CN102458480A - 因子xi对炎症反应的调节 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于在所需个体中调节因子XI和改善炎症疾病、异常或状况的反义化合物和方法。通过给药靶向作用于因子XI的反义化合物，个体所患的炎症疾病如关节炎和结肠炎可以得到改善或预防。

Description

因子XI对炎症反应的调节
序列表
本申请连同电子形式的序列表一起提交。该序列表以命名为BIOL0109WOSEQ.TXT的文件提交，该文件于2010年4月14日创建，84Kb大小。序列表的电子形式中的信息通过引用全文并入本申请。
技术领域
本发明提供通过对动物给药因子XI调节剂来调节炎症反应的方法、化合物和组合物。
背景技术
因子XI
因子XI在肝脏中合成，是凝血级联“内源性途径”的成员之一，其最终使凝血酶活化以阻止血液损失。该内源性途径由因子XII活化为XIIa而触发。因子XIIa将因子XI转化为因子XIa，因子XIa将因子IX转化为因子IXa。因子IXa与其辅因子VIIIa结合，将因子X转化为因子Xa。因子Xa结合因子Va而将凝血酶原(因子II)活化为凝血酶(因子IIa)。
因子XI缺乏(也称为血浆促凝血酶原前体(PTA)缺乏、Rosenthal综合征和C型血友病)是一种具有出血倾向的常染色体隐性遗传病。大多数因子XI缺乏的患者不会自发地出血，但是在外伤后会出现严重出血。低水平的因子XI也会出现在其他疾病状况中，包括Noonan综合征。
炎症
炎症是机体对物理、化学或生物刺激导致的损伤或异常刺激产生应答的一种复杂生物学过程。炎症是机体试图摆脱损伤或刺激以及机体受累组织开始愈合的保护性过程。
对损伤或刺激产生炎症反应的临床体征为发红(rubor)、发热(calor)、肿胀(tumor)、疼痛(dolor)和/或组织功能丧失(functio laesa)。导致发红和发热的原因是，血管扩张引起处于核心体温的血液向炎症组织部位的供应增加。导致肿胀的原因是，在炎症组织部位的血管通透性改变和蛋白和体液的蓄积。导致疼痛的原因是，在炎症组织部位释放的刺激神经末稍的化学物质(例如，缓激肽)。功能丧失可能由多种原因导致。
目前认为炎症是对损伤或刺激产生的一类非特异性免疫应答。炎症反应具有细胞组分和渗出性组分。在细胞组分中，损伤或刺激部位存在的固有巨噬细胞通过释放如TNFα、INFα、IL-1、IL-6、IL-12、IL-18等的炎症介质启动炎症反应。随后白细胞被募集进入炎症组织区域并行使多种功能，如其他细胞介质的释放、噬菌作用、酶颗粒的释放以及其他功能。渗出性组分包括含蛋白的血浆液体从血管向炎症组织部位转移。炎症介质如缓激肽、一氧化氮和组胺导致血管变宽、血管中的血流减慢和血管通透性增加，使得液体和蛋白能够向组织移动。生化级联被活化以放大炎症反应(例如，对感染产生响应的补体系统、对因烧伤或外伤引起的坏死产生响应的纤维蛋白溶解和凝结系统、维持炎症的激肽系统)(Robbins Pathologic Basis of Disease，Philadelphia，W.B Saunders Company)。
炎症可以是急性的或慢性的。急性炎症发病非常迅速、很快加重且在数日至数周后迅速和彻底的消除。慢性炎症起病或急或缓，其可持续数周、数月或数年且终点不明确。当损伤或刺激或因其存在导致的产物持续存在于损伤或刺激部位，且机体的免疫应答不足以应对其作用时，将导致慢性炎症。
尽管通常情况下炎症反应有助于机体清除损伤或刺激，但在某些情况下其可以导致机体损伤。在某些情况下，机体的免疫应答会在机体未出现损伤或刺激的情况下不恰当的触发炎症反应。在这些被归类为自身免疫病的情况下，机体攻击自身组织导致其自身组织损伤。
用于减轻炎症的治疗药物包括非甾体抗炎药(NSAIDS)和疾病改善型药物。多数这些药物都会产生有害的副作用。例如，NSAIDS最常见的副作用是恶心、呕吐、腹泻、便秘、食欲减退、皮疹、头晕、头痛和困倦。NSAIDS还可以引起体液滞留，导致水肿。最严重的副作用为肾衰竭、肝衰竭、溃疡以及损伤或手术后出血时间延长。
因此，需要找到一种针对炎症的替代疗法，使之在临床性质方面更具吸引力。目前对因子XI在炎症中的作用知之甚少，使其成为被关注的研究靶点。新兴的反义技术是用于减少某些基因产物表达的有效手段，因此其可能在针对因子XI调节的若干治疗、诊断和研究方面的应用具有独特作用。
发明概述
本发明提供能够调节动物中因子XI的mRNA和/或蛋白水平的方法、化合物和组合物。本发明提供能够调节动物中因子XI的mRNA和/或蛋白水平的方法、化合物和组合物，以调节动物中的炎症反应。本发明还提供对动物给药治疗有效量的靶向作用于因子XI的化合物的方法、化合物和组合物，以改善动物的炎症疾病；治疗具有患炎症疾病风险的动物；抑制因子XI在患有炎症疾病动物中的表达；以及降低动物患炎症疾病的风险。
在某些实施方式中，因子XI特异性抑制剂调节(即，降低)因子XI的mRNA和/或蛋白的水平。在某些实施方式中，因子XI特异性抑制剂为核酸、蛋白或小分子。
在某些实施方式中，对具有患炎症疾病风险的动物进行治疗，通过对动物给药治疗有效量的包含修饰的寡核苷酸的化合物，所述修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成，其中修饰的寡核苷酸与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：274中所示的因子XI的核酸互补，或治疗有效量的包含修饰的寡核苷酸的化合物，所述修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成且具有的核碱基序列包括选自SEQ ID NOs：15至269所示的任意核碱基序列中的某个核碱基序列的至少8个连续核碱基。
在某些实施方式中，对患有炎症疾病的动物进行治疗，通过对动物给药治疗有效量的包含修饰的寡核苷酸的化合物，所述修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成，其中修饰的寡核苷酸与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：274中所示的因子XI的核酸互补，或治疗有效量的包含修饰的寡核苷酸的化合物，所述修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成且具有的核碱基序列包括选自SEQ ID NOs：15至269中所示的任意核碱基序列中的某个核碱基序列的至少8个连续核碱基，或包括与本发明所述的靶区段或靶区域互补的至少8个连续核碱基。在某些实施方式中，修饰的寡核苷酸具有的核碱基序列包括选自SEQ ID NOs：15至269中任意核碱基序列的某个核碱基序列的一部分连续核碱基，或包括与本发明所述的靶区段或靶区域互补的一部分连续核碱基。
在某些实施方式中，调节可以发生在细胞、组织、器官或有机体。在某些实施方式中，细胞、组织或器官在动物中。在某些实施方式中，动物为人。在某些实施方式中，因子XI的mRNA水平降低。在某些实施方式中，因子XI蛋白水平降低。这种降低可以以时间依赖的方式发生或以剂量依赖的方式发生。
本发明还提供了用于预防、治疗和改善与炎症相关的疾病、异常和状况的方法、化合物和组合物。在某些实施方式中，这种疾病、异常和状况是炎症疾病、异常或状况。
在某些实施方式中，治疗方法包括对有需要的个体给药因子XI的特异性抑制剂。
在某些实施方式中，炎症与败血症无关。在某些实施方式中，炎症与感染无关。
本发明还提供了包括修饰的寡核苷酸的化合物和组合物，所述修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成，其中修饰的寡核苷酸与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQID NO：6或SEQ ID NO：274中所示的因子XI的核酸互补。在某些实施方式中，修饰的寡核苷酸具有的核碱基序列包括选自SEQ ID NOs：15至269中所示的任意核碱基序列的某个核碱基序列的一部分连续核碱基，或包括与本发明所述的靶区段或靶区域互补的一部分连续核碱基。在某些实施方式中，修饰的寡核苷酸具有的核碱基序列包括选自SEQ IDNOs：15至269的核碱基序列的某个核碱基序列的至少8个连续核碱基，或包括与本发明所述的靶区段或靶组织互补的至少8个连续核碱基。
附图的简要说明
图1为图表，显示反义寡核苷酸(ASO)对小鼠的胶原诱导的关节炎(CIA)的抑制作用，如下文实施例11所述。图1A显示了ASO治疗对发展成CIA的小鼠百分率的影响。与未治疗或用因子VII治疗的小鼠相比，小鼠用因子XI ASO治疗后，其CIA的发生率降低。图1B为ASO治疗对小鼠出现关节炎受累足爪的百分率的影响。与未治疗或用因子VII治疗的小鼠相比，小鼠用因子XI ASO治疗后，其受累足爪的发生率降低。
图2为图表，显示反义寡核苷酸(ASO)对小鼠的胶原诱导的关节炎(CIA)的抑制作用，如下文实施例11所述。图2A为ASO治疗对小鼠受累足爪平均数量的影响。因子XI ASO治疗的小鼠的平均受累足爪数较少。图2B显示ASO治疗对小鼠关节炎严重程度的影响。与对照小鼠相比，经因子XI ASO治疗的小鼠发展成严重关节炎的较少。
图3为用ASO治疗或不治疗的小鼠的CIA发病的时间曲线，如下文实施例11所述。用因子XI ASO治疗小鼠后，其CIA的发病时间更晚且受累小鼠更少。
图4为图表，显示胶原诱导的关节炎小鼠在接受或不接受因子XI反义治疗时，其关节炎的严重程度和肝脏中因子XI mRNA含量，如下文实施例11所述。图4A为用因子XI反义寡核苷酸ISIS 404071(F11#1)、ISIS 404057(F11#2)或对照寡核苷酸(F11 MM)治疗10周后，胶原诱导的关节炎小鼠中关节炎的严重程度。图4B为在接受治疗小鼠肝脏中，相同的寡核苷酸对因子XI mRNA的影响。
图5为图表，显示因子XI反义寡核苷酸治疗对器官重量的影响，如下文实施例11所述。图5A为接受治疗小鼠的肝脏重量占小鼠体重的百分率。图5B为接受治疗小鼠的脾脏重量占小鼠体重的百分率。
图6为图表，显示因子XI反义寡核苷酸治疗对肝酶的影响，如下文实施例11所述。图6A为ALT水平。图6B为AST水平。
图7为反义寡核苷酸(ASO)对小鼠结肠炎抑制效果的时间进程和图表，如下文实施例12所述。图7A为用ASO治疗或不治疗的小鼠，其DSS诱导的结肠炎发病率对体重的影响的时间曲线。时间变化曲线表示为在不同时间点的体重相对于研究开始时体重的百分率。在研究期间，用因子XI ASO治疗的小鼠的体重未发生任何显著改变。图7B为在第6天时与DSS对照相比的最终体重变化情况。PBS对照小鼠和用因子VII ASO治疗小鼠的体重减轻。用因子XI ASO治疗小鼠的体重未发生显著改变。图7C为治疗期结束后结肠长度检测结果。PBS对照小鼠和用因子VII ASO治疗小鼠的结肠长度缩短。用因子XI ASO治疗小鼠的结肠长度未发生显著改变。
图8为经苏木素和伊红染色的小鼠结肠组织的组织切片，如下文实施例12所述。图8A为仅皮下注射PBS的对照小鼠的结肠组织，其具有正常的结肠组织学外观。图8B为用DSS处理后诱导出结肠炎的小鼠结肠组织。该组织出现溃疡性结肠炎损伤，包括粘膜溃疡(2-4/动物)、整个结肠出现弥散性的中性粒细胞浸润、粘膜下水肿和固有肌层增厚。图8C为用因子VII ASO治疗及随后采用DSS诱导结肠炎的小鼠的结肠组织，其组织学性质与DSS对照相同。图8D为用因子XI治疗及随后采用DSS诱导结肠炎的小鼠的结肠组织，与DSS对照相比，其溃疡性结肠炎损伤显著减轻且粘膜溃疡减少(＞1/动物)。
图9为反义寡核苷酸(ASO)对小鼠结肠炎抑制效果随时间变化曲线和图表，如下文实施例12所述。图9A为用PBS、因子XI ASO(ISIS 404071)、因子XI ASO(ISIS404057)或对照ASO(ISIS 421208)治疗，对DSS诱导的结肠炎小鼠的体重的影响随时间变化的曲线。随时间变化的曲线表示为不同时间点的体重相对于研究开始时体重的百分率。在研究期间，用ISIS 404071治疗的小鼠和ISIS 404057治疗小鼠的体重未发生任何显著改变。图9B为在第7天研究期结束时与DSS对照相比的最终体重变化情况。用ISIS404071治疗的小鼠和ISIS 404057治疗的小鼠，其体重未发生任何显著改变。图中的星号表示与仅用DSS治疗的小鼠相比具有统计学意义的显著改变。
图10为图表，显示反义寡核苷酸(ASO)对小鼠结肠炎的抑制作用，如下文实施例12所述。图10为经如下试剂治疗的小鼠肝脏中因子XI mRNA的水平：1)仅PBS作为对照；2)PBS且随后使用DSS诱导结肠炎；3)ISIS 404071且随后使用DSS诱导结肠炎；4)ISIS 404057且随后使用DSS诱导结肠炎；以及5)使用对照ASO ISIS 421208且随后使用DSS诱导结肠炎。
图11为因子XI反义寡核苷酸(ASO)对小鼠结肠炎抑制作用的量效关系随时间变化曲线和图表，如下文实施例12所述。对DSS诱导的结肠炎小鼠给药10mg/kg因子XIASO、20mg/kg因子XI ASO、40mg/kg因子XI ASO或40mg/kg对照用非-因子XIASO。图11A为多种不同剂量的因子XI ASO对DSS诱导结肠炎小鼠体重的影响随时间变化曲线。图11B为多种不同剂量的因子XI ASO对DSS诱导结肠炎小鼠软便/腹泻情况的影响。图11C为为多种不同剂量的因子XI ASO对DSS诱导结肠炎小鼠结肠长度的影响。
发明详述
应当理解，前述一般性说明和下文的详细说明仅为示例和解释性的，并非限制本发明所主张的权利。除非另外特别指明，本申请中使用的单数包括复数。如本申请中使用的，除非另有指明，使用的“或”是指“和/或”。另外，术语“包括”以及诸如“包含”和“含有”的使用为非限制性的。另外，除非另有特别指明，“元件”或“组分”等术语涵盖包括一个单元的元件和组分以及包括超过一个亚单元的元件和组分。
本申请中使用的章节标题仅为组织目的，不应解释为限制所描述的主题。本申请中引用的所有文件或部分文件，包括但不限于专利、专利申请、论文、书籍以及专题论文等，在此明确地通过参考并入，不仅为该文件在本申请中所讨论的部分，也包括其全文。定义
除非提供特殊定义，本发明所使用与分析化学、合成有机化学以及医用化学和药物化学相关的术语及程序和技术均为本领域公知和公用。化学合成和化学分析中可以使用标准的技术。在允许的情况下，在本申请通篇公开内容中引用的所有专利、申请、公开的申请以及其他出版物、GENBANK登录号以及可通过诸如美国国立生物技术信息中心(NCBI)的数据库获得的相关的序列信息和其他数据都通过参考并入，不仅为所述文件在本申请中所讨论的部分，也包括其全文。
除非另有指明，下列术语具有以下含义：
“2’-O-甲氧乙基”(也称为2’-MOE和2’-O(CH2)2-OCH3)是指呋喃糖基环的2’位的O-甲氧基-乙基修饰。2’-O-甲氧乙基修饰的糖是修饰的糖。
“2’-O-甲氧乙基核苷酸”是指包含2’-O-甲氧乙基修饰的糖基的核苷酸。
“5-甲基胞嘧啶”是指使用与5’位连接的甲基修饰的胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶是一种修饰的核碱基。
“活性药物”指在药物组合物中的一种或多种物质，对个体给药后能够提供治疗益处。例如，在某些实施方式中靶向作用于因子XI的反义寡核苷酸就是一种活性药物。
“活性靶区域”或“靶区域”指一个或多个活性反义化合物靶向作用的区域。“活性反义化合物”指降低靶核酸水平或蛋白水平的反义化合物。
“伴随给药”是指以任何方式对两种药物联合给药，使得在患者中所述两种药物的药理作用同时有显现。伴随给药不需要以单一药物组合物、以相同剂型或通过相同给药途径对两种制剂进行给药。两种制剂的作用不需要同时显现出来。所述作用仅需要重叠一段时间但不需要同时延伸。
“给药”是指将药物提供给个体，包括但不限于通过医学专业人员给药和自我给药。
“改善”是指相关疾病、异常或状况的至少一种指标、体征或症状减轻。在某些实施方式中，改善包括延迟或减缓某种状况或疾病的一种或多种指标的进展。指标的严重性可通过本领域技术人员已知的主观或客观测量值来确定。例如，可以通过Marty et al(J.Clin.Invest 107：631-640(2001))描述的小鼠关节炎数量的临床评分，来确定在胶原诱导的关节炎小鼠中的关节炎改善情况。
“动物”是指人类或非人类动物，包括但不限于小鼠、大鼠、家兔、犬、猫、猪，以及非人灵长类，包括但不限于猴子和猩猩。
“解毒剂化合物”是指能够减轻任何反义活性的强度或持续时间的化合物。
“解毒剂寡核苷酸”是指一种解毒剂化合物，其包含与反义化合物互补并能够与之杂交的寡核苷酸。
“解毒剂蛋白”是指包含肽的解毒剂化合物。
“抗体”是指其特征为以某种方式与抗原特异性反应的分子，其中抗体和抗原各自根据对方来定义。抗体可指完整的抗体分子或其任何片段或区域，例如重链、轻链、Fab区以及Fc区。
“反义活性”是指由反义化合物与其靶核酸杂交而引起的任何可检测或可测量的活性。在某些实施方式中，反义活性是靶核酸的量减少，或由该靶核酸编码的蛋白的表达减少。
“反义化合物”是指能够通过氢键键合与靶核酸杂交的寡聚化合物。
“反义抑制”是指，当存在与靶核酸互补的反义化合物时，靶核酸水平或靶蛋白水平低于当不存在该反义化合物时的靶核酸水平或靶蛋白水平。
“反义寡核苷酸”是指一种单链寡核苷酸，其具有允许与靶核苷酸的相应区域或片段杂交的核碱基序列。
“双环糖”是指通过两个非成对环原子桥接而修饰的呋喃基环。双环糖是修饰的糖。
“双环核酸”或“BNA”是指一种核苷或核苷酸，其中所述核苷或核苷酸的呋喃糖基含有将呋喃糖环上的两个碳原子连接起来从而形成双环系统的桥键。
“帽结构”或“末端帽基团”是指在反义化合物的任一末端掺入的化学修饰。
“化学不同区域”是指反义化合物的一个区域，其在某种方式上与同一反义化合物的另一区域存在化学差异。例如，具有2’-O-甲氧乙基核苷酸的区域与具有无2’-O-甲氧乙基修饰的核苷酸的区域在化学上不同。
“嵌合反义化合物”是指具有至少两个化学不同区域的反义化合物。
“联合给药”是指对个体给药两种或多种药物。所述两种或多种药物可为单一药物组合物，或可为分开的药物组合物。所述两种或多种药物各自可通过相同或不同给药途径给药。联合给药包括伴随、并行或顺序给药。
“凝血因子”是指血凝级联中的因子I、II、III、IV、V、VII、VIII、IX、X、XI、XII或XIII的任何因子。“凝血因子核酸”是指任何编码凝血因子的核酸。例如，在某些实施方式中，凝血因子核酸包括但不限于，编码凝血因子的DNA序列(包括包含内含子和外显子的基因组DNA)、由编码凝血因子的DNA转录而来的RNA序列以及编码凝血因子的mRNA序列。“凝血因子mRNA”是指编码凝血因子蛋白的mRNA。
“互补性”是指第一核酸和第二核酸之间的核碱基配对能力。
“连续核碱基”是指相互之间直接相邻的核碱基。
“稀释剂”是指组合物中缺乏药理活性但在药学上是必需或合乎需要的成分。例如，在注射用组合物中，稀释剂可为液体，例如生理盐水溶液。
“疾病改善型药物”指能够改善炎症疾病、异常或状况相关的症状和/或进展情况的任意药物，所述炎症疾病、异常或状况包括自身免疫病(例如，关节炎、结肠炎或糖尿病)、外伤或手术相关异常、败血症、过敏性炎症和哮喘。DMARD改善与这些疾病、异常或状况相关的一种或多种症状和/或疾病进展情况。
“剂量”是指在单次给药或在特定时间段提供的药物的特定量。在某些实施方式中，剂量可以通过一次、两次或多次的推注剂、片剂或注射剂给药。例如，在需要皮下注射的某些实施方式中，所需剂量需要的体积量通过单次注射难以提供，因此，可能需要两次或多次注射以实现所需剂量。在某些实施方式中，通过长时间或连续输注来进行所述药物的给药。剂量可表示为每小时、每天、每周或每月的药物的量。
“有效量”是指在需要活性药物的个体中足以实现所需生理结果的该药物的量。有效量可根据待治疗的个体的健康和生理条件、待治疗的个体的分类群、组合物的制剂、个体医学状况的评估以及其他相关因素而在个体中有所不同。
“因子XI”、“FXI”、“因子11”和“F11”在本申请中可以互换使用。
“因子XI核酸”或“因子XI核酸”是指编码因子XI的任何核酸。例如，在某些实施方式中，因子XI核酸包括但不限于编码因子XI的DNA序列、由编码因子XI的DNA(包括含有内含子和外显子的基因组DNA)转录而来的RNA序列以及编码因子XI的mRNA序列。“因子XI mRNA”是指编码因子XI蛋白的mRNA。
“因子XI特异性抑制剂”是指能够在分子水平特异性抑制因子XI的mRNA和/或因子XI蛋白表达的任何药物。例如，因子XI特异性抑制剂包括能够抑制因子XI mRNA和/或因子XI蛋白表达的核酸(包括反义化合物)、肽、抗体、小分子以及其他制剂。在某些实施方式中，通过特异性调节因子XI mRNA水平和/或因子XI蛋白表达，因子XI特异性抑制剂可影响炎症通路中的组分。相似地，在某些实施方式中，因子XI特异性抑制剂可影响动物中的其他分子进程。
“因子XI特异性抑制剂解毒剂”是指能够减轻因子XI特异性抑制剂作用的化合物。在某些实施方式中，因子XI特异性抑制剂解毒剂选自因子XI肽；因子XI解毒剂寡核苷酸，包括与因子XI反义化合物互补的因子XI解毒剂化合物；以及影响内源性或外源性凝血途径的任何化合物或蛋白。
“完全互补”或“100％互补”是指第一核酸的每一个核碱基在第二核酸中都有与之互补的核碱基。在某些实施方式中，第一核酸为反义化合物，靶核酸为第二核酸。
“Gapmer”是指一种嵌合反义化合物，其中具有支持RNA酶H剪切的多个核苷的内部区域位于具有一个或多个核苷的外部区域之间，其中含有所述内部区域的核苷与含有所述外部区域的核苷在化学上不同。内部区域可以称为“间隔区”，外部区域可以称为“侧翼区”。
“间隔加宽的”是指一种嵌合反义化合物，其具有的间隔区有12个或更多连续的2’-脱氧核糖核苷，位于5’和3’侧翼区之间且直接相邻，所述侧翼区具有一个至六个核苷。
“杂交”是指互补的核酸分子的退火。在某些实施方式中，互补的核酸分子包括反义化合物和靶核酸。
“鉴定处于炎症疾病、异常或状况风险中的动物”是指鉴定已经被诊断为患有炎症疾病、异常或状况的动物，或鉴定倾向于发展出炎症疾病、异常或状况的动物。倾向于发展出炎症疾病、异常或状况的个体，例如具有结肠炎或关节炎家族史的个体。这种鉴定可通过任何方法来实现，包括评价个体的就医史和标准临床检测或评估。
“直接相邻”是指在直接相邻的元件之间没有介入的元件。
“个体”是指入选进行治疗或采用疗法的人类或非人类动物。
“炎症反应”指在动物中与炎症相关的任意疾病、异常或状况。炎症反应的例子包括动物机体产生的负责启动炎症反应的用于清除损伤或刺激的免疫应答反应。或者，即使当未见已知损伤或刺激时，机体也可以启动炎症反应，如在自身免疫性疾病中。炎症可以由Th1或Th2应答介导。Th1和Th2应答包括产生选择性细胞因子和细胞迁移或募集至炎症部位。可以迁移至炎症部位的细胞类型包括，但不限于，嗜酸性粒细胞和巨噬细胞。Th1细胞因子包括，但不限于，IL-1、IL-6、TNFα、INFγ和角化细胞趋化因子(KC)。Th2细胞因子包括，但不限于，IL-4和IL-5。细胞因子水平降低或细胞迁移减少可以指示炎症减轻。因此，细胞因子水平或细胞迁移情况可以作为某些炎症类型的标记物，如Th1或Th2介导的炎症。
“炎症疾病”、“炎性异常”或“炎症状况”指对损伤或刺激应答的炎症反应相关的疾病、异常或状况，所述损伤或刺激的临床体征表现为发红(rubor)、发热(calor)、肿胀(tumor)、疼痛(dolor)的增加和/或组织功能的丧失(functiolaesa)。
“核苷间连接”是指核苷之间的化学键。
“连接的核苷”是指键合在一起的相邻核苷。
“错配”或“非互补的核碱基”或“MM”是指当第一核酸的核碱基不能与第二核酸或靶核酸的相应核碱基配对的情况。
“修饰的核苷间连接”是指在天然存在的核苷间连接(即，磷酸二酯核苷间连接)上进行的取代和/或任何变化。
“修饰的核碱基”是指除了腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶以外的任何核碱基。“未修饰的核碱基”是指嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。
“修饰的核苷酸”是指一种核苷酸，其分别具有修饰的糖基、修饰的核苷间连接或修饰的核碱基。“修饰的核苷”是指分别具有修饰的糖基或修饰的核碱基的核苷。
“修饰的寡核苷酸”是指包含修饰的核苷间连接、修饰的糖或修饰的核碱基的寡核苷酸。
“修饰的糖”是指对天然糖的取代和/或改变。
“调节”指改变或调整细胞、组织、器官或机体中的某个特性。例如，调节因子XI mRNA可以表示增加或减少细胞、组织、器官或机体中因子XI mRNA和/或因子XI蛋白的水平。调节因子XI mRNA和/或蛋白可以导致细胞、组织、器官或机体中炎症反应的增强或减弱。“调节剂”具有在细胞、组织、器官或机体中引起变化的作用。例如，因子XI反义寡核苷酸可以作为提高或降低细胞、组织、器官或机体中因子XI mRNA和/或因子XI蛋白量的调节剂。“基序”指反义化合物中化学不同区域的形式。
“天然存在的核苷间连接”是指3′至5′磷酸二酯键。
“天然糖基”是指存在于DNA(2’-H)或RNA(2’-OH)中的糖。
“NSAID”指非甾体抗炎药物。NSAID能够减轻对象的炎症反应，但是一般不能改善或预防疾病的发生或进展。
“核酸”是指由单体核苷酸构成的分子。核酸包括核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、单链核酸、双链核酸、小干扰核糖核酸(siRNA)以及微小RNA(miRNA)。
“核碱基”是指能够与另一核酸的碱基配对的杂环基团。
“核碱基序列”是指不依赖于任何糖、连接或核碱基修饰的连续的核碱基顺序。
“核苷”是指与糖连接的核碱基。
“核苷酸”是指具有磷酸基团的核苷，所述磷酸基团与核苷的糖基共价连接。
“寡聚化合物”或“寡聚物”是指连接的单体亚单位的聚合物，其能够与核酸分子的至少一个区域杂交。
“寡核苷酸”是指连接的核苷的聚合物，其中各核苷可以是修饰的或未修饰的，相互独立。
“胃肠外给药”是指通过注射或输注给药。胃肠外给药包括皮下给药、静脉给药、肌肉给药、动脉给药、腹膜内给药或颅内给药，例如鞘内给药或脑室内给药。
“肽”表示通过酰胺键连接至少两个氨基酸而形成的分子。肽是指多肽和蛋白。
“药物组合物”是指适于对个体给药的物质的混合物。例如，药物组合物可包含一种或多种活性药物和无菌水溶液。
“药学上可接受的盐”是指生理上和药学上可接受的反义化合物的盐，即保留母体寡核苷酸的所需生物学活性且不引入不需要的毒理学作用的盐。
“硫代磷酸酯连接”是指核苷之间的连接，其中磷酸二酯键通过使用硫原子取代非桥接氧原子而修饰。硫代磷酸酯连接是修饰的核苷间连接。
“部分”是指核酸的确定数量的连续的(即，连接的)核碱基。在某些实施方式中，一部分是指靶核酸的确定数量的连续的核碱基。在某些实施方式中，一部分是指反义化合物的确定数量的连续的核碱基。
“预防”是指在几分钟至不确定的时间段内延迟或阻止疾病、异常或状况的发病或发展。“预防”还指降低疾病、异常或状况发展的风险。
“前药”是指以无活性形式制备的治疗药物，在机体或其细胞内所述无活性形式在内源性酶或其他化学物质或条件的作用下而转化为活性形式。
“副作用”是指因治疗引起的非所需作用的生理反应。在某些实施方式中，副作用包括注射部位反应、肝功能检测异常、肾功能异常、肝毒性、肾毒性、中枢神经系统异常、肌病以及不适。例如，血清中转氨酶水平升高可提示肝毒性或肝功能异常。例如，胆红素升高可提示肝毒性或肝功能异常。
“单链寡核苷酸”是指没有与互补链杂交的寡核苷酸。
“可特异性杂交的”是指反义化合物在反义寡核苷酸和靶核苷酸之间具有足够程度的互补性以引发所需作用，而在特异性结合所需的条件下，即在体内检测和治疗情况的生理条件下，对非靶核酸则表现出最小的作用或无作用。
“靶向”或“被靶向”是指对与靶核酸特异性杂交并引发所需作用的反义化合物进行设计和选择的过程。
“靶核酸”、“靶RNA”以及“靶RNA转录”均指能够被反义化合物靶向的核酸。
“靶区段”是指反义化合物靶向作用的靶核酸的核苷酸序列。“5’靶位点”是指靶区段的最5’端的核苷酸。“3’靶位点”是指靶区段的最3’端的核苷酸。
“Th1相关疾病、异常或状况”指由Th1免疫应答介导的炎症疾病、异常或状况。Th1疾病的例子包括，但不限于，过敏性疾病(例如，过敏性鼻炎)、自身免疫性疾病(例如，多发性硬化症、关节炎、硬皮病、牛皮癣、乳糜泻)、心血管疾病、结肠炎、糖尿病(例如，1型胰岛素依赖性糖尿病)、超敏反应(例如，4型超敏反应)、感染性疾病(例如，病毒感染、分枝杆菌感染)以及后葡萄膜炎。
“Th2相关疾病、异常或状况”指由Th2免疫应答介导的炎症疾病、异常或状况。Th2疾病的例子包括，但不限于，过敏性疾病(例如，慢性鼻窦炎)、气道过度反应、哮喘、特应性皮炎、结肠炎、子宫内膜异位症、感染性疾病(例如，寄生虫感染)、甲状腺疾病(例如，格氏病)、超敏反应(例如，1、2或3型超敏反应)和胰腺炎。
“Th1”或“Th2”应答包括产生选择性细胞因子和细胞迁移或募集至炎症部位。可以迁移至炎症部位的细胞类型包括，但不限于，嗜酸性粒细胞和巨噬细胞。因此，细胞因子水平或细胞迁移情况可以作为某种类型炎症的标记物，如Th1或Th2介导的炎症。Th1标记物包括，但不限于，细胞因子IL-1、IL-6、TNFα、INFγ和角化细胞趋化因子(KC)等。Th2标记物包括，但不限于，嗜酸性粒细胞浸润、粘液的产生及细胞因子IL-4和IL-5。细胞因子水平降低或细胞迁移减少可以指示炎症减轻。
“治疗有效量”是指对个体提供治疗益处的药物的量。
“治疗”是指对动物给药药物组合物，使得动物的疾病、异常或状况改变或改善。在某些实施方式中，可以对动物给药一个或多个药物组合物。
“未修饰的核苷酸”是指由天然存在的核碱基、糖基以及核苷间连接组成的核苷酸。在某些实施方式中，未修饰的核苷酸是RNA核苷酸(即，β-D-核糖核苷酸)或DNA核苷酸(即，β-D-脱氧核糖核苷酸)。
一些实施方式
在某些实施方式中，提供了对动物给药化合物来调节炎症反应的方法、化合物和组合物，其中所述化合物包括因子XI调节剂。因子XI的调节能够导致因子XI mRNA和蛋白表达的增加或减少，以提高或降低所需的炎症反应。在某些实施方式中，通过给药靶向作用于因子XI的调节剂能够逆转动物中因子XI的抑制。在本发明的某些实施方式中，因子XI被调节剂抑制。因子XI调节剂可以是靶向作用于因子XI的修饰寡核苷酸。
在某些实施方式中，提供了在有需要的动物中治疗、预防或改善与因子XI相关的炎症疾病、异常和状况的方法、化合物和组合物。在一个实施方式中，改善动物炎症疾病的方法包括对动物给药靶向作用于因子XI的化合物。
在某些实施方式中，提供了治疗处于炎症疾病、异常或状况风险中的动物的方法、化合物和组合物，包括对处于风险中的动物给药治疗有效量的靶向作用于因子XI化合物。
在某些实施方式中，提供了在患有炎症疾病、异常或状况的动物中抑制因子XI表达的方法、化合物和组合物，包括对动物给药靶向作用于因子XI的化合物。
在某些实施方式中，提供了降低动物患炎症疾病、异常或状况风险的方法、化合物和组合物，包括对动物给药靶向作用于因子XI的化合物。
在某些实施方式中，本发明提供了一种因子XI调节剂，其中所述因子XI调节剂是因子XI特异性抑制剂，用于治疗、预防或改善炎症反应、疾病、异常或状况。在某些实施方式中，因子XI特异性抑制剂是核酸(包括反义化合物)、肽、抗体、小分子以及能够抑制因子XI mRNA和/或因子XI蛋白表达的其他药物。
在某些实施方式中，炎症疾病、异常或状况是纤维蛋白相关的炎症疾病、异常或状况。
在某些实施方式中，炎症疾病、异常或状况与败血症或感染无关。
在某些实施方式中，炎症疾病、异常或状况是Th1介导的。在某些实施方式中，Th1介导的炎症疾病、异常或状况的标记物降低。Th1标记物包括，但不限于，细胞因子如IL-1、IL-6、INF-γ、TNF-α或KC。在某些实施方式中，本发明化合物预防或改善Th1介导的疾病。Th1介导的疾病包括，但不限于，过敏性疾病(例如，过敏性鼻炎)、自身免疫性疾病(例如，多发性硬化症、关节炎、硬皮病、牛皮癣、乳糜泻)、心血管疾病、结肠炎、糖尿病(例如，1型胰岛素依赖性糖尿病)、超敏反应(例如，4型超敏反应)、感染性疾病(例如，病毒感染、分枝杆菌感染)以及后葡萄膜炎。
在某些实施方式中，炎症疾病、异常或状况是Th2介导的。在某些实施方式中，Th2介导的炎症疾病、异常或状况的标记物降低。Th2标记物包括，但不限于，嗜酸性粒细胞迁移至炎症部位、粘液的产生和细胞因子如IL-4、IL-5。在某些实施方式中，本发明化合物预防或改善Th2介导的疾病。Th2介导的疾病包括，但不限于，过敏性疾病(例如，慢性鼻窦炎)、气道过度反应、哮喘、特应性皮炎、结肠炎、子宫内膜异位症、感染性疾病(例如，寄生虫感染)、甲状腺疾病(例如，格氏病)、超敏反应(例如，1、2或3型超敏反应)和胰腺炎。
在某些实施方式中，提供了靶向作用于因子XI核酸的化合物。在某些实施方式中，因子XI核酸为GENBANK登录号NM_000128.3(在本申请中作为SEQ ID NO：1并入)、GENBANK登录号NT_022792.17中的核苷酸19598000至19624000(在本申请中作为SEQ ID NO：2并入)、GENBANK登录号NM_028066.1(在本申请中作为SEQ IDNO：6并入)和GENBANK登录号NW_001118167.1的外显子1-15(在本申请中作为SEQ ID NO：274并入)中所列的任意序列。
在某些实施方式中，本发明提供了一种包含修饰寡核苷酸的化合物。在某些实施方式中，本发明的化合物包含一个由12至30个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸。
在某些实施方式中，本发明的化合物可以包含一个修饰寡核苷酸，其包含一个与SEQ ID NO：1等长的部分至少有80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％互补的核碱基序列。在某些实施方式中，本发明的化合物可以包含一个修饰寡核苷酸，其包含一个与SEQ ID NO：1等长的部分100％互补的核碱基序列。
在某些实施方式中，本发明提供一种包含修饰寡核苷酸的化合物，其包含一个与下文列出的靶RNA序列中核碱基靶区域的至少一部分互补的核碱基序列。
在某些实施方式中，本发明提供一种包含修饰寡核苷酸的化合物，其包含一个与SEQ ID NO：1的核碱基656至676的至少一部分互补的核碱基序列。所述修饰寡核苷酸可以包含与SEQ ID NO：1的核碱基656至676的等长部分互补的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或20个连续核碱基。所述修饰寡核苷酸可以包含一个与SEQ ID NO：1的等长部分至少有80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％互补的核碱基序列。所述修饰的寡核苷酸可以包含一个与SEQ ID NO：1的等长部分100％互补的核碱基序列。当采用RT-PCR检测法，任选地在HepG2细胞中进行检测时，所述修饰寡核苷酸对人mRNA水平的抑制至少可以达到80％(例如，实施例3中所描述的)。
在某些实施方式中，本发明提供一种包含修饰寡核苷酸的化合物，其包含一个与SEQ ID NO：1的核碱基665至687的至少一部分互补的核碱基序列。所述修饰寡核苷酸可以包含与SEQ ID NO：1的核碱基665至687的等长部分互补的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或20个连续核碱基。所述修饰寡核苷酸可以包含一个与SEQ IDNO：1的等长部分至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％互补的核碱基序列。所述修饰寡核苷酸可以包含一个与SEQ ID NO：1的等长部分100％互补的核碱基序列。当采用RT-PCR检测法，任选地在HepG2细胞中进行检测时，所述修饰寡核苷酸对人mRNA水平的抑制至少可以达到50％(例如，实施例3中所描述的)。
在某些实施方式中，本发明提供一种包含修饰寡核苷酸的化合物，其包含一个与SEQ ID NO：1的核碱基675至704的至少一部分互补的核碱基序列。所述修饰寡核苷酸可以包含与SEQ ID NO：1的核碱基675至704的等长部分互补的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或20个连续核碱基。所述修饰寡核苷酸可以包含一个与SEQ IDNO：1的等长部分至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％互补的核碱基序列。所述修饰寡核苷酸可以包含一个与SEQ ID NO：1的等长部分100％互补的核碱基序列。当采用RT-PCR检测法，任选地在HepG2细胞中进行检测时，所述修饰寡核苷酸对人mRNA水平的抑制至少可以达到50％(例如，实施例3中所描述的)。
在某些实施方式中，本发明提供一种包含修饰寡核苷酸的化合物，其包含一个与SEQ ID NO：1的核碱基677至704的至少一部分互补的核碱基序列。所述修饰寡核苷酸可以包含与SEQ ID NO：1的核碱基677至704的等长部分互补的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或20个连续核碱基。所述修饰寡核苷酸可以包含一个与SEQ ID NO：1的等长部分至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％互补的核碱基序列。所述修饰寡核苷酸可以包含一个与SEQ ID NO：1的等长部分100％互补的核碱基序列。当采用RT-PCR检测法，任选地在HepG2细胞中进行检测时，所述修饰寡核苷酸对人mRNA水平的抑制至少可以达到60％(例如，实施例3中所描述的)。
在某些实施方式中，本发明提供一种包含修饰寡核苷酸的化合物，其包含一个与SEQ ID NO：1的核碱基678至697的至少一部分互补的核碱基序列。所述修饰寡核苷酸可以包含与SEQ ID NO：1的核碱基678至697的等长部分互补的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或20个连续核碱基。所述修饰寡核苷酸可以包含一个与SEQ ID NO：1的等长部分至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％互补的核碱基序列。所述修饰寡核苷酸可以包含一个与SEQ ID NO：1的等长部分100％互补的核碱基序列。当采用RT-PCR检测法，任选地在HepG2细胞中进行检测时，所述修饰寡核苷酸对人mRNA水平的抑制至少可以达到70％
(例如，实施例3中所描述的)。
在某些实施方式中，本发明提供一种包含修饰寡核苷酸的化合物，其包含一个与SEQ ID NO：1的核碱基680至703的至少一部分互补的核碱基序列。所述修饰寡核苷酸可以包含与SEQ ID NO：1的核碱基680至703的等长部分互补的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或20个连续核碱基。所述修饰寡核苷酸可以包含一个与SEQ ID NO：1的等长部分至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％互补的核碱基序列。所述修饰寡核苷酸可以包含一个与SEQ ID NO：1的等长部分100％互补的核碱基序列。当采用RT-PCR检测法，任选地在HepG2细胞中进行检测时，所述修饰寡核苷酸对人mRNA水平的抑制至少可以达到80％(例如，实施例3和实施例14中所描述的)。
