ES2747260T3 - Métodos para modular la expresión de transcrito antisentido C9ORF72 - Google Patents

Abstract

Un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste de 12 a 30 nucleósidos unidos, en donde el oligonucleótido modificado es al menos 90% complementario a un transcrito antisentido C9ORF72 que tiene la secuencia de nucleobases de la SEQ ID NO: 11, para uso en el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa, en donde el compuesto es capaz de reducir el porcentaje de células con focos antisentido C9ORF72 y/o reducir el número de focos antisentido C9ORF72 por célula en un animal que tiene focos.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos para modular la expresión de transcrito antisentido C9ORF72

Campo

[0001] Se proporcionan compuestos para uso en la inhibición de la expresión del transcrito antisentido C9ORF72 en un animal. Dichos compuestos son útiles para tratar, prevenir o mejorar las enfermedades neurodegenerativas, como la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), la demencia frontotemporal (FTD), el síndrome de degeneración cortical basal (CDB), el síndrome Parkinsoniano atípico y la degeneración olivoponterolar (OPCD).

Antecedentes

[0002] La esclerosis lateral amiotrófica (ELA) es una enfermedad neurodegenerativa mortal caracterizada clínicamente por una parálisis progresiva que conduce a la muerte por insuficiencia respiratoria, generalmente dentro de dos a tres años de la aparición de síntomas (Rowly y Shneider, N. Engl. J. Med, 2001, 344, 1688-1700). La ALS es la tercera enfermedad neurodegenerativa más común en el mundo occidental (Hirtz et al, Neurology, 2007, 68, 326-337), y actualmente no hay terapias efectivas. Aproximadamente el 10% de los casos son de naturaleza familiar, mientras que la mayoría de los pacientes diagnosticados con la enfermedad se clasifican como esporádicos, ya que parecen ocurrir al azar en toda la población (Chio et al, Neurology, 2008, 70, 533-537). Existe un creciente reconocimiento, basado en datos clínicos, genéticos y epidemiológicos, de que la ELA y la demencia frontotemporal (EFT) representan un continuo de enfermedad superpuesto, caracterizado patológicamente por la presencia de inclusiones positivas a TDP-43 en todo el sistema nervioso central (Lillo y Hodges, J. Clin. Neurosci, 2009, 16, 1131-1135; Neumann et al, Science, 2006, 314, 130-133).

[0003] Hasta la fecha, se han descubierto varios genes como causantes de la ALS familiar clásica, por ejemplo, SOD1, TARDBP, FUS, OPTN y VCP (Johnson et al, Neuron, 2010, 68, 857-864; Kwiatkowski et al, Science, 2009, 323, 1205­ 1208; Maruyama et al, Nature, 2010, 465, 223-226; Rosen et al, Nature, 1993, 362, 59-62; Sreedharan et al, Science, 2008, 319, 1668-1672; Vance et al, Brain, 2009, 129, 868-876). Recientemente, el análisis de ligamiento de parientes que involucran múltiples casos de ALS, FTD y ALS-FTD había sugerido que había un lugar importante para la enfermedad en el brazo corto del cromosoma 9 (Boxer y otros, J. Neurol. Neurosurg. Psiquiatría, 2011, 82, 196-203; Morita et al, Neurology, 2006, 66, 839-844; Pearson et al. J. Nerol, 2011, 258, 647-655; Vance et al, Brain, 2006, 129, 868-876). Se ha encontrado que esta mutación es la causa genética más común de ALS y FTD. Se postula que la mutación causante de ALS-FTD es un hexanucleótido grande (GGGGCC) que repite la expansión en el primer intrón del gen C9ORF72 (Renton et al, Neuron, 2011, 72, 257-268; DeJesus-Hernandez et al, Neuron, 2011, 72, 245-256). Un haplotipo fundador, que abarca el gen C9ORF72, está presente en la mayoría de los casos relacionados con esta región (Renton et al, Neuron, 2011, 72, 257-268). Este locus en el cromosoma 9p21 representa casi la mitad de la ELA familiar y casi la cuarta parte de todos los casos de ELA en una cohorte de 405 pacientes finlandeses (Laaksovirta et al, Lancet Neurol, 2010, 9, 978-985). Sha et al, Alzheimers Res. Ther, 2012, 4 (6): 46, analiza el tratamiento de la demencia frontotemporal (FTD, por sus siglas en inglés) y la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), y el vínculo entre una expansión de repetición de hexanucleótidos de C9ORF72 y su patología de la enfermedad.

[0004] Actualmente no hay terapias eficaces para tratar tales enfermedades neurodegenerativas. Por lo tanto, es un objeto proporcionar compuestos para el tratamiento de tales enfermedades neurodegenerativas.

Resumen

[0005] La invención proporciona un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consta de 12 a 30 nucleósidos unidos, en el que el oligonucleótido modificado es al menos el 90% complementario de un transcrito antisentido C9ORF72 que tiene la secuencia de nucleobase de la SEQ ID NO: 11, para uso en el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa, en la que el compuesto es capaz de reducir el porcentaje de células con focos antisentido C9ORF72 y/o reducir el número de focos antisentido C9ORF72 por célula en un animal identificado que tiene focos.

[0006] En ciertas realizaciones, el animal es un humano. En ciertas realizaciones, se reducen los productos de traducción RAN asociados al transcrito antisentido C9ORF72. En ciertas realizaciones, los productos de traducción de RAN asociados al transcrito antisentido C9ORF72 son poli-(prolina-alanina), poli-(prolina-arginina) y poli-(prolinaglicina). En ciertas realizaciones, el transcrito antisentido C9ORF72 contiene una expansión de repetición de hexanucleótido. En ciertas realizaciones, la repetición del hexanucleótido se transcribe en la dirección antisentido del gen C9ORF72. En ciertas realizaciones, la expansión de repetición del hexanucleótido está asociada con una enfermedad asociada con C9ORF72. En ciertas realizaciones, la expansión de repetición de hexanucleótidos está asociada con una enfermedad asociada a la expansión de repetición de hexanucleótidos C9ORF72. En ciertas realizaciones, la expansión de repetición de hexanucleótidos comprende al menos 24 repeticiones de GGCCCC, CCCCCC, GCCCCC y/o CGCCCC. En ciertas realizaciones, la expansión de repetición de hexanucleótidos está asociada con focos nucleares. En ciertas realizaciones, los productos de traducción de RAN asociados al transcrito antisentido C9ORF72 están asociados con focos nucleares. En ciertas realizaciones, los productos de traducción de RAN asociados al transcrito antisentido son poli-(prolina-alanina) y/o poli-(prolina-arginina). En ciertas realizaciones, los compuestos descritos en el presente documento son útiles para reducir los niveles de transcrito antisentido C9ORF72, el transcrito antisentido C9ORF72 asocian los productos de traducción RAN y los focos antisentido C9ORF72. Dicha reducción puede ocurrir de una manera dependiente del tiempo o de una manera dependiente de la dosis.

[0007] En ciertas realizaciones, la enfermedad neurodegenerativa es esclerosis lateral amiotrófica (ALS), demencia frontotemporal (FTD), síndrome de degeneración cortical de base (CBD), síndrome de Parkinsoniano atípico o degeneración olivopontocerelelar (OPCD).

[0008] Tales enfermedades y afecciones pueden tener uno o más factores de riesgo, causas o resultados en común. Ciertos factores de riesgo y las causas del desarrollo de una enfermedad neurodegenerativa, y, en particular, la ELA y la FTD, incluyen la predisposición genética y la edad avanzada.

[0009] En el presente documento también se describen métodos de tratamiento que incluyen la administración de un inhibidor específico de el transcrito antisentido C9ORF72 a un individuo que lo necesite. En ciertos de tales métodos, el inhibidor específico del transcrito antisentido C9ORF72 es un ácido nucleico. En ciertos de tales métodos, el ácido nucleico es un compuesto antisentido. En ciertos de tales métodos, el compuesto antisentido es un oligonucleótido antisentido. En ciertos de tales métodos, el oligonucleótido antisentido es complementario a un transcrito antisentido C9ORF72. En ciertos de tales métodos, el oligonucleótido antisentido es un oligonucleótido antisentido modificado.

Breve descripción de las Figuras

[0010] Fig. 1: Reducción de focos específicos de hebra por ASO.

Descripción detallada

[0011] Debe entenderse que tanto la descripción general anterior como la siguiente descripción detallada son solo ejemplares y explicativas y no son restrictivas de la invención, como se reivindica. Aquí, el uso del singular incluye el plural a menos que se indique específicamente lo contrario. Como se usa en este documento, el uso de "o" significa "y/o" a menos que se indique lo contrario. Además, como se usa en este documento, el uso de “y” significa "y/o" a menos que se indique lo contrario. Además, el uso del término "incluyendo" así como otras formas, tales como "incluye" e "incluido", no es limitante. Además, términos como "elemento" o "componente" abarcan tanto elementos como componentes que comprenden una unidad y elementos y componentes que comprenden más de una subunidad, a menos que se indique lo contrario.

[0012] Los encabezados de sección utilizados en el presente documento tienen únicamente fines organizativos y no deben interpretarse como limitantes de la materia descrita.

Definiciones

[0013] A menos que se proporcionen definiciones específicas, la nomenclatura utilizada en relación con, y los procedimientos y técnicas de química analítica, química orgánica sintética y química farmacéutica y farmacéutica descritas en el presente documento son aquellas bien conocidas y comúnmente utilizadas en la técnica. Se pueden usar técnicas estándar para la síntesis química y el análisis químico.

[0014] A menos que se indique lo contrario, los siguientes términos tienen los siguientes significados:

"2'-O-metoxietilo" (también 2'-MOE y 2 -OCH2CH2-OCH3 y MOE) se refiere a una modificación de O-metoxietilo de la posición 2' de un anillo de furanosa. Un azúcar modificado con 2'-O-metoxietilo es un azúcar modificado.

"Nucleósido 2'-MOE" (también nucleósido 2'-O-metoxietilo) significa un nucleósido que comprende un resto de azúcar modificado con MOE.

"Nucleósido sustituido en 2'" significa un nucleósido que comprende un sustituyente en la posición 2' del anillo de furanosa distinto de H u OH. En ciertas realizaciones, los nucleósidos sustituidos en 2' incluyen nucleósidos con modificaciones de azúcares bicíclicos.

"5-metilcitosina" significa una citosina modificada con un grupo metilo unido a la posición 5'. Una 5-metilcitosina es una nucleobase modificada.

"Acerca de" significa dentro del 67% de un valor. Por ejemplo, si se indica, "los compuestos afectaron al menos aproximadamente el 70% de inhibición del transcrito antisentido C9ORF72", se implica que los niveles del transcrito antisentido C9ORF72 están inhibidos dentro de un rango de 63% y 77%.

"Administrado concomitantemente" se refiere a la administración conjunta de dos agentes farmacéuticos de cualquier manera en que los efectos farmacológicos de ambos se manifiestan en el paciente al mismo tiempo. La administración concomitante no requiere que ambos agentes farmacéuticos se administren en una única composición farmacéutica, en la misma forma de dosificación o por la misma vía de administración. Los efectos de ambos agentes farmacéuticos no necesitan manifestarse al mismo tiempo. Los efectos solo deben superponerse durante un período de tiempo y no tienen que ser coextensivos. "Administrar" significa proporcionar un agente farmacéutico a un animal, e incluye, entre otros, la administración por parte de un profesional médico y la autoadministración.

La "mejora" se refiere a la disminución, desaceleración, detención o reversión de al menos un indicador de la gravedad de una afección o enfermedad. La gravedad de los indicadores puede determinarse mediante medidas subjetivas u objetivas, que son conocidas por los expertos en la técnica.

"Animal" se refiere a un animal humano o no humano, incluidos, entre otros, ratones, ratas, conejos, perros, gatos, cerdos y primates no humanos, incluidos, entre otros, monos y chimpancés.

"Anticuerpo" se refiere a una molécula caracterizada por reaccionar específicamente con un antígeno de alguna manera, donde el anticuerpo y el antígeno se definen cada uno en términos del otro. El anticuerpo puede referirse a una molécula de anticuerpo completa o cualquier fragmento o región del mismo, como la cadena pesada, la cadena ligera, la región Fab y la región Fc.

"Actividad antisentido" significa cualquier actividad detectable o medible atribuible a la hibridación de un compuesto antisentido a su ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, la actividad antisentido es una disminución en la cantidad o expresión de un ácido nucleico diana o producto proteico codificado por dicho ácido nucleico diana.

"Compuesto antisentido" significa un compuesto oligomérico que es capaz de experimentar hibridación con un ácido nucleico diana a través de enlaces de hidrógeno. Los ejemplos de compuestos antisentido incluyen compuestos monocatenarios y bicatenarios, tales como oligonucleótidos antisentido, ARNsi, ARNsh, ARN de cadena simple y compuestos basados en la ocupación.

"Inhibición antisentido" significa la reducción de los niveles de ácido nucleico diana en presencia de un compuesto antisentido complementario a un ácido nucleico diana en comparación con los niveles de ácido nucleico diana o en ausencia del compuesto antisentido.

Los "mecanismos antisentido" son todos aquellos mecanismos que involucran la hibridación de un compuesto con un ácido nucleico diana, en donde el resultado o el efecto de la hibridación es una degradación de la diana o la ocupación de la diana con el estancamiento concomitante de la maquinaria celular que involucra, por ejemplo, transcripción o empalme.

"Oligonucleótido antisentido" significa un oligonucleótido monocatenario que tiene una secuencia de nucleobases que permite la hibridación a un segmento correspondiente de un ácido nucleico diana.

"Complementariedad de base" se refiere a la capacidad para el apareamiento preciso de bases de nucleobases de un oligonucleótido antisentido con nucleobases correspondientes en un ácido nucleico diana (es decir, hibridación), y está mediada por Watson-Crick, Hoogsteen o unión de hidrógeno invertida de Hoogsteen entre nucleobases correspondientes.

"Azúcar bicíclico" significa un anillo de furanosa modificado por la unión de dos átomos. Un azúcar bicíclico es un azúcar modificado.

"Nucleósido bicíclico" (también BNA) significa un nucleósido que tiene un resto de azúcar que comprende un puente que conecta dos átomos de carbono del anillo de azúcar, formando así un sistema de anillo bicíclico. En ciertas realizaciones, el puente conecta el carbono 4' y el carbono 2' del anillo de azúcar.

"Transcrito antisentido C9ORF72" significa transcritos producidos a partir de la hebra no codificante (también hebra antisentido y filamento de plantilla) del gen C9ORF72. El transcrito antisentido C9ORF72 difiere del "transcrito de sentido C9ORF72" transcrito canónicamente, que se produce a partir de la cadena codificante (también cadena de sentido) del gen C9ORF72.

