KR20090083338A - ＳＣＡＰ의 ＲＮＡｉ 조절 및 이들의 치료적 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 SCAP 유전자(인간 SCAP 유전자)의 발현을 저해하는 이중-가닥 리보핵산(dsRNA)에 관계하는데, dsRNA는 30개 이하의 뉴클레오티드 길이, 일반적으로 19-25개 뉴클레오티드 길이를 갖는 뉴클레오티드 서열을 보유하고, SCAP 유전자의 최소한 일부분에 실질적으로 상보적인 안티센스 가닥을 포함한다. 본 발명은 또한, 제약학적으로 허용되는 담체와 함께 dsRNA를 함유하는 제약학적 조성물; 상기 제약학적 조성물을 이용하여, 인간 SCAP 발현과 SCAP 유전자 발현에 의해 유발되는 질환을 치료하는 방법; 세포에서 SCAP 유전자의 발현을 저해하는 방법에 관계한다.
SCAP 유전자

Description

ＳＣＡＰ의 ＲＮＡｉ 조절 및 이들의 치료적 용도{RNAi MODULATION OF SCAP AND THERAPEUTIC USES THEREOF}
본 발명은 유전자 SREPB 절단 활성화 단백질(cleavage activating protein, SCAP)의 조절물질을 이용한 치료 방법에 관계한다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 SCAP의 발현을 하향-조절하는 짧은 간섭(short interfering) RNA를 투여함으로써 원치 않는 SCAP 활성과 연관된 질환을 치료하는 방법 및 여기에 유용한 작용제에 관계한다.
지질 항상성(lipid homeostasis)은 지질 막(lipid membrane)에 의존하여 세포의 생활 기능(vital function)을 환경으로부터 분리하는 모든 살아있는 존재, 예를 들면, 모든 동물과 인간에 필수적이다. 더 나아가, 지질은 많은 생물체에 의해 에너지 저장소(energy reservoir)로서 이용된다. 예로써, 인지질(phospholipid), 트리글리세리드(triglyceride), 지방산(fatty acid)과 스테롤(sterol)을 비롯한 광범위하고 상이한 지질성 물질(lipidic substance)은 세포 내에서 다양한 필수 기능을 수행한다. 전체적으로, 지질 항상성은 본질적으로 모든 고등 생물체(higher organism)에서 상호의존성 과정(interdependent process)의 강하게 통제되고, 복수-가지화된 복잡한 망이다.
자연적으로, 시스템이 더욱 복잡할수록, 더욱 뒤틀릴 수 있다. 예로써, 인간에서 다수의 질환과 장애가 전체적으로 또는 부분적으로, 지질 항상성 기능 장애의 결과인 것으로 알려져 있다. 이들에는 지질 항상성에 관여하는 많은 유전자 중에서 하나 또는 다수가 완전히 또는 부분적으로 기능을 상실하거나 잘못 조절되는 선천성 질환(inherited disease) 및 체내에서 유전자 기능 또는 유전자 조절이 하나의 물질 또는 물질 조합과의 1회 또는 반복된 접촉후 변형되는 후천성 질환(acquired disease)이 모두 포함된다.
인간을 비롯한 많은 생물종에서, 지질에 대한 신체 요구는 전구체(precursor)로부터 지질의 합성뿐만 아니라 식이 섭취(dietary intake)에 의해 부분적으로 채워진다. 간은 식이 지질 섭취(dietary lipid intake), 지질 합성(lipid synthesis) 및 혈류(bloodstream)로 지질 방출과 혈류로부터 재-흡수(re-uptake)의 통제를 집합적으로 담당하는 단일 장기이다. 결과적으로, 이는 비록 전체는 아니지만 많은 지질 대사 질환(lipid metabolism disorder)에 관여한다.
이와 같은 질환은 신체의 전체 또는 일부에서 특정 지질의 과잉(overabundance)에 의해 유발되거나 이러한 과잉을 동반하고, 과도한 섭취(excessive intake), 불완전한 분해 또는 수송, 또는 과도한 de novo 합성으로부터 유래된다.
가령, 비-알코올성 지방간 질환(NAFLD)은 과도한 트리글리세리드가 간에 축적되고, 다양한 약물, 영양 인자(nutritional factor), 에너지 대사(energy metabolism)에서 복수의 유전자 결합, 그리고 가장 현저하게는, 인슐린 내 성(insulin resistance)과 연관되는 장애이다(Browning JD and Horton JD, J. Clin. Investigation 2004, 114:147). 반대로, 동맥경화증(atherosclerosis)의 증표는 과도한 콜레스테롤과 콜레스테롤 에스테르로 채워진 대식세포(macrophage)인 거품 세포(foam cell)의 출현이다(Kruth HS, Front Biosci 2001, 6:D429). 체내에서 과도한 수준의 지질과 연관된 질환의 다른 무-제한적 실례는 아래와 같다: 비-알코올성 간 질환(non-alcoholic liver disease), 지방간(fatty liver), 고지방혈(hyperlipemia), 고지방혈증(hyperlipidemia), 고리포단백혈증(hyperlipoproteinemia), 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia) 및/또는 고중성지방혈증(hypertriglyceridemia), 동맥경화증(atherosclerosis), 췌장염(pancreatitis), 비-인슐린 의존성 당뇨병(non-insulin dependent diabetes mellitus)(NIDDM), 관상 동맥 질환(coronary heart disease), 비만(obesity), 대사 증후군(metabolic syndrome), 말초 동맥 질환(peripheral arterial disease)과 심혈관 질환(cerebrovascular disease). 이러한 유형의 질환의 치료는 지질의 신체 자체 합성을 약화시킴으로써 잠재적으로 보조될 수 있다.
인간 간에서 지질 합성(lipid biosynthesis)의 조절에서 중심 요소는 스테롤 조절 요소 결합 단백질(Sterol Regulatory Element Binding Protein, SREBP)로 불리는 일군의 전사 인자(transcription factor)이다. SREBP-1a, SREBP-1c와 SREBP-2로 지칭되는 3가지 SREBP 동등형(isoform)이 존재한다. 이들은 전구체 형태로 소포체(endoplasmic reticulum, ER) 내에 존재하는데(Yokoyama C. et al., Cell 1993, 75:187; Hua X. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 1993, 90:11603), 상기 전구체는 콜레스테롤의 존재에서, 콜레스테롤과 2개의 다른 단백질: SCAP(SREBP-절단 활성화 단백질)과 Insig-1(인슐린-유도된 유전자 1)에 결합한다. 콜레스테롤 수준이 하락하면, Insig-1은 SREBP-SCAP 복합체로부터 이탈하여 상기 복합체가 골지체(Golgi apparatus)로 이동할 수 있도록 하는데, 여기서 SREBP는 SCAP에 의해 활성화되는 효소 S1P와 S2P에 의해 절단된다(부위 1/2 프로테아제; Sakai J et al, Mol. Cell 1998, 2:505; Rawson R. B. et al, Mol. 세포 1997, 1:47). 이후, 절단된 SREBP는 핵으로 이동하고, 다수 유전자의 SRE(sterol regulatory element)에 결합하고 이들의 전사를 촉진함으로써 전사 인자로서 기능한다(Briggs M. R. et al., J. Biol. Chem. 1993, 268:14490). 전사되는 유전자에는 LDL-수용체, 이의 상향 조절은 혈류로부터 콜레스테롤의 증가된 유입(in-flux)을 결과한다; HMG-CoA 환원효소; de-novo 콜레스테롤 합성에서 속도 제한 효소(rate limiting enzyme)(Anderson et al, Trends Cell Biol 2003, 13:534); 지방산 합성(fatty acid synthesis)에 관여하는 다수의 유전자가 포함된다.
이런 이유로, 지질의 신체 자체 생산을 감소시키는 시도에서, 한 가지 매력적인 옵션은 SREBP 활성화의 차단일 것이다. SCAP-결합이 3가지 SREBP 동등형 모두의 수송과 활성화에 반드시 필요하기 때문에, SCAP 활성의 저해는 세포 지질 합성과 흡수의 전반적인 하향-조절을 이끌어낼 수 있다. 가령, SCAP 활성은 가급적, 비가역적 방식으로 콜레스테롤에서보다 SCAP의 스테롤 감각 도메인(sterol sensing domain, SSD)에 더욱 높은 친화성(affinity)으로 결합하고, 따라서 SREBP 수송과 활성화를 예방하는 작용제에 의해 저해될 수 있다. 대안으로, SCAP를 인코딩하는 유전자의 번역 및/또는 전사 저해는 ER 막 내에 존재하고 SREBP-결합과 활성화에 이용될 수 있는 SCAP의 더욱 낮은 수준을 결과할 수 있다.
최근에, 이중-가닥 RNA 분자(dsRNA)는 RNA 간섭(RNA interference, RNAi)으로 알려져 있는 고도로 보전된 조절 기전(regulatory mechanism)에서 유전자 발현을 차단하는 것으로 밝혀졌다. WO 99/32619 (Fire et al.)에서는 꼬마선충(C. elegans)에서 유전자의 발현을 저해하는 최소한 25개 뉴클레오티드 길이 dsRNA의 용도를 기술한다. dsRNA는 또한, 식물(참조: WO 99/53050, Waterhouse et al.; WO 99/61631, Heifetz et al.), 초파리(Drosophila)(참조: Yang, D., et al., Curr. Biol. (2000) 10:1191-1200)와 포유동물(참조: WO 00/44895, Limmer; DE 101 00 586.5, Kreutzer et al.)을 비롯한 다른 생물체에서 표적 RNA를 분해시키는 것으로 밝혀졌다. 이러한 자연 기전은 현재, 유전자의 비정상적인 또는 원치 않는 조절에 의해 유발되는 질환을 치료하기 위한 새로운 종류의 약제(pharmaceutical agent) 개발에서 중심이 되고 있다. RNAi 분야에서 상당한 진전 및 과도한 지질 수준에 의해 매개되는 병리학적 과정의 치료에서 진전에도 불구하고, 예로써, 세포의 자체 RNAi 기구(machinery)를 이용하여 SCAP와 결과로써, SREBP 활성을 저해함으로써 신체의 자체 지질 생합성을 선택적으로, 그리고 효과적으로 약화시킬 수 있는 작용제가 여전히 요구된다. 이런 작용제는 SCAP 발현에 의해 직간접적으로 매개되는 병리학적 과정을 치료하는데 이용되기 위하여, 높은 생물 활성(biological activity)과 생체내 안정성(in vivo stability)을 모두 보유하고, 표적 SCAP 유전자, 예를 들면, 인간 SCAP의 발현을 효과적으로 저해할 것이다.
본 발명의 요약
본 발명에서는 이중-가닥 리보핵산(dsRNA) 및 이런 dsRNA를 이용하여 세포 또는 포유동물에서 SCAP 유전자의 발현을 저해하는 조성물과 방법을 제시한다. 본 발명에서는 또한, SCAP 유전자의 발현에 의해 매개되는 병리학적 장애와 질환, 예를 들면, 과도한 지질 수준 및/또는 원치 않는 지질 생합성과 연관된 장애와 질환을 치료하는 조성물과 방법을 제시한다. 본 발명의 dsRNA는 30개 이하의 뉴클레오티드 길이, 일반적으로 19-24개 뉴클레오티드 길이를 갖는 영역을 보유하고, SCAP 유전자의 mRNA 전사체의 최소한 일부분에 실질적으로 상보적인 RNA 가닥(안티센스 가닥)을 포함한다. 이러한 SCAP 유전자는 바람직하게는, 인간 SCAP 유전자, 더욱 바람직하게는, 호모 사피엔스(Homo sapiens) SCAP 유전자이다.
한 구체예에서, 본 발명에서는 SCAP 유전자의 발현을 저해하는 이중-가닥 리보핵산(dsRNA) 분자를 제시한다. 이러한 dsRNA는 서로에 상보적인 최소한 2개의 서열을 포함한다. dsRNA는 첫 번째 서열을 포함하는 센스 가닥과 두 번째 서열을 포함하는 안티센스 가닥을 포함한다. 이러한 안티센스 가닥은 SCAP 유전자를 인코딩하는 mRNA의 최소한 일부에 실질적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상보성 영역은 30개 이하의 뉴클레오티드 길이, 일반적으로, 19-24개 뉴클레오티드 길이를 갖는다. dsRNA는 SCAP 유전자를 발현하는 세포와의 접촉 이후에, 예로써, 일차 햄스터 간세포에서 SCAP 유전자의 발현을 최소한 20%, 또는 최소한 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55% 60%, 65%, 70%, 85%, 90% 또는 95% 저해한다.
가령, 본 발명의 dsRNA 분자는 RNAi 작용제 AD-9490 - AD-9513의 센스 가닥 서열(SEQ ID NO: 1-48로 구성된 군의 홀수 번, 표 1)로 구성된 군에서 선택되는 상기 dsRNA의 첫 번째 서열을 포함할 수 있고, 두 번째 서열은 AD-9490 - AD-9513의 안티센스 가닥 서열(SEQ ID NO: 1-48로 구성된 군의 짝수 번, 표 1)로 구성된 군에서 선택된다. 본 발명의 dsRNA 분자는 자연 발생 뉴클레오티드를 포함하거나, 또는 최소한 하나의 변형된 뉴클레오티드, 예를 들면, 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드, 5'-포스포로티오에이트 기를 포함하는 뉴클레오티드와 콜레스테릴 유도체에 연결된 말단 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 대안으로, 이러한 변형된 뉴클레오티드는 아래에서 선택될 수도 있다: 2'-데옥시-2'-플루오르 변형된 뉴클레오티드, 2'-데옥시-변형된 뉴클레오티드, 잠금된 뉴클레오티드, abasic 뉴클레오티드, 2'-아미노-변형된 뉴클레오티드, 2'-알킬-변형된 뉴클레오티드, 모르폴리노 뉴클레오티드, 포스포라미데이트, 또는 비-자연 염기 포함 뉴클레오티드. 일반적으로, 이런 변형된 서열은 AD-9490 - AD-9513(표 1)의 센스 서열로 구성된 군에서 선택되는 상기 dsRNA의 첫 번째 서열 및 AD-9490 - AD-9513(표 1)의 안티센스 서열로 구성된 군에서 선택되는 두 번째 서열에 기초할 것이다.
호모 사피엔스(Homo sapiens)(NM_012235.2), 생쥐(Mus musculus)(NM_001001144.1)와 검은배햄스터(Cricetus cricetus)(U67060) SCAP의 하향-조절과 인간에서 최소 오프-표적 상호작용(off-target interaction)을 위하여 선택된 RNAi 작용제
이중나선 확인자 센스 가닥 서열1 SEQ ID NO: 안티센스 가닥 서열1 SEQ ID NO:
AD-9490 gauuggcauccugguauacTT 1 1 guauaccaggaugccaaucTT 2
AD-9491 agcgccucaucauggcuggTT 3 ccagccaugaugaggcgcuTT 4
AD-9492 ggccuucuacaaccaugggTT 5 cccaugguuguagaaggccTT 6
AD-9493 gaggugugggacgccauugTT 7 caauggcgucccacaccucTT 8
AD-9494 uggauuggcauccugguauTT 9 auaccaggaugccaauccaTT 10
AD-9495 gccauugucugcaacuuugTT 11 caaaguugcagacaauggcTT 12
AD-9496 ccaucacccuggucuuccaTT 13 uggaagaccagggugauggTT 14
AD-9497 uguccuuccgccacuggccTT 15 ggccaguggcggaaggacaTT 16
AD-9498 ccuucuacaaccaugggcuTT 17 agcccaugguuguagaaggTT 18
AD-9499 gaccgcagcacaggcaucaTT 19 ugaugccugugcugcggucTT 20
AD-9500 ggauuggcauccugguauaTT 21 uauaccaggaugccaauccTT 22
AD-9501 aucugggaccgcagcacagTT 23 cugugcugcggucccagauTT 24
AD-9502 ucugcaucuuagccugcugTT 25 cagcaggcuaagaugcagaTT 26
AD-9503 agaucgacauggucaagucTT 27 gacuugaccaugucgaucuTT 28
AD-9504 caucacccuggucuuccagTT 29 cuggaagaccagggugaugTT 30
AD-9505 caucuuagccugcugcuacTT 31 guagcagcaggcuaagaugTT 32
AD-9506 ugcaucuuagccugcugcuTT 33 agcagcaggcuaagaugcaTT 34
AD-9507 aagaucgacauggucaaguTT 35 acuugaccaugucgaucuuTT 36
AD-9508 aggugugggacgccauugaTT 37 ucaauggcgucccacaccuTT 38
AD-9509 cagcgccucaucauggcugTT 39 cagccaugaugaggcgcugTT 40
AD-9510 ggaccgcagcacaggcaucTT 41 gaugccugugcugcgguccTT 42
AD-9511 cugccauugucugcaacuuTT 43 aaguugcagacaauggcagTT 44
AD-9512 cugcaucuuagccugcugcTT 45 gcagcaggcuaagaugcagTT 46
AD-9513 ucuuagccugcugcuacccTT 47 ggguagcagcaggcuaagaTT 48
1대문자 = 데속시리보뉴클레오티드; 소문자 = 리보뉴클레오티드; 밑줄: 뉴클레오시드 삼인산염
바람직한 구체예에서, dsRNA는 AD-9505, AD-9498, AD-9512, AD-9490, AD-9495, AD-9503, AD-9494, AD-9500, AD-9492, AD-9499, AD-9496, AD-9510, AD-9511, AD-9491, AD-9506, AD-9508, AD-9502, AD-9504, AD-9507, AD-9493, AD-9501, AD-9497, AD-9509와 AD-9513으로 구성된 군에서 선택되고, 세포, 예를 들면, 일차 햄스터 간세포에서 SCAP 유전자의 발현을 최소한 20% 저해한다.
더욱 적절하게는, dsRNA는 AD-9505, AD-9498, AD-9512, AD-9490, AD-9495, AD-9503, AD-9494, AD-9500, AD-9492, AD-9499, AD-9496, AD-9510, AD-9511, AD-9491, AD-9506, AD-9508, AD-9502, AD-9504, AD-9507, AD-9493, AD-9501, AD-9497과 AD-9509로 구성된 군에서 선택되고, 세포, 예를 들면, 일차 햄스터 간세포에서 SCAP 유전자의 발현을 최소한 30% 저해한다.
이보다 더욱 적절하게는, dsRNA는 AD-9505, AD-9498, AD-9512, AD-9490, AD-9495, AD-9503, AD-9494, AD-9500, AD-9492, AD-9499, AD-9496, AD-9510, AD-9511, AD-9491, AD-9506, AD-9508, AD-9502, AD-9504와 AD-9507로 구성된 군에서 선택되고, 세포, 예를 들면, 일차 햄스터 간세포에서 SCAP 유전자의 발현을 최소한 40% 저해한다.
이보다 더욱 적절하게는, dsRNA는 AD-9505, AD-9498, AD-9512, AD-9490, AD-9495, AD-9503, AD-9494, AD-9500, AD-9492, AD-9499, AD-9496, AD-9510, AD-9511, AD-9491, AD-9506, AD-9508과 AD-9502로 구성된 군에서 선택되고, 세포, 예를 들면, 일차 햄스터 간세포에서 SCAP 유전자의 발현을 최소한 50% 저해한다.
이보다 더욱 적절하게는, dsRNA는 AD-9505, AD-9498, AD-9512, AD-9490, AD-9495, AD-9503, AD-9494, AD-9500, AD-9492, AD-9499, AD-9496, AD-9510과 AD-9511로 구성된 군에서 선택되고, 세포, 예를 들면, 일차 햄스터 간세포에서 SCAP 유전자의 발현을 최소한 60% 저해한다.
이보다 더욱 적절하게는, dsRNA는 AD-9505, AD-9498, AD-9512, AD-9490, AD-9495, AD-9503, AD-9494와 AD-9500으로 구성된 군에서 선택되고, 세포, 예를 들면, 일차 햄스터 간세포에서 SCAP 유전자의 발현을 최소한 70% 저해한다.
가장 적절하게는, dsRNA는 AD-9505, AD-9498과 AD-9512로 구성된 군에서 선택되고, 세포, 예를 들면, 일차 햄스터 간세포에서 SCAP 유전자의 발현을 최소한 75% 저해한다.
다른 구체예에서, 본 발명에서는 본 발명의 dsRNA 중에서 한 가지를 포함하는 세포를 제시한다. 이러한 세포는 일반적으로, 포유동물 세포, 예를 들면, 인간 세포이다.
다른 구체예에서, 본 발명에서는 생물체, 일반적으로, 인간 개체 내에서 SCAP 유전자, 예를 들면, 인간 또는 호모 사피엔스(Homo sapiens) SCAP 유전자의 발현을 저해하고, 하나이상의 본 발명의 dsRNA와 제약학적으로 허용되는 담체 또는 전달 운반제(delivery vehicle)를 함유하는 제약학적 조성물을 제시한다. 여기서, dsRNA는 바람직하게는, AD-9505, AD-9498, AD-9512, AD-9490, AD-9495, AD-9503, AD-9494, AD-9500, AD-9492, AD-9499, AD-9496, AD-9510, AD-9511, AD-9491, AD-9506, AD-9508, AD-9502, AD-9504, AD-9507, AD-9493, AD-9501, AD-9497, AD-9509와 AD-9513으로 구성된 군에서 선택되고, 세포, 예를 들면, 일차 햄스터 간세포에서 SCAP 유전자의 발현을 최소한 20% 저해한다. 이러한 제약학적 조성물의 더욱 바람직한 구체예에서, dsRNA는 앞서 제시된 군에서 선택된다.
다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포에서 SCAP 유전자, 예를 들면, 인간 SCAP 유전자, 바람직하게는, 호모 사피엔스(Homo sapiens) SCAP 유전자의 발현을 저해하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다:
(a) 세포 내로 이중-가닥 리보핵산(dsRNA)을 도입하는 단계, 여기서 dsRNA는 서로에 상보적인 최소한 2개의 서열을 포함한다. 상기 dsRNA는 첫 번째 서열을 포함하는 센스 가닥 및 두 번째 서열을 포함하는 안티센스 가닥을 포함한다. 상기 안티센스 가닥은 SCAP 유전자를 인코딩하는 mRNA의 최소한 일부분에 실질적으로 상보적인 상보성(complementarity) 영역을 포함하고, 상보성 영역은 30개 이하의 뉴클레오티드 길이, 일반적으로, 19-24개 뉴클레오티드 길이를 갖고, 여기서 dsRNA는 SCAP 유전자를 발현하는 세포와의 접촉 이후에, 예로써, 일차 햄스터 간세포에서 상기 SCAP 유전자의 발현을 최소한 20%, 또는 최소한 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55% 60%, 65%, 70%, 85%, 90% 또는 95% 저해하고;
(b) 단계 (a)에서 생산된 세포를, SCAP 유전자의 mRNA 전사체(transcript)가 분해될 만큼 충분한 시간 동안 유지시켜 세포에서 SCAP 유전자의 발현을 저해하는 단계.
여기서, dsRNA는 바람직하게는, AD-9505, AD-9498, AD-9512, AD-9490, AD-9495, AD-9503, AD-9494, AD-9500, AD-9492, AD-9499, AD-9496, AD-9510, AD-9511, AD-9491, AD-9506, AD-9508, AD-9502, AD-9504, AD-9507, AD-9493, AD-9501, AD-9497, AD-9509과 AD-9513으로 구성된 군에서 선택되고, 세포, 예를 들면, 일차 햄스터 간세포에서 SCAP 유전자의 발현을 최소한 20% 저해한다. 이러한 방법의 더욱 바람직한 구체예에서, dsRNA는 앞서 제시된 군에서 선택된다.
다른 구체예에서, 본 발명에서는 SCAP 발현에 의해 매개되는 병리학적 과정, 예를 들면, 지질 대사, 지질 항상성 및/또는 지질 분포의 질환, 구체적으로, 비-알코올성 간 질환(non-alcoholic liver disease), 지방간(fatty liver), 고지방혈(hyperlipemia), 고지방혈증(hyperlipidemia), 고리포단백혈증(hyperlipoproteinemia), 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia) 및/또는 고중성지방혈증(hypertriglyceridemia), 동맥경화증(atherosclerosis), 췌장염(pancreatitis), 비-인슐린 의존성 당뇨병(non-insulin dependent diabetes mellitus)(NIDDM), 관상 동맥 질환(coronary heart disease), 비만(obesity), 대사 증후군(metabolic syndrome), 말초 동맥 질환(peripheral arterial disease)과 심혈관 질환(cerebrovascular disease)을 치료, 예방 또는 관리하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 이런 치료, 예방 또는 관리가 필요한 환자에 본 발명의 하나이상의 dsRNA의 치료적 또는 예방적 효과량을 투여하는 단계를 포함한다. 여기서, dsRNA는 바람직하게는, AD-9505, AD-9498, AD-9512, AD-9490, AD-9495, AD-9503, AD-9494, AD-9500, AD-9492, AD-9499, AD-9496, AD-9510, AD-9511, AD-9491, AD-9506, AD-9508, AD-9502, AD-9504, AD-9507, AD-9493, AD-9501, AD-9497, AD-9509와 AD-9513으로 구성된 군에서 선택되고, 세포, 예를 들면, 일차 햄스터 간세포에서 SCAP 유전자의 발현을 최소한 20% 저해한다. 이러한 제약학적 조성물의 더욱 바람직한 구체예에서, dsRNA는 앞서 제시된 군에서 선택된다.
다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포에서 SCAP 유전자의 발현을 저해하는 벡터를 제시하는데, 상기 벡터는 본 발명의 dsRNA 중에서 하나의 최소한 하나의 가닥을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 조절 서열을 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포에서 SCAP 유전자의 발현을 저해하는 벡터를 포함하는 세포를 제시한다. 이러한 벡터는 본 발명의 dsRNA 중에서 하나의 최소한 하나의 가닥을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 조절 서열을 포함한다.
본 발명에서는 이중-가닥 리보핵산(dsRNA) 및 이러한 dsRNA를 이용하여 세포 또는 포유동물에서 SCAP 유전자의 발현을 저해하는 조성물과 방법을 제시한다. 본 발명에서는 또한, dsRNA를 이용하여, 포유동물에서 SCAP 유전자의 발현에 의해 유발되는 병리학적 장애와 질환을 치료하는 조성물과 방법을 제시한다. dsRNA는 RNA 간섭(RNA interference, RNAi)으로 알려져 있는 과정을 통하여 mRNA의 서열-특이적 분해(degradation)를 유도한다.
