TW202400791A - 一種核酸、含有該核酸的組合物與綴合物及製備方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本發明提供了一種能夠抑制17 β-羥基類固醇脫氫酶13型（ HSD17B13）基因表達的siRNA，包含正義鏈和反義鏈，所述正義鏈和反義鏈分別包含核苷酸序列I和核苷酸序列II，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II分別由19個修飾或未修飾的核苷酸組成，並至少部分地反向互補形成雙鏈區，所述核苷酸序列II至少部分地與 HSD17B13基因表達的mRNA中的一段核苷酸序列反向互補；按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的第3至6個核苷酸中的至少1個為穩定化修飾核苷酸。本發明提供的siRNA以及包含該siRNA的藥物組合物和siRNA綴合物可以有效治療和/或預防與 HSD17B13基因表達相關的疾病或病症。

Description

一種核酸、含有該核酸的組合物與綴合物及製備方法和用途
本發明涉及一種能夠抑制17 β-羥基類固醇脫氫酶13型（ HSD17B13或17beta-HSD13）基因表達的核酸和含有該核酸的組合物與綴合物。本發明還涉及這些核酸、組合物與綴合物的製備方法和用途。
17β-羥基類固醇脫氫酶13型(通常稱為 HSD17B13或17beta-HSD13)是17β-羥基類固醇脫氫酶(17β-HSD)家族的成員。17β-羥基類固醇脫氫酶13型是位於肝細胞脂滴表面的一種蛋白，其功能可能與肝臟脂質代謝以及轉氨酶的生成有關，已知在肝臟的肝細胞中發現了很高的表達水平，而在卵巢、骨髓、腎臟、腦、肺、骨骼肌、膀胱和睾丸中可以檢測到較低的表達水平。
研究證明， HSD17B13的表達水平在脂肪肝或糖尿病小鼠肝臟為高表達，在C57BL/6鼠體內的肝臟過度表達顯著地增加肝臟中的脂肪生成及甘油三酸酯(TG)含量，導致脂肪肝表型。目前， HSD17B13已被鑒定為非酒精性脂肪肝病(NAFLD)患者中的脂質小滴(LD)相關蛋白。過表達的 HSD17B13會導致LD的數目和大小的增加，而脂質小滴(LD)蓄積與多種代謝疾病及慢性纖維炎性肝病如：肝纖維化、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)及NAFLD相關。表達 HSD17B13的基因敲除減弱了培養的肝細胞中油酸誘導的LD形成。已有報導表明，在脂肪肝患者中已觀察到肝臟中 HSD17B13上調，這支援了 HSD17B13在NAFLD的發病機制中的作用。
目前，在慢性纖維性炎性肝病治療領域中，對於罹患慢性纖維炎性肝病的個體的療法仍存在未被滿足的需求。
為了開發一種能夠抑制 HSD17B13基因的siRNA，發明人發現，在序列中引入具有穩定化修飾核苷酸的siRNA出人意料地顯示出比對應位置不具有穩定化修飾核苷酸的siRNA顯著更高的 HSD17B13基因抑制活性，因此，發明人作出如下發明。
在一方面，本發明提供了一種siRNA，所述siRNA包含正義鏈和反義鏈，所述正義鏈包含核苷酸序列I，所述反義鏈包含核苷酸序列II，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II均由19個核苷酸組成，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II中的每一個核苷酸均為修飾或未修飾的核苷酸，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II至少部分地與第一段核苷酸序列反向互補，所述第一段核苷酸序列為 HSD17B13基因表達的mRNA中的一段長度為19個核苷酸的核苷酸序列，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的第3至6個核苷酸中的至少1個為穩定化修飾核苷酸，所述穩定化修飾核苷酸指核苷酸的核糖2'位羥基被穩定化修飾基團取代的核苷酸，與相應位置的核苷酸為未修飾的核苷酸的siRNA相比，包含所述穩定化修飾核苷酸的siRNA的熱穩定性增加，並且所述穩定化修飾基團的空間位阻大於2'-O-甲基。
在另一方面，本發明還提供了一種藥物組合物，該藥物組合物含有本發明提供的siRNA以及藥學上可接受的載體。
在又一方面，本發明還提供了一種siRNA綴合物，所述siRNA綴合物含有本發明提供的siRNA以及綴合連接至該siRNA的綴合基團，所述綴合基團包含接頭和藥學上可接受的靶向基團，並且，所述siRNA、所述接頭和所述靶向基團依次共價或非共價連接，每個所述靶向基團選自能夠和細胞表面受體結合的配體。
在又一方面，本發明還提供了本發明的siRNA和/或本發明的藥物組合物和/或本發明的siRNA綴合物在製備用於治療和/或預防與 HSD17B13基因表達的mRNA水平相關的疾病或者症狀的藥物中的用途。
在又一方面，本發明還提供了一種治療和/或預防與 HSD17B13基因表達的mRNA水平相關的疾病或症狀的方法，所述方法包括向有需要的受試者給予本發明的siRNA，和/或本發明的藥物組合物，和/或本發明的siRNA綴合物。
在又一方面，本發明還提供了一種抑制細胞中 HSD17B13基因表達水平的方法，所述方法包括將有效劑量的本發明的siRNA，和/或本發明的藥物組合物和/或本發明的siRNA綴合物與所述細胞接觸。
在又一方面，本發明還提供了一種試劑盒，所述試劑盒包含本發明的siRNA，和/或本發明的藥物組合物，和/或本發明的siRNA綴合物。
以引用的方式併入
本說明書中提及的所有出版物、專利以及專利申請均以引用的方式併入本文，其程度與每一單獨的出版物、專利或專利申請均專門並且單獨地以引用的方式併入本文的程度相同。
有益效果
本發明的siRNA、藥物組合物和/或siRNA綴合物具有較高的 HSD17B13基因表達的抑制活性和/或低的毒性，能夠有效治療或預防與 HSD17B13基因表達的mRNA水平相關的疾病或症狀。
本發明的siRNA、藥物組合物和/或siRNA綴合物顯示出優異的 HSD17B13基因表達的mRNA的調節活性。例如，本發明提供的siRNA綴合物在psi-CHECK系統中有很高的目標序列抑制活性，與其序列相同、但不包含穩定化修飾核苷酸的參比綴合物相比，本發明的綴合物對目標序列抑制活性大大提高，IC 50值僅為參比綴合物1的約1/4至1/3。
又例如，在猴原代肝細胞中，本發明提供的siRNA綴合物在50nM或者5nM濃度下， HSD17B13基因表達的mRNA的抑制活性至少為91.30%，甚至可高達94.71%，與不包含穩定化修飾核苷酸的參比綴合物相比，本發明的綴合物均表現出更加優異的 HSD17B13mRNA抑制活性。又例如，在猴原代肝細胞中，本發明提供的siRNA綴合物在10nM濃度下，對 HSD17B13基因表達的mRNA的抑制活性最高可達到92.4%。又例如，在猴原代肝細胞中，本發明提供的siRNA綴合物在50nM或者5nM濃度下，均表現出優異的 HSD17B13mRNA抑制活性，50nM濃度明顯高於5nM濃度的抑制活性，最高可達98%。
又例如，在小鼠體內，本發明提供的siRNA綴合物 HSD17B13mRNA的抑制率為69.34%，與給予不包含穩定化修飾核苷酸的參比綴合物相比，本發明的綴合物均表現出更加優異的 HSD17B13mRNA抑制活性。又例如，在大鼠體內，給予包含穩定化修飾核苷酸的本發明的siRNA綴合物後，在第8天時， HSD17B13mRNA的抑制率為81.2%，與不包含穩定化修飾核苷酸的參比綴合物相比，表現出更加優異的 HSD17B13mRNA抑制活性；在第15天時更是顯著高於對比綴合物，表明本發明的siRNA綴合物還具有優異的體內 HSD17B13mRNA長效抑制活性。
實驗結果證明，在大鼠體內，給予最高達100mg/kg劑量的本發明的siRNA綴合物後，各劑量組的組織結構和臟器重量均無顯著性改變，顯示出本發明的綴合物毒性小，體內耐受性良好，具有30倍以上的安全視窗，適合作為體內抑制 HSD17B13mRNA的藥物使用。
進一步地，本發明提供的siRNA綴合物在psi-CHECK系統中對脫靶序列的抑制率在測試濃度範圍內均不高於50%，顯示出與不包含穩定化修飾核苷酸的參比綴合物相比更低的脫靶效應。
綜上所述，本發明提供的siRNA、藥物組合物以及siRNA綴合物能夠有效抑制 HSD17B13基因的表達，在保證安全性的劑量下，有效治療和/或預防由 HSD17B13基因表達的mRNA水平相關的疾病症狀，具有良好的應用前景。
以下對本發明的具體實施方式進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的具體實施方式僅用於說明和解釋本發明，並不用於限制本發明。
在本發明中，如無其他說明， HSD17B13mRNA或“ HSD17B13基因表達的mRNA”是指具有如Genbank註冊號 NM_001136230.3所示序列的mRNA，在上下文中也簡稱為 HSDmRNA， HSD17B13基因是指轉錄上述 HSD17B13mRNA的基因。
定義
在上文及下文中，如無特別說明，大寫字母C、G、U、A表示核苷酸的鹼基組成；小寫字母m表示該字母m左側相鄰的一個核苷酸為甲氧基修飾的核苷酸；小寫字母f表示該字母f左側相鄰的一個核苷酸為氟代修飾的核苷酸；小寫字母s表示與該字母s左右相鄰的兩個核苷酸之間為硫代磷酸酯基連接；P1表示該P1右側相鄰的一個核苷酸為5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸類似物修飾的核苷酸，在一些實施方式中，P1是表示具體修飾的VP、Ps或P，其中，字母組合VP表示該字母組合VP右側相鄰的一個核苷酸為乙烯基磷酸酯（5'-(E)-vinylphosphonate，E-VP）修飾的核苷酸，字母組合Ps表示該字母組合Ps右側相鄰的一個核苷酸為硫代磷酸酯修飾的核苷酸，大寫字母P表示該字母P右側相鄰的一個核苷酸為5'-磷酸核苷酸。
在上文及下文中，所述“氟代修飾的核苷酸”指核苷酸的核糖基2'位的羥基被氟取代形成的核苷酸，“非氟代修飾的核苷酸”指核苷酸的核糖基2'位的羥基被非氟基團取代形成的核苷酸或核苷酸類似物。“核苷酸類似物”指能夠在核酸中代替核苷酸，但結構不同於腺嘌呤核糖核苷酸、鳥嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸、尿嘧啶核糖核苷酸或胸腺嘧啶去氧核糖核苷酸的基團。如異核苷酸、橋聯的核苷酸（bridged nucleic acid，簡稱BNA）或無環核苷酸。所述“甲氧基修飾的核苷酸”指核糖基的2'-羥基被甲氧基取代而形成的核苷酸。
在本文的上下文中，表述“互補”或“反向互補”可互相替代使用，並具有本領域技術人員周知的含義，即，在雙鏈核酸分子中，一條鏈的鹼基各自與另一條鏈上的鹼基以互補的方式相配對。在DNA中，嘌呤鹼基腺嘌呤（A）始終與嘧啶鹼基胸腺嘧啶（T）（或者在RNA中為尿嘧啶（U））相配對；嘌呤鹼基鳥嘌呤（C）始終與嘧啶鹼基胞嘧啶（G）相配對。每個鹼基對都包括一個嘌呤和一個嘧啶。當一條鏈上的腺嘌呤始終與另一條鏈上的胸腺嘧啶（或尿嘧啶）配對，以及鳥嘌呤始終與胞嘧啶配對時，兩條鏈被認為是彼此相互補的，以及從其互補鏈的序列中可以推斷出該鏈的序列。與此相應地，“錯配”在本領域中意指在雙鏈核酸中，對應位置上的鹼基並未以互補的形式配對存在。
在上文及下文中，如無特別說明，“基本上反向互補”是指所涉及的兩段核苷酸序列之間存在不多於3個的鹼基錯配；“實質上反向互補”是指兩段核苷酸序列之間存在不多於1個的鹼基錯配；“完全反向互補”是指兩段核苷酸序列之間不存在鹼基錯配。
在上文及下文中，特別是在描述本發明的siRNA、藥物組合物或siRNA綴合物的製備方法時，除非特別說明，所述核苷單體（nucleoside monomer）是指，根據欲製備的siRNA或siRNA綴合物中核苷酸的種類和順序，亞磷醯胺固相合成中使用的修飾或未修飾的核苷亞磷醯胺單體（unmodified or modified RNA phosphoramidites，有時RNA phosphoramidites也稱為Nucleoside phosphoramidites）。亞磷醯胺固相合成為本領域技術人員所公知的RNA合成中所用的方法。本發明所用的核苷單體均可商購得到。
在上文或下文中，“經取代的”或“被取代的”基團，如經取代的烷基、經取代的烷氧基、經取代的氨基、經取代的脂族基團、經取代的雜脂族基團、經取代的醯基、經取代的芳基或經取代的雜芳基。其中，如無其他說明，“經取代的”或“被取代的”基團是指該基團中的氫原子被一個或多個取代基所替代而形成的基團。例如，“經取代的烷氧基”是指烷氧基中的一個或多個氫原子被取代基所替代而形成的基團。本領域技術人員能夠理解，可用於本發明應用的化合物中可以包含各種取代基，只要是該取代基的引入不會影響本發明的功能，能夠實現本發明的目的，就可用於本發明。在一些實施方式中，所述取代基選自於由以下基團所組成的群組：C 1-C 10烷基、C 6-C 10芳基、C 5-C 10雜芳基、C 1-C 10鹵代烷基、-OC 1-C 10烷基、­OC 1-C 10烷基苯基、-C 1-C 10烷基-OH、-OC 1-C 10鹵代烷基、-SC 1-C 10烷基、-SC 1-C 10烷基苯基、-C 1-C 10烷基-SH、-SC 1-C 10鹵代烷基、鹵素取代基、-OH、-SH、-NH 2、-C 1-C 10烷基-NH 2、-N(C 1-C 10烷基)(C 1-C 10烷基)、-NH(C 1-C 10烷基)、­N(C 1-C 10烷基)(C 1-C 10烷基苯基)、­NH(C 1-C 10烷基苯基)、-CN、-NO 2、-CO 2H、-C(O)O(C 1-C 10烷基)、-CON(C 1-C 10烷基)(C 1-C 10烷基)、-CONH(C 1-C 10烷基)、-CONH 2，-NHC(O)(C 1-C 10烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C 1-C 10烷基)C(O)(C 1-C 10烷基)、-N(C 1-C 10烷基)C(O)(苯基)、­C(O)C 1-C 10烷基、­C(O)C 1-C 10烷基苯基、­C(O)C 1-C 10鹵代烷基、-OC(O)C 1-C 10烷基、-SO 2(C 1-C 10烷基)、-SO 2(苯基)、-SO 2(C 1-C 10鹵代烷基)、-SO 2NH 2、-SO 2NH(C 1-C 10烷基)、-SO 2NH(苯基)、-NHSO 2(C 1-C 10烷基)、-NHSO 2(苯基)和-NHSO 2(C 1-C 10鹵代烷基)。在一些實施方式中，所述取代基是C 1-C 3烷基、C 6-C 8芳基、-OC 1-C 3烷基、­OC 1-C 3烷基苯基、鹵素、-OH、-NH 2、-CN或-NO 2中的一種。本領域技術人員將理解的是，對於包含一個或多個取代基的任何基團，這些基團不打算引入空間上不切實際、合成上不可行和/或本身不穩定的任何取代或取代模式。
如本文所使用的，“烷基”是指具有指定數量的碳原子的直鏈和支鏈，所述數量通常為1至20個碳原子，例如1至10個碳原子，如1至8個或1至6個碳原子。例如，C 1-C 6烷基包含1至6個碳原子的直鏈和支鏈烷基。當提及具有特定數量的碳的烷基殘基時，旨在涵蓋具有該數量的碳的所有支鏈和直鏈形式；因此，例如，“丁基”意味著包括正丁基、仲丁基、異丁基和叔丁基；“丙基”包括正丙基和異丙基。亞烷基是烷基的子集，指與烷基相同、但具有兩個連接點的殘基。
如本文所使用的，“烯基”是指具有至少一個碳-碳雙鍵的不飽和支鏈或直鏈烷基，所述碳-碳雙鍵是通過從母體烷基的相鄰碳原子中除去一分子氫而獲得的。該基團可以處於雙鍵的順式或反式構型。典型的烯基基團包括但不限於：乙烯基；丙烯基，如丙-1-烯-1-基、丙-1-烯-2-基、丙-2-烯-1-基（烯丙基）、丙-2-烯-2-基；丁烯基，例如丁-1-烯-1-基、丁-1-烯-2-基、2-甲基丙-1-烯-1-基、丁-2-烯-1-基、丁-2-烯-2-基、丁-1,3-二烯-1-基、丁-1,3-二烯-2-基等等。在某些實施方式中，烯基基團具有2到20個碳原子，而在其他實施方式中，具有2至10個、2至8個或2至6個碳原子。亞烯基是烯基的一個子集，指與烯基相同、但具有兩個連接點的殘基。
如本文所使用的，“炔基”是指具有至少一個碳-碳三鍵的不飽和支鏈或直鏈烷基，所述碳-碳三鍵是通過從母體烷基的相鄰碳原子中除去兩分子氫而獲得的。典型的炔基基團包括但不限於：乙炔基；丙炔基，如丙-1-炔-1-基，丙-2-炔-1-基；丁炔基，例如丁-1-炔-1-基，丁-1-炔-3-基，丁-3-炔-1-基等。在某些實施方式中，炔基具有2到20個碳原子，而在其他實施方式中，具有2至10、2至8或2至6個碳原子。亞炔基是炔基的一個子集，指的是與炔基相同、但有兩個連接點的殘基。
如本文所使用的，“烷氧基”是指通過氧橋連接的指定數量碳原子的烷基，例如，甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、2-戊氧基、異戊氧基、新戊氧基、己氧基、2-己氧基、3-己氧基、3-甲基戊氧基等。烷氧基通常具有1至10個、1至8個、1至6個，或1至4個通過氧橋連接的碳原子。
如本文所使用的，“芳基”是指通過從環碳原子中除去氫原子而衍生自芳香族單環或多環烴環系統形成的基團。所述芳香族單環或多環烴環系統僅含有氫和6至18個碳原子的碳，其中所述環系統中的至少一個環是完全不飽和的，即，包含根據Hückel理論的環狀、離域的(4n+2)π-電子體系。芳基包括但不限於苯基、芴基和萘基等基團。亞芳基是芳基的子集，指與芳基相同、但具有兩個連接點的殘基。
“雜芳基”指由3-至18-元芳香環自由基衍生而成的基團，包含2個至17個碳原子和選自氮、氧和硫的1至6個雜原子。如本文所使用的，雜芳基可以是單環、雙環、三環或四環系統，其中環系統中的至少一個環是完全不飽和的，即，包含根據Hückel理論的環狀離域(4n+2)π-電子體系。雜芳基包括稠環或橋環系統。在一些實施方式中，雜芳基中的雜原子是氧化的雜原子。在一些實施方式中，雜芳基中包含一個或多個氮原子。在一些實施方式中，雜芳基中的氮原子中的一個或多個是季銨化的氮原子。雜芳基通過任何環原子附著至分子的其餘部分。雜芳基的實例包括但不限於：氮雜環庚三烯基、吖啶基、苯並咪唑基、苯並吲哚基、1,3-苯並二噁唑基、苯並呋喃基、苯並噁唑基、苯並[d]噻唑基、苯並噻二唑基、苯並[b][1,4]二噁庚英基(benzo[b][1,4]dioxepinyl)、苯並[b][1,4]噁嗪基（benzo[b][1,4]oxazinyl）、1,4-苯並二噁烷基（1,4-benzodioxanyl）、苯並萘並呋喃基、苯並噁唑基、苯並間二氧雜環戊烯基(benzodioxolyl)、苯並二噁英基(benzodioxinyl)、苯並吡喃基、苯並吡喃酮基、苯並呋喃基、苯並呋喃酮基、苯並噻吩基、苯並噻吩並[3,2-d]嘧啶基、苯並三唑基、苯並[4,6]咪唑並[1,2-a]吡啶基、哢唑基、噌啉基（cinnolinyl）、環戊烷並[d]嘧啶基、6,7-二氫-5H-環戊烷並[4,5]噻吩並[2,3-d]嘧啶基、5,6-二氫苯並[h]喹唑啉基（5,6-dihydrobenzo[h]quinazolinyl）、5,6-二氫苯並[h]噌啉基（5,6 dihydrobenzo[h]cinnolinyl）、6,7-二氫-5H-苯並[6,7]環庚烷並[1,2-c]噠嗪基、二苯並呋喃基、二苯並噻吩基、呋喃基、呋喃酮基、呋喃並[3,2-c]吡啶基、5,6,7,8,9,10-六氫環辛烷並[d]嘧啶基、5,6,7,8,9,10-六氫環辛烷並[d]噠嗪基、5,6,7,8,9,10-六氫環辛烷並[d]吡啶基、異噻唑基、咪唑基、吲唑基（indazolyl）、吲哚基、異吲哚基、二氫吲哚基、異二氫吲哚基、異喹啉基、吲哚嗪基（indolizinyl）、異噁唑基、5,8-甲醇-5,6,7,8-四氫喹唑啉基（5,8-methano-5,6,7,8-tetrahydroquinazolinyl）、萘啶基（naphthyridinyl）、1,6-萘啶酮基（1,6-naphthyridinonyl）、噁二唑基、2-氧雜吖庚因基（2-oxoazepinyl）、噁唑基、氧雜環丙烷基（oxiranyl）、5,6,6a,7,8,9,10,10a-八氫苯並[H]喹唑啉基、1-苯基-1H-吡咯基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁嗪基、酞嗪基（phthalazinyl）、蝶啶基（pteridinyl）、嘌呤基、吡咯基、吡唑基、吡唑並[3,4-d]嘧啶基、吡啶基、吡啶並[3,2-d]嘧啶基、吡啶並[3,4-d]嘧啶基、吡嗪基、嘧啶基、噠嗪基、吡咯基、喹唑啉基、喹喔啉基（quinoxalinyl）、喹啉基、四氫喹啉基、5,6,7,8-四氫喹唑啉基、5,6,7,8-四氫苯並[4,5]噻吩並[2,3-d]嘧啶基、6,7,8,9-四氫-5H-環庚烷並[4,5]噻吩並[2,3-d]嘧啶基、5,6,7,8-四氫吡啶並[4,5-c]噠嗪基、噻唑基、噻二唑基、三唑基、四唑基、三嗪基、噻吩並[2,3-d]嘧啶基、噻吩並[3,2-d]嘧啶基、噻吩並[2,3-c]吡啶基（thieno[2,3-c]pridinyl）和噻吩基（thiophenyl/thienyl）。
如本文所使用的，“鹵素取代基”或“鹵代”指氟代、氯代、溴代和碘代，術語“鹵素”包括氟、氯、溴和碘。
如本文所使用的，“鹵代烷基”是指指定數量的氫原子被一個或多個、直至最大允許數量的鹵素原子取代的如上述所定義的烷基。鹵代烷基的實例包括但不限於三氟甲基、二氟甲基、2-氟乙基和五氟乙基。
在本發明中可以使用各種羥基保護基團。一般來說，保護基團使化學官能團對特定的反應條件不敏感，並且可以在分子中的該官能團上添加以及去除，而不實質上損害分子的其餘部分。代表性的羥基保護基團公開於Beaucage等人，Tetrahedron 1992, 48, 2223-2311，以及Greeneand Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，Chapter 2, 2d ed，John Wiley & Sons，New York，1991中，以引用的方式將上述文獻各自整體併入本文。在一些實施方式中，保護基團在鹼性條件下穩定，但可以在酸性條件下脫除。在一些實施方式中，本文可使用的羥基保護基的非排他性實例包括二甲氧基三苯甲基（DMT）、單甲氧基三苯甲基、9-苯基氧雜蒽-9-基（Pixyl）和9-(對甲氧基苯基) 氧雜蒽-9-基（Mox）。在一些實施方式中，本文可使用的羥基保護基的非排他性實例包括Tr（三苯甲基）、MMTr（4-甲氧基三苯甲基）、DMTr（4,4'-二甲氧基三苯甲基）和TMTr（4,4',4''-三甲氧基三苯甲基）。
“受試者”一詞，如本文所使用的，指任何動物，例如哺乳動物或有袋動物。本發明的受試者包括但不限於人類、非人靈長類（例如，恒河猴或其他類型的獼猴）、小鼠、豬、馬、驢、牛、兔、綿羊、大鼠和任何種類的家禽。
如本文所使用的，“治療”指的是獲得有益的或期望的結果的方法，包括但不限於治療益處。“治療益處”意味著根除或改善被治療的潛在障礙。此外，治療益處通過根除或改善與潛在障礙相關的一個或多個生理症狀，從而在受試者中觀察到改善而獲得，儘管受試者可能仍然受到潛在障礙的折磨。
如本文所使用的“預防”指獲得有益或期望的結果的方法，包括但不限於預防性益處。為了獲得“預防性益處”，可將雙鏈siRNA、藥物組合物或siRNA綴合物給予有罹患特定疾病風險的受試者，或給予報告疾病的一種或多種生理症狀的受試者，即便可能該疾病的診斷尚未作出。
本發明所述siRNA或siRNA綴合物中，每個相鄰核苷酸之間由磷酸二酯鍵或硫代磷酸二酯鍵連接，磷酸二酯鍵或硫代磷酸二酯鍵中的非橋接氧原子或硫原子帶有負電荷，它可以以羥基或巰基的形式存在，羥基或巰基中的氫離子也可以部分或全部被陽離子取代。所述陽離子可以是任意的陽離子，如金屬陽離子，銨離子NH 4 +，有機銨陽離子中的一種，處於提高溶解性考慮，在一些實施方式中，所述陽離子選自鹼金屬離子、三級胺形成的銨陽離子和季銨陽離子中的一種或多種。鹼金屬陽離子可以是K +和/或Na +，三級胺形成的陽離子可以是三乙胺形成的銨離子和/或N,N-二異丙基乙胺形成的銨離子。因此，本發明所述siRNA或siRNA綴合物可以至少部分以鹽的形式存在。在一些實施方式中，磷酸二酯鍵或硫代磷酸二酯鍵中的非橋接氧原子或硫原子至少部分與鈉離子結合，本發明所述siRNA或siRNA綴合物以鈉鹽或部分鈉鹽的形式存在。因此，在提及本發明所述的siRNA或siRNA綴合物，包括但不限於本發明所述的任何結構式表示的siRNA綴合物時，均旨在涵蓋該siRNA或siRNA綴合物的鈉鹽或部分鈉鹽形式。
本發明的 siRNA
在一方面，本發明提供了一種具有較高的 HSD17B13基因抑制活性的siRNA。
本發明的siRNA含有核苷酸基團作為基本結構單元，本領域技術人員公知，所述核苷酸基團含有磷酸基團、核糖基團和鹼基，在此不再贅述。
本發明的siRNA包含正義鏈和反義鏈，所述正義鏈包含核苷酸序列I，所述反義鏈包含核苷酸序列II，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II均由19個核苷酸組成，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II中的每一個核苷酸均為修飾或未修飾的核苷酸，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II至少部分地與第一段核苷酸序列反向互補，所述第一段核苷酸序列為 HSD17B13基因表達的mRNA中的一段長度為19個核苷酸的核苷酸序列，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的第3至6個核苷酸中的至少1個為穩定化修飾核苷酸，所述穩定化修飾核苷酸指核苷酸的核糖2'位羥基被穩定化修飾基團取代的核苷酸，與相應位置的核苷酸為未修飾的核苷酸的siRNA相比，包含所述穩定化修飾的核苷酸siRNA的熱穩定性增加，並且所述穩定化修飾基團的空間位阻大於2'-O-甲基。
在一些實施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II中的第3個或第5個核苷酸為所述穩定化修飾核苷酸。在一些實施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II中的第3至9個核苷酸中不超過2個核苷酸為所述穩定化修飾核苷酸。通過對特定位置處穩定化修飾核苷酸的個數進行限定，本發明的siRNA可獲得最佳的藥學活性與低的脫靶效應的平衡，同時還具有優異的穩定性。在一些實施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II中的第3個和/或第5個核苷酸為所述穩定化修飾核苷酸。在一些實施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II中的第3個核苷酸為所述穩定化修飾核苷酸。在一些實施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II中的第5個核苷酸為所述穩定化修飾核苷酸。
在一些實施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II中第3至9個核苷酸之外的核苷酸均不是穩定化修飾核苷酸。若核苷酸序列II中在第3至6個核苷酸中的至少1個為穩定化修飾的核苷酸的同時，在第3至9個核苷酸之外包含穩定化修飾核苷酸，可能會顯著影響該siRNA的目標序列表達水平的調節能力。
在一些實施方式中，本發明的上下文中“siRNA的熱穩定性增加”是指所述siRNA的熱解離溫度（Tm）升高。在一些實施方式中，“雙鏈siRNA的熱穩定性增加”是指siRNA的Tm升高至少0.05℃，在一些實施方式中指升高0.1至6℃，在一些實施方式中指Tm升高0.5至4℃。通過在特定位置包含穩定化修飾核苷酸，本發明的siRNA出人意料地表現出更高的 HSD17B13mRNA抑制活性。在一些實施方式中，本發明的siRNA還顯示出與不包含穩定化修飾核苷酸的siRNA相比更低的脫靶效應。
在一些實施方式中，每個所述穩定化修飾基團獨立地具有-X-R所示的結構，其中，X為O、NR'、S或SiR' 2；R是C 2-C 6烷基、取代的C 2-C 6烷基、C 6-C 8芳基、取代的C 6-C 8芳基中的一種，每個R'獨立地是H、C 1-C 6烷基、取代的C 1-C 6烷基、C 6-C 8芳基、取代的C 6-C 8芳基中的一種，所述取代的C 2-C 6烷基、取代的C 6-C 8芳基或取代的C 1-C 6烷基指C 2-C 6烷基、C 6-C 8芳基或C 1-C 6烷基中的一個或多個氫原子被取代基團取代而形成的基團，所述取代基團選自以下取代基中的一種或多種：C 1-C 3烷基、C 6-C 8芳基、C 1-C 3烷氧基、鹵素、氧亞基和硫亞基。注意的是，本發明並非旨在涵蓋全部符合上述結構的修飾基團，而僅涉及哪些能夠實現siRNA熱穩定性增加的穩定化修飾基團，在一些實施方式中，每個所述穩定化修飾基團獨立地選自2'-O-甲氧基乙基、2'-O-烯丙基、2'-烯丙基、2'-O-2-N-甲基氨基-2-氧亞基乙基、2'-O-2-N,N-二甲基氨基乙基、2'-O-3-氨基丙基和2'-O-2,4-二硝基苯基中的一種。在一些實施方式中，每個所述穩定化修飾基團均為2'-O-甲氧基乙基。
在一些實施方式中，所述正義鏈和反義鏈長度相同或不同，所述正義鏈的長度為19至23個核苷酸，所述反義鏈的長度為19至26個核苷酸，這樣，本發明提供的siRNA正義鏈和反義鏈的長度比可以是19/19、19/20、19/21、19/22、19/23、19/24、19/25、19/26、20/20、20/21、20/22、20/23、20/24、20/25、20/26、21/20、21/21、21/22、21/23、21/24、21/25、21/26、22/20、22/21、22/22、22/23、22/24、22/25、22/26、23/20、23/21、23/22、23/23、23/24、23/25或23/26。在一些實施方式中，所述siRNA正義鏈和反義鏈的長度比為19/21、21/23或23/25。
在一些實施方式中，本發明的具有穩定化修飾核苷酸的siRNA可以是以下第一種至第七種的siRNA，在下文中分別對每一種siRNA進行說明。
第一種 siRNA
在一些實施方式中，本發明的siRNA是第一種siRNA。其中，所述核苷酸序列I與SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異，且所述核苷酸序列II與SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異： 5'- GAAUAAUGCUGGGACAGUZ a1-3' (SEQ ID NO: 1 ); 5'- Z a2ACUGUCCCAGCAUUAUUC-3' (SEQ ID NO: 2 )， 其中，所述Z a1為A，Z a2為U， 並且，所述核苷酸序列I中包含位置對應於Z a1的核苷酸Z a3，所述核苷酸序列II中包含位置對應於Z a2的核苷酸Z a4，所述Z a4是所述反義鏈的5'末端的第一個核苷酸。在一些實施方式中，所述第一段核苷酸序列是如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。在本發明的上文與下文中，“位置對應”是指從核苷酸序列相同端起算，處於核苷酸序列中相同的位置，例如，核苷酸序列I的3'端第一個核苷酸是位置對應於SEQ ID NO:1的第1個核苷酸的核苷酸。
在一些實施方式中，所述正義鏈僅包含核苷酸序列I，所述反義鏈僅包含核苷酸序列II。
在一些實施方式中，所述核苷酸序列I與SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列之間不多於1個核苷酸差異，和/或所述核苷酸序列II與SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列之間不多於1個核苷酸差異。
在一些實施方式中，所述核苷酸序列II與SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列之間的差異包括Z a4位置處的差異，且Z a4選自A、G或C。在一些實施方式中，所述Z a3是與Z a4互補的核苷酸。在一些實施方式中，所述核苷酸序列II與SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列之間的差異為Z a4位置處的差異，且Z 4選自A、G或C。在一些實施方式中，本發明siRNA的核苷酸序列中的每個U或者T可任意地相互替換。這些核苷酸差異並不會顯著降低siRNA的靶基因抑制能力或者提高siRNA的脫靶效應。而這些包含核苷酸差異的siRNA也在本發明的保護範圍之內。
在一些實施方式中，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II基本上反向互補、實質上反向互補或完全反向互補；所述基本上反向互補是指兩個核苷酸序列之間存在不多於3個鹼基的錯配；所述實質上反向互補是指兩個核苷酸序列之間存在不多於1個鹼基的錯配；所述完全反向互補是指兩個核苷酸序列之間沒有錯配。
在一些實施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的第3至19位的核苷酸與所述第一段核苷酸序列第1至17位的核苷酸完全反向互補。
在一些實施方式中，所述核苷酸序列II與所述核苷酸序列I完全反向互補，或者按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II中的第2個核苷酸與按照3'末端到5'末端的方向，所述核苷酸序列I中的第2個核苷酸之間存在鹼基錯配。通過包含該鹼基錯配，本發明的siRNA對目標基因表達的抑制活性得以進一步提升。在一些實施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II中的第2個核苷酸為A；按照3'末端到5'末端的方向，所述核苷酸序列I中的第2個核苷酸選自A、G或C。
在一些實施方式中，所述正義鏈還含有核苷酸序列III，所述反義鏈還含有核苷酸序列IV，所述核苷酸序列III和核苷酸序列IV中的每個核苷酸各自獨立地為非氟代修飾的核苷酸的一種並且不是所述穩定化修飾核苷酸，所述核苷酸序列III和核苷酸序列IV的長度各自為1至4個核苷酸，所述核苷酸序列IV和所述核苷酸序列III長度相等，並且所述核苷酸序列IV和所述核苷酸序列III實質上反向互補或完全反向互補，所述核苷酸序列III連接在所述核苷酸序列I的5'末端，所述核苷酸序列IV連接在所述核苷酸序列II的3'末端。並且，所述核苷酸序列IV與第二段核苷酸序列實質上反向互補或完全反向互補，該第二段核苷酸序列是指和 HSD17B13基因表達的mRNA中與前述第一段核苷酸序列的5'末端相鄰、且長度與所述核苷酸序列IV相同的核苷酸序列。
