JP2012524068A - 第xi因子による炎症反応のモジュレーション - Google Patents
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Abstract
本明細書中に開示するのは、第XI因子をモジュレーションするための、および炎症性疾患、障害または状態をモジュレーションすることを必要としている個体の炎症性疾患、障害または状態をモジュレーションするためのアンチセンス化合物および方法である。関節炎および結腸炎などの個体の炎症性疾患は、第XI因子を標的とするアンチセンス化合物の投与で改善するまたは予防することができる。
Description
本発明は、第XI因子モジュレーターを動物に投与することによって炎症反応をモジュレーションするための方法、化合物および組成物を提供する。
肝臓内で合成される第XI因子は、「内因性経路」という凝固カスケードのメンバーであり、それは、最終的には、トロンビンを活性化して、血液喪失を予防する。その内因性経路は、第XII因子の第XIIa因子への活性化によって引き起こされる。第XIIa因子は、第XI因子を第XIa因子へ変換し、そして第XIa因子は、第IX因子を第IXa因子へ変換する。第IXa因子は、その補因子である第VIIIa因子と共同して、第X因子を第Xa因子へ変換する。第Xa因子は、第Va因子と共同して、プロトロンビン(第II因子)をトロンビン(第IIa因子)へ変換する。
第XI因子欠損症(血漿トロンボプラスチン前駆物質(PTA)欠損症、ローゼンタール症候群および血友病Cとしても知られる)は、出血傾向に関連した常染色体劣性疾患である。第XI因子欠損症を有する大部分の患者は、自然出血することはないが、外傷後に重篤に出血することがありうる。低レベルの第XI因子も、ヌーナン症候群を含めた他の疾患状態を引き起こすことがありうる。
炎症
炎症は、物理的、化学的または生物学的刺激によって引き起こされる傷害または異常刺激作用に応答した身体の複雑な生物学的過程である。炎症は、身体が、その傷害または刺激を除去しようとする且つ体内の罹患組織を治し始める防御過程である。
炎症は、物理的、化学的または生物学的刺激によって引き起こされる傷害または異常刺激作用に応答した身体の複雑な生物学的過程である。炎症は、身体が、その傷害または刺激を除去しようとする且つ体内の罹患組織を治し始める防御過程である。
傷害または刺激への炎症反応は、組織における増加した赤み(発赤)、温度(灼熱)、腫脹(腫瘍)、痛み(疼痛)および/または機能喪失(機能障害)の臨床徴候を特徴とする。増加した赤みおよび温度は、血管拡張によって引き起こされて、炎症を起こした組織部位への深部体温で増加した血液供給をもたらす。腫脹は、炎症を起こした組織部位での血管透過性およびタンパク質および体液の蓄積によって引き起こされる。痛みは、炎症を起こした組織部位での、神経終末部を刺激する化学物質(例えば、ブラジキニン)の放出による。機能喪失は、いくつかの原因によることがありうる。
炎症は、現在、傷害または刺激への非特異的免疫応答のタイプとして認識されている。炎症反応は、細胞性成分および滲出性成分を有する。細胞性成分の場合、傷害または刺激部位における常在マクロファージが、TNFα、IFNα、IL−1、IL−6、IL12、IL−18およびその他などの炎症性メディエーターを放出することによって炎症反応を開始する。次に、白血球が動員されて、炎症を起こした組織部位中に移動し、そして追加の細胞性メディエーターの放出、食作用、酵素顆粒の放出および他の機能などのいろいろな機能を果たす。滲出性成分は、タンパク質を含有する血漿液の血管から炎症を起こした組織部位への通過を伴う。ブラジキニン、酸化窒素およびヒスタミンなどの炎症性メディエーターは、血管を拡張した状態にさせ、血管内の血流を遅らせ、そして血管透過性を増加させて、組織中への体液およびタンパク質の移動を可能にする。生化学的カスケードは、炎症反応を伝播するために活性化される(例えば、感染に応答した補体系、熱傷または外傷による壊死に応答した線維素溶解および凝固系、炎症を維持するキニン系)(Robbins Pathologic Basis of Disease, Philadelphia, W.B Saunders Company)。
炎症は、急性または慢性でありうる。急性炎症は、正に急な開始を有し、急速に重症になり、そして数日〜数週間後に急速且つ明瞭になくなる。慢性炎症は、急速にまたは徐々に開始することがあり、そして不確かな且つ不定の終結を伴って何週間、何ヶ月間または何年間も存続する傾向がある。慢性炎症は、傷害または刺激またはその存在によって生じる生産物が、傷害または刺激作用部位で存続し、しかも身体の免疫応答が、その作用を克服するのに不十分である場合に起こりうる。
炎症反応は、概して、傷害または刺激を取り除くのに身体に有用であるが、時々、身体を傷つけることがありうる。いくつかの場合、身体の免疫応答は、身体への既知の傷害または刺激が存在しない場合に、不適当に炎症反応を引き起こす。自己免疫疾患として分類されるこれらの場合、身体は、それ自身の組織を攻撃して、それ自身の組織を傷つける。
炎症を減少させる処置は、非ステロイド性抗炎症薬(NSAIDS)、更には、疾患修飾性薬を包含する。これら薬物の多くは、望ましくない副作用を有する。例えば、NSAIDSについて、最も一般的な副作用は、悪心、嘔吐、下痢、便秘、食欲低下、発疹、めまい、頭痛および嗜眠状態である。NSAIDは、体液停滞を引き起こすこともあり、浮腫をもたらす。最も重症の副作用は、腎不全、肝不全、潰瘍、および傷害または外科手術後の長期出血である。
Robbins Pathologic Basis of Disease, Philadelphia, W.B Saunders Company
したがって、炎症のための一層魅力的な臨床プロフィールを有する別の処置を発見する要求が存在している。炎症における、研究用に魅力的な標的となっている第XI因子の役割については、ほとんど知られていない。アンチセンス技術は、特定の遺伝子産物の発現を減少させるのに有効な手段として生まれているので、多数の治療的、診断用および研究用用途において第XI因子のモジュレーションのために独特に有用であると証明することができる。
本明細書中に提供されるのは、動物の第XI因子mRNAおよび/またはタンパク質のレベルをモジュレーションする方法、化合物および組成物である。本明細書中に提供されるのは、動物の炎症反応をモジュレーションするために、動物の第XI因子mRNAおよび/またはタンパク質のレベルをモジュレーションする方法、化合物および組成物である。本明細書中に更に提供されるのは、動物の炎症性疾患を改善する;炎症性疾患のリスクがある動物を処置する;炎症性疾患に苦しむ動物において第XI因子発現を阻害する;および動物の炎症性疾患のリスクを減少させるための、治療的有効量の第XI因子に標的指向する化合物を動物に投与する方法、化合物および組成物である。
特定の態様において、第XI因子特異的阻害剤は、第XI因子mRNAおよび/またはタンパク質のレベルをモジュレーションする(すなわち、低下させる)。特定の態様において、第XI因子特異的阻害剤は、核酸、タンパク質または低分子である。
特定の態様において、炎症性疾患のリスクがある動物は、治療的有効量の12〜30個連結したヌクレオシドから成る修飾オリゴヌクレオチドであって、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6またはSEQ ID NO:274に示される第XI因子核酸に相補的である修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物;または治療的有効量の12〜30個連結したヌクレオシドから成る修飾オリゴヌクレオチドを含み且つSEQ ID NO:15〜269に示される核酸塩基配列のいずれか一つより選択される核酸塩基配列の少なくとも8個隣接した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する化合物を動物に投与することによって処置する。
特定の態様において、炎症性疾患を有する動物は、治療的有効量の12〜30個連結したヌクレオシドから成る修飾オリゴヌクレオチドであって、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6またはSEQ ID NO:274に示される第XI因子核酸に相補的である修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物;または治療的有効量の12〜30個連結したヌクレオシドから成る修飾オリゴヌクレオチドであって、SEQ ID NO:15〜269に示される核酸塩基配列のいずれか一つより選択される核酸塩基配列の少なくとも8個隣接した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する、または本明細書中に記載の標的セグメントまたは標的領域に相補的な少なくとも8個隣接した核酸塩基を含む修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を動物に投与することによって処置する。特定の態様において、修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:15〜269に示される核酸塩基配列のいずれか一つより選択される核酸塩基配列の隣接した核酸塩基部分を含む核酸塩基配列を有する、または本明細書中に記載の標的セグメントまたは標的領域に相補的な隣接した核酸塩基部分を含む。
特定の態様において、モジュレーションは、細胞、組織、器官または生物中で生じることができる。特定の態様において、細胞、組織または器官は、動物中である。特定の態様において、動物は、ヒトである。特定の態様において、第XI因子mRNAレベルを減少させる。特定の態様において、第XI因子タンパク質レベルを減少させる。このような減少は、時間依存方式でまたは用量依存方式で生じることができる。
更に提供されるのは、炎症に関連した疾患、障害および状態を予防する、処置するおよび改善するのに有用な方法、化合物および組成物である。特定の態様において、このような疾患、障害および状態は、炎症性疾患、障害または状態である。
特定の態様において、処置方法は、それを必要としている個体に第XI因子特異的阻害剤を投与することを包含する。
特定の態様において、炎症は、敗血症関連ではない。特定の態様において、炎症は、感染に関連していない。
更に提供されるのは、12〜30個連結したヌクレオシドから成る修飾オリゴヌクレオチドであって、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6またはSEQ ID NO:274に示される第XI因子核酸に相補的である修飾オリゴヌクレオチドを包含する化合物および組成物である。特定の態様において、修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:15〜269に示される核酸塩基配列のいずれか一つより選択される核酸塩基配列の隣接した核酸塩基部分を含む核酸塩基配列を有する、または本明細書中に記載の標的セグメントまたは標的領域に相補的な隣接した核酸塩基部分を含む。特定の態様において、修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:15〜269に示される核酸塩基配列の中より選択される核酸塩基配列の少なくとも8個隣接した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する、または本明細書中に記載の標的セグメントまたは標的領域に相補的な少なくとも8個隣接した核酸塩基を含む。
前述の一般的な説明および以下の詳細な説明は双方とも、単に例示し且つ説明するものであり、請求の範囲に記載の本発明を制限するものではないということは理解されるはずである。本明細書中において、単数形の使用は、特に具体的に断らない限り、複数形を包含する。本明細書中で用いられる「または」の使用は、特に断らない限り、「および/または」を意味する。更に、「含めた」という用語並びに「包含する」および「含まれる」などの他の形の使用は、制限するものではない。更に、「要素」または「成分」などの用語は、一つのユニットを含む要素および成分も、特に具体的に断らない限り、二つ以上のサブユニットを含む要素および成分も包含する。
本明細書中に用いられる見出し部分は、単に系統化目的のためであり、記載の内容を制限すると解釈されるべきではない。本出願に引用される特許、特許出願、記事、書物および論文が含まれるがこれに制限されるわけではない書類または書類の一部分は全て、本明細書中に論じられる書類の一部分について参照して明白に、更には、そのまま援用される。
定義
具体的な定義が与えられない限り、本明細書中に記載の分析化学、合成有機化学、および医薬品・製薬化学に関連して利用される命名法、並びにそれら化学の手順および技法は、当該技術分野において周知の且つ一般的に用いられるものである。標準的な技法は、化学合成および化学分析に用いることができる。許容されるところで、特許、出願、公開出願および他の公報、National Center for Biotechnology Information(NCBI)などのデータベースによって入手可能なGENBANK受託番号および関連配列情報、および本明細書中の開示中に挙げられている他のデータは全て、本明細書中に論じられる書類の一部分について参照して、更には、そのまま援用される。
具体的な定義が与えられない限り、本明細書中に記載の分析化学、合成有機化学、および医薬品・製薬化学に関連して利用される命名法、並びにそれら化学の手順および技法は、当該技術分野において周知の且つ一般的に用いられるものである。標準的な技法は、化学合成および化学分析に用いることができる。許容されるところで、特許、出願、公開出願および他の公報、National Center for Biotechnology Information(NCBI)などのデータベースによって入手可能なGENBANK受託番号および関連配列情報、および本明細書中の開示中に挙げられている他のデータは全て、本明細書中に論じられる書類の一部分について参照して、更には、そのまま援用される。
特に断らない限り、次の用語は、次の意味を有する。
「2’−O−メトキシエチル」(更に、2’−MOEおよび2’−O(CH2)2−OCH3)は、フロシル(furosyl)環の2’位のO−メトキシエチル修飾を意味する。2’−O−メトキシエチルで修飾された糖は、修飾糖である。
「2’−O−メトキシエチルヌクレオチド」は、2’−O−メトキシエチル修飾糖部分を含むヌクレオチドを意味する。
「5−メチルシトシン」は、5’位に結合したメチル基で修飾されたシトシンを意味する。5−メチルシトシンは、修飾核酸塩基である。
「活性医薬物質」は、個体に投与された場合に治療的利点を与える医薬組成物中の一つまたは複数の物質を意味する。例えば、特定の態様において、第XI因子を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、活性医薬物質である。
「活性標的領域」または「標的領域」は、一つまたはそれを超える活性アンチセンス化合物に標的とされている領域を意味する。「活性アンチセンス化合物」は、標的核酸レベルまたはタンパク質レベルを減少させるアンチセンス化合物を意味する。
「同時に投与される」は、二つの物質の、双方の薬理作用が患者に同時に現れるいずれかの方式での共投与を意味する。同時投与は、双方の物質が、単一の医薬組成物で、同じ剤形で、または同じ投与経路で投与されることを必要としない。双方の物質の作用は、同時に現れる必要はない。それら作用は、一定時間重複している必要があるだけで、同一に広がる必要はない。
「投与すること」は、医薬物質を個体に与えることを意味し、それには、医療の専門家が投与することおよび自己投与することが含まれるが、これに制限されるわけではない。
「改善」は、関連疾患、障害または状態の少なくとも一つの指標、徴候または症状の軽減を意味する。特定の態様において、改善には、状態または疾患の一つまたはそれを超える指標の進行の遅延または緩慢化が含まれる。指標の重症度は、当業者に知られている主観的または客観的尺度によって決定されてよい。例えば、コラーゲン誘発性関節炎マウスの関節炎の改善は、Marty et al.(J. Clin. Invest 107:631-640 (2001))によって記載のようにマウスの関節炎の量を臨床的に評点することによって決定することができる。
「動物」は、ヒト、またはマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、およびサルおよびチンパンジーが含まれるがこれに制限されるわけではない非ヒト霊長類が含まれるがこれに制限されるわけではない非ヒト動物を意味する。
「解毒薬化合物」は、いずれかのアンチセンス活性の強度または持続時間を低下させることが可能な化合物を意味する。
「解毒薬オリゴヌクレオチド」は、アンチセンス化合物に相補的で且つそれとハイブリッド形成可能であるオリゴヌクレオチドを含む解毒薬化合物を意味する。
「解毒薬タンパク質」は、ペプチドを含む解毒薬化合物を意味する。
「抗体」は、抗原とある程度特異的に反応することを特徴とする分子を意味し、その場合、抗体および抗原は各々、他方によって定義される。抗体は、完全な抗体分子、またはその重鎖、軽鎖、Fab領域およびFc領域などのいずれかのフラグメントまたは領域を意味してよい。
「アンチセンス活性」は、アンチセンス化合物のその標的核酸へのハイブリダイゼーションに起因するいずれかの検出可能なまたは測定可能な活性を意味する。特定の態様において、アンチセンス活性は、標的核酸またはこのような標的核酸によってエンコードされたタンパク質の量または発現の低下である。
「アンチセンス化合物」は、水素結合によって標的核酸へのハイブリダイゼーションを行うことが可能であるオリゴマー性化合物を意味する。
「アンチセンス阻害」は、標的核酸に相補的なアンチセンス化合物の不存在下における標的核酸レベルまたは標的タンパク質レベルに比較した、アンチセンス化合物の存在下における標的核酸レベルまたは標的タンパク質レベルの減少を意味する。
「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、標的核酸の該当する領域またはセグメントへのハイブリダイゼーションを許容する核酸塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを意味する。
「二環式糖」は、2個の非 gem−環原子の架橋によって修飾されたフロシル環を意味する。二環式糖は、修飾糖である。
「二環式核酸」または「BNA」は、ヌクレオシドまたはヌクレオチドのフラノース部分が、フラノース環上の2個の炭素原子を連結している架橋を包含することによって、二環式環系を形成しているヌクレオシドまたはヌクレオチドを意味する。
「キャップ構造」または「末端キャップ部分」は、アンチセンス化合物のどちらかの末端に包含された化学修飾を意味する。
「化学的に異なる領域」は、同じアンチセンス化合物の別の領域とはある程度化学的に異なっているアンチセンス化合物の領域を意味する。例えば、2’−O−メトキシエチルヌクレオチドを有する領域は、2’−O−メトキシエチル修飾不含のヌクレオチドを有する領域とは化学的に異なる。
「キメラのアンチセンス化合物」は、少なくとも二つの化学的に異なる領域を有するアンチセンス化合物を意味する。
「共投与」は、個体への二つまたはそれを超える医薬物質の投与を意味する。二つまたはそれを超える医薬物質は、単一の医薬組成物であってよいし、または別々の医薬組成物であってよい。二つまたはそれを超える医薬物質は各々、同じまたは異なった投与経路によって投与されてよい。共投与は、同時、平行または逐次的投与を包含する。
「凝固因子」は、血液凝固カスケードにおけるI、II、III、IV、V、VII、VIII、IX、X、XI、XIIまたはXIIIといういずれかの因子を意味する。「凝固因子核酸」は、凝固因子をエンコードしているいずれかの核酸を意味する。例えば、特定の態様において、凝固因子核酸には、制限されることなく、凝固因子をエンコードしているDNA配列(イントロンおよびエクソンを含むゲノムDNAを含めた)、凝固因子をエンコードしているDNAより転写されたRNA配列、および凝固因子をエンコードしているmRNA配列が含まれる。「凝固因子mRNA」は、凝固因子タンパク質をエンコードしているmRNAを意味する。
「相補性」は、第一核酸の核酸塩基と第二核酸の核酸塩基との間の対合する能力を意味する。
「隣接した核酸塩基」は、互いに直に隣接する核酸塩基を意味する。
「希釈剤」は、薬理活性を欠いているが、薬学的に必要であるまたは望まれる組成物中の成分を意味する。例えば、注射される組成物中の希釈剤は、液体、例えば、生理食塩水溶液であってよい。
「疾患修飾性薬」は、自己免疫疾患(例えば、関節炎、結腸炎または糖尿病)、外傷または外科手術関連障害、敗血症、アレルギー性炎症および喘息を含めた炎症性疾患、障害または状態に関連した症状および/または進行を修飾するいずれかの物質を意味する。DMARDは、これら疾患、障害または状態に関連した一つまたはそれを超える症状および/または疾患進行を修飾する。
「用量」は、単回投与でまたは規定の時間内に与えられる医薬物質の規定量を意味する。特定の態様において、用量は、一つ、二つまたはそれを超える巨丸剤、錠剤または注射剤で投与されてよい。例えば、皮下投与が望まれる特定の態様において、所望の用量は、単回注射に容易に適応しない容量を必要とするので、2回またはそれを超える注射を用いて、所望の用量に達しさせてよい。特定の態様において、医薬物質は、注入によって長時間にわたってまたは継続して投与される。用量は、毎時、毎日、毎週または毎月の医薬物質の量として提示することができる。
「用量」は、単回投与でまたは規定の時間内に与えられる医薬物質の規定量を意味する。特定の態様において、用量は、一つ、二つまたはそれを超える巨丸剤、錠剤または注射剤で投与されてよい。例えば、皮下投与が望まれる特定の態様において、所望の用量は、単回注射に容易に適応しない容量を必要とするので、2回またはそれを超える注射を用いて、所望の用量に達しさせてよい。特定の態様において、医薬物質は、注入によって長時間にわたってまたは継続して投与される。用量は、毎時、毎日、毎週または毎月の医薬物質の量として提示することができる。
「有効量」は、活性医薬物質を必要としている個体において所望の生理学的結果を実現するのに十分な活性医薬物質の量を意味する。有効量は、処置される個体の健康および身体状態、処置される個体の分類群、組成物の処方、個体の医学的状態の評価および他の関係のある因子に依存して個体間で変動してよい。
「第XI因子」、「FXI」、「第11因子」および「F11」は、本明細書中において同じ意味に用いられる。
「第XI因子核酸」または「第XI因子核酸」は、第XI因子をエンコードしているいずれかの核酸を意味する。例えば、特定の態様において、第XI因子核酸には、第XI因子をエンコードしているDNA配列、第XI因子をエンコードしているDNA(イントロンおよびエクソンを含むゲノムDNAを含めた)より転写されたRNA配列、および第XI因子をエンコードしているmRNA配列が含まれる。「第XI因子mRNA」は、第XI因子タンパク質をエンコードしているmRNAを意味する。
「第XI因子特異的阻害剤」は、第XI因子mRNAおよび/または第XI因子タンパク質の発現を分子レベルで特異的に阻害することが可能ないずれかの物質を意味する。例えば、第XI因子特異的阻害剤には、第XI因子mRNAおよび/または第XI因子タンパク質の発現を阻害することが可能な核酸(アンチセンス化合物を含めた)、ペプチド、抗体、低分子および他の物質が含まれる。特定の態様において、第XI因子mRNAレベルおよび/または第XI因子タンパク質発現を特異的にモジュレーションすることにより、第XI因子特異的阻害剤は、炎症経路の成分に影響を与えることができる。同様に、特定の態様において、第XI因子特異的阻害剤は、動物中の他の分子過程に影響を与えることができる。
「第XI因子特異的阻害剤解毒薬」は、第XI因子特異的阻害剤の作用を低下させることが可能な化合物を意味する。特定の態様において、第XI因子特異的阻害剤解毒薬は、第XI因子ペプチド;第XI因子アンチセンス化合物に相補的な第XI因子解毒薬化合物を含めた第XI因子解毒薬オリゴヌクレオチド;および内因性または外因性行経路に影響を与えるいずれかの化合物またはタンパク質より選択される。
「十分に相補的な」または「100%相補的な」は、第一核酸の核酸塩基が各々、第二核酸中に相補的な核酸塩基を有することを意味する。特定の態様において、第一核酸は、アンチセンス化合物であり、そして標的核酸は、第二核酸である。
「ギャップマー(Gapmer)」は、RNアーゼH切断を支持する複数のヌクレオシドを有する内部領域が、一つまたはそれを超えるヌクレオシドを有する外部領域の間に位置しているキメラのアンチセンス化合物を意味し、ここにおいて、内部領域を構成するヌクレオシドは、外部領域を構成する一つまたは複数のヌクレオシドとは化学的に異なる。内部領域は、「ギャップセグメント」と称することができ、そして外部領域は、「ウィングセグメント」と称することができる。
「広幅ギャップ(Gap-widened)」は、1〜6個のヌクレオシドを有する5’および3’ウィングセグメントの間に且つそれらに直に隣接して位置する12個またはそれを超える隣接した2’−デオキシヌクレオシドのギャップセグメントを有するキメラのアンチセンス化合物を意味する。
「ハイブリダイゼーション」は、相補的核酸分子のアニーリングを意味する。特定の態様において、相補的核酸分子には、アンチセンス化合物および標的核酸が含まれる。
「炎症性疾患、障害または状態のリスクがある動物を識別すること」は、炎症性疾患、障害または状態を有すると診断された動物を識別すること、または炎症性疾患、障害または状態を発生する素質がある動物を識別することを意味する。炎症性疾患、障害または状態を発生する素質がある個体、例えば、結腸炎または関節炎の家族歴を有する個体。このような識別は、個体の病歴を評価することおよび標準的な臨床試験または評価を含めたいずれかの方法によって行うことができる。
「直に隣接する」は、直に隣接する要素の間に介在する要素が存在しないことを意味する。
「個体」は、処置または療法のために選択されるヒトまたは非ヒト動物を意味する。
「炎症反応」は、動物の炎症に関連したいずれかの疾患、障害または状態を意味する。炎症反応の例には、炎症反応を開始する原因となる傷害または刺激を取り除くための動物体による免疫応答が含まれる。或いは、炎症反応は、自己免疫疾患の場合などの、既知の傷害または刺激が見出されない場合でも、体内で開始することがありうる。炎症は、Th1またはTh2応答によって媒介されることがありうる。Th1およびTh2応答には、選択的サイトカインの生産および炎症部位への細胞の遊走または補充が含まれる。炎症部位へ遊走しうる細胞タイプには、好酸球およびマクロファージが含まれるが、これに制限されるわけではない。Th1サイトカインには、IL−1、IL−6、TNFα、INFγおよび角化細胞化学誘引物質(KC)が含まれるが、これに制限されるわけではない。Th2サイトカインには、IL−4およびIL−5が含まれるが、これに制限されるわけではない。一つまたは複数のサイトカインレベルの低下または細胞遊走は、低下した炎症を示すものでありうる。したがって、サイトカインレベルまたは細胞遊走は、Th1またはTh2で媒介される炎症などの特定のタイプの炎症のマーカーでありうる。
「炎症性疾患」、「炎症性障害」または「炎症性状態」は、組織における増加した赤み(発赤)、温度(灼熱)、腫脹(腫瘍)、痛み(疼痛)および/または機能喪失(機能障害)の臨床徴候を特徴とする傷害または刺激への炎症反応に関連した疾患、障害または状態を意味する。
「ヌクレオシド間結合」は、ヌクレオシド間の化学結合を意味する。
「連結したヌクレオシド」は、互いに結合している隣接するヌクレオシドを意味する。
「ミスマッチ」または「非相補的核酸塩基」または「MM」は、第一核酸の核酸塩基が、第二または標的核酸の該当する核酸塩基と対合可能でない場合を意味する。
「修飾ヌクレオシド間結合」は、天然に存在するヌクレオシド間結合(すなわち、ホスホジエステルヌクレオシド間結合)からの置換またはいずれかの変化を意味する。
「修飾核酸塩基」は、アデニン、シトシン、グアニン、チミジンまたはウラシル以外のいずれかの核酸塩基を意味する。「未修飾核酸塩基」は、アデニン(A)およびグアニン(G)というプリン塩基、およびチミン(T)、シトシン(C)およびウラシル(U)というピリミジン塩基を意味する。
「修飾ヌクレオチド」は、修飾糖部分、修飾ヌクレオシド間結合または修飾核酸塩基を独立して有するヌクレオチドを意味する。「修飾ヌクレオシド」は、修飾糖部分または修飾核酸塩基を独立して有するヌクレオシドを意味する。
「修飾オリゴヌクレオチド」は、修飾ヌクレオシド間結合、修飾糖または修飾核酸塩基を含むオリゴヌクレオチドを意味する。
「修飾糖」は、天然糖からの置換または変化を意味する。
「モジュレーションすること」は、細胞、組織、器官または生物中の特性を変化させることまたは調整することを意味する。例えば、第XI因子mRNAをモジュレーションすることは、細胞、組織、器官または生物中の第XI因子mRNAおよび/または第XI因子タンパク質のレベルを増加させるまたは低下させることを意味することができる。第XI因子mRNAおよび/またはタンパク質をモジュレーションすることは、細胞、組織、器官または生物中の炎症反応の増加または低下をもたらすことがありうる。「モジュレーター」は、細胞、組織、器官または生物中の変化をもたらす。例えば、第XI因子アンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞、組織、器官または生物中の第XI因子mRNAおよび/または第XI因子タンパク質の量を増加させるまたは低下させるモジュレーターでありうる。「モチーフ」は、アンチセンス化合物中の化学的に異なる領域のパターンを意味する。
「天然に存在するヌクレオシド間結合」は、3’〜5’ホスホジエステル結合を意味する。
「天然糖部分」は、DNA(2’−H)またはRNA(2’−OH)中に見出される糖を意味する。
「NSAID」は、非ステロイド性抗炎症薬(Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drug)を意味する。NSAIDは、対象の炎症反応を減少させるが、概して、疾患を改善することはないし、または疾患を発症させないまたは進行させないこともない。
「核酸」は、モノマー性ヌクレオチドから構成される分子を意味する。核酸には、リボ核酸(RNA)、デオキシリボ核酸(DNA)、一本鎖核酸、二本鎖核酸、低分子内在性(small interfering)リボ核酸(siRNA)およびマイクロRNA(miRNA)が含まれる。
「核酸塩基」は、別の核酸の塩基と対合することが可能な複素環式部分を意味する。
「核酸塩基配列」は、いずれの糖、結合または核酸塩基修飾とも無関係な隣接した核酸塩基の順序を意味する。
「ヌクレオシド」は、糖に連結した核酸塩基を意味する。
「ヌクレオチド」は、ヌクレオシドの糖部分に共有結合で連結したリン酸基を有するヌクレオシドを意味する。
「オリゴマー性化合物」または「オリゴマー」は、少なくとも核酸分子の領域にハイブリッド形成することが可能である連結したモノマー性サブユニットのポリマーを意味する。
「オリゴヌクレオチド」は、互いに独立して修飾されうるまたは未修飾でありうる各々連結したヌクレオシドのポリマーを意味する。
「非経口投与」は、注射または注入による投与を意味する。非経口投与には、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、動脈内投与、腹腔内投与または頭蓋内投与、例えば、髄腔内または脳室内投与が含まれる。
「ペプチド」は、少なくとも二つのアミノ酸をアミド結合によって連結することによって形成される分子を意味する。ペプチドは、ポリペプチドおよびタンパク質を意味する。
「医薬組成物」は、個体へ投与するのに適する物質の混合物を意味する。例えば、医薬組成物は、一つまたはそれを超える活性医薬物質および滅菌水溶液を含んでよい。
「薬学的に許容しうる塩」は、アンチセンス化合物の生理学的に且つ薬学的に許容しうる塩、すなわち、親オリゴヌクレオチドの所望の生物学的活性を保持する上に、望ましくない毒物学的作用を与えない塩を意味する。
「ホスホロチオエート結合」は、ホスホジエステル結合が、非架橋性酸素原子の一つを硫黄原子で置き換えることによって修飾されているヌクレオシドの間の結合を意味する。ホスホロチオエート結合は、修飾ヌクレオシド間結合である。
「部分」は、核酸の規定数隣接した(すなわち、連結した)核酸塩基を意味する。特定の態様において、一部分は、標的核酸の規定数隣接した核酸塩基である。特定の態様において、一部分は、アンチセンス化合物の規定数隣接した核酸塩基である。
「予防する」は、疾患、障害または状態の開始、発生または進行を何分間か〜無期限の一定期間遅延させることまたは妨げることを意味する。予防するは、更に、疾患、障害または状態を発生するリスクを減少させることを意味する。
「プロドラッグ」は、内因性酵素または他の化学物質または条件の作用によって体内またはその細胞内で活性形へ変換される不活性形で製造される治療薬を意味する。
「副作用」は、処置に起因する所望の作用以外の生理学的応答を意味する。特定の態様において、副作用には、注射部位反応、肝機能検査異常、腎機能異常、肝毒性、腎毒性、中枢神経系異常、筋障害および倦怠感が含まれる。例えば、血清中の増加したアミノトランスフェラーゼレベルは、肝毒性または肝機能異常を示すことがありうる。例えば、増加したビリルビンは、肝毒性または肝機能異常を示すことがありうる。
「一本鎖オリゴヌクレオチド」は、相補鎖へハイブリッド形成されないオリゴヌクレオチドを意味する。
「特異的にハイブリッド形成可能な」は、アンチセンスオリゴヌクレオチドと標的核酸との間に、所望の作用を引き起こすのに十分な程度の相補性を有するが、特異的結合が望まれる条件下、すなわち、in vivo 検定および治療的処置の場合の生理学的条件下において、非標的核酸への作用を最小限にしかまたは全く示さないアンチセンス化合物を意味する。
「標的指向すること」または「標的とされる」は、標的核酸に特異的にハイブリッド形成し且つ所望の作用を引き起こすであろうアンチセンス化合物の設計および選択の過程を意味する。
「標的核酸」、「標的RNA」および「標的RNA転写物」は全て、アンチセンス化合物によって標的とされることが可能な核酸を意味する。
「標的セグメント」は、アンチセンス化合物に標的とされる標的核酸のヌクレオチド配列を意味する。「5’標的部位」は、標的セグメントの最も5’のヌクレオチドを意味する。「3’標的部位」は、標的セグメントの最も3’のヌクレオチドを意味する。
「Th1関連疾患、障害または状態」は、Th1免疫応答によって媒介される炎症性疾患、障害または状態を意味する。Th1疾患の例には、アレルギー性疾患(例えば、アレルギー性鼻炎)、自己免疫疾患(例えば、多発性硬化症、関節炎、強皮症、乾癬、セリアック病)、心臓血管疾患、結腸炎、糖尿病(例えば、1型インスリン依存性糖尿病)、過敏症(例えば、4型過敏症)、感染症(例えば、ウイルス感染、ミコバクテリア感染)および後部ブドウ膜炎が含まれるが、これに制限されるわけではない。
「Th2関連疾患、障害または状態」は、Th2免疫応答によって媒介される炎症性疾患、障害または状態を意味する。Th2疾患の例には、アレルギー性疾患(例えば、慢性鼻副鼻腔炎)、気道過敏性、喘息、アトピー性皮膚炎、結腸炎、子宮内膜症、感染症(例えば、蠕虫感染)、甲状腺疾患(例えば、グレーヴズ病)、過敏症(例えば、1型、2型または3型過敏症)および膵炎が含まれるが、これに制限されるわけではない。
「Th1」または「Th2」応答には、選択的サイトカインの生産および炎症部位への細胞の遊走または補充が含まれる。炎症部位へ遊走しうる細胞タイプには、好酸球およびマクロファージが含まれるが、これに制限されるわけではない。したがって、サイトカインレベルまたは細胞遊走は、Th1またはTh2で媒介される炎症などの特定のタイプの炎症のマーカーでありうる。Th1マーカーには、サイトカインIL−1、IL−6、TNFα、INFγおよび角化細胞化学誘引物質(KC)が含まれるが、これに制限されるわけではない。Th2マーカーには、好酸球浸潤、粘液生産およびサイトカインIL−4およびIL−5が含まれるが、これに制限されるわけではない。一つまたは複数のサイトカインレベルの低下または細胞遊走は、低下した炎症を示すものでありうる。
「治療的有効量」は、個体に治療的利点を与える医薬物質の量を意味する。
「処置する」は、動物の疾患、障害または状態の変更または改善を行うために、動物に医薬組成物を投与することを意味する。特定の態様において、一つまたはそれを超える医薬組成物を、動物に投与することができる。
「未修飾ヌクレオチド」は、天然に存在する核酸塩基、糖部分およびヌクレオシド間結合から構成されるヌクレオチドを意味する。特定の態様において、未修飾ヌクレオチドは、RNAヌクレオチド(すなわち、β−D−リボヌクレオチド)またはDNAヌクレオチド(すなわち、β−D−デオキシリボヌクレオチド)である。
特定の態様
特定の態様において、提供されるのは、化合物であって、第XI因子モジュレーターを含む化合物を動物に投与することによって炎症反応をモジュレーションする方法、化合物および組成物である。第XI因子のモジュレーターは、炎症反応を必要とされるように増加させるまたは低下させるために、第XI因子mRNAおよびタンパク質発現の増加または低下をもたらすことができる。特定の態様において、動物における第XI因子阻害は、第XI因子に標的指向するモジュレーターを投与することによって逆行する。本発明の特定の態様において、第XI因子は、そのモジュレーターによって阻害される。第XI因子モジュレーターは、第XI因子に標的指向する修飾オリゴヌクレオチドでありうる。
特定の態様において、提供されるのは、化合物であって、第XI因子モジュレーターを含む化合物を動物に投与することによって炎症反応をモジュレーションする方法、化合物および組成物である。第XI因子のモジュレーターは、炎症反応を必要とされるように増加させるまたは低下させるために、第XI因子mRNAおよびタンパク質発現の増加または低下をもたらすことができる。特定の態様において、動物における第XI因子阻害は、第XI因子に標的指向するモジュレーターを投与することによって逆行する。本発明の特定の態様において、第XI因子は、そのモジュレーターによって阻害される。第XI因子モジュレーターは、第XI因子に標的指向する修飾オリゴヌクレオチドでありうる。
特定の態様において、提供されるのは、第XI因子に関連した炎症性疾患、障害および状態の処置、予防または改善を必要としている動物の第XI因子に関連した炎症性疾患、障害および状態の処置、予防または改善のための方法、化合物および組成物である。ある態様において、動物の炎症性疾患を改善する方法は、第XI因子に標的指向する化合物を動物に投与することを含む。
特定の態様において、提供されるのは、炎症性疾患、障害または状態のリスクがある動物を処置する方法、化合物および組成物であって、治療的有効量の第XI因子に標的指向する化合物をリスクがある動物に投与することを含む方法、化合物および組成物である。
特定の態様において、提供されるのは、炎症性疾患、障害または状態に苦しむ動物において第XI因子発現を阻害する方法、化合物および組成物であって、第XI因子に標的指向する化合物を動物に投与することを含む方法、化合物および組成物である。
特定の態様において、提供されるのは、動物の炎症性疾患、障害または状態のリスクを減少させる方法、化合物および組成物であって、第XI因子に標的指向する化合物を動物に投与することを含む方法、化合物および組成物である。
特定の態様において、提供されるのは、炎症反応、炎症性疾患、障害または状態を処置する、予防するまたは改善する場合に用いるための第XI因子モジュレーターであって、第XI因子特異的阻害剤である第XI因子モジュレーターである。特定の態様において、第XI因子特異的阻害剤は、第XI因子mRNAおよび/または第XI因子タンパク質の発現を阻害することが可能な核酸(アンチセンス化合物を含めた)、ペプチド、抗体、低分子および他の物質である。
特定の態様において、炎症性疾患、障害または状態は、フィブリン関連炎症性疾患、障害または状態である。
特定の態様において、炎症性疾患、障害または状態は、敗血症関連でも感染関連でもない。
特定の態様において、炎症性疾患、障害または状態は、Th1に媒介される。特定の態様において、Th1に媒介される炎症性疾患、障害または状態のマーカーを低下させる。Th1のマーカーには、IL−1、IL−6、INF−γ、TNF−αまたはKCなどのサイトカインが含まれるが、これに制限されるわけではない。特定の態様において、本発明の化合物は、Th1に媒介される疾患を予防するまたは改善する。Th1に媒介される疾患には、アレルギー性疾患(例えば、アレルギー性鼻炎)、自己免疫疾患(例えば、多発性硬化症、関節炎、強皮症、乾癬、セリアック病)、心臓血管疾患、結腸炎、糖尿病(例えば、1型インスリン依存性糖尿病)、過敏症(例えば、4型過敏症)、感染症(例えば、ウイルス感染、ミコバクテリア感染)および後部ブドウ膜炎が含まれるが、これに制限されるわけではない。
特定の態様において、炎症性疾患、障害または状態は、Th2に媒介される。特定の態様において、Th2に媒介される炎症性疾患、障害または状態のマーカーを低下させる。Th2のマーカーには、炎症部位への好酸球浸潤、粘液生産およびIL−4およびIL−5などのサイトカインが含まれるが、これに制限されるわけではない。特定の態様において、本発明の化合物は、Th2に媒介される疾患を予防するまたは改善する。Th2に媒介される疾患には、アレルギー性疾患(例えば、慢性鼻副鼻腔炎)、気道過敏性、喘息、アトピー性皮膚炎、結腸炎、子宮内膜症、感染症(例えば、蠕虫感染)、甲状腺疾患(例えば、グレーヴズ病)、過敏症(例えば、1型、2型または3型過敏症)および膵炎が含まれるが、これに制限されるわけではない。
特定の態様において、提供されるのは、第XI因子核酸を標的とする化合物である。特定の態様において、第XI因子核酸は、GENBANK受託番号NM_000128.3(本明細書中にSEQ ID NO:1として包含される)、GENBANK受託番号NT_022792.17のヌクレオチド19598000〜19624000(本明細書中にSEQ ID NO:2として包含される)およびGENBANK受託番号NM_028066.1(本明細書中にSEQ ID NO:6として包含される)、エクソン1〜15のGENBANK受託番号NW_001118167.1(本明細書中にSEQ ID NO:274として包含される)に示されるいずれかの配列である。
特定の態様において、本発明は、修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を提供する。特定の態様において、本発明の化合物は、12〜30個連結したヌクレオシドから成る修飾オリゴヌクレオチドを含む。
特定の態様において、本発明の化合物は、SEQ ID NO:1の等長部分に少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%相補的な核酸塩基配列を含む修飾オリゴヌクレオチドを含んでよい。特定の態様において、本発明の化合物は、SEQ ID NO:1の等長部分に100%相補的な核酸塩基配列を含む修飾オリゴヌクレオチドを含んでよい。
特定の態様において、本発明は、標的RNA配列上の核酸塩基範囲として下に示される標的領域の少なくとも一部分に相補的な核酸塩基配列を含む修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を提供する。
特定の態様において、本発明は、SEQ ID NO:1の核酸塩基656〜676の少なくとも一部分に相補的な核酸塩基配列を含む修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を提供する。この修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:1の核酸塩基656〜676の等長部分に相補的な少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個または20個隣接した核酸塩基を含んでよい。この修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:1の等長部分に少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%相補的な核酸塩基配列を含んでよい。この修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:1の等長部分に100%相補的な核酸塩基配列を含んでよい。この修飾オリゴヌクレオチドは、RT−PCR検定法を用いて、場合により、HepG2細胞中で(例えば、実施例3に記載のように)決定されるヒトmRNAレベルの少なくとも80%阻害を達成することができる。
特定の態様において、本発明は、SEQ ID NO:1の核酸塩基665〜687の少なくとも一部分に相補的な核酸塩基配列を含む修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を提供する。この修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:1の核酸塩基665〜687の等長部分に相補的な少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個または20個隣接した核酸塩基を含んでよい。この修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:1の等長部分に少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%相補的な核酸塩基配列を含んでよい。この修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:1の等長部分に100%相補的な核酸塩基配列を含んでよい。この修飾オリゴヌクレオチドは、RT−PCR検定法を用いて、場合により、HepG2細胞中で(例えば、実施例3に記載のように)決定されるヒトmRNAレベルの少なくとも50%阻害を達成することができる。
特定の態様において、本発明は、SEQ ID NO:1の核酸塩基675〜704の少なくとも一部分に相補的な核酸塩基配列を含む修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を提供する。この修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:1の核酸塩基675〜704の等長部分に相補的な少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個または20個隣接した核酸塩基を含んでよい。この修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:1の等長部分に少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%相補的な核酸塩基配列を含んでよい。この修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:1の等長部分に100%相補的な核酸塩基配列を含んでよい。この修飾オリゴヌクレオチドは、RT−PCR検定法を用いて、場合により、HepG2細胞中で(例えば、実施例3に記載のように)決定されるヒトmRNAレベルの少なくとも50%阻害を達成することができる。
特定の態様において、本発明は、SEQ ID NO:1の核酸塩基677〜704の少なくとも一部分に相補的な核酸塩基配列を含む修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を提供する。この修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:1の核酸塩基677〜704の等長部分に相補的な少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個または20個隣接した核酸塩基を含んでよい。この修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:1の等長部分に少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%相補的な核酸塩基配列を含んでよい。この修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:1の等長部分に100%相補的な核酸塩基配列を含んでよい。この修飾オリゴヌクレオチドは、RT−PCR検定法を用いて、場合により、HepG2細胞中で(例えば、実施例3に記載のように)決定されるヒトmRNAレベルの少なくとも60%阻害を達成することができる。
特定の態様において、本発明は、SEQ ID NO:1の核酸塩基678〜697の少なくとも一部分に相補的な核酸塩基配列を含む修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を提供する。この修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:1の核酸塩基678〜697の等長部分に相補的な少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個または20個隣接した核酸塩基を含んでよい。この修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:1の等長部分に少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%相補的な核酸塩基配列を含んでよい。この修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:1の等長部分に100%相補的な核酸塩基配列を含んでよい。この修飾オリゴヌクレオチドは、RT−PCR検定法を用いて、場合により、HepG2細胞中で(例えば、実施例3に記載のように)決定されるヒトmRNAレベルの少なくとも70%阻害を達成することができる。
特定の態様において、本発明は、SEQ ID NO:1の核酸塩基680〜703の少なくとも一部分に相補的な核酸塩基配列を含む修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を提供する。この修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:1の核酸塩基680〜703の等長部分に相補的な少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個または20個隣接した核酸塩基を含んでよい。この修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:1の等長部分に少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%相補的な核酸塩基配列を含んでよい。この修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:1の等長部分に100%相補的な核酸塩基配列を含んでよい。この修飾オリゴヌクレオチドは、RT−PCR検定法を用いて、場合により、HepG2細胞中で(例えば、実施例3および実施例14に記載のように)決定されるヒトmRNAレベルの少なくとも80%阻害を達成することができる。
特定の態様において、本発明は、SEQ ID NO:1の核酸塩基683〜702の少なくとも一部分に相補的な核酸塩基配列を含む修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を提供する。この修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:1の核酸塩基683〜702の等長部分に相補的な少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個または20個隣接した核酸塩基を含んでよい。この修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:1の等長部分に少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%相補的な核酸塩基配列を含んでよい。この修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:1の等長部分に100%相補的な核酸塩基配列を含んでよい。この修飾オリゴヌクレオチドは、RT−PCR検定法を用いて、場合により、HepG2細胞中で(例えば、実施例3に記載のように)決定されるヒトmRNAレベルの少なくとも90%阻害を達成することができる。
特定の態様において、本発明は、SEQ ID NO:1の核酸塩基738〜759の少なくとも一部分に相補的な核酸塩基配列を含む修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を提供する。この修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:1の核酸塩基738〜759の等長部分に相補的な少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個または20個隣接した核酸塩基を含んでよい。この修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:1の等長部分に少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%相補的な核酸塩基配列を含んでよい。この修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:1の等長部分に100%相補的な核酸塩基配列を含んでよい。この修飾オリゴヌクレオチドは、RT−PCR検定法を用いて、場合により、HepG2細胞中で(例えば、実施例3および実施例14に記載のように)決定されるヒトmRNAレベルの少なくとも80%阻害を達成することができる。