본 발명의 dsRNA는 30개 이하의 뉴클레오티드 길이, 일반적으로 19-24개 뉴클레오티드 길이를 갖는 영역을 보유하고, SCAP 유전자의 mRNA 전사체의 최소한 일부분에 실질적으로 상보적인 RNA 가닥(안티센스 가닥)을 포함한다. 이들 dsRNA의 이용은 지질 대사, 지질 항상성 및/또는 지질 분포의 불완전한 조절에 관련된 질환, 예를 들면, 비-알코올성 간 질환(non-alcoholic liver disease), 지방간(fatty liver), 또는 다양한 형태의 지질대사이상(dyslipidemia)에 관여하는 유전자의 mRNA의 표적된 분해를 가능하게 한다. 세포-기초된 검사와 동물 검사를 이용하여, 본 발명자들은 매우 낮은 용량의 이들 dsRNA가 RNAi를 특이적으로, 그리고 효과적으로 매개하여 SCAP 유전자 발현의 현저한 저해를 결과할 수 있음을 증명하였다. 따라서 이들 dsRNA를 포함하는 본 발명의 방법과 조성물은 지질 대사, 지질 항상성 및/또는 지질 분포의 조절에 관여하는 유전자를 표적함으로써, SCAP 발현에 의해 매개되는 병리학적 과정, 예를 들면, 지질 대사, 지질 항상성 및/또는 지질 분포의 질환, 구체적으로, 비-알코올성 간 질환(non-alcoholic liver disease), 지방간(fatty liver), 또는 다양한 형태의 지질대사이상(dyslipidemia)을 치료하는데 유용하다.
아래의 상세한 설명에서는 dsRNA를 제조하고 이용하는 방법; SCAP 유전자의 발현을 저해하기 위하여 dsRNA를 함유하는 조성물; 그리고, SCAP 유전자의 발현에 의해 유발되는 질환과 질병, 예를 들면, 비-알코올성 간 질환(non-alcoholic liver disease), 지방간(fatty liver), 또는 다양한 형태의 지질대사이상(dyslipidemia)을 치료하기 위한 조성물과 방법을 개시한다. 본 발명의 제약학적 조성물은 제약학적으로 허용되는 담체와 함께, 30개 이하의 뉴클레오티드 길이, 일반적으로 19-24개 뉴클레오티드 길이인 상보성 영역을 포함하고 SCAP 유전자의 RNA 전사체의 최소한 일부분에 실질적으로 상보적인 안티센스 가닥을 보유하는 dsRNA를 포함한다.
따라서 본 발명의 특정 측면에서는 제약학적으로 허용되는 담체와 함께, 본 발명의 dsRNA를 함유하는 제약학적 조성물, 이들 조성물을 이용하여 SCAP 유전자의 발현을 저해하는 방법, 이들 제약학적 조성물을 이용하여 SCAP 유전자의 발현에 의해 유발되는 질환을 치료하는 방법, 본 발명의 dsRNA를 인코딩하는 벡터, 본 발명의 이런 dsRNA 또는 벡터를 포함하는 세포를 제시한다.
I. 정의
편의를 위하여, 명세서, 실시예와 첨부된 특허청구범위에 이용된 특정 용어와 어구의 의미가 하기에 제공된다. 본 명세서의 다른 부분에서 용어의 이용과 본 섹션에서 제공된 정의 사이에 명백한 불일치가 존재하는 경우에, 본 섹션에서 정의가 우선한다.
"G," "C," "A", "T"와 "U"(대문자 또는 소문자로 기재되는 지에 상관없이)는 각각, 일반적으로 염기(base)로서 구아닌(guanine), 시토신(cytosine), 아데닌(adenine), 티민(thymine)과 우라실(uracil)을 보유하는 뉴클레오티드를 의미한다. 하지만, "리보뉴클레오티드" 또는 "뉴클레오티드"는 하기에 더욱 상세하게 설명된 바와 같이, 변형된 뉴클레오티드, 또는 대리 치환 모이어티(surrogate replacement moiety)를 지칭할 수도 있다. 당업자가 충분히 인지하는 바와 같이,
구아닌, 시토신, 아데닌, 티민과 우라실은 이런 대체 모이어티를 보유하는 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드의 염기 짝짓기(base pairing) 특성을 실질적으로 변화시키지 않으면서 다른 모이어티에 의해 치환될 수 있다. 가령, 제한 없이, 염기로서 이노신(inosine)을 포함하는 뉴클레오티드는 아데닌, 시토신, 또는 우라실을 보유하는 뉴클레오티드와 염기쌍을 형성할 수 있다. 따라서 우라실, 구아닌, 또는 아데닌을 보유하는 뉴클레오티드는 본 발명의 뉴클레오티드 서열 내에서, 예로써 이노신을 보유하는 뉴클레오티드에 의해 치환될 수 있다. 이런 치환 모이어티를 포함하는 서열은 본 발명의 구체예이다.
본 명세서에서, "SCAP" 또는 "SCAP 유전자"는 SREBP 활성화 단백질을 인코딩하는 유전자를 지칭하는데, 이의 무-제한적 실례는 GenBank 수탁 번호 NM_012235.2(호모 사피엔스(Homo sapiens)), NM_001001144.1(생쥐(Mus musculus))과 U67060(검은배햄스터(Cricetus cricetus)) 하에 발견된다.
본 명세서에서, "표적 서열"은 일차 전사 산물의 RNA 처리(processing)의 산물인 mRNA를 비롯하여, SCAP 유전자의 전사 동안 형성되는 mRNA 분자의 뉴클레오티드 서열의 연속 부분(contiguous portion)을 지칭한다. 본 발명의 소정의 RNAi 작용제의 표적 서열은 RNAi 작용제의 안티센스 가닥의 상보성(complementarity)으로 인하여, 이러한 RNAi 작용제에 의해 표적되는 X 뉴클레오티드의 mRNA-서열을 의미하는데, 이러한 mRNA 서열에 안티센스 가닥은 상기 mRNA와 접촉하면 혼성화되고, 여기서 X는 안티센스 가닥 내에서 뉴클레오티드의 숫자 + 존재하면, 센스 가닥의 단일-가닥 오버행(single-stranded overhang) 내에서 뉴클레오티드의 숫자이다.
본 명세서에서, "서열을 포함하는 가닥"은 표준 뉴클레오티드 명명법을 이용하여 지칭되는 서열에 의해 기술되는 뉴클레오티드 사슬을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다.
본 명세서에서, 달리 명시하지 않는 경우에, 두 번째 뉴클레오티드 서열과 관련하여 첫 번째 뉴클레오티드 서열을 기술하는데 이용되는 "상보적인(complementary)"은 당업자가 인지하는 바와 같이, 첫 번째 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드가 특정의 조건 하에서, 두 번째 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드와 혼성화되고 이중나선 구조를 형성하는 능력을 지칭한다. 이런 조건은 예로써, 엄격한 조건(stringent condition)일 수 있는데, 여기서 엄격한 조건은 12-16시간 동안 400 mM NaCl, 40 mM PIPES pH 6.4, 1 mM EDTA, 50℃ 또는 70℃, 이후 세척 과정을 포함한다. 다른 조건, 예를 들면, 생물체 내에서 조우할 수 있는 생리학적으로 적합한 조건이 적용될 수 있다. 당업자는 혼성화된 뉴클레오티드의 궁극적 적용에 따라서, 두 서열의 상보성 검사에 가장 적합한 일단의 조건을 결정할 수 있을 것이다.
이는 첫 번째와 두 번째 뉴클레오티드 서열의 전장(entire length)에서, 첫 번째 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의, 두 번째 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드로의 염기쌍을 포함한다. 이들 서열은 본 명세서에서, 서로에 대하여 "완전히 상보적인"으로 지칭될 수 있다. 하지만, 본 명세서에서, 첫 번째 서열이 두 번째 서열에 대하여 "실질적으로 상보적인"으로 지칭되는 경우에, 이들 두 서열은 혼성화(hybridization) 이후에 완전히 상보적이거나, 또는 1개 이상 내지 일반적으로, 4개, 3개 또는 2개 이하의 잘못 짝짓기된 염기쌍을 형성하지만, 그들의 궁극적 적용에 가장 적합한 조건 하에 혼성화하는 능력을 유지한다. 하지만, 두 올리고뉴클레오티드가 혼성화 이후에, 하나 이상의 단일 가닥 오버행을 형성하도록 설계되는 경우에, 이런 오버행은 상보성(complementarity)의 결정과 관련하여 미스매치(mismatch)로서 간주되지 않는다. 가령, 21개 뉴클레오티드 길이를 갖는 한 올리고뉴클레오티드와 23개 뉴클레오티드 길이를 갖는 다른 올리고뉴클레오티드를 포함하는 dsRNA에서, 더욱 긴 올리고뉴클레오티드가 더욱 짧은 올리고뉴클레오티드에 완전히 상보적인 21개 뉴클레오티드의 서열을 포함하면, 이들 dsRNA는 본 발명에서 여전히 "완전히 상보적인"으로 지칭된다.
본 명세서에서, "상보적인" 서열은 혼성화하는 능력과 관련된 상기 필요조건이 충족된다면, 비-Watson-Crick 염기쌍 및/또는 비-자연 뉴클레오티드와 변형된 뉴클레오티드로부터 형성된 염기쌍을 포함하거나, 또는 이들 염기쌍으로부터 전적으로 형성될 수도 있다.
본 명세서에서, "상보적인", "완전히 상보적인"과 "실질적으로 상보적인"은 이들 용어의 이용 배경으로부터 인지되는 바와 같이, dsRNA의 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이에, 또는 dsRNA의 안티센스 가닥과 표적 서열 사이에 염기 정합(base matching)과 관련하여 이용될 수 있다.
본 명세서에서, 메신저 RNA(mRNA)의 "최소한 일부분에 실질적으로 상보적인" 폴리뉴클레오티드는 목적(가령, SCAP 유전자를 인코딩하는) mRNA의 연속 부분에 실질적으로 상보적인 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 가령, 폴리뉴클레오티드는 상기 서열이 SCAP 유전자를 인코딩하는 mRNA의 비-중단된 부분에 실질적으로 상보적이면 SCAP 유전자 mRNA의 최소한 일부분에 상보적이다.
본 명세서에서, "이중-가닥 RNA" 또는 "dsRNA"는 2개의 역평행(anti-parallel)하고, 앞서 정의된 바와 같이, 실질적으로 상보적인 핵산 가닥을 포함하는 이중나선 구조를 보유하는 리보핵산 분자의 복합체를 지칭한다. 이중나선 구조를 형성하는 이들 2개의 가닥은 하나의 대형 RNA 분자의 상이한 부분이거나, 또는 별개의 RNA 분자일 수 있다. 이들 2개의 가닥이 하나의 대형 분자의 일부이고, 따라서 이중나선 구조를 형성하는 한쪽 가닥의 3'-단부와 다른 가닥의 5' 단부 사이에 뉴클레오티드의 중단되지 않은 사슬에 의해 연결되면, 이러한 연결 RNA 사슬은 "헤어핀 루프(hairpin loop)"로 지칭된다. 이들 2개의 가닥이 이중나선 구조를 형성하는 한쪽 가닥의 3'-단부와 다른 가닥의 5' 단부 사이에 뉴클레오티드의 중단되지 않은 사슬 이외의 수단에 의해 공유 연결되는 경우에, 이러한 구조는 "링커(linker)"로 지칭된다. RNA 가닥은 동일하거나 상이한 숫자의 뉴클레오티드를 갖는다. 염기쌍의 최대수는 이중나선 내에 존재하는 임의의 오버행을 제외하고, dsRNA의 가장 짧은 가닥 내에서 뉴클레오티드의 숫자이다. 이러한 이중나선 구조 이외에, dsRNA는 하나 이상의 뉴클레오티드 오버행을 포함할 수 있다.
본 명세서에서, "뉴클레오티드 오버행"은 dsRNA의 한쪽 가닥의 3'-단부가 다른 가닥의 5'-단부를 초과하여 확장되거나, 또는 그 반대일 때, dsRNA의 이중나선 구조로부터 돌출되는 짝이 없는 뉴클레오티드(들)를 지칭한다. "평활(blunt)" 또는 "평활 단부"는 dsRNA의 상기 단부에서 짝이 없는 뉴클레오티드, 즉, 뉴클레오티드 오버행이 존재하지 않음을 의미한다. "평활 단부" dsRNA는 분자의 한쪽 단부에서 뉴클레오티드 오버행이 존재하지 않는 dsRNA이다.
"안티센스 가닥"은 표적 서열에 실질적으로 상보적인 영역을 포함하는 dsRNA의 가닥을 지칭한다. 본 명세서에서, "상보성 영역"은 본 명세서에 정의된 바와 같이, 서열, 예를 들면, 표적 서열에 실질적으로 상보적인 안티센스 가닥 상에서 영역을 지칭한다. 이러한 상보성 영역이 표적 서열에 완전히 상보적이지 않은 경우에, 미스매치는 말단 영역에서 가장 관용되고, 존재하면, 일반적으로, 말단 영역(들), 예를 들면, 5' 및/또는 3' 말단의 6개, 5개, 4개, 3개, 또는 2개 뉴클레오티드 내에 위치한다. 가장 적절하게는, 미스매치는 안티센스 가닥의 5' 말단 및/또는 센스 가닥의 3' 말단의 6개, 5개, 4개, 3개, 또는 2개 뉴클레오티드 내에 위치한다.
본 명세서에서, "센스 가닥"은 안티센스 가닥의 영역에 실질적으로 상보적인 영역을 포함하는 dsRNA의 가닥을 지칭한다.
dsRNA를 수식할 때, "세포 내로 도입"은 당업자가 인지하는 바와 같이, 세포 내로 흡입(uptake) 또는 흡수(absorption)를 용이하게 하는 것을 의미한다. dsRNA의 흡수 또는 흡입은 보조 없는 확산성(diffusive) 또는 활성 세포 과정을 통하여, 또는 보조 약물 또는 장치에 의해 진행될 수 있다. 상기 용어의 의미는 시험관내 세포에 한정되지 않는다; dsRNA는 살아있는 생물체의 일부인 "세포 내로 도입"될 수도 있다. 이런 경우에, 세포 내로 도입은 생물체로 전달을 수반할 것이다. 가령, 생체내 전달을 위하여, dsRNA는 조직 부위(tissue site) 내로 주입되거나 전신 투여될 수 있다. 세포 내로 시험관내 도입은 전기천공(electroporation)과 리포펙션(lipofection)과 같은 당분야에 공지된 방법을 수반한다.
본 명세서에서, SCAP 유전자, 예를 들면, 인간 SCAP 유전자를 수식할 때, "침묵(silence)"과 "발현 저해"는 첫 번째 세포 또는 세포 집단과 실질적으로 동일하지만 처리되지 않은 두 번째 세포 또는 세포 집단(대조 세포)과 비교하여, SCAP 유전자가 전사되고 SCAP 유전자의 발현이 저해되도록 처리된 첫 번째 세포 또는 세포 집단으로부터 분리되는 SCAP 유전자로부터 전사된 mRNA 양의 감소에 의해 증명되는, SCAP 유전자, 예를 들면, 인간 SCAP 유전자 발현의 최소한 일부 억제를 지칭한다. 적절하게는, 세포는 일차 햄스터 간세포이다. 저해 정도는 통상적으로, 아래와 같이 표시된다:
Figure 112009022201213-PCT00001
X 100%
대안으로, 저해 정도는 SCAP 유전자 전사에 기능적으로 연결된 파라미터, 예를 들면, 세포에 의해 분비되는 SCAP 유전자에 의해 인코딩되거나, 또는 이들 세포의 용해(lysis)후 용액에서 관찰되는 단백질의 양, 또는 특정 표현형(phenotype), 예를 들면, LDL 수용체의 표면 발현, 또는 지질 합성을 보이는 세포의 숫자에서 감소의 측면에서 제공될 수 있다. 원칙적으로, SCAP 유전자 침묵(gene silencing)은 구성적으로 또는 게놈 조작(genomic engineering)에 의해 표적을 발현하는 임의의 세포에서, 임의의 적절한 검사법으로 결정될 수 있다. 하지만, 소정의 dsRNA가 SCAP 유전자의 발현을 특정한 정도로 저해하고, 따라서 본 발명에 의해 포섭되는 지를 결정하기 위하여 참고(reference)가 필요한 경우에, 하기 실시예에 제공된 분석법이 이런 참고로서 기능한다.
일반적으로, SCAP 유전자의 발현은 본질적으로, 임의 효과(random effect)로부터 산출되는, 처리된 세포와 대조 세포로부터 획득된 SCAP mRNA 함량 또는 다른 기능적 파라미터의 측정 결과에서 차이 가능성이 5% 미만이면, 최소한 부분적으로 억제되는 것으로 간주된다. 다시 말하면, SCAP 유전자의 발현은 이러한 차이가 통계학적으로 유의하면, 최소한 부분적으로 억제되는 것으로 간주된다.
가령, 특정 사례에서, SCAP 유전자, 예를 들면, 인간 SCAP 유전자의 발현은 본 발명의 이중-가닥 올리고뉴클레오티드의 투여에 의해 최소한 20%, 25%, 35%, 40%, 45%, 또는 50% 억제된다. 일부 구체예에서, SCAP 유전자, 예를 들면, 인간 SCAP 유전자는 본 발명의 이중-가닥 올리고뉴클레오티드의 투여에 의해 최소한 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 또는 80% 억제된다. 일부 구체예에서, SCAP 유전자, 예를 들면, 인간 SCAP 유전자는 본 발명의 이중-가닥 올리고뉴클레오티드의 투여에 의해 최소한 85%, 90%, 또는 95% 억제된다.
표 5에서는 본 발명의 다양한 dsRNA 분자를 이용한 SCAP 발현의 저해에 대한 수치를 제공한다.
본 명세서에서, SCAP 발현, 예를 들면, 인간 SCAP 발현의 배경에서, "처리", "치료" 등은 SCAP 발현에 의해 매개되는 병리학적 과정의 경감 또는 완화를 지칭한다. 본 발명의 배경에서, 하기에 언급된 다른 장애(SCAP 발현에 의해 매개되는 병리학적 과정 이외의 장애)와 관련하여, "처리", "치료" 등은 이런 장애와 연관된 최소한 하나의 증상을 경감 또는 완화시키거나, 또는 이런 장애의 진행을 지연 또는 반전시키는 것을 의미한다.
본 명세서에서, "치료 효과량"과 "예방 효과량"은 SCAP 발현에 의해 매개되는 병리학적 과정 또는 SCAP 발현에 의해 매개되는 병리학적 과정의 명백한 증상의 치료, 예방, 또는 관리에서 치료 이익(therapeutic benefit)을 제공하는 양을 지칭한다. 치료 효과적인 특정량은 통상의 일반의(medical practitioner)에 의해 용이하게 결정될 수 있고, 당분야에 공지된 인자, 예를 들면, SCAP 발현에 의해 매개되는 병리학적 과정의 타입, 환자의 병력과 연령, SCAP 발현에 의해 매개되는 병리학적 과정의 단계 및 다른 항-SCAP 발현 작용제의 투여에 따라 달라질 수 있다.
본 명세서에서, "제약학적 조성물"은 dsRNA의 약리학적 효과량과 제약학적으로 허용되는 담체를 함유한다. 본 명세서에서, "약리학적 효과량," "치료 효과량" 또는 "효과량"은 의도된 약리학적, 치료적 또는 예방적 결과를 산출하는데 효과적인 RNA의 양을 지칭한다. 가령, 소정의 임상적 치료가 질병 또는 질환과 연관된 측정가능 파라미터에서 최소한 25% 감소가 나타날 때 효과적인 것으로 간주된다면, 이러한 질병 또는 질환의 치료를 위한 약물의 치료 효과량은 상기 파라미터에서 최소한 25% 감소를 달성하는데 필요한 양이다.
"제약학적으로 허용되는 담체"는 치료제(therapeutic agent)의 투여를 위한 담체를 지칭한다. 이런 담체에는 염수(saline), 완충된 염수(buffered saline), 덱스트로스(dextrose), 물(water), 글리세롤(glycerol), 에탄올(ethanol)과 이들의 조합이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 상기 용어는 세포 배양 배지를 특정적으로 배제한다. 경구 투여되는 약물의 경우에, 제약학적으로 허용되는 담체에는 제약학적으로 허용되는 부형제(excipient), 예를 들면, 불활성 희석제(inert diluent), 붕해제(disintegrating agent), 접합제(binding agent), 윤활제(lubricating agent), 감미료(sweetening agent), 방향제(flavoring agent), 착색제(coloring agent)와 보존제(preservative)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 적절한 불활성 희석제에는 나트륨과 칼슘 탄산염, 나트륨과 칼슘 인산염과 락토오스가 포함되고, 옥수수 전분(corn starch)과 알긴산(alginic acid)은 붕해제로서 적합하다. 접합제에는 전분(starch)과 젤라틴(gelatin)이 포함되고, 윤활제(lubricating agent)는 존재하면, 일반적으로 스테아르산마그네슘(magnesium stearate), 스테아르산(stearic acid) 또는 활석(talc)이다. 원하는 경우에, 이들 정제는 위장관(gastrointestinal tract) 내에서 흡수를 지연시키기 위하여 글리세릴 모노스테아르산염(glyceryl monostearate) 또는 글리세릴 디스테아르산염(glyceryl distearate)와 같은 물질로 코팅될 수 있다.
본 명세서에서, "형질전환된(transformed) 세포"는 dsRNA 분자가 발현되는 벡터가 도입된 세포이다.
II. 이중-가닥 리보핵산(dsRNA)
한 구체예에서, 본 발명에서는 세포 또는 포유동물에서 SCAP 유전자, 예를 들면, 인간 SCAP 유전자의 발현을 저해하는 이중-가닥 리보핵산(dsRNA) 분자를 제시하는데, 여기서 dsRNA는 SCAP 유전자, 예를 들면, 인간 SCAP 유전자의 발현에서 형성된 mRNA의 최소한 일부분에 상보적인 상보성 영역을 포함하는 안티센스 가닥을 포함하고, 상보성 영역은 30개 이하의 뉴클레오티드 길이, 일반적으로 19-24개 뉴클레오티드 길이이고, 여기서 dsRNA는 SCAP 유전자를 발현하는 세포와의 접촉 이후에, SCAP 유전자의 발현을 최소한 20% 저해한다. 이러한 dsRNA는 혼성화하여 이중나선 구조를 형성할 만큼 충분히 상보적인 2개의 RNA 가닥을 포함한다. dsRNA의 한쪽 가닥(안티센스 가닥)은 SCAP 유전자의 발현 동안 형성된 mRNA의 서열로부터 유래된, 표적 서열에 실질적으로 상보적인, 일반적으로, 완전히 상보적인 상보성 영역을 포함하고, 다른 가닥(센스 가닥)은 상기 안티센스 가닥에 상보적인 영역을 포함하고, 따라서 이들 두 가닥은 적절한 조건 하에 결합되면, 혼성화하여 이중나선 구조를 형성한다. 일반적으로, 이러한 이중나선 구조는 15개 내지 30개, 더욱 일반적으로, 18개 내지 25개, 이보다 더욱 일반적으로, 19개 내지 24개, 가장 일반적으로, 19개 내지 21개 염기쌍 길이를 갖는다. 유사하게, 표적 서열에 상보성 영역은 15개 내지 30개, 더욱 일반적으로, 18개 내지 25개, 이보다 더욱 일반적으로, 19개 내지 24개, 가장 일반적으로, 19개 내지 21개 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 본 발명의 dsRNA는 하나 이상의 단일 가닥 뉴클레오티드 오버행을 더욱 포함할 수 있다.
이러한 dsRNA는 하기에 더욱 상술된 바와 같은 당분야에 공지된 표준 방법, 예를 들면, 자동화 DNA 합성기(synthesizer)에 의해 합성되거나, 예로써 Biosearch, Applied Biosystems, Inc.로부터 상업적으로 구입가능하다. 바람직한 구체예에서, SCAP 유전자는 인간 SCAP 유전자이다. 특정 구체예에서, dsRNA의 첫 번째 가닥은 RNAi 작용제 AD-9490 - AD-9513의 센스 가닥 서열(SEQ ID NO: 1-48 군의 홀수 번, 표 1)을 포함하고, 두 번째 서열은 AD-9490 - AD-9513의 안티센스 가닥 서열(SEQ ID NO: 1-48 군의 짝수 번, 표 1)로 구성되는 군에서 선택된다.
다른 구체예에서, dsRNA는 RNAi 작용제 AD-9490 - AD-9513(표 1)에 대하여 앞서 제시된 서열 군에서 선택되는 최소한 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, dsRNA는 이러한 군에서 선택되는 최소한 2개의 서열을 포함하는데, 여기서 최소한 2개의 서열 중에서 하나는 최소한 2개의 서열 중에서 다른 서열에 상보적이고, 최소한 2개의 서열 중에서 하나는 SCAP 유전자, 예를 들면, 인간 SCAP 유전자의 발현에서 산출된 mRNA의 서열에 실질적으로 상보적이다. 일반적으로, dsRNA는 2개의 올리고뉴클레오티드를 포함하는데, 여기서 한쪽 올리고뉴클레오티드는 RNAi 작용제 AD-9490 - AD-9513(표 1) 중에서 하나에서 센스 가닥으로 기술되고, 두 번째 올리고뉴클레오티드는 RNAi 작용제 AD-9490 - AD-9513(표 1) 중에서 하나에서 안티센스 가닥으로 기술된다.
당업자가 충분히 인지하는 바와 같이, 20개 내지 23개, 구체적으로, 21개 염기쌍의 이중나선 구조를 포함하는 dsRNA는 RNA 간섭을 유도하는데 특히 효과적인 것으로 보고되었다(Elbashir et al., EMBO 2001, 20:6877-6888). 하지만, 더욱 짧은 또는 더욱 긴 dsRNA 역시 효과적일 수 있음이 밝혀졌다. 앞서 기술된 구체예에서, RNAi 작용제 AD-9490 - AD-9513(표 1)에 대하여 제공된 올리고뉴클레오티드 서열의 특성에 비추어, 본 발명의 dsRNA는 최소 21개 nt 길이의 최소한 하나의 가닥을 포함할 수 있다. 한쪽 또는 양쪽 단부에서 몇몇 뉴클레오티드를 제외하고, RNAi 작용제 AD-9490 - AD-9513(표 1)에 대하여 본 명세서에서 제시된 서열 중에서 하나를 포함하는 더욱 짧은 dsRNA가 앞서 기술된 dsRNA와 비교하여 유사하게 효과적일 것임은 합리적으로 예상될 수 있다. 따라서 RNAi 작용제 AD-9490 - AD-9513(표 1)의 서열 중에서 하나로부터 최소한 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 또는 그 이상의 연속 뉴클레오티드의 부분 서열을 포함하고, 하기에 기술된 검사에서 전체 서열을 포함하는 dsRNA로부터 SCAP 유전자, 예를 들면, 인간 SCAP 유전자의 발현을 최대 5, 10, 15, 20, 25, 또는 30 % 저해로 저해하는 능력에서 구별되는 dsRNA가 본 발명에 의해 고려된다. RNAi 작용제 AD-9490 - AD-9513(표 1)의 표적 서열 내에서 분열하는 다른 dsRNA는 SCAP mRNA 서열, 예를 들면, 인간 SCAP mRNA 서열, 특히, GeneBank accession no. NM_012235.2 및 개별 표적 서열을 이용하여 용이하게 만들 수 있다.