在一些實施方式中，所述核苷酸序列III和IV的長度均為1個核苷酸，所述核苷酸序列III的鹼基為U，核苷酸序列IV的鹼基為A，所述第二段核苷酸序列的鹼基為U；此時，正義鏈和反義鏈的長度比為20/20；或者，所述核苷酸序列III和IV的長度均為2個核苷酸，所述核苷酸序列III的鹼基組成為GU，所述核苷酸序列IV的鹼基組成為AC，所述第二段核苷酸序列的鹼基組成為GU；此時，正義鏈和反義鏈的長度比為21/21；或者，所述核苷酸序列III和IV的長度均為3個核苷酸，所述核苷酸序列III的鹼基組成為GGU，所述核苷酸序列IV的鹼基組成為ACC，所述第二段核苷酸序列的鹼基組成為GGU；此時，正義鏈和反義鏈的長度比為22/22；或者，所述核苷酸序列III和IV的長度均為4個核苷酸，所述核苷酸序列III的鹼基組成為UGGU，所述核苷酸序列IV的鹼基組成為ACCA，所述第二段核苷酸序列的鹼基組成為UGGU；此時，正義鏈和反義鏈的長度比為23/23。
在一些實施方式中，核苷酸序列III和核苷酸序列IV完全反向互補，因此，給出了核苷酸序列III的鹼基組成，核苷酸鹼基IV的鹼基組成也就確定了。
第二種 siRNA
在一些實施方式中，本發明的siRNA是第二種siRNA，其中所述核苷酸序列I與SEQ ID NO:27所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異，且所述核苷酸序列II與SEQ ID NO:28所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異： 5'- GCACCAAGGAUGAAGAGAZ b1-3' (SEQ ID NO: 27); 5'- Z b2UCUCUUCAUCCUUGGUGC-3' (SEQ ID NO: 28)， 其中Z b1為U，Z b2為A，所述核苷酸序列I中包含位置對應於Z b1的核苷酸Z b3，所述核苷酸序列II中包含位置對應於Z b2的核苷酸Z b4，所述Z b4是所述反義鏈的5'末端的第一個核苷酸。
在一些實施方式中，所述第一段核苷酸序列是如SEQ ID NO:27所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，所述正義鏈僅包含核苷酸序列I，所述反義鏈僅包含核苷酸序列II。
在一些實施方式中，所述核苷酸序列I與SEQ ID NO:27所示的核苷酸序列之間不多於1個核苷酸差異，和/或所述核苷酸序列II與SEQ ID NO:28所示的核苷酸序列之間不多於1個核苷酸差異。
在一些實施方式中，所述核苷酸序列II與SEQ ID NO:28所示的核苷酸序列之間的差異包括Z b4位置處的差異，且Z b4選自U、G或C。在一些實施方式中，所述核苷酸差異為Z b4位置處的差異，且Z b4選自U、G或C。在一些實施方式中，Z b3是與Z b4互補的核苷酸。在一些實施方式中，本發明siRNA的核苷酸序列中的每個U或者T可任意地相互替換。這些核苷酸差異並不會顯著降低siRNA的靶基因抑制能力或者提高siRNA的脫靶效應。而這些包含核苷酸差異的siRNA也在本發明的保護範圍之內。
在一些實施方式中，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II基本上反向互補、實質上反向互補或完全反向互補；所述基本上反向互補是指兩個核苷酸序列之間存在不多於3個鹼基的錯配；所述實質上反向互補是指兩個核苷酸序列之間存在不多於1個鹼基的錯配；所述完全反向互補是指兩個核苷酸序列之間沒有錯配。
在一些實施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的第3至19位的核苷酸與所述第一段核苷酸序列第1至17位的核苷酸完全反向互補。在一些實施方式中，所述核苷酸序列II與所述核苷酸序列I完全反向互補，或者按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II中的第2個核苷酸與按照3'末端到5'末端的方向，所述核苷酸序列I中的第2個核苷酸之間存在鹼基錯配。通過包含該鹼基錯配，本發明的siRNA對目標基因表達的抑制活性得以進一步提升。在一些實施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II中的第2個核苷酸為U；按照3'末端到5'末端的方向，所述核苷酸序列I中的第2個核苷酸選自U、G或C。
在一些實施方式中，所述正義鏈還含有核苷酸序列III, 所述反義鏈還含有核苷酸序列IV，所述核苷酸序列III和核苷酸序列IV的每個核苷酸獨立地為非氟代修飾的核苷酸中的一種且不是所述穩定化修飾核苷酸，所述核苷酸序列III和核苷酸序列IV的長度各自為1至4個核苷酸，所述核苷酸序列IV和所述核苷酸序列III長度相等，並且所述核苷酸序列IV和所述核苷酸序列III實質上反向互補或完全反向互補，所述核苷酸序列III連接在所述核苷酸序列I的5'末端，所述核苷酸序列IV連接在所述核苷酸序列II的3'末端。並且，所述核苷酸序列IV與第二段核苷酸序列實質上反向互補或完全反向互補，該第二段核苷酸序列是指和 HSD17B13基因表達的mRNA中與前述第一段核苷酸序列的5'末端相鄰、且長度與所述核苷酸序列IV相同的核苷酸序列。
在一些實施方式中，所述核苷酸序列III和核苷酸序列IV的長度均為1個核苷酸，所述核苷酸序列III的鹼基為A，所述核苷酸序列IV的鹼基為U，所述第二段核苷酸序列的鹼基為A；此時，正義鏈和反義鏈的長度比為20/20；或者，所述核苷酸序列III和核苷酸序列IV的長度均為2個核苷酸，所述核苷酸序列III的鹼基組成為CA，所述核苷酸序列IV的鹼基組成為UG，所述第二段核苷酸序列的鹼基組成為CA；此時，正義鏈和反義鏈的長度比為21/21；或者，所述核苷酸序列III和核苷酸序列IV的長度均為3個核苷酸，所述核苷酸序列III的鹼基組成為UCA，所述核苷酸序列IV的鹼基組成為UGA，所述第二段核苷酸序列的鹼基組成為UCA，此時，正義鏈和反義鏈的長度比為22/22；或者，所述核苷酸序列III和核苷酸序列IV的長度均為4個核苷酸，所述核苷酸序列III的鹼基組成為CUCA，所述核苷酸序列IV的鹼基組成為UGAG，所述第二段核苷酸序列的鹼基組成為CUCA；此時，正義鏈和反義鏈的長度比為23/23。
在一些實施方式中，核苷酸序列III和核苷酸序列IV完全反向互補，因此，給出了核苷酸序列III的鹼基組成，核苷酸序列IV的鹼基組成也就確定了。
第三種 siRNA
在一些實施方式中，本發明的siRNA是第三種siRNA。其中，所述核苷酸序列I與SEQ ID NO:53所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異，且所述核苷酸序列II與SEQ ID NO:54所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異： 5'- CACCAAGGAUGAAGAGAUZ c1-3' (SEQ ID NO: 53); 5'- Z c2AUCUCUUCAUCCUUGGUG-3' (SEQ ID NO: 54)， 其中Z c1為U，Z c2為A，所述核苷酸序列I中包含位置對應於Z c1的核苷酸Z c3，所述核苷酸序列II中包含位置對應於Z c2的核苷酸Z c4，所述Z c4是所述反義鏈的5'末端的第一個核苷酸。
在一些實施方式中，所述第一段核苷酸序列是如SEQ ID NO:53所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，所述正義鏈僅包含核苷酸序列I，所述反義鏈僅包含核苷酸序列II。
在一些實施方式中，所述核苷酸序列I與SEQ ID NO:53所示的核苷酸序列之間不多於1個核苷酸差異，和/或所述核苷酸序列II與SEQ ID NO:54所示的核苷酸序列之間不多於1個核苷酸差異。
在一些實施方式中，所述核苷酸序列II與SEQ ID NO:54所示的核苷酸序列之間的差異包括Z c4位置處的差異，且Z c4選自U、G或C。在一些實施方式中，所述Z c3是與Z c4互補的核苷酸。在一些實施方式中，所述核苷酸序列II與SEQ ID NO:54所示的核苷酸序列之間的差異為Z c4位置處的差異，且Z c4選自U、G或C。在一些實施方式中，本發明siRNA的核苷酸序列中的每個U或者T可任意地相互替換。這些核苷酸差異並不會顯著降低siRNA的靶基因抑制能力或者提高siRNA的脫靶效應。而這些包含核苷酸差異的siRNA也在本發明的保護範圍之內。
在一些實施方式中，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II基本上反向互補、實質上反向互補或完全反向互補；所述基本上反向互補是指兩個核苷酸序列之間存在不多於3個鹼基的錯配；所述實質上反向互補是指兩個核苷酸序列之間存在不多於1個鹼基的錯配；所述完全反向互補是指兩個核苷酸序列之間沒有錯配。
在一些實施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的第3至19位的核苷酸與所述第一段核苷酸序列第1至17位的核苷酸完全反向互補。在一些實施方式中，所述核苷酸序列II與所述核苷酸序列I完全反向互補，或者按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II中的第2個核苷酸與按照3'末端到5'末端的方向，所述核苷酸序列I中的第2個核苷酸之間存在鹼基錯配。通過包含該鹼基錯配，本發明的siRNA對目標基因表達的抑制活性得以進一步提升，同時脫靶效應出人意料地進一步降低。在一些實施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II中的第2個核苷酸為A；按照3'末端到5'末端的方向，所述核苷酸序列I中的第2個核苷酸選自A、G或C。
在一些實施方式中，所述正義鏈還含有核苷酸序列III，所述反義鏈還含有核苷酸序列IV，所述核苷酸序列III和核苷酸序列IV中的每個核苷酸各自獨立地為非氟代修飾的核苷酸的一種並且不是所述穩定化修飾核苷酸，所述核苷酸序列III和核苷酸序列IV的長度各自為1至4個核苷酸，所述核苷酸序列IV和所述核苷酸序列III長度相等，並且所述核苷酸序列IV和所述核苷酸序列III實質上反向互補或完全反向互補，所述核苷酸序列III連接在所述核苷酸序列I的5'末端，所述核苷酸序列IV連接在所述核苷酸序列II的3'末端。並且，所述核苷酸序列IV與第二段核苷酸序列實質上反向互補或完全反向互補，該第二段核苷酸序列是指和 HSD17B13基因表達的mRNA中與前述第一段核苷酸序列的5'末端相鄰、且長度與所述核苷酸序列IV相同的核苷酸序列。
在一些實施方式中，所述核苷酸序列III和IV的長度均為1個核苷酸，所述核苷酸序列III的鹼基為G，核苷酸序列IV的鹼基為C，所述第二段核苷酸序列的鹼基為G；此時，正義鏈和反義鏈的長度比為20/20；或者，所述核苷酸序列III和IV的長度均為2個核苷酸，所述核苷酸序列III的鹼基組成為AG，所述核苷酸序列IV的鹼基組成為CU，所述第二段核苷酸序列的鹼基組成為AG；此時，正義鏈和反義鏈的長度比為21/21；或者，所述核苷酸序列III和IV的長度均為3個核苷酸，所述核苷酸序列III的鹼基組成為CAG，所述核苷酸序列IV的鹼基組成為CUG，所述第二段核苷酸序列的鹼基組成為CAG；此時，正義鏈和反義鏈的長度比為22/22；或者，所述核苷酸序列III和IV的長度均為4個核苷酸，所述核苷酸序列III的鹼基組成為UCAG，所述核苷酸序列IV的鹼基組成為CUGA，所述第二段核苷酸序列的鹼基組成為UCAG；此時，正義鏈和反義鏈的長度比為23/23。
在一些實施方式中，核苷酸序列III和核苷酸序列IV完全反向互補，因此，給出了核苷酸序列III的鹼基組成，核苷酸鹼基IV的鹼基組成也就確定了。
第四種 siRNA
在一些實施方式中，本發明的siRNA是第四種siRNA。其中，所述核苷酸序列I與SEQ ID NO:79所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異，且所述核苷酸序列II與SEQ ID NO:80所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異： 5'- UCUGAUAGAUGGAAUACUZ d1-3' (SEQ ID NO: 79); 5'- Z d2AGUAUUCCAUCUAUCAGA-3' (SEQ ID NO: 80)， 其中Z d1為U，Z d2為A，所述核苷酸序列I中包含位置對應於Z d1的核苷酸Z d3，所述核苷酸序列II中包含位置對應於Z d2的核苷酸Z d4，所述Z d4是所述反義鏈的5'末端的第一個核苷酸。
在一些實施方式中，所述第一段核苷酸序列是如SEQ ID NO:79所示的核苷酸序列。在一些實施方式中，所述正義鏈僅包含核苷酸序列I，所述反義鏈僅包含核苷酸序列II。
在一些實施方式中，所述核苷酸序列I與SEQ ID NO:79所示的核苷酸序列之間不多於1個核苷酸差異，和/或所述核苷酸序列II與SEQ ID NO:80所示的核苷酸序列之間不多於1個核苷酸差異。
在一些實施方式中，所述核苷酸序列II與SEQ ID NO:80所示的核苷酸序列之間的差異包括Z d4位置處的差異，且Z d4選自U、G或C。在一些實施方式中，所述Z d3是與Z d4互補的核苷酸。在一些實施方式中，所述核苷酸序列II與SEQ ID NO:80所示的核苷酸序列之間的差異為Z d4位置處的差異，且Z d4選自U、G或C。在一些實施方式中，本發明siRNA的核苷酸序列中的每個U或者T可任意地相互替換。這些核苷酸差異並不會顯著降低siRNA的靶基因抑制能力或者提高siRNA的脫靶效應。而這些包含核苷酸差異的siRNA也在本發明的保護範圍之內。
在一些實施方式中，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II基本上反向互補、實質上反向互補或完全反向互補；所述基本上反向互補是指兩個核苷酸序列之間存在不多於3個鹼基的錯配；所述實質上反向互補是指兩個核苷酸序列之間存在不多於1個鹼基的錯配；所述完全反向互補是指兩個核苷酸序列之間沒有錯配。
在一些實施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的第3至19位的核苷酸與所述第一段核苷酸序列第1至17位的核苷酸完全反向互補。在一些實施方式中，所述核苷酸序列II與所述核苷酸序列I完全反向互補，或者按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II中的第2個核苷酸與按照3'末端到5'末端的方向，所述核苷酸序列I中的第2個核苷酸之間存在鹼基錯配。通過包含該鹼基錯配，本發明的siRNA對目標基因表達的抑制活性得以進一步提升。在一些實施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II中的第2個核苷酸為A；按照3'末端到5'末端的方向，所述核苷酸序列I中的第2個核苷酸選自A、G或C。
在一些實施方式中，所述正義鏈還含有核苷酸序列III，所述反義鏈還含有核苷酸序列IV，所述核苷酸序列III和核苷酸序列IV中的每個核苷酸各自獨立地為非氟代修飾的核苷酸的一種並且不是所述穩定化修飾核苷酸，所述核苷酸序列III和核苷酸序列IV的長度各自為1至4個核苷酸，所述核苷酸序列IV和所述核苷酸序列III長度相等，並且所述核苷酸序列IV和所述核苷酸序列III實質上反向互補或完全反向互補，所述核苷酸序列III連接在所述核苷酸序列I的5'末端，所述核苷酸序列IV連接在所述核苷酸序列II的3'末端。並且，所述核苷酸序列IV與第二段核苷酸序列實質上反向互補或完全反向互補，該第二段核苷酸序列是指和 HSD17B13基因表達的mRNA中與前述第一段核苷酸序列的5'末端相鄰、且長度與所述核苷酸序列IV相同的核苷酸序列。
在一些實施方式中，所述核苷酸序列III和IV的長度均為1個核苷酸，所述核苷酸序列III的鹼基為G，核苷酸序列IV的鹼基為C，所述第二段核苷酸序列的鹼基為G；此時，正義鏈和反義鏈的長度比為20/20；或者，所述核苷酸序列III和IV的長度均為2個核苷酸，所述核苷酸序列III的鹼基組成為AG，所述核苷酸序列IV的鹼基組成為CU，所述第二段核苷酸序列的鹼基組成為AG；此時，正義鏈和反義鏈的長度比為21/21；或者，所述核苷酸序列III和IV的長度均為3個核苷酸，所述核苷酸序列III的鹼基組成為AAG，所述核苷酸序列IV的鹼基組成為CUU，所述第二段核苷酸序列的鹼基組成為AAG；此時，正義鏈和反義鏈的長度比為22/22；或者，所述核苷酸序列III和IV的長度均為4個核苷酸，所述核苷酸序列III的鹼基組成為GAAG，所述核苷酸序列IV的鹼基組成為CUUC，所述第二段核苷酸序列的鹼基組成為GAAG；此時，正義鏈和反義鏈的長度比為23/23。
在一些實施方式中，核苷酸序列III和核苷酸序列IV完全反向互補，因此，給出了核苷酸序列III的鹼基組成，核苷酸鹼基IV的鹼基組成也就確定了。
第五種 siRNA
在一些實施方式中，本發明的siRNA是第五種siRNA。其中，所述核苷酸序列I與SEQ ID NO:105所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異，且所述核苷酸序列II與SEQ ID NO:106所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異： 5'- CUGAUAGAUGGAAUACUUZ e1-3' (SEQ ID NO: 105); 5'- Z e2AAGUAUUCCAUCUAUCAG-3' (SEQ ID NO: 106)， 其中Z e1為A，Z e2為U，所述核苷酸序列I中包含位置對應於Z e1的核苷酸Z e3，所述核苷酸序列II中包含位置對應於Z e2的核苷酸Z e4，所述Z e4是所述反義鏈的5'末端的第一個核苷酸。
在一些實施方式中，所述第一段核苷酸序列是如SEQ ID NO:105所示的核苷酸序列。在一些實施方式中，所述正義鏈僅包含核苷酸序列I，所述反義鏈僅包含核苷酸序列II。
在一些實施方式中，所述核苷酸序列I與SEQ ID NO:105所示的核苷酸序列之間不多於1個核苷酸差異，和/或所述核苷酸序列II與SEQ ID NO:106所示的核苷酸序列之間不多於1個核苷酸差異。
在一些實施方式中，所述核苷酸序列II與SEQ ID NO:106所示的核苷酸序列之間的差異Z e4位置處的差異，且Z e4選自A、G或C。在一些實施方式中，所述Z e3是與Z e4互補的核苷酸。在一些實施方式中，所述核苷酸序列II與SEQ ID NO:106所示的核苷酸序列之間的差異為Z e4位置處的差異，且Z e4選自A、G或C。在一些實施方式中，本發明siRNA的核苷酸序列中的每個U或者T可任意地相互替換。這些核苷酸差異並不會顯著降低siRNA的靶基因抑制能力或者提高siRNA的脫靶效應。而這些包含核苷酸差異的siRNA也在本發明的保護範圍之內。
在一些實施方式中，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II基本上反向互補、實質上反向互補或完全反向互補；所述基本上反向互補是指兩個核苷酸序列之間存在不多於3個鹼基的錯配；所述實質上反向互補是指兩個核苷酸序列之間存在不多於1個鹼基的錯配；所述完全反向互補是指兩個核苷酸序列之間沒有錯配。
在一些實施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的第3至19位的核苷酸與所述第一段核苷酸序列第1至17位的核苷酸完全反向互補。在一些實施方式中，所述核苷酸序列II與所述核苷酸序列I完全反向互補，或者按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II中的第2個核苷酸與按照3'末端到5'末端的方向，所述核苷酸序列I中的第2個核苷酸之間存在鹼基錯配。通過包含該鹼基錯配，本發明的siRNA對目標基因表達的抑制活性得以進一步提升。在一些實施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II中的第2個核苷酸為A；按照3'末端到5'末端的方向，所述核苷酸序列I中的第2個核苷酸選自A、G或C。
在一些實施方式中，所述正義鏈還含有核苷酸序列III，所述反義鏈還含有核苷酸序列IV，所述核苷酸序列III和核苷酸序列IV中的每個核苷酸各自獨立地為非氟代修飾的核苷酸的一種並且不是所述穩定化修飾核苷酸，所述核苷酸序列III和核苷酸序列IV的長度各自為1至4個核苷酸，所述核苷酸序列IV和所述核苷酸序列III長度相等，並且所述核苷酸序列IV和所述核苷酸序列III實質上反向互補或完全反向互補，所述核苷酸序列III連接在所述核苷酸序列I的5'末端，所述核苷酸序列IV連接在所述核苷酸序列II的3'末端。並且，所述核苷酸序列IV與第二段核苷酸序列實質上反向互補或完全反向互補，該第二段核苷酸序列是指和 HSD17B13基因表達的mRNA中與前述第一段核苷酸序列的5'末端相鄰、且長度與所述核苷酸序列IV相同的核苷酸序列。
在一些實施方式中，所述核苷酸序列III和IV的長度均為1個核苷酸，所述核苷酸序列III的鹼基為U，核苷酸序列IV的鹼基為A，所述第二段核苷酸序列的鹼基為U；此時，正義鏈和反義鏈的長度比為20/20；或者，所述核苷酸序列III和IV的長度均為2個核苷酸，所述核苷酸序列III的鹼基組成為GU，所述核苷酸序列IV的鹼基組成為AC，所述第二段核苷酸序列的鹼基組成為GU；此時，正義鏈和反義鏈的長度比為21/21；或者，所述核苷酸序列III和IV的長度均為3個核苷酸，所述核苷酸序列III的鹼基組成為AGU，所述核苷酸序列IV的鹼基組成為ACU，所述第二段核苷酸序列的鹼基組成為AGU；此時，正義鏈和反義鏈的長度比為22/22；或者，所述核苷酸序列III和IV的長度均為4個核苷酸，所述核苷酸序列III的鹼基組成為AAGU，所述核苷酸序列IV的鹼基組成為ACUU，所述第二段核苷酸序列的鹼基組成為AAGU；此時，正義鏈和反義鏈的長度比為23/23。
在一些實施方式中，核苷酸序列III和核苷酸序列IV完全反向互補，因此，給出了核苷酸序列III的鹼基組成，核苷酸鹼基IV的鹼基組成也就確定了。
第六種 siRNA
在一些實施方式中，本發明的siRNA是第六種siRNA。其中，所述核苷酸序列I與SEQ ID NO:131所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異，且所述核苷酸序列II與SEQ ID NO:132所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異： 5'- GAUGGAAUACUUACCAAUZ f1-3' (SEQ ID NO:131); 5'- Z f2AUUGGUAAGUAUUCCAUC-3' (SEQ ID NO: 132)， 其中Z f1為A，Z f2為U，所述核苷酸序列I中包含位置對應於Z f1的核苷酸Z f3，所述核苷酸序列II中包含位置對應於Z f2的核苷酸Z f4，所述Z f4是所述反義鏈的5'末端的第一個核苷酸。
在一些實施方式中，所述第一段核苷酸序列是如SEQ ID NO:131所示的核苷酸序列。在一些實施方式中，所述正義鏈僅包含核苷酸序列I，所述反義鏈僅包含核苷酸序列II。
在一些實施方式中，所述核苷酸序列I與SEQ ID NO:131所示的核苷酸序列之間不多於1個核苷酸差異，和/或所述核苷酸序列II與SEQ ID NO:132所示的核苷酸序列之間不多於1個核苷酸差異。
在一些實施方式中，所述核苷酸序列II與SEQ ID NO:132所示的核苷酸序列之間的差異Z f4位置處的差異，且Z f4選自A、G或C。在一些實施方式中，所述Z f3是與Z f4互補的核苷酸。在一些實施方式中，所述核苷酸序列II與SEQ ID NO:132所示的核苷酸序列之間的差異為Z f4位置處的差異，且Z f4選自A、G或C。在一些實施方式中，本發明siRNA的核苷酸序列中的每個U或者T可任意地相互替換。這些核苷酸差異並不會顯著降低siRNA的靶基因抑制能力或者提高siRNA的脫靶效應。而這些包含核苷酸差異的siRNA也在本發明的保護範圍之內。
在一些實施方式中，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II基本上反向互補、實質上反向互補或完全反向互補；所述基本上反向互補是指兩個核苷酸序列之間存在不多於3個鹼基的錯配；所述實質上反向互補是指兩個核苷酸序列之間存在不多於1個鹼基的錯配；所述完全反向互補是指兩個核苷酸序列之間沒有錯配。
在一些實施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的第3至19位的核苷酸與所述第一段核苷酸序列第1至17位的核苷酸完全反向互補。在一些實施方式中，所述核苷酸序列II與所述核苷酸序列I完全反向互補，或者按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II中的第2個核苷酸與按照3'末端到5'末端的方向，所述核苷酸序列I中的第2個核苷酸之間存在鹼基錯配。通過包含該鹼基錯配，本發明的siRNA對目標基因表達的抑制活性得以進一步提升。在一些實施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II中的第2個核苷酸為A；按照3'末端到5'末端的方向，所述核苷酸序列I中的第2個核苷酸選自A、G或C。
在一些實施方式中，所述正義鏈還含有核苷酸序列III，所述反義鏈還含有核苷酸序列IV，所述核苷酸序列III和核苷酸序列IV中的每個核苷酸各自獨立地為非氟代修飾的核苷酸的一種並且不是所述穩定化修飾核苷酸，所述核苷酸序列III和核苷酸序列IV的長度各自為1至4個核苷酸，所述核苷酸序列IV和所述核苷酸序列III長度相等，並且所述核苷酸序列IV和所述核苷酸序列III實質上反向互補或完全反向互補，所述核苷酸序列III連接在所述核苷酸序列I的5'末端，所述核苷酸序列IV連接在所述核苷酸序列II的3'末端。並且，所述核苷酸序列IV與第二段核苷酸序列實質上反向互補或完全反向互補，該第二段核苷酸序列是指和 HSD17B13基因表達的mRNA中與前述第一段核苷酸序列的5'末端相鄰、且長度與所述核苷酸序列IV相同的核苷酸序列。
在一些實施方式中，所述核苷酸序列III和IV的長度均為1個核苷酸，所述核苷酸序列III的鹼基為A，核苷酸序列IV的鹼基為U，所述第二段核苷酸序列的鹼基為A；此時，正義鏈和反義鏈的長度比為20/20；或者，所述核苷酸序列III和IV的長度均為2個核苷酸，所述核苷酸序列III的鹼基組成為UA，所述核苷酸序列IV的鹼基組成為UA，所述第二段核苷酸序列的鹼基組成為UA；此時，正義鏈和反義鏈的長度比為21/21；或者，所述核苷酸序列III和IV的長度均為3個核苷酸，所述核苷酸序列III的鹼基組成為AUA，所述核苷酸序列IV的鹼基組成為UAU，所述第二段核苷酸序列的鹼基組成為AUA；此時，正義鏈和反義鏈的長度比為22/22；或者，所述核苷酸序列III和IV的長度均為4個核苷酸，所述核苷酸序列III的鹼基組成為GAUA，所述核苷酸序列IV的鹼基組成為UAUC，所述第二段核苷酸序列的鹼基組成為GAUA；此時，正義鏈和反義鏈的長度比為23/23。
在一些實施方式中，核苷酸序列III和核苷酸序列IV完全反向互補，因此，給出了核苷酸序列III的鹼基組成，核苷酸鹼基IV的鹼基組成也就確定了。
第七種 siRNA
在一些實施方式中，本發明的siRNA是第七種siRNA。其中，所述核苷酸序列I與SEQ ID NO:157所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異，且所述核苷酸序列II與SEQ ID NO:158所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異： 5'- GAAUACUUACCAAUAAGAZ g1-3' (SEQ ID NO: 157); 5'- Z g2UCUUAUUGGUAAGUAUUC-3' (SEQ ID NO: 158)， 其中Z g1為A，Z g2為U，所述核苷酸序列I中包含位置對應於Z g1的核苷酸Z g3，所述核苷酸序列II中包含位置對應於Z g2的核苷酸Z g4，所述Z g4是所述反義鏈的5'末端的第一個核苷酸。
在一些實施方式中，所述第一段核苷酸序列是如SEQ ID NO:157所示的核苷酸序列。在一些實施方式中，所述正義鏈僅包含核苷酸序列I，所述反義鏈僅包含核苷酸序列II。
在一些實施方式中，所述核苷酸序列I與SEQ ID NO:157所示的核苷酸序列之間不多於1個核苷酸差異，和/或所述核苷酸序列II與SEQ ID NO:158所示的核苷酸序列之間不多於1個核苷酸差異。
在一些實施方式中，所述核苷酸序列II與SEQ ID NO:158所示的核苷酸序列之間的差異Z g4位置處的差異，且Z g4選自A、G或C。在一些實施方式中，所述Z g3是與Z g4互補的核苷酸。在一些實施方式中，所述核苷酸序列II與SEQ ID NO:158所示的核苷酸序列之間的差異為Z g4位置處的差異，且Z g4選自A、G或C。在一些實施方式中，本發明siRNA的核苷酸序列中的每個U或者T可任意地相互替換。這些核苷酸差異並不會顯著降低siRNA的靶基因抑制能力或者提高siRNA的脫靶效應。而這些包含核苷酸差異的siRNA也在本發明的保護範圍之內。
在一些實施方式中，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II基本上反向互補、實質上反向互補或完全反向互補；所述基本上反向互補是指兩個核苷酸序列之間存在不多於3個鹼基的錯配；所述實質上反向互補是指兩個核苷酸序列之間存在不多於1個鹼基的錯配；所述完全反向互補是指兩個核苷酸序列之間沒有錯配。
在一些實施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的第3至19位的核苷酸與所述第一段核苷酸序列第1至17位的核苷酸完全反向互補。在一些實施方式中，所述核苷酸序列II與所述核苷酸序列I完全反向互補，或者按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II中的第2個核苷酸與按照3'末端到5'末端的方向，所述核苷酸序列I中的第2個核苷酸之間存在鹼基錯配。通過包含該鹼基錯配，本發明的siRNA對目標基因表達的抑制活性得以進一步提升。在一些實施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II中的第2個核苷酸為U；按照3'末端到5'末端的方向，所述核苷酸序列I中的第2個核苷酸選自U、G或C。
在一些實施方式中，所述正義鏈還含有核苷酸序列III，所述反義鏈還含有核苷酸序列IV，所述核苷酸序列III和核苷酸序列IV中的每個核苷酸各自獨立地為非氟代修飾的核苷酸的一種並且不是所述穩定化修飾核苷酸，所述核苷酸序列III和核苷酸序列IV的長度各自為1至4個核苷酸，所述核苷酸序列IV和所述核苷酸序列III長度相等，並且所述核苷酸序列IV和所述核苷酸序列III實質上反向互補或完全反向互補，所述核苷酸序列III連接在所述核苷酸序列I的5'末端，所述核苷酸序列IV連接在所述核苷酸序列II的3'末端。並且，所述核苷酸序列IV與第二段核苷酸序列實質上反向互補或完全反向互補，該第二段核苷酸序列是指和 HSD17B13基因表達的mRNA中與前述第一段核苷酸序列的5'末端相鄰、且長度與所述核苷酸序列IV相同的核苷酸序列。
在一些實施方式中，所述核苷酸序列III和IV的長度均為1個核苷酸，所述核苷酸序列III的鹼基為G，核苷酸序列IV的鹼基為C，所述第二段核苷酸序列的鹼基為G；此時，正義鏈和反義鏈的長度比為20/20；或者，所述核苷酸序列III和IV的長度均為2個核苷酸，所述核苷酸序列III的鹼基組成為UG，所述核苷酸序列IV的鹼基組成為CA，所述第二段核苷酸序列的鹼基組成為UG；此時，正義鏈和反義鏈的長度比為21/21；或者，所述核苷酸序列III和IV的長度均為3個核苷酸，所述核苷酸序列III的鹼基組成為AUG，所述核苷酸序列IV的鹼基組成為CAU，所述第二段核苷酸序列的鹼基組成為AUG；此時，正義鏈和反義鏈的長度比為22/22；或者，所述核苷酸序列III和IV的長度均為4個核苷酸，所述核苷酸序列III的鹼基組成為GAUG，所述核苷酸序列IV的鹼基組成為CAUC，所述第二段核苷酸序列的鹼基組成為GAUG；此時，正義鏈和反義鏈的長度比為23/23。
在一些實施方式中，核苷酸序列III和核苷酸序列IV完全反向互補，因此，給出了核苷酸序列III的鹼基組成，核苷酸鹼基IV的鹼基組成也就確定了。
以下，對於核苷酸序列V、siRNA中的核苷酸修飾以及修飾序列的描述適用於上述本發明的siRNA，例如第一種siRNA、第二種siRNA、第三種siRNA、第四種siRNA、第五種siRNA、第六種siRNA和第七種siRNA。即如果沒有特指，下面對siRNA的描述應視為對上述本發明的七種siRNA，例如，如不特別指明具體的siRNA，“所述siRNA還含有核苷酸序列V”的意思是“本發明的siRNA，例如上述第一種siRNA、第二種siRNA、第三種siRNA、第四種siRNA、第五種siRNA、第六種siRNA或第七種siRNA還含有核苷酸序列V”。
在一些實施方式中，所述正義鏈和反義鏈長度不同，所述反義鏈還含有核苷酸序列V，核苷酸序列V的每個核苷酸獨立地為非氟代修飾的核苷酸中的一種且不是所述穩定化修飾核苷酸，核苷酸序列V的長度為1至3個核苷酸，連接在所述反義鏈的3'末端，構成反義鏈的3'突出端。由此，本發明提供的siRNA正義鏈和反義鏈的長度比可以是19/20、19/21、19/22、20/21、20/22、20/23、21/22、21/23、21/24、22/23、22/24、22/25、23/24、23/25或23/26。在一些實施方式中，所述核苷酸序列V的長度為2個核苷酸，由此，本發明提供的siRNA正義鏈和反義鏈的長度比可以是19/21、21/23或23/25。
所述核苷酸序列V中的每一個核苷酸可以是任意的核苷酸，為了便於合成並節約成本，在一些實施方式中，所述核苷酸序列V為連續的2個胸腺嘧啶去氧核糖核苷酸（dTdT）、連續的2個尿嘧啶核糖核苷酸（UU）；或者，為了提高siRNA反義鏈與 HSDmRNA的親和力，靶核苷酸序列V與第三段核苷酸序列完全反向互補，所述第三段核苷酸序列是指 HSD17B13基因表達的mRNA中與所述第一段核苷酸序列的5'末端或所述第二段核苷酸序列的5'末端相鄰、且長度與所述核苷酸序列V相等的核苷酸序列。因此，在一些實施方式中，本發明的正義鏈和反義鏈的長度之比為19/21或21/23，此時，本發明的siRNA具有更好的mRNA沉默活性。