在某些实施方式中，本发明提供一种包含修饰寡核苷酸的化合物，其包含一个与SEQ ID NO：1的核碱基683至702的至少一部分互补的核碱基序列。所述修饰寡核苷酸可以包含与SEQ ID NO：1的核碱基683至702的等长部分互补的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或20个连续核碱基。所述修饰寡核苷酸可以包含一个与SEQ ID NO：1的等长部分至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％互补的核碱基序列。所述修饰寡核苷酸可以包含一个与SEQ ID NO：1的等长部分100％互补的核碱基序列。当采用RT-PCR检测法，任选地在HepG2细胞中进行检测时，所述修饰寡核苷酸对人mRNA水平的抑制至少可以达到90％(例如，实施例3中所描述的)。
在某些实施方式中，本发明提供一种包含修饰寡核苷酸的化合物，其包含一个与SEQ ID NO：1的核碱基738至759的至少一部分互补的核碱基序列。所述修饰寡核苷酸可以包含与SEQ ID NO：1的核碱基738至759的等长部分互补的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或20个连续核碱基。所述修饰寡核苷酸可以包含一个与SEQ ID NO：1的等长部分至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％互补的核碱基序列。所述修饰寡核苷酸可以包含一个与SEQ ID NO：1的等长部分100％互补的核碱基序列。当采用RT-PCR检测法，任选地在HepG2细胞中进行检测时，所述修饰寡核苷酸对人mRNA水平的抑制至少可以达到80％(例如，实施例3和实施例14中所描述的)。
在某些实施方式中，本发明提供一种包含修饰寡核苷酸的化合物，其包含一个与SEQ ID NO：1的核碱基738至760的至少一部分互补的核碱基序列。所述修饰寡核苷酸可以包含与SEQ ID NO：1的核碱基738至760的等长部分互补的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或20个连续核碱基。所述修饰寡核苷酸可以包含一个与SEQ ID NO：1的等长部分至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％互补的核碱基序列。所述修饰寡核苷酸可以包含一个与SEQ ID NO：1的等长部分100％互补的核碱基序列。当采用RT-PCR检测法，任选地在HepG2细胞中进行检测时，所述修饰寡核苷酸对人mRNA水平的抑制至少可以达到60％(例如，实施例3中所描述的)。
在某些实施方式中，本发明提供一种包含修饰寡核苷酸的化合物，其包含一个与SEQ ID NO：1的核碱基738至762的至少一部分互补的核碱基序列。所述修饰寡核苷酸可以包含与SEQ ID NO：1的核碱基738至762的等长部分互补的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或20个连续核碱基。所述修饰寡核苷酸可以包含一个与SEQ IDNO：1的等长部分至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％互补的核碱基序列。所述修饰寡核苷酸可以包含一个与SEQ ID NO：1的等长部分100％互补的核碱基序列。当采用RT-PCR检测法，任选地在HepG2细胞中进行检测时，所述修饰寡核苷酸对人mRNA水平的抑制至少可以达到45％(例如，实施例3中所描述的)。
在某些实施方式中，本发明提供一种包含修饰寡核苷酸的化合物，其包含一个与SEQ ID NO：1的核碱基1018至1042的至少一部分互补的核碱基序列。所述修饰寡核苷酸可以包含与SEQ ID NO：1的核碱基1018至1042的等长部分互补的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或20个连续核碱基。所述修饰寡核苷酸可以包含一个与SEQ ID NO：1的等长部分至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％互补的核碱基序列。所述修饰寡核苷酸可以包含一个与SEQ ID NO：1的等长部分100％互补的核碱基序列。当采用RT-PCR检测法，任选地在HepG2细胞中进行检测时，所述修饰寡核苷酸对人mRNA水平的抑制至少可以达到80％(例如，实施例3中所描述的)。
在某些实施方式中，本发明提供一种包含修饰寡核苷酸的化合物，其包含一个与SEQ ID NO：1的核碱基1062至1089的至少一部分互补的核碱基序列。所述修饰寡核苷酸可以包含与SEQ ID NO：1的核碱基1062至1089的等长部分互补的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或20个连续核碱基。所述修饰寡核苷酸可以包含一个与SEQ ID NO：1的等长部分至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％互补的核碱基序列。所述修饰寡核苷酸可以包含一个与SEQ ID NO：1的等长部分100％互补的核碱基序列。当采用RT-PCR检测法，任选地在HepG2细胞中进行检测时，所述修饰寡核苷酸对人mRNA水平的抑制至少可以达到70％(例如，实施例3中所描述的)。
在某些实施方式中，本发明提供一种包含修饰寡核苷酸的化合物，其包含一个与SEQ ID NO：1的核碱基1062至1090的至少一部分互补的核碱基序列。所述修饰寡核苷酸可以包含与SEQ ID NO：1的核碱基1062至1090的等长部分互补的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或20个连续核碱基。所述修饰寡核苷酸可以包含一个与SEQ ID NO：1的等长部分至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％互补的核碱基序列。所述修饰寡核苷酸可以包含一个与SEQ ID NO：1的等长部分100％互补的核碱基序列。当采用RT-PCR检测法，任选地在HepG2细胞中进行检测时，所述修饰寡核苷酸对人mRNA水平的抑制至少可以达到60％(例如，实施例3中所描述的)。
在某些实施方式中，本发明提供一种包含修饰寡核苷酸的化合物，其包含一个与SEQ ID NO：1的核碱基1062至1091的至少一部分互补的核碱基序列。所述修饰寡核苷酸可以包含与SEQ ID NO：1的核碱基1062至1091的等长部分互补的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或20个连续核碱基。所述修饰寡核苷酸可以包含一个与SEQ ID NO：1的等长部分至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％互补的核碱基序列。所述修饰寡核苷酸可以包含一个与SEQ ID NO：1的等长部分100％互补的核碱基序列。当采用RT-PCR检测法，任选地在HepG2细胞中进行检测时，所述修饰寡核苷酸对人mRNA水平的抑制至少可以达到20％(例如，实施例3中所描述的)。
在某些实施方式中，本发明提供一种包含修饰寡核苷酸的化合物，其包含一个与SEQ ID NO：1的核碱基1275至1301的至少一部分互补的核碱基序列。所述修饰寡核苷酸可以包含与SEQ ID NO：1的核碱基1062至1091的等长部分互补的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或20个连续核碱基。所述修饰寡核苷酸可以包含一个与SEQ ID NO：1的等长部分至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％互补的核碱基序列。所述修饰寡核苷酸可以包含一个与SEQ ID NO：1的等长部分100％互补的核碱基序列。当采用RT-PCR检测法，任选地在HepG2细胞中进行检测时，所述修饰寡核苷酸对人mRNA水平的抑制至少可以达到80％(例如，实施例3中所描述的)。
在某些实施方式中，本发明提供一种包含修饰寡核苷酸的化合物，其包含一个与SEQ ID NO：1的核碱基1276至1301的至少一部分互补的核碱基序列。所述修饰寡核苷酸可以包含与SEQ ID NO：1的核碱基1062至1091的等长部分互补的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或20个连续核碱基。所述修饰寡核苷酸可以包含一个与SEQ ID NO：1的等长部分至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％互补的核碱基序列。所述修饰寡核苷酸可以包含一个与SEQ ID NO：1的等长部分100％互补的核碱基序列。当采用RT-PCR检测法，任选地在HepG2细胞中进行检测时，所述修饰寡核苷酸对人mRNA水平的抑制至少可以达到80％(例如，实施例14中所描述的)。
在某些实施方式中，本发明提供一种包含修饰寡核苷酸的化合物，其包含一个与SEQ ID NO：1的核碱基1284至1308的至少一部分互补的核碱基序列。所述修饰寡核苷酸可以包含与SEQ ID NO：1的核碱基1062至1091的等长部分互补的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或20个连续核碱基。所述修饰寡核苷酸可以包含一个与SEQ ID NO：1的等长部分至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％互补的核碱基序列。所述修饰寡核苷酸可以包含一个与SEQ ID NO：1的等长部分100％互补的核碱基序列。当采用RT-PCR检测法，任选地在HepG2细胞中进行检测时，所述修饰寡核苷酸对人mRNA水平的抑制至少可以达到80％(例如，实施例3中所描述的)。
在某些实施方式中，本发明提供一种包含修饰寡核苷酸的化合物，其包含一个与SEQ ID NO：1的核碱基1291至1317的至少一部分互补的核碱基序列。所述修饰寡核苷酸可以包含与SEQ ID NO：1的核碱基1062至1091的等长部分互补的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或20个连续核碱基。所述修饰寡核苷酸可以包含一个与SEQ ID NO：1的等长部分至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％互补的核碱基序列。所述修饰寡核苷酸可以包含一个与SEQ ID NO：1的等长部分100％互补的核碱基序列。当采用RT-PCR检测法，任选地在HepG2细胞中进行检测时，所述修饰寡核苷酸对人mRNA水平的抑制至少可以达到80％(例如，实施例3中所描述的)。
在某些实施方式中，本发明提供一种包含修饰寡核苷酸的化合物，其包含一个与SEQ ID NO：1的核碱基1275至1318的至少一部分互补的核碱基序列。所述修饰寡核苷酸可以包含与SEQ ID NO：1的核碱基1275至1318的等长部分互补的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或20个连续核碱基。所述修饰寡核苷酸可以包含一个与SEQ ID NO：1的等长部分至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％互补的核碱基序列。所述修饰寡核苷酸可以包含一个与SEQ ID NO：1的等长部分100％互补的核碱基序列。当采用RT-PCR检测法，任选地在HepG2细胞中进行检测时，所述修饰寡核苷酸对人mRNA水平的抑制至少可以达到70％(例如，实施例3中所描述的)。
本发明所述的实施方式提供包含由12至30个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸的化合物，其具有的核碱基序列包含选自SEQ ID NOs：15至241中所示核碱基序列的某个核碱基序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或20个连续核碱基。
本发明所述的实施方式提供包含由12至30个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸的化合物，其具有的核碱基序列包含选自SEQ ID NOs：15至269中所示核碱基序列的某个核碱基序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或20个连续核碱基的核碱基序列。
本发明所述的实施方式提供包含由12至30个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸的化合物，其具有的核碱基序列包含选自SEQ ID NOs：242至269中所示核碱基序列的某个核碱基序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或20个连续核碱基。
本发明所述的某些实施方式提供包含由12至30个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸的化合物，其具有的核碱基序列包含选自SEQ ID NOs：15至269中所示核碱基序列的某个核碱基序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或20个连续核碱基。
本发明所述的某些实施方式提供包含由12至30个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸的化合物，其具有的核碱基序列包含选自SEQ ID NOs：242至269中所示核碱基序列的某个核碱基序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或20个连续核碱基。
在某些实施方式中，修饰寡核苷酸包含选自ISIS NO：22、31、32、34、36至38、40、41、43、51至53、55、56、59、60、64、66、71、73、75、96、98至103、105至109、113至117、119、124、127、129、171、172、174、176、178、179、181至197、199至211和213至232的核碱基序列的某个核碱基序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或20个核碱基。在某些实施方式中，修饰寡核苷酸包含选自SEQ ID NOs：22、31、32、34、36至38、40、41、43、51至53、55、56、59、60、64、66、71、73、75、96、98至103、105至109、113至117、119、124、127、129、171、172、174、176、178、179、181至197、199至211和213至232的核碱基序列。在某些实施方式中，修饰寡核苷酸由选自SEQ ID NOs：22、31、32、34、36至38、40、41、43、51至53、55、56、59、60、64、66、71、73、75、96、98至103、105至109、113至117、119、124、127、129、171、172、174、176、178、179、181至197、199至211和213至232的核碱基序列组成。当采用RT-PCR检测法，任选地在HepG2细胞中进行检测时，所述修饰寡核苷酸对人mRNA水平的抑制至少可以达到70％(例如，实施例3中所描述的)。
在某些实施方式中，修饰寡核苷酸包含选自ISIS NO：22、31、34、37、40、43、51至53、60、98、100至102、105至109、114、115、119、171、174、176、179、181、186、188至193、195、196、199至210和213至232的核碱基序列的某个核碱基序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或20个核碱基。在某些实施方式中，修饰寡核苷酸包含选自SEQ ID NOs：22、31、34、37、40、43、51至53、60、98、100至102、105至109、114、115、119、171、174、176、179、181、186、188至193、195、196、199至210和213至232的核碱基序列。在某些实施方式中，修饰寡核苷酸由选自SEQ ID NOs：22、31、34、37、40、43、51至53、60、98、100至102、105至109、114、115、119、171、174、176、179、181、186、188至193、195、196、199至210和213至232的核碱基序列组成。当采用RT-PCR检测法，任选地在HepG2细胞中进行检测时，所述修饰寡核苷酸对人mRNA水平的抑制至少可以达到80％(例如，实施例3中所描述的)。
在某些实施方式中，修饰寡核苷酸包含选自ISIS NO：31、37、100、105、179、190至193、196、202至207、209、210、214至219、221至224、226、227、229和231的核碱基序列的某个核碱基序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或20个核碱基。在某些实施方式中，修饰寡核苷酸包含选自SEQ ID NOs：31、37、100、105、179、190至193、196、202至207、209、210、214至219、221至224、226、227、229和231的核碱基序列。在某些实施方式中，修饰寡核苷酸由选自SEQ IDNOs：31、37、100、105、179、190至193、196、202至207、209、210、214至219、221至224、226、227、229和231的核碱基序列组成。当采用RT-PCR检测法，任选地在HepG2细胞中进行检测时，所述修饰寡核苷酸对人mRNA水平的抑制至少可以达到90％(例如，实施例3中所描述的)。
在某些实施方式中，修饰寡核苷酸包含选自ISIS NO：34、52、53、114、115、190、213至232、242至260和262至266的核碱基序列的某个核碱基序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或20个核碱基。在某些实施方式中，修饰寡核苷酸包含选自SEQ ID NOs：34、52、53、114、115、190、213至232、242至260和262至266的核碱基序列。在某些实施方式中，修饰寡核苷酸由选自SEQ ID NOs：34、52、53、114、115、190、213至232、242至260和262至266的核碱基序列组成。当采用RT-PCR检测法，任选地在HepG2细胞中进行检测时，所述修饰寡核苷酸对人mRNA水平的抑制至少可以达到70％(例如，实施例14中所描述的)。
在某些实施方式中，修饰寡核苷酸包含选自ISIS NO：34、52、53、114、115、190、213至216、218至226、243至246、248、249、252至259、264和265的核碱基序列的某个核碱基序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或20个核碱基。在某些实施方式中，修饰寡核苷酸包含选自SEQ ID NOs：34、52、53、114、115、190、213至216、218至226、243至246、248、249、252至259、264和265的核碱基序列。在某些实施方式中，修饰寡核苷酸由选自SEQ ID NOs：34、52、53、114、115、190、213至216、218至226、243至246、248、249、252至259、264和265的核碱基序列组成。当采用RT-PCR检测法，任选地在HepG2细胞中进行检测时，所述修饰寡核苷酸对人mRNA水平的抑制至少可以达到80％(例如，实施例14中所描述的)。
在某些实施方式中，修饰寡核苷酸包含选自ISIS NO：34、190、215、222、223、226、246和254的核碱基序列的某个核碱基序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或20个核碱基。在某些实施方式中，修饰寡核苷酸包含选自SEQ IDNOs：34、190、215、222、223、226、246和254的核碱基序列。在某些实施方式中，修饰寡核苷酸由选自SEQ ID NOs：34、190、215、222、223、226、246和254的核碱基序列组成。当采用RT-PCR检测法，任选地在HepG2细胞中进行检测时，所述修饰寡核苷酸对人mRNA水平的抑制至少可以达到90％(例如，实施例14中所描述的)。
在某些实施方式中，本发明化合物由单链修饰寡核苷酸组成。
在某些实施方式中，修饰寡核苷酸由12至30个连接的核苷或20个连接的核苷组成。
在某些实施方式中，修饰寡核苷酸的核碱基序列与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：274的核碱基序列100％互补。
在某些实施方式中，化合物至少具有一个修饰的核苷间连接。在某些实施方式中，修饰的核苷间连接是硫代磷酸酯核苷间连接。在某些实施方式中，各修饰的核苷间连接均是硫代磷酸酯核苷间连接。
在某些实施方式中，化合物具有至少一个包含修饰糖的核苷。在某些实施方式中，至少一个修饰糖是双环糖。在某些实施方式中，至少一个修饰糖包含2’-O-甲氧乙基(2’MOE)。
在某些实施方式中，化合物具有至少一个包含修饰核碱基的核苷。在某些实施方式中，修饰核碱基是5-甲基胞嘧啶。
在某些实施方式中，化合物的修饰寡核苷酸包括：
(i)由连接的脱氧核苷组成的间隔区；
(ii)由连接的核苷组成的5’侧翼区；
(iii)由连接的核苷组成的3’侧翼区，其中所述间隔区位于5’侧翼区和3’侧翼区之间且直接相邻，并且其中每个侧翼区的每个核苷均包含修饰的糖。
在某些实施方式中，化合物的修饰寡核苷酸包括：
(i)由10个连接的脱氧核苷组成的间隔区；
(ii)由连接的核苷组成的5’侧翼区；
(iii)由连接的核苷组成的3’侧翼区，其中所述间隔区位于5’侧翼区和3’侧翼区之间且直接相邻，并且其中每个侧翼区的每个核苷均包含修饰的糖。
在某些实施方式中，化合物的修饰寡核苷酸包括：
(i)由10个连接的脱氧核苷组成的间隔区；
(ii)由5个连接的核苷组成的5’侧翼区；
(iii)由5个连接的核苷组成的3’侧翼区；其中所述间隔区位于5’侧翼区和3’侧翼区之间且直接相邻，其中每个侧翼区的每个核苷均包含2’-O-甲氧乙基糖；并且其中每个核苷间连接均为硫代磷酸酯键。
在某些实施方式中，化合物的修饰寡核苷酸包括：
(i)由14个连接的脱氧核苷组成的间隔区；
(ii)由3个连接的核苷组成的5’侧翼区；
(iii)由3个连接的核苷组成的3’侧翼区；其中所述间隔区位于5’侧翼区和3’侧翼区之间且直接相邻，其中每个侧翼区的每个核苷均包含2’-O-甲氧乙基糖；并且其中每个核苷间连接均为硫代磷酸酯键。
在某些实施方式中，化合物的修饰寡核苷酸包括：
(i)由13个连接的脱氧核苷组成的间隔区；
(ii)由2个连接的核苷组成的5’侧翼区；
(iii)由5个连接的核苷组成的3’侧翼区；其中所述间隔区位于5’侧翼区和3’侧翼区之间且直接相邻，其中每个侧翼区的每个核苷均包含2’-O-甲氧乙基糖；并且其中每个核苷间连接均为硫代磷酸酯键。
在某些实施方式中，本发明提供了用于治疗处于炎症疾病、异常或状况风险之中的动物，或用于治疗患有炎症疾病、异常或状况的动物的方法、化合物和组合物，包括对动物给药治疗有效量的包含由12至30个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸的化合物，其中所述修饰寡核苷酸与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中所示的因子XI的核酸互补。
在某些实施方式中，本发明提供了用于治疗处于炎症疾病、异常或状况风险之中的动物，或用于治疗患有炎症疾病、异常或状况的动物的方法、化合物和组合物，包括对动物给药治疗有效量的包含修饰寡核苷酸的化合物，所述修饰寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成且具有的核碱基序列包含选自SEQ ID NOs：15至269所示的任意核碱基序列中的某个核碱基序列的至少8个连续核碱基。
在某些实施方式中，对动物给药因子XI调节剂不会导致有害的出血或加剧出血状况。
在某些实施方式中，预先对动物给药一种或多种因子XI调节剂。
在某些实施方式中，动物是人。
在某些实施方式中，本发明的化合物用于治疗、预防或改善动物的炎症反应、疾病、异常或状况。在某些实施方式中，应答、疾病、异常或状况与因子XI有关。在某些实施方式中，炎症反应、疾病、异常或状况可以包括，但不限于，或者由以下所致或与之相关，关节炎、结肠炎、纤维化、过敏性炎症和哮喘、心血管疾病、糖尿病、败血症、免疫增生性疾病、抗磷脂综合征、移植相关疾病和自身免疫性疾病或其组合。
关节炎的例子包括，但不限于，类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、痛风性关节炎、痛风、慢性多关节炎、关节周炎、肩周炎、颈椎关节炎、腰骶关节炎、骨关节炎、牛皮癣关节炎、肠病性关节炎和强直性脊柱炎。
结肠炎的例子包括，但不限于，溃疡性结肠炎、炎性肠病(IBD)和克罗恩氏病。
移植相关疾病的例子包括，但不限于，移植物抗宿主疾病(GVHD)、与移植物排斥反应相关的疾病、慢性排斥以及组织或细胞同种异体移植或异体移植。
免疫增生性疾病的例子包括，但不限于，癌症(例如，肺癌)和良性过度增生。
自身免疫性疾病的例子包括，但不限于，狼疮(例如，系统性红斑狼疮、狼疮性肾炎)、桥本氏甲状腺炎、原发性粘液性水肿、格氏病、恶性贫血、自身免疫性萎缩性胃炎、爱迪生氏病、糖尿病(例如，胰岛素依赖性糖尿病、I型糖尿病、II型糖尿病)、肺出血-肾炎综合征、重症肌无力、天疱疮、克罗恩氏病、交感性眼炎、自身免疫性葡萄膜炎、多发性硬化症、自身免疫性溶血性贫血、自发性血小板减少症、原发性胆汁性肝硬化、慢性活动性肝炎、溃疡性结肠炎、干燥综合征、风湿性疾病(例如，类风湿性关节炎)、多肌炎、硬皮病、牛皮癣和混合结缔组织疾病。
在某些实施方式中，对动物给药化合物和组合物以治疗、预防或改善炎症疾病。在某些实施方式中，通过胃肠道外途径对动物给药。在某些实施方式中，胃肠道外给药为皮下或静脉给药。
在某些实施方式中，化合物与一种或多种另外的制剂合用。在某些实施方式中，另外的制剂为NSAID或疾病改善型药物。
NSAIDS包括，但不限于，乙酰水杨酸、水杨酸胆碱镁、二氟尼柳、水杨酸镁、双水杨酯、水杨酸钠、双氯芬酸、依托度酸、非诺洛芬、氟比洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、酮咯酸、甲氯灭酸、萘普生、萘丁美酮、保泰松、吡罗昔康、舒林酸、托美丁、对乙酰氨基酚、布洛芬、Cox-2抑制剂、美洛昔康和曲马多。本发明化合物和一种或多种NSAID可以联合或顺序给药。
疾病改善型药物的例子包括，但不限于，甲氨蝶呤、阿巴西普、英大利昔单抗、环磷酰胺、硫唑嘌呤、皮质激素、环孢菌素A、氨基水杨酸盐、柳氮磺吡啶、羟氯喹、来氟米特、依那西普、依法利珠、6-巯基嘌呤(6-MP)和肿瘤坏死因子-α(TNFα)或其他细胞因子阻断剂或拮抗剂。本发明化合物和一种或多种疾病改善型药物可以联合或顺序给药。
在某些实施方式中，化合物或寡核苷酸可以成盐。
在某些实施方式中，化合物或组合物可以加入药学上可接受的载体或稀释剂制成制剂。
在某些实施方式中，本发明提供了用于治疗、预防或改善炎症反应或炎症疾病、异常或状况的方法和组合物。因子XI具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：274所示的序列。在某些实施方式中，使用修饰的寡核苷酸治疗炎症反应或炎症疾病、异常或状况。在某些实施方式中，修饰的寡核苷酸具有的核碱基序列包含选自SEQ ID NOs：15-269所示的核碱基序列的某个核碱基序列的至少8个连续核碱基。
在某些实施方式中，本发明提供用于生产治疗、预防或改善炎症反应或炎症疾病、异常或状况的药物的方法和化合物。因子XI具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：6或SEQ ID NO：274所示的序列。在某些实施方式中，本发明提供一种用于生产治疗、预防或改善炎症反应或炎症疾病、异常或状况的药物的修饰寡核苷酸。在某些实施方式中，修饰寡核苷酸具有的核碱基序列包含选自SEQ ID NOs：15至269中核碱基序列的某个核碱基序列的一部分连续核碱基，或包含与本发明所述的靶区段或靶区域互补的一部分连续核碱基。在某些实施方式中，修饰寡核苷酸具有的核碱基序列包含选自SEQ IDNOs：15至269的核碱基序列的某个核碱基序列的至少8个连续核碱基。或包含与本发明所述的靶区段或靶区域互补的至少8个连续核碱基。
在某些实施方式中，本发明提供了本发明所述的因子Ⅺ调节剂用于生产药物的用途，所述药物用于治疗、改善或预防与因子XI相关的炎症疾病、异常或状况。
在某些实施方式中，本发明提供了本发明所述的因子XI调节剂用于治疗、改善或预防本发明所述的炎症疾病、异常或状况的用途。因子XI调节剂可以与本发明所述的一种或多种其他药物或疗法合用。药物或疗法可以联合或顺序对动物给药。
在某些实施方式中，本发明提供了本发明所述的因子XI调节剂用于生产药物的用途，所述药物用于治疗、改善或预防本发明所述的炎症疾病、异常或状况。因子XI调节剂可以与本发明所述的一种或多种其他药物或疗法合用。药物或疗法可以联合或顺序对动物给药。
在某些实施方式中，本发明提供了用于治疗、预防或改善本发明所述的炎症反应、疾病、异常或状况的药物盒，其中所述药物盒包括：
(i)本发明所述的因子XI特异性抑制剂；以及可选地
(ii)本发明所述的其他药物或疗法，
本发明的药物盒可以进一步包括使用该药物盒治疗、预防或改善本发明所述的炎症疾病、异常或状况的说明书，如本发明所述的联合治疗。
反义化合物
寡聚化合物包含，但不限于，寡核苷酸、寡核苷、寡核苷酸类似物、寡核苷酸模拟物、反义化合物，反义寡核苷酸和siRNA。寡聚化合物可以对靶核酸“反义”，即其能够通过氢键与靶核酸进行杂交。
在某些实施方式中，反义化合物具有这样的核碱基序列，当其以5’到3’方向书写的时候，包含其靶向作用的靶核酸的靶区段的反向互补序列。在某些实施方式中，反义寡核苷酸具有这样的核碱基序列，当其以5’到3’方向书写的时候，包含其靶向作用的靶核酸的靶区段的反向互补序列。
在某些实施方式中，靶向作用于因子XI核酸的反义化合物的长度为12至30个亚单位。也就是说，反义化合物为12至30个连接的亚单位。在其他实施方式中，所述反义化合物为8至80、12至50、15至30、18至24、19至22、或20个连接的亚单位。在某些这样的实施方式中，反义化合物的长度为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、或80个连接的亚单位，或由上述值的任意两个所确定的范围内。在某些实施方式中，反义化合物是反义寡核苷酸，连接的亚单位是核苷酸。
在某些实施方式中，靶向作用于因子XI核酸的缩短或截短的反义化合物从5’端(5’截短)或可选地从3’端(3’截短)缺失了单一亚单位。靶向作用于因子XI核酸的缩短或截短的反义化合物可以从该反义化合物5’端缺失两个亚单位，或可选地从3’端缺失两个亚单位。可选地，所缺失的核苷可分散于整个反义化合物中，例如，在反义化合物中从5’端缺失一个核苷并且从3’端也缺失一个核苷。
当在延长的反义化合物中存在单个添加的亚单元时，所述添加的亚单元可以位于所述反义化合物的5’或3’末端。当存在两个或更多添加的亚单元时，所述添加的亚单元可以彼此相邻；例如，在具有添加于5’端(5’添加)或可选地于3’端(3’添加)的2个亚单元的反义化合物中。可选地，所述添加的亚单元可以分散于所述反义化合物中，例如，在反义化合物中有一个添加于5’端的亚单元和一个添加于3’端的亚单元。
可以增加或减少反义化合物例如反义寡核苷酸的长度，和/或掺入不匹配碱基，而不消除其活性。例如，在Woolf et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：7305-7309，1992)中，测试了一系列13-25个碱基长度的反义寡核苷酸在卵母细胞注射模型中诱导剪切靶RNA的活性。具有25个碱基长度、并在反义寡核苷酸的末端附近具有8或11个不匹配碱基的反义寡核苷酸能够引导靶mRNA的特异性剪切，虽然相比于不含有不匹配碱基的反义寡核苷酸而言其程度较轻。相似地，使用13个碱基的反义寡核苷酸，包括那些具有1或3个不匹配碱基的，也能实现靶向特异性的剪切。
Gautschi等人(J.Natl.Cancer Inst.93：463-471，March 2001)证明了，与bcl-2mRNA具有100％互补性，且与bcl-xL mRNA具有3个错配的寡核苷酸在体外和体内降低bcl-2和bcl-xL两者的表达。另外，该寡核苷酸显示出强效的体内抗肿瘤活性。
Maher和Dolnick(Nuc.Acid.Res.16：3341-3358，1988)在家兔网织红细胞实验中分别检测了一系列串联的14个核碱基反义寡核苷酸，以及包含两个或三个串联反义寡核苷酸的28和42个核碱基的反义寡核苷酸阻滞人DHFR翻译的能力。三种14个核碱基的反义寡核苷酸各自都能够单独抑制翻译，尽管其抑制水平略低于28或42个核碱基的寡核苷酸。
反义化合物基序
在某些实施方式中，靶向作用于因子XI核酸的反义化合物具有化学修饰的亚单位，这些亚单位配置成某些模式或基序，以赋予反义化合物某些特性，例如，抑制活性增强、对于靶核酸的结合亲和力增加，或在体内对核酸酶降解具有抗性。
嵌合的反义化合物通常含有至少一个修饰的区域，从而使其对核酸酶降解的抗性增强、细胞摄取增加、对于靶核酸的结合亲和力增加和/或抑制活性增加。嵌合反义化合物的另一个区域可任选作为细胞内切核酸酶RNA酶H的底物，RNA酶H剪切RNA:DNA双链体的RNA链。
具有gapmer基序的反义化合物被认为是嵌合反义化合物。在gapmer中，具有多个核苷酸的支持RNA酶H剪切的内部区域位于外部区域之间，外部区域具有与内部区域的核苷化学上不同的多个核苷酸。在具有gapmer基序的反义寡核苷酸的情况中，间隔区通常作为核酸内切酶剪切的底物，而侧翼区包含修饰的核苷。在某些实施方式中，gapmer区域由各不同区域包含的糖基类型而区别开来。在某些实施方式中，用于区别gapmer区域的糖基的类型可包括β-D-核糖核苷、β-D-脱氧核糖核苷、2’-修饰的核苷(除了其他的，这样的2’-修饰的核苷还可包括2’-MOE和2’-O-CH3等等)，双环糖修饰的核苷(这样的双环糖修饰的核苷可包括具有4’-(CH2)n-O-2’桥键，其中，n＝1或n＝2的那些双环糖修饰的核苷)。优选地，每个不同区域中包括的糖基一致。侧翼-间隔-侧翼基序通常被描述为“X-Y-Z”，其中“X”代表5’侧翼区的长度，“Y”代表间隔区域的长度，“Z”代表3’侧翼区的长度。在本申请中，被描述为“X-Y-Z”的gapmer具有一构型，使得间隔区与各5’侧翼区和3’侧翼区直接相邻。因此，在5’侧翼区和间隔区之间或在间隔区和3’侧翼区之间不存在介入的核苷酸。本发明描述的任何反义化合物可具有gapmer基序。在一些实施方式中，X和Z是相同的，在另一些实施方式中，它们是不同的。在一些实施方式中，Y为8至15个核苷酸。X、Y或Z可为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个、30个或更多数量的核苷酸。因此，本发明的gapmer包括但不限于，例如，5-10-5、4-8-4、4-12-3、4-12-4、3-14-3、2-13-5、2-16-2、1-18-1、3-10-3、2-10-2、1-10-1、或2-8-2。
在某些实施方式中，反义化合物具有“wingmer”基序，该基序具有侧翼-间隔或间隔-侧翼构型，即如上所述的gapmer构型的X-Y或Y-Z构型。因此，本发明的wingmer构型包括但不限于，例如5-10、8-4、4-12、12-4、3-14、16-2、18-1、10-3、2-10、1-10、8-2、2-13、或5-13。
在某些实施方式中，靶向作用于因子XI核酸的反义化合物具有5-10-5gapmer基序。
在某些实施方式中，靶向作用于因子XI核酸的反义化合物具有3-14-3gapmer基序。
在某些实施方式中，靶向作用于因子XI核酸的反义化合物具有2-13-5gapmer基序。
在某些实施方式中，靶向作用于因子XI核酸的反义化合物具有间隔加宽的基序。
在某些实施方式中，靶向作用于因子XI核酸的间隔加宽的反义寡核苷酸具有含14个2’-脱氧核糖核苷的间隔区，其位于含3个化学修饰核苷的侧翼区之间并与之直接相邻。在某些实施方式中，所述化学修饰包括2’-糖修饰。在另一实施方式中，所述化学修饰包括2’-MOE糖修饰。
在某些实施方式中，靶向作用于因子XI核酸的间隔加宽的反义寡核苷酸具有含13个2’-脱氧核糖核苷酸的间隔区，其位于具有2个化学修饰的核苷的5’侧翼区和具有5个化学修饰的核苷的3’侧翼区之间并且与之直接相邻。在某些实施方式中，所述化学修饰包括2’-糖修饰。在另一实施方式中，所述化学修饰包括2’-MOE糖修饰。
靶核酸、靶区域和核苷酸序列
编码因子XI的核苷酸序列包括，但不限于，下列序列：GENBANK
Figure BPA00001481359800341
登录号NM_000128.3，于1999年3月24日首次在GENBANK
Figure BPA00001481359800342
中保存，在本发明中作为SEQID NO：1并入；GENBANK
Figure BPA00001481359800343
登录号NT_022792.17，截取19598000至19624000，于2000年11月29日首次在GENBANK
Figure BPA00001481359800344
中保存，且在本发明中作为SEQ ID NO：2并入；GENBANK
Figure BPA00001481359800345
登录号NM_028066.1，于2002年6月2日首次在GENBANK
Figure BPA00001481359800346
中保存，在本发明中作为SEQ ID NO：6并入；以及GENBANK登录号NW_001118167.1的外显子1-15(在本发明中作为SEQ ID NO：274并入)。
应当理解，本发明实施例中的各SEQ ID NO中所列的序列不依赖于对糖基、核苷间连接或核碱基的任何修饰。因此，由SEQ IDNO定义的反义化合物可独立地包括对糖基、核苷间连接或核碱基的一种或多种修饰。Isis编号(Isis No.)描述的反义化合物表示核碱基序列和基序的组合。