이에 더하여, 표 1에 제시된 RNAi 작용제는 RNAi-유발된 절단에 민감한 SCAP mRNA 내에서 부위를 확인한다. 따라서 본 발명에는 본 발명의 작용제 중에서 하나에 의해 표적되는 서열 내를 표적하는 RNAi 작용제가 포함된다. 본 명세서에서, 두 번째 RNAi 작용제는 이러한 두 번째 RNAi 작용제가 첫 번째 RNAi 작용제의 안티센스 가닥에 상보적인 mRNA 내에 임의의 위치에서 메시지(message)를 절단하면, 첫 번째 RNAi 작용제의 서열 내를 표적하는 것으로 일컬어진다. 이런 두 번째 작용제는 일반적으로, SCAP 유전자 내에서 선택된 서열에 연속하는 영역으로부터 유래된 추가의 뉴클레오티드 서열에 결합된, 표 1에 제시된 서열 중에서 하나로부터 최소한 15개 연속 뉴클레오티드로 구성된다. 가령, 표적 SCAP 유전자로부터 차기 6개 뉴클레오티드와 결합된 AD-9509의 표적 서열의 3'-최말단 15개 뉴클레오티드는 표 1에 제시된 서열 중에서 하나에 기초된 21개 뉴클레오티드의 단일 가닥 작용제를 산출한다.
본 발명의 dsRNA는 표적 서열에 대한 하나 이상의 미스매치(mismatch)를 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 dsRNA는 3개의 미스매치를 포함한다. dsRNA의 안티센스 가닥이 표적 서열에 대한 미스매치를 포함하면, 미스매치 부위는 상보성 영역의 중심에 위치하지 않는 것이 바람직하다. dsRNA의 안티센스 가닥이 표적 서열에 대한 미스매치를 포함하면, 이러한 미스매치는 단부로부터 5개 뉴클레오티드, 예를 들면, 상보성 영역의 5' 또는 3' 단부, 바람직하게는, 5'-단부로부터 5개, 4개, 3개, 2개, 또는 1개 뉴클레오티드로 국한되는 것이 바람직하다. 가령, SCAP 유전자의 영역에 상보적인 23개 뉴클레오티드 dsRNA 가닥의 경우에, 이러한 dsRNA는 일반적으로, 중심 13개 뉴클레오티드 내에서 미스매치를 포함하지 않는다. 다른 구체예에서, dsRNA의 안티센스 가닥은 안티센스 가닥의 위치 1, 또는 2에서부터 위치 9, 10, 11, 또는 12까지(5'-3' 계산) 영역 내에서 미스매치를 포함하지 않는다. 이들 위치는 일반적으로, 각각, 종자 영역(seed region)(위치 1, 또는 2, 내지 9, 또는 10)과 mRNA 절단 부위(위치 11과 12)로 간주되고, 미스매치에 가장 민감한 것으로 보인다. 본 발명에서 기술된 방법은 표적 서열에 하나의 미스매치를 포함하는 dsRNA가 SCAP 유전자의 발현을 저해하는데 효과적인 지를 결정하는데 이용될 수 있다. 미스매치를 포함하는 dsRNA의 SCAP 유전자 발현을 저해하는 효능의 고려는 특히, SCAP 유전자 내에서 특정의 상보성 영역이 집단 내에서 동질이상 서열 변이(polymorphic sequence variation)를 갖는 것으로 알려져 있는 경우에 중요하다.
한 구체예에서, dsRNA의 최소한 하나의 단부는 1개 내지 4개, 일반적으로 1개 또는 2개 뉴클레오티드의 단일 가닥 뉴클레오티드 오버행을 보유한다. 최소한 하나의 뉴클레오티드 오버행을 보유하는 dsRNA는 그들의 평활-단부 대응물보다 예상치 않게 우수한 저해 특성을 갖는다. 게다가, 본 발명자들은 단지 하나의 뉴클레오티드 오버행의 존재가 dsRNA의 전체 안정성(overall stability)에 영향을 주지 않으면서 dsRNA의 간섭 활성(interference activity)을 강화시킨다는 것을 확인하였다. 단지 하나의 오버행을 보유하는 dsRNA는 다양한 세포, 세포 배양 배지, 혈액과 혈청에서뿐만 아니라 생체내에서 특히 안정하고 효과적인 것으로 증명되었다. 일반적으로, 이러한 단일 가닥 오버행은 안티센스 가닥의 3'-말단 단부 또는, 대안으로, 센스 가닥의 3'-말단 단부에 위치한다. 또한, dsRNA는 일반적으로 안티센스 가닥의 5'-단부에 위치하는 평활 단부를 보유할 수도 있다. 이들 dsRNA는 향상된 안정성과 저해 활성을 갖고, 따라서 적은 용량, 다시 말하면, 일일 수용자 체중 ㎏당 5 ㎎ 이하의 투여를 가능하게 한다. 일반적으로, dsRNA의 안티센스 가닥은 3'-단부에서 뉴클레오티드 오버행을 보유하고, 5'-단부는 평활이다. 다른 구체예에서, 오버행 내에서 하나이상의 뉴클레오티드가 뉴클레오시드 삼인산염으로 치환된다.
또 다른 구체예에서, dsRNA는 안정성을 향상시키기 위하여 화학적으로 변형된다. 본 발명의 핵산은 당분야에 널리 확립된 방법, 예를 들면, "Current protocols in nucleic acid chemistry", Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USA에 기술된 방법에 합성되고 및/또는 변형될 수 있다. 본 발명에 유용한 바람직한 dsRNA 화합물의 특정 실례는 변형된 골격을 보유하거나 자연 인터뉴클레오시드 연쇄(internucleoside linkage)가 없는 dsRNA이다. 본 명세서에서 정의된 바와 같이, 변형된 골격을 보유하는 dsRNA에는 골격 내에 인 인자(phosphorus atom)를 유지하는 것들 및 골격 내에 인 원자를 보유하지 않는 것들이 포함된다. 본 명세서에서 및 때때로, 당분야에서 언급되는 바와 같이, 그들의 인터뉴클레오시드 골격 내에 인 원자를 보유하지 않는 변형된 dsRNA 역시 올리고뉴클레오시드인 것으로 간주될 수 있다.
바람직한 변형된 dsRNA 골격에는 예로써, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 키랄성 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트(phosphorodithioate), 포스포트리에스테르(phosphotriester), 아미노알킬포스포트리에스테르(aminoalkylphosphotriester), 3'-알킬렌 포스포네이트(3'-alkylene phosphonate)와 키랄성 포스포네이트를 비롯한 메틸과 다른 알킬 포스포네이트, 포스피네이트(phosphinate), 3'-아미노 포스포라미데이트(3'-amino phosphoramidate)와 아미노알킬포스포라미데이트(aminoalkylphosphoramidate)를 비롯한 포스포라미데이트, 티오노포스포라미데이트(thionophosphoramidate), 티오노알킬포스포네이트(thionoalkylphosphonate), 티오노알킬포스포트리에스테르(thionoalkylphospho triester) 및 정상적인 3'-5' 연쇄를 보유하는 보라노인산염(boranophosphate), 이들의 2'-5' 연결된 유사체와 반대의 극성(polarity)을 갖는 유사체(여기서, 뉴클레오시드 단위의 인접한 쌍은 3'-5'에서 5'-3'으로, 또는 2'-5'에서 5'-2'로 연결된다. 다양한 염, 혼합된 염과 유리산(free acid) 형태 역시 포함된다.
상기 인-보유 연쇄의 제조를 교시하는 대표적인 U.S. 특허에는 U.S. Pat. No. 3,687,808; 4,469,863; 4,476,301; 5,023,243; 5,177,195; 5,188,897; 5,264,423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676; 5,405,939; 5,453,496; 5,455,233; 5,466,677; 5,476,925; 5,519,126; 5,536,821; 5,541,316; 5,550,111; 5,563,253; 5,571,799; 5,587,361; 5,625,050이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
내부에 인 원자를 보유하지 않는 바람직한 변형된 dsRNA 골격은 짧은 사슬 알킬 또는 사이클로알킬 인터뉴클레오시드 연쇄, 혼성의 헤테로원자와 알킬 또는 사이클로알킬 인터뉴클레오시드 연쇄, 또는 하나 이상의 짧은 사슬 헤테로원자형 또는 헤테로환형 인터뉴클레오시드 연쇄에 의해 형성되는 골격을 보유한다. 이들에는 모르폴리노 연쇄(뉴클레오시드의 당 부분으로부터 부분적으로 형성됨); 실록산(siloxane) 골격; 술피드(sulfide), 술폭시드(sulfoxide)와 술폰(sulfone) 골격; 포름아세틸(formacetyl)과 티오포름아세틸(thioformacetyl) 골격; 메틸렌 포름아세틸과 티오포름아세틸 골격; 알켄(alkene) 보유 골격; 술파메이트(sulfamate) 골격; 메틸렌이미노(methyleneimino)와 메틸렌하이드라지노(methylenehydrazino) 골격; 술포네이트(sulfonate)와 술폰아마이드(sulfonamide) 골격; 아마이드(amide) 골격; 혼성의 N, O, S와 CH2 구성요소를 갖는 골격을 보유하는 것들이 포함된다.
상기 올리고뉴클레오시드의 제조를 교시하는 대표적인 U.S. 특허에는 U.S. Pat. No. 5,034,506; 5,166,315; 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141; 5,235,033; 5,64,562; 5,264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466,677; 5,470,967; 5,489,677; 5,541,307; 5,561,225; 5,596,086; 5,602,240; 5,608,046; 5,610,289; 5,618,704; 5,623,070; 5,663,312; 5,633,360; 5,677,437; 5,677,439가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
다른 바람직한 dsRNA 모방체(mimetic)에서, 뉴클레오티드 단위의 당과 인터뉴클레오시드 연쇄, 다시 말하면, 골격은 신규한 기로 치환된다. 이들 염기 단위는 적절한 핵산 표적 화합물과의 혼성화를 위하여 유지된다. 우수한 혼성화 특성을 갖는 것으로 밝혀진 dsRNA 모방체인 이와 같은 올리고머 화합물은 펩티드 핵산(peptide nucleic acid, PNA)으로 지칭된다. PNA 화합물에서, dsRNA의 당 골격은 아마이드 보유 골격, 특히, 아미노에틸글리신(aminoethylglycine) 골격으로 치환된다. 핵염기(nucleobase)는 유지되고, 골격의 아마이드 부분의 aza 질소 원자에 직접적으로 또는 간접적으로 결합된다. PNA 화합물의 제조를 교시하는 대표적인 U.S. 특허에는 U.S. Pat. No. 5,539,082; 5,714,331; 5,719,262가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. PNA 화합물에 관한 추가의 교시는 Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500에서 찾아볼 수 있다.
본 발명의 가장 바람직한 구체예는 포스포로티오에이트 골격을 보유하는 dsRNA 및 헤테로원자 골격, 특히, CH2NHCH2, CH2N(CH3)OCH2[메틸렌(메틸이미노) 또는 MMI 골격으로 알려져 있음], CH2ON(CH3)CH2, 앞서 언급된 U.S. Pat. No. 5,489,677의 CH2N(CH3)N(CH3)CH2와 N(CH3)CH2CH2[여기서, 고유 포스포디에스테르(phosphodiester) 골격은 OPOCH2로서 표시된다] 및 앞서 언급된 U.S. Pat. No. 5,602,240의 아마이드 골격을 보유하는 올리고뉴클레오시드이다. 또한, 앞서 언급된 U.S. Pat. No. 5,034,506의 모르폴리노 골격 구조를 보유하는 dsRNA가 바람직하다.
변형된 dsRNA는 또한, 하나 이상의 치화된 당 모이어티(moiety)를 보유할 수 있다. 바람직한 dsRNA는 2' 위치에 아래 중에서 한 가지를 포함한다: OH; F; O-, S-, 또는 N-알킬; O-, S-, 또는 N-알케닐; O-, S- 또는 N-알키닐; 또는 O-알킬-O-알킬, 여기서 알킬, 알케닐과 알키닐은 치환되거나 치환되지 않은 C1 내지 C10 알킬 또는 C2 내지 C10 알케닐과 알키닐이다. 특히 바람직하게는, O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2와 O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2인데, 여기서 n과 m은 1 내지 대략 10이다. 다른 바람직한 dsRNA는 2' 위치에 아래 중에서 한 가지를 포함한다: C1 내지 C10 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 알크아릴, 아르알킬, O-알크아릴 또는 O-아르알킬, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, 헤테로사이클로알킬, 헤테로사이클로알크아릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환된 실릴, RNA 절단기(cleaving group), 리포터(reporter) 기, 인터칼레이터(intercalator), dsRNA의 약동학적 특성을 향상시키는 기, 또는 dsRNA의 약역학적 특성을 향상시키는 기, 또는 유사한 특성을 갖는 다른 치환기. 바람직한 변형에는 2'-메톡시에톡시(2'-OCH2CH2OCH3; 일명, 2'-O-(2-메톡시에틸) 또는 2'-MOE)(Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504), 다시 말하면, 알콕시-알콕시 기가 포함된다. 다른 바람직한 변형에는 하기 실시예에 기술된 바와 같은 2'-디메틸아미노옥시에톡시, 다시 말하면, O(CH2)2ON(CH3)2 기(일명, 2'-DMAOE) 및 하기 실시예에 기술된 2'-디메틸아미노에톡시에톡시(일명, 2'-O-디메틸아미노에톡시에틸 또는 2'-DMAEOE), 다시 말하면, 2'-OCH2OCH2N(CH2)2가 포함된다.
다른 바람직한 변형에는 2'-메톡시(2'-OCH3), 2'-아미노프로폭시 (2'-OCH2CH2CH2NH2)와 2'-플루오르(2'-F)가 포함된다. 유사한 변형은 dsRNA 상에서 다른 위치, 특히, 3' 말단 뉴클레오티드 상에서 또는 2'-5' 연결된 dsRNA 내에서 당의 3' 위치에서 및 5' 말단 뉴클레오티드의 5' 위치에서 만들어질 수도 있다. dsRNA는 또한, 펜토푸라노실 당(pentofuranosyl sugar) 대신에 사이클로부틸 모이어티와 같은 당 모방체(sugar mimetic)를 보유할 수도 있다. 이런 변형된 당 구조의 제조를 교시하는 대표적인 U.S. 특허에는 U.S. Pat. No. 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646,265; 5,658,873; 5,670,633; 5,700,920이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
dsRNA는 또한, 핵염기(종종, 당분야에서 "염기"로서 약칭됨) 변형 또는 치환을 보유할 수도 있다. 본 명세서에서, "변형되지 않은" 또는 "자연" 핵염기에는 퓨린(purine) 염기 아데닌(A)과 구아닌(G) 및 피리미딘(pyrimidine) 염기 티민(T), 시토신(C)과 우라실(U)이 포함된다. 변형된 핵염기에는 다른 합성과 자연 핵염기, 예를 들면, 5-메틸시토신(5-me-C), 5-하이드록시메틸 시토신, 산틴, 하이포산틴, 2-아미노아데닌, 아데닌과 구아닌의 6-메틸과 다른 알킬 유도체, 아데닌과 구아닌의 2-프로필과 다른 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민과 2-티오시토신, 5-할로우라실과 시토신, 5-프로피닐 우라실과 시토신, 6-아조 우라실, 시토신과 티민, 5-우라실(슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-하이드록실과 다른 8-치환된 아데닌과 구아닌, 5-할로, 특히, 5-브로모, 5-트리플루오르메틸과 다른 5-치환된 우라실과 시토신, 7-메틸구아닌과 7-메틸아데닌, 8-아자구아닌과 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌과 7-데아자아데닌 및 3-데아자구아닌과 3-데아자아데닌이 포함된다. 추가의 핵염기에는 U.S. Pat. No. 3,687,808에서 기술된 것들, The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. L, ed. John Wiley & Sons, 1990에서 기술된 것들, Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613에서 개시된 것들 및 Sanghvi, Y S., Chapter 15, DsRNA Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., Ed., CRC Press, 1993에서 개시된 것들이 포함된다. 이들 중에서 특정의 핵염기가 본 발명의 올리고머 화합물의 결합 친화성(binding affinity)을 증가시키는데 특히 유용하다. 이들에는 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실과 5-프로피닐시토신을 비롯하여, 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6과 0-6 치환된 퓨린이 포함된다. 5-메틸시토신 치환은 핵산 이중나선 안정성(duplex stability)을 0.6-1.2 정도 증가시키는 것으로 밝혀졌는데(Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. and Lebleu, B., Eds., DsRNA Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278), 이러한 치환은 현재 바람직한 염기 치환이고, 특히, 2'-O-메톡시에틸 당 변형과 연합되는 경우에 더욱 바람직하다.
특정의 앞서 언급된 변형된 핵염기 및 다른 변형된 핵염기의 제조를 교시하는 대표적인 U.S. 특허에는 앞서 언급된 U.S. Pat. No. 3,687,808 및 U.S. Pat. No. 4,845,205; 5,130,30; 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,594,121, 5,596,091; 5,614,617; 5,681,941, 그리고 U.S. Pat. No. 5,750,692가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
본 발명의 dsRNA의 다른 변형은 dsRNA의 활성, 세포 분포 또는 세포 흡입을 강화시키는 하나 이상의 모이어티 또는 배합체(conjugate)를 이러한 dsRNA에 화학적으로 연결하는 과정을 수반한다. 이런 모이어티에는 지질 모이어티, 예를 들면, 콜레스테롤 모이어티(Letsinger et al., Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 199, 86, 6553-6556), 콜릭산(cholic acid)(Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1994 4 1053-1060), 티오에테르, 예를 들면, 베릴-S-트리틸티올(beryl-S-tritylthiol)(Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309; Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770), 티오콜레스테롤(thiocholesterol)(Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538), 지방족 사슬(aliphatic chain), 예를 들면, 도데칸디올(dodecandiol) 또는 운데실(undecyl) 잔기(Saison-Behmoaras et al., EMBO J, 1991, 10, 1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49-54), 인지질(phospholipid), 예를 들면, 디-헥사데실-rac-글리세롤(di-hexadecyl-rac-glycerol) 또는 트리에틸-암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H-포스포네이트(triethyl-ammonium 1,2-di-O-hexadecyl-rac-glycero-3-H- phosphonate)(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783), 폴리아민(polyamine) 또는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol) 사슬(Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973), 또는 아다만탄 아세트산(adamantane acetic acid)(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654), 팔미틸 모이어티(palmityl moiety)(Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237), 또는 옥타데실아민(octadecylamine) 또는 헥실아미노-카르보닐옥시콜레스테롤 모이어티(hexylamino-carbonyloxycholesterol)(Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923-937)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
이런 dsRNA 배합체의 제조를 교시하는 대표적인 U.S. 특허에는 U.S. Pat. No. 4,828,979; 4,948,882; 5,218,105; 5,525,465; 5,541,313; 5,545,730; 5,552,538; 5,578,717, 5,580,731; 5,591,584; 5,109,124; 5,118,802; 5,138,045; 5,414,077; 5,486,603; 5,512,439; 5,578,718; 5,608,046; 4,587,044; 4,605,735; 4,667,025; 4,762,779; 4,789,737; 4,824,941; 4,835,263; 4,876,335; 4,904,582; 4,958,013; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,245,022; 5,254,469; 5,258,506; 5,262,536; 5,272,250; 5,292,873; 5,317,098; 5,371,241, 5,391,723; 5,416,203, 5,451,463; 5,510,475; 5,512,667; 5,514,785; 5,565,552; 5,567,810; 5,574,142; 5,585,481; 5,587,371; 5,595,726; 5,597,696; 5,599,923; 5,599,928; 5,688,941이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
소정의 화합물 내에서 모든 위치가 균일하게 변형될 필요는 없고, 실제로, 상기한 변형 중에서 하나 이상이 단일 화합물 내에, 또는 심지어, dsRNA 내에서 단일 뉴클레오시드에 통합될 수 있다. 본 발명에는 키메라성(chimeric) 화합물인 dsRNA 화합물이 포함된다. 본 발명의 배경에서, "키메라성" dsRNA 화합물 또는 "키메라(chimera)"는 dsRNA 화합물, 특히, 2개 이상의 화학적으로 상이한 영역을 보유하는 dsRNA인데, 상기 영역 각각은 최소한 하나의 단량체 단위, 다시 말하면, dsRNA 화합물의 경우에 뉴클레오티드로 구성된다. 이들 dsRNA는 전형적으로, 최소한 하나의 영역을 보유하고, 여기서 상기 dsRNA는 뉴클레아제(nuclease) 분해에 대한 증가된 저항성, 증가된 세포 흡입 및/또는 표적 핵산에 대한 증가된 결합 친화성이 dsRNA에 공여되도록 변형된다. dsRNA의 추가적인 영역은 RNA:DNA 또는 RNA:RNA 하이브리드(hybrid)를 절단할 수 있는 효소에 대한 기질(substrate)로서 기능할 것이다. RNA 표적의 절단은 겔 전기영동(gel electrophoresis) 및 필요하면, 당분야에 공지된 연관된 핵산 혼성화(hybridization) 기술에 의해 편의하게 탐지될 수 있다.
특정 사례에서, dsRNA는 비-리간드(non-ligand) 기에 의해 변형된다. 다수의 비-리간드 분자가 dsRNA의 활성, 세포 분포 또는 세포 흡입을 강화시키기 위하여 dsRNA에 결합되는데, 이런 결합(conjugation)을 수행하는 절차는 과학 문헌에서 확인가능하다. 이런 비-리간드 모이어티에는 지질 모이어티, 예를 들면, 콜레스테롤(Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:6553), 콜릭산 (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4:1053), 티오에테르, 예를 들면, 헥실-S-트리틸티올(Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765), 티오콜레스테롤(Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533), 지방족 사슬, 예를 들면, 도데칸디올 또는 운데실 잔기(Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10:111; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49), 인지질, 예를 들면, 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H-포스포네이트(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777), 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬(Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969), 또는 아다만탄 아세트산(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651), 팔미틸 모이어티(Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229), 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카르보닐-옥시콜레스테롤 모이어티(Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923)가 포함된다. 이런 dsRNA 배합체의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 앞서 목록으로 기술되었다. 전형적인 결합 프로토콜은 서열의 하나 이상의 위치에서 아미노링커(aminolinker)를 보유하는 dsRNA의 합성을 수반한다. 이후, 아미노 기는 적절한 커플링(coupling) 또는 활성화(activating) 시약을 이용하여 결합되는 분자와 반응한다. 이러한 결합 반응(conjugation reaction)은 dsRNA가 고형 서포트(solid support)에 여전히 결합된 상태에서, 또는 용액 상(solution phase)에서 dsRNA의 절단 이후에 수행될 수 있다. HPLC에 의한 이러한 dsRNA 배합체의 정제는 전형적으로, 순수한 배합체를 산출한다.
RNAi 작용제를 인코딩하는 벡터
본 발명의 dsRNA는 또한, 생체내에서 세포내 재조합 바이러스 벡터로부터 발현될 수 있다. 본 발명의 재조합 바이러스 벡터는 본 발명의 dsRNA를 인코딩하는 서열 및 이들 dsRNA 서열을 발현하기 위한 임의의 적절한 프로모터를 포함한다. 적절한 프로모터에는 예로써, U6 또는 H1 RNA pol III 프로모터 서열과 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus) 프로모터가 포함된다. 다른 적절한 프로모터의 선택은 당분야의 통상적인 기술에 속한다. 본 발명의 재조합 바이러스 벡터는 또한, 특정 조직 또는 특정 세포내 환경에서 dsRNA의 발현을 위한 유도성 또는 조절가능성 프로모터를 포함할 수 있다. 생체내에서 본 발명의 dsRNA를 세포로 전달하기 위한 재조합 바이러스 벡터의 이용은 하기에 더욱 상세하게 논의된다.
본 발명의 dsRNA는 2개의 개별 상보성 RNA 분자로서, 또는 2개의 상보성 영역을 보유하는 단일 RNA 분자로서 재조합 바이러스 벡터로부터 발현될 수 있다.
발현되는 dsRNA 분자에 대한 코딩 서열(coding sequence)을 수용할 수 있는 임의의 바이러스 벡터, 예를 들면, 아데노바이러스(adenovirus, AV); 아데노-연관된 바이러스(adeno-associated virus, AAV); 레트로바이러스(retroviruse)(가령, 렌티바이러스(lentivirus, LV), 라브도바이러스(Rhabdovirus), 뮤린 백혈병 바이러스(murine leukemia virus)); 포진 바이러스(herpes virus) 등으로부터 유래된 벡터가 이용될 수 있다. 바이러스 벡터의 향성(tropism)은 다른 바이러스로부터 외피 단백질(envelope protein) 또는 다른 표면 항원(surface antigen)으로 이들 벡터를 슈도타이핑(pseudotyping)함으로써, 또는 적절하면, 상이한 바이러스 캡시드 단백질(capsid protein)을 치환함으로써 변형될 수 있다.
가령, 본 발명의 렌티바이러스 벡터는 소낭성 구내염 바이러스(vesicular stomatitis virus, VSV), 광견병(rabies), 에볼라(Ebola), 모콜라(Mokola) 등으로부터 표면 단백질로 슈도타이핑될 수 있다. 본 발명의 AAV 벡터는 상이한 캡시드 단백질 혈청형(serotype)을 발현하도록 이들 벡터를 조작함으로써 상이한 세포를 표적하도록 만들어질 수 있다. 가령, 혈청형 2 게놈 상에서 혈청형 2 캡시드를 발현하는 AAV 벡터는 AAV 2/2로 불린다. AAV 2/2 벡터 내에서 혈청형 2 캡시드 유전자는 혈청형 5 캡시드 유전자로 치환하여 AAV 2/5 벡터를 산출할 수 있다. 상이한 캡시드 단백질 혈청형을 발현하는 AAV 벡터를 작제하는 기술은 당분야의 통상적인 기술에 속한다(참조: Rabinowitz J E et al. (2002), J Virol 76:791-801).