特定の態様において、本発明は、SEQ ID NO:1の核酸塩基738〜760の少なくとも一部分に相補的な核酸塩基配列を含む修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を提供する。この修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:1の核酸塩基738〜760の等長部分に相補的な少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個または20個隣接した核酸塩基を含んでよい。この修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:1の等長部分に少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%相補的な核酸塩基配列を含んでよい。この修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:1の等長部分に100%相補的な核酸塩基配列を含んでよい。この修飾オリゴヌクレオチドは、RT−PCR検定法を用いて、場合により、HepG2細胞中で(例えば、実施例3に記載のように)決定されるヒトmRNAレベルの少なくとも60%阻害を達成することができる。
特定の態様において、本発明は、SEQ ID NO:1の核酸塩基738〜762の少なくとも一部分に相補的な核酸塩基配列を含む修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を提供する。この修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:1の核酸塩基738〜762の等長部分に相補的な少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個または20個隣接した核酸塩基を含んでよい。この修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:1の等長部分に少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%相補的な核酸塩基配列を含んでよい。この修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:1の等長部分に100%相補的な核酸塩基配列を含んでよい。この修飾オリゴヌクレオチドは、RT−PCR検定法を用いて、場合により、HepG2細胞中で(例えば、実施例3に記載のように)決定されるヒトmRNAレベルの少なくとも45%阻害を達成することができる。
特定の態様において、本発明は、SEQ ID NO:1の核酸塩基1018〜1042の少なくとも一部分に相補的な核酸塩基配列を含む修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を提供する。この修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:1の核酸塩基1018〜1042の等長部分に相補的な少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個または20個隣接した核酸塩基を含んでよい。この修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:1の等長部分に少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%相補的な核酸塩基配列を含んでよい。この修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:1の等長部分に100%相補的な核酸塩基配列を含んでよい。この修飾オリゴヌクレオチドは、RT−PCR検定法を用いて、場合により、HepG2細胞中で(例えば、実施例3に記載のように)決定されるヒトmRNAレベルの少なくとも80%阻害を達成することができる。
特定の態様において、本発明は、SEQ ID NO:1の核酸塩基1062〜1089の少なくとも一部分に相補的な核酸塩基配列を含む修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を提供する。この修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:1の核酸塩基1062〜1089の等長部分に相補的な少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個または20個隣接した核酸塩基を含んでよい。この修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:1の等長部分に少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%相補的な核酸塩基配列を含んでよい。この修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:1の等長部分に100%相補的な核酸塩基配列を含んでよい。この修飾オリゴヌクレオチドは、RT−PCR検定法を用いて、場合により、HepG2細胞中で(例えば、実施例3に記載のように)決定されるヒトmRNAレベルの少なくとも70%阻害を達成することができる。
特定の態様において、本発明は、SEQ ID NO:1の核酸塩基1062〜1090の少なくとも一部分に相補的な核酸塩基配列を含む修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を提供する。この修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:1の核酸塩基1062〜1090の等長部分に相補的な少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個または20個隣接した核酸塩基を含んでよい。この修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:1の等長部分に少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%相補的な核酸塩基配列を含んでよい。この修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:1の等長部分に100%相補的な核酸塩基配列を含んでよい。この修飾オリゴヌクレオチドは、RT−PCR検定法を用いて、場合により、HepG2細胞中で(例えば、実施例3に記載のように)決定されるヒトmRNAレベルの少なくとも60%阻害を達成することができる。
特定の態様において、本発明は、SEQ ID NO:1の核酸塩基1062〜1091の少なくとも一部分に相補的な核酸塩基配列を含む修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を提供する。この修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:1の核酸塩基1062〜1091の等長部分に相補的な少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個または20個隣接した核酸塩基を含んでよい。この修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:1の等長部分に少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%相補的な核酸塩基配列を含んでよい。この修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:1の等長部分に100%相補的な核酸塩基配列を含んでよい。この修飾オリゴヌクレオチドは、RT−PCR検定法を用いて、場合により、HepG2細胞中で(例えば、実施例3に記載のように)決定されるヒトmRNAレベルの少なくとも20%阻害を達成することができる。
特定の態様において、本発明は、SEQ ID NO:1の核酸塩基1275〜1301の少なくとも一部分に相補的な核酸塩基配列を含む修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を提供する。この修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:1の核酸塩基1062〜1091の等長部分に相補的な少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個または20個隣接した核酸塩基を含んでよい。この修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:1の等長部分に少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%相補的な核酸塩基配列を含んでよい。この修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:1の等長部分に100%相補的な核酸塩基配列を含んでよい。この修飾オリゴヌクレオチドは、RT−PCR検定法を用いて、場合により、HepG2細胞中で(例えば、実施例3に記載のように)決定されるヒトmRNAレベルの少なくとも80%阻害を達成することができる。
特定の態様において、本発明は、SEQ ID NO:1の核酸塩基1276〜1301の少なくとも一部分に相補的な核酸塩基配列を含む修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を提供する。この修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:1の核酸塩基1062〜1091の等長部分に相補的な少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個または20個隣接した核酸塩基を含んでよい。この修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:1の等長部分に少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%相補的な核酸塩基配列を含んでよい。この修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:1の等長部分に100%相補的な核酸塩基配列を含んでよい。この修飾オリゴヌクレオチドは、RT−PCR検定法を用いて、場合により、HepG2細胞中で(例えば、実施例14に記載のように)決定されるヒトmRNAレベルの少なくとも80%阻害を達成することができる。
特定の態様において、本発明は、SEQ ID NO:1の核酸塩基1284〜1308の少なくとも一部分に相補的な核酸塩基配列を含む修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を提供する。この修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:1の核酸塩基1062〜1091の等長部分に相補的な少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個または20個隣接した核酸塩基を含んでよい。この修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:1の等長部分に少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%相補的な核酸塩基配列を含んでよい。この修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:1の等長部分に100%相補的な核酸塩基配列を含んでよい。この修飾オリゴヌクレオチドは、RT−PCR検定法を用いて、場合により、HepG2細胞中で(例えば、実施例3に記載のように)決定されるヒトmRNAレベルの少なくとも80%阻害を達成することができる。
特定の態様において、本発明は、SEQ ID NO:1の核酸塩基1291〜1317の少なくとも一部分に相補的な核酸塩基配列を含む修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を提供する。この修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:1の核酸塩基1062〜1091の等長部分に相補的な少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個または20個隣接した核酸塩基を含んでよい。この修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:1の等長部分に少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%相補的な核酸塩基配列を含んでよい。この修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:1の等長部分に100%相補的な核酸塩基配列を含んでよい。この修飾オリゴヌクレオチドは、RT−PCR検定法を用いて、場合により、HepG2細胞中で(例えば、実施例3に記載のように)決定されるヒトmRNAレベルの少なくとも80%阻害を達成することができる。
特定の態様において、本発明は、SEQ ID NO:1の核酸塩基1275〜1318の少なくとも一部分に相補的な核酸塩基配列を含む修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を提供する。この修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:1の核酸塩基1275〜1318の等長部分に相補的な少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個または20個隣接した核酸塩基を含んでよい。この修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:1の等長部分に少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%相補的な核酸塩基配列を含んでよい。この修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:1の等長部分に100%相補的な核酸塩基配列を含んでよい。この修飾オリゴヌクレオチドは、RT−PCR検定法を用いて、場合により、HepG2細胞中で(例えば、実施例3に記載のように)決定されるヒトmRNAレベルの少なくとも70%阻害を達成することができる。
本発明の態様は、12〜30個連結したヌクレオシドから成る且つSEQ ID NO:15〜241に示される核酸塩基配列の中より選択される核酸塩基配列の少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個または20個隣接した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を提供する。
本発明の態様は、12〜30個連結したヌクレオシドから成る且つSEQ ID NO:15〜269に示される核酸塩基配列の中より選択される核酸塩基配列の少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個または20個隣接した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を提供する。
本発明の態様は、12〜30個連結したヌクレオシドから成る且つSEQ ID NO:242〜269に示される核酸塩基配列の中より選択される核酸塩基配列の少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個または20個隣接した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を提供する。
本発明の特定の態様は、12〜30個連結したヌクレオシドから成る且つSEQ ID NO:15〜269に示される核酸塩基配列の中より選択される核酸塩基配列の少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個または20個隣接した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を提供する。
本発明の特定の態様は、12〜30個連結したヌクレオシドから成る且つSEQ ID NO:242〜269に示される核酸塩基配列の中より選択される核酸塩基配列の少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個または20個隣接した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を提供する。
特定の態様において、修飾オリゴヌクレオチドは、ISIS No:22、31、32、34、36〜38、40、41、43、51〜53、55、56、59、60、64、66、71、73、75、96、98〜103、105〜109、113〜117、119、124、127、129、171、172、174、176、178、179、181〜197、199〜211および213〜232より選択される核酸塩基配列の少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個または20個隣接した核酸塩基を含む。特定の態様において、修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:22、31、32、34、36〜38、40、41、43、51〜53、55、56、59、60、64、66、71、73、75、96、98〜103、105〜109、113〜117、119、124、127、129、171、172、174、176、178、179、181〜197、199〜211および213〜232より選択される核酸塩基配列を含む。特定の態様において、修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:22、31、32、34、36〜38、40、41、43、51〜53、55、56、59、60、64、66、71、73、75、96、98〜103、105〜109、113〜117、119、124、127、129、171、172、174、176、178、179、181〜197、199〜211および213〜232より選択される核酸塩基配列から成る。この修飾オリゴヌクレオチドは、RT−PCR検定法を用いて、場合により、HepG2細胞中で(例えば、実施例3に記載のように)決定されるヒトmRNAレベルの少なくとも70%阻害を達成することができる。
特定の態様において、修飾オリゴヌクレオチドは、ISIS No:22、31、34、37、40、43、51〜53、60、98、100〜102、105〜109、114、115、119、171、174、176、179、181、186、188〜193、195、196、199〜210および213〜232より選択される核酸塩基配列の少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個または20個隣接した核酸塩基を含む。特定の態様において、修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:22、31、34、37、40、43、51〜53、60、98、100〜102、105〜109、114、115、119、171、174、176、179、181、186、188〜193、195、196、199〜210および213〜232より選択される核酸塩基配列を含む。特定の態様において、修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:22、31、34、37、40、43、51〜53、60、98、100〜102、105〜109、114、115、119、171、174、176、179、181、186、188〜193、195、196、199〜210および213〜232より選択される核酸塩基配列から成る。この修飾オリゴヌクレオチドは、RT−PCR検定法を用いて、場合により、HepG2細胞中で(例えば、実施例3に記載のように)決定されるヒトmRNAレベルの少なくとも80%阻害を達成することができる。
特定の態様において、修飾オリゴヌクレオチドは、ISIS No:31、37、100、105、179、190〜193、196、202〜207、209、210、214〜219、221〜224、226、227、229および231より選択される核酸塩基配列の少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個または20個隣接した核酸塩基を含む。特定の態様において、修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:31、37、100、105、179、190〜193、196、202〜207、209、210、214〜219、221〜224、226、227、229および231より選択される核酸塩基配列を含む。特定の態様において、修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:31、37、100、105、179、190〜193、196、202〜207、209、210、214〜219、221〜224、226、227、229および231より選択される核酸塩基配列から成る。この修飾オリゴヌクレオチドは、RT−PCR検定法を用いて、場合により、HepG2細胞中で(例えば、実施例3に記載のように)決定されるヒトmRNAレベルの少なくとも90%阻害を達成することができる。
特定の態様において、修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:34、52、53、114、115、190、213〜232、242〜260および262〜266より選択される核酸塩基配列の少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個または20個隣接した核酸塩基を含む。特定の態様において、修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:34、52、53、114、115、190、213〜232、242〜260および262〜266より選択される核酸塩基配列を含む。特定の態様において、修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:34、52、53、114、115、190、213〜232、242〜260および262〜266より選択される核酸塩基配列から成る。この修飾オリゴヌクレオチドは、RT−PCR検定法を用いて、場合により、HepG2細胞中で(例えば、実施例14に記載のように)決定されるヒトmRNAレベルの少なくとも70%阻害を達成することができる。
特定の態様において、修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:34、52、53、114、115、190、213〜216、218〜226、243〜246、248、249、252〜259、264および265より選択される核酸塩基配列の少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個または20個隣接した核酸塩基を含む。特定の態様において、修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:34、52、53、114、115、190、213〜216、218〜226、243〜246、248、249、252〜259、264および265より選択される核酸塩基配列を含む。特定の態様において、修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:34、52、53、114、115、190、213〜216、218〜226、243〜246、248、249、252〜259、264および265より選択される核酸塩基配列から成る。この修飾オリゴヌクレオチドは、RT−PCR検定法を用いて、場合により、HepG2細胞中で(例えば、実施例14に記載のように)決定されるヒトmRNAレベルの少なくとも80%阻害を達成することができる。
特定の態様において、修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:34、190、215、222、223、226、246および254より選択される核酸塩基配列の少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個または20個隣接した核酸塩基を含む。特定の態様において、修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:34、190、215、222、223、226、246および254より選択される核酸塩基配列を含む。特定の態様において、修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:34、190、215、222、223、226、246および254より選択される核酸塩基配列から成る。この修飾オリゴヌクレオチドは、RT−PCR検定法を用いて、場合により、HepG2細胞中で(例えば、実施例14に記載のように)決定されるヒトmRNAレベルの少なくとも90%阻害を達成することができる。
特定の態様において、本発明の化合物は、一本鎖修飾オリゴヌクレオチドから成る。
特定の態様において、修飾オリゴヌクレオチドは、12〜30個連結したヌクレオシドまたは20個連結したヌクレオシドから成る。
特定の態様において、修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6またはSEQ ID NO:274の核酸塩基配列に100%相補的である。
特定の態様において、化合物は、少なくとも一つの修飾ヌクレオシド間結合を有する。特定の態様において、修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。特定の態様において、各々の修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
特定の態様において、化合物は、修飾糖を含む少なくとも一つのヌクレオシドを有する。特定の態様において、少なくとも一つの修飾糖は、二環式糖である。特定の態様において、少なくとも一つの修飾糖は、2’−O−メトキシエチル(2’MOE)を含む。
特定の態様において、化合物は、修飾核酸塩基を含む少なくとも一つのヌクレオシドを有する。特定の態様において、修飾核酸塩基は、5−メチルシトシンである。
特定の態様において、化合物の修飾オリゴヌクレオチドは、
(i)連結したデオキシヌクレオシドから成るギャップセグメント;
(ii)連結したヌクレオシドから成る5’ウィングセグメント;
(iii)連結したヌクレオシドから成る3’ウィングセグメント
を含み、ここにおいて、ギャップセグメントは、5’ウィングセグメントおよび3’ウィングセグメントに直に隣接して且つそれらの間に位置し、そしてここにおいて、各々のウィングセグメントのヌクレオシドは各々、修飾糖を含む。
(i)連結したデオキシヌクレオシドから成るギャップセグメント;
(ii)連結したヌクレオシドから成る5’ウィングセグメント;
(iii)連結したヌクレオシドから成る3’ウィングセグメント
を含み、ここにおいて、ギャップセグメントは、5’ウィングセグメントおよび3’ウィングセグメントに直に隣接して且つそれらの間に位置し、そしてここにおいて、各々のウィングセグメントのヌクレオシドは各々、修飾糖を含む。
特定の態様において、化合物の修飾オリゴヌクレオチドは、
(i)10個連結したデオキシヌクレオシドから成るギャップセグメント;
(ii)連結したヌクレオシドから成る5’ウィングセグメント;
(iii)連結したヌクレオシドから成る3’ウィングセグメント
を含み、ここにおいて、ギャップセグメントは、5’ウィングセグメントおよび3’ウィングセグメントに直に隣接して且つそれらの間に位置し、そしてここにおいて、各々のウィングセグメントのヌクレオシドは各々、修飾糖を含む。
(i)10個連結したデオキシヌクレオシドから成るギャップセグメント;
(ii)連結したヌクレオシドから成る5’ウィングセグメント;
(iii)連結したヌクレオシドから成る3’ウィングセグメント
を含み、ここにおいて、ギャップセグメントは、5’ウィングセグメントおよび3’ウィングセグメントに直に隣接して且つそれらの間に位置し、そしてここにおいて、各々のウィングセグメントのヌクレオシドは各々、修飾糖を含む。
特定の態様において、化合物の修飾オリゴヌクレオチドは、
(i)10個連結したデオキシヌクレオシドから成るギャップセグメント;
(ii)5個連結したヌクレオシドから成る5’ウィングセグメント;
(iii)5個連結したヌクレオシドから成る3’ウィングセグメント
を含み、ここにおいて、ギャップセグメントは、5’ウィングセグメントおよび3’ウィングセグメントに直に隣接して且つそれらの間に位置し、ここにおいて、各々のウィングセグメントのヌクレオシドは各々、2’−O−メトキシエチル糖を含み;そしてここにおいて、各々のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。
(i)10個連結したデオキシヌクレオシドから成るギャップセグメント;
(ii)5個連結したヌクレオシドから成る5’ウィングセグメント;
(iii)5個連結したヌクレオシドから成る3’ウィングセグメント
を含み、ここにおいて、ギャップセグメントは、5’ウィングセグメントおよび3’ウィングセグメントに直に隣接して且つそれらの間に位置し、ここにおいて、各々のウィングセグメントのヌクレオシドは各々、2’−O−メトキシエチル糖を含み;そしてここにおいて、各々のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。
特定の態様において、化合物の修飾オリゴヌクレオチドは、
(i)14個連結したデオキシヌクレオシドから成るギャップセグメント;
(ii)3個連結したヌクレオシドから成る5’ウィングセグメント;
(iii)3個連結したヌクレオシドから成る3’ウィングセグメント
を含み、ここにおいて、ギャップセグメントは、5’ウィングセグメントおよび3’ウィングセグメントに直に隣接して且つそれらの間に位置し、ここにおいて、各々のウィングセグメントのヌクレオシドは各々、2’−O−メトキシエチル糖を含み;そしてここにおいて、各々のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。
(i)14個連結したデオキシヌクレオシドから成るギャップセグメント;
(ii)3個連結したヌクレオシドから成る5’ウィングセグメント;
(iii)3個連結したヌクレオシドから成る3’ウィングセグメント
を含み、ここにおいて、ギャップセグメントは、5’ウィングセグメントおよび3’ウィングセグメントに直に隣接して且つそれらの間に位置し、ここにおいて、各々のウィングセグメントのヌクレオシドは各々、2’−O−メトキシエチル糖を含み;そしてここにおいて、各々のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。
特定の態様において、化合物の修飾オリゴヌクレオチドは、
(i)13個連結したデオキシヌクレオシドから成るギャップセグメント;
(ii)2個連結したヌクレオシドから成る5’ウィングセグメント;
(iii)5個連結したヌクレオシドから成る3’ウィングセグメント
を含み、ここにおいて、ギャップセグメントは、5’ウィングセグメントおよび3’ウィングセグメントに直に隣接して且つそれらの間に位置し、ここにおいて、各々のウィングセグメントのヌクレオシドは各々、2’−O−メトキシエチル糖を含み;そしてここにおいて、各々のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。
(i)13個連結したデオキシヌクレオシドから成るギャップセグメント;
(ii)2個連結したヌクレオシドから成る5’ウィングセグメント;
(iii)5個連結したヌクレオシドから成る3’ウィングセグメント
を含み、ここにおいて、ギャップセグメントは、5’ウィングセグメントおよび3’ウィングセグメントに直に隣接して且つそれらの間に位置し、ここにおいて、各々のウィングセグメントのヌクレオシドは各々、2’−O−メトキシエチル糖を含み;そしてここにおいて、各々のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。
特定の態様において、提供されるのは、炎症性疾患、障害または状態のリスクがある動物、または炎症性疾患、障害または状態を有する動物を処置する方法、化合物および組成物であって、治療的有効量の12〜30個連結したヌクレオシドから成る修飾オリゴヌクレオチドであって、SEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:2に示される第XI因子核酸に相補的である修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を動物に投与することを含む方法、化合物および組成物である。
特定の態様において、提供されるのは、炎症性疾患、障害または状態のリスクがある動物、または炎症性疾患、障害または状態を有する動物を処置する方法、化合物および組成物であって、治療的有効量の12〜30個連結したヌクレオシドから成る且つSEQ ID NO:15〜269に示される核酸塩基配列のいずれか一つより選択される核酸塩基配列の少なくとも8個隣接した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を動物に投与することを含む方法、化合物および組成物である。
特定の態様において、第XI因子モジュレーターの動物への投与は、動物に有害な出血を引き起こさないしまたは出血状態を悪化させない。
特定の態様において、動物は、一つまたはそれを超える第XI因子モジュレーターで予め処置する。
特定の態様において、動物は、ヒトである。
特定の態様において、本発明の化合物は、動物の炎症反応、炎症性疾患、障害または状態を処置する、予防するまたは改善する。特定の態様において、その反応、疾患、障害または状態は、第XI因子に関連している。特定の態様において、炎症反応、炎症性疾患、障害または状態には、関節炎、結腸炎、線維症、アレルギー性炎症および喘息、心臓血管疾患、糖尿病、敗血症、免疫増殖性疾患、抗リン脂質症候群、移植片関連疾患および自己免疫疾患またはいずれかその組み合わせが含まれてよいが、これに制限されるわけではないし、またはその反応、疾患、障害または状態は、それによってよいしまたはそれに関連してよい。
関節炎の例には、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、尿酸性関節炎、痛風、慢性多発性関節炎、上腕肩甲関節周囲炎、頸部関節炎、腰仙関節炎、変形性関節症、乾癬性関節炎、腸疾患に基づく関節炎および強直性脊椎炎が含まれるが、これに制限されるわけではない。
結腸炎の例には、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患(Inflammatory Bowel Disease)(IBD)およびクローン病(Crohn’s Disease)が含まれるが、これに制限されるわけではない。
移植片関連障害の例には、移植片対宿主病(GVHD)、移植片移植拒絶に関連した障害、慢性拒絶反応および組織または細胞の同種移植片または異種移植片が含まれるが、これに制限されるわけではない。
免疫増殖性疾患の例には、癌(例えば、肺癌)および良性過形成が含まれるが、これに制限されるわけではない。
自己免疫疾患の例には、狼瘡(例えば、エリテマトーデス、ループス腎炎)、橋本甲状腺炎、原発性粘液水腫、グレーヴズ病、悪性貧血、自己免疫性萎縮性胃炎、アディソン病、糖尿病(例えば、インスリン依存性糖尿病、I型糖尿病、II型糖尿病)、グッドパスチャー症候群、重症筋無力症、天疱瘡、クローン病、交感性眼炎、自己免疫性ブドウ膜炎、多発性硬化症、自己免疫性溶血性貧血、特発性血小板減少症、原発性胆汁性肝硬変、慢性作用肝炎、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、リウマチ性疾患(例えば、関節リウマチ)、多発性筋炎、強皮症、乾癬および混合性結合組織病が含まれるが、これに制限されるわけではない。
特定の態様において、化合物および組成物は、炎症性疾患を処置する、予防するまたは改善するために動物に投与する。特定の態様において、動物への投与は、非経口経路による。特定の態様において、非経口投与は、皮下投与または静脈内投与のいずれかである。
特定の態様において、化合物は、一つまたはそれを超える第二物質と共投与する。特定の態様において、第二物質は、NSAIDまたは疾患修飾性薬である。
NSAIDSには、アセチルサリチル酸、コリンマグネシウムサリチレート、ジフルニサル、サリチル酸マグネシウム、サルサラート、サリチル酸ナトリウム、ジクロフェナク、エトドラク(etodolac)、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ケトロラク(ketorolac)、メクロフェナメート、ナプロキセン、ナブメトン(nabumetone)、フェニルブタゾン、ピロキシカム、スリンダク、トルメチン、アセトアミノフェン、イブプロフェン、Cox−2阻害剤、メロキシカム(meloxicam)およびトラマドールが含まれるが、これに制限されるわけではない。本発明の化合物および一つまたはそれを超えるNSAIDSは、同時にまたは逐次的に投与することができる。
疾患修飾性薬の例には、メトトレキサート、アバタセプト(abatacept)、インフリキシマブ、シクロホスファミド、アザチオプリン、コルチコステロイド、シクロスポリンA、アミノサリチレート、スルファサラジン、ヒドロキシクロロキン(hydroxychloroquine)、レフルノミド(leflunomide)、エタナーセプト、エファリズマブ(efalizumab)、6−メルカプトプリン(6−MP)および腫瘍壊死因子−α(TNFα)または他のサイトカイン遮断薬またはアンタゴニストが含まれるが、これに制限されるわけではない。本発明の化合物および一つまたはそれを超える疾患修飾性薬は、同時にまたは逐次的に投与することができる。
特定の態様において、化合物またはオリゴヌクレオチドは、塩の形である。
特定の態様において、化合物または組成物は、薬学的に許容しうる担体または希釈剤と一緒に処方する。
特定の態様において、提供されるのは、炎症反応または炎症性疾患、障害または状態の処置、予防または改善に有用な方法および化合物である。第XI因子は、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6またはSEQ ID NO:274に示される配列を有する。特定の態様において、修飾オリゴヌクレオチドは、炎症反応または炎症性疾患、障害または状態を処置するために用いる。特定の態様において、修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:15〜269に示される核酸塩基配列の中より選択される核酸塩基配列の少なくとも8個隣接した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する。
特定の態様において、提供されるのは、炎症反応または炎症性疾患、障害または状態の処置、予防または改善のための薬剤の製造において有用な方法および化合物である。第XI因子は、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6またはSEQ ID NO:274に示される配列を有する。特定の態様において、修飾オリゴヌクレオチドは、炎症反応または炎症性疾患、障害または状態を処置するための薬剤の製造に用いる。特定の態様において、修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:15〜269に示される核酸塩基配列の中より選択される核酸塩基配列の隣接した核酸塩基の一部分を含む核酸塩基配列を有する、または本明細書中に記載の標的セグメントまたは標的領域に相補的な核酸塩基の一部分を含む。特定の態様において、修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:15〜269に示される核酸塩基配列の中より選択される核酸塩基配列の少なくとも8個隣接した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する、または本明細書中に記載の標的セグメントまたは標的領域に相補的な少なくとも8個隣接した核酸塩基を含む。
特定の態様において、提供されるのは、第XI因子に関連した炎症性疾患、障害および状態を処置する、改善するまたは予防するための薬剤の製造における、本明細書中に記載の第XI因子モジュレーターの使用である。
特定の態様において、提供されるのは、本明細書中に記載の炎症反応または炎症性疾患、障害または状態を処置する、予防するまたは改善する場合に用いるための、本明細書中に記載の第XI因子モジュレーターである。第XI因子モジュレーターは、一つまたはそれを超える追加の物質との組み合わせ療法で、または本明細書中に記載の療法で用いることができる。物質または療法は、動物に同時にまたは逐次的に投与することができる。
特定の態様において、提供されるのは、本明細書中に記載の炎症性疾患、障害または状態を処置する、予防するまたは改善するための薬剤の製造における、本明細書中に記載の第XI因子モジュレーターの使用である。第XI因子モジュレーターは、一つまたはそれを超える追加の物質との組み合わせ療法で、または本明細書中に記載の療法で用いることができる。物質または療法は、動物に同時にまたは逐次的に投与することができる。
特定の態様において、提供されるのは、本明細書中に記載の炎症反応、炎症性疾患、障害または状態を処置する、予防するまたは改善するためのキットであって、
(i)本明細書中に記載の第XI因子特異的阻害剤;および場合により、
(ii)本明細書中に記載の追加の物質または療法
を含むキットである。
(i)本明細書中に記載の第XI因子特異的阻害剤;および場合により、
(ii)本明細書中に記載の追加の物質または療法
を含むキットである。
本発明のキットは、本明細書中に記載の組み合わせ療法によって本明細書中に記載の炎症性疾患、障害または状態を処置する、予防するまたは改善するキットを用いるための取扱説明書を更に包含してよい。
アンチセンス化合物
オリゴマー性化合物には、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、オリゴヌクレオチド類似体、オリゴヌクレオチド模擬体、アンチセンス化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびsiRNAが含まれるが、これに制限されるわけではない。オリゴマー性化合物は、標的核酸に「アンチセンス」であってよい、すなわち、標的核酸への水素結合によるハイブリダイゼーションを行うことが可能であるという意味である。
オリゴマー性化合物には、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、オリゴヌクレオチド類似体、オリゴヌクレオチド模擬体、アンチセンス化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびsiRNAが含まれるが、これに制限されるわけではない。オリゴマー性化合物は、標的核酸に「アンチセンス」であってよい、すなわち、標的核酸への水素結合によるハイブリダイゼーションを行うことが可能であるという意味である。
特定の態様において、アンチセンス化合物は、5’〜3’方向で表された場合に、それに標的とされる標的核酸の標的セグメントの逆補体を含む核酸塩基配列を有する。このような特定の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、5’〜3’方向で表された場合に、それに標的とされる標的核酸の標的セグメントの逆補体を含む核酸塩基配列を有する。
特定の態様において、第XI因子核酸を標的とするアンチセンス化合物は、12〜30サブユニット長さである。言い換えると、アンチセンス化合物は、12〜30個連結したサブユニットである。他の態様において、アンチセンス化合物は、8〜80個、12〜50個、15〜30個、18〜24個、19〜22個または20個連結したサブユニットである。このような特定の態様において、アンチセンス化合物は、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個、50個、51個、52個、53個、54個、55個、56個、57個、58個、59個、60個、61個、62個、63個、64個、65個、66個、67個、68個、69個、70個、71個、72個、73個、74個、75個、76個、77個、78個、79個または80個連結したサブユニット長さ、または上のいずれか二つの値によって規定される範囲である。いくつかの態様において、アンチセンス化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、そして連結したサブユニットは、ヌクレオチドである。
特定の態様において、第XI因子核酸を標的とする短いまたは切断された(shortened or truncated)アンチセンス化合物は、5’末端から(5’切断)または或いは、3’末端から(3’切断)欠失している単一サブユニットを有する。第XI因子核酸を標的とする短いまたは切断されたアンチセンス化合物は、そのアンチセンス化合物の5’末端から欠失している二つのサブユニットを有してよいし、または或いは、3’末端からから欠失している二つのサブユニットを有してよい。或いは、欠失しているヌクレオシドは、そのアンチセンス化合物全体に、例えば、5’末端から欠失している一つのヌクレオシドおよび3’末端から欠失している一つのヌクレオシドを有するアンチセンス化合物中に分散していてよい。
単一の追加のサブユニットが、長いアンチセンス化合物中に存在する場合、追加のサブユニットは、そのアンチセンス化合物の5’末端または3’末端に位置していてよい。二つまたはそれを超える追加のサブユニットが存在する場合、加えられたサブユニットは、例えば、そのアンチセンス化合物の5’末端に(5’付加)または或いは、3’末端に(3’付加)加えられた二つのサブユニットを有するアンチセンス化合物中に互いに隣接していてよい。或いは、加えられたサブユニットは、アンチセンス全体に、例えば、5’末端に加えられた一つのサブユニットおよび3’末端に加えられた一つのサブユニットを有するアンチセンス化合物中に分散していてよい。
活性を排除することなく、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどのアンチセンス化合物の長さを増加させるまたは低下させること、および/またはミスマッチ塩基を導入することは、可能である。例えば、Woolf et al.(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7305-7309, 1992)の場合、13〜25核酸塩基長さの一連のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、卵母細胞注射モデルにおいて標的RNAの切断を引き起こすそれらの能力について調べた。アンチセンスオリゴヌクレオチドの両末端付近に8個または11個のミスマッチ塩基を含む25核酸塩基長さのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ミスマッチ不含のアンチセンスオリゴヌクレオチドより少ない程度にではあるが、標的mRNAの特異的切断を支配することが可能であった。同様に、標的特異的切断は、1個または3個のミスマッチを含むものを含めた13核酸塩基アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて達成された。
Gautschi et al(J. Natl. Cancer Inst. 93:463-471, March 2001)は、bcl−2mRNAに100%相補性を有し且つbcl−xLmRNAへ3個のミスマッチを有するオリゴヌクレオチドの、bcl−2およびbcl−xL双方の in vitro および in vivo の発現を減少させる能力を示した。更に、このオリゴヌクレオチドは、強力な in vivo 抗腫瘍活性を示した。
Maher および Dolnick(Nuc. Acid. Res. 16:3341-3358,1988)は、一連のタンデムの14核酸塩基アンチセンスオリゴヌクレオチドと、二つまたは三つのタンデムアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列から構成される28および42核酸塩基アンチセンスオリゴヌクレオチドをそれぞれ、ウサギ網状赤血球検定においてヒトDHFRの翻訳を止めるそれらの能力について調べた。三つの14核酸塩基アンチセンスオリゴヌクレオチド各々単独では、28または42核酸塩基アンチセンスオリゴヌクレオチドより控えめなレベルではあるが、翻訳を阻止できた。
アンチセンス化合物モチーフ
特定の態様において、第XI因子核酸を標的とするアンチセンス化合物は、増強された阻害活性、標的核酸への増加した結合親和性、または in vivo ヌクレアーゼによる分解への耐性などの性質をそれらアンチセンス化合物に与えるパターンまたはモチーフで配置された化学修飾サブユニットを有する。
特定の態様において、第XI因子核酸を標的とするアンチセンス化合物は、増強された阻害活性、標的核酸への増加した結合親和性、または in vivo ヌクレアーゼによる分解への耐性などの性質をそれらアンチセンス化合物に与えるパターンまたはモチーフで配置された化学修飾サブユニットを有する。
キメラのアンチセンス化合物は、典型的に、ヌクレアーゼ分解への増加した耐性、増加した細胞取込み、標的核酸への増加した結合親和性、および/または増加した阻害活性を与えるように修飾された少なくとも一つの領域を含有する。キメラのアンチセンス化合物の第二領域は、細胞エンドヌクレアーゼRNアーゼHの基質として役立つこともありうるが、それは、RNA:DNA二重らせんのRNA鎖を切断する。
ギャップマーモチーフを有するアンチセンス化合物は、キメラのアンチセンス化合物と考えられる。ギャップマーの場合、RNアーゼH切断を支持する複数のヌクレオチドを有する内部領域は、その内部領域のヌクレオシドとは化学的に異なる複数のヌクレオチドを有する外部領域の間に位置している。ギャップマーモチーフを有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの場合、ギャップセグメントは、概して、エンドヌクレアーゼ切断の基質として役立つが、ウィングセグメントは、修飾ヌクレオシドを含む。特定の態様において、ギャップマーの領域は、各々異なる領域を含む糖残基のタイプによって区別される。いくつかの態様において、ギャップマーの領域を区別するのに用いられる糖残基のタイプには、β−D−リボヌクレオシド、β−D−デオキシリボヌクレオシド、2’−修飾ヌクレオシド(このような2’−修飾ヌクレオシドには、特に、2’−MOEおよび2’−O−CH3が含まれてよい)、および二環式糖修飾ヌクレオシド(このような二環式糖修飾ヌクレオシドには、4’−(CH2)n−O−2’架橋(式中、n=1またはn=2)を有するものが含まれてよい)が含まれてよい。好ましくは、各々異なる領域は、一様な糖残基を含む。ウィング−ギャップ−ウィングモチーフは、しばしば、「X−Y−Z」と記載され、この場合の「X」は、5’ウィング領域の長さであり、「Y」は、ギャップ領域の長さであり、そして「Z」は、3’ウィング領域の長さである。本明細書中で用いられる「X−Y−Z」と記載されるギャップマーは、ギャップセグメントが、5’ウィングセグメントおよび3’ウィングセグメント各々に直に隣接して位置するような立体配置を有する。したがって、5’ウィングセグメントおよびギャップセグメントの間に、またはギャップセグメント(segement)および3’ウィングセグメントの間に存在する介在ヌクレオチドはない。本明細書中に記載のアンチセンス化合物はいずれも、ギャップマーモチーフを有することができる。いくつかの態様において、XおよびZは同じであり、他の態様において、それらは異なる。好ましい態様において、Yは、8〜15ヌクレオチドである。X、YまたはZは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30またはそれを超えるいずれかのヌクレオチドでありうる。したがって、本発明のギャップマーには、例えば、5−10−5、4−8−4、4−12−3、4−12−4、3−14−3、2−13−5、2−16−2、1−18−1、3−10−3、2−10−2、1−10−1または2−8−2が含まれるが、これに制限されるわけではない。
特定の態様において、ウィング−ギャップまたはギャップ−ウィング立体配置、すなわち、ギャップマー立体配置について上に記載のX−YまたはY−Z立体配置を有する「ウィングマー」モチーフとしてのアンチセンス化合物。したがって、本発明のウィングマー立体配置には、例えば、5−10、8−4、4−12、12−4、3−14、16−2、18−1、10−3、2−10、1−10、8−2、2−13または5−13が含まれるが、これに制限されるわけではない。
特定の態様において、第XI因子核酸を標的とするアンチセンス化合物は、5−10−5ギャップマーモチーフを有する。
特定の態様において、第XI因子核酸を標的とするアンチセンス化合物は、3−14−3ギャップマーモチーフを有する。
特定の態様において、第XI因子核酸を標的とするアンチセンス化合物は、2−13−5ギャップマーモチーフを有する。
特定の態様において、第XI因子核酸を標的とするアンチセンス化合物は、広幅ギャップモチーフを有する。
特定の態様において、第XI因子核酸を標的とする広幅ギャップアンチセンスオリゴヌクレオチドは、3個の化学修飾ヌクレオシドのウィングセグメントに直に隣接して且つそれらの間に位置する14個の2’−デオキシリボヌクレオシドのギャップセグメントを有する。特定の態様において、化学修飾は、2’−糖修飾を含む。別の態様において、化学修飾は、2’−MOE糖修飾を含む。