"Productos de traducción RAN asociados al transcrito antisentido C9ORF72" significa péptidos aberrantes o polímeros di-peptídicos traducidos a través de la traducción RAN (es decir, traducción asociada con repetición y no dependiente de ATG). En ciertas realizaciones, los productos de traducción RAN asociados al transcrito antisentido C9ORF72 son cualquiera de poli-(prolina-alanina), poli-(prolina-arginina) y poli-(prolina-glicina). "Inhibidor específico del transcrito antisentido C9ORF72" se refiere a cualquier agente capaz de inhibir específicamente la expresión del transcrito antisentido C9ORF72 y/o sus productos de expresión a nivel molecular. Por ejemplo, los inhibidores del transcrito antisentido específicos de C9ORF72 incluyen ácidos nucleicos (incluidos los compuestos antisentido), ARNsi, aptámeros, anticuerpos, péptidos, moléculas pequeñas y otros agentes capaces de inhibir la expresión del transcrito antisentido de C9ORF72 y/o sus productos de expresión, como C9ORF72. transcrito antisentido asociada a productos de traducción RAN. "Enfermedad asociada con C9ORF72" significa cualquier enfermedad asociada con cualquier ácido nucleico C9ORF72 o producto de expresión del mismo, independientemente de la cadena de ADN del cual se derive el ácido nucleico C9ORF72 o producto de expresión del mismo. Tales enfermedades pueden incluir una enfermedad neurodegenerativa. Tales enfermedades neurodegenerativas pueden incluir ALS y FTD.

"Focos C9ORF72" significa focos nucleares que comprenden una transcripción C9ORF72. Los focos C9ORF72 pueden comprender al menos una transcripción de sentido C9ORF72 (en este documento, "focos de sentido C9ORF72"). Los focos de detección C9ORF72 pueden comprender transcripciones de sentido C9ORF72 que comprenden cualquiera de las siguientes repeticiones de hexanucleótidos: GGGGCC, GGGGGG, GGGGGC y/o GGGGCG. Un foco C9ORF72 puede comprender al menos un transcrito antisentido C9ORF72 (en este documento, "focos antisentido C9ORF72"). En ciertas realizaciones, los focos antisentido C9ORF72 comprenden transcripciones antisentido C9ORF72 que comprenden cualquiera de las siguientes repeticiones de hexanucleótidos: GGCCCC, GCCCCC, y/o CGCCCC. Los focos C9ORF72 pueden comprender tanto transcripciones de sentido C9ORF72 como transcripciones antisentido C9ORF72.

"Enfermedad asociada a la expansión por repetición de hexanucleótidos C9ORF72" significa cualquier enfermedad asociada con un ácido nucleico C9ORF72 que contiene una expansión por repetición de hexanucleótidos. En ciertas realizaciones, la expansión de repetición de hexanucleótidos puede comprender cualquiera de las siguientes repeticiones de hexanucleótidos: GGGGCC, GGGGGG, Gg Gg GC, GGGGCG, GGCCCC, GCCCCC, y/o CGCCCC. En ciertas realizaciones, la repetición del hexanucleótido se repite al menos 24 veces. Tales enfermedades pueden incluir una enfermedad neurodegenerativa. Tales enfermedades neurodegenerativas pueden incluir ALS y FTD.

"Ácido nucleico C9ORF72" significa cualquier ácido nucleico derivado del locus C9ORF72, sin importar de qué cadena de ADN se derive el ácido nucleico C9ORF72. En ciertos casos de la divulgación, un ácido nucleico C9ORF72 incluye una secuencia de ADN que codifica C9ORF72, una secuencia de ARN transcrita de ADN que codifica C9ORF72 que incluye ADN genómico que comprende intrones y exones (es decir, pre-ARNm) y una secuencia de ARNm que codifica C9ORF72. "ARNm de C9ORF72" significa un ARNm que codifica una proteína C9ORF72. En ciertos casos de la divulgación, un ácido nucleico C9ORF72 incluye transcripciones producidas a partir de la cadena codificante del gen C9ORF72. Los transcritos de sentido C9ORF72 son ejemplos de ácidos nucleicos C9ORF72. En ciertos casos de la divulgación, un ácido nucleico C9ORF72 incluye transcripciones producidas a partir de la cadena no codificante del gen C9ORF72. Las transcripciones antisentido de C9ORF72 son ejemplos de ácidos nucleicos de C9ORF72.

"Variante de ARNm asociada patógena de C9ORF72" significa la variante de ARNm de C9ORF72 procesada a partir de una variante de pre-ARNm de C9ORF72 que contiene la repetición del hexanucleótido. Un pre-ARNm C9ORF72 contiene la repetición del hexanucleótido cuando la transcripción del pre-ARNm comienza en la región desde el sitio de inicio del exón 1A hasta el sitio de inicio del exón 1B, por ejemplo, los nucleótidos 1107 a 1520 de la secuencia genómica (SEQ ID NO: 2, el complemento del número de acceso de GENBANK NT_008413,18 truncado desde los nucleósidos 27535000 hasta 27565000). En ciertas realizaciones, el nivel de una variante de ARNm asociada patógena C9ORF72 se mide para determinar el nivel de un pre-ARNm C9ORF72 que contiene la repetición de hexanucleótidos en una muestra.

"Transcripción de C9ORF72" significa un ARN transcrito de C9ORF72. En ciertos casos de la divulgación, una transcripción de C9ORF72 es una transcripción de sentido de C9ORF72. En ciertos casos de la divulgación, una transcripción C9ORF72 es un transcrito antisentido C9ORF72.

"Estructura de la tapa" o "resto de tapa terminal" significa modificaciones químicas, que se han incorporado en cualquiera de los extremos de un compuesto antisentido.

"cEt" o "etilo restringido" significa un nucleósido bicíclico que tiene un resto de azúcar que comprende un puente que conecta el carbono 4' y el carbono 2', en donde el puente tiene la fórmula: 4'-CH(CH3)-O-2'. "Nucleósido de etilo restringido" (también cEt nucleósido) significa un nucleósido que comprende un resto de azúcar bicíclico que comprende un puente 4'-CH(CH3)-O-2'.

"Región químicamente distinta" se refiere a una región de un compuesto antisentido que de alguna manera es químicamente diferente a otra región del mismo compuesto antisentido. Por ejemplo, una región que tiene nucleósidos 2'-O-metoxietilo es químicamente distinta de una región que tiene nucleósidos sin modificaciones 2'-O-metoxietilo.

"Compuesto antisentido quimérico" significa un compuesto antisentido que tiene al menos dos regiones químicamente distintas, y cada posición tiene una pluralidad de subunidades.

"Administración conjunta" significa la administración de dos o más agentes farmacéuticos a un individuo. Los dos o más agentes farmacéuticos pueden estar en una única composición farmacéutica, o pueden estar en composiciones farmacéuticas separadas. Cada uno de los dos o más agentes farmacéuticos puede administrarse a través de la misma o diferentes vías de administración. La administración conjunta abarca la administración paralela o secuencial.

"Complementariedad" significa la capacidad de emparejamiento entre nucleobases de un primer ácido nucleico y un segundo ácido nucleico.

"Comprende", "que comprende" y "comprendiendo" se entenderá que implica la inclusión de un paso o elemento o grupo de pasos o elementos establecidos, pero no la exclusión de cualquier otro paso o elemento o grupo de pasos o elementos. "Nucleobases contiguas" significa nucleobases inmediatamente adyacentes entre sí.

"Diseñar" o "diseñado para" se refiere al proceso de diseño de un compuesto oligomérico que hibrida específicamente con una molécula de ácido nucleico seleccionada.

"Diluyente" significa un ingrediente en una composición que carece de actividad farmacológica, pero es farmacéuticamente necesario o deseable. Por ejemplo, en los medicamentos que se inyectan, el diluyente puede ser un líquido, por ejemplo, una solución salina.

"Dosis" significa una cantidad específica de un agente farmacéutico proporcionado en una sola administración, o en un período de tiempo específico. En ciertas realizaciones, una dosis se puede administrar en uno, dos o más bolos, tabletas o inyecciones. Por ejemplo, en ciertas realizaciones donde se desea la administración subcutánea, la dosis deseada requiere un volumen que no se puede acomodar fácilmente con una sola inyección, por lo tanto, se pueden usar dos o más inyecciones para lograr la dosis deseada. En ciertas realizaciones, el agente farmacéutico se administra por infusión durante un período de tiempo prolongado o de forma continua. Las dosis se pueden establecer como la cantidad de agente farmacéutico por hora, día, semana o mes.

"Cantidad efectiva" en el contexto de modular una actividad o de tratar o prevenir una afección significa la administración de esa cantidad de agente farmacéutico a un sujeto que necesita dicha modulación, tratamiento o profilaxis, ya sea en una dosis única o como parte de una serie, que es eficaz para la modulación de ese efecto, o para el tratamiento o la profilaxis o la mejora de esa condición. La cantidad efectiva puede variar entre individuos dependiendo de la salud y la condición física del individuo a tratar, el grupo taxonómico de los individuos a tratar, la formulación de la composición, la evaluación de la condición médica del individuo y otros factores relevantes.

"Eficacia" significa la capacidad de producir un efecto deseado.

"Expresión" incluye todas las funciones mediante las cuales la información codificada de un gen, independientemente de la cadena de ADN de la que se deriva la información codificada, se convierte en estructuras presentes y operativas en una célula. Tales estructuras incluyen, pero no están limitadas a los productos de transcripción y traducción, incluida la traducción RAN.

"Completamente complementario" o "100% complementario" significa que cada nucleobase de un primer ácido nucleico tiene una nucleobase complementaria en un segundo ácido nucleico. Un primer ácido nucleico puede ser un compuesto antisentido y un ácido nucleico diana puede ser un segundo ácido nucleico.

"Gapmer'' significa un compuesto antisentido quimérico en el que una región interna que tiene una pluralidad de nucleósidos que soportan la escisión de la RNasa H se coloca entre regiones externas que tienen uno o más nucleósidos, en donde los nucleósidos que comprenden la región interna son químicamente distintos de los nucleósidos o nucleósidos que comprenden las regiones externas. La región interna puede denominarse "brecha" y las regiones externas pueden denominarse "alas".

"Espacio reducido" significa un compuesto antisentido quimérico que tiene un segmento hueco de 9 o menos 2'-desoxirribonucleósidos contiguos posicionados entre e inmediatamente adyacentes a los segmentos del ala 5' y 3' que tienen de 1 a 6 nucleósidos.

"Amplitud de brecha" significa un compuesto antisentido quimérico que tiene un segmento de brecha de 12 o más 2'-desoxirobonucleósidos contiguos posicionados entre e inmediatamente adyacentes a los segmentos de ala 5' y 3' que tienen de 1 a 6 nucleósidos.

"Expansión de repetición de hexanucleótidos" se refiere a una serie de seis bases (p. ej, GGGGCC, GGGGGG, GGGGGC, GGGGCG, GGCCCC, CCCCCC, GCCCCC y/o CGCCCC), al menos dos veces. En ciertas realizaciones, la expansión de repetición del hexanucleótido puede estar localizada en el intrón 1 de un ácido nucleico C9ORF72. En ciertas realizaciones, la repetición del hexanucleótido puede transcribirse en la dirección antisentido del gen C9ORF72. En ciertas realizaciones, una expansión de repetición de hexanucleótidos patógena incluye al menos 24 repeticiones de GGGGCC, GGGGGG, GGGGGC, GGGGCG, GGCCCC, CCCCCC, GCCCC, y/o CGCCCC en un ácido nucleico C9ORF72 y se asocia con la enfermedad. En ciertas realizaciones, las repeticiones son consecutivas. En ciertas realizaciones, las repeticiones están interrumpidas por 1 o más nucleobases. En ciertas realizaciones, una expansión de repetición de hexanucleótido de tipo silvestre incluye 23 o menos repeticiones de GGGGCC, GGGGGG, GGGGGC, GGGGCG, GGCCCC, CCCCCC, GCCCCC, y/o CGCCCC en un ácido nucleico C9ORF72. En ciertas realizaciones, las repeticiones son consecutivas. En ciertas realizaciones, las repeticiones están interrumpidas por 1 o más nucleobases.

"Hibridación" significa el recocido de moléculas de ácido nucleico complementarias. Las moléculas de ácido nucleico complementarias incluyen, pero no se limitan a, un compuesto antisentido y un ácido nucleico diana. Las moléculas de ácido nucleico complementarias incluyen, pero no se limitan a, un oligonucleótido antisentido y una diana de ácido nucleico.

"Identificar a un animal que tiene una enfermedad asociada con C9ORF72" significa identificar a un animal que ha sido diagnosticado con una enfermedad asociada a C9ORF72 o predispuesto a desarrollar una enfermedad asociada a C9ORF72. Los individuos predispuestos a desarrollar una enfermedad asociada a C9ORF72 incluyen aquellos que tienen uno o más factores de riesgo para desarrollar una enfermedad asociada a C9ORF72, que incluyen antecedentes personales o familiares o predisposición genética de una o más enfermedades asociadas a C9ORF72. En ciertas realizaciones, la enfermedad asociada a C9ORF72 es una enfermedad asociada a la expansión por repetición de hexanucleótidos C9ORF72. Dicha identificación se puede lograr mediante cualquier método, incluida la evaluación de la historia médica de un individuo y las pruebas o evaluaciones clínicas estándar, como las pruebas genéticas.

"Inmediatamente adyacente" significa que no hay elementos intermedios entre los elementos inmediatamente adyacentes.

"Individual" significa un animal humano o no humano seleccionado para tratamiento o terapia.

"Inhibir la expresión de un transcrito antisentido C9ORF72" significa reducir el nivel o la expresión de un transcrito antisentido C9ORF72 y/o sus productos de expresión (p. ej, productos de traducción RAN). Los transcritos antisentido de C9ORF72 se inhiben en presencia de un compuesto antisentido que apunta a un transcrito antisentido de C9ORF72, que incluye un oligonucleótido antisentido que apunta a un transcrito antisentido de C9ORF72, en comparación con la expresión del transcrito antisentido C9ORF72 en ausencia de un compuesto antisentido C9ORF72, como un oligonucleótido antisentido.

"Inhibir la expresión o actividad" se refiere a una reducción o bloqueo de la expresión o actividad y no necesariamente indica una eliminación total de la expresión o actividad.

"Enlace internucleosídico" se refiere al enlace químico entre los nucleósidos.

"Nucleósidos enlazados" significa nucleósidos adyacentes unidos entre sí por un enlace internucleósido. "Ácido nucleico bloqueado" o "LNA" o "nucleósidos de LNA" significa monómeros de ácido nucleico que tienen un puente que conecta dos átomos de carbono entre la posición 4' y 2' de la unidad de azúcar del nucleósido, formando así un azúcar bicíclico. Los ejemplos de dicho azúcar bicíclico incluyen, pero no se limitan a, A) aL-metilenoxi (4'-CH2-O-2') LNA, (B) p-D-metilenoxi (4'-CH2-O-2') LNA, (C) Etilenoxi (4'-(CH2)2-O-2') LNA, (D) Aminooxi (4'-CH2-O-N(R)-2') LnA y (E) Oxiamino (4'-CH2-N(R)-O-2') l Na , como se muestra a continuación.