본 발명에 이용하기 적합한 재조합 바이러스 벡터의 선택, dsRNA를 벡터 내로 발현하기 위한 핵산 서열을 삽입하는 방법 및 바이러스 벡터를 목적 세포로 전달하는 방법은 당분야의 통상적인 기술에 속한다(참조: Dornburg R (1995), Gene Therap. 2: 301-310; Eglitis M A (1988), Biotechniques 6: 608-614; Miller A D (1990), Hum Gene Therap. 1: 5-14; Anderson W F (1998), Nature 392: 25-30; Rubinson D A et al., Nat. Genet. 33: 401-406).
바람직한 바이러스 벡터는 AV와 AAV로부터 유래된 것들이다. 특히 바람직한 구체예에서, 본 발명의 dsRNA는 예로써, U6 또는 H1 RNA 프로모터, 또는 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터를 포함하는 재조합 AAV 벡터로부터 2개의 개별 상보성 단일 가닥 RNA 분자로서 발현된다.
본 발명의 dsRNA를 발현하는데 적합한 AV 벡터, 재조합 AV 벡터를 작제하는 방법 및 이들 벡터를 표적 세포 내로 전달하는 방법은 Xia H et al. (2002), Nat. Biotech. 20: 1006-1010에서 기술된다.
본 발명의 dsRNA를 발현하는데 적합한 AAV 벡터, 재조합 AAV 벡터를 작제하는 방법 및 이들 벡터를 표적 세포 내로 전달하는 방법은 Samulski R et al. (1987), J. Virol. 61: 3096-3101; Fisher K J et al. (1996), J. Virol, 70: 520-532; Samulski R et al. (1989), J. Virol. 63: 3822-3826; U.S. Pat. No. 5,252,479; U.S. Pat. No. 5,139,941; International Patent Application No. WO 94/13788; International Patent Application No. WO 93/24641에서 기술된다.
III. dsRNA를 함유하는 제약학적 조성물
한 구체예에서, 본 발명에서는 본 명세서에 기술된 바와 같은 dsRNA 및 제약학적으로 허용되는 담체를 함유하는 제약학적 조성물을 제시한다. dsRNA를 함유하는 제약학적 조성물은 SCAP 유전자의 발현 또는 활성과 연관된 질환이나 질병, 예를 들면, 인간 SCAP 발현에 의해 매개되는 병리학적 과정, 또는 SCAP 발현의 하향조절에 의해 치료될 수 있는 질환이나 질병을 치료하는데 유용하다. 이런 제약학적 조성물은 전달 양식에 기초하여 제제화된다. 한 가지 실례는 비경구 전달(parenteral delivery)을 통한 전신 투여(systemic administration)용으로 제제화되는 조성물이다.
본 발명의 제약학적 조성물은 SCAP 유전자의 발현을 저해할 만큼 충분한 용량(dosage)으로 투여된다. 본 발명자들은 본 발명의 dsRNA를 함유하는 조성물이 향상된 효능으로 인하여, 놀랍도록 낮은 용량으로 투여될 수 있다는 것을 확인하였다. 일일 수용자 체중 ㎏당 5 ㎎ dsRNA의 최대 용량(maximum dosage)은 SCAP 유전자의 발현을 저해하거나 완전히 억제하는데 충분하다.
일반적으로, dsRNA의 적절한 (1회)분량(dose)은 일일 수용자 체중 ㎏당 0.01 ㎍ 내지 5.0 ㎎, 바람직하게는, 일일 체중 ㎏당 1 ㎍ 내지 1 ㎎ 범위 내에 존재한다. 이러한 제약학적 조성물은 일일 1회 투여되고, 또는 dsRNA는 하루 동안 적절한 간격에서 2회, 3회, 또는 그 이상의 하위-분량(sub-dose)으로 투여되거나, 또는 연속 주입(continuous infusion) 또는 통제된 방출 제제(controlled release formulation)를 통한 전달을 이용하여 투여될 수 있다. 이러한 경우에, 각 하위-분량에 포함된 dsRNA는 총 일일 용량(total daily dosage)을 달성하기 위하여 더욱 적어야 한다. 투약 단위(dosage unit)는 예로써, 수일 기간 동안 dsRNA의 서방(sustained release)을 제공하는 전통적인 서방 제제(sustained release formulation)를 이용하여 수일간 전달용으로 합성될 수도 있다. 서방 제제는 당분야에 널리 공지되어 있고, 특히, 본 발명의 작용제의 경우에서처럼, 질 전달(vaginal delivery)에 유용하다. 이러한 구체예에서, 투약 단위는 일일 분량(daily dose)의 상응하는 배량(multiple)을 포함한다.
당업자가 인지하는 바와 같이, 질환이나 질병의 심각도(severity), 기존의 치료, 개체의 전반적인 건강 및/또는 연령 및 존재하는 다른 질환이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 특정 인자가 개체를 효과적으로 치료하기 위하여 요구되는 용량과 기간에 영향을 줄 수 있다. 게다가, 조성물의 치료 효과량으로 개체의 치료는 단일 치료 또는 일련의 치료를 포함할 수 있다. 본 발명에 의해 포섭되는 개별 dsRNA에 대한 효과량(effective dosage)과 생체내 반감기(in vivo half-life)의 평가는 본 명세서에 기술된 바와 같이, 전통적인 방법을 이용하여, 또는 적절한 동물 모형(animal model)을 이용한 생체내 검사(in vivo testing)에 기초하여 달성될 수 있다.
유전학에서 진전으로, 다양한 인간 질환, 예를 들면, SCAP 발현에 의해 매개되는 병리학적 과정의 연구를 위한 다수의 실험실 동물 모형(laboratory animal model)이 산출되었다. 이들 모형은 dsRNA의 생체내 검사 및 치료 효과량 결정에 이용된다.
본 발명에는 본 발명의 dsRNA 화합물을 함유하는 제약학적 조성물과 제제 역시 포함된다. 본 발명의 제약학적 조성물은 국소 또는 전신 치료가 요구되는 지의 여부 및 치료되는 부위에 따라, 다양한 방식으로 투여될 수 있다. 투여는 국소(local) 투여, 예로써 분무기(nebulizer)에 의한 분말이나 에어로졸(aerosol)의 흡입(inhalation 또는 insufflation)에 의한 폐 투여, 기관내(intratracheal) 투여, 비강내(intranasal) 투여, 상피(epidermal)와 경피(transdermal) 투여, 경구(oral) 투여 또는 비경구(parenteral) 투여가 포함된다. 비경구 투여에는 정맥내(intravenous), 동맥내(intraarterial), 피하(subcutaneous), 복강내(intraperitoneal) 또는 근육내(intramuscular) 주사(injection) 또는 주입(infusion); 또는 두개내(intracranial), 예를 들면, 수막강내(intrathecal) 또는 뇌실내(intraventricular) 투여가 포함된다.
국소 투여용 제약학적 조성물과 제제에는 경피 패치(transdermal patch), 연고(ointment), 로션(lotion), 크림(cream), 겔(gel), 점안약(drop), 좌약(suppository), 스프레이(spray), 지질과 분말이 포함된다. 전통적인 제약학적 담체, 수성, 분말 또는 유성 기부(base), 농후제(thickener) 등이 필요하거나 바람직할 수 있다. 코팅된 콘돔(condom), 장갑(glove) 등이 유용할 수도 있다. 바람직한 국소 제제에는 본 발명의 dsRNA가 국소 전달제(topical delivery agent), 예를 들면, 지질, 리포좀(liposome), 지방산, 지방산 에스테르, 스테로이드, 킬레이트화제(chelating agent)와 계면활성제(surfactant)와 혼합된 것들이 포함된다. 바람직한 지질과 리포좀에는 중성(가령, 디올레오일포스파티딜 에탄올아민(dioleoylphosphatidyl ethanolamine) = DOPE, 디미리스토일포스파티딜 콜린(dimyristoylphosphatidyl choline) = DMPC, 디스테아로일포스파티딜 콜린(distearolyphosphatidyl choline)), 음성(가령, 디미리스토일포스파티딜 글리세롤(dimyristoylphosphatidyl glycerol) = DMPG)과 양이온성(가령, 디올레오일테트라메틸아미노프로필(dioleoyltetramethylaminopropyl) = DOTAP 및 디올레오일프로필 트리메틸암모늄 염화물(dioleoylpropyl trimethylammonium cloride) = DOTMA)이 포함된다. 본 발명의 dsRNA는 리포좀 내에서 캡슐화되거나, 또는 상기 리포좀, 특히, 양이온성 리포좀에 복합체를 형성할 수 있다.
대안으로, dsRNA는 지질, 특히, 양이온성 지질에 복합될 수도 있다. 바람직한 지방산과 에스테르에는 아라키돈산(arachidonic acid), 올레산(oleic acid), 에이코사노산(eicosanoic acid), 라우르산(lauric acid), 카프릴산(caprylic acid), 카프르산(capric acid), 미리스트산(myristic acid), 팔미트산(palmitic acid), 스테아르산(stearic acid), 리놀레산(linoleic acid), 리놀렌산(linolenic acid), 디카프레이트(dicaprate), 트리카프레이트(tricaprate), 모노올레인(monoolein), 딜라우린(dilaurin), 글리세릴 1-모노카프레이트(glyceryl 1-monocaprate), 1-도데실아자사이클로헵탄-2-원(1-dodecylazacycloheptan-2-one), 아실카르니틴(acylcarnitine), 아실콜린(acylcholine), 또는 C1-10 알킬 에스테르(가령, 이소프로필미리스테이트 IPM), 모노글리세리드(monoglyceride), 디글리세리드(diglyceride) 또는 이의 제약학적으로 허용되는 염이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 국소 제제는 1999년 5월 20일 제출된 U.S. 특허 출원 No. 09/315,298에서 상세하게 기술된다.
경구 투여용 조성물과 제제에는 분말 또는 과립, 마이크로미립자(microparticulate), 나노미립자(nanoparticulate), 물이나 비-수성 매체(non-aqueous media)에서 현탁액이나 용액, 캡슐(capsule), 겔 캡슐(gel capsule), 향가루(sachet), 정제(tablet) 또는 미니정제(minitablet)가 포함된다. 농후제, 방향제, 희석제, 유화제, 분산 보조제(dispersing aid) 또는 접합제가 바람직하다. 바람직한 경구 제제는 본 발명의 dsRNA가 하나 이상의 침투 강화제(penetration enhancer), 계면활성제(surfactant), 킬레이터(chelator)와 공동으로 투여되는 것들이다. 바람직한 계면활성제에는 지방산 및/또는 에스테르 또는 이의 염, 담즙산 및/또는 이의 염이 포함된다. 바람직한 담즙산/염에는 케노데옥시콜릭산(chenodeoxycholic acid, CDCA)과 우르소데옥시케노데옥시콜릭산(ursodeoxychenodeoxycholic acid, UDCA), 콜릭산(cholic acid), 디하이드로콜릭산(dehydrocholic acid), 데옥시콜릭산(deoxycholic acid), 글루콜릭산(glucholic acid), 글리콜릭산(glycholic acid), 글리코데옥시콜릭산(glycodeoxycholic acid), 타우로콜릭산(taurocholic acid), 타우로데옥시콜릭산(taurodeoxycholic acid), 나트륨 타우로-24,25-디하이드로-푸시데이트(sodium tauro-24,25-dihydro-푸시데이트)와 나트륨 글리코디하이드로푸시데이트(sodium glycodihydro푸시데이트)가 포함된다. 바람직한 지방산에는 아라키돈산(arachidonic acid), 운데칸산(undecanoic acid), 올레산(oleic acid), 라우르산(lauric acid), 카프릴산(caprylic acid), 카프르산(capric acid), 미리스트산(myristic acid), 팔미트산(palmitic acid), 스테아르산(stearic acid), 리놀레산(linoleic acid), 리놀렌산(linolenic acid), 디카프레이트(dicaprate), 트리카프레이트(tricaprate), 모노올레인(monoolein), 딜라우린(dilaurin), 글리세릴 1-모노카프레이트(glyceryl 1-monocaprate), 1-도데실아자사이클로헵탄-2-원(1-dodecylazacycloheptan-2-one), 아실카르니틴(acylcarnitine), 아실콜린(acylcholine), 또는 모노글리세리드(monoglyceride), 디글리세리드(diglyceride) 또는 이의 제약학적으로 허용되는 염(가령, 나트륨)이 포함된다. 또한, 침투 강화제의 조합, 예를 들면, 담즙산/염과의 조합으로 지방산/염이 바람직하다. 특히 바람직한 조합은 라우르산, 카프르산과 UDCA의 나트륨 염이다. 다른 침투 강화제에는 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르(polyoxyethylene-9-lauryl ether), 폴리옥시에틸렌-20-세틸 에테르(polyoxyethylene-20-cetyl ether)가 포함된다. 본 발명의 dsRNA는 경구 전달되거나, 분무 건조된 입자를 비롯한 과립 형태(granular form)로 전달되거나, 또는 복합되어 마이크로입자 또는 나노입자를 형성한다. dsRNA 복합제(complexing agent)에는 폴리-아미노산(poly-amino acid); 폴리이민(polyimine); 폴리아크릴레이트(polyacrylate); 폴리알킬아크릴레이트(polyalkylacrylate), 폴리옥세탄(polyoxethane), 폴리알킬시아노아크릴레이트(polyalkylcyanoacrylate); 양이온화된 젤라틴(cationized gelatin), 알부민(albumin), 전분(starch), 아크릴레이트(acrylate), 폴리에틸렌글리콜(PEG)과 전분; 폴리알킬시아노아크릴레이트(polyalkylcyanoacrylate); DEAE-유도체화된 폴리이민(polyimine), 폴룰란(pollulan), 셀룰로오스와 전분이 포함된다. 특히 바람직한 복합제에는 키토산(chitosan), N-트리메틸키토산(N-trimethylchitosan), 폴리-L-리신(poly-L-lysine), 폴리히스티딘(polyhistidine), 폴리오르니틴(polyornithine), 폴리스페르민(polyspermine), 프로타민(protamine), 폴리비닐피리딘(polyvinylpyridine), 폴리티오디에틸아미노메틸에틸렌(polythiodiethylaminomethylethylene) P(TDAE), 폴리아미노스티렌(polyaminostyrene)(가령, p-아미노), 폴리(메틸시아노아크릴레이트)(poly(methylcyanoacrylate)), 폴리(에틸시아노아크릴레이트)(poly(ethylcyanoacrylate)), 폴리(부틸시아노아크릴레이트)(poly(butylcyanoacrylate)), 폴리(이소부틸시아노아크릴레이트)(poly(isobutylcyanoacrylate)), 폴리(이소헥실시아노아크릴레이트)(poly(isohexylcynaoacrylate)), DEAE-메타크릴레이트(methacrylate), DEAE-헥실아크릴레이트(hexylacrylate), DEAE-아크릴아마이드(acrylamide), DEAE-알부민(albumin)과 DEAE-덱스트란(dextran), 폴리메틸아크릴레이트(polymethylacrylate), 폴리헥실아크릴레이트(polyhexylacrylate), 폴리(D,L-락트산), 폴리(DL-락틱-co-글리콜산)(PLGA), 알기네이트(alginate)와 폴리에틸렌글리콜(PEG)이 포함된다. dsRNA와 이들의 제조물에 대한 경구 제제는 U.S. 출원 No. 08/886,829(1997년 7월 1일 제출됨), No. 09/108,673(1998년 7월 1일 제출됨), No. 09/256,515(1999년 2월 23일 제출됨), No. 09/082,624(1998년 5월 21일 제출됨)와 No. 09/315,298(1999년 5월 20일 제출됨)에서 상세하게 기술된다.
비경구, 수막강내 또는 뇌실내 투여용 조성물과 제제에는 무균 수용액(sterile aqueous solution)이 포함되는데, 이는 완충제(buffer), 희석제(diluent)와 다른 적절한 첨가제, 예를 들면, 침투 강화제, 담체 화합물과 다른 제약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 함유할 수도 있다.
본 발명의 제약학적 조성물에는 용액, 에멀젼(emulsion)과 리포좀-함유 제제가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 이들 조성물은 미리 형성된 액체, 자가-유화 고체(self-emulsifying solid)와 자가-유화 반고체(self-emulsifying semisolid)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 다양한 성분으로 산출될 수 있다.
본 발명의 제약학적 제제는 단위 제형(unit dosage form)으로 편의하게 제공될 수 있고, 제약업계에 널리 공지된 통상적인 기술에 따라 제조될 수 있다. 이들 기술은 활성 성분을 제약학적 담체 또는 부형제와 혼합하는 단계를 포함한다. 일반적으로, 이들 제제는 활성 성분을 액상 담체 또는 미세하게 분할된 고형 담체 또는 둘 모두와 균일하고 친밀하게 혼합하고, 이후 필요한 경우에, 산물을 성형함으로써 제조된다.
본 발명의 조성물은 다수의 가능한 제형, 예를 들면, 정제(tablet), 캡슐(capsule), 겔 캡슐(gel capsule), 액상 시럽(liquid syrup), 연성 겔(soft gel), 좌약(suppository)과 관장제(enema)로 제제화될 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한, 수성, 비-수성 또는 혼성 매체에서 현탁액으로서 제제화될 수도 있다. 수성 현탁액은 예로써, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 소르비톨 및/또는 덱스트란을 비롯한 현탁액의 점성(viscosity)을 증가시키는 물질을 더욱 함유할 수도 있다. 현탁액은 또한, 안정화제(stabilizer)를 함유할 수도 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 제약학적 조성물은 거품으로서 제조되고 이용된다. 제약학적 거품(pharmaceutical foam)에는 에멀젼(emulsion), 마이크로에멀젼(microemulsion), 크림(cream), 젤리(jelly)와 리포좀(liposome)이 포함되지만 이들에 국한되지 않은 제제가 포함된다. 특성에서 기본적으로 유사하긴 하지만, 이들 제제는 최종 산물(final product)의 성분과 경도(consistency)에서 달라진다. 이런 조성물과 제제의 제조는 일반적으로, 제약과 제제 분야의 당업자에게 공지되어 있고, 본 발명의 조성물의 제조에 적용될 수 있다.
에멀젼
본 발명의 조성물은 에멀젼으로 제조되고 제제화될 수 있다. 에멀젼은 전형적으로, 0.1 ㎛ 직경을 초과하는 액적(droplet) 형태로, 한 액체에 분산된 다른 액체의 이질성 시스템(heterogenous system)이다(Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Volume 1, p. 245; Block in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 2, p. 335; Higuchi et al., in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 301). 에멀젼은 종종, 서로 친밀하게 혼합되고 분산되는 2가지 혼화불가능(immiscible) 액상(liquid phase)을 포함하는 이중상 시스템(biphasic system)이다. 일반적으로, 에멀젼은 유중수(water-in-oil)(w/o) 또는 수중유(oil-in-water)(o/w) 분류이다. 수상이 대량 유상(oily phase) 내로 미세하게 분할되고 미세 액적으로서 분산되면, 생성된 조성물은 유중수(w/o) 에멀젼으로 불린다. 대안으로, 유상이 대량 수상 내로 미세하게 분할되고 미세 액적으로서 분산되면, 생성된 조성물은 수중유(o/w) 에멀젼으로 불린다. 에멀젼은 이들 분산된 상 이외에 추가의 성분 및 수상 또는 유상에서 용액으로, 또는 별개의 상으로 존재하는 활성 약물을 함유할 수도 있다. 제약학적 부형제, 예를 들면, 유화제, 안정화제, 염료와 항-산화제 역시 필요에 따라, 에멀젼 내에 존재할 수 있다. 제약학적 에멀젼은 예로써, 유중수중유(oil-in-water-in-oil)(o/w/o)와 수중유중수(water-in-oil-in-water)(w/o/w) 에멀젼의 경우에서처럼, 2개 이상의 상으로 구성되는 복수 에멀젼일 수도 있다. 이런 복합 제제는 종종, 단순한 이가 에멀젼이 갖지 못하는 특정의 이점을 제공한다. o/w 에멀젼의 개별 오일 액적이 작은 물 액적(water droplet)을 둘러싸고 있는 복수 에멀젼이 w/o/w 에멀젼를 구성한다. 유사하게, 오일 연속 상(oily continuous phase) 내에 안정화된 물의 소구체(globule)에 내포된 오일 액적의 시스템은 o/w/o 에멀젼을 제공한다.
에멀젼은 열역학적 안정성(thermodynamic stability)이 거의 또는 전혀 없는 것으로 특징된다. 종종, 에멀젼의 분산된 또는 불연속 상은 외부 또는 연속 상 내로 충분히 분산되고, 유화제 또는 상기 제제의 점성을 통하여 이러한 형태로 유지된다. 에멀젼의 이들 상 중에서 한쪽은 에멀젼-스타일 연고 기부(ointment base)와 크림의 경우에서처럼, 반고체 또는 고체이다. 에멀젼을 안정화시키는 다른 수단은 에멀젼의 한쪽 상 내로 통합되는 유화제의 이용을 수반한다. 유화제는 크게 4가지 부류로 분류될 수 있다: 합성 계면활성제, 자연 발생 유화제, 흡수 기부(absorption base)와 미세하게 분산된 고체(Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199).
표면 활성제(surface active agent)로 알려져 있는 합성 계면활성제는 에멀젼의 제제에서 폭넓게 이용되고 있고, 기존 문헌에서 재고되었다(Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, volume 1, p. 199). 계면활성제는 전형적으로, 친양쪽성(amphiphilic)이고 친수성(hydrophilic)과 소수성(hydrophobic) 부분을 포함한다. 계면활성제의 친수성 대 소수성의 비율은 HLB(hydrophile/lipophile balance)로 지칭되고, 제제의 제조에서 계면활성제를 분류하고 선택하는데 귀중한 도구이다. 계면활성제는 친수성 기의 특성: 비이온성(nonionic), 음이온성(anionic), 양이온성(cationic)과 양쪽성(amphoteric)에 기초하여 상이한 부류로 분류될 수 있다(Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285).
에멀젼 제제에 이용되는 자연 발생 유화제에는 라놀린(lanolin), 밀랍(beeswax), 포스파티드(phosphatide), 레시틴(lecithin)과 아카시아(acacia)가 포함된다. 흡수 기부, 예를 들면, 무수성 라놀린(anhydrous lanolin)과 친수성 바셀린(hydrophilic petrolatum)은 친수성을 보유하고, 따라서 이들은 물을 빨아들여 w/o 에멀젼을 형성하면서도 그들의 반고체 경도(semisolid consistency)를 유지할 수 있다. 미세하게 분할된 고체 역시 특히, 계면활성제와의 조합으로 점성 제조물에서 우수한 유화제로서 이용되고 있다. 이들에는 극성 무기 고체, 예를 들면, 중금속 수산화물(heavy metal hydroxide), 비-팽창 점토(non-swelling clay), 예를 들면, 벤토나이트(bentonite), 애타플자이트(attapulgite), 헥토리트(hectorite), 카올린(kaolin), 몬모릴로나이트(montmorillonite), 콜로이드성 알루미늄 실리케이트(colloidal aluminum silicate)와 콜로이드성 마그네슘 알루미늄 실리케이트(colloidal magnesium aluminum silicate), 색소와 비극성 고체, 예를 들면, 탄소 또는 글리세릴 트리스테아르산염(glyceryl tristearate)이 포함된다.
다양한 비-유화 물질(non-emulsifying material) 역시 에멀젼 제제에 포함되고 에멀젼의 특성에 기여한다. 이들에는 지방(fat), 오일(oil), 왁스(wax), 지방산(fatty acid), 지방 알코올(fatty alcohol), 지방 에스테르(fatty ester), 습윤제(humectant), 친수성 콜로이드(hydrophilic colloid), 보존제(preservative)와 항산화제(antioxidant)가 포함된다(Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199).
친수성 콜로이드(hydrophilic colloid) 또는 하이드로콜로이드(hydrocolloid)에는 자연 발생 검(gum)과 합성 폴리머, 예를 들면, 폴리사카라이드(가령, 아카시아(acacia), 아가(agar), 알긴산(alginic acid), 카라게닌(carrageenan), 구아 검(guar gum), 카라야 검(karaya gum)과 트래거캔스(tragacanth)), 셀룰로오스 유도체(가령, 카로복시메틸셀룰로오스(carboxymethylcellulose)와 카르복시프로필셀룰로오스(carboxypropylcellulose))와 합성 폴리머(가령, 카르보머(carbomer), 셀룰로오스 에테르(cellulose ether)와 카르복시비닐 폴리머(carboxyvinyl polymer))가 포함된다. 이들은 물에서 분산하거나 팽창하여 콜리이드성 용액을 형성하는데, 이는 분산된-상 액적 주변에 강한 계면 필름(interfacial film)을 형성하고 외부 상(external phase)의 점성을 증가시킴으로써 에멀젼을 안정화시킨다.
에멀젼이 종종, 미생물(microbe)의 성장을 용이하게 뒷받침하는 탄수화물, 단백질, 스테로이드와 포스파티드와 같은 다수의 성분을 함유하기 때문에, 이들 제제는 종종, 보존제를 포함한다. 에멀젼 제제에 포함되는 통상적으로 이용되는 보존제에는 메틸 파라벤(methyl paraben), 프로필 파라벤(propyl paraben), 4급 암모늄 염(quaternary ammonium salt), 벤잘코늄 염화물(benzalkonium chloride), p-하이드록시벤조산의 에스테르와 붕산(boric acid)이 포함된다. 항산화제 역시 에멀젼 제제의 악화를 예방하기 위하여 상기 제제에 통상적으로 첨가된다. 이용되는 항산화제는 유리 라디칼 소거제(free radical scavenger), 예를 들면, 토코페롤(tocopherol), 알킬 몰식자산염(alkyl gallate), 부틸화된 하이드록시아니솔(butylated hydroxyanisole), 부틸화된 하이드록시톨루엔(butylated hydroxytoluene), 또는 환원제(reducing agent), 예를 들면, 아스코르브산(ascorbic acid)과 나트륨 메타비아황산염(sodium metabisulfite) 및 항산화 상승제(antioxidant synergist), 예를 들면, 구연산(citric acid), 주석산(tartaric acid)과 레시틴(lecithin)이다.
피부, 경구와 비경구 경로를 통한 에멀젼 제제의 적용 및 이들의 제조 방법은 기존 문헌에서 재고되었다(Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199). 경구 전달용 에멀젼 제제는 제조의 용이함 및 흡수와 생체이용효율(bioavailability) 관점으로부터 효능으로 인하여 매우 폭넓게 이용되고 있다(Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199). 미네랄 오일 기부(mineral-oil base) 하제(laxative), 지용성(oil-soluble) 비타민과 고지방 영양 제조물은 통상적으로, o/w 에멀젼으로서 경구로 투여되고 있는 물질들이다.