在某些实施方式中，靶区域为靶核酸上以结构定义的区域。例如，靶区域可包含3’UTR、5’UTR、外显子、内含子、外显子/内含子接头、编码区、翻译起始区、翻译终止区或其他定义的核酸区域。因子XI的以结构定义的区域可通过诸如NCBI的序列数据库的登录号来获得，这样的信息通过引用并入本申请。在某些实施方式中，靶区域可包含从靶区域内的一个靶区段的5’靶位点至靶区域的另一靶区段的3’靶位点的序列。
靶向包括确定反义化合物与之杂交从而发生所需作用的至少一个靶区段。在某些实施方式中，所需作用是降低mRNA靶核酸水平。在某些实施方式中，所需作用是降低由所述靶核酸编码的蛋白水平，或发生与靶核酸相关的表型改变。
靶区域可含有一个或多个靶区段。靶区域内的多个靶区段可为重叠的。可选地，它们可为不重叠的。在某些实施方式中，靶区域内的靶区段由不超过约300个核苷酸分隔。在某些实施方式中，靶区域内的靶区段由靶核酸上的多个核苷酸分隔，所述多个核苷酸为、约为、不超过、不超过约250个、200个、150个、100个、90个、80个、70个、60个、50个、40个、30个、20个、或10个核苷酸，或为任何两个前述数值限定的范围。在某些实施方式中，靶区域内的靶区段由靶核酸上的不超过、不超过约5个核苷酸分隔。在某些实施方式中，靶区段是连续的。预期的靶区域由一范围来确定，该范围的起始核酸是本发明所列的任何5’靶位点或3’靶位点。
合适的靶区段可见于5’UTR、编码区、3’UTR、内含子、外显子或外显子/内含子接头内。含有起始密码子或终止密码子的靶区段也是适宜的靶区段。适宜的靶区段可特别排除某些以结构定义的区域，例如起始密码子或终止密码子。
确定适宜的靶区段可包括将靶核酸与基因组中的其他序列进行比较。例如，可以使用BLAST算法来识别不同核酸中具有相似性的区域。该比较可以防止选择到的反义化合物序列以非特异性方式与除了所选择的靶核酸以外的序列(即，非靶序列或脱靶序列)杂交。
在活性靶区域内，反义化合物的活性(例如，以靶核酸水平降低的百分数所定义)可以不同。在某些实施方式中，因子XI mRNA水平降低提示因子XI表达被抑制。因子XI蛋白水平的降低也提示靶mRNA水平被抑制。另外，表型改变提示因子XI表达被抑制。例如，延长的PTT时间可提示因子XI的表达被抑制。在另一实例中，延长的aPTT时间与正常的PT时间一起可提示因子XI的表达被抑制。在另一实例中，血小板因子4(PF-4)表达量降低可提示因子XI的表达被抑制。在另一实例中，炎症形成(例如，血栓、哮喘、关节炎或结肠炎形成)减轻可提示因子XI的表达被抑制。可选地，炎症形成(例如，血栓、哮喘、关节炎或结肠炎形成)时间增加可提示因子XI的表达被抑制。
杂交
在某些实施方式中，在本发明公开的反义化合物和因子XI核酸之间发生杂交。最常用的杂交机制涉及核酸分子的互补核碱基之间的氢键键合(例如，Watson-Crick、Hoogsteen或逆向Hoogsteen氢键键合)。
杂交可在不同条件下发生。严谨条件具有序列依赖性，并且由待杂交的核酸分子的性质和组成来确定。
确定某序列是否可与靶核酸特异性杂交的方法为本领域的公知常识。在某些实施方式中，本发明提供的反义化合物可与因子XI核酸特异性杂交。
互补性
当反义化合物中有足够数量的核碱基可与靶核酸的相应核碱基以氢键键合，从而发生所需的作用(例如，诸如因子XI核酸靶核酸的反义抑制)时，反义化合物和靶核酸相互之间互补。
反义化合物和因子XI核酸之间可以具有非互补的核碱基，只要反义化合物仍能够与靶核酸特异性杂交。另外，反义化合物可与因子XI核酸的一个或多个区段杂交，使得介入或相邻片段不参与杂交事件(例如，环结构、错配或发夹结构)。
在某些实施方式中，本发明提供的反义化合物或其特定部分与因子XI核酸、其靶区域、靶区段或其特定部分为，或至少为，70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％互补。反义化合物与靶核酸的互补百分数可使用常规方法来确定。
例如，如果反义化合物的20个核碱基中有18个与靶区域互补，并因此能够特异性杂交，则该反义化合物为90％互补。在这个实例里，其余的非互补核碱基可以是聚集的或分散于互补核碱基之间，并且不需要相互连续或与互补核碱基连续。因此，如果一个长度为18个核碱基的反义化合物具有4个非互补的与两个与靶核酸完全互补区域侧接的核碱基，则这样的反义化合物与靶核酸在整体上具有77.8％的互补性，因此落入本发明的范围内。反义化合物与靶核酸区域的互补百分比可以用本领域公知的BLAST程序(基础局部比对检索工具)和PowerBLAST程序进行常规确定(Altschul et al.，J.MoI.Biol.，1990，215，403410；Zhang and Madden，Genome Res.，1997，7，649656)。同源百分比、序列同一性或互补性百分数可以通过，例如使用Smith和Waterman算法(Adv.Appl.Math.，1981，2，482489)的Gap程序(Wisconsin Sequence Analysis Package，Version 8 for Unix，Genetics Computer Group，University Research Park，Madison Wis.)，使用默认设置来确定。
在某些实施方式中，本发明提供的反义化合物或其特定部分与靶核酸或其特定部分完全互补(即，100％互补)。例如，反义化合物可与因子XI核酸、或其靶区域、或靶区段或靶序列完全互补。在本申请中，“完全互补”是指反义化合物的各核碱基能够与靶核酸的相应核碱基精确碱基配对。例如，20个核碱基的反义化合物与400个核碱基长度的靶序列完全互补，只要靶核酸的相应20个核碱基部分与反义化合物完全互补即可。完全互补还可用于指第一和/或第二核酸的特定部分。例如，含30个核碱基的反义化合物中的20个核碱基部分可与长度为400个核碱基的靶序列“完全互补”。如果靶序列具有相应的20个核碱基部分，其中各碱基与反义化合物的20个核碱基部分互补，则所述含30个核碱基的寡核苷酸中的20个核碱基部分与靶序列完全互补。同时，完整的30个核碱基的反义化合物可与靶序列完全互补或者不与其完全互补，这取决于反义化合物余下的10个核碱基是否也与靶序列互补。
非互补核碱基的位置可位于反义化合物的5’端或3’端。可选地，非互补的一个核碱基或多个核碱基可位于反义化合物的内部位置。当存在两个或多个非互补核碱基时，它们可以是连续的(即，连接的)或非连续的。在一个实施方式中，非互补的核碱基位于gapmer反义寡核苷酸的侧翼区中。
在某些实施方式中，长度为，或最多为12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、或20个核碱基的反义化合物，包含不超过4个、不超过3个、不超过2个或不超过1个与靶核酸非互补的核碱基，靶核酸例如，因子XI核酸或其特定部分。
在某些实施方式中，长度为，或最多为12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、或30个核碱基的反义化合物，包含不超过6个、不超过5个、不超过4个、不超过3个、不超过2个或不超过1个与靶核酸非互补的核碱基，靶核酸例如，因子XI核酸或其特定部分。
本发明提供的反义化合物还包括与靶核酸的一部分互补的那些反义化合物。在本申请中，“部分”是指靶核酸的某区域或某片段中确定数量的连续(即，连接的)核碱基。“部分”还可指反义化合物的确定数量的连续核碱基。在某些实施方式中，反义化合物与靶区段的至少8个核碱基的部分互补。在某些实施方式中，反义化合物与靶区段的至少12个核碱基的部分互补。在某些实施方式中，反义化合物与靶区段的至少15个核碱基的部分互补。还预期了与靶序列的至少9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、或更多核碱基的部分互补的反义化合物，或者与由这些数值中任何两个限定的范围互补的反义化合物。
同一性
本发明提供的反义化合物也可以与特定核苷酸序列、SEQ ID NO或由特定Isis编号表示的化合物或其部分具有确定的百分比同一性。在本申请中，如果反义化合物具有与本发明公开的序列相同的核碱基配对能力，则它与本发明公开的序列具有同一性。例如，某RNA含有公开的DNA序列但其中的胸腺嘧啶用尿嘧啶取代，则认为该RNA与所述DNA序列具有同一性，因为尿嘧啶和胸腺嘧啶都与腺嘌呤配对。本发明还预期了本发明描述的反义化合物的缩短和延长形式，以及具有与本发明提供的反义化合物非同一碱基的化合物。非全同碱基可相互邻近或分散在整个反义化合物中。反义化合物的百分比同一性根据与之比较的序列中，具有相同碱基配对的碱基的数量来计算。
在某些实施方式中，反义化合物或其部分与本发明公开的一种或多种反义化合物或SEQ ID NO或其部分具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
修饰
核苷为碱基-糖组合。核苷的核碱基(也称为碱基)部分通常是杂环碱基基团。核苷酸为进一步包括磷酸基团的核苷，所述磷酸基团与核苷糖基共价连接。对于包括戊呋喃糖基糖的核苷而言，磷酸基团可与糖的2’、3’或5’羟基基团连接。寡核苷酸的形成是通过相邻的核苷相互之间共价键合，形成线性聚合的寡核苷酸。在寡核苷酸结构内，磷酸基团通常是指形成寡核苷酸的核苷间连接。
对反义化合物的修饰包括对核苷间连接、糖基或核碱基的取代或改变。修饰的反义化合物通常比天然形式更优选，因为其具有所希望的性质，例如，细胞摄取增强，核酸靶向亲和力增强，在核酸酶存在下的稳定性增加，或抑制活性增强。
化学修饰的核苷也可用于增加缩短或截短的寡核苷酸与其靶核酸的结合亲和力。由此，使用具有此类化学修饰核苷的缩短反义化合物通常能够获得具有可比性的结果。
修饰的核苷间连接
RNA和DNA中天然存在的核苷间连接是3’至5’磷酸二酯键。与具有天然存在的核苷间连接的反义化合物相比，具有一个或多个修饰的，即，非天然存在的，核苷间连接的反义化合物通常更为优选，因为其具有所希望的性质，例如，细胞摄取增强，核酸靶向亲和力增强以及在核酸酶存在下的稳定性增加。
具有修饰的核苷间连接的寡核苷酸包括保留磷原子的核苷间连接和不具有磷原子的核苷间连接。典型的含磷核苷间连接包括，但不限于，磷酸二酯、磷酸三酯、甲基磷酸酯、氨基磷酸酯以及硫代磷酸酯。含磷和不含磷的连接的制备方法是公知的。
在某些实施方式中，靶向作用于因子XI核酸的反义化合物包括一种或多种修饰的核苷间连接。在某些实施方式中，修饰的核苷间连接为硫代磷酸酯键。在某些实施方式中，反义化合物的各核苷间连接为硫代磷酸酯核苷间连接。
修饰的糖基
本发明的反义化合物可任选地含有一个或多个糖基被修饰的核苷。此类糖修饰的核苷可赋予反义化合物增强的核酸酶稳定性、增加的结合亲和力或其他一些有益的生物特性。在某些实施方式中，核苷包含化学修饰的呋喃核糖环基团。化学修饰的呋喃核糖环的例子包括但不限于，添加取代基(包括5’和2’取代基，非成对的环原子桥接形成双环核酸(BNA)，以S、N(R)或C(R1)(R)2(R＝H、C1-C12烷基或保护基团)取代核糖基环的氧原子)及其组合。化学修饰糖的例子包括2’-F-5’-甲基取代的核苷(对于其他公开的5’，2’-双取代核苷，见2008年8月21日公布的PCT国际申请WO2008/101157)或以“S”取代核糖环的氧原子并在2’位有进一步取代(见2005年6月16日公布的美国专利申请US2005-0130923)，或可选地BNA的5’取代(见2007年11月22日公布的PCT国际申请WO2007/134181，其中使用例如5’-甲基或5’-乙烯基取代LNA)。
具有修饰的糖基的核苷例子包括，但不限于，包含5’-乙烯基、5-甲基(R或S)、4’-S、2’-F、2’-OCH3以及2’-O(CH2)2OCH3取代基的核苷。2’位的取代基还可选自烯丙基、氨基、叠氮基、硫代基、O-烯丙基、O-C1-C10烷基、OCF3、O(CH2)2SCH3、O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)以及O-CH2-C(＝O)-N(Rm)(Rn)，其中，各Rm和Rn独立地为H或取代或未取代的C1-C10烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、取代的烷基、烯基、炔基、烷芳基、芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、SOCH3、SO2CH3、ONO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨烷基氨基、聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA剪切基团、报告基团、插入剂、用于改善反义化合物的药代动力学性质的基团或用于改善反义化合物的药效学性质的基团，以及具有类似性质的其他取代基。
双环核酸(BNA)的例子包括，但不限于，在4’和2’核糖基环原子之间包含桥键的核苷。在某些实施方式中，本发明提供的反义化合物包括一种或多种BNA核苷，其中所述桥键包括下式中的一种：4’-(CH2)-O-2’(LNA)；4’-(CH2)-S-2’；4’-(CH2)2-O-2’(ENA)；4’-C(CH3)2-O-2’(见PCT/US2008/068922)；4’-CH(CH3)--O-2’和4’-C-H(CH2OCH3)--O-2’(见2008年7月15日授权的美国专利7,399,845)；4’-CH2-N(OCH3)-2’(见PCT/US2008/064591)；4’-CH2-O-N(CH3)-2’(见2004年9月2日公布的美国专利申请US2004-0171570)；4’-CH2-N(R)-O-2’(见2008年9月23日授权的美国专利7,427,672)；4’-CH2-CHCH3)-2’(参见Chattopadhyaya et al.，J.Org.Chem，2009，74，118-134)以及4’-CH2-C-(＝CH2)-2’(见PCT/US2008/066154)；其中R独立地为H、C1-C12烷基或保护基团。各前述BNA包括各种立体化学糖构型，包括，例如，α-L-呋喃核糖和β-D-呋喃核糖(见，1999年3月25日作为WO99/14226公布的PCT国际申请PCT/DK98/00393)。此前，已将α-L-亚甲基氧(4’-CH2-O-2’)BNA掺入反义寡核苷酸，并显示出反义活性(Frieden et al.，Nucleic Acids Research，2003，21，6365-6372)。
与双环核苷相关的进一步报道见已经公开的文献(参见例如，Srivastava et al.，J.Am.Chem.Soc.，2007，129，8362-8379；美国专利7,053,207；6,268,490；6,770,748；6,794,499；7,034,133；和6,525,191；Elayadi et al.，Curr.Opinion Invens.Drugs，2001，2，558-561；Braaschet al.，Chem.Biol.，2001，8，1-7；和Orum et al.，Curr.Opinion Mol.Ther.，2001，3，239-243；以及美国专利6,670,461；国际专利申请WO 2004/106356；WO 94/14226；WO 2005/021570；美国专利公开号US2004-0171570；US2007-0287831；US2008-0039618；美国专利7,399,845；美国专利序列号12/129,154；60/989,574；61/026,995；61/026,998；61/056,564；61/086,231；61/097,787；61/099,844；PCT国际申请PCT/US2008/064591；PCT/US2008/066154；PCT/US2008/068922；和公开的PCT国际申请WO 2007/134181)。
在某些实施方式中，BNA核苷的双环糖基包括，但不限于，在呋喃戊糖基的4’和2’位之间至少有一个桥键的化合物，其中此类桥键独立地包括1个或2至4个连接的基团，其独立地选自-[C(Ra)(Rb)]n-、-C(Ra)＝C(Rb)-、-C(Ra)＝N-、-C(＝O)-、-C(＝NRa)-、-C(＝S)-、-O-、-Si(Ra)2-、-S(＝O)x-和-N(Ra)-；
其中：
x是0、1或2；
n是1、2、3或4；
各Ra和Rb独立地为H、保护基团、羟基、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、取代的C5-C20芳基、杂环基、取代的杂环基、杂芳基、取代的杂芳基、C5-C7脂环基、取代的C5-C7脂环基、卤素、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、COOJ1、酰基(C(＝O)-H)、取代的酰基、CN、磺酰基(S(＝O)2-J1)、或亚砜基(S(＝O)-J1)；以及
各J1和J2独立地为H、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、取代的C5-C20芳基、酰基(C(＝O)-H)、取代的酰基、杂环基、取代的杂环基、C1-C12氨烷基、取代的C1-C12氨烷基或保护基团。
在某些实施方式中，双环糖基的桥键为-[C(Ra)(Rb)]n-、-[C(Ra)(Rb)]n-O-、-C(RaRb)-N(R)-O-或-C(RaRb)-O-N(R)-。在某些实施方式中，桥键为4′-CH2-2′、4′-(CH2)2-2′、4′-(CH2)3-2′、4′-CH2-O-2′、4′-(CH2)2-O-2′、4′-CH2-O-N(R)-2′和4′-CH2-N(R)-O-2′-，其中各R独立地为H、保护基团或C1-C12烷基。
在某些实施方式中，双环核苷包括，但不限于，如下所示的(A)α-L-亚甲氧基(4’-CH2-O-2’)BNA、(B)β-D-亚甲氧基(4’-CH2-O-2’)BNA、(C)乙烯氧基(4’-(CH2)2-O-2’)BNA、(D)氨氧基(4’-CH2-O-N(R)-2’)BNA、(E)氧代胺基(4’-CH2-N(R)-O-2’)BNA、以及(F)甲基(亚甲氧基)(4’-CH(CH3)-O-2’)BNA、(G)亚甲氧基-硫代(4’-CH2-S-2’)BNA、(H)亚甲基-氨基(4’-CH2-N(R)-2’)BNA、(I)甲基碳环(4’-CH2-CH(CH3)-2’)BNA、以及(J)丙烯基碳环(4’-(CH2)3-2’)。
Figure BPA00001481359800421
其中Bx为碱基部分以及R独立地为H、保护基团或C1-C12烷基。
在某些实施方式中，双环核苷具有式I所示的结构：
Figure BPA00001481359800422
其中：
Bx为杂环碱基基团；
-Qa-Qb-Qc-为-CH2-N(Rc)-CH2-、-C(＝O)-N(Rc)-CH2-、-CH2-O-N(Rc)-、-CH2-N(Rc)-O-或-N(Rc)-O-CH2；
Rc为C1-C12烷基或氨基保护基团；以及
Ta和Tb分别独立地为H、羟基保护基团、缀合基团、反应性磷酸基团、磷酸基或与支持载体的共价结合。
在某些实施方式中，双环核苷具有式II所示的结构：
Figure BPA00001481359800431
其中：
Bx为杂环碱基基团；
Ta和Tb分别独立地为H、羟基保护基团、缀合基团、反应性磷酸基团、磷酸基或与支持载体的共价结合；
Za为C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、取代的C1-C6烷基、取代的C2-C6烯基、取代的C2-C6炔基、酰基、取代的酰基、取代的酰胺基、硫代或取代的硫代。
在一个实施方式中，各取代基独立地为单取代或多取代，其取代基独立地选自卤素、氧代、羟基、OJc、NJcJd、SJc、N3、OC(＝X)Jc和NJeC(＝X)NJcJd，其中各Jc、Jd和Je独立地为H、C1-C6烷基或取代C1-C6烷基，以及X为O或NJc。
在某些实施方式中，双环核苷具有式III所示的结构：
Figure BPA00001481359800432
其中：
Bx为杂环碱基基团；
Ta和Tb分别独立地为H、羟基保护基团、缀合基团、反应性磷酸基团、磷酸基或与支持载体的共价结合；
Zb为C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、取代的C1-C6烷基、取代的C2-C6烯基、取代的C2-C6炔基或取代的酰基(C(＝O)-)。
在某些实施方式中，双环核苷具有式IV所示的结构：
Figure BPA00001481359800441
其中：
Bx为杂环碱基基团；
Ta和Tb分别独立地为H、羟基保护基团、缀合基团、反应性磷酸基团、磷酸基或与支持载体的共价结合；
Rd为C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基、取代的C2-C6炔基；
各qa、qb、qc和qd独立地为H、卤素、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、酰基、取代的酰基、C1-C6氨烷基或取代的C1-C6氨烷基；
在某些实施方式中，双环核苷具有式V所示的结构：
Figure BPA00001481359800442
其中：
Bx为杂环碱基基团；
Ta和Tb分别独立地为H、羟基保护基团、缀合基团、反应性磷酸基团、磷酸基或与支持载体的共价结合；
qa、qb、qe和qf分别独立地为氢、卤素、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C1-C12烷氧基、取代的C1-C12烷氧基、OJj、SJj、SOJj、SO2Jj、NJjJk、N3、CN、C(＝O)OJj、C(＝O)NJjJk、C(＝O)Jj、O-C(＝O)NJjJk、N(H)C(＝NH)NJjJk、N(H)C(＝O)-NJjJk或N(H)C(＝S)NJjJk；
或qe和qf为＝C(qg)(qh)；
qg和qh分别独立地为H、卤素、C1-C12烷基或取代C1-C12烷基。
已经报道了亚甲氧基(4’-CH2-O-2’)BNA单体腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、5-甲基-胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶的合成、制备及其低聚反应，以及核酸识别的性质(Koshkinet al.，Tetrahedron，1998，54，3607-3630)。BNA及其制备还可参见WO 98/39352和WO99/14226。
亚甲氧基(4’-CH2-O-2’)BNA和2’-硫代-BNA的类似物也已被制备(Kumar etal.，Bioorg.Med.Chem.Lett.，1998，8，2219-2222)。也已报道了锁核苷类似物的制备，包括以脱氧核糖核苷酸双螺旋作为核酸聚合酶底物(Wengel et al.，WO 99/14226)。而且，本领域也已报道了2’-氨基-BNA，一种新型构象限定的高亲和寡核苷酸类似物，的合成(Singh et al.，J.Org.Chem.，1998，63，10035-10039)。此外，2’-氨基-和2’-甲氨基-BNA也已被制备，此前也已报道了其与互补RNA和DNA链形成的双螺旋具有热稳定性。
在某些实施方式中，双环核苷具有式VI所示的结构：
Figure BPA00001481359800451
其中：
Bx为杂环碱基基团；
Ta和Tb分别独立地为H、羟基保护基团、缀合基团、反应性磷酸基团、磷酸基或与支持载体的共价结合；
各qi、qj、qk和ql分别独立地为氢、卤素、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C1-C12烷氧基、取代的C1-C12烷氧基、OJj、SJj、SOJj、SO2Jj、NJjJk、N3、CN、C(＝O)OJj、C(＝O)NJjJk、C(＝O)Jj、O-C(＝O)-NJjJk、N(H)C(＝NH)NJjJk、N(H)C(＝O)NJjJk或N(H)C(＝S)NJjJk；以及
qi和qj或ql和qk一起为＝C(qg)(qh)，其中qg和qh分别独立地为H、卤素、C1-C12烷基或取代的C1-C12烷基。
已报道了具有一个4′-(CH2)3-2′桥键和烯基类似桥键4′-CH＝CH-CH2-2′的碳环双环核苷(Freier et al.，Nucleic Acids Research，1997，25(22)，4429-4443和Albaek et al.，J.Org.Chem.，2006，71，7731-7740)。也已报道了碳环双环核苷类似物的合成和制备，及其低聚反应，以及对其进行的生物化学研究(Srivastava et al.，J.Am.Chem.Soc.，2007，129(26)，8362-8379)。
在某些实施方式中，通过使用糖替代物取代核糖基环来修饰核苷。这样的修饰包括但不限于，使用替代物环系统(有时也称为DNA类似物)取代核糖基环，替代物环系统例如吗啉环、环己烯基环、环己基环或者诸如具有下式中一种的四氢吡喃基环：
Figure BPA00001481359800461
许多其他可用于掺入反义化合物而修饰核苷的双环和三环糖替代物环系统也是本领域已知的(参见例如综述文章：Leumann，Christian J.，Bioorg.Med.Chem.，2002，10，841-854)。这样的环系统可进行多种额外的取代以增强活性。示例性化合物具有式VII所示的结构：
Figure BPA00001481359800462
其中对于式VII中所述的至少一个四氢吡喃核苷类似物，其各自独立地：
Bx为杂环碱基基团；
Ta和Tb均独立地为将四氢吡喃核苷类似物与反义化合物连接的核苷间连接基团，或Ta和Tb其中之一为将四氢吡喃核苷类似物与反义化合物连接的核苷间连接，且另外一个Ta和Tb为H、羟基保护基团、连接的缀合基团或5’或3’末端基团；
q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7均独立地为H、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基；以及各R1和R2选自氢、羟基、卤素、取代或未取代的烷氧基、NJ1J2、SJ1、N3、OC(＝X)J1、OC(＝X)NJ1J2、NJ3C(＝X)NJ1J2和CN，其中X为O、S或NJ1，以及各J1、J2和J3独立地为H或C1-C6烷基。
在某些实施方式中，提供了式VII所示的修饰THP核苷，其中q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7均为H(M)。在某些实施方式中，q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7中的至少一个不是H。在某些实施方式中，q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7中的至少一个为甲基。在某些实施方式中，提供了式VII所示的THP核苷，其中R1和R2中的一个为氟(K)。在某些实施方式中，提供了式VII所示的THP核苷，其中R1和R2中的一个为甲氧乙氧基。在某些实施方式中，R1是氟且R2是H；R1是H且R2是氟；R1是甲氧基且R2是H；R1是H且R2是甲氧乙氧基。修饰糖的制备方法为本领域的公知常识。
在具有修饰的糖基的核苷酸中，保持核碱基基团(天然的、修饰的或其组合)使之与合适的靶核酸杂交。
在某些实施方式中，靶向作用于因子XI核酸的反义化合物包括具有修饰的糖基的一种或多种核苷酸。在某些实施方式中，修饰的糖基是2’-MOE。在某些实施方式中，2’-MOE修饰的核苷酸配置在gapmer基序中。在某些实施方式中，修饰的糖基是具有(4’-CH(CH3)-O-2’)桥键的双环核苷。在某些实施方式中，(4’-CH(CH3)-O-2’)修饰核苷配置在gapmer基序的整个侧翼中。
修饰的核碱基
核碱基(或碱基)的修饰或取代可在结构上区别于天然存在的或合成的未修饰核碱基，但在功能上可与之互换。天然和修饰的核碱基能够参与氢键键合。这样的核碱基修饰可赋予反义化合物核酸酶稳定性、结合亲和力或某些其他有益的生物特性。修饰的核碱基包括合成的和天然的核碱基，例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)。某些核碱基取代，包括5-甲基胞嘧啶取代，特别适用于增加反义化合物对于靶核酸的结合亲和力。例如，5-甲基胞嘧啶取代可使核酸双螺旋的稳定性增加0.6-1.2℃(Sanghvi，Y.S.，Crooke，S.T.and Lebleu，B.，eds.，Antisense Research and Applications，CRC Press，Boca Raton，1993，pp.276-278)。
其他未修饰的核碱基包括：5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基以及其他烷基衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基以及其他烷基衍生物，2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶以及2-硫胞嘧啶，5-卤素尿嘧啶以及5-卤素胞嘧啶，5-丙炔基(-C≡C-CH3)尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶以及嘧啶碱基的其他炔基衍生物，6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶以及6-偶氮胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶，8-卤素、8-氨基、8-巯基、8-巯基烷基、8-羟基以及其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤素特别是5-溴、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤，2-F-腺嘌呤，2-氨基腺嘌呤，8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤，7-去氮鸟嘌呤和7-去氮腺嘌呤，以及3-去氮鸟嘌呤和3-去氮腺嘌呤。
杂环碱基基团还可包括那些其中的嘌呤或嘧啶碱基被其他杂环取代的杂环碱基基团，例如，7-去氮杂-腺嘌呤、7-去氮杂鸟嘌呤、2-氨基吡啶以及2-吡啶酮。特别适用于增强反义化合物的结合亲和力的核碱基包括5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶以及N-2、N-6以及O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶、以及5-丙炔基胞嘧啶。
在某些实施方式中，靶向作用于因子XI核酸的反义化合物包含一种或多种修饰的核碱基。在某些实施方式中，间隔加宽的靶向作用于因子XI核酸的反义寡核苷酸包含一种或多种修饰的核碱基。在某些实施方式中，修饰的核碱基是5-甲基胞嘧啶。在某些实施方式中，各胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。
用于制备药物组合物的组分和方法
可将反义寡核苷酸与药学上可接受的活性或惰性物质混合，用于制备药物组合物或制剂。用于制备药物组合物的组分和方法取决于多个标准，包括但不限于，给药途径、病变程度或待给药的剂量。
包含反义化合物的药物组合物包括任何药学上可接受的盐、酯、或所述酯的盐，或当给药至动物包括人类时能够提供(直接或间接)生物活性代谢物或其残基的任何其他寡核苷酸。因此，例如，本发明还涉及药学上可接受的反义化合物的盐、前药、药学上可接受的所述前药的盐以及其他生物等效物。合适的药学上可接受的盐包括，但不限于，钠盐和钾盐。
在某些实施方式中，本发明所述的一种或多种修饰寡核苷酸可被制成前药。可以通过修饰药学活性化合物生产前药，使得在体内给药后将产生活性化合物。例如，前药可以包括在反义化合物的一端或两端掺入其他核苷，其在体内可被内源性核酸酶剪切，以形成活性反义化合物。可以对前药进行设计，以改变药物的代谢稳定性或转运特性，以掩盖副作用或毒性，以改善药物的味道或改变药物的其他特性或性质。在某些实施方式中，经体内给药后，前药经化学转变为生物学、药学或治疗上具有更高活性的修饰寡核苷酸。在某些实施方式中，前药是有用的，因为其比相应的活性形式更易于给药。例如，在某些例子中，前药与相应的活性形式相比可以具有更高的生物利用度(例如，经口服给药)。在某些例子中，前药与相应的活性形式相比可以具有改善的溶解度。在某些实施方式中，前药与相应的活性形式相比水溶性降低。在某些例子中，此类前药具有优越的跨膜转运性质，因为水溶性不利于迁移。在某些实施方式中，前药是酯。在某些这样的实施方式中，给药后，酯被代谢水解为羧酸。在某些例子中，包含羧酸的化合物是相应的活性形式。在某些实施方式中，前药包含一个与酸性基团连接的短肽(聚氨酸)。在某些此类实施方式中，给药后，肽被剪切为相应的活性形式。
在某些实施方式中，本发明的药物组合物以剂量单位的形式给药(例如，片剂、胶囊剂、推注剂等)。在某些实施方式中，此类药物组合物包含一个修饰的寡核苷酸，其剂量选自25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、55mg、60mg、65mg、70mg、75mg、80mg、85mg、90mg、95mg、100mg、105mg、110mg、115mg、120mg、125mg、130mg、135mg、140mg、145mg、150mg、155mg、160mg、165mg、170mg、175mg、180mg、185mg、190mg、195mg、200mg、205mg、210mg、215mg、220mg、225mg、230mg、235mg、240mg、245mg、250mg、255mg、260mg、265mg、270mg、270mg、280mg、285mg、290mg、295mg、300mg、305mg、310mg、315mg、320mg、325mg、330mg、335mg、340mg、345mg、350mg、355mg、360mg、365mg、370mg、375mg、380mg、385mg、390mg、395mg、400mg、405mg、410mg、415mg、420mg、425mg、430mg、435mg、440mg、445mg、450mg、455mg、460mg、465mg、470mg、475mg、480mg、485mg、490mg、495mg、500mg、505mg、510mg、515mg、520mg、525mg、530mg、535mg、540mg、545mg、550mg、555mg、560mg、565mg、570mg、575mg、580mg、585mg、590mg、595mg、600mg、605mg、610mg、615mg、620mg、625mg、630mg、635mg、640mg、645mg、650mg、655mg、660mg、665mg、670mg、675mg、680mg、685mg、690mg、695mg、700mg、705mg、710mg、715mg、720mg、725mg、730mg、735mg、740mg、745mg、750mg、755mg、760mg、765mg、770mg、775mg、780mg、785mg、790mg、795mg和800mg。在某些此类实施方式中，本发明的药物组合物包含的修饰寡核苷酸的剂量选自25mg、50mg、75mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、500mg、600mg、700mg和800mg。
在某些实施方式中，药物组合物包含无菌冻干的修饰寡核苷酸，可用适宜的稀释剂对其进行复溶，例如，无菌注射用水或注射用无菌盐水。利用盐水稀释后，复溶产品可以通过皮下注射或静脉输注的方式给药。冻干药物制品由修饰寡核苷酸组成，其用注射用水或注射用盐水制备，在制备过程中使用酸或碱调节pH至7.0-9.0，然后进行冻干。冻干的修饰寡核苷酸可以是25-800mg，或在25-800mg之间的上文所述的修饰寡核苷酸的任意剂量。冻干的药物制剂可以包装在配有溴丁基橡胶塞的2mL I型透明玻璃瓶(经硫酸铵处理)中，使用铝制FLIP-OFF.RTM.外套密封。
在某些实施方式中，本发明的组合物中可以含有药物组合物中常用的其他附加成分，在其已确定的用量水平下使用。因此，例如，组合物可以包含其他的、可配伍的、药物活性原料，例如，止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂或抗炎剂，或可以包含对将本发明组合物制成多种剂型有用的其他原料，如染料、调味剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、增稠剂和稳定剂。加入这些原料后不应过度干扰本发明组合物的组分的生物活性。制剂可以被灭菌，如有需要，还可在其中混入辅料，例如，润滑剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲液、着色剂、调味剂和/或芳香物质等，其对制剂中的寡核苷酸不会造成不良影响。
在某些实施方式中，本发明的药物组合物包含一种或多种修饰寡核苷酸和一种或多种辅料。在某些实施方式中，辅料选自水、盐溶液、乙醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、淀粉酶、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。
在某些实施方式中，本发明的药物组合物采用已知技术制备，包括但不限于，混合、溶解、制粒、包糖衣、磨细、乳化、包封、包埋或压片工艺。
在某些实施方式中，本发明的靶向作用于因子XI核酸的化合物可用在药物组合物中，通过将反义化合物与适宜的药学上可接受的稀释剂或载体合用制备。药学上可接受的稀释剂包括，但不限于，水、油、乙醇或磷酸盐缓冲液(PBS)。PBS是一种稀释剂，适用于以非胃肠道方式递送的药物组合物。相应地，在一个实施方式中，本发明所述方法使用的是一个药物组合物，其包含靶向作用于因子XI核酸的化合物和药学上可接受稀释剂。在某些实施方式中，药学上可接受的稀释剂是PBS。在某些实施方式中，化合物是反义寡核苷酸。
在某些实施方式中，本发明的药物组合物是液体(例如，混悬剂、酏剂和/或溶液剂)。在某些这样的实施方式中，采用本领域公知的成分制备液体药物组合物，包括但不限于，水、缓冲液、乙二醇类、油类、醇类、调味剂、防腐剂和着色剂。
在某些实施方式中，本发明的药物组合物是固体(例如，粉末、片剂和/或胶囊)。在某些这样的实施方式中，采用本领域公知的成分制备包含一种或多种寡核苷酸的固体药物组合物，包括但不限于，淀粉、糖、稀释剂、制粒剂、润滑剂、粘合剂和崩解剂。
在某些实施方式中，将本发明的药物制剂成长效制剂。某些此类长效制剂的作用时间一般长于非长效制剂。在某些实施方式中，此类制剂以植入(例如，皮下或肌内)或肌内注射方式给药。在某些实施方式中，长效制剂的制备采用适宜的聚合性或疏水性材料(例如，在可接受油中的乳剂)或离子交换树脂，或作为难溶性衍生物，例如作为难溶性盐。
在某些实施方式中，本发明的药物组合物包含递送系统。递送系统的例子包括，但不限于，脂质体和乳剂。适用于制备某些药物组合物的某些递送系统包括那些包含疏水性化合物的递送系统。在某些实施方式中，可使用某些有机溶剂，如二甲基亚砜。