特定の態様において、第XI因子核酸を標的とする広幅ギャップアンチセンスオリゴヌクレオチドは、2個の化学修飾ヌクレオシドの5’ウィングセグメントおよび5個の化学修飾ヌクレオシドの3’ウィングセグメントに直に隣接して且つそれらの間に位置する13個の2’−デオキシリボヌクレオシドのギャップセグメントを有する。特定の態様において、化学修飾は、2’−糖修飾を含む。別の態様において、化学修飾は、2’−MOE糖修飾を含む。
標的核酸、標的領域およびヌクレオチド配列
第XI因子をエンコードするヌクレオチド配列には、制限されることなく、次が含まれる。1999年3月24日に最初にGENBANK(登録商標)で寄託され、本明細書中にSEQ ID NO:1として包含されるGENBANK(登録商標)受託番号NM_000128.3;19598000〜19624000を切断され、2000年11月29日に最初にGENBANK(登録商標)で寄託され、そして本明細書中にSEQ ID NO:2として包含されるGENBANK(登録商標)受託番号NT_022792.17;2002年6月2日に最初にGENBANK(登録商標)で寄託され、本明細書中にSEQ ID NO:6として包含されるGENBANK(登録商標)受託番号NM_028066.1;およびエクソン1〜15のGENBANK受託番号NW_001118167.1(本明細書中にSEQ ID NO:274として包含される)。
第XI因子をエンコードするヌクレオチド配列には、制限されることなく、次が含まれる。1999年3月24日に最初にGENBANK(登録商標)で寄託され、本明細書中にSEQ ID NO:1として包含されるGENBANK(登録商標)受託番号NM_000128.3;19598000〜19624000を切断され、2000年11月29日に最初にGENBANK(登録商標)で寄託され、そして本明細書中にSEQ ID NO:2として包含されるGENBANK(登録商標)受託番号NT_022792.17;2002年6月2日に最初にGENBANK(登録商標)で寄託され、本明細書中にSEQ ID NO:6として包含されるGENBANK(登録商標)受託番号NM_028066.1;およびエクソン1〜15のGENBANK受託番号NW_001118167.1(本明細書中にSEQ ID NO:274として包含される)。
本明細書中にある実施例において各々SEQ ID NOで示される配列は、糖残基、ヌクレオシド間結合または核酸塩基へのいずれの修飾とも無関係であるということは理解される。それ自体で、SEQ ID NOによって規定されるアンチセンス化合物は、独立して、糖残基、ヌクレオシド間結合または核酸塩基への一つまたはそれを超える修飾を含んでよい。Isis 番号(Isis No)によって記載されるアンチセンス化合物は、核酸塩基配列およびモチーフの組み合わせを示す。
特定の態様において、標的領域は、標的核酸の構造的に規定された領域である。例えば、標的領域は、3’UTR、5’UTR、エクソン、イントロン、エクソン/イントロンジャンクション(junction)、コーディング領域、翻訳開始領域、翻訳終結領域または他の規定の核酸領域を包含してよい。第XI因子について構造的に規定された領域は、NCBIなどの配列データベースから受託番号によって得ることができ、そしてこのような情報は、本明細書中に援用される。特定の態様において、標的領域は、その標的領域内の一つの標的セグメントの5’標的部位〜標的領域内の別の標的セグメントの3’標的部位の配列を包含してよい。
標的指向することは、アンチセンス化合物が、所望の作用を生じるようにハイブリッド形成する少なくとも一つの標的セグメントの決定を包含する。特定の態様において、所望の作用は、mRNA標的核酸レベルの減少である。特定の態様において、所望の作用は、標的核酸によってエンコードされるタンパク質のレベルの減少、または標的核酸に関連した表現型変化である。
標的領域は、一つまたはそれを超える標的セグメントを含有してよい。標的領域内の多数の標的セグメントは、オーバーラップしていてよい。或いは、それらは、オーバーラップしていなくてよい。特定の態様において、標的領域内の標的セグメントは、約300以下のヌクレオチドで隔てられている。特定の態様において、標的領域内の標的セグメントは、標的核酸上の250、200、150、100、90、80、70、60、50、40、30、20または10ヌクレオチドである、ほぼその数である、それ以下である、ほぼそれ以下である、または前述の値のいずれか二つで規定される範囲である多数のヌクレオチドで隔てられている。特定の態様において、標的領域内の標的セグメントは、標的核酸上の5以下またはほぼそれ以下のヌクレオチドで隔てられている。特定の態様において、標的セグメントは隣接している。考えられるのは、本明細書中に挙げられる5’標的部位または3’標的部位のいずれかである出発核酸を有する範囲で規定される標的範囲である。
適する標的セグメントは、5’UTR、コーディング領域、3’UTR、イントロン、エクソンまたはエクソン/イントロンジャンクション中に見出すことができる。出発コドンまたは停止コドンを含有する標的セグメントも、適する標的セグメントである。適する標的セグメントは、出発コドンまたは停止コドンなどの特定の構造的に規定された領域を特異的に除外してよい。
適する標的セグメントの決定には、標的核酸の配列の、ゲノム中の他の配列への比較が含まれてよい。例えば、BLASTアルゴリズムを用いて、異なった核酸の中で類似性を有する領域を識別することができる。この比較は、選択された標的核酸以外の配列(すなわち、非標的または標的外の配列)に非特異的方式でハイブリッド形成するかもしれないアンチセンス化合物配列の選択を妨げることができる。
活性標的領域内のアンチセンス化合物の活性(例えば、標的核酸レベルの減少パーセントによって規定される)には、変動があってよい。特定の態様において、第XI因子mRNAレベルの減少は、第XI因子発現の阻害を示すものである。第XI因子タンパク質のレベルの減少も、標的mRNAレベルの阻害を示すものである。更に、表現型変化は、第XI因子発現の阻害を示すものである。例えば、長期aPTT時間は、第XI因子発現の阻害を示すものでありうる。別の例では、標準PT時間に関連した長期aPTT時間は、第XI因子発現の阻害を示すものでありうる。別の例では、低下した量の血小板因子(Platelet Factor)4(PF−4)は、第XI因子発現の阻害を示すものでありうる。別の例では、減少した炎症形成(例えば、血栓、喘息、関節炎または結腸炎形成の場合)は、第XI因子発現の阻害を示すものでありうる。或いは、炎症形成について増加した時間(例えば、血栓、喘息、関節炎または結腸炎形成の場合)は、第XI因子発現の阻害を示すものでありうる。
ハイブリダイゼーション
いくつかの態様において、ハイブリダイゼーションは、本明細書中に開示のアンチセンス化合物と、第XI因子核酸との間で起こる。ハイブリダイゼーションの最も一般的な機構は、核酸分子の相補的核酸塩基の間の水素結合(例えば、ワトソン・クリック型、フーグスティーン型または逆フーグスティーン型水素結合)を必要とする。
いくつかの態様において、ハイブリダイゼーションは、本明細書中に開示のアンチセンス化合物と、第XI因子核酸との間で起こる。ハイブリダイゼーションの最も一般的な機構は、核酸分子の相補的核酸塩基の間の水素結合(例えば、ワトソン・クリック型、フーグスティーン型または逆フーグスティーン型水素結合)を必要とする。
ハイブリダイゼーションは、いろいろな条件下で起こりうる。ストリンジェント条件は、配列依存性であり、しかもハイブリッド形成される核酸分子の性状および組成によって決定される。
ある配列が、標的核酸に特異的にハイブリッド形成しうるか否かを決定する方法は、当該技術分野において周知である。特定の態様において、本明細書中に与えられるアンチセンス化合物は、第XI因子核酸と特異的にハイブリッド形成しうる。
相補性
アンチセンス化合物および標的核酸は、所望の作用(例えば、第XI因子核酸などの標的核酸のアンチセンス阻害)が生じるであろうように、そのアンチセンス化合物の十分な数の核酸塩基が、標的核酸の該当する核酸塩基と水素結合することができる場合、互いに相補的である。
アンチセンス化合物および標的核酸は、所望の作用(例えば、第XI因子核酸などの標的核酸のアンチセンス阻害)が生じるであろうように、そのアンチセンス化合物の十分な数の核酸塩基が、標的核酸の該当する核酸塩基と水素結合することができる場合、互いに相補的である。
アンチセンス化合物と第XI因子核酸との間の非相補的核酸塩基は、そのアンチセンス化合物が、標的核酸に特異的にハイブリッド形成可能な状態のままであるという条件付きで、許容することができる。更に、アンチセンス化合物は、介在するまたは隣接するセグメントがハイブリダイゼーションイベントに関与しないように、第XI因子核酸の一つまたはそれを超えるセグメントを越えてハイブリッド形成してよい(例えば、ループ構造、ミスマッチまたはヘアピン構造)。
特定の態様において、本明細書中に与えられるアンチセンス化合物またはそれらの特定部分は、第XI因子核酸、標的領域、標的セグメントまたはその特定部分に70%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%相補的または少なくとも相補的である。標的核酸とアンチセンス化合物の相補性パーセントは、常套法を用いて決定することができる。例えば、アンチセンス化合物の20核酸塩基の内18個が標的領域に相補的であり、したがって、特異的にハイブリッド形成すると考えられるアンチセンス化合物は、90パーセント相補性であると考えられる。この例の場合、残りの非相補的核酸塩基は、相補的核酸塩基と一緒に集合していてよいしまたはそれらの間に散在していてよく、互いにまたは相補的核酸塩基に隣接している必要はない。それ自体で、標的核酸と完全相補性の二つの領域に隣接している4(4個の)非相補的核酸塩基を有する18核酸塩基長さであるアンチセンス化合物は、標的核酸と77.8%の全相補性を有すると考えられ、したがって、本発明の範囲内であると考えられる。標的核酸の領域とアンチセンス化合物の相補性パーセントは、当該技術分野において知られているBLASTプログラム(基本的な局所整列探索手段)および PowerBLASTプログラムを用いて常套的に決定することができる(Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403 410; Zhang and Madden, Genome Res., 1997, 7, 649 656)。相同性、配列同一性または相補性パーセントは、例えば、Gap プログラム(Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.)により、暗黙値設定を用いて決定することができ、それは、Smith and Waterman(Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482 489)のアルゴリズムを用いる。
特定の態様において、本明細書中に与えられるアンチセンス化合物またはそれらの特定部分は、標的核酸またはその特定部分に完全に相補的(すなわち、100%相補的)である。例えば、アンチセンス化合物は、第XI因子核酸または標的領域または標的セグメントまたはその標的配列に完全に相補的であってよい。本明細書中で用いられる「完全に相補的」は、アンチセンス化合物の核酸塩基各々が、標的核酸の該当する核酸塩基と正確に塩基対合することが可能であることを意味する。例えば、20核酸塩基アンチセンス化合物は、そのアンチセンス化合物に完全に相補的である標的核酸の該当する20核酸塩基部分が存在する限りにおいて、400核酸塩基長さである標的配列に完全に相補的である。完全に相補的は、第一および/または第二核酸の特定部分に関して用いることもできる。例えば、30核酸塩基アンチセンス化合物の20核酸塩基部分は、400核酸塩基長さである標的配列に「完全に相補的」でありうる。30核酸塩基オリゴヌクレオチドの20核酸塩基部分は、標的配列が、アンチセンス化合物の20核酸塩基部分に各々の核酸塩基が相補的である該当する20核酸塩基部分を有する場合、標的配列に完全に相補的である。同時に、30核酸塩基アンチセンス化合物全体は、そのアンチセンス化合物の残りの10核酸塩基も標的配列に相補的であるか否かに依存して、標的配列に完全に相補的であってよいしまたは完全に相補的でなくてよい。
非相補的核酸塩基の場所は、アンチセンス化合物の5’末端または3’末端であってよい。或いは、一つまたは複数の非相補的核酸塩基は、アンチセンス化合物の内部位置であってよい。二つまたはそれを超える非相補的核酸塩基が存在する場合、それらは、隣接して(すなわち、連結して)いてよいし、または隣接していなくてよい。一つの態様において、非相補的核酸塩基は、ギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチドのウィングセグメント中に位置する。
特定の態様において、12、13、14、15、16、17、18、19または20核酸塩基長さまたはそれまでであるアンチセンス化合物は、第XI因子核酸またはその特定部分などの標的核酸に相対して、4個以下、3個以下、2個以下または1個以下の非相補的核酸塩基を含む。
特定の態様において、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29または30核酸塩基長さまたはそれまでであるアンチセンス化合物は、第XI因子核酸またはその特定部分などの標的核酸に相対して、6個以下、5個以下、4個以下、3個以下、2個以下または1個以下の非相補的核酸塩基を含む。
本明細書中に与えられるアンチセンス化合物には、更に、標的核酸の一部分に相補的であるものが含まれる。本明細書中で用いられる「部分」は、標的核酸の領域またはセグメント内の規定数の隣接した(すなわち、連結した)核酸塩基を意味する。一「部分」も、アンチセンス化合物の規定数の隣接した核酸塩基を意味することができる。特定の態様において、アンチセンス化合物は、標的セグメントの少なくとも8核酸塩基部分に相補的である。特定の態様において、アンチセンス化合物は、標的セグメントの少なくとも12核酸塩基部分に相補的である。特定の態様において、アンチセンス化合物は、標的セグメントの少なくとも15核酸塩基部分に相補的である。更に考えられるのは、標的セグメントの少なくとも9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20またはそれを超える核酸塩基部分、またはこれら値のいずれか二つで規定される範囲に相補的であるアンチセンス化合物である。
同一性
本明細書中に与えられるアンチセンス化合物は、更に、具体的なヌクレオチド配列、SEQ ID NO、または特定の Isis 番号によって表される化合物またはその部分に一定の同一性パーセントを有してよい。本明細書中で用いられるアンチセンス化合物は、本明細書中に開示の配列が、同じ核酸塩基対合能力を有する場合、それと同一である。例えば、開示されたDNA配列中でチミジンの代わりにウラシルを含有するRNAは、ウラシルおよびチミジン双方がアデニンと対合するので、そのDNA配列と同一と考えられるであろう。本明細書中に与えられるアンチセンス化合物に相対して短いおよび長い変型の本明細書中に記載のアンチセンス化合物、更には、同一でない塩基を有する化合物も考えられる。同一でない塩基は、互いに隣接していてよいし、またはアンチセンス化合物中に分散していてよい。アンチセンス化合物の同一性パーセントは、比較されている配列に相対して、同一塩基対合を有する塩基の数によって計算する。
本明細書中に与えられるアンチセンス化合物は、更に、具体的なヌクレオチド配列、SEQ ID NO、または特定の Isis 番号によって表される化合物またはその部分に一定の同一性パーセントを有してよい。本明細書中で用いられるアンチセンス化合物は、本明細書中に開示の配列が、同じ核酸塩基対合能力を有する場合、それと同一である。例えば、開示されたDNA配列中でチミジンの代わりにウラシルを含有するRNAは、ウラシルおよびチミジン双方がアデニンと対合するので、そのDNA配列と同一と考えられるであろう。本明細書中に与えられるアンチセンス化合物に相対して短いおよび長い変型の本明細書中に記載のアンチセンス化合物、更には、同一でない塩基を有する化合物も考えられる。同一でない塩基は、互いに隣接していてよいし、またはアンチセンス化合物中に分散していてよい。アンチセンス化合物の同一性パーセントは、比較されている配列に相対して、同一塩基対合を有する塩基の数によって計算する。
特定の態様において、アンチセンス化合物またはそれらの部分は、本明細書中に開示の一つまたはそれを超えるアンチセンス化合物またはSEQ ID NOまたはそれらの一部分に少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%同一である。
修飾
ヌクレオシドは、塩基−糖組み合わせである。ヌクレオシドの核酸塩基(塩基としても知られる)部分は、通常は、複素環式塩基残基である。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合で連結したリン酸基を更に包含するヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を包含するそれらヌクレオシドについて、リン酸基は、糖の2’、3’または5’ヒドロキシル残基に連結することができる。オリゴヌクレオチドは、隣接するヌクレオシドの互いへの共有結合によって形成されて、直鎖状ポリマー性オリゴヌクレオチドを形成する。オリゴヌクレオチド構造内で、リン酸基は、一般的に、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間結合を形成していると云われている。
ヌクレオシドは、塩基−糖組み合わせである。ヌクレオシドの核酸塩基(塩基としても知られる)部分は、通常は、複素環式塩基残基である。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合で連結したリン酸基を更に包含するヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を包含するそれらヌクレオシドについて、リン酸基は、糖の2’、3’または5’ヒドロキシル残基に連結することができる。オリゴヌクレオチドは、隣接するヌクレオシドの互いへの共有結合によって形成されて、直鎖状ポリマー性オリゴヌクレオチドを形成する。オリゴヌクレオチド構造内で、リン酸基は、一般的に、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間結合を形成していると云われている。
アンチセンス化合物への修飾は、ヌクレオシド間結合、糖残基または核酸塩基への置換または変化を包含する。修飾されたアンチセンス化合物は、しばしば、例えば、増強された細胞取込み、核酸標的への増強された親和性、ヌクレアーゼ存在下の増加した安定性、または増加した阻害活性などの望まれる性質ゆえに、天然の形より好適である。
化学修飾されたヌクレオシドを用いて、短いまたは切断されたアンチセンスオリゴヌクレオチドのその標的核酸への結合親和性を増加させることもできる。結果として、比較しうる結果は、しばしば、このような化学修飾ヌクレオシドを有するより短いアンチセンス化合物で得ることができる。
修飾ヌクレオシド間結合
RNAおよびDNAの天然に存在するヌクレオシド間結合は、3’〜5’ホスホジエステル結合である。一つまたはそれを超える修飾された、すなわち、天然に存在しないヌクレオシド間結合を有するアンチセンス化合物は、しばしば、例えば、増強された細胞取込み、標的核酸への増強された親和性、およびヌクレアーゼ存在下の増加した安定性などの望まれる性質ゆえに、天然に存在するヌクレオシド間結合を有するアンチセンス化合物に優先して選択される。
RNAおよびDNAの天然に存在するヌクレオシド間結合は、3’〜5’ホスホジエステル結合である。一つまたはそれを超える修飾された、すなわち、天然に存在しないヌクレオシド間結合を有するアンチセンス化合物は、しばしば、例えば、増強された細胞取込み、標的核酸への増強された親和性、およびヌクレアーゼ存在下の増加した安定性などの望まれる性質ゆえに、天然に存在するヌクレオシド間結合を有するアンチセンス化合物に優先して選択される。
修飾ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドは、リン原子を保持するヌクレオシド間結合、更には、リン原子を有していないヌクレオシド間結合を包含する。代表的なリン含有ヌクレオシド間結合には、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、ホスホルアミデートおよびホスホロチオエートが含まれるが、これに制限されるわけではない。リン含有結合およびリン不含結合の製造方法は、周知である。
特定の態様において、第XI因子核酸を標的とするアンチセンス化合物は、一つまたはそれを超える修飾ヌクレオシド間結合を含む。特定の態様において、修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。特定の態様において、アンチセンス化合物のヌクレオシド間結合は各々、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
修飾糖残基
本発明のアンチセンス化合物は、糖基が修飾された一つまたはそれを超えるヌクレオシドを含有することもありうる。このような糖修飾ヌクレオシドは、増強されたヌクレアーゼ安定性、増加した結合親和性またはいくつか他の有益な生物学的性質をアンチセンス化合物に与えることができる。特定の態様において、ヌクレオシドは、化学修飾されたリボフラノース環残基を含む。化学修飾リボフラノース環の例には、制限されることなく、置換基(5’および2’置換基を含めた)の付加;二環式核酸(BNA)を形成する非 gem 環原子の架橋;リボシル環酸素原子のS、N(R)またはC(R1)(R)2(R=H、C1−C12アルキルまたは保護基)での置換;およびそれらの組み合わせが含まれる。化学修飾された糖の例には、2’−F−5’−メチル置換ヌクレオシド(他の開示された5’,2’−ビス置換ヌクレオシドについて08年8月21日公開のPCT国際出願WO2008/101157号を参照されたい)またはリボシル環酸素原子の2’位に追加の置換を含むSでの置換(2005年6月16日公開の公開米国特許出願US2005−0130923号を参照されたい)または或いは、BNAの5’−置換(LNAが、例えば、5’−メチル基または5’−ビニル基で置換されている、07年11月22日公開のPCT国際出願WO2007/134181を参照されたい)が含まれる。
本発明のアンチセンス化合物は、糖基が修飾された一つまたはそれを超えるヌクレオシドを含有することもありうる。このような糖修飾ヌクレオシドは、増強されたヌクレアーゼ安定性、増加した結合親和性またはいくつか他の有益な生物学的性質をアンチセンス化合物に与えることができる。特定の態様において、ヌクレオシドは、化学修飾されたリボフラノース環残基を含む。化学修飾リボフラノース環の例には、制限されることなく、置換基(5’および2’置換基を含めた)の付加;二環式核酸(BNA)を形成する非 gem 環原子の架橋;リボシル環酸素原子のS、N(R)またはC(R1)(R)2(R=H、C1−C12アルキルまたは保護基)での置換;およびそれらの組み合わせが含まれる。化学修飾された糖の例には、2’−F−5’−メチル置換ヌクレオシド(他の開示された5’,2’−ビス置換ヌクレオシドについて08年8月21日公開のPCT国際出願WO2008/101157号を参照されたい)またはリボシル環酸素原子の2’位に追加の置換を含むSでの置換(2005年6月16日公開の公開米国特許出願US2005−0130923号を参照されたい)または或いは、BNAの5’−置換(LNAが、例えば、5’−メチル基または5’−ビニル基で置換されている、07年11月22日公開のPCT国際出願WO2007/134181を参照されたい)が含まれる。
修飾糖残基を有するヌクレオシドの例には、制限されることなく、5’−ビニル、5’−メチル(RまたはS)、4’−S、2’−F、2’−OCH3および2’−O(CH2)2OCH3置換基を含むヌクレオシドが含まれる。2’位にある置換基は、更に、アリル、アミノ、アジド、チオ、O−アリル、O−C1−C10アルキル、OCF3、O(CH2)2SCH3、O(CH2)2−O−N(Rm)(Rn)およびO−CH2−C(=O)−N(Rm)(Rn)(式中、RmおよびRnは、各々独立して、Hまたは置換されたまたは未置換のC1−C10アルキルである)、O−アルカリルまたはO−アラルキル、置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリ-アルキルアミノ、置換シリル、RNA切断性基、レポーター基、インターカレーター(intercalator)、アンチセンス化合物の薬物動態学的性質を改善する基または薬力学的性質を改善する基、および同様の性質を有する他の置換基より選択することができる。
二環式核酸(BNA)の例には、制限されることなく、4’および2’リボシル環原子の間に架橋を含むヌクレオシドが含まれる。特定の態様において、本明細書中に与えられるアンチセンス化合物には、一つまたはそれを超えるBNAヌクレオシドが含まれるが、ここにおいて、架橋は、次の式:4’−(CH2)−O−2’(LNA);4’−(CH2)−S−2’;4’−(CH2)2−O−2’(ENA);4’−C(CH3)2−O−2’(PCT/US2008/068922号を参照されたい);4’−CH(CH3)−O−2’および4’−C−H(CH2OCH3)−O−2’(2008年7月15日発行の米国特許第7,399,845号を参照されたい);4’−CH2−N(OCH3)−2’(PCT/US2008/064591号を参照されたい);4’−CH2−O−N(CH3)−2’(2004年9月2日公開の公開米国特許出願US2004−0171570号を参照されたい);4’−CH2−N(R)−O−2’(2008年9月23日発行の米国特許第7,427,672号を参照されたい);4’−CH2−CH(CH3)−2’(Chattopadhyaya et al., J. Org. Chem, 2009, 74, 118-134 を参照されたい)および4’−CH2−C−(=CH2)−2’(PCT/US2008/066154号を参照されたい)の一つを含み;そしてここにおいて、Rは、独立して、H、C1−C12アルキルまたは保護基である。前述のBNAは各々、例えば、α−L−リボフラノースおよびβ−D−リボフラノースを含めたいろいろな立体化学的糖立体配置を包含する(WO99/14226号として1999年3月25日公開のPCT国際出願PCT/DK98/00393号を参照されたい)。以前には、α−L−メチレンオキシ(4’−CH2−O−2’)BNAも、アンチセンス活性を示したアンチセンスオリゴヌクレオチド中に包含された(Frieden et al., Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365-6372)。
二環式ヌクレオシドに関する追加の報告は、公表された参考文献に見出されうる(例えば、Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129, 8362-8379;米国特許第7,053,207号;同第6,268,490号;同第6,770,748号;同第6,794,499号;同第7,034,133号;および同第6,525,191号;Elayadi et al., Curr. Opinion Invens. Drugs, 2001, 2, 558-561;Braasch et al., Chem. Biol., 2001, 8, 1-7;および Orum et al., Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243;およびU.S.6,670,461号;国際出願WO2004/106356号;WO94/14226号;WO2005/021570号;米国特許公報US2004−0171570号;US2007−0287831号;US2008−0039618号;米国特許第7,399,845号;米国特許出願第12/129,154号;同第60/989,574号;同第61/026,995号;同第61/026,998号;同第61/056,564号;同第61/086,231号;同第61/097,787号;同第61/099-,844号;PCT国際出願PCT/US2008/064591号;PCT/US2008/066154号;PCT/US-2008/-068922号;および公開PCT国際出願WO2007-/-134-181号)。
特定の態様において、BNAヌクレオシドの二環式糖残基には、ペントフラノシル糖残基の4’位および2’位の間に少なくとも一つの架橋を有する化合物であって、このような架橋が、独立して、−[C(Ra)(Rb)]n−、−C(Ra)=C(Rb)−、−C(Ra)=N−、−C(=O)−、−C(=NRa)−、−C(=S)−、−O−、−Si(Ra)2−、−S(=O)x−および−N(Ra)−より独立して選択される1個または2〜4個連結した基を含み;ここにおいて、
xは、0、1または2であり;
nは、1、2、3または4であり;
RaおよびRbは、各々独立して、H、保護基、ヒドロキシル、C1−C12アルキル、置換C1−C12アルキル、C2−C12アルケニル、置換C2−C12アルケニル、C2−C12アルキニル、置換C2−C12アルキニル、C5−C20アリール、置換C5−C20アリール、複素環ラジカル、置換複素環ラジカル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、C5−C7脂環式ラジカル、置換C5−C7脂環式ラジカル、ハロゲン、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、COOJ1、アシル(C(=O)−H)、置換アシル、CN、スルホニル(S(=O)2−J1)またはスルホキシル(S(=O)−J1)であり;そして
J1およびJ2は、各々独立して、H、C1−C12アルキル、置換C1−C12アルキル、C2−C12アルケニル、置換C2−C12アルケニル、C2−C12アルキニル、置換C2−C12アルキニル、C5−C20アリール、置換C5−C20アリール、アシル(C(=O)−H)、置換アシル、複素環ラジカル、置換複素環ラジカル、C1−C12アミノアルキル、置換C1−C12アミノアルキルまたは保護基である化合物が含まれる。
xは、0、1または2であり;
nは、1、2、3または4であり;
RaおよびRbは、各々独立して、H、保護基、ヒドロキシル、C1−C12アルキル、置換C1−C12アルキル、C2−C12アルケニル、置換C2−C12アルケニル、C2−C12アルキニル、置換C2−C12アルキニル、C5−C20アリール、置換C5−C20アリール、複素環ラジカル、置換複素環ラジカル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、C5−C7脂環式ラジカル、置換C5−C7脂環式ラジカル、ハロゲン、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、COOJ1、アシル(C(=O)−H)、置換アシル、CN、スルホニル(S(=O)2−J1)またはスルホキシル(S(=O)−J1)であり;そして
J1およびJ2は、各々独立して、H、C1−C12アルキル、置換C1−C12アルキル、C2−C12アルケニル、置換C2−C12アルケニル、C2−C12アルキニル、置換C2−C12アルキニル、C5−C20アリール、置換C5−C20アリール、アシル(C(=O)−H)、置換アシル、複素環ラジカル、置換複素環ラジカル、C1−C12アミノアルキル、置換C1−C12アミノアルキルまたは保護基である化合物が含まれる。
特定の態様において、二環式糖残基の架橋は、−[C(Ra)(Rb)]n−、−[C(Ra)(Rb)]n−O−、−C(RaRb)−N(R)−O−または−C(RaRb)−O−N(R)−である。特定の態様において、架橋は、4’−CH2−2’、4’−(CH2)2−2’、4’−(CH2)3−2’、4’−CH2−O−2’、4’−(CH2)2−O−2’、4’−CH2−O−N(R)−2’および4’−CH2−N(R)−O−2’−であり、ここにおいて、Rは、各々独立して、H、保護基またはC1−C12アルキルである。
特定の態様において、二環式ヌクレオシドには、下に示される(A)α−L−メチレンオキシ(4’−CH2−O−2’)BNA、(B)β−D−メチレンオキシ(4’−CH2−O−2’)BNA、(C)エチレンオキシ(4’−(CH2)2−O−2’)BNA、(D)アミノオキシ(4’−CH2−O−N(R)−2’)BNA、(E)オキシアミノ(4’−CH2−N(R)−O−2’)BNA、および(F)メチル(メチレンオキシ)(4’−CH(CH3)−O−2’)BNA、(G)メチレンチオ(4’−CH2−S−2’)BNA、(H)メチレンアミノ(4’−CH2−N(R)−2’)BNA、(I)メチル炭素環式(4’−CH2−CH(CH3)−2’)BNA、および(J)プロピレン炭素環式(4’−(CH2)3−2’)BNAが含まれるが、これに制限されるわけではない。
式中、Bxは、塩基残基であり、そしてRは、独立して、H、保護基またはC1−C12アルキルである。
特定の態様において、式I:
[式中、Bxは、複素環式塩基残基であり;
−Qa−Qb−Qc−は、−CH2−N(Rc)−CH2−、−C(=O)−N(Rc)−CH2−、−CH2−O−N(Rc)−、−CH2−N(Rc)−O−または−N(Rc)−O−CH2であり;
Rcは、C1−C12アルキルまたはアミノ保護基であり;そして
TaおよびTbは、各々独立して、H、ヒドロキシル保護基、抱合基(conjugate group)、反応性リン基、リン残基、または支持基剤への共有結合である]
を有する二環式ヌクレオシド。
−Qa−Qb−Qc−は、−CH2−N(Rc)−CH2−、−C(=O)−N(Rc)−CH2−、−CH2−O−N(Rc)−、−CH2−N(Rc)−O−または−N(Rc)−O−CH2であり;
Rcは、C1−C12アルキルまたはアミノ保護基であり;そして
TaおよびTbは、各々独立して、H、ヒドロキシル保護基、抱合基(conjugate group)、反応性リン基、リン残基、または支持基剤への共有結合である]
を有する二環式ヌクレオシド。
特定の態様において、式II:
(式中、Bxは、複素環式塩基残基であり;
TaおよびTbは、各々独立して、H、ヒドロキシル保護基、抱合基、反応性リン基、リン残基、または支持基剤への共有結合であり;
Zaは、C1−C6アルキル、C2−C6アルケニル、C2−C6アルキニル、置換C1−C6アルキル、置換C2−C6アルケニル、置換C2−C6アルキニル、アシル、置換アシル、置換アミド、チオールまたは置換チオである)
を有する二環式ヌクレオシド。
TaおよびTbは、各々独立して、H、ヒドロキシル保護基、抱合基、反応性リン基、リン残基、または支持基剤への共有結合であり;
Zaは、C1−C6アルキル、C2−C6アルケニル、C2−C6アルキニル、置換C1−C6アルキル、置換C2−C6アルケニル、置換C2−C6アルキニル、アシル、置換アシル、置換アミド、チオールまたは置換チオである)
を有する二環式ヌクレオシド。
一つの態様において、各々の置換基は、独立して、ハロゲン、オキソ、ヒドロキシル、OJc、NJcJd、SJc、N3、OC(=X)JcおよびNJeC(=X)NJcJdより独立して選択される置換基で一置換または多置換されていて、ここにおいて、Jc、JdおよびJeは、各々独立して、H、C1−C6アルキルまたは置換C1−C6アルキルであり、そしてXは、OまたはNJcである。
特定の態様において、式III:
[式中、Bxは、複素環式塩基残基であり;
TaおよびTbは、各々独立して、H、ヒドロキシル保護基、抱合基、反応性リン基、リン残基、または支持基剤への共有結合であり;
Zbは、C1−C6アルキル、C2−C6アルケニル、C2−C6アルキニル、置換C1−C6アルキル、置換C2−C6アルケニル、置換C2−C6アルキニルまたは置換アシル(C(=O)−)である]
を有する二環式ヌクレオシド。
TaおよびTbは、各々独立して、H、ヒドロキシル保護基、抱合基、反応性リン基、リン残基、または支持基剤への共有結合であり;
Zbは、C1−C6アルキル、C2−C6アルケニル、C2−C6アルキニル、置換C1−C6アルキル、置換C2−C6アルケニル、置換C2−C6アルキニルまたは置換アシル(C(=O)−)である]
を有する二環式ヌクレオシド。
特定の態様において、式IV:
(式中、Bxは、複素環式塩基残基であり;
TaおよびTbは、各々独立して、H、ヒドロキシル保護基、抱合基、反応性リン基、リン残基、または支持基剤への共有結合であり;
Rdは、C1−C6アルキル、置換C1−C6アルキル、C2−C6アルケニル、置換C2−C6アルケニル、C2−C6アルキニルまたは置換C2−C6アルキニルであり;
qa、qb、qcおよびqdは、各々独立して、H、ハロゲン、C1−C6アルキル、置換C1−C6アルキル、C2−C6アルケニル、置換C2−C6アルケニル、C2−C6アルキニルまたは置換C2−C6アルキニル、C1−C6アルコキシル、置換C1−C6アルコキシル、アシル、置換アシル、C1−C6アミノアルキルまたは置換C1−C6アミノアルキルである)
を有する二環式ヌクレオシド。
TaおよびTbは、各々独立して、H、ヒドロキシル保護基、抱合基、反応性リン基、リン残基、または支持基剤への共有結合であり;
Rdは、C1−C6アルキル、置換C1−C6アルキル、C2−C6アルケニル、置換C2−C6アルケニル、C2−C6アルキニルまたは置換C2−C6アルキニルであり;
qa、qb、qcおよびqdは、各々独立して、H、ハロゲン、C1−C6アルキル、置換C1−C6アルキル、C2−C6アルケニル、置換C2−C6アルケニル、C2−C6アルキニルまたは置換C2−C6アルキニル、C1−C6アルコキシル、置換C1−C6アルコキシル、アシル、置換アシル、C1−C6アミノアルキルまたは置換C1−C6アミノアルキルである)
を有する二環式ヌクレオシド。
特定の態様において、式V:
[式中、Bxは、複素環式塩基残基であり;
TaおよびTbは、各々独立して、H、ヒドロキシル保護基、抱合基、反応性リン基、リン残基、または支持基剤への共有結合であり;
qa、qb、qeおよびqfは、各々独立して、水素、ハロゲン、C1−C12アルキル、置換C1−C12アルキル、C2−C12アルケニル、置換C2−C12アルケニル、C2−C12アルキニル、置換C2−C12アルキニル、C1−C12アルコキシ、置換C1−C12アルコキシ、OJj、SJj、SOJj、SO2Jj、NJjJk、N3、CN、C(=O)OJj、C(=O)NJjJk、C(=O)Jj、O−C(=O)-NJjJk、N(H)C(=NH)NJjJk、N(H)C(=O)-NJjJkまたはN(H)C(=S)NJjJkであり;または
qeおよびqfは一緒に、=C(qg)(qh)であり;
qgおよびqhは、各々独立して、H、ハロゲン、C1−C12アルキルまたは置換C1−C12アルキルである]
を有する二環式ヌクレオシド。
TaおよびTbは、各々独立して、H、ヒドロキシル保護基、抱合基、反応性リン基、リン残基、または支持基剤への共有結合であり;
qa、qb、qeおよびqfは、各々独立して、水素、ハロゲン、C1−C12アルキル、置換C1−C12アルキル、C2−C12アルケニル、置換C2−C12アルケニル、C2−C12アルキニル、置換C2−C12アルキニル、C1−C12アルコキシ、置換C1−C12アルコキシ、OJj、SJj、SOJj、SO2Jj、NJjJk、N3、CN、C(=O)OJj、C(=O)NJjJk、C(=O)Jj、O−C(=O)-NJjJk、N(H)C(=NH)NJjJk、N(H)C(=O)-NJjJkまたはN(H)C(=S)NJjJkであり;または
qeおよびqfは一緒に、=C(qg)(qh)であり;
qgおよびqhは、各々独立して、H、ハロゲン、C1−C12アルキルまたは置換C1−C12アルキルである]
を有する二環式ヌクレオシド。
メチレンオキシ(4’−CH2−O−2’)BNAモノマーであるアデニン、シトシン、グアニン、5−メチルシトシン、チミンおよびウラシルの合成および製造は、それらのオリゴマー化および核酸認識特性と一緒に記載された(Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630)。BNAおよびそれらの製造も、WO98/39352号およびWO99/14226号に記載されている。
メチレンオキシ(4’−CH2−O−2’)BNAおよび2’−チオ−BNAの類似体も製造された(Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222)。核酸ポリメラーゼの基質としてのオリゴデオキシリボヌクレオチド二重らせんを含むロック済み(locked)ヌクレオシド類似体の製造も記載された(Wengel et al., WO99/14226号)。更に、新規な立体配座限定(comformationally restricted)高親和性オリゴヌクレオチド類似体である2’−アミノ−BNAの合成は、当該技術分野において記載された(Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039)。更に、2’−アミノ−BNAおよび2’−メチルアミノ−BNAが製造されたが、相補的RNAおよびDNA鎖を含むそれらの二重らせんの熱安定性は、以前に報告された。
特定の態様において、式VI:
[式中、Bxは、複素環式塩基残基であり;
TaおよびTbは、各々独立して、H、ヒドロキシル保護基、抱合基、反応性リン基、リン残基、または支持基剤への共有結合であり;
qi、qj、qkおよびqlは、各々独立して、H、ハロゲン、C1−C12アルキル、置換C1−C12アルキル、C2−C12アルケニル、置換C2−C12アルケニル、C2−C12アルキニル、置換C2−C12アルキニル、C1−C12アルコキシル、置換C1−C12アルコキシル、OJj、SJj、SOJj、SO2Jj、NJjJk、N3、CN、C(=O)OJj、C(=O)NJjJk、C(=O)Jj、O−C(=O)-NJjJk、N(H)C(=NH)NJjJk、N(H)C(=O)-NJjJkまたはN(H)C(=S)NJjJkであり;そして
qiおよびqjまたはqlおよびqkは一緒に、=C(qg)(qh)であり、ここにおいて、qgおよびqhは、各々独立して、H、ハロゲン、C1−C12アルキルまたは置換C1−C12アルキルである]
を有する二環式ヌクレオシド。
TaおよびTbは、各々独立して、H、ヒドロキシル保護基、抱合基、反応性リン基、リン残基、または支持基剤への共有結合であり;
qi、qj、qkおよびqlは、各々独立して、H、ハロゲン、C1−C12アルキル、置換C1−C12アルキル、C2−C12アルケニル、置換C2−C12アルケニル、C2−C12アルキニル、置換C2−C12アルキニル、C1−C12アルコキシル、置換C1−C12アルコキシル、OJj、SJj、SOJj、SO2Jj、NJjJk、N3、CN、C(=O)OJj、C(=O)NJjJk、C(=O)Jj、O−C(=O)-NJjJk、N(H)C(=NH)NJjJk、N(H)C(=O)-NJjJkまたはN(H)C(=S)NJjJkであり;そして
qiおよびqjまたはqlおよびqkは一緒に、=C(qg)(qh)であり、ここにおいて、qgおよびqhは、各々独立して、H、ハロゲン、C1−C12アルキルまたは置換C1−C12アルキルである]
を有する二環式ヌクレオシド。
4’−(CH2)3−2’架橋およびアルケニル類似体架橋4’−CH=CH−CH2−2’を有する一つの炭素環式二環式ヌクレオシドが記載された(Freier et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4429-4443 および Albaek et al., J. Org. Chem., 2006, 71, 7731-7740)。炭素環式二環式ヌクレオシドの合成および製造も、それらのオリゴマー化および生化学研究と一緒に記載された(Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(26), 8362-8379)。
特定の態様において、ヌクレオシドは、糖代用物でのリボシル環の置換によって修飾される。このような修飾には、制限されることなく、モルホリノ環、シクロヘキセニル環、シクロヘキシル環、または式:
を有するものなどのテトラヒドロピラニル環などの代用環系(時々、DNA類似体と称される)でのリボシル環の置換が含まれる。
アンチセンス化合物中に包含するためのヌクレオシドを修飾するのに用いることができる多数の他のビシクロおよびトリシクロ糖代用環系も、当該技術分野において知られている(例えば、概説論文:Leumann, Christian J., Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 841-854 を参照されたい)。このような環系は、活性を増強するためのいろいろな追加の置換を行うことができる。例えば、式VII:
[式中、式VIIを有するこの少なくとも一つのテトラヒドロピランヌクレオシド類似体各々について独立して、
Bxは、複素環式塩基残基であり;
TaおよびTbは、各々独立して、テトラヒドロピランヌクレオシド類似体をアンチセンス化合物に連結するヌクレオシド間連結基であり、またはTaおよびTbの一方は、テトラヒドロピランヌクレオシド類似体をアンチセンス化合物に連結するヌクレオシド間連結基であり、そしてTaおよびTbのもう一方は、H、ヒドロキシル保護基、連結した抱合基、または5’または3’末端基であり;
q1、q2、q3、q4、q5、q6およびq7は、各々独立して、H、C1−C6アルキル、置換C1−C6アルキル、C2−C6アルケニル、置換C2−C6アルケニル、C2−C6アルキニルまたは置換C2−C6アルキニルであり;そしてR1およびR2は各々、水素、ヒドロキシル、ハロゲン、置換(subsitituted)または未置換のアルコキシ、NJ1J2、SJ1、N3、OC(=X)J1、OC(=X)NJ1J2、NJ3C(=X)NJ1J2およびCNより選択され、ここにおいて、Xは、O、SまたはNJ1であり、そしてJ1、J2およびJ3は、各々独立して、HまたはC1−C6アルキルである]
を有する化合物を参照されたい。
Bxは、複素環式塩基残基であり;
TaおよびTbは、各々独立して、テトラヒドロピランヌクレオシド類似体をアンチセンス化合物に連結するヌクレオシド間連結基であり、またはTaおよびTbの一方は、テトラヒドロピランヌクレオシド類似体をアンチセンス化合物に連結するヌクレオシド間連結基であり、そしてTaおよびTbのもう一方は、H、ヒドロキシル保護基、連結した抱合基、または5’または3’末端基であり;
q1、q2、q3、q4、q5、q6およびq7は、各々独立して、H、C1−C6アルキル、置換C1−C6アルキル、C2−C6アルケニル、置換C2−C6アルケニル、C2−C6アルキニルまたは置換C2−C6アルキニルであり;そしてR1およびR2は各々、水素、ヒドロキシル、ハロゲン、置換(subsitituted)または未置換のアルコキシ、NJ1J2、SJ1、N3、OC(=X)J1、OC(=X)NJ1J2、NJ3C(=X)NJ1J2およびCNより選択され、ここにおいて、Xは、O、SまたはNJ1であり、そしてJ1、J2およびJ3は、各々独立して、HまたはC1−C6アルキルである]
を有する化合物を参照されたい。
特定の態様において、q1、q2、q3、q4、q5、q6およびq7が、各々H(M)である式VIIを有する修飾THPヌクレオシドを提供する。特定の態様において、q1、q2、q3、q4、q5、q6およびq7の少なくとも一つは、H以外である。特定の態様において、q1、q2、q3、q4、q5、q6およびq7の少なくとも一つは、メチルである。特定の態様において、R1およびR2の一方が、フルオロ(K)である式VIIを有するTHPヌクレオシドを提供する。特定の態様において、R1およびR2の一方が、メトキシエトキシである式VIIを有するTHPヌクレオシドを提供する。特定の態様において、R1はフルオロであり、そしてR2はHである;R1はHであり、そしてR2はフルオロである;R1はメトキシであり、そしてR2はHである;そしてR1はHであり、そしてR2はメトキシエトキシである。修飾糖の製造方法は、当業者に周知である。
修飾糖残基を有するヌクレオチドの場合、核酸塩基残基(天然の、修飾されたまたはその組み合わせ)は、適当な核酸標的とのハイブリダイゼーションのために維持される。
特定の態様において、第XI因子核酸を標的とするアンチセンス化合物は、修飾糖残基を有する一つまたはそれを超えるヌクレオチドを含む。特定の態様において、修飾糖残基は、2’−MOEである。特定の態様において、2’−MOE修飾ヌクレオチドは、ギャップマーモチーフ中に配置されている。特定の態様において、修飾糖残基は、(4’−CH(CH3)−O−2’)架橋性基を有する二環式ヌクレオシドである。特定の態様において、(4’−CH(CH3)−O−2’)修飾ヌクレオチドは、ギャップマーモチーフのウィング中に配置されている。
修飾核酸塩基
核酸塩基(または塩基)修飾または置換は、天然に存在するまたは合成の未修飾核酸塩基とは、構造的に区別可能であるが、機能的に交換可能である。天然の核酸塩基も修飾された核酸塩基も、水素結合に関与することが可能である。このような核酸塩基修飾は、ヌクレアーゼ安定性、結合親和性またはいくつか他の有益な生物学的性質をアンチセンス化合物に与えることができる。修飾核酸塩基には、例えば、5−メチルシトシン(5−me−C)などの合成および天然の核酸塩基が含まれる。5−メチルシトシン置換を含めた特定の核酸塩基置換は、標的核酸へのアンチセンス化合物の結合親和性を増加させるのに特に有用である。例えば、5−メチルシトシン置換は、核酸二重らせん安定性を0.6〜1.2℃増加させることが分かった(Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. and Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278)。
核酸塩基(または塩基)修飾または置換は、天然に存在するまたは合成の未修飾核酸塩基とは、構造的に区別可能であるが、機能的に交換可能である。天然の核酸塩基も修飾された核酸塩基も、水素結合に関与することが可能である。このような核酸塩基修飾は、ヌクレアーゼ安定性、結合親和性またはいくつか他の有益な生物学的性質をアンチセンス化合物に与えることができる。修飾核酸塩基には、例えば、5−メチルシトシン(5−me−C)などの合成および天然の核酸塩基が含まれる。5−メチルシトシン置換を含めた特定の核酸塩基置換は、標的核酸へのアンチセンス化合物の結合親和性を増加させるのに特に有用である。例えば、5−メチルシトシン置換は、核酸二重らせん安定性を0.6〜1.2℃増加させることが分かった(Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. and Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278)。
追加の未修飾核酸塩基には、5−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの6−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの2−プロピルおよび他のアルキル誘導体、2−チオウラシル、2−チオチミンおよび2−チオシトシン、5−ハロウラシルおよびシトシン、5−プロピニル(−C≡C−CH3)ウラシルおよびシトシン、およびピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、6−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、5−ウラシル(プソイドウラシル)、4−チオウラシル、8−ハロ、8−アミノ、8−チオール、8−チオアルキル、8−ヒドロキシルおよび他の8−置換アデニンおよびグアニン、5−ハロ、具体的には、5−ブロモ、5−トリフルオロメチルおよび他の5−置換ウラシルおよびシトシン、7−メチルグアニンおよび7−メチルアデニン、2−F−アデニン、2−アミノアデニン、8−アザグアニンおよび8−アザアデニン、7−デアザグアニンおよび7−デアザアデニン、および3−デアザグアニンおよび3−デアザアデニンが含まれる。
複素環式塩基残基には、更に、プリンまたはピリミジン塩基が、他の複素環、例えば、7−デアザアデニン、7−デアザグアノシン、2−アミノピリジンおよび2−ピリドンで置き換えられているものが含まれてよい。アンチセンス化合物の結合親和性を増加させるのに特に有用である核酸塩基には、2アミノプロピルアデニン、5−プロピニルウラシルおよび5−プロピニルシトシンを含めた、5−置換ピリミジン、6−アザピリミジンおよびN−2、N−6およびO−6置換プリンが含まれる。
特定の態様において、第XI因子核酸を標的とするアンチセンス化合物は、一つまたはそれを超える修飾核酸塩基を含む。特定の態様において、第XI因子核酸を標的とする広幅ギャップアンチセンスオリゴヌクレオチドは、一つまたはそれを超える修飾核酸塩基を含む。特定の態様において、修飾核酸塩基は、5−メチルシトシンである。特定の態様において、シトシンは各々、5−メチルシトシンである。
医薬組成物を処方するための組成および方法
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、医薬組成物または製剤の製造のために、薬学的に許容しうる活性または不活性な物質と混合することができる。医薬組成物の処方のための組成および方法は、投与経路、疾患の程度または投与される用量が含まれるがこれに制限されるわけではない多数の判定基準に依存する。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、医薬組成物または製剤の製造のために、薬学的に許容しうる活性または不活性な物質と混合することができる。医薬組成物の処方のための組成および方法は、投与経路、疾患の程度または投与される用量が含まれるがこれに制限されるわけではない多数の判定基準に依存する。
アンチセンス化合物を含む医薬組成物は、ヒトを含めた動物への投与時に、生物学的に活性な代謝産物またはその残留物を(直接的にまたは間接的に)与えることが可能であるいずれかの薬学的に許容しうる塩、エステル、またはこのようなエステルの塩、またはいずれか他のオリゴヌクレオチドを包含する。したがって、例えば、開示は、アンチセンス化合物の薬学的に許容しうる塩、プロドラッグ、このようなプロドラッグの薬学的に許容しうる塩、および他の生物学的同等物にも及ぶ。適する薬学的に許容しうる塩には、ナトリウム塩およびカリウム塩が含まれるが、これに制限されるわけではない。