[0015] Como se usa en el presente documento, los compuestos de LNA incluyen, pero no se limitan a, compuestos que tienen al menos un puente entre las posiciones 4' y 2' del azúcar, en donde cada uno de los puentes comprende independientemente 1 o de 2 a 4 grupos enlazados seleccionados independientemente de -[C(Ri)(R2)]n-, -C(Ri) = C(R2)-, -C(Ri) = N-, -C(=NRi)-, -C(=O)-, -C(=S)-, -O-, -Si(Ri)2-, -S(=O)X- y -N(Ri)-; en donde: x es 0, 1 o 2; n es 1, 2, 3 o 4; cada Ri y R2 es, independientemente, H, un grupo protector, hidroxilo, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, arilo C5-C20, arilo C5-C20 sustituido, un radical heterociclo, un radical heterociclo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, radical alicíclico C5-C7, radical alicíclico C5-C7 sustituido, halógeno, OJi, NJ1J2, SJi, N3, COOJi, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, CN, sulfonilo (S(=O)2-Ji) o sulfoxilo (S(=O)-Ji); y cada Ji y J2 es, independientemente, H, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, arilo C5-C20, sustituido, arilo C5-C20, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, un radical heterociclo, un radical heterociclo sustituido, aminoalquilo C i-C i2, aminoalquilo C i-C i2 sustituido o un grupo protector.

[0016] Los ejemplos de grupos puente 4'-2' comprendidos en la definición de LNA incluyen, pero no se limitan a una de las fórmulas: -[C(Ri)(R2)]n-, -[C(Ri)(R2)]n-O-, -C(RiR2)-N(Ri)-O- o -C(RiR2)-O-N(Ri)-. Además, otros grupos puente incluidos en la definición de LnA son puentes 4'-CH2-2', 4 '-(c H2)2-2', 4'-(CH2)3-2', 4'-CH2-O-2', 4'-(CH2)2-O-2', 4'-CH2-O-N(Ri)-2' y 4'-CH2-N(Ri)-O-2'-, en donde cada Ri y R2 es, independientemente, H, un grupo protector o alquilo Ci-Ci2.

[0017] También se incluyen dentro de la definición de LNA según la invención los LNA en los que el grupo 2'-hidroxilo del anillo de azúcar de ribosilo está conectado al átomo de carbono 4' del anillo de azúcar, formando así un puente metilenoxi (4'-CH2-O-2') para formar el resto de azúcar bicíclico. El puente también puede ser un grupo metileno (-CH2-) que conecta el átomo de oxígeno 2' y el átomo de carbono 4', para el cual se utiliza el término LNA metileno (4'-CH2-O-2 '). Además; en el caso del resto de azúcar bicíclico que tiene un grupo puente de etileno en esta posición, se usa el término etilenoxi (4 -CH2CH2-O-2 ') LNA. a-L-metilenoxi (4'-CH2-O-2'), un isómero de metilenoxi (4'-CH2-O-2') LNA también se incluye dentro de la definición de LNA, como se usa en este documento.

"Desajuste" o "nucleobase no complementaria" se refiere al caso en el que una nucleobase de un primer ácido nucleico no es capaz de emparejarse con la nucleobase correspondiente de un segundo ácido nucleico o diana.

"Enlace internucleosídico modificado" se refiere a una sustitución o cualquier cambio de un enlace internucleosídico natural (es decir, un enlace internucleósido fosfodiéster).

"Nucleobase modificada" significa cualquier nucleobase que no sea adenina, citosina, guanina, timidina o uracilo. Una "nucleobase no modificada" significa las bases de purina adenina (A) y guanina (G), y las bases de pirimidina de timina (T), citosina (C) y uracilo (U).

"Nucleósido modificado" significa un nucleósido que tiene, independientemente, un resto de azúcar modificado y/o una nucleobase modificada.

"Nucleótido modificado" significa un nucleótido que tiene, independientemente, un resto de azúcar modificado, un enlace internucleósido modificado y/o una nucleobase modificada.

"Oligonucleótido modificado" significa un oligonucleótido que comprende al menos un enlace internucleósido modificado, azúcar modificado y/o nucleobase modificada.

"Azúcar modificado" significa la sustitución y/o cualquier cambio de un resto de azúcar natural.

"Monómero" significa una sola unidad de un oligómero. Los monómeros incluyen, pero no se limitan a, nucleósidos y nucleótidos, ya sean naturales o modificados.

"Motivo" significa el patrón de nucleósido no modificado y modificado en un compuesto antisentido.

"Razón de azúcar natural" significa un resto de azúcar que se encuentra en el ADN (2'-H) o ARN (2'-OH). "Enlace internucleosídico natural" significa un enlace fosfodiéster de 3' a 5'.

"Nucleobase no complementaria" se refiere a un par de nucleobases que no forman enlaces de hidrógeno entre sí o de otro modo apoyan la hibridación.

"Ácido nucleico" se refiere a moléculas compuestas de nucleótidos monoméricos. Un ácido nucleico incluye, pero no se limita a, ácidos ribonucleicos (ARN), ácidos desoxirribonucleicos (ADN), ácidos nucleicos monocatenarios, ácidos nucleicos bicatenarios, pequeños ácidos ribonucleicos interferentes (ARNsi) y microARN (miARN).

"Nucleobase" significa un resto heterocíclico capaz de emparejarse con una base de otro ácido nucleico.

"Complementariedad de nucleobase" se refiere a una nucleobase que es capaz de emparejar bases con otra nucleobase. Por ejemplo, en el ADN, la adenina (A) es complementaria a la timina (T). Por ejemplo, en el ARN, la adenina (A) es complementaria al uracilo (U). La nucleobase complementaria se refiere a una nucleobase de un compuesto antisentido que es capaz de emparejar bases con una nucleobase de su ácido nucleico diana. Por ejemplo, si una nucleobase en una cierta posición de un compuesto antisentido es capaz de formar enlaces de hidrógeno con una nucleobase en una cierta posición de un ácido nucleico diana, se considera que la posición de los enlaces de hidrógeno entre el oligonucleótido y el ácido nucleico diana es complementaria en ese par de nucleobases.

"Secuencia de nucleobase" significa el orden de las nucleobases contiguas independientemente de cualquier azúcar, enlace y/o modificación de nucleobase.

"Nucleósido" significa una nucleobase unida a un azúcar.

"Nucleósido mimético" incluye aquellas estructuras utilizadas para reemplazar el azúcar o el azúcar y la base y no necesariamente el enlace en una o más posiciones de un compuesto oligomérico, como por ejemplo los miméticos de nucleósidos que tienen morfolino, ciclohexenilo, ciclohexilo, tetrahidropiranilo, biciclo, o miméticos del azúcar triciclo, por ejemplo, unidades de azúcar no furtóreas. El mimético de nucleótidos incluye aquellas estructuras utilizadas para reemplazar el nucleósido y el enlace en una o más posiciones de un compuesto oligomérico como, por ejemplo, ácidos nucleicos peptídicos o morfolinos (morfolinos unidos por -N(H)-C(=O)-O- u otro enlace no fosfodiéster). El sustituto del azúcar se solapa con el término mimético de nucleósidos, un término un poco más amplio, pero está destinado a indicar el reemplazo de la unidad de azúcar (anillo de furanosa) solamente. Los anillos de tetrahidropiranilo proporcionados en este documento son ilustrativos de un ejemplo de un sustituto de azúcar en el que el grupo de azúcar de furanosa se ha reemplazado con un sistema de anillo de tetrahidropiranilo. "Mimético" se refiere a grupos que están sustituidos por un enlace de azúcar, nucleobase y/o internucleósido. En general, se utiliza un mimético en lugar de la combinación de enlaces azúcar-internucleósido, y la nucleobase se mantiene para la hibridación a una diana seleccionada. "Nucleótido" significa un nucleósido que tiene un grupo fosfato unido covalentemente a la porción de azúcar del nucleósido. "Efecto fuera de la diana" se refiere a un efecto biológico no deseado o perjudicial asociado con la modulación de la expresión de ARN o proteína de un gen distinto del ácido nucleico diana deseado.

"Compuesto oligomérico" u "oligómero" significa un polímero de subunidades monoméricas enlazadas que es capaz de hibridar con al menos una región de una molécula de ácido nucleico.

"Oligonucleótido" significa un polímero de nucleósidos enlazados, cada uno de los cuales puede ser modificado o no modificado, independientemente uno del otro.

"Administración parenteral" significa la administración a través de inyección (p. ej, inyección en bolo) o infusión. La administración parenteral incluye administración subcutánea, administración intravenosa, administración intramuscular, administración intraarterial, administración intraperitoneal o administración intracraneal, por ejemplo, administración intratecal o intracerebroventricular.

"Péptido" significa una molécula formada al unir al menos dos aminoácidos mediante enlaces amida. Sin limitación, como se usa en este documento, péptido se refiere a polipéptidos y proteínas.

"Agente farmacéutico" significa una sustancia que proporciona un beneficio terapéutico cuando se administra a un individuo. Un oligonucleótido antisentido dirigido al transcrito antisentido C9ORF72 es un agente farmacéutico. "Composición farmacéutica" significa una mezcla de sustancias adecuadas para administrar como sujeto. Por ejemplo, una composición farmacéutica puede comprender un oligonucleótido antisentido y una solución acuosa estéril. "Derivado farmacéuticamente aceptable" abarca sales, conjugados, profármacos o isómeros farmacéuticamente aceptables de los compuestos descritos en el presente documento.

"Sales farmacéuticamente aceptables" significa sales fisiológicamente y farmacéuticamente aceptables de compuestos antisentido, es decir, sales que retienen la actividad biológica deseada del oligonucleótido parental y no imparten efectos toxicológicos no deseados al mismo.

"Enlace de fosforotioato" significa un enlace entre nucleósidos donde el enlace fosfodiéster se modifica reemplazando uno de los átomos de oxígeno que no forman puentes con un átomo de azufre. Un enlace de fosforotioato es un enlace modificado entre nucleósidos.

"Porción" significa un número definido de nucleobases contiguas (es decir, unidas) de un ácido nucleico. En ciertas realizaciones, una porción es un número definido de nucleobases contiguas de un ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, una parte es un número definido de nucleobases contiguas de un compuesto antisentido.

"Prevenir" o "previniendo" se refiere a retrasar o prevenir la aparición o el desarrollo de una enfermedad, trastorno o afección durante un período de tiempo de minutos a días, de semanas a meses o de forma indefinida.

"Profármaco" significa un agente terapéutico que se prepara en una forma inactiva que se convierte en una forma activa dentro del cuerpo o las células del mismo por la acción de enzimas endógenas u otros químicos o condiciones.

"Cantidad profilácticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un agente farmacéutico que proporciona un beneficio profiláctico o preventivo a un animal.

"Región" se define como una porción del ácido nucleico diana que tiene al menos una estructura, función o característica identificable.

"Ribonucleótido" significa un nucleótido que tiene un hidroxi en la posición 2' de la porción de azúcar del nucleótido. Los ribonucleótidos pueden modificarse con cualquiera de una variedad de sustituyentes.

"Sales" significa sales fisiológicamente y farmacéuticamente aceptables de compuestos antisentido, es decir, sales que retienen la actividad biológica deseada del oligonucleótido parental y no imparten efectos toxicológicos no deseados al mismo. Los "segmentos" se definen como más pequeños o sub-porciones de regiones dentro de un ácido nucleico diana.

Las versiones "abreviadas" o "truncadas" de oligonucleótidos antisentido que se enseñan en este documento tienen uno, dos o más nucleósidos eliminados.

"Efectos secundarios" significa respuestas fisiológicas atribuibles a un tratamiento distinto de los efectos deseados. En ciertas realizaciones, los efectos secundarios incluyen, sin limitación, reacciones en el lugar de la inyección, anomalías en las pruebas de función hepática, anomalías de la función renal, toxicidad hepática, toxicidad renal, anomalías del sistema nervioso central y miopatías.

"Oligonucleótido monocatenario" significa un oligonucleótido que no está hibridado con una cadena complementaria.

"Sitios", como se usan en este documento, se definen como posiciones únicas de nucleobases dentro de un ácido nucleico diana.

"Retrasa la progresión" significa una disminución en el desarrollo de la enfermedad.

"Específicamente hibridable" se refiere a un compuesto antisentido que tiene un grado suficiente de complementariedad entre un oligonucleótido antisentido y un ácido nucleico diana para inducir un efecto deseado, mientras que exhibe efectos mínimos o nulos sobre los ácidos nucleicos no diana en condiciones en las que se desea una unión específica, es decir, bajo condiciones fisiológicas en el caso de ensayos in vivo y tratamientos terapéuticos.

"Condiciones de hibridación rigurosas" o "condiciones rigurosas" se refieren a las condiciones en las que un compuesto oligomérico se hibridará con su secuencia diana, pero con un número mínimo de otras secuencias. "Sujeto" significa un animal humano o no humano seleccionado para tratamiento o terapia.

"Apuntar" o "dirigirse" significa el proceso de diseño y selección de un compuesto antisentido que hibridará específicamente con un ácido nucleico diana e inducirá un efecto deseado.

"Ácido nucleico diana", "ARN diana" y "transcrito de ARN diana" y "diana de ácido nucleico" significan un ácido nucleico capaz de ser atacado por compuestos antisentido.

"Región diana" significa una porción de un ácido nucleico diana a la que se dirige uno o más compuestos antisentido.

"Segmento diana" significa la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico diana al que se dirige un compuesto antisentido.

"Sitio diana 5'" se refiere al nucleótido más 5' de un segmento diana.

"Sitio diana 3'" se refiere al nucleótido más 3' de un segmento diana.

"Cantidad terapéuticamente efectiva" significa una cantidad de un agente farmacéutico que proporciona un beneficio terapéutico a un individuo.

"Tratar" o "tratado" o "tratamiento" significa administrar una composición para efectuar una alteración o mejora de una enfermedad o afección.

"Nucleobases no modificadas" significa las bases de purina adenina (A) y guanina (G), y las bases de pirimidina (T), citosina (C) y uracilo (U).

"Nucleótido no modificado" significa un nucleótido compuesto de nucleobases naturales, restos de azúcar y enlaces internucleósidos. En ciertas realizaciones, un nucleótido no modificado es un nucleótido de ARN (es decir, p-D-ribonucleósidos) o un nucleótido de ADN (es decir, p-D-desoxirribonucleósido).

"Segmento de ala" significa una pluralidad de nucleósidos modificados para impartir a un oligonucleótido propiedades tales como actividad inhibitoria aumentada, afinidad de unión aumentada por un ácido nucleico diana, o resistencia a la degradación por nucleasas in vivo.

Ciertas Realizaciones

[0018] En el presente documento se describen métodos que comprenden poner en contacto una célula con un inhibidor específico del transcrito antisentido C9ORF72.

[0019] En el presente documento se describen métodos que comprenden poner en contacto una célula con un inhibidor específico del transcrito antisentido C9ORF72 y un inhibidor específico de la transcripción con sentido C9ORF72.

[0020] En el presente documento se describen métodos que comprenden poner en contacto una célula con un inhibidor específico del transcrito antisentido C9ORF72; y reduciendo así el nivel o la expresión del transcrito antisentido C9ORF72 en la célula.

[0021] En el presente documento se describen métodos que comprenden poner en contacto una célula con un inhibidor específico del transcrito antisentido C9ORF72 y un inhibidor específico de la transcripción con sentido C9ORF72; y, por lo tanto, reduciendo el nivel o la expresión del transcrito antisentido C9ORF72 y la transcripción del sentido C9ORF72 en la célula.