在某些实施方式中，本发明的药物组合物包含用于将本发明的一个或多个药物递送至特定组织或细胞类型的一个或多个组织特异性转运分子。例如，在某些实施方式中，药物组合物含有包被了组织特异性抗体的脂质体。
在某些实施方式中，本发明的药物组合物包含共溶剂系统。某些此类共溶剂系统包括，例如，苄基乙醇、非极性表面活性剂、可与水混合的有机聚合物和水相。在某些实施方式中，此类共溶剂系统用于疏水性化合物。此类共溶剂系统的非限制性例子为VPD共溶剂系统，其为含有3％w/v苄基乙醇、8％w/v非极性表面活性剂聚山梨醇酯80.TM.和65％w/v聚乙烯乙二醇300的绝对乙醇溶液。此类共溶剂系统的成分可以大范围地改变，而不显著改变其溶解性和毒性性质。而且，共溶剂系统的同一性可以改变：例如，可以使用其他表面活性剂代替聚山梨醇酯80.TM.；聚乙烯乙二醇的比例可以改变；可以使用其他生物相容性聚合物代替聚乙二醇，例如，聚乙烯吡咯烷酮；以及可以使用其他糖或多糖代替葡萄糖。
在某些实施方式中，本发明的药物组合物包含一个持续释放系统。此类持续释放系统的非限制性例子为固态疏水性聚合物的半渗透基质。在某些实施方式中，持续释放系统可以，取决于其化学性质，在几小时、几天、几周或几月的时间段内释放药物。
在某些实施方式中，本发明的药物组合物被制成口服制剂。在某些此类实施方式中，利用将一种或多种包含修饰寡核苷酸的化合物与一种或多种药学上可接受的载体进行组合从而将药物组合物制剂。某些这样的载体能将药物组合物制成用于个体口服给药的片剂、丸剂、糖衣剂、胶囊剂、液体制剂、凝胶剂、糖浆剂、膏剂和混悬剂等。在某些实施方式中，通过将寡核苷酸与一种或多种固体辅料混合以获得供口服的药物组合物。适宜的辅料包括，但不限于，填充剂，如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纤维素制品，例如，玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。在某些实施方式中，此类混合物被任选地粉碎以及可任选地加入辅料。在某些实施方式中，将药物组合物制成片剂或糖衣剂芯材。在某些实施方式中，加入崩解剂(例如，交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐，如海藻酸钠)。
在某些实施方式中，将糖衣剂的芯材包衣。在某些此类实施方式中，可以使用浓缩糖溶液，其可以任选地包含阿拉伯胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、聚羧乙烯胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶液和适宜的有机溶剂或溶剂混合物。可以在片剂或糖衣剂的包衣中加入染料或色素。
在某些实施方式中，将用于口服给药的药物组合物装入由明胶制成的推入胶囊。此类推入胶囊中的某些包含一种或多种本发明的药物与一种或多种填充剂如乳糖、粘合剂如淀粉和/或润滑剂如滑石粉或硬质酸镁以及，任选地稳定剂的混合物。在某些实施方式中，用于口服给药的药物组合物为由明胶和增塑剂如甘油或山梨醇制成的密封软胶囊。在某些软胶囊中，本发明的一种或多种药物被溶解或混悬于适宜液体中，如脂肪油脂、液体石蜡或液体聚乙二醇。此外，可以加入稳定剂。
在某些实施方式中，将药物组合物制成口腔给药的制剂。某些这样的药物组合物使用常规方法制备成片剂或锭剂。
在某些实施方式中，将药物组合物制成用于注射的制剂(例如，静脉注射、皮下注射、肌内注射等)。在某些此类实施方式中，药物组合物中包含某种载剂，并将其制成水性溶液，如水或生理上相容的缓冲液如Hank’s液、Ringer′s液或生理盐水缓冲液(如，PBS)。在某些实施方式中，加入其他成分(例如，改善溶解度或作为防腐剂的成分)。在某些实施方式中，采用适宜的液体载剂、助悬剂等制备注射用混悬剂。用于注射的某些药物组合物为单位给药形式，例如，置于安瓿或多剂量的容器中。用于注射给药的某些药物组合物为在油性或水性溶剂中的混悬剂、溶液剂或乳剂，且可以包含制剂用的物质如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。在注射给药的药物组合物中适用的某些溶剂包括，但不限于，亲脂性溶剂和脂肪油脂，如芝麻油，合成脂肪酸酯，如油酸乙酯或甘油三酯，以及脂质体。水性注射混悬液可以包含能够增加混悬液粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。任选地，此类混悬剂还可以包含适宜的稳定剂或能够增加药物溶解度的物质，以制备高度浓缩的溶液。
在某些实施方式中，将药物组合物制成透皮给药制剂。在某些此类实施方式中，制剂中使用适用于需要穿透的障碍的渗透剂。此类渗透剂一般为本领域所公知。
在某些实施方式中，将药物组合物制成吸入剂。某些此类用于吸入的药物组合物被制成置于加压包装或雾化器中的气雾剂。某些此类药物组合物包含推进剂，例如氟利昂、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他适宜气体。在使用加压气雾剂的某些实施方式中，可以采用定量递送阀确定给药单位。在某些实施例中，可以制成供吸入器或吹入器使用的胶囊或药筒。某些此类制剂包括本发明药物组合物和适宜粉末如乳糖或淀粉的混合粉末。
在某些实施方式中，将药物组合物制成直肠给药制剂如栓剂或保留灌肠剂。某些此类药物组合物包含已知成分，如可可油和/或其他甘油酯。
在某些实施方式中，将药物组合物制成局部给药制剂。某些此类药物组合物包含温和的保湿基质，例如软膏剂或乳膏剂。适宜的软膏剂基质的例子包括，但不限于，凡士林油、凡士林油加挥发性硅酮，以及在油性乳剂中使用的羊毛脂和水。适宜的乳膏剂基质的例子包括，但不限于，冷膏和亲水性乳膏。
在某些实施方式中，本发明的药物组合物包含治疗有效量的修饰寡核苷酸。在某些实施方式中，治疗有效量为足以预防、减轻或改善疾病症状或用于延长被治疗个体存活时间的剂量。
给药途径
在某些实施方式中，对个体的给药方式包含非胃肠道给药。在某些实施方式中，对个体的给药方式包含静脉给药。在某些实施方式中，对个体的给药方式包含皮下给药。
在某些实施方式中，给药方式包含肺部给药。在某些实施方式中，肺部给药包含通过吸入法将经雾化的寡核苷酸递送至个体肺部。个体吸入经雾化的寡核苷酸后，寡核苷酸分布至正常和炎症肺组织的细胞，包括肺泡巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、上皮细胞、血管内皮细胞和支气管上皮细胞。用于递送包含修饰寡核苷酸药物组合物的适宜设备包括，但不限于，标准雾化设备。其他适宜设备包括干粉吸入器或定量吸入器。
在某些实施方式中，给药药物组合物以达到局部暴露而非全身暴露。例如，肺部给药将药物组合物递送至肺部，其具有极低的全身暴露量。
其他适宜的给药途径包括，但不限于，口服给药、直肠给药、透皮给药、小肠内给药、肠道内给药、局部给药、栓剂给药、鞘内给药、心室内给药、腹膜内给药、鼻内给药、眼内给药、肌内给药、髓内给药和瘤内给药。
缀合的反义化合物
在某些实施方式中，本发明的化合物可与一种或多种能够使反义寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄取增强的基团或缀合物共价连接。典型的缀合基团包括胆固醇基团和脂质基团。其他的缀合基团包括碳水化合物、磷脂、生物素、吩嗪、叶酸酯、菲啶、蒽醌、吖啶、荧光素、罗丹明、香豆素、以及染料。
在某些实施方式中，还可对反义化合物修饰以使其具有一个或多个稳定的基团，所述稳定的基团通常与反义化合物的一端或两端连接而提高诸如核酸酶稳定性等特性。稳定基团中包括帽结构。这些末端修饰保护具有末端核酸的反义化合物不受核酸外切酶的降解，且可有助于在细胞内递送和/或定位。帽可存在于5’-端(5’-帽)或3’-端(3’-帽)，或可存在于两端。帽结构为本领域公知，包括，例如倒置的脱氧无碱基帽。其他可用于在反义化合物的一端或两端形成帽且赋予核酸酶稳定性的3’和5’稳定基团包括在2003年1月16日公布的WO 03/004602中公开的那些基团。
细胞培养和反义化合物处理
可在体外在多种细胞类型中检测反义化合物对于因子XI核酸的水平、活性或表达的作用。用于此类分析的细胞类型可来自商业供应商(例如，美国模式培养物保藏中心，Manassus，VA；Zen-Bio，Inc.，Research Triangle Park，NC；Clonetics Corporation，Walkersville，MD)，根据供应商的说明书使用商品化的试剂(例如，Invitrogen LifeTechnologies，Carlsbad，CA)培养细胞。细胞类型的例子包括HepG2细胞、HepB3细胞以及原代肝细胞。
反义寡核苷酸的体外检测
本发明描述了使用反义寡核苷酸处理细胞的方法，可对方法进行适当修改以适用于其他反义化合物的处理。
通常，当细胞在培养基中达到约60-80％汇合时，使用反义寡核苷酸处理细胞。
通常用于将反义寡核苷酸引入培养细胞中的试剂包括阳离子脂质转染试剂LIPOFECTIN
Figure BPA00001481359800551
(Invitrogen，Carlsbad，CA)。将反义寡核苷酸与溶于OPTI-MEM
Figure BPA00001481359800552
1(Invitrogen，Carlsbad，CA)中的LIPOFECTIN
Figure BPA00001481359800553
混合，以达到所需的反义寡核苷酸的最终浓度，以及通常在每100nM反义寡核苷酸2-12ug/mL范围的LIPOFECTIN
Figure BPA00001481359800554
的浓度。
另一种用于将反义寡核苷酸引入培养细胞中的试剂包括LIPOFECTAMINE
Figure BPA00001481359800555
(Invitrogen，Carlsbad，CA)。将反义寡核苷酸与溶于OPTI-MEM
Figure BPA00001481359800556
的少血清培养基(Invitrogen，Carlsbad，CA)中的LIPOFECTAMINE
Figure BPA00001481359800561
混合，以达到所需的反义寡核苷酸的最终浓度，以及通常在每100nM反义寡核苷酸2-12ug/mL范围的LIPOFECTAMINE的浓度。
另一种用于将反义寡核苷酸引入培养细胞中的技术包括电穿孔。
通过常规方法使用反义寡核苷酸处理细胞。通常在反义寡核苷酸处理之后16-24小时收获细胞，在该时间通过本领域已知和本发明描述的方法测定靶核酸的RNA或蛋白质水平。通常，当以多个重复进行处理时，将数据表示为重复处理的平均值。
所使用的反义寡核苷酸的浓度根据细胞系的不同而不同。确定某特定细胞系的最佳反义寡核苷酸浓度的方法为本领域公知。当使用LIPOFECTAMINE
Figure BPA00001481359800563
转染时，通常使用1nM至300nM范围浓度的反义寡核苷酸。当使用电穿孔转染时，通常使用625nM至20,000nM范围的较高浓度的反义寡核苷酸。
RNA分离
可对细胞总RNA或poly(A)+mRNA进行RNA分析。RNA分离的方法为本领域公知。使用本领域公知的方法制备RNA，例如，根据生产厂商推荐的实验方法使用TRIZOL
Figure BPA00001481359800564
试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA)。
靶水平或表达抑制的分析
可使用本领域已知的多种方式来测定因子XI核酸的水平或表达的抑制。例如，可通过，例如Northern印迹分析、竞争性聚合酶链式反应(RT-PCR)或定量实时PCR来对靶核酸水平进行定量。可对细胞总RNA或poly(A)+mRNA进行RNA分析。RNA分离的方法为本领域公知。Northern印迹分析也是本领域的常规方法。可使用商品化的ABIPRISM
Figure BPA00001481359800565
7600、7700、或7900序列检测系统(购自PE-Applied Biosystems，Foster City，CA)，按照生产厂商的说明书方便地进行定量实时PCR。
靶RNA水平的定量实时PCR分析
可使用ABI PRISM
Figure BPA00001481359800571
7600、7700、或7900序列检测系统(PE-Applied Biosystems，Foster City，CA)，按照生产厂商的说明书来进行定量实时PCR，以完成靶RNA水平的定量。实时定量PCR的方法为本领域公知。
在实时PCR之前，使分离的RNA进行逆转录(RT)反应，产生互补的DNA(cDNA)并随后将其用作实时PCR扩增的底物。RT和实时PCR反应在相同样品孔中按顺序进行。RT和实时PCR的试剂购自Invitrogen(Carlsbad，CA)。通过本领域的技术人员公知的方法进行RT和实时PCR反应。
通过实时PCR获得的靶基因(或RNA)的量，使用下述方法进行归一化：使用表达恒定基因的表达水平，例如亲环素A或GAPDH，或使用RIBOGREEN
Figure BPA00001481359800572
(Invitrogen，Inc.Carlsbad，CA)对总RNA进行定量。通过与靶分子同时检测、复式检测或分开检测，用实时RT-PCR定量亲环素A或GAPDH的表达量。使用RIBOGREEN
Figure BPA00001481359800573
RNA定量试剂(Invetrogen，Inc.Eugene，OR)对总RNA进行定量。通过RIBOGREEN
Figure BPA00001481359800574
进行RNA定量的方法在Jones，L.J.et al.(Analytical Biochemistry，1998，265，368-374)中有教导。使用CYTOFLUOR
Figure BPA00001481359800575
4000型仪器(PE Applied Biosystems)测定RIBOGREEN
Figure BPA00001481359800576
的荧光。
设计探针和引物，使之与因子XI核酸杂交。设计实时PCR的探针和引物的方法为本领域公知，包括使用诸如PRIMER EXPRESS
Figure BPA00001481359800577
软件(Applied Biosystems，Foster City，CA)等软件。
PCR探针的5’末端具有共价连接的JOE或FAM，3’末端具有共价连接的TAMRA或MGB，其中JOE或FAM为荧光报告染料，TAMRA或MGB为淬灭剂染料。在某些细胞类型中，用于检测表达的引物和探针被设计为可以针对不同种属的序列。例如，人GAPDH引物和探针可用于检测猴细胞和细胞系中GAPDH的表达。
蛋白质水平的分析
可通过测量因子XI蛋白水平来评估因子XI核酸的反义抑制。可以以本领域公知的多种方式来评估或定量因子XI蛋白水平，例如免疫沉淀、Western印迹分析(免疫印迹)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、定量蛋白检测、蛋白活性检测(例如，级联活性检测)、免疫组织化学、免疫细胞化学或荧光激活细胞分选术(FACS)。针对靶点的抗体可被识别并从多种来源获得，例如MSRS抗体目录(Aerie Corporation，Birmingham，MI)，或可通过本领域公知的传统的单克隆或多克隆抗体生产方法来制备。用于检测人和大鼠因子XI的抗体可经商业途径购得。
反义化合物的体内检测
可以在动物中测试反义化合物，例如反义寡核苷酸，以评价其抑制因子XI的表达和产生表型改变的能力，如aPTT延长、与正常PT结合的aPTT时间延长、血小板因子4(PF-4)量减少、哮喘诱发减少、关节炎形成减少、结肠炎形成减少、哮喘形成时间增加、关节炎形成时间增加和结肠炎形成时间增加。可在正常动物中或在实验性疾病模型中进行检测。对于对动物的给药，将反义寡核苷酸用药学上可接受的稀释剂配制，例如磷酸盐缓冲盐水。给药包括胃肠外途径给药，例如腹膜内、静脉以及皮下。在一个实施例中，在使用反义寡核苷酸治疗一段时间之后，从肝脏组织分离RNA，并测量因子XI核酸表达的改变。使用来自于被治疗的动物的血浆，测定凝血时间，例如PT和aPTT，或检测动物中存在的炎症水平、炎症状况(例如，哮喘、关节炎、结肠炎)或炎症标记物(炎症因子)。
一些适应症
在某些实施方式中，本发明提供了治疗个体的方法，包括给药本发明的一种或多种药物组合物。在某些实施方式中，个体患有或处于炎症疾病、异常或状况的风险中。在某些实施方式中，个体处于上文所述的炎症疾病、异常或症状的风险中。在某些实施方式中，本发明提供了预防性降低个体中因子XI表达的方法。某些实施方式包括治疗有需要的个体，通过对所述个体给药治疗有效量的靶向作用于因子XI核酸的反义化合物。
在某些实施方式中，给药治疗有效量的靶向作用于因子XI核酸的反义化合物，并伴随监测个体血清中的因子XI水平，以确定个体对所述反义化合物给药的反应。医师利用个体对所述反义化合物给药的反应来确定治疗介入的量和持续时间。
在某些实施方式中，靶向作用于因子XI核酸的反义化合物的给药导致因子XI表达降低至少15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％，或由这些数值中的任何两个限定的范围。在某些实施方式中，靶向作用于因子XI核酸的反义化合物的给药导致由标准检测所测量的血液凝固测定值改变，例如但不限于，活化的部分促凝血酶原激活时间(aPTT)检测、凝血酶原时间(PT)检测、凝血酶时间(TCT)、流血时间或D-二聚体。可选地，可以在炎症动物模型(例如，诱导哮喘、关节炎或结肠炎)中确定炎症(例如，哮喘、关节炎或结肠炎水平)的改变。在某些实施方式中，因子XI反义化合物的给药增加测量值至少15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％，或由这些数值中的任何两个限定的范围。在某些实施方式中，因子XI反义化合物的给药减少测量值至少15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％，或由这些数值中的任何两个限定的范围。
在某些实施方式中，用含有靶向作用于因子XI反义化合物的药物组合物来制备治疗患有或易患炎症疾病、异常或症状的患者的药物。
一些联合疗法
在某些实施方式中，将本发明的一种或多种药物组合物与一种或多种其他药学物质联合给药。在某些实施方式中，将这样的一种或多种其他药学物质设计成与本发明的一种或多种药物组合物治疗相同的疾病、异常或状况。在某些实施方式中，将这样的一种或多种其他药学物质设计成与使用本发明的一种或多种药物组合物治疗不同的疾病、异常或状况。在某些实施方式中，将这样的一种或多种其他药学物质设计成治疗本发明的一种或多种药物组合物不需要的副作用。在某些实施方式中，将本发明的一种或多种药物组合物与另一种药学物质联合给药，以治疗该药学物质不需要的副作用。在某些实施方式中，将本发明的一种或多种药物组合物与另一种药学物质联合给药，以产生组合作用。在某些实施方式中，将本发明的一种或多种药物组合物与另一种药学物质联合给药以产生协同作用。
在某些实施方式中，本发明的一种或多种药物组合物与一种或多种其他药学物质在相同时间给药。在某些实施方式中，本发明的一种或多种药物组合物与一种或多种其他药学物质在不同时间给药。在某些实施方式中，将本发明的一种或多种药物组合物与一种或多种其他药学物质一起制备在单一制剂中。在某些实施方式中，将本发明的一种或多种药物组合物与一种或多种其他药学物质分开制备。
在某些实施方式中，可与本发明的药物组合物联合给药的药学物质包括NSAIDS和/或上文所述的疾病改善型药物。在某些实施方式中，将疾病改善型药物先于本发明的药物组合物给药。在某些实施方式中，疾病改善型药物在本发明的药物组合物给药之后给药。在某些实施方式中，疾病改善型药物与本发明的药物组合物同时给药。在某些实施方式中，联合给药时疾病改善型药物的给药剂量与疾病改善药物单独使用时的给药剂量相同。在某些实施方式中，联合给药时疾病改善型药物的给药剂量低于疾病改善型药物单独使用时的给药剂量。在某些实施方式中，联合给药时疾病改善型药物的给药剂量高于疾病改善型药物单独使用时的给药剂量。
在某些实施方式中，联合给药的第二种化合物增强第一种化合物的作用，这样化合物联合给药的作用高于第一种化合物单独给药的作用。在其他实施方式中，联合给药的作用相当于化合物单独给药作用的累加。在某些实施方式中，联合给药的作用高于化合物单独给药作用的累加。在某些实施方式中，第一种化合物为反义化合物。在某些实施方式中，第二种化合物为反义化合物。
在某些实施方式中，在因子XI特异性抑制剂给药之后的任何时间进行解毒剂给药。在某些实施方式中，在靶向作用于因子XI的反义寡核苷酸给药之后的任何时间进行解毒剂给药。在某些实施方式中，在靶向作用于因子XI的反义化合物给药之后的几分钟、几小时、几天、几周或几个月后进行解毒剂给药。在某些实施方式中，解毒剂与靶向作用于因子XI的反义化合物互补(例如，有义链)。在某些实施方式中，解毒剂是因子7、因子7a、因子XI或因子XIa蛋白。在某些实施方式中，因子7、因子7a、因子XI或因子XIa蛋白是人类因子7、人因子7a、人因子XI或人因子XIa蛋白。在某些实施方式中，因子7蛋白是NovoSeven。
本发明的优势
本发明首次提供了用于调节因子XI的方法和组合物，其可治疗、预防和/或改善炎症反应。在一个特殊的实施方式中，提供了因子XI寡核苷酸(寡核苷酸靶向作用于编码因子XI蛋白的核酸)，以改善炎症状况如关节炎或结肠炎。
实施例
非限制性声明和参考引用
尽管已经根据一些实施方式专门描述了本发明所述的一些化合物、组合物以及方法，下列实施例仅用以描述本发明所述化合物且非旨在对其限制。本申请中所引用的各参考文献通过引用整体并入。
实施例1：HepG2细胞内人因子XI的反义抑制
测试了靶向作用于因子XI核酸的反义寡核苷酸在体外对因子XI mRNA的影响。用含75nM的反义寡核苷酸的脂质体试剂转染培养好的密度为每孔10,000个细胞的HepG2细胞。在处理大约24小时后，从细胞分离RNA，用定量实时PCR测定因子XImRNA的水平。因子XI mRNA的水平根据由RIBOGREEN
Figure BPA00001481359800611
测量的总RNA含量进行调整。结果表示为，与未处理的对照细胞相比，因子XI抑制的百分率。
表1和2中的嵌合反义寡核苷酸设计为5-10-5 MOE gapmer。所述gapmer长为20个核苷酸，中间的间隔区含10个2’-脱氧核苷酸并在两侧(在5’和3’方向)分别连接含有5个核苷酸的侧翼区。5’侧翼区的每个核苷酸和3’侧翼区的每个核苷酸都具有2’-MOE修饰。贯穿每个gapmer的核苷间连接都是硫代磷酸酯(P＝S)连接。贯穿每个gapmer的所有胞嘧啶核苷残基都是5-甲基胞嘧啶核苷。“靶向起始位点”表示gapmer靶向作用的最5’端位置。“靶向终止位点”表示gapmer靶向作用的最3’端位置。表1中所列的每个gapmer都靶向作用于SEQ ID NO：1(GENBANK登录号NM_000128.3)和表2中所列的每个gapmer都靶向作用于SEQ ID NO：2(GENBANK登录号NT_022792.17，截取19598000至19624000)。
表1
通过靶向作用于SEQ ID NO：1的具有5-10-5MOE侧翼区和脱氧间隔区的嵌合反义寡核苷酸来抑制人因子XI mRNA水平
Figure BPA00001481359800612
Figure BPA00001481359800621
Figure BPA00001481359800631
Figure BPA00001481359800641
表2
通过靶向作用于SEQ IDNO：2的具有5-10-5MOE侧翼区和脱氧间隔区的嵌合反义寡核苷酸来抑制人因子XI mRNA水平
Figure BPA00001481359800642
Figure BPA00001481359800651
实施例2：HepG2细胞内人因子XI的剂量依赖性反义抑制
在HepG2细胞中以不同剂量测试了12个gapmer，这些gapmer在体外对人因子XI的抑制作用都在84％或以上。以每孔10,000细胞的浓度将细胞铺板，并用含9.375nM、18.75nM、37.5nM、75nM和150nM浓度的如表3所示的反义寡核苷酸的脂质体试剂进行转染。在处理大约16小时后，从细胞分离RNA，用定量实时PCR测定因子XI mRNA的水平。采用人因子XI引物探针组RTS 2966(正向序列：CAGCCTGGAGCATCGTAACA，作为SEQ IDNO：3并入本发明；反向序列：TTTATCGAGCTTCGTTATTCTGGTT，作为SEQ ID NO：4并入本发明；探针序列：TTGTCTACTGAAGCACACCCAAACAGGGAX，其中X为荧光团，作为SEQ ID NO：5并入本发明)检测mRNA水平。因子XI mRNA的水平根据由RIBOGREEN测量的总RNA含量进行调整。结果表示为，与未处理的对照细胞相比，因子XI抑制的百分率。如表3所示，在经反义寡核苷酸处理的细胞中，因子XI mRNA水平以剂量依赖性的方式降低。
表3
HepG2细胞内因子XI的剂量依赖性反义抑制
Figure BPA00001481359800662
实施例3：通过微移设计的寡核苷酸在HepG2细胞内对人因子XI的反义抑制
基于表3中的gapmer设计了其他gapmer。将表3中的原始gapmer向其上游和下游稍微进行迁移(即，“微移”)，创造出这些gapmer。还可创造出带有不同的基序的gapmer，例如5-10-5MOE、3-14-3MOE和2-13-5MOE。在体外对这些gapmer进行检测。用含75nM的反义寡核苷酸的脂质体试剂转染培养好的密度为每孔10,000个细胞的HepG2细胞。在处理大约24小时后，从细胞分离RNA，用定量实时PCR测定因子XImRNA的水平。因子XI mRNA的水平根据由RIBOGREEN
Figure BPA00001481359800671
则量的总RNA含量进行调整。结果表示为，与未处理对照细胞相比，因子XI抑制的百分率。
随后将通过微移设计出的gapmer的体外抑制数据与表3中gapmer的体外抑制数据进行比较，如表4、5、6、7和8所示。根据其匹配的人mRNA(GENBANK登记号NM_000128.3)的区域显示寡核苷酸。
表4中的嵌合反义聚核苷酸设计为5-10-5MOE、3-14-3MOE和2-13-5MOEgapmer。表4中列出的前几个gapmer为原始gapmer(见表3)并以星号表示，由此通过微移设计其余的gapmer。5-10-5gapmer长为20个核苷酸，中间的间隔区含10个2’-脱氧核苷酸，并在两侧(在5’和3’方向)分别连接含有5个核苷酸的侧翼区。3-14-3gapmer长为20个核苷酸，中间的间隔区含14个2’-脱氧核苷酸，并在两侧(在5’和3’方向)分别连接含有3个核苷酸的侧翼区。2-13-5gapmer长为20个核苷酸，中间的间隔区含13个2’-脱氧核苷酸。中间的间隔在5’末端侧接有含2个核苷酸的侧翼且在3’末端侧接有含5个核苷酸的侧翼。对于各基序(5-10-5、3-14-3和2-13-5)而言，5’侧翼区的各核苷酸和3’侧翼区的各核苷酸均具有一个2’-MOE修饰。贯穿每个gapmer的核苷间连接都是硫代磷酸酯(P＝S)连接。贯穿每个gapmer的所有胞嘧啶核苷残基都是5-甲基胞嘧啶核苷。“靶向起始位点”表示gapmer靶向作用的最5’端位置。“靶向终止位点”表示gapmer靶向作用的最3’端位置。表4中所列的每个gapmer都靶向作用于SEQ ID NO：1(GENBANK登录号NM_000128.3)。
如表4所示，靶向作用于SEQ ID NO：1中起始于靶向起始位点656并终止于靶向终止位点675的靶区域(即，核碱基656-675)的所有5-10-5MOE gapmers、3-14-3MOEgapmers和2-13-5MOE gapmers，都对因子XI mRNA展示出至少20％的抑制作用。多数gapmer展示出至少60％的抑制作用。某些gapmer展示出至少80％的抑制作用，包括ISIS编号：416806、416809、416811、416814、416821、416825、416826、416827、416828、416868、416869、416878、416879、416881、416883、416890、416891、416892、416893、416894、416895、416896、416945、416946、416969、416970、416971、416972、416973、412203、413467、413468和413469。下述ISIS编号展示出至少90％的抑制作用：412203、413467、416825、416826、416827、416868、416878、416879、416892、416893、416895、416896、416945、416972和416973。下述ISIS编号展示出至少95％的抑制作用：416878、416892、416895和416896。
表4
靶向作用于SEQ ID NO：1(GENBANK登录号NM_000128.3.3)核碱基656至704的嵌合反义寡核苷酸对人因子XI mRNA水平的抑制作用
Figure BPA00001481359800681
Figure BPA00001481359800691
Figure BPA00001481359800701
表5中的嵌合反义聚核苷酸设计为5-10-5MOE、3-14-3MOE和2-13-5MOEgapmer。表5中列出的前几个gapmer为原始gapmer(见表3)并以星号表示，由此通过微移设计其余的gapmer。5-10-5gapmer长为20个核苷酸，中间的间隔区含10个2’-脱氧核苷酸，并在两侧(在5’和3’方向)分别连接含有5个核苷酸的侧翼区。3-14-3gapmer长为20个核苷酸，中间的间隔区含14个2’-脱氧核苷酸，并在两侧(在5’和3’方向)分别连接含有3个核苷酸的侧翼区。2-13-5gapmer长为20个核苷酸，中间的间隔区含13个2’-脱氧核苷酸。中间的间隔在5’末端侧接有包含2个核苷酸的侧翼且在3’末端侧接有包含5个核苷酸的侧翼。对于各基序(5-10-5、3-14-3和2-13-5)而言，5’侧翼区的各核苷酸和3’侧翼区的各核苷酸均具有一个2’-MOE修饰。贯穿每个gapmer的核苷间连接都是硫代磷酸酯(P＝S)连接。贯穿每个gapmer的所有胞嘧啶核苷残基都是5-甲基胞嘧啶核苷。“靶向起始位点”表示gapmer靶向作用的最5’端位置。“靶向终止位点”表示gapmer靶向作用的最3’端位置。表5中所列的每个gapmer都靶向作用于SEQ ID NO：1(GENBANK登录号NM_000128.3)。
如表5所示，靶向作用于SEQ ID NO：1中起始于靶向起始位点738并终止于靶向终止位点762的靶区域(即，核碱基738-762)的所有5-10-5MOE gapmers、3-14-3MOEgapmers和2-13-5MOE gapmers，都对因子XI mRNA展示出至少45％的抑制作用。多数gapmer展示出至少60％的抑制作用。某些gapmer展示出至少80％的抑制作用，包括ISIS编号：412206、416830、416831、416898、416899、416900、416903、416975、416976、416977和416980。下述ISIS编号展示出至少90％的抑制作用：412206、416831和416900。
表5
靶向作用于SEQ ID NO：1(GENBANK登录号NM_000128.3.3)核碱基738至762的嵌合反义寡核苷酸对人因子XI mRNA水平的抑制作用
Figure BPA00001481359800711
表6中的嵌合反义聚核苷酸设计为5-10-5MOE、3-14-3MOE和2-13-5MOEgapmer。表6中列出的前几个gapmer为原始gapmer(见表3)并以星号表示，由此通过微移设计其余的gapmer。5-10-5gapmer长为20个核苷酸，中间的间隔区含10个2’-脱氧核苷酸，并在两侧(在5’和3’方向)分别连接含5个核苷酸的侧翼区。3-14-3gapmer长为20个核苷酸，中间的间隔区含14个2’-脱氧核苷酸，并在两侧(在5’和3’方向)分别连接含3个核苷酸的侧翼区。2-13-5gapmer长为20个核苷酸，中间的间隔区含13个2’-脱氧核苷酸。中间的间隔在5’末端侧接有包含2个核苷酸的侧翼且在3’末端侧接有包含5个核苷酸的侧翼。对于各基序(5-10-5、3-14-3和2-13-5)而言，5’侧翼区的各核苷酸和3’侧翼区的各核苷酸均具有一个2’-MOE修饰。贯穿每个gapmer的核苷间连接都是硫代磷酸酯(P＝S)连接。贯穿每个gapmer的所有胞嘧啶核苷残基都是5-甲基胞嘧啶核苷。“靶向起始位点”表示gapmer靶向作用的最5’端位置。“靶向终止位点”表示gapmer靶向作用的最3’端位置。表6中所列的每个gapmer都靶向作用于SEQ ID NO：1(GENBANK登录号NM_000128.3)。
如表6所示，靶向作用于SEQ ID NO：1中起始于靶向起始位点1018并终止于靶向终止位点1042的靶区域(即，核碱基1018-1042)的所有5-10-5MOE gapmers、3-14-3MOE gapmers和2-13-5MOE gapmers，都对因子XI mRNA展示出至少80％的抑制作用。下述ISIS编号展示出至少90％的抑制作用：413474、416837、416838、416904、416907和416908。
表6
靶向作用于SEQ ID NO：1(GENBANK登录号NM_000128.3.3)核碱基1018至1042的嵌合反义寡核苷酸对人因子XI mRNA水平的抑制作用
Figure BPA00001481359800721
Figure BPA00001481359800731
表7中的嵌合反义聚核苷酸设计为5-10-5MOE、3-14-3MOE和2-13-5MOEgapmer。表7中列出的前几个gapmer为原始gapmer(见表3)并以星号表示，由此通过微移设计其余的gapmer。5-10-5gapmer长为20个核苷酸，中间的间隔区含10个2’-脱氧核苷酸，并在两侧(在5’和3’方向)分别连接含有5个核苷酸的侧翼区。3-14-3gapmer长为20个核苷酸，中间的间隔区含14个2’-脱氧核苷酸，并在两侧(在5’和3’方向)分别连接含有3个核苷酸的侧翼区。2-13-5gapmer长为20个核苷酸，中间的间隔区含13个2’-脱氧核苷酸。中间的间隔在5’末端侧接有包含2个核苷酸的侧翼且在3’末端侧接有包含5个核苷酸的侧翼。对于各基序(5-10-5、3-14-3和2-13-5)而言，5’侧翼区的各核苷酸和3’侧翼区的各核苷酸均具有一个2’-MOE修饰。贯穿每个gapmer的核苷间连接都是硫代磷酸酯(P＝S)连接。贯穿每个gapmer的所有胞嘧啶核苷残基都是5-甲基胞嘧啶核苷。“靶向起始位点”表示gapmer靶向作用的最5’端位置。“靶向终止位点”表示gapmer靶向作用的最3’端位置。表7中所列的每个gapmer都靶向作用于SEQ ID NO：1(GENBANK登录号NM_000128.3)。
如表7所示，靶向作用于SEQ ID NO：1中起始于靶向起始位点1062并终止于靶向终止位点1091的靶区域(即，核碱基1062-1091)的所有5-10-5MOE gapmers、3-14-3MOE gapmers和2-13-5MOE gapmers，都对因子XI mRNA展示出至少20％的抑制作用。多数gapmer展示出至少50％的抑制作用，包括：412215、413476、413476、416839、416840、416841、416842、416843、416844、416845、416846、416847、416909、416910、416911、416912、416913、416914、416915、416916、416917、416918、416986、416987、416988、416989、416990、416991、416992、416993、416994、416995。下述ISIS编号展示出至少80％的抑制作用：412215、413476、413476、416839、416840、416841、416842、416843、416844、416845、416910、416911、416912、416913、416914、416916、416917、416986、416987、416989、416991、416992、416993和416994。下述ISIS编号展示出至少90％的抑制作用：413476、413476、416842、416844、416910、416911、416912、416913、416916、416917和416993。
表7
靶向作用于SEQ ID NO：1(GENBANK登录号NM_000128.3.3)核碱基1062至1091的嵌合反义寡核苷酸对人因子XI mRNA水平的抑制作用
Figure BPA00001481359800741
表8中的嵌合反义聚核苷酸设计为5-10-5MOE、3-14-3MOE和2-13-5MOEgapmer。表8中列出的前几个gapmer为原始gapmer(见表3)并以星号表示，由此通过微移设计其余的gapmer。5-10-5gapmer长为20核苷酸，中间的间隔区含10个2’-脱氧核苷酸并在两侧(在5’和3’方向)分别连接含有5个核苷酸的侧翼区。3-14-3gapmer长为20个核苷酸，中间的间隔区含14个2’-脱氧核苷酸，并在两侧(在5’和3’方向)分别连接含有3个核苷酸的侧翼区。2-13-5gapmer长为20个核苷酸，中间的间隔区含13个2’-脱氧核苷酸。中间的间隔在5’末端侧接有包含2个核苷酸的侧翼且在3’末端侧接有包含5个核苷酸的侧翼。对于各基序(5-10-5、3-14-3和2-13-5)而言，5’侧翼区的各核苷酸和3’侧翼区的各核苷酸均具有一个2’-MOE修饰。贯穿每个gapmer的核苷间连接都是硫代磷酸酯(P＝S)连接。贯穿每个gapmer的所有胞嘧啶核苷残基都是5-甲基胞嘧啶核苷。“靶向起始位点”表示gapmer靶向作用的最5’端位置。“靶向终止位点”表示gapmer靶向作用的最3’端位置。表8中所列的每个gapmer都靶向作用于SEQ ID NO：1(GENBANK登录号NM_000128.3)。
如表8所示，靶向作用于SEQ ID NO：1中起始于靶向起始位点1275并终止于靶向终止位点1318的靶区域(即，核碱基1275-1318)的所有5-10-5MOE gapmers、3-14-3MOE gapmers和2-13-5MOE gapmers，都对因子XI mRNA展示出至少70％的抑制作用。多数gapmer展示出至少80％的抑制作用，包括：412223、412224、412225、413482、416848、416849、416850、416851、416852、416853、416854、416855、416856、416857、416858、416859、416860、416861、416862、416863、416864、416865、416866、416867、416920、416921、416922、416923、416924、416925、416926、416927、416928、416929、416930、416931、416932、416933、416934、416935、416936、416937、416938、416939、416940、416941、416942、416943、416944、416997、416998、416999、417000、417001、417002、417003、417004、417006、417007、417008、417009、417010、417011、417013、417014、417015、417016、417017、417018、417019和417020。下述ISIS编号展示出至少90％的抑制作用：412224、416850、416853、416856、416857、416858、416861、416862、416864、416922、416923、416924、416925、416926、416928、416931、416932、416933、416934、416935、416937、416938、416940、416941、416943、416999和417002。