본 발명의 한 구체예에서, dsRNA와 핵산의 조성물은 마이크로에멀젼(microemulsion)으로 제제화된다. 마이크로에멀젼은 광학적으로 균등성(isotropic)이고 열역학적으로 안정한 단일 액상 용액인, 물, 오일과 친양쪽체(amphiphile)의 시스템으로 정의된다(Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245). 전형적으로, 마이크로에멀젼은 먼저, 오일을 수성 계면활성 용액(aqueous surfactant solution) 내로 분산시키고, 이후 충분한 양의 네 번째 성분, 일반적으로, 투명 시스템(transparent system)을 형성하는 중간 사슬-길이 알코올을 첨가함으로써 제조되는 시스템이다. 이런 이유로, 마이크로에멀젼 역시 표면 활성 분자의 계면 필름(interfacial film)에 의해 안정화되는 2개의 혼화불가능 액체의 열역학적으로 안정하고 균등성으로 투명한 분산액으로 기술되었다(Leung and Shah, in: Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, New York, pages 185-215). 마이크로에멀젼은 통상적으로, 오일, 물, 계면활성제, 보조계면활성제와 전해질(electrolyte)을 포함하는 3가지 내지 5 성분의 조합을 통하여 제조된다. 마이크로에멀젼이 유중수(w/o) 또는 수중유(o/w) 타입인지의 여부는 이용되는 오일과 계면활성제의 특성 및 계면활성제 분자의 극성 머리(polar head)와 탄화수소 꼬리(hydrocarbon tail)의 구조와 기하학적 포장(geometric packing)에 좌우된다(Schott, in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 271).
상 다이어그램(phase diagram)을 이용하는 현상학적 접근법은 광범위하게 연구되고 있고, 마이크로에멀젼을 어떻게 제조하는 지에 관한 폭넓은 지식을 당업자에게 제공하고 있다(Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245; Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335). 전통적인 에멀젼과 비교하여, 마이크로에멀젼은 자발적으로 형성되는 열역학적으로 안정한 액적의 제제에 불수용성(water-insoluble) 약물을 용해시키는 이점을 제공한다.
마이크로에멀젼의 제조에 이용되는 계면활성제에는 단독으로 또는 보조계면활성제와의 조합으로, 이온성 계면활성제, 비-이온성 계면활성제, Brij 96, 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르(polyoxyethylene oleyl ether), 폴리글리세롤 지방산 에스테르(polyglycerol fatty acid ester), 테트라글리세롤 모놀라우레이트(tetraglycerol monolaurate)(ML310), 테트라글리세롤 모노올레에이트(tetraglycerol monooleate)(MO310), 헥사글리세롤 모노올레에이트(hexaglycerol monooleate)(PO310), 헥사글리세롤 펜타올레에이트(hexaglycerol pentaoleate)(PO500), 데카글리세롤 모노카프레이트(decaglycerol monocaprate)(MCA750), 데카글리세롤 모노올레에이트(decaglycerol monooleate)(MO750), 데카글리세롤 세퀴올레에이트(decaglycerol sequioleate)(SO750), 데카글리세롤 데카올레에이트(decaglycerol decaoleate)(DAO750)가 포함된다. 보조계면활성제, 통상적으로, 짧은 사슬 알코올(short-chain alcohol), 예를 들면, 에탄올(ethanol), 1-프로판올(1-propanol)과 1-부탄올(1-butanol)은 계면활성제 필름 내로 침투하고, 결과적으로, 계면활성제 분자 사이에 만들어진 빈 공간으로 인하여 무질서한 필름을 발생시킴으로써 계면 유동성(interfacial fluidity)을 증가시키는 역할을 한다. 하지만, 마이크로에멀젼은 보조계면활성제의 이용 없이 제조될 수도 있는데, 알코올-없는 자가-유화 마이크로에멀젼 시스템이 당분야에 공지되어 있다. 수상은 전형적으로, 물, 약물의 수용액, 글리세롤, PEG300, PEG400, 폴리글리세롤, 프로필렌 글리콜과 에틸렌 글리의 유도체이지만 이들에 국한되지 않는다. 유상은 Captex 300, Captex 355, Capmul MCM, 지방산 에스테르, 중간 사슬(C8-C12) 모노-, 디-와 트리-글리세리드, 폴리옥시에틸화된 글리세릴 지방산 에스테르, 지방 알코올, 폴리글리콜화된 글리세리드, 포화된 폴리글리콜화된 C8-C10 글리세리드, 식물성 오일과 실리콘 오일(silicone oil)과 같은 물질이지만 이들에 국한되지 않는다.
마이크로에멀젼은 약물 용해화(drug solubilization)와 강화된 약물 흡수의 관점에서 특히 주목된다. 지질 기초된 마이크로에멀젼(o/w와 w/o 둘 모두)은 펩티드를 비롯한 약물의 경구 생체이용효율(oral bioavailability)을 강화시키는 것으로 제안되었다(Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390; Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205). 마이크로에멀젼은 향상된 약물 용해도, 효소 가수분해(enzymatic hydrolysis)로부터 약물의 보호, 막 유동성(fluidity)과 침투성(permeability)에서 계면활성제-유도된 변화에 기인한 약물 흡수의 가능한 향상, 제조의 용이함, 고형 제형(solid dosage form)에 비하여 경구 투여의 용이함, 향상된 임상적 효능(clinical potency)과 감소된 독성(toxicity)의 이점을 제공한다(Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385; Ho et al., J. Pharm. Sci., 1996, 85, 138-143). 종종, 마이크로에멀젼은 그들의 성분이 실온에서 합쳐지면 자발적으로 형성된다. 이는 열분안정(thermolabile) 약물, 펩티드 또는 dsRNA를 제제화할 때 특히 유익하다. 마이크로에멀젼은 미용학적 적용과 제약학적 적용 모두에서 활성 성분의 경피 전달(transdermal delivery)에도 효과적이다. 본 발명의 마이크로에멀젼 조성물과 제제는 위장관(gastrointestinal tract)으로부터 dsRNA와 핵산의 증가된 전신 흡수를 촉진하고, 위장관, 질(vagina), 구강(buccal cavity)과 다른 투여 부위 내에서 dsRNA와 핵산의 국소 세포 흡입을 개선할 것으로 기대된다.
본 발명의 마이크로에멀젼은 또한, 제제의 특성을 향상시키고 본 발명의 dsRNA와 핵산의 흡수를 강화시키기 위하여, 소르비탄 모노스테아르산염(sorbitan monostearate)(Grill 3), 라브라솔(Labrasol)과 침투 강화제(penetration enhancer)와 같은 추가의 성분과 보조제(additive)를 함유할 수 있다. 본 발명의 마이크로에멀젼에 이용되는 침투 강화제는 5가지 대부류: 계면활성제, 지방산, 담즙산염, 킬레이트화제와 비-킬레이트화 비-계면활성제 중에서 하나에 속하는 것으로 분류된다(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92). 이들 분류 각각은 앞서 언급되었다.
리포좀
약물의 제제화를 위하여 연구되고 이용되고 있는, 마이크로에멀젼 이외에 다수의 조직화된 계면활성제 구조가 존재한다. 이들에는 단일층(monolayer), 교질입자(micelle), 이중층(bilayer)과 소포(vesicle)가 포함된다. 소포, 예를 들면, 리포좀은 약물 전달(drug delivery)의 관점에서 그들이 제공하는 특이성(specificity)과 작용 지속 기간으로 인하여 많은 주목을 받고 있다. 본 명세서에서, "리포좀"은 구형 이중층 내에 정렬된 친양쪽성 지질로 구성되는 소포를 의미한다.
리포좀은 친유성(lipophilic) 물질과 수성 내부로부터 형성된 막을 보유하는 단일막(unilamellar) 또는 다중막(multilamellar) 소포이다. 수성 부분은 전달되는 조성물을 함유한다. 양이온성 리포좀은 세포 벽에 융합할 수 있는 이점을 갖는다. 비-양이온성 리포좀은 세포 벽과 효율적으로 융합할 수 없긴 하지만, 생체내에서 대식세포(macrophage)에 의해 빨려 들어간다.
본래대로의 포유동물 피부를 교차하기 위하여, 지질 소포는 적절한 경피 농도구배(transdermal gradient)의 영향 하에, 50 nm 이하의 직경을 갖는 일련의 미세한 구멍을 통과해야 한다. 이런 이유로, 고도로 변형가능하고 이런 미세한 구멍을 통과할 수 있는 리포좀을 이용하는 것이 바람직하다.
리포좀의 다른 이점은 아래와 같다; 자연 인지질로부터 획득된 리포좀은 생체적합성(biocompatible)과 생분해성(biodegradable)이다; 리포좀은 넓은 범위의 수용성과 지용성 약물을 통합할 수 있다; 리포좀은 그들의 내부 구획(internal compartment)에 내포된 약물을 물질대사와 분해로부터 보호할 수 있다(Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245). 리포좀 제제의 제조에서 중요한 고려사항은 지질 표면 전하, 소포 크기와 리포좀의 수성 용적(aqueous volume)이다.
리포좀은 작용 부위로 활성 성분의 전달에 유용하다. 리포좀 막이 생물학적 막에 구조적으로 유사하기 때문에, 리포좀이 조직에 적용될 때, 이들 리포좀은 세포 막과 합체하기 시작하고, 리포좀과 세포의 합체가 진행됨에 따라, 리포좀 내용물은 활성 성분이 작용하는 세포 내로 흘러 들어간다.
리포좀 제제는 다수 약물에 대한 전달 양식으로서 집중적으로 연구되고 있다. 더욱 증가하는 증거를 통하여, 국소 투여의 경우에, 리포좀이 다른 제제에 비하여 여러 이점을 제공하는 것으로 증명되고 있다. 이런 이점에는 공급된 약물의 높은 전신 흡수에 관련된 감소된 부작용, 원하는 표적에서 공급된 약물의 증가된 축적 및 다양한 친수성과 소수성 약물을 피부 내로 공급하는 능력이 포함된다.
여러 보고서에서 고분자량(high-molecular weight) DNA를 비롯한 작용제를 피부 내로 전달하는 리포좀의 능력을 상세하게 보고하였다. 진통제, 항체, 호르몬과 고분자량 DNA를 비롯한 화합물이 피부에 투여되고 있다. 대부분의 적용에서 상면 표피(upper epidermis)가 표적되었다.
리포좀은 2가지 대분류로 구분된다. 양이온성 리포좀은 음전하를 띠는 DNA 분자와 상호작용하여 안정한 복합체를 형성하는 양전하를 띠는 리포좀이다. 양전하를 띠는 DNA/리포좀 복합체는 음전하를 띠는 세포 표면에 결합하고 엔도솜(endosome) 내부로 들어간다. 엔도솜 내에서 산성 pH로 인하여, 리포좀이 파열되고, 그들의 내용물이 세포 세포질(cytoplasm) 내로 방출된다(Wang et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, 147, 980-985).
pH-감수성이거나 또는 음전하를 띠는 리포좀은 DNA와 복합되기 보다는 DNA를 포획한다. DNA와 지질 둘 모두 유사한 전하를 띠기 때문에, 복합체 형성보다는 척력(repulsion)이 발생한다. 그럼에도 불구하고, 일부 DNA는 이들 리포좀의 수성 내부에 포획된다. pH-감수성 리포좀은 티미딘 키나아제(thymidine kinase) 유전자를 인코딩하는 DNA를 배양 중인 세포 단층으로 전달하는데 이용되고 있다. 외인성 유전자의 발현이 표적 세포에서 탐지되었다(Zhou et al., Journal of Controlled Release, 1992, 19, 269-274).
리포좀 조성물의 한 가지 주요 형태에는 자연적으로 유도된 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine) 이외의 인지질이 포함된다. 중성 리포좀 조성물은 예로써, 디미리스토일 포스파티딜콜린(dimyristoyl phosphatidylcholine, DMPC) 또는 디팔미토일 포스파티딜콜린(dipalmitoyl phosphatidylcholine, DPPC)으로부터 형성될 수 있다. 음이온성 리포좀 조성물은 일반적으로, 디미리스토일 포스파티딜글리세롤로부터 형성되고, 음이온성 융해성(fusogenic) 리포좀은 주로, 디올레오일 포스파티딜에탄올아민(DOPE)으로부터 형성된다. 다른 유형의 리포좀 조성물은 포스파티딜콜린(PC), 예를 들면, 콩 PC와 계란 PC로부터 형성된다. 다른 유형은 인지질 및/또는 포스파티딜콜린 및/또는 콜레스테롤의 혼합물로부터 형성된다.
여러 연구에서는 피부로 리포좀 약물 제제의 국소 전달을 평가하였다. 기니 피그(guinea pig) 피부에 인터페론-포함 리포좀의 적용은 피부 포진 상처(skin herpes sore)의 감소를 결과하는 반면, 다른 수단(가령, 용액 또는 에멀젼으로서)을 통한 인터페론의 전달은 무효하였다(Weiner et al., Journal of Drug Targeting, 1992, 2, 405-410). 더 나아가, 다른 검사에서 수성 시스템(aqueous system)을 이용한 인터페론의 투여에 리포좀 제제의 일부로서 투여된 인터페론의 효능을 조사하고, 이러한 리포좀 제제가 수성 투여(aqueous administration)보다 우수하다고 결론하였다(du Plessis et al., Antiviral Research, 1992, 18, 259-265).
비-이온성 리포좀 시스템, 특히, 비-이온성 계면활성제와 콜레스테롤을 함유하는 시스템 역시 피부로 약물의 전달에서 유용성을 조사하였다. Novasome.TM. I(글리세릴 디라우레이트/콜레스테롤/폴리옥시에틸렌-10-스테아릴 에테르)와 Novasome.TM. II(글리세릴 디스테아르산염/콜레스테롤/폴리옥시에틸렌-10-스테아릴 에테르)를 함유하는 비-이온성 리포좀 제제가 사이클로스포린-A를 생쥐 피부의 진피(dermis)로 전달하는데 이용되었다. 결과는 이런 비-이온성 리포좀 시스템이 피부의 상이한 층 내로 사이클로스포린-A의 침착(deposition)을 촉진하는데 효과적이었다(Hu et al. S.T.P.Pharma. Sci., 1994, 4, 6, 466).
리포좀에는 또한, "입체구조적으로 안정화된" 리포좀이 포함되는데, 상기 용어는 본 명세서에서, 리포좀 내로 통합될 때, 특수한 지질이 없는 리포좀과 비교하여 강화된 순환 수명(circulation lifetime)을 결과하는 하나 이상의 특수한 지질을 함유하는 리포좀을 지칭한다. 입체구조적으로 안정화된 리포좀의 실례는 리포좀의 소포-형성 지질 부분의 일부가 (A) 하나 이상의 당지질(glycolipid), 예를 들면, 모노시알로강글리오시드(monosialoganglioside) Gm1을 포함하거나, 또는 (B) 하나 이상의 친수성 폴리머, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 모이어티(moiety)로 유도체화되는 것들이다. 특정 이론에 한정됨 없이, 최소한, 강글리오시드(ganglioside), 스핑고미엘린(sphingomyelin), 또는 PEG-유도체화된 지질을 포함하는 입체구조적으로 안정화된 리포좀의 경우에, 이들 입체구조적으로 안정화된 리포좀의 강화된 순환 반감기(circulation half-life)는 세망내피계(reticuloendothelial system, RES)의 세포 내로 감소된 흡입으로부터 유래된다(Allen et al., FEBS Letters, 1987, 223, 42; Wu et al., Cancer Research, 1993, 53, 3765).
하나 이상의 당지질을 함유하는 다양한 리포좀이 당분야에 공지되어 있다. Papahadjopoulos et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1987, 507, 64에서는 리포좀의 혈중 반감기(blood half-life)를 향상시키는 모노시알로강글리오시드 Gm1, 갈락토세레브로시드 황산염(galactocerebroside sulfate)과 포스파티딜이노시톨(phosphatidylinositol)의 능력을 보고하였다. 이들 조사 결과는 Gabizon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1988, 85, 6949에 의해 뒷받침되었다. U.S. Pat. No. 4,837,028과 WO 88/04924(둘 모두 Allen et al.)에서는 (1) 스핑고미엘린(sphingomyelin)과 (2) 강글리오시드 Gm1 또는 갈락토세레브로시드 황산염 에스테르를 함유하는 리포좀을 개시한다. U.S. Pat. No. 5,543,152(Webb et al.)에서는 스핑고미엘린을 함유하는 리포좀을 개시한다. 1,2-sn-디미리스토일포스파티딜콜린을 함유하는 리포좀이 WO 97/13499(Lim et al)에서 개시된다.
하나 이상의 친수성 폴리머로 유도체화된 지질을 함유하는 다수의 리포좀 및 이의 제조 방법은 당분야에 공지되어 있다. Sunamoto et al., Bull. Chem. Soc. Jpn., 1980, 53, 2778에서는 PEG 모이어티를 보유하는 비-이온성 세정제, 2C1215G을 함유하는 리포좀을 기술한다. Illum et al., FEBS Lett., 1984, 167, 79에서는 폴리머 글리콜로 폴리스티렌 입자의 친수성 코팅(hydrophilic coating)은 현저하게 강화된 혈중 반감기를 결과한다. 폴리알킬렌 글리콜(가령, PEG)의 카르복실 기의 부착에 의해 변형된 합성 인지질은 Sears(U.S. Pat. Nos. 4,426,330과 4,534,899)에 의해 기술된다. Klibanov et al., FEBS Lett., 1990, 268, 235에서는 PEG 또는 PEG 스테아르산염(stearate)으로 유도체화된 포스파티딜에탄올아민(PE)을 함유하는 리포좀이 혈중 순환 반감기에서 현저한 증가를 나타낸다는 것을 증명하는 실험 결과를 기술하였다. Blume et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1990, 1029, 91에서는 이런 관찰 결과를 다른 PEG-유도체화된 인지질, 예를 들면, 디스테아로일포스파티딜에탄올아민(DSPE)과 PEG의 조합으로부터 형성된 DSPE-PEG까지 확대하였다. 외부 표면에 공유 결합된 PEG 모이어티를 보유하는 리포좀은 European Patent No. EP 0 445 131 B1과 WO 90/04384(Fisher)에서 기술된다. PEG로 유도체화된 1-20 몰백분율(mole percent)의 PE를 함유하는 리포좀 조성물 및 이의 이용 방법은 Woodle 등(U.S. Pat. Nos. 5,013,556과 5,356,633)과 Martin 등(U.S. Pat. No. 5,213,804와 European Patent No. EP 0 496 813 B1)에 의해 기술된다. 다수의 다른 지질-중합체 배합체를 함유하는 리포좀은 WO 91/05545와 U.S. Pat. No. 5,225,212(둘 모두 Martin et al.) 및 WO 94/20073(Zalipsky et al.)에서 개시된다. PEG-변형된 세라미드(ceramide) 지질을 함유하는 리포좀은 WO 96/10391(Choi et al)에서 기술된다. U.S. Pat. No. 5,540,935(Miyazaki et al.)와 U.S. Pat. No. 5,556,948(Tagawa et al.)에서는 표면에서 기능성 모이어티(functional moiety)로 더욱 유도체화될 수 있는 PEG-보유 리포좀을 기술한다.
제한된 숫자의 핵산-함유 리포좀이 당분야에 공지되어 있다. WO 96/40062(Thierry et al.)에서는 리포좀 내에 고분자량 핵산을 캡슐화하는 방법을 개시한다. U.S. Pat. No. 5,264,221(Tagawa et al.)에서는 단백질-결합된 리포좀을 개시하고, 이런 리포좀의 내용물이 dsRNA를 포함한다고 주장한다. U.S. Pat. No. 5,665,710(Rahman et al.)에서는 리포좀 내에 올리고데옥시뉴클레오티드를 캡슐화하는 특정의 방법을 기술한다. WO 97/04787(Love et al.)에서는 raf 유전자에 표적된 dsRNA를 함유하는 리포좀을 개시한다.
트랜스퍼좀(transfersome)은 다른 유형의 리포좀이고, 약물 전달 운반제에 대한 매력적인 후보인 고도로 변형가능 지질 응집체(aggregate)이다. 트랜스퍼좀은 액적보다 작은 구멍을 용이하게 통과할 수 있을 만큼 고도로 변형가능한 지질 액적로서 기술된다. 트랜스퍼좀은 그들이 이용되는 환경에 맞게 개조된다. 예를 들면, 이들은 자가-최적화(피부 내에 구멍의 형태에 맞춰짐)되고, 자가-회복되고, 단편화(fragmenting) 없이 표적에 빈번하게 도달하고, 종종, 자가-하중된다. 트랜스퍼좀을 만들기 위하여, 표면 가장자리 활성인자(surface edge-activator), 일반적으로, 계면활성제를 표준 리포좀 조성물에 첨가하는 것이 가능하다. 트랜스퍼좀은 혈청 알부민(serum albumin)을 피부로 전달하는데 이용되고 있다. 혈청 알부민의 트랜스퍼좀-매개된 전달은 혈청 알부민을 함유하는 용액의 피하 주사(subcutaneous injection) 만큼 효과적인 것으로 밝혀졌다.
계면활성제는 에멀젼(마이크로에멀젼 포함)과 리포좀과 같은 제제에서 폭넓게 적용된다. 많은 상이한 유형의 자연 계면활성제와 합성 계면활성제의 특성을 분류하고 정렬시키는 가장 일반적인 방식은 HLB(hydrophile/lipophile balance)를 이용하는 것이다. 친수성 기(일명, "헤드")의 특성은 제제에 이용되는 상이한 계면활성제를 분류하기 위한 가장 유용한 수단을 제공한다(Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285).
계면활성제 분자가 이온화되지 않으면, 이는 비-이온성 계면활성제로 분류된다. 비-이온성 계면활성제는 제약학적 산물과 미용학적 산물에 폭넓게 이용되고, 넓은 범위에 pH 수치에서 이용가능하다. 일반적으로, HLB 수치는 이들의 구조에 따라, 2 내지 대략 18이다. 비-이온성 계면활성제에는 비-이온성 에스테르, 예를 들면, 에틸렌 글리콜 에스테르, 프로필렌 글리콜 에스테르, 글리세릴 에스테르, 폴리글리세릴 에스테르, 소르비탄 에스테르, 수크로스 에스테르와 에톡실화된 에스테르가 포함된다. 비-이온성 알칸올아마이드(alkanolamide)와 에테르, 예를 들면, 지방 알코올 에톡실레이트, 프로폭실화된 알코올과 에톡실화된/프로폭실화된 블록 폴리머 역시 이러한 분류에 포함된다. 폴리옥시에틸렌 계면활성제는 비-이온성 계면활성제 분류의 가장 인기 있는 구성원이다.
계면활성제 분자가 물에 용해되거나 분산될 때 음전하를 띠면, 이러한 계면활성제는 음이온성으로 분류된다. 음이온성 계면활성제에는 카르복실레이트, 예를 들면, 비누(soap), 아실 락틸레이트(acyl lactylate), 아미노산의 아릴 아마이드, 황산(sulfuric acid)의 에스테르, 예를 들면, 알킬 황산염과 에톡실화된 알킬 황산염, 술폰산염(sulfonate), 예를 들면, 알킬 벤젠 술폰산염, 아실 이세티오네이트(acyl isethionate), 아실 타우레이트(acyl taurate)와 술포숙시네이트(sulfosuccinate)와 인산염이 포함된다. 음이온성 계면활성제 분류의 가장 중요한 구성원은 알킬 황산염과 비누이다.
계면활성제 분자가 물에 용해되거나 분산될 때 양전하를 띠면, 이러한 계면활성제는 양이온성으로 분류된다. 양이온성 계면활성제에는 4급 암모늄 염(quaternary ammonium salt)과 에톡실화된 아민이 포함된다. 4급 암모늄 염이 이러한 분류의 가장 빈번하게 이용되는 구성원이다.
계면활성제 분자가 양전하 또는 음전하를 운반하는 능력을 갖고 있으면, 이러한 계면활성제는 양쪽성(amphoteric)으로 분류된다. 양쪽성 계면활성제에는 아크릴산(acrylic acid) 유도체, 치환된 알킬아마이드(alkylamide), N-알킬베타인(alkylbetaine)과 포스파티드(phosphatide)가 포함된다.
약물 산물, 제제와 에멀젼에서 계면활성제의 이용은 재고되었다(Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285).
침투 강화제
한 구체예에서, 본 발명에서는 동물의 피부로 핵산, 특히, dsRNA의 효과적인 전달을 달성하기 위하여 다양한 침투 강화제를 이용한다. 대부분의 약물은 용액에서 이온화된 형태와 비-이온화된 형태 둘 모두로 존재한다. 하지만, 통상적으로, 지용성 또는 친유성 약물만 세포 막을 용이하게 통과한다. 비-친유성 약물은 통과되는 막이 침투 강화제로 처리되면 세포 막을 통과할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 세포 막을 가로질러 비-친유성 약물의 확산(diffusion)을 보조할 뿐만 아니라, 침투 강화제는 친유성 약물의 투과성(permeability) 역시 강화시킨다.
침투 강화제는 5가지 대부류: 계면활성제, 지방산, 담즙산염, 킬레이트화제와 비-킬레이트화 비-계면활성제 중에서 하나에 속하는 것으로 분류된다(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92). 앞서 언급된 분류의 침투 강화제 각각은 하기에 더욱 상세하게 기술된다.
계면활성제: 본 발명과 관련하여, 계면활성제(또는 "표면 활성제(surface-active agent)")는 수용액에 용해될 때, 용액의 표면 장력(surface tension) 또는 수용액과 다른 액체 사이에 계면 장력(interfacial tension)을 감소시켜 점막(mucosa)을 통한 dsRNA의 흡수를 강화시키는 화학적 존재(chemical entity)이다. 담즙산염과 지방산 이외에, 이들 침투 강화제에는 예로써, 나트륨 라우릴 황산염, 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르와 폴리옥시에틸렌-20-세틸 에테르(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92); 퍼플루오르케미칼(perfluorochemical) 에멀젼, 예를 들면, FC-43(Takahashi et al., J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252)이 포함된다.
지방산: 침투 강화제로서 기능하는 다양한 지방산과 이들의 유도체에는 예로서, 올레산(oleic acid), 라우르산(lauric acid), 카프르산(capric acid)(n-데칸산(decanoic acid)), 미리스트산(myristic acid), 팔미트산(palmitic acid), 스테아르산(stearic acid), 리놀레산(linoleic acid), 리놀렌산(linolenic acid), 디카프레이트(dicaprate), 트리카프레이트(tricaprate), 모노올레인(monoolein)(1-모노올레일-rac-글리세롤), 딜라우린(dilaurin), 카프릴산(caprylic acid), 아라키돈산(arachidonic acid), 글리세롤 1-모노카프레이트, 1-도데실아자사이클로헵탄-2-원, 아실카르니틴(acylcarnitine), 아실콜린(acylcholine), 이들의 C1 - C10 알킬 에스테르(가령, 메틸, 이소프로필과 t-부틸), 이들의 모노-와 디-글리세리드(즉, 올레에이트(oleate), 라우레이트(laurate), 카프레이트(caprate), 미리스테이트(myristate), 팔미트산염(palmitate), 스테아르산염(stearate), 리놀레산염(linoleate) 등)가 포함된다(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carryier Systems, 1991, p.92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; El Hariri et al., J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651-654).