[0022] El inhibidor específico antisentido C9ORF72 de la divulgación puede ser un compuesto antisentido.

[0023] El inhibidor específico del transcrito antisentido C9ORF72 de la divulgación puede ser un compuesto antisentido.

[0024] En ciertos casos de la divulgación, en el que la célula está in vitro.

[0025] En ciertos casos de la divulgación, la célula está en un animal.

[0026] En el presente documento se describen métodos que comprenden administrar a un animal que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor específico del transcrito antisentido C9ORF72.

[0027] En ciertos casos de la divulgación, la cantidad es eficaz para reducir el nivel o la expresión del transcrito antisentido C9ORF72.

[0028] En el presente documento se describen métodos que comprenden la coadministración a un animal que lo necesite, una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor del transcrito antisentido C9ORF72 y una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de la transcripción con sentido C9ORF72.

[0029] En ciertos casos de la divulgación, la cantidad es eficaz para reducir el nivel o la expresión del transcrito antisentido C9ORF72 y la transcripción con sentido C9ORF72.

[0030] En el presente documento se describen métodos que comprenden:

identificar un animal que tiene una enfermedad asociada con C9ORF72; y

administrar al animal una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor específico del transcrito antisentido C9ORF72.

[0031] En el presente documento se describen métodos que comprenden:

identificar un animal que tiene una enfermedad asociada con C9ORF72; y

coadministrar al animal una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor específico del transcrito antisentido C9ORF72 y una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de la transcripción con sentido C9ORF72.

[0032] En ciertos casos de la divulgación, el compuesto antisentido específico del transcrito antisentido C9ORF72 es al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% complementario a un transcrito antisentido C9ORF72.

[0033] El transcrito antisentido de C9ORF72 es la SEQ ID NO: 11.

[0034] La transcripción de sentido C9ORF72 es cualquiera de las SEQ ID NO: 1-10.

[0035] En ciertas realizaciones, la enfermedad asociada a C9ORF72 es una enfermedad asociada a la expansión de repetición de hexanucleótido C9ORF72.

[0036] En ciertas realizaciones, la enfermedad asociada a la expansión por repetición del hexanucleótido C9ORF72 o hexanucleótido C9ORF72 es la esclerosis lateral amiotrófica (a Ls ), la demencia frontotemporal (FTD), el síndrome de degeneración cortical de la base (CDB), el síndrome atípico de Parkinson o el síndrome de olivopontocerelar (OP).

[0037] En ciertas realizaciones, la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) es un ELA familiar o un ELA esporádico.

[0038] La puesta en contacto o la administración de la invención reivindicada reduce los focos antisentido C9ORF72.

[0039] En ciertos casos de la divulgación, los focos C9ORF72 son a la vez focos de sentido C9ORF72 y focos de antisentido C9ORF72.

[0040] En ciertas realizaciones, el contacto o la administración reducen los productos de traducción de RAN asociados al transcrito antisentido C9ORF72.

[0041] En ciertas realizaciones, los productos de traducción de RAN asociados al transcrito antisentido C9ORF72 son cualquiera de poli-(prolina-alanina), poli-(prolina-arginina) y poli-(prolina-glicina).

[0042] En ciertas realizaciones, la administración y administración conjunta es la administración parenteral.

[0043] En ciertas realizaciones, la administración parental es cualquier inyección o infusión.

[0044] En ciertas realizaciones, la administración parenteral es cualquiera de la administración intratecal o administración intracerebroventricular

[0045] En ciertas realizaciones, el al menos un síntoma de una enfermedad asociada a C9ORF72 o una enfermedad asociada a la expansión de repetición de hexanucleótido C9ORF72 se ralentiza, mejora o previene.

[0046] En ciertas realizaciones, al menos un síntoma es cualquiera de la función motora, la respiración, la debilidad muscular, la fasciculación y los calambres musculares, la dificultad para proyectar la voz, la falta de aliento, la dificultad para respirar y tragar, el comportamiento social inapropiado, la falta de de empatía, distracción, cambios en las preferencias alimenticias, agitación, emociones embotadas, negligencia en la higiene personal, comportamiento repetitivo o compulsivo, y disminución de la energía y la motivación.

[0047] En ciertas realizaciones, al menos un enlace internucleósido del oligonucleótido antisentido es un enlace internucleósido modificado.

[0048] En ciertas realizaciones, al menos un enlace internucleósido modificado es un enlace internucleósido fosforotioato.

[0049] En ciertas realizaciones, cada enlace internucleósido modificado es un enlace internucleósido fosforotioato.

[0050] En ciertas realizaciones, al menos un nucleósido del oligonucleótido antisentido modificado comprende una nucleobase.

[0051] En ciertas realizaciones, la nucleobase modificada es una 5-metilcitosina.

[0052] En ciertas realizaciones, al menos un nucleósido del oligonucleótido antisentido modificado comprende un azúcar.

[0053] En ciertas realizaciones, el al menos un azúcar modificado es un azúcar bicíclico.

[0054] En ciertas realizaciones, el azúcar bicíclico comprende un puente químico entre las posiciones 2' y 4' del azúcar, en donde el puente químico se selecciona de: 4-CH2-O-2'; 4'-Ch (CH3)-O-2'; 4'-(CH2)2-O-2'; y 4'-CH2-N(R)-O-2' en donde R es, independientemente, H, alquilo C1-C12, o un grupo protector.

[0055] En ciertas realizaciones, el al menos un azúcar modificado comprende un grupo 2'-O-metoxietilo.

[0056] En ciertas realizaciones, el oligonucleótido antisentido es un gapmer.

Compuestos antisentido

[0057] Los compuestos oligoméricos incluyen, pero no se limitan a, oligonucleótidos, oligonucleósidos, análogos de oligonucleótidos, miméticos de oligonucleótidos, compuestos antisentido, oligonucleótidos antisentido y ARNsi. Un compuesto oligomérico puede ser "antisentido" para un ácido nucleico diana, lo que significa que es capaz de experimentar hibridación con un ácido nucleico diana a través de enlaces de hidrógeno.

[0058] En ciertos casos de la divulgación, un compuesto antisentido puede tener una secuencia de nucleobases que, cuando se escribe en la dirección 5' a 3', comprende el complemento inverso del segmento diana de un ácido nucleico diana al que se dirige. En ciertos casos de la divulgación, un oligonucleótido antisentido puede tener una secuencia de nucleobases que, cuando se escribe en la dirección 5' a 3', comprende el complemento inverso del segmento diana de un ácido nucleico diana al que se dirige.

[0059] En ciertos casos de la divulgación, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico C9ORF72 tiene una longitud de 12 a 30 subunidades. En otras palabras, tales compuestos antisentido son de 12 a 30 subunidades enlazadas. En ciertos casos de la divulgación, el compuesto antisentido es 8 a 80, 12 a 50, 15 a 30, 18 a 24, 19 a 22, o 20 subunidades enlazadas. En ciertos casos de la divulgación, los compuestos antisentido son 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, u 80 subunidades vinculadas en longitud, o un rango definido por cualquiera de los dos valores anteriores. En algunos casos de la divulgación, el compuesto antisentido es un oligonucleótido antisentido, y las subunidades enlazadas son nucleósidos.

[0060] En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos antisentido dirigidos a un ácido nucleico C9ORF72 pueden acortarse o truncarse. Por ejemplo, una sola subunidad puede eliminarse del extremo 5' (truncamiento 5'), o alternativamente del extremo 3' (truncamiento 3'). Un compuesto antisentido acortado o truncado dirigido a un ácido nucleico C9ORF72 puede tener dos subunidades eliminadas del extremo 5', o alternativamente puede tener dos subunidades eliminadas del extremo 3' del compuesto antisentido. Alternativamente, los nucleósidos eliminados pueden dispersarse por todo el compuesto antisentido, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tiene un nucleósido eliminado del extremo 5' y un nucleósido eliminado del extremo 3'.

[0061] Cuando una única subunidad adicional está presente en un compuesto antisentido alargado, la subunidad adicional puede estar ubicada en el extremo 5' o 3' del compuesto antisentido. Cuando dos o más subunidades adicionales están presentes, las subunidades agregadas pueden ser adyacentes entre sí, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tiene dos subunidades agregadas al extremo 5' (adición 5'), o alternativamente al extremo 3' (3 'adición), del compuesto antisentido. Alternativamente, las subunidades agregadas pueden dispersarse por todo el compuesto antisentido, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tiene una subunidad agregada al extremo 5' y una subunidad agregada al extremo 3'.

[0062] Es posible aumentar o disminuir la longitud de un compuesto antisentido, tal como un oligonucleótido antisentido, y/o introducir bases no coincidentes sin eliminar la actividad. Por ejemplo, en Woolf et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89: 7305-7309, 1992), una serie de oligonucleótidos antisentido de 13-25 nucleobases de longitud se probaron para determinar su capacidad para inducir la escisión de un ARN diana en un modelo de inyección de ovocitos. Los oligonucleótidos antisentido de 25 nucleobases de longitud con 8 u 11 bases no coincidentes cerca de los extremos de los oligonucleótidos antisentido fueron capaces de dirigir la escisión específica del ARNm diana, aunque en menor medida que los oligonucleótidos antisentido que no contenían desajustes. De manera similar, la división específica de la diana se logró utilizando 13 oligonucleótidos antisentido de nucleobases, incluidos aquellos con 1 o 3 desapareamientos.

[0063] Gautschi y otros (J. Natl. Cancer Inst. 93: 463-471, marzo de 2001) demostraron la capacidad de un oligonucleótido que tiene una complementariedad del 100% con el ARNm de bcl-2 y que tiene 3 desapareamientos con el ARNm de bcl-xL para reducir la expresión de bcl-2 y bcl-xL in vitro e in vivo. Además, este oligonucleótido demostró una potente actividad antitumoral in vivo.

[0064] Maher y Dolnick (Nuc. Acid. Res. 16: 3341-3358, 1988) probaron una serie de oligonucleótidos antisentido de nucleobase en tándem 14 y un oligonucleótido antisentido de 28 y 42 nucleobases compuesto por la secuencia de dos o tres del tándem. Oligonucleótidos antisentido, respectivamente, por su capacidad para detener la traducción de DHFR humana en un ensayo de reticulocitos de conejo. Cada uno de los tres oligonucleótidos antisentido de 14 nucleobases solos fue capaz de inhibir la traducción, aunque a un nivel más modesto que los oligonucleótidos antisentido de 28 o 42 nucleobases.

Motivos de compuestos antisentido

[0065] En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico C9ORF72 tienen subunidades modificadas químicamente dispuestas en patrones, o motivos, para conferir a los compuestos antisentido propiedades tales como actividad inhibitoria aumentada, afinidad de unión aumentada por un ácido nucleico diana, o resistencia a la degradación por nucleasas in vivo.

[0066] Los compuestos antisentido quiméricos típicamente contienen al menos una región modificada para conferir un aumento de resistencia desde la degradación de la nucleasa, el aumento de la captación celular, el aumento de la afinidad de unión para el ácido nucleico diana y/o el aumento de la actividad inhibidora. Una segunda región de un compuesto antisentido quimérico puede servir opcionalmente como un sustrato para la endonucleasa celular RNasa H, que corta la cadena de ARN de un dúplex de ARN:ADN.

[0067] Los compuestos antisentido que tienen un motivo gapmer se consideran compuestos antisentido quiméricos. En una brecha, una región interna que tiene una pluralidad de nucleótidos que soporta la escisión de la RNasaH se coloca entre regiones externas que tienen una pluralidad de nucleótidos que son químicamente distintos de los nucleósidos de la región interna. En el caso de un oligonucleótido antisentido que tiene un motivo gapmer, el segmento gapmer generalmente sirve como sustrato para la escisión de la endonucleasa, mientras que los segmentos del ala comprenden nucleósidos modificados. En ciertas realizaciones, las regiones de un gapmer se diferencian por los tipos de restos de azúcar que comprenden cada región distinta. Los tipos de restos de azúcar que se usan para diferenciar las regiones de un gapmer pueden en algunas realizaciones incluir p-D-ribonucleósidos, p-D-desoxirribonucleósidos, nucleósidos modificados en 2' (tales nucleósidos modificados en 2' pueden incluir 2'-MOE, y 2 -O-CH3, entre otros), y nucleósidos modificados con azúcar bicíclicos (tales nucleósidos modificados con azúcar bicíclicos pueden incluir aquellos que tienen un puente 4'-(CH2)n-O-2', donde n = 1 o n = 2 y 4 -CH2-O-CH2-2'). Preferiblemente, cada región distinta comprende restos de azúcar uniformes. El motivo ala-hueco-ala se describe con frecuencia como “X-Y-Z”, donde "X" representa la longitud de la región del ala 5', “Y” representa la longitud de la región de la brecha y "Z" representa la longitud de la región de ala 3'. Como se usa en este documento, un separador de brechas descrito como “X-Y-Z” tiene una configuración tal que el segmento de brecha se coloca inmediatamente adyacente a cada uno de los segmentos de ala 5' y el segmento de ala 3'. Por lo tanto, no existen nucleótidos intermedios entre el segmento de ala 5' y el segmento de separación, o el segmento de separación y el segmento de ala 3'. Cualquiera de los compuestos antisentido descritos en el presente documento puede tener un motivo gapmer. En algunas realizaciones, X y Z son iguales, en otras realizaciones son diferentes. En una realización preferida, Y está entre 8 y 15 nucleótidos. X, y/o Z pueden ser cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 o más nucleótidos. Por lo tanto, los separadores aquí descritos incluyen, entre otros, 5-10-5, 5-10-4, 4-10-4, 4-10-3, 3-10-3, 2-10-2, 5-9­ 5, 5-9-4, 4-9-5, 5-8-5, 5-8-4, 4-8-5, 5-7-5, 4-7-5, 5-7-4, o 4-7-4.

[0068] En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido tiene un motivo de "wingmer", que tiene una configuración de ala o brecha de ala, es decir, una configuración X-Y o Y-Z como se describió anteriormente para la configuración de brecha. Por lo tanto, las configuraciones de ala descritas aquí incluyen, pero no están limitadas a, por ejemplo, 5­ 10, 8-4, 4-12, 12-4, 3-14, 16-2, 18-1, 10-3, 2-10, 1-10, 8-2, 2-13, 5-13, 5-8 o 6-8.

[0069] En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico C9ORF72 tiene un motivo de brecha vacía. En ciertas realizaciones, un oligonucleótido antisentido con espacios reducidos dirigido a un ácido nucleico C9ORF72 tiene un segmento gapmer de 9, 8, 7 o 6 2'-desoxinucleótidos posicionados inmediatamente adyacentes y entre segmentos laterales de 5, 4, 3, 2, o 1 nucleósidos químicamente modificados. En ciertas realizaciones, la modificación química comprende un azúcar bicíclico. En ciertas realizaciones, el azúcar bicíclico comprende un puente de 4' a 2' seleccionado de entre: el puente 4'-(CH2)n-O-2', en donde n es 1 o 2; y 4 -CH2-O-CH2-2'. En ciertas realizaciones, el azúcar bicíclico comprende un puente 4'-CH(CH3)-O-2'. En ciertas realizaciones, la modificación química comprende un resto de azúcar modificado en 2' no bicíclico. En ciertas realizaciones, el resto de azúcar modificado en 2' no bicíclico comprende un grupo 2'-O-metiletilo o un grupo 2'-O-metilo.