在一些實施方式中，對於所述第一種siRNA，所述第一段核苷酸序列具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，所述第三段核苷酸序列的鹼基組成是GU；所述siRNA的正義鏈含有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，所述反義鏈含有如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列： 5'- GAACAGAGAUACUACGGUZ a3-3'(SEQ ID NO:3); 5'- Z a4ACUGUCCCAGCAUUAUUCAC -3'(SEQ ID NO:4)， 其中，所述Z a4是反義鏈的5'末端的第一個核苷酸，Z a3選自A、U、G或C，並且Z a3是與Z a4互補的核苷酸； 或者，所述siRNA的正義鏈含有如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，所述siRNA的反義鏈含有如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列： 5'- GUGAAUAAUGCUGGGACAGUZ a3-3'(SEQ ID NO:5); 5'- Z a4ACUGUCCCAGCAUUAUUCACCA -3'(SEQ ID NO:6)， 其中，所述Z a4是反義鏈的5'末端的第一個核苷酸，Z a3選自A、U、G或C，並且Z a3是與Z a4互補的核苷酸。
在一些實施方式中，對於所述第二種siRNA，所述第一段核苷酸序列具有SEQ ID NO:29所示的核苷酸序列，所述第三段核苷酸序列的鹼基組成是CA。
所述siRNA的正義鏈含有如SEQ ID NO:29所示的核苷酸序列，所述siRNA的反義鏈含有如SEQ ID NO:30所示的核苷酸序列： 5'- GCACCAAGGAUGAAGAGAZ b3-3'(SEQ ID NO:29); 5'- Z b4UCUCUUCAUCCUUGGUGCUG -3'(SEQ ID NO:30)， 其中，所述Z b4是反義鏈的5'末端的第一個核苷酸，Z b3選自A、U、G或C，並且Z b4是與Z b3互補的核苷酸； 所述siRNA的正義鏈含有如SEQ ID NO:31所示的核苷酸序列，所述siRNA的反義鏈含有如SEQ ID NO:32所示的核苷酸序列： 5'- CAGCACCAAGGAUGAAGAGAZ b3-3'(SEQ ID NO:31); 5'- Z b4UCUCUUCAUCCUUGGUGCUGAG -3'(SEQ ID NO:32)， 其中，所述Z b4是反義鏈的5'末端的第一個核苷酸，Z b3選自A、U、G或C，並且Z b4是與Z b3互補的核苷酸。
在一些實施方式中，對於所述第三種siRNA，所述第一段核苷酸序列具有SEQ ID NO:55所示的核苷酸序列，所述第三段核苷酸序列的鹼基組成是AG；所述siRNA的正義鏈含有如SEQ ID NO:55所示的核苷酸序列，所述反義鏈含有如SEQ ID NO:56所示的核苷酸序列： 5'- CACCAAGGAUGAAGAGAUZ c3-3'(SEQ ID NO:55); 5'- Z c4AUCUCUUCAUCCUUGGUGCU -3'(SEQ ID NO:56)， 其中，所述Z c4是反義鏈的5'末端的第一個核苷酸，Z c3選自A、U、G或C，並且Z c4是與Z c3互補的核苷酸； 或者，所述siRNA的正義鏈含有如SEQ ID NO:57所示的核苷酸序列，所述siRNA的反義鏈含有如SEQ ID NO:58所示的核苷酸序列： 5'- AGCACCAAGGAUGAAGAGAUZ c3-3'(SEQ ID NO:57); 5'- Z c4AUCUCUUCAUCCUUGGUGCUGA -3'(SEQ ID NO:58)， 其中，所述Z c4是反義鏈的5'末端的第一個核苷酸，Z c3選自A、U、G或C，並且Z c4是與Z c3互補的核苷酸。
在一些實施方式中，對於所述第四種siRNA，所述第一段核苷酸序列具有SEQ ID NO:81所示的核苷酸序列，所述第三段核苷酸序列的鹼基組成是AG；所述siRNA的正義鏈含有如SEQ ID NO:81所示的核苷酸序列，所述反義鏈含有如SEQ ID NO:82所示的核苷酸序列： 5'- UCUGAUAGAUGGAAUACUZ d3-3'(SEQ ID NO:81); 5'- Z d4AGUAUUCCAUCUAUCAGACU -3'(SEQ ID NO:82)， 其中，所述Z d4是反義鏈的5'末端的第一個核苷酸，Z d3選自A、U、G或C，並且Z d4是與Z d3互補的核苷酸； 或者，所述siRNA的正義鏈含有如SEQ ID NO:83所示的核苷酸序列，所述siRNA的反義鏈含有如SEQ ID NO:84所示的核苷酸序列： 5'- AGUCUGAUAGAUGGAAUACUZ d3-3'(SEQ ID NO:83); 5'- Z d4AGUAUUCCAUCUAUCAGACUUC -3'(SEQ ID NO:84)， 其中，所述Z d4是反義鏈的5'末端的第一個核苷酸，Z d3選自A、U、G或C，並且Z d4是與Z d3互補的核苷酸。
在一些實施方式中，對於所述第五種siRNA，所述第一段核苷酸序列具有SEQ ID NO:107所示的核苷酸序列，所述第三段核苷酸序列的鹼基組成是GU；所述siRNA的正義鏈含有如SEQ ID NO:107所示的核苷酸序列，所述反義鏈含有如SEQ ID NO:108所示的核苷酸序列： 5'- CUGAUAGAUGGAAUACUUZ e3-3'(SEQ ID NO:107); 5'- Z e4AAGUAUUCCAUCUAUCAGAC -3'(SEQ ID NO:108)， 其中，所述Z e4是反義鏈的5'末端的第一個核苷酸，Z e3選自A、U、G或C，並且Z e4是與Z e3互補的核苷酸； 或者，所述siRNA的正義鏈含有如SEQ ID NO:109所示的核苷酸序列，所述siRNA的反義鏈含有如SEQ ID NO:110所示的核苷酸序列： 5'- GUCUGAUAGAUGGAAUACUUZ e3-3'(SEQ ID NO:109); 5'- Z e4AAGUAUUCCAUCUAUCAGACUU -3'(SEQ ID NO:110)， 其中，所述Z e4是反義鏈的5'末端的第一個核苷酸，Z e3選自A、U、G或C，並且Z e4是與Z e3互補的核苷酸。
在一些實施方式中，對於所述第六種siRNA，所述第一段核苷酸序列具有SEQ ID NO:133所示的核苷酸序列，所述第三段核苷酸序列的鹼基組成是UA；所述siRNA的正義鏈含有如SEQ ID NO:133所示的核苷酸序列，所述反義鏈含有如SEQ ID NO:134所示的核苷酸序列： 5'- GAUGGAAUACUUACCAAUZ f3-3'(SEQ ID NO:133); 5'- Z f4AUUGGUAAGUAUUCCAUCUA -3'(SEQ ID NO:134)， 其中，所述Z f4是反義鏈的5'末端的第一個核苷酸，Z f3選自A、U、G或C，並且Z f4是與Z f3互補的核苷酸； 或者，所述siRNA的正義鏈含有如SEQ ID NO:135所示的核苷酸序列，所述siRNA的反義鏈含有如SEQ ID NO:136所示的核苷酸序列： 5'- UAGAUGGAAUACUUACCAAUZ f3-3'(SEQ ID NO:135); 5'- Z f4AUUGGUAAGUAUUCCAUCUAUC -3'(SEQ ID NO:136)， 其中，所述Z f4是反義鏈的5'末端的第一個核苷酸，Z f3選自A、U、G或C，並且Z f4是與Z f3互補的核苷酸。
在一些實施方式中，對於所述第七種siRNA，所述第一段核苷酸序列具有SEQ ID NO:159所示的核苷酸序列，所述第三段核苷酸序列的鹼基組成是UG；所述siRNA的正義鏈含有如SEQ ID NO:159所示的核苷酸序列，所述反義鏈含有如SEQ ID NO:160所示的核苷酸序列： 5'- GAAUACUUACCAAUAAGAZ g3-3'(SEQ ID NO:159); 5'- Z g4UCUUAUUGGUAAGUAUUCCA -3'(SEQ ID NO:160)， 其中，所述Z g4是反義鏈的5'末端的第一個核苷酸，Z g3選自A、U、G或C，並且Z g4是與Z g3互補的核苷酸； 或者，所述siRNA的正義鏈含有如SEQ ID NO:161所示的核苷酸序列，所述siRNA的反義鏈含有如SEQ ID NO:162所示的核苷酸序列： 5'- UGGAAUACUUACCAAUAAGAZ g3-3'(SEQ ID NO:161); 5'- Z g4UCUUAUUGGUAAGUAUUCCAUC -3'(SEQ ID NO:162)， 其中，所述Z g4是反義鏈的5'末端的第一個核苷酸，Z g3選自A、U、G或C，並且Z g4是與Z g3互補的核苷酸。
如前所述，本發明的siRNA中的核苷酸各自獨立地為修飾或未修飾的核苷酸，在一些實施方式中，本發明的siRNA中的部分或全部核苷酸為修飾的核苷酸，核苷酸基團上的這些修飾不會導致本發明的siRNA抑制 HSD17B13基因表達的功能明顯削弱或喪失。
在本發明的上下文中，所使用的的術語“修飾的核苷酸”是指核苷酸的核糖基2'位羥基被其他基團取代形成的核苷酸或核苷酸類似物，或者核苷酸上的鹼基是經修飾的鹼基的核苷酸。所述修飾的核苷酸不會導致siRNA抑制基因表達的功能明顯削弱或喪失。例如，可以選擇J.K. Watts, G.F. Deleavey, and M.J. Damha, Chemically modified siRNA: tools and applications. Drug Discov Today, 2008, 13(19-20): 842-55中公開的修飾的核苷酸。
在一些實施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的第2、6、14、16個核苷酸，如果不是所述穩定化修飾核苷酸的話，為氟代修飾的核苷酸。在一些實施方式中，所述核苷酸序列II中的全部核苷酸均為修飾的核苷酸；按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的第2、6、14、16個核苷酸，如果不是所述穩定化修飾核苷酸的話，為氟代修飾的核苷酸，所述核苷酸序列II中的其它核苷酸各自獨立地為非氟代修飾的核苷酸的一種。在一些實施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列I的第7至9個核苷酸為氟代修飾的核苷酸。在一些實施方式中，所述核苷酸序列I中的全部核苷酸均為修飾的核苷酸；按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列I的第7至9個核苷酸為氟代修飾的核苷酸，所述核苷酸序列I中的其它核苷酸各自獨立地為非氟代修飾的核苷酸的一種。本發明的siRNA通過具有上述修飾，能夠實現基因表達調節活性和體內穩定性的良好平衡。
在本發明的上下文中，“氟代修飾的核苷酸”指核苷酸的核糖基2'位的羥基被氟取代形成的核苷酸，其具有以下式（7）所示的結構。“非氟代修飾的核苷酸”指核苷酸的核糖基2'位的羥基被非氟基團取代形成的核苷酸、或核苷酸類似物。
在一些實施方式中，每一個非氟代修飾的核苷酸獨立地選自核苷酸的核糖基2'位的羥基被非氟基團取代形成的核苷酸或核苷酸類似物中的一種。
這些核糖基2'位的羥基被非氟基團取代形成的核苷酸是本領域技術人員所公知的，這些核苷酸可以選自2'-烷氧基修飾的核苷酸、2'-烷基修飾的核苷酸、2'-經取代的烷基修飾的核苷酸、2'-氨基修飾的核苷酸、2'-經取代的氨基修飾的核苷酸、2'-去氧核苷酸中的一種。
在一些實施方式中，2'-烷氧基修飾的核苷酸為甲氧基修飾的核苷酸（2'-OMe），如式（8）所示。在一些實施方式中，2'-氨基修飾的核苷酸（2'-NH 2）如式（9）所示。在一些實施方式中，2'-去氧核苷酸（DNA）如式（10）所示： 、 、 、 。 式（7）          式（8）            式（9）         式（10）
本領域技術人員知曉各種對核苷酸的鹼基進行修飾的方式。在一些實施方式中，鹼基修飾包括但不限於在鹼基上增加一個或多個甲基。在一些實施方式中，將胸腺嘧啶（T）視為鹼基經修飾的尿嘧啶（U）的一種。在一些實施方式中，將5-甲基胞嘧啶視為鹼基經修飾的胞嘧啶（C）的一種。
核苷酸類似物指能夠在核酸中代替核苷酸，但結構不同於腺嘌呤核糖核苷酸、鳥嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸、尿嘧啶核糖核苷酸或胸腺嘧啶去氧核糖核苷酸的基團。在一些實施方式中，核苷酸類似物可以是異核苷酸、橋聯的核苷酸（bridged nucleic acid，簡稱BNA）或無環核苷酸。
BNA是指受約束的或不能接近的核苷酸。BNA可以含有五元環、六元環、或七元環的具有“固定的”C3'-內切糖縮攏的橋聯結構。通常將該橋摻入到該核糖的2'-、4'-位處以提供一個2', 4'-BNA核苷酸。在一些實施方式中，BNA可以是LNA、ENA、cET BNA等，其中，LNA如式（12）所示，ENA如式（13）所示，cET BNA如式（14）所示： 、 、 。 式（12）                式（13）                 式（14）
無環核苷酸是核苷酸的糖環被打開形成的一類核苷酸。在一些實施方式中，無環核苷酸可以是解鎖核酸（UNA）或甘油核酸（GNA），其中，UNA如式（15）所示，GNA如式（16）所示： 、 。 式（15）                 式（16）
上述式（15）和式（16）中，R選自H、OH或烷氧基（O-烷基）。
異核苷酸是指核苷酸中鹼基在核糖環上的位置發生改變而形成的化合物。在一些實施方式中，異核苷酸可以是鹼基從核糖環的1'-位移動至2'-位或3'-位而形成的化合物，如式（17）或（18）所示。 式（17）      式（18）
上述式（17）至式（18）化合物中，Base表示核酸鹼基，例如A、U、G、C或T；R選自H、OH、F或者如上所述的非氟基團。
在一些實施方式中，核苷酸類似物選自異核苷酸、LNA、ENA、cET、UNA和GNA中的一種。在一些實施方式中，每一個非氟代修飾的核苷酸均為甲氧基修飾的核苷酸，在上文和下文中，所述甲氧基修飾的核苷酸指核糖基的2'-羥基被甲氧基取代而形成的核苷酸。
在上文及下文中，“氟代修飾的核苷酸”、“2'-氟修飾的核苷酸”、“核糖基團的2'-羥基被氟取代的核苷酸”和“具有2’-氟代核糖基的核苷酸”意義相同，均指核苷酸的2'-羥基被氟取代，而形成的具有如式（7）所示結構的化合物；“甲氧基修飾的核苷酸”、“2'-甲氧基修飾的核苷酸”、“核糖基團的2'-羥基被甲氧基取代的核苷酸”和“具有2’-甲氧基核糖基的核苷酸”意義相同，均指核苷酸核糖基團的2'-羥基被甲氧基取代而形成的具有如式（8）所示結構的化合物。
在一些實施方式中，其中，所述反義鏈中不多於3個非氟代修飾的核苷酸為2'-去氧核苷酸，其餘每一個非氟代修飾的核苷酸均為甲氧基修飾的核苷酸；或者，每一個非氟代修飾的核苷酸均為甲氧基修飾的核苷酸；所述甲氧基修飾的核苷酸指核糖基的2'-羥基被甲氧基取代而形成的核苷酸。
在一些實施方式中，本發明的包含穩定化修飾核苷酸的siRNA是具有以下修飾的siRNA：按照5'末端到3'末端的方向，在所述正義鏈中，所述核苷酸序列I的第7、8、9位或者第5、7、8、9位的核苷酸為氟代修飾的核苷酸，所述正義鏈中其餘位置的核苷酸為甲氧基修飾的核苷酸；在所述反義鏈中，所述核苷酸序列II的第2、6、14、16位或者第2、6、8、9、14、16位的核苷酸為氟代修飾的核苷酸，所述反義鏈中第3位或第5位的核苷酸為穩定化修飾核苷酸，第18位的核苷酸為2'-去氧核苷酸或甲氧基修飾的核苷酸，所述反義鏈中其餘位置的核苷酸為甲氧基修飾的核苷酸。
具有上述修飾的siRNA不僅成本低，而且可使血液中的核糖核酸酶不易切割核酸，由此增加核酸的穩定性，使核酸具有更強的抵抗核酸酶水解的性能。同時，上述修飾並未顯著降低siRNA的抑制性能，具有上述修飾的siRNA還具有低的脫靶效應。
在一些實施方式中，本發明提供的所述siRNA為為下表1a-1g中列出的siHSDa1-M1、siHSDa1-M2、siHSDa2-M1、siHSDa2-M2、siHSDb1-M1、siHSDb1-M2、siHSDb2-M1、siHSDb2-M2、HSDc1-M1、siHSDc1-M2、siHSDc2-M1、siHSDc2-M2、HSDd1-M1、siHSDd1-M2、siHSDd2-M1、siHSDd2-M2、siHSDe1-M1、siHSDe1-M2、siHSDe2-M1、siHSDe2-M2、siHSDf1-M1、siHSDf1-M2、siHSDf2-M1、siHSDf2-M2、siHSDg1-M1、siHSDg1-M2、siHSDg2-M1或siHSDg2-M2中的一種。。
在一些實施方式中，本發明提供的siRNA的正義鏈和反義鏈中至少一條單鏈的磷酸-糖骨架中的磷酸酯基中的至少一部分為具有修飾基團的磷酸酯基。在一些實施方式中，具有修飾基團的磷酸酯基為磷酸酯基中的磷酸二酯鍵中的至少一個氧原子被硫原子取代而形成的硫代磷酸酯基；在一些實施方式中，所述具有修飾基團的磷酸酯基為具有如式（1）所示結構的硫代磷酸酯基： 式（1）。
這種修飾能穩定siRNA的雙鏈結構，保持鹼基配對的高特異性和高親和力。
在一些實施方式中，本發明提供的siRNA中，硫代磷酸酯基連接存在於由以下位置組成的群組中的至少一處：正義鏈或反義鏈任意一端的第一個和第二個核苷酸之間；正義鏈或反義鏈任意一端的第二個和第三個核苷酸之間；或上述的任意組合。在一些實施方式中，硫代磷酸酯基連接存在於除正義鏈5'末端以外的全部上述位置處。在一些實施方式中，硫代磷酸酯基連接存在於除正義鏈的3'末端以外的全部上述位置處。在一些實施方式中，硫代磷酸酯基連接存在於以下位置中的至少一處： 所述正義鏈的5'末端端部第1個核苷酸和第2個核苷酸之間； 所述正義鏈的5'末端端部第2個核苷酸和第3個核苷酸之間； 所述正義鏈的3'末端端部第1個核苷酸和第2個核苷酸之間； 所述正義鏈的3'末端端部第2個核苷酸和第3個核苷酸之間； 所述反義鏈的5'末端端部第1個核苷酸和第2個核苷酸之間； 所述反義鏈的5'末端端部第2個核苷酸和第3個核苷酸之間； 所述反義鏈的3'末端端部第1個核苷酸和第2個核苷酸之間；以及 所述反義鏈的3'末端端部第2個核苷酸和第3個核苷酸之間。
在一些實施方式中，本發明的siRNA為表1a至1g中列出的siHSDa1-M1S、siHSDa1-M2S、siHSDa2-M1S、siHSDa2-M2S、siHSDb1-M1S、siHSDb1-M2S、siHSDb2-M1S、siHSDb2-M2S、HSDc1-M1S、siHSDc1-M2S、siHSDc2-M1S、siHSDc2-M2S、HSDd1-M1S、siHSDd1-M2S、siHSDd2-M1S、siHSDd2-M2S、siHSDe1-M1S、siHSDe1-M2S、siHSDe2-M1S、siHSDe2-M2S、siHSDf1-M1S、siHSDf1-M2S、siHSDf2-M1S、siHSDf2-M2S、siHSDg1-M1S、siHSDg1-M2S、siHSDg2-M1S或siHSDg2-M2S中的一種。
在一些實施方式中，所述siRNA反義鏈的5'末端核苷酸為5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸類似物修飾的核苷酸。
常用的所述5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸類似物修飾的核苷酸是本領域技術人員所公知的，如5'-磷酸核苷酸可具有如下結構： 式（2）；
再如，Anastasia Khvorova and Jonathan K. Watts, The chemical evolution of oligonucleotide therapies of clinical utility. Nature Biotechnology, 2017, 35(3): 238-48中公開了如下4種5'-磷酸類似物修飾的核苷酸： 式（3）            式（4）            式（5）              式（6） 其中，R選自H、OH、甲氧基、氟；Base表示核酸鹼基，選自A、U、C、G或T。
在一些實施方式中，5'-磷酸核苷酸為式（2）所示的含有5'-磷酸修飾的核苷酸，5'-磷酸類似物修飾的核苷酸為含有乙烯基磷酸酯（5'-(E)-vinylphosphonate，E-VP）修飾的核苷酸，如式（3）所示，或者為硫代磷酸酯修飾的核苷酸，如式（5）所示。
在一些實施方式中，本發明的siRNA為下表1a至1g中列出的siHSDa1-M1P、siHSDa1-M2P、siHSDa2-M1P、siHSDa2-M2P、siHSDb1-M1P、siHSDb1-M2P、siHSDb2-M1P、siHSDb2-M2P、HSDc1-M1P、siHSDc1-M2P、siHSDc2-M1P、siHSDc2-M2P、HSDd1-M1P、siHSDd1-M2P、siHSDd2-M1P、siHSDd2-M2P、siHSDe1-M1P、siHSDe1-M2P、siHSDe2-M1P、siHSDe2-M2P、siHSDf1-M1P、siHSDf1-M2P、siHSDf2-M1P、siHSDf2-M2P、siHSDg1-M1P、siHSDg1-M2P、siHSDg2-M1P或siHSDg2-M2P中的一種。
本發明的發明人意外發現，這些本發明提供的siRNA不僅具有顯著增強的血漿和溶酶體穩定性，還保留很高的 HSDmRNA抑制活性，並且還具有低的脫靶效應。
本發明提供的siRNA可以通過本領域常規的siRNA製備方法（例如固相合成和液相合成的方法）得到。其中，固相合成已經有商業化訂制服務。可以通過使用具有相應修飾的核苷單體來將修飾的核苷酸基團引入本發明所述的siRNA中，製備具有相應修飾的核苷單體的方法及將修飾的核苷酸基團引入siRNA的方法也是本領域技術人員所熟知的。
藥物組合物
本發明提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物含有如上所述的siRNA作為活性成分和藥學上可接受的載體。
所述藥學上可接受的載體可以是siRNA給藥領域常規使用的載體，例如但不限於磁性納米粒（magnetic nanoparticles，如基於Fe 3O 4或Fe 2O 3的納米粒）、碳納米管（carbon nanotubes）、介孔矽（mesoporous silicon）、磷酸鈣納米粒（calcium phosphate nanoparticles）、聚乙烯亞胺（polyethylenimine，PEI)、聚醯胺型樹形高分子（polyamidoamine (PAMAM) dendrimer）、聚賴氨酸（poly(L-lysine)，PLL）、殼聚糖（chitosan）、1,2-二油醯基-3-三甲銨丙烷（1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane，DOTAP）、聚D型或L型乳酸/羥基乙酸共聚物（poly(D&L-lactic/glycolic acid)copolymer，PLGA）、聚（氨乙基乙撐磷酸酯）（poly(2-aminoethyl ethylene phosphate)，PPEEA）和聚（甲基丙烯酸-N,N-二甲氨基乙酯）（poly(2-dimethylaminoethyl methacrylate)，PDMAEMA）以及它們的衍生物中的一種或多種。
在一些實施方式中，所述藥物組合物中，對siRNA和藥學上可接受的載體的含量沒有特別要求，在一些實施方式中，siRNA與藥學上可接受的載體的重量比可以為1 : (1至500)，在一些的實施方式中，上述重量比為1 : (1至50)。
在一些實施方式中，所述藥物組合物中，還可以包含藥學上可接受的其它輔料，該輔料可以為本領域常規採用的各種製劑或化合物的一種或多種。例如，所述藥學上可接受的其它輔料可以包括pH緩衝液、保護劑和滲透壓調節劑中的至少一種。
所述pH緩衝液可以為pH值7.5至8.5的三羥甲基胺基甲烷鹽酸鹽緩衝液和/或pH值5.5至8.5的磷酸鹽緩衝液，例如可以為pH值5.5至8.5的磷酸鹽緩衝液。
所述保護劑可以為肌醇、山梨醇、蔗糖、海藻糖、甘露糖、麥芽糖、乳糖和葡萄糖中的至少一種。以所述藥物組合物的總重量為基準，所述保護劑的含量可以為0.01至30重量%。
所述滲透壓調節劑可以為氯化鈉和/或氯化鉀。所述滲透壓調節劑的含量使所述藥物組合物的滲透壓為200至700毫滲摩爾/千克（mOsm/kg）。根據所需滲透壓，本領域技術人員可以容易地確定所述滲透壓調節劑的含量。在一些實施方式中，所述藥物組合物所製成的製劑在給藥過程中的劑量會因給藥方式的不同而發生調整。
在一些實施方式中，所述藥物組合物可以為液體製劑，例如注射液；也可以為凍乾粉針劑，實施給藥時與液體輔料混合，配製成液體製劑。所述液體製劑可以但不限於用於皮下、肌肉或靜脈注射給藥，也可以但不限於通過噴霧給藥到肺部、或通過噴霧經肺部給藥到其它臟器組織（如肝臟）、或通過口服等方式遞送所述藥物組合物。在一些實施方式中，所述藥物組合物通過皮下注射的方式給藥。
在一些實施方式中，所述藥物組合物可以為脂質體製劑的形式。在一些實施方式中，所述脂質體製劑中使用的藥學上可接受的載體包含含胺的轉染化合物（下文也可將其稱為有機胺）、輔助脂質和/或聚乙二醇化脂質。其中，所述有機胺、輔助脂質和聚乙二醇化脂質可分別選自於中國專利申請CN103380113A（通過引用的方式將其整體併入本文）中所描述的含胺的轉染化合物或其藥學上可接受的鹽或衍生物、輔助脂質和聚乙二醇化脂質中的一種或多種。
在一些實施方式中，所述有機胺可為中國專利申請CN103380113A中描述的如式（201）所示的化合物或其藥學上可接受的鹽： 式（201）， 其中： 每個X 101或X 102各自獨立地是O、S、N－A或C－A，其中A是氫或C1-C20烴鏈； 每個Y101或Z101各自獨立地是C=O、C=S、S=O、CH-OH或SO 2； 每個R 101、R 102、R 103、R 104、R 105、R 106或R 107各自獨立地是氫，環狀或無環的、被取代的或未被取代的、支鏈或直鏈脂族基團，環狀或無環的、被取代的或未被取代的、支鏈或直鏈雜脂族基團，被取代的或未被取代的、支鏈或直鏈醯基，被取代的或未被取代的、支鏈或直鏈芳基，被取代的或未被取代的、支鏈或直鏈雜芳基； x是1至10的整數； n是1至3的整數，m是0至20的整數，p是0或1；其中，如果m=p=0，則R102是氫； 並且，如果n或m中的至少一個是2，那麼R 103和在式（201）中的氮形成如式（202）或式（203）所示的結構： 式（202）， 式（203）； 其中，g、e和f各自獨立地是1至6的整數，“HCC”代表烴鏈，且每個*N代表式（201）中的氮原子。
在一些實施方式中，R 103是多胺。在其它實施方式中，R 103是縮酮。在一些實施方式中，在式（201）中的R 101和R 102中的每一個獨立地是任意的被取代的或未被取代的、支鏈或直鏈烷基或烯基，所述烷基或烯基具有3至約20個碳原子，諸如8至約18個碳原子，和0至4個雙鍵，諸如0至2個雙鍵。
在一些實施方式中，如果n和m中的每一個獨立地具有1或3的值，那麼R 103可以是下述式（204）至式（213）中的任一個： 式（204）， 式（205）， 式（206）， 式（207）， 式（208）， 式（209）， 式（210）， 式（211）， 式（212）和 式（213）； 其中，式（204）至式（213）中，g、e和f各自獨立地是1至6的整數，每個“HCC”代表烴鏈，且每個*顯示R 103與在式（201）中的氮原子的可能連接點，其中在任意*位置上的每個H可以被替換以實現與在式（201）中的氮原子的連接。 其中，式（201）所示化合物可以根據中國專利申請CN103380113A中的描述製備。
在一些實施方式中，所述有機胺為如式（214）所示的有機胺和/或如式（215）所示的有機胺： 式（214）， 式（215）； 所述輔助脂質為膽固醇、膽固醇的類似物和/或膽固醇的衍生物； 所述聚乙二醇化脂質為1,2-二棕櫚醯胺-sn-甘油-3-磷脂醯乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)]-2000。
在一些實施方式中，所述藥物組合物中，所述有機胺、所述輔助脂質和所述聚乙二醇化脂質三者之間的摩爾比為(19.7至80) : (19.7至80) : (0.3至50)，例如可以為(50至70) : (20至40) : (3至20)。
在一些實施方式中，由本發明的siRNA與上述含胺的轉染試劑形成的藥物組合物顆粒具有約30nm至約200nm的平均直徑，通常為約40nm至約135nm，更通常地，該脂質體顆粒的平均直徑是約50nm至約120nm、約50nm至約100nm、約60nm至約90nm或約70nm至約90nm，例如，該脂質體顆粒的平均直徑是約30、40、50、60、70、75、80、85、90、100、110、120、130、140、150或160nm。
在一些實施方式中，由本發明的siRNA與上述含胺的轉染試劑形成的藥物組合物中，siRNA與全部脂質（例如有機胺、輔助脂質和/或聚乙二醇化脂質）的重量比（重量/重量比）在從約1:1至約1:50、從約1:1至約1:30、從約1:3至約1:20、從約1:4至約1:18、從約1:5至約1:17、從約1:5至約1:15、從約1:5至約1:12、從約1:6至約1:12或從約1:6至約1:10的範圍內，例如，本發明的siRNA與全部脂質的重量比為約1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17或1:18。
在一些實施方式中，所述藥物組合物在銷售時各組分可以獨立存在，在使用時可以液體製劑的形式存在。在一些實施方式中，本發明提供的siRNA與上述藥學上可接受的載體形成的藥物組合物可以按照已知的各種方法製備，只是用本發明提供的siRNA替代現有siRNA即可；在一些實施方式中，可以按照如下方法製備： 將有機胺、輔助脂質和聚乙二醇化脂質按照上述摩爾比懸浮於醇中並混勻得到脂質溶液；醇的用量使得到的脂質溶液的總品質濃度為2至25mg/mL，例如可以為8至18mg/mL。所述醇選自藥學上可接受的醇，諸如在室溫附近為液體的醇，例如，乙醇、丙二醇、苯甲醇、甘油、聚乙二醇200，聚乙二醇300，聚乙二醇400中的一種或多種，例如可以為乙醇。
將本發明提供的siRNA溶解於緩衝鹽溶液中，得到siRNA水溶液。緩衝鹽溶液的濃度為0.05至0.5M，例如可以為0.1至0.2M，調節緩衝鹽溶液的pH至4.0至5.5，例如可以為5.0至5.2，緩衝鹽溶液的用量使siRNA的濃度不超過0.6mg/mL，例如可以為0.2至0.4mg/mL。所述緩衝鹽選自可溶性醋酸鹽、可溶性檸檬酸鹽中的一種或多種，例如可以為醋酸鈉和/或醋酸鉀。
將脂質溶液和siRNA水溶液混合，將混合後得到的產物在40至60℃孵育至少2分鐘，例如可以為5至30分鐘，得到孵育後的脂質體製劑。脂質溶液和siRNA水溶液的體積比為1：(2至5)，例如可以為1:4。
將孵育後的脂質體製劑濃縮或稀釋，去除雜質，除菌，得到本發明提供的藥物組合物，其理化參數為pH值為6.5至8，包封率不低於80%，粒徑為40至200nm，多分散指數不高於0.30，滲透壓為250至400mOsm/kg；例如理化參數可以為pH值為7.2至7.6，包封率不低於90%，粒徑為60至100nm，多分散指數不高於0.20，滲透壓為300至400mOsm/kg。
其中，濃縮或稀釋可以在去除雜質之前、之後或同時進行。去除雜質的方法可以採用現有各種方法，例如可以使用切相流系統、中空纖維柱，在100K Da條件下超濾，超濾交換溶液為pH7.4的磷酸鹽緩衝液（PBS）。除菌的方法可以採用現有各種方法，例如可以在0.22μm濾器上過濾除菌。
siRNA 綴合物
在另一方面，本發明提供了一種siRNA綴合物，所述siRNA綴合物含有本發明提供的siRNA，以及綴合連接至該siRNA的綴合基團。在一些實施方式中，所述綴合基團包含接頭和藥學上可接受的靶向基團和/或遞送輔助基團，並且，所述siRNA、所述接頭和所述靶向基團或者所述遞送輔助基團依次共價或非共價連接，每個所述靶向基團選自能夠和細胞表面受體結合的配體，每個遞送輔助基團選自能夠增加所述siRNA綴合物在遞送目標器官或組織中的生物相容性的基團。
在本發明的上下文中，除非另有說明，“綴合”是指兩個或多個各自具有特定功能的化學部分之間以共價連接的方式彼此連接；相應地，“綴合物”是指該各個化學部分之間通過共價連接而形成的化合物。進一步地，“siRNA綴合物”表示一個或多個具有特定功能的化學部分共價連接至siRNA上而形成的化合物。siRNA綴合物應根據上下文，理解為多個siRNA綴合物的總稱或者某個化學式所表示的siRNA綴合物。在本發明的上下文中，“綴合分子”應當理解為可通過反應綴合至siRNA，最終形成本發明的siRNA綴合物的特定化合物。
一般來說，所述綴合基團包含藥學上可接受的至少一個靶向基團，或者進一步還包含接頭（linker），並且，所述siRNA、所述接頭和所述靶向基團依次連接。在一些實施方式中，所述靶向基團為1至6個。在一些實施方式中，所述靶向基團為2至4個。所述siRNA分子可以非共價或共價綴合至所述綴合基團，例如可以共價綴合至所述綴合基團。siRNA與綴合基團的綴合位點可以在siRNA正義鏈的3'端或5'端，也可在反義鏈的5'端，還可以在siRNA的內部序列中。在一些實施方式中，所述siRNA與綴合基團的綴合位點在siRNA正義鏈的3'末端。
在一些實施方式中，所述綴合基團可以連接在核苷酸的磷酸基團、2'-位羥基或者鹼基上。在一些實施方式中，所述綴合基團還可以連接在3'-位羥基上，此時核苷酸之間採用2'-5'磷酸二酯鍵連接。當綴合基團連接在siRNA鏈的末端時，所述綴合基團通常連接在核苷酸的磷酸基團上；當綴合基團連接在siRNA的內部序列時，所述綴合基團通常連接在核糖糖環或者鹼基上。各種連接方式可以參考文獻：Muthiah Manoharan et.al. siRNA conjugates carrying sequentially assembled trivalent N-acetylgalactosamine linked through nucleosides elicit robust gene silencing in vivo in hepatocytes. ACS Chemical biology, 2015, 10 (5): 1181-7.
