施形態では、アンチセンス配列は、表１又は表２に列記されるアンチセンス配列からの少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、又は少なくとも１９個の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、センス配列及び／又はアンチセンス配列は、表１又は表２に列記される配列からの１、２、又は３個以下のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも１５個のヌクレオチドを含む。

ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖は、通常、２本の鎖が生理的条件下でハイブリダイズして二重鎖領域を形成するようにアンチセンス鎖の配列と十分に相補的な配列を含む。「二重鎖領域」は、ワトソン－クリック塩基対形成又は他の水素結合相互作用のいずれかによって互いに塩基対を形成して、２つのポリヌクレオチド間で二重鎖を生成する２つの相補的な、又は実質的に相補的なポリヌクレオチド内の領域を指す。ＲＮＡｉコンストラクトの二重鎖領域は、例えば、ダイサー酵素及び／又はＲＩＳＣ複合体が結合することにより、ＲＮＡｉコンストラクトがＲＮＡ干渉経路に入ることを可能にする十分な長さのものであるべきである。例えば、いくつかの実施形態では、二重鎖領域は、約１５～約３０塩基対長である。この範囲内の二重鎖領域の他の長さ、例えば約１５～約２８塩基対、約１５～約２６塩基対、約１５～約２４塩基対、約１５～約２２塩基対、約１７～約２８塩基対、約１７～約２６塩基対、約１７～約２４塩基対、約１７～約２３塩基対、約１７～約２１塩基対、約１９～約２５塩基対、約１９～約２３塩基対、又は約１９～約２１塩基対も好適である。一実施形態では、二重鎖領域は、約１７～約２４塩基対長である。別の実施形態では、二重鎖領域は、約１９～約２１塩基対長である。

いくつかの実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、標的ＲＮＡ配列、例えばＨＳＤ１７Ｂ１３標的ｍＲＮＡ配列と相互作用して、標的ＲＮＡの切断を誘導する約２４～約３０個のヌクレオチドの二重鎖領域を含有する。理論に束縛されるものではないが、細胞に導入された長い二本鎖ＲＮＡは、ダイサーとして知られるＩＩＩ型エンドヌクレアーゼによってｓｉＲＮＡに分解され得る（Ｓｈａｒｐ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：４８５）。ダイサーであるリボヌクレアーゼＩＩＩ様酵素は、ｄｓＲＮＡを、特徴的な２塩基の３’オーバーハングを有する１９～２３塩基対の短い干渉ＲＮＡにプロセシングする（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４０９：３６３）。次いで、ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれるが、１つ以上のヘリカーゼがｓｉＲＮＡ二重鎖を巻き戻して、相補的なアンチセンス鎖が標的認識を誘導することを可能にする（Ｎｙｋａｎｅｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｃｅｌｌ １０７：３０９）。適切な標的のｍＲＮＡに結合すると、ＲＩＳＣ内の１つ以上のエンドヌクレアーゼが標的を切断してサイレンシングを誘導する（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：１８８）。

センス鎖及びアンチセンス鎖が２つの別個の分子である（例えば、ＲＮＡｉコンストラクトがｓｉＲＮＡを含む）実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖は、二重鎖領域の長さと同じ長さである必要はない。例えば、一方の鎖又は双方の鎖が、二重鎖領域よりも長くてもよく、そして二重鎖領域の側面に位置する１個以上の不対ヌクレオチド又はミスマッチを有してもよい。従って、いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、少なくとも１つのヌクレオチドオーバーハングを含む。本明細書で使用する場合、「ヌクレオチドオーバーハング」は、鎖の末端で二重鎖領域を越えて延在する１個又は複数個の不対ヌクレオチドを指す。ヌクレオチドオーバーハングは、典型的には、一方の鎖の３’末端が他方の鎖の５’末端を越えて延在するか、又は一方の鎖の５’末端が他方の鎖の３’末端を越えて延在する場合に生成される。ヌクレオチドオーバーハングの長さは、一般に、１～６個のヌクレオチド、１～５個のヌクレオチド、１～４個のヌクレオチド、１～３個のヌクレオチド、２～６個のヌクレオチド、２～５個のヌクレオチド、又は２～４個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドオーバーハングは、１、２、３、４、５又は６個のヌクレオチドを含む。特定の一実施形態では、ヌクレオチドオーバーハングは、１～４個のヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、ヌクレオチドオーバーハングは、２個のヌクレオチドを含む。オーバーハングにおけるヌクレオチドは、本明細書に記載される通りのリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、又は修飾ヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態では、オーバーハングは、５’－ウリジン－ウリジン－３’（５’－ＵＵ－３’）ジヌクレオチドを含む。そのような実施形態では、ＵＵジヌクレオチドは、リボヌクレオチド又は修飾ヌクレオチド、例えば２’－修飾ヌクレオチドを含んでもよい。他の実施形態では、オーバーハングは、５’－デオキシチミジン－デオキシチミジン－３’（５’－ｄＴｄＴ－３’）ジヌクレオチドを含む。

ヌクレオチドオーバーハングは、一方又は両方の鎖の５’末端又は３’末端に存在してもよい。例えば、一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の５’末端及び３’末端にヌクレオチドオーバーハングを含む。別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖の５’末端及び３’末端にヌクレオチドオーバーハングを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖の５’末端及びアンチセンス鎖の５’末端にヌクレオチドオーバーハングを含む。他の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖の３’末端及びアンチセンス鎖の３’末端にヌクレオチドオーバーハングを含む。

ＲＮＡｉコンストラクトは、二重鎖ＲＮＡ分子の一方の末端に単一ヌクレオチドオーバーハングを含み、且つ他の末端に平滑末端を含み得る。「平滑末端」は、分子の末端においてセンス鎖及びアンチセンス鎖が完全に塩基対形成しており、二重鎖領域を越えて延在する不対ヌクレオチドが存在しないことを意味する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖の３’末端にヌクレオチドオーバーハングを含み、且つセンス鎖の５’末端及びアンチセンス鎖の３’末端に平滑末端を含む。他の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端にヌクレオチドオーバーハングを含み、且つアンチセンス鎖の５’末端及びセンス鎖の３’末端に平滑末端を含む。特定の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、二本鎖ＲＮＡ分子の両方の末端に平滑末端を含む。このような実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖は同じ長さを有し、二重鎖領域はセンス鎖及びアンチセンス鎖と同じ長さである（すなわち、分子は、その全長にわたって二本鎖である）。

センス鎖及びアンチセンス鎖は、それぞれ独立して、約１５～約３０ヌクレオチド長、約１８～約２８ヌクレオチド長、約１９～約２７ヌクレオチド長、約１９～約２５ヌクレオチド長、約１９～約２３ヌクレオチド長、約２１～約２５ヌクレオチド長、又は約２１～約２３ヌクレオチド長であり得る。特定の実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖は、それぞれ約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４又は約２５ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖は、同じ長さを有するが、ＲＮＡｉコンストラクトが２つのヌクレオチドオーバーハングを有するように、これらの鎖よりも短い二重鎖領域を形成する。例えば、一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、（ｉ）それぞれ２１ヌクレオチド長であるセンス鎖及びアンチセンス鎖、（ｉｉ）１９塩基対長である二重鎖領域、並びに（ｉｉｉ）センス鎖の３’末端及びアンチセンス鎖の３’末端の両方にある２個の不対ヌクレオチドのヌクレオチドオーバーハングを含む。別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、（ｉ）それぞれ２３ヌクレオチド長であるセンス鎖及びアンチセンス鎖、（ｉｉ）２１塩基対長である二重鎖領域、並びに（ｉｉｉ）センス鎖の３’末端及びアンチセンス鎖の３’末端の両方にある２個の不対ヌクレオチドのヌクレオチドオーバーハングを含む。他の実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖は、二本鎖分子のいずれの末端にもヌクレオチドオーバーハングが存在しないように、同じ長さを有し、且つその全長にわたって二重鎖領域を形成する。このような一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、平滑末端であり、（ｉ）それぞれ２１ヌクレオチド長であるセンス鎖及びアンチセンス鎖、並びに（ｉｉ）２１塩基対長である二重鎖領域を含む。別のこのような実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、平滑末端であり、（ｉ）それぞれ２３ヌクレオチド長であるセンス鎖及びアンチセンス鎖、並びに（ｉｉ）２３塩基対長である二重鎖領域を含む。

他の実施形態では、センス鎖又はアンチセンス鎖は、ＲＮＡｉコンストラクトが少なくとも１つのヌクレオチドオーバーハングを含むように他方の鎖よりも長く、この２本の鎖は、短い方の鎖の長さに等しい長さを有する二重鎖領域を形成する。例えば、一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、（ｉ）１９ヌクレオチド長であるセンス鎖、（ｉｉ）２１ヌクレオチド長であるアンチセンス鎖、（ｉｉｉ）１９塩基対長の二重鎖領域、及び（ｉｖ）アンチセンス鎖の３’末端にある２個の不対ヌクレオチドの単一ヌクレオチドオーバーハングを含む。別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、（ｉ）２１ヌクレオチド長であるセンス鎖、（ｉｉ）２３ヌクレオチド長であるアンチセンス鎖、（ｉｉｉ）２１塩基対長の二重鎖領域、及び（ｉｖ）アンチセンス鎖の３’末端にある２個の不対ヌクレオチドの単一ヌクレオチドオーバーハングを含む。

本発明のＲＮＡｉコンストラクトのアンチセンス鎖は、表１若しくは表２に列記されるアンチセンス配列又はこれらのアンチセンス配列のいずれかのヌクレオチド１～１９の配列のいずれか１つの配列を含み得る。表１及び６に列記されるアンチセンス配列の各々は、２ヌクレオチドのオーバーハング配列に加えて、ＨＳＤ１７Ｂ１３のｍＲＮＡ配列と相補的な１９個の連続したヌクレオチド（５’末端から数えて最初の１９個のヌクレオチド）の配列を含む。従って、いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号１～６４６又は６４８～１２９２のいずれか１つのヌクレオチド１～１９の配列を含む。

修飾ヌクレオチド
本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含み得る。「修飾ヌクレオチド」は、ヌクレオシド、核酸塩基、ペントース環又はホスフェート基に対する１つ以上の化学修飾を有するヌクレオチドを指す。本明細書で使用する場合、修飾ヌクレオチドは、アデノシン一リン酸、グアノシン一リン酸、ウリジン一リン酸、及びシチジン一リン酸を含有するリボヌクレオチド、並びにデオキシアデノシン一リン酸、デオキシグアノシン一リン酸、デオキシチミジン一リン酸、及びデオキシシチジン一リン酸を含有するデオキシリボヌクレオチドを包含しない。しかしながら、ＲＮＡｉコンストラクトは、修飾ヌクレオチド、リボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドの組み合わせを含み得る。二本鎖ＲＮＡ分子の一方又は両方の鎖に修飾ヌクレオチドを組み込むと、例えば、ヌクレアーゼ及び他の分解プロセスに対する分子の感受性を低下させることによって、ＲＮＡ分子のインビボ安定性を向上させることができる。修飾ヌクレオチドの組み込みにより、標的遺伝子の発現を低下させるためのＲＮＡｉコンストラクトの効力を増強させることもできる。

特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、リボース糖の修飾を有する。これらの糖の修飾には、ペントース環の２’及び／又は５’位での修飾並びに二環式糖修飾が含まれ得る。２’－修飾ヌクレオチドは、Ｈ又はＯＨ以外の置換基を２’位に有するペントース環を有するヌクレオチドを指す。このような２’修飾としては、２’－Ｏ－アルキル（例えば、Ｏ－Ｃ１～Ｃ１０又はＯ－Ｃ１～Ｃ１０置換アルキル）、２’－Ｏ－アリル（Ｏ－ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）、２’－Ｃ－アリル、２’－フルオロ、２’－Ｏ－メチル（ＯＣＨ３）、２’－Ｏ－メトキシエチル（Ｏ－（ＣＨ２）２ＯＣＨ３）、２’－ＯＣＦ３、２’－Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、２’－Ｏ－アミノアルキル、２’－アミノ（例えば、ＮＨ２）、２’－Ｏ－エチルアミン及び２’－アジドが挙げられるが、これらに限定されない。ペントース環の５’位での修飾としては、５’－メチル（Ｒ又はＳ）、５’－ビニル及び５’－メトキシが挙げられるが、これらに限定されない。

「二環式糖修飾」は、ペントース環の修飾を指し、この場合、架橋が環の２つの原子を接続して、二環式糖構造をもたらす第２の環を形成する。いくつかの実施形態では、二環式糖修飾は、ペントース環の４’炭素と２’炭素との間の架橋を含む。二環式糖修飾を有する糖部分を含むヌクレオチドは、本明細書では二環式核酸又はＢＮＡと称される。例示的な二環式糖修飾としては、α－Ｌ－メチレンオキシ（４’－ＣＨ２－Ｏ－２’）二環式核酸（ＢＮＡ）；β－Ｄ－メチレンオキシ（４’－ＣＨ２－Ｏ－２’）ＢＮＡ（ロックド核酸又はＬＮＡとも称される）；エチレンオキシ（４’－（ＣＨ２）２－Ｏ－２’）ＢＮＡ；アミノオキシ（４’－ＣＨ２－Ｏ－Ｎ（Ｒ）－２’）ＢＮＡ；オキシアミノ（４’－ＣＨ２－Ｎ（Ｒ）－Ｏ－２’）ＢＮＡ；メチル（メチレンオキシ）（４’－ＣＨ（ＣＨ３）－Ｏ－２’）ＢＮＡ（拘束エチル又はｃＥｔとも称される）；メチレン－チオ（４’－ＣＨ２－Ｓ－２’）ＢＮＡ；メチレン－アミノ（４’－ＣＨ２－Ｎ（Ｒ）－２’）ＢＮＡ；メチル炭素環式（４’－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ３）－２’）ＢＮＡ；プロピレン炭素環式（４’－（ＣＨ２）３－２’）ＢＮＡ；及びメトキシ（エチレンオキシ）（４’－ＣＨ（ＣＨ２ＯＭｅ）－Ｏ－２’）ＢＮＡ（拘束ＭＯＥ又はｃＭＯＥとも称される）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のＲＮＡｉコンストラクトに組み込むことができるこれら及び他の糖修飾ヌクレオチドは、米国特許第９，１８１，５５１号明細書、米国特許出願公開第２０１６／０１２２７６１号明細書、及びＤｅｌｅａｖｅｙ ａｎｄ Ｄａｍｈａ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１９：９３７－９５４，２０１２に記載され、これらの全ては参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、１つ以上の２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、二環式核酸（ＢＮＡ）、グリコール核酸、又はこれらの組み合わせを含む。特定の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、１つ以上の２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド又はこれらの組み合わせを含む。特定の一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、１つ以上の２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド又はこれらの組み合わせを含む。

ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方は、１つ又は複数の修飾ヌクレオチドを含むことができる。例えば、いくつかの実施形態では、センス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上の修飾ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、センス鎖内の全てのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上の修飾ヌクレオチドを含む。他の実施形態では、アンチセンス鎖の全てのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである。特定の他の実施形態では、センス鎖内の全てのヌクレオチド及びアンチセンス鎖内の全てのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである。これら及び他の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド又はこれらの組み合わせであり得る。

いくつかの実施形態では、センス鎖、アンチセンス鎖又は両方の鎖におけるアデノシンヌクレオチドの前にある全てのピリミジンヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである。例えば、いずれかの鎖で配列５’－ＣＡ－３’又は５’－ＵＡ－３’が現れる場合、シチジン及びウリジンヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドであり、好ましくは２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドである。特定の実施形態では、センス鎖内の全てのピリミジンヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド（例えば、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド）であり、アンチセンス鎖内に存在する全ての配列５’－ＣＡ－３’又は５’－ＵＡ－３’の５’ヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド（例えば、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド）である。他の実施形態では、二重鎖領域内の全てのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである。このような実施形態では、修飾ヌクレオチドは、好ましくは、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド又はこれらの組み合わせである。

ＲＮＡｉコンストラクトがヌクレオチドオーバーハングを含む実施形態では、オーバーハング内のヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド又は修飾ヌクレオチドであり得る。一実施形態では、オーバーハング内のヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、例えばデオキシチミジンである。別の実施形態では、オーバーハング内のヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドである。例えば、いくつかの実施形態では、オーバーハング内のヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－メトキシエチル修飾ヌクレオチド又はこれらの組み合わせである。