表8
靶向作用于SEQ ID NO：1(GENBANK登录号NM_000128.3.3)核碱基1275至1318的嵌合反义寡核苷酸对人因子XI mRNA水平的抑制作用
Figure BPA00001481359800761
Figure BPA00001481359800771
实施例4：HepG2细胞内人因子XI的剂量依赖性反义抑制
在HepG2细胞中以多个剂量测试了实施例3中的gapmer(见表4、5、6、7和8)，这些gapmer在体外都显示出人因子XI的抑制作用。以每孔10,000细胞的浓度将细胞铺板，并用含9.375nM、18.75nM、37.5nM和75nM浓度的如表9所示的反义寡核苷酸的脂质体试剂进行转染。在处理大约16小时后，从细胞分离RNA，用定量实时PCR测定因子XI mRNA的水平。采用人因子XI引物探针组RTS 2966检测mRNA水平。因子XI mRNA的水平根据由RIBOGREEN
Figure BPA00001481359800782
测量的总RNA含量进行调整。结果表示为，与未处理的对照细胞相比，因子XI抑制的百分率。如表9所示，在经反义寡核苷酸处理的细胞中，因子XI mRNA水平以剂量依赖性的方式降低。
表9
通过脂质体对HepG2细胞进行寡核苷酸转染后人因子XI的剂量依赖性反义抑制
Figure BPA00001481359800791
也通过电穿孔转染gapmer，并检测其对人因子XI mRNA呈现出的剂量依赖性的抑制。以每孔20,000细胞的浓度将细胞铺板，并用含0.7μM、2.2μM、6.7μM和20μM浓度的如表10所示的反义寡核苷酸进行电穿孔转染。在处理大约16小时后，从细胞分离RNA，用定量实时PCR测定因子XI mRNA的水平。采用人因子XI引物探针组RTS 2966检测mRNA水平。因子XI mRNA的水平根据由RIBOGREEN测量的总RNA含量进行调整。结果表示为，与未处理的对照细胞相比，因子XI抑制的百分率。如表10所示，在经反义寡核苷酸处理的细胞中，因子XI mRNA水平以剂量依赖性的方式降低。
表10
通过电穿孔对HepG2细胞转染寡核苷酸后人因子XI的剂量依赖性反义抑制
Figure BPA00001481359800803
Figure BPA00001481359800811
实施例5：选择和确认在HepG2细胞内人因子XI有效剂量依赖性的反义抑制
选择在实施例4中显示出对人因子XI有显著剂量依赖性抑制作用的gapmer，在HepG2细胞中以多个剂量进行检测。以每孔10,000细胞的浓度将细胞铺板，并用含2.34nM、4.69nM、9.375nM、18.75nM、37.5nM和75nM浓度的如表11所示的反义寡核苷酸的脂质体药物进行转染。在处理大约16小时后，从细胞分离RNA，用定量实时PCR测定因子XI mRNA的水平。采用人因子XI引物探针组RTS 2966检测mRNA水平。因子XI mRNA的水平根据由RIBOGREEN
Figure BPA00001481359800812
测量的总RNA含量进行调整。结果表示为，与未处理的对照细胞相比，因子XI抑制的百分率。如表11所示，与对照相比，在经反义寡核苷酸处理的细胞中，因子XI mRNA水平以剂量依赖性方式降低。
表11
通过脂质体对HepG2细胞进行寡核苷酸转染后人因子XI的剂量依赖性反义抑制
Figure BPA00001481359800813
也通过电穿孔转染gapmer，并检测其对人因子XI mRNA呈现出的剂量依赖性的抑制。以每孔20,000细胞的浓度将细胞铺板，并用含625nM、1250nM、2500nM、5,000nM、10,000nM和20,000nM浓度的如表12所示的反义寡核苷酸进行电穿孔转染。在处理大约16小时后，从细胞分离RNA，用定量实时PCR测定因子XI mRNA的水平。采用人因子XI引物探针组RTS 2966检测mRNA水平。因子XI mRNA的水平根据由RIBOGREEN测量的总RNA含量进行调整。结果表示为，与未处理的对照细胞相比，因子XI抑制的百分率。如表12所示，与对照相比，在经反义寡核苷酸处理的细胞中，因子XI mRNA水平以剂量依赖性方式降低。
表12
通过电穿孔对HepG2细胞进行寡核苷酸转染后人因子XI的剂量依赖性反义抑制
实施例6：选择和确认在短尾猴原代肝细胞内人因子XI有效剂量依赖性的反义抑制
在短尾猴(cyno)原代肝细胞中以多个剂量测试了在实施例4中显示出人因子XI显著剂量依赖性抑制作用的gapmer。以每孔35,000细胞的浓度将细胞铺板，加入含0.74nM、2.2nM、6.7nM、20nM、60nM和180nM浓度的如表13所示的反义寡核苷酸，进行电穿孔转染。在处理大约16小时后，从细胞分离RNA，用定量实时PCR测定因子XImRNA的水平。采用人因子XI引物探针组RTS 2966检测mRNA水平。因子XI mRNA的水平根据由RIBOGREEN
Figure BPA00001481359800831
测量的总RNA含量进行调整。结果表示为，与未处理的对照细胞相比，因子XI抑制的百分率。如表13所示，与对照相比，在经反义寡核苷酸处理的细胞中，因子XI mRNA水平以剂量依赖性方式降低。
表13
短尾猴原代肝细胞内人因子XI的剂量依赖性反义抑制
Figure BPA00001481359800832
实施例7：选择和确认gapmer在HepB3细胞内对人因子XI有效剂量依赖性的反义抑制
在人HepB3细胞中以多个剂量测试在实施例4中显示出人因子XI显著剂量依赖性抑制作用的gapmer。以每孔4,000细胞的浓度将细胞铺板，并用含2.3nM、4.7nM、9.4nM、18.75nM、37.5nM和75nM浓度的如表14所示的反义寡核苷酸的脂质体试剂进行转染。在处理大约16小时后，从细胞分离RNA，用定量实时PCR测定因子XI mRNA的水平。采用人因子XI引物探针组RTS 2966检测mRNA水平。因子XI mRNA的水平根据由RIBOGREEN测量的总RNA含量进行调整。结果表示为，与未处理的对照细胞相比，因子XI抑制的百分率。如表14所示，与对照相比，在经反义寡核苷酸处理的细胞中，因子XI mRNA水平以剂量依赖性方式降低。
表14
HepB3细胞内人因子XI的剂量依赖性反义抑制
Figure BPA00001481359800841
也通过穿孔对gapmer进行转染，并检测其对人因子XI mRNA呈现出的剂量依赖性的抑制。以每孔20,000细胞的浓度将细胞铺板，并用含41.15nM、123.457nM、370.37nM、1111.11nM、3333.33nM和10,000nM浓度的如表15所示的反义寡核苷酸进行电穿孔转染。在处理大约16小时后，从细胞分离RNA，用定量实时PCR测定因子XI mRNA的水平。采用人因子XI引物探针组RTS 2966检测mRNA水平。因子XI mRNA的水平根据由RIBOGREEN
Figure BPA00001481359800842
测量的总RNA含量进行调整。结果表示为，与未处理的对照细胞相比，因子XI抑制的百分率。如表15所示，与对照相比，在经反义寡核苷酸处理的细胞中，因子XI mRNA水平以剂量依赖性方式降低。
表15
HepB3细胞内人因子XI的剂量依赖性反义抑制
Figure BPA00001481359800843
Figure BPA00001481359800851
实施例8：原代小鼠肝细胞内鼠因子XI的反义抑制
将靶向作用于鼠因子XI的嵌合反义寡核苷酸设计为靶向作用于鼠因子XI(GENBANK登录号NM_028066.1，作为SEQ ID NO：6并入本发明)的5-10-5MOEgapmer。所述gapmer长为20个核苷酸，中间的间隔区含10个2’-脱氧核苷酸，并在两侧(在5’和3’方向)分别连接含5个核苷酸的侧翼区。各侧翼区的每个核苷酸都具有2’-MOE修饰。贯穿每个gapmer的核苷间连接都是硫代磷酸酯(P＝S)连接。贯穿每个gapmer的所有胞嘧啶核苷残基都是5-甲基胞嘧啶核苷。在原代小鼠肝细胞中评估反义寡核苷酸降低鼠因子XI mRNA的能力。
使用6.25nM、12.5nM、25nM、50nM、100nM和200nM反义寡核苷酸处理原代小鼠肝细胞，处理时间约为24小时。从细胞中分离RNA，使用定量实时PCR检测鼠因子XI mRNA的水平。采用鼠因子XI引物探针组RTS 2898(正向序列：ACATGACAGGCGCGATCTCT，作为SEQ ID NO：7并入本发明；反向序列：TCTAGGTTCACGTACACATCTTTGC，作为SEQ ID NO：8并入本发明；探针序列：TTCCTTCAAGCAATGCCCTCAGCAATX，作为SEQ ID NO：9并入本发明)检测mRNA水平。因子XI mRNA的水平根据由RIBOGREEN
Figure BPA00001481359800852
测量的总RNA含量进行调整。一些鼠反义寡核苷酸能够以剂量依赖的方式降低因子XI mRNA的水平。
实施例9：在原代小鼠肝细胞中鼠因子XI的交叉反应性的反义抑制
在体外检测了靶向作用于鼠因子XI核酸的反义寡核苷酸对因子XI mRNA的影响。用100nM反义寡核苷酸处理培养好的密度为每孔10,000个细胞的原代小鼠肝细胞。在处理大约24小时后，从细胞分离RNA，用定量实时PCR测定小鼠因子XI mRNA的水平。根据由RIBOGREEN
Figure BPA00001481359800861
测量的总RNA含量调整因子XI mRNA的水平。结果表示为，与未处理对照细胞相比，因子XI的抑制百分率。
将表16中的嵌合反义寡核苷酸设计为5-10-5MOE gapmer。所述gapmer长为20个核苷酸，中间的间隔区含10个2’-脱氧核苷酸，并在两侧(在5’和3’方向)分别连接含5个核苷酸的侧翼区。5’侧翼区的每个核苷酸和3’侧翼区的每个核苷酸都具有2’-MOE修饰。贯穿每个gapmer的核苷间连接都是硫代磷酸酯(P＝S)连接。贯穿每个gapmer的所有胞嘧啶核苷残基都是5-甲基胞嘧啶核苷。“小鼠靶向起始位点”表示gapmer靶向作用的最5’端位置。“小鼠靶向终止位点”表示gapmer靶向作用的最3’端位置。所有列出的小鼠寡核苷酸在小鼠因子XI mRNA(GENBANK登录号NM_028066.1，作为SEQ IDNO：6并入本发明)与人因子XI mRNA(GENBANK登录号NM_000128.3，作为SEQ IDNO：1并入本发明)之间均显示出交叉反应性。“人靶向起始位点”表示反义寡核苷酸靶向作用的人mRNA(GENBANK登录号NM_000128.3)的最5’端位置。“人靶向终止位点”表示反义寡核苷酸靶向作用的人mRNA(GENBANK登录号NM_000128.3)的最3’端位置。“错配数量”表示小鼠寡核苷酸和人mRNA序列之间的错配。
表16
靶向作用于SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：6的且具有5-10-5MOE侧翼和脱氧间隔的嵌合反义寡核苷酸对小鼠因子XI mRNA水平的抑制作用
Figure BPA00001481359800862
实施例10：鼠因子XI的体内反义抑制
对在体外研究中显示出具有统计学显著意义的剂量依赖性抑制的若干靶向作用于鼠因子XI mRNA(GENBANK登录号NM_028066.1，作为SEQ ID NO：6并入本发明)的反义寡核苷酸进行体内评估。用ISIS 404057(TCCTGGCATTCTCGAGCATT，靶向起始位点487，作为SEQ ID NO：10并入本发明)和ISIS 404071(TGGTAATCCACTTTCAGAGG，靶向起始位点869，作为SEQ ID NO：11并入本发明)治疗BALB/c小鼠。
治疗
对BALB/c小鼠注射给药5mg/kg、10mg/kg、25mg/kg或50mg/kg的ISIS 404057或ISIS 404071，每周两次，连续3周。对对照组小鼠注射给药磷酸盐缓冲液(PBS)，每周两次，连续3周。末次给药5天后处死小鼠。取整个肝脏用于RNA分析，收集血浆用于蛋白分析。
RNA分析
从肝脏组织中提取RNA，用于对因子XI进行实时PCR分析。如表17所示，与PBS对照相比，反义寡核苷酸能够剂量依赖性的降低鼠因子XI。结果表示为，与对照相比，因子XI的抑制百分率。
表17
在BALB/c小鼠中鼠因子XI mRNA剂量依赖性的反义抑制
  mg/kg   ％抑制
  404057   5   40
  10   64
  25   85
  50   95
  404071   5   72
  10   82
  25   93
  50   96
蛋白分析
如表18所示，用ISIS 404071治疗后，导致因子XI蛋白出现剂量依赖性的显著降低。结果表示为，与PBS对照相比，因子XI的抑制百分率。
表18
在BALB/c小鼠中ISIS 404071对鼠因子XI蛋白剂量依赖性的抑制
Figure BPA00001481359800881
实施例11：在胶原诱导的关节炎模型中，对鼠因子XI的体内反义抑制效果
在鼠胶原诱导的关节炎(CIA)模型中，评估了因子XI的抑制效果，以及其对导致关节炎症和类风湿性关节炎的关节中的纤维蛋白蓄积的作用。通过对动物给药胶原诱导关节炎的方法为本领域所公知的，此前Trentham et al.(J Exp Med，146：857-68，1977)、Courtenay et al.(Nature，283：666-668，1980)、Cathcart et al.(Lab Invest，54：26-31，1986)、Wooley(Methods Enzymol 162：361-373，1988)和Holmdahl et al.(ArthritisRheum 29：106，1986)已有描述。对小鼠给药胶原从而诱导出的关节炎可以进行目测评估和临床评估，参见Marty et al.(J Clin Invest，107：631-640，2001)的描述，其中除拇指外各脚趾肿胀时计1分(最高，4分)，跗骨或腕骨关节计1分，以及跖骨或掌骨关节计1分，后爪最高计6分，前爪最高计5分。分别对各只足爪进行分级，每只小鼠最高的临床关节炎累计评分为22分。
ISIS 404071(TGGTAATCCACTTTCAGAGG，作为SEQ ID NO：11并入本发明)是被设计为靶向作用于鼠因子XI(GENBANK登录号NM_028066.1，作为SEQ ID NO：6并入本发明；寡核苷酸靶向位点起始位置为869)的5-10-5MOE gapmer的嵌合反义寡核苷酸。所述gapmer长为20个核苷酸，中间的间隔区含10个2’-脱氧核苷酸，并在两侧(在5’和3’方向)分别连接含5个核苷酸的侧翼区。各侧翼区的每个核苷酸都具有2’-MOE修饰。贯穿每个gapmer的核苷间连接都是硫代磷酸酯(P＝S)连接。贯穿每个gapmer的所有胞嘧啶核苷残基都是5’甲基胞嘧啶核苷。
ISIS 403102(CCATAGAACAGCTTCACAGG，作为SEQ ID NO：275并入本发明)是被设计为靶向作用于鼠因子VII的5-10-5MOE gapmer的嵌合反义寡核苷酸。所述gapmer长为20个核苷酸，中间的间隔区含10个2’-脱氧核苷酸，并在两侧(在5’和3’方向)分别连接含5个核苷酸的侧翼区。各侧翼区的每个核苷酸都具有2’-MOE修饰。贯穿每个gapmer的核苷间连接都是硫代磷酸酯(P＝S)连接。贯穿每个gapmer的所有胞嘧啶核苷残基都是5’甲基胞嘧啶核苷。
ISIS 421208(TCGGAAGC GACTCTTATATG，作为AS SEQ ID NO：14并入本发明)是带有8个错配(MM)的ISIS 404071的对照寡核苷酸，将其作为对照。ISIS421208是被设计为靶向作用于鼠因子XI(GENBANK登录号NM_028066.1，作为SEQID NO：6并入本发明；寡核苷酸靶向位点起始位置为869)的5-10-5MOE gapmer的嵌合反义寡核苷酸。所述gapmer长为20个核苷酸，中间的间隔区含10个2’-脱氧核苷酸，并在两侧(在5’和3’方向)分别连接含5个核苷酸的侧翼区。各侧翼区的每个核苷酸都具有2’-MOE修饰。贯穿每个gapmer的核苷间连接都是硫代磷酸酯(P＝S)连接。贯穿每个gapmer的所有胞嘧啶核苷残基都是5’甲基胞嘧啶核苷。
ISIS 404057(TCCTGGCATT CTCGAGCATT，作为SEQ ID NO：10并入本发明)是被设计为靶向作用于鼠因子XI(GENBANK登录号NM_028066.1，作为SEQ ID NO：6并入本发明；寡核苷酸靶向位点起始位置为487)的5-10-5MOE gapmer的嵌合反义寡核苷酸。所述gapmer长为20个核苷酸，中间的间隔区含10个2’-脱氧核苷酸，并在两侧(在5’和3’方向)分别连接含5个核苷酸的侧翼区。各侧翼区的每个核苷酸都具有2’-MOE修饰。贯穿每个gapmer的核苷间连接都是硫代磷酸酯(P＝S)连接。贯穿每个gapmer的所有胞嘧啶核苷残基都是5’甲基胞嘧啶核苷。
雄性DBA/1J小鼠购自杰克逊实验室(Bar Harbor，Maine)。
关节炎研究A：因子Ⅺ的抑制(ISIS 404071)对关节炎的作用
在胶原诱导的关节炎(CIA)模型中评估ISIS 404071对因子XI的抑制效果及其改善关节炎的作用。
将雄性DBA/1J小鼠分组，并按照表19所示的方式治疗。
表19
小鼠研究分组小结
  分组(N)   ASO   CIA
  1.(15)   无   否
  2.(15)   无   是
  3.(15)   F7(403102) 20mpk   是
  4.(15)   F11(404071) 20mpk   是
在有15只DBA/1J小鼠的组中，对小鼠皮下注射20mg/kg ISIS 404071，每周两次，连续12周。在有15只小鼠的对照组中，对小鼠注射20mg/kg ISIS 403102，每周两次，连续12周。在各有15只小鼠的两个对照组中，对小鼠注射PBS，每周两次，连续12周。寡核苷酸首次给药后两周，将II型牛胶原(Chondrex Inc，Redmond，WA)与完全弗氏佐剂混合后，在冰上匀浆制成乳剂，其中含有100μg胶原，将其皮下注射至因子XI组、因子VII组和一个PBS对照组的动物的尾根部。在向这些组的动物首次注射胶原21天后，在尾根部的不同注射部位再次皮下注射含有100μg II型胶原和不完全弗氏佐剂的加强注射剂。
在首次胶原注射后的最初35天，每日对各组小鼠目测检查外周关节的关节炎外观，如肿胀和僵硬。结果参见表20(以相对于PBS对照的百分率表示)和图1-3。
表20
在CIA模型中反义寡核苷酸的临床效果
Figure BPA00001481359800901
‘CIA发生率’指在第40天时各组出现CIA的小鼠的百分率。‘受累足爪百分率’指各组小鼠总计60只足爪中出现关节炎的足爪所占的百分率。‘受累足爪的平均数量’指诊断为患有关节炎的小鼠的受累足爪数量。依据Marty et al.(J Clin Invest，107：631-640，2001)描述的方法对‘CIA临床严重性’评分，详情如下：除拇指外各脚趾肿胀时计1分(最高，4分)，跗骨或腕骨关节计1分，以及跖骨或掌骨关节计1分，后爪最高计6分，前爪最高计5分。分别对各只足爪进行分级，每只小鼠最高的临床关节炎累计评分为22分。
如表20和图1-3所示，用ISIS 404071治疗后对CIA的发病率产生显著抑制。
关节炎研究B：因子XI的抑制(ISIS 404071和ISIS 404057)对关节炎的作用
在胶原诱导的关节炎模型中评估ISIS 404071或ISIS 404057对因子XI的抑制效果及其改善关节炎的作用。
将雄性DBA/1J小鼠分组，并按照表21所示的方式治疗。
表21
小鼠研究分组小结
  分组(N)   ASO   CIA
  1.(20)   无   否
  2.(20)   无   是
  3.(20)   F11(404071) 20mpk   是
  4.(20)   F11(404057) 20mpk   是
  5.(20)   F11MM(421208) 20mpk   是
在有20只DBA/1J小鼠的组中，对小鼠皮下注射20mg/kg ISIS 404071，每周两次，连续10周。在另一个有20只DBA/1J小鼠的组中，对小鼠皮下注射20mg/kg ISIS404057，每周两次，连续10周。在第三个有20只DBA/1J小鼠的组中，对小鼠皮下注射20mg/kg ISIS 421208，每周两次，连续10周。在各有20只小鼠的两个对照组中，对小鼠注射PBS，每周两次，连续10周。
寡核苷酸首次给药后2.5周，将II型牛胶原与完全弗氏佐剂皮下注射至所有实验组和一个PBS对照组动物的尾根部。在首次向这些组动物注射胶原21天后，在尾根部的不同注射部位再次皮下注射含有100μg II型胶原和不完全弗氏佐剂的加强注射剂。
在首次胶原注射后的最初30天，对所有组中的小鼠进行目测检查外周关节的关节炎外观。在研究结束时，因子XI反义寡核苷酸的效果见表22和图4-6。除肝脏和脾脏重量以外，表22中的结果以相对于PBS对照的变化百分率表示。
表22
在CIA模型中反义寡核苷酸的作用
Figure BPA00001481359800921
胶原诱导的关节炎小鼠在经因子XI反义寡核苷酸ISIS 404071治疗后，其关节炎的量比未经治疗的小鼠显著降低(表22和图4A)。胶原诱导的关节炎小鼠在经因子XI反义寡核苷酸ISIS 404057治疗后，其关节炎的量与未经治疗的小鼠相比未受影响。这两个因子XI反义寡核苷酸作用的差异可能与各寡核苷酸对因子XI mRNA的抑制作用有关，参见图4B。ISIS 404057对因子XI缺乏抑制作用，相应地在小鼠中也缺乏关节炎抑制作用。
综上，就发明人所知，本实施例首次发现了因子XI对关节炎具有作用，且对动物用因子XI抑制剂进行治疗将改善动物的关节炎。用因子XI抑制剂治疗还能降低动物患有关节炎的风险和减慢关节炎的进展。
实施例12：在DSS诱导的结肠炎模型中，对鼠因子XI的体内反义抑制
在葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎模型中评估反义寡核苷酸对因子XI的抑制效果及其在改善结肠炎中的作用。对动物给药DSS是本领域所公知的可以诱导结肠炎的方法，此前Okayasu et al.(Gastroenterology，1990，98：694-702)、Cooper et al.(Lab Invest，1993，69：238-249)和Dieleman et al.(Clin Exp Immunol，1998，114：385-391)已有报道。
人类结肠炎的症状可以包括持续性腹泻(软便、水样便或频繁肠运动)、腹部绞痛、发热、直肠出血、食欲减退和体重减轻。结肠炎病理改变可以包括结肠改变如结肠缩短(Gore，1992，AJR，158：59-61)、炎症损伤形成、弥散性中性粒细胞浸润、粘膜下层水肿和固有肌层增厚。
靶向作用于因子XI的反义寡核苷酸已在上文的实施例11中进行了描述。SwissWebb小鼠购自Charles River实验室(Wilmington，MA)。
结肠炎研究A：因子XI的抑制(ISIS 404071)对结肠炎的效果
在葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎模型中，评估ISIS 404071对因子XI的抑制效果及其改善结肠炎的作用。
将雌性Swiss Webb小鼠分组，并按照表23所示的方式治疗。
表23
小鼠研究分组小结
  分组(N)   ASO   DSS
  1.(8)   无   否
  2.(8)   无   是
  3.(8)   F7(403102) 20mpk   是
  4.(8)   F11(404071) 20mpk   是
在一个有8只Swiss Webb小鼠的组中，对小鼠皮下注射20mg/kg ISIS 404071或ISIS 403102，每周两次，连续3周。在各有8只小鼠的两个对照组中，对小鼠注射PBS，每周两次，连续3周。寡核苷酸治疗后，实验组和一个PBS对照组的动物连续6天自由饮用4％DSS的水溶液。
在第0天对各组小鼠称重。在给药DSS后第7天研究结束，处死小鼠，测量其体重和结肠长度。结果参见表24(以PBS对照组的百分率表示)和图7。
表24
第7天时DSS诱导结肠炎模型中因子XI的抑制效果
Figure BPA00001481359800941
评估DSS诱导结肠炎的小鼠的结肠长度。用因子XI寡核苷酸治疗后，结肠炎的结肠缩短症状减少。
对用因子VII或XI寡核苷酸治疗的(DSS诱导的)溃疡性结肠炎小鼠模型的小鼠结肠组织进行研究，以确定炎症存在的量。
使用戊巴比妥钠(160mg/kg)处死小鼠。将结肠部分纵向分成相等的三段，采用10％中性缓冲福尔马林固定，石蜡包埋，切成4μm的切片，经苏木精和伊红染色后，光镜下检查。由病理学家负责对切片进行显微镜下检查，并对结肠炎症进行组织学严重性评分，参见图8和表25。将8C(用因子VII治疗)和8D(用因子XI治疗)中炎症的量与阴性对照8A(无炎症)和阳性对照8B(炎症最强)进行比较，以确定炎症的严重性。
表25
结肠组织组织病理学严重性评分
  分组   处置   ASO/靶向   严重性评分
  1(图5A)   否   无
  2(图5B)   DSS   无   ++++
  3(图5C)   DSS   FVII   ++++
  4(图5D)   DSS   FXI   +
与未经DSS处理的结肠(图8A)相比，经DSS处理的结肠(图8B)出现多处结肠炎损伤。图8C是经靶向作用于因子VII的对照寡核苷酸ISIS 403102治疗的结肠，其损伤情况与图8B中经DSS处理的结肠相似。图8D是经ISIS 404071处理的结肠，其粘膜的溃疡性损伤明显少于图8B或8C中的结肠。
结肠炎研究B：因子XI抑制(ISIS 404071和ISIS 404057)对结肠炎的效果
在葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎模型中评估ISIS 404071和ISIS 404057对因子XI的抑制效果及其改善结肠炎的作用。
将Swiss Webb小鼠分组，并按照表26所示的方式治疗。
表26
小鼠研究分组小结
  分组(N)   ASO   DSS
  1.(8)   无   否
  2.(8)   无   是
  3.(8)   F11(404071) 20mpk   是
  4.(8)   F11(404057) 20mpk   是
  5.(8)   F11MM(421208) 20mpk   是
在第一个有8只Swiss Webb小鼠的组中，对小鼠皮下注射20mg/kg ISIS 404071，每周两次，连续3周。在第二个有8只Swiss Webb小鼠的组中，对小鼠皮下注射20mg/kg ISIS 404057，每周两次，连续3周。在第三个有8只Swiss Webb小鼠的对照组中，对小鼠皮下注射20mg/kg ISIS 421208，每周两次，连续3周。在各有8只小鼠的两个对照组中，对小鼠注射PBS，每周两次，连续3周。寡核苷酸给药后，所有实验组和一个PBS对照组动物连续6天自由饮用4％DSS的水溶液。
在第0天和给药DSS后每天对各组小鼠称重。在给药DSS后第7天结束研究，处死小鼠，取肝脏和结肠用于RNA分析，测量其重量和结肠长度。
反义寡核苷酸对体重变化和结肠长度的效果参见表27和图9。
对因子ⅪmRNA进行RT-PCR分析。如表27和图10所示，与PBS对照相比，靶向作用于因子XI的反义寡核苷酸能够剂量依赖性地、且具有显著统计学意义的降低肝脏中的鼠因子XI。所有检测均使用亲环素进行归一化处理。
表27
第7天时DSS诱导结肠炎模型中因子XI的效果
  DSS对照  ISIS 404071   ISIS 404057   ISIS 421208
 肝脏因子XI mRNA   +150  -75   -50   +25
 结肠长度   -33  -11   -11   -33
 体重   -12  -10   -16   -10
表27中的所有结果均以相对于PBS对照的变化百分率表示。
结肠炎研究C：因子XI的抑制(ISIS 404071)对结肠炎的效果
采用因子XI寡核苷酸(ISIS 404071，SEQ ID NO：11)进行对结肠炎的第三项研究。本研究的进行与在本实施例前面描述的基本一致。进行了一项考察软便/腹泻的研究。7天后，未给药DSS的对照小鼠未出现腹泻，给药DSS的小鼠出现腹泻，给药因子XI寡核苷酸的小鼠表现为正常至软便，但未出现腹泻。
P-选择素与结肠炎恶化有关，降低P-选择素被发现可改善结肠炎(Gironella，M.etal.，J.Leukoc.Biol.2002.72：56-64)。在本研究中评估了反义抑制因子XI对血清P-选择素水平的影响。给药DSS后会导致P-选择素水平增加，在给药ISIS 404071后其减少。结果参见表28。
表28
因子XI抑制对血清中P-选择素水平的作用
  P-选择素(ng/mL)
  对照   86
  DSS对照   106
  ISIS 404071   83
结肠炎研究D：多种剂量的因子XI抑制(ISIS 404071)对结肠炎的效果
在葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎模型中评估多种剂量的ISIS 404071对因子XI的抑制效果及其改善结肠炎的作用。
将雌性Swiss Webb小鼠分组，并按照表29所示的方式给药。
表29
小鼠研究分组小结
  分组(N)   ASO   DSS
  1.(8)   无   否
  2.(8)   无   是
  3.(8)   F11(404071) 40mpk   是
  4.(8)   F11(404071) 20mpk   是
  5.(8)   F11(404071) 10mpk   是
在第一个有8只Swiss Webb小鼠的组中，对小鼠皮下注射10mg/kg ISIS 404071，每周两次，连续3周。在第二个有8只Swiss Webb小鼠的组中，对小鼠皮下注射20mg/kg ISIS 404057，每周两次，连续3周。在第三个有8只Swiss Webb小鼠的对照组中，对小鼠皮下注射40mg/kg ISIS 404057，每周两次，连续3周。在各有8只小鼠的两个对照组中，对小鼠注射PBS，每周两次，连续3周。寡核苷酸治疗后，所有实验组和一个PBS对照组动物连续7天自由饮用4％DSS的水溶液。
在第0天和自给药DSS后第3天起每天对各组小鼠称重，参见图11A。在给药DSS后第7天分析小鼠软便/腹泻情况，参见图11B。在给药DSS后第7天结束研究，处死小鼠，测量其结肠长度，参见图11C。
反义寡核苷酸对体重和腹泻评分的影响(图11A和11B)具有统计学显著性。尽管多种剂量的反义寡核苷酸之间对结肠长度的作用未显示出统计学显著性，但是与安慰剂比较时，给药这三个剂量均能显著改善结肠长度，参见图11C。
葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导产生结肠炎的小鼠的血液中，凝血酶-抗凝血酶(TAT)复合物的水平升高(Anthoni，C.et al.，J.Exp.Med.204：1595-1601，2007)，其也见于溃疡性结肠炎患者(Kume，K.et al.，Intern Med.2007.46：1323-9)。本研究评估了因子XI反义抑制对结肠中TAT水平的影响(凝血酶-抗-凝血酶III复合物，SiemensHealthcare Diagnostics，Deerfield，IL)，其结果见表30。结果显示，给药DSS后TAT水平升高，给药ISIS 404071后其可以剂量依赖性的方式降低。
已知当出现炎性肠病时，血浆中可溶性CD40配体(CD40L)的水平升高(Ludwiczek，O.et al.，Int.J.Colorectal Disease.2003.18：142-147)，可以考虑将其作为肠炎的标记物。本研究评估了因子XI反义抑制对血浆中CD40L水平的影响(BenderMedsystems，Vienna，Austria；eBioscience，San Diego，CA)，其结果见表31。结果显示，给药DSS后CD40L水平升高，给药ISIS 404071后其降低。
对实验模型和人溃疡性结肠炎的观察均提示激肽释放酶-激肽系统在炎性肠病中具有致病作用(Devani，M.et al.，Digestive and Liver Disease.2005.37：665-673)。本研究评估了因子XI反义抑制对结肠中激肽水平的影响(Phoenix Pharmaceuticals，Burlingame，CA)，其结果见表32。结果显示，给药DSS后激肽释放酶水平升高，给药ISIS 404071后其降低。
表30
各组小鼠结肠中的TAT水平
Figure BPA00001481359800981
表31
各组小鼠结肠中的CD40L水平
Figure BPA00001481359800982
表32
各组小鼠结肠中的激肽释放酶水平
Figure BPA00001481359800991
综上，该实施例表明，对动物用因子XI寡核苷酸治疗能够显著改善DSS诱导的溃疡性结肠炎。给药因子XI抑制剂还能降低动物患有结肠炎的风险和减慢结肠炎进展。
结肠炎研究E：在结肠炎模型中确定天然人因子XI蛋白是否能够逆转因子XI抑制剂(ISIS 404071)的效果
在葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎模型中评估人因子XI蛋白对ISIS 404071抑制因子XI效果的逆转作用。
将雌性Swiss Webb小鼠分组，并按照表33所示的方式给药。
表33
小鼠研究分组小结
  分组(N)   ASO   DSS   人重组FXI
  1.(8)   无   否   0
  2.(8)   无   是   0
  3.(8)   F11(404071) 40mpk   是   0
  4.(8)   F11(404071) 40mpk   是   20ug/小鼠/天
在各有8只Swiss Webb小鼠的两个组中，对小鼠皮下注射40mg/kg ISIS 404071，每周两次，连续3周。在各有8只小鼠的两个对照组中，对小鼠注射PBS，每周两次，连续3周。随后两个ASO治疗组和一个对照组动物连续7天自由饮用4％DSS的蒸馏水溶液。一个ASO和DSS处理组还连续7天对动物皮下注射20μg重组人因子XI蛋白(Haematologic Technologies Inc.)，从DSS处理前一天开始。在给药DSS后第7天结束研究，处死小鼠。
ISIS 404071对因子XI mRNA水平的反义抑制效果参见表34。与未经治疗的PBS对照相比，仅用ISIS 404071治疗的小鼠其因子XI的水平显著降低。
在第0天和研究结束时对各组小鼠称重。结果见表35，结果表明不同组在研究过程中均出现体重改变。在给药DSS后第7天结束研究，处死小鼠，并测量结肠长度。结果见表36，结果显示，给药重组因子XI蛋白后ISIS 404071治疗产生的结肠长度增加被抵消。在给药DSS后第7天，分析了小鼠的软便/腹泻情况，其评分结果见表37。在加入重组因子XI蛋白后，ISIS 404071治疗对小鼠腹泻情况的改善被抵消。
葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎小鼠的血液中，凝血酶-抗凝血酶(TAT)复合物水平升高(Anthoni，C.et al.，J.Exp.Med.204：1595-1601，2007)，其也见于溃疡性结肠炎患者(Kume，K.et al.，Intem Med.2007.46：1323-9)。在给药DSS后第7天结束研究，评估了因子XI反义抑制对结肠中TAT水平的影响(Siemens Healthcare Diagnostics，Deerfield，IL)，其结果见表38。结果显示，给药DSS后TAT水平升高，给药ISIS404071后其降低。给药重组因子XI蛋白导致在DSS处理的小鼠中TAT水平几乎恢复。
已知当出现炎性肠病时，血浆中可溶性CD40配体(CD40L)的水平升高(Ludwiczek，O.et al.，Int.J.Colorectal Disease.2003.18：142-147)，可以考虑将其作为肠炎的标记物。在给药DSS后第7天结束研究，评估了因子XI反义抑制对血浆中CD40L水平的影响，其结果见表39。采用商品化可购得的ELISA试剂盒(Bender MedSystems，Vienna，Austria，eBioscience，San Diego，CA)对血浆中的CD40L水平进行检测，依据生产厂商提供试验方案进行。结果显示，给药DSS后CD40L水平升高，给药ISIS 404071后其降低。给药重组因子XI蛋白导致在DSS处理的小鼠中CD40L水平恢复。
对实验模型和人溃疡性结肠炎的观察均提示激肽释放酶-激肽系统在炎性肠病中具有致病作用(Devani，M.et al.，Digestive and Liver Disease.2005.37：665-673)。在给药DSS后第7天结束研究，评估了因子XI反义抑制对结肠中激肽水平的影响(PhoenixPharmaceuticals，Burlingame，CA)，其结果见表40。结果显示，给药DSS后激肽释放酶的水平升高，给药ISIS 404071后其降低。给药重组因子XI蛋白导致在DSS处理的小鼠中激肽释放酶水平恢复。
在给药DSS后第7天结束研究，检测了各组小鼠结肠组织中IFN-γ、IL-10、IL-12、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、TNF-α和角化细胞趋化因子(KC)的细胞因子水平。将结肠在加入蛋白酶抑制剂(Sigma，St.Louis，MO)的PBS中进行冰上匀浆，在4℃下旋转提取1小时。离心除去不溶性物质后，使用多元ELISA(小鼠TH1/TH29-Plex超灵敏药物盒，Meso Scale Discovery，Gaithersburg，MD)分析结肠匀浆物中的细胞因子，依据生产厂商提供的试验方案进行。用蛋白检测试剂盒(BioRad，Hercules，CA)检测蛋白浓度，并以此对结肠提取物中的细胞因子水平进行归一化处理。细胞因子水平结果见表41。给药DSS后促炎性细胞因子IFN-γ、IL-1β、IL-10、IL-2、IL-5、TNF-α和KC的水平升高，给药ISIS 404071后其降低。给药重组因子XI蛋白导致在DSS处理的小鼠中细胞因子水平恢复。
综上，该实施例表明，对DSS诱导的溃疡性结肠炎动物进行反义治疗，能够改善其溃疡性结肠炎，降低诸如Th1细胞因子INF-γ、IL-1β、TNF-α和KC等某些促炎性细胞因子。此外，与未治疗小鼠相比，诸如Th2细胞因子IL-4和IL-5等促炎性细胞因子降低。该实施例还表明，用人因子XI蛋白治疗可以成功地逆转反义治疗对DSS诱导溃疡性结肠炎动物的作用。因此，重组人因子XI蛋白可以作为ISIS 404071治疗的解毒剂。