靶向基團可經由合適的接頭與siRNA分子相連，本領域技術人員可以根據靶向基團的具體類型選擇合適的接頭。這些接頭、靶向基團的種類以及與siRNA的連接方式可參見WO2015006740A2的公開內容，通過引用的方式將其整體內容併入本文。在一些實施方式中，所述siRNA與綴合基團間可以通過酸不穩定的、或可還原的化學鍵相連，在細胞內涵體的酸性環境下，這些化學鍵可降解，從而使siRNA成為自由狀態。對於不可降解的綴合方式，綴合基團可連接在siRNA的正義鏈，從而儘量降低綴合對siRNA活性的影響。
在一些實施方式中，所述靶向基團可以是siRNA給藥領域常規使用的配體，例如WO2009082607A2中描述的各種配體，以引用的方式將其全部公開內容併入本文。
在一些實施方式中，至少一個或每個所述靶向基團選自能夠和表達所述 HSD17B13基因的細胞表面受體結合的配體。
在一些實施方式中，至少一個或每個所述靶向基團選自能夠和哺乳動物肝實質細胞表面受體（ASGPR）結合的配體。在一些實施方式中，每個所述靶向基團獨立地為與哺乳動物肝細胞表面的去唾液酸糖蛋白受體親和的配體。在一些實施方式中，每個所述靶向基團獨立地為去唾液酸糖蛋白或糖。在一些實施方式中，每個所述靶向基團獨立地為去唾液酸糖蛋白，例如去唾液酸血清類枯蛋白（asialoorosomucoid, ASOR）或去唾液酸始球蛋白（asialofetuin，ASF）。在一些實施方式中，每個所述靶向基團獨立地選自D-吡喃甘露糖、L-吡喃甘露糖、D-阿拉伯糖、D-呋喃木糖、L-呋喃木糖、D-葡萄糖、L-葡萄糖、D-半乳糖、L-半乳糖、α-D-呋喃甘露糖、β-D-呋喃甘露糖、α-D-吡喃甘露糖、β-D-吡喃甘露糖、α-D-吡喃葡萄糖、β-D-吡喃葡萄糖、α-D-呋喃葡萄糖、β-D-呋喃葡萄糖、α-D-呋喃果糖、α-D-吡喃果糖、α-D-吡喃半乳糖、β-D-吡喃半乳糖、α-D-呋喃半乳糖、β-D-呋喃半乳糖、葡糖胺、唾液酸、半乳糖胺、N-乙醯半乳糖胺、N-三氟乙醯半乳糖胺、N-丙醯半乳糖胺、N-正丁醯半乳糖胺、N-異丁醯半乳糖胺、2-氨基-3-O-[(R)-1-羧乙基]-2-去氧-β-D-吡喃葡萄糖、2-去氧-2-甲基氨基-L-吡喃葡萄糖、4,6-二去氧-4-甲醯胺基-2,3-二-O-甲基-D-吡喃甘露糖、2-去氧-2-磺氨基-D-吡喃葡萄糖、N-乙醇醯基-α-神經氨酸、5-硫代-β-D-吡喃葡萄糖、2,3,4-三-O-乙醯基-1-硫代-6-O-三苯甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷甲酯、4-硫代-β-D-吡喃半乳糖、3,4,6,7-四-O-乙醯基-2-去氧-1,5-二硫代-α-D-吡喃葡庚糖苷乙酯、2,5-脫水-D-阿洛糖腈、核糖、D-核糖、D-4-硫代核糖、L-核糖、L-4-硫代核糖中的一種。在一些實施方式中，至少一個或每個所述靶向基團為半乳糖或N-乙醯半乳糖胺。在一些實施方式中，本發明的siRNA綴合物中的接頭具有如式（301）所示的結構： 式（301）， 其中，k為1至3的整數； L A具有如式（302）所示的包含醯胺鍵的結構，L B具有如式（303）所示的包含N-醯基吡咯烷的結構，含有羰基和氧原子，L C為基於羥甲基氨基甲烷、二羥甲基氨基甲烷或三羥甲基氨基甲烷的連接基團； 式（302）； 式（303）； 其中，n 302、q 302和p 302各自獨立地為2至6的整數，可選地，n 302、q 302和p 302各自獨立地為2或3；n 303為4至16的整數，可選地，n 303為8至12的整數， 表示基團共價連接的位點。
所述接頭中，每個L A分別與一個所述靶向基團通過醚鍵連接，並通過L C部分中羥基的氧原子與L C部分形成醚鍵而連接；L B通過式（303）中的羰基與L C部分中氨基的氮原子形成醯胺鍵而連接，並通過式（303）中的氧原子與所述siRNA通過氧原子形成磷酸酯鍵或硫代磷酸酯鍵相連接。
在一些實施方式中，本發明提供的siRNA綴合物具有如式（305）所示的結構： ， 式（305） 其中，Nu表示本發明提供的siRNA。
在一些實施方式中，本發明的siRNA綴合物中的接頭具有式（306）所示的結構： 式（306）， 其中，n 306為0至3的整數，每個p 306獨立地為1至6的整數， 表示基團共價連接的位點；所述連接基團通過由*標出的氧原子與所述靶向基團形成醚鍵連接；所述連接基團由#標出的氧原子中的至少一個與所述siRNA形成磷酸酯鍵或硫代磷酸酯鍵而連接，其餘由#標出的氧原子與氫原子連接形成羥基，或者與C 1-C 3烷基連接形成C 1-C 3烷氧基。
在一些實施方式中，本發明的siRNA綴合物具有如式（307）所示的結構： 式（307） 其中，Nu表示本發明提供的siRNA。
在一些實施方式中，本發明的siRNA綴合物具有式（308）所示的結構： 式（308）， 其中， n1為選自1至3的整數，n3為選自0至4的整數； 每個m1、m2或m3各自獨立地為選自2至10的整數； R 10、R 11、R 12、R 13、R 14或R 15各自獨立地為H，或選自於由以下基團所組成的群組：C 1-C 10烷基、C 1-C 10鹵代烷基以及C 1-C 10烷氧基； R 3具有式A59所示的結構： （A59） 其中，E 1為OH、SH或BH 2，Nu表示本發明提供的siRNA； R 2是長度為1至20個碳原子的直鏈亞烷基，其中一個或多個碳原子任選地被選自於以下基團所組成的群組中的任何一個或多個所替換：C(O)、NH、O、S、CH=N、S(O) 2、C 2-C 10亞烯基、C 2-C 10亞炔基、C 6-C 10亞芳基、C 3-C 18亞雜環基和C 5-C 10亞雜芳基；並且其中R 2可任選地具有由以下基團所組成的群組中的任何一個或多個的取代基：C 1-C 10烷基、C 6-C 10芳基、C 5-C 10雜芳基、C 1-C 10鹵代烷基、-OC 1-C 10烷基、­OC 1-C 10烷基苯基、-C 1-C 10烷基-OH、-OC 1-C 10鹵代烷基、-SC 1-C 10烷基、-SC 1-C 10烷基苯基、-C 1-C 10烷基-SH、-SC 1-C 10鹵代烷基、鹵素取代基、-OH、-SH、-NH 2、-C 1-C 10烷基-NH 2、-N(C 1-C 10烷基)(C 1-C 10烷基)、-NH(C 1-C 10烷基)、­N(C 1-C 10烷基)(C 1-C 10烷基苯基)、­NH(C 1-C 10烷基苯基)、氰基、硝基、-CO 2H、-C(O)O(C 1-C 10烷基)、-CON(C 1-C 10烷基)(C 1-C 10烷基)、-CONH(C 1-C 10烷基)、-CON(C 1-C 10烷基)(C 1-C 10烷基苯基)、-CONH(C 1-C 10烷基苯基)、-CONH 2、-NHC(O)(C 1-C 10烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C 1-C 10烷基)C(O)(C 1-C 10烷基)、-N(C 1-C 10烷基)C(O)(苯基)、­C(O)C 1-C 10烷基、­C(O)C 1-C 10烷基苯基、­C(O)C 1-C 10鹵代烷基、-OC(O)C 1-C 10烷基、-SO 2(C 1-C 10烷基)、-SO 2(苯基)、-SO 2(C 1-C 10鹵代烷基)、-SO 2NH 2、-SO 2NH(C 1-C 10烷基)、-SO 2NH(苯基)、-NHSO 2(C 1-C 10烷基)、-NHSO 2(苯基)和-NHSO 2(C 1-C 10鹵代烷基)； 每個L 1獨立地是長度為1至70個碳原子的直鏈亞烷基，其中一個或多個碳原子可任選地被選自於以下基團所組成的群組中的任何一個或多個所替換：C(O)、NH、O、S、CH=N、S(O) 2、C 2-C 10亞烯基、C 2-C 10亞炔基、C 6-C 10亞芳基、C 3-C 18亞雜環基和C 5-C 10亞雜芳基；並且其中，L 1可選地具有由以下基團所組成的群組中的任何一個或多個的取代基：C 1-C 10烷基、C 6-C 10芳基、C 5-C 10雜芳基、C 1-C 10鹵代烷基、-OC 1-C 10烷基、­OC 1-C 10烷基苯基、-C 1-C 10烷基-OH、-OC 1-C 10鹵代烷基、-SC 1-C 10烷基、-SC 1-C 10烷基苯基、-C 1-C 10烷基-SH、-SC 1-C 10鹵代烷基、鹵素取代基、-OH、-SH、-NH 2、-C 1-C 10烷基-NH 2、-N(C 1-C 10烷基)(C 1-C 10烷基)、-NH(C 1-C 10烷基)、­N(C 1-C 10烷基)(C 1-C 10烷基苯基)、­NH(C 1-C 10烷基苯基)、氰基、硝基、-CO 2H、-C(O)O(C 1-C 10烷基)、-CON(C 1-C 10烷基)(C 1-C 10烷基)、-CONH(C 1-C 10烷基)、-CONH 2，-NHC(O)(C 1-C 10烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C 1-C 10烷基)C(O)(C 1-C 10烷基)、-N(C 1-C 10烷基)C(O)(苯基)、­C(O)C 1-C 10烷基、­C(O)C 1-C 10烷基苯基、­C(O)C 1-C 10鹵代烷基、-OC(O)C 1-C 10烷基、-SO 2(C 1-C 10烷基)、-SO 2(苯基)、-SO 2(C 1-C 10鹵代烷基)、-SO 2NH 2、-SO 2NH(C 1-C 10烷基)、-SO 2NH(苯基)、-NHSO 2(C 1-C 10烷基)、-NHSO 2(苯基)和-NHSO 2(C 1-C 10鹵代烷基)； 表示基團共價連接的位點； M 1表示靶向基團，其定義和可選擇的範圍與上述相同。在一些實施方式中，每個M 1獨立地選自對哺乳動物肝臟細胞表面上的去唾液酸糖蛋白受體具有親合力的配體中的一種。
技術人員會理解的是，儘管為了方便起見，L 1被定義為線性亞烷基，但是它可能不是線性基團或者名稱不同，例如由於上述替換和/或置換而產生的胺或烯基。為了本發明內容的目的，L 1的長度是連接兩個附著點的鏈中的原子數。為此目的，將替換所述直鏈亞烷基的碳原子而得到的環（如亞雜環基或亞雜芳基）計為一個原子。
當M 1為對哺乳動物肝臟細胞表面上的去唾液酸糖蛋白受體具有親合力的配體時，在一些實施方式中，n1可以是1至3的整數，n3可以是0至4的整數，保證所述綴合物中M 1配體的個數至少為2；在一些實施方式中，n1+n3≥2，這樣可以使得M 1配體的個數至少為3，使得M 1配體與肝表面去唾液酸糖蛋白受體更容易結合，進而促進所述綴合物通過內吞作用進入細胞。實驗表明，當M 1配體的個數大於3個時，M 1配體與肝表面去唾液酸糖蛋白受體結合的容易程度增加並不明顯，因此，從合成容易程度、結構/工藝成本和遞送效率等多方面綜合考慮，在一些實施方式中，n1為1至2的整數，n3為0至1的整數，且n1+n3=2至3。
在一些實施方式中，m1、m2和m3獨立地選自2至10的整數時，可以使多個M 1配體之間的空間位置適合M 1配體與肝表面去唾液酸糖蛋白受體的結合，為了使本發明提供的綴合物更為簡單，更容易合成和/或降低成本，在一些實施方式中，m1、m2和m3各自獨立地為2至5的整數，在一些實施方式中，m1=m2=m3。
本領域技術人員可以理解，當R 10、R 11、R 12、R 13、R 14和R 15各自獨立地選自H、C 1-C 10烷基、C 1-C 10鹵代烷基、以及C 1-C 10烷氧基中的一種時，不會改變本文公開的綴合物的性質，均可以實現本發明的目的。在一些實施方式中，R 10、R 11、R 12、R 13、R 14和R 15各自獨立地選自H、甲基和乙基。在一些實施方式中，R 10、R 11、R 12、R 13、R 14和R 15均為H。
根據本發明提供的siRNA綴合物，R 3為式A59所示結構的基團，其中，E 1為OH、SH或BH 2，基於製備原料易獲取性的考慮，在一些實施方式中，E 1為OH或SH。
在一些實施方式中，R 2的選擇是為了實現與含氮骨架上的N原子與A59的連接。在本發明的上下文中，“含氮骨架”是指連接有R 10、R 11、R 12、R 13、R 14和R 15的碳原子與N原子互相連接的鏈狀結構。因此，R 2可以是任何能夠以適當方式將A59基團連接至含氮骨架上的N原子的連接基團。在一些實施方式中，在通過固相合成的工藝製備本發明的siRNA綴合物的情況下，R 2基團中需要同時含有與含氮骨架上的N原子連接的連接位點和與R 3中的P原子相連接的連接位點。在一些實施方式中，R 2中所述與含氮骨架上的N原子連接的位點與N原子形成醯胺鍵，所述與R 3上的P原子連接的位點與P原子形成磷酸酯鍵。在一些實施方式中，R 2的長度為2至20個原子、或者4至15個原子。在一些實施方式中，R 2是B5、B6、B5’或B6’： 、 、 （B5）                                  （B6） 、 ； （B5’）                               （B6’） 其中， 表示基團共價鍵連接的位點。 q 2的取值範圍可以是1至10的整數，在一些實施方式中，q 2為1至5的整數。
L 1的作用是將M 1配體與含氮骨架上的N連接，為本發明的siRNA綴合物提供靶向功能。在一些實施方式中，L 1選自式A1至A26基團中的一種或多種的連接組合。在一些實施方式中，L 1選自A1、A4、A5、A6、A8、A10、A11和A13中的一種或多種的連接組合；在一些實施方式中，L 1選自A1、A4、A8、A10和A11中至少2個的連接組合；在一些實施方式中，L 1選自A1、A8、A10中至少2個的連接組合。 、 、 、 、 （A1）                （A2）                （A3）                  （A4） 、 、 、 、 （A5）               （A6）                     （A7）                    （A8） 、 、 、 （A9）                 （A10）                                （A11） 、 、 、 （A12）                         （A13）                           （A14） 、 、 、 （A15）                          （A16）                                  （A17） 、 、 、 、 （A18）                    （A19）               （A20）                  （A21） 、 、 、 （A22）                                （A23）                               （A24） 和 ； （A25）                         （A26）
在一些實施方式中，L 1的長度可以為3至25個原子，3至20個原子、4至15個原子或5至12個原子。在一些實施方式中是，L 1的長度為3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個原子。
在一些實施方式中，j1為2至10的整數，在一些實施方式中，j1為3至5的整數。在一些實施方式中，j2為2至10的整數，在一些實施方式中，j2為3至5的整數。R’為C1-C4的烷基，在一些實施方式中，R’為甲基、乙基和異丙基中的一種。Ra為A27、A28、A29、A30和A31中的一種，在一些實施方式中，Ra為A27或A28。Rb為C1-C5的烷基，在一些實施方式中，Rb為甲基、乙基、異丙基和丁基中的一種。在一些實施方式中，在式A1至A26中各自對j1、j2、R’、Ra、Rb進行選擇，以實現M 1配體與含氮骨架上的N連接，並使M 1配體之間的空間位置更適合M 1配體與肝表面去唾液酸糖蛋白受體結合。 、 、 、 、 （A27） （A28）     （A29）            （A30）               （A31）
在一些實施方式中，本發明的siRNA綴合物具有式（403）、（404）、（405）、（406）、（407）、（408）、（409）、（410）、（411）、（412）、（413）、（414）、（415）、（416）、（417）、（418）、（419）、（420）、（421）或（422）所示的結構： 式（403） 式（404） 式（405） 式（406） 式（407） 式（408） 式（409） 式（410） 式（411） 式（412） 式（413） 式（414） 式（415） 式（416） 式（417） 式（418） 式（419） 式（420） 式（421） 式（422）， 其中，Nu表示本發明的siRNA。
在一些實施方式中，式A59中的P原子可以連接到siRNA序列中任何可能的位置，例如，式A59中的P原子可以連接到siRNA正義鏈或反義鏈的任何一個核苷酸上；在一些實施方式中，式A59中的P原子連接到siRNA正義鏈的任何一個核苷酸上。在一些實施方式中，式A59中的P原子連接到siRNA正義鏈或反義鏈的端部；在一些實施方式中，式A59中的P原子連接到siRNA正義鏈的端部。所述端部指所述正義鏈或所述反義鏈中從其一端起算的前4個核苷酸。在一些實施方式中，式A59中的P原子連接到siRNA正義鏈或反義鏈的末端；在一些實施方式中，式A59中的P原子連接到siRNA正義鏈的3'末端。在連接至siRNA的正義鏈的上述位置的情況下，本發明提供的綴合物進入細胞後，在解旋時，可以釋放出單獨的siRNA反義鏈，以通過RNAi機制抑制靶基因表達。
式A59中的P原子可以連接到siRNA中的核苷酸上任何可能的位置，例如，核苷酸的5'位、核苷酸的2'位、核苷酸的3'位或核苷酸的鹼基上。在一些實施方式中，式A59中的P原子可通過形成磷酸二酯鍵連接至所述siRNA中的核苷酸的2'位、3'位或5'位。在一些實施方式中，式A59中的P原子連接在siRNA正義鏈的3'末端核苷酸的3'羥基脫氫後形成的氧原子上，或者式A59中的P原子通過取代siRNA正義鏈中的一個核苷酸的2'-羥基中的氫與核苷酸連接，或者式A59中的P原子通過取代siRNA正義鏈5'末端核苷酸的5'羥基中的氫與核苷酸連接。
本發明的發明人發現，本發明的siRNA以及含有這些siRNA的siRNA綴合物表現出具有顯著提高的血漿中穩定性和低脫靶效應的同時，還表現出較高的 HSD17B13沉默活性。因此，在一些實施方式中，本發明的siRNA可以為表1a和1b中示出的siRNA中的一種。
表1a本發明的第一種siRNA序列
siRNA編號 SEQ ID NO: 序列方向5' - 3'
siHSDa1-M1 7 GmAmAmUmAmAmUfGfCfUmGmGmGmAmCmAmGmUmAm
8 UmAfC SUmGmUfCmCmCmAmGmCmAmUfUmAfUmdUCmAmCm
siHSDa1-M2 7 GmAmAmUmAmAmUfGfCfUmGmGmGmAmCmAmGmUmAm
15 UmAfCmUmG SUfCmCmCmAmGmCmAmUfUmAfUmdUCmAmCm
siHSDa2-M1 9 GmUmGmAmAmUmAmAmUfGfCfUmGmGmGmAmCmAmGmUmAm
10 UmAfC SUmGmUfCmCmCmAmGmCmAmUfUmAfUmdUCmAmCmCmAm
siHSDa2-M2 9 GmUmGmAmAmUmAmAmUfGfCfUmGmGmGmAmCmAmGmUmAm
16 UmAfCmUmG SUfCmCmCmAmGmCmAmUfUmAfUmdUCmAmCmCmAm
siHSDa1-M1S 13 GmsAmsAmUmAmAmUfGfCfUmGmGmGmAmCmAmGmUmAm
19 UmsAfsC SUmGmUfCmCmCmAmGmCmAmUfUmAfUmdUCmsAmsCm
siHSDa1-M2S 13 GmsAmsAmUmAmAmUfGfCfUmGmGmGmAmCmAmGmUmAm
21 UmsAfsCmUmG SUfCmCmCmAmGmCmAmUfUmAfUmdUCmsAmsCm
siHSDa2-M1S 11 GmsUmsGmAmAmUmAmAmUfGfCfUmGmGmGmAmCmAmGmUmAm
23 UmsAfsC SUmGmUfCmCmCmAmGmCmAmUfUmAfUmdUCmAmCmsCmsAm
siHSDa2-M2S 11 GmsUmsGmAmAmUmAmAmUfGfCfUmGmGmGmAmCmAmGmUmAm
25 UmsAfsCmUmG SUfCmCmCmAmGmCmAmUfUmAfUmdUCmAmCmsCmsAm
siHSDa1-M1P1 7 GmAmAmUmAmAmUfGfCfUmGmGmGmAmCmAmGmUmAm
12 P1UmAfC SUmGmUfCmCmCmAmGmCmAmUfUmAfUmdUCmAmCm
siHSDa1-M2P1 7 GmAmAmUmAmAmUfGfCfUmGmGmGmAmCmAmGmUmAm
17 P1UmAfCmUmG SUfCmCmCmAmGmCmAmUfUmAfUmdUCmAmCm
siHSDa2-M1P1 9 GmUmGmAmAmUmAmAmUfGfCfUmGmGmGmAmCmAmGmUmAm
14 P1UmAfC SUmGmUfCmCmCmAmGmCmAmUfUmAfUmdUCmAmCmCmAm
siHSDa2-M2P1 9 GmUmGmAmAmUmAmAmUfGfCfUmGmGmGmAmCmAmGmUmAm
18 P1UmAfCmUmG SUfCmCmCmAmGmCmAmUfUmAfUmdUCmAmCmCmAm
siHSDa1-M1SP1 13 GmsAmsAmUmAmAmUfGfCfUmGmGmGmAmCmAmGmUmAm
20 P1UmsAfsC SUmGmUfCmCmCmAmGmCmAmUfUmAfUmdUCmsAmsCm
siHSDa1-M2SP1 13 GmsAmsAmUmAmAmUfGfCfUmGmGmGmAmCmAmGmUmAm
22 P1UmsAfsCmUmG SUfCmCmCmAmGmCmAmUfUmAfUmdUCmsAmsCm
siHSDa2-M1SP1 11 GmsUmsGmAmAmUmAmAmUfGfCfUmGmGmGmAmCmAmGmUmAm
24 P1UmsAfsC SUmGmUfCmCmCmAmGmCmAmUfUmAfUmdUCmAmCmsCmsAm
siHSDa2-M2SP1 11 GmsUmsGmAmAmUmAmAmUfGfCfUmGmGmGmAmCmAmGmUmAm
26 P1UmsAfsCmUmG SUfCmCmCmAmGmCmAmUfUmAfUmdUCmAmCmsCmsAm
表1b本發明的第二種siRNA序列
siRNA編號 SEQ ID NO: 序列方向5' - 3'
siHSDb1-M1 33 GmCmAmCmCmAmAfGfGfAmUmGmAmAmGmAmGmAmUm
34 AmUfC SUmCmUfUmCmAmUmCmCmUmUfGmGfUmdGCmUmGm
siHSDb1-M2 33 GmCmAmCmCmAmAfGfGfAmUmGmAmAmGmAmGmAmUm
41 AmUfCmUmC SUfUmCmAmUmCmCmUmUfGmGfUmdGCmUmGm
siHSDb2-M1 35 CmAmGmCmAmCmCmAmAfGfGfAmUmGmAmAmGmAmGmAmUm
36 AmUfC SUmCmUfUmCmAmUmCmCmUmUfGmGfUmdGCmUmGmAmGm
siHSDb2-M2 35 CmAmGmCmAmCmCmAmAfGfGfAmUmGmAmAmGmAmGmAmUm
42 AmUfCmUmC SUfUmCmAmUmCmCmUmUfGmGfUmdGCmUmGmAmGm
siHSDb1-M1S 39 GmsCmsAmCmCmAmAfGfGfAmUmGmAmAmGmAmGmAmUm
45 AmsUfsC SUmCmUfUmCmAmUmCmCmUmUfGmGfUmdGCmsUmsGm
siHSDb1-M2S 39 GmsCmsAmCmCmAmAfGfGfAmUmGmAmAmGmAmGmAmUm
47 AmsUfsCmUmC SUfUmCmAmUmCmCmUmUfGmGfUmdGCmsUmsGm
siHSDb2-M1S 37 CmsAmsGmCmAmCmCmAmAfGfGfAmUmGmAmAmGmAmGmAmUm
49 AmsUfsC SUmCmUfUmCmAmUmCmCmUmUfGmGfUmdGCmUmGmsAmsGm
siHSDb2-M2S 37 CmsAmsGmCmAmCmCmAmAfGfGfAmUmGmAmAmGmAmGmAmUm
51 AmsUfsCmUmC SUfUmCmAmUmCmCmUmUfGmGfUmdGCmUmGmsAmsGm
siHSDb1-M1P1 33 GmCmAmCmCmAmAfGfGfAmUmGmAmAmGmAmGmAmUm
38 P1AmUfC SUmCmUfUmCmAmUmCmCmUmUfGmGfUmdGCmUmGm
siHSDb1-M2P1 33 GmCmAmCmCmAmAfGfGfAmUmGmAmAmGmAmGmAmUm
43 P1AmUfCmUmC SUfUmCmAmUmCmCmUmUfGmGfUmdGCmUmGm
siHSDb2-M1P1 35 CmAmGmCmAmCmCmAmAfGfGfAmUmGmAmAmGmAmGmAmUm
40 P1AmUfC SUmCmUfUmCmAmUmCmCmUmUfGmGfUmdGCmUmGmAmGm
siHSDb2-M2P1 35 CmAmGmCmAmCmCmAmAfGfGfAmUmGmAmAmGmAmGmAmUm
44 P1AmUfCmUmC SUfUmCmAmUmCmCmUmUfGmGfUmdGCmUmGmAmGm
siHSDb1-M1SP1 39 GmsCmsAmCmCmAmAfGfGfAmUmGmAmAmGmAmGmAmUm
46 P1AmsUfsC SUmCmUfUmCmAmUmCmCmUmUfGmGfUmdGCmsUmsGm
siHSDb1-M2SP1 39 GmsCmsAmCmCmAmAfGfGfAmUmGmAmAmGmAmGmAmUm
48 P1AmsUfsCmUmC SUfUmCmAmUmCmCmUmUfGmGfUmdGCmsUmsGm
siHSDb2-M1SP1 37 CmsAmsGmCmAmCmCmAmAfGfGfAmUmGmAmAmGmAmGmAmUm
50 P1AmsUfsC SUmCmUfUmCmAmUmCmCmUmUfGmGfUmdGCmUmGmsAmsGm
siHSDb2-M2SP1 37 CmsAmsGmCmAmCmCmAmAfGfGfAmUmGmAmAmGmAmGmAmUm
52 P1AmsUfsCmUmC SUfUmCmAmUmCmCmUmUfGmGfUmdGCmUmGmsAmsGm
表1c本發明的第三種siRNA序列
siRNA編號 SEQ ID NO: 序列方向5' - 3'
siHSDc1-M1 59 CmAmCmCmAmAmGfGfAfUmGmAmAmGmAmGmAmUmUm
60 AmAfU SCmUmCfUmUmCmAmUmCmCmUfUmGfGmdUGmCmUm
siHSDc1-M2 59 CmAmCmCmAmAmGfGfAfUmGmAmAmGmAmGmAmUmUm
67 AmAfUmCmU SCfUmUmCmAmUmCmCmUfUmGfGmdUGmCmUm
siHSDc2-M1 61 AmGmCmAmCmCmAmAmGfGfAfUmGmAmAmGmAmGmAmUmUm
62 AmAfU SCmUmCfUmUmCmAmUmCmCmUfUmGfGmdUGmCmUmGmAm
siHSDc2-M2 61 AmGmCmAmCmCmAmAmGfGfAfUmGmAmAmGmAmGmAmUmUm
68 AmAfUmCmU SCfUmUmCmAmUmCmCmUfUmGfGmdUGmCmUmGmAm
siHSDc1-M1S 65 CmsAmsCmCmAmAmGfGfAfUmGmAmAmGmAmGmAmUmUm
71 AmsAfsU SCmUmCfUmUmCmAmUmCmCmUfUmGfGmdUGmsCmsUm
siHSDc1-M2S 65 CmsAmsCmCmAmAmGfGfAfUmGmAmAmGmAmGmAmUmUm
73 AmsAfsUmCmU SCfUmUmCmAmUmCmCmUfUmGfGmdUGmsCmsUm
siHSDc2-M1S 63 AmsGmsCmAmCmCmAmAmGfGfAfUmGmAmAmGmAmGmAmUmUm
75 AmsAfsU SCmUmCfUmUmCmAmUmCmCmUfUmGfGmdUGmCmUmsGmsAm
siHSDc2-M2S 63 AmsGmsCmAmCmCmAmAmGfGfAfUmGmAmAmGmAmGmAmUmUm
77 AmsAfsUmCmU SCfUmUmCmAmUmCmCmUfUmGfGmdUGmCmUmsGmsAm
siHSDc1-M1P1 59 CmAmCmCmAmAmGfGfAfUmGmAmAmGmAmGmAmUmUm
64 P1AmAfU SCmUmCfUmUmCmAmUmCmCmUfUmGfGmdUGmCmUm
siHSDc1-M2P1 59 CmAmCmCmAmAmGfGfAfUmGmAmAmGmAmGmAmUmUm
69 P1AmAfUmCmU SCfUmUmCmAmUmCmCmUfUmGfGmdUGmCmUm
siHSDc2-M1P1 61 AmGmCmAmCmCmAmAmGfGfAfUmGmAmAmGmAmGmAmUmUm
66 P1AmAfU SCmUmCfUmUmCmAmUmCmCmUfUmGfGmdUGmCmUmGmAm
siHSDc2-M2P1 61 AmGmCmAmCmCmAmAmGfGfAfUmGmAmAmGmAmGmAmUmUm
70 P1AmAfUmCmU SCfUmUmCmAmUmCmCmUfUmGfGmdUGmCmUmGmAm
siHSDc1-M1SP1 65 CmsAmsCmCmAmAmGfGfAfUmGmAmAmGmAmGmAmUmUm
72 P1AmsAfsU SCmUmCfUmUmCmAmUmCmCmUfUmGfGmdUGmsCmsUm
siHSDc1-M2SP1 65 CmsAmsCmCmAmAmGfGfAfUmGmAmAmGmAmGmAmUmUm
74 P1AmsAfsUmCmU SCfUmUmCmAmUmCmCmUfUmGfGmdUGmsCmsUm
siHSDc2-M1SP1 63 AmsGmsCmAmCmCmAmAmGfGfAfUmGmAmAmGmAmGmAmUmUm
76 P1AmsAfsU SCmUmCfUmUmCmAmUmCmCmUfUmGfGmdUGmCmUmsGmsAm
siHSDc2-M2SP1 63 AmsGmsCmAmCmCmAmAmGfGfAfUmGmAmAmGmAmGmAmUmUm
78 P1AmsAfsUmCmU SCfUmUmCmAmUmCmCmUfUmGfGmdUGmCmUmsGmsAm
表1d本發明的第四種siRNA序列
siRNA編號 SEQ ID NO: 序列方向5' - 3'
siHSDd1-M1 85 UmCmUmGmAmUmAfGfAfUmGmGmAmAmUmAmCmUmUm
86 AmAfG SUmAmUfUmCmCmAmUmCmUmAfUmCfAmdGAmCmUm
siHSDd1-M2 85 UmCmUmGmAmUmAfGfAfUmGmGmAmAmUmAmCmUmUm
93 AmAfGmUmA SUfUmCmCmAmUmCmUmAfUmCfAmdGAmCmUm
siHSDd2-M1 87 AmGmUmCmUmGmAmUmAfGfAfUmGmGmAmAmUmAmCmUmUm