Ácidos nucleicos diana, regiones diana y secuencias de nucleótidos

[0070] Las secuencias de nucleótidos que codifican C9ORF72 incluyen, sin limitación, lo siguiente: el complemento del Número de acceso de GENBANK NM_001256054,1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 1), Número de acceso de GENBANK NT_008413,18 truncado desde la base de datos 27535000 hasta 27565000 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 2), Número de acceso de GENBANK BQ068108,1 (incorporado aquí como SeQ ID No : 3), Número de acceso de g En BANK NM_018325,3 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 4), GENBANK Número de acceso DN993522,1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 5), Número de acceso GENBANK NM_145005,5 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 6), Número de acceso GENBANK DB079375,1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 7), Número de acceso de GENbA n K BU194591,1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 8), identificador de secuencia 4141_014_A (incorporado aquí como SEQ ID NO: 9) e identificador de secuencia 4008_73_A (incorporado aquí como SEQ ID NO: 10).

[0071] Las secuencias de nucleótidos que codifican el transcrito antisentido de C9ORF72 incluyen, sin limitación, las siguientes: SEQ ID NO: 11 es una secuencia que es complementaria a los nucleótidos 1159 a 1734 de la SEQ ID NO: 2 (el complemento de N° de acceso de GenBank NT_008413,18 truncado de los nucleótidos 27535000 a 27565000).

[0072] Se entiende que la secuencia expuesta en cada SEQ ID NO en los Ejemplos contenidos en este documento es independiente de cualquier modificación de un resto de azúcar, un enlace internucleósido o una nucleobase. Como tales, los compuestos antisentido definidos por una SEQ ID NO pueden comprender, independientemente, una o más modificaciones a un resto de azúcar, un enlace internucleósido o una nucleobase. Los compuestos antisentido descritos por el Número de Isis (N° de Isis) indican una combinación de secuencia de nucleobase y motivo.

[0073] En ciertas realizaciones, una región diana es una región estructuralmente definida del ácido nucleico diana. Por ejemplo, una región diana puede abarcar una UTR 3', una UTR 5', un exón, un intrón, una unión exón/intrón, una región codificante, una región de iniciación de la traducción, una región de terminación de la traducción u otra región de ácido nucleico definida. Las regiones definidas estructuralmente para C9ORF72 se pueden obtener mediante el número de acceso de las bases de datos de secuencias como NCBI. En ciertas realizaciones, una región diana puede abarcar la secuencia desde un sitio diana 5' de un segmento diana dentro de la región diana hasta un sitio diana 3' de otro segmento diana dentro de la misma región diana.

[0074] La selección incluye la determinación de al menos un segmento diana con el que se hibrida un compuesto antisentido, de manera que se produce un efecto deseado. En ciertas realizaciones, el efecto deseado es una reducción en los niveles de ácido nucleico diana de ARNm. En ciertas realizaciones, el efecto deseado es la reducción de los niveles de proteína codificada por el ácido nucleico diana o un cambio fenotípico asociado con el ácido nucleico diana.

[0075] Una región diana puede contener uno o más segmentos diana. Los múltiples segmentos diana dentro de una e pueden estar superpuestos. Alternativamente, pueden estar no superpuestos. En ciertas realizaciones, los segmentos diana dentro de una región diana están separados por no más de aproximadamente 300 nucleótidos. En ciertas realizaciones, los segmentos diana dentro de una región diana están separados por un número de nucleótidos que es, es aproximadamente, no es más que, no es más que aproximadamente, 250, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 o 10 nucleótidos en el ácido nucleico diana, o es un rango definido por cualquiera de los dos valores precedentes. En ciertas realizaciones, los segmentos diana dentro de una región diana están separados por no más de, o no más de aproximadamente, 5 nucleótidos en el ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, los segmentos diana son contiguos. Se contemplan las regiones diana definidas por un rango que tiene un ácido nucleico de partida que es cualquiera de los sitios diana 5' o sitios diana 3' enumerados en este documento.

[0076] Los segmentos diana adecuados se pueden encontrar dentro de una UTR 5', una región de codificación, una UTR 3', un intrón, un exón o una unión exón/intrón. Los segmentos diana que contienen un codón de inicio o un codón de parada también son segmentos diana adecuados. Un Segmento diana adecuado puede excluir específicamente una determinada región estructuralmente definida, como el codón de inicio o el codón de parada.

[0077] La determinación de segmentos diana adecuados puede incluir una comparación de la secuencia de un ácido nucleico diana con otras secuencias a lo largo del genoma. Por ejemplo, el algoritmo BLAST se puede usar para identificar regiones de similitud entre diferentes ácidos nucleicos. Esta comparación puede evitar la selección de secuencias de compuestos antisentido que pueden hibridar de una manera no específica a secuencias distintas de un ácido nucleico diana seleccionado (es decir, secuencias no diana o fuera de la diana).

[0078] Puede haber variación en la actividad (p. ej, como se define por el porcentaje de reducción de los niveles de ácido nucleico diana) de los compuestos antisentido dentro de una región diana. En ciertas realizaciones, las reducciones en los niveles de ARNm de C9ORF72 son indicativos de la inhibición de la expresión de C9ORF72. Las reducciones en los niveles de una proteína C9ORF72 también son indicativas de la inhibición de la expresión del ARNm diana. La reducción en la presencia de focos de ARN C9ORF72 expandido es indicativo de la inhibición de la expresión de C9ORF72. Además, los cambios fenotípicos son indicativos de la inhibición de la expresión de C9ORF72. Por ejemplo, la función motora y la respiración mejoradas pueden ser indicativas de inhibición de la expresión de C9ORF72.

Hibridación

[0079] La hibridación se produce entre un compuesto antisentido descrito en el presente documento y un ácido nucleico C9ORF72. El mecanismo más común de hibridación implica enlaces de hidrógeno (p. ej, Watson-Crick, Hoogsteen o enlaces de hidrógeno invertidos de Hoogsteen) entre nucleobases complementarias de las moléculas de ácido nucleico.

[0080] La hibridación puede ocurrir en condiciones variables. Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia y están determinadas por la naturaleza y la composición de las moléculas de ácido nucleico que se hibridan.

[0081] Los métodos para determinar si una secuencia es hibridable específicamente a un ácido nucleico diana son bien conocidos en la técnica. los compuestos antisentido proporcionados en el presente documento son hibridables específicamente con un ácido nucleico C9ORF72.

Complementariedad

[0082] Un compuesto antisentido y un ácido nucleico diana son complementarios entre sí cuando un número suficiente de nucleobases del compuesto antisentido pueden unirse mediante enlaces de hidrógeno con las nucleobases correspondientes del ácido nucleico diana, de modo que se producirá un efecto deseado (p. ej, inhibición antisentido de un ácido nucleico diana, como un ácido nucleico C9ORF72).

[0083] Se pueden tolerar las nucleobases no complementarias entre un compuesto antisentido y un ácido nucleico C9ORF72 siempre que el compuesto antisentido siga siendo capaz de hibridar específicamente con un ácido nucleico diana. Además, un compuesto antisentido puede hibridar sobre uno o más segmentos de un ácido nucleico C9ORF72, de manera que los segmentos intermedios o adyacentes no están involucrados en el evento de hibridación (p. ej, una estructura de bucle, falta de coincidencia o estructura de horquilla).

[0084] En el presente documento también se describen compuestos antisentido, o una porción específica de los mismos, que son, o que son al menos, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% complementarios a un ácido nucleico C9ORF72, una región diana, un segmento diana o una porción específica de los mismos. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con un ácido nucleico diana se puede determinar usando métodos de rutina.

[0085] Por ejemplo, un compuesto antisentido en el que 18 de 20 nucleobases del compuesto antisentido son complementarios de una región diana y, por lo tanto, hibridaría específicamente, representaría un 90 por ciento de complementariedad. En este ejemplo, las nucleobases no complementarias restantes pueden agruparse o intercalarse con nucleobases complementarias y no necesitan ser contiguas entre sí o con nucleobases complementarias. Como tal, un compuesto antisentido de 18 nucleobases de longitud que tiene 4 (cuatro) nucleobases no complementarias que están flanqueadas por dos regiones de completa complementariedad con el ácido nucleico diana tendría una complementariedad total del 77,8% con el ácido nucleico diana. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con una región de un ácido nucleico diana se puede determinar de forma rutinaria utilizando los programas BLAST (herramientas básicas de búsqueda de alineación local) y los programas PowerBLAST conocidos en la técnica (Altschul et al, J. Mol. Biol, 1990, 215, 403410; Zhang y Madden, Genome Res, 1997, 7, 649656). El porcentaje de homología, identidad de secuencia o complementariedad se puede determinar, por ejemplo, mediante el programa Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.), Usando la configuración predeterminada, que usa el algoritmo de Smith y Waterman (Adv. Appl. Math, 1981,2, 482489).

[0086] En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido proporcionados en el presente documento, o porciones específicas de los mismos, son completamente complementarios (es decir, 100% complementarios) a un ácido nucleico diana, o una porción específica de los mismos. Por ejemplo, un compuesto antisentido puede ser completamente complementario a un ácido nucleico C9ORF72, o una región diana, o un segmento diana o una secuencia diana del mismo. Como se usa en este documento, "totalmente complementario" significa que cada nucleobase de un compuesto antisentido es capaz de un emparejamiento preciso de bases con las nucleobases correspondientes de un ácido nucleico diana. Por ejemplo, un compuesto antisentido de 20 nucleobases es completamente complementario a una secuencia diana que tiene una longitud de 400 nucleobases, siempre que haya una porción correspondiente de 20 nucleobases del ácido nucleico diana que sea completamente complementaria al compuesto antisentido. Completamente complementario también se puede usar en referencia a una porción específica del primer y/o segundo ácido nucleico. Por ejemplo, una porción de 20 nucleobases de un compuesto antisentido de 30 nucleobases puede ser "completamente complementaria" a una secuencia diana que tiene una longitud de 400 nucleobases. La porción de 20 nucleobases del oligonucleótido de 30 nucleobases es completamente complementaria de la secuencia diana si la secuencia diana tiene una porción de 20 nucleobases correspondiente en la que cada nucleobase es complementaria de la porción de 20 nucleobases del compuesto antisentido. Al mismo tiempo, todo el compuesto antisentido de 30 nucleobases puede o no ser completamente complementario a la secuencia diana, dependiendo de si las 10 nucleobases restantes del compuesto antisentido también son complementarias de la secuencia diana.

[0087] La ubicación de una nucleobase no complementaria puede estar en el extremo 5' o en el extremo 3' del compuesto antisentido. Alternativamente, las nucleobases o nucleobases no complementarias pueden estar en una posición interna del compuesto antisentido. Cuando están presentes dos o más nucleobases no complementarias, pueden ser contiguas (es decir, unidas) o no contiguas. En una realización, una nucleobase no complementaria está localizada en el segmento del ala de un oligonucleótido antisentido gapmer.

[0088] En ciertos casos de la divulgación, los compuestos antisentido que tienen, o son hasta 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleobases de longitud comprenden no más de 4, no más de 3, no más de 2, o no más de 1 nucleobase(s) no complementaria(s) en relación con un ácido nucleico diana, como un ácido nucleico C9ORF72, o una porción específica del mismo.

[0089] En ciertos casos de la divulgación, compuestos antisentido que son, o son hasta 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30 nucleobases de longitud comprenden no más de 6, no más de 5, no más de 4, no más de 3, no más de 2, o no más de 1 nucleobase(s) complementaria(s) en relación con un ácido nucleico diana, tal como un ácido nucleico C9ORF72, o una porción específica del mismo.

[0090] Los compuestos antisentido descritos en el presente documento también incluyen aquellos que son complementarios a una porción de un ácido nucleico diana. Como se usa en este documento, "porción" se refiere a un número definido de nucleobases contiguas (es decir, unidas) dentro de una región o segmento de un ácido nucleico diana. Una "parte" también puede referirse a un número definido de nucleobases contiguas de un compuesto antisentido. En ciertos casos de la divulgación, los compuestos antisentido son complementarios a al menos una porción de 8 nucleobases de un segmento diana. En ciertos casos de la divulgación, los compuestos antisentido son complementarios a al menos una porción de 9 nucleobases de un segmento diana. En ciertos casos de la divulgación, los compuestos antisentido son complementarios a al menos una porción de 10 nucleobases de un segmento diana. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios a al menos una porción de 11 nucleobases de un segmento diana. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios a al menos una porción de 12 nucleobases de un segmento diana. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios a al menos una porción de 13 nucleobases de un segmento diana. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios a al menos una porción de 14 nucleobases de un segmento diana. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios a al menos una porción de 15 nucleobases de un segmento diana. También se contemplan los compuestos antisentido que son complementarios a al menos una 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, o más porciones de nucleobases de un segmento diana, o un rango definido por cualquiera de estos dos valores.

Identidad

[0091] Los compuestos antisentido descritos en el presente documento también pueden tener un porcentaje de identidad definido con una secuencia de nucleótidos particular, SEQ ID NO, o un compuesto representado por un número de Isis específico, o una porción del mismo. Como se usa en este documento, un compuesto antisentido es idéntico a la secuencia descrita en este documento si tiene la misma capacidad de emparejamiento de nucleobases. Por ejemplo, un ARN que contiene uracilo en lugar de timidina en una secuencia de ADN divulgada se consideraría idéntico a la secuencia de ADN ya que tanto el uracilo como la timidina se emparejan con la adenina. Versiones abreviadas y alargadas de los compuestos antisentido descritos aquí, así como compuestos que tienen bases no idénticas con respecto a los compuestos antisentido proporcionados en el presente documento también se contemplan. Las bases no idénticas pueden estar adyacentes entre sí o dispersas en todo el compuesto antisentido. El porcentaje de identidad de un compuesto antisentido se calcula de acuerdo con el número de bases que tienen un par de bases idéntico en relación con la secuencia con la que se está comparando.

[0092] En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido, o porciones de los mismos, son al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idénticos a uno o más de los compuestos antisentido o SEQ ID NO, o una porción de los mismos, descritos en este documento.

[0093] En ciertas realizaciones, una porción del compuesto antisentido se compara con una porción de igual longitud del ácido nucleico diana. Por ejemplo, una porción de 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 se compara con una porción de igual longitud del ácido nucleico diana.

[0094] En ciertas realizaciones, una porción del oligonucleótido antisentido se compara con una porción de igual longitud del ácido nucleico diana. Por ejemplo, una porción de 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 , 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 se compara con una porción de igual longitud del ácido nucleico diana.

Modificaciones

[0095] Un nucleósido es una combinación de azúcar de base. La porción de nucleobase (también conocida como base) del nucleósido es normalmente un resto de base heterocíclica. Los nucleótidos son nucleósidos que incluyen además un grupo fosfato unido covalentemente a la porción de azúcar del nucleósido. Para aquellos nucleósidos que incluyen un azúcar pentofuranosilo, el grupo fosfato se puede unir al resto hidroxilo 2 ', 3' o 5' del azúcar. Los oligonucleótidos se forman a través del enlace covalente de nucleósidos adyacentes entre sí, para formar un oligonucleótido polimérico lineal. Dentro de la estructura del oligonucleótido, se hace referencia comúnmente a los grupos fosfato como formadores de los enlaces internucleósidos del oligonucleótido.