本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、１つ以上の修飾ヌクレオチド間結合も含み得る。本明細書で使用する場合、用語「修飾されたヌクレオチド間結合」は、天然の３’－５’ホスホジエステル結合以外のヌクレオチド間の結合を指す。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチド間結合は、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、アルキルホスホナート（例えば、メチルホスホナート、３’－アルキレンホスホナート）、ホスフィナート、ホスホロアミダート（例えば、３’－アミノホスホロアミダート及びアミノアルキルホスホロアミダート）、ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、チオノホスホロアミダート、チオノアルキルホスホナート、チオノアルキルホスホトリエステル及びボラノホスフェートなどのリン含有ヌクレオチド間結合である。一実施形態では、修飾ヌクレオチド間結合は、２’－５’ホスホジエステル結合である。他の実施形態では、修飾ヌクレオチド間結合は、リン非含有ヌクレオチド間結合であり、従って修飾ヌクレオシド間結合と称される場合もある。このようなリン非含有結合としては、モルホリノ結合（部分的にヌクレオシドの糖部分から形成される）；シロキサン結合（－Ｏ－Ｓｉ（Ｈ）２－Ｏ－）；スルフィド、スルホキシド及びスルホン結合；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル結合；アルケン含有骨格；スルファマート骨格；メチレンメチルイミノ（－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－Ｏ－ＣＨ２－）及びメチレンヒドラジノ結合；スルホナート及びスルホンアミド結合；アミド結合；並びに混合されたＮ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２構成要素部分を有する他のものが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、修飾ヌクレオシド間結合は、米国特許第５，５３９，０８２号明細書；米国特許第５，７１４，３３１号明細書；及び米国特許第５，７１９，２６２号明細書に記載されているものなどの、ペプチド核酸又はＰＮＡを生成するためのペプチドベースの結合（例えば、アミノエチルグリシン）である。本発明のＲＮＡｉコンストラクトにおいて使用され得る他の好適な修飾されたヌクレオチド間及びヌクレオシド間結合は、米国特許第６，６９３，１８７号明細書、同第９，１８１，５５１号明細書、米国特許出願公開第２０１６／０１２２７６１号明細書、及びＤｅｌｅａｖｅｙ ａｎｄ Ｄａｍｈａ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１９：９３７－９５４，２０１２に記載され、これらの文献は、全て参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

特定の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、１つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。ホスホロチオエートヌクレオチド間結合は、ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖、アンチセンス鎖又は両方の鎖に存在し得る。例えば、いくつかの実施形態では、センス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８個以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。他の実施形態では、アンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８個以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。さらに他の実施形態では、両方の鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８個以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖、アンチセンス鎖又は両方の鎖の３’末端、５’末端又は３’末端及び５’末端の両方に１つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み得る。例えば、特定の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖、アンチセンス鎖、又は双方の鎖の３’末端に約１個～約６個以上（例えば、約１、２、３、４、５、６個以上）の連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。他の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の鎖の５’末端に約１個～約６個以上（例えば、約１、２、３、４、５、６個以上）の連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖の３’末端に単一のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、且つアンチセンス鎖の３’末端に単一のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合（すなわちアンチセンス鎖の３’末端における第１及び第２のヌクレオチド間結合でのホスホロチオエートヌクレオチド間結合）を含む。別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端及び５’末端の両方に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。さらに別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端及び５’末端の両方に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、且つセンス鎖の５’末端に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。さらに別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端及び５’末端の両方に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、且つセンス鎖の３’末端及び５’末端の両方に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を（すなわちアンチセンス鎖の５’末端及び３’末端の両方において第１及び第２のヌクレオチド間結合でのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、且つセンス鎖の５’末端及び３’末端の両方において第１及び第２のヌクレオチド間結合でのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を）含む。一方又は両方の鎖が１つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む実施形態のいずれかでは、鎖内の残りのヌクレオチド間結合は、天然の３’－５’ホスホジエステル結合であり得る。例えば、いくつかの実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖の各ヌクレオチド間結合は、ホスホジエステル及びホスホロチオエートから選択され、少なくとも１つのヌクレオチド間結合がホスホロチオエートである。

ＲＮＡｉコンストラクトがヌクレオチドオーバーハングを含む実施形態では、オーバーハング内の不対ヌクレオチドの２個以上がホスホロチオエートヌクレオチド間結合によって連結され得る。特定の実施形態では、アンチセンス鎖及び／又はセンス鎖の３’末端のヌクレオチドオーバーハングにおける全ての不対ヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合によって連結されている。他の実施形態では、アンチセンス鎖及び／又はセンス鎖の５’末端のヌクレオチドオーバーハングにおける全ての不対ヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合によって連結されている。さらに他の実施形態では、あらゆるヌクレオチドオーバーハングにおける全ての不対ヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合によって連結されている。

特定の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトの鎖の一方又は両方に組み込まれる修飾ヌクレオチドは、核酸塩基（本明細書で「塩基」とも称される）の修飾を有する。「修飾核酸塩基」又は「修飾塩基」は、天然に存在するプリン塩基であるアデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）並びにピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）以外の塩基を指す。修飾核酸塩基は、合成的な修飾又は天然に存在する修飾であってもよく、以下に限定されないが、ユニバーサル塩基、５ーメチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン（Ｘ）、ヒポキサンチン（Ｉ）、２－アミノアデニン、６－メチルアデニン、６－メチルグアニン、並びにアデニン及びグアニンの他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２－プロピル並びに他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミン及び２－チオシトシン、５－ハロウラシル及びシトシン、５－プロピニルウラシル及びシトシン、６－アゾウラシル、シトシン及びチミン、５－ウラシル（シュードウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオ、８－チオアルキル、８－ヒドロキシル及び他の８－置換アデニン及びグアニン、５－ハロ、特に５－ブロモ、５－トリフルオロメチル及び他の５－置換ウラシル及びシトシン、７－メチルグアニン及び７－メチルアデニン、８－アザグアニン及び８－アザアデニン、７－デアザグアニン及び７－デアザアデニン並びに３－デアザグアニン及び３－デアザアデニン、並びに脱塩基残基（プリン塩基又はピリミジン塩基がなく、リボース糖の１位に核酸塩基がないアプリン／アピリミジン残基）、並びに反転ヌクレオチド（３’－３’結合を有するヌクレオチドであり、上述のいずれかの反転ヌクレオチド、例えば反転脱塩基ヌクレオチド及び反転デオキシヌクレオチドであり得る）が挙げられる。

いくつかの実施形態では、修飾塩基は、ユニバーサル塩基である。「ユニバーサル塩基」は、結果として生じる二重鎖領域の二重らせん構造を変えることなく、ＲＮＡ及びＤＮＡの天然の塩基の全てと無差別に塩基対を形成する塩基類似体を指す。ユニバーサル塩基は、当業者に知られており、例えばイノシン、Ｃ－フェニル、Ｃ－ナフチル及び他の芳香族誘導体、アゾールカルボキサミド並びに３－ニトロピロール、４－ニトロインドール、５－ニトロインドール及び６－ニトロインドールなどのニトロアゾール誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明のＲＮＡｉコンストラクトに組み込むことができる他の好適な修飾塩基は、Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．，Ｖｏｌ．１０：２９７－３１０，２０００及びＰｅａｃｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｒｎ．，Ｖｏｌ．７６：７２９５－７３００，２０１１に記載されているものを含み、これらの文献の両方は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。グアニン、シトシン、アデニン、チミン、及びウラシルは、上述の修飾核酸塩基などの他の核酸塩基により、そのような置換核酸塩基を有するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの塩基対特性を実質的に変えることなく置換され得ることを当業者は十分に認識している。

本発明のＲＮＡｉコンストラクトのいくつかの実施形態では、センス鎖、アンチセンス鎖、又はアンチセンス鎖及びセンス鎖の両方の５’末端は、ホスフェート部分を含む。本明細書で使用する場合、用語「ホスフェート部分」は、非修飾ホスフェート（－Ｏ－Ｐ＝Ｏ）（ＯＨ）ＯＨ）及び修飾ホスフェートを含む末端ホスフェート基を指す。修飾ホスフェートは、Ｏ及びＯＨ基の１つ以上がＨ、Ｏ、Ｓ、Ｎ（Ｒ）又はアルキルで置換されており、ＲがＨ、アミノ保護基又は非置換若しくは置換アルキルであるホスフェートを含む。例示的なホスフェート部分としては、５’－モノホスフェート；５’ジホスフェート；５’－トリホスフェート；５’－グアノシンキャップ（７－メチル化若しくは非メチル化）；５’－アデノシンキャップ又は任意の他の修飾若しくは非修飾ヌクレオチドキャップ構造；５’－モノチオホスフェート（ホスホロチオエート）；５’－モノジチオホスフェート（ホスホロジチオエート）；５’－α－チオトリホスフェート；５’－γ－チオトリホスフェート；５’－ホスホロアミダート；５’－ビニルホスフェート；５’－アルキルホスホナート（例えば、アルキル＝メチル、エチル、イソプロピル、プロピルなど）；及び５’－アルキルエーテルホスホナート（例えば、アルキルエーテル＝メトキシメチル、エトキシメチルなど）が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明のＲＮＡｉコンストラクトに組み込むことができる修飾ヌクレオチドは、本明細書に記載の２つ以上の化学修飾を有し得る。例えば、修飾ヌクレオチドは、リボース糖への修飾及び核酸塩基への修飾を有し得る。例として、修飾ヌクレオチドは、２’糖修飾（例えば、２’－フルオロ又は２’－メチル）を含み得、修飾塩基（例えば、５－メチルシトシン又はシュードウラシル）を含み得る。他の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、５’ホスフェートへの修飾と組み合わされた糖修飾を含んでもよく、これにより、修飾ヌクレオチドがポリヌクレオチドに組み込まれたときに、修飾されたヌクレオチド間又はヌクレオシド間結合を生成することになる。例えば、いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、糖修飾、例えば２’－フルオロ修飾、２’－Ｏ－メチル修飾又は二環式糖修飾及び５’ホスホロチオエート基を含み得る。従って、いくつかの実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトの一方又は両方の鎖は、２’修飾ヌクレオチド又はＢＮＡ及びホスホロチオエートヌクレオチド間結合の組み合わせを含む。特定の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方は、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド及びホスホロチオエートヌクレオチド間結合の組み合わせを含む。修飾ヌクレオチド及び修飾ヌクレオチド間結合を含む例示的なＲＮＡｉコンストラクトを表２に示す。

ＲＮＡｉコンストラクトの機能
好ましくは、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、細胞内、特に肝臓細胞におけるＨＳＤ１７Ｂ１３の発現を低減又は阻害する。従って、一実施形態では、本発明は、細胞を本明細書に記載の任意のＲＮＡｉコンストラクトと接触させることにより、細胞のＨＳＤ１７Ｂ１３発現を低減する方法を提供する。細胞は、インビトロ又はインビボであり得る。ＨＳＤ１７Ｂ１３の発現は、ＨＳＤ１７Ｂ１３のｍＲＮＡ、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質又はＨＳＤ１７Ｂ１３発現と関連する別のバイオマーカーの量又はレベルを測定することによって評価することができる。本発明のＲＮＡｉコンストラクトで処置された細胞又は動物におけるＨＳＤ１７Ｂ１３発現の低減は、ＲＮＡｉコンストラクトで処置されていないか又は対照ＲＮＡｉコンストラクトで処置された細胞又は動物におけるＨＳＤ１７Ｂ１３発現と比較して決定することができる。例えば、いくつかの実施形態では、ＨＳＤ１７Ｂ１３発現の低減は、（ａ）本発明のＲＮＡｉコンストラクトで処置された肝臓細胞におけるＨＳＤ１７Ｂ１３のｍＲＮＡの量又はレベルを測定すること、（ｂ）対照ＲＮＡｉコンストラクト（例えば、肝臓細胞に発現しないＲＮＡ分子又はナンセンス配列若しくはスクランブル配列を有するＲＮＡｉコンストラクトを対象とするＲＮＡｉコンストラクト）又はコンストラクトなしで処置された肝臓細胞におけるＨＳＤ１７Ｂ１３のｍＲＮＡの量又はレベルを測定すること、及び（ｃ）（ａ）において処置された細胞から測定されたＨＳＤ１７Ｂ１３のｍＲＮＡレベルと、（ｂ）における対照細胞から測定されたＨＳＤ１７Ｂ１３のｍＲＮＡレベルとを比較することによって評価される。比較前に、処置された細胞及び対照細胞におけるＨＳＤ１７Ｂ１３のｍＲＮＡレベルを、対照遺伝子（例えば、１８Ｓ リボソームＲＮＡ）のＲＮＡレベルに対して正規化してもよい。ＨＳＤ１７Ｂ１３のｍＲＮＡレベルは、ノーザンブロット分析、ヌクレアーゼプロテクションアッセイ、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、逆転写酵素（ＲＴ）－ＰＣＲ、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ、定量ＰＣＲなどを含む様々な方法によって測定することができる。

他の実施形態では、ＨＳＤ１７Ｂ１３発現の低減は、（ａ）本発明のＲＮＡｉコンストラクトで処置された肝臓細胞におけるＨＳＤ１７Ｂ１３のタンパク質の量又はレベルを測定すること、（ｂ）対照ＲＮＡｉコンストラクト（例えば、肝臓細胞に発現しないＲＮＡ分子又はナンセンス配列若しくはスクランブル配列を有するＲＮＡｉコンストラクトを対象とするＲＮＡｉコンストラクト）又はコンストラクトなしで処置された肝臓細胞におけるＨＳＤ１７Ｂ１３のタンパク質の量又はレベルを測定すること、及び（ｃ）（ａ）において処置された細胞から測定されたＨＳＤ１７Ｂ１３のタンパク質レベルと、（ｂ）における対照細胞から測定されたＨＳＤ１７Ｂ１３のタンパク質レベルとを比較することによって評価される。ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質レベルを測定する方法は、当業者に知られており、例えばウエスタンブロット、イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）及びフローサイトメトリーが挙げられる。ＨＳＤ１７Ｂ１３のタンパク質発現を評価するための例示的なドロップレットデジタルＰＣＲ法を実施例２に記載する。ＨＳＤ１７Ｂ１３のｍＲＮＡ又はタンパク質を測定することができる任意の方法を使用して、本発明のＲＮＡｉコンストラクトの有効性を評価することができる。

いくつかの実施形態では、ＨＳＤ１７Ｂ１３の発現レベルを評価するための方法は、ＨＳＤ１７Ｂ１３を自然に発現する細胞（例えば、肝臓細胞）又はＨＳＤ１７Ｂ１３を発現するように操作された細胞においてインビトロで実施される。特定の実施形態では、本方法は、肝臓細胞においてインビトロで実施される。適切な肝臓細胞としては、初代肝細胞（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、又は齧歯類の肝細胞）、ＨｅｐＡＤ３８細胞、ＨｕＨ－６細胞、ＨｕＨ－７細胞、ＨｕＨ－５－２細胞、ＢＮＬＣＬ２細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞、又はＨｅｐＧ２細胞が挙げられるが、これらに限定されない。

他の実施形態では、ＨＳＤ１７Ｂ１３の発現レベルを評価するための方法は、インビボで実施される。ＲＮＡｉコンストラクト及び任意の対照ＲＮＡｉコンストラクトを動物（例えば、齧歯類又は非ヒト霊長類）に投与することができ、処置後の動物から採取した肝臓組織でＨＳＤ１７Ｂ１３のｍＲＮＡ又はタンパク質レベルを評価することができる。代わりに又は加えて、ＨＳＤ１７Ｂ１３発現と関連するバイオマーカー又は機能的表現型を、処置動物で評価することができる。

特定の実施形態では、ＨＳＤ１７Ｂ１３の発現は、本発明のＲＮＡｉコンストラクトにより、肝臓細胞において少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、又は少なくとも５０％低減する。いくつかの実施形態では、ＨＳＤ１７Ｂ１３の発現は、本発明のＲＮＡｉコンストラクトにより、肝臓細胞において少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、又は少なくとも８５％低減する。他の実施形態では、ＨＳＤ１７Ｂ１３の発現は、本発明のＲＮＡｉコンストラクトにより、肝臓細胞において約９０％以上、例えば９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上低減する。ＨＳＤ１７Ｂ１３発現の低減率は、本明細書に記載の方法のいずれか及び当技術分野で知られる他の方法によって測定することができる。例えば、特定の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、インビトロの初代肝細胞（野生型ＨＳＤ１７Ｂ１３を発現する）において５ｎＭでＨＳＤ１７Ｂ１３発現の少なくとも７０％を阻害する。関連する実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、インビトロにて５ｎＭでＨＳＤ１７Ｂ１３発現の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、又は少なくとも７５％を阻害する。他の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、インビトロの初代肝細胞において５ｎＭでＨＳＤ１７Ｂ１３発現の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％又は少なくとも９８％を阻害する。ＨＳＤ１７Ｂ１３の低減は、実施例２に記載されるように、ＲＮＡ ＦＩＳＨ又はドロップレットデジタルＰＣＲを含む様々な手法を使用して測定することができる。