特定の態様において、本発明の一つまたはそれを超える修飾オリゴヌクレオチドは、プロドラッグとして処方することができる。プロドラッグは、in vivo 投与時に活性化合物が再生されるであろうように薬学的に活性な化合物を修飾することによって製造することができる。例えば、プロドラッグは、アンチセンス化合物の一方または双方の末端に、内因性ヌクレアーゼによって体内で切断されて活性アンチセンス化合物を形成させる追加のヌクレオシドの包含を包含することができる。そのプロドラッグは、薬物の代謝安定性または輸送特性を変更する、副作用または毒性を隠す、薬物の香味を改善する、または薬物の他の特性または性質を変更するように設計することができる。特定の態様において、in vivo 投与時に、プロドラッグは、生物学的に、薬学的にまたは治療的に一層活性な形の修飾オリゴヌクレオチドへと化学変換される。特定の態様において、プロドラッグは、それらの該当する活性形よりも投与するのが容易であるので、有用である。例えば、特定の態様において、プロドラッグは、該当する活性形の場合よりも(例えば、経口投与によって)生物学的に利用可能でありうる。特定の態様において、プロドラッグは、該当する活性形と比較して、改善された溶解性を有することがありうる。特定の態様において、プロドラッグは、該当する活性形よりも水溶性が少ない。特定の場合、このようなプロドラッグは、細胞膜を越える優れた透過を有するが、この場合、水への溶解度は、移動度に不利益である。特定の態様において、プロドラッグは、エステルである。特定のこのような態様において、そのエステルは、投与時にカルボン酸へと代謝加水分解される。特定の場合、カルボン酸含有化合物は、該当する活性形である。特定の態様において、プロドラッグは、酸基に結合した短いペプチド(ポリアミノ酸)を含む。特定のこのような態様において、そのペプチドは、投与時に切断されて、該当する活性形を形成する。
特定の態様において、本発明の医薬組成物は、単位剤形(例えば、錠剤、カプセル剤、巨丸剤等)で投与される。特定の態様において、このような医薬組成物は、修飾オリゴヌクレオチドを、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、55mg、60mg、65mg、70mg、75mg、80mg、85mg、90mg、95mg、100mg、105mg、110mg、115mg、120mg、125mg、130mg、135mg、140mg、145mg、150mg、155mg、160mg、165mg、170mg、175mg、180mg、185mg、190mg、195mg、200mg、205mg、210mg、215mg、220mg、225mg、230mg、235mg、240mg、245mg、250mg、255mg、260mg、265mg、270mg、270mg、280mg、285mg、290mg、295mg、300mg、305mg、310mg、315mg、320mg、325mg、330mg、335mg、340mg、345mg、350mg、355mg、360mg、365mg、370mg、375mg、380mg、385mg、390mg、395mg、400mg、405mg、410mg、415mg、420mg、425mg、430mg、435mg、440mg、445mg、450mg、455mg、460mg、465mg、470mg、475mg、480mg、485mg、490mg、495mg、500mg、505mg、510mg、515mg、520mg、525mg、530mg、535mg、540mg、545mg、550mg、555mg、560mg、565mg、570mg、575mg、580mg、585mg、590mg、595mg、600mg、605mg、610mg、615mg、620mg、625mg、630mg、635mg、640mg、645mg、650mg、655mg、660mg、665mg、670mg、675mg、680mg、685mg、690mg、695mg、700mg、705mg、710mg、715mg、720mg、725mg、730mg、735mg、740mg、745mg、750mg、755mg、760mg、765mg、770mg、775mg、780mg、785mg、790mg、795mgおよび800mgより選択される用量で含む。特定の態様において、本発明の医薬組成物は、25mg、50mg、75mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、500mg、600mg、700mgおよび800mgより選択される用量の修飾オリゴヌクレオチドを含む。
特定の態様において、医薬組成物は、適する希釈剤、例えば、注射用滅菌水または注射用滅菌生理食塩水で再構成される滅菌凍結乾燥済み修飾オリゴヌクレオチドを含む。再構成される製品は、生理食塩水中に希釈後、皮下注射としてまたは静脈内注入として投与する。凍結乾燥済み薬物製品は、注射用水または注射用生理食塩水中で調製し、調製中に酸または塩基でpH7.0〜9.0に調整後、凍結乾燥された修飾オリゴヌクレオチドから成る。凍結乾燥済み修飾オリゴヌクレオチドは、25〜800mgの、または上記の25〜800mgのいずれかの用量の修飾オリゴヌクレオチドであってよい。凍結乾燥済み薬物製品は、2mLの Type I透明ガラスバイアル(硫酸アンモニウム処理済み)中に包装し、ブロモブチルゴムクロージャーで栓をし、そしてアルミニウムFLIP−OFF.RTM.オーバーシールで密封されていてよい。
特定の態様において、本発明の組成物は、更に、医薬組成物中で慣用的に見出される他の補助成分を、それらの当該技術分野で確立された使用レベルで含有してよい。したがって、例えば、組成物は、追加の、適合性の、薬学的に活性な物質、例えば、止痒薬、収斂薬、局所麻酔薬または抗炎症薬などを含有してよいし、または染料、着香剤、保存剤、酸化防止剤、乳白剤、増粘剤および安定化剤などの、本発明の組成物のいろいろな剤形を物理的に処方する場合に有用な追加の物質を含有してよい。このような物質は、加えられる場合、本発明の組成物の成分の生物学活性を過度に妨害すべきではない。製剤は、滅菌することができるし、そして所望ならば、製剤の一つまたは複数のオリゴヌクレオチドと有害に相互作用することがない補助物質、例えば、滑沢剤、保存剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響する塩類、緩衝剤、着色剤、着香剤および/または芳香物質等と混合することができる。
特定の態様において、本発明の医薬組成物は、一つまたはそれを超える修飾オリゴヌクレオチドおよび一つまたはそれを超える賦形剤を含む。特定の態様において、賦形剤は、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミラーゼ、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロースおよびポリビニルピロリドンより選択される。
特定の態様において、本発明の医薬組成物は、混合する、溶解させる、造粒する、糖衣錠製造する、磨砕する、乳化させる、カプセル封入する、閉じ込めるまたは錠剤成形する方法が含まれるがこれに制限されるわけではない既知の技法を用いて製造される。
特定の態様において、第XI因子核酸を標的とする本発明の化合物は、アンチセンス化合物を適する薬学的に許容しうる希釈剤または担体と組み合わせることによって、医薬組成物中で利用することができる。薬学的に許容しうる希釈剤には、水、油、アルコールまたはリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)が含まれるが、これに制限されるわけではない。PBSは、非経口送達される組成物中で用いるのに適する希釈剤である。したがって、一つの態様において、本明細書中に記載の方法で用いられるのは、第XI因子核酸を標的とする化合物および薬学的に許容しうる希釈剤を含む医薬組成物である。特定の態様において、薬学的に許容しうる希釈剤は、PBSである。特定の態様において、化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
特定の態様において、本発明の医薬組成物は、液体(例えば、懸濁液、エリキシルおよび/または溶液)である。特定のこのような態様において、液状医薬組成物は、水、緩衝化生理食塩水、グリコール、油、アルコール、着香剤、保存剤および着色剤が含まれるがこれに制限されるわけではない当該技術分野において知られている成分を用いて製造される。
特定の態様において、本発明の医薬組成物は、固体(例えば、粉末、錠剤および/またはカプセル)である。特定のこのような態様において、一つまたはそれを超えるオリゴヌクレオチドを含む固形医薬組成物は、デンプン、糖、希釈剤、造粒剤、滑沢剤、結合剤および崩壊剤が含まれるがこれに制限されるわけではない当該技術分野において知られている成分を用いて製造される。
特定の態様において、本発明の医薬組成物は、デポ製剤として処方される。特定のこのようなデポ製剤は、典型的に、非デポ製剤よりも長時間作用性である。特定の態様において、このような製剤は、植込み(例えば、皮下または筋肉内)によってまたは筋肉内注射によって投与される。特定の態様において、デポ製剤は、適するポリマー性または疎水性物質(例えば、許容しうる油中のエマルジョン)またはイオン交換樹脂を用いて、または僅かに可溶性の誘導体として、例えば、僅かに可溶性の塩として製造される。
特定の態様において、本発明の医薬組成物は、送達システムを含む。送達システムの例には、リポソームおよびエマルジョンが含まれるが、これに制限されるわけではない。特定の送達システムは、疎水性化合物を含むものを含めた特定の医薬組成物を製造するのに有用である。特定の態様において、ジメチルスルホキシドなどの特定の有機溶媒を用いる。
特定の態様において、本発明の医薬組成物は、本発明の一つまたはそれを超える医薬物質を、特定の組織または細胞タイプへ送達するように設計された一つまたはそれを超える組織特異的送達分子を含む。例えば、特定の態様において、医薬組成物は、組織特異的抗体で被覆されたリポソームを包含する。
特定の態様において、本発明の医薬組成物は、補助溶媒システム(co-solvent system)を含む。特定のこのような補助溶媒システムは、例えば、ベンジルアルコール、無極性界面活性剤、水混和性有機ポリマーおよび水性相を含む。特定の態様において、このような補助溶媒システムは、疎水性化合物に用いられる。このような補助溶媒システムの非制限例は、VPD補助溶媒システムであり、それは、3%w/vのベンジルアルコール、8%w/vの無極性界面活性剤 Polysorbate 80.TMおよび65%w/vのポリエチレングリコール300を含む無水エタノールの溶液である。このような補助溶媒システムの比率は、それらの溶解性および毒性を有意に変更することなく、かなり変動することがありうる。更に、補助溶媒成分の同一性は、変動することがありうる。例えば、他の界面活性剤を、Polysorbate 80.TM.の代わりに用いることができる;ポリエチレングリコールの分別サイズは、変動することがありうる;他の生体適合性ポリマーは、ポリエチレングリコール、例えば、ポリビニルピロリドンに代わることができる;そして他の糖または多糖は、デキストロースの代わりにすることができる。
特定の態様において、本発明の医薬組成物は、徐放性システムを含む。このような徐放性システムの非制限例は、固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスである。特定の態様において、徐放性システムは、それらの化学的性質に依存して、医薬物質を何時間か、何日間か、何週間かまたは何ヶ月間かにわたって放出することができる。
特定の態様において、本発明の医薬組成物は、経口投与用に製造される。特定のこのような態様において、医薬組成物は、修飾オリゴヌクレオチドを含む一つまたはそれを超える化合物を、一つまたはそれを超える薬学的に許容しうる担体と組み合わせることによって処方される。特定のこのような担体は、医薬組成物を、対象による経口摂取用に、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤等として処方することを可能にする。特定の態様において、経口使用のための医薬組成物は、オリゴヌクレオチドおよび一つまたはそれを超える固形賦形剤を混合することによって得られる。適する賦形剤には、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含めた糖などの充填剤;セルロース製品、例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、バレイショデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロースおよび/またはポリビニルピロリドン(PVP)などが含まれるが、これに制限されるわけではない。特定の態様において、このような混合物は、粉砕されてよいし、そして助剤を加えてよい。特定の態様において、医薬組成物は、錠剤または糖衣錠のコアを得るように形成される。特定の態様において、崩壊剤(例えば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸またはアルギン酸ナトリウムなどのその塩)を加える。
特定の態様において、糖衣錠コアは、コーティングと一緒に与えられる。特定のこのような態様において、濃厚糖溶液を用いることができ、それは、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル(carbopol gel)、ポリエチレングリコールおよび/または二酸化チタン、ラッカー溶液、および適する有機溶媒または溶媒混合物を含有してもよい。色素または顔料を、錠剤または糖衣錠のコーティングに加えることができる。
特定の態様において、経口投与用の医薬組成物は、ゼラチン製の押し嵌め(push-fit)カプセル剤である。特定のこのような押し嵌めカプセル剤は、本発明の一つまたはそれを超える医薬物質を、一つまたはそれを超えるラクトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤、および/またはタルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤および場合により、安定化剤との混合物中で含む。特定の態様において、経口投与用の医薬組成物は、ゼラチンと、グリセロールまたはソルビトールなどの可塑剤から作られる軟シールカプセル剤である。特定の軟カプセル剤の場合、本発明の一つまたはそれを超える医薬物質は、脂肪油、流動パラフィンまたは液状ポリエチレングリコールなどの適する液体中に溶解させるまたは懸濁させる。更に、安定化剤を加えることができる。
特定の態様において、医薬組成物は、口腔内投与用に製造される。特定のこのような医薬組成物は、慣用的な方式で処方される錠剤またはロゼンジである。
特定の態様において、医薬組成物は、注射(例えば、静脈内、皮下、筋肉内等)による投与用に製造される。特定のこのような態様において、医薬組成物は、担体を含み、そして水、またはハンクス液、リンガー液または生理食塩水緩衝液(例えば、PBS)などの生理学的に適合性の緩衝液などの水溶液中で処方される。特定の態様において、他の成分(例えば、溶解性の助けとなるまたは保存剤として役立つ成分)が含まれる。特定の態様において、注射可能懸濁剤は、適当な液状担体、懸濁化剤等を用いて製造される。注射用の特定の医薬組成物は、単位剤形で、例えば、アンプル中、または複数回用量容器中で与えられる。注射用の特定の医薬組成物は、油状または水性のビヒクル中の懸濁剤、液剤または乳剤であり、そして懸濁化剤、安定化剤および/または分散助剤などの配合剤を含有してよい。注射用の医薬組成物中で用いるのに適する特定の溶媒には、親油性溶媒およびゴマ油などの脂肪油、オレイン酸エチルまたはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、およびリポソームが含まれるが、これに制限されるわけではない。水性注射用懸濁剤は、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランなどの、懸濁液の粘度を増加させる物質を含有してよい。場合により、このような懸濁剤は、更に、適する安定化剤、または極めて濃厚な液剤の製造を可能にするように医薬物質の溶解度を増加させる物質を含有してよい。
特定の態様において、医薬組成物は、経粘膜投与用に製造される。特定のこのような態様において、透過する関門に適当な浸透剤を、製剤中に用いる。このような浸透剤は、概して、当該技術分野において知られている。
特定の態様において、医薬組成物は、吸入による投与用に製造される。吸入用の特定のこのような医薬組成物は、加圧パックまたはネブライザー中のエアゾルスプレーの形で製造される。特定のこのような医薬組成物は、噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適するガスを含む。加圧エアゾルを用いる特定の態様において、投薬単位は、一定計量を送達するバルブで決定することができる。特定の態様において、吸入器または吹入器中で用いるためのカプセル剤およびカートリッジを処方することができる。特定のこのような製剤は、本発明の医薬物質と、ラクトースまたはデンプンなどの適する粉末塩基の粉末混合物を含む。
特定の態様において、医薬組成物は、坐剤または停留浣腸などの、直腸投与用に製造される。特定のこのような医薬組成物は、カカオ脂および/または他のグリセリドなどの既知の成分を含む。
特定の態様において、医薬組成物は、局所投与用に製造される。特定のこのような医薬組成物は、軟膏剤またはクリーム剤などの無刺激吸湿性基剤を含む。代表的な適する軟膏基剤には、ワセリン、揮発性シリコーンを加えたワセリン、およびラノリンおよび油中水エマルジョンが含まれるが、これに制限されるわけではない。代表的な適するクリーム基剤には、コールドクリームおよび親水性軟膏が含まれるが、これに制限されるわけではない。
特定の態様において、本発明の医薬組成物は、治療的有効量の修飾オリゴヌクレオチドを含む。特定の態様において、治療的有効量は、疾患の症状を予防する、軽減するまたは改善する、または処置されている対象の生存を延長するのに十分である。
投与経路
特定の態様において、対象へ投与することは、非経口投与を含む。特定の態様において、対象へ投与することは、静脈内投与を含む。特定の態様において、対象へ投与することは、皮下投与を含む。
特定の態様において、対象へ投与することは、非経口投与を含む。特定の態様において、対象へ投与することは、静脈内投与を含む。特定の態様において、対象へ投与することは、皮下投与を含む。
特定の態様において、投与には、肺投与が含まれる。特定の態様において、肺投与は、エアゾール適用オリゴヌクレオチドの吸入器による対象の肺への送達を含む。エアゾール適用オリゴヌクレオチドの対象による吸入後、オリゴヌクレオチドは、肺胞マクロファージ、好酸球、上皮、血管内皮および細気管支上皮を含めた、正常および炎症双方の肺組織の細胞に分布する。修飾オリゴヌクレオチドを含む医薬組成物の送達に適する装置には、標準的なネブライザー装置が含まれるが、これに制限されるわけではない。追加の適する装置には、乾燥粉末吸入器または定量吸入器が含まれる。
特定の態様において、医薬組成物は、全身暴露よりもむしろ局所暴露を達成するように投与される。例えば、肺投与は、医薬組成物を肺へ、最小限の全身暴露で送達する。
追加の適する投与経路には、経口、直腸内、経粘膜、腸管、経腸、局部、坐剤、髄腔内、脳室内、腹腔内、鼻腔内、眼内、筋肉内、髄内および腫瘍内が含まれるが、これに制限されるわけではない。
抱合アンチセンス化合物
特定の態様において、本発明の化合物は、得られたアンチセンスオリゴヌクレオチドの活性、細胞分布または細胞取込みを増強する一つまたはそれを超える残基または抱合体(conjugate)に共有結合で連結することができる。典型的な抱合基には、コレステロール残基および脂質残基が含まれる。追加の抱合基には、炭水化物、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸塩、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリンおよび染料が含まれる。
特定の態様において、本発明の化合物は、得られたアンチセンスオリゴヌクレオチドの活性、細胞分布または細胞取込みを増強する一つまたはそれを超える残基または抱合体(conjugate)に共有結合で連結することができる。典型的な抱合基には、コレステロール残基および脂質残基が含まれる。追加の抱合基には、炭水化物、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸塩、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリンおよび染料が含まれる。
特定の態様において、アンチセンス化合物は、更に修飾されて、概して、アンチセンス化合物の一方または双方の末端に結合して、例えば、ヌクレアーゼ安定性などの性質を増強する一つまたはそれを超える安定性基を有することができる。安定性基に包含されるのは、キャップ構造である。これら末端修飾は、末端核酸を有するアンチセンス化合物を、エキソヌクレアーゼ分解から保護し、しかも細胞内の送達および/または局在化に役立つことができる。そのキャップは、5’末端(5’キャップ)または3’末端(3’キャップ)に存在することができるし、または双方の末端上に存在することができる。キャップ構造は、当該技術分野において周知であり、それには、例えば、逆方向デオキシ脱塩基キャップが含まれる。アンチセンス化合物の一方または双方の末端をキャップして、ヌクレアーゼ安定性を与えるのに用いることができる追加の3’および5’安定性基には、2003年1月16日公開のWO03/004602号に開示されたものが含まれる。
細胞培養およびアンチセンス化合物処理
第XI因子核酸のレベル、活性または発現へのアンチセンス化合物の作用は、いろいろな細胞タイプにおいて in vitro で調べることができる。このような分析に用いられる細胞タイプは、販売業者(例えば、American Type Culture Collection, Manassus, VA; Zen-Bio, Inc., Research Triangle Park, NC; Clonetics Corporation, Walkersville, MD)から入手可能であり、そして細胞は、販売業者の取扱説明書にしたがって、商業的に入手可能な試薬(例えば、Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)を用いて培養する。典型的な細胞タイプには、HepG2細胞、Hep3B細胞および一次肝細胞が含まれるが、これに制限されるわけではない。
第XI因子核酸のレベル、活性または発現へのアンチセンス化合物の作用は、いろいろな細胞タイプにおいて in vitro で調べることができる。このような分析に用いられる細胞タイプは、販売業者(例えば、American Type Culture Collection, Manassus, VA; Zen-Bio, Inc., Research Triangle Park, NC; Clonetics Corporation, Walkersville, MD)から入手可能であり、そして細胞は、販売業者の取扱説明書にしたがって、商業的に入手可能な試薬(例えば、Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)を用いて培養する。典型的な細胞タイプには、HepG2細胞、Hep3B細胞および一次肝細胞が含まれるが、これに制限されるわけではない。
アンチセンスオリゴヌクレオチドの in vitro 試験
本明細書中に記載されるのは、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの細胞の処理方法であり、それは、他のアンチセンス化合物での処理用に適当に修飾することができる。
本明細書中に記載されるのは、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの細胞の処理方法であり、それは、他のアンチセンス化合物での処理用に適当に修飾することができる。
概して、細胞は、それら細胞が、培養中に約60〜80%密集に達した時点で、アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理する。
アンチセンスオリゴヌクレオチドを培養細胞中に導入するのに一般的に用いられる一つの試薬には、陽イオン脂質トランスフェクション試薬LIPOFECTIN(登録商標)(Invitrogen, Carlsbad, CA)が含まれる。アンチセンスオリゴヌクレオチドを、OPTI−MEM(登録商標)1(Invitrogen, Carlsbad, CA)中でLIPOFECTIN(登録商標)と混合して、アンチセンスオリゴヌクレオチドの所望の最終濃度、および典型的に、100nMアンチセンスオリゴヌクレオチドにつき2〜12ug/mLであるLIPOFECTIN(登録商標)濃度を達成する。
アンチセンスオリゴヌクレオチドを培養細胞中に導入するのに用いられる別の試薬には、LIPOFECTAMINE(登録商標)(Invitrogen, Carlsbad, CA)が含まれる。アンチセンスオリゴヌクレオチドを、OPTI−MEM(登録商標)1低血清基剤(Invitrogen, Carlsbad, CA)中でLIPOFECTAMINE(登録商標)と混合して、アンチセンスオリゴヌクレオチドの所望の濃度、および典型的に、100nMアンチセンスオリゴヌクレオチドにつき2〜12ug/mLであるLIPOFECTAMINE(登録商標)濃度を達成する。
アンチセンスオリゴヌクレオチドを培養細胞中に導入するのに用いられる別の技法には、エレクトロポレーションが含まれる。
細胞は、常套法により、アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理する。細胞は、典型的に、アンチセンスオリゴヌクレオチド処理後16〜24時間に採取するが、その時点で、標的核酸のRNAまたはタンパク質レベルを、当該技術分野において知られている方法および本明細書中に記載の方法によって測定する。概して、処理を、多数反復試験で行う場合、データは、反復処理の平均として示される。
用いられるアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度は、細胞系毎に異なる。特定の細胞系の最適アンチセンスオリゴヌクレオチド濃度を決定する方法は、当該技術分野において周知である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、LIPOFECTAMINE(登録商標)でトランスフェクションする場合、典型的に、1nM〜300nMの濃度で用いられる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、エレクトロポレーションを用いてトランスフェクションする場合、625〜20,000nMのより高い濃度で用いられる。
RNA単離
RNA分析は、全細胞RNAまたはポリ(A)+mRNAについて行うことができる。RNA単離方法は、当該技術分野において周知である。RNAは、当該技術分野において周知の方法を用いて、例えば、TRIZOL(登録商標)Reagent(Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いて、製造者の推奨プロトコルにしたがって調製する。
RNA分析は、全細胞RNAまたはポリ(A)+mRNAについて行うことができる。RNA単離方法は、当該技術分野において周知である。RNAは、当該技術分野において周知の方法を用いて、例えば、TRIZOL(登録商標)Reagent(Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いて、製造者の推奨プロトコルにしたがって調製する。
標的のレベルまたは発現の阻害分析
第XI因子核酸のレベルまたは発現の阻害は、当該技術分野において知られているいろいろな方法で検定することができる。例えば、標的核酸レベルは、例えば、ノーザンブロット分析、競合的ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)または定量リアルタイムPCRによって定量することができる。RNA分析は、全細胞RNAまたはポリ(A)+mRNAについて行うことができる。RNA単離方法は、当該技術分野において周知である。ノーザンブロット分析も、当該技術分野において常套である。定量リアルタイムPCRは、PE−Applied Biosystems, Foster City, CA より入手可能で且つ製造者の取扱説明書にしたがって用いられる、商業的に入手可能なABI PRISM(登録商標)7600、7700または7900 Sequence Detection System を用いて、好都合に行うことができる。
第XI因子核酸のレベルまたは発現の阻害は、当該技術分野において知られているいろいろな方法で検定することができる。例えば、標的核酸レベルは、例えば、ノーザンブロット分析、競合的ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)または定量リアルタイムPCRによって定量することができる。RNA分析は、全細胞RNAまたはポリ(A)+mRNAについて行うことができる。RNA単離方法は、当該技術分野において周知である。ノーザンブロット分析も、当該技術分野において常套である。定量リアルタイムPCRは、PE−Applied Biosystems, Foster City, CA より入手可能で且つ製造者の取扱説明書にしたがって用いられる、商業的に入手可能なABI PRISM(登録商標)7600、7700または7900 Sequence Detection System を用いて、好都合に行うことができる。
標的RNAレベルの定量リアルタイムPCR分析
標的RNAレベルの定量は、定量リアルタイムPCRにより、ABI PRISM(登録商標)7600、7700または7900 Sequence Detection System(PE−Applied Biosystems, Foster City, CA)を用いて、製造者の取扱説明書にしたがって行うことができる。定量リアルタイムPCRの方法は、当該技術分野において周知である。
標的RNAレベルの定量は、定量リアルタイムPCRにより、ABI PRISM(登録商標)7600、7700または7900 Sequence Detection System(PE−Applied Biosystems, Foster City, CA)を用いて、製造者の取扱説明書にしたがって行うことができる。定量リアルタイムPCRの方法は、当該技術分野において周知である。
リアルタイムPCRの前に、単離されたRNAを、逆転写酵素(RT)反応に供するが、それは、相補的DNA(cDNA)を生じた後、それを、リアルタイムPCR増幅の基質として用いる。RT反応およびリアルタイムPCR反応は、同じ試料ウェル中で逐次的に行われる。RT試薬およびリアルタイムPCR試薬は、Invitrogen(Carlsbad, CA)より入手する。RT反応、リアルタイムPCR反応は、当業者に周知の方法によって行われる。
リアルタイムPCRによって得られる遺伝子(またはRNA)標的量は、シクロフィリンAまたはGAPDHなどの、発現が一定している遺伝子の発現レベルを用いてか、または全RNAをRIBOGREEN(登録商標)(Invitrogen, Inc. Carlsbad, CA)を用いて定量することによって規格化される。シクロフィリンAまたはGAPDH発現は、リアルタイムPCRにより、標的と同時に、多重にまたは別々に行うことによって定量する。全RNAは、RIBOGREEN(登録商標)RNA定量化試薬(Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いて定量する。RIBOGREEN(登録商標)によるRNA定量化の方法は、Jones, L.J., et al,(Analytical Biochemistry, 1998, 265, 368-374)に示されている。CYTOFLUOR(登録商標)4000計測器(PE Applied Biosystems)は、RIBOGREEN(登録商標)蛍光を測定するのに用いられる。
プローブおよびプライマーは、第XI因子核酸にハイブリッド形成するように設計される。リアルタイムPCRプローブおよびプライマーを設計する方法は、当該技術分野において周知であり、それには、PRIMER EXPRESS(登録商標)Software(Applied Biosystems, Foster City, CA)などのソフトウェアの使用が含まれてよい。
PCRプローブは、5’末端に共有結合で連結したJOEまたはFAM、および3’末端に共有結合で連結したTAMRAまたはMGBを有するが、この場合、JOEまたはFAMは、蛍光レポーター染料であり、そしてTAMRAまたはMGBは、消光剤染料である。いくつかの細胞タイプにおいて、異なった種からの配列へと設計されたプライマーおよびプローブは、発現を測定するのに用いられる。例えば、ヒトGAPDHプライマー・プローブセットは、サル由来の細胞および細胞系におけるGAPDH発現を測定するのに用いることができる。
タンパク質レベルの分析
第XI因子核酸のアンチセンス阻害は、第XI因子タンパク質レベルを測定することによって評価することができる。第XI因子のタンパク質レベルは、免疫沈降、ウェスタンブロット分析(免疫ブロット法)、固相酵素免疫検定法(enzyme-linked immunosorbent assay)(ELISA)、定量タンパク質検定、タンパク質活性検定(例えば、カスパーゼ活性検定)、免疫組織化学、免疫細胞化学または蛍光活性化セルソーティング(fluorescence-activated cell sorting)(FACS)などの、当該技術分野において周知のいろいろな方法で評価するまたは定量することができる。標的へ向けられる抗体は、抗体のMSRSカタログ(Aerie Corporation, Birmingham, MI)などのいろいろな源から識別し且つ入手することができるし、または当該技術分野において周知の慣用的な単クローン性または多クローン性抗体生成法によって製造することができる。ヒトおよびラット第XI因子の検出に有用な抗体は、商業的に入手可能である。
第XI因子核酸のアンチセンス阻害は、第XI因子タンパク質レベルを測定することによって評価することができる。第XI因子のタンパク質レベルは、免疫沈降、ウェスタンブロット分析(免疫ブロット法)、固相酵素免疫検定法(enzyme-linked immunosorbent assay)(ELISA)、定量タンパク質検定、タンパク質活性検定(例えば、カスパーゼ活性検定)、免疫組織化学、免疫細胞化学または蛍光活性化セルソーティング(fluorescence-activated cell sorting)(FACS)などの、当該技術分野において周知のいろいろな方法で評価するまたは定量することができる。標的へ向けられる抗体は、抗体のMSRSカタログ(Aerie Corporation, Birmingham, MI)などのいろいろな源から識別し且つ入手することができるし、または当該技術分野において周知の慣用的な単クローン性または多クローン性抗体生成法によって製造することができる。ヒトおよびラット第XI因子の検出に有用な抗体は、商業的に入手可能である。
アンチセンス化合物の in vivo 試験
アンチセンス化合物、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドを、動物において調べて、第XI因子の発現を阻害する且つ長期aPTT、標準PTに関連した長期aPTT時間、低下した量の血小板因子4(PF−4)、減少した喘息誘発、減少した関節炎形成、減少した結腸炎形成、喘息形成、関節炎形成について増加した時間、および結腸炎形成について増加した時間などの表現型変化を生じるそれらの能力を評価する。試験は、正常な動物においてまたは実験的疾患モデルにおいて行うことができる。動物への投与用に、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、リン酸緩衝化生理食塩水などの薬学的に許容しうる希釈剤中で処方する。投与には、腹腔内、静脈内および皮下などの非経口投与経路が含まれる。一つの態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドで一定期間処置後、RNAを、肝組織から単離し、そして第XI因子核酸発現の変化を測定する。第XI因子タンパク質レベルの変化は、クロット時間(clot times)、例えば、PTおよびaPTTを、被処置動物からの血漿を用いて決定することによって、または炎症、炎症性状態(例えば、喘息、関節炎、結腸炎)、または被験動物中に存在する炎症マーカー(炎症性サイトカイン)のレベルを測定することによって測定することができる。
アンチセンス化合物、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドを、動物において調べて、第XI因子の発現を阻害する且つ長期aPTT、標準PTに関連した長期aPTT時間、低下した量の血小板因子4(PF−4)、減少した喘息誘発、減少した関節炎形成、減少した結腸炎形成、喘息形成、関節炎形成について増加した時間、および結腸炎形成について増加した時間などの表現型変化を生じるそれらの能力を評価する。試験は、正常な動物においてまたは実験的疾患モデルにおいて行うことができる。動物への投与用に、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、リン酸緩衝化生理食塩水などの薬学的に許容しうる希釈剤中で処方する。投与には、腹腔内、静脈内および皮下などの非経口投与経路が含まれる。一つの態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドで一定期間処置後、RNAを、肝組織から単離し、そして第XI因子核酸発現の変化を測定する。第XI因子タンパク質レベルの変化は、クロット時間(clot times)、例えば、PTおよびaPTTを、被処置動物からの血漿を用いて決定することによって、または炎症、炎症性状態(例えば、喘息、関節炎、結腸炎)、または被験動物中に存在する炎症マーカー(炎症性サイトカイン)のレベルを測定することによって測定することができる。
特定の適応症
特定の態様において、本発明は、個体を処置する方法であって、一つまたはそれを超える本発明の医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。特定の態様において、その個体は、炎症性疾患、障害または状態を有する、またはそのリスクがある。特定の態様において、その個体は、上記のような炎症性疾患、障害または状態のリスクがある。特定の態様において、本発明は、個体の第XI因子発現を予防的に減少させる方法を提供する。特定の態様は、処置を必要としている個体を、治療的有効量の第XI因子核酸を標的とするアンチセンス化合物を個体に投与することによって処置することを包含する。
特定の態様において、本発明は、個体を処置する方法であって、一つまたはそれを超える本発明の医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。特定の態様において、その個体は、炎症性疾患、障害または状態を有する、またはそのリスクがある。特定の態様において、その個体は、上記のような炎症性疾患、障害または状態のリスクがある。特定の態様において、本発明は、個体の第XI因子発現を予防的に減少させる方法を提供する。特定の態様は、処置を必要としている個体を、治療的有効量の第XI因子核酸を標的とするアンチセンス化合物を個体に投与することによって処置することを包含する。
特定の態様において、治療的有効量の第XI因子核酸を標的とするアンチセンス化合物の投与は、個体の血清中の第XI因子レベルを監視して、アンチセンス化合物の投与への個体の応答を決定することを伴う。アンチセンス化合物の投与への個体の応答は、治療的介入の量および持続時間を医師が決定するのに用いられる。
特定の態様において、第XI因子核酸を標的とするアンチセンス化合物の投与は、第XI因子発現の少なくとも15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%または99%、またはこれら値のいずれか二つで規定される範囲の減少を引き起こす。特定の態様において、第XI因子核酸を標的とするアンチセンス化合物の投与は、標準的な試験、例えば、活性化部分トロンボプラスチン時間(aPTT)試験、プロトロンビン時間(PT)試験、トロンビン時間(TCT)、出血時間、またはDダイマーがあるがこれに制限されるわけではない試験によって測定される血液凝固の尺度の変化を引き起こす。或いは、炎症(例えば、喘息、関節炎または結腸炎レベル)の変化は、炎症(例えば、誘発された喘息、関節炎または結腸炎)を有する動物モデルにおいて決定することができる。特定の態様において、第XI因子アンチセンス化合物の投与は、その尺度を少なくとも15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%または99%、またはこれら値のいずれか二つで規定される範囲増加させる。いくつかの態様において、第XI因子アンチセンス化合物の投与は、その尺度を少なくとも15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%または99%、またはこれら値のいずれか二つで規定される範囲低下させる。
特定の態様において、第XI因子を標的とするアンチセンス化合物を含む医薬組成物は、炎症性疾患、障害または状態に苦しむまたはそれに感受性の患者を処置するための薬剤の製造に用いられる。
特定の組み合わせ療法
特定の態様において、一つまたはそれを超える本発明の医薬組成物は、一つまたはそれを超える他の医薬物質と共投与する。特定の態様において、このような一つまたはそれを超える他の医薬物質は、一つまたはそれを超える本発明の医薬組成物と同じ疾患、障害または状態を処置するように設計される。特定の態様において、このような一つまたはそれを超える他の医薬物質は、一つまたはそれを超える本発明の医薬組成物とは異なった疾患、障害または状態を処置するように設計される。特定の態様において、このような一つまたはそれを超える他の医薬物質は、一つまたはそれを超える本発明の医薬組成物の望ましくない副作用を処置するように設計される。特定の態様において、一つまたはそれを超える本発明の医薬組成物は、別の医薬物質と共投与されて、その他の医薬物質の望ましくない作用を処置する。特定の態様において、一つまたはそれを超える本発明の医薬組成物は、別の医薬物質と共投与されて、組み合わせ作用を生じる。特定の態様において、一つまたはそれを超える本発明の医薬組成物は、別の医薬物質と共投与されて、共力作用を生じる。
特定の態様において、一つまたはそれを超える本発明の医薬組成物は、一つまたはそれを超える他の医薬物質と共投与する。特定の態様において、このような一つまたはそれを超える他の医薬物質は、一つまたはそれを超える本発明の医薬組成物と同じ疾患、障害または状態を処置するように設計される。特定の態様において、このような一つまたはそれを超える他の医薬物質は、一つまたはそれを超える本発明の医薬組成物とは異なった疾患、障害または状態を処置するように設計される。特定の態様において、このような一つまたはそれを超える他の医薬物質は、一つまたはそれを超える本発明の医薬組成物の望ましくない副作用を処置するように設計される。特定の態様において、一つまたはそれを超える本発明の医薬組成物は、別の医薬物質と共投与されて、その他の医薬物質の望ましくない作用を処置する。特定の態様において、一つまたはそれを超える本発明の医薬組成物は、別の医薬物質と共投与されて、組み合わせ作用を生じる。特定の態様において、一つまたはそれを超える本発明の医薬組成物は、別の医薬物質と共投与されて、共力作用を生じる。
特定の態様において、一つまたはそれを超える本発明の医薬組成物および一つまたはそれを超える他の医薬物質は、同時に投与する。特定の態様において、一つまたはそれを超える本発明の医薬組成物および一つまたはそれを超える他の医薬物質は、異なった時点で投与する。特定の態様において、一つまたはそれを超える本発明の医薬組成物および一つまたはそれを超える他の医薬物質は、単一製剤中で一緒に製造する。特定の態様において、一つまたはそれを超える本発明の医薬組成物および一つまたはそれを超える他の医薬物質は、別々に製造する。
特定の態様において、本発明の医薬組成物と共投与することができる医薬物質には、上記のようなNSAIDSおよび/または疾患修飾性薬が含まれる。特定の態様において、疾患修飾性薬は、本発明の医薬組成物の投与前に投与する。特定の態様において、疾患修飾性薬は、本発明の医薬組成物の投与後に投与する。特定の態様において、疾患修飾性薬は、本発明の医薬組成物と同時に投与する。特定の態様において、共投与される疾患修飾性薬の用量は、その疾患修飾性薬が単独投与された場合に投与されると考えられる用量と同じである。特定の態様において、共投与される疾患修飾性薬の用量は、その疾患修飾性薬が単独投与された場合に投与されると考えられる用量より少ない。特定の態様において、共投与される疾患修飾性薬の用量は、その疾患修飾性薬が単独投与された場合に投与されると考えられる用量より多い。
特定の態様において、第二化合物の共投与は、第一化合物の作用を増強するので、それら化合物の共投与は、第一化合物を単独投与する作用より大きい作用を引き起こす。他の態様において、共投与は、それら化合物の単独投与時の作用の相加である作用を引き起こす。特定の態様において、共投与は、それら化合物の単独投与時の作用の相加より大きい作用を引き起こす。特定の態様において、第一化合物は、アンチセンス化合物である。特定の態様において、第二化合物は、アンチセンス化合物である。
特定の態様において、解毒薬は、第XI因子特異的阻害剤の投与後いつでも投与する。特定の態様において、解毒薬は、第XI因子に標的指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与後いつでも投与する。特定の態様において、解毒薬は、第XI因子に標的指向するアンチセンス化合物の投与後何分か、何時間か、何日か、何週間かまたは何ヶ月かに投与する。特定の態様において、解毒薬は、第XI因子に標的指向するアンチセンス化合物に相補的(例えば、センス鎖)である。特定の態様において、解毒薬は、第7因子、第7a因子、第XI因子または第XIa因子タンパク質である。特定の態様において、第7因子、第7a因子、第XI因子または第XIa因子タンパク質は、ヒト第7因子、ヒト第7a因子、ヒト第XI因子またはヒト第XIa因子タンパク質である。特定の態様において、第7因子タンパク質は、NovoSeven である。
発明の利点
本明細書中に最初に提供されるのは、炎症反応を処置する、予防するおよび/または改善することができる、第XI因子のモジュレーションのための方法および組成物である。具体的な態様において、提供されるのは、関節炎または結腸炎などの炎症性状態を改善するための第XI因子オリゴヌクレオチド(第XI因子タンパク質をエンコードしている核酸に標的指向するオリゴヌクレオチド)である。
本明細書中に最初に提供されるのは、炎症反応を処置する、予防するおよび/または改善することができる、第XI因子のモジュレーションのための方法および組成物である。具体的な態様において、提供されるのは、関節炎または結腸炎などの炎症性状態を改善するための第XI因子オリゴヌクレオチド(第XI因子タンパク質をエンコードしている核酸に標的指向するオリゴヌクレオチド)である。
非制限開示および援用
本明細書中に記載の特定の化合物、組成物および方法を、特定の態様によって具体的に記載してきたが、次の実施例は、単に、本明細書中に記載の化合物を詳しく説明するのに役立ち、それらを制限するためのものではない。本出願に引用される参考文献は各々、本明細書中にそのまま援用される。
本明細書中に記載の特定の化合物、組成物および方法を、特定の態様によって具体的に記載してきたが、次の実施例は、単に、本明細書中に記載の化合物を詳しく説明するのに役立ち、それらを制限するためのものではない。本出願に引用される参考文献は各々、本明細書中にそのまま援用される。
実施例1:HepG2細胞中におけるヒト第XI因子のアンチセンス阻害
第XI因子核酸を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを、第XI因子mRNAへのそれらの作用について in vitro で調べた。10,000個/ウェルの細胞密度で培養されたHepG2細胞を、リポフェクチン試薬を用いて75nMアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクションした。約24時間の処理時間後、RNAを細胞から単離し、そして第XI因子mRNAレベルを、定量リアルタイムPCRによって測定した。第XI因子mRNAレベルは、RIBOGREEN(登録商標)で測定される全RNA含量によって調整した。結果は、未処理対照細胞に相対する第XI因子の阻害パーセントとして示す。
第XI因子核酸を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを、第XI因子mRNAへのそれらの作用について in vitro で調べた。10,000個/ウェルの細胞密度で培養されたHepG2細胞を、リポフェクチン試薬を用いて75nMアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクションした。約24時間の処理時間後、RNAを細胞から単離し、そして第XI因子mRNAレベルを、定量リアルタイムPCRによって測定した。第XI因子mRNAレベルは、RIBOGREEN(登録商標)で測定される全RNA含量によって調整した。結果は、未処理対照細胞に相対する第XI因子の阻害パーセントとして示す。
表1および表2のキメラのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、5−10−5MOEギャップマーとして設計した。それらギャップマーは、20ヌクレオチド長さであり、ここにおいて、中心ギャップセグメントは、10個の2’−デオキシヌクレオチドから構成され、そして両側に(5’および3’方向に)、各々5ヌクレオチドを含むウィングが隣接している。5’ウィングセグメント中の各々のヌクレオチドおよび3’ウィングセグメント中の各々のヌクレオチドは、2’−MOE修飾を有する。各々のギャップマー中のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート(P=S)結合である。各々のギャップマー中のシチジン残基は全て、5−メチルシチジンである。「標的出発部位」は、ギャップマーに標的とされている最も5’のヌクレオチドを示す。「標的停止部位」は、ギャップマーに標的とされている最も3’のヌクレオチドを示す。表1に挙げられているギャップマーは各々、SEQ ID NO:1(GENBANK受託番号NM_000128.3)を標的とし、そして表2に挙げられているギャップマーは各々、SEQ ID NO:2(19598000〜19624000を切断されたGENBANK受託番号NT_022792.17)を標的としている。
実施例2:HepG2細胞中におけるヒト第XI因子の用量依存性アンチセンス阻害
84パーセントまたはそれより大を超えるヒト第XI因子の in vitro 阻害を示す12種類のギャップマーを、HepG2細胞中においていろいろな用量で調べた。細胞は、10,000個/ウェルの細胞密度で平板培養し、そしてリポフェクチン試薬を用いて、表3に明記される9.375nM、18.75nM、37.5nM、75nMおよび150nMの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクションした。約16時間の処理時間後、RNAを細胞から単離し、そして第XI因子mRNAレベルを、定量リアルタイムPCRによって測定した。ヒト第XI因子プライマー・プローブセットRTS2966(正配列:CAGCCTGGAGCATCGTAACA、本明細書中にSEQ ID NO:3として包含される;逆配列:TTTATCGAGCTTCGTTATTCTGGTT、本明細書中にSEQ ID NO:4として包含される;プローブ配列:TTGTCTACTGAAGCACACCCAAACAGGGAX、ここにおいて、Xは、発蛍光団であり、本明細書中にSEQ ID NO:5として包含される)を用いて、mRNAレベルを測定した。第XI因子mRNAレベルは、RIBOGREEN(登録商標)で測定される全RNA含量によって調整した。結果は、未処理対照細胞に相対する第XI因子の阻害パーセントとして示す。表3に示されるように、第XI因子mRNAレベルは、アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理された細胞において、用量依存方式で減少した。
84パーセントまたはそれより大を超えるヒト第XI因子の in vitro 阻害を示す12種類のギャップマーを、HepG2細胞中においていろいろな用量で調べた。細胞は、10,000個/ウェルの細胞密度で平板培養し、そしてリポフェクチン試薬を用いて、表3に明記される9.375nM、18.75nM、37.5nM、75nMおよび150nMの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクションした。約16時間の処理時間後、RNAを細胞から単離し、そして第XI因子mRNAレベルを、定量リアルタイムPCRによって測定した。ヒト第XI因子プライマー・プローブセットRTS2966(正配列:CAGCCTGGAGCATCGTAACA、本明細書中にSEQ ID NO:3として包含される;逆配列:TTTATCGAGCTTCGTTATTCTGGTT、本明細書中にSEQ ID NO:4として包含される;プローブ配列:TTGTCTACTGAAGCACACCCAAACAGGGAX、ここにおいて、Xは、発蛍光団であり、本明細書中にSEQ ID NO:5として包含される)を用いて、mRNAレベルを測定した。第XI因子mRNAレベルは、RIBOGREEN(登録商標)で測定される全RNA含量によって調整した。結果は、未処理対照細胞に相対する第XI因子の阻害パーセントとして示す。表3に示されるように、第XI因子mRNAレベルは、アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理された細胞において、用量依存方式で減少した。