[0096] Las modificaciones a los compuestos antisentido abarcan sustituciones o cambios en los enlaces internucleósidos, restos de azúcar o nucleobases. Los compuestos antisentido modificados son a menudo preferidos sobre las formas nativas debido a las propiedades deseables tales como, por ejemplo, captación celular mejorada, afinidad aumentada por la diana del ácido nucleico, estabilidad aumentada en presencia de nucleasas, o actividad inhibitoria incrementada.

[0097] Los nucleósidos modificados químicamente también pueden emplearse para aumentar la afinidad de unión de un oligonucleótido antisentido acortado o truncado para su ácido nucleico diana. En consecuencia, a menudo se pueden obtener resultados comparables con compuestos antisentido más cortos que tienen tales nucleósidos modificados químicamente.

Enlaces intemucleosídicos modificados

[0098] El enlace internucleosídico natural del ARN y el ADN es un enlace fosfodiéster de 3' a 5'. Los compuestos antisentido que tienen uno o más enlaces internucleosídicos modificados, es decir, no naturales, a menudo se seleccionan sobre los compuestos antisentido que tienen enlaces internucleósidos naturales, debido a propiedades deseables como, por ejemplo, captación celular mejorada, afinidad mejorada por los ácidos nucleicos diana y mayor estabilidad en presencia de nucleasas.

[0099] Los oligonucleótidos que tienen enlaces internucleósidos modificados incluyen enlaces internucleósidos que retienen un átomo de fósforo, así como enlaces internucleósidos que no tienen un átomo de fósforo. Los enlaces internucleosídicos que contienen fósforo representativos incluyen, pero no se limitan a, fosfodiésteres, fosfotriésteres, metilfosfonatos, fosforamidato y fosforotioatos. Los métodos de preparación de enlaces que contienen fósforo y que no contienen fósforo son bien conocidos.

[0100] En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico C9ORF72 comprenden uno o más enlaces internucleósidos modificados. En ciertas realizaciones, los enlaces internucleosídicos modificados se intercalan a lo largo del compuesto antisentido. En ciertas realizaciones, los enlaces internucleosídicos modificados son enlaces fosforotioato. En ciertas realizaciones, cada enlace internucleosídico de un compuesto antisentido es un enlace internucleósido fosforotioato. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico C9ORF72 comprenden al menos un enlace fosfodiéster y al menos un enlace fosforotioato.

Restos de azúcar modificados

[0101] Los compuestos antisentido pueden contener opcionalmente uno o más nucleósidos en los que se ha modificado el grupo azúcar. Dichos nucleósidos modificados con azúcar pueden impartir una mayor estabilidad de las nucleasas, una mayor afinidad de unión o alguna otra propiedad biológica beneficiosa a los compuestos antisentido. En ciertas realizaciones, los nucleósidos comprenden restos de anillos de ribofuranosa modificados químicamente.

Los ejemplos de anillos de ribofuranosa modificados químicamente incluyen, sin limitación, la adición de grupos sustituyentes (incluidos los grupos sustituyentes 5' y 2', la unión de los átomos del anillo no geminal para formar ácidos nucleicos bicíclicos (BNA), la sustitución del átomo de oxígeno del anillo ribosilo con S, N(R) o C(R-i)(R2) (R, R1 y R2 son cada uno independientemente H, alquilo C1-C12 o un grupo protector) y combinaciones de los mismos. Ejemplos de azúcares modificados químicamente incluyen 2'-F-5' nucleósido sustituido con metilo (ver solicitud internacional PCT WO 2008/101157 publicada el 21/8/08 para otros nucleósidos sustituidos en 5',2'-bis descritos o para reemplazar el átomo de oxígeno del anillo ribosilo con S con una sustitución adicional en la posición 2' (ver la solicitud de patente estadounidense US2005-0130923, publicada el 16 de junio de 2005) o como alternativa, la sustitución en 5' de un BNA (véase la Solicitud Internacional PCT WO 2007/134181 publicada el 22/11/07 en la que el LNA está sustituido con, por ejemplo, un grupo 5'-metilo o 5'-vinilo).

[0102] Los ejemplos de nucleósidos que tienen restos de azúcar modificados incluyen, sin limitación, nucleósidos que comprenden grupos sustituyentes 5'-vinilo, 5'-metilo (R o S), 4'-S, 2'-F, 2 -OCH3, 2 -OCH2CH3, 2 -OCH2CH2F y 2'-O(CH2)2OCH3. El sustituyente en la posición 2' también se puede seleccionar entre alilo, amino, azido, tio, O-alilo, O-C1-C10 alquilo, OCF3, OCH2F, O(CH2)2SCH3, O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn), y O-CH2-C(=O)-N(R1)-(CH2)2-N(Rm)(Rn)), donde cada R1, Rm y Rn es, independientemente, H o alquilo C1-C10 sustituido o no sustituido.

[0103] Como se usa en el presente documento, "nucleósidos bicíclicos" se refiere a nucleósidos modificados que comprenden un resto de azúcar bicíclico. Los ejemplos de nucleósidos bicíclicos incluyen, sin limitación, nucleósidos que comprenden un puente entre los átomos del anillo ribosilo 4' y 2'. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido proporcionados en el presente documento incluyen uno o más nucleósidos bicíclicos que comprenden un puente de 4' a 2'. Los ejemplos de dichos nucleósidos bicíclicos con puentes de 4' a 2' incluyen, entre otros, una de las fórmulas: 4'-(CH2)-O-2' (LNA); 4'-(CH2)-S-2'; 4'-(CH2)2-O-2' (ENA); 4'-CH(CH3)-O-2' y 4'-CH(CH2OCH3)-O-2' (y sus análogos se encuentran en la Patente de EE.UU. 7,399,845, expedida el 15 de julio de 2008); 4'-C(CH3) (CH3)-O-2' (y sus análogos se encuentran en la Solicitud Internacional publicada WO/2009/006478, publicada el 8 de enero de 2009); 4'-CH2-N(OCH3)-2' (y sus análogos se encuentran en la Solicitud Internacional publicada WO/2008/150729, publicada el 11 de diciembre de 2008); 4'-CH2-O-N(CH3)-2'(ver la solicitud de patente estadounidense publicada US2004-0171570, publicada el 2 de septiembre de 2004); 4'-CH2-N(R)-O-2', en donde R es H, alquilo C1-C12, o un grupo protector (ver Patente de EE.UU. 7,427,672, concedida el 23 de septiembre de 2008); 4'-CH2-C(H)(CH3)-2' (ver Chattopadhyaya et al, J. Org. Chem, 2009, 74, 118-134); y 4'-CH2-C-(=CH2)-2' (y sus análogos se encuentran en la Solicitud Internacional publicada WO 2008/154401, publicada el 8 de diciembre de 2008).

[0104] Otros informes relacionados con nucleósidos bicíclicos también se pueden encontrar en la literatura publicada (ver por ejemplo: Singh et al, Chem. Commun, 1998, 4, 455-456; Koshkin et al, Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Wahlestedt y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 2000, 97, 5633-5638; Kumar y otros, Bioorg. Med. Chem. Lett, 1998, 8, 2219-2222; Singh y col, J. Org. Chem, 1998, 63, 10035-10039; Srivastava y col, J. Am. Chem. Soc, 2007, 129 (26) 8362-8379; Elayadi y col, Curr. Opinion Invest. Drugs, 2001,2, 558-561; Braasch y otros, Chem. Biol, 2001, 8, 1-7 y Orum y otros, Curr. Opinion Mol. Ther, 2001, 3, 239 -243; Patentes de EE.UU. Nos 6,268,490; 6,525,191; 6,670,461; 6,770,748; 6,794,499; 7,034,133; 7,053,207; 7,399,845; 7,547,684; y 12,696,345; 61/026,995; 61/026,998; 61/056,564; 61/086,231; 61/097,787; y 61/099,844; Solicitudes internacionales PCT publicadas WO 1994/014226; WO 2004/106356; WO 2005/021570; WO 2007/134181; WO 2008/150729; WO 2008/154401; y WO 2009/006478. Cada uno de los nucleósidos bicíclicos anteriores puede prepararse con una o más configuraciones de azúcares estereoquímicos que incluyen, por ejemplo, a-L-ribofuranosa y p-D-ribofuranosa (véase la solicitud internacional PCT PCT/DK98/00393, publicada el 25 de marzo de 1999 como WO 99/14226).

[0105] En ciertas realizaciones, los restos de azúcares bicíclicos de los nucleósidos de BNA incluyen, pero no se limitan a, compuestos que tienen al menos un puente entre las posiciones 4' y 2' del resto de azúcar pentofuranosilo en donde dichos puentes comprenden independientemente 1 o 2 a 4 grupos vinculados seleccionados independientemente entre -[C(Ra)(Rb)]n-, -C(Ra) = C(Rb)-, -C(Ra) = N-, -C(=O)-, -C(=NRa)-, -C(=S)-, -O-, -Si(Ra)2-, -S(=O)X-, y -N(Ra)-;

en donde:

x es 0, 1 o 2;

n es 1, 2, 3 o 4;

cadaRay Rbes, independientemente, H, un grupo protector, hidroxilo, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, arilo C5-C20, arilo C5-C20 sustituido, radical heterociclo, radical heterociclo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, radical alicíclico C5-C7, radical alicíclico C5-C7 sustituido, halógeno, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, COOJ1, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, CN, sulfonilo (S(=O)2-J1) o sulfoxilo (S(=O)-J1); y

cada J1 y J2 es, independientemente, H, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, arilo C5-C20, arilo C5-C20 sustituido, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, un radical heterociclo, un radical heterociclo sustituido, aminoalquilo C1-C12, aminoalquilo C1-C12 sustituido o un grupo protector.

[0106] En ciertas realizaciones, el puente de un resto de azúcar bicíclico es-[C(Ra)(Rb)]n-, -[C(Ra)(Rb)]n-O-, -C(RaRb)-N(R)-O- o -C(RaRb)-O-N(R)-. En ciertas realizaciones, el puente es 4'-CH2-2', 4'-(CH2)2-2', 4'-(CH2) 3-2', 4'-CH2-O-2', 4'-(CH2)2-O-2', 4'-CH2-O-N(R)-2' y 4'-CH2-N(R)-O-2'- en donde cada R es, independientemente, H, un grupo protector o alquilo C1-C12.

[0107] En ciertas realizaciones, los nucleósidos bicíclicos se definen adicionalmente por configuración isomérica. Por ejemplo, un nucleósido que comprende un puente 4'-2'metileno-oxi, puede estar en la configuración a-L o en la configuración p-D. Anteriormente, los BNA de a-L-metilenoxi (4'-CH2-O-2') se habían incorporado en oligonucleótidos antisentido que mostraban actividad antisentido (Frieden et al, Nucleic Acids Research, 2003, 21,6365-6372).

[0108] En ciertas realizaciones, los nucleósidos bicíclicos incluyen, pero no se limitan a, (A) a-L-metilenoxi (4 -CH2-O-2') BNA, (B) p-D-metilenoxi (4'-CH2-O-2') BNA, (C) etilenoxi (4'-(CH2)2-O-2') BNA, (D) aminooxi (4'-CH2-O-N(R)-2') BNA, (E) oxiamino (4'-CH2-N(R)-O-2') BNA, y (F) metil (metilenoxi) (4'-CH(CH3)-O-2') BNA, (G) metilen-tio (4'-CH2-S-2') BNA, (H) metilen-amino (4'-CH2-N(R)-2') BNA, (I) metil carbocíclico (4'-CH2-CH(CH3)-2') BNA y (J) propileno carbocíclico (4'-(CH2)3-2') BNA como se muestra a continuación.

en donde Bx es el resto base y R es independientemente H, un grupo protector o alquilo C1-C12.

[0109] En ciertas realizaciones, se proporcionan nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula I:

en donde:

Bx es un resto de base heterocíclico;

-Qa-Qb-Qc- es -CH2-N(Rc)-CH2-, -C(=O)-N(Rc)-CH2-, -CH2-O-N(Rc)-, -CH2-N(Rc)-O- o-N(Rc)-O-CH2;

Rc es alquilo C1-C12 o un grupo protector de amino; y

Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte.

[0110] En ciertas realizaciones, se proporcionan nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula II:

en donde:

Bx es un resto base heterocíclico;

Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo

de fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;

Za es alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 sustituido, acilo, acilo sustituido, amida sustituida, tiol o tio sustituido.

[0111] En una realización, cada uno de los grupos sustituidos está, independientemente, mono o poli sustituido con

grupos sustituyentes seleccionados independientemente entre halógeno, oxo, hidroxilo, OJc, NJcJd, SJc, N3, OC(=X)Jc

y NJeC(=X)NJcJd, en donde cada Jc, Jd y Je es, independientemente, H, alquilo C1-C6, o alquilo C1-C6 sustituido y X es

O o NJc.

[0112] En ciertas realizaciones, se proporcionan nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula III:

en donde:

Bx es un resto de base heterocíclico;

Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo

de fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;

Zb es alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6 sustit alquinilo C2-C6 sustituido o acilo sustituido (C(=O)-).

[0113] En ciertas realizaciones, se proporcionan nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula I-V:

en donde:

Bx es un resto de base heterocíclico;

Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo

de fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;

Rd es alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 o alquinilo C2-C6 sustituido;

cada qa, qb, qc y qd es, independientemente, H, halógeno, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-Ca, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 o alquinilo C2-C6 sustituido, alcoxilo C1-C6, alcoxilo C1-C6 sustituido, acilo, acilo sustituido, aminoalquilo C1-Ca o aminoalquilo C1-Ca sustituido;

[0114] En ciertas realizaciones, se proporcionan nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula V:

en donde:

Bx es un resto de base heterocíclico;

Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;

qa, qb, qe y qf son cada uno, independientemente, hidrógeno, halógeno, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, alcoxi C1-C12, alcoxi C1-C12 sustituido, OJj, SJj, SOJj, SO2Jj, NJjJk, N3, CN, C(=O)OJj, C(=O)NJjJk, C(=O)Jj, OC(=O)NJjJk, N(H)C(= NH) NJjJk, N(H)C(=O)NJjJk o N(H)C(= S) NJjJk;

o qe y qf juntos son =C(qg)(qh);

qg y qh son cada uno, independientemente, H, halógeno, alquilo C1-C12 o alquilo C1-C12 sustituido.

[0115] La síntesis y preparación de los monómeros de BNA metilenoxi (4'-CH2-O-2') adenina, citosina, guanina, 5-metilcitosina, timina y uracilo, junto con sus propiedades de oligomerización y reconocimiento de ácido nucleico han sido descritas (Koshkin et al, Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630). Los BNA y su preparación también se describen en los documentos WO 98/39352 y WO 99/14226.