表34
与未经处理的PBS对照相比ISIS 404071的反义抑制作用和重组因子XI蛋白使因子XI水平的恢复情况
Figure BPA00001481359801011
表35
各组小鼠的体重变化(％)
Figure BPA00001481359801021
表36
各组小鼠的结肠长度
Figure BPA00001481359801022
表37
各组小鼠的粪便分析
Figure BPA00001481359801023
表38
各组小鼠的凝血酶-抗凝血酶(TAT)水平
Figure BPA00001481359801024
Figure BPA00001481359801031
表39
各组小鼠的CD40L血浆水平
表40
各组小鼠结肠中的激肽释放酶水平
Figure BPA00001481359801033
表41
各组小鼠结肠中的细胞因子水平(pg/mg)
Figure BPA00001481359801034
结肠炎研究F：ISIS 404071对结肠炎的效果
在葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎模型中评估ISIS 404071对因子XI的抑制作用及其改善结肠炎的作用。
将雌性Swiss Webb小鼠分组，并按照表42所示的方式治疗。
表42
小鼠研究分组小结
  分组(N)   ASO   DSS
  1.(8)   无   否
  2.(8)   无   是
  3.(8)   F11(404071) 50mpk   是
在第一个有8只Swiss Webb小鼠的组中，对小鼠皮下注射50mg/kg ISIS 404071，每周两次，连续3周。在各有8只小鼠的两个对照组中，对小鼠注射PBS，每周两次，连续3周。寡核苷酸治疗后，实验组和一个PBS对照组动物连续7天自由饮用4％DSS的水溶液。在给药DSS后第7天结束研究，处死小鼠。
在第0天和给药DSS后7天中每天对各组小鼠称重。小鼠第0天和第7天的体重见表43。给药DSS 7天后分析小鼠的软便/腹泻情况，见表44。在给药DSS后第7天结束研究，处死小鼠，测量其结肠长度和重量，见表45。
反义寡核苷酸对腹泻评分和结肠长度的影响具有统计学显著性(表44和45)。与安慰剂相比，ISIS 404071不会对体重造成显著影响，见表43。
在给药DSS后第7天结束研究，检测各组小鼠结肠中细胞因子IL-1、IL-6、IL-10、IL-12、IL-17和TNF-αmRNA的水平。将结肠在加入蛋白酶抑制剂(Sigma，St.Louis，MO)的PBS中进行冰上匀浆，在4℃下旋转提取1小时。离心除去不溶性物质后，使用多元ELISA(Meso Scale Discovery，Gaithersburg，MD)分析结肠匀浆中的细胞因子，依据生产厂商提供的试验方案进行。用蛋白检测试剂盒(BioRad，Hercules，CA)测得蛋白浓度，并据此对结肠提取物中的细胞因子水平进行归一化处理。结果见表46。给药DSS后，包括Th1细胞因子IL-1和IL-6的促炎性细胞因子的水平升高，给药ISIS 404071后其降低。GATA-3是一种转录因子，其能够促进Th2细胞分泌细胞因子IL-4、IL-5和IL-13。反义寡核苷酸对GATA-3的效果见表46。
对治疗后血浆中氨基转移酶(ALT和AST)、血液尿素氮(BUN)、肌酸酐(CREAT)、胆固醇(CHOL)和胆红素(TBIL)的水平进行了评估，结果见表47。
ISIS 404071治疗后，对肝脏和结肠中因子XI mRNA水平具有反义抑制效果，见表48(表示为占PBS处理对照的百分率)。
综上，该实施例表明，用因子XI寡核苷酸治疗能够显著改善DSS诱导的动物的溃疡性结肠炎。用因子XI抑制剂治疗还能降低动物患有结肠炎的风险和减慢结肠炎进展。用因子XI抑制剂治疗还能够降低Th1细胞因子IL-1和IL-6。
表43
治疗后的体重变化(克)
  体重(第0天)   体重(第7天)
  PBS   28.3   29.6
  DSS对照   26.8   23.1
  ISIS 404071   28   24.7
表44
经ISIS 404071治疗后的粪便评分
 第3天   第4天  第5天  第6天   第7天   第8天
  PBS  0   0  0  0   0   0
  DSS  0   0  1  1   1.63   2.5
  ISIS 404071  0   0.25  1  1   1   2
表45
治疗后的结肠长度和重量
  长度(cm)   重量(mg)
  PBS   10.8   293.8
  DSS对照   5.9   276.4
  ISIS 404071   7.8   339.3
表46
经ISIS 404071治疗后结肠中细胞因子mRNA的水平(表示为PBS处理动物的％)
Figure BPA00001481359801061
表47
经ISIS 404071治疗后的血浆ALT、AST、BUN、CREAT、CHOL和TBIL水平
Figure BPA00001481359801062
表48
与PBS处理相比经ISIS 404071治疗后肝脏和结肠中因子XI mRNA水平
Figure BPA00001481359801063
实施例13：在OVA诱导的哮喘模型中，对鼠因子XI反义抑制的体内效果
在OVA/alum-诱导的哮喘模型中评估反义寡核苷酸对因子XI的抑制效果及其在改善哮喘中的作用。通过对动物给药卵清蛋白诱导结肠炎是本领域所公知的方法，此前Henderson et al.(J.Exp.Med.，1996，184：1483-1494)已有报道。
哮喘在人体内的症状可以包括喘息、呼吸困难、非保护性咳嗽、胸部发紧和疼痛、心律加快和出汗。在哮喘发作或哮喘恶化时，肺组织出现炎症、支气管平滑肌细胞收缩、气道阻塞以及呼吸困难(Fanta，C.H.N.Engl.J.Med.2009.360：1002-1014)。
靶向作用于因子XI的反义寡核苷酸已在上文的实施例11中进行了描述。
治疗
将BALB/c小鼠(购自Charles River实验室，Wilmington，MA)饲养在12小时明暗交替循环的环境中，其可自由采食Teklad实验室啮齿动物饲料(Harlan Laboratories，Indianapolis，IN)。实验开始前，将动物在研究机构至少适应7天。使用PBS制备反义寡核苷酸(ASO)，利用0.2微米滤膜过滤除菌。将寡核苷酸溶于注射用0.9％的PBS中。
将小鼠分成四个治疗组，每组5只小鼠。一组动物皮下注射剂量为50mg/kg的ISIS404071，连续4周，每周两次。一组动物皮下注射剂量为50mg/kg的对照寡核苷酸ISIS421208，其是ISIS 404071的错配寡核苷酸序列，连续4周，每周两次。两组小鼠皮下注射给药PBS，连续4周，每周两次。一个PBS组不进行处置，将其作为对照组。第二个PBS组和两个寡核苷酸治疗组的动物在第0天和第14天注射OVA/alum，在第24天、第25天和第26天喷雾给药溶于PBS的OVA。第一次OVA用于使小鼠对OVA致敏，而第二次为攻击性应用，以激发哮喘反应。末次给药2天后，将小鼠麻醉，收集支气管灌洗液(BAL)并对其进行分析。
支气管哮喘，即使是轻微形式，也具有炎症细胞和免疫效应细胞局部浸润和活化的特性，包括T淋巴细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和肥大细胞(Smith D.L.et al.，Am.Rev.Respir.Dis.1993.148：523-532)。评估了ISIS 404071对支气管灌洗液(BAL)嗜酸性粒细胞募集情况的效果。将BAL细胞用苏木精和伊红(H&E)染色。结果见表49，表示为占BAL中总细胞的百分率。数据显示，ISIS 404071治疗能够减少嗜酸性粒细胞的募集。
将肺切片用碘酸希夫氏碱(PAS)染色，其可染色在哮喘发作时产生的粘液(Rogers，D.F.Curr.Opin Pharmacol.2004.4：241-250)。评估含有粘液的气道数占肺部气道总数的百分率。数据见表50，提示用ISIS 404071治疗减少了肺部粘液的产生。
表49
治疗后BAL嗜酸性粒细胞的募集
  嗜酸性粒细胞(％)
  PBS   0
  OVA对照   48
  ISIS 404071   32
  ISIS 421208   51
表50
治疗后粘液产生情况
  气道％
  PBS   0
  OVA对照   58
  ISIS 404071   34
  ISIS 421208   49
综上，该实施例表明，用因子XI寡核苷酸治疗能够显著改善OVA诱导的动物的哮喘。用因子XI抑制剂治疗还能降低动物患有哮喘的风险和减慢哮喘进展。
实施例14：在HepG2细胞中微移的寡核苷酸对人因子XI的反义抑制
根据ISIS 416850和ISIS 416858设计了其他的gapmer(见上文表8)。这些gapmer向ISIS 416850和ISIS 416858的上游和下游略微进行了迁移(即，“微移”)。微移gapmer设计为5-8-5MOE或6-8-6MOE基序。
在体外对这些微移gapmer进行了测试。用8,000nM反义寡核苷酸电穿孔转染培养好的密度为每孔20,000个细胞的HepG2细胞。在处理大约24小时后，从细胞分离RNA，用定量实时PCR测定因子XI mRNA的水平。因子XI mRNA的水平根据由RIBOGREEN测量的总RNA含量进行调整。结果表示为，与未处理对照细胞相比，因子XI的抑制百分率。
在体外对ISIS 416850和ISIS 416858以及选自表1和表8的gapmer与微移gapmer一并在上文所述的相同条件下进行再检测(即，ISIS 412206、ISIS 412223、ISIS 412224、ISIS412225、ISIS 413481、ISIS 413482、ISIS 416825、ISIS 416848、ISIS 416849、ISIS416850、ISIS 416851、ISIS 416852、ISIS 416853、ISIS 416854、ISIS 416855、ISIS416856、ISIS 416857、ISIS 416858、ISIS 416859、ISIS 416860、ISIS 416861、ISIS416862、ISIS 416863、ISIS 416864、ISIS 416865、ISIS 416866和ISIS 416867)。
表51中的嵌合反义寡核苷酸设计为5-10-5MOE、5-8-5和6-8-6MOE gapmers。表51中列出的前两个gapmer为原始gapmer(ISIS 416850和ISIS 416858)并以星号表示，由此通过微移设计ISIS 445493-445543。5-10-5gapmer长为20个核苷酸，中间的间隔区含10个2’-脱氧核苷酸，并在两侧(在5’和3’方向)分别连接包含5个核苷酸的侧翼区。5-8-5gapmer长为18个核苷酸，中间的间隔区含8个2’-脱氧核苷酸，并在两侧(在5’和3’方向)分别连接包含5个核苷酸的侧翼区。6-8-6gapmer长为20个核苷酸，中间的间隔区含8个2’-脱氧核苷酸，并在两侧(在5’和3’方向)分别连接包含6个核苷酸的侧翼区。对于各基序(5-10-5、5-8-5和6-8-6)而言，5’侧翼区的各核苷酸和3’侧翼区的各核苷酸均具有一个2’-MOE修饰。贯穿每个gapmer的核苷间连接都是硫代磷酸酯(P＝S)连接。贯穿每个gapmer的所有胞嘧啶核苷残基都是5-甲基胞嘧啶核苷。“人靶向起始位点”表示gapmer靶向作用的人序列的最5’端的核苷酸。“人靶向终止位点”表示gapmer靶向作用的人序列的最3’端的核苷酸。表51中所列的每个gapmer都靶向作用于SEQ ID NO：1(GENBANK登录号NM_000128.3)。表51中所列的每个gapmer还对恒河猴因子XI基因序列，在本申请中命名为SEQ ID NO：274(外显子1-15GENBANK登录号NW_001118167.1)，具有完全的交叉反应性。‘恒河猴起始位点’表示gapmer靶向作用的恒河猴序列的最5’端的核苷酸。‘恒河猴终止位点’表示gapmer靶向作用的恒河猴序列的最3’端的核苷酸。
如表51所示，微移设计的靶向作用于SEQ ID NO：1中起始于靶向起始位点1275并终止于靶向终止位点1317的靶区域(即，核碱基1275-1317)的所有gapmer，对因子XImRNA都展示出至少60％的抑制作用。类似地，表1和表8中所有再检测的gapmer均展示出至少60％的抑制作用。
若干gapmer展示出至少70％的抑制作用，包括ISIS编号：ISIS 412206、412224、412225、413481、413482、416825、416848、416849、416850、416851、416852、416853、416854、416855、416856、416857、416858、416859、416860、416861、416862、416863、416864、416865、416866、416867、445494、445495、445496、445497、445498、445499、445500、445501、445502、445503、445504、445505、445506、445507、445508、445509、445510、445511、445512、445513、445514、445515、445516、445517、445518、445519、445520、445521、445522、445523、445524、445525、445526、445527、445528、445529、445530、445531、445532、445533、445534、445535、445536、445537、455538、445539、445540、445541、445542和445543。
若干gapmer展示出至少80％的抑制作用，包括ISIS编号：ISIS 412206、412224、412225、413481、413482、416825、416848、416849、416850、416851、416852、416853、416854、416855、416856、416857、416858、416859、416860、416861、416862、416863、416864、416865、416866、416867、445494、445495、445496、445497、445498、445500、445501、445502、445503、445504、445505、445506、445507、445508、445509、445510、445513、445514、445519、445520、445521、445522、445525、445526、445529、445530、445531，445532、445533、445534、445535、445536、455538、445541和445542。
若干gapmer展示出至少90％的抑制作用，包括ISIS编号：ISIS 412206、416825、416850、416857、416858、416861、445522和445531。
表51
靶向作用于SEQ ID NO：1(GENBANK登录号NM_000128.3)的嵌合反义寡核苷酸对人因子XImRNA水平的抑制
Figure BPA00001481359801101
Figure BPA00001481359801111
Figure BPA00001481359801121
实施例15：HepG2细胞中人因子XI剂量依赖性反义抑制
在HepG2细胞中以多种剂量测试在实施例14中显示出人因子XI体外抑制作用的gapmer。以每孔20,000细胞的浓度将细胞铺板，加入含123.46nM、370.37nM、1,111.11nM、3,333.33nM和10,000nM浓度的如表52所示的反义寡核苷酸进行电穿孔转染。在处理大约16小时后，从细胞分离RNA，用定量实时PCR测定因子XI mRNA的水平。采用人因子XI引物探针组RTS 2966检测mRNA水平。因子XI mRNA的水平根据由RIBOGREEN测量的总RNA含量进行调整。结果表示为，与未处理的对照细胞相比，因子XI的抑制百分率。如表52所示，反义寡核苷酸处理的细胞中，因子XI mRNA水平以剂量依赖性的方式降低。
通过用使用的反义寡核苷酸浓度对在各浓度时达到的因子XI mRNA表达抑制的百分率作图，记录与PBS对照相比因子XI mRNA的表达抑制达到50％时的反义寡核苷酸浓度，计算各寡核苷酸的半数最大抑制浓度(IC50)。IC50值见表52。
表52
通过电穿孔在HepG2细胞内转染寡核苷酸后人因子XI的剂量依赖性反义抑制
n.d.＝无数据
实施例16：HepG2细胞中对寡核苷酸进行微调设计后人因子XI剂量依赖性反义抑制
根据ISIS 416850和ISIS 416858设计了其他gapmer(见上文表8)。这些gapmer向ISIS 416850和ISIS 416858的上游和下游略微进行了迁移(即，“微移”)。微移gapmer设计为3-8-3MOE、4-8-4MOE、2-10-2MOE、3-10-3MOE或4-10-4MOE基序。
在HepG2细胞中以多个剂量对这些gapmer进行检测。以每孔20,000细胞的浓度将细胞铺板，加入含375nM、750nM、1,500nM、3,000nM、6,000nM和12,000nM浓度的如表54所示的反义寡核苷酸进行电穿孔转染。在处理大约16小时后，从细胞分离RNA，用定量实时PCR测定因子XI mRNA的水平。采用人因子XI引物探针RTS 2966检测mRNA水平。因子XI mRNA的水平根据由RIBOGREEN测量的总RNA含量进行调整。结果表示为，与未处理的对照细胞相比，因子XI的抑制百分率。
在体外对ISIS 416850、ISIS 416858、ISIS 445522和ISIS 445531(见上表52)与微移gapmer一并在上文所述的相同条件下进行再检测。
将表53中的嵌合反义寡核苷酸设计为3-8-3MOE、4-8-4MOE、2-10-2MOE、3-10-3MOE或4-10-4MOE gapmers。3-8-3gapmer长为14个核苷酸，中间的间隔区含8个2’-脱氧核苷酸，并在两侧(在5’和3’方向)分别连接包含3个核苷酸的侧翼区。4-8-4gapmer长为16个核苷酸，中间的间隔区含8个2’-脱氧核苷酸，并在两侧(在5’和3’方向)分别连接包含4个核苷酸的侧翼区。2-10-2gapmer长为14个核苷酸，中间的间隔区含10个2’-脱氧核苷酸并在两侧(在5’和3’方向)分别连接包含2个核苷酸的侧翼区。3-10-3gapmer长为16个核苷酸，中间的间隔区含10个2’-脱氧核苷酸，并在两侧(在5’和3’方向)分别连接包含3个核苷酸的侧翼区。4-10-4gapmer长为18个核苷酸，中间的间隔区含10个2’-脱氧核苷酸，并在两侧(在5’和3’方向)分别连接包含4个核苷酸的侧翼区。对于各基序(3-8-3、4-8-4、2-10-2，3-10-3和4-10-4)而言，5’侧翼区的各核苷酸和3’侧翼区的各核苷酸均具有一个2’-MOE修饰。贯穿每个gapmer的核苷间连接都是硫代磷酸酯(P＝S)连接。贯穿每个gapmer的所有胞嘧啶核苷残基都是5-甲基胞嘧啶核苷。“人靶向起始位点”表示gapmer靶向作用的人序列的最5’端的核苷酸。“人靶向终止位点”表示gapmer靶向作用的人序列的最3’端的核苷酸。表53中所列的每个gapmer都靶向作用于SEQ ID NO：1(GENBANK登录号NM_000128.3)。表53中所列的每个gapmer还对恒河猴因子XI基因序列，在本申请中命名为SEQ ID NO：274(外显子1-15GENBANK登录号NW_001118167.1)，具有完全的交叉反应性。‘恒河猴起始位点’表示gapmer靶向作用的恒河猴序列的最5’端的核苷酸。‘恒河猴终止位点’表示gapmer靶向作用的恒河猴序列的最3’端的核苷酸。
表53
靶向作用于SEQ ID NO：1(GENBANK登录号NM_000128.3)的嵌合反义寡核苷酸，通过微移ISIS 416850和ISIS 416858设计
Figure BPA00001481359801161
剂量依赖性抑制数据见表54。如表54所示，采用反义寡核苷酸处理细胞后，因子XI mRNA水平以剂量依赖的方式降低。还计算了各反义寡核苷酸的IC50，见表54。表54中列出的前两个gapmer为原始gapmer(ISIS 416850和ISIS 416858)并以星号表示，由此通过微移设计其余的gapmer。
表54
通过电穿孔在HepG2细胞内转染寡核苷酸后人因子XI的剂量依赖性反义抑制
n.d.＝无数据
实施例17：CD1小鼠中靶向作用于人因子XI的反义寡核苷酸的耐受性
用靶向作用于人因子XI的ISIS反义寡核苷酸治疗CD1小鼠，并评估多种代谢标记物水平的变化情况。
治疗
每5只CD1小鼠一组，皮下注射50mg/kg ISIS 416825、ISIS 416826、ISIS416838、ISIS 416850、ISIS 416858、ISIS 416864、ISIS 416892、ISIS 416925、ISIS416999、ISIS 417002或ISIS 417003，每周两次，连续2、4或6周。对照组的五只动物连续2周皮下注射PBS。将所有实验组(即，连续2、4、6周用ASO治疗的小鼠)与对照组(即，PBS，2周)进行比较。
各组末次给药3天后，将小鼠处死。测定器官重量，收集血液进行进一步分析。
器官重量
研究结束时测定肝脏、脾脏和肾脏的重量，见表55、56和57，表示为相对于PBS对照的百分率，用体重进行归一化处理。选择与PBS对照相比未使肝脏和脾脏重量增加六倍以上的反义寡核苷酸进行进一步研究。
表55
用反义寡核苷酸治疗后CD1小鼠肝脏重量的变化百分率
Figure BPA00001481359801171
表56
用反义寡核苷酸治疗后CD1小鼠脾脏重量的变化百分率
Figure BPA00001481359801181
表57
用反义寡核苷酸治疗后CD1小鼠肾脏重量的变化百分率
Figure BPA00001481359801182
肝功能
为评估ISIS寡核苷酸对肝功能的影响，采用自动临床化学分析仪(HitachiOlympus AU400e，Melville，NY)对转氨酶的血浆浓度进行了检测。丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)的检测结果以IU/L表示，其结果见表58和59。采用相同的临床化学分析仪还对血浆中胆红素和白蛋白的水平进行了检测，以mg/dL表示。结果见表60和61。选择与对照水平相比未使ALT/AST水平增加七倍以上的反义寡核苷酸进行进一步研究。选择与对照水平相比未使胆红素水平增加两倍以上的反义寡核苷酸进行进一步研究。
表58
CD1小鼠中反义寡核苷酸对ALT(IU/L)的影响
  2周   4周   6周
  PBS   36   n.d.   n.d.
  ISIS 416825   64   314   507
  ISIS 416826   182   126   1954
  ISIS 416838   61   41   141
  ISIS 416850   67   58   102
  ISIS 416858   190   57   216
  ISIS 416864   44   33   92
  ISIS 416925   160   284   1284
  ISIS 416999   61   160   1302
  ISIS 417002   71   138   2579
  ISIS 416892   66   1526   1939
  ISIS 417003   192   362   2214
n.d.＝无数据
表59
CD1小鼠中反义寡核苷酸对AST(IU/L)的影响
  2周   4周   6周
  PBS   68   n.d.   n.d.
  ISIS 416825   82   239   301
  ISIS 416826   274   156   1411
  ISIS 416838   106   73   107
  ISIS 416850   72   88   97
  ISIS 416858   236   108   178
  ISIS 416864   58   46   101
  ISIS 416925   144   206   712
  ISIS 416999   113   130   671
  ISIS 417002   96   87   1166
  ISIS 416892   121   1347   1443
  ISIS 417003   152   249   839
n.d.＝无数据
表60
CD1小鼠中反义寡核苷酸对胆红素(mg/dL)的影响
  2周   4周   6周
  PBS   0.28   n.d.   n.d.
  ISIS 416825   0.41   0.69   0.29
  ISIS 416826   0.39   0.20   0.37
  ISIS 416838   0.57   0.24   0.20
  ISIS 416850   0.46   0.23   0.22
  ISIS 416858   0.57   0.24   0.16
  ISIS 416864   0.40   0.26   0.22
  ISIS 416925   0.45   0.25   0.25
  ISIS 416999   0.48   0.18   0.28
  ISIS 417002   0.50   0.25   0.29
  ISIS 416892   0.38   2.99   0.50
  ISIS 417003   0.33   0.15   0.24
n.d.＝无数据
表61
CD1小鼠中反义寡核苷酸对白蛋白(mg/dL)的影响
  2周   4周   6周
  PBS   3.7   n.d.   n.d.
  ISIS 416825   3.6   3.4   3.5
  ISIS 416826   3.3   3.4   3.4
  ISIS 416838   3.5   3.8   3.6
  ISIS 416850   3.6   3.5   3.1
  ISIS 416858   3.4   3.5   2.8
  ISIS 416864   3.5   3.6   3.5
  ISIS 416925   3.5   3.5   3.2
  ISIS 416999   3.4   3.3   3.2
  ISIS 417002   3.2   3.4   3.4
  ISIS 416892   3.2   4.0   4.4
  ISIS 417003   3.4   3.4   3.2
n.d.＝无数据
肾功能
为评估ISIS寡核苷酸对肾功能的影响，采用自动临床化学分析仪(HitachiOlympus AU400e，Melville，NY)对血液尿素氮(BUN)和肌酸酐的血浆浓度进行了检测。结果见表62和63，以mg/dL表示。选择与PBS对照相比未使BUN水平增加两倍以上的反义寡核苷酸进行进一步研究。
        表62
CD1小鼠中反义寡核苷酸对BUN(mg/dL)的影响
  2周   4周   6周
  PBS   30   n.d.   n.d.
  ISIS 416825   29   35   31
  ISIS 416826   24   34   27
  ISIS 416838   25   38   30
  ISIS 416850   25   30   23
  ISIS 416858   21   29   19
  ISIS 416864   22   31   28
  ISIS 416925   21   30   17
  ISIS 416999   22   27   22
  ISIS 417002   19   23   19
  ISIS 416892   19   28   23
  ISIS 417003   23   26   24
n.d.＝无数据
表63
CD1小鼠中反义寡核苷酸对肌酸酐(mg/dL)的影响
  2周   4周   6周
  PBS   0.14   n.d.   n.d.
  ISIS 416825   0.14   0.21   0.17
  ISIS 416826   0.15   0.20   0.15
  ISIS 416838   0.09   0.27   0.14
  ISIS 416850   0.13   0.22   0.19
  ISIS 416858   0.13   0.23   0.10
  ISIS 416864   0.11   0.22   0.16
  ISIS 416925   0.12   0.25   0.13
  ISIS 416999   0.07   0.18   0.13
  ISIS 417002   0.06   0.16   0.10
  ISIS 416892   0.11   0.20   0.17
  ISIS 417003   0.17   0.24   0.18
n.d.＝无数据
血液学检测
将从各组小鼠中获得的血液运送至Antech Diagnostics进行红细胞压积(HCT)、平均红细胞容积(MCV)、平均红细胞血红蛋白(MCH)以及平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)的检测和分析，以及对多种血细胞进行检测，如WBC(中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞)、RBC和血小板，以及总血红蛋白含量。结果见表64-74。表中的百分率表示相对于总血细胞计数的百分率。选择未使血小板计数值的减少超过50％和/或单核细胞计数增加超过三倍的反义寡核苷酸进行进一步研究。
表64
CD1小鼠中反义寡核苷酸对HCT(％)的影响
  2周   4周   6周
  PBS   50   n.d.   n.d.
  ISIS 416825   49   46   40
  ISIS 416826   47   41   37
  ISIS 416838   42   44   39
  ISIS 416850   44   44   38
  ISIS 416858   50   45   46
  ISIS 416864   50   45   42
  ISIS 416925   51   47   47
  ISIS 416999   5l   42   40
  ISIS 417002   44   44   51
  ISIS 416892   48   42   45
  ISIS 417003   48   41   43
n.d.＝无数据
表65
CD1小鼠中反义寡核苷酸对MCV(fL)的影响
  2周   4周   6周
  PBS   61   n.d.   n.d.
  ISIS 416825   58   53   51
  ISIS 416826   56   52   53
  ISIS 416838   56   54   48
  ISIS 416850   57   51   50
  ISIS 416858   59   51   50
  ISIS 416864   57   52   51
  ISIS 416925   61   52   47
  ISIS 416999   60   49   48
  ISIS 417002   61   50   52
  ISIS 416892   59   49   53
  ISIS 417003   60   48   45
n.d.＝无数据
表66
CD1小鼠中反义寡核苷酸对MCH(pg)的影响
  ISIS No.   2周   4周   6周
  PBS   18   n.d.   n.d.
  ISIS 416825   17   16   15
  ISIS 416826   17   16   16
  ISIS 416838   17   17   15
  ISIS 416850   17   16   15
  ISIS 416858   17   16   15
  ISIS 416864   18   16   16
  ISIS 416925   17   16   15
  ISIS 416999   17   16   15
  ISIS 417002   17   16   16
  ISIS 416892   18   16   16
  ISIS 417003   17   16   16
n.d.＝无数据
表67
CD1小鼠中反义寡核苷酸对MCHC(％)的影响
  2周   4周   6周
  PBS   30   n.d.   n.d.
  ISIS 416825   29   31   31
  ISIS 416826   29   31   30
  ISIS 416838   30   31   32
  ISIS 416850   30   31   31
  ISIS 416858   30   32   31
  ISIS 416864   31   31   31
  ISIS 416925   30   32   32
  ISIS 416999   27   32   31
  ISIS 417002   29   32   31
  ISIS 416892   30   32   30
  ISIS 417003   29   32   33
n.d.＝无数据
表68
CD1小鼠中反义寡核苷酸对WBC计数(细胞/nL)的影响
  2周   4周   6周
  PBS   6   n.d.   n.d.
  ISIS 416825   8   8   6
  ISIS 416826   5   6   8
  ISIS 416838   4   6   5
  ISIS 416850   4   5   5
  ISIS 416858   6   7   4
  ISIS 416864   7   6   5
  ISIS 416925   6   6   11
  ISIS 416999   4   9   7
  ISIS 417002   8   8   16
  ISIS 416892   5   8   9
  ISIS 417003   7   9   10
n.d.＝无数据
表69
CD1小鼠中反义寡核苷酸对RBC计数(细胞/nL)的影响
  2周   4周   6周
  PBS   8   n.d.   n.d.
  ISIS 416825   9   9   8
  ISIS 416826   8   8   7
  ISIS 416838   8   8   8
  ISIS 416850   8   9   8
  ISIS 416858   9   9   9
  ISIS 416864   9   9   8
  ISIS 416925   9   9   10
  ISIS 416999   9   9   8
  ISIS 417002   9   9   10
  ISIS 416892   7   9   9
  ISIS 417003   8   9   10
n.d.＝无数据
表70
CD1小鼠中反义寡核苷酸对中性粒细胞计数(％)的影响
  2周   4周   6周
  PBS   16   n.d.   n.d.
  ISIS 416825   15   43   23
  ISIS 416826   26   33   23
  ISIS 416838   19   33   31
  ISIS 416850   15   21   16
  ISIS 416858   14   24   27
  ISIS 416864   13   27   20
  ISIS 416925   12   39   33
  ISIS 416999   12   25   22
  ISIS 417002   14   31   36
  ISIS 416892   19   43   28
  ISIS 417003   10   39   24
n.d.＝无数据
表71
CD1小鼠中反义寡核苷酸对淋巴细胞计数(％)的影响
  2周   4周   6周
  PBS   81   n.d.   n.d.
  ISIS 416825   82   53   71
  ISIS 416826   70   61   67
  ISIS 416838   76   64   60
  ISIS 416850   82   73   76
  ISIS 416858   83   73   65
  ISIS 416864   84   71   74
  ISIS 416925   86   58   57
  ISIS 416999   86   72   69
  ISIS 417002   83   64   51
  ISIS 416892   79   52   64
  ISIS 417003   86   54   66
n.d.＝无数据
表72
CD1小鼠中反义寡核苷酸对单核细胞计数(％)的影响
  2周   4周   6周
  PBS   3   n.d.   n.d.
  ISIS 416825   2   5   4
  ISIS 416826   3   5   8
  ISIS 416838   2   2   6
  ISIS 416850   3   6   6
  ISIS 416858   2   3   7
  ISIS 416864   2   2   5
  ISIS 416925   2   4   8
  ISIS 416999   2   4   8
  ISIS 417002   3   4   12
  ISIS 416892   3   6   7
  ISIS 417003   2   6   8
n.d.＝无数据
表73
CD1小鼠中反义寡核苷酸对血小板计数(％)的影响
  2周   4周   6周
  PBS   2126   n.d.   n.d.
  ISIS 416825   1689   1229   942
  ISIS 416826   1498   970   645
  ISIS 416838   1376   1547   1229
  ISIS 416850   1264   1302   1211
  ISIS 416858   2480   1364   1371
  ISIS 416864   1924   1556   933
  ISIS 416925   1509   1359   1211
  ISIS 416999   1621   1219   1057
  ISIS 417002   1864   1245   1211
  ISIS 416892   1687   636   1004
  ISIS 417003   1309   773   922
n.d.＝无数据
表74
CD1小鼠中反义寡核苷酸对血红蛋白含量(g/dL)的影响
  2周   4周   6周
  PBS   15.1   n.d.   n.d.