88 AmAfG SUmAmUfUmCmCmAmUmCmUmAfUmCfAmdGAmCmUmUmCm
siHSDd2-M2 87 AmGmUmCmUmGmAmUmAfGfAfUmGmGmAmAmUmAmCmUmUm
94 AmAfGmUmA SUfUmCmCmAmUmCmUmAfUmCfAmdGAmCmUmUmCm
siHSDd1-M1S 91 UmsCmsUmGmAmUmAfGfAfUmGmGmAmAmUmAmCmUmUm
97 AmsAfsG SUmAmUfUmCmCmAmUmCmUmAfUmCfAmdGAmsCmsUm
siHSDd1-M2S 91 UmsCmsUmGmAmUmAfGfAfUmGmGmAmAmUmAmCmUmUm
99 AmsAfsGmUmA SUfUmCmCmAmUmCmUmAfUmCfAmdGAmsCmsUm
siHSDd2-M1S 89 AmsGmsUmCmUmGmAmUmAfGfAfUmGmGmAmAmUmAmCmUmUm
101 AmsAfsG SUmAmUfUmCmCmAmUmCmUmAfUmCfAmdGAmCmUmsUmsCm
siHSDd2-M2S 89 AmsGmsUmCmUmGmAmUmAfGfAfUmGmGmAmAmUmAmCmUmUm
103 AmsAfsGmUmA SUfUmCmCmAmUmCmUmAfUmCfAmdGAmCmUmsUmsCm
siHSDd1-M1P1 85 UmCmUmGmAmUmAfGfAfUmGmGmAmAmUmAmCmUmUm
90 P1AmAfG SUmAmUfUmCmCmAmUmCmUmAfUmCfAmdGAmCmUm
siHSDd1-M2P1 85 UmCmUmGmAmUmAfGfAfUmGmGmAmAmUmAmCmUmUm
95 P1AmAfGmUmA SUfUmCmCmAmUmCmUmAfUmCfAmdGAmCmUm
siHSDd2-M1P1 87 AmGmUmCmUmGmAmUmAfGfAfUmGmGmAmAmUmAmCmUmUm
92 P1AmAfG SUmAmUfUmCmCmAmUmCmUmAfUmCfAmdGAmCmUmUmCm
siHSDd2-M2P1 87 AmGmUmCmUmGmAmUmAfGfAfUmGmGmAmAmUmAmCmUmUm
96 P1AmAfGmUmA SUfUmCmCmAmUmCmUmAfUmCfAmdGAmCmUmUmCm
siHSDd1-M1SP1 91 UmsCmsUmGmAmUmAfGfAfUmGmGmAmAmUmAmCmUmUm
98 P1AmsAfsG SUmAmUfUmCmCmAmUmCmUmAfUmCfAmdGAmsCmsUm
siHSDd1-M2SP1 91 UmsCmsUmGmAmUmAfGfAfUmGmGmAmAmUmAmCmUmUm
100 P1AmsAfsGmUmA SUfUmCmCmAmUmCmUmAfUmCfAmdGAmsCmsUm
siHSDd2-M1SP1 89 AmsGmsUmCmUmGmAmUmAfGfAfUmGmGmAmAmUmAmCmUmUm
102 P1AmsAfsG SUmAmUfUmCmCmAmUmCmUmAfUmCfAmdGAmCmUmsUmsCm
siHSDd2-M2SP1 89 AmsGmsUmCmUmGmAmUmAfGfAfUmGmGmAmAmUmAmCmUmUm
104 P1AmsAfsGmUmA SUfUmCmCmAmUmCmUmAfUmCfAmdGAmCmUmsUmsCm
表1e本發明的第五種siRNA序列
siRNA編號 SEQ ID NO: 序列方向5' - 3'
siHSDe1-M1 111 CmUmGmAmUmAmGfAfUfGmGmAmAmUmAmCmUmUmAm
112 UmAfA SGmUmAfUmUmCmCmAmUmCmUfAmUfCmdAGmAmCm
siHSDe1-M2 111 CmUmGmAmUmAmGfAfUfGmGmAmAmUmAmCmUmUmAm
119 UmAfAmGmU SAfUmUmCmCmAmUmCmUfAmUfCmdAGmAmCm
siHSDe2-M1 113 GmUmCmUmGmAmUmAmGfAfUfGmGmAmAmUmAmCmUmUmAm
114 UmAfA SGmUmAfUmUmCmCmAmUmCmUfAmUfCmdAGmAmCmUmUm
siHSDe2-M2 113 GmUmCmUmGmAmUmAmGfAfUfGmGmAmAmUmAmCmUmUmAm
120 UmAfAmGmU SAfUmUmCmCmAmUmCmUfAmUfCmdAGmAmCmUmUm
siHSDe1-M1S 117 CmsUmsGmAmUmAmGfAfUfGmGmAmAmUmAmCmUmUmAm
123 UmsAfsA SGmUmAfUmUmCmCmAmUmCmUfAmUfCmdAGmsAmsCm
siHSDe1-M2S 117 CmsUmsGmAmUmAmGfAfUfGmGmAmAmUmAmCmUmUmAm
125 UmsAfsAmGmU SAfUmUmCmCmAmUmCmUfAmUfCmdAGmsAmsCm
siHSDe2-M1S 115 GmsUmsCmUmGmAmUmAmGfAfUfGmGmAmAmUmAmCmUmUmAm
127 UmsAfsA SGmUmAfUmUmCmCmAmUmCmUfAmUfCmdAGmAmCmsUmsUm
siHSDe2-M2S 115 GmsUmsCmUmGmAmUmAmGfAfUfGmGmAmAmUmAmCmUmUmAm
129 UmsAfsAmGmU SAfUmUmCmCmAmUmCmUfAmUfCmdAGmAmCmsUmsUm
siHSDe1-M1P1 111 CmUmGmAmUmAmGfAfUfGmGmAmAmUmAmCmUmUmAm
116 P1UmAfA SGmUmAfUmUmCmCmAmUmCmUfAmUfCmdAGmAmCm
siHSDe1-M2P1 111 CmUmGmAmUmAmGfAfUfGmGmAmAmUmAmCmUmUmAm
121 P1UmAfAmGmU SAfUmUmCmCmAmUmCmUfAmUfCmdAGmAmCm
siHSDe2-M1P1 113 GmUmCmUmGmAmUmAmGfAfUfGmGmAmAmUmAmCmUmUmAm
118 P1UmAfA SGmUmAfUmUmCmCmAmUmCmUfAmUfCmdAGmAmCmUmUm
siHSDe2-M2P1 113 GmUmCmUmGmAmUmAmGfAfUfGmGmAmAmUmAmCmUmUmAm
122 P1UmAfAmGmU SAfUmUmCmCmAmUmCmUfAmUfCmdAGmAmCmUmUm
siHSDe1-M1SP1 117 CmsUmsGmAmUmAmGfAfUfGmGmAmAmUmAmCmUmUmAm
124 P1UmsAfsA SGmUmAfUmUmCmCmAmUmCmUfAmUfCmdAGmsAmsCm
siHSDe1-M2SP1 117 CmsUmsGmAmUmAmGfAfUfGmGmAmAmUmAmCmUmUmAm
126 P1UmsAfsAmGmU SAfUmUmCmCmAmUmCmUfAmUfCmdAGmsAmsCm
siHSDe2-M1SP1 115 GmsUmsCmUmGmAmUmAmGfAfUfGmGmAmAmUmAmCmUmUmAm
128 P1UmsAfsA SGmUmAfUmUmCmCmAmUmCmUfAmUfCmdAGmAmCmsUmsUm
siHSDe2-M2SP1 115 GmsUmsCmUmGmAmUmAmGfAfUfGmGmAmAmUmAmCmUmUmAm
130 P1UmsAfsAmGmU SAfUmUmCmCmAmUmCmUfAmUfCmdAGmAmCmsUmsUm
表1f本發明的第六種siRNA序列
siRNA編號 SEQ ID NO: 序列方向5' - 3'
siHSDf1-M1 137 GmAmUmGmGmAmAfUfAfCmUmUmAmCmCmAmAmUmAm
138 UmAfU SUmGmGfUmAmAmGmUmAmUmUfCmCfAmdUCmUmAm
siHSDf1-M2 137 GmAmUmGmGmAmAfUfAfCmUmUmAmCmCmAmAmUmAm
145 UmAfUmUmG SGfUmAmAmGmUmAmUmUfCmCfAmdUCmUmAm
siHSDf2-M1 139 UmAmGmAmUmGmGmAmAfUfAfCmUmUmAmCmCmAmAmUmAm
140 UmAfU SUmGmGfUmAmAmGmUmAmUmUfCmCfAmdUCmUmAmUmCm
siHSDf2-M2 139 UmAmGmAmUmGmGmAmAfUfAfCmUmUmAmCmCmAmAmUmAm
146 UmAfUmUmG SGfUmAmAmGmUmAmUmUfCmCfAmdUCmUmAmUmCm
siHSDf1-M1S 143 GmsAmsUmGmGmAmAfUfAfCmUmUmAmCmCmAmAmUmAm
149 UmsAfsU SUmGmGfUmAmAmGmUmAmUmUfCmCfAmdUCmsUmsAm
siHSDf1-M2S 143 GmsAmsUmGmGmAmAfUfAfCmUmUmAmCmCmAmAmUmAm
151 UmsAfsUmUmG SGfUmAmAmGmUmAmUmUfCmCfAmdUCmsUmsAm
siHSDf2-M1S 141 UmsAmsGmAmUmGmGmAmAfUfAfCmUmUmAmCmCmAmAmUmAm
153 UmsAfsU SUmGmGfUmAmAmGmUmAmUmUfCmCfAmdUCmUmAmsUmsCm
siHSDf2-M2S 141 UmsAmsGmAmUmGmGmAmAfUfAfCmUmUmAmCmCmAmAmUmAm
155 UmsAfsUmUmG SGfUmAmAmGmUmAmUmUfCmCfAmdUCmUmAmsUmsCm
siHSDf1-M1P1 137 GmAmUmGmGmAmAfUfAfCmUmUmAmCmCmAmAmUmAm
142 P1UmAfU SUmGmGfUmAmAmGmUmAmUmUfCmCfAmdUCmUmAm
siHSDf1-M2P1 137 GmAmUmGmGmAmAfUfAfCmUmUmAmCmCmAmAmUmAm
147 P1UmAfUmUmG SGfUmAmAmGmUmAmUmUfCmCfAmdUCmUmAm
siHSDf2-M1P1 139 UmAmGmAmUmGmGmAmAfUfAfCmUmUmAmCmCmAmAmUmAm
144 P1UmAfU SUmGmGfUmAmAmGmUmAmUmUfCmCfAmdUCmUmAmUmCm
siHSDf2-M2P1 139 UmAmGmAmUmGmGmAmAfUfAfCmUmUmAmCmCmAmAmUmAm
148 P1UmAfUmUmG SGfUmAmAmGmUmAmUmUfCmCfAmdUCmUmAmUmCm
siHSDf1-M1SP1 143 GmsAmsUmGmGmAmAfUfAfCmUmUmAmCmCmAmAmUmAm
150 P1UmsAfsU SUmGmGfUmAmAmGmUmAmUmUfCmCfAmdUCmsUmsAm
siHSDf1-M2SP1 143 GmsAmsUmGmGmAmAfUfAfCmUmUmAmCmCmAmAmUmAm
152 P1UmsAfsUmUmG SGfUmAmAmGmUmAmUmUfCmCfAmdUCmsUmsAm
siHSDf2-M1SP1 141 UmsAmsGmAmUmGmGmAmAfUfAfCmUmUmAmCmCmAmAmUmAm
154 P1UmsAfsU SUmGmGfUmAmAmGmUmAmUmUfCmCfAmdUCmUmAmsUmsCm
siHSDf2-M2SP1 141 UmsAmsGmAmUmGmGmAmAfUfAfCmUmUmAmCmCmAmAmUmAm
156 P1UmsAfsUmUmG SGfUmAmAmGmUmAmUmUfCmCfAmdUCmUmAmsUmsCm
表1g本發明的第七種siRNA序列
siRNA編號 SEQ ID NO: 序列方向5' - 3'
siHSDg1-M1 163 GmAmAmUmAmCmUfUfAfCmCmAmAmUmAmAmGmAmAm
164 UmUfC SUmUmAfUmUmGmGmUmAmAmGfUmAfUmdUCmCmAm
siHSDg1-M2 163 GmAmAmUmAmCmUfUfAfCmCmAmAmUmAmAmGmAmAm
171 UmUfCmUmU SAfUmUmGmGmUmAmAmGfUmAfUmdUCmCmAm
siHSDg2-M1 165 UmGmGmAmAmUmAmCmUfUfAfCmCmAmAmUmAmAmGmAmAm
166 UmUfC SUmUmAfUmUmGmGmUmAmAmGfUmAfUmdUCmCmAmUmCm
siHSDg2-M2 165 UmGmGmAmAmUmAmCmUfUfAfCmCmAmAmUmAmAmGmAmAm
172 UmUfCmUmU SAfUmUmGmGmUmAmAmGfUmAfUmdUCmCmAmUmCm
siHSDg1-M1S 169 GmsAmsAmUmAmCmUfUfAfCmCmAmAmUmAmAmGmAmAm
175 UmsUfsC SUmUmAfUmUmGmGmUmAmAmGfUmAfUmdUCmsCmsAm
siHSDg1-M2S 169 GmsAmsAmUmAmCmUfUfAfCmCmAmAmUmAmAmGmAmAm
177 UmsUfsCmUmU SAfUmUmGmGmUmAmAmGfUmAfUmdUCmsCmsAm
siHSDg2-M1S 167 UmsGmsGmAmAmUmAmCmUfUfAfCmCmAmAmUmAmAmGmAmAm
179 UmsUfsC SUmUmAfUmUmGmGmUmAmAmGfUmAfUmdUCmCmAmsUmsCm
siHSDg2-M2S 167 UmsGmsGmAmAmUmAmCmUfUfAfCmCmAmAmUmAmAmGmAmAm
181 UmsUfsCmUmU SAfUmUmGmGmUmAmAmGfUmAfUmdUCmCmAmsUmsCm
siHSDg1-M1P1 163 GmAmAmUmAmCmUfUfAfCmCmAmAmUmAmAmGmAmAm
168 P1UmUfC SUmUmAfUmUmGmGmUmAmAmGfUmAfUmdUCmCmAm
siHSDg1-M2P1 163 GmAmAmUmAmCmUfUfAfCmCmAmAmUmAmAmGmAmAm
173 P1UmUfCmUmU SAfUmUmGmGmUmAmAmGfUmAfUmdUCmCmAm
siHSDg2-M1P1 165 UmGmGmAmAmUmAmCmUfUfAfCmCmAmAmUmAmAmGmAmAm
170 P1UmUfC SUmUmAfUmUmGmGmUmAmAmGfUmAfUmdUCmCmAmUmCm
siHSDg2-M2P1 165 UmGmGmAmAmUmAmCmUfUfAfCmCmAmAmUmAmAmGmAmAm
174 P1UmUfCmUmU SAfUmUmGmGmUmAmAmGfUmAfUmdUCmCmAmUmCm
siHSDg1-M1SP1 169 GmsAmsAmUmAmCmUfUfAfCmCmAmAmUmAmAmGmAmAm
176 P1UmsUfsC SUmUmAfUmUmGmGmUmAmAmGfUmAfUmdUCmsCmsAm
siHSDg1-M2SP1 169 GmsAmsAmUmAmCmUfUfAfCmCmAmAmUmAmAmGmAmAm
178 P1UmsUfsCmUmU SAfUmUmGmGmUmAmAmGfUmAfUmdUCmsCmsAm
siHSDg2-M1SP1 167 UmsGmsGmAmAmUmAmCmUfUfAfCmCmAmAmUmAmAmGmAmAm
180 P1UmsUfsC SUmUmAfUmUmGmGmUmAmAmGfUmAfUmdUCmCmAmsUmsCm
siHSDg2-M2SP1 167 UmsGmsGmAmAmUmAmCmUfUfAfCmCmAmAmUmAmAmGmAmAm
182 P1UmsUfsCmUmU SAfUmUmGmGmUmAmAmGfUmAfUmdUCmCmAmsUmsCm
其中，大寫字母C、G、U、A表示核苷酸的鹼基組成；小寫字母m表示該字母m左側相鄰的一個核苷酸為甲氧基修飾的核苷酸；小寫字母f表示該字母f左側相鄰的一個核苷酸為氟代修飾的核苷酸；小寫字母d表示該字母d右側相鄰的一個核苷酸為2'-去氧核苷酸；底線標出的大寫字母 S表示該字母 S左側相鄰的一個核苷酸為穩定化修飾核苷酸；小寫字母s表示該字母s左右兩個核苷酸之間為硫代磷酸酯基連接；P1表示該P1右側相鄰的一個核苷酸為5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸類似物修飾的核苷酸。在一些實施方式中， S是表示具體的穩定化修飾例如 moe，其中，底線標出的字母組合 moe表示在該字母組合 moe左側相鄰的一個核苷酸為具有2'-O-甲氧基乙基修飾的核苷酸。在一些實施方式中，P1是表示具體修飾的VP、Ps或P，其中，字母組合VP表示該字母組合VP右側相鄰的一個核苷酸為乙烯基磷酸酯（5'-(E)-vinylphosphonate，E-VP）修飾的核苷酸，字母組合Ps表示該字母組合Ps右側相鄰的一個核苷酸為硫代磷酸酯修飾的核苷酸，大寫字母P表示該字母P右側相鄰的一個核苷酸為5'-磷酸核苷酸。另外，上述表1a-1g中所列的序列中的每個U或者T可任意地相互替換，不會對siRNA的活性或脫靶效應產生明顯影響。
本發明 siRNA 綴合物的製備
上述siRNA綴合物可以通過現有技術中已經詳細描述的方法進行合成。例如，WO2015006740A2中詳細描述了多種siRNA綴合物的製備方法。也可以通過本領域技術人員熟知的方式，獲得本發明的siRNA綴合物。如WO2014025805A1中記載了式（305）所示結構的製備方法，Rajeev等人在ChemBioChem 2015, 16, 903-908中描述了式（307）所示結構的製備方法。中國專利申請CN110959011A也詳細公開了製備式（308）所示的siRNA綴合物的方法。以引用的方式將上述文獻內容整體併入本文。
本發明的siRNA綴合物也可以與藥學上可接受的其它輔料聯用，該輔料可以為本領域常規採用的各種製劑或化合物的一種或多種，詳情可參見上文關於本發明的藥物組合物的描述。
本發明的 siRNA 、藥物組合物及 siRNA 綴合物 的應用
在一些實施方式中，本發明提供了本發明的siRNA，和/或藥物組合物和/或siRNA綴合物在製備用於治療和/或預防與 HSD17B13基因表達的mRNA水平相關的疾病或症狀的藥物中的用途。在一些實施方式中，本發明提供了本發明的siRNA，和/或藥物組合物和/或siRNA綴合物在製備用於治療和/或預防慢性纖維炎性肝病的藥物中的用途。
在一些實施方式中，本發明提供了一種治療和/或預防與 HSD17B13基因表達的mRNA水平相關的疾病或症狀的方法，所述方法包括向有需要的受試者給予本發明的siRNA，和/或本發明的藥物組合物和/或本發明的siRNA綴合物。在一些實施方式中，所述與 HSD17B13基因表達的mRNA水平相關的疾病或症狀是慢性纖維炎性肝病。在一些實施方式中，所述慢性纖維炎性肝病選自由下列所組成的群組：肝炎、肝纖維化、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、肝硬化、酒精性脂肪性肝炎(ASH)、酒精性脂肪肝病(ALD)、丙型肝炎(HCV)相關的硬化、藥物引起的肝損傷、及肝細胞壞死。
在一些實施方式中，本發明還提供了一種抑制細胞中 HSD17B13基因水平表達的方法，所述方法包括將有效劑量的本發明的siRNA，和/或藥物組合物和/或siRNA綴合物與所述細胞接觸。
通過將本發明提供的siRNA、藥物組合物和/或siRNA綴合物給予有需要的受試者，可以通過對基因表達進行調控的機制達到預防和/或治療由細胞中 HSD17B13基因的表達而引起的病理狀況或疾病的目的。
因此，本發明提供的siRNA、藥物組合物和/或siRNA綴合物可用於預防和/或治療所述病理狀況或疾病、或用於製備用於預防和/或治療本文所述病理狀況或疾病的藥物。
本文所使用的術語“給藥/給予”是指通過使得至少部分地將siRNA、藥物組合物和/或siRNA綴合物定位於期望的位點以產生期望效果的方法或途徑，將siRNA、藥物組合物和/或siRNA綴合物放置入受試者體內。適於本發明方法的給藥途徑包括局部給藥和全身給藥。一般而言，局部給藥導致與受試者整個身體相比將更多siRNA、藥物組合物和/或siRNA綴合物遞送至特定位點；而全身給藥導致將所述siRNA、藥物組合物和/或siRNA綴合物遞送至受試者的基本整個身體。考慮到本發明旨在提供預防和/或治療慢性纖維炎性肝病的手段，在一些實施方式中採用能夠將藥物遞送至肝臟的給藥方式。
可通過本領域已知的任何合適途徑向受試者給藥，所述途徑包括但不僅限於：口服或胃腸外途徑，如靜脈內給藥、肌肉內給藥、皮下給藥、經皮給藥、氣道給藥（氣霧劑）、肺部給藥、鼻部給藥、直腸給藥和局部給藥（包括口腔含化給藥和舌下給藥）。給藥頻率可以是每天、每週、每兩周、每三周、每個月、每2個月、每3個月、每半年、或每年1次或多次。
本發明所述的siRNA、藥物組合物和/或siRNA綴合物的使用劑量可為本領域常規的劑量，所述劑量可以根據各種參數、尤其是受試者的年齡、體重和性別來確定。可在細胞培養或實驗動物中通過標準藥學程式測定毒性和療效，例如測定LD50（使50%的群體死亡的致死量）和ED50（在量反應中指能引起50%最大反應強度的劑量；在質反應中，指引起50%實驗物件出現陽性反應時的劑量）。可基於由細胞培養分析和動物研究得到的資料得出人用劑量的範圍。
在給予本發明所述的siRNA、藥物組合物和/或siRNA綴合物時，例如，對於雄性或雌性、6至12周齡、體重18至25g的C57BL/6J或C3H/HeNCrlVr小鼠，以所述siRNA、藥物組合物和/或siRNA綴合物中的siRNA的量計：對於siRNA與藥學上可接受的綴合分子形成的siRNA綴合物，其siRNA用量可以為0.001至100mg/kg體重，在一些實施方式中為0.01至50mg/kg體重，在進一步的實施方式中為0.05至20mg/kg體重，在更進一步的實施方式中為0.1至15mg/kg體重，在又進一步的實施方式中為0.1至10mg/kg體重。在給予本發明所述的siRNA、藥物組合物和/或siRNA綴合物時，可優選上述用量。
另外，通過將本發明的siRNA、藥物組合物和/或siRNA綴合物導入細胞，還可以通過RNAi的機制達到抑制細胞中 HSD17B13基因的表達這一目的。
採用本發明提供的方法抑制 HSD17B13基因在細胞中表達，所提供的siRNA、藥物組合物和/或siRNA綴合物中的siRNA的用量是本領域技術人員根據期望獲得的效果容易確定的。例如，在一些實施方式中，所提供的siRNA綴合物中的siRNA用量是這樣的量：其足以減少靶基因的表達，並導致在靶細胞表面處1pM至1μM、或0.01nM至100nM、或0.05nM至50nM或至約5nM的細胞外濃度。達到該局部濃度所需的量將隨各種因素而變化，所述因素包括遞送方法、遞送部位、在遞送部位和靶細胞或組織之間的細胞層的數目、遞送是局部還是全身等。在遞送部位處的濃度可以顯著高於在靶細胞或組織的表面處的濃度。
試劑盒
本發明提供了一種試劑盒，所述試劑盒包含有效量的本發明提供的siRNA、藥物組合物和/或siRNA綴合物。
在一些實施方式中，本文所述的試劑盒可在一個容器中提供siRNA、藥物組合物和/或siRNA綴合物。在一些實施方式中，本文所述的試劑盒可包含一個提供藥學上可接受的賦形劑的容器。在一些實施方式中，所述試劑盒中還可包含其它成分，如穩定劑或防腐劑等。在一些實施方式中，本文所述的試劑盒可在不同於提供本文所述siRNA、藥物組合物和/或siRNA綴合物的容器以外的其它容器中包含至少一種其它治療劑。在一些實施方式中，所述試劑盒可包含用於將siRNA、藥物組合物和/或siRNA綴合物與藥學上可接受的載體和/或輔料或其它成分（若有的話）進行混合的說明書。
在本發明的試劑盒中，所述siRNA和藥學上可接受的載體和/或輔料以及所述藥物組合物和/或siRNA綴合物，和/或藥學上可接受的輔料可以任何形式提供，例如液體形式、乾燥形式或凍乾形式。在一些實施方式中，所述siRNA和藥學上可接受的載體和/或輔料以及所述藥物組合物和/或siRNA綴合物和任選的藥學上可接受的輔料基本上純淨和/或無菌。在一些實施方式中，可在本發明的試劑盒中提供無菌水。
下面將通過實施例來進一步說明本發明，但是本發明並不因此而受到任何限制。
實施例
除非特別說明，以下實施例中所用到的試劑、培養基均為市售商品，所用到的核酸電泳、real-time PCR等操作均參照Molecular Cloning（Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)）所記載的方法進行。
製備例1至7： 本發明提供的siRNA綴合物1至7的合成
按照CN110959011A製備例13所述的製備方法，製備獲得了以下表2中的綴合物1至7，區別僅在於，各siRNA綴合物中含有的siRNA的正義鏈和反義鏈分別如表2中所示；按照以下表2中編號為綴合物1至綴合物7的siRNA的核酸序列，分別合成siRNA的正義鏈和反義鏈。使用超純水（Milli-Q超純水儀，電阻率18.2MΩ*cm（25℃））將各siRNA綴合物稀釋至濃度為0.2mg/mL（以siRNA計）後，利用液質聯用儀（LC-MS，Liquid Chromatography-Mass SP1ectrometry，購於Waters公司，型號：LCT Premier）進行分子量檢測。實測值與理論值一致，說明所合成的綴合物1至7是目標設計的雙鏈核酸序列。各個siRNA綴合物分別具有式（403）所示的結構，並且該siRNA綴合物包含的siRNA分別具有表2中綴合物1至7所對應的siRNA序列。 式（403） 其中，式（403）中的Nu為具有本發明表2中綴合物1至7所對應的siRNA序列的siRNA基團，並且綴合基團連接至siRNA基團正義鏈的3'末端核苷酸的核糖3'位。
對比製備例1至9： 參比siRNA綴合物的合成
按照CN110959011A製備例13所述的製備方法，製備獲得了上文表2中編號為參比綴合物1、參比綴合物2、參比綴合物3、參比綴合物4、參比綴合物5、參比綴合物6、參比綴合物7、參比綴合物8和參比綴合物NC的參比siRNA綴合物，區別僅在於，各參比siRNA綴合物中含有的siRNA的正義鏈和反義鏈分別如表2中所示；按照以下表2中編號為參比綴合物1、參比綴合物2、參比綴合物3、參比綴合物4、參比綴合物5、參比綴合物6、參比綴合物7、參比綴合物8和參比綴合物NC的siRNA的核酸序列，分別合成siRNA的正義鏈和反義鏈。使用超純水（Milli-Q超純水儀，電阻率18.2MΩ*cm（25℃））將各參比siRNA綴合物稀釋至濃度為0.2mg/mL（以siRNA計）後，利用液質聯用儀（LC-MS，Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，購於Waters公司，型號：LCT Premier）進行分子量檢測。實測值與理論值一致，說明所合成的參比綴合物1、參比綴合物2、參比綴合物3、參比綴合物4、參比綴合物5、參比綴合物6、參比綴合物7、參比綴合物8和參比綴合物NC分別具有目標設計的雙鏈核酸序列。各參比siRNA綴合物具有式（403）所示的結構，並且所包含的siRNA分別具有表2中參比綴合物1、參比綴合物2、參比綴合物4、參比綴合物5、參比綴合物6、參比綴合物7和參比綴合物NC所對應的siRNA序列。其中，參比綴合物1是和綴合物1相比具有基本相同的序列組成、但不包含穩定化修飾核苷酸的siRNA綴合物；參比綴合物2是和綴合物2相比具有基本相同的序列組成、但不包含穩定化修飾核苷酸的siRNA綴合物；參比綴合物3是和綴合物3相比具有基本相同的序列組成、但不包含穩定化修飾核苷酸的siRNA綴合物；參比綴合物4是和綴合物4相比具有基本相同的序列組成、但不包含穩定化修飾核苷酸的siRNA綴合物；參比綴合物5是和綴合物5相比具有基本相同的序列組成、但不包含穩定化修飾核苷酸的siRNA綴合物；參比綴合物6是和綴合物6相比具有基本相同的序列組成、但不包含穩定化修飾核苷酸的siRNA綴合物；參比綴合物7是和綴合物7相比具有基本相同的序列組成、但不包含穩定化修飾核苷酸的siRNA綴合物；參比綴合物8是和綴合物9相比具有基本相同的序列組成、但不包含穩定化修飾核苷酸的siRNA綴合物；參比綴合物NC是序列與已知的mRNA均不具有顯著同源性的陰性對照siRNA綴合物。
表2 siRNA綴合物中的siRNA序列
製備例 編號 siRNA 綴合物 編號 序列方向5'-3' SEQ ID NO
製備例1 綴合物1 正義鏈 GmsAmsAmUmAmAmUfGfCfUmGmGmGmAmCmAmGmGmAm 183
反義鏈 UmsAfsCmUmG moeUfCmCmCmAmGmCmAmUfUmAfUmdTCmsAmsCm 184
製備例2 綴合物2 正義鏈 GmsCmsAmCmCmAmAfGfGfAmUmGmAmAmGmAmGmCmUm 185
反義鏈 AmsUfsCmUm5mC moeUfUmCmAmUmCmCmUmUfGmGfUmdGCmsUmsGm 186
製備例3 綴合物3 正義鏈 CmsAmsCmCmAmAmGfGfAfUmGmAmAmGmAmGmAmGmUm 187
反義鏈 AmsAfsUmCmT moeCfUmUmCmAmUmCmCmUfUmGfGmdTGmsCmsUm 188
製備例4 綴合物4 正義鏈 UmsCmsUmGmAmUmAfGfAfUmGmGmAmAmUmAmCmGmUm 189
反義鏈 AmsAfsGmUmA moeUfUmCmCmAmUmCmUmAfUmCfAmdGAmsCmsUm 190
製備例5 綴合物5 正義鏈 CmsUmsGmAmUmAmGfAfUfGmGmAmAmUmAmCmUmGmAm 191
反義鏈 UmsAfsAmGmT moeAfUmUmCmCmAmUmCmUfAmUfCmdAGmsAmsCm 192
製備例6 綴合物6 正義鏈 GmsAmsUmGmGmAmAfUfAfCmUmUmAmCmCmAmAmGmAm 193
反義鏈 UmsAfsUmUmG moeGfUmAmAmGmUmAmUmUfCmCfAmdTCmsUmsAm 194
製備例7 綴合物7 正義鏈 GmsAmsAmUmAmCmUfUfAfCmCmAmAmUmAmAmGmCmAm 195
反義鏈 UmsUfsCmUmT moeAfUmUmGmGmUmAmAmGfUmAfUmdTCmsCmsAm 196
製備例8 綴合物8 正義鏈 GmsAmsAmUmAmCmUfUfAfCmCmAmAmUmAmAmGmAmAm 197
反義鏈 UmsUfsCmUmU moeAfUmUmGmGmUmAmAmGfUmAfUmUmCmsCmsAm 198
製備例9 綴合物9 正義鏈 CmsAmsCmCmAmAmGfGfAfUmGmAmAmGmAmGmAmUmUm 65
反義鏈 AmsAfsUmCmT moeCfUmUmCmAmUmCmCmUfUmGfGmUmGmsCmsUm 240
製備例10 綴合物10 正義鏈 CmsUmsGmAmUmAmGfAfUfGmGmAmAmUmAmCmUmUmAm 117
反義鏈 UmsAfsAmGmTmoeAfUmUmCmCmAmUmCmUfAmUfCmAmGmsAmsCm 241