[0116] También se han preparado análogos de metilenoxi (4'-CH2-O-2') BNA y 2'-tio-BNA (Kumar et al, Bioorg. Med. Chem. Lett, 1998, 8, 2219-2222). También se ha descrito la preparación de análogos de nucleósidos bloqueados que comprenden dúplex de oligodesoxirribonucleótidos como sustratos para las polimerasas de ácido nucleico (Wengel et al, Documento WO 99/14226). Además, la síntesis de 2'-amino-BNA, un nuevo análogo de oligonucleótido de alta afinidad comformacionalmente restringida, se ha descrito en la técnica (Singh et al, J. Org. Chem, 1998, 63, 10035­ 10039). Además, se han preparado 2'-amino y 2'-metilamino-BNA y se ha informado previamente la estabilidad térmica de sus dúplex con ARN complementario y cadenas de ADN.

[0117] En ciertas realizaciones, se proporcionan nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula VI:

en donde:

Bx es un resto de base heterocíclico;

Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;

cada qi, qj, qk y ql es, independientemente, H, halógeno, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, alcoxilo C1-C12, alcoxilo C1-C12 sustituido, OJj, SJj, SOJj, SO2Jj, NJjJk, N3, CN, C(=O)OJj, C(=O)NJjJk, C(=O)Jj, OC(=O)NJjJk, N(H)C(= NH) NJjJk, N(H)C(=O)NJjJk o

N(H)C(=S)NJjJk; y

qi y qj o ql y qkjuntos son =C(qg)(qh), en donde qg y qh son cada uno, independientemente, H, halógeno, alquilo C1-C12 o alquilo C1-C12 sustituido.

[0118] Se ha descrito un nucleósido bicíclico carbocíclico que tiene un puente 4'-(CH2)3-2' y el puente análogo de alquenilo 4'-CH=CH-CH2-2' (Freier et al, Nucleic Acids Research, 1997, 25 (22), 4429-4443 y Albaek et al, J. Org. Chem, 2006, 71, 7731-7740). La síntesis y preparación de nucleósidos bicíclicos carbocíclicos junto con su oligomerización y estudios bioquímicos también se han descrito (Srivastava et al, J. Am. Chem. Soc, 2007, 129 (26), 8362-8379).

[0119] Como se usa en el presente documento, "4'-2' nucleósido bicíclico" o "4' a 2' nucleósido bicíclico" se refiere a un nucleósido bicíclico que comprende un anillo de furanosa que comprende un puente que conecta dos átomos de carbono del anillo de furanosa que conecta el átomo de carbono 2' y átomo de carbono 4' del anillo de azúcar.

[0120] Como se usa en este documento, "nucleósidos monocíclicos" se refiere a nucleósidos que comprenden restos de azúcar modificados que no son restos de azúcares bicíclicos. En ciertas realizaciones, el resto azúcar, o análogo de resto azúcar, de un nucleósido puede modificarse o sustituirse en cualquier posición.

[0121] Como se usa en el presente documento, "azúcar modificado en 2'" significa un azúcar de furanosilo modificado en la posición 2'. En ciertas realizaciones, dichas modificaciones incluyen sustituyentes seleccionados entre: un haluro, que incluye, pero no se limita a, alcoxi sustituido y no sustituido, tioalquilo sustituido y no sustituido, aminoalquilo sustituido y no sustituido, alquilo sustituido y no sustituido, alilo sustituido y no sustituido, y alquilo sustituido y alquinilo no sustituido. En ciertas realizaciones, las modificaciones 2' se seleccionan entre los sustituyentes que incluyen, entre otros: O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nF, O(CH2))nONH2, OCH2C(=O)n(H)CH3, y/o (CH2)nON[(CH2)nCH3]2, donde n y m son de 1 a aproximadamente 10. Otros grupos sustituyentes 2' también pueden seleccionarse de: alquilo C1-C12, alquilo sustituido, alquenilo, alquinilo, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo o O-aralquilo, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, Cn , F, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo de escisión de ARN, un grupo informador, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de compuesto, y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. En ciertas realizaciones, los nucleósidos modificados comprenden una cadena lateral 2 '-m Oe (Baker et al, J. Biol. Chem, 1997, 272, 11944-12000). Se ha descrito que dicha sustitución 2'-MOE tiene una afinidad de unión mejorada en comparación con los nucleósidos no modificados y con otros nucleósidos modificados, tales como 2'-O-metilo, O-propilo y O-aminopropilo. Los oligonucleótidos que tienen el sustituyente 2'-MOE también han demostrado ser inhibidores antisentido de la expresión génica con características prometedoras para su uso in vivo (Martin, Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504; Altmann et al, Chimia, 1996, 50, 168-176; Altmann et al, Biochem. Soc. Trans, 1996, 24, 630-637; y Altmann et al, Nucleosides Nucleótidos, 1997, 16, 917-926).

[0122] Como se usa en este documento, un "nucleósido de tetrahidropirano modificado" o "nucleósido de THP modificado" significa un nucleósido que tiene un "azúcar" de tetrahidropirano de seis miembros sustituido por el residuo de pentofuranosilo en nucleósidos normales (un sustituto de azúcar). Los nucleósidos de THP modificados incluyen, pero no se limitan a, lo que se conoce en la técnica como ácido nucleico hexitol (HNA), ácido nucleico anitol (ANA), ácido nucleico manitol (MNA) (véase Leumann, Bioorg. Med. Chem, 2002, 10, 841-854), flúor HNA (F-HNA) o aquellos compuestos que tienen la fórmula VII:

en donde independientemente para cada uno de dichos al menos un análogo de nucleósido de tetrahidropirano de Fórmula VII:

Bx es un resto de base heterocíclico;

Ta y Tb son cada uno, independientemente, un grupo de enlace internucleósido que une el análogo nucleosídico de tetrahidropirano al compuesto antisentido o uno de Ta y Tb es un grupo de enlace internucleósido que une el análogo de nucleósido tetrahidropirano al compuesto antisentido y el otro de Ta y Tb es H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado unido o un grupo terminal 5' o 3';

q-i, q2, q3, q4, q5, q6 y q7 son cada uno independientemente, H, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 o alquinilo C2-C6 sustituido; y cada uno de R1 y R2 se selecciona entre hidrógeno, hidroxilo, halógeno, alcoxi sustituido o no sustituido, NJ1J2, SJ1, N3, o C (= X J OC(=X) NJ1J2, NJ3C(=X)NJJ2 y CN, donde X es O, S o NJ1 y cada J1, J2 y J3 es, independientemente, H o alquilo C1-C6.

[0123] En ciertas realizaciones, los nucleósidos THP modificados de la Fórmula VII se proporcionan en donde qi, q2, q3, q4, q5, q6 y q7 son cada uno H. En ciertas realizaciones, al menos uno de q1 , q2, q3, q4, q5, q6 y q7 es distinto de H. En ciertas realizaciones, al menos uno de q1, q2, q3, q4, q5, q6y q7 es metilo. En ciertas realizaciones, se proporcionan nucleósidos THP de Fórmula VII en donde uno de R1 y R2 es flúor. En ciertas realizaciones, R1 es flúor y R2 es H; R1 es metoxi y R2 es H, y R1 es H y R2 es metoxietoxi.

[0124] Como se usa en este documento, "2-modificado" o "2'-sustituido" se refiere a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un sustituyente en la posición 2' diferente de H u OH. Los nucleósidos modificados en 2' incluyen, pero no se limitan a, nucleósidos bicíclicos en los que el puente que conecta dos átomos de carbono del anillo de azúcar conecta el carbono 2' y otro carbono del anillo de azúcar; y nucleósidos con sustituyentes 2 que no forman puentes, como alilo, amino, azido, tio, O-alilo, alquilo C1-C10, -OCF3, O-(CH2)2-O-CH3, 2'-O(CH2)2SCH3, O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), o O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn), donde cada Rm y Rn es, independientemente, H o sustituido o alquilo C1-C10 no sustituido. Los nucleósidos modificados en 2' pueden comprender además otras modificaciones, por ejemplo, en otras posiciones del azúcar y/o en la nucleobase.

[0125] Como se usa en el presente documento, "2'-F" se refiere a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un grupo flúor en la posición 2'.

[0126] Como se usa en el presente documento, "2'-OMe" o "2 -OCH3" o "2'-O-metilo" se refieren a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un grupo -OCH3 en la posición 2' del anillo de azúcar.

[0127] Como se usa en este documento, "MOE" o "2'-MOE" o "2 -OCH2CH2OCH3" o "2'-O-metoxietilo" se refieren a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un grupo -OCH2CH2OCH3 en la posición 2' del anillo de azúcar.

[0128] Como se usa en el presente documento, "oligonucleótido" se refiere a un compuesto que comprende una pluralidad de nucleósidos unidos. En ciertas realizaciones, se modifica uno o más de la pluralidad de nucleósidos. En ciertas realizaciones, un oligonucleótido comprende uno o más ribonucleósidos (ARN) y/o desoxirribonucleósidos (ADN).

[0129] En la técnica también se conocen muchos otros sistemas de anillos sustitutos de azúcar biciclo y triciclo que se pueden usar para modificar nucleósidos para su incorporación en compuestos antisentido (ver, por ejemplo, artículo de revisión: Leumann, Bioorg. Med. Chem, 2002, 10, 841-854).

Tales sistemas de anillos pueden sufrir varias sustituciones adicionales para mejorar la actividad.

[0130] Los expertos en la técnica conocen bien los métodos para la preparación de azúcares modificados.

[0131] En nucleótidos que tienen restos de azúcar modificados, los restos de nucleobase (naturales, modificados o una combinación de los mismos) se mantienen para la hibridación con una diana de ácido nucleico apropiada.

[0132] En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido comprenden uno o más nucleósidos que tienen proteínas de azúcar modificadas. En ciertas realizaciones, el resto de azúcar modificado es 2'-MOE. En ciertas realizaciones, los nucleósidos modificados en 2'-MOE están dispuestos en un motivo gapmer. En ciertas realizaciones, el resto de azúcar modificado es un nucleósido bicíclico que tiene un grupo puente (4'-CH(CH3)-O-2'). En ciertas realizaciones, los nucleósidos modificados (4'-CH(CH3)-O-2') están dispuestos a lo largo de las alas de un motivo gapmer.

Métodos para formular composiciones farmacéuticas

[0133] Los oligonucleótidos antisentido se pueden mezclar con sustancias activas o inertes farmacéuticamente aceptables para la preparación de composiciones o formulaciones farmacéuticas. Los métodos para la formulación de composiciones farmacéuticas dependen de una serie de criterios, entre los que se incluyen, entre otros, la vía de administración, la extensión de la enfermedad o la dosis que se administrará.

[0134] Un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico C9ORF72 puede utilizarse en composiciones farmacéuticas combinando el compuesto antisentido con un diluyente o vehículo adecuado farmacéuticamente aceptable. Un diluyente farmacéuticamente aceptable incluye solución salina tamponada con fosfato (PBS). PBS es un diluyente adecuado para uso en composiciones para ser administradas por vía parenteral. Por consiguiente, en un caso de la divulgación, empleado en los métodos descritos en este documento es una composición farmacéutica que comprende un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico C9ORF72 y un diluyente farmacéuticamente aceptable. En ciertas realizaciones, el diluyente farmacéuticamente aceptable es PBS. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido es un oligonucleótido antisentido.

[0135] Las composiciones farmacéuticas que comprenden compuestos antisentido abarcan cualquier sal, ésteres o sales farmacéuticamente aceptables de tales ésteres, o cualquier otro oligonucleótido que, tras la administración a un animal, incluido un ser humano, sea capaz de proporcionar (directa o indirectamente) el metabolito o residuo biológico activo de los mismos. Por consiguiente, por ejemplo, la descripción también se refiere a sales farmacéuticamente aceptables de compuestos antisentido, profármacos, sales farmacéuticamente aceptables de tales profármacos y otros bioequivalentes. Las sales farmacéuticamente aceptables adecuadas incluyen, pero no se limitan a sales de sodio y potasio.

[0136] Un profármaco puede incluir la incorporación de nucleósidos adicionales en uno o ambos extremos de un compuesto antisentido que se escinden por nucleasas endógenas dentro del cuerpo, para formar el compuesto antisentido activo.

Compuestos antisentido conjugados

[0137] Los compuestos antisentido pueden unirse covalentemente a uno o más restos o conjugados que mejoran la actividad, distribución celular o captación celular de los oligonucleótidos antisentido resultantes. Los grupos conjugados típicos incluyen restos de colesterol y restos de lípidos. Los grupos conjugados adicionales incluyen carbohidratos, fosfolípidos, biotina, fenazina, folato, fenantridina, antraquinona, acridina, fluoresceínas, rodaminas, cumarinas y colorantes.

[0138] Los compuestos antisentido también pueden modificarse para tener uno o más grupos estabilizadores que generalmente están unidos a uno o ambos extremos de compuestos antisentido para mejorar propiedades tales como, por ejemplo, la estabilidad de la nucleasa. Incluidas en los grupos estabilizadores están las estructuras de los casquetes. Estas modificaciones terminales protegen el compuesto antisentido que tiene ácido nucleico terminal de la degradación de la exonucleasa, y pueden ayudar en el suministro y/o localización dentro de una célula. La tapa puede estar presente en el extremo 5' (5'-cap), o en el término 3' (3'-cap), o puede estar presente en ambos extremos. Las estructuras de capuchones son bien conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, capuchones abásicos deoxi invertidos. Otros grupos estabilizadores 3' y 5' que pueden usarse para cubrir uno o ambos extremos de un compuesto antisentido para impartir estabilidad de nucleasa incluyen los descritos en el documento WO 03/004602 publicado el 16 de enero de 2003.

Cultivo celular y tratamiento de compuestos antisentido.

[0139] Los efectos de los compuestos antisentido en el nivel, la actividad o la expresión de los ácidos nucleicos de C9ORF72 se pueden ensayar in vitro en una variedad de tipos de células. Los tipos de células utilizados para tales análisis están disponibles en proveedores comerciales (p. ej, American Type Culture Collection, Manassus, VA; Zen-Bio, Inc, Research Triangle Park, NC; Clonetics Corporation, Walkersville, MD) y se cultivan de acuerdo con las instrucciones del vendedor. utilizando reactivos disponibles comercialmente (p. ej, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). Los tipos de células ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, células HepG2, células Hep3B y hepatocitos primarios.

Ensayo in vitro de oligonucleótidos antisentido.

[0140] En este documento se describen métodos para el tratamiento de células con oligonucleótidos antisentido, que pueden modificarse de manera apropiada para el tratamiento con otros compuestos antisentido.

[0141] En general, las células se tratan con oligonucleótidos antisentido cuando las células alcanzan aproximadamente el 60-80% de fluidez en el cultivo.

[0142] Un reactivo comúnmente utilizado para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye el reactivo de transfección de lípidos catiónicos LIPOFECTIN (Invitrogen, Carlsbad, CA). Los oligonucleótidos antisentido se mezclan con LIPOFECTIN en OPTI-MEM 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para lograr la concentración final deseada de oligonucleótido antisentido y una concentración de LIPOFECTIN que típicamente oscila entre 2 y 12 ug/ml por oligonucleótido antisentido 100 nM.