いくつかの実施形態では、ＩＣ５０値を計算して、肝臓細胞におけるＨＳＤ１７Ｂ１３発現の阻害に対する本発明のＲＮＡｉコンストラクトの効力を評価する。「ＩＣ５０値」は、生物学的又は生化学的機能及びレベルの５０％阻害を達成するのに必要とされる用量／濃度である。特定の任意の物質又はアンタゴニストのＩＣ５０値は、任意のアッセイにおいて、用量反応曲線を構築し、発現レベル又は機能活性に及ぼす種々の濃度の物質又はアンタゴニストの効果を試験することによって決定することができる。最大の生物学的応答又は本来の発現レベルの半分を阻害するのに必要な濃度を決定することにより、所与のアンタゴニスト又は物質のＩＣ５０値を計算することができる。従って、実施例に記載のイムノアッセイ又はＲＮＡ ＦＩＳＨアッセイ又はドロップレットデジタルＰＣＲアッセイなどの任意のアッセイにおいて、肝臓細胞における本来のＨＳＤ１７Ｂ１３発現レベル（例えば、対照肝臓細胞におけるＨＳＤ１７Ｂ１３の発現レベル）の半分を阻害するのに必要とされるＲＮＡｉコンストラクトの濃度を決定することにより、任意のＲＮＡｉコンストラクトのＩＣ５０値を計算することができる。本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、約４０ｎＭ未満のＩＣ５０で肝臓細胞（例えば、初代肝細胞）におけるＨＳＤ１７Ｂ１３発現を阻害し得る。例えば、ＲＮＡｉコンストラクトは、約０．００１ｎＭ～約４０ｎＭ、約０．００１ｎＭ～約３０ｎＭ、約０．００１ｎＭ～約２０ｎＭ、約０．００１ｎＭ～約１５ｎＭ、約０．１ｎＭ～約１０ｎＭ、約０．１ｎＭ～約５ｎＭ、又は約０．１ｎＭ～約１ｎＭのＩＣ５０で肝臓細胞におけるＨＳＤ１７Ｂ１３発現を阻害する。

本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、当技術分野において公知の技術を用いて、例えば従来の核酸固相合成法を用いて容易に作製することができる。ＲＮＡｉコンストラクトのポリヌクレオチドは、標準的なヌクレオチド又はヌクレオシド前駆体（例えば、ホスホラミダイト）を使用して、好適な核酸合成装置で構築することができる。自動核酸合成装置は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）のＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置、ＢｉｏＡｕｔｏｍａｔｉｏｎ（Ｉｒｖｉｎｇ、ＴＸ）のＭｅｒＭａｄｅ合成装置、及びＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）のＯｌｉｇｏＰｉｌｏｔ合成装置を含む、いくつかのベンダーによって市販されている。

リボヌクレオシドの５’位で酸解離性ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）と共に２’シリル保護基を使用して、ホスホラミダイト化学を介してオリゴヌクレオチドを合成することができる。最終脱保護条件は、ＲＮＡ産物を著しく分解しないことが知られている。全ての合成は、大規模、中規模又は小規模で任意の自動又は手動合成装置において行うことができる。合成は、複数のウェルプレート、カラム又はスライドガラスにおいて実行することもできる。

２’－Ｏ－シリル基は、フッ化物イオンに曝露することによって除去することができ、フッ化物イオンは、フッ化物イオンの任意の供給源、例えば無機対イオンと対になるフッ化物イオンを含有する塩、例えばフッ化セシウム及びフッ化カリウム又は有機対イオンと対になるフッ化物イオンを含有する塩、例えばフッ化テトラアルキルアンモニウムを含むことができる。脱保護反応では、クラウンエーテル触媒を無機フッ化物と組み合わせて利用することができる。好ましいフッ化物イオン供給源は、フッ化テトラブチルアンモニウム又はアミンヒドロフルオライド（例えば、双極性非プロトン溶媒、例えばジメチルホルムアミド中でトリエチルアミンと水性ＨＦとを組み合わせる）である。

亜リン酸トリエステル及びホスホトリエステルに使用する保護基を選択することにより、フッ化物に対するトリエステルの安定性を変えることができる。ホスホトリエステル又は亜リン酸トリエステルのメチル保護は、フッ化物イオンに対する結合を安定化させ、且つプロセス収率を向上させることができる。

リボヌクレオシドは、反応性の２’ヒドロキシル置換基を有するため、ＲＮＡにおける反応性の２’位を、５’－Ｏ－ジメトキシトリチル保護基に対して直交性である保護基、例えば酸処理に対して安定であるもので保護することが望ましい場合がある。シリル保護基は、この条件を満たし、且つ最終のフッ化物脱保護工程において容易に除去することができ、これによりＲＮＡ分解を最小限に抑えることができる。

テトラゾール触媒は、標準的なホスホラミダイトカップリング反応に使用することができる。好ましい触媒としては、例えば、テトラゾール、Ｓ－エチル－テトラゾール、ベンジルチオテトラゾール、ｐ－ニトロフェニルテトラゾールが挙げられる。

当業者によって理解され得るように、本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトを合成するさらなる方法が当業者に明らかであろう。加えて、様々な合成工程を代替の順番又は順序で実施して、所望の化合物を得てもよい。本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトの合成において有用な他の合成化学転換、保護基（例えば、塩基に存在するヒドロキシル、アミノなどのための）及び保護基の手法（保護及び脱保護）は、当技術分野で知られており、例えばＲ．Ｌａｒｏｃｋ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９８９）；Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｄ．Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９１）；Ｌ．Ｆｉｅｓｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｆｉｅｓｅｒ，Ｆｉｅｓｅｒ ａｎｄ Ｆｉｅｓｅｒ’ｓ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９４）；及びＬ．Ｐａｑｕｅｔｔｅ，ｅｄ．，Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９５）、並びにそれらの後続版に記載されるものが挙げられる。また、ＲＮＡｉコンストラクトのカスタム合成も、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｉｎｃ．（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＣＯ）、ＡｘｏＬａｂｓ ＧｍｂＨ（Ｋｕｌｍｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）及びＡｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）が挙げられるいくつかの民間のベンダーから利用可能である。

本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、リガンドを含み得る。本明細書で使用する場合、「リガンド」は、別の化合物又は分子と直接的又は間接的に相互作用することができる任意の化合物又は分子を指す。別の化合物又は分子とリガンドとの相互作用は、生物学的応答を誘発し得るか（例えば、シグナル伝達カスケードを惹起する、受容体媒介性のエンドサイトーシスを誘導する）、又はまさに物理的会合であり得る。リガンドは、結合する二本鎖ＲＮＡ分子の１つ以上の特性、例えばＲＮＡ分子の薬力学、薬物動態、結合、吸収、細胞分布、細胞取り込み、電荷及び／又はクリアランス特性を改変することができる。

リガンドは、血清タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン、低密度リポタンパク質、グロブリン）、コレステロール部分、ビタミン（ビオチン、ビタミンＥ、ビタミンＢ１２）、葉酸部分、ステロイド、胆汁酸（例えば、コール酸）、脂肪酸（例えば、パルミチン酸、ミリスチン酸）、炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン若しくはヒアルロン酸）、グリコシド、リン脂質、又は抗体若しくはその結合断片（例えば、肝臓などの特定の細胞型に対するＲＮＡｉコンストラクトを標的化する抗体若しくは結合断片）を含み得る。リガンドの他の例としては、染料、挿入剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、プソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性分子（例えば、アダマンタン酢酸、１－ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３－ビスＯ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３－プロパンジオール、ヘプタデシル基、０３－（オレオイル）リトコール酸、０３－（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル又はフェノキサジン）、ペプチド（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド、ＲＧＤペプチド）、アルキル化剤、ポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えば、ＰＥＧ－４０Ｋ）、ポリアミノ酸及びポリアミン（例えば、スペルミン、スペルミジン）が挙げられる。

特定の実施形態では、リガンドは、エンドソーム不安定化特性を有する。エンドソーム溶解リガンドは、エンドソームの溶解、及び／又は本発明のＲＮＡｉコンストラクト若しくはその構成要素のエンドソームから細胞の細胞質への輸送を促進する。エンドソーム不安定化リガンドは、ｐＨ依存性膜活性及び膜融合性を示すポリカチオンペプチド又はペプチド模倣体であり得る。一実施形態では、エンドソーム不安定化リガンドは、エンドソームのｐＨでその活性型コンフォメーションをとる。「活性型」コンフォメーションは、エンドソーム溶解リガンドが、エンドソームの溶解、及び／又は本発明のＲＮＡｉコンストラクト若しくはその構成要素のエンドソームから細胞の細胞質への輸送を促進するコンフォメーションである。例示的なエンドソーム不安定化リガンドとしては、ＧＡＬＡペプチド（Ｓｕｂｂａｒａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２６：２９６４－２９７２，１９８７）、ＥＡＬＡペプチド（Ｖｏｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｒｎ．Ｓｏｃ．，Ｖｏｌ．１１８：１５８１－１５８６，１９９６）、及びこれらの誘導体（Ｔｕｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，Ｖｏｌ．１５５９：５６－６８，２００２）が挙げられる。一実施形態では、エンドソーム不安定化構成要素は、ｐＨの変化に応答して電荷又はプロトン化に変化を起こすことになる化学基（例えば、アミノ酸）を含有し得る。エンドソーム溶解成分は、直鎖状又は分枝状であってよい。

いくつかの実施形態では、リガンドは、脂質又は他の疎水性分子を含む。一実施形態では、リガンドは、コレステロール部分又は他のステロイドを含む。コレステロールとコンジュゲートしたオリゴヌクレオチドは、コレステロールとコンジュゲートしていないオリゴヌクレオチドよりも活性があることが報告されている（Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｖｏｌ．１２：１０３－２２８，２００２）。核酸分子にコンジュゲートするコレステロール部分及び他の脂質を含むリガンドは、米国特許第７，８５１，６１５号明細書；同第７，７４５，６０８号明細書；及び同第７，８３３，９９２号明細書にも記載されており、これらの文献は、全て参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。別の実施形態では、リガンドは、葉酸部分を含む。葉酸部分にコンジュゲートしているポリヌクレオチドは、受容体依存性エンドサイトーシス経路を介して細胞に取り込まれ得る。そのような葉酸ポリヌクレオチドコンジュゲートは、米国特許第８，１８８，２４７号明細書に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

ＨＳＤ１７Ｂ１３が肝臓細胞（例えば、肝細胞）に発現することを考慮すると、特定の実施形態では、それらの肝臓細胞にＲＮＡｉコンストラクトを特異的に送達することが望ましい。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、肝臓細胞の表面に発現するタンパク質と結合又は相互作用するリガンドを用いることにより、肝臓に特異的に標的化され得る。例えば、特定の実施形態では、リガンドは、肝細胞上に発現する受容体、例えばＡＳＧＲ１に特異的に結合する抗原結合タンパク質（例えば、抗体又はその結合断片（例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ））を含んでもよい。

特定の実施形態では、リガンドは、炭水化物を含む。「炭水化物」は、少なくとも６個の炭素原子（直鎖状、分枝状、又は環状であり得る）を有し、各炭素原子に酸素、窒素、又は硫黄原子が結合されている１つ以上の単糖単位で構成される化合物を指す。炭水化物としては、糖（例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、及び約４、５、６、７、８、又は９個の単糖単位を含有するオリゴ糖）並びに多糖、例えば、デンプン、グリコーゲン、セルロース、及び多糖類ガムが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、リガンドに組み込まれる炭水化物は、ペントース、ヘキソース又はヘプトースから選択される単糖、並びにこのような単糖単位を含む二糖及び三糖である。他の実施形態では、リガンドに組み込まれている炭水化物は、アミノ糖であり、例えば、ガラクトサミン、グルコサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、及びＮ－アセチルグルコサミンである。

いくつかの実施形態では、リガンドは、ヘキソース又はヘキソサミンを含む。ヘキソースは、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、又はフルクトースから選択され得る。ヘキソサミンは、フルクトサミン、ガラクトサミン、グルコサミン、又はマンノサミンから選択され得る。特定の実施形態では、リガンドは、グルコース、ガラクトース、ガラクトサミン、又はグルコサミンを含む。一実施形態では、リガンドは、グルコース、グルコサミン、又はＮ－アセチルグルコサミンを含む。別の実施形態では、リガンドは、ガラクトース、ガラクトサミン、又はＮ－アセチル－ガラクトサミンを含む。特定の実施形態では、リガンドは、Ｎ－アセチル－ガラクトサミンを含む。グルコース、ガラクトース、及びＮ－アセチル－ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を含むリガンドは、化合物を肝臓細胞に標的化するのに特に有効である。例えば、Ｄ’Ｓｏｕｚａ ａｎｄ Ｄｅｖａｒａｊａｎ，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｖｏｌ．２０３：１２６－１３９，２０１５を参照されたい。本発明のＲＮＡｉコンストラクトに組み込むことができるＧａｌＮＡｃ又はガラクトース含有リガンドの例は、米国特許第７，４９１，８０５号明細書；同第８，１０６，０２２号明細書；及び同第８，８７７，９１７号明細書；米国特許出願公開第２００３０１３０１８６号明細書；並びに国際公開第２０１３１６６１５５号パンフレットに記載されており、これらの文献は、全て参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

特定の実施形態では、リガンドは、多価炭水化物部分を含む。本明細書で使用する場合、「多価炭水化物部分」は、独立して他の分子と結合又は相互作用することができる２個以上の炭水化物単位を含む部分を指す。例えば、多価炭水化物部分は、２個以上の異なる分子、又は同じ分子上の２個以上の異なる部位に結合することができる、炭水化物で構成された２個以上の結合ドメインを含む。炭水化物部分の価数は、炭水化物部分内の個々の結合ドメインの数を示す。例えば、炭水化物部分に関する用語「一価」、「二価」、「三価」、及び「四価」は、それぞれ１、２、３、及び４個の結合ドメインを有する炭水化物部分を指す。多価炭水化物部分は、多価ラクトース部分、多価ガラクトース部分、多価グルコース部分、多価Ｎ－アセチル－ガラクトサミン部分、多価Ｎ－アセチル－グルコサミン部分、多価マンノース部分、又は多価フコース部分を含み得る。いくつかの実施形態では、リガンドは、多価ガラクトース部分を含む。他の実施形態では、リガンドは、多価Ｎ－アセチル－ガラクトサミン部分を含む。これら及び他の実施形態では、多価炭水化物部分は、二価、三価、又は四価である。このような実施形態では、多価炭水化物部分は、二分岐又は三分岐であり得る。特定の一実施形態では、多価Ｎ－アセチル－ガラクトサミン部分は、三価又は四価である。別の特定の実施形態では、多価ガラクトース部分は、三価又は四価である。本発明のＲＮＡｉコンストラクトに組み込むための例示的な三価又は四価ＧａｌＮＡｃ含有リガンドを以下に詳述する。

リガンドは、ＲＮＡｉコンストラクトのＲＮＡ分子に直接的又は間接的に結合又はコンジュゲートされ得る。例えば、いくつかの実施形態では、リガンドは、ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖又はアンチセンス鎖に共有結合的に直接結合される。他の実施形態では、リガンドは、ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖又はアンチセンス鎖にリンカーを介して共有結合的に結合される。リガンドは、本発明のＲＮＡｉコンストラクトのポリヌクレオチド（例えば、センス鎖又はアンチセンス鎖）の核酸塩基、糖部分、又はヌクレオチド間結合に結合され得る。プリン核酸塩基又はその誘導体へのコンジュゲーション又は結合は、環内及び環外の原子を含む任意の位置で起こり得る。特定の実施形態では、プリン核酸塩基の２位、６位、７位又は８位がリガンドに結合される。ピリミジン核酸塩基又はその誘導体へのコンジュゲーション又は結合も任意の位置で起こり得る。いくつかの実施形態では、ピリミジン核酸塩基の２位、５位、及び６位がリガンドに結合され得る。ヌクレオチドの糖部分へのコンジュゲーション又は結合は、任意の炭素原子で起こり得る。リガンドに結合され得る糖部分の例示的な炭素原子としては、２’、３’及び５’の炭素原子が挙げられる。１’位も塩基性残基などにおいてリガンドに結合され得る。ヌクレオチド間結合もまた、リガンドの結合を促進することができる。リン含有結合（例えば、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミダートなど）の場合、リガンドは、リン原子に直接結合することができるか、又はリン原子に結合しているＯ原子、Ｎ原子、若しくはＳ原子に結合することができる。アミン含有ヌクレオシド間結合又はアミド含有ヌクレオシド間結合（例えば、ＰＮＡ）では、リガンドは、アミン若しくはアミドの窒素原子又は隣接する炭素原子に結合することができる。