製備例11 綴合物11 S CmsCmsUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 232
AS VPUmsUmsTmoeGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm 233
製備例12 綴合物12 S CmsCmsAmAmGmAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm 234
AS PUmsAfsGmUmTmoeCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmsCmsUm 235
對比 製備例1 參比 綴合物1 正義鏈 GmsAmsAmUmAmAmUfGfCfUmGmGmGmAmCmAmGmGmAm 199
反義鏈 UmsAfsCmUmGmUfCmCmCmAmGmCmAmUfUmAfUmdTCmsAmsCm 200
對比 製備例2 參比 綴合物2 正義鏈 GmsCmsAmCmCmAmAfGfGfAmUmGmAmAmGmAmGmCmUm 201
反義鏈 AmsUfsCmUmCmUfUmCmAmUmCmCmUmUfGmGfUmdGCmsUmsGm 202
對比 製備例3 參比綴合物3 正義鏈 CmsAmsCmCmAmAmGfGfAfUmGmAmAmGmAmGmAmGmUm 203
反義鏈 AmsAfsUmCmUmCfUmUmCmAmUmCmCmUfUmGfGmdTGmsCmsUm 204
對比 製備例4 參比 綴合物4 正義鏈 UmsCmsUmGmAmUmAfGfAfUmGmGmAmAmUmAmCmGmUm 205
反義鏈 AmsAfsGmUmAmUfUmCmCmAmUmCmUmAfUmCfAmdGAmsCmsUm 206
對比 製備例5 參比 綴合物5 正義鏈 CmsUmsGmAmUmAmGfAfUfGmGmAmAmUmAmCmUmGmAm 207
反義鏈 UmsAfsAmGmUmAfUmUmCmCmAmUmCmUfAmUfCmdAGmsAmsCm 208
對比 製備例6 參比 綴合物6 正義鏈 GmsAmsUmGmGmAmAfUfAfCmUmUmAmCmCmAmAmGmAm 209
反義鏈 UmsAfsUmUmGmGfUmAmAmGmUmAmUmUfCmCfAmdTCmsUmsAm 210
對比 製備例7 參比 綴合物7 正義鏈 GmsAmsAmUmAmCmUfUfAfCmCmAmAmUmAmAmGmCmAm 211
反義鏈 UmsUfsCmUmUmAfUmUmGmGmUmAmAmGfUmAfUmdTCmsCmsAm 212
對比 製備例8 參比綴合物NC 正義鏈 UmsUmsCmUmCmCmGfAfAfCmGmUmGmUmCmAmCmGmUm 213
反義鏈 AmsCfsGmUmGmAfCmAmCmGmUmUmCmGfGmAfGmAmAmsCmsUm 214
對比 製備例9 參比 綴合物8 正義鏈 CmsAmsCmCmAmAmGfGfAfUmGmAmAmGmAmGmAmUmUm 65
反義鏈 AmsAfsUmCmUmCfUmUmCmAmUmCmCmUfUmGfGmUmGmsCmsUm 231
對比 製備例10 參比綴合物10 正義鏈 CmsCmsUmUmGmAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm 236
反義鏈 VPUmsUmsUGmAmAfGmUmAmUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm 237
對比 製備例11 參比 綴合物11 正義鏈 CmsCmsAmAmGmAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm 238
反義鏈 PUmsAfsGmUmUCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmsCmsUm 239
其中，大寫字母C、G、U、A、T表示核苷酸的鹼基組成；小寫字母m表示該字母m左側相鄰的一個核苷酸為甲氧基修飾的核苷酸；小寫字母f表示該字母f左側相鄰的一個核苷酸為氟代修飾的核苷酸；底線標出的字母組合 moe表示該字母組合moe左側相鄰的一個核苷酸為核糖2'-O-甲氧基乙基修飾的核苷酸；5mC moe表示鹼基為5-甲基胞嘧啶，且核糖被2'-O-甲氧基乙基修飾的核苷酸；小寫字母s表示該字母s左右兩個核苷酸之間為硫代磷酸酯基連接；小寫字母d表示該字母d右側相鄰的一個核苷酸為2'-去氧核苷酸，字母組合VP表示該字母組合VP右側相鄰的一個核苷酸為核糖環5’位具有(E)乙烯基磷酸基修飾的核苷酸，大寫字母P表示該大寫字母合VP右側相鄰的一個核苷酸為核糖環5’位具有磷酸酯基的核苷酸。
製備例8至12： 本發明提供的siRNA綴合物8至12的合成
按照CN110959011A製備例13所述的製備方法，製備獲得了上表2中的綴合物8至10，區別僅在於，各siRNA綴合物中含有的siRNA的正義鏈和反義鏈分別如表2中所示；按照以上表2中編號為綴合物8至綴合物12的siRNA的核酸序列，分別合成siRNA的正義鏈和反義鏈。使用超純水（Milli-Q超純水儀，電阻率18.2MΩ*cm（25℃））將各siRNA綴合物稀釋至濃度為0.2mg/mL（以siRNA計）後，利用液質聯用儀（LC-MS，Liquid Chromatography-Mass SP1ectrometry，購於Waters公司，型號：LCT Premier）進行分子量檢測。實測值與理論值一致，說明所合成的綴合物8至12是目標設計的雙鏈核酸序列。各個siRNA綴合物分別具有式（403）所示的結構，其中綴合基團共價連接至siRNA正義鏈的3’末端核苷酸的核糖環3’位，並且該siRNA綴合物包含的siRNA基團分別具有表2中綴合物8至12所對應的siRNA序列。具體的分子量檢測結果參見以下表2A：
表2A siRNA綴合物分子量檢測結果
siRNA 綴合物 序列方向5'-3' 分子量 理論值（mw） 分子量 實測值 （mw）
綴合物1 S GmsAmsAmUmAmAmUfGfCfUmGmGmGmAmCmAmGmGmAm 7698.54 7697.2
AS UmsAfsCmUmG moeUfCmCmCmAmGmCmAmUfUmAfUmdTCmsAmsCm 6892.52 6891.0
綴合物2 S GmsCmsAmCmCmAmAfGfGfAmUmGmAmAmGmAmGmCmUm 7657.52 7656.6
AS AmsUfsCmUm5mC moeUfUmCmAmUmCmCmUmUfGmGfUmdGCmsUmsGm 6902.47 6901.2
綴合物3 S CmsAmsCmCmAmAmGfGfAfUmGmAmAmGmAmGmAmGmUm 7681.55 7680.4
AS AmsAfsUmCmT moeCfUmUmCmAmUmCmCmUfUmGfGmdTGmsCmsUm 6900.49 6899.4
綴合物4 S UmsCmsUmGmAmUmAfGfAfUmGmGmAmAmUmAmCmGmUm 7597.42 7596.4
AS AmsAfsGmUmA moeUfUmCmCmAmUmCmUmAfUmCfAmdGAmsCmsUm 6926.56 6925.8
綴合物5 S CmsUmsGmAmUmAmGfAfUfGmGmAmAmUmAmCmUmGmAm 7620.46 7620.2
AS UmsAfsAmGmT moeAfUmUmCmCmAmUmCmUfAmUfCmdAGmsAmsCm 6940.58 6939.6
綴合物6 S GmsAmsUmGmGmAmAfUfAfCmUmUmAmCmCmAmAmGmAm 7603.47 7602.7
AS UmsAfsUmUmG moeGfUmAmAmGmUmAmUmUfCmCfAmdTCmsUmsAm 6958.56 6957.6
綴合物7 S GmsAmsAmUmAmCmUfUfAfCmCmAmAmUmAmAmGmCmAm 7547.44 7546.7
AS UmsUfsCmUmT moeAfUmUmGmGmUmAmAmGfUmAfUmdTCmsCmsAm 6949.45 6949.2
綴合物8 S GmsAmsAmUmAmCmUfUfAfCmCmAmAmUmAmAmGmAmAm 7571.47 7671.6
AS UmsUfsCmUmT moeAfUmUmGmGmUmAmAmGfUmAfUmUmCmsCmsAm 6965.54 6965.3
綴合物9 S CmsAmsCmCmAmAmGfGfAfUmGmAmAmGmAmGmAmUmUm 7642.51 7642.0
AS AmsAfsUmCmT moeCfUmUmCmAmUmCmCmUfUmGfGmUmGmsCmsUm 6916.49 6916.0
綴合物10 S CmsUmsGmAmUmAmGfAfUfGmGmAmAmUmAmCmUmUmAm 7581.42 7580.3
AS UmsAfsAmGmTmoeAfUmUmCmCmAmUmCmUfAmUfCmAmGmsAmsCm 6970.60 6970.2
製備例13： 本發明提供的siRNA綴合物Tm測定
稱取上述製備的綴合物9或者參比綴合物8各25mg，分別用PBS配置成0.02mg/mL的供試品溶液。將供試品溶液置於石英比色（10mm）中。使用Agilent cary 3000 UV，設定波長260nm，按照說明書測定Tm值。測得綴合物9的Tm值為89.02℃，參比綴合物8的Tm值為88.07℃。表明與參比綴合物相比，本發明的siRNA綴合物具有基本相同的序列組成、但包含穩定化修飾核苷酸的siRNA的Tm增加0.95℃。
製備例14： 雙鏈熱解離溫度Tm的測定
用1×PBS緩衝液將上述製備的綴合物11、綴合物12、參比綴合物10和參比綴合物11中的每一個分別配製為0.02 mg/mL的溶液，作為供試品溶液。在配備有熱式程式的Agilent cary300 UV分光光度計上的10 mm路徑長度石英比色皿中加入供試品溶液，在260 nm波長下監測溫度-吸光率曲線，其中加熱速率為0.5 ℃/min，自20.0℃起始升溫至95℃。雙鏈熱解離溫度Tm按照分光光度計說明書由溫度-吸光率曲線的一階導數計算獲得。Tm值和ΔTm值結果如以下表2B所示：
表2B 雙鏈熱解離溫度Tm
綴合物 Tm（℃） （℃）
參比綴合物10 65.02 0
綴合物11 66.07 1.05
參比綴合物11 67.27 0
綴合物12 71.22 3.95
其中，對於綴合物11和參比綴合物10， ΔTm值（待測綴合物）=Tm（待測綴合物）-Tm（參比綴合物10）； 對於綴合物12和參比綴合物11， ΔTm值（待測綴合物）=Tm（待測綴合物）-Tm（參比綴合物11）。
根據表2B的結果可知，如說明書中所述，按照本發明的方式，在siRNA中引入穩定化修飾核苷酸，可以提高雙鏈熱解離溫度，其Tm值升高。本發明提供的其他未給出Tm值的綴合物具有類似的性質。
實驗例1： siRNA綴合物在體外psi-CHECK系統中對在靶目標序列的抑制活性
根據Kumico Ui-Tei et.al., Functional dissection of siRNA sequence by systematic DNA substitution: modified siRNA with a DNA seed arm is a powerful tool for mammalian gene silencing with significantly reduced off-target effect. Nucleic Acids Research, 2008.36(7), 2136-2151描述的方法，構建檢測質粒，將所述檢測質粒與待測綴合物共轉染至HEK293A細胞中，通過雙螢光素酶報告基因的表達水平，來反映siRNA的目標序列抑制活性。具體步驟如下：
[1] 構建檢測質粒
採用psi-CHECK TM-2（Promega TM）質粒構建了檢測質粒，根據綴合物1、綴合物2和綴合物4分別構建檢測質粒，所述質粒中分別含有目標序列1、目標序列2和目標序列3，即siRNA綴合物1靶序列為目標序列1，siRNA綴合物2靶序列為目標序列2，siRNA綴合物4靶序列為目標序列3。對於待測siRNA綴合物，目標序列如下所示： 目標序列1： 5’- TCGAGGTGAATAATGCTGGGACAGTAGC -3’ （SEQ ID NO: 215） 目標序列2： 5’- TCGAGCAGCACCAAGGATGAAGAGATGC -3’ （SEQ ID NO: 216） 目標序列3： 5’- TCGAGAGTCTGATAGATGGAATACTTGC -3’ （SEQ ID NO: 217）
該目標序列1、目標序列2或目標序列3與 HSDmRNA中的一部分同源，並與所檢測的siRNA綴合物中反義鏈的序列完全互補，因此各siRNA綴合物對目標序列1的抑制效果可反映所檢測的siRNA綴合物的目標基因表達的抑制能力。將目標序列1及其互補序列克隆到psi-CHECK TM-2質粒的Xho I/Not I位點。
[2] 轉染
在添加有10 %的胎牛血清（FBS，RMBIO 公司）及0.2 %體積比的青鏈黴素雙抗（Penicillin-Streptomycin，HyClone公司）的H-DMEM完全培養基（HyClone公司）中，於37°C在含5% CO 2/95%空氣的培養箱中培養HEK293A細胞（購自南京科百生物技術有限公司）。
將HEK293A細胞以8×10 3細胞/孔接種於96孔板中，16小時後細胞生長密度達到70%時，吸盡培養孔中完全培養基，每孔加入80 μL opti-MEM培養基（GIBCO 公司）繼續培養1.5小時。
用PBS將上述檢測質粒稀釋成20 μM儲存液；用PBS將每一種待測siRNA綴合物分別配製成20 μM、4 μM、1 μM、0.25 μM、0.0625 μM、0.015625 μM、0.003906 μM、0.0009765 μM、0.0002441 μM、0.00006104 μM和0.00001526 μM（以siRNA綴合物中的siRNA量計）共11個不同濃度的siRNA綴合物工作液。所用siRNA綴合物分別為上述製備獲得的綴合物1、綴合物2、綴合物4和參比綴合物1、參比綴合物2、參比綴合物4。
對於每一siRNA綴合物，分別配製1A1至1A11溶液，每份1A1至1A11溶液依次分別含有上述11個濃度的siRNA工作液1 μL、檢測質粒工作液0.05 μL（含檢測質粒10 ng）和8.95 μL的Opti-MEM培養基。
配製1B溶液，每份1B溶液含有0.2 μL Lipofectamine™ 2000和9.8 μL Opti-MEM培養基。
配製1C溶液，每份1C溶液含有檢測質粒工作液0.05 μL（含檢測質粒10 ng）和8.95 μL的Opti-MEM培養基。
分別將一份1B溶液與得到的一份每個siRNA綴合物的1A1至1A11溶液混合，分別室溫下孵育20min，得到每個siRNA綴合物的轉染複合物1X1至1X11。
將一份1B溶液與一份1C溶液混合，分別室溫下孵育20min，得到空白轉染複合物1Xa。
在培養孔中，分別加入每一siRNA綴合物的轉染複合物1X1至1X11，均勻混合，加入量為20 μL/孔，得到每個siRNA綴合物終濃度分別約為40 nM、10 nM、2.5 nM、0.625 nM、0.15625 nM、0.03906 nM、0.009765 nM、0.002441 nM、0.0006103 nM、0.0001526 nM、0.00003815 nM（以siRNA綴合物中的siRNA量計）的轉染複合物，每個siRNA綴合物的轉染複合物1X1至1X11均轉染3個培養孔，得到含siRNA綴合物的共轉染混合物，記為測試組。
對於每一siRNA綴合物，在另外3個培養孔中，分別加入轉染複合物1Xa，加入量為20 μL/孔，得到不含siRNA綴合物的轉染混合物，記為空白對照組。
分別將含siRNA綴合物的共轉染混合物和不含siRNA綴合物的轉染混合物在培養孔中轉染4小時後，每孔補加100 μL 含20% FBS的H-DMEM完全培養基。將96孔板置於CO 2培養箱在37℃、含5 v/v% CO 2的空氣氣氛下繼續培養24小時。
[3] 檢測
吸去培養孔中的培養基，每孔加入150μL的Dual-Glo ®Luciferase試劑與H-DMEM混合溶液（體積比1:1），充分混勻，室溫孵育10min後，轉移120μL混合液到96孔酶標板上，使用Synergy II多功能酶標儀（BioTek公司）讀取96孔酶標板上各培養孔中Firefly的化學發光值（Fir）；再向96孔酶標板上每孔加入60μL Dual-Glo ®Stop & Glo ®試劑，充分混勻，室溫孵育10min後，按照讀取Fir的排布方式，使用酶標儀讀取96孔酶標板上各培養孔中 Renilla的化學發光值（Ren）。
計算96孔酶標板上每孔發光比值Ratio = Ren / Fir，各測試組或對照組的發光比值Ratio(測試)或Ratio(對照)為三個培養孔Ratio的平均值；以對照組的發光比值為基準，對各測試組的發光比值進行歸一化，獲得Ratio(測試)/Ratio(對照)的比值R，以此表示 Renilla報告基因的相對表達水平，即殘留活性。siRNA對目標序列的抑制率 = (1-R) × 100%。
依據轉染了不同濃度的待測siRNA後，HEK293A細胞中 Renilla的相對殘留活性，利用Graphpad 5.0軟體的非線性回歸分析功能擬合log(inhibitor) vs. response—Variable slope (four parameters)劑量-效應曲線。
根據擬合的劑量-效應曲線對應的函數，計算待測siRNA靶向目標序列的IC 50值，所述函數如下， 式中： Y是比值R，即 Renilla的相對殘留活性， X為轉染siRNA濃度的對數值， Bot是穩態期底部的Y值， Top是穩態期頂部的Y值， X'是當Y在底部到頂部之間一半時對應的X值，而HillSlope則是曲線在X'處的斜率。
由該劑量-效應曲線和對應的函數，確定當Y=50%時對應的X 50值，計算獲得各siRNA的IC 50值=10^X 50(nM)，IC 50值總結於表3中。
表3 siRNA綴合物在psi-CHECK系統中的IC 50
綴合物編號 IC 50(nM)
綴合物1 0.008
參比綴合物1 0.044
綴合物2 0.003
參比綴合物2 0.009
綴合物4 0.002
參比綴合物4 0.003
由表3的結果可知，本發明的siRNA綴合物在體外psi-CHECK系統中有很高的目標序列抑制活性。同時，本發明的siRNA綴合物與其序列相同、但不包含穩定化修飾核苷酸的參比綴合物1相比，參比綴合物1的IC 50值是綴合物1的IC 50的5倍以上，參比綴合物2的IC 50值是綴合物2的IC 50的3倍，綴合物4同樣顯示出極低的目標序列抑制的IC 50值。這些結果表明，與參比綴合物相比，本發明的siRNA綴合物對目標序列具有顯著提高的抑制活性。
實驗例2： siRNA綴合物在猴原代肝細胞中對 HSDmRNA表達量的抑制效率檢測
在I型膠原蛋白包被的12孔培養板中，每孔中加入1000μL的細胞維持培養基（CM Culture medium，The Primary Cell Solution），於37℃在含5% CO 2/95%空氣的培養箱中培養30min。
將凍存的猴原代肝細胞（The Primary Cell Solution）在含有10% 胎牛血清（FBS，RMBIO公司）的解凍培養基（Thawing medium，The Primary Cell Solution公司）中，在37℃下解凍2min，在700 rpm速度下離心5min，棄去上清液，以接種培養基（CM seeding medium，The Primary Cell Solution公司）溶解並使用細胞計數儀計數，隨後加入接種培養基至活細胞量為4 × 10 5細胞/孔，於37℃在含5% CO 2/95%空氣的培養箱中培養過夜。
棄去培養基，每孔添加1000 μL的細胞維持培養基（CM Culture medium，The Primary Cell Solution），得到猴原代肝細胞懸液。
用DEPC水將siRNA綴合物6、綴合物7、參比綴合物6和參比綴合物7分別配製成20 μM（以siRNA計）的siRNA綴合物工作液。
配製2A溶液，使用siRNA綴合物6配製2A溶液，每份2A溶液依次含有上述siRNA綴合物6工作液3 μl和細胞維持培養基97 μl。
配製2B溶液，使用siRNA綴合物7配製2B溶液，每份2B溶液依次含有上述siRNA綴合物7工作液3 μl和細胞維持培養基97 μl。
配製2C溶液，使用siRNA參比綴合物6配製2C溶液，每份2C溶液依次含有上述siRNA參比綴合物6工作液3 μl和細胞維持培養基97 μl。
配製2D溶液，使用siRNA參比綴合物7配製2D溶液，每份2D溶液依次含有上述siRNA參比綴合物7工作液3 μl和細胞維持培養基97 μl。
配製2E溶液，每份2E溶液含有2 μl Lipofectamine™ 2000和細胞維持培養基98 μl。
分別將一份2E溶液與得到的siRNA綴合物6的2A溶液混合，分別室溫下孵育20min，得到siRNA綴合物6的轉染複合物2X a。
將一份2E溶液與得到的siRNA綴合物7的2B溶液混合，分別室溫下孵育20min，得到siRNA綴合物7的轉染複合物2X b。
將一份2E溶液與得到的siRNA參比綴合物7的2C溶液混合，分別室溫下孵育20min，得到siRNA參比綴合物7的轉染複合物2X C。
將一份2E溶液與得到的siRNA參比綴合物7的2D溶液混合，分別室溫下孵育20min，得到siRNA參比綴合物7的轉染複合物2X d。
將一份2E溶液與細胞維持培養基100 μl混合，在室溫下孵育20min，得到空白轉染複合物2X e。
在2個培養孔中，分別加入siRNA綴合物6的轉染複合物2X a，均勻混合，加入量為200μl/孔，得到含siRNA綴合物6終濃度（以siRNA計）約為50 nM的轉染複合物的轉染混合物，記為測試組1。
在2個培養孔中，分別加入siRNA綴合物7的轉染複合物2X b，均勻混合，加入量為200μl/孔，得到含siRNA綴合物7終濃度（以siRNA計）約為50 nM的轉染複合物的轉染混合物，記為測試組2。
在2個培養孔中，分別加入siRNA參比綴合物6的轉染複合物2X c，均勻混合，加入量為200μl/孔，得到含參比siRNA綴合物6終濃度（以siRNA計）約為50 nM的轉染混合物，記為測試組3。
在2個培養孔中，分別加入siRNA參比綴合物7的轉染複合物2X d，均勻混合，加入量為200μl/孔，得到含參比siRNA綴合物7終濃度（以siRNA計）約為50 nM的轉染混合物，記為測試組4。
在另外2個培養孔中，分別加入空白轉染複合物2X e，加入量為200μl/孔，得到不含siRNA的轉染混合物，記為空白對照組。
將載有含siRNA綴合物6、綴合物7、參比綴合物6和參比綴合物7轉染混合物的12孔板置於含5% CO 2/95%空氣的培養箱在37°C下繼續培養24h。
隨後，使用UNIQ-10 柱式總 RNA 抽提試劑盒（購自生工公司，貨號B511361-0100）根據說明書記載的方法提取各孔細胞中的總RNA，分別得到含總RNA的溶液。
對於每孔細胞，分別取含1μg總RNA的溶液，使用反轉錄試劑盒Goldenstar TMRT6 cDNA Synthesis Kit（購自北京擎科新業生物技術有限公司，貨號TSK301M）提供的試劑，其中選取Goldenstar TMOligo (dT)17作為引物，按試劑盒說明書中反轉錄操作步驟配製反轉錄反應體系20μl，對各孔細胞的總RNA進行反轉錄。反轉錄的條件為：對於每一反轉錄反應體系，將反轉錄反應體系置於50℃孵育50min，然後85℃孵育5min，最後4℃孵育30s，反應結束後，向反轉錄反應體系中加入DEPC水80μl，得到含cDNA的溶液100 μL。
對於每一反轉錄反應體系，分別取上述含cDNA的溶液5μl做範本，使用NovoStart® SYBR qPCR SuperMix Plus試劑盒（購自近岸蛋白質科技有限公司，貨號E096-01B）提供的試劑配置qPCR反應體系20μl，其中，用於擴增目標基因HSD和內參基因GAPDH的PCR引物序列如表4所示，每條引物的終濃度為0.25μM。將包含目標基因HSD的各qPCR反應體系置於ABI StepOnePlus Real-Time PCR儀上，使用三步法進行擴增，擴增程式為在95℃預變性10min，然後在95℃變性30s，在55℃退火30s，在72℃延伸30s，重複上述變性、退火、延伸的過程共40次後，得到含有擴增了目標基因HSD的產物W；對於包含內參基因GAPDH的qPCR體系，使用與上述相同的方法進行qPCR擴增，區別僅在於，擴增程式中退火的溫度為60℃，得到含有擴增了內參基因GAPDH的產物W’。產物W和W’隨即依次經過95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s的孵育，通過即時螢光定量PCR儀分別測定獲得產物W和W’中目標基因HSD和內參基因GAPDH的溶解曲線，得到目標基因HSD和內參基因GAPDH的Ct值。
表4：引物信息
基因名稱 引物類型 核苷酸序列（5'酸序列） SEQ ID NO
猴HSD 上游引物 GAGTGCCGAAAACTAGGCGT 218
下游引物 CATCCTTGGTGCTGCGAAGA 219
猴GAPDH 上游引物 GGTCGGAGTCAACGGATTT 220
下游引物 CCAGCATCGCCCCACTTGA 221
對於上述各測試組和對照組，分別進行2次上述定量PCR檢測。
採用比較Ct（ΔΔCt）法，對各測試組中目標基因HSD進行相對定量計算，計算方法如下： ΔCt(測試組) = Ct(測試組目標基因) – Ct(測試組內參基因) ΔCt(對照組) = Ct(對照組目標基因) – Ct(對照組內參基因) ΔΔCt(測試組) = ΔCt(測試組) - ΔCt(對照組平均) ΔΔCt(對照組) = ΔCt(對照組) - ΔCt(對照組平均) 其中，ΔCt(對照組平均)是空白對照組兩次檢測測得的ΔCt(對照組)的算術平均值。從而，各測試組和空白對照組的每一次檢測結果均對應一個ΔΔCt值。
以對照組為基準，對測試組 HSDmRNA的表達水平進行歸一化，定義對照組 HSDmRNA表達水平為100%。 測試組 HSDmRNA相對表達水平 = 2 -ΔΔCt( 測試組 )× 100% 測試組 HSDmRNA抑制率 = (1-測試組 HSDmRNA相對表達水平) × 100%
表5為轉染了本發明的siRNA綴合物6和綴合物7後，猴原代肝細胞中 HSDmRNA的抑制率。
表5 猴原代肝細胞中 HSDmRNA的抑制率
siRNA綴合物 綴合物6 參比綴合物6 綴合物7 參比綴合物7
HSDmRNA抑制率%(50nM) 94.71% 86.46% 91.30% 79.15%
由表5的結果可見，在猴原代肝細胞中，本發明提供的siRNA綴合物6和綴合物7在50nM濃度下，與其序列相同、但不包含穩定化修飾核苷酸的參比綴合物相比，顯示出顯著更高的 HSDmRNA抑制活性。
實施例3： 不同濃度siRNA綴合物在猴肝原代細胞上對 HSDmRNA表達量的抑制效率
採用和實驗例2中相同的方法製備猴原代肝細胞。
用DEPC水將siRNA綴合物2、綴合物3、綴合物5、和參比綴合物NC分別配製成20 μM和2μM（以siRNA計）的siRNA綴合物工作液。
配製3A溶液，每份3A溶液依次含有上述siRNA綴合物2工作液3 μl和細胞維持培養基97 μl，分別得到3Aa、3Ab的siRNA工作液。
配製3B溶液，每份3B溶液依次含有上述siRNA綴合物3工作液3 μl和細胞維持培養基97 μl，分別得到3Ba、3Bb的siRNA工作液。
配製3C溶液，每份3C溶液依次含有上述siRNA綴合物5工作液3 μl和細胞維持培養基97 μl，分別得到3Ca、3Cb的siRNA工作液。
配製3D溶液, 每份3D溶液依次含有上述參比綴合物NC工作液3 μl和細胞維持培養基97 μl，分別得到3Da、3Db的siRNA工作液。
配製3E溶液，每份3E1溶液含有2 μl Lipofectamine™ 2000和細胞維持培養基98 μl。
配製3Xa溶液，分別將1份3E溶液與1份3Aa溶液混合、1份2Ab 溶液混合，室溫下孵育20min，分別得到轉染複合物3Xa1或3Xa2。
配製3Xb溶液，分別將1份3E溶液與1份3Ba溶液混合、1份3Bb 溶液混合，室溫下孵育20min，分別得到轉染複合物3Xb1或3Xb2。
配製3Xc溶液，分別將1份3E溶液與1份3Ca溶液混合、1份3Cb 溶液混合，室溫下孵育20min，分別得到轉染複合物3Xc1或3Xc2。
配製3Xd溶液，分別將1份3E溶液與1份3Da溶液混合、1份3Db溶液混合，室溫下孵育20min，分別得到轉染複合物3Xd1或3Xd2。
將一份3E溶液與細胞維持培養基100 μl混合，在室溫下孵育20min，得到空白轉染複合物3Xe1。
在2個培養孔，分別加入siRNA綴合物2的轉染複合物3Xa1或3Xa2，均勻混合，加入量為200μl/孔，得到每個siRNA綴合物終濃度（以siRNA計）分別約為50 nM或5nM的轉染混合物，記為測試組1。
在2個培養孔中，分別加入siRNA綴合物3的轉染複合物3Xb1或3Xb2，均勻混合，加入量為200μl/孔，得到每個siRNA綴合物終濃度（以siRNA計）分別約為50 nM或5nM的轉染混合物，記為測試組2。
在2個培養孔中，分別加入siRNA綴合物5的轉染複合物3Xc1或3Xc2，均勻混合，加入量為200μl/孔，得到每個siRNA綴合物終濃度（以siRNA計）分別約為50 nM或5nM的轉染混合物，記為測試組3。
在2個培養孔中，分別加入空白轉染複合物3Xe1，加入量為200μl/孔，得到不含siRNA的轉染混合物，記為空白對照組。
在2個培養孔中，分別加入siRNA參比綴合物NC的轉染複合物3Xf1或3Xf2，均勻混合，加入量為200μl/孔，得到每個siRNA綴合物終濃度（以siRNA計）分別約為50 nM的轉染混合物，記為陰性對照組
將載有含siRNA綴合物2、綴合物3、綴合物5和參比綴合物NC的轉染混合物12孔板置於含5% CO 2/95%空氣的培養箱在37°C下繼續培養24h。
採用和實驗例2中相同的方法提取各孔細胞中的總RNA和反轉錄並對各測試組中目標基因HSD進行相對定量計算。結果如圖1所示。圖1是顯示了轉染50 nM和5 nM濃度的本發明的siRNA後，體外猴原代肝細胞中的 HSDmRNA相對表達水平的柱狀圖。圖1中，blank表示空白對照組，NC表示陰性對照組。由圖1的結果可見，在猴原代肝細胞中，本發明提供的siRNA綴合物2、綴合物3和綴合物5在50 nM和5 nM的siRNA濃度下，顯示出高的 HSDmRNA抑制活性。
實驗例4： siRNA綴合物在體外psi-CHECK系統中對脫靶序列的抑制活性
按照實驗例1的方法，測試了綴合物3和參比綴合物3在體外psi-CHECK系統中的脫靶序列抑制活性。區別僅在於，對於綴合物3使用如下所示的目標序列4： 目標序列4： 5’- TCGAGTATGATCGTTGCTGAGAGATTGC-3’ （SEQ ID NO: 222） 其中，目標序列4中包含與待測綴合物中siRNA反義鏈部分互補的序列、因此待測綴合物對目標序列4的抑制效果可反應脫靶效應的程度。即，抑制效果越高，表示待測綴合物越可能發生脫靶。
按照實驗例1的方法，由該劑量-效應曲線和對應的函數，確定當Y=50%時對應的X50值，計算獲得各siRNA的IC 50值=10^X50 (nM)。其結果，在所測定的濃度範圍內，綴合物3的脫靶目標序列抑制率始終未低於50%，即，完全未發生脫靶。