담즙산염: 담즙(bile)의 생리학적 역할에는 지질과 지용성 비타민의 분산과 흡수의 촉진이 포함된다(Brunton, Chapter 38 in: Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Ed., Hardman et al. Eds., McGraw-Hill, New York, 1996, pp. 934-935). 다양한 자연 담즙산염과 이들의 합성 유도체는 침투 강화제로서 기능한다. 따라서 "담즙산염"에는 담즙의 임의의 자연 발생 성분 및 이들의 합성 유도체가 포함된다. 본 발명의 담즙산염에는 예로써, 콜릭산(또는 이의 제약학적으로 허용되는 나트륨 염, 나트륨 콜산염), 디하이드로콜릭산(나트륨 디하이드로콜산염), 데옥시콜릭산(나트륨 데옥시콜산염), 글루콜릭산(나트륨 글루콜산염), 글리콜릭산(나트륨 글리콜산염), 글리코데옥시콜릭산(나트륨 글리코데옥시콜산염), 타우로콜릭산(나트륨 타우로콜산염), 타우로데옥시콜릭산(나트륨 타우로데옥시콜산염), 케노데옥시콜릭산(나트륨 케노데옥시콜산염), 우르소데옥시콜릭산(UDCA), 나트륨 타우로-24,25-디하이드로-푸시데이트(STDHF), 나트륨 글리코디하이드로푸시데이트와 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르(POE)가 포함된다(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Swinyard, Chapter 39 In: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990, pages 782-783; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Yamamoto et al., J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25; Yamashita et al., J. Pharm. Sci., 1990, 79, 579-583).
킬레이트화제: 본 발명과 관련하여, 킬레이트화제는 용액과 복합체를 형성함으로써 상기 용액으로부터 금속성 이온(metallic ion)을 제거하여 점막을 통한 dsRNA의 흡수가 강화되는 화합물로서 정의될 수 있다. 본 발명에서 침투 강화제로서 용도와 관련하여, 킬레이트화제는 DNase 저해물질로서도 기능하는 추가된 이점을 갖는데, 그 이유는 대부분의 특징적인 DNA 뉴클레아제(nuclease)가 촉매작용(catalysis)을 위하여 이가 금속 이온(divalent metal ion)을 요구하고, 따라서 킬레이트화제에 의해 저해되기 때문이다(Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315-339). 본 발명의 킬레이트화제에는 이나트륨 에틸렌디아민테트라아세트산염(disodium ethylenediaminetetraacetate, EDTA), 구연산(citric acid), 살리실레이트(salicylate)(가령, 나트륨 살리실레이트, 5-메톡시살리실레이트와 호모바닐레이트(homovanillate)), 콜라겐(collagen)의 N-아실 유도체, 라우레트(laureth)-9와 베타-디케톤(beta-diketone)의 N-아미노 아실 유도체(enamine)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Buur et al., J. Control Rel., 1990, 14, 43-51).
비-킬레이트화 비-계면활성제: 본 명세서에서, 비-킬레이트화 비-계면활성제 침투 강화 화합물은 킬레이트화제 또는 계면활성제로서 의미없는 활성을 나타내지만 그럼에도 불구하고, 장관 점막(alimentary mucosa)을 통한 dsRNA의 흡수를 강화시키는 화합물로서 정의될 수 있다(Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33). 이러한 분류의 침투 강화제에는 예로써, 불포화된 환형 요소(cyclic urea), 1-알킬-과 1-알케닐아자사이클로-알카논 유도체 (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92); 비-스테로이드성 소염제, 예를 들면, 디클로페낙 나트륨(diclofenac sodium), 인도메타신(indomethacin)과 페닐부타존(phenylbutazone)(Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621-626)이 포함된다.
세포 수준에서 dsRNA의 흡입을 강화시키는 작용제 역시 본 발명의 제약학적 조성물과 다른 조성물에 첨가될 수 있다. 가령, 양이온성 지질, 예를 들면, 리포펙틴(lipofectin)(Junichi et al, U.S. Pat. No. 5,705,188), 양이온성 글리세롤 유도체와 다가양이온성 분자, 예를 들면, 폴리리신(Lollo et al., PCT Application WO 97/30731) 역시 dsRNA의 세포 흡입을 강화시키는 것으로 알려져 있다.
투여된 핵산의 침투를 강화시키기 위하여, 글리콜(glycol), 예를 들면, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜, 피롤(pyrrol), 예를 들면, 2-피롤, 아존(azone)과 테르펜(terpene), 예를 들면, 리모넨(limonene)과 메톤(menthone)을 비롯한 다른 작용제가 이용될 수 있다.
담체
본 발명의 특정 조성물은 또한, 제제 내에 담체 화합물을 통합한다. 본 명세서에서, "담체 화합물" 또는 "담체"는 불활성(즉, 본질적으로 생리학적 활성을 갖지 않음)이지만 예로써 생물학적 활성 핵산을 분해시키거나, 또는 순환계로부터 이의 제거를 촉진함으로써 생물학적 활성을 갖는 핵산의 생체이용효율을 감소시키는 생체내 과정에 의해 핵산으로 인지되는 핵산, 또는 이의 유사체를 지칭한다. 핵산 및 담체 화합물, 전형적으로, 과량의 담체 화합물 공동 투여는 아마도, 공통 수용체에 대한 담체 화합물과 핵산 사이에 경쟁으로 인하여, 간, 신장 또는 다른 외순환 저장소(extracirculatory reservoir)에서 회수되는 핵산의 양에서 실질적인 감소를 결과할 수 있다. 가령, 간 조직에서 부분적으로 포스포로티오에이트 dsRNA의 회수는 폴리이노신산(polyinosinic acid), 덱스트란 황산염(dextran sulfate), 폴리시티드산(polycytidic acid) 또는 4-아세트아미도-4'이소티오시아노-스틸벤-2,2'-디술폰산(4-acetamido-4'isothiocyano-stilbene-2,2'-disulfonic acid)과 공동 투여되는 경우에 감소될 수 있다(Miyao et al., Antisense Res. Dev., 1995, 5, 115-121; Takakura et al., Antisense & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183.
부형제:
담체 화합물과 대조적으로, "제약학적 담체" 또는 "부형제"는 제약학적으로 허용되는 용매, 현탁제(suspending agent) 또는 하나 이상의 핵산을 동물에 전달하기 위한 임의의 다른 약리학적으로 불활성 운반제(pharmacologically inert vehicle)이다. 부형제는 액체 또는 고형이고, 의도된 투여 방식에 따라, 핵산 및 소정의 제약학적 조성물의 다른 성분과 혼합될 때 원하는 부피(bulk), 경도(consistency) 등을 제공하도록 선택된다. 전형적인 제약학적 담체에는 접합제(binding agent)(가령, 전젤라틴화된 옥수수 전분(pregelatinized maize starch), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone) 또는 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스(hydroxypropyl methylcellulose) 등); 충전제(가령, 락토오스(lactose)와 다른 당, 미세결정성(microcrystalline) 셀룰로오스, 펙틴(pectin), 젤라틴(gelatin), 칼슘 황산염(calcium sulfate), 에틸 셀룰로오스(ethyl cellulose), 폴리아크릴레이트(polyacrylate) 또는 칼슘 하이드로겐 인산염(calcium hydrogen phosphate) 등); 윤활제(가령, 스테아르산마그네슘(magnesium stearate), 활석(talc), 실리카(silica), 콜로이드성 실리콘 이산화물(colloidal silicon dioxide), 스테아르산(stearic acid), 금속성 스테아르산염(metallic stearate), 수소화된 식물성 오일, 옥수수 전분(corn starch), 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 벤조산염(sodium benzoate), 나트륨 아세트산염(sodium acetate) 등); 붕해제(disintegrant)(가령, 전분, 나트륨 전분 글리콜산염 등); 적심제(wetting agent)(가령, 나트륨 라우릴 술페이트(sodium lauryl sulphate) 등)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
핵산과 유해하게 반응하지 않는 비주사형(non-parenteral) 투여에 적합한 제약학적으로 허용되는 유기 또는 무기 부형제 역시 본 발명의 조성물을 제제화하는데 이용될 수 있다. 적절한 제약학적으로 허용되는 담체에는 물, 염 용액, 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 락토오스, 아밀로오스, 스테아르산마그네슘, 활석, 규산(silicic acid), 점성 파라핀(viscous paraffin), 하이드록시메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
핵산의 국소 투여용 제제에는 무균과 비-무균 수용액, 통상적인 용매, 예를 들면, 알코올에서 비-수용액, 또는 액상이나 고형 오일 기부(oil base)에서 핵산의 용액이 포함된다. 이들 용액은 완충제, 희석제와 다른 적절한 첨가제를 함유할 수도 있다. 핵산과 유해하게 작용하지 않는 비주사형 투여에 적합한 제약학적으로 허용되는 유기 또는 무기 부형제가 이용될 수 있다.
적절한 제약학적으로 허용되는 부형제에는 물, 염 용액, 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 락토오스, 아밀로오스, 스테아르산마그네슘, 활석, 규산, 점성 파라핀, 하이드록시메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
기도에 전달을 위한 제약학적 조성물
본 발명의 다른 측면에서는 기도에 IRNA 작용제의 전달을 제시한다. 기도는 입인두(oropharynx)와 후두(larynx)를 비롯한 상부 기도(upper airway) 및 호흡관(trachea)과 그 뒤에, 기관지(bronchus)와 세기관지로(bronchioli)로의 분기(bifurcation)를 비롯한 하부 기도(lower airway)를 포괄한다. 상부와 하부 기도는 전도 기도(conductive airway)로 불린다. 말단 세기관지는 호흡 세기관지로 분할되고, 이들은 이후, 궁극적 호흡 구역(ultimate respiratory zone), 폐포, 또는 폐의 깊은 부위(deep lung)로 이어진다. 폐의 깊은 부위, 또는 폐포는 iRNA 작용제의 시스템 전달을 위한 흡입된 치료 에어로졸의 일차 표적이다.
폐 전달 조성물은 환자에 의한 분산액(dispersion)의 흡입으로 전달될 수 있는데, 이러한 분산액 내에서 조성물, 바람직하게는, iRNA 작용제는 폐에 도달할 수 있고, 여기서 상기 분산액은 예로써, 폐포 영역(alveolar region)을 통하여 혈액 순환계(blood circulation) 내로 직접적으로 용이하게 흡수될 수 있다. 폐 전달은 폐 질환을 치료하기 위한 전신 전달과 국소 전달 모두에 효과적일 수 있다.
폐 전달은 분무되고 에어로졸화된 교질입자성 건성 분말-기초된 제제의 이용을 비롯한 상이한 접근법으로 달성될 수 있다; 흡입에 의한 투여는 구강 및/또는 비강 투여일 수 있다. 전달은 액상 분무기(liquid nebulizer), 에어로졸-기초된 흡입기(aerosol-based inhaler)와 건성 분말 분산 장치(dry powder dispersion devices)로 달성될 수 있다. 계량 장치(metered-dose device)가 바람직하다. 분무기(atomizer) 또는 흡입기(inhaler)를 이용하는 이점 중의 하나는 오염의 가능성이 최소화된다는 점인데, 그 이유는 이들 장치가 자가 봉쇄되기 때문이다. 건성 분말 분산 장치는 예로써, 건성 분말로서 용이하게 제조될 수 있는 약물을 전달한다. iRNA 조성물은 자체로써, 또는 적절한 분말 담체와의 조합으로, 동결 건조된(lyophilized) 또는 분무 건조된(spray-dried) 분말로서 안정적으로 보관될 수 있다. 흡입용 조성물의 전달은 타이머(timer), 용량 계산기(dose counter), 시간 측정 장치(time measuring device), 또는 장치 내로 통합되면, 에어로졸 약제의 투여 동안 용량 추적(dose tracking), 순응도 모니터링(compliance monitoring) 및/또는 환자에 대한 투약 유인(dose triggering)을 가능하게 하는 시간 인디케이터(time indicator)를 포함할 수 있는 투약 시간 요소(dosing timing element)에 의해 조정될 수 있다.
에어로졸 전달을 위한 제약학적 장치의 실례에는 계량 흡입기(metered dose inhaler, MDI), 건성 분말 흡입기(dry powder inhaler, DPI)와 에어-제트 분무기(air-jet nebulizer)가 포함된다. 본 발명의 iRNA 작용제의 전달에 용이하게 맞춤될 수 있는 흡입에 의한 전형적인 전달 시스템은 예로써, U.S. Pat. No. 5,756,353; 5,858,784; PCT 출원 WO98/31346; WO98/10796; WO00/27359; WO01/54664; WO02/060412에서 기술된다. iRNA 작용제를 전달하는데 이용될 수 있는 다른 에어로졸 제제는 U.S. Pat. No. 6,294,153; 6,344,194; 6,071,497; PCT 출원 WO02/066078; WO02/053190; WO01/60420; WO00/66206에 기술된다. 더 나아가, iRNA 작용제를 전달하는 방법은 예로써, Templin et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev, 2000, 10:359-68; Sandrasagra et al., Expert Opin Biol Ther, 2001, 1:979-83; Sandrasagra et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev, 2002, 12:177-81에 기술된 바와 같이, 흡입으로 다른 올리고뉴클레오티드(가령, 안티센스 올리고뉴클레오티드)를 전달하는데 이용되는 방법으로부터 개조될 수 있다.
본 발명의 작용제의 전달은 또한, 소위, "프로드러그(prodrug)", 다시 말하면, 가급적 작용이 요구되는 부위에 치료 물질을 방출하기 위하여 개별 미생물에 선척적인 시스템에 의한 일정한 형태의 가공 또는 수송을 요하는 치료 물질의 제제 또는 화학적 변형의 투여를 수반할 수도 있다; 이러한 후자 구체예는 기도의 전달과 공동으로 이용될 뿐만 아니라 본 발명의 다른 구체예와 함께 이용될 수도 있다. 가령, 인간 폐는 수분 내지 수시간 범위의 기간 동안, 가수분해로 절단가능한 침착된 에어로졸을 제거하거나 신속하게 분해시킬 수 있다. 상부 기도에서, 섬모상피(ciliated epithelium)는 "점액섬모 승강장치(mucociliary escalator)"에 기여하는데, 이에 의해 입자가 기도로부터 입 방향으로 휩쓸린다(Pavia, D., "Lung Mucociliary Clearance," in Aerosols and the Lung: Clinical and Experimental Aspects, Clarke, S. W. and Pavia, D., Eds., Butterworths, London, 1984). 폐의 깊은 부분에서, 폐포 대식세포는 침착 직후에 입자를 식작용할 수 있다(Warheit et al. Microscopy Res. Tech., 26: 412-422 (1993); Brain, J. D., "Physiology and Pathophysiology of 폐 Macrophages," in The Reticuloendothelial System, S. M. Reichard and J. Filkins, Eds., Plenum, New. York., pp. 315-327, 1985).
바람직한 구체예에서, 특히, iRNA 작용제로 전신 투약이 요구되는 경우에, 에어로졸화된 iRNA 작용제는 마이크로입자로서 제제화된다. 0.5 내지 10 마이크론의 직경을 갖는 마이크로입자는 폐에 침투하고 대부분의 자연 장벽을 통과할 수 있다. 10 마이크론 이하의 직경은 목을 회피하기 위하여 요구된다; 0.5 마이크론 이상의 직경은 내뱉어지는 것을 피하기 위하여 요구된다.
다른 성분
본 발명의 조성물은 당분야에 확립된 용량 수준에서, 제약학적 조성물에서 통상적으로 관찰되는 다른 보조 성분을 추가로 함유할 수 있다. 따라서 가령, 조성물은 추가의 양립가능 제약학적 활성 물질, 예를 들면, 가려움약(antipruritic), 수렴제(astringent), 국소 마취제(local anesthetic) 또는 소염제(anti-inflammatory agent)를 함유하거나, 또는 본 발명의 조성물의 다양한 제형을 물리적으로 제제화하는데 유용한 추가의 물질, 예를 들면, 염료, 방향제, 보존제, 항산화제, 불투명화제(opacifier), 농후제와 안정화제를 함유할 수 있다. 하지만, 이들 물질은 첨가될 때, 본 발명의 조성물의 성분의 생리 활성(biological activity)을 부당하게 간섭하지 않아야 하다. 이들 제제는 멸균되고, 원하는 경우에, 보조제(auxiliary agent), 예를 들면, 윤활제, 보존제, 안정화제, 적심제, 유화제, 삼투압(osmotic pressure)에 영향을 주는 염, 완충제, 착색제, 방향제 및/또는 방향족 물질(aromatic substance) 및 제제의 핵산과 유해하게 반응하지 않는 다른 보조제와 혼합될 수 있다.
수성 현탁액은 예로써, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 소르비톨 및/또는 덱스트란을 비롯한, 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 함유할 수 있다. 이러한 현탁액은 또한, 안정화제를 함유할 수 있다.
본 발명의 특정 구체예에서는 (a) 하나 이상의 dsRNA 작용제 및 (b) 비-RNA 간섭 기전(interference mechanism)으로 기능하는 하나 이상의 다른 화학치료제를 함유하는 제약학적 조성물을 제시한다. 이런 화학치료제의 실례에는 다우노루비신(daunorubicin), 다우노마이신(daunomycin), 닥티노마이신(dactinomycin), 독소루비신(doxorubicin), 에피루비신(epirubicin), 이다루비신(idarubicin), 에소루비신(esorubicin), 블레오마이신(bleomycin), 마포스파마이드(mafosfamide), 이포스파마이드(ifosfamide), 시토신 아라비노시드(cytosine arabinoside), 비스-클로로에틸니트로소우레아(bis-chloroethylnitrosourea), 부설판(busulfan), 미토마이신(mitomycin) C, 악티노마이신(actinomycin) D, 미트라마이신(mithramycin), 프레드니손(prednisone), 하이드록시프로게스테론(hydroxyprogesterone), 테스토스테론(testosterone), 타목시펜(tamoxifen), 다카르바진(dacarbazine), 프로카르바진(procarbazine), 헥사메틸멜라민(hexamethylmelamine), 펜타메틸멜라민(pentamethylmelamine), 미톡산트론(mitoxantrone), 암사크린(amsacrine), 클로람부실(chlorambucil), 메틸사이클로헥실니트로소우레아(methylcyclohexylnitrosurea), 질소 겨자(nitrogen mustard), 멜팔란(melphalan), 사이클로포스파마이드(cyclophosphamide), 6-메르캅토퓨린(6-mercaptopurine), 6-티오구아닌(6-thioguanine), 시타라빈(cytarabine), 5-아자시티딘(5-azacytidine), 하이드록시우레아(hydroxyurea), 데옥시코포르마이신(deoxycoformycin), 4-하이드록시페록시사이클로포스포라마이드(4-hydroxyperoxycyclophosphoramide), 5-플루오르우라실(5-fluorouracil, 5-FU), 5-플루오르데옥시우리딘(5-fluorodeoxyuridine, 5-FUdR), 메토트렉세이트(methotrexate, MTX), 콜히친(colchicine), 탁솔(taxol), 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 에토포시드(etoposide)(VP-16), 트리메트렉세이트(trimetrexate), 이리노테칸(irinotecan), 토포테칸(topotecan), 젬시타빈(gemcitabine), 테니포시드(teniposide), 시스플라틴(cisplatin)과 디에틸스틸베스트롤(diethylstilbestrol)(DES)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다(참조: The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 15th Ed. 1987, pp. 1206-1228, Berkow et al., eds., Rahway, N.J). 본 발명의 화합물과 함께 이용될 때, 이들 화학치료제는 개별적으로(가령, 5-FU와 올리고뉴클레오티드), 순차적으로(가령, 일정한 기간 동안 5-FU와 올리고뉴클레오티드, 이후 MTX와 올리고뉴클레오티드), 또는 하나 이상의 다른 화학치료제와의 조합으로(가령, 5-FU, MTX와 올리고뉴클레오티드, 또는 5-FU, 방사선요법(radiotherapy)과 올리고뉴클레오티드) 이용될 수 있다. 비스테로이드성 소염 약물과 코르티코스테로이드(corticosteroid)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 소염 약물 및 리비비린(ribivirin), 비다라빈(vidarabine), 아시클로비르(acyclovir)와 간시클로비르(ganciclovir)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 항바이러스 약물 역시 본 발명의 조성물에 혼합될 수 있다(참조: The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 15th Ed., Berkow et al., eds., 1987, Rahway, N.J., pages 2499-2506 and 46-49, respectively). 다른 비-dsRNA 화학치료제 역시 본 발명의 범위 내에 속한다. 2가지 이상의 결합된 화합물이 함께, 또는 순차적으로 이용될 수 있다.
이들 화합물의 독성과 치료 효능은 예로써, LD50(개체군의 50%를 치사시키는 용량)과 ED50(개체군의 50%에서 치료 효과적인 용량)을 측정하기 위한, 세포 배양액 또는 실험 동물에서 표준 제약학적 절차로 결정될 수 있다. 독성과 치료 효과 사이에 용량 비율(dose ratio)은 치료 지수(therapeutic index)이고, LD50/ED50 비율로 표시될 수 있다. 높은 치료 지수를 나타내는 화합물이 바람직하다.
세포 배양 검사와 동물 연구로부터 획득된 데이터는 인간에서 이용을 위한 용량 범위를 결정하는데 이용될 수 있다. 본 발명의 조성물의 용량은 일반적으로, 거의 또는 전혀 독성 없이, ED50을 포함하는 순환 농도(circulating concentration)의 범위 내에 존재한다. 이러한 용량은 이용된 제형과 투여 경로에 따라, 상기 범위 내에서 변한다. 본 발명의 방법에 이용되는 화합물의 경우에, 치료 효과량은 세포 배양 검사로부터 최초 추정될 수 있다. 용량은 세포 배양액에서 측정되는 IC50(즉, 증상의 반-극대 저해를 달성하는 시험 화합물의 농도)을 포함하는, 화합물 또는, 적절한 경우에, 표적 서열의 폴리펩티드 산물의 순환 혈장 농도(circulating plasma concentration) 범위를 달성하는(가령, 상기 폴리펩티드의 감소한 농도를 달성하는) 동물 모형(animal model)에서 결정될 수 있다. 이런 정보는 인간에서 유용한 용량을 더욱 정확하게 결정하는데 이용될 수 있다. 혈장 내에서 수준은 예로써, 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography)에 의해 측정될 수 있다.
단독으로 또는 복수로 이들의 투여 이외에, 앞서 언급된 바와 같이, 본 발명의 dsRNA는 SCAP 발현에 의해 매개되는 병리학적 과정의 치료에 효과적인 다른 공지된 작용제와 조합으로 투여될 수 있다. 어떤 경우든, 담당 의사는 당분야에 공지되거나 본 명세서에 기술된, 효능의 표준 척도를 이용하여 관찰된 결과에 기초하여 dsRNA 투여의 양과 기간을 조정할 수 있다.
SCAP 유전자의 발현에 의해 유발되는 질환을 치료하는 방법
본 발명은 특히, 지질 대사, 지질 항상성 및/또는 지질 분포의 질환, 예를 들면, 비-알코올성 간 질환(non-alcoholic liver disease), 지방간(fatty liver), 고지방혈(hyperlipemia), 고지방혈증(hyperlipidemia), 고리포단백혈증(hyperlipoproteinemia), 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia) 및/또는 고중성지방혈증(hypertriglyceridemia), 동맥경화증(atherosclerosis), 췌장염(pancreatitis), 비-인슐린 의존성 당뇨병(non-insulin dependent diabetes mellitus)(NIDDM), 관상 동맥 질환(coronary heart disease), 비만(obesity), 대사 증후군(metabolic syndrome), 말초 동맥 질환(peripheral arterial disease)과 심혈관 질환(cerebrovascular disease)의 치료를 위한 dsRNA 또는 이로부터 만들어진 제약학적 조성물의 용도에 관계한다. SCAP 발현에 대한 저해 효과(inhibitory effect)로 인하여, 본 발명에 따른 dsRNA 또는 이로부터 만들어진 제약학적 조성물은 이들 질환이나 질병을 앓는 환자의 삶의 질을 향상시킬 수 있다.
더 나아가, 본 발명은 다른 의약품 및/또는 다른 치료 방법, 예를 들면, 공지된 의약품 및/또는 공지된 치료 방법, 특히, 지질 대사, 지질 항상성 및/또는 지질 분포의 질환이나 질병, 구체적으로, 비-알코올성 간 질환(non-alcoholic liver disease), 지방간(fatty liver), 고지방혈(hyperlipemia), 고지방혈증(hyperlipidemia), 고리포단백혈증(hyperlipoproteinemia), 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia) 및/또는 고중성지방혈증(hypertriglyceridemia), 동맥경화증(atherosclerosis), 췌장염(pancreatitis), 비-인슐린 의존성 당뇨병(non-insulin dependent diabetes mellitus)(NIDDM), 관상 동맥 질환(coronary heart disease), 비만(obesity), 대사 증후군(metabolic syndrome), 말초 동맥 질환(peripheral arterial disease)과 심혈관 질환(cerebrovascular disease)을 치료하는데 현재 이용되고 있는 의약품 및/또는 치료 방법과의 조합으로, dsRNA 또는 이의 제약학적 조성물의 용도에 관계한다. 이러한 제약학적 조성물이 지질 대사, 지질 항상성 및/또는 지질 분포의 질환이나 질병의 치료를 목적하지만, 지질 강하제(lipid lowering drug), 예를 들면, 스타틴(statin), 당뇨병용 인슐린(insulin) 및 간 질환용 약제와의 조합이 우선된다.
SCAP 유전자의 발현을 저해하는 방법
또 다른 측면에서, 본 발명에서는 포유동물에서 SCAP 유전자의 발현을 저해하는 방법을 제시한다. 상기 방법은 표적 SCAP 유전자, 예를 들면, 인간 SCAP 유전자의 발현이 침묵되도록 하기 위하여 포유동물에 본 발명의 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 높은 특이성(specificity)으로 인하여, 본 발명의 dsRNA는 표적 SCAP 유전자의 RNA(일차 또는 처리된)를 특이적으로 표적한다. dsRNA를 이용하여 이들 SCAP 유전자의 발현을 저해하는 조성물과 방법은 본 명세서에 기술된 바와 같이 수행될 수 있다.