特定の実施形態では、リガンドは、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかの３’又は５’末端に結合され得る。特定の実施形態では、リガンドは、センス鎖の５’末端に共有結合的に結合される。他の実施形態では、リガンドは、センス鎖の３’末端に共有結合的に結合される。例えば、いくつかの実施形態では、リガンドは、センス鎖の３’末端ヌクレオチドに結合される。このような特定の実施形態では、リガンドは、センス鎖の３’末端ヌクレオチドの３’位で結合される。代替的な実施形態では、リガンドは、センス鎖の３’末端近傍であるが、１つ以上の末端ヌクレオチドの前（すなわち１、２、３又は４つの末端ヌクレオチドの前）に結合される。いくつかの実施形態では、リガンドは、センス鎖の３’末端ヌクレオチドの糖の２’位で結合される。

特定の実施形態では、リガンドは、リンカーを介してセンス鎖又はアンチセンス鎖に結合される。「リンカー」は、リガンドをＲＮＡｉコンストラクトのポリヌクレオチド構成要素に共有結合的に結合する原子又は原子団である。リンカーは、約１～約３０原子長、約２～約２８原子長、約３～約２６原子長、約４～約２４原子長、約６～約２０原子長、約７～約２０原子長、約８～約２０原子長、約８～約１８原子長、約１０～約１８原子長、及び約１２～約１８原子長であってよい。いくつかの実施形態では、リンカーは、一般に、２つの官能基を有するアルキル部分を含む二官能性結合部分を含み得る。官能基の一方は、目的の化合物（例えば、ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖又はアンチセンス鎖）に結合するように選択され、他方は、本明細書に記載されるようなリガンドなどの任意の選択された基に実質的に結合するように選択される。特定の実施形態では、リンカーは、エチレングリコール単位又はアミノ酸単位などの繰返し単位からなる鎖構造又はオリゴマーを含む。二官能性結合部分に通常用いられる官能基の例としては、求核性基と反応させるための求電子剤及び求電子性基と反応させるための求核剤が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、二官能性結合部分としては、アミノ、ヒドロキシル、カルボン酸、チオール及び不飽和結合（例えば、二重結合又は三重結合）などが挙げられる。

リガンドを本発明のＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖又はアンチセンス鎖に結合するために使用することのできるリンカーは、ピロリジン、８－アミノ－３，６－ジオキサオクタン酸、スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシラート、６－アミノヘキサン酸、置換Ｃ１～Ｃ１０アルキル、置換若しくは非置換Ｃ２～Ｃ１０アルケニル又は置換若しくは非置換Ｃ２～Ｃ１０アルキニルを含むが、これらに限定されない。このようなリンカーにとって好ましい置換基としては、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル及びアルキニルが挙げられるが、これらに限定されない。

特定の実施形態では、リンカーは、切断可能である。切断可能リンカーは、細胞外部で十分に安定であるが、標的細胞内への進入後に切断されて、リンカーが一体に保持している２つの部分を放出するものである。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、標的細胞中又は第１の参照条件（例えば、細胞内条件を模倣するか、又はそれに相当するように選択され得る）下において、対象の血液中又は第２の参照条件（例えば、血液若しくは血清に見出される条件を模倣するか、又はそれに相当するように選択され得る）下よりも少なくとも１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍若しくは９０倍以上又は少なくとも１００倍速く切断される。

切断可能なリンカーは、切断剤、例えばｐＨ、酸化還元電位又は分解性分子の存在に対して感受性である。一般に、切断剤は、血清又は血液中よりも細胞内部で優勢であるか、又は高いレベル若しくは活性で見出される。このような分解性薬剤の例としては、例えば、細胞内に存在し、還元によって酸化還元切断可能リンカーを分解することができるメルカプタンなどの酸化酵素若しくは還元酵素又は還元剤を含む、特定の基質のために選択されるか、又は基質特異性のない酸化還元剤；エステラーゼ；エンドソーム又は酸性環境を生成することができる薬剤、例えば、５以下のｐＨをもたらすもの；一般的な酸として作用することによって酸切断可能リンカーを加水分解又は分解することができる酵素、ペプチダーゼ（基質特異的であり得る）及びホスファターゼが挙げられる。

切断可能リンカーは、ｐＨに感受性のある部分を含み得る。ヒト血清のｐＨは７．４であるが、平均的な細胞内ｐＨは、わずかにより低く、約７．１～７．３の範囲である。エンドソームは、５．５～６．０の範囲のより酸性のｐＨを有し、リソソームは、およそ５．０のさらにより酸性のｐＨを有する。いくつかのリンカーは、好ましいｐＨで切断され、それによってリガンドから細胞内部に、又は細胞の所望の区画にＲＮＡ分子を放出する切断可能な基を有する。

リンカーは、特定の酵素によって切断可能となる切断可能な基を含み得る。リンカーに組み込まれる切断可能な基の種類は、標的化される細胞に依存し得る。例えば、肝臓標的化リガンドは、エステル基を含むリンカーを介してＲＮＡ分子に結合され得る。肝細胞はエステラーゼに富んでおり、従って、リンカーは、エステラーゼに富んでいない細胞型よりも肝細胞において効率的に切断されることとなる。エステラーゼに富む他の種類の細胞としては、肺、腎皮質、及び精巣の細胞が挙げられる。肝臓細胞及び滑膜細胞などのペプチダーゼに富む細胞を標的化する場合に、ペプチド結合を含有するリンカーを用いることができる。

一般に、切断可能リンカー候補の適合性は、リンカー候補を切断する分解性薬剤の能力（又は条件）を試験することによって評価することができる。また、血液中、又は他の非標的組織と接触する場合の切断に抵抗する能力について、切断可能なリンカー候補を試験することが望ましい。従って、標的細胞内で切断を示すように選択される第１の条件と、他の組織又は体液、例えば血液又は血清内で切断を示すように選択される第２の条件との間で、切断に対する相対的感受性を判断することができる。評価は、無細胞系、細胞、細胞培養物、臓器若しくは組織培養物中で、又は動物全体で実行することができる。無細胞又は培養条件で初期評価を行い、さらに動物全体で評価することによって確認することが有用であり得る。いくつかの実施形態では、有用なリンカー候補は、血液又は血清（又は細胞外条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下）と比較して、標的細胞（又は細胞内条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下）において少なくとも２倍、４倍、１０倍、２０倍、５０倍、７０倍又は１００倍速く切断される。

他の実施形態では、酸化還元切断可能リンカーが使用される。酸化還元切断可能リンカーは、還元又は酸化されると切断される。還元的に切断可能な基の一例は、ジスルフィド連結基（－Ｓ－Ｓ－）である。切断可能なリンカー候補が、好適な「還元的に切断可能なリンカー」であるか、又は例えば特定のＲＮＡｉコンストラクト及び特定のリガンドに使用するのに好適であるかを判断するのに、本明細書に記載される１つ以上の方法を用いることができる。例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）又は細胞、例えば標的細胞中で観察されるであろう切断速度を模倣する、当技術分野で知られている他の還元剤と共にインキュベーションすることにより、リンカー候補を評価することができる。リンカー候補は、血液条件又は血清条件を模倣するように選択された条件下で評価することもできる。特定の実施形態では、リンカー候補は、血液中で最大１０％切断される。他の実施形態では、有用なリンカー候補は、細胞（又は細胞内条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下）において、血液（又は細胞外条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下）と比較して少なくとも２倍、４倍、１０倍、２０倍、５０倍、７０倍、又は１００倍速く分解される。

さらに他の実施形態では、ホスフェート系の切断可能リンカーは、ホスフェート基を分解又は加水分解する薬剤によって切断される。細胞内でホスフェート基を加水分解する薬剤の例としては、細胞内のホスファターゼなどの酵素がある。ホスフェート系の切断可能な基の例は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＳＲｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｓ－である。特定の実施形態としては、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＳＨ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｓ－、－ＳＰ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｓ－が挙げられる。別の特定の実施形態は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－である。これらのリンカー候補は、上記に記載されるものに類似する方法を用いて評価することができる。

他の実施形態では、リンカーは、酸性条件下で切断される基である、酸切断可能な基を含み得る。いくつかの実施形態では、酸切断可能な基は、ｐＨ約６．５以下（例えば、約６．０、５．５、５．０又はそれを下回る）の酸性環境において、又は一般酸として作用し得る酵素などの薬剤によって切断される。細胞内では、エンドソーム及びリソソームなどの特定の低ｐＨオルガネラが、酸切断可能な基に切断環境を提供することができる。酸切断可能な結合基の例としては、ヒドラゾン、エステル及びアミノ酸のエステルが挙げられるが、これらに限定されない。酸切断可能な基は、一般式－Ｃ＝ＮＮ－、Ｃ（Ｏ）Ｏ又は－ＯＣ（Ｏ）を有し得る。特定の実施形態は、エステルの酸素に結合された炭素（アルコキシ基）が、アリール基、置換アルキル基又は三級アルキル基、例えばジメチル、ペンチル又はｔ－ブチルである場合である。これらの候補は、上記に記載したものに類似する方法を用いて評価することができる。

他の実施形態では、リンカーは、細胞中のエステラーゼ及びアミダーゼなどの酵素によって切断されるエステル系の切断可能な基を含み得る。エステル系の切断可能な基の例としては、アルキレン、アルケニレン及びアルキニレン基のエステルが挙げられるが、これらに限定されない。エステルの切断可能な基は、一般式－Ｃ（Ｏ）Ｏ－又は－ＯＣ（Ｏ）－を有する。これらのリンカー候補は、上記に記載されるものに類似する方法を用いて評価することができる。

さらなる実施形態では、リンカーは、細胞中のペプチダーゼ及びプロテアーゼなどの酵素によって切断されるペプチド系の切断可能な基を含み得る。ペプチド系の切断可能な基は、オリゴペプチド（例えば、ジペプチド、トリペプチドなど）及びポリペプチドを生じるような、アミノ酸間で形成されたペプチド結合である。ペプチド系の切断可能な基は、アミド基（－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－）を含まない。アミド基は、あらゆるアルキレン、アルケニレン又はアルキニレン間で形成され得る。ペプチド結合は、ペプチド及びタンパク質を生じるような、アミノ酸間で形成される特殊なタイプのアミド結合である。ペプチド系の切断基は、一般に、アミノ酸間で形成されてペプチド及びタンパク質を生じるペプチド結合（すなわちアミド結合）に限定され、アミド官能基全体を含むわけではない。ペプチド系の切断可能な連結基は、一般式－ＮＨＣＨＲＡＣ（Ｏ）ＮＨＣＨＲＢＣ（Ｏ）－を有し、式中、ＲＡ及びＲＢは、２つの隣接するアミノ酸のＲ基である。これらの候補は、上記に記載したものに類似する方法を用いて評価することができる。

リガンドを本発明のＲＮＡｉコンストラクトにおけるセンス鎖又はアンチセンス鎖に結合するのに好適な他の種類のリンカーが当技術分野で知られており、米国特許第７，７２３，５０９号明細書；同第８，０１７，７６２号明細書；同第８，８２８，９５６号明細書；同第８，８７７，９１７号明細書；及び同第９，１８１，５５１号明細書に記載されるリンカーを含むことができ、これらの文献は、全て参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

特定の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖又はアンチセンス鎖に共有結合的に結合されるリガンドは、ＧａｌＮＡｃ部分、例えば多価のＧａｌＮＡｃ部分を含む。いくつかの実施形態では、多価のＧａｌＮＡｃ部分は、三価のＧａｌＮＡｃ部分であり、且つセンス鎖の３’末端に結合される。他の実施形態では、多価のＧａｌＮＡｃ部分は、三価のＧａｌＮＡｃ部分であり、且つセンス鎖の５’末端に結合される。さらに他の実施形態では、多価のＧａｌＮＡｃ部分は、四価のＧａｌＮＡｃ部分であり、且つセンス鎖の３’末端に結合される。さらに他の実施形態では、多価のＧａｌＮＡｃ部分は、四価のＧａｌＮＡｃ部分であり、且つセンス鎖の５’末端に結合される。さらに他の実施形態では、多価のＧａｌＮＡｃ部分は、四価のＧａｌＮＡｃ部分であり、且つセンス鎖の３’末端に結合される。さらに他の実施形態では、多価のＧａｌＮＡｃ部分は、四価のＧａｌＮＡｃ部分であり、且つセンス鎖の５’末端に結合される。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ部分は、配列番号１～６４５又は６４７～１２９１の奇数の配列のセンス鎖の５’末端に結合される。

いくつかの実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、ＲＮＡｉコンストラクトの細胞内発現をコードし、且つ制御するベクターを投与することにより、目的の細胞又は組織に送達され得る。「ベクター」（本明細書では「発現ベクター」とも称される）は、目的の核酸を細胞の内部に送達するために使用することができる物質の組成物である。多数のベクターが当技術分野で知られており、線状ポリヌクレオチド、イオン性又は両親媒性化合物と結合したポリヌクレオチド、プラスミド及びウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。従って、用語「ベクター」は、自律的に複製するプラスミド又はウイルスを含む。ウイルスベクターの例としては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター及びレトロウイルスベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。ベクターは、生細胞内で複製されてもよいし、合成的に作製されてもよい。

一般に、本発明のＲＮＡｉコンストラクトを発現するためのベクターは、ＲＮＡｉコンストラクトをコードする配列に作動可能に連結された１つ以上のプロモーターを含むことになる。本明細書で使用する場合、語句「作動可能に連結」又は「転写制御下」は、プロモーターが適切な位置及びポリヌクレオチド配列に対して適切な向きにあり、ＲＮＡポリメラーゼによる転写の開始及びポリヌクレオチド配列の発現を制御することを意味する。「プロモーター」は、細胞の合成機構、又は導入された合成機構によって認識される、遺伝子配列の特異的転写を開始するのに必要とされる配列を指す。適切なプロモーターとしては、ＲＮＡ ｐｏｌ Ｉ、ｐｏｌ ＩＩ、Ｈ１、又はＵ６ ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩ、及びウイルスプロモーター（例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、及びラウス肉腫ウイルスの長い末端反復）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、Ｈ１又はＵ６ ＲＮＡ ｐｏｌＩＩＩプロモーターが好ましい。当該プロモーターは、組織特異的プロモーターであってもよく、又は誘導性プロモーターであってもよい。特に興味深いのは、ヒトα１－アンチトリプシン遺伝子、アルブミン遺伝子、ヘモペキシン遺伝子、及び肝性リパーゼ遺伝子由来のプロモーター配列などの肝臓特異的なプロモーターである。誘導性プロモーターとしては、エクジソン、エストロゲン、プロゲステロン、テトラサイクリン、及びイソプロピル－ＰＤ１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）によって調節されるプロモーターが挙げられる。

ＲＮＡｉコンストラクトがｓｉＲＮＡを含むいくつかの実施形態では、別々の２つの鎖（センス鎖及びアンチセンス鎖）を、単一のベクターか、又は別々の２つのベクターから発現させることができる。例えば、一実施形態では、センス鎖をコードする配列は、第１のベクターのプロモーターに作動可能に連結され、アンチセンス鎖をコードする配列は、第２のベクターのプロモーターに作動可能に連結される。このような実施形態では、第１及び第２のベクターは、例えば、感染又はトランスフェクションによって標的細胞に同時に導入され、その結果、センス鎖及びアンチセンス鎖が転写されると、細胞内でハイブリダイズしてｓｉＲＮＡ分子を形成することになる。別の実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖は、単一のベクター内に位置する２つの別個のプロモーターから転写される。いくつかのこのような実施形態では、センス鎖をコードする配列は、第１のプロモーターに作動可能に連結され、アンチセンス鎖をコードする配列は、第２のプロモーターに作動可能に連結され、第１及び第２のプロモーターは、単一のベクター内に配置される。一実施形態では、ベクターは、ｓｉＲＮＡ分子をコードする配列に作動可能に連結される第１のプロモーターと、同じ配列に逆方向で作動可能に連結される第２のプロモーターとを含み、その結果、第１のプロモーターからの配列の転写がｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖の合成をもたらし、第２のプロモーターからの配列の転写がｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖の合成をもたらす。

ＲＮＡｉコンストラクトがｓｈＲＮＡを含む他の実施形態では、単一の少なくとも部分的に自己相補的ＲＮＡ分子をコードする配列が、単一の転写物を生成するプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡをコードする配列は、リンカーポリヌクレオチド配列によって結合される逆方向反復を含み、転写後にｓｈＲＮＡのステム及びループ構造を生成する。

いくつかの実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトをコードするベクターは、ウイルスベクターである。本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトを発現するのに好適な種々のウイルスベクター系としては、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター、モロニーマウス白血病ウイルス）、アデノ随伴ウイルスベクター；単純ヘルペスウイルスベクター；ＳＶ４０ベクター；ポリオーマウイルスベクター；パピローマウイルスベクター；ピコルナウイルスベクター；及びポックスウイルスベクター（例えば、ワクシニアウイルス）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）である。