  ISIS 416825   14.5   14.1   12.1
  ISIS 416826   13.4   12.8   11.0
  ISIS 416838   12.4   13.6   12.6
  ISIS 416850   13.1   13.5   11.6
  ISIS 416858   14.8   14.2   14.1
  ISIS 416864   15.2   13.9   13.0
  ISIS 416925   14.9   14.8   15.3
  ISIS 416999   14.2   13.3   12.8
  ISIS 417002   14.7   14.0   15.7
  ISIS 416892   13.0   13.5   13.1
  ISIS 417003   13.7   13.4   14.0
n.d.＝无数据
实施例18：反义寡核苷酸在CD1小鼠肝脏中的半衰期测定
用靶向作用于人因子XI的ISIS反义寡核苷酸治疗CD1小鼠，评估寡核苷酸的半衰期以及寡核苷酸的降解时间和在肝脏中的消除时间。
治疗
每15只CD1小鼠一组，皮下注射50mg/kg ISIS 416825、ISIS 416826、ISIS416838、ISIS 416850、ISIS 416858、ISIS 416864、ISIS 416892、ISIS 416925、ISIS416999、ISIS 417002或ISIS 417003，每周两次，连续2周。末次给药后3天、28天和56天，每组处死5只小鼠。收集肝脏用于分析。
寡核苷酸浓度的测定
测定全长寡核苷酸以及总寡核苷酸(包括降解形式)的浓度。采用此前已公开方法(Leeds et al.，1996；Geary et al.，1999)的改良方法进行检测，其由先进行苯酚-氯仿(液-液)提取，再进行固相提取组成。在提取前先加入内标物(ISIS 355868，27-mer 2’-O-甲氧乙基修饰硫代磷酸寡核苷酸，GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT，本申请中命名为SEQ ID NO：270)。采用校准曲线计算组织样本浓度，其定量检测下限(LLOQ)约为1.14μg/g。随后利用WinNonlin软件(PHARSIGHT)计算半衰期。
结果见表75和76，以μg/g肝脏组织表示。各寡核苷酸的半衰期见表77。
表75
CD1小鼠肝脏中全长寡核苷酸的浓度(μg/g)
  ISISNo.   基序   第3天   第28天   第56天
  416825   5-10-5   151   52   7
  416826   5-10-5   186   48   8
  416838   5-10-5   170   46   10
  416850   5-10-5   238   93   51
  416858   5-10-5   199   102   18
  416864   5-10-5   146   38   25
  416999   2-13-5   175   26   0
  417002   2-13-5   119   24   1
  417003   2-13-5   245   42   4
  416925   3-14-3   167   39   5
  416892   3-14-3   135   31   6
表76
CD1小鼠肝脏中总寡核苷酸的浓度(μg/g)
  ISISNo.   基序   第3天   第28天   第56天
  416825   5-10-5   187   90   39
  416826   5-10-5   212   61   12
  416838   5-10-5   216   98   56
  416850   5-10-5   295   157   143
  416858   5-10-5   273   185   56
  416864   5-10-5   216   86   112
  416999   2-13-5   232   51   0
  417002   2-13-5   206   36   1
  417003   2-13-5   353   74   4
  416925   3-14-3   280   72   8
  416892   3-14-3   195   54   6
表77
CD1小鼠肝脏中反义寡核苷酸的半衰期
Figure BPA00001481359801281
Figure BPA00001481359801291
实施例19：Sprague-Dawley大鼠中靶向作用于人因子的XI反义寡核苷酸的耐受性
用靶向作用于人因子XI的ISIS反义寡核苷酸治疗Sprague-Dawley大鼠，并评估多种代谢标记物水平的变化情况。
治疗
每4只Sprague Dawley大鼠一组，皮下注射50mg/kg ISIS 416825、ISIS 416826、ISIS 416838、ISIS 416850、ISIS 416858、ISIS 416848、ISIS 416864、ISIS 416892、ISIS416925、ISIS 416999、ISIS 417002或ISIS 417003，每周两次，连续6周。对照组的4只Sprague Dawley大鼠皮下注射PBS，连续6周，每周两次。在给药前和整个给药期间测量体重。在开始给药前收集尿样。末次给药后3天收集尿样并处死大鼠。测定器官重量，收集血液用于进一步分析。
体重和器官重量
在研究开始时以及此后每周两次测定大鼠的体重。体重见表78，表示为相对于研究开始时体重的变化百分率。研究结束时测定肝脏、脾脏和肾脏的重量，见表78，以相对于盐水对照的百分率表示，用体重进行归一化处理。选择与PBS对照相比未使肝脏和脾脏重量增加六倍以上的反义寡核苷酸进行进一步研究。
表78
用反义寡核苷酸治疗后Sprague Dawley大鼠的器官重量变化百分率
Figure BPA00001481359801292
Figure BPA00001481359801301
肝功能
为评估ISIS寡核苷酸对肝功能的影响，采用自动临床化学分析仪(HitachiOlympus AU400e，Melville，NY)对转氨酶的血浆浓度进行了检测。丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)的检测结果以IU/L表示，其结果见表79。选择与对照水平相比未使ALT/AST水平增加七倍以上的反义寡核苷酸进行进一步研究。采用相同的临床分析仪还对血浆中胆红素和白蛋白的水平进行了检测，结果同样见表79，以mg/dL表示。选择用反义寡核苷酸治疗后与对照水平相比未使胆红素水平增加两倍以上的反义寡核苷酸进行进一步研究。
表79
反义寡核苷酸治疗对Sprague-Dawley大鼠肝脏代谢标记物的影响
Figure BPA00001481359801302
肾功能
为评估对肾功能的影响，采用自动临床化学分析仪(Hitachi Olympus AU400e，Melville，NY)对血液尿素氮(BUN)和肌酸酐的血浆浓度进行了检测。结果见表80，以mg/dL表示。选择与PBS对照相比未使BUN水平增加两倍以上的反义寡核苷酸进行进一步研究。还计算了反义寡核苷酸治疗前后在总尿液样本中尿蛋白与肌酸酐的比率，结果见表81。选择与PBS对照相比未使尿蛋白/肌酸酐比率增加五倍以上的反义寡核苷酸进行进一步研究。
表80
反义寡核苷酸治疗对Sprague-Dawley大鼠肾脏代谢标记物的影响
  BUN   肌酸酐
  PBS   4   8
  ISIS 416825   7   17
  ISIS 416826   25   6
  ISIS 416838   4   5
  ISIS 416850   5   7
  ISIS 416858   8   4
  ISIS 416864   5   6
  ISIS 416925   7   5
  ISIS 416999   2   4
  ISIS 417002   11   1
  ISIS 416892   188   1
  ISIS 417003   9   9
表81
反义寡核苷酸治疗对Sprague-Dawley大鼠尿蛋白/肌酸酐比率的影响
  前   后
  PBS   1.2   1.3
  416825   1.1   5.4
  416826   1.0   11.4
  416838   1.2   3.7
  416850   1.0   4.0
  416858   0.9   4.4
  416864   1.2   4.0
  416925   1.0   4.3
  416999   1.3   9.1
  417002   1.0   2.4
  416892   0.8   21.3
  417003   0.9   4.8
血液学检测
将从各组大鼠中获得的血液运送至Antech Diagnostics进行红细胞压积(HCT)、平均红细胞容积(MCV)、平均红细胞血红蛋白(MCV)以及平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)的检测和分析，以及对多种血细胞进行检测，如WBC(中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞)、RBC和血小板，以及血红蛋白含量。结果见表82和83。选择未使血小板计数值的减少超过50％和/或单核细胞计数超过三倍的反义寡核苷酸进行进一步研究。
表82
反义寡核苷酸治疗对Sprague-Dawley大鼠血细胞计数的影响
Figure BPA00001481359801321
表83
反义寡核苷酸治疗对Sprague-Dawley大鼠血液学因子(％对照)的影响
Figure BPA00001481359801322
实施例20：反义寡核苷酸在Sprague-Dawley大鼠肝脏和肾脏中的半衰期测定
用靶向作用于人因子XI的ISIS反义寡核苷酸治疗Sprague Dawley大鼠，评估寡核苷酸的半衰期以及寡核苷酸的降解时间以及在肝脏和肾脏中的消除时间。
治疗
每4只Sprague Dawley大鼠一组，皮下注射20mg/kg ISIS 416825、ISIS416826、ISIS 416838、ISIS 416850、ISIS 416858、ISIS 416864、ISIS 416892、ISIS416925、ISIS 416999、ISIS 417002或ISIS 417003，每周两次，连续2周。末次治疗后3天，处死大鼠，收集肝脏和肾脏用于分析。
寡核苷酸浓度的测定
测定全长寡核苷酸以及总寡核苷酸(包括降解形式)的浓度。采用此前已公开方法(Leeds et al.，1996；Geary et al.，1999)的改良方法进行检测，其由先进行苯酚-氯仿(液-液)提取，再进行固相提取组成。在提取前先加入内标物(ISIS 355868，27-mer 2’-O-甲氧乙基修饰硫代磷酸寡核苷酸，GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT，本申请中命名为SEQ ID NO：270)。采用校准曲线计算组织样本浓度，其定量检测下限(LLOQ)约为1.14μg/g。结果见表84和85，以μg/g肝脏或肾脏组织表示。随后利用WinNonlin软件(PHARSIGHT)计算半衰期，见表86。
表84
Sprague-Dawley大鼠肝脏和肾脏中全长寡核苷酸的浓度(μg/g)
Figure BPA00001481359801331
表85
Sprague-Dawley大鼠肝脏和肾脏中总寡核苷酸的浓度(μg/g)
  ISIS No.   基序   肾脏   肝脏
  416825   5-10-5   845   278
  416826   5-10-5   775   214
  416838   5-10-5   623   207
  416850   5-10-5   352   346
  416858   5-10-5   818   308
  416864   5-10-5   516   209
  416999   2-13-5   524   329
  417002   2-13-5   490   183
  417003   2-13-5   504   248
  416925   3-14-3   642   267
  416892   3-14-3   608   316
表86
Sprague-Dawley大鼠肝脏和肾脏中ISIS寡核苷酸的半衰期(天)
  ISIS No.   基序   半衰期
  416825   5-10-5   16
  416826   5-10-5   13
  416838   5-10-5   13
  416850   5-10-5   18
  416858   5-10-5   26
  416864   5-10-5   13
  416999   2-13-5   9
  417002   2-13-5   11
  417003   2-13-5   10
  416925   3-14-3   12
  416892   3-14-3   12
实施例21：CD1小鼠中靶向作用于人因子XI的反义寡核苷酸的耐受性
用靶向作用于人因子XI的ISIS反义寡核苷酸治疗CD1小鼠，并评估多种代谢标记物水平的变化情况。
治疗
每5只CD1小鼠一组，皮下注射50mg/kg ISIS 412223、ISIS 412224、ISIS412225、ISIS 413481、ISIS 413482、ISIS 416848、ISIS 416849、ISIS 416850、ISIS416851、ISIS 416852、ISIS 416853、ISIS 416854、ISIS 416855、ISIS 416856、ISIS416857、ISIS 416858、ISIS 416859、ISIS 416860、ISIS 416861、ISIS 416862、ISIS416863、ISIS 416864、ISIS 416865、ISIS 416866或ISIS 416867，每周两次，连续6周。对照组的十只动物皮下注射PBS，连续六周。治疗前和整个治疗期间测定体重。末次治疗3天后，将小鼠处死，测定器官重量，收集血液进行进一步分析。
体重和器官重量
在研究开始时以及此后每周两次测定一次体重。小鼠的体重见表87，表示为相对于开始治疗前PBS对照体重的增量，以克计。研究结束时测定肝脏、脾脏和肾脏的重量，同样见表87，表示为相对于体重的百分率。选择与PBS对照相比未使肝脏和脾脏重量增加六倍以上的反义寡核苷酸进行进一步研究。
表87
反义寡核苷酸治疗后CD1小鼠体重和器官重量的变化量
Figure BPA00001481359801351
Figure BPA00001481359801361
肝功能
为评估ISIS寡核苷酸对肝功能的影响，采用自动临床化学分析仪(HitachiOlympus AU400e，Melville，NY)对转氨酶的血浆浓度进行了检测。丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)的检测结果以IU/L表示，其结果见表88。选择与对照水平相比未使ALT/AST水平增加七倍以上的反义寡核苷酸进行进一步研究。采用相同的临床化学分析仪还对血浆中胆红素、胆固醇和白蛋白的水平进行了检测，见表88，以mg/dL表示。选择反义寡核苷酸治疗后与对照水平相比未使胆红素水平增加两倍以上的反义寡核苷酸进行进一步研究。
表88
反义寡核苷酸治疗对CD1小鼠肝脏代谢标记物的影响
Figure BPA00001481359801362
Figure BPA00001481359801371
肾功能
为评估ISIS寡核苷酸对肾功能的影响，采用自动临床化学分析仪对血液尿素氮(BUN)的血浆浓度进行了检测，结果见表89，以mg/dL表示。选择与PBS对照相比未使BUN水平增加两倍以上的反义寡核苷酸进行进一步研究。
表89
反义寡核苷酸治疗对CD1小鼠肾脏BUN水平(mg/dL)的影响
  BUN
  PBS   22
  ISIS 416850   24
  ISIS 416858   23
  ISIS 416864   24
  ISIS 412223   28
  ISIS 412224   29
  ISIS 412225   23
  ISIS 413481   23
  ISIS 413482   27
  ISIS 416848   23
  ISIS 416849   23
  ISIS 416851   21
  ISIS 416852   21
  ISIS 416853   22
  ISIS 416854   27
  ISIS 416855   23
  ISIS 416856   21
  ISIS 416857   17
  ISIS 416859   18
  ISIS 416860   25
  ISIS 416861   23
  ISIS 416862   21
  ISIS 416863   22
  ISIS 416865   20
  ISIS 416866   22
  ISIS 416867   20
血液学检测
将从各组小鼠中获得的血液运送至Antech Diagnostics进行红细胞压积(HCT)检测，以及对多种血细胞进行检测，如WBC(中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞)、RBC和血小板，以及总血红蛋白含量分析。结果见表90和91。选择未使血小板计数值的减少超过50％和/或单核细胞计数超过三倍的反义寡核苷酸进行进一步研究。
表90
反义寡核苷酸治疗对CD1小鼠血液学因子的影响
Figure BPA00001481359801381
Figure BPA00001481359801391
表91
反义寡核苷酸治疗对CD1小鼠血细胞计数的影响
Figure BPA00001481359801392
Figure BPA00001481359801401
实施例22：反义寡核苷酸在CD1小鼠肝脏中的半衰期测定
对在CD1小鼠中已评估的15个反义寡核苷酸(实施例21)进行进一步评估。用ISIS反义寡核苷酸治疗CD1小鼠，评估寡核苷酸的半衰期以及寡核苷酸的降解时间和在肝脏中的消除时间。
治疗
每15只CD1小鼠一组，皮下注射50mg/kg ISIS 412223、ISIS 412225、ISIS413481、ISIS 413482、ISIS 416851、ISIS 416852、ISIS 416856、ISIS 416860、ISIS416861、ISIS 416863、ISIS 416866、ISIS 416867、ISIS 412224、ISIS 416848或ISIS416859，每周两次，连续2周。末次治疗后3天、28天和56天每组处死5只小鼠，收集肝脏用于分析。
寡核苷酸浓度的测定
测定全长寡核苷酸的浓度。采用此前已公开方法(Leeds et al.，1996；Geary et al.，1999)的改良方法进行检测，其由先进行苯酚-氯仿(液-液)提取，再进行固相提取组成。在提取前先加入内标物(ISIS 355868，27-mer 2’-O-甲氧乙基修饰硫代磷酸寡核苷酸，GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT，本申请中命名为SEQ ID NO：270)。采用校准曲线计算组织样本浓度，其定量检测下限(LLOQ)约为1.14μg/g。结果见表92，以μg/g肝脏组织表示。各寡核苷酸的半衰期同样见表92。
表92
CD1小鼠肝脏中全长寡核苷酸的浓度和半衰期
  ISISNo   基序   第3天   第28天   第56天   半衰期(天)
  412223   5-10-5   276   127   52   21.9
  412224   5-10-5   287   111   31   16.6
  412225   5-10-5   279   91   47   20.7
  413481   5-10-5   185   94   31   20.6
  413482   5-10-5   262   95   40   19.5
  416848   5-10-5   326   147   68   23.5
  416851   5-10-5   319   147   68   23.8
  416852   5-10-5   306   145   83   28.4
  416856   5-10-5   313   115   46   19.2
  416859   5-10-5   380   156   55   19.0
  416860   5-10-5   216   96   36   20.6
  416861   5-10-5   175   59   39   24.5
  416863   5-10-5   311   101   48   19.8
  416866   5-10-5   246   87   25   16.0
  416867   5-10-5   246   87   35   18.9
实施例23：Sprague-Dawley大鼠中靶向作用于人因子XI的反义寡核苷酸的耐受性
对在CD1小鼠中已评估的15个反义寡核苷酸(实施例21)进一步在Sprague-Dawley大鼠中评估多种代谢标记物水平的变化情况。
治疗
每4只Sprague Dawley大鼠一组，皮下注射50mg/kg ISIS 412223、ISIS412224、ISIS 412225、ISIS 413481、ISIS 413482、ISIS 416848、ISIS 416851、ISIS416852、ISIS 416856、ISIS 416859、ISIS 416860、ISIS 416861、ISIS 416863、ISIS416866或ISIS 416867，每周两次，连续6周。对照组的4只Sprague Dawley大鼠皮下注射PBS，连续6周，每周两次。在治疗前和整个治疗期间测量体重。末次治疗后3天收集尿样，随后处死大鼠，测定器官重量，收集血液用于进一步分析。
体重和器官重量
在研究开始时以及此后每周两次测定大鼠的体重。体重见表93，表示为相对于研究开始时体重的变化百分率。研究结束时测定肝脏、脾脏和肾脏的重量，同样见表93，表示为相对于体重的百分率。选择与PBS对照相比未使肝脏和脾脏重量增加六倍以上的反义寡核苷酸进行进一步研究。
表93
反义寡核苷酸治疗后Sprague Dawley大鼠体重和器官重量的变化量
Figure BPA00001481359801421
肝功能
为评估ISIS寡核苷酸对肝功能的影响，采用自动临床化学分析仪(HitachiOlympus AU400e，Melville，NY)对转氨酶的血浆浓度进行了检测。丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)的检测结果以IU/L表示，其结果见表94。选择与对照水平相比未使ALT/AST水平增加七倍以上的反义寡核苷酸进行进一步研究。采用相同的临床化学分析仪还对血浆中胆红素和白蛋白的水平进行了检测，结果同样见表94，以mg/dL表示。选择反义寡核苷酸治疗后与对照水平相比未使胆红素水平增加两倍以上的反义寡核苷酸进行进一步研究。
表94
反义寡核苷酸治疗对Sprague-Dawley大鼠肝脏代谢标记物的影响
Figure BPA00001481359801431
肾功能
为评估ISIS寡核苷酸对肾功能的影响，采用自动临床化学分析仪(HitachiOlympus AU400e，Melville，NY)对血液尿素氮(BUN)和肌酸酐的血浆浓度进行了检测。结果见表95，以mg/dL表示。选择与PBS对照相比未使BUN水平增加两倍以上的反义寡核苷酸进行进一步研究。还计算了反义寡核苷酸治疗后在总尿液样本中总尿蛋白以及尿蛋白与肌酸酐的比率，结果见表95。选择与PBS对照相比未使尿蛋白/肌酸酐比率增加五倍以上的反义寡核苷酸进行进一步研究。
表95
反义寡核苷酸治疗对Sprague-Dawley大鼠肾脏代谢标记物的影响
血液学检测
将从各组大鼠中获得的血液运送至Antech Diagnostics进行红细胞压积(HCT)检测，以及对多种血细胞进行检测，如WBC(中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞)、RBC和血小板，以及血红蛋白含量。结果见表96和97。选择未使血小板计数值的减少超过50％和/或单核细胞计数超过三倍的反义寡核苷酸进行进一步研究。
表96
反义寡核苷酸治疗对Sprague-Dawley大鼠血液学因子的影响
Figure BPA00001481359801442
Figure BPA00001481359801451
表97
反义寡核苷酸治疗对Sprague-Dawley大鼠血细胞计数的影响
Figure BPA00001481359801452
实施例24：反义寡核苷酸在Sprague-Dawley大鼠肝脏和肾脏中的半衰期测定
用靶向作用于人因子XI的ISIS反义寡核苷酸治疗Sprague Dawley大鼠，评估寡核苷酸的半衰期以及寡核苷酸的降解时间以及在肝脏和肾脏中的消除时间。
治疗
每4只Sprague Dawley大鼠一组，皮下注射20mg/kg ISIS 412223、ISIS412224、ISIS 412225、ISIS 413481、ISIS 413482、ISIS 416848、ISIS 416851、ISIS416852、ISIS 416856、ISIS 416859、ISIS 416860、ISIS 416861、ISIS 416863、ISIS416866或ISIS 416867，每周两次，连续2周。末次治疗后3天处死大鼠，收集肝脏和肾脏用于分析。
寡核苷酸浓度的测定
测定全长寡核苷酸以及总寡核苷酸(包括降解形式)的浓度。采用此前已公开方法(Leeds et al.，1996；Geary et al.，1999)的改良方法进行检测，其由先进行苯酚-氯仿(液-液)提取，再进行固相提取组成。在提取前先加入内标物(ISIS 355868，27-mer 2’-O-甲氧乙基修饰硫代磷酸寡核苷酸，GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT，本申请中命名为SEQ ID NO：270)。采用校准曲线计算组织样本浓度，其定量检测下限(LLOQ)约为1.14μg/g。结果见表98和99，以μg/g肝脏或肾脏组织表示。随后利用WinNonlin软件(PHARSIGHT)计算半衰期，见表100。
表98
Sprague-Dawley大鼠肝脏和肾脏中全长寡核苷酸的浓度(μg/g)
  ISISNo   基序   肾脏   肝脏
  412223   5-10-5   551   97
  412224   5-10-5   487   107
  412225   5-10-5   202   119
  413481   5-10-5   594   135
  413482   5-10-5   241   95
  416848   5-10-5   488   130
  416851   5-10-5   264   193
  416852   5-10-5   399   108
  416856   5-10-5   378   84
  416859   5-10-5   253   117
  416860   5-10-5   247   94
  416861   5-10-5   187   159
  416863   5-10-5   239   82
  416866   5-10-5   210   98
  416867   5-10-5   201   112
表99
Sprague-Dawley大鼠肝脏和肾脏中总寡核苷酸的浓度(μg/g)
  ISIS No   基序   肾脏   肝脏
  412223   5-10-5   395   86
  412224   5-10-5   292   78
  412225   5-10-5   189   117
  413481   5-10-5   366   96
  413482   5-10-5   217   91
  416848   5-10-5   414   115
  416851   5-10-5   204   178
  416852   5-10-5   304   87
  416856   5-10-5   313   80
  416859   5-10-5   209   112
  416860   5-10-5   151   76
  416861   5-10-5   165   144
  416863   5-10-5   203   79
  416866   5-10-5   145   85
  416867   5-10-5   157   98
表100
Sprague-Dawley大鼠肝脏和肾脏中ISIS寡核苷酸的半衰期(天)
  ISIS No   基序   半衰期
  412223   5-10-5   22
  412224   5-10-5   17
  412225   5-10-5   21
  413481   5-10-5   21
  413482   5-10-5   20
  416848   5-10-5   24
  416851   5-10-5   24
  416852   5-10-5   28
  416856   5-10-5   19
  416859   5-10-5   19
  416860   5-10-5   21
  416861   5-10-5   25
  416863   5-10-5   20
  416866   5-10-5   16
  416867   5-10-5   19
实施例25：CD1小鼠中靶向作用于人因子XI的反义寡核苷酸的耐受性
用靶向作用于人因子XI的带有6-8-6MOE和5-8-5MOE基序的ISIS寡核苷酸治疗CD1小鼠，评估多种代谢标记物水平的变化情况。
治疗
每5只CD1小鼠一组，皮下注射50mg/kg ISIS 416850，ISIS 445498、ISIS445503、ISIS 445504、ISIS 445505、ISIS 445509、ISIS 445513、ISIS 445522、ISIS445530、ISIS 445531或ISIS 445532，每周两次，连续6周。对照组的5只CD1小鼠连续6周每周两次皮下注射PBS。在治疗前和治疗后测量体重。末次治疗后3天处死小鼠，测定器官重量，收集血液用于进一步分析。
体重和器官重量
小鼠的体重见表101，表示为相对于开始治疗前PBS对照体重的增量，以克计。研究结束时测定肝脏、脾脏和肾脏的重量，同样见表101，表示为相对于体重的百分率。选择与PBS对照相比未使肝脏和脾脏重量增加六倍以上的反义寡核苷酸进行进一步研究。
表101
反义寡核苷酸治疗后CD1小鼠体重和器官重量的变化量
Figure BPA00001481359801481
肝功能
为评估ISIS寡核苷酸对肝功能的影响，采用自动临床化学分析仪(HitachiOlympus AU400e，Melville，NY)对转氨酶的血浆浓度进行了检测。丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)的检测结果以IU/L表示，其结果见表102。选择与对照水平相比未使ALT/AST水平增加七倍以上的反义寡核苷酸进行进一步研究。采用相同的临床化学分析仪还对血浆中胆红素和白蛋白的水平进行了检测，见表102，以mg/dL表示。选择反义寡核苷酸治疗后与对照水平相比未使胆红素水平增加两倍以上的反义寡核苷酸进行进一步研究。
表102
反义寡核苷酸对CD1小鼠肝脏代谢标记物的影响
Figure BPA00001481359801491
肾功能
为评估ISIS寡核苷酸对肾功能的影响，采用自动临床化学分析仪(HitachiOlympus AU400e，Melville，NY)对血液尿素氮(BUN)的血浆浓度进行了检测。结果见表103，以mg/dL表示。选择与PBS对照相比未使BUN水平增加两倍以上的反义寡核苷酸进行进一步研究。
表103
反义寡核苷酸对CD1小鼠肾脏BUN水平(mg/dL)的影响
  BUN
  PBS   29
  ISIS 416850   28
  ISIS 445498   28
  ISIS 445503   29
  ISIS 445504   29
  ISIS 445505   29
  ISIS 445509   29
  ISIS 445513   27
  ISIS 445522   28
  ISIS 445530   26
  ISIS 445531   27
  ISIS 445532   23
血液学检测
将从各组小鼠中获得的血液运送至Antech Diagnostics进行红细胞压积(HCT)检测，以及对多种血细胞进行检测，如WBC(中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞)、RBC和血小板，以及总血红蛋白含量。结果见表104和105。选择未使血小板计数值的减少超过50％和/或单核细胞计数超过三倍的反义寡核苷酸进行进一步研究。
表104
反义寡核苷酸治疗对CD1小鼠血液学因子的影响
Figure BPA00001481359801501
Figure BPA00001481359801511
表105
反义寡核苷酸治疗对CD1小鼠血细胞计数的影响
Figure BPA00001481359801512
实施例26：Sprague-Dawley大鼠中靶向作用于人因子XI的反义寡核苷酸的耐受性
对已在CD1小鼠中评估过的八个反义寡核苷酸(实施例25)在Sprague-Dawley大鼠中进一步评估多种代谢标记物水平的变化情况。
治疗
每4只Sprague Dawley大鼠一组，皮下注射50mg/kg ISIS 445498、ISIS445504、ISIS 445505、ISIS 445509、ISIS 445513、ISIS 445522、ISIS 445530或ISIS445531，每周两次，连续6周。对照组的Sprague Dawley大鼠连续6周每周两次皮下注射PBS。在治疗前和整个治疗期间测量体重。末次治疗后3天收集尿样，随后处死大鼠，测定器官重量，收集血液用于进一步分析。
体重和器官重量
在研究开始时以及此后每周两次测定大鼠的体重。体重见表106，表示为相对于开始治疗前PBS对照体重的增加百分率。研究结束时测定肝脏、脾脏和肾脏的重量，同样见表106，表示为相对于体重的百分率。选择与PBS对照相比未使肝脏和脾脏重量增加六倍以上的反义寡核苷酸进行进一步研究。
表106
反义寡核苷酸治疗后Sprague Dawley大鼠体重和器官重量的变化量(％)
  体重   肝脏   脾脏   肾脏
  ISIS 445498   -17   +26   +107   -10
  ISIS 445504   -15   +22   +116   +6
  ISIS 445505   -21   +12   +146   +2
  ISIS 445509   -17   +16   +252   +3
  ISIS 445513   -13   +25   +194   +15
  ISIS 445522   -13   +26   +184   +19
  ISIS 445530   -7   +24   +99   +4
  ISIS 445531   -10   +17   +89   +4
肝功能
为评估ISIS寡核苷酸对肝功能的影响，采用自动临床化学分析仪(HitachiOlympus AU400e，Melville，NY)对转氨酶的血浆浓度进行了检测。丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)的检测结果见表107，以IU/L表示。选择与对照水平相比未使ALT/AST水平增加七倍以上的反义寡核苷酸进行进一步研究。采用相同的临床化学分析仪还对血浆中胆红素和白蛋白的水平进行了检测，结果见表107，以mg/dL表示。选择反义寡核苷酸治疗后与对照水平相比未使胆红素水平增加两倍以上的反义寡核苷酸进行进一步研究。
表107
反义寡核苷酸治疗对Sprague-Dawley大鼠肝脏代谢标记物的影响
Figure BPA00001481359801521
  ISIS 445504   206   86   0.11   3.5
  ISIS 445505   356   243   0.15   3.6
  ISIS 445509   676   291   0.14   3.5
  ISIS 445513   214   91   0.15   3.5
  ISIS 445522   240   138   0.47   3.6
  ISIS 445530   116   56   0.11   3.7
  ISIS 445531   272   137   0.12   3.7
肾功能
为评估ISIS寡核苷酸对肾功能的影响，采用自动临床化学分析仪(HitachiOlympus AU400e，Melville，NY)对血液尿素氮(BUN)和肌酸酐的血浆浓度进行了检测。结果见表108，以mg/dL表示。选择与PBS对照相比未使BUN水平增加两倍以上的反义寡核苷酸进行进一步研究。还计算了反义寡核苷酸治疗后总尿液样本中的总尿蛋白以及尿蛋白与肌酸酐的比率，结果见表108。选择与PBS对照相比未使尿蛋白/肌酸酐比率增加五倍以上的反义寡核苷酸进行进一步研究。
表108
反义寡核苷酸治疗对Sprague-Dawley大鼠肾脏代谢标记物的影响
Figure BPA00001481359801531
血液学检测
将从各组大鼠中获得的血液运送至Antech Diagnostics进行红细胞压积(HCT)检测，以及对多种血细胞进行检测，如WBC(中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞)、RBC和血小板，以及血红蛋白含量。结果见表109和110。选择未使血小板计数值的减少超过50％和/或单核细胞计数超过三倍的反义寡核苷酸进行进一步研究。
表109
反义寡核苷酸治疗对Sprague-Dawley大鼠血液学因子的影响
Figure BPA00001481359801541
表110
反义寡核苷酸治疗对Sprague-Dawley大鼠血细胞计数的影响
Figure BPA00001481359801542
实施例27：CD1小鼠中靶向作用于人因子XI的反义寡核苷酸的耐受性
用靶向作用于人因子XI的带有4-8-4MOE、3-8-3MOE、2-10-2MOE、3-10-3MOE和4-10-4MOE基序的ISIS寡核苷酸治疗CD1小鼠，评估多种代谢标记物水平的变化情况。
治疗
每5只CD1小鼠一组，皮下注射50mg/kg ISIS 449707、ISIS 449708、ISIS449409、ISIS 449710或ISIS 449711，每周两次，连续6周。对照组的5只CD1小鼠连续6周每周两次皮下注射PBS。在治疗前和治疗后测量体重。末次治疗后3天处死小鼠，测定器官重量，收集血液用于进一步分析。
体重和器官重量
在研究结束时测定小鼠的体重，见表111，以克计。研究结束时还测定了肝脏、脾脏和肾脏的重量，同样见表111，表示为相对于体重的百分率。选择与PBS对照相比未使肝脏和脾脏重量增加六倍以上的反义寡核苷酸进行进一步研究。
表111
反义寡核苷酸治疗后CD1小鼠体重和器官重量的变化量
  体重(g)   肝脏(％)   脾脏(％)   肾脏(％)
  PBS   39   -   -   -
  ISIS 449707   42   +11   +63   -5
  ISIS 449708   40   +17   +66   0
  ISIS 449709   40   +15   +62   -14
  ISIS 449710   42   +6   +43   -7
  ISIS 449711   42   +18   +63   -12
肝功能
为评估ISIS寡核苷酸对肝功能的影响，采用自动临床化学分析仪(HitachiOlympus AU400e，Melville，NY)对转氨酶的血浆浓度进行了检测。丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)的检测结果见表112，以IU/L表示。选择与对照水平相比未使ALT/AST水平增加七倍以上的反义寡核苷酸进行进一步研究。采用相同的临床化学分析仪还对血浆中胆红素和白蛋白的水平进行了检测，见表112，以mg/dL表示。选择反义寡核苷酸后治疗与对照水平相比未使胆红素水平增加两倍以上的反义寡核苷酸进行进一步研究。
表112
反义寡核苷酸对CD1小鼠肝脏代谢标记物的影响
Figure BPA00001481359801551
Figure BPA00001481359801561
肾功能
为评估ISIS寡核苷酸对肾功能的影响，采用自动临床化学分析仪(HitachiOlympus AU400e，Melville，NY)对血液尿素氮(BUN)的血浆浓度进行了检测。结果见表113，以mg/dL表示。选择与PBS对照相比未使BUN水平增加两倍以上的反义寡核苷酸进行进一步研究。
表113
反义寡核苷酸对CD1小鼠肾脏代谢标记物(mg/dL)的影响
  BUN   肌酸酐
  PBS   28   0.3
  ISIS 449707   27   0.2
  ISIS 449708   28   0.2
  ISIS 449709   34   0.3
  ISIS 449710   29   0.2
  ISIS 449711   26   0.2
血液学检测
将从各组小鼠中获得的血液运送至Antech Diagnostics进行红细胞压积(HCT)检测，以及对多种血细胞进行检测，如WBC(中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞)、RBC和血小板，以及总血红蛋白含量。结果见表114和115。选择未使血小板计数值的减少量超过50％和/或单核细胞计数超过三倍的反义寡核苷酸进行进一步研究。
表114
反义寡核苷酸治疗对CD1小鼠血液学因子的影响
  RBC(/pL)   血红蛋白(g/dL)   红细胞压积(％)   WBC(/nL)
  PBS   9.8   14.6   54   6
  ISIS 449707   8.4   12.4   45   6
  ISIS 449708   9.2   13.2   48   7
  ISIS 449709   9.2   13.2   49   5
  ISIS 449710   9.1   13.5   48   7
  ISIS 449711   9.0   13.3   48   6
表115
反义寡核苷酸治疗对CD1小鼠血细胞计数的影响
Figure BPA00001481359801571
实施例28：Sprague-Dawley大鼠中靶向作用于人因子XI的反义寡核苷酸的耐受性
对已在CD1小鼠中评估过的五个反义寡核苷酸(实施例27)在Sprague-Dawley大鼠中进一步评估多种代谢标记物水平的变化情况。
治疗
每4只Sprague Dawley大鼠一组，皮下注射50mg/kg ISIS 449707，ISIS 449708，ISIS 449709，ISIS 449710，or ISIS 449711，每周两次，连续6周。对照组的四只SpragueDawley大鼠连续6周每周两次皮下注射PBS。在治疗前和整个治疗期间测量体重。末次治疗后3天收集尿样，随后处死大鼠，测定器官重量，收集血液用于进一步分析。
体重和器官重量
在研究开始时以及此后每周两次测定大鼠的体重。体重变化量见表116，表示为相对于开始治疗前PBS对照体重的增量，以克计。研究结束时测定肝脏、脾脏和肾脏的重量，同样见表116，表示为相对于体重的百分率。选择与PBS对照相比未使肝脏和脾脏重量增加六倍以上的反义寡核苷酸进行进一步研究。
表116
反义寡核苷酸治疗后Sprague Dawley大鼠体重和器官重量的变化量
Figure BPA00001481359801572
Figure BPA00001481359801581
肝功能
为评估ISIS寡核苷酸对肝功能的影响，采用自动临床化学分析仪(HitachiOlympus AU400e，Melville，NY)对转氨酶的血浆浓度进行了检测。丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)的检测结果见表117，以IU/L表示。选择与对照水平相比未使ALT/AST水平增加七倍以上的反义寡核苷酸进行进一步研究。还对血浆中胆红素和白蛋白的水平进行了检测，结果见表117，以mg/dL表示。选择反义寡核苷酸治疗后与对照水平相比未使胆红素水平增加两倍以上的反义寡核苷酸进行进一步研究。
表117
反义寡核苷酸治疗对Sprague-Dawley大鼠肝脏代谢标记物的影响
  ALT(IU/L)   AST(IU/L)   胆红素(mg/dL)   白蛋白(mg/dL)
  PBS   41   107   0.1   3.4
  ISIS 449707   61   199   0.2   3.1
  ISIS 449708   25   90   0.1   3.2
  ISIS 449709   63   126   0.2   3.1
  ISIS 449710   36   211   0.1   2.9
  ISIS 449711   32   163   0.1   2.9
肾功能
为评估ISIS寡核苷酸对肾功能的影响，采用自动临床化学分析仪(HitachiOlympus AU400e，Melville，NY)对BUN和肌酸酐的血浆浓度进行了检测。结果见表118，以mg/dL表示。选择与PBS对照相比未使BUN水平增加两倍以上的反义寡核苷酸进行进一步研究。还计算了反义寡核苷酸治疗后总尿液样本中的总尿蛋白以及尿蛋白与肌酸酐的比率，结果见表118。选择与PBS对照相比未使尿蛋白/肌酸酐比率增加五倍以上的反义寡核苷酸进行进一步研究。
表118
反义寡核苷酸治疗对Sprague-Dawley大鼠肾脏代谢标记物的影响
Figure BPA00001481359801591
血液学检测
将从各组大鼠中获得的血液运送至Antech Diagnostics进行红细胞压积(HCT)检测，以及对多种血细胞进行检测，如WBC(中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞)、RBC和血小板，以及血红蛋白含量。结果见表119和120。选择未使血小板计数值的减少超过50％和/或单核细胞计数超过三倍的反义寡核苷酸进行进一步研究。
表119
反义寡核苷酸治疗对Sprague-Dawley大鼠血液学因子的影响
Figure BPA00001481359801592
表120
反义寡核苷酸治疗对Sprague-Dawley大鼠血细胞计数的影响
实施例29：在短尾猴中靶向作用于人因子XI反义寡核苷酸的剂量依赖性药理学效果
在短尾猴中对几种反义寡核苷酸进行了检测，以确定寡核苷酸对因子XI活性、抗凝作用和出血时间、肝脏和肾脏分布以及耐受性的药理学作用。本研究使用的所有ISIS寡核苷酸均靶向作用于人因子XI mRNA，且还与恒河猴基因序列具有完全的交叉反应性(见表51)。预计恒河猴ISIS寡核苷酸与短尾猴基因序列也具有完全的交叉反应性。在进行本研究时，尚无法从美国国立生物技术信息中心(NCBI)的数据库中获得短尾猴的基因序列；因此，未对短尾猴基因序列的交叉反应性进行确证。
治疗
每组由两只雄猴和三只雌猴组成，以渐增剂量皮下注射ISIS 416838、ISIS416850、ISIS 416858、ISIS 416864或ISIS 417002。对猴给药反义寡核苷酸，第1周每周三次，每次5mg/kg；第2周和第3周每周两次，每次5mg/kg；第4周每周三次每次10mg/kg；第5周和第6周每周两次，每次10mg/kg；第7周每周三次，每次25mg/kg；以及第8周、第9周、第10周、第11周和第12周每周两次，每次25mg/kg。对照组由两只雄猴和三只雌猴组成，按照相同的治疗方案皮下注射PBS。附加实验组由两只雄猴和三只雌猴组成，按照长期低剂量方案皮下注射ISIS 416850。对猴给药反义寡核苷酸，第1周每周三次，每次5mg/kg；第2周和第3周每周两次，每次5mg/kg；第4周每周三次，每次10mg/kg；以及第5周至第12周每周两次，每次10mg/kg。每周测定一次体重。在开始治疗前14天和5天以及此后每周一次收集血样，以便对血浆中因子XI蛋白的活性进行分析，并对多种血液学因子进行检测。在第85天，将动物深度麻醉后放血处死，收集器官进行进一步分析。