表6 siRNA綴合物在psi-CHECK系統中的脫靶效應IC 50
綴合物編號 脫靶IC 50
綴合物3 未見脫靶
參比綴合物3 78.541
由實驗例3和實驗例4的結果可知，本發明的siRNA綴合物3在大大提高 HSDmRNA抑制活性的同時，表現出比參比綴合物更低的脫靶效應的效果，具有優異的成藥能力。
實驗例5： siRNA綴合物在小鼠原代肝細胞中的 HSDmRNA抑制活性
從C57BL/6j小鼠新鮮肝組織中提取獲得小鼠肝原代細胞，在Opti-MEM（1X）培養基（GIBCO公司，貨號31985-070）中調整小鼠肝原代細胞密度至1×10 5細胞/mL，得到小鼠肝原代細胞懸液。隨後在12孔板的不同培養孔中分別加入體積為1 mL/孔的小鼠肝原代細胞懸液。
用DEPC水將siRNA綴合物6、綴合物7和參比綴合物 NC分別配製成20 μM（以siRNA計）的siRNA綴合物工作液。
配製5A溶液，每份5A溶液依次含有上述siRNA綴合物6工作液3 μl和細胞維持培養基97 μl，分別得到5A1的siRNA工作液。
配製5B溶液，每份5B溶液依次含有上述siRNA綴合物7工作液3 μl和細胞維持培養基97 μl，分別得到5B的siRNA工作液。
配製5C溶液，每份5C溶液依次含有上述參比綴合物 NC工作液3 μl和細胞維持培養基97 μl，分別得到5C的siRNA工作液。
配製5D溶液，每份5D溶液含有2 μl Lipofectamine™ 2000和細胞維持培養基98 μl。
配製5Xa溶液，分別將1份5D溶液與1份5Aa溶液混合，室溫下孵育20min，分別得到轉染複合物5Xa。
配製5Xb溶液，分別將1份5D溶液與1份5Ba溶液混合，室溫下孵育20min，分別得到轉染複合物5Xb。
配製5Xc溶液，分別將1份5D溶液與1份5Ca溶液混合，室溫下孵育20min，分別得到轉染複合物5Xc。
在2個培養孔中，分別加入siRNA綴合物6的轉染複合物5Xa，均勻混合，加入量為200μl/孔，得到含siRNA綴合物6終濃度（以siRNA計）約為50 nM轉染複合物，記為測試組1。
在2個培養孔中，分別加入siRNA綴合物7的轉染複合物5Xb，均勻混合，加入量為200μl/孔，得到含siRNA綴合物7終濃度（以siRNA計）分別約為50 nM的轉染複合物，記為測試組2。
在2個培養孔中，分別加入siRNA參比綴合物 NC轉染複合物5Xc，均勻混合，加入量為200μl/孔，得到含對照參比綴合物 NC終濃度（以siRNA計）約為50 nM的轉染複合物，記為陰性對照組。在2個培養孔中，分別加入4D溶液，均勻混合，加入量為200μl/孔，得到含有2 μl Lipofectamine™ 2000和細胞維持培養基98 μl的混合物，記為Lipo對照組。在2個培養孔中，分別加入細胞維持培養基，加入量為200μl/孔，記為空白對照組。
將每一含siRNA的轉染混合物和空白對照組置於含5% CO 2的培養箱中，在37 ℃下繼續培養24h。
採用和實驗例2中相同的方法提取各孔細胞中的總RNA和反轉錄並對各測試組中目標基因HSD進行相對定量計算，使用的引物資訊如表7所示。結果如圖2所示。
表7：引物信息
基因名稱 引物類型 核苷酸序列（5'酸序列） SEQ ID NO
小鼠HSD 上游引物 AGCCATGAACCTCATCCTGG 223
下游引物 TTCCTCAACACCACGCTTATTG 224
小鼠GAPDH 上游引物 TGCACCACCAACTGCTTAG 225
下游引物 GGATGCAGGGATGATGTTC 226
圖2為分別表示綴合物6、綴合物7或參比綴合物 NC後，C57BL/6j小鼠原代肝細胞中 HSDmRNA相對表達水平的柱狀圖。其中，blank表示空白對照組，lipo表示Lipo對照組，NC表示陰性對照組。由圖2的結果可見，本發明的siRNA綴合物在C57BL/6j小鼠原代肝細胞中顯示出優異的 HSDmRNA抑制活性，在50 nM的siRNA濃度下， HSDmRNA抑制率至少83.11%。
實驗例6： siRNA綴合物在小鼠體內的活性效果
將綴合物8和參比綴合物7分別用PBS溶解為3 mg/ml的溶液（以siRNA綴合物計）。將C57BL/6小鼠（雌性，16至18g重，6至8周齡，購自於斯貝福公司）隨機分組，每組6只小鼠，分別編號。以頸背部皮下注射的方式，向每只小鼠分別給予上述siRNA綴合物溶液，給藥前稱重並記錄體重，按體重給藥，給藥體積均為5 mL/kg，作為測試組；另外向一組小鼠中的每只分別給予PBS，給藥體積均為5mL/kg，作為空白對照組。
以給藥時間點作為第1天計算，在第8天，取測試組和空白對照組每只小鼠的肝組織，用RNAlater保存。
採用和實驗例2中相同的方法提取各孔細胞中的總RNA和反轉錄並對各測試組中目標基因HSD進行相對定量計算，使用的引物資訊如上表7所示。結果如圖3所示。
試驗資料均以平均數±標準差（Mean±SD）表示，資料分析採用Graphpad prism統計分析軟體。資料符合正態分佈及方差齊，採用單因素方差分析（one-way由ANOVA）法進行檢驗；不符合正態分佈或方差不齊，採用非參數檢驗的Kruskal-Wallis H方法進行分析，P≤0.05認為有顯著的統計學差異。
圖3是給予3mg/kg的綴合物8、參比綴合物7或PBS後，第8天綴合物對小鼠肝細胞中 HSD17B13mRNA的抑制作用。圖3可見，與空白對照組相比，給予不包含穩定化修飾核苷酸的參比綴合物7後，小鼠肝細胞中 HSD17B13mRNA的抑制率為57.2%；而給予本發明的siRNA綴合物後，小鼠肝細胞中 HSD17B13mRNA的抑制率為69.34%，顯示出比空白對照組和參比綴合物7更高的抑制活性。
實驗例7： 綴合物1在猴原代肝細胞中對 HSDmRNA表達量的抑制效率
採用和實驗例2中相同的方法得到每孔添加1mL的細胞維持培養基的猴原代肝細胞懸液。
用DEPC水將siRNA綴合物1配製成20 μM（以siRNA計）的siRNA綴合物工作液。
配製7A溶液，使用siRNA綴合物1配製7A溶液，每份7A溶液依次含有上述siRNA綴合物1工作液3 μl和細胞維持培養基97 μl。
配製7B溶液，每份7B溶液含有2 μl Lipofectamine™ 2000和細胞維持培養基98 μl。
分別將一份7B溶液與得到的siRNA綴合物1的7A溶液混合，分別室溫下孵育20min，得到siRNA綴合物1的轉染複合物7X a。
將一份7B溶液與細胞維持培養基100 μl混合，在室溫下孵育20min，得到空白轉染複合物7X b。
在2個培養孔中，分別加入siRNA綴合物1的轉染複合物7X a，均勻混合，加入量為200μl/孔，得到含siRNA綴合物1終濃度（以siRNA計）約為50 nM的轉染複合物的轉染混合物，記為測試組1。
在另外2個培養孔中，分別加入空白轉染複合物7X b，加入量為200μl/孔，得到不含siRNA的轉染混合物，記為空白對照組。
將載有含siRNA綴合物1的轉染混合物12孔板置於含5% CO 2/95%空氣的培養箱在37°C下繼續培養24h。
採用和實驗例2中相同的方法提取各孔細胞中的總RNA和反轉錄並對各測試組中目標基因HSD進行相對定量計算，使用的引物資訊如上表4所示。
結果顯示，本發明提供的包含穩定化修飾核苷酸siRNA綴合物1，在50nM濃度下猴原代肝細胞中 HSDmRNA的抑制率達到92.47%，顯示出優異的抑制活性。
實驗例8： siRNA綴合物3在大鼠體內的抑制活性效果
將綴合物3用PBS溶解為0.6 mg/ml的溶液（以siRNA綴合物計）。將將SD大鼠（雄性，200至240g重，6至8周齡，購自於斯貝福公司），隨機分為3組，每組6只，分別編號。以頸背部皮下注射的方式，向每只小鼠分別給予上述siRNA綴合物3溶液，給藥前稱重並記錄體重，按體重給藥，給藥體積均為5 mL/kg，作為測試組；另外向一組小鼠中的每只分別給予PBS，給藥體積均為5 mL/kg，作為空白對照組。
以給藥時間點作為第1天計算，在第8天，取測試組和空白對照組每只大鼠的肝組織，用RNAlater保存。
採用和實驗例2中相同的方法提取各孔細胞中的總RNA和反轉錄並對各測試組中目標基因HSD進行相對定量計算，其中大鼠內參基因為ACTIN，使用的引物資訊如下表8所示。
表8：引物信息
基因 名稱 引物類型 核苷酸序列（5'酸序列） SEQ ID NO
大鼠HSD 上游引物 AGCCATCGAGCAAACGAGAG 227
下游引物 CCAATACCAGGGGCTGAGAG 228
大鼠ACTIN 上游引物 CCGTGAAAAGATGACCCAGAT 229
下游引物 GCCAGGTCCAGACGCAGG 230
結果顯示，給予3mg/kg的綴合物3後，第8天綴合物對大鼠肝細胞中 HSD17B13mRNA的抑制率為74.24%。顯示出良好的抑制活性和長效性。
實驗例9： siRNA綴合物在猴原代肝細胞中抑制率檢測
採用和實驗例2中相同的方法得到每孔添加1mL的細胞維持培養基得到猴原代肝細胞懸液。
用DEPC水將siRNA綴合物3、綴合物5、綴合物7、綴合物8、綴合物9、綴合物10和參比綴合物NC分別配製成20 μM和2μM（以siRNA計）的siRNA綴合物工作液。
配製9A溶液，每份9A溶液依次含有上述siRNA綴合物3工作液3 μl和細胞維持培養基97 μl，分別得到9A 1、9A 2的siRNA工作液。
配製9B溶液，每份9B溶液依次含有上述siRNA綴合物5工作液3 μl和細胞維持培養基97 μl，分別得到9B 1、9B 2的siRNA工作液。
配製9C溶液，每份9C溶液依次含有上述siRNA綴合物7工作液3 μl和細胞維持培養基97 μl，分別得到9C 1、9C 2的siRNA工作液。
配製9D溶液，每份9D溶液依次含有上述siRNA綴合物8工作液3 μl和細胞維持培養基97 μl，分別得到9D 1、9D 2的siRNA工作液。
配製9E溶液，每份9E溶液依次含有上述siRNA綴合物9工作液3 μl和細胞維持培養基97 μl，分別得到9E 1、9E 2的siRNA工作液。
配製9F溶液，每份9F溶液依次含有上述siRNA綴合物10工作液3 μl和細胞維持培養基97 μl，分別得到9F 1、9F 2的siRNA工作液。配製9G溶液，每份9G溶液含有2 μl Lipofectamine™ 2000和細胞維持培養基98 μl。配製9H溶液，每份9H溶液依次含有上述參比綴合物NC工作液3 μl和細胞維持培養基97 μl，分別得到9H 1、9H 2的siRNA工作液。
配製9X a溶液，分別將1份9G溶液與1份9A 1溶液混合、1份9A 2溶液混合，室溫下孵育20min，分別得到轉染複合物9X a1或9X a2。
配製9X b溶液，分別將1份9G溶液與1份9B 1溶液混合、1份9B 2溶液混合，室溫下孵育20min，分別得到轉染複合物9X b1或9X b2。
配製9X c溶液，分別將1份9G溶液與1份9C 1溶液混合、1份9C 2溶液混合，室溫下孵育20min，分別得到轉染複合物9X c1或9X c2。
配製9X d溶液，分別將1份9G溶液與1份9D 1溶液混合、1份9D 2溶液混合，室溫下孵育20min，分別得到轉染複合物9X d1或9X d2。
配製9X e溶液，分別將1份9E溶液與1份9E 1溶液混合、1份9E 2溶液混合，室溫下孵育20min，分別得到轉染複合物9X e1或9X e2。
配製9X f溶液，分別將1份9F溶液與1份9F 1溶液混合、1份9F 2溶液混合，室溫下孵育20min，分別得到轉染複合物9X f1或9X f2。將一份9G溶液與細胞維持培養基100 μl混合，在室溫下孵育20min，得到空白轉染複合物9X g。
配製9X h溶液，分別將1份9H溶液與1份9H 1溶液混合、1份9H 2溶液混合，室溫下孵育20min，分別得到轉染複合物9X h1或9X h2。
在2個培養孔中，分別加入siRNA綴合物3的轉染複合物9X a1或9X a2，均勻混合，加入量為200μl/孔，得到含siRNA綴合物3終濃度（以siRNA計）約為50 nM或5nM的轉染混合物，記為測試組1。
在2個培養孔中，分別加入siRNA綴合物5的轉染複合物9X b1或9X b2，均勻混合，加入量為200μl/孔，得到含siRNA綴合物5終濃度（以siRNA計）約為50 nM或5nM的轉染混合物，記為測試組2。
在2個培養孔中，分別加入siRNA綴合物7的轉染複合物9X c1或9X c2，均勻混合，加入量為200μl/孔，得到含參比siRNA綴合物7終濃度（以siRNA計）約為50 nM或5nM的轉染混合物，記為測試組3。
在2個培養孔中，分別加入siRNA綴合物8的轉染複合物9X d1或9X d2，均勻混合，加入量為200μl/孔，得到含參比siRNA綴合物8終濃度（以siRNA計）約為50 nM或5nM的轉染混合物，記為測試組4。
在2個培養孔中，分別加入siRNA綴合物9的轉染複合物9X e1或9X e2，均勻混合，加入量為200μl/孔，得到含參比siRNA綴合物9終濃度（以siRNA計）約為50 nM或5nM的轉染混合物，記為測試組5。
在2個培養孔中，分別加入siRNA綴合物10的轉染複合物9X f1或9X f2，均勻混合，加入量為200μl/孔，得到含參比siRNA綴合物10終濃度（以siRNA計）約為50 nM或5nM的轉染混合物物，記為測試組6。在另外2個培養孔中，分別加入空白轉染複合物2X g，加入量為200μl/孔，得到不含siRNA的轉染混合物，記為空白對照組。
在2個培養孔中，分別加入siRNA參比綴合物NC的轉染複合物3X h1或3X h2，均勻混合，加入量為200μl/孔，得到每個siRNA綴合物終濃度（以siRNA計）分別約為50 nM的轉染混合物，記為陰性對照組。
將載有含siRNA綴合物3、綴合物5、綴合物7、綴合物8、綴合物9、綴合物10和參比綴合物NC的轉染混合物的12孔板置於含5% CO 2/95%空氣的培養箱在37°C下繼續培養24h。
採用和實驗例2中相同的方法提取各孔細胞中的總RNA和反轉錄並對各測試組中目標基因HSD進行相對定量計算，使用的引物資訊如上表4所示。結果如圖4所示，blank表示空白對照組，NC表示陰性對照組
由圖4的結果可見，在猴原代肝細胞中，本發明提供的siRNA綴合物包含1個鹼基錯配的綴合物與不包含1個鹼基錯配的綴合物，均顯示出優異的 HSDmRNA抑制活性。
實驗例10： siRNA綴合物在HEK293A細胞SEAP-HSD模型 的體外活性
用DEPC水將siRNA綴合物3、綴合物5、綴合物7、綴合物8、綴合物9和綴合物10分別配製成0.12μM和0.012μM（以siRNA計）的siRNA綴合物工作液。
配置10A溶液，每份10A溶液含有2μl Lipofectamine™ 2000和細胞維持培養基98μl。
將1份10A溶液100μl分別與上述siRNA綴合物3工作液100μl混合，室溫下孵育20min，分別得到轉染複合物10X 1和10X 01。
將1份10A溶液100μl分別與上述siRNA綴合物5工作液100μl混合，室溫下孵育20min，分別得到轉染複合物10X 2和10X 02。
將1份10A溶液100μl分別與上述siRNA綴合物7工作液100μl混合，室溫下孵育20min，分別得到轉染複合物10X 3和10X 03。
將1份10A溶液100μl分別與上述siRNA綴合物8工作液100μl混合，室溫下孵育20min，分別得到轉染複合物10X 4和10X 04。
將1份10A溶液100μl分別與上述siRNA綴合物9工作液100μl混合，室溫下孵育20min，分別得到轉染複合物10X 5和10X 05。
將1份10A溶液100μl分別與上述siRNA綴合物10工作液100μl混合，室溫下孵育20min，分別得到轉染複合物10X 6和10X 06。
將1份10A溶液與細胞維持培養基100 μl混合，在室溫下孵育20min，得到對照組轉染複合物10X。
取對數生長期的HEK293A細胞，按照1× 10 5細胞/孔進行鋪板，每孔1mL。實驗前吸盡培養孔中完全培養基，每孔加入1mL opti-MEM培養基（GIBCO 公司）。在2個培養孔，分別加入100ng/μl的SEAP-HSD質粒溶液，每孔1μl；以及siRNA綴合物3的轉染複合物10X 1或10X 01，均勻混合，加入量為200μl/孔，得到每個siRNA綴合物終濃度（以siRNA計）分別約為10 nM或1nM的共轉染混合物，記為測試組1。
在2個培養孔，分別加入加入100ng/μl的SEAP-HSD質粒溶液，每孔1μl；以及siRNA綴合物5的轉染複合物10X 2或10X 02，均勻混合，加入量為200μl/孔，得到每個siRNA綴合物終濃度（以siRNA計）分別約為10 nM或1nM的共轉染混合物，記為測試組2。
在2個培養孔，分別加入100ng/μl的SEAP-HSD質粒溶液，每孔1μl；以及加入siRNA綴合物7的轉染複合物10X 3或10X 03，均勻混合，加入量為200μl/孔，得到每個siRNA綴合物終濃度（以siRNA計）分別約為10 nM或1nM的共轉染混合物，記為測試組3。
在2個培養孔，分別加入加入100ng/μl的SEAP-HSD質粒溶液，每孔1μl；以及siRNA綴合物8的轉染複合物10X 4或10X 04，均勻混合，加入量為200μl/孔，得到每個siRNA綴合物終濃度（以siRNA計）分別約為10 nM或1nM的共轉染混合物，記為測試組4。
在2個培養孔，分別加入加入100ng/μl的SEAP-HSD質粒溶液，每孔1μl；以及siRNA綴合物9的轉染複合物10X 5或10X 05，均勻混合，加入量為200μl/孔，得到每個siRNA綴合物終濃度（以siRNA計）分別約為10 nM或1nM的共轉染混合物，記為測試組5。
在2個培養孔，分別加入加入100ng/μl的SEAP-HSD質粒溶液，每孔1μl；以及siRNA綴合物10的轉染複合物10X 6或10X 06，均勻混合，加入量為200μl/孔，得到每個siRNA綴合物終濃度（以siRNA計）分別約為10 nM或1nM的共轉染混合物，記為測試組6。
在2個培養孔中，分別加入100ng/μl的SEAP-HSD質粒溶液，每孔1μl；以及對照組轉染複合物10X，加入量為200μl/孔，得到不含siRNA的轉染混合物，記為對照組。
將載有含siRNA綴合物3、綴合物5、綴合物7、綴合物8、綴合物9和綴合物10的轉染混合物的12孔板置於含5% CO 2/95%空氣的培養箱在37°C下繼續培養24h。將所述檢測質粒與待測綴合物共轉染至HEK293A細胞中，通過SEAP酶活的水平，來反映siRNA的目標序列抑制活性。上述SEAP-HSD質粒含有插入SEAP(分泌型鹼性磷酸酶，購自北京原平皓生物技術有限公司)報告基因的3' UTR內的HSD cDNA序列(Genbank註冊號 NM_001136230.3)。
根據說明書，SEAP Reporter GENE ASSAY KIT(Luminescence )abcam-ab 133077 Protocol對上述細胞進行測量。每個測試組SEAP水平用對照組樣本進行標準化。具體來說，首先，將每個測試組在各時間點的SEAP水平除以各時間點對照組SEAP水平，從而確定給予綴合物後的相對表達水平。根據各組細胞樣本在各個時間點的SEAP相對表達水平的算術平均值S，siRNA對SEAP-HSD酶活的抑制率 = (1-S) × 100%。
按照上述方法計算siRNA對 HSDmRNA的抑制率，如下表9所示。
表9 猴原代肝細胞中 HSDmRNA的抑制率
siRNA綴合物 綴合物3 綴合物9 綴合物5 綴合物10 綴合物7 綴合物8
抑制率% 10nM-24h 85.4% 89.0% 83.8% 85.2% 76.4% 64.6%
1nM-24h 82.5% 85.9% 77.3% 77.1% 69.8% 27.6%
10nM-72h 92.4% 91.6% 89.0% 91.2% 85.3% 82.1%
1nM-72h 90.0% 89.9% 84.8% 84.9% 82.3% 61.3%
圖5顯示了在10nM和1nM濃度下，HEK293A細胞SEAP濃度的柱狀圖。
結果表明，與空白對照組相比，在24h和72h，各個測試組的SEAP均明顯降低。其中，綴合物9在72h表現出特別高的 HSDmRNA的抑制率，10nM濃度下抑制率達到91.6%，1nM濃度下抑制率達到89.9%。72小時對 HSD17B13基因表達的mRNA的抑制活性最高可達到92.4%，各個組別72小時的抑制率整體高於24小時的抑制率，顯示出對 HSD17B13mRNA長效的抑制活性。
實驗例11： siRNA綴合物在大鼠的體內抑制活性
將SD大鼠（雄性，200至240g重，6至8周齡，購自於斯貝福公司），隨機分為3組，每組5只。
用PBS將上述製備的參比綴合物3和綴合物9用PBS分別配製為0.6mg/mL的溶液（以siRNA計）。以頸背部皮下注射的方式，向每組小鼠分別給予上述siRNA綴合物溶液，給藥前稱重並記錄體重，按體重給藥，單次給藥容積為5 µL/g小鼠體重，計算可知單次給藥劑量為3 mg/kg。另外向一組每只小鼠分別給予PBS，單次給藥體積為5 µL/g，作為空白對照組。
以給藥時間點作為第1天計算，在第8天和第15天，取測試組和空白對照組每只大鼠的肝組織，用RNAlater保存。
採用和實驗例2中相同的方法提取各孔細胞中的總RNA和反轉錄並以空白對照組的結果歸一化，對各測試組中目標基因HSD進行相對定量計算，使用的引物資訊如上表8所示。
試驗資料均以平均數±標準差（Mean±SD）表示，資料分析採用 Graphpad prism 統計分析軟體。資料符合正態分佈及方差齊，採用單因素方差分析（one-way ANOVA）法進行檢驗；不符合正態分佈或方差不齊，採用非參數檢驗的 Kruskal Wallis H 方法進行分析，P≤0.05 認為有顯著的統計學差異。結果如圖6所示。
圖6是顯示了在給予本發明的3 mg/kg 的siRNA綴合物後，第8天和第15天綴合物對小鼠肝細胞中 HSD17B13mRNA的抑制率。其中，“對比綴合物3”表示參比綴合物3的結果，“PBS”表示空白對照組的結果。圖6的結果顯示，給予本發明的包含穩定化修飾核苷酸的siRNA綴合物後，小鼠肝細胞中 HSD17B13mRNA的抑制率明顯高於參比綴合物，顯示出更高的抑制活性。其中，在第8天時， HSD17B13mRNA的抑制率為81.2%，與不包含穩定化修飾核苷酸的參比綴合物相比，表現出更加優異的 HSD17B13mRNA抑制活性；在第15天時更是顯著高於對比綴合物，表明本發明的siRNA綴合物還具有優異的體內 HSD17B13mRNA長效抑制活性。
實驗例12： 本實驗說明本發明的siRNA綴合物的動物水平毒性。
將SD大鼠（購自斯貝福（北京）生物技術有限公司）分為5組，每組10只，雌雄各半。
向每組大鼠分別皮下單次給予30mg/kg或100mg/kg（以siRNA計）的本發明的綴合物3、綴合物9和PBS為對照組，給藥前稱重並記錄體重，按體重給藥，給藥當天記為D1，分別於D15，D29給藥，共給藥3次，D30天進行組織病理學檢查。
觀察期間大鼠表現無死亡或行為異常，各劑量組動物和對照組動物，體重增長均無顯著性差異。
組織病理學檢查：對大鼠進行解剖，剖取肝組織，經取材、脫水、包埋、製片和染色後，製成病理切片，在光學顯微鏡下（顯微鏡型號：NIKON Eclipse ci，成像系統：NIKON digital sight DS-FI2，MADE IN JAPAN）觀察。其結果，給予綴合物3和綴合物9的大鼠的肝臟病理切片中，組織肝索結構清晰，肝細胞排列緊密，界限清晰，胞質豐富，著色均勻，胞核圓形，大小正常，靜脈內皮完整正常，組織未見明顯異常。結果顯示，各劑量組雌性和雄性動物各臟器重量均無顯著性改變。由此可見，本發明的綴合物毒性小，體內耐受性良好，因此相對於顯示出藥效的劑量（3 mg/kg動物體重），具有至少30倍以上的安全視窗，適合作為體內抑制 HSD17B13mRNA的藥物使用。
上述結果表明，與參比綴合物相比，本發明的siRNA綴合物具有更加有效抑制 HSD17B13mRNA的作用，因此在製備用於HSD疾病或症狀的治療和/或預防的藥物方面顯示出顯著更高的治療效果，具有優異的開發前景。
以上詳細描述了本發明的一些實施方式，但是，本發明並不限於上述實施方式中的具體細節，在本發明的技術構思範圍內，可以對本發明的技術方案進行多種簡單變型，這些簡單變型均屬於本發明的保護範圍。
另外需要說明的是，在上述一些實施方式中所描述的各個具體技術特徵，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進行組合，為了避免不必要的重複，本發明對各種可能的組合方式不再另行說明。
此外，本發明的各種不同的實施方式之間也可以進行任意組合，只要其不違背本發明的思想，其同樣應當視為本發明所公開的內容。
無
附圖是用來提供對本發明的進一步理解，並且構成說明書的一部分，與下面的具體實施方式一起用於解釋本發明，但並不構成對本發明的限制。在附圖中：
圖1是顯示了轉染50 nM和5 nM濃度的本發明的siRNA後，體外猴原代肝細胞中的 HSDmRNA相對表達水平的柱狀圖。
圖2是顯示了轉染50nM濃度的本發明的siRNA後，體外C57BL/6j小鼠原代肝細胞中的 HSDmRNA相對表達水平的柱狀圖。
圖3是顯示了在給予本發明的3 mg/kg 的siRNA後，小鼠體內的 HSDmRNA相對表達水平的圖。
圖4是顯示了轉染50 nM和5 nM濃度的本發明的siRNA後，體外猴原代肝細胞中的 HSDmRNA相對表達水平的柱狀圖。
圖5是顯示了轉染10 nM和1nM濃度的本發明的siRNA後，24小時和72小時體外猴原代肝細胞中SEAP濃度的折線圖。
圖6是顯示了在給予本發明的3 mg/kg 的siRNA和參比綴合物後，小鼠體內的 HSDmRNA相對表達水平的圖。
無
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Claims (43)

  1. 一種siRNA，所述siRNA包含正義鏈和反義鏈，所述正義鏈包含核苷酸序列I，所述反義鏈包含核苷酸序列II，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II均由19個核苷酸組成，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II中的每一個核苷酸均為修飾或未修飾的核苷酸，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II至少部分地反向互補形成雙鏈區，所述核苷酸序列II至少部分地與第一段核苷酸序列反向互補，所述第一段核苷酸序列為 HSD17B13基因表達的mRNA中的一段長度為19個核苷酸的核苷酸序列，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的第3至6個核苷酸中的至少1個為穩定化修飾核苷酸，所述穩定化修飾核苷酸指核苷酸的核糖2'位羥基被穩定化修飾基團取代的核苷酸，與相應位置的核苷酸為未修飾的核苷酸的siRNA相比，包含所述穩定化修飾核苷酸的siRNA的熱穩定性增加，並且所述穩定化修飾基團的空間位阻大於2'-O-甲基。
  2. 如請求項1所述的siRNA，其中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II中的第3個或第5個核苷酸為所述穩定化修飾核苷酸。
  3. 如請求項1或2所述的siRNA，其中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II中第3至9個核苷酸中不超過2個核苷酸為所述穩定化修飾核苷酸。
  4. 如請求項1至3中任意一項所述的siRNA，其中，所述siRNA的熱穩定性增加是指所述siRNA的Tm升高，Tm為siRNA的雙鏈熱解離溫度。
  5. 如請求項4所述的siRNA，其中，所述siRNA的熱穩定性增加是指所述siRNA的Tm升高至少0.05℃。
  6. 如請求項4所述的siRNA，其中，所述siRNA的熱穩定性增加是指所述siRNA的Tm升高0.1至6℃。
  7. 如請求項4所述的siRNA，其中，所述siRNA的熱穩定性增加是指所述siRNA的Tm升高0.5至4℃。
  8. 如請求項1至7中任意一項所述的siRNA，其中，每個所述穩定化修飾基團獨立地具有-X-R所示的結構，其中，X為O、NR'、S或SiR' 2；R是C 2-C 6烷基、取代的C 2-C 6烷基、C 6-C 8芳基、取代的C 6-C 8芳基中的一種，每個R'獨立地是H、C 1-C 6烷基、取代的C 1-C 6烷基、C 6-C 8芳基、取代的C 6-C 8芳基中的一種，所述取代的C 2-C 6烷基、取代的C 6-C 8芳基或取代的C 1-C 6烷基是指C 2-C 6烷基、C 6-C 8芳基或C 1-C 6烷基中的一個或多個氫原子被取代基取代而形成的基團，所述取代基選自以下取代基中的一種或多種：C 1-C 3烷基、C 6-C 8芳基、C 1-C 3烷氧基、鹵素、氧亞基和硫亞基。
  9. 如請求項8所述的siRNA，其中，每個所述穩定化修飾基團獨立地選自2'-O-甲氧基乙基、2'-O-烯丙基、2'-烯丙基、2'-O-2-N-甲基氨基-2-氧亞基乙基、2'-O-2-N,N-二甲基氨基乙基、2'-O-3-氨基丙基和2'-O-2,4-二硝基苯基中的一種。
  10. 如請求項9所述的siRNA，其中，每個所述穩定化修飾基團為2'-O-甲氧基乙基。