本発明に用いるのに好適な様々なベクター、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ分子をコードする核酸配列をベクターに挿入する方法及びベクターを目的の細胞に送達する方法は、当業者の技術の範囲内である。例えば、全て参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｄｏｒｎｂｕｒｇ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ．，Ｖｏｌ．２：３０１－３１０，１９９５；Ｅｇｌｉｔｉｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｖｏｌ．６：６０８－６１４，１９８８；Ｍｉｌｌｅｒ，ＨｕｍＧｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ．，Ｖｏｌ．１：５－１４，１９９０；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３９２：２５－３０，１９９８；Ｒｕｂｉｎｓｏｎ Ｄ Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ．，Ｖｏｌ．３３：４０１－４０６，２００３；Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２９６：５５０－５５３，２００２；Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．２：２４３－２４７，２００２；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，Ｖｏｌ．２０：５００－５０５，２００２；Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，Ｖｏｌ．２０：４９７－５００，２００２；Ｐａｄｄｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＧｅｎｅｓＤｅｖ，Ｖｏｌ．１６：９４８－９５８，２００２；Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，Ｖｏｌ．２０：５０５－５０８，２００２；Ｓｕｉ ｅｔ ａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９９：５５１５－５５２０，２００２；及びＹｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９９：６０４７－６０５２，２００２を参照されたい。

本発明はまた、本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクト及び薬学的に許容される担体、賦形剤、又は希釈剤を含む医薬組成物及び製剤を含む。このような組成物及び製剤は、それを必要とする対象のＨＳＤ１７Ｂ１３の発現を低減させるのに有用である。臨床上の用途が想定される場合、医薬組成物及び製剤は、目的の用途に適切な形態で調製される。一般に、このことは、パイロジェンだけでなく、ヒト又は動物に有害となる可能性のある他の不純物も実質的に含まない組成物の調製を伴う。

語句「薬学的に許容される」又は「薬理学的に許容される」は、動物又はヒトに投与される場合に、有害反応、アレルギー性反応又は他の不都合な反応をもたらさない分子実体及び組成物を指す。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤」には、ヒトに投与するのに好適な薬剤などの医薬の製剤化に用いるのに許容される溶媒、緩衝液、溶液、分散媒体、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤並びに吸収遅延剤などが含まれる。薬学的に活性な物質に対するこのような媒体及び薬剤の使用は、当技術分野でよく知られている。従来のあらゆる媒体又は薬剤が、本発明のＲＮＡｉコンストラクトと適合しない場合を除いて、治療組成物に使用されることが意図される。補助的な活性成分もまた、それらが組成物のベクター又はＲＮＡｉコンストラクトを不活化しないことを条件として、組成物中に組み込まれ得る。

医薬組成物の製剤の組成及び方法は、投与経路、治療される疾患若しくは障害の種類及び程度又は投与される用量を含むがこれらに限定されない、いくつかの条件に依存する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、意図する送達経路に基づいて製剤化される。例えば、特定の実施形態では、医薬組成物は、非経口送達用に製剤化される。非経口の送達形態としては、静脈内、動脈内、皮下、髄腔内、腹腔内又は筋肉内の注射又は注入が挙げられる。一実施形態では、医薬組成物は、静脈内送達用に製剤化される。このような実施形態では、医薬組成物は、脂質ベースの送達ビヒクルを含み得る。別の実施形態では、医薬組成物は、皮下送達用に製剤化される。このような実施形態では、医薬組成物は、標的化リガンド（例えば、本明細書に記載のＧａｌＮＡｃ含有リガンド）を含み得る。

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトの有効量を含む。「有効量」は、有利な、又は所望の臨床結果をもたらすのに十分な量である。いくつかの実施形態では、有効量は、対象の肝細胞におけるＨＳＤ１７Ｂ１３発現を低減するのに十分な量である。いくつかの実施形態では、有効量は、ＨＳＤ１７Ｂ１３発現を、例えばヒトヘテロ接合体における野生型ＨＳＤ１７Ｂ１３アレルの発現に相当するレベルまで部分的にのみ低減するのに十分な量であり得る。

本発明のＲＮＡｉコンストラクトの有効量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０５ｍｇ／ｋｇ体重～約７５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重～約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ／ｋｇ～約３０ｍｇ／ｋｇ体重、約２．５ｍｇ／ｋｇ体重～約２０ｍｇ／ｋｇ体重、又は約５ｍｇ／ｋｇ体重～約１５ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。特定の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトの単回の有効量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ又は約１０ｍｇ／ｋｇであり得る。有効量のＲＮＡｉコンストラクトを含む医薬組成物は、毎週、隔週、毎月、四半期毎又は半年毎に投与され得る。有効であると考えられる投与量及び投与頻度を正確に決定することは、患者の大きさ、年齢及び全身状態、処置する障害の種類（例えば、心筋梗塞、心不全、冠動脈疾患、高コレステロール血症）、使用される特定のＲＮＡｉコンストラクト並びに投与経路を含むいくつかの要因に基づき得る。本発明の特定のあらゆるＲＮＡｉコンストラクトの有効投薬量及びインビボ半減期の推定値は、従来の方法及び／又は適切な動物モデルにおける試験を用いて確認することができる。

本発明の医薬組成物の投与は、標的組織がその経路を介して利用できる限り、任意の一般的な経路を介するものであり得る。このような経路としては、非経口（例えば、皮下、筋肉内、腹腔内又は静脈内）、経口、経鼻、頬側、皮内、経皮及び舌下経路又は肝臓組織への直接注射若しくは肝門脈を介する送達が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、非経口投与される。例えば、特定の実施形態では、医薬組成物は、静脈内投与される。他の実施形態では、医薬組成物は、皮下投与される。

水中油型エマルション、ミセル、混合ミセル及びリポソームを含む、高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ及び脂質ベースのなどのコロイド分散系を、本発明のＲＮＡｉコンストラクト又はそのようなコンストラクトをコードするベクターの送達ビヒクルとして使用してもよい。本発明の核酸の送達に好適な市販の脂肪エマルションとしては、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（登録商標）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（登録商標）ＩＩ、Ｌｉｐｏｓｙｎ（登録商標）ＩＩＩ、Ｎｕｔｒｉｌｉｐｉｄ及び他の類似の脂肪エマルションが挙げられる。インビボにおける送達ビヒクルとして使用するための好ましいコロイド系は、リポソーム（すなわち人工膜小胞）である。本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、リポソーム内に封入され得るか、又はリポソーム、特にカチオン性リポソームと複合体を形成し得る。或いは、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、脂質、特にカチオン性脂質と複合体を形成し得る。好適な脂質及びリポソームとしては、中性（例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、及びジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン）、陰性（例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ））、並びにカチオン性（例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピル（ＤＯＴＡＰ）及びジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＴＭＡ））が挙げられる。このようなコロイド分散系の調製及び使用は、当技術分野においてよく知られている。例示的な製剤は、米国特許第５，９８１，５０５号明細書、米国特許第６，２１７，９００号明細書；米国特許第６，３８３，５１２号明細書；米国特許第５，７８３，５６５号明細書；米国特許第７，２０２，２２７号明細書；米国特許第６，３７９，９６５号明細書；米国特許第６，１２７，１７０号明細書；米国特許第５，８３７，５３３号明細書；米国特許６，７４７，０１４号明細書、及び国際公開第０３／０９３４４９号パンフレットにも開示されている。

いくつかの実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、脂質製剤に完全に封入されて、例えばＳＰＬＰ、ｐＳＰＬＰ、ＳＮＡＬＰ、又は他の核酸－脂質粒子を形成する。本明細書で使用する場合、用語「ＳＮＡＬＰ」は、ＳＰＬＰを含む安定な核酸－脂質粒子を指す。本明細書で使用する場合、用語「ＳＰＬＰ」は、脂質小胞に封入されたプラスミドＤＮＡを含む核酸－脂質粒子を指す。ＳＮＡＬＰ及びＳＰＬＰは通常、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、及び粒子の凝集を防ぐ脂質（例えば、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート）を含有する。ＳＮＡＬＰ及びＳＰＬＰは、静脈内注射後に長期間の循環寿命を示し、且つ遠位部位（例えば、投与部位から物理的に離れた部位）に蓄積するため、全身投与に極めて有用である。ＳＰＬＰとしては、国際公開第００／０３６８３号パンフレットに記載される、封入された縮合剤－核酸複合体を含む「ｐＳＰＬＰ」が挙げられる。核酸－脂質粒子は、典型的には、平均直径が約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約６０ｎｍ～約１３０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１１０ｎｍ又は約７０ｎｍ～約９０ｎｍであり、実質的に非毒性である。加えて、核酸－脂質粒子中に存在する場合の核酸は、水溶液中でヌクレアーゼによる分解に対して耐性がある。核酸－脂質粒子及びその調製方法は、例えば、米国特許第５，９７６，５６７号明細書；同第５，９８１，５０１号明細書；同第６，５３４，４８４号明細書；同第６，５８６，４１０号明細書；同第６，８１５，４３２号明細書；及び国際公開第９６／４０９６４号パンフレットに開示されている。

注射用途に好適な医薬組成物は、例えば、滅菌水溶液又は分散体及び注射用滅菌溶液又は分散体の即時調製のための滅菌粉末を含む。一般に、これらの調製物は、滅菌済みであり、容易に注射可能である程度の流体である。調製物は、製造及び保存条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されていなければならない。適切な溶媒又は分散媒は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、これらの好適な混合液及び植物油を含有してもよい。例えば、レシチンなどのコーティングを使用することにより、分散体の場合に必要とされる粒径を維持することにより、及び界面活性剤を使用することにより、適切な流動性を維持することができる。微生物作用の予防は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、及びチメロサールによってもたらすことができる。多くの場合、等張剤、例えば糖又は塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延する剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物中で使用することによってもたらすことができる。

滅菌注射溶液は、活性化合物を適切な量で所望の（例えば、上記に列挙したような）他の任意の成分と共に溶媒中に加えた後に、濾過滅菌することによって調製してもよい。一般的に、分散体は、塩基性分散媒体及び所望の他の成分、例えば上記で列挙された成分を含有する滅菌ビヒクル中に、滅菌された様々な活性成分を組み込むことによって調製される。注射用滅菌溶液の調製用の滅菌粉末の場合、好ましい調製方法としては、活性成分に加えて追加の所望の任意の成分の粉末を予め滅菌濾過されたそれらの溶液から生じさせる、真空乾燥及び凍結乾燥の技術が挙げられる。

本発明の組成物は、一般に、中性又は塩形態で製剤化され得る。薬学的に許容される塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸若しくはリン酸）又は有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、及びマンデル酸など）から誘導される酸付加塩（遊離アミノ基により形成される）が挙げられる。遊離カルボキシル基と共に形成される塩は、無機塩基（例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、若しくは水酸化第二鉄）から誘導することもでき、又は有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなど）から誘導することもできる。

水溶液における非経口投与のために、例えば、溶液は、通常、適切に緩衝化され、液体希釈剤は、例えば、十分な生理食塩水又はグルコースにより最初に等張にされる。このような水溶液を、例えば、静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内投与に使用してもよい。特に本開示を考慮すれば、当業者に知られているような滅菌水性媒体を使用することが好ましい。実例として、単回用量を等張ＮａＣｌ溶液１ｍｌ中に溶解し、皮下注入液１０００ｍｌに添加してもよく、又は提示された注入部位に注射してもよい（例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”１５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐａｇｅｓ １０３５－１０３８ ａｎｄ １５７０－１５８０を参照されたい）。ヒトに投与する場合、調製物は、ＦＤＡ基準に要求される無菌性、発熱性、一般的安全性及び純度の基準を満たさなければならない。特定の実施形態では、本発明の医薬組成物は、滅菌生理食塩水及び本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトを含むか又はそれらからなる。他の実施形態では、本発明の医薬組成物は、本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクト及び滅菌水（例えば、注射用水、ＷＦＩ）を含むか又はそれらからなる。さらに他の実施形態では、本発明の医薬組成物は、本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクト及びリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含むか又はそれらからなる。

いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、投与用デバイスでパッケージ化されるか又はその中に保存される。注射製剤用のデバイスとしては、注射ポート、プレフィルドシリンジ、自動注入装置、注射ポンプ、装着型注射器、及び注射ペンが挙げられるが、これらに限定されない。エアロゾル化製剤又は粉末製剤用のデバイスとしては、インヘラー、吸入器、吸引器などが挙げられるが、これらに限定されない。従って、本発明は、本明細書に記載される障害の１つ以上を治療又は予防するための本発明の医薬組成物を含む投与デバイスを含む。

ＨＳＤ１７Ｂ１３発現を阻害するための方法
本発明はまた、細胞におけるＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現を阻害する方法を提供する。方法は、細胞をＲＮＡｉコンストラクト、例えば二本鎖ＲＮＡｉコンストラクトと、細胞におけるＨＳＤ１７Ｂ１３の発現を阻害するのに有効な量で接触させることにより、細胞におけＨＳＤ１７Ｂ１３の発現を阻害することを含む。細胞をＲＮＡｉコンストラクト、例えば二本鎖ＲＮＡｉコンストラクトと接触させることは、インビトロ又はインビボで行われ得る。細胞をインビボでＲＮＡｉコンストラクトと接触させることは、対象、例えばヒト対象内の細胞又は細胞群をＲＮＡｉコンストラクトと接触させることを含む。また、細胞を接触させるインビトロ及びインビボでの方法の組み合わせも可能である。

本発明は、それを必要とする対象のＨＳＤ１７Ｂ１３の発現を低減又は阻害させる方法、及びＨＳＤ１７Ｂ１３発現又は活性と関連する病態、疾患又は障害を治療又は予防する方法を提供する。「ＨＳＤ１７Ｂ１３発現と関連する病態、疾患又は障害」は、ＨＳＤ１７Ｂ１３の発現レベルが変化するか、又はＨＳＤ１７Ｂ１３の発現レベルの上昇がその病態、疾患又は障害の発症リスクの増大と関連する病態、疾患又は障害を指す。

細胞を接触させることは、上記で考察されるように、直接的であっても、又は間接的であってもよい。さらに、細胞を接触させることは、本明細書に記載されるか、又は当該技術で知られるあらゆるリガンドを含む標的化リガンドを介して達成してもよい。好ましい実施形態では、標的化リガンドは、炭水化物部分、例えば、ＧａｌＮＡｃリガンド、三価のＧａｌＮＡｃ部分、又は目的の部位にＲＮＡｉコンストラクトを誘導する他のあらゆるリガンドである。

一実施形態では、細胞とＲＮＡｉコンストラクトを接触させることは、細胞への取り込み又は細胞への吸収を促進するか又は引き起こすことによって、細胞にＲＮＡｉコンストラクトを「導入」又は「送達」することを含む。ＲＮＡｉコンストラクトの吸収又は取り込みは、補助なしの拡散性若しくは活性細胞プロセスによって、又は補助剤若しくはデバイスによって生じさせることができる。ＲＮＡｉコンストラクトを細胞中に導入することは、インビトロ且つ／又はインビボであり得る。例えば、インビボでの導入のために、ＲＮＡｉコンストラクトを組織部位に注射してもよく、又は全身投与してもよい。細胞へのインビトロでの導入としては、エレクトロポレーション及びリポフェクションなど、当技術分野で知られる方法が挙げられる。さらなる方法は、本明細書において以下に記載されており、且つ／又は当技術分野において知られている。

本明細書で使用する場合、用語「阻害する」は、「低減する」、「サイレンシングする」、「下方制御する」、「抑制する」、及び他の類似用語と互換的に使用され、あらゆるレベルの阻害を含む。

語句「ＨＳＤ１７Ｂ１３の発現を阻害する」は、任意のＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子（例えば、マウスＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子、ラットＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子、サルＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子、又はヒトＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子など）及びＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子のバリアント又は変異体の発現の阻害を指すことが意図される。従って、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子は、遺伝子操作細胞、細胞群、若しくは生物の文脈における野生型ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子、変異体ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子、又はトランスジェニックＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子であり得る。

「ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現を阻害する」には、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子のあらゆるレベルの阻害、例えばＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現の少なくとも一部の抑制が含まれる。ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現は、例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子発現と関連する任意の変数のレベル又はレベルの変化、例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３のｍＲＮＡレベル、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質レベル、又はアミロイド沈着物の数若しくは程度に基づいて評価され得る。このレベルは、例えば、対象に由来する試料を含む個々の細胞又は細胞群において評価され得る。

阻害は、対照レベルと比較して、ＨＳＤ１７Ｂ１３発現に関連する１つ以上の変数の絶対又は相対レベルの減少によって評価され得る。対照レベルは、例えば、投与前のベースラインレベル、又は治療されていないか若しくは対照（例えば、緩衝液のみの対照又は不活性薬剤対照）で治療された類似対象、細胞、若しくは試料から決定されるレベルなどの当技術分野で利用される任意のタイプの対照レベルであり得る。本発明の方法のいくつかの実施形態では、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現は、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％，少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％又は少なくとも約９９％阻害される。

ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現の阻害は、第１の細胞又は細胞群と実質的に同一であるが、同様に処置されていない第２の細胞又は細胞群（対照細胞）と比較した場合の、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現が阻害されるように、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子が転写され、且つ処置された（例えば、細胞を本発明のＲＮＡｉコンストラクトと接触させることにより、又はこの細胞が存在する、若しくは存在した対象に本発明のＲＮＡｉコンストラクトを投与することにより）第１の細胞又は細胞群（このような細胞は、例えば、対象に由来する試料中に存在し得る）により発現されるｍＲＮＡの量の減少によって明らかにされ得る。好ましい実施形態では、阻害は、以下の式を用いて、処置細胞中のｍＲＮＡレベルを対照細胞中のｍＲＮＡレベルの割合として表すことによって評価する。

或いは、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現の阻害は、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子発現に機能的に関連するパラメーターの低下に関して評価してもよい。ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子サイレンシングは、構成的に又はゲノム操作によりＨＳＤ１７Ｂ１３を発現する任意の細胞において、当技術分野で知られる任意のアッセイにより決定され得る。

ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質の発現の阻害は、細胞又は細胞群により発現されるＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質のレベル（例えば、対象に由来する試料中で発現されるタンパク質のレベル）の低減によって明らかにされ得る。上記で説明されるように、ｍＲＮＡの抑制を評価するために、処置細胞又は細胞群におけるタンパク質発現レベルの阻害は、対照細胞又は細胞群におけるタンパク質のレベルのパーセンテージとして同様に表され得る。

ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現の阻害を評価するために使用され得る対照細胞又は細胞群としては、本発明のＲＮＡｉコンストラクトとまだ接触していない細胞又は細胞群が挙げられる。例えば、対照細胞又は対照細胞群は、ＲＮＡｉコンストラクトによる対象の処置の前に、個々の対象（例えば、ヒト対象又は動物対象）から得てもよい。

細胞又は細胞群により発現されるＨＳＤ１７Ｂ１３のｍＲＮＡのレベル又は循環ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｍＲＮＡのレベルは、ｍＲＮＡ発現を評価するための当技術分野で知られる任意の方法を用いて決定され得る。一実施形態では、試料中のＨＳＤ１７Ｂ１３の発現レベルは、転写ポリヌクレオチド又はその部分、例えばＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子のｍＲＮＡを検出することにより決定される。ＲＮＡは、例えば、酸性フェノール／グアニジンイソチオシアネート抽出（ＲＮＡｚｏｌ Ｂ；Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）、ＲＮｅａｓｙ ＲＮＡ調製キット（Ｑｉａｇｅｎ）又はＰＡＸｇｅｎｅ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉｘ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の使用を含むＲＮＡ抽出技術を用いて、細胞から抽出され得る。リボ核酸ハイブリダイゼーションを利用する典型的なアッセイ形式としては、核ランオンアッセイ、ＲＴ－ＰＣＲ、ＲＮアーゼ保護アッセイ（Ｍｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：７０３５）、ノーザンブロッティング、インサイチュハイブリダイゼーション及びマイクロアレイ分析が挙げられる。循環ｍＲＮＡは、その全ての内容が参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１２／０４３５８４号明細書に記載される方法を用いて検出してもよい。

一実施形態では、ＨＳＤ１７Ｂ１３の発現のレベルは、核酸プローブを使用して決定される。用語「プローブ」は、本明細書で使用する場合、特定のＨＳＤ１７Ｂ１３に選択的に結合することができる任意の分子を指す。プローブは、当業者によって合成することができるか、又は適切な生物学的調製物から誘導することができる。プローブは、標識するように特別に設計してもよい。プローブとして利用され得る分子の例としては、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、抗体及び有機分子が挙げられるが、これらに限定されない。

単離ｍＲＮＡは、サザン又はノーザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析及びプローブアレイを含むが、これらに限定されないハイブリダイゼーション又は増幅アッセイに使用することができる。ｍＲＮＡレベルの１つの決定方法は、ＨＳＤ１７Ｂ１３のｍＲＮＡとハイブリダイズすることができる核酸分子（プローブ）と単離ｍＲＮＡを接触させることを含む。一実施形態では、例えば、アガロースゲル上で単離ｍＲＮＡを泳動させ、ｍＲＮＡをゲルからニトロセルロースなどの膜に移すことによって、ｍＲＮＡを固体表面上に固定化し、プローブと接触させる。代替的な実施形態では、プローブは、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ遺伝子チップアレイにおいて、固体表面上に固定化し、ｍＲＮＡをプローブと接触させる。当業者は、ＨＳＤ１７Ｂ１３のｍＲＮＡのレベルを決定するのに使用するために、公知のｍＲＮＡ検出法を容易に適合させることができる。

試料中のＨＳＤ１７Ｂ１３の発現のレベルを決定するための代替的な方法は、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ（Ｍｕｌｌｉｓ，１９８７，米国特許第４，６８３，２０２号明細書に記載の実験的な実施形態）、リガーゼ連鎖反応（Ｂａｒａｎｙ（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１８９－１９３）、自家持続配列複製法（Ｇｕａｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１８７４－１８７８）、転写増幅系（Ｋｗｏｈ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１１７３－１１７７）、Ｑ－ベータレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１１９７）、ローリングサークル複製（Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，８５４，０３３号明細書）又は他の任意の核酸増幅法による、例えば試料中のｍＲＮＡの核酸増幅及び／又は逆転写酵素（ｃＤＮＡを調製する）のプロセスに続いて、当業者によく知られた技術を用いて増幅された分子を検出することを含む。これらの検出スキームは、特に、核酸分子が非常に少ない数で存在するときに、核酸分子を検出するのに有用である。本発明の具体的な態様では、ＨＳＤ１７Ｂ１３の発現のレベルは、定量蛍光ＲＴ－ＰＣＲ（すなわち、ＴａｑＭａｎ^（商標）Ｓｙｓｔｅｍ）により決定される。ＨＳＤ１７Ｂ１３のｍＲＮＡの発現レベルは、メンブレンブロット（ノーザン、サザン、ドットなどのハイブリダイゼーション分析に使用されているものなど）又はマイクロウェル、サンプルチューブ、ゲル、ビーズ若しくはファイバー（又は結合核酸を含む任意の固体支持体）を使用して観察することができる。参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，７７０，７２２号明細書、同第５，８７４，２１９号明細書、同第５，７４４，３０５号明細書、同第５，６７７，１９５号明細書及び同第５，４４５，９３４号明細書を参照されたい。ＨＳＤ１７Ｂ１３の発現レベルの決定は、溶液中の核酸プローブの使用も含み得る。

好ましい実施形態では、ｍＲＮＡの発現のレベルは、例えば、分岐状ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）アッセイ、リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、又は定量的ＦＩＳＨアッセイを使用して評価される。これらの方法の使用については、本明細書に提示される実施例に記載及び例示されている。

ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質発現のレベルは、タンパク質レベルの測定のための当技術分野で知られる任意の方法を使用して決定され得る。このような方法としては、例えば、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、高拡散クロマトグラフィー、液体又はゲル沈降素反応、吸収分光法、比色アッセイ、分光光度アッセイ、フローサイトメトリー、免疫拡散法（一元又は二元）、免疫電気泳動、ウエスタンブロッティング、放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ、電気化学発光アッセイなどが挙げられる。

いくつかの実施形態では、本発明の方法の有効性は、肝疾患のバイオマーカー、例えばＡＳＴ及びＡＬＴなどのＨＳＤ１７Ｂ１３疾患の症状が減少することを検出又は観察することができる。これらの症状は、当技術分野で知られる任意の方法を使用してインビトロ又はインビボで評価され得る。

本発明の方法のいくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトが対象内の特定の部位に送達されるように対象に投与される。ＨＳＤ１７Ｂ１３の発現の阻害は、対象内の特定の部位からの体液又は組織に由来する試料中のＨＳＤ１７Ｂ１３のｍＲＮＡ又はＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質のレベル又はレベルの変化の測定値を使用して評価され得る。好ましい実施形態では、その部位は、肝臓、脈絡叢、網膜及び膵臓からなる群から選択される。その部位は、前述の部位のいずれか１つに由来する細胞の小単位又は部分群であってもよい。また、当該部位は、特定の型の受容体を発現する細胞を含んでもよい。

ＨＳＤ１７Ｂ１３関連疾患を治療又は予防する方法
本発明は、ＨＳＤ１７Ｂ１３関連疾患、障害、及び／若しくは症状がある対象、又はＨＳＤ１７Ｂ１３関連疾患、障害、及び／若しくは症状を発症しやすい対象に、本発明のＲＮＡｉコンストラクトを含む組成物、又はＲＮＡｉコンストラクトを含む医薬組成物、又はＲＮＡｉコンストラクトを含むベクターを投与することを含む治療及び予防方法を提供する。ＨＳＤ１７Ｂ１３関連疾患の非限定的な例としては、例えば、脂肪肝（脂肪症）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、肝臓内での脂肪の蓄積、肝臓の炎症、肝細胞壊死、肝線維症、肥満、又は非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）が挙げられる。一実施形態では、ＨＳＤ１７Ｂ１３関連疾患は、ＮＡＦＬＤである。別の実施形態では、ＨＳＤ１７Ｂ１３関連疾患は、ＮＡＳＨである。別の実施形態では、ＨＳＤ１７Ｂ１３関連疾患は、脂肪肝（脂肪症）である。別の実施形態では、ＨＳＤ１７Ｂ１３関連疾患は、インスリン抵抗性である。別の実施形態では、ＨＳＤ１７Ｂ１３関連疾患は、インスリン抵抗性ではない。

特定の実施形態では、本発明は、それを必要とする患者のＨＳＤ１７Ｂ１３の発現を低減させる方法であって、本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトのいずれかをその患者に投与することを含む方法を提供する。本明細書で使用する場合、用語「患者」は、ヒトを含む哺乳動物を指し、用語「対象」と互換的に使用することができる。好ましくは、患者の肝細胞におけるＨＳＤ１７Ｂ１３の発現レベルは、ＲＮＡｉコンストラクトの投与を受けていない患者のＨＳＤ１７Ｂ１３発現レベルと比較して、ＲＮＡｉコンストラクトを投与した後に低減する。

本発明の方法は、ＨＳＤ１７Ｂ１３関連疾患を有する対象、例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子発現及び／又はＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質産生が低減することによって利益を受けるであろう対象を治療するのに有用である。一態様では、本発明は、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を有する対象の１７β－ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ１３型（ＨＳＤ１７Ｂ１３）遺伝子発現のレベルを低減する方法を提供する。別の態様では、本発明は、ＮＡＦＬＤを有する対象のＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質のレベルを低減する方法を提供する。

別の態様では、本発明は、ＮＡＦＬＤを有する対象を治療する方法を提供する。一態様では、本発明は、ＨＳＤ１７Ｂ１３関連疾患、例えば、脂肪肝（脂肪症）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、肝臓内での脂肪蓄積、肝臓の炎症、肝細胞壊死、肝線維症、肥満、又は非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を有する対象を治療する方法を提供する。本発明の治療方法（及び使用）は、対象、例えばヒトに、治療有効量のＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を標的とする本発明のＲＮＡｉコンストラクト、又はＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を標的とする本発明のＲＮＡｉコンストラクトを含む医薬組成物、又はＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を標的とするＲＮＡｉコンストラクトを含む本発明のベクターを投与することを含む。

一態様では、本発明は、例えば、高められたヘッジホッグシグナル伝達経路の存在、疲労、衰弱、減量、食欲不振、吐き気、腹痛、クモ状血管、皮膚及び眼の黄色化（黄疸）、かゆみ、水分蓄積及び脚の腫脹（浮腫）、腹部膨満（腹水）、及び精神錯乱などの、ＮＡＦＬＤを有する対象の少なくとも１つの症状を予防する方法を提供する。この方法は、治療有効量の本発明のＲＮＡｉコンストラクト、例えばｄｓＲＮＡ、医薬組成物又はベクターを対象に投与し、それにより、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子発現を低減することによって利益を受けるであろう障害を有する対象の少なくとも１つの症状を予防することを含む。

別の態様では、本発明は、対象、例えばＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子発現を低減及び／又は阻害することによって利益を受けるであろう対象を治療するための、治療有効量の本発明のＲＮＡｉコンストラクトの使用を提供する。さらなる態様では、本発明は、例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子発現及び／又はＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質産生を低減及び／又は阻害することによって利益を受けるであろう対象、例えばＨＳＤ１７Ｂ１３関連疾患などのＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子発現が低減することによって利益を受けるであろう障害を有する対象を治療するための医薬の製造における、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を標的とする本発明のＲＮＡｉコンストラクト、例えばｄｓＲＮＡ、又はＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を標的とするＲＮＡｉコンストラクトを含む医薬組成物の使用を提供する。

別の態様では、本発明は、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子発現及び／又はＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質産生を低減及び／又は阻害することによって利益を受けるであろう障害に罹患している対象の少なくとも１つの症状を予防するための本発明のＲＮＡｉ、例えばｄｓＲＮＡの使用を提供する。

さらなる態様では、本発明は、ＨＳＤ１７Ｂ１３関連疾患などのＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子発現及び／又はＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質産生を低減及び／又は阻害することによって利益を受けるであろう障害に罹患している対象の少なくとも１つの症状を予防するための医薬の製造における、本発明のＲＮＡｉコンストラクトの使用を提供する。

一実施形態では、ＨＳＤ１７Ｂ１３を標的化するＲＮＡｉコンストラクトは、ｄｓＲＮＡ薬剤が対象に投与される場合、例えば、対象の細胞、組織、血液又は他の組織若しくは体液におけるＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現が、少なくとも約１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６２％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は少なくとも約９９％以上低減するように、ＨＳＤ１７Ｂ１３関連疾患、例えば、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を有する対象に投与される。

本発明の方法及び使用は、標的ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現が、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、１２、１６、１８、２４、２８、３２、３６、４０、４４、４８、５２、５６、６０、６４、６８、７２、７６、又は約８０時間低減するように、本明細書に記載の組成物を投与することを含む。一実施形態では、標的ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現は、長期間、例えば、少なくとも約２、３、４、５、６、７日以上、例えば、約１週間、２週間、３週間、又は約４週間以上低減する。

本発明の方法及び使用に従ってｄｓＲＮＡを投与することにより、ＨＳＤ１７Ｂ１３関連疾患、例えば、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を有する患者において、そのような疾患又は障害の重症度、徴候、症状、及び／又はマーカーの低減をもたらし得る。この文脈における「低減」は、このようなレベルの統計的に有意な低減を意味する。低減は、例えば、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は約１００％であり得る。疾患の治療又は予防の有効性は、例えば、疾患進行、疾患寛解、病徴重症度、疼痛の低減、生活の質、治療効果を維持するのに必要な医薬の用量、疾患マーカーのレベル又は治療されているか若しくは予防の標的となる所与の疾患に適した他の任意の測定可能パラメーターを測定することによって評価され得る。このようなパラメーターのいずれか１つ又はパラメーターの任意の組み合わせを測定することにより、治療又は予防の有効性を観察することは、十分に当業者の能力の範囲内である。例えば、ＮＡＦＬＤの処置の有効性は、例えば、ＮＡＦＬＤ病徴、肝臓脂肪レベル、又は下流遺伝子の発現を定期的に観察することよって評価することができる。最初の読取りと後の読取りとの比較は、治療が有効であるかどうかの指標を医師に提供する。このようなパラメーターのいずれか１つ又はパラメーターの任意の組み合わせを測定することにより、治療又は予防の有効性を観察することは、十分に当業者の能力の範囲内である。ＨＳＤ１７Ｂ１３を標的化するＲＮＡｉコンストラクト又はその医薬組成物の投与と関連して、ＨＳＤ１７Ｂ１３関連疾患「に対して有効」とは、臨床的に適切な様式で投与することによって、少なくとも統計的に有意な割合の患者に、症状の改善、治癒、疾患の低減、延命、生活の質の改善、又はＮＡＦＬＤ及び／若しくはＨＳＤ１７Ｂ１３関連疾患並びに関連原因の治療に精通している医者によって好ましいと一般に認められている他の効果などの有益な効果がもたらされることを示す。

治療又は予防効果は、病状の１つ以上のパラメーターにおいて統計的に有意な改善がある場合、又はそうでない場合に予期される症状が悪化又は発症しないことによって明らかとなる。一例として、疾患の測定可能なパラメーターの少なくとも１０％の、好ましくは少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％以上の好ましい変化が、有効な治療を意味し得る。所与のＲＮＡｉ薬物又はこの薬物の製剤の有効性は、当技術分野において知られている所与の疾患のための実験動物モデルを用いて判断することもできる。実験動物モデルを使用する場合、治療の有効性は、マーカー又は症状の統計的に有意な低減が観察される場合に証明される。

ＲＮＡｉコンストラクトの投与は、例えば、患者の細胞、組織、血液、尿又は他の区画内のＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質レベルの存在を、少なくとも約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは少なくとも約９９％以上低減することができる。