実施例3:HepG2細胞中における、ミクロウォーク(microwalk)で設計されたオリゴヌクレオチドによるヒト第XI因子のアンチセンス阻害
更に別のギャップマーを、表3に示されたギャップマーに基づいて設計した。これらギャップマーは、表3による元のギャップマーの上流および下流に僅かにシフトした(すなわち、「ミクロウォーク」)ギャップマーを作ることによって設計した。ギャップマーは、更に、いろいろなモチーフ、例えば、5−10−5MOE、3−14−3MOEおよび2−13−5MOEで作成した。これらギャップマーを、in vitro で調べた。10,000個/ウェルの細胞密度で培養されたHepG2細胞を、リポフェクチン試薬を用いて75nMアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクションした。約24時間の処理時間後、RNAを細胞から単離し、そして第XI因子mRNAレベルを、定量リアルタイムPCRによって測定した。第XI因子mRNAレベルは、RIBOGREEN(登録商標)で測定される全RNA含量によって調整した。結果は、未処理対照細胞に相対する第XI因子の阻害パーセントとして示す。
更に別のギャップマーを、表3に示されたギャップマーに基づいて設計した。これらギャップマーは、表3による元のギャップマーの上流および下流に僅かにシフトした(すなわち、「ミクロウォーク」)ギャップマーを作ることによって設計した。ギャップマーは、更に、いろいろなモチーフ、例えば、5−10−5MOE、3−14−3MOEおよび2−13−5MOEで作成した。これらギャップマーを、in vitro で調べた。10,000個/ウェルの細胞密度で培養されたHepG2細胞を、リポフェクチン試薬を用いて75nMアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクションした。約24時間の処理時間後、RNAを細胞から単離し、そして第XI因子mRNAレベルを、定量リアルタイムPCRによって測定した。第XI因子mRNAレベルは、RIBOGREEN(登録商標)で測定される全RNA含量によって調整した。結果は、未処理対照細胞に相対する第XI因子の阻害パーセントとして示す。
次に、ミクロウォークで設計されたギャップマーについての in vitro 阻害データを、表4、表5、表6、表7および表8に示されるように、表3によるギャップマーについての in vitro 阻害データと比較した。オリゴヌクレオチドは、それらが位置するヒトmRNA上の領域(GENBANK受託番号NM_000128.3)にしたがって表示している。
表4のキメラのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、5−10−5MOE、3−14−3MOEおよび2−13−5MOEギャップマーとして設計した。表4に最初に挙げられているギャップマーは、残りのギャップマーがミクロウォークによって設計された元のギャップマーであり(表3を参照されたい)、星印で示されている。5−10−5ギャップマーは、20ヌクレオチド長さであり、ここにおいて、中心ギャップセグメントは、10個の2’−デオキシヌクレオチドから構成され、そして両側に(5’および3’方向に)、各々5ヌクレオチドを含むウィングが隣接している。3−14−3ギャップマーは、20ヌクレオチド長さであり、ここにおいて、中心ギャップセグメントは、14個の2’−デオキシヌクレオチドから構成され、そして両側に(5’および3’方向に)、各々3ヌクレオチドを含むウィングが隣接している。2−13−5ギャップマーは、20ヌクレオチド長さであり、ここにおいて、中心ギャップセグメントは、13個の2’−デオキシヌクレオチドから構成されている。その中心ギャップは、5’末端上に2ヌクレオチドを含むウィング、そして3’末端上に5ヌクレオチドを含むウィングと隣接している。各々のモチーフ(5−10−5、3−14−3および2−13−5)について、5’ウィングセグメント中の各々のヌクレオチドおよび3’ウィングセグメント中の各々のヌクレオチドは、2’−MOE修飾を有する。各々のギャップマー中のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート(P=S)結合である。各々のギャップマー中のシチジン残基は全て、5−メチルシチジンである。「標的出発部位」は、ギャップマーに標的とされている最も5’のヌクレオチドを示す。「標的停止部位」は、ギャップマーに標的とされている最も3’のヌクレオチドを示す。表4に挙げられているギャップマーは各々、SEQ ID NO:1(GENBANK受託番号NM_000128.3)を標的としている。
表4に示されるように、SEQ ID NO:1の標的出発部位656で始まり且つ標的停止部位675で終わる標的領域(すなわち、核酸塩基656〜675)を標的とする5−10−5MOEギャップマー、3−14−3MOEギャップマーおよび2−13−5MOEギャップマーの全てが、少なくとも20%の第XI因子mRNA阻害を示す。大部分のギャップマーは、少なくとも60%の阻害を示す。ISIS番号:416806、416809、416811、416814、416821、416825、416826、416827、416828、416868、416869、416878、416879、416881、416883、416890、416891、416892、416893、416894、416895、416896、416945、416946、416969、416970、416971、416972、416973、412203、413467、413468および413469を含めたいくつかのギャップマーは、少なくとも80%の阻害を示す。次のISIS番号:412203、413467、416825、416826、416827、416868、416878、416879、416892、416893、416895、416896、416945、416972および416973は、少なくとも90%の阻害を示した。次のISIS番号:416878、416892、416895および416896は、少なくとも95%の阻害を示した。
表5のキメラのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、5−10−5MOE、3−14−3MOEおよび2−13−5MOEギャップマーとして設計した。表5に最初に挙げられているギャップマーは、残りのギャップマーが、ミクロウォークによって設計された元のギャップマーであり(表3を参照されたい)、星印で示されている。5−10−5ギャップマーは、20ヌクレオチド長さであり、ここにおいて、中心ギャップセグメントは、10個の2’−デオキシヌクレオチドから構成され、そして両側に(5’および3’方向に)、各々5ヌクレオチドを含むウィングが隣接している。3−14−3ギャップマーは、20ヌクレオチド長さであり、ここにおいて、中心ギャップセグメントは、14個の2’−デオキシヌクレオチドから構成され、そして両側に(5’および3’方向に)、各々3ヌクレオチドを含むウィングが隣接している。2−13−5ギャップマーは、20ヌクレオチド長さであり、ここにおいて、中心ギャップセグメントは、13個の2’−デオキシヌクレオチドから構成されている。その中心ギャップは、5’末端上に2ヌクレオチドを含むウィング、そして3’末端上に5ヌクレオチドを含むウィングと隣接している。各々のモチーフ(5−10−5、3−14−3および2−13−5)について、5’ウィングセグメント中の各々のヌクレオチドおよび3’ウィングセグメント中の各々のヌクレオチドは、2’−MOE修飾を有する。各々のギャップマー中のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート(P=S)結合である。各々のギャップマー中のシチジン残基は全て、5−メチルシチジンである。「標的出発部位」は、ギャップマーに標的とされている最も5’のヌクレオチドを示す。「標的停止部位」は、ギャップマーに標的とされている最も3’のヌクレオチドを示す。表5に挙げられているギャップマーは各々、SEQ ID NO:1(GENBANK受託番号NM_000128.3)を標的としている。
表5に示されるように、SEQ ID NO:1の標的出発部位738で始まり且つ標的停止部位762で終わる標的領域(すなわち、核酸塩基738〜762)を標的とする5−10−5MOEギャップマー、3−14−3MOEギャップマーおよび2−13−5MOEギャップマーの全てが、少なくとも45%の第XI因子mRNA阻害を示す。大部分のギャップマーは、少なくとも60%の阻害を示す。ISIS番号:412206、416830、416831、416898、416899、416900、416903、416975、416976、416977および416980を含めたいくつかのギャップマーは、少なくとも80%の阻害を示す。次のISIS番号:412206、416831および416900は、少なくとも90%の阻害を示した。
表6のキメラのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、5−10−5MOE、3−14−3MOEおよび2−13−5MOEギャップマーとして設計した。表6に最初に挙げられているギャップマーは、残りのギャップマーが、ミクロウォークによって設計された元のギャップマーであり(表3を参照されたい)、星印で示されている。5−10−5ギャップマーは、20ヌクレオチド長さであり、ここにおいて、中心ギャップセグメントは、10個の2’−デオキシヌクレオチドから構成され、そして両側に(5’および3’方向に)、各々5ヌクレオチドを含むウィングが隣接している。3−14−3ギャップマーは、20ヌクレオチド長さであり、ここにおいて、中心ギャップセグメントは、14個の2’−デオキシヌクレオチドから構成され、そして両側に(5’および3’方向に)、各々3ヌクレオチドを含むウィングが隣接している。2−13−5ギャップマーは、20ヌクレオチド長さであり、ここにおいて、中心ギャップセグメントは、13個の2’−デオキシヌクレオチドから構成されている。その中心ギャップは、5’末端上に2ヌクレオチドを含むウィング、そして3’末端上に5ヌクレオチドを含むウィングと隣接している。各々のモチーフ(5−10−5、3−14−3および2−13−5)について、5’ウィングセグメント中の各々のヌクレオチドおよび3’ウィングセグメント中の各々のヌクレオチドは、2’−MOE修飾を有する。各々のギャップマー中のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート(P=S)結合である。各々のギャップマー中のシチジン残基は全て、5−メチルシチジンである。「標的出発部位」は、ギャップマーに標的とされている最も5’のヌクレオチドを示す。「標的停止部位」は、ギャップマーに標的とされている最も3’のヌクレオチドを示す。表6に挙げられているギャップマーは各々、SEQ ID NO:1(GENBANK受託番号NM_000128.3)を標的としている。
表6に示されるように、SEQ ID NO:1の標的出発部位1018で始まり且つ標的停止部位1042で終わる標的領域(すなわち、核酸塩基1018〜1042)を標的とする5−10−5MOEギャップマー、3−14−3MOEギャップマーおよび2−13−5MOEギャップマーの全てが、少なくとも80%の第XI因子mRNA阻害を示す。次のISIS番号:413474、416837、416838、416904、416907および416908は、少なくとも90%の阻害を示した。
表7のキメラのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、5−10−5MOE、3−14−3MOEおよび2−13−5MOEギャップマーとして設計した。表7に最初に挙げられているギャップマーは、残りのギャップマーがミクロウォークによって設計された元のギャップマーであり(表3を参照されたい)、星印で示されている。5−10−5ギャップマーは、20ヌクレオチド長さであり、ここにおいて、中心ギャップセグメントは、10個の2’−デオキシヌクレオチドから構成され、そして両側に(5’および3’方向に)、各々5ヌクレオチドを含むウィングが隣接している。3−14−3ギャップマーは、20ヌクレオチド長さであり、ここにおいて、中心ギャップセグメントは、14個の2’−デオキシヌクレオチドから構成され、そして両側に(5’および3’方向に)、各々3ヌクレオチドを含むウィングが隣接している。2−13−5ギャップマーは、20ヌクレオチド長さであり、ここにおいて、中心ギャップセグメントは、13個の2’−デオキシヌクレオチドから構成されている。その中心ギャップは、5’末端上に2ヌクレオチドを含むウィング、そして3’末端上に5ヌクレオチドを含むウィングと隣接している。各々のモチーフ(5−10−5、3−14−3および2−13−5)について、5’ウィングセグメント中の各々のヌクレオチドおよび3’ウィングセグメント中の各々のヌクレオチドは、2’−MOE修飾を有する。各々のギャップマー中のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート(P=S)結合である。各々のギャップマー中のシチジン残基は全て、5−メチルシチジンである。「標的出発部位」は、ギャップマーに標的とされている最も5’のヌクレオチドを示す。「標的停止部位」は、ギャップマーに標的とされている最も3’のヌクレオチドを示す。表7に挙げられているギャップマーは各々、SEQ ID NO:1(GENBANK受託番号NM_000128.3)を標的としている。
表7に示されるように、SEQ ID NO:1の標的出発部位1062で始まり且つ標的停止部位1091で終わる標的領域(すなわち、核酸塩基1062〜1091)を標的とする5−10−5MOEギャップマー、3−14−3MOEギャップマーおよび2−13−5MOEギャップマーの全てが、少なくとも20%の第XI因子mRNA阻害を示す。412215、413476、413476、416839、416840、416841、416842、416843、416844、416845、416846、416847、416909、416910、416911、416912、416913、416914、416915、416916、416917、416918、416986、416987、416988、416989、416990、416991、416992、416993、416994、416995を含めた大部分のギャップマーは、少なくとも50%の阻害を示す。次のISIS番号:412215、413476、413476、416839、416840、416841、416842、416843、416844、416845、416910、416911、416912、416913、416914、416916、416917、416986、416987、416989、416991、416992、416993および416994は、少なくとも80%の阻害を示した。次のISIS番号:413476、413476、416842、416844、416910、416911、416912、416913、416916、416917および416993は、少なくとも90%の阻害を示した。
表8のキメラのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、5−10−5MOE、3−14−3MOEおよび2−13−5MOEギャップマーとして設計した。表8に最初に挙げられているギャップマーは、残りのギャップマーがミクロウォークによって設計された元のギャップマーであり(表3を参照されたい)、星印で示されている。5−10−5ギャップマーは、20ヌクレオチド長さであり、ここにおいて、中心ギャップセグメントは、10個の2’−デオキシヌクレオチドから構成され、そして両側に(5’および3’方向に)、各々5ヌクレオチドを含むウィングが隣接している。3−14−3ギャップマーは、20ヌクレオチド長さであり、ここにおいて、中心ギャップセグメントは、14個の2’−デオキシヌクレオチドから構成され、そして両側に(5’および3’方向に)、各々3ヌクレオチドを含むウィングが隣接している。2−13−5ギャップマーは、20ヌクレオチド長さであり、ここにおいて、中心ギャップセグメントは、13個の2’−デオキシヌクレオチドから構成されている。その中心ギャップは、5’末端上に2ヌクレオチドを含むウィング、そして3’末端上に5ヌクレオチドを含むウィングと隣接している。各々のモチーフ(5−10−5、3−14−3および2−13−5)について、5’ウィングセグメント中の各々のヌクレオチドおよび3’ウィングセグメント中の各々のヌクレオチドは、2’−MOE修飾を有する。各々のギャップマー中のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート(P=S)結合である。各々のギャップマー中のシチジン残基は全て、5−メチルシチジンである。「標的出発部位」は、ギャップマーに標的とされている最も5’のヌクレオチドを示す。「標的停止部位」は、ギャップマーに標的とされている最も3’のヌクレオチドを示す。表8に挙げられているギャップマーは各々、SEQ ID NO:1(GENBANK受託番号NM_000128.3)を標的としている。
表8に示されるように、SEQ ID NO:1の標的出発部位1275で始まり且つ標的停止部位1318で終わる標的領域(すなわち、核酸塩基1275〜1318)を標的とする5−10−5MOEギャップマー、3−14−3MOEギャップマーおよび2−13−5MOEギャップマーの全てが、少なくとも70%の第XI因子mRNA阻害を示す。412223、412224、412225、413482、416848、416849、416850、416851、416852、416853、416854、416855、416856、416857、416858、416859、416860、416861、416862、416863、416864、416865、416866、416867、416920、416921、416922、416923、416924、416925、416926、416927、416928、416929、416930、416931、416932、416933、416934、416935、416936、416937、416938、416939、416940、416941、416942、416943、416944、416997、416998、416999、417000、417001、417002、417003、417004、417006、417007、417008、417009、417010、417011、417013、417014、417015、417016、417017、417018、417019および417020を含めた大部分のギャップマーは、少なくとも80%の阻害を示す。次のISIS番号:412224、416850、416853、416856、416857、416858、416861、416862、416864、416922、416923、416924、416925、416926、416928、416931、416932、416933、416934、416935、416937、416938、416940、416941、416943、416999および417002は、少なくとも90%の阻害を示した。
実施例4:HepG2細胞中におけるヒト第XI因子の用量依存性アンチセンス阻害
ヒト第XI因子の in vitro 阻害を示す、実施例3によるギャップマー(表4、表5、表6、表7および表8を参照されたい)を、HepG2細胞中においていろいろな用量で調べた。細胞は、10,000個/ウェルの細胞密度で平板培養し、そしてリポフェクチン試薬を用いて、表9に明記される9.375nM、18.75nM、37.5nMおよび75nMの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクションした。約16時間の処理時間後、RNAを細胞から単離し、そして第XI因子mRNAレベルを、定量リアルタイムPCRによって測定した。ヒト第XI因子プライマー・プローブセットRTS2966を用いて、mRNAレベルを測定した。第XI因子mRNAレベルは、RIBOGREEN(登録商標)で測定される全RNA含量によって調整した。結果は、未処理対照細胞に相対する第XI因子の阻害パーセントとして示す。表9に示されるように、第XI因子mRNAレベルは、アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理された細胞において、用量依存方式で減少した。
ヒト第XI因子の in vitro 阻害を示す、実施例3によるギャップマー(表4、表5、表6、表7および表8を参照されたい)を、HepG2細胞中においていろいろな用量で調べた。細胞は、10,000個/ウェルの細胞密度で平板培養し、そしてリポフェクチン試薬を用いて、表9に明記される9.375nM、18.75nM、37.5nMおよび75nMの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクションした。約16時間の処理時間後、RNAを細胞から単離し、そして第XI因子mRNAレベルを、定量リアルタイムPCRによって測定した。ヒト第XI因子プライマー・プローブセットRTS2966を用いて、mRNAレベルを測定した。第XI因子mRNAレベルは、RIBOGREEN(登録商標)で測定される全RNA含量によって調整した。結果は、未処理対照細胞に相対する第XI因子の阻害パーセントとして示す。表9に示されるように、第XI因子mRNAレベルは、アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理された細胞において、用量依存方式で減少した。
ギャップマーを、更に、エレクトロポレーションによってトランスフェクションし、そしてそれらの用量依存性のヒト第XI因子mRNA阻害を測定した。細胞は、20,000個/ウェルの細胞密度で平板培養し、そしてエレクトロポレーションによって、表10に明記される0.7μM、2.2μM、6.7μMおよび20μMの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクションした。約16時間の処理時間後、RNAを細胞から単離し、そして第XI因子mRNAレベルを、定量リアルタイムPCRによって測定した。ヒト第XI因子プライマー・プローブセットRTS2966を用いて、mRNAレベルを測定した。第XI因子mRNAレベルは、RIBOGREEN(登録商標)で測定される全RNA含量によって調整した。結果は、未処理対照細胞に相対する第XI因子の阻害パーセントとして示す。表10に示されるように、第XI因子mRNAレベルは、アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理された細胞において、用量依存方式で減少した。
実施例5:HepG2細胞中におけるヒト第XI因子の有効な用量依存性アンチセンス阻害の選択および確認
実施例4においてヒト第XI因子の有意の用量依存性阻害を示したギャップマーを選択し、そしてHepG2細胞中においていろいろな用量で調べた。細胞は、10,000個/ウェルの細胞密度で平板培養し、そしてリポフェクチン試薬を用いて、表11に明記される2.34nM、4.69nM、9.375nM、18.75nM、37.5nMおよび75nMの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクションした。約16時間の処理時間後、RNAを細胞から単離し、そしてヒト第XI因子mRNAレベルを、定量リアルタイムPCRによって測定した。ヒト第XI因子プライマー・プローブセットRTS2966を用いて、mRNAレベルを測定した。第XI因子mRNAレベルは、RIBOGREEN(登録商標)で測定される全RNA含量によって調整した。結果は、未処理対照細胞に相対するヒト第XI因子の阻害パーセントとして示す。表11に示されるように、第XI因子mRNAレベルは、アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理された細胞において、対照と比較したところ、用量依存方式で減少した。
実施例4においてヒト第XI因子の有意の用量依存性阻害を示したギャップマーを選択し、そしてHepG2細胞中においていろいろな用量で調べた。細胞は、10,000個/ウェルの細胞密度で平板培養し、そしてリポフェクチン試薬を用いて、表11に明記される2.34nM、4.69nM、9.375nM、18.75nM、37.5nMおよび75nMの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクションした。約16時間の処理時間後、RNAを細胞から単離し、そしてヒト第XI因子mRNAレベルを、定量リアルタイムPCRによって測定した。ヒト第XI因子プライマー・プローブセットRTS2966を用いて、mRNAレベルを測定した。第XI因子mRNAレベルは、RIBOGREEN(登録商標)で測定される全RNA含量によって調整した。結果は、未処理対照細胞に相対するヒト第XI因子の阻害パーセントとして示す。表11に示されるように、第XI因子mRNAレベルは、アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理された細胞において、対照と比較したところ、用量依存方式で減少した。
ギャップマーを、更に、エレクトロポレーションによってトランスフェクションし、そしてそれらの用量依存性のヒト第XI因子mRNA阻害を測定した。細胞は、20,000個/ウェルの細胞密度で平板培養し、そしてエレクトロポレーションによって、表12に明記される625nM、1250nM、2500nM、5,000nM、10,000nMおよび20,000nMの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクションした。約16時間の処理時間後、RNAを細胞から単離し、そしてヒト第XI因子mRNAレベルを、定量リアルタイムPCRによって測定した。ヒト第XI因子プライマー・プローブセットRTS2966を用いて、mRNAレベルを測定した。第XI因子mRNAレベルは、RIBOGREEN(登録商標)で測定される全RNA含量によって調整した。結果は、未処理対照細胞に相対するヒト第XI因子の阻害パーセントとして示す。表12に示されるように、第XI因子mRNAレベルは、アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理された細胞において、対照と比較したところ、用量依存方式で減少した。
実施例6:cyno一次肝細胞中におけるヒト第XI因子の有効な用量依存性アンチセンス阻害の選択および確認
ヒト第XI因子の有意の用量依存性 in vitro 阻害を示した実施例4によるギャップマーを、更に、カニクイザル(cynomolgus monkey)(cyno)一次肝細胞中においていろいろな用量で調べた。細胞は、35,000個/ウェルの細胞密度で平板培養し、そしてエレクトロポレーションによって、表13に明記される0.74nM、2.2nM、6.7nM、20nM、60nMおよび180nMの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクションした。約16時間の処理時間後、RNAを細胞から単離し、そしてヒト第XI因子mRNAレベルを、定量リアルタイムPCRによって測定した。ヒト第XI因子プライマー・プローブセットRTS2966を用いて、mRNAレベルを測定した。第XI因子mRNAレベルは、RIBOGREEN(登録商標)で測定される全RNA含量によって調整した。結果は、未処理対照細胞に相対するヒト第XI因子の阻害パーセントとして示す。表13に示されるように、第XI因子mRNAレベルは、アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理された細胞において、対照と比較したところ、用量依存方式で減少した。
ヒト第XI因子の有意の用量依存性 in vitro 阻害を示した実施例4によるギャップマーを、更に、カニクイザル(cynomolgus monkey)(cyno)一次肝細胞中においていろいろな用量で調べた。細胞は、35,000個/ウェルの細胞密度で平板培養し、そしてエレクトロポレーションによって、表13に明記される0.74nM、2.2nM、6.7nM、20nM、60nMおよび180nMの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクションした。約16時間の処理時間後、RNAを細胞から単離し、そしてヒト第XI因子mRNAレベルを、定量リアルタイムPCRによって測定した。ヒト第XI因子プライマー・プローブセットRTS2966を用いて、mRNAレベルを測定した。第XI因子mRNAレベルは、RIBOGREEN(登録商標)で測定される全RNA含量によって調整した。結果は、未処理対照細胞に相対するヒト第XI因子の阻害パーセントとして示す。表13に示されるように、第XI因子mRNAレベルは、アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理された細胞において、対照と比較したところ、用量依存方式で減少した。
実施例7:HepB3細胞中における、ギャップマーによるヒト第XI因子の有効な用量依存性アンチセンス阻害の選択および確認
実施例4においてヒト第XI因子の in vitro 阻害を示したギャップマーを、ヒトHepB3細胞中においていろいろな用量で調べた。細胞は、4,000個/ウェルの細胞密度で平板培養し、そしてリポフェクチン試薬を用いて、表14に明記される2.3nM、4.7nM、9.4nM、18.75nM、37.5nMおよび75nMの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクションした。約16時間の処理時間後、RNAを細胞から単離し、そしてヒト第XI因子mRNAレベルを、定量リアルタイムPCRによって測定した。ヒト第XI因子プライマー・プローブセットRTS2966を用いて、mRNAレベルを測定した。第XI因子mRNAレベルは、RIBOGREEN(登録商標)で測定される全RNA含量によって調整した。結果は、未処理対照細胞に相対する第XI因子の阻害パーセントとして示す。表14に示されるように、第XI因子mRNAレベルは、アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理された細胞において、対照と比較したところ、用量依存方式で減少した。
実施例4においてヒト第XI因子の in vitro 阻害を示したギャップマーを、ヒトHepB3細胞中においていろいろな用量で調べた。細胞は、4,000個/ウェルの細胞密度で平板培養し、そしてリポフェクチン試薬を用いて、表14に明記される2.3nM、4.7nM、9.4nM、18.75nM、37.5nMおよび75nMの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクションした。約16時間の処理時間後、RNAを細胞から単離し、そしてヒト第XI因子mRNAレベルを、定量リアルタイムPCRによって測定した。ヒト第XI因子プライマー・プローブセットRTS2966を用いて、mRNAレベルを測定した。第XI因子mRNAレベルは、RIBOGREEN(登録商標)で測定される全RNA含量によって調整した。結果は、未処理対照細胞に相対する第XI因子の阻害パーセントとして示す。表14に示されるように、第XI因子mRNAレベルは、アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理された細胞において、対照と比較したところ、用量依存方式で減少した。
ギャップマーを、更に、エレクトロポレーションによってトランスフェクションし、そしてそれらの用量依存性のヒト第XI因子mRNA阻害を測定した。細胞は、20,000個/ウェルの細胞密度で平板培養し、そしてエレクトロポレーションによって、表15に明記される41.15nM、123.457nM、370.37nM、1111.11nM、3333.33nMおよび10,000nMの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクションした。約16時間の処理時間後、RNAを細胞から単離し、そしてヒト第XI因子mRNAレベルを、定量リアルタイムPCRによって測定した。ヒト第XI因子プライマー・プローブセットRTS2966を用いて、mRNAレベルを測定した。第XI因子mRNAレベルは、RIBOGREEN(登録商標)で測定される全RNA含量によって調整した。結果は、未処理対照細胞に相対するヒト第XI因子の阻害パーセントとして示す。表15に示されるように、第XI因子mRNAレベルは、アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理された細胞において、対照と比較したところ、用量依存方式で減少した。
実施例8:一次マウス肝細胞中におけるネズミ第XI因子のアンチセンス阻害
ネズミ第XI因子に標的指向するキメラのアンチセンスオリゴヌクレオチドを、ネズミ第XI因子(SEQ ID NO:6として本明細書中に包含されるGENBANK受託番号NM_028066.1)に標的指向する5−10−5MOEギャップマーとして設計した。それらギャップマーは、20ヌクレオチド長さであり、ここにおいて、中心ギャップセグメントは、10個の2’−デオキシヌクレオチドから構成され、そして両側に(5’および3’方向に)、各々5ヌクレオチドを含むウィングが隣接している。各々のウィングセグメント中のヌクレオチドは各々、2’−MOE修飾を有する。各々のギャップマー中のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート(P=S)結合である。各々のギャップマー中のシチジン残基は全て、5−メチルシチジンである。それらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、一次マウス肝細胞中においてネズミ第XI因子mRNAを減少させるそれらの能力について評価した。
ネズミ第XI因子に標的指向するキメラのアンチセンスオリゴヌクレオチドを、ネズミ第XI因子(SEQ ID NO:6として本明細書中に包含されるGENBANK受託番号NM_028066.1)に標的指向する5−10−5MOEギャップマーとして設計した。それらギャップマーは、20ヌクレオチド長さであり、ここにおいて、中心ギャップセグメントは、10個の2’−デオキシヌクレオチドから構成され、そして両側に(5’および3’方向に)、各々5ヌクレオチドを含むウィングが隣接している。各々のウィングセグメント中のヌクレオチドは各々、2’−MOE修飾を有する。各々のギャップマー中のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート(P=S)結合である。各々のギャップマー中のシチジン残基は全て、5−メチルシチジンである。それらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、一次マウス肝細胞中においてネズミ第XI因子mRNAを減少させるそれらの能力について評価した。
一次マウス肝細胞は、6.25nM、12.5nM、25nM、50nM、100nMおよび200nMのアンチセンスオリゴヌクレオチドで、約24時間処理した。RNAを細胞から単離し、そしてネズミ第XI因子mRNAレベルを、定量リアルタイムPCRによって測定した。ネズミ第XI因子プライマー・プローブセットRTS2898(正配列ACATGACAGGCGCGATCTCT、本明細書中にSEQ ID NO:7として包含される;逆配列TCTAGGTTCACGTACACATCTTTGC、本明細書中にSEQ ID NO:8として包含される;プローブ配列TTCCTTCAAGCAATGCCCTCAGCAATX、本明細書中にSEQ ID NO:9として包含される)を用いて、mRNAレベルを測定した。第XI因子mRNAレベルは、RIBOGREEN(登録商標)で測定される全RNA含量によって調整した。いくつかのネズミアンチセンスオリゴヌクレオチドは、第XI因子mRNAレベルを用量依存方式で減少させた。
実施例9:一次マウス肝細胞中におけるネズミ第XI因子の交差反応性アンチセンス阻害
ネズミ第XI因子核酸を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを、第XI因子mRNAへのそれらの作用について in vitro で調べた。10,000個/ウェルの細胞密度で培養された一次マウス肝細胞を、100nMアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した。約24時間の処理時間後、RNAを細胞から単離し、そしてマウス第XI因子mRNAレベルを、定量リアルタイムPCRによって測定した。第XI因子mRNAレベルは、RIBOGREEN(登録商標)で測定される全RNA含量によって調整した。結果は、未処理対照細胞に相対する第XI因子の阻害パーセントとして示す。
ネズミ第XI因子核酸を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを、第XI因子mRNAへのそれらの作用について in vitro で調べた。10,000個/ウェルの細胞密度で培養された一次マウス肝細胞を、100nMアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した。約24時間の処理時間後、RNAを細胞から単離し、そしてマウス第XI因子mRNAレベルを、定量リアルタイムPCRによって測定した。第XI因子mRNAレベルは、RIBOGREEN(登録商標)で測定される全RNA含量によって調整した。結果は、未処理対照細胞に相対する第XI因子の阻害パーセントとして示す。
表16のキメラのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、5−10−5MOEギャップマーとして設計した。それらギャップマーは、20ヌクレオチド長さであり、ここにおいて、中心ギャップセグメントは、10個の2’−デオキシヌクレオチドから構成され、そして両側に(5’および3’方向に)、各々5ヌクレオチドを含むウィングが隣接している。5’ウィングセグメント中の各々のヌクレオチドおよび3’ウィングセグメント中の各々のヌクレオチドは、2’−MOE修飾を有する。各々のギャップマー中のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート(P=S)結合である。各々のギャップマー中のシチジン残基は全て、5−メチルシチジンである。「マウス標的出発部位」は、ギャップマーに標的とされている最も5’のヌクレオチドを示す。「マウス標的停止部位」は、ギャップマーに標的とされている最も3’のヌクレオチドを示す。挙げられているマウスオリゴヌクレオチドは全て、SEQ ID NO:6として本明細書中に包含されるマウス第XI因子mRNA(GENBANK受託番号NM_028066.1)と、SEQ ID NO:1として本明細書中に包含されるヒト第XI因子mRNA(GENBANK受託番号NM_000128.3)との間に交差反応性を示す。「ヒト標的出発部位」は、アンチセンスオリゴヌクレオチドに標的とされているヒトmRNA(GENBANK受託番号NM_000128.3)中の最も5’のヌクレオチドを示す。「ヒト標的停止部位」は、アンチセンスオリゴヌクレオチドに標的とされているヒトmRNA(GENBANK受託番号NM_000128.3)中の最も3’のヌクレオチドを示す。「ミスマッチ数」は、マウスオリゴヌクレオチドとヒトmRNA配列との間のミスマッチを示す。
実施例10:ネズミ第XI因子の in vivo アンチセンス阻害
in vitro 研究により統計的に有意の用量依存性阻害を示した、ネズミ第XI因子mRNA(SEQ ID NO:6として本明細書中に包含されるGENBANK受託番号NM_028066.1,)を標的とするいくつかのアンチセンスオリゴヌクレオチドを、in vivo で評価した。BALB/cマウスを、ISIS404057(SEQ ID NO:10として本明細書中に包含されるTCCTGGCATTCTCGAGCATT、標的出発部位487)およびISIS404071(SEQ ID NO:11として本明細書中に包含されるTGGTAATCCACTTTCAGAGG、標的出発部位869)で処置した。
in vitro 研究により統計的に有意の用量依存性阻害を示した、ネズミ第XI因子mRNA(SEQ ID NO:6として本明細書中に包含されるGENBANK受託番号NM_028066.1,)を標的とするいくつかのアンチセンスオリゴヌクレオチドを、in vivo で評価した。BALB/cマウスを、ISIS404057(SEQ ID NO:10として本明細書中に包含されるTCCTGGCATTCTCGAGCATT、標的出発部位487)およびISIS404071(SEQ ID NO:11として本明細書中に包含されるTGGTAATCCACTTTCAGAGG、標的出発部位869)で処置した。
処置
BALB/cマウスに、5mg/kg、10mg/kg、25mg/kgまたは50mg/kgのISIS404057またはISIS404071を、週2回3週間注射した。対照群マウスには、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)を週2回3週間注射した。最後の用量を与えて5日後に、マウスを屠殺した。全肝を、RNA分析用に採取し、そして血漿を、タンパク質分析用に集めた。
BALB/cマウスに、5mg/kg、10mg/kg、25mg/kgまたは50mg/kgのISIS404057またはISIS404071を、週2回3週間注射した。対照群マウスには、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)を週2回3週間注射した。最後の用量を与えて5日後に、マウスを屠殺した。全肝を、RNA分析用に採取し、そして血漿を、タンパク質分析用に集めた。
RNA分析
RNAは、第XI因子のリアルタイムPCR分析用に、肝組織より抽出した。表17に示されるように、それらアンチセンスオリゴヌクレオチドは、PBS対照を越えて、ネズミ第XI因子の用量依存性減少を達成した。結果は、対照に相対する第XI因子の阻害パーセントとして示す。
RNAは、第XI因子のリアルタイムPCR分析用に、肝組織より抽出した。表17に示されるように、それらアンチセンスオリゴヌクレオチドは、PBS対照を越えて、ネズミ第XI因子の用量依存性減少を達成した。結果は、対照に相対する第XI因子の阻害パーセントとして示す。
タンパク質分析
表18に示されるように、ISIS404071での処置は、第XI因子タンパク質の有意の用量依存性減少を引き起こした。結果は、PBS対照に相対する第XI因子の阻害パーセントとして示す。
表18に示されるように、ISIS404071での処置は、第XI因子タンパク質の有意の用量依存性減少を引き起こした。結果は、PBS対照に相対する第XI因子の阻害パーセントとして示す。
実施例11:ネズミ第XI因子のアンチセンス阻害のコラーゲン誘発性関節炎への in vivo 作用
第XI因子の阻害作用および関節炎症および関節リウマチをもたらす関節中のフィブリン蓄積におけるその役割の作用を、ネズミコラーゲン誘発性関節炎(CIA)モデルにおいて評価した。被験動物へのコラーゲンの投与は、関節炎を誘発する周知の方法であり、従来、Trentham et al. (J Exp Med, 146:857-68, 1977)、Courtenay et al. (Nature, 283:666-668, 1980)、Cathcart et al. (Lab Invest, 54:26-31, 1986)、Wooley (Methods Enzymol 162:361-373, 1988) および Holmdahl et al. (Arthritis Rheum 29:106, 1986) によって記載された。コラーゲンを投与されたマウスで誘発された関節炎は、Marty et al. (J Clin Invest, 107:631-640, 2001) によって記載のように、目視評価し且つ臨床評点することができるが、この場合、母指を除く腫脹した指各々について1点とし(最大値4)、足根骨または手根骨関節について1点とし、そして中足骨または中手骨関節について、後足に6および前足に5の最大スコアで1点とする。各々の足を、個々に採点したが、マウス毎の累積臨床関節炎スコアは、最大22点に達した。
第XI因子の阻害作用および関節炎症および関節リウマチをもたらす関節中のフィブリン蓄積におけるその役割の作用を、ネズミコラーゲン誘発性関節炎(CIA)モデルにおいて評価した。被験動物へのコラーゲンの投与は、関節炎を誘発する周知の方法であり、従来、Trentham et al. (J Exp Med, 146:857-68, 1977)、Courtenay et al. (Nature, 283:666-668, 1980)、Cathcart et al. (Lab Invest, 54:26-31, 1986)、Wooley (Methods Enzymol 162:361-373, 1988) および Holmdahl et al. (Arthritis Rheum 29:106, 1986) によって記載された。コラーゲンを投与されたマウスで誘発された関節炎は、Marty et al. (J Clin Invest, 107:631-640, 2001) によって記載のように、目視評価し且つ臨床評点することができるが、この場合、母指を除く腫脹した指各々について1点とし(最大値4)、足根骨または手根骨関節について1点とし、そして中足骨または中手骨関節について、後足に6および前足に5の最大スコアで1点とする。各々の足を、個々に採点したが、マウス毎の累積臨床関節炎スコアは、最大22点に達した。
ISIS404071(SEQ ID NO:11として本明細書中に包含されるTGGTAATCCACTTTCAGAGG)は、ネズミ第XI因子(SEQ ID NO:6として本明細書中に包含されるGENBANK受託番号NM_028066.1;869位で始まるオリゴヌクレオチド標的部位)に標的指向する5−10−5 MOEギャップマーとして設計されたキメラのアンチセンスオリゴヌクレオチドである。そのギャップマーは、20ヌクレオチド長さであり、ここにおいて、中心ギャップセグメントは、10個連続した2’−デオキシヌクレオシドから構成され、そして両側に(5’および3’方向に)、各々5ヌクレオシドを含むウィングが隣接している。各々のウィングセグメント中のヌクレオシドは各々、2’−MOE修飾を有する。ギャップマー中のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート(P=S)ヌクレオシド間結合である。ギャップマー中のシチジン残基は全て、5−メチルシチジンである。
ISIS403102(SEQ ID NO:275として本明細書中に包含されるCCATAGAACAGCTTCACAGG)は、ネズミ第VII因子に標的指向する5−10−5MOEギャップマーとして設計されたキメラのアンチセンスオリゴヌクレオチドである。そのギャップマーは、20ヌクレオチド長さであり、ここにおいて、中心ギャップセグメントは、10個連続した2’−デオキシヌクレオシドから構成され、そして両側に(5’および3’方向に)、各々5ヌクレオシドを含むウィングが隣接している。各々のウィングセグメント中のヌクレオシドは各々、2’−MOE修飾を有する。ギャップマー中のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート(P=S)ヌクレオシド間結合である。ギャップマー中のシチジン残基は全て、5−メチルシチジンである。
ISIS404071について8個のミスマッチ(MM)を含む対照オリゴヌクレオチドであるISIS421208(SEQ ID NO:14として本明細書中に包含されるTCGGAAGCGACTCTTATATG)を、対照として用いた。ISIS421208は、ネズミ第XI因子(SEQ ID NO:6として本明細書中に包含されるGENBANK受託番号NM_028066.1;869位で始まるオリゴヌクレオチド標的部位)に標的指向する5−10−5MOEギャップマーとして設計されたキメラのアンチセンスオリゴヌクレオチドである。そのギャップマーは、20ヌクレオチド長さであり、ここにおいて、中心ギャップセグメントは、10個連続した2’−デオキシヌクレオシドから構成され、そして両側に(5’および3’方向に)、各々5ヌクレオシドを含むウィングが隣接している。各々のウィングセグメント中のヌクレオシドは各々、2’−MOE修飾を有する。ギャップマー中のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート(P=S)ヌクレオシド間結合である。ギャップマー中のシチジン残基は全て、5−メチルシチジンである。
ISIS404057(SEQ ID NO:10として本明細書中に包含されるTCCTGGCATTCTCGAGCATT)は、ネズミ第XI因子(SEQ ID NO:6として本明細書中に包含されるGENBANK受託番号NM_028066.1;487位で始まるオリゴヌクレオチド標的部位)に標的指向する5−10−5MOEギャップマーとして設計されたキメラのアンチセンスオリゴヌクレオチドである。そのギャップマーは、20ヌクレオチド長さであり、ここにおいて、中心ギャップセグメントは、10個連続した2’−デオキシヌクレオシドから構成され、そして両側に(5’および3’方向に)、各々5ヌクレオシドを含むウィングが隣接している。各々のウィングセグメント中のヌクレオシドは各々、2’−MOE修飾を有する。ギャップマー中のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート(P=S)ヌクレオシド間結合である。ギャップマー中のシチジン残基は全て、5−メチルシチジンである。
雄DBA/1Jマウスは、The Jackson Laboratory(Bar Harbor, Maine)より入手した。
関節炎研究A:第XI因子阻害(ISIS404071)の関節炎への作用
ISIS404071で第XI因子を阻害する作用および関節炎を改善する場合のその役割の作用を、コラーゲン誘発性関節炎(CIA)モデルにおいて評価した。
ISIS404071で第XI因子を阻害する作用および関節炎を改善する場合のその役割の作用を、コラーゲン誘発性関節炎(CIA)モデルにおいて評価した。
雄DBA/1Jマウスを、表19に示されるように群に分け且つ処置した。
15匹のDBA/1Jマウスの群に、20mg/kgのISIS404071を、週2回12週間皮下注射した。一つの対照群の15匹のマウスに、20mg/kgのISIS403102を、週2回12週間注射した。各15匹の二つの対照群のマウスに、PBSを、週2回12週間注射した。最初のオリゴヌクレオチド用量の2週間後、II型ウシコラーゲン(Chondrex Inc, Redmond, WA)を、完全フロイントアジュバントと混合し、氷上で均一化し、そして100μgのコラーゲンを含有するエマルジョンを、第XI因子群、第VII因子群および一つのPBS対照群の尾の基部に皮下注射した。不完全フロイントアジュバント中に100μgのII型コラーゲンを含有するブースター注射は、最初のコラーゲン注射後21日目に、これら群の尾の基部の異なった注射部位に皮下注射した。
最初のコラーゲン注射から35日に開始して、全ての群のマウスの末梢関節を、腫脹および硬直などの関節炎の目視外観について毎日調べた。それら結果を、表20(PBS対照の百分率として表される)および図1〜3に示す。
「CIAの発生率」は、40日目にCIAを有した各群のマウスの百分率を意味する。「罹患した足の百分率」は、関節炎に罹患したマウスの各群における全60の足からの足の百分率を意味する。「罹患した足の平均数」は、関節炎を有すると診断されたマウスおける罹患した足の数を意味する。「CIAの臨床的重症度」は、Marty et al. (J Clin Invest, 107:631-640, 2001) によって記載のように且つ次のように評点した。母指を除く腫脹した指各々について1点とし(最大値4)、足根骨または手根骨関節について1点とし、そして中足骨または中手骨関節について、後足に6および前足に5の最大スコアで1点とする。各々の足を、個々に採点したが、マウス毎の累積臨床関節炎スコアは、最大22点に達した。
表20および図1〜3に示されるように、ISIS404071での処置は、CIAの発生率を有意に阻害することが認められた。
関節炎研究B:第XI因子阻害(ISIS404071およびISIS404057)の関節炎への作用
ISIS404071またはISIS404057で第XI因子を阻害する作用および関節炎を改善する場合のそれらの役割の作用を、コラーゲン誘発性関節炎モデルにおいて評価した。
ISIS404071またはISIS404057で第XI因子を阻害する作用および関節炎を改善する場合のそれらの役割の作用を、コラーゲン誘発性関節炎モデルにおいて評価した。
雄DBA/1Jマウスを、表21に示されるように群に分け且つ処置した。
20匹のDBA/1Jマウスの群に、20mg/kgのISIS404071を、週2回10週間皮下注射した。第二群の20匹のDBA/1Jマウスに、20mg/kgのISIS404057を、週2回10週間皮下注射した。第三の対照群の20匹のマウスに、20mg/kgのISIS421208を、週2回10週間皮下注射した。各20匹の二つの対照群のマウスに、PBSを、週2回10週間注射した。
最初のオリゴヌクレオチド用量の2週間半後、完全フロイントアジュバント中のII型ウシコラーゲンを、全ての実験群と一つのPBS対照群の尾の基部に皮下注射した。不完全フロイントアジュバント中に100μgのII型コラーゲンを含有するブースター注射は、最初のコラーゲン注射後21日目に、これら群の尾の基部の異なった注射部位に皮下注射した。
最初のコラーゲン注射後30日目の後に、全ての群のマウスの末梢関節を、関節炎の目視外観について毎日調べた。研究の最後の第XI因子アンチセンスオリゴヌクレオチド処置の作用を、表22および図4〜6に示す。表22の結果は、肝および脾臓重量を除いて、PBS対照と比較した変化パーセントとして表されている。