RNA分析
在第85天时，从肝脏组织中提取RNA，用于对因子XI进行实时PCR分析，使用的引物探针组为LTS00301(正向引物序列ACACGCATTAAAAAGAGCAAAGC，本发明中命名为SEQ ID NO 271；反向引物序列CAGTGTCATGGTAAAATGAAGAATGG，本发明中命名为SEQ ID NO：272；以及探针序列TGCAGGCACAGCATCCCAGTGTTCTX，其中X是荧光团，本申请中命名为SEQ ID NO.273)。结果表示为，与PBS对照相比，因子XI的抑制百分率。如表121所示，与PBS对照相比，用ISIS寡核苷酸治疗后因子XI mRNA显著降低。
表121
与PBS对照相比短尾猴肝脏中因子XI mRNA的抑制情况
  ISIS编号   ％抑制
  416838   37
  416850   84
  416858   90
  416864   44
  417002   57
蛋白分析
通过三明治型ELISA检测(Affinity Biologicals Inc.)对不同日期收集的各组猴的血浆样本进行分析，采用亲和纯化的抗因子XI多克隆抗体作为捕获抗体，采用过氧化物酶缀合的抗因子XI多克隆抗体作为检测抗体。检测中将猴血浆按照1∶50的比例稀释。通过将过氧化物酶与其底物o-苯二胺共同孵育表示过氧化物酶的活性。采用酶标仪在490nm处对生成的颜色进行定量，其与样品中因子XI的浓度成正比。
结果见表122，表示为相对于PBS对照的降低百分率。用ISIS 416850和ISIS416858治疗后，蛋白水平呈现出时间依赖性降低。
表122
与PBS对照相比短尾猴肝脏中因子XI蛋白的抑制情况
Figure BPA00001481359801611
体重和器官重量
在整个治疗期间每周测定一次体重。各组的检测结果见表123，以克表示。结果表明用反义寡核苷酸治疗不会导致动物的健康出现任何不良改变，不良改变可能使重量与PBS对照相比发生显著改变。将动物处死后测定器官重量，收集肝脏、肾脏和脾脏并称重。结果见表124，其也显示与PBS对照相比重量未发生显著改变，但ISIS 416858除外，其脾脏重量增加。以长期治疗方案给药的ISIS寡核苷酸ISIS 416850用星号(*)与其他寡核苷酸相区分。
表123
短尾猴体重的每周检测结果(g)
Figure BPA00001481359801622
n.d.＝无数据
表124
反义寡核苷酸治疗后短尾猴的器官重量(g)
  肝脏   脾脏   肾脏
  PBS   46   4   11
  ISIS 416838   63   5   12
  ISIS 416580   64   4   16
  ISIS 416858   60   12   13
  ISIS 416864   53   5   14
  ISIS 417002   51   5   15
肝功能
为评估ISIS寡核苷酸对肝功能的影响，采用自动临床化学分析仪(HitachiOlympus AU400e，Melville，NY)对转氨酶的血浆浓度进行了检测。丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)的检测结果见表125和表126，以IU/L表示。选择与对照水平相比未使ALT/AST水平增加七倍以上的反义寡核苷酸进行进一步研究。还对血浆中胆红素的水平进行了检测，结果见表127，以mg/dL表示。选择反义寡核苷酸治疗后与对照水平相比未使胆红素水平增加两倍以上的反义寡核苷酸进行进一步研究。涉及长期治疗方案的ISIS寡核苷酸ISIS 416850用星号(*)与其他寡核苷酸相区分。
表125
反义寡核苷酸治疗对短尾猴肝脏中ALT(IU/L)的影响
Figure BPA00001481359801631
n.d.＝无数据
表126
反义寡核苷酸治疗对短尾猴肝脏中AST(IU/L)的影响
Figure BPA00001481359801632
n.d.＝无数据
表127
反义寡核苷酸治疗对短尾猴肝脏中胆红素(mg/dL)的影响
Figure BPA00001481359801641
n.d.＝无数据
肾功能
为评估ISIS寡核苷酸对肾功能的影响，收集尿样。计算反义寡核苷酸治疗后尿液样本中尿蛋白与肌酸酐的比率，结果见表128。选择与PBS对照相比未使尿蛋白/肌酸酐比率增加五倍以上的反义寡核苷酸进行进一步研究。
表128
反义寡核苷酸治疗对短尾猴尿蛋白与肌酸酐比率的影响
Figure BPA00001481359801642
寡核苷酸浓度的测定
测定全长寡核苷酸的浓度以及评估在肝脏和肾脏中寡核苷酸的降解时间和消除时间。采用此前已公开方法(Leeds et al.，1996；Geary et al.，1999)的改良方法进行检测，其由先进行苯酚-氯仿(液-液)提取，再进行固相提取组成。在提取前先加入内标物(ISIS355868，27-mer 2’-O-甲氧乙基修饰硫代磷酸寡核苷酸，GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT，本发明中命名为SEQ ID NO：270)。采用校准曲线计算组织样本浓度，其定量检测下限(LLOQ)约为1.14μg/g。随后利用WinNonlin软件(PHARSIGHT)计算半衰期。结果见表129和130，以μg/g肝脏或肾脏组织表示。
表129
短尾猴肝脏和肾脏中全长寡核苷酸的浓度(μg/g)
  ISIS编号   肾脏   肝脏
  416838   1339   1087
  416850   2845   1225
  416858   1772   1061
  416864   2093   1275
  417002   2162   1248
表130
短尾猴肝脏和肾脏中总寡核苷酸的浓度(μg/g)
  ISIS No.   肾脏   肝脏
  416838   1980   1544
  416850   3988   1558
  416858   2483   1504
  416864   3522   1967
  417002   3462   1757
血液学检测
将从各组猴中获得的血液运送至韩国毒理学研究所(KIT)进行HCT、MCV、MCH和MCHC分析，以及对多种血细胞进行检测，如WBC(中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、网状细胞)、RBC、血小板以及总血红蛋白含量。结果见表131-144。选择未使血小板计数值的减少超过50％和/或单核细胞计数超过三倍的反义寡核苷酸进行进一步研究。以长期治疗方案给药的ISIS寡核苷酸ISIS416850用星号(*)与其他寡核苷酸相区分。
表131
反义寡核苷酸对短尾猴WBC计数(x103/μL)的影响
Figure BPA00001481359801651
Figure BPA00001481359801661
n.d.＝无数据
表132
反义寡核苷酸对短尾猴RBC计数(x106/μL)的影响
Figure BPA00001481359801662
n.d.＝无数据
表133
反义寡核苷酸对短尾猴血红蛋白(g/dL)的影响
Figure BPA00001481359801663
Figure BPA00001481359801671
n.d.＝无数据
表134
反义寡核苷酸对短尾猴红细胞压积(％)的影响
Figure BPA00001481359801672
n.d.＝无数据
表135
反义寡核苷酸对短尾猴MCV(fL)的影响
Figure BPA00001481359801673
Figure BPA00001481359801681
n.d.＝无数据
表136
反义寡核苷酸对短尾猴MCH(pg)的影响
Figure BPA00001481359801682
n.d.＝无数据
表137
反义寡核苷酸对短尾猴MCHC(g/dL)的影响
Figure BPA00001481359801691
n.d.＝无数据
表138
反义寡核苷酸对短尾猴血小板计数(x 103/μL)的影响
Figure BPA00001481359801692
n.d.＝无数据
表139
反义寡核苷酸对短尾猴网状细胞(％)的影响
Figure BPA00001481359801693
Figure BPA00001481359801701
n.d.＝无数据
表140
反义寡核苷酸对短尾猴中性粒细胞(％)的影响
Figure BPA00001481359801702
n.d.＝无数据
表141
反义寡核苷酸对短尾猴淋巴细胞(％)的影响
Figure BPA00001481359801703
Figure BPA00001481359801711
n.d.＝无数据
表142
反义寡核苷酸对短尾猴嗜酸性粒细胞(％)的影响
Figure BPA00001481359801712
n.d.＝无数据
表143
反义寡核苷酸对短尾猴单核细胞(％)的影响
Figure BPA00001481359801713
Figure BPA00001481359801721
n.d.＝无数据
表144
反义寡核苷酸对短尾猴嗜碱性粒细胞(％)的影响
Figure BPA00001481359801722
n.d.＝无数据
细胞因子和趋化因子检测
收集用PBS、ISIS 416850和ISIS 416858以渐增剂量治疗方案治疗的猴的血样，运送至Pierce Biotechnology(Woburn，MA)进行趋化因子和细胞因子水平检测。采用其各自的灵长类动物抗体检测IL-1β、IL-6、IFN-γ和TNF-α水平，采用其各自的交叉反应性人抗体对IL-8、MIP-1α、MCP-1、MIP-1β和RANTES水平进行检测。在开始治疗前14天和第85天将猴处死时进行检测。结果见表145和146。
表145
第-14天时反义寡核苷酸治疗对短尾猴细胞因子/趋化因子水平(pg/mL)的影响
表146
第85天时反义寡核苷酸治疗对短尾猴细胞因子/趋化因子水平(pg/mL)的影响
Figure BPA00001481359801731
实施例30：在短尾猴中靶向作用于人因子XI的反义寡核苷酸的药理学作用
已从啮齿类耐受性研究中选择了若干反义寡核苷酸(实施例25-28)在短尾猴中进行检测，以确定其在短尾猴模型中的药理学作用、对因子XI活性的相对效果和耐受性。在将这些反义寡核苷酸与之前已描述的猴研究中(实施例29)选择的ISIS 416850和ISIS416858进行了比较。本研究使用的所有ISIS寡核苷酸均靶向作用于人因子XI mRNA，且还与恒河猴基因序列具有完全的交叉反应性(见表51和53)。预计恒河猴ISIS寡核苷酸与短尾猴基因序列也具有完全的交叉反应性。在进行本研究时，尚无法从美国国立生物技术信息中心(NCBI)的数据库中获得短尾猴的基因序列；因此，未对短尾猴基因序列的交叉反应性进行确证。
治疗
每组由两只雄猴和两只雌猴组成，皮下注射25mg/kg ISIS 416850、ISIS 449709、ISIS 445522、ISIS 449710、ISIS 449707、ISIS 449711、ISIS 449708、416858和ISIS445531。对猴给药反义寡核苷酸，第1周每周三次，每次25mg/kg，第2周至第8周每周两次，每次25mg/kg。对照组由两只雄猴和两只雌猴组成，按照相同的治疗方案皮下注射PBS。在开始治疗前14天和7天，以及整个治疗期间每周一次测定体重。在开始治疗前14天和5天以及此后治疗期间若干次收集血样，以便对多种血液学因子进行检测。在第55天，将动物深度麻醉后放血处死，收集器官进行进一步分析。
RNA分析
在第55天时，从肝脏组织中提取RNA，用于对因子XI进行实时PCR分析，使用的引物探针组为LTS00301。结果表示为，与PBS对照相比，因子XI抑制的百分率。如表147所示，与PBS对照相比，用ISIS 416850、ISIS 449709、ISIS 445522、ISIS449710、ISIS 449707、ISIS 449708、ISIS 416858和ISIS 445531治疗后因子XI mRNA显著降低。
表147
与PBS对照相比短尾猴肝脏中因子XI mRNA的抑制情况
Oligo ID   ％抑制
416850   68
449709   69
445522   89
449710   52
449707   47
449711   0
449708   46
416858   89
445531   66
蛋白分析
通过三明治型ELISA检测(Affinity Biologicals Inc.)对不同日期收集的各组猴的血浆样本进行分析，采用亲和纯化的抗因子XI多克隆抗体作为捕获抗体，采用过氧化物酶缀合的抗因子XI多克隆抗体作为检测抗体。检测中将猴血浆按照1∶50的比例稀释。通过将过氧化物酶与其底物o-苯二胺共同孵育表示过氧化物酶的活性。采用酶标仪在490nm处对生成的颜色进行定量，其与样品中因子XI的浓度成正比。
结果见表148，表示为与PBS对照相比降低的百分率。用ISIS 416850、ISIS449709、ISIS 445522和ISIS 416858治疗后，蛋白水平呈现出时间依赖性降低。
表148
与PBS对照相比短尾猴肝脏中因子XI蛋白的抑制情况
Figure BPA00001481359801741
Figure BPA00001481359801751
体重和器官重量
各组的检测结果见表149，以克表示。结果表明，用反义寡核苷酸治疗不会导致动物的健康出现任何不良改变，不良改变可能导致与PBS对照相比重量发生显著改变。在第55天将动物处死后测定器官重量，并收集肝脏、肾脏和脾脏。结果见表150，表示为相对于体重的百分率，结果也显示与PBS对照相比重量未发生显著改变，但ISIS 449711除外，其导致脾脏重量增加。
表149
短尾猴体重的每周测定结果(g)
Figure BPA00001481359801752
表150
反义寡核苷酸治疗后短尾猴的器官重量(g)
Figure BPA00001481359801753
Figure BPA00001481359801761
肝功能
为评估ISIS寡核苷酸对肝功能的影响，采用自动临床化学分析仪(HitachiOlympus AU400e，Melville，NY)对转氨酶的血浆浓度进行了检测。丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)的检测结果见表151和表152，以IU/L表示。还对血浆中胆红素的水平进行了检测，结果见表153，以mg/dL表示。如表151-153所示，反义寡核苷酸治疗后，各肝脏代谢标记物均未出现显著增加。
表151
反义寡核苷酸治疗对短尾猴肝脏中ALT(IU/L)的影响
Figure BPA00001481359801762
表152
反义寡核苷酸治疗对短尾猴肝脏中AST(IU/L)的影响
Figure BPA00001481359801763
Figure BPA00001481359801771
表153
反义寡核苷酸治疗对短尾猴肝脏中胆红素(mg/dL)的影响
Figure BPA00001481359801772
肾功能
为评估ISIS寡核苷酸对肾功能的影响收集了不同日期的尿样。采用自动临床化学分析仪(Hitachi Olympus AU400e，Melville，NY)对不同时间点的BUN水平进行了检测，结果见表154。计算第49天时反义寡核苷酸治疗后尿液样本中尿蛋白与肌酸酐的比率，结果见表155。如表154和155所示，反义寡核苷酸治疗后，各肾脏代谢标记物均未出现显著增加。
表154
反义寡核苷酸治疗对短尾猴BUN水平(mg/dL)的影响
Figure BPA00001481359801773
Figure BPA00001481359801781
表155
反义寡核苷酸治疗对短尾猴尿蛋白与肌酸酐比率的影响
血液学检测
将从各组猴中不同日期获得的血液运送至韩国毒理学研究所(KIT)进行HCT、MCV、MCH和MCHC检测，以及对多种血细胞进行检测，如WBC(中性粒细胞和单核细胞)、RBC和血小板以及总血红蛋白含量。结果见表156-165。
表156
反义寡核苷酸治疗对短尾猴HCT(％)的影响
Figure BPA00001481359801783
表157
反义寡核苷酸治疗对短尾猴血小板计数(x 100/μL)的影响
Figure BPA00001481359801791
表158
反义寡核苷酸治疗对短尾猴中性粒细胞(％)的影响
Figure BPA00001481359801792
表159
反义寡核苷酸治疗对短尾猴单核细胞(％)的影响
表160
反义寡核苷酸治疗对短尾猴血红蛋白含量(g/dL)的影响
  第-14天   第-5天   第17天   第31天   第45天   第55天
  PBS   12.3   12.5   12.9   12.7   12.4   12.1
  ISIS 416850   13.0   13.5   13.3   13.1   13.1   12.7
  ISIS 449709   12.8   12.8   13.2   13.1   12.6   12.5
  ISIS 445522   13.3   12.7   12.7   12.9   12.6   12.0
  ISIS 449710   13.0   13.2   13.4   13.1   13.0   12.7
  ISIS 449707   12.7   12.8   12.7   12.7   12.9   12.6
  ISIS 449711   12.7   12.7   12.5   11.8   11.5   11.3
  ISIS 449708   13.0   13.2   13.5   13.0   13.3   13.0
  ISIS 416858   12.8   13.0   13.0   12.8   12.3   12.0
  ISIS 445531   12.6   12.6   12.7   12.3   12.0   12.1
表161
反义寡核苷酸治疗对短尾猴WBC计数(x103/μL)的影响
  第-14天   第-5天   第17天   第31天   第45天   第55天
  PBS   10   10   11   12   11   12
  ISIS 416850   12   13   11   12   12   10
  ISIS 449709   11   10   11   11   11   10
  ISIS 445522   10   9   11   13   10   11
  ISIS 449710   11   11   12   12   11   15
  ISIS 449707   13   11   12   11   12   8
  ISIS 449711   13   12   10   9   9   7
  ISIS 449708   14   10   11   11   10   10
  ISIS 416858   10   11   10   9   8   9
  ISIS 445531   20   15   17   17   20   15
表162
反义寡核苷酸治疗对短尾猴RBC计数(x106/μL)的影响
Figure BPA00001481359801802
Figure BPA00001481359801811
表163
反义寡核苷酸治疗对短尾猴MCV(fL)的影响
Figure BPA00001481359801812
表164
反义寡核苷酸治疗对短尾猴MCH(pg)的影响
表165
反义寡核苷酸治疗对短尾猴MCHC(g/dL)的影响
Figure BPA00001481359801821
细胞因子和趋化因子检测
收集各组猴的血样运送至Pierce Biotechnology(Woburn，MA)进行趋化因子和细胞因子水平检测。采用其各自的灵长类动物抗体检测IL-1β、IL-6、IFN-γ和TNF-α水平，采用其各自的交叉反应性人抗体对IL-8、MIP-1α、MCP-1、MIP-1β和RANTES水平进行检测。在开始治疗前14天和第55天将猴处死时进行检测。结果见表166和167。
表166
第-14天时反义寡核苷酸治疗对短尾猴细胞因子/趋化因子水平(pg/mL)的影响
  IL-1β   IL-6   IFN-γ   TNF-α   IL-8   MIP-1α   MCP-1  MIP-1β   RANTES
  PBS   350   3   314   32   82   27   277  8   297
  ISIS 416850   215   1   115   4   45   14   434  31   4560
  ISIS 449409   137   1   37   9   34   13   290  14   2471
  ISIS 445522   188   5   172   16   32   22   297  27   3477
  ISIS 449710   271   7   1115   72   29   20   409  18   1215
  ISIS 449707   115   1   34   6   106   16   294  13   3014
  ISIS 449711   79   2   29   6   156   20   264  24   3687
  ISIS 449708   35   1   27   12   184   11   361  19   11666
  ISIS 416858   103   0   32   4   224   11   328  37   6521
  ISIS 445531   101   2   68   9   83   25   317  22   7825
表167
第55天时反义寡核苷酸治疗对短尾猴细胞因子/趋化因子水平(pg/mL)的影响
  IL-1β   IL-6   IFN-γ   TNF-α   IL-8  MIP-1α   MCP-1  MIP-1β   RANTES
  PBS   453   3   232   191   68  21   237  34   775
  ISIS 416850   106   1   19   16   620  17   887  50   27503
  ISIS 449409   181   0   25   8   254  17   507  47   8958
  ISIS 445522   341   2   83   18   100  22   592  63   16154
  ISIS 449710   286   2   176   26   348  27   474  53   22656
  ISIS 449707   97   1   24   16   48  12   264  49   1193
  ISIS 449711   146   7   22   31   110  17   469  91   3029
  ISIS 449708   131   0   18   17   85  23   409  128   4561
  ISIS 416858   28   1   9   15   167  11   512  47   5925
  ISIS 445531   155   1   15   16   293  12   339  84   5935
实施例31：靶向作用于人因子XI的ISIS反义寡核苷酸的粘度测定
检测靶向作用于人因子XI的反义寡核苷酸的粘度，旨在筛选出当浓度为165-185mg/mL时粘度高于40cP的反义寡核苷酸。
将ISIS寡核苷酸(32-35mg)称重加入玻璃药瓶中，加入120μL水，将药瓶加热至50℃使反义寡核苷酸溶解呈溶液。吸取部分事先预热的样品(75μL)加入微型粘度计(Cambridge)中。将微型粘度计的温度设定为25℃，测定样品的粘度。吸取另外一部分事先预热的样本(20μL)加入10mL水中，在85℃260nM条件下进行UV检测(CaryUV设备)。结果见表168。
表168
靶向作用于人因子XI的ISIS反义寡核苷酸的粘度和浓度
Figure BPA00001481359801831
Figure BPA00001481359801841
Figure IPA00001481359300011
Figure IPA00001481359300021
Figure IPA00001481359300031
Figure IPA00001481359300041
Figure IPA00001481359300051
Figure IPA00001481359300061
Figure IPA00001481359300081
Figure IPA00001481359300091
Figure IPA00001481359300101
Figure IPA00001481359300111
Figure IPA00001481359300131
Figure IPA00001481359300141
Figure IPA00001481359300151
Figure IPA00001481359300161
Figure IPA00001481359300181
Figure IPA00001481359300201
Figure IPA00001481359300211
Figure IPA00001481359300221
Figure IPA00001481359300231
Figure IPA00001481359300241
Figure IPA00001481359300251
Figure IPA00001481359300261
Figure IPA00001481359300271
Figure IPA00001481359300281
Figure IPA00001481359300291
Figure IPA00001481359300301
Figure IPA00001481359300311
Figure IPA00001481359300321
Figure IPA00001481359300331
Figure IPA00001481359300341
Figure IPA00001481359300351
Figure IPA00001481359300361
Figure IPA00001481359300371
Figure IPA00001481359300381
Figure IPA00001481359300391
Figure IPA00001481359300401
Figure IPA00001481359300411
Figure IPA00001481359300421
Figure IPA00001481359300431
Figure IPA00001481359300461
Figure IPA00001481359300481
Figure IPA00001481359300491

Claims (49)

1.一种通过对动物给药化合物来调节炎症反应的方法，其中所述化合物包括因子XI的调节剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述因子XI调节剂是靶向作用于因子XI的修饰寡核苷酸。
3.一种改善动物炎症疾病、异常或状况的方法，包括对动物给药靶向作用于因子XI的化合物，其中对动物给药的所述化合物改善所述动物的炎症疾病、异常或状况。
4.一种对处于炎症疾病、异常或状况风险中的动物进行治疗方法，包括对动物给药治疗有效量的靶向作用于因子XI的化合物，其中对动物给药的所述化合物治疗所述动物的炎症疾病、异常或状况。
5.一种在患有炎症疾病、异常或状况的动物中抑制因子XI表达的方法，包括对动物给药靶向作用于因子XI的化合物，其中对动物给药的所述化合物在患有炎症疾病、异常或状况的所述动物中抑制因子XI的表达。
6.一种降低动物患炎症疾病、异常或状况风险的方法，包括对动物给药靶向作用于因子XI的化合物，其中对动物给药的化合物降低所述动物患炎症疾病、异常或状况的风险。
7.根据权利要求1、3、4、5或6所述的方法，其中因子XI具有SEQ ID NO：1或SEQID NO：2所示的序列。
8.根据权利要求3、4、5或6所述的方法，其中靶向作用于因子XI的化合物是修饰的寡核苷酸。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述修饰的寡核苷酸具有包括至少8个连续核碱基的核碱基序列，所述核碱基序列选自SEQ ID NOs：15-269所示的核碱基序列。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述修饰寡核苷酸的核碱基序列与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：274的核碱基序列100％互补。
11.根据权利要求8所述的方法，其中所述修饰寡核苷酸由一个单链修饰寡核苷酸组成。
12.根据权利要求8所述的方法，其中所述修饰寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述修饰寡核苷酸由20个连接的核苷组成。
14.根据权利要求12所述的方法，其中至少一个核苷间连接为修饰的核苷间连接。
15.根据权利要求14所述的方法，其中各修饰核苷间连接为硫代磷酸酯核苷间连接。
16.根据权利要求12所述的方法，其中至少一个核苷包含修饰的糖。
17.根据权利要求16所述的方法，其中至少一个修饰的糖为双环糖。
18.根据权利要求16所述的方法，其中至少一个修饰的糖包含2’-O-甲氧乙基。
19.根据权利要求12所述的方法，其中至少一个核苷包含修饰的核碱基。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述修饰的核碱基为5-甲基胞嘧啶。
21.根据权利要求8所述的方法，其中所述修饰寡核苷酸包括：
(a)由连接的脱氧核苷组成的间隔区；
(b)由连接的核苷组成的5’侧翼区；
(c)由连接的核苷组成的3’侧翼区；
其中所述间隔区位于5’侧翼区和3’侧翼区之间且直接相邻，并且其中每个侧翼区的每个核苷均包含修饰的糖。
22.根据权利要求8所述的方法，其中所述修饰的寡核苷酸包括：
(a)由10个连接的脱氧核苷组成的间隔区；
(b)由5个连接的核苷组成的5’侧翼区；
(c)由5个连接的核苷组成的3’侧翼区；
其中所述间隔区位于5’侧翼区和3’侧翼区之间且直接相邻，其中每个侧翼区的每个核苷均包含2’-O-甲氧乙基糖；并且其中每个核苷间连接均为硫代磷酸酯连接。
23.根据权利要求8所述的方法，其中所述修饰的寡核苷酸包括：
(a)由14个连接的脱氧核苷组成的间隔区；
(b)由3个连接的核苷组成的5’侧翼区；
(c)由3个连接的核苷组成的3’侧翼区；
其中所述间隔区位于5’侧翼区和3’侧翼区之间且直接相邻，其中每个侧翼区的每个核苷均包含2’-O-甲氧乙基糖；并且其中每个核苷间连接均为硫代磷酸酯连接。
24.根据权利要求8所述的方法，其中所述修饰的寡核苷酸包括：
(a)由13个连接的脱氧核苷组成的间隔区；
(b)由2个连接的核苷组成的5’侧翼区；
(c)由5个连接的核苷组成的3’侧翼区；
其中所述间隔区位于5’侧翼区和3’侧翼区之间且直接相邻，其中每个侧翼区的每个核苷均包含2’-O-甲氧乙基糖；并且其中每个核苷间连接均为硫代磷酸酯连接。
25.一种对处于炎症疾病风险中的动物进行治疗的方法，包括对动物给药治疗有效量的包含修饰的寡核苷酸的化合物，所述修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成，其中所述修饰的寡核苷酸与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的因子XI的核酸互补，且其中对动物给药的化合物治疗处于炎症疾病风险中的所述动物。
26.一种对处于炎症疾病风险中的动物进行治疗的方法，包括对动物给药治疗有效量的包含修饰的寡核苷酸的化合物，所述修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成且具有的核碱基序列包括选自SEQ ID NOs：15至269所示的任意核碱基序列中的某个核碱基序列的至少8个连续核碱基，且其中对动物给药的化合物治疗处于炎症疾病风险中的所述动物。
27.一种对患有炎症疾病的动物进行治疗的方法，包括对动物给药治疗有效量的包含修饰的寡核苷酸的化合物，所述修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成，其中所述修饰的寡核苷酸与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的因子XI的核酸互补，且其中对动物给药的化合物治疗患有炎症疾病的所述动物。
28.一种对患有炎症疾病的动物进行治疗的方法，包括对动物给药治疗有效量的包含修饰的寡核苷酸的化合物，所述修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成且具有的核碱基序列包括选自SEQ ID NOs：15至269所示的任意核碱基序列中的某个核碱基序列的至少8个连续核碱基，且其中对动物给药的化合物治疗患有炎症疾病的所述动物。
29.根据权利要求1、3、4、5、6、25、26、27或28所述的方法，其中所述动物是人。
30.根据权利要求3、4、5、6、25、26、27或28所述的方法，其中所述炎症疾病是关节炎、结肠炎、糖尿病、败血症、过敏性炎症、哮喘、免疫增殖性疾病、抗磷脂综合征或移植相关异常。
31.根据权利要求3、4、5、6、25、26、27或28所述的方法，其中所述炎症疾病是自身免疫性疾病。
32.根据权利要求30所述的方法，其中所述关节炎选自类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、痛风性关节炎、痛风、慢性多关节炎、关节周炎、肩周炎、颈椎关节炎、腰骶关节炎、骨关节炎、牛皮癣关节炎、肠病性关节炎和强直性脊柱炎。
33.根据权利要求30所述的方法，其中所述结肠炎选自溃疡性结肠炎、炎性肠病(IBD)和克罗恩氏病。
34.根据权利要求3、4、5、6、25、26、27或28所述的方法，其中所述炎症疾病、异常或状况是Th1介导的。
35.根据权利要求34所述的方法，其中Th1介导的炎症疾病、异常或状况的标记物减少。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述Th1标记物为细胞因子IL-1、IL-6、INF-γ、TNF-α或KC中的任意一个。
37.根据权利要求3、4、5、6、25、26、27或28所述的方法，其中所述炎症疾病、异常或状况是Th2介导的。
38.根据权利要求37所述的方法，其中Th2介导的炎症疾病、异常或状况的标记物减少。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述Th2标记物为IL-4、IL-5、嗜酸性粒细胞浸润或粘液产生中的任意一个。
40.根据权利要求1、3、4、5、6、25、26、27或28所述的方法，其中所述化合物通过非胃肠道给药。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述非胃肠道给药为皮下给药或静脉给药中的任意一个。
42.根据权利要求1、3、4、5、6、25、26、27或28所述的方法，还包括另外一种药物。
43.根据权利要求42所述的方法，其中另外一种药物与所述化合物伴随或顺序给药。
44.根据权利要求1、3、4、5、6、25、26、27或28所述的方法，其中所述化合物是盐的形式。
45.根据权利要求1、3、4、5、6、25、26、27或28所述的方法，还包括药学上可接受的载体或稀释剂。
46.靶向作用于因子XI的化合物在治疗炎症疾病中的用途。
47.根据权利要求46所述的用途，其中所述化合物为修饰寡核苷酸。
48.根据权利要求46所述的用途，其中因子XI具有如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的序列。
49.根据权利要求47所示的用途，其中所述修饰的寡核苷酸具有的核碱基序列包括选自SEQ ID NOs：15-269所示的核碱基序列中的某一核碱基序列的至少8个连续核碱基。
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MX (1) MX2011010930A (zh)
NZ (1) NZ595891A (zh)
RU (1) RU2011146158A (zh)
WO (1) WO2010121074A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022028457A1 (zh) * 2020-08-04 2022-02-10 上海拓界生物医药科技有限公司 抑制凝血因子XI表达的siRNA、组合物及其医药用途

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SI2379084T1 (en) 2008-10-15 2018-04-30 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of factor expression 11
WO2012174154A1 (en) * 2011-06-13 2012-12-20 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of inflammatory responses by factor vii
AU2012327227A1 (en) * 2011-11-07 2013-05-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Administration of Factor XI antisense oligonucleotides
EP2992009B1 (en) 2013-05-01 2020-06-24 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modulating apolipoprotein (a) expression
CN110903337A (zh) 2014-05-01 2020-03-24 Ionis制药公司 用于调节生长激素受体表达的组合物和方法
WO2015179693A1 (en) 2014-05-22 2015-11-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated antisense compounds and their use
TW201802121A (zh) 2016-05-25 2018-01-16 諾華公司 抗因子XI/XIa抗體之逆轉結合劑及其用途
US11400161B2 (en) 2016-10-06 2022-08-02 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Method of conjugating oligomeric compounds
US11168147B2 (en) 2016-12-23 2021-11-09 Novartis Ag Factor XI antibodies and methods of use
WO2019105419A1 (zh) 2017-12-01 2019-06-06 苏州瑞博生物技术有限公司 一种核酸、含有该核酸的组合物与缀合物及制备方法和用途
CA3083968C (en) 2017-12-01 2024-04-23 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. Double-stranded oligonucleotide, composition and conjugate comprising double-stranded oligonucleotide, preparation method thereof and use thereof
US11633482B2 (en) 2017-12-29 2023-04-25 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. Conjugates and preparation and use thereof
EP3799604A4 (en) 2018-05-09 2022-09-07 Ionis Pharmaceuticals, Inc. COMPOUNDS AND METHODS FOR REDUCING FXI EXPRESSION
WO2020038377A1 (zh) 2018-08-21 2020-02-27 苏州瑞博生物技术有限公司 一种核酸、含有该核酸的药物组合物和缀合物及其用途
JP7376952B2 (ja) 2018-09-30 2023-11-09 スーチョウ リボ ライフ サイエンス カンパニー、リミテッド ｓｉＲＮＡ複合体及びその調製方法と使用
JP2022533722A (ja) * 2019-05-22 2022-07-25 スーチョウ リボ ライフ サイエンス カンパニー、リミテッド 核酸、薬物組成物及び複合体ならびに調製方法と使用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003013423A2 (en) * 2001-08-05 2003-02-20 Gvg, Inc. Antithrombotic agent

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5801154A (en) * 1993-10-18 1998-09-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of multidrug resistance-associated protein
US6639062B2 (en) * 1997-02-14 2003-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Aminooxy-modified nucleosidic compounds and oligomeric compounds prepared therefrom
US20070037165A1 (en) * 2000-09-08 2007-02-15 Applera Corporation Polymorphisms in known genes associated with human disease, methods of detection and uses thereof
US6440737B1 (en) * 2000-11-01 2002-08-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of cellular apoptosis susceptibility gene expression
US7384909B2 (en) * 2002-07-15 2008-06-10 Board Of Regents, The University Of Texas System Anti-viral treatment methods using phosphatidylethanolamine-binding peptides linked to anti-viral agents
KR101185050B1 (ko) * 2004-04-22 2012-10-04 레가도 바이오사이언스, 인코포레이티드 응고 인자의 개선된 모듈레이터
CA2648522A1 (en) * 2005-04-04 2006-10-12 Daiamed, Inc. Substituted azetidinones
CA2660052A1 (en) * 2006-08-04 2008-02-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for the modulation of jnk proteins
MX2009005527A (es) * 2006-11-27 2009-06-08 Isis Pharmaceuticals Inc Metodos para el tratamiento de hipercolesterolemia.
CA2701128A1 (en) * 2007-10-01 2009-04-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of fibroblast growth factor receptor 4 expression
PT3002298T (pt) * 2007-11-21 2019-11-20 Univ Oregon Health & Science Anticorpos monoclonais anti-fator xi e métodos de utilização dos mesmos
SI2379084T1 (en) * 2008-10-15 2018-04-30 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of factor expression 11

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003013423A2 (en) * 2001-08-05 2003-02-20 Gvg, Inc. Antithrombotic agent

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ERIK I. TUCKER等: "Survival Advantage of Coagulation Factor XI-Deficient Mice during Peritoneal Sepsis", 《J INFECT DIS.》 *
ERIK I. TUCKER等: "Survival Advantage of Coagulation Factor XI-Deficient Mice during Peritoneal Sepsis", 《J INFECT DIS》 *
HILLIER LW等: "Genbank：NT_016354.19", 《GENBANK》 *
LEVI M等: "Two-way interactions between inflammation and coagulation", 《 TRENDS CARDIOVASC MED.》 *
THE RIKEN GENOME EXPLORATION RESEARCH GROUP PHASE II TEAM等: "NM_028066", 《GENBANK》 *
WU,W.等: "Genbank：NM_000128.3", 《GENBANK》 *
无: "Genbank：XM_001165847.1", 《GENBANK》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022028457A1 (zh) * 2020-08-04 2022-02-10 上海拓界生物医药科技有限公司 抑制凝血因子XI表达的siRNA、组合物及其医药用途

Also Published As

Publication number Publication date
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US20120083522A1 (en) 2012-04-05
AU2010236286B2 (en) 2013-06-06

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