ＲＮＡｉコンストラクトの総用量を投与する前に、５％の注入液などのより少ない用量を患者に投与し、アレルギー反応などの有害作用について観察してもよい。別の実施例では、サイトカイン（例えば、ＴＮＦ－アルファ又はＩＮＦ－アルファ）レベルの増大などの望ましくない免疫賦活作用について、患者を観察してもよい。

ＨＳＤ１７Ｂ１３発現に対する阻害効果により、本発明による組成物又はそれから調製される医薬組成物は、生活の質を高めることができる。

本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、「裸の」形態で投与されてもよく、この場合、修飾又は未修飾ＲＮＡｉコンストラクトは、「遊離ＲＮＡｉ」として水性溶媒又は適切な緩衝溶媒中に直接懸濁されている。遊離ＲＮＡｉは、医薬組成物の不在下で投与される。

或いは、本発明のＲＮＡｉは、ｄｓＲＮＡリポソーム製剤などの医薬組成物として投与され得る。

ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子発現を低減及び／又は阻害することによって利益を受けることになる対象は、本明細書に記載されるような非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）及び／又はＨＳＤ１７Ｂ１３関連疾患若しくは障害を有する。

ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子発現を低減及び／又は阻害することによって利益を受けることになる対象の治療は、治療的及び予防的治療を含む。

本発明はさらに、他の医薬品及び／又は他の治療法と、例えば、これらの障害を治療するために現在利用されているような、例えば公知の医薬品及び／又は公知の治療法と組み合わせて、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子発現を低減及び／又は阻害することによって利益を受けることになる対象、例えばＨＳＤ１７Ｂ１３関連疾患を有する対象を治療するための方法、並びにＲＮＡｉコンストラクト又はその医薬組成物の使用を提供する。

例えば、特定の実施形態では、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を標的化するＲＮＡｉコンストラクトは、本明細書の他の箇所で記載されるように、例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３関連疾患を治療するのに有用な薬剤と組み合わせて投与される。例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３発現を低減させることによって利益を受けるであろう対象、例えばＨＳＤ１７Ｂ１３関連疾患を有する対象を治療するのに好適な追加の治療薬及び治療法としては、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の異なる部分を標的とするＲＮＡｉコンストラクト、ＨＳＤ１７Ｂ１３関連疾患を治療するための治療剤及び／若しくは手法又は前述のいずれかの組み合わせが挙げられる。

特定の実施形態では、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を標的化する第１のＲＮＡｉコンストラクトは、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の異なる部分を標的化する第２のＲＮＡｉコンストラクトと組み合わせて投与される。例えば、第１のＲＮＡｉコンストラクトは、二重鎖領域を形成する第１のセンス鎖及び第１のアンチセンス鎖を含み、前記第１のセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全て、且つ第１のアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが修飾ヌクレオチドであり、前記第１のセンス鎖は、３’末端に結合したリガンドにコンジュゲートされており、当該リガンドは、二価又は三価の分枝状リンカーを介して結合された１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体であり；且つ第２のＲＮＡｉコンストラクトは、二重鎖領域を形成する第２のセンス鎖及び第２のアンチセンス鎖を含み、第２のセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全て、且つ第２のアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが修飾ヌクレオチドであり、第２のセンス鎖は、３’末端に結合したリガンドにコンジュゲートされており、当該リガンドは、二価又は三価の分枝状リンカーを介して結合された１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体である。

一実施形態では、第１及び第２のセンス鎖のヌクレオチドの全て、並びに／又は第１及び第２のアンチセンス鎖のヌクレオチドの全ては、修飾を含む。

一実施形態では、修飾ヌクレオチドの少なくとも１つは、３’－末端デオキシ－チミン（ｄＴ）ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、アンロックドヌクレオチド、立体配座が制限されたヌクレオチド、拘束エチルヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’－アミノ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、２’－Ｃ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－ヒドロキシ修飾ヌクレオチド、２’－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミダート、非天然塩基を含むヌクレオチド、テトラヒドロピラン修飾ヌクレオチド、１，５－アンヒドロヘキシトール修飾ヌクレオチド、シクロヘキセニル修飾ヌクレオチド、ホスホロチオアート基を含むヌクレオチド、メチルホスホナート基を含むヌクレオチド、５’－ホスフェートを含むヌクレオチド、及び５’－ホスフェート模倣体を含むヌクレオチドからなる群から選択される。

特定の実施形態では、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を標的化する第１のＲＮＡｉコンストラクトは、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子とは異なる遺伝子を標的化する第２のＲＮＡｉコンストラクトと組み合わせて投与される。例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を標的化するＲＮＡｉコンストラクトは、ＳＣＡＰ遺伝子を標的化するＲＮＡｉコンストラクトと組み合わせて投与してもよい。ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を標的化する第１のＲＮＡｉコンストラクト及びＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子とは異なる遺伝子、例えば、ＳＣＡＰ遺伝子を標的化する第２のＲＮＡｉコンストラクトは、同じ医薬組成物の一部として投与してもよい。或いは、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を標的化する第１のＲＮＡｉコンストラクト及びＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子とは異なる遺伝子、例えば、ＳＣＡＰ遺伝子を標的化する第２のＲＮＡｉコンストラクトは、異なる医薬組成物の一部として投与してもよい。

ＲＮＡｉコンストラクト及び追加の治療剤並びに／又は処置は、同時に、且つ／又は同じ組み合わせで、例えば、非経口的に投与してもよく、或いは、追加の治療剤が、別個の組成物の一部として、若しくは別々に、且つ／又は当該技術において知られているか若しくは本明細書に記載される別の方法によって投与してもよい。

本発明はまた、細胞内のＨＳＤ１７Ｂ１３発現を低減及び／又は阻害するために、本発明のＲＮＡｉコンストラクト及び／又は本発明のＲＮＡｉコンストラクトを含有する組成物を使用する方法も提供する。他の態様では、本発明は、細胞内のＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子発現を低減及び／又は阻害するのに使用するための、本発明のＲＮＡｉコンストラクト及び／又は本発明のＲＮＡｉコンストラクトを含む組成物を提供する。さらに他の態様では、細胞内のＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子発現を低減及び／又は阻害する医薬の製造のための、本発明のＲＮＡｉ及び／又は本発明のＲＮＡｉを含む組成物の使用が提供される。さらに他の態様では、本発明は、細胞内のＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質産生を低減及び／又は阻害するのに使用するための、本発明のＲＮＡｉ及び／又は本発明のＲＮＡｉを含む組成物を提供する。さらに他の態様では、細胞内のＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質産生を低減及び／又は阻害する医薬の製造のための、本発明のＲＮＡｉ及び／又は本発明のＲＮＡｉを含む組成物の使用が提供される。本方法及び使用は、細胞を本発明のＲＮＡｉ、例えばｄｓＲＮＡと接触させ、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を達成するのに十分な時間にわたって細胞を維持し、それにより細胞内のＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現を阻害するか又はＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質産生を阻害することを含む。

遺伝子発現の低減は、当技術分野で知られる任意の方法によって評価することができる。例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３発現の低減は、当業者にとって通例の方法、例えばノーザンブロッティング、ｑＲＴ－ＰＣＲを用いてＨＳＤ１７Ｂ１３のｍＲＮＡ発現レベルを決定することによって、ウエスタンブロッティング、免疫学的手法、フローサイトメトリー法、ＥＬＩＳＡなどの当業者にとって通例の方法を用いてＨＳＤ１７Ｂ１３のタンパク質レベルを決定することによって、且つ／又はＨＳＤ１７Ｂ１３の生物活性を決定することによって判断してもよい。

本発明の方法及び使用では、細胞をインビトロで接触させてもよく、又はインビボで接触してもよく、すなわち細胞が対象内に存在していてもよい。

本発明の方法を使用する治療に好適な細胞は、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を発現する任意の細胞、例えば、ＮＡＦＬＤを有する対象に由来する細胞、又はＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子若しくはＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の一部から構成される発現ベクターを含む細胞であり得る。本発明の方法及び使用に用いるのに好適な細胞は、哺乳動物細胞、例えば霊長類細胞（ヒト細胞又は非ヒト霊長類細胞、例えばサル細胞若しくはチンパンジー細胞など）、非霊長類細胞（ウシ細胞、ブタ細胞、ラクダ細胞、ラマ細胞、ウマ細胞、ヤギ細胞、ウサギ細胞、ヒツジ細胞、ハムスター、モルモット細胞、ネコ細胞、イヌ細胞、ラット細胞、マウス細胞、ライオン細胞、トラ細胞、クマ細胞又はバッファロー細胞など）、鳥類細胞（例えば、アヒル細胞又はガチョウ細胞）又はクジラ細胞であり得る。一実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。

ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子発現は、細胞において、少なくとも約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は約１００％阻害され得る。

ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質産生は、細胞において、少なくとも約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は約１００％阻害され得る。

本発明のインビボにおける方法及び使用は、ＲＮＡｉコンストラクトを含有する組成物を対象に投与することを含んでもよく、ＲＮＡｉコンストラクトは、治療される哺乳動物のＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部と相補的なヌクレオチド配列を含む。治療対象の生物がヒトである場合、組成物は、当技術分野で知られる任意の手段によって投与してもよく、このような手段としては、皮下、静脈内、経口、腹腔内又は頭蓋内（例えば、脳室内、実質内及び髄腔内）、筋肉内、経皮、気道（噴霧剤）、経鼻、直腸を含む非経口経路並びに局所（頬側及び舌下を含む）投与が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、組成物は、皮下又は静脈内の注入又は注射によって投与される。一実施形態では、組成物は、皮下注射によって投与される。

いくつかの実施形態では、投与は、デポ注射による。デポ注射は、長期間にわたってＲＮＡｉを一貫して放出し得る。従って、デポ注射は、所望の効果、例えば所望のＨＳＤ１７Ｂ１３の阻害又は治療効果若しくは予防効果を得るのに必要な投与頻度を減少させることができる。デポ注射は、より一貫した血清濃度も提供し得る。デポ注射としては、皮下注射又は筋肉内注射が挙げられ得る。好ましい実施形態では、デポ注射は、皮下注射である。

いくつかの実施形態では、投与は、ポンプによる。ポンプは、外部ポンプ又は外科的に埋め込まれるポンプであり得る。特定の実施形態では、ポンプは、皮下に埋め込まれる浸透圧ポンプである。他の実施形態では、ポンプは、注入ポンプである。注入ポンプは、静脈内、皮下、動脈又は硬膜外注入に用いられ得る。好ましい実施形態では、注入ポンプは、皮下注入ポンプである。他の実施形態では、ポンプは、ＲＮＡｉコンストラクトを対象に送達する、外科的に埋め込まれるポンプである。

投与様式は、局所性又は全身性の治療が所望されるかどうかに基づいて、及び治療されることになる領域に基づいて選択され得る。投与経路及び投与部位は、標的化を高めるように選択され得る。

一態様では、本発明は、哺乳動物、例えばヒトにおいてＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現を阻害するための方法も提供する。本発明は、哺乳動物においてＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現を阻害するのに使用するための、哺乳動物の細胞内のＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を標的とするＲＮＡｉコンストラクト、例えばｄｓＲＮＡを含む組成物も提供する。別の態様では、本発明は、哺乳動物においてＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現を阻害する医薬の製造における、哺乳動物の細胞内のＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を標的化とするＲＮＡｉ、例えばｄｓＲＮＡの使用を提供する。

本方法及び使用は、ＲＮＡｉ、例えば、哺乳動物の細胞内でＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を標的化するｄｓＲＮＡを含む組成物を、哺乳動物、例えば、ヒトに投与すること、及び哺乳動物をＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を達成するのに十分な時間にわたって維持し、それにより哺乳動物内のＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現を阻害することを含む。

遺伝子発現の低減は、当技術分野で知られる任意の方法、例えば本明細書に記載されるｑＲＴ－ＰＣＲにより、ＲＮＡｉが投与された対象の末梢血試料で評価することができる。タンパク質産生の低減は、当技術分野で知られる任意の方法及び本明細書に記載される方法、例えばＥＬＩＳＡ又はウエスタンブロッティングによって評価することができる。一実施形態では、組織試料は、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子及び／又はタンパク質の発現の低減を観察するための組織材料としての役割を果たす。別の実施形態では、血液試料は、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子及び／又はタンパク質の発現の低減を観察するための組織材料としての役割を果たす。

一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトを投与した後のインビボにおける標的のＲＩＳＣ媒介性切断の検証は、５’－ＲＡＣＥ又は当技術分野で知られるプロトコルの改変（Ｌａｓｈａｍ Ａ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，３８（３）ｐ－ｅｌ９）（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ ４４１：１１１－４）を実行することによって行われる。

本明細書に開示される全てのリボ核酸配列は、配列中のウラシル塩基をチミン塩基で置換することにより、デオキシリボ核酸配列に変換することができることが理解される。同様に、本明細書に開示される全てのデオキシリボ核酸配列は、配列中のチミン塩基をウラシル塩基と置換することにより、リボ核酸配列に変換することができる。本明細書に開示される全ての配列のデオキシリボ核酸配列、リボ核酸配列並びにデオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドの混合物を含有する配列が本発明に含まれる。

加えて、本明細書に開示されるあらゆる核酸配列は、化学修飾の任意の組み合わせによって修飾され得る。当業者であれば、特定の場合に、修飾ポリヌクレオチドを記載するための「ＲＮＡ」又は「ＤＮＡ」としてのこのような標記が任意であることを容易に理解するであろう。例えば、リボース糖に２’－ＯＨ置換基及びチミン塩基を有するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは、修飾糖を有するＤＮＡ分子（ＤＮＡの天然の２’－Ｈに対して２’－ＯＨ）又は修飾塩基（ＲＮＡの天然のウラシルに対してチミン（メチル化ウラシル））を有するＲＮＡ分子と記載され得る。

従って、配列表のものを含むがこれらに限定されない本明細書に提供される核酸配列は、修飾核酸塩基を有するそのような核酸を含むが、これらに限定されない天然若しくは修飾ＲＮＡ及び／又はＤＮＡの任意の組み合わせを含有する核酸を包含するように意図される。さらなる例として、限定するものではないが、配列「ＡＴＣＧＡＴＣＧ」を有するポリヌクレオチドは、修飾又は非修飾にかかわらないＲＮＡ塩基、例えば配列「ＡＵＣＧＡＵＣＧ」を有するもの、並びに「ＡＵＣＧＡＴＣＧ」などのいくつかのＤＮＡ塩基及びＲＮＡ塩基を有するもの、並びに「ＡＴｍｅＣＧＡＵＣＧ」などの他の修飾塩基を有するポリヌクレオチドを含むそのような化合物を含むが、これらに限定されないそのような配列を有する任意のポリヌクレオチドを包含し、配列中、ｍｅＣは、５位にメチル基を含むシトシン塩基を示す。

実施された実験及び達成された結果を含む以下の実施例は、例示の目的のみのために提供されるものであり、添付の特許請求の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

参照による組み込み
本明細書において言及される全ての刊行物、特許及び特許出願は、各々の個々の刊行物、特許又は特許出願が具体的且つ個別に参照により組み込まれることが示された場合と同程度に参照により本明細書に組み込まれる。しかしながら、本明細書における参考文献の引用は、そのような参考文献が本発明の先行技術であることを認めるものと解釈されるべきではない。参照により組み込まれる参考文献において提供される定義又は用語のいずれかが、本明細書で提供される用語及び考察と異なる限りにおいて、本用語及び本定義が優先される。

均等物
前述の本明細書は、当業者が本発明を実施するのに十分なものであると考えられる。前述の説明及び実施例は、本発明のある特定の好ましい実施形態を詳細に説明し、本発明者らが企図する最良の形態を記載するものである。しかしながら、前述の内容がいかに詳細に記載されようとも、本発明を多くの方法で実施してもよく、添付の特許請求の範囲及びその均等物に従って本発明が解釈されるべきであることが理解されるであろう。

実施された実験及び達成された結果を含む以下の実施例は、例示の目的のみのために提供されるものであり、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

本明細書に記載される全ての動物実験は、Ａｍｇｅｎの動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）により承認され、Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ，８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ（Ｕ．Ｓ．）、Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓの更新のための委員会、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｕ．Ｓ．）及びＮａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｉｅｓ Ｐｒｅｓｓ（Ｕ．Ｓ．）（２０１１）Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃａｒｅ ａｎｄ ｕｓｅ ｏｆ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｎｉｍａｌｓ．８ｔｈ Ｅｄ．，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｉｅｓ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．に従って管理された。マウスは、空調された空間において２２±２℃で１２時間明期；１２時間暗期のサイクル（０６００～１８００時間）で単独飼育した。動物には、別段の指示がない限り、通常の固形飼料食餌（Ｅｎｖｉｇｏ、２９２０Ｘ、又は別途明記された食餌）及び自動給水システムによる水（逆浸透精製）を自由に与えた。終了時に、深麻酔下で心臓穿刺によって血液を回収し、その後Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ａｎｄ Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ（ＡＡＡＬＡＣ）ガイドラインに従って、二次的な物理的方法によって安楽死させた。