第XI因子アンチセンスオリゴヌクレオチドISIS404071でのコラーゲン誘発性関節炎マウスの処置は、マウスにおいて評価される関節炎の量を、未処置マウスに比較して有意に低下させた(表22および図4A)。第XI因子アンチセンスオリゴヌクレオチドISIS404057でのコラーゲン誘発性関節炎マウスの処置は、未処置マウスに比較して、マウスにおいて評価される関節炎の量に影響を与えなかった。それら二つの第XI因子アンチセンスオリゴヌクレオチド間の有効性の相違は、図4Bに示されるように、第XI因子mRNAを阻害する場合の各々のオリゴヌクレオチドの相対有効性に関係することがありうる。ISIS404057による第XI因子阻害の欠如は、マウスにおける関節炎阻害の欠如に相関した。
要約すると、この実施例は、本発明者に初めて知られた、第XI因子が、関節炎においてある役割を果たしているということ、および第XI因子阻害剤での動物の処置は、その動物の関節炎を改善するであろうということを示している。第XI因子阻害剤での処置は、動物の関節炎のリスクおよび進行を減少させることも分かっている。
実施例12:ネズミ第XI因子のアンチセンス阻害のDSS誘発性結腸炎への in vivo 作用
第XI因子のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害の作用および結腸炎を改善する場合のその役割の作用を、デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)誘発性結腸炎モデルにおいて評価した。被験動物へのDSSの投与は、結腸炎を誘発する周知の方法であり、従来、Okayasu et al. (Gastroenterology, 1990, 98:694-702)、Cooper et al. (Lab Invest, 1993, 69:238-249) および Dieleman et al. (Clin Exp Immunol, 1998, 114:385-391) によって記載された。
第XI因子のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害の作用および結腸炎を改善する場合のその役割の作用を、デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)誘発性結腸炎モデルにおいて評価した。被験動物へのDSSの投与は、結腸炎を誘発する周知の方法であり、従来、Okayasu et al. (Gastroenterology, 1990, 98:694-702)、Cooper et al. (Lab Invest, 1993, 69:238-249) および Dieleman et al. (Clin Exp Immunol, 1998, 114:385-391) によって記載された。
ヒトの結腸炎は、持続性下痢(弛緩性、水様、または頻回便通)、痙攣性腹痛、発熱、直腸出血、食欲不振および体重減少が含まれうる症状を有する。結腸炎の病理学的変化には、結腸短縮(Gore, 1992, AJR, 158:59-61)、炎症性病変の形成、拡散した好中球浸潤、粘膜下浮腫および固有筋肥厚などの結腸への変化が含まれうる。
第XI因子に標的指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、上の実施例11に記載した。Swiss Webb マウスは、Charles River Laboratories(Wilmington, MA)からであった。
結腸炎研究A:第XI因子阻害(ISIS404071)の結腸炎への作用
ISIS404071で第XI因子を阻害する作用および結腸炎を改善する場合のその役割の作用を、デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)誘発性結腸炎モデルにおいて評価した。
ISIS404071で第XI因子を阻害する作用および結腸炎を改善する場合のその役割の作用を、デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)誘発性結腸炎モデルにおいて評価した。
メスSwiss Webb マウスを、表23に示されるように群に分け且つ処置した。
8匹ずつの Swiss Webb マウスの群に、20mg/kgのISIS404071またはISIS403102を、週2回3週間皮下注射した。各8匹の二つの対照群のマウスには、PBSを週2回3週間注射した。オリゴヌクレオチド処置後、水中の4%DSSを、実験群と一つのPBS対照群に随意に6日間投与した。
全ての群のマウスの体重を、0日目に量った。DSSを投与後7日目の研究の最後に、マウスを屠殺し、そしてそれらの体重および結腸長さを測定した。結果は、表24(PBS対照の百分率として表される)および図7に示す。
結腸長さを、DSS誘発性結腸炎マウスにおいて評価した。第XI因子オリゴヌクレオチドでの処置は、結腸炎の症状を示す結腸短縮の量を低下させた。
第VII因子または第XI因子オリゴヌクレオチドで処置されたマウス(DSS誘発性)潰瘍結腸炎モデルからのマウス結腸組織を調べて、存在する炎症の量を決定した。
それらマウスは、ナトリウムペントバルビタール(160mg/kg)を用いて屠殺した。結腸部分は、三等分し、縦に切断し、そして10%中性緩衝化ホルマリン中で固定し、パラフィンで包埋し、4μm切片とし、そして光学顕微鏡検査用にヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。それらスライドは、病理学者が顕微鏡で調べ、そして図8および表25に示されるように、腸炎症についての組織学的重症度スコアで評価した。8C(第VII因子被処置)および8D(第XI因子被処置)の炎症の量を、8A(炎症なし)の負の対照および8B(最大炎症)の正対照と比較して、炎症の重症度を決定した。
多病変結腸炎は、DSSで処置されなかった結腸(図8A)と比較したところ、DSS被処置結腸において認められた(図8B)。図8Cの結腸は、第VII因子に標的指向する対照オリゴヌクレオチドISIS403102で処置したが、図8BのDSS被処置結腸と同様の外観の病変を示す。図8Dの結腸は、ISIS404071で処置したが、図8Bまたは図8Cの結腸よりも有意に少ない潰瘍性粘膜病変を示す。
結腸研究B:第XI因子阻害(ISIS404071およびISIS404057)の結腸炎への作用
ISIS404071およびISIS404057で第XI因子を阻害する作用および結腸炎を改善する場合のそれらの役割の作用を、デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)誘発性結腸炎モデルにおいて評価した。
ISIS404071およびISIS404057で第XI因子を阻害する作用および結腸炎を改善する場合のそれらの役割の作用を、デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)誘発性結腸炎モデルにおいて評価した。
Swiss Webb マウスを、表26に示されるように群に分け且つ処置した。
第一群の8匹の Swiss Webb マウスに、20mg/kgのISIS404071を、週2回3週間皮下注射した。第二群の8匹の Swiss Webb マウスに、20mg/kgのISIS404057を、週2回3週間皮下注射した。第三対照群の8匹の Swiss Webb マウスに、20mg/kgのISISI421208を、週2回3週間皮下注射した。各8匹の二つの対照群のマウスには、PBSを週2回3週間注射した。オリゴヌクレオチド処置後、水中の4%DSSを、全ての実験群と一つのPBS対照群に随意に6日間投与した。
全ての群のマウスの体重を、0日目と、DSSの投与後毎日、量った。DSSを投与後7日目の研究の最後に、マウスを屠殺し、それらの肝および結腸を、RNA分析用に採取し、そしてそれらの体重および結腸長さを測定した。
アンチセンスオリゴヌクレオチドの体重変化および体結腸長さへの作用を、表27および図9に示す。
第XI因子mRNAのRT−PCR分析を行った。表27および図10に示されるように、第XI因子に標的指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、肝においてPBS対照を越えて統計的に有意の用量依存性のネズミ第XI因子減少を達成した。測定値は全て、シクロフィリンに規格化する。
表27の結果は全て、PBS対照と比較した変化パーセントとして表されている。
結腸炎研究C:第XI因子阻害(ISIS404071)の結腸炎への作用
第XI因子オリゴヌクレオチド(ISIS404071、SEQ ID NO:11)を用いた結腸炎についての第三の研究を行った。その研究は、本質的には、この実施例の始めの方に記載のように行った。軟便/下痢研究を行った。7日後、DSS非投与の対照マウスには下痢がなく、DSSを投与されたマウスは、下痢を生じ、そして第XI因子オリゴヌクレオチドを投与されたマウスは、普通〜軟便を生じたが、下痢はなかった。
第XI因子オリゴヌクレオチド(ISIS404071、SEQ ID NO:11)を用いた結腸炎についての第三の研究を行った。その研究は、本質的には、この実施例の始めの方に記載のように行った。軟便/下痢研究を行った。7日後、DSS非投与の対照マウスには下痢がなく、DSSを投与されたマウスは、下痢を生じ、そして第XI因子オリゴヌクレオチドを投与されたマウスは、普通〜軟便を生じたが、下痢はなかった。
P−セレクチンは、結腸炎を悪化させることに関与していたが、P−セレクチンの剥離は、結腸炎を改善することが判明した(Gironella, M. et al., J. Leukoc. Biol. 2002. 72: 56-64)。血清P−セレクチンレベルへの第XI因子のアンチセンス阻害の作用を、この研究で評価した。DSS投与は、P−セレクチンレベルの増加をもたらしたが、それは、ISIS404071での処置によって減少した。それら結果を、表28に示す。
結腸炎研究D:いろいろな用量の第XI因子阻害(ISIS404071)の結腸炎への作用
結腸炎を改善する場合にいろいろな用量のISIS404071で第XI因子を阻害する作用を、デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)誘発性結腸炎モデルにおいて評価した。
結腸炎を改善する場合にいろいろな用量のISIS404071で第XI因子を阻害する作用を、デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)誘発性結腸炎モデルにおいて評価した。
メス Swiss Webb マウスを、表29に示されるように群に分け且つ処置した。
第一群の8匹の Swiss Webb マウスに、10mg/kgのISIS404071を、週2回3週間皮下注射した。第二群の8匹の Swiss Webb マウスに、20mg/kgのISIS404057を、週2回3週間皮下注射した。第三対照群の8匹の Swiss Webb マウスに、40mg/kgのISISI404057を、週2回3週間皮下注射した。各8匹の二つの対照群のマウスには、PBSを週2回3週間注射した。オリゴヌクレオチド処置後、水中の4%DSSを、全ての実験群と一つのPBS対照群に随意に7日間投与した。
全ての群のマウスの体重を、図11Aに示されるように、0日目と、DSSの投与後3日目に開始して毎日量った。マウスの軟便/下痢を、図11Bに示されるように、DSSを投与後7日目に分析した。DSSを投与後7日目の研究の最後に、マウスを屠殺し、そしてそれらの結腸長さを、図11Cに示されるように測定した。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、体重および下痢スコアへの統計的に有意の用量作用を示した(図11Aおよび図11B)。いろいろな用量のオリゴヌクレオチドは、それらいろいろな用量の間では、結腸長さへの統計的に有意の作用を示さなかったが、それら3種類の用量のいずれの投与も、図11Cに示されるように、プラシーボと比較した場合、結腸長さを有意に改善した。
デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)誘発性結腸炎のマウスは、血中のトロンビン・アンチトロンビン(TAT)複合体のレベルを上昇させたが(Anthoni, C. et al., J. Exp. Med. 204: 1595-1601, 2007)、それは、潰瘍性大腸炎の患者でも認められる(Kume, K. et al., Intern Med. 2007. 46: 1323-9)。結腸中のTATレベルへの第XI因子のアンチセンス阻害の作用を評価したが(Thrombi-Anti-Thrombin III complex, Siemens Healthcare Diagnostics, Deerfield, IL)、それら結果を、表30に示す。示されるように、DSS投与は、TATレベルを増加させたが、それは、ISIS404071での処理により、用量依存方式で低下した。
可溶性CD40リガンド(CD40L)の血漿レベルは、炎症性腸疾患の場合に上昇することが知られているので(Ludwiczek, O. et al., Int. J. Colorectal Disease. 2003. 18: 142-147)、腸炎症のマーカーと考えることができる。血漿中のCD40Lレベルへの第XI因子のアンチセンス阻害の作用を評価したが(Bender Medsystems, Vienna, Austria; eBioscience, San Diego, CA)、それら結果を、表31に示す。示されるように、DSS投与は、CD40Lレベルを増加させたが、それは、ISIS404071での処置により低下した。
潰瘍性大腸炎を有する実験モデルおよびヒトについての知見は、炎症性腸疾患におけるカリクレイン・キニン系の病原の役割を示唆する(Devani, M. et al., Digestive and Liver Disease. 2005. 37: 665-673)。結腸中のキニンレベルへの第XI因子のアンチセンス阻害の作用を評価したが(Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA)、それら結果を、表32に示す。示されるように、DSS投与は、ブラジキニンレベルを増加させたが、それは、ISIS404071での処置により低下した。
要約すると、この実施例は、第XI因子オリゴヌクレオチド処置が、被験動物におけるDSS誘発性潰瘍性大腸炎を有意に改善したということを示す。第XI因子阻害剤での処置は、被験動物における結腸炎のリスクおよび進行を減少させることも分かっている。
結腸研究E:天然ヒト第XI因子タンパク質が、結腸炎モデルにおいて第XI因子阻害(ISIS404071)の作用を逆転させうるかどうかを決定すること。
ISIS404071で第XI因子を阻害する作用を逆転させる場合のヒト第XI因子タンパク質の効力を、デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)誘発性結腸炎モデルにおいて評価した。
メスSwiss Webb マウスを、表33に示されるように群に分け且つ処置した。
二つの群の8匹ずつの Swiss Webb マウスに、40mg/kgのISIS404071を皮下注射で週2回3週間投与した。二つの対照群の8匹ずつの Swiss Webb マウスに、PBSを週2回3週間皮下投与した。次に、双方のASO被処置群および一つの対照群に、蒸留水中の4%DSSを7日間随意に与えた。ASOおよびDSS被処置群の一つには、更に、20μgの組換えヒト第XI因子タンパク質(Haematologic Technologies Inc.)の静脈内注射を、DSS処置の前日に開始して連続7日間与えた。DSSを投与後7日目の研究の最後に、マウスを屠殺した。
第XI因子mRNAレベルへのISIS404071によるアンチセンス阻害の作用を、表34に示す。第XI因子レベルは、ISIS404071単独で処置されたマウスにおいて、未処置PBS対照と比較して有意に低下した。
全ての群のマウスの体重を、0日目と研究の最後に量った。それら結果は、表35に示すが、異なった群における研究時間にわたる体重変化を示している。DSSを投与後7日目の研究の最後に、マウスを屠殺し、そしてそれらの結腸長さを測定した。結果は、表36に示すが、ISIS404071での処置による結腸長さの増加が、組換え第XI因子タンパク質の投与によって排除されることを示している。マウスの軟便/下痢を、DSSを投与後7日目に分析したが、そのスコアを表37に示す。ISIS404071で処置されたマウスの下痢の改善は、組換え第XI因子タンパク質の付加で排除される。
デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)誘発性結腸炎のマウスは、血中のトロンビン・アンチトロンビン(TAT)複合体のレベルを上昇させたが(Anthoni, C. et al., J. Exp. Med. 204: 1595-1601, 2007)、潰瘍性大腸炎の患者でも認められる(Kume, K. et al., Intern Med. 2007. 46: 1323-9)。結腸中のTATレベルへの第XI因子のアンチセンス阻害の作用を、DSSを投与後7日目の研究の最後に評価したが(Siemens Healthcare Diagnostics, Deerfield, IL)、それら結果を、表38に示す。示されるように、DSS投与は、TATレベルを増加させたが、それは、ISIS404071での処理により低下した。組換え第XI因子タンパク質の投与は、TATレベルを、DSS被処置マウスの場合へとほぼ回復させた。
可溶性CD40リガンド(CD40L)の血漿レベルは、炎症性腸疾患の場合に上昇することが知られているので(Ludwiczek, O. et al., Int. J. Colorectal Disease. 2003. 18: 142-147)、腸炎症のマーカーと考えることができる。血漿中のCD40Lレベルへの第XI因子のアンチセンス阻害の作用を、DSSを投与後7日目の研究の最後に評価したが、それら結果を、表39に示す。血漿中のCD40Lレベルは、商業的に入手可能なELISAキット(Bender MedSystems, Vienna, Austria, eBioscience, San Diego, CA)により、製造者のプロトコルにしたがって測定した。示されるように、DSS投与は、CD40Lレベルを増加させたが、それは、ISIS404071での処置により低下した。組換え第XI因子タンパク質の投与は、CD40Lレベルを、DSS被処置マウスの場合へと回復させた。
潰瘍性大腸炎を有する実験モデルおよびヒトについての知見は、炎症性腸疾患におけるカリクレイン・キニン系の病原の役割を示唆する(Devani, M. et al., Digestive and Liver Disease. 2005. 37: 665-673)。結腸中のキニンレベルへの第XI因子のアンチセンス阻害の作用を、DSSを投与後7日目の研究の最後に評価したが(Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA)、それら結果を、表40に示す。示されるように、DSS投与は、ブラジキニンレベルを増加させたが、それは、ISIS404071での処置により低下した。組換え第XI因子タンパク質の投与は、ブラジキニンレベルを、DSS被処置マウスの場合へと回復させた。
IFN−γ、IL−10、IL−12、IL−1β、IL−2、IL−4、IL−5、TNF−αおよび角化細胞化学誘引物質(KC)のサイトカインレベルを、それらマウス群の結腸において、DSSを投与後7日目の研究の最後に測定した。結腸を、プロテアーゼ阻害剤(Sigma, St. Louis, MO)を補足したPBS中において氷上で均一化し、そして4℃で1時間の回転で抽出した。遠心分離による不溶性物質の除去後、結腸ホモジネートを、サイトカイン分析のために、多様なELISA(Mouse TH1/TH2 9-Plex Ultra-Sensitive Kit, Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD)により、製造者のプロトコルにしたがって用いた。結腸抽出物中のサイトカインレベルは、タンパク質検定キット(BioRad, Hercules, CA)によって測定されたタンパク質濃度に規格化した。サイトカインレベル結果を、表41に示す。炎症誘発性サイトカインであるIFN−γ、IL−1β、IL−10、IL−2、IL−5、TNF−αおよびKCのレベルは、DSS投与によって上昇し、そしてISIS404071での処置によって低下した。組換え第XI因子タンパク質の投与は、サイトカインレベルを、DSS被処置マウスの場合へと回復させた。
要約すると、この実施例は、被験動物のDSS誘発性潰瘍性大腸炎のアンチセンス処置が、潰瘍性大腸炎を改善し、そしてTh1サイトカインであるINF−γ、IL−1β、TNF−αおよびKCなどの特定の炎症誘発性サイトカインを低下させたということを示している。更に、Th2サイトカインであるIL−4およびIL−5などの炎症誘発性サイトカインは、未処置マウスと比較して低下した。この実施例は、更に、ヒト第XI因子タンパク質処置が、被験動物のDSS誘発性潰瘍性大腸炎のアンチセンス処置の作用を首尾よく逆転させうるということを示している。したがって、組換えヒト第XI因子タンパク質は、ISIS404071処置のための解毒薬として役立つことができる。
結腸炎研究F:ISIS404071の結腸炎への作用
結腸炎を改善する場合にISIS404071で第XI因子を阻害する作用を、デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)誘発性結腸炎モデルにおいて評価した。
結腸炎を改善する場合にISIS404071で第XI因子を阻害する作用を、デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)誘発性結腸炎モデルにおいて評価した。
メスSwiss Webb マウスを、表42に示されるように群に分け且つ処置した。
第一群の8匹の Swiss Webb マウスに、50mg/kgのISIS404071を、週2回3週間皮下注射した。二つの対照群の各8匹のマウスに、PBSを週2回3週間注射した。オリゴヌクレオチド処置後、水中の4%DSSを、実験群および一つのPBS対照群に7日間随意に投与した。DSSを投与後7日目の研究の最後に、マウスを屠殺した。
全ての群のマウスの体重を、0日目と、DSSの投与後7日間毎日量った。0日目と7日目のマウス体重を、表43に示す。マウスの軟便/下痢を、表44に示されるように、DSSを投与後7日間分析した。DSSを投与後7日目の研究の最後に、マウスを屠殺し、そしてそれらの結腸長さおよび体重を、表45に示されるように測定した。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、下痢スコアおよび結腸長さへの統計的に有意の用量作用を示した(表44および表45)。ISIS404071は、表43に示されるように、プラシーボと比較した場合、体重に有意に影響を与えなかった。
サイトカインIL−1、IL−6、IL−10、IL−12、IL−17およびTNF−αのmRNAレベルを、それらマウス群の結腸において、DSSを投与後7日目の研究の最後に測定した。結腸を、プロテアーゼ阻害剤(Sigma, St. Louis, MO)を補足したPBS中において氷上で均一化し、そして4℃で1時間の回転で抽出した。遠心分離による不溶性物質の除去後、結腸ホモジネートを、サイトカイン分析のために、多様なELISA(Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD)により、製造者のプロトコルにしたがって用いた。結腸抽出物中のサイトカインレベルは、タンパク質検定キット(BioRad, Hercules, CA)によって測定されたタンパク質濃度に規格化した。それら結果を、表46に示す。DSS投与によって上昇した、Th1サイトカインIL−1およびIL−6を含めた炎症誘発性サイトカインのレベルは、ISIS404071での処置によって低下した。GATA−3は、転写因子であるが、Th2細胞からのサイトカインであるIL−4、IL−5およびIL−13の分泌を促進することが分かった。GATA−3へのアンチセンスオリゴヌクレオチドの作用を、表46に示す。
アミノトランスフェラーゼ(ALTおよびAST)の血漿レベル、血中尿素窒素(BUN)、クレアチニン(CREAT)、コレステロール(CHOL)および総ビリルビン(TBIL)は、処置後に測定したが、表47に示す。
ISIS404071による処置後の第XI因子mRNAの肝レベルおよび結腸レベルでのアンチセンス阻害の作用を、表48に(PBS被処置対照のパーセントとして)示す。
要約すると、この実施例は、第XI因子オリゴヌクレオチドが、被験動物のDSS誘発性潰瘍性大腸炎を有意に改善したということを示している。第XI因子阻害剤での処置は、更に、被験動物の結腸炎のリスクおよび進行を減少させることが分かっている。第XI因子阻害剤での処置は、更に、Th1サイトカインIL−1およびIL−6を低下させた。
実施例13:ネズミ第XI因子のアンチセンス阻害のOVA誘発性喘息モデルへの in vivo 作用
第XI因子のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害の作用および喘息を改善する場合のその役割の作用を、OVA/ミョウバン誘発性喘息モデルにおいて評価した。被験動物へのオボアルブミンの投与は、結腸炎を誘発する周知の方法であり、従来、Henderson et al. (J. Exp. Med., 1996, 184: 1483-1494) によって記載された。
第XI因子のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害の作用および喘息を改善する場合のその役割の作用を、OVA/ミョウバン誘発性喘息モデルにおいて評価した。被験動物へのオボアルブミンの投与は、結腸炎を誘発する周知の方法であり、従来、Henderson et al. (J. Exp. Med., 1996, 184: 1483-1494) によって記載された。
ヒトの喘息は、喘鳴音、呼吸困難、乾性咳、胸部の絞窄感(tightness)および痛み、急速心拍数および発汗が含まれうる症状を有する。喘息発作または喘息の悪化の際は、肺組織中に炎症、気管支の平滑筋細胞の収縮、気道の遮断および呼吸困難が存在する(Fanta, C.H. N. Engl. J. Med. 2009. 360: 1002-1014)。
第XI因子に標的指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、上の実施例11に記載した。
処置
BALB/cマウス(Charles River Laboratories, Wilmington, MA より入手可能)を、12時間明/暗サイクルで維持し、Teklad 実験用飼料(Harlan Laboratories, Indianapolis, IN)を随意に与えた。被験動物を、研究設備内で少なくとも7日間順応させた後、実験を開始した。アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)は、PBS中で調製し、そして0.2ミクロンフィルターを介して濾過することによって滅菌した。オリゴヌクレオチドを、注射用に0.9%PBS中に溶解させた。
BALB/cマウス(Charles River Laboratories, Wilmington, MA より入手可能)を、12時間明/暗サイクルで維持し、Teklad 実験用飼料(Harlan Laboratories, Indianapolis, IN)を随意に与えた。被験動物を、研究設備内で少なくとも7日間順応させた後、実験を開始した。アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)は、PBS中で調製し、そして0.2ミクロンフィルターを介して濾過することによって滅菌した。オリゴヌクレオチドを、注射用に0.9%PBS中に溶解させた。
マウスを、各5匹の四つの処置群に分けた。一つの群に、ISIS404071の皮下注射を50mg/kgの用量で週2回4週間与えた。一つの群のマウスに、対照オリゴヌクレオチドであって、ISIS404071のミスマッチオリゴヌクレオチド配列であるISIS421208の皮下注射を、50mg/kgの用量で週2回4週間与えた。二つの群のマウスに、PBSの皮下注射を週2回4週間与えた。一つのPBS群は、未処置のままにし、対照群とした。第二のPBS群と、双方のオリゴヌクレオチド被処置群に、OVA/ミョウバンを0日目と14日目に注射し、そしてPBS中のOVAを、24日目、25日目および26日目に噴霧した。最初のOVA適用は、OVAに対してマウスを感作するのに役立ったが、二回目は、喘息反応を引き起こすチャレンジ適用であった。最終用量後2日に、マウスを安楽死させ、気管支洗浄(BAL)を集め、分析を行った。
気管支喘息は、その軽症形でも、Tリンパ球、マクロファージ、好酸球およびマスト細胞を含めた、炎症細胞およびイムノエフェクター細胞の活性化および局所浸潤を特徴とする(Smith D.L. et al., Am. Rev. Respir. Dis. 1993. 148: 523-532)。気管支肺胞洗浄(BAL)好酸球動員へのISIS404071での処置の作用を評価した。BAL細胞を、ヘマトキシリン(hemotoxylin)およびエオシン(H&E)で染色した。それら結果を、表49に、BAL中の全細胞の百分率として示す。そのデータは、ISIS404071での処置が、好酸球動員を低下させたということを示している。
肺部分を、喘息発作の際に生じる粘液を染色する過ヨウ素酸シフト(shift)(PAS)基剤染色で染色した(Rogers, D.F. Curr. Opin Pharmacol. 2004. 4: 241-250)。肺における全気道の百分率としての粘液含有気道の数を評価した。そのデータは、表50に示すが、ISIS404071での処置が、肺における粘液生産を低下させたということを示している。
要約すると、この実施例は、第XI因子オリゴヌクレオチド処置が、被験動物のOVA誘発性喘息を有意に改善したということを示している。第XI因子阻害剤での処置は、被験動物の喘息のリスクおよび進行を減少させることも分かっている。
実施例14:HepG2細胞中におけるミクロウォークで設計されたオリゴヌクレオチドによるヒト第XI因子のアンチセンス阻害
更に別のギャップマーを、ISIS416850およびISIS416858に基づいて設計した(上の表8を参照されたい)。これらギャップマーは、ISIS416850およびISIS416858の上流および下流に僅かにシフトしていた(すなわち、「ミクロウォーク」)。それらミクロウォークギャップマーは、5−8−5MOEかまたは6−8−6MOEモチーフで設計した。
更に別のギャップマーを、ISIS416850およびISIS416858に基づいて設計した(上の表8を参照されたい)。これらギャップマーは、ISIS416850およびISIS416858の上流および下流に僅かにシフトしていた(すなわち、「ミクロウォーク」)。それらミクロウォークギャップマーは、5−8−5MOEかまたは6−8−6MOEモチーフで設計した。
これらミクロウォークギャップマーを、in vitro で調べた。20,000個/ウェルの細胞密度で培養されたHepG2を、エレクトロポレーションを用いて8,000nMアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクションした。約24時間の処理時間後、RNAを細胞から単離し、そして第XI因子mRNAレベルを、定量リアルタイムPCRで測定した。第XI因子mRNAレベルは、RIBOGREENで測定される全RNA含量によって調整した。結果は、未処理対照細胞に相対する第XI因子の阻害パーセントとして示す。
ISIS416850およびISIS416858、更には、表1および表8より選択されるギャップマー(すなわち、ISIS412206、ISIS412223、ISIS412224、ISIS412225、ISIS413481、ISIS413482、ISIS416825、ISIS416848、ISIS416849、ISIS416850、ISIS416851、ISIS416852、ISIS416853、ISIS416854、ISIS416855、ISIS416856、ISIS416857、ISIS416858、ISIS416859、ISIS416860、ISIS416861、ISIS416862、ISIS416863、ISIS416864、ISIS416865、ISIS416866およびISIS416867)を、上記と同じ条件下において、ミクロウォークギャップマーと一緒に in vitro で再試験した。
表51のキメラのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、5−10−5MOE、5−8−5および6−8−6MOEギャップマーとして設計した。表51に挙げられている最初の二つのギャップマーは、ISIS445493〜445543がミクロウォークによって設計された元のギャップマー(ISIS416850およびISIS416858)であり、星印で示されている。5−10−5ギャップマーは、20ヌクレオチド長さであり、ここにおいて、中心ギャップセグメントは、10個の2’−デオキシヌクレオチドから構成され、そして両側に(5’および3’方向に)、各々5ヌクレオチドを含むウィングが隣接している。5−8−5ギャップマーは、18ヌクレオチド長さであり、ここにおいて、中心ギャップセグメントは、8個の2’−デオキシヌクレオチドから構成され、そして両側に(5’および3’方向に)、各々5ヌクレオチドを含むウィングが隣接している。6−8−6ギャップマーは、20ヌクレオチド長さであり、ここにおいて、中心ギャップセグメントは、8個の2’−デオキシヌクレオチドから構成され、そして両側に(5’および3’方向に)、各々6ヌクレオチドを含むウィングが隣接している。各々のモチーフ(5−10−5、5−8−5および6−8−6)について、5’ウィングセグメント中の各々のヌクレオチドおよび3’ウィングセグメント中の各々のヌクレオチドは、2’−MOE修飾を有する。各々のギャップマー中のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート(P=S)結合である。各々のギャップマー中のシチジン残基は全て、5−メチルシチジンである。「ヒト標的出発部位」は、ギャップマーに標的とされているヒト配列中の最も5’のヌクレオチドを示す。「ヒト標的停止部位」は、ギャップマーに標的とされているヒト配列中の最も3’のヌクレオチドを示す。表51に挙げられているギャップマーは各々、SEQ ID NO:1(GENBANK受託番号NM_000128.3)を標的としている。表51にある各々のギャップマーは、本明細書中においてSEQ ID NO:274(エクソン1−15のGENBANK受託番号NW_001118167.1)と称されるアカゲザル(rhesus monkey)第XI因子遺伝子配列と完全に交差反応性でもある。「アカゲザル出発部位」は、ギャップマーに標的とされているアカゲザル配列中の最も5’のヌクレオチドを示す。「アカゲザル停止部位」は、ギャップマーに標的とされているアカゲザル配列に最も3’のヌクレオチドを示す。
表51に示されるように、SEQ ID NO:1の標的出発部位1275で始まり且つ標的停止部位1317で終わる標的領域(すなわち、核酸塩基1275〜1317)を標的とするギャップマーに設計されたミクロウォークは全て、少なくとも60%の第XI因子mRNA阻害を示した。同様に、表1および表8からの再試験されたギャップマーは全て、少なくとも60%の阻害を示した。
ISIS番号:ISIS412206、412224、412225、413481、413482、416825、416848、416849、416850、416851、416852、416853、416854、416855、416856、416857、416858、416859、416860、416861、416862、416863、416864、416865、416866、416867、445494、445495、445496、445497、445498、445499、445500、445501、445502、445503、445504、445505、445506、445507、445508、445509、445510、445511、445512、445513、445514、445515、445516、445517、445518、445519、445520、445521、445522、445523、445524、445525、445526、445527、445528、445529、445530、445531、445532、445533、445534、445535、445536、445537、455538、445539、445540、445541、445542および445543を含めたいくつかのギャップマーは、少なくとも70%の阻害を示した。
ISIS番号:ISIS412206、412224、412225、413481、413482、416825、416848、416849、416850、416851、416852、416853、416854、416855、416856、416857、416858、416859、416860、416861、416862、416863、416864、416865、416866、416867、445494、445495、445496、445497、445498、445500、445501、445502、445503、445504、445505、445506、445507、445508、445509、445510、445513、445514、445519、445520、445521、445522、445525、445526、445529、445530、445531、445532、445533、445534、445535、445536、455538、445541および445542を含めたいくつかのギャップマーは、少なくとも80%の阻害を示した。
ISIS番号:ISIS412206、416825、416850、416857、416858、416861、445522および445531を含めたいくつかのギャップマーは、少なくとも90%の阻害を示した。
実施例15:HepG2細胞中におけるヒト第XI因子の用量依存性アンチセンス阻害
ヒト第XI因子の in vitro 阻害を示す実施例14によるギャップマーを、HepG2細胞中においていろいろな用量で調べた。細胞は、20,000個/ウェルの細胞密度で平板培養し、そしてエレクトロポレーションを用いて、表52に明記される123.46nM、370.37nM、1,111.11nM、3,333.33nMおよび10,000nMの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクションした。約16時間の処理時間後、RNAを細胞から単離し、そして第XI因子mRNAレベルを、定量リアルタイムPCRによって測定した。ヒト第XI因子プライマー・プローブセットRTS2966を用いて、mRNAレベルを測定した。第XI因子mRNAレベルは、RIBOGREENで測定される全RNA含量によって調整した。結果は、未処理対照細胞に相対する第XI因子の阻害パーセントとして示す。表52に示されるように、第XI因子mRNAレベルは、アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理された細胞において、用量依存方式で減少した。
ヒト第XI因子の in vitro 阻害を示す実施例14によるギャップマーを、HepG2細胞中においていろいろな用量で調べた。細胞は、20,000個/ウェルの細胞密度で平板培養し、そしてエレクトロポレーションを用いて、表52に明記される123.46nM、370.37nM、1,111.11nM、3,333.33nMおよび10,000nMの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクションした。約16時間の処理時間後、RNAを細胞から単離し、そして第XI因子mRNAレベルを、定量リアルタイムPCRによって測定した。ヒト第XI因子プライマー・プローブセットRTS2966を用いて、mRNAレベルを測定した。第XI因子mRNAレベルは、RIBOGREENで測定される全RNA含量によって調整した。結果は、未処理対照細胞に相対する第XI因子の阻害パーセントとして示す。表52に示されるように、第XI因子mRNAレベルは、アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理された細胞において、用量依存方式で減少した。
各々のオリゴヌクレオチドの半最大阻害濃度(IC50)は、用いられたアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度を、各々の濃度で達成された第XI因子mRNA発現の阻害パーセントに対してプロットし、そしてPBS対照と比較して第XI因子mRNA発現の50%阻害を達成したアンチセンスオリゴヌクレオチド濃度に注目することによって計算した。IC50値を、表52に示す。
実施例16:HepG2細胞中における、ミクロウォークで設計されたオリゴヌクレオチドによるヒト第XI因子の用量依存性アンチセンス阻害
更に別のギャップマーを、ISIS416850およびISIS416858に基づいて設計した(上の表8を参照されたい)。これらギャップマーは、ISIS416850およびISIS416858の上流および下流に僅かにシフトしている(すなわち、ミクロウォーク)。ミクロウォークで設計されたギャップマーは、3−8−3MOE、4−8−4MOE、2−10−2MOE、3−10−3MOEまたは4−10−4MOEモチーフを有する。
更に別のギャップマーを、ISIS416850およびISIS416858に基づいて設計した(上の表8を参照されたい)。これらギャップマーは、ISIS416850およびISIS416858の上流および下流に僅かにシフトしている(すなわち、ミクロウォーク)。ミクロウォークで設計されたギャップマーは、3−8−3MOE、4−8−4MOE、2−10−2MOE、3−10−3MOEまたは4−10−4MOEモチーフを有する。
これらギャップマーを、HepG2細胞中においていろいろな用量で調べた。細胞は、20,000個/ウェルの細胞密度で平板培養し、そしてエレクトロポレーションを用いて、表54に明記される375nM、750nM、1,500nM、3,000nM、6,000nMおよび12,000nMの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクションした。約16時間の処理時間後、RNAを細胞から単離し、そして第XI因子mRNAレベルを、定量リアルタイムPCRによって測定した。ヒト第XI因子プライマー・プローブセットRTS2966を用いて、mRNAレベルを測定した。第XI因子mRNAレベルは、RIBOGREENで測定される全RNA含量によって調整した。結果は、未処理対照細胞に相対する第XI因子の阻害パーセントとして示す。
ISIS416850、ISIS416858、ISIS445522およびISIS445531(上の表52を参照されたい)を、上記と同じ条件下において、ミクロウォークギャップマーと一緒に in vitro 再試験した。
表53のキメラのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、3−8−3MOE、4−8−4MOE、2−10−2MOE、3−10−3MOEまたは4−10−4MOEギャップマーとして設計した。3−8−3ギャップマーは、14ヌクレオチド長さであり、ここにおいて、中心ギャップセグメントは、8個の2’−デオキシヌクレオチドから構成され、そして両側に(5’および3’方向に)、各々3ヌクレオチドを含むウィングが隣接している。4−8−4ギャップマーは、16ヌクレオチド長さであり、ここにおいて、中心ギャップセグメントは、8個の2’−デオキシヌクレオチドから構成され、そして両側に(5’および3’方向に)、各々4ヌクレオチドを含むウィングが隣接している。2−10−2ギャップマーは、14ヌクレオチド長さであり、ここにおいて、中心ギャップセグメントは、10個の2’−デオキシヌクレオチドから構成され、そして両側に(5’および3’方向に)、各々2ヌクレオチドを含むウィングが隣接している。3−10−3ギャップマーは、16ヌクレオチド長さであり、ここにおいて、中心ギャップセグメントは、10個の2’−デオキシヌクレオチドから構成され、そして両側に(5’および3’方向に)、各々3ヌクレオチドを含むウィングが隣接している。4−10−4ギャップマーは、18ヌクレオチド長さであり、ここにおいて、中心ギャップセグメントは、10個の2’−デオキシヌクレオチドから構成され、そして両側に(5’および3’方向に)、各々4ヌクレオチドを含むウィングが隣接している。各々のモチーフ(3−8−3、4−8−4、2−10−2、3−10−3および4−10−4)について、5’ウィングセグメント中の各々のヌクレオチドおよび3’ウィングセグメント中の各々のヌクレオチドは、2’−MOE修飾を有する。各々のギャップマー中のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート(P=S)結合である。各々のギャップマー中のシチジン残基は全て、5−メチルシチジンである。「ヒト標的出発部位」は、ギャップマーに標的とされているヒト配列中の最も5’のヌクレオチドを示す。「ヒト標的停止部位」は、ギャップマーに標的とされているヒト配列中の最も3’のヌクレオチドを示す。表53に挙げられているギャップマーは各々、SEQ ID NO:1(GENBANK受託番号NM_000128.3)を標的としている。表53にある各々のギャップマーは、本明細書中においてSEQ ID NO:274(エクソン1−15のGENBANK受託番号NW_001118167.1)と称されるアカゲザル第XI因子遺伝子配列と完全に交差反応性でもある。「アカゲザル出発部位」は、ギャップマーに標的とされているアカゲザル配列中の最も5’のヌクレオチドを示す。「アカゲザル停止部位」は、ギャップマーに標的とされているアカゲザル配列に最も3’のヌクレオチドを示す。
用量反応阻害データを、表54に与える。表54に示されるように、第XI因子mRNAレベルは、アンチセンスオリゴヌクレオチド被処置細胞において用量依存方式で減少した。アンチセンスオリゴヌクレオチド各々のIC50も計算し、表54に示した。表54に挙げられている最初の二つのギャップマーは、残りのギャップマーがミクロウォークによって設計された元のギャップマー(ISIS416850およびISIS416858)であり、星印で示されている。
実施例17:CD1マウスにおけるヒト第XI因子に標的指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドの耐容性
CD1マウスを、ヒト第XI因子に標的指向するISISアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置し、そしていろいろな代謝マーカーのレベルの変化について評価した。
CD1マウスを、ヒト第XI因子に標的指向するISISアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置し、そしていろいろな代謝マーカーのレベルの変化について評価した。
処置
各5匹のCD1マウスの群に、50mg/kgのISIS416825、ISIS416826、ISIS416838、ISIS416850、ISIS416858、ISIS416864、ISIS416892、ISIS416925、ISIS416999、ISIS417002またはISIS417003を、週2回2週間、4週間または6週間皮下注射した。対照群の5匹のマウスには、PBSを2週間皮下注射した。全ての実験群(すなわち、2週間、4週間、6週間でのASO被処置マウス)を、対照群(すなわち、PBS、2週間)と比較した。
各5匹のCD1マウスの群に、50mg/kgのISIS416825、ISIS416826、ISIS416838、ISIS416850、ISIS416858、ISIS416864、ISIS416892、ISIS416925、ISIS416999、ISIS417002またはISIS417003を、週2回2週間、4週間または6週間皮下注射した。対照群の5匹のマウスには、PBSを2週間皮下注射した。全ての実験群(すなわち、2週間、4週間、6週間でのASO被処置マウス)を、対照群(すなわち、PBS、2週間)と比較した。
最後の用量を全ての群に投与後3日に、マウスを屠殺した。臓器重量を測定し、そして血液を、更なる分析用に集めた。
臓器重量
肝、脾臓および腎臓重量は、研究の最後に測定したが、表55、表56および表57に、体重に規格化されたPBS対照のパーセントとして示されている。PBS対照より上の、肝および脾臓重量の6倍増加しか影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。
肝、脾臓および腎臓重量は、研究の最後に測定したが、表55、表56および表57に、体重に規格化されたPBS対照のパーセントとして示されている。PBS対照より上の、肝および脾臓重量の6倍増加しか影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。
肝機能
肝機能へのISISオリゴヌクレオチドの作用を評価するために、トランスアミナーゼの血漿濃度を、自動臨床化学分析器(Hitachi Olympus AU400e,Melville, NY)を用いて測定した。アラニントランスアミナーゼ(ALT)およびアスパラギン酸トランスアミナーゼ(AST)の測定値は、IU/Lで表し、それら結果を、表58および表59に示す。ビリルビンおよびアルブミンの血漿レベルも、同じ臨床化学分析器を用いて測定し、mg/dLで表した。それら結果を、表60および表61に示す。ALT/ASTレベルの、対照レベルの7倍より上の増加に影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。ビリルビンレベルを対照レベルの2倍しか増加させなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。
肝機能へのISISオリゴヌクレオチドの作用を評価するために、トランスアミナーゼの血漿濃度を、自動臨床化学分析器(Hitachi Olympus AU400e,Melville, NY)を用いて測定した。アラニントランスアミナーゼ(ALT)およびアスパラギン酸トランスアミナーゼ(AST)の測定値は、IU/Lで表し、それら結果を、表58および表59に示す。ビリルビンおよびアルブミンの血漿レベルも、同じ臨床化学分析器を用いて測定し、mg/dLで表した。それら結果を、表60および表61に示す。ALT/ASTレベルの、対照レベルの7倍より上の増加に影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。ビリルビンレベルを対照レベルの2倍しか増加させなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。
腎機能
腎機能へのISISオリゴヌクレオチドの作用を評価するために、血中尿素窒素(BUN)およびクレアチニンの血漿濃度を、自動臨床化学分析器(Hitachi Olympus AU400e,Melville, NY)を用いて測定した。結果を、表62および表63に示し、mg/dLで表している。BUNレベルの、PBS対照と比較して2倍増加しか影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。
腎機能へのISISオリゴヌクレオチドの作用を評価するために、血中尿素窒素(BUN)およびクレアチニンの血漿濃度を、自動臨床化学分析器(Hitachi Olympus AU400e,Melville, NY)を用いて測定した。結果を、表62および表63に示し、mg/dLで表している。BUNレベルの、PBS対照と比較して2倍増加しか影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。
血液学検定
全てのマウス群から得た血液を、ヘマトクリット(HCT)、平均赤血球容積(MCV)、平均赤血球ヘモグロビン(MCH)および平均赤血球ヘモグロビン濃度(MCHC)の測定および分析、更には、WBC(好中球、リンパ球および単球)、RBCおよび血小板などのいろいろな血液細胞および全ヘモグロビン含量の測定のために、Antech Diagnostics へ送った。それら結果を、表64〜74に示す。それら表に与えられている百分率は、全血液細胞計数のパーセントを示す。50%より大の血小板計数の低下および/または3倍より大の単球計数の増加に影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。
全てのマウス群から得た血液を、ヘマトクリット(HCT)、平均赤血球容積(MCV)、平均赤血球ヘモグロビン(MCH)および平均赤血球ヘモグロビン濃度(MCHC)の測定および分析、更には、WBC(好中球、リンパ球および単球)、RBCおよび血小板などのいろいろな血液細胞および全ヘモグロビン含量の測定のために、Antech Diagnostics へ送った。それら結果を、表64〜74に示す。それら表に与えられている百分率は、全血液細胞計数のパーセントを示す。50%より大の血小板計数の低下および/または3倍より大の単球計数の増加に影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。
実施例18:CD1マウス肝におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの半減期の測定
CD1マウスを、ヒト第XI因子に標的指向するISISアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置し、そしてオリゴヌクレオチド半減期、更には、肝からのオリゴヌクレオチドの分解および排除の経過時間を評価した。
CD1マウスを、ヒト第XI因子に標的指向するISISアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置し、そしてオリゴヌクレオチド半減期、更には、肝からのオリゴヌクレオチドの分解および排除の経過時間を評価した。
処置
各15匹のCD1マウスの群に、50mg/kgのISIS416825、ISIS416826、ISIS416838、ISIS416850、ISIS416858、ISIS416864、ISIS416892、ISIS416925、ISIS416999、ISIS417002またはISIS417003を、週2回2週間皮下注射した。最終用量後3日、28日および56日に、各群から5匹ずつのマウスを屠殺した。肝を分析用に採取した。