한 구체예에서, 이러한 방법은 dsRNA를 함유하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는데, 여기서 상기 dsRNA는 치료되는 포유동물의 SCAP 유전자, 예를 들면, 인간 SCAP 유전자의 RNA 전사체의 최소한 일부분에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 치료되는 생물체가 포유동물, 예를 들면, 인간이면, 조성물은 정맥내(intravenous), 근육내(intramuscular), 피하(subcutaneous), 경피(transdermal), 기도(에어로졸), 비강, 직장, 질과 국소(구강점막(buccal)과 설하(sublingual) 포함) 투여를 비롯한 경구 또는 비경구 경로가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 당분야에 공지된 임의의 수단으로 투여될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 이들 조성물은 정맥내 주입 또는 주사에 의해 투여된다.
달리 명시하지 않는 경우에, 본 명세서에 이용된 기술 용어와 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기술된 것들과 유사하거나 균등한 방법과 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에서 이용될 수 있긴 하지만, 적절한 방법과 물질이 하기에 기술된다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허와 다른 참고문헌은 순전히 참조로서 편입된다. 충돌하는 경우에, 정의를 비롯한 본 명세서가 우선할 것이다. 이에 더하여, 이들 물질, 방법과 실례는 설명을 목적으로 하고, 본 발명을 결코 한정하지 않는다.
siRNA의 설계
siRNA 설계는 햄스터, 생쥐 및/또는 인간 SCAP를 표적하는 siRNA를 확인하기 위하여 수행하였다. 먼저, 생쥐(Mus musculus)(NM_001001144.1)와 검은배햄스터(Cricetus cricetus)(U67060; Hua et al., Cell. 1996, 87:415) SCAP의 mRNA 서열을 컴퓨터 분석(computer analysis)으로 조사하고, 이들 두 생물종 사이에 교차-반응성(cross-reactive) RNAi 작용제를 산출하는 19개 뉴클레오티드의 상동성 서열을 확인하였다.
생쥐와 햄스터 사이에 교차-반응성 작용제를 확인하는 과정에서, 이러한 선택은 Whitehead Institute(http://jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/ in the version of May 18, 2005)에 의해 제공된 소프트웨어 도구를 이용함으로써, 생쥐 게놈 내에서 임의의 다른 서열에 최소한 3개의 미스매치(mismatch)를 보유하는 19mer 서열로 한정되었다. 이렇게 확인된 서열은 표 2에 제시된, 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 iRNA 작용제의 합성을 위한 기초가 되었다. 여기서, 센스 가닥 내에서 모든 피리미딘-기초 보유 뉴클레오티드 및 안티센스 가닥 내에서 서열 환경 5'-ca-3'에서 발생하는 모든 시티딘(cytidine)과 서열 환경 5'-ua-3'에서 발생하는 모든 우리 딘(uridine)은 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오티드와 3'-말단 데옥시티미딘이다.
생쥐(Mus musculus)(NM_001001144.1)와 검은배햄스터(Cricetus cricetus) (U67060) SCAP의 하향-조절을 위하여 선택된 RNAi 작용제 및 생쥐에서 최소 오프-표적(off-target) 상호작용
이중나선 확인자 센스 가닥 서열1 SEQ ID NO: 안티센스 가닥 서열1 SEQ ID NO:
AL-DP-6054 ggcmgacmaumumacmcmumumgumacmaTT 49 ugumacmaaggumaaugucgccTT 50
AL-DP-6055 gumcmcmumgumcmgaumcmgacmaumumcmTT 51 gaaugucgaucgacmaggacTT 52
AL-DP-6056 cmacmumcmaaumggcmggumgagaumTT 53 aucucmaccgccmauugagugTT 54
AL-DP-6057 umcmcmumgumcmgaumcmgacmaumumcmgTT 55 cgaaugucgaucgacmaggaTT 56
AL-DP-6058 gagumgumcmumggcmumagcmgaumgTT 57 cmaucgcumagccmagacmacucTT 58
AL-DP-6059 cmumcmacmcmumgcmumumaaumcmgacmaTT 59 ugucgauumaagcmaggugagTT 60
AL-DP-6060 ggaumumgumagcmumgcmumcmggcmumTT 61 agccgagcmagcumacmaauccTT 62
AL-DP-6061 umumgumagcmumgcmumcmggcmumumaaTT 63 uumaagccgagcmagcumacmaaTT 64
AL-DP-6062 gcmumumaaumggumumcmcmcmumumgaumTT 65 aucmaagggaaccmauumaagcTT 66
AL-DP-6063 acmacmumcmaaumggcmggumgagaTT 67 ucucmaccgccmauugaguguTT 68
AL-DP-6064 acmcmumcmacmcmumgcmumumaaumcmgaTT 69 ucgauumaagcmaggugagguTT 70
AL-DP-6065 gaggumgaagcmumumcmggaumumgTT 71 cmaauccgaagcuucmaccucTT 72
1 대문자 = 데속시리보뉴클레오티드; 소문자 = 리보뉴클레오티드; 밑줄: 뉴클레오시드 삼인산염; cm = 2'-O-메틸-시티딘; um = 2'-O-메틸-우리딘
인간 SCAP의 발현을 저해하는데 유용한 작용제를 더욱 확인하기 위하여, 호모 사피엔스(Homo sapiens)(NM_012235.2), 생쥐(Mus musculus)(NM_001001144.1)와 검은배햄스터(Cricetus cricetus)(U67060) SCAP의 서열을 두 번째 단계에서 비교하고, 이들 세 생물종 사이에 교차-반응성 RNAi 작용제를 산출하는 19개 뉴클레오티드의 상동성 서열을 확인하였다. 인간에서 비-고유 효과를 최소화하기 위하여, 이러한 선택은 인간 RefSeq 데이터베이스(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/), Rev. 17에서 이들 유전자 서열에 fastA 비교에 의해 더욱 한정하였다. 센스와 안티센스 가닥 둘 모두에 대하여 인간 RefSeq 데이터베이스에서 임의의 다른 유전자에 최소한 2개의 미스매치를 보유하는 RNAi 작용제의 24개 19mer 서열(표 1)이 확인되었는데, 여기서, 가장 가깝게 정합하는 유전자의 경우에, 이들 미스매치 중에서 최소한 하나는 생쥐 RefSeq 데이터베이스에서 임의의 다른 유전자에 최소한 2개의 미스매치, 또는 최소한 하나의 종자 영역 미스매치를 보유하고 미스매체에 특히 민감한 "종자 영역(seed region)"(위치 2 내지 10, 5'에서 3'으로 계산) 내에 위치하였다.
dsRNA 합성
시약 공급원
시약 공급원이 본 명세서에서 특정되지 않는 경우에, 이런 시약은 분자 생물학에 적용되는 품질/순도 기준에서 분자 생물학용 시약의 임의의 공급업체로부터 구입될 수 있다.
siRNA 합성
단일 가닥 RNA는 Expedite 8909 합성장치(Applied Biosystems, Applera Deutschland GmbH, Darmstadt, Germany) 및 고형 서포트(solid support)로서 통제된 다공성 유리(controlled pore glass)(CPG, 500Å, Proligo Biochemie GmbH, Hamburg, Germany)를 이용하여 1 μmole의 척도(scale)에서 고형상 합성(solid phase synthesis)으로 생산하였다. RNA 및 2'-O-메틸 뉴클레오티드를 포함하는 RNA는 각각, 상응하는 포스포르아미디트(phosphoramidite)와 2'-O-메틸포스포르아미디트를 이용한 고형상 합성으로 산출하였다(Proligo Biochemie GmbH, Hamburg, Germany). 이들 빌딩 블록(building block)은 Current protocols in nucleic acid chemistry, Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USA에서 기술된 바와 같은 표준 뉴클레오시드 포스포르아미디트 화학을 이용하여 올리고리보뉴클레오티드사슬의 서열 내에서 선택된 부위에 통합시켰다. 포스포로티오에이트 연쇄는 아세토니트릴(acetonitrile)(1%)에 녹인 Beaucage 시약(Chruachem Ltd, Glasgow, UK)의 용액으로 요오드 산화제 용액(iodine oxidizer solution)을 대체함으로써 도입하였다. 다른 보조 시약은 Mallinckrodt Baker(Griesheim, Germany)로부터 구입하였다.
정제되지 않은 올리고리보뉴클레오티드의 탈보호(deprotection)와 음이온 교환(anion exchange) HPLC에 의한 이의 정제는 확립된 절차에 따라 수행하였다. 수율과 농도는 분광 광도계(spectral photometer)(DU 640B, Beckman Coulter GmbH, Unterschleiㅯheim, Germany)를 이용하여 260 nm의 파장(wavelength)에서 개별 RNA 용액의 UV 흡수로 결정하였다. 이중 가닥 RNA는 어닐링 완충액(annealing buffer)(20 mM 나트륨 인산염, pH 6.8; 100 mM 염화나트륨)에서 상보성 가닥의 동몰 용액(equimolar solution)을 혼합하여 산출하고, 85 - 90℃에서 3분 동안 수조(water bath)에서 가열하고, 3 - 4 시간 동안 실온으로 냉각하였다. 어닐링된 RNA 용액은 사용 때까지 -20℃에서 보관하였다.
3'-콜레스테롤-결합된 siRNA(이후, -Chol-3')의 합성을 위하여, 적절하게 변형된 고형 서포트가 RNA 합성에 이용되었다. 상기 변형된 고형 서포트는 아래와 같이 제조하였다:
디에틸-2-아자부탄-1,4-디카르복실레이트 AA
Figure 112009022201213-PCT00002
나트륨 수산화물(50 ㎖)의 4.7 M 수용액은 물(50 ㎖)에 녹인 에틸 글리세네이트 염산염(32.19 g, 0.23 mole)의 교반되고 냉각된 용액에 첨가하였다. 이후, 에틸 아크릴레이트(23.1 g, 0.23 mole)를 첨가하고, 혼합물은 TLC에 의해 반응의 완결이 확증될 때까지 실온에서 교반하였다. 19시간후, 용액은 디클로로메탄(3 x 100 ㎖)으로 분할하였다. 유기층은 무수성 나트륨 황산염에서 건조시키고, 여과하고, 증발시켰다. 잔류물은 증류하여 AA(28.8 g, 61%)를 수득하였다.
3-{에톡시카르보닐메틸-[6-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐-아미노)-헥사노일]-아미노}-프로피온산 에틸 에스테르 AB
Figure 112009022201213-PCT00003
AB
Fmoc-6-아미노-헥산산(9.12 g, 25.83 mmol)은 디클로로메탄(50 ㎖)에 용해시키고 얼음으로 냉각하였다. 디이소프로필카르보디이미드(3.25 g, 3.99 ㎖, 25.83 mmol)를 0℃에서 상기 용액에 첨가하였다. 이후, 디에틸-아자부탄-1,4-디카르복실레이트(5 g, 24.6 mmol)와 디메틸아미노 피리딘(0.305 g, 2.5 mmol)을 첨가하였다. 용액은 실온으로 데우고, 6시간 동안 추가로 교반하였다. 반응의 완결은 TLC로 확증하였다. 반응 혼합물은 진공 하에 농축하고, 에틸 아세트산염을 첨가하여 디이소프로필 요소를 침전시켰다. 현탁액은 여과하였다. 여과액은 5% 수성 염산, 5% 나트륨 중탄산염과 물로 세척하였다. 모아진 유기층은 나트륨 황산염에서 건조시키고 농축하여 정제되지 않은 산물을 얻고, 상기 산물은 칼럼 크로마토그래피(50 % EtOAC/헥산)로 정제하여 11.87 g(88%)의 AB를 수득하였다.
3-[(6-아미노-헥사노일)-에톡시카르보닐메틸-아미노]-프로피온산 에틸 에스테르 AC
Figure 112009022201213-PCT00004
AC
3-{에톡시카르보닐메틸-[6-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)-헥사노일]-아미노}-프로피온산 에틸 에스테르 AB(11.5 g, 21.3 mmol)는 0℃에서, 디메틸포름아마이드에 녹인 20% 피페리딘에 용해시켰다. 용액은 1시간 동안 계속 교반하였다. 반응 혼합물은 진공 하에 농축하고, 물을 잔류물에 첨가하고, 산물은 에틸 아세트산염으로 추출하였다. 정제되지 않은 산물은 염산염으로의 전환(conversion)으로 정제하였다.
3-({6-[17-(1,5-디메틸-헥실)-10,13-디메틸-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일옥시카르보닐아미노]-헥사노일}에톡시카르보닐메틸-아미노)-프로피온산 에틸 에스테르 AD
Figure 112009022201213-PCT00005
AD
3-[(6-아미노-헥사노일)-에톡시카르보닐메틸-아미노]-프로피온산 에틸 에스테르 AC(4.7 g, 14.8 mmol)의 염산염은 디클로로메탄에 집어넣었다. 현탁액은 얼음 위에서 0℃로 냉각하였다. 상기 현탁액에, 디이소프로필에틸아민(3.87 g, 5.2 ㎖, 30 mmol)을 첨가하였다. 생성된 용액에 콜레스테릴 클로로포름산염(6.675 g, 14.8 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물은 하룻밤동안 교반하였다. 반응 혼합물은 디클로로메탄으로 희석하고 10% 염산으로 세척하였다. 산물은 플래시 크로마토그래피로 정제하였다(10.3 g, 92%).
1-{6-[17-(1,5-디메틸-헥실)-10,13-디메틸-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a] 페난트렌-3-일옥시카르보닐아미노]-헥사노일}-4-옥소-피롤리딘-3-카르복실산 에틸 에스테르 AE
Figure 112009022201213-PCT00006
AE
칼륨 t-부톡시드(1.1 g, 9.8 mmol)는 30 ㎖의 건성 톨루엔에서 슬러리로 만들었다. 혼합물은 얼음 위에서 0℃로 냉각하고, 5 g(6.6 mmol)의 디에스테르 AD를 천천히 첨가하고, 20분 이내로 교반한다. 온도는 이러한 첨가 동안 5℃ 미만으로 유지시켰다. 0℃에서 30분 동안 교반을 지속하고, 1 ㎖의 빙초산(glacial acetic acid)을 첨가하고, 직후에 40 ㎖의 물에 녹인 4 g의 NaH2PO4ㅇH2O를 첨가한다. 생성된 혼합물은 각각, 100 ㎖의 디클로로메탄으로 2회 추출하고, 모아진 유기 추출물은 각각, 10 ㎖의 인산염 완충액으로 2회 세척하고, 건조시키고, 증발 건조시킨다. 잔류물은 60 ㎖의 톨루엔에 용해시키고, 0℃로 냉각하고, 차가운 pH 9.5 탄산염 완충액의 3회 50 ㎖ 분량으로 추출하였다. 수성 추출물은 인산(phosphoric acid)으로 pH 3으로 조정하고, 클로로포름의 5회 40 ㎖ 분량으로 추출하고, 이는 합치고, 건조시키고, 증발 건조시켰다. 잔류물은 25% 에틸아세트산염/헥산을 이용한 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 1.9 g의 b-케토에스테르(39%)를 수득하였다.
[6-(3-하이드록시-4-하이드록시메틸-피롤리딘-1-일)-6-옥소-헥실]-카르밤산 17-(1,5-디메틸-헥실)-10,13-디메틸-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 에스테르 AF
Figure 112009022201213-PCT00007
AF
테트라하이드로푸란(10 ㎖)에 녹인 b-케토에스테르 AE(1.5 g, 2.2 mmol)와 나트륨 보로하이드리드(0.226 g, 6 mmol)의 환류 혼합물에 메탄올(2 ㎖)을 1시간 동안 방울방울 첨가하였다. 교반은 환류 온도(reflux temperature)에서 1시간 동안 지속하였다. 실온으로 냉각한 이후, 1 N HCl(12.5 ㎖)을 첨가하고, 혼합물은 에틸아세트산염(3 x 40 ㎖)으로 추출하였다. 모아진 에틸아세트산염 층은 무수성 나트륨 황산염에서 건조시키고 진공 하에 농축하여 산물을 수득하고, 이는 칼럼 크로마토그래피(10% MeOH/CHCl3)(89%)로 정제하였다.
(6-{3-[비스-(4-메톡시-페닐)-페닐-메톡시메틸]-4-하이드록시-피롤리딘-1-일}-6-옥소-헥실)-카르밤산 17-(1,5-디메틸-헥실)-10,13-디메틸-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 에스테르 AG
Figure 112009022201213-PCT00008
AG
디올 AF(1.25 gm 1.994 mmol)는 진공에서 피리딘(2 x 5 ㎖)과 함께 증발시킴으로써 건조시켰다. 교반하면서 무수성 피리딘(10 ㎖)과 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드(0.724 g, 2.13 mmol)를 첨가하였다. 반응은 실온에서 하룻밤동안 수행하였다. 반응은 메탄올의 첨가로 소멸시켰다. 반응 혼합물은 진공 하에 농축하고, 잔류물에 디클로로메탄(50 ㎖)을 첨가하였다. 유기층은 1M 수성 나트륨 중탄산염으로 세척하였다. 유기층은 무수성 나트륨 황산염에서 건조시키고, 여과하고, 농축하였다. 잔류성 피리딘은 톨루엔과 함께 증발시킴으로써 제거하였다. 정제되지 않은 산물은 칼럼 크로마토그래피(2% MeOH/클로로포름, Rf = 5% MeOH/CHCl3에서 0.5)로 정제하였다(1.75 g, 95%).
숙신산 모노-(4-[비스-(4-메톡시-페닐)-페닐-메톡시메틸]-1-{6-[17-(1,5-디메틸-헥실)-10,13-디메틸 2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H 사이클로펜타[a]페난트렌-3-일옥시카르보닐아미노]-헥사노일}-피롤리딘-3-일) 에스테르 AH
Figure 112009022201213-PCT00009
AH
화합물 AG(1.0 g, 1.05 mmol)는 숙신산 무수물(0.150 g, 1.5 mmol)과 DMAP(0.073 g, 0.6 mmol)와 혼합하고 진공 하에 40℃에서 하룻밤동안 건조시켰다. 혼합물은 무수성 디클로로에탄(3 ㎖)에 용해시키고, 트리에틸아민(0.318 g, 0.440 ㎖, 3.15 mmol)을 첨가하고, 용액은 아르곤 대기 하에 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 이후, 디클로로메탄 (40 ㎖)으로 희석하고 차가운 수성 구연산(5 wt%, 30 ㎖)과 물(2 X 20 ㎖)로 세척하였다. 유기상은 무수성 나트륨 황산염에서 건조시키고 농축 건조시켰다. 잔류물은 다음 단계에 정제 없이 이용되었다.
콜레스테롤 유도체화된 CPG AI
Figure 112009022201213-PCT00010
AI
숙신산염 AH(0.254 g, 0.242 mmol)는 디클로로메탄/아세토니트릴(3:2, 3 ㎖)의 혼합물에 용해시켰다. 상기 용액에, 아세토니트릴(1.25 ㎖)에 녹인 DMAP(0.0296 g, 0.242 mmol) 및 아세토니트릴/디클로로에탄(3:1, 1.25 ㎖)에 녹인 2,2'-디티오-비스(5-니트로피리딘)(0.075 g, 0.242 mmol)을 연속적으로 첨가하였다. 생성된 용액에, 아세토니트릴(0.6 ㎖)에 녹인 트리페닐포스핀(0.064 g, 0.242 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물은 밝은 오렌지색으로 변하였다. 용액은 손목 동작 진탕기(wrist-action shaker)(5 분)를 이용하여 짧게 진탕하였다. 긴 사슬 알킬 아민-CPG(LCAA-CPG)(1.5 g, 61 mM)을 첨가하였다. 현탁액은 2시간 동안 진탕하였다. CPG는 소결된 깔때기(sintered funnel)를 통하여 여과하고 아세토니트릴, 디클로로메탄과 에테르로 연속적으로 세척하였다. 처리되지 않은 아미노 기는 아세트산 무수물/피리딘을 이용하여 감추었다. CPG의 달성된 적하(loading)는 UV 측정(37 mM/g)을 수행함으로써 측정하였다.
5'-12-도데카논산 비스데실아마이드 기(이후, "5'-C32-") 또는 5'-콜레스테릴 유도체 기(이후, "5'-Chol-")을 보유하는 siRNA의 합성은 콜레스테릴 유도체의 경우에, 핵산 올리고머의 5'-단부에서 포스포로티오에이트 연쇄를 도입하기 위하여 Beaucage 시약을 이용한 산화(oxidation) 단계가 수행되는 점을 제외하고, WO 2004/065601에서 기술된 바와 같이 수행하였다.
핵산 서열은 표준 명명법, 구체적으로, 표 2의 약어를 이용하여 하기에 제시된다.
핵산 서열 제시에 이용되는 뉴클레오티드 단량체의 약어. 이들 단량체는 올리고뉴클레오티드 내에 존재할 때, 5'-3'-포스포디에스테르 결합에 의해 상호 연결된 것으로 간주된다.
약어 a 뉴클레오티드
A, a 2'-데옥시-아데노신-5'-인산염, 아데노신-5'-인산염
C, c 2'-데옥시-시티딘-5'-인산염, 시티딘-5'-인산염
G, g 2'-데옥시-구아노신-5'-인산염, 구아노신-5'-인산염
T, t 2'-데옥시-티미딘-5'-인산염, 티미딘-5'-인산염
U, u 2'-데옥시-우리딘-5'-인산염, 우리딘-5'-인산염
N, n 임의의 2'-데옥시-뉴클레오티드/뉴클레오티드 (G, A, C, 또는 T, g, a, c 또는 u)
Am 2'-O-메틸아데노신-5'-인산염
Cm 2'-O-메틸시티딘-5'-인산염
Gm 2'-O-메틸구아노신-5'-인산염
Tm 2'-O-메틸-티미딘-5'-인산염
Um 2'-O-메틸우리딘-5'-인산염
Af 2'-플루오르-2'-데옥시-아데노신-5'-인산염
Cf 2'-플루오르-2'-데옥시-시티딘-5'-인산염
Gf 2'-플루오르-2'-데옥시-구아노신-5'-인산염
Tf 2'-플루오르-2'-데옥시-티미딘-5'-인산염
Uf 2'-플루오르-2'-데옥시-우리딘-5'-인산염
A, C, G, T, U, a, c, g, t, u 밑줄: 뉴클레오시드-5'-포스포로티오에이트
am, cm, gm, tm, um 밑줄: 2-O-메틸-뉴클레오시드-5'-포스포로티오에이트
a대문자는 2'-데옥시리보뉴클레오티드(DNA)를 나타내고, 소문자는 리보뉴클레오티드(RNA)를 나타낸다.
dsRNA 발현 벡터
본 발명의 다른 측면에서, 인간 SCAP 유전자 발현 활성을 조절하는 인간 SCAP 특이적 dsRNA 분자는 DNA 또는 RNA 벡터 내로 삽입된 전사 단위로부터 발현된다(참조: Couture, A, et al., TIG. (1996), 12:5-10; Skillern, A., et al., International PCT Publication No. WO 00/22113, Conrad, International PCT Publication No. WO 00/22114, Conrad, US Pat. No. 6,054,299). 이들 이식유전자(transgene)는 선형 구조체(linear construct), 환형 플라스미드(circular plasmid), 또는 바이러스 벡터로서 도입될 수 있는데, 이는 숙주 게놈 내로 통합된 이식유전자로서 합병되고 유전될 수 있다. 이러한 이식유전자는 또한, 염색체외 플라스미드(extrachromosomal plasmid)로서 유전될 수 있도록 작제될 수 있다(Gassmann, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:1292).
dsRNA의 개별 가닥은 2개의 독립된 발현 벡터에서 프로모터에 의해 전사되고, 표적 세포 내로 동시-형질감염(transfection)될 수 있다. 대안으로, dsRNA의 각 개별 가닥은 동일한 발현 플라스미드 상에 위치하는 양쪽 프로모터에 의해 전사될 수 있다. 바람직한 구체예에서, dsRNA는 이러한 dsRNA가 스템(stem)과 루프(loop) 구조를 갖도록 링커 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 연결된 역위 반복(inverted repeat)으로서 발현된다.
이들 재조합 dsRNA 발현 벡터는 일반적으로, DNA 플라스미드 또는 바이러스 벡터이다. dsRNA 발현 바이러스 벡터는 아데노-연관된 바이러스(adeno-associated virus)(참조: Muzyczka, et al., Curr. Topics Micro. Immunol. (1992) 158:97-129)); 아데노바이러스(adenovirus)(참조: Berkner, et al., BioTechniques (1998) 6:616), Rosenfeld et al. (1991, Science 252:431-434), Rosenfeld et al. (1992), Cell 68:143-155)); 알파바이러스(alphavirus); 또는 당분야에 공지된 바이러스에 기초하여 작제될 수 있다. 시험관내에서 및/또는 생체내에서, 다양한 유전자를 상피 세포를 비롯한 다수의 상이한 세포 유형 내로 도입하는데 레트로바이러스(retrovirus)가 이용되고 있다(참조: Eglitis, et al., Science (1985) 230:1395-1398; Danos and Mulligan, Proc. NatI. Acad. Sci. USA (1998) 85:6460-6464; Wilson et al., 1988, Proc. NatI. Acad. Sci. USA 85:3014-3018; Armentano et al., 1990, Proc. NatI. Acad. Sci. USA 87:61416145; Huber et al., 1991, Proc. NatI. Acad. Sci. USA 88:8039-8043; Ferry et al., 1991, Proc. NatI. Acad. Sci. USA 88:8377-8381; Chowdhury et al., 1991, Science 254:1802-1805; van Beusechem. et al., 1992, Proc. Nad. Acad. Sci. USA 89:7640-19 ; Kay et al., 1992, Human Gene Therapy 3:641-647; Dai et al., 1992, Proc. Natl.Acad. Sci. USA 89:10892-10895; Hwu et al., 1993, J. Immunol. 150:4104-4115; U.S. Patent No. 4,868,116; U.S. Patent No. 4,980,286; PCT Application WO 89/07136; PCT Application WO 89/02468; PCT Application WO 89/05345; PCT Application WO 92/07573). 세포의 게놈 내로 삽입된 유전자를 형질도입하고 발현할 수 있는 재조합 레트로바이러스 벡터는 이러한 재조합 레트로바이러스 게놈을 적절한 포장 세포주(packaging line line), 예를 들면, PA317과 Psi-CRIP 내로 형질감염시킴으로써 생산될 수 있다(Comette et al., 1991, Human Gene Therapy 2:5-10; Cone et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6349). 재조합 아데노바이러스 벡터는 감수성 숙주(가령, 쥐, 햄스터, 개와 침팬지)에서 다양한 세포와 조직을 감염시키는데 이용될 수 있고(Hsu et al., 1992, J. Infectious Disease, 166:769), 감염을 위하여 유사분열 활성 세포를 요구하지 않는 이점을 갖는다.