  11. 如請求項1至10中任意一項所述的siRNA，其中，所述核苷酸序列I與SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異，且所述核苷酸序列II與SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異： 5'- GAAUAAUGCUGGGACAGUZ a1-3' (SEQ ID NO: 1); 5'- Z a2ACUGUCCCAGCAUUAUUC-3' (SEQ ID NO: 2)， 其中，所述Z a1為A，Z a2為U，所述核苷酸序列I中包含位置對應於Z a1的核苷酸Z a3，所述核苷酸序列II中包含位置對應於Z a2的核苷酸Z a4，所述Z a4是所述反義鏈的5'末端的第一個核苷酸； 或者，所述核苷酸序列I與SEQ ID NO:27所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異，且所述核苷酸序列II與SEQ ID NO:28所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異： 5'- GCACCAAGGAUGAAGAGAZ b1-3' (SEQ ID NO: 27); 5'- Z b2UCUCUUCAUCCUUGGUGC-3' (SEQ ID NO: 28)， 其中Z b1為U，Z b2為A，所述核苷酸序列I中包含位置對應於Z b1的核苷酸Z b3，所述核苷酸序列II中包含位置對應於Z b2的核苷酸Z b4，所述Z b4是所述反義鏈的5'末端的第一個核苷酸； 或者，所述核苷酸序列I與SEQ ID NO:53所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異，且所述核苷酸序列II與SEQ ID NO:54所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異： 5'- CACCAAGGAUGAAGAGAUZ c1-3' (SEQ ID NO: 53); 5'- Z c2AUCUCUUCAUCCUUGGUG-3' (SEQ ID NO: 54)， 其中Z c1為U，Z c2為A，所述核苷酸序列I中包含位置對應於Z c1的核苷酸Z c3，所述核苷酸序列II中包含位置對應於Z c2的核苷酸Z c4，所述Z c4是所述反義鏈的5'末端的第一個核苷酸； 或者，所述核苷酸序列I與SEQ ID NO:79所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異，且所述核苷酸序列II與SEQ ID NO:80所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異： 5'- UCUGAUAGAUGGAAUACUZ d1-3' (SEQ ID NO: 79); 5'- Z d2AGUAUUCCAUCUAUCAGA-3' (SEQ ID NO: 80)， 其中Z d1為U，Z d2為A，所述核苷酸序列I中包含位置對應於Z d1的核苷酸Z d3，所述核苷酸序列II中包含位置對應於Z d2的核苷酸Z d4，所述Z d4是所述反義鏈的5'末端的第一個核苷酸； 或者，所述核苷酸序列I與SEQ ID NO:105所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異，且所述核苷酸序列II與SEQ ID NO:106所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異： 5'- CUGAUAGAUGGAAUACUUZ e1-3' (SEQ ID NO: 105); 5'- Z e2AAGUAUUCCAUCUAUCAG-3' (SEQ ID NO: 106)， 其中Z e1為A，Z e2為U，所述核苷酸序列I中包含位置對應於Z e1的核苷酸Z e3，所述核苷酸序列II中包含位置對應於Z e2的核苷酸Z e4，所述Z e4是所述反義鏈的5'末端的第一個核苷酸； 或者，所述核苷酸序列I與SEQ ID NO:131所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異，且所述核苷酸序列II與SEQ ID NO:132所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異： 5'- GAUGGAAUACUUACCAAUZ f1-3' (SEQ ID NO:131); 5'- Z f2AUUGGUAAGUAUUCCAUC-3' (SEQ ID NO: 132)， 其中Z f1為A，Z f2為U，所述核苷酸序列I中包含位置對應於Z f1的核苷酸Z f3，所述核苷酸序列II中包含位置對應於Z f2的核苷酸Z f4，所述Z f4是所述反義鏈的5'末端的第一個核苷酸； 或者，所述核苷酸序列I與SEQ ID NO:157所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異，且所述核苷酸序列II與SEQ ID NO:158所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸差異： 5'- GAAUACUUACCAAUAAGAZ g1-3' (SEQ ID NO: 157); 5'- Z g2UCUUAUUGGUAAGUAUUC-3' (SEQ ID NO: 158)， 其中Z g1為A，Z g2為U，所述核苷酸序列I中包含位置對應於Z g1的核苷酸Z g3，所述核苷酸序列II中包含位置對應於Z g2的核苷酸Z g4，所述Z g4是所述反義鏈的5'末端的第一個核苷酸。
  12. 如請求項11所述的siRNA，其中，所述核苷序列I與SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列之間不多於1個核苷酸差異，和/或所述核苷酸序列II與SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列之間不多於1個核苷酸差異； 或者，所述核苷酸序列I與SEQ ID NO:27所示的核苷酸序列之間不多於1個核苷酸差異，和/或所述核苷酸序列II與SEQ ID NO:28所示的核苷酸序列之間不多於1個核苷酸差異； 或者，所述核苷酸序列I與SEQ ID NO:53所示的核苷酸序列之間不多於1個核苷酸差異，和/或所述核苷酸序列II與SEQ ID NO:54所示的核苷酸序列之間不多於1個核苷酸差異； 或者，所述核苷酸序列I與SEQ ID NO:79所示的核苷酸序列之間不多於1個核苷酸差異，和/或所述核苷酸序列II與SEQ ID NO:80所示的核苷酸序列之間不多於1個核苷酸差異； 或者，所述核苷酸序列I與SEQ ID NO:105所示的核苷酸序列之間不多於1個核苷酸差異，和/或所述核苷酸序列II與SEQ ID NO:106所示的核苷酸序列之間不多於1個核苷酸差異； 或者，所述核苷酸序列I與SEQ ID NO:131所示的核苷酸序列之間不多於1個核苷酸差異，和/或所述核苷酸序列II與SEQ ID NO:132所示的核苷酸序列之間不多於1個核苷酸差異； 或者，所述核苷酸序列I與SEQ ID NO:157所示的核苷酸序列之間不多於1個核苷酸差異，和/或所述核苷酸序列II與SEQ ID NO:158所示的核苷酸序列之間不多於1個核苷酸差異。
  13. 如請求項12所述的siRNA，其中，所述核苷酸序列II與SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列之間的差異包括Z a4位置處的差異，且Z a4選自A、G或C； 或者，所述核苷酸序列II與SEQ ID NO:28所示的核苷酸序列之間的差異包括Z b4位置處的差異，且Z b4選自U、G或C； 或者，所述核苷酸序列II與SEQ ID NO:54所示的核苷酸序列之間的差異包括Z c4位置處的差異，且Z c4選自U、G或C； 或者，所述核苷酸序列II與SEQ ID NO:80所示的核苷酸序列之間的差異包括Z d4位置處的差異，且Z d4選自U、G或C； 或者，所述核苷酸序列II與SEQ ID NO:106所示的核苷酸序列之間的差異包括Z e4位置處的差異，且Z e4選自A、G或C； 或者，所述核苷酸序列II與SEQ ID NO:132所示的核苷酸序列之間的差異包括Z f4位置處的差異，且Z f4選自A、G或C； 或者，所述核苷酸序列II與SEQ ID NO:158所示的核苷酸序列之間的差異包括Z g4位置處的差異，且Z g4選自A、G或C。
  14. 如請求項1至13中任意一項所述的siRNA，其中，所述Z a3是與Z a4互補的核苷酸；或者所述Z b3是與Z b4互補的核苷酸；或者所述Z c3是與Z c4互補的核苷酸；或者所述Z d3是與Z d4互補的核苷酸；或者所述Z e3是與Z e4互補的核苷酸；或者所述Z f3是與Z f4互補的核苷酸；或者所述Z g3是與Z g4互補的核苷酸。
  15. 如請求項1至14中任意一項所述的siRNA，其中，所述核苷酸序列II與所述第一段核苷酸序列基本上反向互補、實質上反向互補或完全反向互補；所述基本上反向互補是指兩個核苷酸序列之間存在不多於3個鹼基的錯配；所述實質上反向互補是指兩個核苷酸序列之間存在不多於1個鹼基的錯配；所述完全反向互補是指兩個核苷酸序列之間沒有錯配。
  16. 如請求項15所述的siRNA，其中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的第3至19位的核苷酸與所述第一段核苷酸序列第1至17位的核苷酸完全反向互補。
  17. 如請求項16所述的siRNA，其中，所述核苷酸序列II與所述核苷酸序列I完全反向互補；或者按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II中的第2個核苷酸與按照3'末端到5'末端的方向，所述核苷酸序列I中的第2個核苷酸之間存在鹼基錯配。
  18. 如請求項1至17中任意一項所述的siRNA，其中，所述正義鏈和所述反義鏈長度相同或不同，所述正義鏈的長度為19至23個核苷酸，所述反義鏈的長度為19至26個核苷酸。
  19. 如請求項1至18中任意一項所述的siRNA，其中，所述核苷酸序列II中的全部核苷酸均為修飾的核苷酸；按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的第2、6、14、16個核苷酸，如果不是所述穩定化修飾核苷酸的話，為氟代修飾的核苷酸，所述核苷酸序列II中的其它核苷酸各自獨立地為非氟代修飾的核苷酸中的一種。
  20. 如請求項1至19中任意一項所述的siRNA，其中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列I的第7至9個核苷酸為氟代修飾的核苷酸。
  21. 如請求項20所述的siRNA，其中，所述核苷酸序列I中的全部核苷酸均為修飾的核苷酸；按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列I的第7至9個核苷酸為氟代修飾的核苷酸，所述核苷酸序列I中的其它核苷酸各自獨立地為非氟代修飾的核苷酸中的一種。
  22. 如請求項1至21中任意一項所述的siRNA，其中，所述正義鏈還含有核苷酸序列III，所述反義鏈還含有核苷酸序列IV，所述核苷酸序列III和所述核苷酸序列IV的每個核苷酸獨立地為非氟代修飾的核苷酸中的一種且不是所述穩定化修飾核苷酸，所述核苷酸序列III的長度為1個、2個、3個或4個核苷酸，所述核苷酸序列IV和所述核苷酸序列III長度相等，並且所述核苷酸序列IV和所述核苷酸序列III實質上反向互補或完全反向互補，所述核苷酸序列III連接在所述核苷酸序列I的5'末端，所述核苷酸序列IV連接在所述核苷酸序列II的3'末端，並且所述核苷酸序列IV與第二段核苷酸序列實質上反向互補或完全反向互補，該第二段核苷酸序列是指和 HSD17B13基因表達的mRNA中與所述第一段核苷酸序列的5'末端相鄰、且長度與所述核苷酸序列IV相同的核苷酸序列。
  23. 如請求項22所述的siRNA，其中，所述核苷酸序列I與SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸的差異，並且，所述核苷酸序列III和IV的長度均為1個核苷酸，所述核苷酸序列III的鹼基為U，核苷酸序列IV的鹼基為A；或者，所述核苷酸序列III和IV的長度均為2個核苷酸，所述核苷酸序列III的鹼基組成為GU，所述核苷酸序列IV的鹼基組成為AC；或者，所述核苷酸序列III和IV的長度均為3個核苷酸，所述核苷酸序列III的鹼基組成為GGU，所述核苷酸序列IV的鹼基組成為ACC；或者，所述核苷酸序列III和IV的長度均為4個核苷酸，所述核苷酸序列III的鹼基組成為UGGU，所述核苷酸序列IV的鹼基組成為ACCA; 或者，所述核苷酸序列I與SEQ ID NO:27所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸的差異，並且，所述核苷酸序列III和IV的長度均為1個核苷酸，所述核苷酸序列III的鹼基為A，核苷酸序列IV的鹼基為U；或者，所述核苷酸序列III和IV的長度均為2個核苷酸，所述核苷酸序列III的鹼基組成為CA，所述核苷酸序列IV的鹼基組成為UG；或者，所述核苷酸序列III和IV的長度均為3個核苷酸，所述核苷酸序列III的鹼基組成為UCA，所述核苷酸序列IV的鹼基組成為UGA；或者，所述核苷酸序列III和IV的長度均為4個核苷酸，所述核苷酸III的鹼基組成為CUCA，所述核苷酸序列IV的鹼基組成為UGAG; 或者，所述核苷酸序列I與SEQ ID NO:53所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸的差異，並且，所述核苷酸序列III和IV的長度均為1個核苷酸，所述核苷酸序列III的鹼基為G，所述核苷酸序列IV的鹼基為C；或者，所述核苷酸序列III和IV的長度均為2個核苷酸，所述核苷酸序列III的鹼基組成為AG，所述核苷酸序列IV的鹼基組成為CU；或者，所述核苷酸序列III和IV的長度均為3個核苷酸，所述核苷酸序列III的鹼基組成為CAG，所述核苷酸序列IV的鹼基組成為CUG；或者，所述核苷酸序列III和IV的長度均為4個核苷酸，所述核苷酸III的鹼基組成為UCAG，所述核苷酸序列IV的鹼基組成為CUGA; 或者，所述核苷酸序列I與SEQ ID NO:79所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸的差異，並且，所述核苷酸序列III和IV的長度均為1個核苷酸，所述核苷酸序列III的鹼基為G，所述核苷酸序列IV的鹼基為C；或者，所述核苷酸序列III和IV的長度均為2個核苷酸，所述核苷酸序列III的鹼基組成為AG，所述核苷酸序列IV的鹼基組成為CU；或者，所述核苷酸序列III和IV的長度均為3個核苷酸，所述核苷酸序列III的鹼基組成為AAG，所述核苷酸序列IV的鹼基組成為CUU；或者，所述核苷酸序列III和IV的長度均為4個核苷酸，所述核苷酸III的鹼基組成為GAAG，所述核苷酸序列IV的鹼基組成為CUUC; 或者，所述核苷酸序列I與SEQ ID NO:105所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸的差異，並且，所述核苷酸序列III和IV的長度均為1個核苷酸，所述核苷酸序列III的鹼基為U，所述核苷酸序列IV的鹼基為A；或者，所述核苷酸序列III和IV的長度均為2個核苷酸，所述核苷酸序列III的鹼基組成為GU，所述核苷酸序列IV的鹼基組成為AC；或者，所述核苷酸序列III和IV的長度均為3個核苷酸，所述核苷酸序列III的鹼基組成為AGU，所述核苷酸序列IV的鹼基組成為ACU；或者，所述核苷酸序列III和IV的長度均為4個核苷酸，所述核苷酸III的鹼基組成為AAGU，所述核苷酸序列IV的鹼基組成為ACUU; 或者，所述核苷酸序列I與SEQ ID NO:131所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸的差異，並且，所述核苷酸序列III和IV的長度均為1個核苷酸，所述核苷酸序列III的鹼基為A，所述核苷酸序列IV的鹼基為U；或者，所述核苷酸序列III和IV的長度均為2個核苷酸，所述核苷酸序列III的鹼基組成為UA，所述核苷酸序列IV的鹼基組成為UA；或者，所述核苷酸序列III和IV的長度均為3個核苷酸，所述核苷酸序列III的鹼基組成為AUA，所述核苷酸序列IV的鹼基組成為UAU；或者，所述核苷酸序列III和IV的長度均為4個核苷酸，所述核苷酸III的鹼基組成為GAUA，所述核苷酸序列IV的鹼基組成為UAUC; 或者，所述核苷酸序列I與SEQ ID NO:157所示的核苷酸序列長度相等，且不多於3個核苷酸的差異，並且，所述核苷酸序列III和IV的長度均為1個核苷酸，所述核苷酸序列III的鹼基為G，所述核苷酸序列IV的鹼基為C；或者，所述核苷酸序列III和IV的長度均為2個核苷酸，所述核苷酸序列III的鹼基組成為UG，所述核苷酸序列IV的鹼基組成為CA；或者，所述核苷酸序列III和IV的長度均為3個核苷酸，所述核苷酸序列III的鹼基組成為AUG，所述核苷酸序列IV的鹼基組成為CAU；或者，所述核苷酸序列III和IV的長度均為4個核苷酸，所述核苷酸III的鹼基組成為GAUG，所述核苷酸序列IV的鹼基組成為CAUC。
  24. 如請求項1至23中任意一項所述的siRNA，其中所述siRNA還含有寡核苷酸序列V，所述寡核苷酸序列V的每個核苷酸獨立地為非氟代修飾的核苷酸中的一種且不是所述穩定化修飾核苷酸，所述核苷酸序列V的長度為1至3個核苷酸，連接在所述反義鏈的3'末端，從而構成所述反義鏈的3'突出端。
  25. 如請求項24所述的siRNA，其中所述核苷酸序列V的長度為2個核苷酸，並且按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列V為連續的2個胸腺嘧啶去氧核糖核苷酸、連續的2個尿嘧啶核糖核苷酸、或者與第三段核苷酸序列完全反向互補的序列，所述第三段核苷酸序列是指 HSD17B13基因表達的mRNA中與所述第一段核苷酸序列的5'末端或所述第二段核苷酸序列的5'末端相鄰、並且長度與所述核苷酸序列V相等的核苷酸序列。
  26. 如請求項25所述的siRNA，其中，所述第一段核苷酸序列具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，所述第三段核苷酸序列的鹼基組成是GU；或者，所述第一段核苷酸序列具有SEQ ID NO:27所示的核苷酸序列，所述第三段核苷酸序列的鹼基組成是CA; 或者，所述第一段核苷酸序列具有SEQ ID NO:53所示的核苷酸序列，所述第三段核苷酸序列的鹼基組成是AG;或者，所述第一段核苷酸序列具有SEQ ID NO:79所示的核苷酸序列，所述第三段核苷酸序列的鹼基組成是AG;或者，所述第一段核苷酸序列具有SEQ ID NO:105所示的核苷酸序列，所述第三段核苷酸序列的鹼基組成是GU;或者，所述第一段核苷酸序列具有SEQ ID NO:131所示的核苷酸序列，所述第三段核苷酸序列的鹼基組成是UA;或者，所述第一段核苷酸序列具有SEQ ID NO:157所示的核苷酸序列，所述第三段核苷酸序列的鹼基組成是UG。
  27. 如請求項1至26中任意一項所述的siRNA，其中，所述siRNA的該正義鏈含有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，所述反義鏈含有如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列： 5'- GAACAGAGAUACUACGGUZa3 -3'(SEQ ID NO:3); 5'- Za4ACUGUCCCAGCAUUAUUCAC -3'(SEQ ID NO:4), 其中，所述Z a4是該反義鏈的5'末端的第一個核苷酸，Z a3選自A、U、G或C，並且Z a3是與Z a4互補的核苷酸； 或者，所述siRNA的該正義鏈含有如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，所述siRNA的該反義鏈含有如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列： 5'- GUGAAUAAUGCUGGGACAGUZ a3-3'(SEQ ID NO:5); 5'- Z a4ACUGUCCCAGCAUUAUUCACCA -3'(SEQ ID NO:6)， 其中，所述Z a4是該反義鏈的5'末端的第一個核苷酸，Z a3選自A、U、G或C，並且Z a3是與Z a4互補的核苷酸； 或者，所述siRNA的該正義鏈含有如SEQ ID NO:29所示的核苷酸序列，所述siRNA的該反義鏈含有如SEQ ID NO:30所示的核苷酸序列： 5'- GCACCAAGGAUGAAGAGAZ b3-3'(SEQ ID NO:29); 5'- Z b4UCUCUUCAUCCUUGGUGCUG -3'(SEQ ID NO:30)， 其中，所述Z b4是該反義鏈的5'末端的第一個核苷酸，Z b3選自A、U、G或C，並且Z b4是與Z b3互補的核苷酸； 或者，所述siRNA的該正義鏈含有如SEQ ID NO:31所示的核苷酸序列，所述siRNA的該反義鏈含有如SEQ ID NO:32所示的核苷酸序列： 5'- CAGCACCAAGGAUGAAGAGAZ b3-3'(SEQ ID NO:31); 5'- Z b4UCUCUUCAUCCUUGGUGCUGAG -3'(SEQ ID NO:32)， 其中，所述Z b4是該反義鏈的5'末端的第一個核苷酸，Z b3選自A、U、G或C，並且Z b4是與Z b3互補的核苷酸； 或者，所述siRNA的該正義鏈含有如SEQ ID NO:55所示的核苷酸序列，所述siRNA的該反義鏈含有如SEQ ID NO:56所示的核苷酸序列： 5'- CACCAAGGAUGAAGAGAUZ c3-3'(SEQ ID NO:55); 5'- Z c4AUCUCUUCAUCCUUGGUGCU -3'(SEQ ID NO:56)， 其中，所述Z c4是該反義鏈的5'末端的第一個核苷酸，Z c3選自A、U、G或C，並且Z c4是與Z c3互補的核苷酸； 或者，所述siRNA的該正義鏈含有如SEQ ID NO:57所示的核苷酸序列，所述siRNA的該反義鏈含有如SEQ ID NO:58所示的核苷酸序列： 5'- AGCACCAAGGAUGAAGAGAUZ c3-3'(SEQ ID NO:57); 5'- Z c4AUCUCUUCAUCCUUGGUGCUGA -3'(SEQ ID NO:58)， 其中，所述Z c4是該反義鏈的5'末端的第一個核苷酸，Z c3選自A、U、G或C，並且Z c4是與Z c3互補的核苷酸； 或者，所述siRNA的該正義鏈含有如SEQ ID NO:81所示的核苷酸序列，所述siRNA的該反義鏈含有如SEQ ID NO:82所示的核苷酸序列： 5'- UCUGAUAGAUGGAAUACUZ d3-3'(SEQ ID NO:81); 5'- Z d4AGUAUUCCAUCUAUCAGACU -3'(SEQ ID NO:82)， 其中，所述Z d4是該反義鏈的5'末端的第一個核苷酸，Z d3選自A、U、G或C，並且Z d4是與Z d3互補的核苷酸； 或者，所述siRNA的該正義鏈含有如SEQ ID NO:83所示的核苷酸序列，所述siRNA的該反義鏈含有如SEQ ID NO:84所示的核苷酸序列： 5'- AGUCUGAUAGAUGGAAUACUZ d3-3'(SEQ ID NO:83); 5'- Z d4AGUAUUCCAUCUAUCAGACUUC -3'(SEQ ID NO:84)， 其中，所述Z d4是該反義鏈的5'末端的第一個核苷酸，Z d3選自A、U、G或C，並且Z d4是與Z d3互補的核苷酸； 或者，所述siRNA的該正義鏈含有如SEQ ID NO:107所示的核苷酸序列，所述siRNA的該反義鏈含有如SEQ ID NO:108所示的核苷酸序列： 5'- CUGAUAGAUGGAAUACUUZ e3-3'(SEQ ID NO:107); 5'- Z e4AAGUAUUCCAUCUAUCAGAC -3'(SEQ ID NO:108), 其中，所述Z e4是該反義鏈的5'末端的第一個核苷酸，Z e3選自A、U、G或C，並且Z e4是與Z e3互補的核苷酸； 或者，所述siRNA的該正義鏈含有如SEQ ID NO:109所示的核苷酸序列，所述siRNA的該反義鏈含有如SEQ ID NO:110所示的核苷酸序列： 5'- GUCUGAUAGAUGGAAUACUUZ e3-3'(SEQ ID NO:109); 5'- Z e4AAGUAUUCCAUCUAUCAGACUU -3'(SEQ ID NO:110), 其中，所述Z e4是該反義鏈的5'末端的第一個核苷酸，Z e3選自A、U、G或C，並且Z e4是與Z e3互補的核苷酸； 或者，所述siRNA的該正義鏈含有如SEQ ID NO:133所示的核苷酸序列，所述siRNA的該反義鏈含有如SEQ ID NO:134所示的核苷酸序列： 5'- GAUGGAAUACUUACCAAUZ f3-3'(SEQ ID NO:133); 5'- Z f4AUUGGUAAGUAUUCCAUCUA -3'(SEQ ID NO:134), 其中，所述Z f4是該反義鏈的5'末端的第一個核苷酸，Z f3選自A、U、G或C，並且Z f4是與Z f3互補的核苷酸； 或者，所述siRNA的該正義鏈含有如SEQ ID NO:135所示的核苷酸序列，所述siRNA的該反義鏈含有如SEQ ID NO:136所示的核苷酸序列： 5'- UAGAUGGAAUACUUACCAAUZ f3-3'(SEQ ID NO:135); 5'- Z f4AUUGGUAAGUAUUCCAUCUAUC -3'(SEQ ID NO:136), 其中，所述Z f4是該反義鏈的5'末端的第一個核苷酸，Z f3選自A、U、G或C，並且Z f4是與Z f3互補的核苷酸； 或者，所述siRNA的該正義鏈含有如SEQ ID NO:159所示的核苷酸序列，所述siRNA的該反義鏈含有如SEQ ID NO:160所示的核苷酸序列： 5'- GAAUACUUACCAAUAAGAZ g3-3'(SEQ ID NO:159); 5'- Z g4UCUUAUUGGUAAGUAUUCCA -3'(SEQ ID NO:160), 其中，所述Z g4是該反義鏈的5'末端的第一個核苷酸，Z g3選自A、U、G或C，並且Z g4是與Z g3互補的核苷酸； 或者，所述siRNA的該正義鏈含有如SEQ ID NO:161所示的核苷酸序列，所述siRNA的該反義鏈含有如SEQ ID NO:162所示的核苷酸序列： 5'- UGGAAUACUUACCAAUAAGAZ g3-3'(SEQ ID NO:161); 5'- Z g4UCUUAUUGGUAAGUAUUCCAUC -3'(SEQ ID NO:162), 其中，所述Z g4是該反義鏈的5'末端的第一個核苷酸，Z g3選自A、U、G或C，並且Z g4是與Z g3互補的核苷酸。
  28. 如請求項1至27中任意一項所述的siRNA，其中，每一個非氟代修飾的核苷酸獨立地選自核苷酸的核糖基2'位的羥基被非氟基團取代形成的核苷酸、或核苷酸類似物中的一種。
  29. 如請求項28所述的siRNA，其中，不多於3個非氟代修飾的核苷酸為2'-去氧核苷酸，其餘每一個非氟代修飾的核苷酸均為甲氧基修飾的核苷酸；或者，每一個非氟代修飾的核苷酸均為甲氧基修飾的核苷酸；所述甲氧基修飾的核苷酸指核糖基的2'-羥基被甲氧基取代而形成的核苷酸。
  30. 如請求項29所述的siRNA，其中，所述siRNA為siHSDa1-M1、siHSDa1-M2、siHSDa2-M1、siHSDa2-M2、siHSDb1-M1、siHSDb1-M2、siHSDb2-M1、siHSDb2-M2、HSDc1-M1、siHSDc1-M2、siHSDc2-M1、siHSDc2-M2、HSDd1-M1、siHSDd1-M2、siHSDd2-M1、siHSDd2-M2、siHSDe1-M1、siHSDe1-M2、siHSDe2-M1、siHSDe2-M2、siHSDf1-M1、siHSDf1-M2、siHSDf2-M1、siHSDf2-M2、siHSDg1-M1、siHSDg1-M2、siHSDg2-M1或siHSDg2-M2中的一種。
  31. 如請求項1至30中任意一項所述的siRNA，其中，所述正義鏈和所述反義鏈中至少一條單鏈的磷酸-糖骨架中的至少1個磷酸酯基為具有修飾基團的磷酸酯基，所述具有修飾基團的磷酸酯基存在於由以下位置組成的群組中的至少一處： 所述正義鏈的5'末端端部第1個核苷酸和第2個核苷酸之間； 所述正義鏈的5'末端端部第2個核苷酸和第3個核苷酸之間； 所述正義鏈的3'末端端部第1個核苷酸和第2個核苷酸之間； 所述正義鏈的3'末端端部第2個核苷酸和第3個核苷酸之間； 所述反義鏈的5'末端端部第1個核苷酸和第2個核苷酸之間； 所述反義鏈的5'末端端部第2個核苷酸和第3個核苷酸之間； 所述反義鏈的3'末端端部第1個核苷酸和第2個核苷酸之間；以及 所述反義鏈的3'末端端部第2個核苷酸和第3個核苷酸之間。
  32. 如請求項31所述的siRNA，其中，所述siRNA為siHSDa1-M1S、siHSDa1-M2S、siHSDa2-M1S、siHSDa2-M2S、siHSDb1-M1S、siHSDb1-M2S、siHSDb2-M1S、siHSDb2-M2S、HSDc1-M1S、siHSDc1-M2S、siHSDc2-M1S、siHSDc2-M2S、HSDd1-M1S、siHSDd1-M2S、siHSDd2-M1S、siHSDd2-M2S、siHSDe1-M1S、siHSDe1-M2S、siHSDe2-M1S、siHSDe2-M2S、siHSDf1-M1S、siHSDf1-M2S、siHSDf2-M1S、siHSDf2-M2S、siHSDg1-M1S、siHSDg1-M2S、siHSDg2-M1S或siHSDg2-M2S中的一種。
  33. 如請求項1至32中任意一項所述的siRNA，其中，所述反義鏈的5'末端核苷酸為5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸類似物修飾的核苷酸。
  34. 如請求項33所述的siRNA，其中，所述siRNA為siHSDa1-M1P、siHSDa1-M2P、siHSDa2-M1P、siHSDa2-M2P、siHSDb1-M1P、siHSDb1-M2P、siHSDb2-M1P、siHSDb2-M2P、HSDc1-M1P、siHSDc1-M2P、siHSDc2-M1P、siHSDc2-M2P、HSDd1-M1P、siHSDd1-M2P、siHSDd2-M1P、siHSDd2-M2P、siHSDe1-M1P、siHSDe1-M2P、siHSDe2-M1P、siHSDe2-M2P、siHSDf1-M1P、siHSDf1-M2P、siHSDf2-M1P、siHSDf2-M2P、siHSDg1-M1P、siHSDg1-M2P、siHSDg2-M1P或siHSDg2-M2P中的一種。
  35. 一種藥物組合物，該藥物組合物含有如請求項1至34中任意一項所述的siRNA以及藥學上可接受的載體。
  36. 一種siRNA綴合物，所述siRNA綴合物含有請求項1至34中任意一項所述的siRNA以及綴合連接至該siRNA的綴合基團，所述綴合基團包含接頭和藥學上可接受的靶向基團，並且，所述siRNA、所述接頭和所述靶向基團依次共價或非共價連接，每個所述靶向基團選自能夠和細胞表面受體結合的配體。
  37. 如請求項1至34中任意一項所述的siRNA，和/或請求項35所述的藥物組合物和/或請求項36所述的siRNA綴合物在製備用於治療和/或預防與 HSD17B13基因表達的mRNA水平相關的疾病或者症狀的藥物中的用途。
  38. 如請求項37所述的用途，其中所述與 HSD17B13基因表達的mRNA水平相關的疾病或症狀是慢性纖維炎性肝病。
  39. 如請求項38所述的用途，所述慢性纖維炎性肝病選自由下列所組成的群組：肝炎、肝纖維化、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、肝硬化、酒精性脂肪性肝炎(ASH)、酒精性脂肪肝病(ALD)、丙型肝炎(HCV)相關的硬化、藥物引起的肝損傷及肝細胞壞死。
  40. 一種治療和/或預防與 HSD17B13基因表達的mRNA水平相關的疾病或症狀的方法，所述方法包括向有需要的受試者給予請求項1至34中任意一項所述的siRNA，和/或請求項35所述的藥物組合物和/或請求項36所述的siRNA綴合物。
  41. 如請求項40所述的方法，其中，所述與 HSD17B13基因表達的mRNA水平相關的疾病或症狀是慢性纖維炎性肝病 。
  42. 一種抑制細胞中 HSD17B13基因表達水平的方法，所述方法包括將有效劑量的請求項1至34中任意一項所述的siRNA，和/或請求項35所述的藥物組合物和/或請求項36所述的siRNA綴合物與所述細胞接觸。
  43. 一種試劑盒，所述試劑盒包含請求項1至34中任意一項所述的siRNA，和/或請求項35所述的藥物組合物和/或請求項36所述的siRNA綴合物。
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