各15匹のCD1マウスの群に、50mg/kgのISIS416825、ISIS416826、ISIS416838、ISIS416850、ISIS416858、ISIS416864、ISIS416892、ISIS416925、ISIS416999、ISIS417002またはISIS417003を、週2回2週間皮下注射した。最終用量後3日、28日および56日に、各群から5匹ずつのマウスを屠殺した。肝を分析用に採取した。
オリゴヌクレオチド濃度の測定
完全長オリゴヌクレオチドの濃度、更には、(分解された形を含めた)全オリゴヌクレオチド濃度を測定した。用いられる方法は、従来公表された、フェノール−クロロホルム(液−液)抽出後、固相抽出から成る方法(Leeds et al., 1996; Geary et al., 1999)の修飾である。内部標準(ISIS355868、27マーの2’−O−メトキシエチル修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT、本明細書中においてSEQ ID NO:270と称される)を加えた後、抽出を行った。組織試料濃度は、検量線を用いて、約1.14μg/gの定量下限(LLOQ)で計算した。次に、半減期を、WinNonlin ソフトウェア(PHARSIGHT)を用いて計算した。
完全長オリゴヌクレオチドの濃度、更には、(分解された形を含めた)全オリゴヌクレオチド濃度を測定した。用いられる方法は、従来公表された、フェノール−クロロホルム(液−液)抽出後、固相抽出から成る方法(Leeds et al., 1996; Geary et al., 1999)の修飾である。内部標準(ISIS355868、27マーの2’−O−メトキシエチル修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT、本明細書中においてSEQ ID NO:270と称される)を加えた後、抽出を行った。組織試料濃度は、検量線を用いて、約1.14μg/gの定量下限(LLOQ)で計算した。次に、半減期を、WinNonlin ソフトウェア(PHARSIGHT)を用いて計算した。
それら結果を、表75および表76に示し、μg/g(肝組織)として表している。各々のオリゴヌクレオチドの半減期を、表77に示す。
実施例19:Sprague-Dawley ラットにおける、ヒト第XI因子に標的指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドの耐容性
Sprague-Dawley ラットを、ヒト第XI因子に標的指向するISISアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置し、そしていろいろな代謝マーカーのレベルの変化について評価した。
Sprague-Dawley ラットを、ヒト第XI因子に標的指向するISISアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置し、そしていろいろな代謝マーカーのレベルの変化について評価した。
処置
各4匹の Sprague Dawley ラットの群に、50mg/kgのISIS416825、ISIS416826、ISIS416838、ISIS416850、ISIS416858、ISIS416848、ISIS416864、ISIS416892、ISIS416925、ISIS416999、ISIS417002またはISIS417003を、週2回6週間皮下注射した。対照群の4匹の Sprague Dawley ラットに、PBSを週2回6週間皮下注射した。体重測定値を、処置期間の前と期間中に得た。尿試料を、処置の開始前に得た。最後の用量後3日に、尿試料を得、そしてラットを屠殺した。臓器重量を測定し、そして血液を、更なる分析用に集めた。
各4匹の Sprague Dawley ラットの群に、50mg/kgのISIS416825、ISIS416826、ISIS416838、ISIS416850、ISIS416858、ISIS416848、ISIS416864、ISIS416892、ISIS416925、ISIS416999、ISIS417002またはISIS417003を、週2回6週間皮下注射した。対照群の4匹の Sprague Dawley ラットに、PBSを週2回6週間皮下注射した。体重測定値を、処置期間の前と期間中に得た。尿試料を、処置の開始前に得た。最後の用量後3日に、尿試料を得、そしてラットを屠殺した。臓器重量を測定し、そして血液を、更なる分析用に集めた。
体重および臓器重量
ラットの体重を、研究の開始時と、その後週2回測定した。体重は、表78に示し、研究の開始時に得られた体重への変化パーセントとして表されている。肝、脾臓および腎臓重量は、研究の最後に測定したが、表78に、体重に規格化された生理食塩水対照のパーセントとして示されている。PBS対照より上の、肝および脾臓重量の6倍増加しか影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。
ラットの体重を、研究の開始時と、その後週2回測定した。体重は、表78に示し、研究の開始時に得られた体重への変化パーセントとして表されている。肝、脾臓および腎臓重量は、研究の最後に測定したが、表78に、体重に規格化された生理食塩水対照のパーセントとして示されている。PBS対照より上の、肝および脾臓重量の6倍増加しか影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。
肝機能
肝機能へのISISオリゴヌクレオチドの作用を評価するために、トランスアミナーゼの血漿濃度を、自動臨床化学分析器(Hitachi Olympus AU400e,Melville, NY)を用いて測定した。アラニントランスアミナーゼ(ALT)およびアスパラギン酸トランスアミナーゼ(AST)の測定値は、IU/Lで表し、それら結果を、表79に示す。ALT/ASTレベルの、対照レベルの7倍より上の増加に影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。ビリルビンおよびアルブミンの血漿レベルも、同じ臨床分析器を用いて測定したが、それら結果も、表79に示し、mg/dLで表している。アンチセンスオリゴヌクレオチド処置により、ビリルビンのレベルの、対照レベルの2倍より大の増加に影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。
肝機能へのISISオリゴヌクレオチドの作用を評価するために、トランスアミナーゼの血漿濃度を、自動臨床化学分析器(Hitachi Olympus AU400e,Melville, NY)を用いて測定した。アラニントランスアミナーゼ(ALT)およびアスパラギン酸トランスアミナーゼ(AST)の測定値は、IU/Lで表し、それら結果を、表79に示す。ALT/ASTレベルの、対照レベルの7倍より上の増加に影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。ビリルビンおよびアルブミンの血漿レベルも、同じ臨床分析器を用いて測定したが、それら結果も、表79に示し、mg/dLで表している。アンチセンスオリゴヌクレオチド処置により、ビリルビンのレベルの、対照レベルの2倍より大の増加に影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。
腎機能
腎機能の作用を評価するために、血中尿素窒素(BUN)およびクレアチニンの血漿濃度を、自動臨床化学分析器(Hitachi Olympus AU400e,Melville, NY)を用いて測定した。結果を、表80に示し、mg/dLで表している。BUNレベルの、PBS対照と比較して2倍増加しか影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。全尿試料中の尿タンパク質対クレアチニンの比率も、アンチセンスオリゴヌクレオチド処置の前と後に計算しており、表81に示す。尿タンパク質/クレアチニン比の、PBS対照と比較して5倍増加しか影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。
腎機能の作用を評価するために、血中尿素窒素(BUN)およびクレアチニンの血漿濃度を、自動臨床化学分析器(Hitachi Olympus AU400e,Melville, NY)を用いて測定した。結果を、表80に示し、mg/dLで表している。BUNレベルの、PBS対照と比較して2倍増加しか影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。全尿試料中の尿タンパク質対クレアチニンの比率も、アンチセンスオリゴヌクレオチド処置の前と後に計算しており、表81に示す。尿タンパク質/クレアチニン比の、PBS対照と比較して5倍増加しか影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。
血液学検定
全てのラット群から得た血液を、ヘマトクリット(HCT)、平均赤血球容積(MCV)、平均赤血球ヘモグロビン(MCV)および平均赤血球ヘモグロビン濃度(MCHC)の測定および分析、更には、WBC(好中球、リンパ球および単球)、RBCおよび血小板などのいろいろな血液細胞並びに全ヘモグロビン含量の測定のために、Antech Diagnostics へ送った。それら結果を、表82および表83に示す。50%より大の血小板計数の低下および3倍より大の単球計数の増加に影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。
全てのラット群から得た血液を、ヘマトクリット(HCT)、平均赤血球容積(MCV)、平均赤血球ヘモグロビン(MCV)および平均赤血球ヘモグロビン濃度(MCHC)の測定および分析、更には、WBC(好中球、リンパ球および単球)、RBCおよび血小板などのいろいろな血液細胞並びに全ヘモグロビン含量の測定のために、Antech Diagnostics へ送った。それら結果を、表82および表83に示す。50%より大の血小板計数の低下および3倍より大の単球計数の増加に影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。
実施例20:Sprague-Dawley ラット肝および腎臓におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの半減期の測定
Sprague Dawley ラットを、ヒト第XI因子に標的指向するISISアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置し、そしてオリゴヌクレオチド半減期、更には、肝および腎臓からのオリゴヌクレオチドの分解および排除の経過時間を評価した。
Sprague Dawley ラットを、ヒト第XI因子に標的指向するISISアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置し、そしてオリゴヌクレオチド半減期、更には、肝および腎臓からのオリゴヌクレオチドの分解および排除の経過時間を評価した。
処置
各4匹の Sprague Dawley ラットの群に、20mg/kgのISIS416825、ISIS416826、ISIS416838、ISIS416850、ISIS416858、ISIS416864、ISIS416892、ISIS416925、ISIS416999、ISIS417002またはISIS417003を、週2回2週間皮下注射した。最終用量後3日に、ラットを屠殺し、そして肝および腎臓を、分析用に集めた。
各4匹の Sprague Dawley ラットの群に、20mg/kgのISIS416825、ISIS416826、ISIS416838、ISIS416850、ISIS416858、ISIS416864、ISIS416892、ISIS416925、ISIS416999、ISIS417002またはISIS417003を、週2回2週間皮下注射した。最終用量後3日に、ラットを屠殺し、そして肝および腎臓を、分析用に集めた。
オリゴヌクレオチド濃度の測定
完全長オリゴヌクレオチドの濃度、更には、(分解された形を含めた)全オリゴヌクレオチド濃度を測定した。用いられる方法は、従来公表された、フェノール−クロロホルム(液−液)抽出後、固相抽出から成る方法(Leeds et al., 1996; Geary et al., 1999)の修飾である。内部標準(ISIS355868、27マーの2’−O−メトキシエチル修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT、本明細書中においてSEQ ID NO:270と称される)を加えた後、抽出を行った。組織試料濃度は、検量線を用いて、約1.14μg/gの定量下限(LLOQ)で計算した。それら結果を、表84および表85に示し、μg/g(肝または腎臓組織)として表している。次に、半減期を、WinNonlin ソフトウェア(PHARSIGHT)を用いて計算し、表86に示した。
完全長オリゴヌクレオチドの濃度、更には、(分解された形を含めた)全オリゴヌクレオチド濃度を測定した。用いられる方法は、従来公表された、フェノール−クロロホルム(液−液)抽出後、固相抽出から成る方法(Leeds et al., 1996; Geary et al., 1999)の修飾である。内部標準(ISIS355868、27マーの2’−O−メトキシエチル修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT、本明細書中においてSEQ ID NO:270と称される)を加えた後、抽出を行った。組織試料濃度は、検量線を用いて、約1.14μg/gの定量下限(LLOQ)で計算した。それら結果を、表84および表85に示し、μg/g(肝または腎臓組織)として表している。次に、半減期を、WinNonlin ソフトウェア(PHARSIGHT)を用いて計算し、表86に示した。
実施例21:CD1マウスにおけるヒト第XI因子に標的指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドの耐容性
CD1マウスを、ヒト第XI因子に標的指向するISISアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置し、そしていろいろな代謝マーカーのレベルの変化について評価した。
CD1マウスを、ヒト第XI因子に標的指向するISISアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置し、そしていろいろな代謝マーカーのレベルの変化について評価した。
処置
各5匹のCD1マウスの群に、50mg/kgのISIS412223、ISIS412224、ISIS412225、ISIS413481、ISIS413482、ISIS416848、ISIS416849、ISIS416850、ISIS416851、ISIS416852、ISIS416853、ISIS416854、ISIS416855、ISIS416856、ISIS416857、ISIS416858、ISIS416859、ISIS416860、ISIS416861、ISIS416862、ISIS416863、ISIS416864、ISIS416865、ISIS416866またはISIS416867を、週2回6週間皮下注射した。対照群の10匹のマウスには、PBSを週2回6週間皮下注射した。体重測定値を、処置期間の前と期間中に得た。最後の用量後3日に、マウスを屠殺し、臓器重量を測定し、そして血液を、更なる分析用に集めた。
各5匹のCD1マウスの群に、50mg/kgのISIS412223、ISIS412224、ISIS412225、ISIS413481、ISIS413482、ISIS416848、ISIS416849、ISIS416850、ISIS416851、ISIS416852、ISIS416853、ISIS416854、ISIS416855、ISIS416856、ISIS416857、ISIS416858、ISIS416859、ISIS416860、ISIS416861、ISIS416862、ISIS416863、ISIS416864、ISIS416865、ISIS416866またはISIS416867を、週2回6週間皮下注射した。対照群の10匹のマウスには、PBSを週2回6週間皮下注射した。体重測定値を、処置期間の前と期間中に得た。最後の用量後3日に、マウスを屠殺し、臓器重量を測定し、そして血液を、更なる分析用に集めた。
体重および臓器重量
体重は、研究の開始時と、その後週2回測定した。マウスの体重を、表87に示し、処置の開始前に得られたPBS対照体重へのグラムでの増加を表している。肝、脾臓および腎臓重量は、研究の最後に測定したが、それらも、表87に、体重の百分率として示されている。PBS対照より上の、肝および脾臓重量の6倍増加しか影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。
体重は、研究の開始時と、その後週2回測定した。マウスの体重を、表87に示し、処置の開始前に得られたPBS対照体重へのグラムでの増加を表している。肝、脾臓および腎臓重量は、研究の最後に測定したが、それらも、表87に、体重の百分率として示されている。PBS対照より上の、肝および脾臓重量の6倍増加しか影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。
肝機能
肝機能へのISISオリゴヌクレオチドの作用を評価するために、トランスアミナーゼの血漿濃度を、自動臨床化学分析器(Hitachi Olympus AU400e,Melville, NY)を用いて測定した。アラニントランスアミナーゼ(ALT)およびアスパラギン酸トランスアミナーゼ(AST)の測定値は、IU/Lで表し、それら結果を、表88に示す。ALT/ASTレベルの、対照レベルの7倍より上の増加に影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。ビリルビン、コレステロールおよびアルブミンの血漿レベルも、同じ臨床化学分析器を用いて測定したが、表88に示し、mg/dLで表している。アンチセンスオリゴヌクレオチド処置により、ビリルビンのレベルの、対照レベルの2倍より大の増加に影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。
肝機能へのISISオリゴヌクレオチドの作用を評価するために、トランスアミナーゼの血漿濃度を、自動臨床化学分析器(Hitachi Olympus AU400e,Melville, NY)を用いて測定した。アラニントランスアミナーゼ(ALT)およびアスパラギン酸トランスアミナーゼ(AST)の測定値は、IU/Lで表し、それら結果を、表88に示す。ALT/ASTレベルの、対照レベルの7倍より上の増加に影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。ビリルビン、コレステロールおよびアルブミンの血漿レベルも、同じ臨床化学分析器を用いて測定したが、表88に示し、mg/dLで表している。アンチセンスオリゴヌクレオチド処置により、ビリルビンのレベルの、対照レベルの2倍より大の増加に影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。
腎機能
腎機能へのISISオリゴヌクレオチドの作用を評価するために、血中尿素窒素(BUN)の血漿濃度を、自動臨床化学分析器を用いて測定したが、結果は、表89に示し、mg/dLで表している。BUNレベルの、PBS対照と比較して2倍増加しか影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。
腎機能へのISISオリゴヌクレオチドの作用を評価するために、血中尿素窒素(BUN)の血漿濃度を、自動臨床化学分析器を用いて測定したが、結果は、表89に示し、mg/dLで表している。BUNレベルの、PBS対照と比較して2倍増加しか影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。
血液学検定
全てのマウス群から得た血液を、ヘマトクリット(HCT)測定、更には、WBC(好中球、リンパ球および単球)、RBCおよび血小板などのいろいろな血液細胞の測定、更には、全ヘモグロビン含量分析のために、Antech Diagnostics へ送った。それら結果を、表90および表91に示す。50%より大の血小板計数の低下および3倍より大の単球計数の増加に影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。
全てのマウス群から得た血液を、ヘマトクリット(HCT)測定、更には、WBC(好中球、リンパ球および単球)、RBCおよび血小板などのいろいろな血液細胞の測定、更には、全ヘモグロビン含量分析のために、Antech Diagnostics へ送った。それら結果を、表90および表91に示す。50%より大の血小板計数の低下および3倍より大の単球計数の増加に影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。
実施例22:CD1マウス肝におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの半減期の測定
CD1マウスにおいて評価された(実施例21)15種類のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更に評価した。CD1マウスを、ISISアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置し、そしてオリゴヌクレオチド半減期、更には、肝中のオリゴヌクレオチドの分解および排除の経過時間を評価した。
CD1マウスにおいて評価された(実施例21)15種類のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更に評価した。CD1マウスを、ISISアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置し、そしてオリゴヌクレオチド半減期、更には、肝中のオリゴヌクレオチドの分解および排除の経過時間を評価した。
処置
各15匹のCD1マウスの群に、50mg/kgのISIS412223、ISIS412225、ISIS413481、ISIS413482、ISIS416851、ISIS416852、ISIS416856、ISIS416860、ISIS416861、ISIS416863、ISIS416866、ISIS416867、ISIS412224、ISIS416848またはISIS416859を、週2回2週間皮下注射した。最終用量後3日、28日および56日に、各群から5匹ずつのマウスを屠殺し、肝を分析用に集めた。
各15匹のCD1マウスの群に、50mg/kgのISIS412223、ISIS412225、ISIS413481、ISIS413482、ISIS416851、ISIS416852、ISIS416856、ISIS416860、ISIS416861、ISIS416863、ISIS416866、ISIS416867、ISIS412224、ISIS416848またはISIS416859を、週2回2週間皮下注射した。最終用量後3日、28日および56日に、各群から5匹ずつのマウスを屠殺し、肝を分析用に集めた。
オリゴヌクレオチド濃度の測定
完全長オリゴヌクレオチドの濃度を測定した。用いられる方法は、従来公表された、フェノール−クロロホルム(液−液)抽出後、固相抽出から成る方法(Leeds et al., 1996; Geary et al., 1999)の修飾である。内部標準(ISIS355868、27マーの2’−O−メトキシエチル修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT、本明細書中においてSEQ ID NO:270と称される)を加えた後、抽出を行った。組織試料濃度は、検量線を用いて、約1.14μg/gの定量下限(LLOQ)で計算した。それら結果を、表92に示し、μg/g(肝組織)として表している。各々のオリゴヌクレオチドの半減期も、表92に示した。
完全長オリゴヌクレオチドの濃度を測定した。用いられる方法は、従来公表された、フェノール−クロロホルム(液−液)抽出後、固相抽出から成る方法(Leeds et al., 1996; Geary et al., 1999)の修飾である。内部標準(ISIS355868、27マーの2’−O−メトキシエチル修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT、本明細書中においてSEQ ID NO:270と称される)を加えた後、抽出を行った。組織試料濃度は、検量線を用いて、約1.14μg/gの定量下限(LLOQ)で計算した。それら結果を、表92に示し、μg/g(肝組織)として表している。各々のオリゴヌクレオチドの半減期も、表92に示した。
実施例23:Sprague-Dawley ラットにおける、ヒト第XI因子に標的指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドの耐容性
CD1マウスにおいて評価された(実施例21)15種類のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、Sprague-Dawley ラットにおいて、いろいろな代謝マーカーのレベルの変化について更に評価した。
CD1マウスにおいて評価された(実施例21)15種類のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、Sprague-Dawley ラットにおいて、いろいろな代謝マーカーのレベルの変化について更に評価した。
処置
各4匹の Sprague Dawley ラットの群に、50mg/kgのISIS412223、ISIS412224、ISIS412225、ISIS413481、ISIS413482、ISIS416848、ISIS416851、ISIS416852、ISIS416856、ISIS416859、ISIS416860、ISIS416861、ISIS416863、ISIS416866またはISIS416867を、週2回6週間皮下注射した。対照群の4匹の Sprague Dawley ラットに、PBSを週2回6週間皮下注射した。体重測定値を、処置期間の前と期間中に得た。最後の用量後3日に、尿試料を集めた後、ラットを屠殺し、臓器重量を測定し、そして血液を、更なる分析用に集めた。
各4匹の Sprague Dawley ラットの群に、50mg/kgのISIS412223、ISIS412224、ISIS412225、ISIS413481、ISIS413482、ISIS416848、ISIS416851、ISIS416852、ISIS416856、ISIS416859、ISIS416860、ISIS416861、ISIS416863、ISIS416866またはISIS416867を、週2回6週間皮下注射した。対照群の4匹の Sprague Dawley ラットに、PBSを週2回6週間皮下注射した。体重測定値を、処置期間の前と期間中に得た。最後の用量後3日に、尿試料を集めた後、ラットを屠殺し、臓器重量を測定し、そして血液を、更なる分析用に集めた。
体重および臓器重量
ラットの体重を、研究の開始時と、その後週2回測定した。体重は、表93に示し、処置の開始前に得られたPBS対照体重へのグラムでの増加として表されている。肝、脾臓および腎臓重量は、研究の最後に測定したが、それも、表93に、体重の百分率として示されている。PBS対照より上の、肝および脾臓重量の6倍増加しか影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。
ラットの体重を、研究の開始時と、その後週2回測定した。体重は、表93に示し、処置の開始前に得られたPBS対照体重へのグラムでの増加として表されている。肝、脾臓および腎臓重量は、研究の最後に測定したが、それも、表93に、体重の百分率として示されている。PBS対照より上の、肝および脾臓重量の6倍増加しか影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。
肝機能
肝機能へのISISオリゴヌクレオチドの作用を評価するために、トランスアミナーゼの血漿濃度を、自動臨床化学分析器(Hitachi Olympus AU400e,Melville, NY)を用いて測定した。アラニントランスアミナーゼ(ALT)およびアスパラギン酸トランスアミナーゼ(AST)の測定値は、IU/Lで表し、それら結果を、表94に示す。ALT/ASTレベルの、対照レベルの7倍より上の増加に影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。ビリルビンおよびアルブミンの血漿レベルも、同じ臨床化学分析器を用いて測定したが、それら結果も、表94に示し、mg/dLで表している。アンチセンスオリゴヌクレオチド処置により、ビリルビンのレベルの、対照レベルの2倍より大の増加に影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。
肝機能へのISISオリゴヌクレオチドの作用を評価するために、トランスアミナーゼの血漿濃度を、自動臨床化学分析器(Hitachi Olympus AU400e,Melville, NY)を用いて測定した。アラニントランスアミナーゼ(ALT)およびアスパラギン酸トランスアミナーゼ(AST)の測定値は、IU/Lで表し、それら結果を、表94に示す。ALT/ASTレベルの、対照レベルの7倍より上の増加に影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。ビリルビンおよびアルブミンの血漿レベルも、同じ臨床化学分析器を用いて測定したが、それら結果も、表94に示し、mg/dLで表している。アンチセンスオリゴヌクレオチド処置により、ビリルビンのレベルの、対照レベルの2倍より大の増加に影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。
腎機能
腎機能へのISISオリゴヌクレオチドの作用を評価するために、血中尿素窒素(BUN)およびクレアチニンの血漿濃度を、自動臨床化学分析器(Hitachi Olympus AU400e,Melville, NY)を用いて測定した。結果を、表95に示し、mg/dLで表している。BUNレベルの、PBS対照と比較して2倍増加しか影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。アンチセンスオリゴヌクレオチド処置後の全尿タンパク質および全尿試料中の尿タンパク質対クレアチニンの比率を計算したが、それも、表95に示す。尿タンパク質/クレアチニン比の、PBS対照と比較して5倍増加しか影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。
腎機能へのISISオリゴヌクレオチドの作用を評価するために、血中尿素窒素(BUN)およびクレアチニンの血漿濃度を、自動臨床化学分析器(Hitachi Olympus AU400e,Melville, NY)を用いて測定した。結果を、表95に示し、mg/dLで表している。BUNレベルの、PBS対照と比較して2倍増加しか影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。アンチセンスオリゴヌクレオチド処置後の全尿タンパク質および全尿試料中の尿タンパク質対クレアチニンの比率を計算したが、それも、表95に示す。尿タンパク質/クレアチニン比の、PBS対照と比較して5倍増加しか影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。
血液学検定
全てのラット群から得た血液を、ヘマトクリット(HCT)測定、更には、WBC(好中球およびリンパ球)、RBCおよび血小板などのいろいろな血液細胞、並びに全ヘモグロビン含量の測定のために、Antech Diagnostics へ送った。それら結果を、表96および表97に示す。50%より大の血小板計数の低下および3倍より大の単球計数の増加に影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。
全てのラット群から得た血液を、ヘマトクリット(HCT)測定、更には、WBC(好中球およびリンパ球)、RBCおよび血小板などのいろいろな血液細胞、並びに全ヘモグロビン含量の測定のために、Antech Diagnostics へ送った。それら結果を、表96および表97に示す。50%より大の血小板計数の低下および3倍より大の単球計数の増加に影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。
実施例24:Sprague-Dawley ラットの肝および腎臓におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの半減期の測定
Sprague Dawley ラットを、ヒト第XI因子に標的指向するISISアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置し、そしてオリゴヌクレオチド半減期、更には、肝および腎臓からのオリゴヌクレオチドの分解および排除の経過時間を評価した。
Sprague Dawley ラットを、ヒト第XI因子に標的指向するISISアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置し、そしてオリゴヌクレオチド半減期、更には、肝および腎臓からのオリゴヌクレオチドの分解および排除の経過時間を評価した。
処置
各4匹の Sprague Dawley ラットの群に、20mg/kgのISIS412223、ISIS412224、ISIS412225、ISIS413481、ISIS413482、ISIS416848、ISIS416851、ISIS416852、ISIS416856、ISIS416859、ISIS416860、ISIS416861、ISIS416863、ISIS416866またはISIS416867を、週2回2週間皮下注射した。最終用量後3日に、ラットを屠殺し、そして肝および腎臓を採取した。
各4匹の Sprague Dawley ラットの群に、20mg/kgのISIS412223、ISIS412224、ISIS412225、ISIS413481、ISIS413482、ISIS416848、ISIS416851、ISIS416852、ISIS416856、ISIS416859、ISIS416860、ISIS416861、ISIS416863、ISIS416866またはISIS416867を、週2回2週間皮下注射した。最終用量後3日に、ラットを屠殺し、そして肝および腎臓を採取した。
オリゴヌクレオチド濃度の測定
完全長オリゴヌクレオチドの濃度、更には、(分解された形を含めた)全オリゴヌクレオチド濃度を測定した。用いられる方法は、従来公表された、フェノール−クロロホルム(液−液)抽出後、固相抽出から成る方法(Leeds et al., 1996; Geary et al., 1999)の修飾である。内部標準(ISIS355868、27マーの2’−O−メトキシエチル修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT、本明細書中においてSEQ ID NO:270と称される)を加えた後、抽出を行った。組織試料濃度は、検量線を用いて、約1.14μg/gの定量下限(LLOQ)で計算した。それら結果を、表98および表99に示し、μg/g(肝または腎臓組織)として表している。次に、半減期を、WinNonlin ソフトウェア(PHARSIGHT)を用いて計算し、表100に示した。
完全長オリゴヌクレオチドの濃度、更には、(分解された形を含めた)全オリゴヌクレオチド濃度を測定した。用いられる方法は、従来公表された、フェノール−クロロホルム(液−液)抽出後、固相抽出から成る方法(Leeds et al., 1996; Geary et al., 1999)の修飾である。内部標準(ISIS355868、27マーの2’−O−メトキシエチル修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT、本明細書中においてSEQ ID NO:270と称される)を加えた後、抽出を行った。組織試料濃度は、検量線を用いて、約1.14μg/gの定量下限(LLOQ)で計算した。それら結果を、表98および表99に示し、μg/g(肝または腎臓組織)として表している。次に、半減期を、WinNonlin ソフトウェア(PHARSIGHT)を用いて計算し、表100に示した。
実施例25:CD1マウスにおけるヒト第XI因子に標的指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドの耐容性
ヒト第XI因子に標的指向する、6−8−6MOEおよび5−8−5MOEモチーフを有するISISオリゴヌクレオチドを、CD1マウスに投与し、いろいろな代謝マーカーのレベルの変化について評価した。
ヒト第XI因子に標的指向する、6−8−6MOEおよび5−8−5MOEモチーフを有するISISオリゴヌクレオチドを、CD1マウスに投与し、いろいろな代謝マーカーのレベルの変化について評価した。
処置
各5匹のCD1マウスの群に、50mg/kgのISIS416850、ISIS445498、ISIS445503、ISIS445504、ISIS445505、ISIS445509、ISIS445513、ISIS445522、ISIS445530、ISIS445531またはISIS445532を、週2回6週間皮下注射した。対照群の5匹のマウスには、PBSを週2回6週間皮下注射した。体重測定値を、処置期間の前と最後に得た。最後の用量後3日に、マウスを屠殺し、臓器重量を測定し、そして血液を、更なる分析用に集めた。
各5匹のCD1マウスの群に、50mg/kgのISIS416850、ISIS445498、ISIS445503、ISIS445504、ISIS445505、ISIS445509、ISIS445513、ISIS445522、ISIS445530、ISIS445531またはISIS445532を、週2回6週間皮下注射した。対照群の5匹のマウスには、PBSを週2回6週間皮下注射した。体重測定値を、処置期間の前と最後に得た。最後の用量後3日に、マウスを屠殺し、臓器重量を測定し、そして血液を、更なる分析用に集めた。
体重および臓器重量
マウスの体重変化は、表101に示し、処置の開始前に得られたPBS対照体重へのグラムでの増加を表している。肝、脾臓および腎臓重量は、研究の最後に測定したが、それらも、表101に、体重の百分率として示されている。PBS対照より上の、肝および脾臓重量の6倍増加しか影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。
マウスの体重変化は、表101に示し、処置の開始前に得られたPBS対照体重へのグラムでの増加を表している。肝、脾臓および腎臓重量は、研究の最後に測定したが、それらも、表101に、体重の百分率として示されている。PBS対照より上の、肝および脾臓重量の6倍増加しか影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。
肝機能
肝機能へのISISオリゴヌクレオチドの作用を評価するために、トランスアミナーゼの血漿濃度を、自動臨床化学分析器(Hitachi Olympus AU400e,Melville, NY)を用いて測定した。アラニントランスアミナーゼ(ALT)およびアスパラギン酸トランスアミナーゼ(AST)の測定値は、IU/Lで表し、それら結果を、表102に示す。ALT/ASTレベルの、対照レベルの7倍より上の増加に影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。ビリルビンおよびアルブミンの血漿レベルも測定したが、それら結果も、表102に示し、mg/dLで表している。アンチセンスオリゴヌクレオチド処置により、ビリルビンのレベルの、対照レベルの2倍より大の増加に影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。
肝機能へのISISオリゴヌクレオチドの作用を評価するために、トランスアミナーゼの血漿濃度を、自動臨床化学分析器(Hitachi Olympus AU400e,Melville, NY)を用いて測定した。アラニントランスアミナーゼ(ALT)およびアスパラギン酸トランスアミナーゼ(AST)の測定値は、IU/Lで表し、それら結果を、表102に示す。ALT/ASTレベルの、対照レベルの7倍より上の増加に影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。ビリルビンおよびアルブミンの血漿レベルも測定したが、それら結果も、表102に示し、mg/dLで表している。アンチセンスオリゴヌクレオチド処置により、ビリルビンのレベルの、対照レベルの2倍より大の増加に影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。
腎機能
腎機能へのISISオリゴヌクレオチドの作用を評価するために、血中尿素窒素(BUN)の血漿濃度を、自動臨床化学分析器(Hitachi Olympus AU400e,Melville, NY)を用いて測定した。結果は、表103に示し、mg/dLで表している。BUNレベルの、PBS対照と比較して2倍増加しか影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。
腎機能へのISISオリゴヌクレオチドの作用を評価するために、血中尿素窒素(BUN)の血漿濃度を、自動臨床化学分析器(Hitachi Olympus AU400e,Melville, NY)を用いて測定した。結果は、表103に示し、mg/dLで表している。BUNレベルの、PBS対照と比較して2倍増加しか影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。
血液学検定
全てのマウス群から得た血液を、ヘマトクリット(HCT)測定、更には、WBC(好中球およびリンパ球)、RBCおよび血小板などのいろいろな血液細胞、および全ヘモグロビン含量の測定のために、Antech Diagnostics へ送った。それら結果を、表104および表105に示す。50%より大の血小板計数の低下および3倍より大の単球計数の増加に影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。
全てのマウス群から得た血液を、ヘマトクリット(HCT)測定、更には、WBC(好中球およびリンパ球)、RBCおよび血小板などのいろいろな血液細胞、および全ヘモグロビン含量の測定のために、Antech Diagnostics へ送った。それら結果を、表104および表105に示す。50%より大の血小板計数の低下および3倍より大の単球計数の増加に影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。
実施例26:Sprague-Dawley ラットにおける、ヒト第XI因子に標的指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドの耐容性
CD1マウスにおいて評価された(実施例25)8種類のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、Sprague-Dawley ラットにおいて、いろいろな代謝マーカーのレベルの変化について更に評価した。
CD1マウスにおいて評価された(実施例25)8種類のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、Sprague-Dawley ラットにおいて、いろいろな代謝マーカーのレベルの変化について更に評価した。
処置
各4匹の Sprague Dawley ラットの群に、50mg/kgのISIS445498、ISIS445504、ISIS445505、ISIS445509、ISIS445513、ISIS445522、ISIS445530またはISIS445531を、週2回6週間皮下注射した。対照群の Sprague Dawley ラットに、PBSを週2回6週間皮下注射した。体重測定値を、処置期間の前と期間中に得た。最後の用量後3日に、尿試料を集めた後、ラットを屠殺し、臓器重量を測定し、そして血液を、更なる分析用に集めた。
各4匹の Sprague Dawley ラットの群に、50mg/kgのISIS445498、ISIS445504、ISIS445505、ISIS445509、ISIS445513、ISIS445522、ISIS445530またはISIS445531を、週2回6週間皮下注射した。対照群の Sprague Dawley ラットに、PBSを週2回6週間皮下注射した。体重測定値を、処置期間の前と期間中に得た。最後の用量後3日に、尿試料を集めた後、ラットを屠殺し、臓器重量を測定し、そして血液を、更なる分析用に集めた。
体重および臓器重量
ラットの体重を、研究の開始時と、その後週2回測定した。体重は、表106に示し、処置の開始前に得られたPBS対照体重へのグラムでの増加として表されている。肝、脾臓および腎臓重量は、研究の最後に測定したが、それも、表106に、体重の百分率として示されている。PBS対照より上の、肝および脾臓重量の6倍増加しか影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。
ラットの体重を、研究の開始時と、その後週2回測定した。体重は、表106に示し、処置の開始前に得られたPBS対照体重へのグラムでの増加として表されている。肝、脾臓および腎臓重量は、研究の最後に測定したが、それも、表106に、体重の百分率として示されている。PBS対照より上の、肝および脾臓重量の6倍増加しか影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。
肝機能
肝機能へのISISオリゴヌクレオチドの作用を評価するために、トランスアミナーゼの血漿濃度を、自動臨床化学分析器(Hitachi Olympus AU400e,Melville, NY)を用いて測定した。ALT(アラニントランスアミナーゼ)およびAST(アスパラギン酸トランスアミナーゼ)の血漿濃度を測定したが、それら結果は、表107に示し、IU/Lで表している。ALT/ASTレベルの、対照レベルの7倍より上の増加に影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。ビリルビンおよびアルブミンの血漿レベルも、同じ臨床化学分析器を用いて測定した;それら結果を、表107に示し、mg/dLで表している。アンチセンスオリゴヌクレオチド処置により、ビリルビンのレベルの、対照レベルの2倍より大の増加に影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。
肝機能へのISISオリゴヌクレオチドの作用を評価するために、トランスアミナーゼの血漿濃度を、自動臨床化学分析器(Hitachi Olympus AU400e,Melville, NY)を用いて測定した。ALT(アラニントランスアミナーゼ)およびAST(アスパラギン酸トランスアミナーゼ)の血漿濃度を測定したが、それら結果は、表107に示し、IU/Lで表している。ALT/ASTレベルの、対照レベルの7倍より上の増加に影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。ビリルビンおよびアルブミンの血漿レベルも、同じ臨床化学分析器を用いて測定した;それら結果を、表107に示し、mg/dLで表している。アンチセンスオリゴヌクレオチド処置により、ビリルビンのレベルの、対照レベルの2倍より大の増加に影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。
腎機能
腎機能へのISISオリゴヌクレオチドの作用を評価するために、血中尿素窒素(BUN)およびクレアチニンの血漿濃度を、自動臨床化学分析器(Hitachi Olympus AU400e,Melville, NY)を用いて測定した。結果を、表108に示し、mg/dLで表している。BUNレベルの、PBS対照と比較して2倍増加しか影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。アンチセンスオリゴヌクレオチド処置後の全尿タンパク質および全尿試料中の尿タンパク質対クレアチニンの比率を計算したが、それも、表108に示す。尿タンパク質/クレアチニン比の、PBS対照と比較して5倍増加しか影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。
腎機能へのISISオリゴヌクレオチドの作用を評価するために、血中尿素窒素(BUN)およびクレアチニンの血漿濃度を、自動臨床化学分析器(Hitachi Olympus AU400e,Melville, NY)を用いて測定した。結果を、表108に示し、mg/dLで表している。BUNレベルの、PBS対照と比較して2倍増加しか影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。アンチセンスオリゴヌクレオチド処置後の全尿タンパク質および全尿試料中の尿タンパク質対クレアチニンの比率を計算したが、それも、表108に示す。尿タンパク質/クレアチニン比の、PBS対照と比較して5倍増加しか影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。
血液学検定
全てのラット群から得た血液を、ヘマトクリット(HCT)測定、更には、WBC(好中球、リンパ球および単球)、RBCおよび血小板などのいろいろな血液細胞、および全ヘモグロビン含量の測定のために、Antech Diagnostics へ送った。それら結果を、表109および表110に示す。50%より大の血小板計数の低下および3倍より大の単球計数の増加に影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。
全てのラット群から得た血液を、ヘマトクリット(HCT)測定、更には、WBC(好中球、リンパ球および単球)、RBCおよび血小板などのいろいろな血液細胞、および全ヘモグロビン含量の測定のために、Antech Diagnostics へ送った。それら結果を、表109および表110に示す。50%より大の血小板計数の低下および3倍より大の単球計数の増加に影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。
実施例27:CD1マウスにおけるヒト第XI因子に標的指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドの耐容性
ヒト第XI因子に標的指向する、4−8−4MOE、3−8−3MOE、2−10−2MOE、3−10−3MOEおよび4−10−4MOEモチーフを有するISISオリゴヌクレオチドを、CD1マウスに投与し、いろいろな代謝マーカーのレベルの変化について評価した。
ヒト第XI因子に標的指向する、4−8−4MOE、3−8−3MOE、2−10−2MOE、3−10−3MOEおよび4−10−4MOEモチーフを有するISISオリゴヌクレオチドを、CD1マウスに投与し、いろいろな代謝マーカーのレベルの変化について評価した。
処置
各5匹のCD1マウスの群に、50mg/kgのISIS449707、ISIS449708、ISIS449409、ISIS449710またはISIS449711を、週2回6週間皮下注射した。対照群の5匹のマウスには、PBSを週2回6週間皮下注射した。体重測定値を、処置期間の前と最後に得た。最後の用量後3日に、マウスを屠殺し、臓器重量を測定し、そして血液を、更なる分析用に集めた。
各5匹のCD1マウスの群に、50mg/kgのISIS449707、ISIS449708、ISIS449409、ISIS449710またはISIS449711を、週2回6週間皮下注射した。対照群の5匹のマウスには、PBSを週2回6週間皮下注射した。体重測定値を、処置期間の前と最後に得た。最後の用量後3日に、マウスを屠殺し、臓器重量を測定し、そして血液を、更なる分析用に集めた。
体重および臓器重量
研究の最後に得られたマウスの体重を、表111に示し、グラムで表している。肝、脾臓および腎臓重量も、研究の最後に測定したが、それらも、表111に、体重の百分率として示されている。PBS対照より上の、肝および脾臓重量の6倍増加しか影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。
研究の最後に得られたマウスの体重を、表111に示し、グラムで表している。肝、脾臓および腎臓重量も、研究の最後に測定したが、それらも、表111に、体重の百分率として示されている。PBS対照より上の、肝および脾臓重量の6倍増加しか影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。
肝機能
肝機能へのISISオリゴヌクレオチドの作用を評価するために、トランスアミナーゼの血漿濃度を、自動臨床化学分析器(Hitachi Olympus AU400e,Melville, NY)を用いて測定した。ALT(アラニントランスアミナーゼ)およびAST(アスパラギン酸トランスアミナーゼ)の血漿濃度を測定したが、それら結果は、表112に示し、IU/Lで表している。ALT/ASTレベルの、対照レベルの7倍より上の増加に影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。ビリルビンおよびアルブミンの血漿レベルも、同じ臨床化学分析器を用いて測定したが、結果を表112に示し、mg/dLで表している。アンチセンスオリゴヌクレオチド処置により、ビリルビンのレベルの、対照レベルの2倍より大の増加に影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。