본 발명의 DNA 플라스미드 또는 바이러스 벡터에서 dsRNA 발현을 수행하는 프로모터는 진핵 RNA 중합효소 I(가령, 리보솜 RNA 프로모터), RNA 중합효소 II(가령, CMV 조기 프로모터 또는 액틴 프로모터 또는 U1 snRNA 프로모터) 또는 일반적으로, RNA 중합효소 III 프로모터(가령, U6 snRNA 또는 7SK RNA 프로모터), 또는 원핵 프로모터, 예를 들면 T7 프로모터일 수 있는데, 단서로써, 이러한 발현 플라스미드는 T7 프로모터로부터 전사에 요구되는 T7 RNA 중합효소를 또한 인코딩한다. 프로모터는 또한, 췌장으로 이식유전자 발현을 수행할 수 있다(가령, 췌장에 대한 인슐린 조절 서열(Bucchini et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2511-2515)).
이에 더하여, 이식유전자의 발현은 예로써, 유도성 조절 서열과 발현 시스템, 예를 들면, 특정의 생리 조절인자(physiological regulator), 예를 들면, 순환 글루코오스 수준(circulating glucose level), 또는 호르몬에 민감한 조절 서열을 이용함으로써 정확하게 조절될 수 있다(Docherty et al., 1994, FASEB J. 8:20-24). 세포 또는 포유동물에서 이식유전자 발현의 통제에 적합한 이와 같은 유도성 발현 시스템은 엑디손(ecdysone), 에스트로겐(estrogen), 프로게스테론(progesterone), 테트라사이클린(tetracycline), 이합체화(dimerization)의 화학적 유도인자(chemical inducer)와 이소프로필-베타-D1-티오갈락토피라노시드(isopropyl-beta-D1-thiogalactopyranoside, EPTG)에 의한 조절을 포함한다. 당업자는 dsRNA 이식유전자의 의도된 용도에 기초하여 적절한 조절/프로모터 서열을 선택할 수 있을 것이다.
일반적으로, dsRNA 분자를 발현할 수 있는 재조합 벡터는 아래에 기술된 바와 같이 전달되고, 표적 세포 내에 존속한다. 대안으로, dsRNA 분자의 일시적인 발현을 제공하는 바이러스 벡터가 이용될 수 있다. 이들 벡터는 필요에 따라, 반복적으로 투여될 수 있다. 일단 발현된 dsRNA는 표적 RNA에 결합하고 이의 기능 또는 발현을 조절한다. dsRNA 발현 벡터의 전달은 전신 투여, 예를 들면, 정맥내 또는 근육내 투여, 환자로부터 체외배양된 표적 세포에 투여와 이후 상기 환자 내로 재도입(reintroduction), 또는 원하는 표적 세포 내로 도입을 가능하게 하는 임의의 다른 수단으로 달성될 수 있다.
dsRNA 발현 DNA 플라스미드는 전형적으로, 양이온성 지질 담체(가령, 올리고펙타민) 또는 비-양이온성 지질-기초된 담체(가령, Transit-TKOTM)와의 복합체로서 표적 세포 내로 형질감염된다. 일주일 이상의 기간 동안 단일 인간 SCAP 유전자 또는 복수 인간 SCAP 유전자의 상이한 영역을 표적하는 dsRNA-매개된 녹다운(knockdown)을 위한 복수 지질 형질감염(lipid transfection) 역시 본 발명에 의해 고려된다. 숙주 세포 내로 본 발명의 벡터의 성공적인 도입은 다양한 공지된 방법을 이용하여 모니터할 수 있다. 가령, 일시적인 형질감염은 리포터(reporter), 예를 들면, 형광 마커(fluorescent marker), 예를 들면, 녹색 형광 단백질(Green Fluorescent protein, GFP)로 신호될 수 있다. 탈체 세포의 안정한 형질감염은 형질감염된 세포에 특정 환경 인자(가령, 항생제 또는 약물)에 내성을 제공하는 마커, 예를 들면, 히그로마이신 B 내성(hygromycin B resistance)을 이용하여 담보될 수 있다.
인간 SCAP 특이적 dsRNA 분자는 벡터 내로 삽입되고, 인간 환자에 대한 유전자 치료(gene therapy) 벡터로서 이용될 수도 있다. 유전자 치료 벡터는 예로써, 정맥내 주입(intravenous injection), 국소 투여(local administration)(참조: U.S. Patent 5,328,470) 또는 정위 주입(stereotactic injection)(참조: Chen et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3054-3057)에 의해 개체로 전달될 수 있다. 유전자 치료 벡터의 제약학적 제조물은 허용되는 희석제 내에 유전자 치료 벡터를 함유하거나, 또는 유전자 전달 운반제가 묻혀있는 느린 방출 매트릭스(slow release matrix)를 포함할 수 있다. 대안으로, 완전한 유전자 전달 벡터, 예를 들면, 레트로바이러스 벡터가 재조합 세포로부터 본래대로 생산될 수 있는 경우에, 제약학적 제조물은 이러한 유전자 전달 시스템을 생산하는 하나 이상의 세포를 함유할 수 있다.
생체내 실험으로부터, 일차 간세포와 간에서 지방산과 콜레스테롤 합성에 관여하는 유전자에 대한 SCAP RNAi의 효과
일차 햄스터 간세포에서 단일 용량 스크린
간세포는 햄스터 간으로부터 분리하고, 1.2ㅧ106개 세포/접시의 밀도로 60-㎜ 접시에 도말하였다. 2-시간 부착 기간후, 세포는 올리고펙타민을 이용하여 200 nM의 지정된 siRNA로 형질감염시켰다. 전체 RNA는 RNA STAT-60 용액(Tel-Test Inc., Friendswood, Texas, USA)을 이용한 형질감염후 24시간 시점에 세포로부터 분리하였다. 각 접시당 10 ㎍의 RNA는 DNase I(DNA-free; Ambion Inc., Austin, Texas, USA)로 처리하였다. 첫 번째 가닥 cDNA는 ABI cDNA 합성 키트(N808-0234; PE Biosystems, Foster City, California, USA)를 이용하여 무작위 헥사머 프라이머(random hexamer primer)로 2 ㎍의 DNase I-처리된 전체 RNA로부터 합성하였다. 각 유전자에 대한 아래의 특이적인 프라이머는 Primer Express 소프트웨어(PE Biosystems)를 이용하여 설계하였다: β-액틴, 5' 프라이머, 5'-GGCTCCCAGCACCATGAA-3', 3' 프라이머, 5'-GCCACCGATCCACACAGAGT-3'; SCAP, 5' 프라이머, 5'-GTACCTGCAGATGATGTCCATTG-3', 3' 프라이머, 5'-CTGCCATCCCGGAAAGTG-3'. β-액틴 불변 대조(invariant control)로서 이용되었다. 실시간 RT-PCR 반응은 20 ng의 역-전사된 전체 RNA, 167 nM의 정방향과 역방향 프라이머 및 10 ㎕의 2x SYBR Green PCR Master Mix(4312704; PE Biosystems)를 포함하는 20 ㎕의 최종 부피로 설정되었다. PCR 반응은 ABI PRISM 7900HT 서열 탐지 시스템(PE Biosystems)을 이용하여 384-웰 평판에서 수행하였다. 모든 반응은 삼중으로 수행하였다. 전체 mRNA의 상대적인 양은 비교 역치 주기(comparative threshold cycle, CT) 방법을 이용하여 산정하였다. 햄스터 β-액틴 mRNA는 불변 대조로서 이용되었다. 수치는 1로서 정의되는 형질감염되지 안은 세포에서 mRNA 양에 상대적인 mRNA 양을 나타낸다(n = 1개 평판).
햄스터 일차 간세포 내에서, 생쥐와 햄스터에서 SCAP의 저해에 특이적인 siRNA 스크리닝
이중나선 확인자 남아있는 SCAP mRNA
가성 트랜스펙션 1.0 (정의상으로)
AL-DP-6054 1.06
AL-DP-6055 1.04
AL-DP-6056 1.59
AL-DP-6057 1.32
AL-DP-6058 1.06
AL-DP-6059 0.62
AL-DP-6061 1.21
AL-DP-6062 0.22
AL-DP-6063 0.89
AL-DP-6064 0.81
AL-DP-6065 0.31
햄스터 일차 간세포 내에서 SCAP의 저해를 위한 인간 교차반응성 siRNA 스크리닝
이중나선 확인자 남아있는 SCAP mRNA
가성 트랜스펙션 1.0 (정의상으로)
AL-DP-6062 0.37
AD-9505 0.21
AD-9498 0.22
AD-9512 0.23
AD-9490 0.27
AD-9495 0.27
AD-9503 0.27
AD-9494 0.28
AD-9500 0.28
AD-9492 0.31
AD-9499 0.33
AD-9496 0.34
AD-9510 0.37
AD-9511 0.38
AD-9491 0.41
AD-9506 0.42
AD-9508 0.44
AD-9502 0.45
AD-9504 0.51
AD-9507 0.53
AD-9493 0.61
AD-9501 0.62
AD-9497 0.66
AD-9509 0.69
AD-9513 0.78
생체내에서 햄스터에서 지방산과 콜레스테롤 합성에 관여하는 유전자에 대한 SCAP RNAi의 효과
생체내 RNAi 실험을 위하여, 리포좀으로 제제화된 AL-DP-6062를 경정맥(jugular vein)을 통하여 6마리 햄스터 내로 주입하였다(4 ㎎/㎏). 주입 3일후, 이들 동물은 희생시키고, 전체 RNA는 확립된 절차를 이용하여 간으로부터 준비하였다.
전체 RNA는 QIAGEN(Valencia, CA)으로부터 RNeasy 키트를 이용하여 간세포로부터 준비하였다. 각 햄스터 간으로부터 10 ㎍의 RNA는 DNase I(DNA-free; Ambion Inc., Austin, Texas, USA)로 처리하였다. 일차 가닥 cDNA는 ABI cDNA 합성 키트(N808-0234; PE Biosystems, Foster City, California, USA)를 이용하여 무작위 헥사머 프라이머로 2 ㎍의 DNase I-처리된 전체 RNA로부터 합성하였다. 6마리 햄스터로부터 동등량의 cDNA를 집합시켰다. 각 유전자에 대한 특이적인 프라이머는 아래의 유전자에 대하여 Primer Express 소프트웨어(PE Biosystems)를 이용하여 설계하였다: β-액틴, 5' 프라이머, 5'-GGCTCCCAGCACCATGAA-3', 3' 프라이머, 5'-GCCACCGATCCACACAGAGT-3'; SCAP, 5' 프라이머, 5'-GTACCTGCAGATGATGTCCATTG-3', 3' 프라이머, 5'-CTGCCATCCCGGAAAGTG-3'; SREBP-1c, 5' 프라이머, 5'-ACGCAGTCTGGGCAACAA-3', 3' 프라이머, 5'-GAGCTGGAGCATGTCTTCAAAC-3'; SREBP-2, 5' 프라이머, 5'-GTCAGCAATCAAGTGGGAGAGT-3', 3' 프라이머, 5'-CTACCACCACCAGGGAAGGA-3'; 지방산 신타아제(FAS), 5' 프라이머, 5'-AACAAGCAATGCCAGCTCACT-3', 3' 프라이머, 5'-AACAGGCCCAAGCTTTGTTG-3'; 스테아로일-CoA 디새튜라아제(desaturase)-1(SCD-1), 5' 프라이머, 5'-CAGAATGGACGGGAGAAGCA-3', 3' 프라이머, 5'-TCATTTCAGGGCGGATGTC-3'; HMG-CoA 신타아제, 5' 프라이머, 5'-CCTATGACTGCATTGGGCG-3', 3' 프라이머, 5'-CCCAGACTCCTCAAACAGCTG-3'; HMG-CoA 환원효소, 5' 프라이머, 5'-ACCATCTGTATGATGTCAATGAACA-3', 3' 프라이머, 5'-GCTCAATACGTCCTCTTCAAATTT-3'. 실시간 RT-PCR 반응은 앞서 기술된 바와 같이 설정되었다. 햄스터 β-액틴은 불변 대조(invariant control)로서 이용되었다. 수치는 1로서 정의되는 염수가 주입된 햄스터의 간에서 mRNA의 양에 상대적인 mRNA의 양을 나타낸다.
siRNA가 주입된 햄스터의 간에서 SCAP와 SREBP의 단백질 발현
막과 핵 단백질은 기존 문헌(Engelking et.al., J. Clin. Invest. 113: 1168-1175, 2004)에서 기술된 바와 같이, 동결된 간으로부터 준비하였다. 동등량의 단백질은 8% 겔에서 SDS-PAGE를 수행하고, Hybond ECL 막(Amersham)으로 이전하였다. 다클론 항-햄스터 SREBP-1과 SREBP-2 항체를 이용하여 면역블랏(immunoblot) 분석을 수행하였다(Shimomura et al., PNAS, 94: 12354-12359, 1997). 항체-결합된 밴드는 SuperSignal CL-HRP 기질 시스템(Pierce Biotechnology Inc., Rockford, IL)을 이용하여 탐지하였다. 항-CREB(cAMP 반응 요소 결합 단백질)와 항-RAP(수용체 연관된 단백질)은 각각, 간 핵과 막 단백질에 대한 적하 대조(loading control)로서 이용되었다. 신호는 Research Services Branch, National Institute of Mental Health(Bethesda, Maryland)로부터 입수가능한 Image J 프로그램을 이용하여 정량하고, 수치는 1로서 정의되는 염수가 주입된 햄스터의 간에서 단백질의 양에 상대적인 단백질의 양을 나타낸다.
4 ㎎/㎏ AL-DP-6062로 치료후 3일 시점에 햄스터에서 SCAP의 하류에서 SCAP와 다른 유전자의 mRNA 발현(간세포: n=2, 간: 6마리 햄스터로부터 집합된 cDNA)
간세포 간
SCAP 0.22 0.14
SREBP-1c 0.48 0.39
SREBP-2 0.65 0.51
FAS 0.78 0.68
SCD-1 0.74 0.86
HMG-CoA 신타아제 0.34 0.47
HMG-CoA 환원효소 0.88 0.27
siRNA가 주입된 햄스터의 간에서 SCAP의 mRNA와 단백질 발현(6마리 햄스터로부터 집합된 cDNA 또는 집합된 단백질)
SCAP mRNA SCAP 단백질
siRNA
염수 1 1
루시페라제 1.07 0.9
SCAP 0.14 0.1
SCAP-MM 0.82 0.9
siRNA가 주입된 햄스터의 간에서 SREBP-1의 mRNA와 단백질 발현(6마리 햄스터로부터 집합된 cDNA 또는 집합된 단백질)
mRNA 단백질
SREBP-1c pSREBP-1 nSREBP-1
siRNA
염수 1 1 1
루시페라제 0.59 0.8 0.9
SCAP 0.38 0.4 0.4
SCAP-MM 0.68 0.9 0.8
siRNA가 주입된 햄스터의 간에서 SREBP-2의 mRNA와 단백질 발현(6마리 햄스터로부터 집합된 cDNA 또는 집합된 단백질)
mRNA 단백질
SREBP-2 pSREBP-2 nSREBP-2
siRNA
염수 1 1 1
루시페라제 0.95 1 0.7
SCAP 0.5 0.2 0.5
SCAP-MM 0.81 0.9 0.6
혈장과 간에서 콜레스테롤과 트리글리세리드 농도(n=6)
혈장(㎎/㎗) 간(㎎/g)
RNAi 콜레스테롤 트리글리세리드 콜레스테롤 트리글리세리드
염수 91 ± 5 166 ± 12 2.1 ± 0.1 3.6 ± 0.2
루시페라제 113 ± 8 130 ± 12 2.3 ± 0.1 3.9 ± 0.3
SCAP 105 ± 2 157 ± 18 2.3 ± 0.1 3.7 ± 0.1
SCAP-MM 119 ± 13 164 ± 25 2.6 ± 0.1 4.0 ± 0.3
<110> Alnylam Pharmaceuticals Inc. <120> RNAI MODULATION OF SCAP AND THERAPEUTIC USES THEREOF <130> 14174-141WO1 <140> To Be Assigned <141> 2007-09-18 <150> US 60/845,289 <151> 2006-09-18 <160> 76 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <221> ZN_FING <223> RNAi agents selected for the down-regulation of SCAP <220> <221> modified_base <222> (1)..(19) <223> /mod_base = "2'-hydroxy corresponding base" <400> 1 gauuggcauc cugguauact t 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <221> ZN_FING <223> RNAi agents selected for the down-regulation of SCAP <220> <221> modified_base <222> (1)..(19) <223> /mod_base = "2'-hydroxy corresponding base" <400> 2 guauaccagg augccaauct t 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <221> ZN_FING <223> RNAi agents selected for the down-regulation of SCAP <220> <221> modified_base <222> (1)..(19) <223> /mod_base = "2'-hydroxy corresponding base" <400> 3 agcgccucau cauggcuggt t 21 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<400> 7 gagguguggg acgccauugt t 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <221> ZN_FING <223> RNAi agents selected for the down-regulation of SCAP <220> <221> modified_base <222> (1)..(19) <223> /mod_base = "2'-hydroxy corresponding base" <400> 8 caauggcguc ccacaccuct t 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <221> ZN_FING <223> RNAi agents selected for the down-regulation of SCAP <220> <221> modified_base <222> (1)..(19) <223> /mod_base = "2'-hydroxy corresponding base" <400> 9 uggauuggca uccugguaut t 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <221> ZN_FING <223> RNAi agents selected for the down-regulation of SCAP <220> <221> modified_base <222> (1)..(19) <223> /mod_base = "2'-hydroxy corresponding base" <400> 10 auaccaggau gccaauccat t 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <221> ZN_FING <223> RNAi agents selected for the down-regulation of SCAP <220> <221> modified_base <222> (1)..(19) <223> 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Claims (21)

  1. 세포에서 SCAP 유전자의 발현을 저해하는 이중-가닥 리보핵산(dsRNA)에 있어서, 상기 dsRNA는 서로에 상보적인 최소한 2개의 서열을 포함하고, 여기서 센스 가닥은 첫 번째 서열을 포함하고, 안티센스 가닥은 SCAP 유전자를 인코딩하는 mRNA의 최소한 일부분에 실질적으로 상보적인 상보성(complementarity) 영역을 포함하는 두 번째 서열을 포함하고, 상보성 영역은 30개 이하의 뉴클레오티드 길이를 갖고, 여기서 dsRNA는 SCAP 유전자를 발현하는 세포와의 접촉 이후에, 상기 SCAP 유전자의 발현을 최소한 20% 저해하는 것을 특징으로 하는 dsRNA.
  2. 청구항 1에 있어서, SCAP 유전자는 인간 SCAP 유전자, 바람직하게는, 호모 사피엔스(Homo sapiens) SCAP 유전자인 것을 특징으로 하는 dsRNA.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, SCAP 유전자 발현의 최소한 20% 저해가 일차 햄스터 간세포(primary hamster hepatocyte)에서 달성되는 것을 특징으로 하는 dsRNA.
  4. 전술한 항중 어느 한 항에 있어서, 첫 번째 서열과 두 번째 서열은 각각, SEQ ID NO:1-48로 구성된 군의 짝수 번과 홀수 번에서 선택되는 것을 특징으로 하는 dsRNA.
  5. 전술한 항중 어느 한 항에 있어서, AD-9505, AD-9498, AD-9512, AD-9490, AD-9495, AD-9503, AD-9494, AD-9500, AD-9492, AD-9499, AD-9496, AD-9510, AD-9511, AD-9491, AD-9506, AD-9508, AD-9502, AD-9504, AD-9507, AD-9493, AD-9501, AD-9497, AD-9509와 AD-9513으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 dsRNA.
  6. 전술한 항중 어느 한 항에 있어서, 최소한 하나의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 dsRNA.
  7. 전술한 항중 어느 한 항에 있어서, 변형된 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드, 5'-포스포로티오에이트(phosphorothioate) 기를 포함하는 뉴클레오티드와 콜레스테릴 유도체(cholesteryl derivative) 또는 도데카논산(dodecanoic acid) 비스데실아마이드(bisdecylamide) 기에 연결된 말단 뉴클레오티드로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 dsRNA.
  8. 전술한 항중 어느 한 항에 있어서, 변형된 뉴클레오티드는 2'-데옥시-2'-플루오르 변형된 뉴클레오티드, 2'-데옥시-변형된 뉴클레오티드, 잠금된 뉴클레오티드, abasic 뉴클레오티드, 2'-아미노-변형된 뉴클레오티드, 2'-알킬-변형된 뉴클레오티드, 모르폴리노(morpholino) 뉴클레오티드, 포스포라미데이 트(phosphoramidate), 또는 비-자연 염기(non-natural base) 포함 뉴클레오티드에서 선택되는 것을 특징으로 하는 dsRNA.
  9. 전술한 항중 어느 한 항에 있어서, 첫 번째 서열과 두 번째 서열은 각각, SEQ ID NO:1-48로 구성된 군의 짝수 번과 홀수 번에서 선택되는 것을 특징으로 하는 dsRNA.
  10. 전술한 항중 어느 한 항에 따른 dsRNA를 포함하는 세포.
  11. 생물체 내에서 SCAP 유전자의 발현을 저해하고, dsRNA와 제약학적으로 허용되는 담체를 함유하는 제약학적 조성물에 있어서, dsRNA는 서로에 상보적인 최소한 2개의 서열을 포함하고, 센스 가닥은 첫 번째 서열을 포함하고, 안티센스 가닥은 SCAP를 인코딩하는 mRNA의 최소한 일부분에 실질적으로 상보적인 상보성 영역을 포함하는 두 번째 서열을 포함하고, 상보성 영역은 30개 이하의 뉴클레오티드 길이를 갖고, 여기서 dsRNA는 인간 SCAP를 발현하는 세포와의 접촉 이후에, 호모 사피엔스(Homo sapiens) SCAP 유전자의 발현을 최소한 20% 저해하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  12. 청구항 11에 있어서, SCAP 유전자는 인간 SCAP 유전자, 바람직하게는, 호모 사피엔스(Homo sapiens) SCAP 유전자인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  13. 청구항 11 또는 12에 있어서, SCAP 유전자 발현의 최소한 20% 저해가 일차 햄스터 간세포(primary hamster hepatocyte)에서 달성되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  14. 청구항 11 내지 13중 어느 한 항에 있어서, 첫 번째 서열과 두 번째 서열은 각각, SEQ ID NO:1-48로 구성된 군의 짝수 번과 홀수 번에서 선택되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  15. 청구항 11 내지 14중 어느 한 항에 있어서, dsRNA는 AD-9505, AD-9498, AD-9512, AD-9490, AD-9495, AD-9503, AD-9494, AD-9500, AD-9492, AD-9499, AD-9496, AD-9510, AD-9511, AD-9491, AD-9506, AD-9508, AD-9502, AD-9504, AD-9507, AD-9493, AD-9501, AD-9497, AD-9509와 AD-9513으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  16. 세포에서 SCAP 유전자의 발현을 저해하는 방법에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) 세포 내로 이중-가닥 리보핵산(dsRNA)을 도입하는 단계, 여기서 dsRNA는 서로에 상보적인 최소한 2개의 서열을 포함하고, 여기서 센스 가닥은 첫 번째 서열을 포함하고, 안티센스 가닥은 SCAP 유전자를 인코딩하는 mRNA의 최소한 일부분에 실질적으로 상보적인 상보성(complementarity) 영역을 포함하는 두 번째 서열을 포함하고, 상보성 영역은 30개 이하의 뉴클레오티드 길이를 갖고, 여기서 dsRNA는 SCAP 유전자를 발현하는 세포와의 접촉 이후에, 상기 SCAP 유전자의 발현을 최소한 20% 저해하고;
    (b) 단계 (a)에서 생산된 세포를, SCAP 유전자의 mRNA 전사체(transcript)가 분해될 만큼 충분한 시간 동안 유지시켜 세포에서 SCAP 유전자의 발현을 저해하는 단계.
  17. 청구항 16에 있어서, 유전자는 인간 SCAP 유전자, 바람직하게는, 호모 사피엔스(Homo sapiens) SCAP 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. SCAP 발현에 의해 매개되는 병리학적 과정을 치료, 예방 또는 관리하는 방법에 있어서, 상기 방법은 이런 치료, 예방 또는 관리가 필요한 환자에 치료적 또는 예방적 효과량의 dsRNA를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 dsRNA는 서로에 상보적인 최소한 2개의 서열을 포함하고, 여기서 센스 가닥은 첫 번째 서열을 포함하고, 안티센스 가닥은 SCAP 유전자를 인코딩하는 mRNA의 최소한 일부분에 실질적으로 상보적인 상보성(complementarity) 영역을 포함하는 두 번째 서열을 포함하고, 상보성 영역은 30개 이하의 뉴클레오티드 길이를 갖고, 여기서 dsRNA는 SCAP 유전자를 발현하는 세포와의 접촉 이후에, 상기 SCAP 유전자의 발현을 최소한 20% 저해하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 청구항 18에 있어서, 환자는 비-알코올성 간 질환(non-alcoholic liver disease), 지방간(fatty liver), 고지방혈(hyperlipemia), 고지방혈증(hyperlipidemia), 고리포단백혈증(hyperlipoproteinemia), 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia) 또는 고중성지방혈증(hypertriglyceridemia), 동맥경화증(atherosclerosis), 췌장염(pancreatitis), 비-인슐린 의존성 당뇨병(non-insulin dependent diabetes mellitus, NIDDM), 관상 동맥 질환(coronary heart disease), 비만(obesity), 대사 증후군(metabolic syndrome), 말초 동맥 질환(peripheral arterial disease), 또는 심혈관 질환(cerebrovascular disease)으로 고통받는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 세포에서 SCAP 유전자의 발현을 저해하는 벡터에 있어서, 상기 벡터는 dsRNA의 최소한 하나의 가닥을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 조절 서열을 포함하고, dsRNA의 가닥 중에서 하나는 SCAP를 인코딩하는 mRNA의 최소한 일부분에 실질적으로 상보적이고, dsRNA는 30개 이하의 염기쌍 길이를 갖고, dsRNA는 SCAP 유전자를 발현하는 세포와의 접촉 이후에, SCAP 유전자의 발현을 최소한 20% 저해하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  21. 청구항 20의 벡터를 포함하는 세포.
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