実施例１：改変ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｓｉＲＮＡ分子の選択、設計及び合成
１７β－ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ１３型（ＨＳＤ１７Ｂ１３）を標的化する治療用ｓｉＲＮＡ分子のための最適な配列の同定及び選択は、ヒトＨＳＤ１７Ｂ１３転写物（ＮＭ＿１７８１３５．４又はＮＭ＿００１１３６２３０．２）のバイオインフォマティクス分析を使用して確認した。表１は、治療特性を有するものとして同定された配列を示す。種々の配列全体を通して、｛ＩＮＶＡＢ｝は反転脱塩基であり、｛ＩＮＶＤＡ｝は反転デオキシアデノシンであり、ＧＮＡはグリコール核酸であり、ｄＴはデオキシチミジンであり、ｄＣはデオキシシトシンである。

ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｓｉＲＮＡ配列の効力及びインビボ安定性を向上させるために、化学修飾をＨＳＤ１７Ｂ１３ ｓｉＲＮＡ分子に組み込んだ。具体的には、リボース糖の２’－Ｏ－メチル及び２’－フルオロ修飾をＨＳＤ１７Ｂ１３ ｓｉＲＮＡ内の特定の位置に組み込んだ。また、アンチセンス配列及び／又はセンス配列の末端にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を組み込んだ。下記の表２に、修飾ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｓｉＲＮＡの各々のセンス配列及びアンチセンス配列における修飾を示す。表２及び本出願の他の部分のヌクレオチド配列は、以下の表記法に従って列記されている。Ａ、Ｕ、Ｇ、及びＣ＝対応するリボヌクレオチド；ｄＴ＝デオキシチミジン；ｄＡ＝デオキシアデノシン；ｄＣ＝デオキシシチジン；ｄＧ＝デオキシグアノシン；ｉｎｖＤＴ＝反転デオキシチミジン；ｉｎｖＤＡ＝反転デオキシアデノシン；ｉｎｖＤＣ＝反転デオキシシチジン；ｉｎｖＤＧ＝反転デオキシグアノシン；ａ、ｕ、ｇ、及びｃ＝対応する２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド；Ａｆ、Ｕｆ、Ｇｆ、及びＣｆ＝対応する２’－デオキシ－２’－フルオロ（「２’－フルオロ」）リボヌクレオチド；Ａｂ＝脱塩基；ＭｅＯ－Ｉ＝２’メトキシイノシン；ＧＮＡ＝グリコール核酸；ｓＧＮＡ＝３’ホスホロチオエートを有するグリコール核酸；ＬＮＡ＝ロックド核酸。配列中の「ｓ」の挿入は、２つの隣接するヌクレオチドがホスホロチオジエステル基（例えば、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合）によって連結されていることを示す。特に示されない限り、他の全てのヌクレオチドは、３’－５’ホスホジエステル基によって連結されている。表２のｓｉＲＮＡ化合物の各々は、両方の鎖の３’末端に２ヌクレオチドのオーバーハング又は一方若しくは両方の末端に平滑末端を有する２１塩基対の二重鎖領域を含む。ｓｉＲＮＡ化合物の各々のセンス鎖の５’末端は、ホスホロチオエート結合又はホスホジエステル結合を介して下記の式ＩのＧａｌＮＡｃ構造に連結されている：

式中、Ｘ＝Ｏ又はＳである。

実施例３：ＨＳＤ１７Ｂ１３－ｒｓ７３８４０９及びＨＳＤ１７Ｂ１３－ｒｓ７３８４０９－ｒｓ７３８４０８に関するｓｉＲＮＡのドロップレットデジタルＰＣＲアッセイ
製造業者のプロトコルに従って、ヒト初代肝細胞（Ｘｅｎｏｔｅｃｈ／Ｓｅｋｉｓｕｉ ドナーロット＃ＨＣ３－３８）をＯｐｔｉＴｈａｗ培地（Ｘｅｎｏｔｅｃｈ ｃａｔ＃Ｋ８０００）中に解凍し、細胞を遠心分離し、培地吸引後、ＯｐｔｉＰｌａｔｅ肝細胞培地（Ｘｅｎｏｔｅｃｈ ｃａｔ＃Ｋ８２００）に再懸濁し、９６ウェルのコラーゲンコーティングプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｃａｔ＃６５５９５０）に蒔いた。２～４時間のインキュベーション期間の後、培地を除去し、ＯｐｔｉＣｕｌｔｕｒｅ肝細胞培地（Ｘｅｎｏｔｅｃｈ ｃａｔ＃Ｋ８３００）で置き換えた。ＯｐｔｉＣｕｌｔｕｒｅ培地を添加して２～４時間後、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートｓｉＲＮＡを自由取り込み（トランスフェクション試薬なし）によって最大３．８μＭの様々な濃度で細胞に送達した。細胞を３７℃及び５％のＣＯ２で２４～７２時間インキュベートした。続いて、１％の２－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、Ｍ－３１４８）を加えたＱｉａｇｅｎのＲＬＴ緩衝液（７９２１６）で細胞を溶解し、溶解物を－２０℃で保存した。ＱｉａｇｅｎのＱＩＡＣｕｂｅ ＨＴ機器（９００１７９３）及びＱｉａｇｅｎのＲＮｅａｓｙ ９６ ＱＩＡＣｕｂｅ ＨＴキット（７４１７１）を使用して、製造業者の指示書に従ってＲＮＡを精製した。試料は、ＱＩＡｘｐｅｒｔシステム（９００２３４０）を使用して分析した。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ逆転写キット（４３６８８１３）を使用してＲＮＡ試料からｃＤＮＡを合成し、反応物を製造業者の指示書に従って組み立て、インプットＲＮＡの濃度を試料によって変動させた。逆転写は、ＢｉｏＲａｄの４つ組のサーマルサイクラー（モデル番号ＰＴＣ－０２４０Ｇ）上において以下の条件で実行した： ２５℃で１０分、３７℃で１２０分、８５℃で５分、その後（任意選択で）４℃で保持し続ける。

ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を、製造業者の指示書に従ってＢｉｏＲａｄのＱＸ２００ ＡｕｔｏＤＧドロップレットデジタルＰＣＲシステムを使用して実施した。ＢｉｏＲａｄのプローブ用ｄｄＰＣＲスーパーミックス（１８６３０１０）、並びにＨＳＤ１７Ｂ１３のための蛍光標識されたｑＰＣＲアッセイ（ＩＤＴ Ｈｓ．ＰＴ．５８．２１４６４６３７、プライマー対プローブ比３．６：１及びＴＢＰ（ＩＤＴ Ｈｓ．ＰＴ．５３ａ．２０１０５４８６、プライマー対プローブ比３．６：１）、並びにＲＮａｓｅフリー水（Ａｍｂｉｏｎ、ＡＭ９９３７）を使用して、反応物をＥｐｐｅｎｄｏｒｆの透明な９６ウェルＰＣＲプレート（９５１０２０３０３）に組み立てた。プライマー／プローブの最終濃度は、それぞれ９００ｎＭ／２５０ｎＭであり、インプットｃＤＮＡの濃度をウェル間で変動させた。ドロップレットは、製造業者によって推奨される消耗品（ＢｉｏＲａｄのＤＧ３２カートリッジ１８６４１０８、ＢｉｏＲａｄのチップ１８６４１２１、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆの青色９６ウェルＰＣＲプレート９５１０２０３６２、ＢｉｏＲａｄのプローブ用ドロップレット生成オイル１８６４１１０及びＢｉｏＲａｄのドロップレットプレート組立品）と共に設置されたＢｉｏＲａｄ Ａｕｔｏ ＤＧドロップレット生成器（１８６４１０１）を使用して形成した。ドロップレットは、ＢｉｏＲａｄのＣ１０００ ｔｏｕｃｈサーマルサイクラー（１８５１１９７）上で次の条件を用いて増幅した： 酵素活性化に９５℃で１０分、変性に９４℃で３０秒、その後アニーリング／伸長に６０℃で１分間、２℃／秒のランプ速度を用いて４０サイクル、酵素不活性化に９８℃で１０分間、その後（任意選択により）４℃で保持し続ける。続いて、ＨＳＤ１７Ｂ１３又はＴＢＰ濃度に相関するＦＡＭ／ＨＥＸシグナルを測定するＢｉｏＲａｄのＱＸ２００ドロップレットリーダー上で試料を読み取った。ＢｉｏＲａｄのＱｕａｎｔａＳｏｆｔソフトウェアパッケージを使用してデータを分析した。試料をチャネル（蛍光標識）によりゲーティングして、試料当たりの濃度を測定した。続いて、試料負荷量における差異を調節するために、各試料を目的遺伝子（ＨＳＤ１７Ｂ１３）の濃度／ハウスキーピング遺伝子（ＴＢＰ）の濃度の比として表した。続いて、データをＧｅｎｅｄａｔａ Ｓｃｒｅｅｎｅｒにインポートし、各試験のｓｉＲＮＡを中立対照ウェル（緩衝液のみ）の中央値に対して正規化する。ＩＣ５０値を表３で報告する。

実施例４：野生型ラットにおける化学修飾されたＨＳＤ１７Ｂ１３ ｓｉＲＮＡ分子のスクリーニング
９～１０週齢の体重３５０～４００グラムのスプラーグドーリー系雄ラットを、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ，ＭＡ）から入手した。馴化させた後、これらの動物を体重に基づいてランダム化した。各群に６頭のラットを含め、これらにＨＳＤ１７Ｂ１３ ｓｉＲＮＡを体重１ｋｇ当たり３ミリグラムで皮下投与した。投与化合物をカルシウム及びマグネシウムを含まないリン酸緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１４１９０－１３６）中に希釈した。ｓｉＲＮＡを処置して３０日後に動物を安楽死させ、肝臓を採取した。新たに単離した肝臓左葉を、液体窒素中で直ちに急速凍結した。ＱＩＡｃｕｂｅ ＨＴ機器及びＲＮｅａｓｙ ９６ ＱＩＡｃｕｂｅ ＨＴキットを用いて、製造業者のプロトコルに従って３０～５０ｍｇの肝臓組織を用いてＲＮＡを単離した。ＲＱ１ ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍ６１０１）で２～４μｇのＲＮＡを処置した。１０ｎｇのＤＮａｓｅ消化ＲＮＡを、Ｑｕａｎｔ Ｓｔｕｄｉｏ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲマシン上でＴａｑＭａｎ ＲＮＡ ｔｏ ＣＴ １ステップキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）ランを用いるリアルタイムｑＰＣＲにかけた。ラットＨＳＤ１７Ｂ１３用のＴａｑＭａｎプローブ（Ｒｎ＿０１４５００３９＿ｍ１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｔａｑｍａｎ発現アッセイ）を使用して発現を測定し、ハウスキーピング遺伝子であるＨＭＢＳ（ヒドロキシメチルビラン合成酵素、Ｒｎ０１４２１８７３＿ｇ１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｔａｑｍａｎ発現アッセイ）の発現に対して正規化した。相対倍数変化をＰＢＳコホートと比較した場合で計算した。データをＰＢＳに対するｓｉＲＮＡ処置群のノックダウンの割合として表す。合計で２３のトリガーを試験した。結果を表４に示す。負の値は、ＨＳＤ１７Ｂ１３レベルが低減したことを示している。

Claims (37)

1. センス鎖及びアンチセンス鎖を含むＲＮＡｉコンストラクトであって、前記アンチセンス鎖は、表１又は表２に列記されるアンチセンス配列から３ヌクレオチド以下異なる、少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを有する領域を含み、前記ＲＮＡｉコンストラクトは、１７β－ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ１３型（ＨＳＤ１７Ｂ１３）の発現を阻害する、ＲＮＡｉコンストラクト。
2. 前記アンチセンス鎖が、ＨＳＤ１７Ｂ１３のｍＲＮＡ配列と相補的な領域を含む、請求項１に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
3. 前記センス鎖が、表１又は２に列記されるアンチセンス配列から３ヌクレオチド以下異なる、少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを有する領域を含む、請求項１～２のいずれかに記載のＲＮＡｉコンストラクト。
4. 前記センス鎖が、約１５～約３０塩基対長の二重鎖領域を形成するように、前記アンチセンス鎖の配列と十分に相補的な配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
5. 前記二重鎖領域が、約１７～約２４塩基対長である、請求項４に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
6. 前記二重鎖領域が、約１９～約２１塩基対長である、請求項４に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
7. 前記二重鎖領域が、１９塩基対長である、請求項６に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
8. 前記二重鎖領域が、２０塩基対長である、請求項６に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
9. 前記二重鎖領域が、２１塩基対長である、請求項６に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
10. 前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖が、それぞれ約１５～約３０ヌクレオチド長である、請求項４～９のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
11. 前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖が、それぞれ約１９～約２７ヌクレオチド長である、請求項１０に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
12. 前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖が、それぞれ約２１～約２５ヌクレオチド長である、請求項１０に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
13. 前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖が、それぞれ約２１～約２３ヌクレオチド長である、請求項１０に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
14. 前記ＲＮＡｉコンストラクトが、少なくとも１つの平滑末端を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
15. 前記ＲＮＡｉコンストラクトが、１～４個の不対ヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチドオーバーハングを含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
16. 前記ヌクレオチドオーバーハングが、２個の不対ヌクレオチドを有する、請求項１５に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
17. 前記ＲＮＡｉコンストラクトが、前記センス鎖の３’末端、前記アンチセンス鎖の３’末端、又は前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖の両方の３’末端にヌクレオチドオーバーハングを含む、請求項１５又は１６に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
18. 前記ヌクレオチドオーバーハングが、５’－ＵＵ－３’ジヌクレオチド又は５’－ｄＴｄＴ－３’ジヌクレオチドを含む、請求項１５～１７のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
19. 前記ＲＮＡｉコンストラクトが、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
20. 前記修飾ヌクレオチドが、２’－修飾ヌクレオチドである、請求項１９に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
21. 前記修飾ヌクレオチドが、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、二環式核酸（ＢＮＡ）、グリコール核酸、反転塩基又はこれらの組み合わせである、請求項１９に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
22. 前記修飾ヌクレオチドが、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド又はこれらの組み合わせである、請求項２１に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
23. 前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖内の全てのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである、請求項１９に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
24. 前記修飾ヌクレオチドが、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド又はこれらの組み合わせである、請求項２３に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
25. 前記ＲＮＡｉコンストラクトが、少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
26. 前記ＲＮＡｉコンストラクトが、前記アンチセンス鎖の３’末端に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項２５に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
27. 前記ＲＮＡｉコンストラクトが、前記アンチセンス鎖の３’末端及び５’末端の両方に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、且つ前記センス鎖の５’末端に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項２５に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
28. 前記アンチセンス鎖が、表１又は表２に列記されるアンチセンス配列から選択される配列を含む、請求項１～２７のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
29. 前記センス鎖が、表１又は表２に列記されるセンス配列から選択される配列を含む、請求項２８に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
30. 前記ＲＮＡｉコンストラクトが、表１～２のいずれか１つに列記される二重鎖化合物のいずれか１つである、請求項１～２９のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
31. 前記ＲＮＡｉコンストラクトが、対照ＲＮＡｉコンストラクトとインキュベートされた肝臓細胞におけるＨＳＤ１７Ｂ１３発現レベルと比較して、前記ＲＮＡｉコンストラクトとインキュベートした後の肝臓細胞におけるＨＳＤ１７Ｂ１３発現レベルを低減する、請求項１～３０のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
32. 前記肝臓細胞が、初代肝細胞である、請求項２５に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
33. 前記ＲＮＡｉコンストラクトが、約４０ｎＭ未満のＩＣ５０で初代肝細胞におけるＨＳＤ１７Ｂ１３発現を阻害する、請求項１～３２のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
34. 前記ＲＮＡｉコンストラクトが、約３０ｎＭ未満のＩＣ５０で初代肝細胞におけるＨＳＤ１７Ｂ１３発現を阻害する、請求項１～３２のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
35. 請求項１～３４のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト及び薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤を含む医薬組成物。
36. ＨＳＤ１７Ｂ１３の発現の低減を必要とする患者における、ＨＳＤ１７Ｂ１３の発現を低減させるための方法であって、請求項１～３５のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクトを前記患者に投与することを含む方法。
37. 肝細胞におけるＨＳＤ１７Ｂ１３の発現レベルが、前記ＲＮＡｉコンストラクトを受けていない患者におけるＨＳＤ１７Ｂ１３発現レベルと比較して、前記ＲＮＡｉコンストラクトを投与した後の前記患者で低減する、請求項３６に記載の方法。