肝機能へのISISオリゴヌクレオチドの作用を評価するために、トランスアミナーゼの血漿濃度を、自動臨床化学分析器(Hitachi Olympus AU400e,Melville, NY)を用いて測定した。ALT(アラニントランスアミナーゼ)およびAST(アスパラギン酸トランスアミナーゼ)の血漿濃度を測定したが、それら結果は、表112に示し、IU/Lで表している。ALT/ASTレベルの、対照レベルの7倍より上の増加に影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。ビリルビンおよびアルブミンの血漿レベルも、同じ臨床化学分析器を用いて測定したが、結果を表112に示し、mg/dLで表している。アンチセンスオリゴヌクレオチド処置により、ビリルビンのレベルの、対照レベルの2倍より大の増加に影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。
腎機能
腎機能へのISISオリゴヌクレオチドの作用を評価するために、血中尿素窒素(BUN)およびクレアチニンの血漿濃度を、自動臨床化学分析器(Hitachi Olympus AU400e,Melville, NY)を用いて測定した。結果は、表113に示し、mg/dLで表している。BUNレベルの、PBS対照と比較して2倍増加しか影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。
腎機能へのISISオリゴヌクレオチドの作用を評価するために、血中尿素窒素(BUN)およびクレアチニンの血漿濃度を、自動臨床化学分析器(Hitachi Olympus AU400e,Melville, NY)を用いて測定した。結果は、表113に示し、mg/dLで表している。BUNレベルの、PBS対照と比較して2倍増加しか影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。
血液学検定
全てのマウス群から得た血液を、ヘマトクリット(HCT)測定、更には、WBC(好中球、リンパ球および単球)、RBCおよび血小板などのいろいろな血液細胞、および全ヘモグロビン含量の測定のために、Antech Diagnostics へ送った。それら結果を、表114および表115に示す。50%より大の血小板計数の低下および3倍より大の単球計数の増加に影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。
全てのマウス群から得た血液を、ヘマトクリット(HCT)測定、更には、WBC(好中球、リンパ球および単球)、RBCおよび血小板などのいろいろな血液細胞、および全ヘモグロビン含量の測定のために、Antech Diagnostics へ送った。それら結果を、表114および表115に示す。50%より大の血小板計数の低下および3倍より大の単球計数の増加に影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。
実施例28:Sprague-Dawley ラットにおける、ヒト第XI因子に標的指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドの耐容性
CD1マウスにおいて評価された(実施例27)5種類のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、Sprague-Dawley ラットにおいて、いろいろな代謝マーカーのレベルの変化について更に評価した。
CD1マウスにおいて評価された(実施例27)5種類のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、Sprague-Dawley ラットにおいて、いろいろな代謝マーカーのレベルの変化について更に評価した。
処置
各4匹の Sprague Dawley ラットの群に、50mg/kgのISIS449707、ISIS449708、ISIS449709、ISIS449710またはISIS449711を、週2回6週間皮下注射した。対照群の4匹の Sprague Dawley ラットに、PBSを週2回6週間皮下注射した。体重測定値を、処置期間の前と期間中に得た。最後の用量後3日に、尿試料を集めた後、ラットを屠殺し、臓器重量を測定し、そして血液を、更なる分析用に集めた。
各4匹の Sprague Dawley ラットの群に、50mg/kgのISIS449707、ISIS449708、ISIS449709、ISIS449710またはISIS449711を、週2回6週間皮下注射した。対照群の4匹の Sprague Dawley ラットに、PBSを週2回6週間皮下注射した。体重測定値を、処置期間の前と期間中に得た。最後の用量後3日に、尿試料を集めた後、ラットを屠殺し、臓器重量を測定し、そして血液を、更なる分析用に集めた。
体重および臓器重量
ラットの体重を、研究の開始時および研究の最後に測定した。体重変化を、表116に示し、処置の開始前に得られたPBS対照体重へのグラムでの増加として表している。肝、脾臓および腎臓重量は、研究の最後に測定したが、それも、表116に、体重の百分率として示している。PBS対照より上の、肝および脾臓重量の6倍増加しか影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。
ラットの体重を、研究の開始時および研究の最後に測定した。体重変化を、表116に示し、処置の開始前に得られたPBS対照体重へのグラムでの増加として表している。肝、脾臓および腎臓重量は、研究の最後に測定したが、それも、表116に、体重の百分率として示している。PBS対照より上の、肝および脾臓重量の6倍増加しか影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。
肝機能
肝機能へのISISオリゴヌクレオチドの作用を評価するために、ALTおよびASTの血漿濃度を、自動臨床化学分析器(Hitachi Olympus AU400e,Melville, NY)を用いて測定した。アラニントランスアミナーゼ(ALT)およびアスパラギン酸トランスアミナーゼ(AST)の血漿濃度を測定したが、それら結果は、表117に示し、IU/Lで表している。ALT/ASTレベルの、対照レベルの7倍より上の増加に影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。ビリルビンおよびアルブミンの血漿レベルも測定したが、結果は、表117に示し、mg/dLで表している。アンチセンスオリゴヌクレオチド処置により、ビリルビンのレベルの、対照レベルの2倍より大の増加に影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。
肝機能へのISISオリゴヌクレオチドの作用を評価するために、ALTおよびASTの血漿濃度を、自動臨床化学分析器(Hitachi Olympus AU400e,Melville, NY)を用いて測定した。アラニントランスアミナーゼ(ALT)およびアスパラギン酸トランスアミナーゼ(AST)の血漿濃度を測定したが、それら結果は、表117に示し、IU/Lで表している。ALT/ASTレベルの、対照レベルの7倍より上の増加に影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。ビリルビンおよびアルブミンの血漿レベルも測定したが、結果は、表117に示し、mg/dLで表している。アンチセンスオリゴヌクレオチド処置により、ビリルビンのレベルの、対照レベルの2倍より大の増加に影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。
腎機能
腎機能へのISISオリゴヌクレオチドの影響を評価するために、BUNおよびクレアチニンの血漿濃度を、自動臨床化学分析器(Hitachi Olympus AU400e,Melville, NY)を用いて測定した。結果を、表118に示し、mg/dLで表している。BUNレベルの、PBS対照と比較して2倍増加しか影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。アンチセンスオリゴヌクレオチド処置後の全尿タンパク質および全尿試料中の尿タンパク質対クレアチニンの比率を計算したが、それも、表118に示す。尿タンパク質/クレアチニン比の、PBS対照と比較して5倍増加しか影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。
腎機能へのISISオリゴヌクレオチドの影響を評価するために、BUNおよびクレアチニンの血漿濃度を、自動臨床化学分析器(Hitachi Olympus AU400e,Melville, NY)を用いて測定した。結果を、表118に示し、mg/dLで表している。BUNレベルの、PBS対照と比較して2倍増加しか影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。アンチセンスオリゴヌクレオチド処置後の全尿タンパク質および全尿試料中の尿タンパク質対クレアチニンの比率を計算したが、それも、表118に示す。尿タンパク質/クレアチニン比の、PBS対照と比較して5倍増加しか影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。
血液学検定
全てのラット群から得た血液を、ヘマトクリット(HCT)測定、更には、WBC(好中球、リンパ球および単球)、RBCおよび血小板などのいろいろな血液細胞、および全ヘモグロビン含量の測定のために、Antech Diagnostics へ送った。それら結果を、表119および表120に示す。50%より大の血小板計数の低下および3倍より大の単球計数の増加に影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。
全てのラット群から得た血液を、ヘマトクリット(HCT)測定、更には、WBC(好中球、リンパ球および単球)、RBCおよび血小板などのいろいろな血液細胞、および全ヘモグロビン含量の測定のために、Antech Diagnostics へ送った。それら結果を、表119および表120に示す。50%より大の血小板計数の低下および3倍より大の単球計数の増加に影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。
実施例29:カニクイザルにおける、ヒト第XI因子に標的指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドの用量依存性薬理作用
いくつかのアンチセンスオリゴヌクレオチドを、カニクイザルにおいて調べて、第XI因子活性、抗凝固および出血時間、肝および腎臓分布、および耐容性へのそれらオリゴヌクレオチドの薬理作用を決定した。この研究に用いられたISISオリゴヌクレオチドは全て、ヒト第XI因子mRNAに標的指向し、そして更に、アカゲザル遺伝子配列と完全に交差反応性である(表51を参照されたい)。アカゲザルISISオリゴヌクレオチドは、更に、カニクイザル遺伝子配列と完全に交差反応性であると考えられる。研究を行った時点で、カニクイザルゲノム配列は、National Center for Biotechnology Information(NCBI)データベースで利用不能であった;したがって、カニクイザル遺伝子配列との交差反応性は、確かめることができなかった。
いくつかのアンチセンスオリゴヌクレオチドを、カニクイザルにおいて調べて、第XI因子活性、抗凝固および出血時間、肝および腎臓分布、および耐容性へのそれらオリゴヌクレオチドの薬理作用を決定した。この研究に用いられたISISオリゴヌクレオチドは全て、ヒト第XI因子mRNAに標的指向し、そして更に、アカゲザル遺伝子配列と完全に交差反応性である(表51を参照されたい)。アカゲザルISISオリゴヌクレオチドは、更に、カニクイザル遺伝子配列と完全に交差反応性であると考えられる。研究を行った時点で、カニクイザルゲノム配列は、National Center for Biotechnology Information(NCBI)データベースで利用不能であった;したがって、カニクイザル遺伝子配列との交差反応性は、確かめることができなかった。
処置
各々、2頭の雄サルおよび3頭の雌サルから成る群に、ISIS416838、ISIS416850、ISIS416858、ISIS416864またはISIS417002を、段階的増加用量で皮下注射した。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、それらサルに、5mg/kgで週3回を1週目;5mg/kgで週2回を2週目および3週目;10mg/kgで週3回を4週目;10mg/kgで週2回を5週目および6週目;25mg/kgで週3回を7週目;そして25mg/kgで週2回を8週目、9週目、10週目、11週目および12週目に投与した。2頭の雄サルおよび3頭の雌サルから成る一つの対照群に、同じ投与計画にしたがってPBSを皮下注射した。2頭の雄サルおよび3頭の雌サルから成る追加の実験群に、ISIS416850を、長期の一層低用量の計画で皮下注射した。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、それらサルに、5mg/kgで週3回を1週目;5mg/kgで週2回を2週目および3週目;10mg/kgで週3回を4週目;そして10mg/kgで週2回を5〜12週目に投与した。体重は、毎週測定した。血液試料は、血漿中の第XI因子タンパク質活性分析およびいろいろな血液学的因子の測定のために、処置の開始前14日および5日と、その後週1回集めた。85日目に、それらサルを、深麻酔下の間に全採血によって安楽死させ、そして臓器を、更なる分析用に採取した。
各々、2頭の雄サルおよび3頭の雌サルから成る群に、ISIS416838、ISIS416850、ISIS416858、ISIS416864またはISIS417002を、段階的増加用量で皮下注射した。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、それらサルに、5mg/kgで週3回を1週目;5mg/kgで週2回を2週目および3週目;10mg/kgで週3回を4週目;10mg/kgで週2回を5週目および6週目;25mg/kgで週3回を7週目;そして25mg/kgで週2回を8週目、9週目、10週目、11週目および12週目に投与した。2頭の雄サルおよび3頭の雌サルから成る一つの対照群に、同じ投与計画にしたがってPBSを皮下注射した。2頭の雄サルおよび3頭の雌サルから成る追加の実験群に、ISIS416850を、長期の一層低用量の計画で皮下注射した。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、それらサルに、5mg/kgで週3回を1週目;5mg/kgで週2回を2週目および3週目;10mg/kgで週3回を4週目;そして10mg/kgで週2回を5〜12週目に投与した。体重は、毎週測定した。血液試料は、血漿中の第XI因子タンパク質活性分析およびいろいろな血液学的因子の測定のために、処置の開始前14日および5日と、その後週1回集めた。85日目に、それらサルを、深麻酔下の間に全採血によって安楽死させ、そして臓器を、更なる分析用に採取した。
RNA分析
85日目に、RNAを、プライマー・プローブセットLTS00301(正プライマー配列ACACGCATTAAAAAGAGCAAAGC、本明細書中においてSEQ ID NO 271と称される;逆プライマー配列CAGTGTCATGGTAAAATGAAGAATGG、本明細書中においてSEQ ID NO:272と称される;およびプローブ配列TGCAGGCACAGCATCCCAGTGTTCTX、ここにおいて、Xは、発蛍光団(fluorphore)であり、本明細書中においてSEQ ID NO.273と称される)を用いた第XI因子のリアルタイムPCR分析用に、肝組織から抽出した。結果を、PBS対照に相対する第XI因子の阻害パーセントとして示す。表121に示されるように、ISISオリゴヌクレオチドでの処置は、PBS対照に比較して、第XI因子mRNAの有意の減少を引き起こした。
85日目に、RNAを、プライマー・プローブセットLTS00301(正プライマー配列ACACGCATTAAAAAGAGCAAAGC、本明細書中においてSEQ ID NO 271と称される;逆プライマー配列CAGTGTCATGGTAAAATGAAGAATGG、本明細書中においてSEQ ID NO:272と称される;およびプローブ配列TGCAGGCACAGCATCCCAGTGTTCTX、ここにおいて、Xは、発蛍光団(fluorphore)であり、本明細書中においてSEQ ID NO.273と称される)を用いた第XI因子のリアルタイムPCR分析用に、肝組織から抽出した。結果を、PBS対照に相対する第XI因子の阻害パーセントとして示す。表121に示されるように、ISISオリゴヌクレオチドでの処置は、PBS対照に比較して、第XI因子mRNAの有意の減少を引き起こした。
タンパク質分析
異なった日数で得られた全てのサル群からの血漿試料を、サンドイッチ型ELISA検定(Affinity Biologicals Inc.)により、アフィニティー精製した多クローン性抗第XI因子抗体を捕捉抗体としておよびペルオキシダーゼ結合多クローン性抗第XI因子抗体を検出用抗体として用いて分析した。サル血漿は、検定用に1:50希釈した。ペルオキシダーゼ活性は、基質o−フェニレンジアミンとのインキュベーションによって表した。生じた色は、ミクロプレートリーダーを用いて490nmで定量したが、試料中の第XI因子の濃度に比例すると考えられた。
異なった日数で得られた全てのサル群からの血漿試料を、サンドイッチ型ELISA検定(Affinity Biologicals Inc.)により、アフィニティー精製した多クローン性抗第XI因子抗体を捕捉抗体としておよびペルオキシダーゼ結合多クローン性抗第XI因子抗体を検出用抗体として用いて分析した。サル血漿は、検定用に1:50希釈した。ペルオキシダーゼ活性は、基質o−フェニレンジアミンとのインキュベーションによって表した。生じた色は、ミクロプレートリーダーを用いて490nmで定量したが、試料中の第XI因子の濃度に比例すると考えられた。
それら結果を、表122に示し、PBS対照の場合に相対する減少百分率として表している。ISIS416850およびISIS416858での処置は、タンパク質レベルの時間依存性低下を引き起こした。
体重および臓器重量
体重は、投与計画中に週1回得た。各々の群の測定値を、表123に、グラムで表して与える。それら結果は、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処置が、PBS対照と比較して有意の体重変化を引き起こしたかもしれない被験動物の健康状態に不都合な変化を全く引き起こさなかったということを示している。臓器重量は、被験動物を安楽死させた後に得たが、肝、腎臓および脾臓を採取し且つ秤量した。それら結果は、表124に示すが、脾臓重量の増加を示しているISIS416858の場合を除いて、PBS対照と比較して有意の体重変化がないことも示している。長期投与計画で与えられたISISオリゴヌクレオチドであるISIS416850は、星印(*)で、他のオリゴヌクレオチドと区別している。
体重は、投与計画中に週1回得た。各々の群の測定値を、表123に、グラムで表して与える。それら結果は、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処置が、PBS対照と比較して有意の体重変化を引き起こしたかもしれない被験動物の健康状態に不都合な変化を全く引き起こさなかったということを示している。臓器重量は、被験動物を安楽死させた後に得たが、肝、腎臓および脾臓を採取し且つ秤量した。それら結果は、表124に示すが、脾臓重量の増加を示しているISIS416858の場合を除いて、PBS対照と比較して有意の体重変化がないことも示している。長期投与計画で与えられたISISオリゴヌクレオチドであるISIS416850は、星印(*)で、他のオリゴヌクレオチドと区別している。
肝機能
肝機能へのISISオリゴヌクレオチドの影響を評価するために、トランスアミナーゼの血漿濃度を、自動臨床化学分析器(Hitachi Olympus AU400e,Melville, NY)を用いて測定した。ALT(アラニントランスアミナーゼ)およびAST(アスパラギン酸トランスアミナーゼ)の血漿濃度を測定したが、それら結果は、表125および表126に示し、IU/Lで表している。ALT/ASTレベルの、対照レベルの7倍より上の増加に影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。ビリルビンの血漿レベルも測定したが、結果を表127に示し、mg/dLで表している。アンチセンスオリゴヌクレオチド処置により、ビリルビンのレベルの、対照レベルの2倍より大の増加に影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。長期投与計画で与えられたISISオリゴヌクレオチドであるISIS416850は、星印(*)で、他のオリゴヌクレオチドと区別している。
肝機能へのISISオリゴヌクレオチドの影響を評価するために、トランスアミナーゼの血漿濃度を、自動臨床化学分析器(Hitachi Olympus AU400e,Melville, NY)を用いて測定した。ALT(アラニントランスアミナーゼ)およびAST(アスパラギン酸トランスアミナーゼ)の血漿濃度を測定したが、それら結果は、表125および表126に示し、IU/Lで表している。ALT/ASTレベルの、対照レベルの7倍より上の増加に影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。ビリルビンの血漿レベルも測定したが、結果を表127に示し、mg/dLで表している。アンチセンスオリゴヌクレオチド処置により、ビリルビンのレベルの、対照レベルの2倍より大の増加に影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。長期投与計画で与えられたISISオリゴヌクレオチドであるISIS416850は、星印(*)で、他のオリゴヌクレオチドと区別している。
腎機能
腎機能へのISISオリゴヌクレオチドの影響を評価するために、尿試料を集めた。アンチセンスオリゴヌクレオチド処置後の尿試料中の尿タンパク質対クレアチニンの比率を計算したが、表128に示している。PBS対照と比較して、尿タンパク質/クレアチニン比の5倍増加しか影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。
腎機能へのISISオリゴヌクレオチドの影響を評価するために、尿試料を集めた。アンチセンスオリゴヌクレオチド処置後の尿試料中の尿タンパク質対クレアチニンの比率を計算したが、表128に示している。PBS対照と比較して、尿タンパク質/クレアチニン比の5倍増加しか影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。
オリゴヌクレオチド濃度の測定
完全長オリゴヌクレオチドの濃度、更には、肝および腎臓からのオリゴヌクレオチドの分解および排除の経過時間を評価した。用いられる方法は、従来公表された、フェノール−クロロホルム(液−液)抽出後、固相抽出から成る方法(Leeds et al., 1996; Geary et al., 1999)の修飾である。内部標準(ISIS355868、27マーの2’−O−メトキシエチル修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT、本明細書中においてSEQ ID NO:270と称される)を加えた後、抽出を行った。組織試料濃度は、検量線を用いて、約1.14μg/gの定量下限(LLOQ)で計算した。次に、半減期を、WinNonlin ソフトウェア(PHARSIGHT)を用いて計算した。それら結果を、表129および表130に示し、μg/g(肝または腎臓組織)として表している。
完全長オリゴヌクレオチドの濃度、更には、肝および腎臓からのオリゴヌクレオチドの分解および排除の経過時間を評価した。用いられる方法は、従来公表された、フェノール−クロロホルム(液−液)抽出後、固相抽出から成る方法(Leeds et al., 1996; Geary et al., 1999)の修飾である。内部標準(ISIS355868、27マーの2’−O−メトキシエチル修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT、本明細書中においてSEQ ID NO:270と称される)を加えた後、抽出を行った。組織試料濃度は、検量線を用いて、約1.14μg/gの定量下限(LLOQ)で計算した。次に、半減期を、WinNonlin ソフトウェア(PHARSIGHT)を用いて計算した。それら結果を、表129および表130に示し、μg/g(肝または腎臓組織)として表している。
血液学検定
全てのサル群から得た血液を、HCT、MCV、MCHおよびMCHC分析、更には、WBC(好中球、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球、網状赤血球)、RBC、血小板などのいろいろな血液細胞、および全ヘモグロビン含量の測定のために、Korea Institute of Toxicology(KIT)へ送った。それら結果を、表131〜144に示す。50%より大の血小板計数の低下および3倍より大の単球計数の増加に影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。長期投与計画で与えられたISISオリゴヌクレオチドであるISIS416850は、星印(*)で、他のオリゴヌクレオチドと区別している。
全てのサル群から得た血液を、HCT、MCV、MCHおよびMCHC分析、更には、WBC(好中球、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球、網状赤血球)、RBC、血小板などのいろいろな血液細胞、および全ヘモグロビン含量の測定のために、Korea Institute of Toxicology(KIT)へ送った。それら結果を、表131〜144に示す。50%より大の血小板計数の低下および3倍より大の単球計数の増加に影響を与えなかったそれらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更なる研究用に選択した。長期投与計画で与えられたISISオリゴヌクレオチドであるISIS416850は、星印(*)で、他のオリゴヌクレオチドと区別している。
サイトカインおよびケモカイン検定
段階的増加投与計画で投与されたPBS、ISIS416850およびISIS416858で処置されたサル群から得た血液試料を、ケモカインおよびサイトカインのレベルの測定のために、Pierce Biotechnology(Woburn, MA)へ送った。IL−1β、IL−6、IFN−γおよびTNF−αのレベルを、それぞれの霊長類抗体を用いて測定し、そしてIL−8、MIP−1α、MCP−1、MIP−1βおよびRANTESのレベルを、それぞれの交差反応性ヒト抗体を用いて測定した。測定値は、処置の開始前14日と、それらサルを安楽死させた85日目に得た。それら結果を、表145および表146に示す。
段階的増加投与計画で投与されたPBS、ISIS416850およびISIS416858で処置されたサル群から得た血液試料を、ケモカインおよびサイトカインのレベルの測定のために、Pierce Biotechnology(Woburn, MA)へ送った。IL−1β、IL−6、IFN−γおよびTNF−αのレベルを、それぞれの霊長類抗体を用いて測定し、そしてIL−8、MIP−1α、MCP−1、MIP−1βおよびRANTESのレベルを、それぞれの交差反応性ヒト抗体を用いて測定した。測定値は、処置の開始前14日と、それらサルを安楽死させた85日目に得た。それら結果を、表145および表146に示す。
実施例30:カニクイザルにおける、ヒト第XI因子に標的指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドの薬理作用
齧歯類動物耐容性研究(実施例25〜28)より選択されたいくつかのアンチセンスオリゴヌクレオチドを、カニクイザルにおいて調べて、それらの薬理作用、第XI因子活性への相対効力、およびカニクイザルモデルにおける耐容性を決定した。それらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更に、前の方に記載したサル研究(実施例29)より選択されたISIS416850およびISIS416858と比較した。この研究に用いられたISISオリゴヌクレオチドは全て、ヒト第XI因子mRNAに標的指向し、そして更に、アカゲザル遺伝子配列と完全に交差反応性である(表51および表53を参照されたい)。アカゲザルISISオリゴヌクレオチドは、更に、カニクイザル遺伝子配列と完全に交差反応性であると考えられる。研究を行った時点で、カニクイザルゲノム配列は、National Center for Biotechnology Information(NCBI)データベースで利用不能であった;したがって、カニクイザル遺伝子配列との交差反応性は、確かめることができなかった。
齧歯類動物耐容性研究(実施例25〜28)より選択されたいくつかのアンチセンスオリゴヌクレオチドを、カニクイザルにおいて調べて、それらの薬理作用、第XI因子活性への相対効力、およびカニクイザルモデルにおける耐容性を決定した。それらアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更に、前の方に記載したサル研究(実施例29)より選択されたISIS416850およびISIS416858と比較した。この研究に用いられたISISオリゴヌクレオチドは全て、ヒト第XI因子mRNAに標的指向し、そして更に、アカゲザル遺伝子配列と完全に交差反応性である(表51および表53を参照されたい)。アカゲザルISISオリゴヌクレオチドは、更に、カニクイザル遺伝子配列と完全に交差反応性であると考えられる。研究を行った時点で、カニクイザルゲノム配列は、National Center for Biotechnology Information(NCBI)データベースで利用不能であった;したがって、カニクイザル遺伝子配列との交差反応性は、確かめることができなかった。
処置
各々、2頭の雄サルおよび2頭の雌サルから成る群に、25mg/kgのISIS416850、ISIS449709、ISIS445522、ISIS449710、ISIS449707、ISIS449711、ISIS449708、416858およびISIS445531を皮下注射した。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、それらサルに、25mg/kgで週3回を1週目に、そして25mg/kgで週2回2〜8週目に投与した。2頭の雄サルおよび2頭の雌サルから成る対照群に、同じ投与計画にしたがってPBSを皮下注射した。体重は、処置の開始前14日および7日に得た後、処置期間中に毎週測定した。血液試料は、いろいろな血液学的因子の測定のために、処置の開始前14日および5日と、その後、投与計画中に数回集めた。55日目に、それらサルを、深麻酔下の間に全採血によって安楽死させ、そして臓器を、更なる分析用に採取した。
各々、2頭の雄サルおよび2頭の雌サルから成る群に、25mg/kgのISIS416850、ISIS449709、ISIS445522、ISIS449710、ISIS449707、ISIS449711、ISIS449708、416858およびISIS445531を皮下注射した。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、それらサルに、25mg/kgで週3回を1週目に、そして25mg/kgで週2回2〜8週目に投与した。2頭の雄サルおよび2頭の雌サルから成る対照群に、同じ投与計画にしたがってPBSを皮下注射した。体重は、処置の開始前14日および7日に得た後、処置期間中に毎週測定した。血液試料は、いろいろな血液学的因子の測定のために、処置の開始前14日および5日と、その後、投与計画中に数回集めた。55日目に、それらサルを、深麻酔下の間に全採血によって安楽死させ、そして臓器を、更なる分析用に採取した。
RNA分析
55日目に、RNAを、プライマー・プローブセットLTS00301を用いた第XI因子のリアルタイムPCR分析用に、肝組織から抽出した。結果を、PBS対照に相対する第XI因子の阻害パーセントとして示す。表147に示されるように、ISIS416850、ISIS449709、ISIS445522、ISIS449710、ISIS449707、ISIS449708、ISIS416858およびISIS445531での処置は、PBS対照に比較して、第XI因子mRNAの有意の減少を引き起こした。
55日目に、RNAを、プライマー・プローブセットLTS00301を用いた第XI因子のリアルタイムPCR分析用に、肝組織から抽出した。結果を、PBS対照に相対する第XI因子の阻害パーセントとして示す。表147に示されるように、ISIS416850、ISIS449709、ISIS445522、ISIS449710、ISIS449707、ISIS449708、ISIS416858およびISIS445531での処置は、PBS対照に比較して、第XI因子mRNAの有意の減少を引き起こした。
タンパク質分析
異なった日に得られた全てのサル群からの血漿試料を、サンドイッチ型ELISA検定(Affinity Biologicals Inc.)により、アフィニティー精製した多クローン性抗第XI因子抗体を捕捉抗体としておよびペルオキシダーゼ結合多クローン性抗第XI因子抗体を検出用抗体として用いて分析した。サル血漿は、検定用に1:50希釈した。ペルオキシダーゼ活性は、基質o−フェニレンジアミンとのインキュベーションによって表した。生じた色は、ミクロプレートリーダーを用いて490nmで定量したが、試料中の第XI因子の濃度に比例すると考えられた。
異なった日に得られた全てのサル群からの血漿試料を、サンドイッチ型ELISA検定(Affinity Biologicals Inc.)により、アフィニティー精製した多クローン性抗第XI因子抗体を捕捉抗体としておよびペルオキシダーゼ結合多クローン性抗第XI因子抗体を検出用抗体として用いて分析した。サル血漿は、検定用に1:50希釈した。ペルオキシダーゼ活性は、基質o−フェニレンジアミンとのインキュベーションによって表した。生じた色は、ミクロプレートリーダーを用いて490nmで定量したが、試料中の第XI因子の濃度に比例すると考えられた。
それら結果を、表148に示し、PBS対照の場合に相対する減少百分率として表している。ISIS416850、ISIS449709、ISIS445522およびISIS416858での処置は、タンパク質レベルの時間依存性低下を引き起こした。
体重および臓器重量
各々の群の体重を、表149に、グラムで表して与える。それら結果は、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処置が、PBS対照と比較して有意の体重変化を引き起こしたかもしれない被験動物の健康状態に不都合な変化を全く引き起こさなかったということを示している。臓器重量は、55日目に被験動物を安楽死させた後に得たが、肝、腎臓および脾臓を採取した。それら結果は、表150に示し、体重の百分率として表し、そして更に、脾臓重量の増加を引き起こしたISIS449711を除いて、PBS対照と比較して有意の体重変化がないことも示している。
各々の群の体重を、表149に、グラムで表して与える。それら結果は、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処置が、PBS対照と比較して有意の体重変化を引き起こしたかもしれない被験動物の健康状態に不都合な変化を全く引き起こさなかったということを示している。臓器重量は、55日目に被験動物を安楽死させた後に得たが、肝、腎臓および脾臓を採取した。それら結果は、表150に示し、体重の百分率として表し、そして更に、脾臓重量の増加を引き起こしたISIS449711を除いて、PBS対照と比較して有意の体重変化がないことも示している。
肝機能
肝機能へのISISオリゴヌクレオチドの影響を評価するために、ALTおよびASTの血漿濃度を、自動臨床化学分析器(Hitachi Olympus AU400e,Melville, NY)を用いて測定した。アラニントランスアミナーゼ(ALT)およびアスパラギン酸トランスアミナーゼ(AST)の血漿濃度を測定したが、それら結果は、表151および表152に示し、IU/Lで表している。ビリルビンの血漿レベルも測定したが、結果を表153に示し、mg/dLで表している。表151〜153で認められるように、アンチセンスオリゴヌクレオチド処置後のいずれの肝代謝マーカーにも有意の増加は存在しなかった。
肝機能へのISISオリゴヌクレオチドの影響を評価するために、ALTおよびASTの血漿濃度を、自動臨床化学分析器(Hitachi Olympus AU400e,Melville, NY)を用いて測定した。アラニントランスアミナーゼ(ALT)およびアスパラギン酸トランスアミナーゼ(AST)の血漿濃度を測定したが、それら結果は、表151および表152に示し、IU/Lで表している。ビリルビンの血漿レベルも測定したが、結果を表153に示し、mg/dLで表している。表151〜153で認められるように、アンチセンスオリゴヌクレオチド処置後のいずれの肝代謝マーカーにも有意の増加は存在しなかった。
腎機能
腎機能へのISISオリゴヌクレオチドの影響を評価するために、尿試料を、異なった日に集めた。BUNレベルを、いろいろな時点で、自動臨床化学分析器(Hitachi Olympus AU400e,Melville, NY)を用いて測定したが、それら結果は、表154に示す。アンチセンスオリゴヌクレオチド処置後の尿試料中の尿タンパク質対クレアチニンの比率も、49日目に計算したが、結果は、表155に示す。表154および表155で認められるように、アンチセンスオリゴヌクレオチド処置後のいずれの腎代謝マーカーにも有意の増加は存在しなかった。
腎機能へのISISオリゴヌクレオチドの影響を評価するために、尿試料を、異なった日に集めた。BUNレベルを、いろいろな時点で、自動臨床化学分析器(Hitachi Olympus AU400e,Melville, NY)を用いて測定したが、それら結果は、表154に示す。アンチセンスオリゴヌクレオチド処置後の尿試料中の尿タンパク質対クレアチニンの比率も、49日目に計算したが、結果は、表155に示す。表154および表155で認められるように、アンチセンスオリゴヌクレオチド処置後のいずれの腎代謝マーカーにも有意の増加は存在しなかった。
血液学検定
異なった日に全てのサル群から得た血液を、HCT、MCV、MCHおよびMCHC測定、更には、WBC(好中球および単球)、RBCおよび血小板などのいろいろな血液細胞、並びに全ヘモグロビン含量の測定のために、Korea Institute of Toxicology(KIT)へ送った。それら結果を、表156〜165に示す。
異なった日に全てのサル群から得た血液を、HCT、MCV、MCHおよびMCHC測定、更には、WBC(好中球および単球)、RBCおよび血小板などのいろいろな血液細胞、並びに全ヘモグロビン含量の測定のために、Korea Institute of Toxicology(KIT)へ送った。それら結果を、表156〜165に示す。
サイトカインおよびケモカイン検定
全てのサル群から得た血液試料を、ケモカインおよびサイトカインのレベルの測定のために、Pierce Biotechnology(Woburn, MA)へ送った。IL−1β、IL−6、IFN−γおよびTNF−αのレベルを、それぞれの霊長類抗体を用いて測定し、そしてIL−8、MIP−1α、MCP−1、MIP−1βおよびRANTESのレベルを、それぞれの交差反応性ヒト抗体を用いて測定した。測定値は、処置の開始前14日と、それらサルを安楽死させた85日目に得た。それら結果を、表166および表167に示す。
全てのサル群から得た血液試料を、ケモカインおよびサイトカインのレベルの測定のために、Pierce Biotechnology(Woburn, MA)へ送った。IL−1β、IL−6、IFN−γおよびTNF−αのレベルを、それぞれの霊長類抗体を用いて測定し、そしてIL−8、MIP−1α、MCP−1、MIP−1βおよびRANTESのレベルを、それぞれの交差反応性ヒト抗体を用いて測定した。測定値は、処置の開始前14日と、それらサルを安楽死させた85日目に得た。それら結果を、表166および表167に示す。
実施例31:ヒト第XI因子に標的指向するISISアンチセンスオリゴヌクレオチドの粘度の測定
ヒト第XI因子に標的指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドの粘度を、165〜185mg/mLの濃度で40cPより大の粘度を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを選別する目的で測定した。
ヒト第XI因子に標的指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドの粘度を、165〜185mg/mLの濃度で40cPより大の粘度を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを選別する目的で測定した。
ISISオリゴヌクレオチド(32〜35mg)を、ガラスバイアル中に秤量し、120μLの水を加え、そしてアンチセンスオリゴヌクレオチドを、50℃でバイアルを加熱することによって溶液中に溶解させた。予熱された試料の一部分(75μL)を、ミクロ粘度計(Cambridge)にピペットで移した。ミクロ粘度計(micro-viscometter)の温度を、25℃に設定し、試料の粘度を測定した。予熱された試料の別の部分(20μL)を、85℃において260nMでUV読み取りのために、10mLの水中にピペットで移した(Cary UV測定器)。それら結果を、表168に示す。
配列リスト
本出願は、電子フォーマットでの配列リストと一緒に出願している。配列リストは、2010年4月14日作成の、84KbサイズのBIOL0109WOSEQ.TXTと称するファイルとして提供する。配列リストの電子フォーマットでの情報は、本明細書中にそのまま援用される。
本出願は、電子フォーマットでの配列リストと一緒に出願している。配列リストは、2010年4月14日作成の、84KbサイズのBIOL0109WOSEQ.TXTと称するファイルとして提供する。配列リストの電子フォーマットでの情報は、本明細書中にそのまま援用される。
Claims (49)
- 炎症反応をモジュレーションする方法であって、動物に、化合物であって、第XI因子モジュレーターを含む化合物を投与することによる方法。
- 第XI因子モジュレーターが、第XI因子に標的指向する修飾オリゴヌクレオチドである、請求項1に記載の方法。
- 動物の炎症性疾患、障害または状態を改善する方法であって、第XI因子に標的指向する化合物を該動物に投与することを含み、ここにおいて、該動物に投与される化合物が、該動物の炎症性疾患、障害または状態を改善する方法。
- 炎症性疾患、障害または状態のリスクがある動物を処置する方法であって、治療的有効量の第XI因子に標的指向する化合物を該動物に投与することを含み、ここにおいて、該動物に投与される化合物が、該動物の炎症性疾患、障害または状態を処置する方法。
- 炎症性疾患、障害または状態に苦しむ動物において第XI因子発現を阻害する方法であって、第XI因子に標的指向する化合物を該動物に投与することを含み、ここにおいて、該動物に投与される化合物が、炎症性疾患、障害または状態に苦しむ動物における第XI因子発現を阻害する方法。
- 動物の炎症性疾患、障害または状態のリスクを減少させる方法であって、第XI因子に標的指向する化合物を該動物に投与することを含み、ここにおいて、該動物に投与される化合物が、該動物の炎症性疾患、障害または状態のリスクを減少させる方法。
- 第XI因子が、SEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:2に示される配列を有する、請求項1、請求項3、請求項4、請求項5または請求項6に記載の方法。
- 第XI因子に標的指向する化合物が、修飾オリゴヌクレオチドである、請求項3、請求項4、請求項5または請求項6に記載の方法。
- 修飾オリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO:15〜269に示される核酸塩基配列の中より選択される核酸塩基配列の少なくとも8個隣接した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する、請求項8に記載の方法。
- 修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列が、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6またはSEQ ID NO:274の核酸塩基配列に100%相補的である、請求項9に記載の方法。
- 修飾オリゴヌクレオチドが、一本鎖修飾オリゴヌクレオチドから成る、請求項8に記載の方法。
- 修飾オリゴヌクレオチドが、12〜30個連結したヌクレオシドから成る、請求項8に記載の方法。
- 修飾オリゴヌクレオチドが、20個連結したヌクレオシドから成る、請求項12に記載の方法。
- 少なくとも一つのヌクレオシド間結合が、修飾ヌクレオシド間結合である、請求項12に記載の方法。
- 各々の修飾ヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、請求項14に記載の方法。
- 少なくとも一つのヌクレオシドが、修飾糖を含む、請求項12に記載の方法。
- 少なくとも一つの修飾糖が、二環式糖である、請求項16に記載の方法。
- 少なくとも一つの修飾糖が、2’−O−メトキシエチルを含む、請求項16に記載の方法。
- 少なくとも一つのヌクレオシドが、修飾核酸塩基を含む、請求項12に記載の方法。
- 修飾核酸塩基が、5−メチルシトシンである、請求項19に記載の方法。
- 修飾オリゴヌクレオチドが、
(a)連結したデオキシヌクレオシドから成るギャップセグメント;
(b)連結したヌクレオシドから成る5’ウィングセグメント;
(c)連結したヌクレオシドから成る3’ウィングセグメント
を含み;ここにおいて、該ギャップセグメントは、5’ウィングセグメントおよび3’ウィングセグメントに直に隣接して且つそれらの間に位置し、そしてここにおいて、各々のウィングセグメントのヌクレオシドは各々、修飾糖を含む、請求項8に記載の方法。 - 修飾オリゴヌクレオチドが、
(a)10個連結したデオキシヌクレオシドから成るギャップセグメント;
(b)5個連結したヌクレオシドから成る5’ウィングセグメント;
(c)5個連結したヌクレオシドから成る3’ウィングセグメント
を含み;ここにおいて、該ギャップセグメントは、5’ウィングセグメントおよび3’ウィングセグメントに直に隣接して且つそれらの間に位置し、ここにおいて、各々のウィングセグメントのヌクレオシドは各々、2’−O−メトキシエチル糖を含み;そしてここにおいて、各々のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である、請求項8に記載の方法。 - 修飾オリゴヌクレオチドが、
(a)14個連結したデオキシヌクレオシドから成るギャップセグメント;
(b)3個連結したヌクレオシドから成る5’ウィングセグメント;
(c)3個連結したヌクレオシドから成る3’ウィングセグメント
を含み;ここにおいて、該ギャップセグメントは、5’ウィングセグメントおよび3’ウィングセグメントに直に隣接して且つそれらの間に位置し、ここにおいて、各々のウィングセグメントのヌクレオシドは各々、2’−O−メトキシエチル糖を含み;そしてここにおいて、各々のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である、請求項8に記載の方法。 - 修飾オリゴヌクレオチドが、
(a)13個連結したデオキシヌクレオシドから成るギャップセグメント;
(b)2個連結したヌクレオシドから成る5’ウィングセグメント;
(c)5個連結したヌクレオシドから成る3’ウィングセグメント
を含み;ここにおいて、該ギャップセグメントは、5’ウィングセグメントおよび3’ウィングセグメントに直に隣接して且つそれらの間に位置し、ここにおいて、各々のウィングセグメントのヌクレオシドは各々、2’−O−メトキシエチル糖を含み;そしてここにおいて、各々のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である、請求項8に記載の方法。 - 炎症性疾患のリスクがある動物を処置する方法であって、治療的有効量の12〜30個連結したヌクレオシドから成る修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を該動物に投与することを含み、ここにおいて、該修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:2に示される第XI因子核酸に相補的であり、そしてここにおいて、該動物に投与される化合物が、炎症性疾患のリスクがある動物を処置する方法。
- 炎症性疾患のリスクがある動物を処置する方法であって、治療的有効量の12〜30個連結したヌクレオシドから成る且つSEQ ID NO:15〜269に示される核酸塩基配列のいずれか一つより選択される核酸塩基配列の少なくとも8個隣接した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を該動物に投与することを含み、そしてここにおいて、該動物に投与される化合物が、炎症性疾患のリスクがある動物を処置する方法。
- 炎症性疾患を有する動物を処置する方法であって、治療的有効量の12〜30個連結したヌクレオシドから成る修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を該動物に投与することを含み、ここにおいて、該修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:2に示される第XI因子核酸に相補的であり、そしてここにおいて、該動物に投与される化合物が、炎症性疾患を有する動物を処置する方法。
- 炎症性疾患を有する動物を処置する方法であって、治療的有効量の12〜30個連結したヌクレオシドから成る且つSEQ ID NO:15〜269に示される核酸塩基配列のいずれか一つより選択される核酸塩基配列の少なくとも8個隣接した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を該動物に投与することを含み、そしてここにおいて、該動物に投与される化合物が、炎症性疾患を有する動物を処置する方法。
- 動物が、ヒトである、請求項1、請求項3、請求項4、請求項5、請求項6、請求項25、請求項26、請求項27または請求項28に記載の方法。
- 炎症性疾患が、関節炎、結腸炎、糖尿病、敗血症、アレルギー性炎症、喘息、免疫増殖性疾患、抗リン脂質症候群または移植片関連障害である、請求項3、請求項4、請求項5、請求項6、請求項25、請求項26、請求項27または請求項28に記載の方法。
- 炎症性疾患が、自己免疫疾患である、請求項3、請求項4、請求項5、請求項6、請求項25、請求項26、請求項27または請求項28に記載の方法。
- 関節炎が、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、尿酸性関節炎、痛風、慢性多発性関節炎、上腕肩甲関節周囲炎、頸部関節炎、腰仙関節炎、変形性関節症、乾癬性関節炎、腸疾患に基づく関節炎および強直性脊椎炎より選択される、請求項30に記載の方法。
- 結腸炎が、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患(Inflammatory Bowel Disease)(IBD)およびクローン病(Crohn’s Disease)より選択される、請求項30に記載の方法。
- 炎症性疾患、障害または状態が、Th1で媒介されている、請求項3、請求項4、請求項5、請求項6、請求項25、請求項26、請求項27または請求項28に記載の方法。
- Th1で媒介される炎症性疾患、障害または状態のマーカーを減少させる、請求項34に記載の方法。
- Th1のマーカーが、IL−1、IL−6、INF−γ、TNF−αまたはKCといういずれかのサイトカインである、請求項35に記載の方法。
- 炎症性疾患、障害または状態が、Th2で媒介されている、請求項3、請求項4、請求項5、請求項6、請求項25、請求項26、請求項27または請求項28に記載の方法。
- Th2で媒介される炎症性疾患、障害または状態のマーカーを減少させる、請求項37に記載の方法。
- Th2のマーカーが、IL−4、IL−5、好酸球浸潤または粘液生産のいずれかである、請求項38に記載の方法。
- 化合物を、非経口投与する、請求項1、請求項3、請求項4、請求項5、請求項6、請求項25、請求項26、請求項27または請求項28に記載の方法。
- 非経口投与が、皮下投与または静脈内投与のいずれかである、請求項40に記載の方法。
- 第二物質を更に含む、請求項1、請求項3、請求項4、請求項5、請求項6、請求項25、請求項26、請求項27または請求項28に記載の方法。
- 第二物質を、化合物と同時にまたは逐次的に投与する、請求項42に記載の方法。
- 化合物が、塩の形である、請求項1、請求項3、請求項4、請求項5、請求項6、請求項25、請求項26、請求項27または請求項28に記載の方法。
- 薬学的に許容しうる担体または希釈剤を更に含む、請求項1、請求項3、請求項4、請求項5、請求項6、請求項25、請求項26、請求項27または請求項28に記載の方法。
- 炎症性疾患を処置するための、第XI因子を標的とする化合物の使用。
- 化合物が、修飾オリゴヌクレオチドである、請求項46に記載の使用。
- 第XI因子が、SEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:2に示される配列を有する、請求項46に記載の使用。
- 修飾オリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO:15〜269に示される核酸塩基配列の中より選択される核酸塩基配列の少なくとも8個隣接した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する、請求項47に記載の使用。
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