[0143] Otro reactivo utilizado para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye L iPo Fe CTAMINA (Invitrogen, Carlsbad, CA). El oligonucleótido antisentido se mezcla con LIPOFECTAMINA en medio de suero reducido OPTI-MEM 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para lograr la concentración deseada de oligonucleótido antisentido y una concentración de LIPOFECTAMINA que típicamente oscila entre 2 y 12 ug/ml por oligonucleótido antisentido 100 nM.

[0144] Otra técnica usada para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye la electroporación.

[0145] Las células se tratan con oligonucleótidos antisentido por métodos de rutina. Las células se cosechan típicamente 16-24 horas después del tratamiento con oligonucleótido antisentido, momento en el que los niveles de ARN o proteína de los ácidos nucleicos diana se miden mediante métodos conocidos en la técnica y descritos en este documento. En general, cuando los tratamientos se realizan en múltiples repeticiones, los datos se presentan como el promedio de los tratamientos repetidos.

[0146] La concentración de oligonucleótido antisentido utilizada varía de una línea celular a otra. Los métodos para determinar la concentración óptima de oligonucleótido antisentido para una línea celular particular son bien conocidos en la técnica. Los oligonucleótidos antisentido se usan típicamente en concentraciones que varían de 1 nM a 300 nM cuando se transfectan con LIPOFECTAMINA. Los oligonucleótidos antisentido se utilizan en concentraciones más altas que varían de 625 a 20.000 nM cuando se transfectan utilizando electroporación.

Aislamiento de ARN

[0147] El análisis de ARN se puede realizar en ARN celular total o poli(A)+ ARNm. Los métodos de aislamiento de ARN son bien conocidos en la técnica. El ARN se prepara utilizando métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, usando el Reactivo TRIZOL (Invitrogen, Carlsbad, c A) de acuerdo con los protocolos recomendados por el fabricante.

Análisis de inhibición de niveles o expresión diana.

[0148] La inhibición de los niveles o la expresión de un ácido nucleico C9ORF72 se puede ensayar de una variedad de formas conocidas en la técnica. Por ejemplo, los niveles de ácido nucleico diana se pueden cuantificar, por ejemplo, mediante análisis de transferencia Northern, reacción en cadena de la polimerasa competitiva (PCR) o PCR cuantitativa en tiempo real. El análisis de ARN puede realizarse en ARN celular total o poli(A)+ ARNm. Los métodos de aislamiento de ARN son bien conocidos en la técnica. El análisis de transferencia Northern también es rutinario en la técnica. PCR en tiempo real cuantitativo se puede realizar convenientemente utilizando el Sistema de Detección de Secuencias ABI PRISM 7600, 7700 o 7900, disponible en el mercado, disponible en PE-Applied Biosystems, Foster City, CA y se usa de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Análisis cuantitativo de PCR en tiempo real de los niveles de ARN diana

[0149] La cuantificación de los niveles de ARN diana se puede lograr mediante PCR cuantitativa en tiempo real utilizando el sistema de detección de secuencias ABI PRISM 7600, 7700 o 7900 (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los métodos de PCR cuantitativa en tiempo real son bien conocidos en la técnica.

[0150] Antes de la PCR en tiempo real, el ARN aislado se somete a una reacción de transcriptasa inversa (RT), que produce ADN complementario (ADNc) que luego se usa como el sustrato para la amplificación por PCR en tiempo real. La RT y las reacciones de PCR en tiempo real se realizan secuencialmente en el mismo pocillo de muestra. Los reactivos de RT y PCR en tiempo real se obtienen de Invitrogen (Carlsbad, CA). Las reacciones de RT en tiempo real de la PCR se llevan a cabo mediante métodos bien conocidos por los expertos en la materia.

[0151] Las cantidades diana del gen (o ARN) obtenidas por PCR en tiempo real se normalizan utilizando el nivel de expresión de un gen cuya expresión es constante, como la ciclofilina A, o cuantificando el ARN total utilizando RIBOGREEN (Invitrogen, Inc. Carlsbad, CA). La expresión de la ciclofilina A se cuantifica por PCR en tiempo real, ejecutándose simultáneamente con el objetivo, multiplexación o por separado. El ARN total se cuantifica utilizando el reactivo de cuantificación de ARN RIBOGREEN (Invetrogen, Inc. Eugene, OR). Los métodos de cuantificación de ARN por RIBOGREEN se enseñan en Jones, LJ, et al, (Analytical Biochemistry, 1998, 265, 368-374). Se utiliza un instrumento CYTOFLUOR 4000 (PE Applied Biosystems) para medir la fluorescencia de RIBOGREEN.

[0152] Las sondas y los cebadores están diseñados para hibridar con un ácido nucleico C9ORF72. Los métodos para diseñar sondas y cebadores de PCR en tiempo real son bien conocidos en la técnica y pueden incluir el uso de software como el software PRIMER EXPRESS (Applied Biosystems, Foster City, CA).

Análisis de PCR semicuantitativo específico de hebra de niveles de ARN diana

[0153] El análisis de los niveles específicos de la cadena de ARN diana de baja abundancia se puede realizar por transcripción inversa, PCR y análisis de densitometría en gel utilizando el sistema de imágenes Gel Logic 200 y Kodak MI (Kodak Scientific Imaging Systems, Rochester, NY, EE.UU.) según a las instrucciones del fabricante.

[0154] Las reacciones de RT-PCR se llevan a cabo como se enseña en Ladd, PD, et al, (Human Molecular Genetics, 2007, 16, 3174-3187) y en Sopher, BL, et al, (Neuron, 2011, 70, 1071). -1084) y tales métodos son bien conocidos en la técnica.

[0155] Los productos de amplificación por PCR se cargan en geles, se tiñen con bromuro de etidio y se someten a análisis de densitometría. Se miden las intensidades medias de las regiones de interés (ROI) que corresponden a las bandas de interés en el gel.

[0156] Las cantidades diana del gen (o ARN) obtenidas por PCR se normalizan utilizando el nivel de expresión de un gen de mantenimiento cuya expresión es constante, tal como GAPDH. La expresión del gen de mantenimiento (o ARN) se analiza y mide utilizando los mismos métodos que la diana.

[0157] Las sondas y los cebadores están diseñados para hibridarse con un ácido nucleico C9ORF72. Los métodos para diseñar sondas y cebadores de RT-PCR son bien conocidos en la técnica y pueden incluir el uso de software como el software PRIMER EXPRESS (Applied Biosystems, Foster City, CA).

Análisis de los niveles de proteína

[0158] La inhibición antisentido de los ácidos nucleicos C9ORF72 puede evaluarse midiendo los niveles de proteína C9ORF72. Los niveles de proteína de C9ORF72 se pueden evaluar o cuantificar de diversas formas bien conocidas en la técnica, como la inmunoprecipitación, el análisis de transferencia de Western (inmunotransferencia), el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), los análisis cuantitativos de proteínas y los ensayos de actividad de proteínas (p. ej, ensayos de actividad de caspasa), inmunohistoquímica, inmunocitoquímica o clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). Los anticuerpos dirigidos a una diana pueden identificarse y obtenerse de una variedad de fuentes, como el catálogo de anticuerpos MSRS (Aerie Corporation, Birmingham, MI), o pueden prepararse mediante métodos convencionales de generación de anticuerpos monoclonales o policlonales bien conocidos en la técnica. Los anticuerpos útiles para la detección de C9ORF72 de ratón, rata, mono y humano están disponibles comercialmente.

Ensayos in vivo de compuestos antisentido.

[0159] Los compuestos antisentido, por ejemplo, oligonucleótidos antisentido, se prueban en animales para evaluar su capacidad para inhibir la expresión de C9ORF72 y producir cambios fenotípicos, como la función motora y la respiración mejoradas. En ciertas realizaciones, la función del motor se mide por rotarod, fuerza de agarre, escalada de polos, rendimiento en campo abierto, haz de equilibri, prueba de huella de pata trasera en el animal. En ciertas realizaciones, la respiración se mide con pletismografía de cuerpo entero, resistencia invasiva y mediciones de cumplimiento en el animal. Las pruebas se pueden realizar en animales normales o en modelos de enfermedades experimentales. Para la administración a animales, los oligonucleótidos antisentido se formulan en un diluyente farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina tamponada con fosfato. La administración incluye rutas parenterales de administración, tales como intraperitoneal, intravenosa y subcutánea. El cálculo de la dosis de oligonucleótido antisentido y la frecuencia de dosificación están dentro de las capacidades de los expertos en la materia, y dependen de factores tales como la vía de administración y el peso corporal del animal. Después de un período de tratamiento con oligonucleótidos antisentido, el ARN se aísla del tejido del SNC o CSF y se miden los cambios en la expresión del ácido nucleico C9ORF72.

Orientación a C9ORF72

[0160] Los oligonucleótidos antisentido descritos en el presente documento pueden hibridar con un ácido nucleico C9ORF72 derivado de cualquier cadena de ADN. Por ejemplo, los oligonucleótidos antisentido descritos en el presente documento pueden hibridar con un transcrito antisentido C9ORF72 o un transcrito con sentido C9ORF72. Los oligonucleótidos antisentido descritos en este documento pueden hibridar con un ácido nucleico C9ORF72 en cualquier etapa del procesamiento de ARN. En el presente documento se describen oligonucleótidos antisentido que son complementarios a un pre-ARNm o un ARNm maduro. Además, los oligonucleótidos antisentido descritos en el presente documento pueden hibridar con cualquier elemento de un ácido nucleico C9ORF72. Por ejemplo, aquí se describen oligonucleótidos antisentido que son complementarios a un exón, un intrón, la 5' UTR, la 3' UTR, una región de repetición, una expansión de repetición de hexanucleótidos, una unión de empalme, una unión de empalmes de exón: exón, una silenciador de empalme exónico (ESS), un potenciador de empalme exónico (ESE), exón la, exón lb, exón 1c, exón 1d, exón 1e, exón 2, exón 3, exón 4, exón 5, exón 6, exón 7, exón 8, exón 9, exón 10, exón 11, intrón 1, intrón 2, intrón 3, intrón 4, intrón 5, intrón 6, intrón 7, intrón 8, intrón 9 o intrón 10 de un ácido nucleico C9ORF72.

Características de C9OFF72

[0161] Los oligonucleótidos antisentido descritos en el presente documento pueden hibridar con cualquier ácido nucleico C9ORF72 en cualquier estado de procesamiento dentro de cualquier elemento del gen C9ORF72. Por ejemplo, los oligonucleótidos antisentido descritos aquí pueden hibridar con un exón, un intrón, la UTR 5', la UTR 3', una región repetida, una expansión repetida de hexanucleótidos, una unión de empalme, una unión de empalme exón: exón, un silenciador de empalme exónico (ESS), un potenciador de empalme exónico (ESE), exón 1a, exón 1b, exón 1c, Id del exón, exón 1e, exón 2, exón 3, exón 4, exón 5, exón 6, exón 7, exón 8, exón 9, exón 10, exón 11, intrón 1, intrón 2, intrón 3, intrón 4, intrón 5, intrón 6, intrón 7, intrón 8, intrón 9 o intrón 10. Por ejemplo, los oligonucleótidos antisentido pueden apuntar a cualquiera de los exones caracterizados abajo en las Tablas 1-5 descritas abajo. Los oligonucleótidos antisentido descritos en el presente documento también pueden dirigirse a los ácidos nucleicos que no se caracterizan a continuación y dicho ácido nucleico se puede caracterizar en GENBANK. Además, los oligonucleótidos antisentido descritos en el presente documento también pueden dirigirse a elementos distintos de los exones y a los elementos caracterizados en GENBANK.

Tabla 1

Tabla 2

Tabla 3

Tabla 4

Tabla 5

Ciertas indicaciones

[0162] En el presente documento se describen métodos para tratar a un individuo que comprenden administrar una o más composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento. En ciertos casos de la divulgación, el individuo tiene una enfermedad neurodegenerativa. En ciertos casos de la divulgación, el individuo está en riesgo de desarrollar una enfermedad neurodegenerativa, que incluye, entre otras, ALS o FTD. En ciertos casos de la divulgación, se ha identificado a la persona que tiene una enfermedad asociada con C9ORF72. En ciertos casos de la divulgación, se ha identificado que el individuo tiene una enfermedad asociada a la expansión por repetición de hexanucleótidos C9ORF72. En ciertos casos de la divulgación, en el presente documento se proporcionan compuestos para uso en la reducción profiláctica de la expresión de C9ORF72 en un individuo. Ciertos casos de la divulgación incluyen tratar a un individuo que lo necesite administrando a un individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico C9ORF72.

[0163] En una realización, la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico C9ORF72 se acompaña de un seguimiento de los niveles de C9ORF72 en un individuo, para determinar la respuesta de un individuo a la administración del compuesto antisentido. La respuesta de un individuo a la administración del compuesto antisentido puede ser utilizada por un médico para determinar la cantidad y la duración de la intervención terapéutica.

[0164] En ciertas realizaciones, la administración de un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico C9ORF72 da como resultado la reducción de la expresión de C9ORF72 en al menos 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 99%, o un rango definido por cualquiera de estos dos valores. En ciertas realizaciones, la administración de un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico C9ORF72 da como resultado una mejor función motora y respiración en un animal. En ciertas realizaciones, la administración de un compuesto antisentido C9ORF72 mejora la función motora y la respiración en al menos 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90. 95 o 99%, o un rango definido por cualquiera de estos dos valores.

[0165] En ciertas realizaciones, la administración de un compuesto antisentido dirigido a un transcrito antisentido C9ORF72 da como resultado la reducción de la expresión del transcrito antisentido C9ORF72 en al menos 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 99%, o un rango definido por cualquiera de estos dos valores. En ciertas realizaciones, la administración de un compuesto antisentido dirigido a un transcrito antisentido C9ORF72 da como resultado una mejor función motora y respiración en un animal. En ciertas realizaciones, la administración de un compuesto antisentido C9ORF72 mejora la función motora y la respiración en al menos 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 99%, o un rango definido por cualquiera de estos dos valores. En ciertas realizaciones, la administración de un compuesto antisentido C9ORF72 reduce el número de células con focos antisentido C9ORF72 y/o el número de focos antisentido C9ORF72 por célula.

[0166] En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto antisentido dirigido a un núcleo C9ORF72 se usan para la preparación de un medicamento para tratar a un paciente que sufre o es susceptible a una enfermedad neurodegenerativa que incluye ALS y FTD.

Ciertas terapias combinadas

[0167] En ciertas realizaciones, una o más composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento se coadministran con uno o más agentes farmacéuticos. En ciertas realizaciones, tales uno o más agentes farmacéuticos están diseñados para tratar la misma enfermedad, trastorno o afección que la una o más composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento. En ciertas realizaciones, tales uno o más agentes farmacéuticos están diseñados para tratar una enfermedad, trastorno o afección diferente como una o más composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento. En ciertas realizaciones, tales uno o más agentes farmacéuticos están diseñados para tratar un efecto secundario no deseado de una o más composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento. En ciertas realizaciones, una o más composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento se coadministran con otro agente farmacéutico para tratar un efecto no deseado de ese otro agente farmacéutico. En ciertas realizaciones, una o más composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento se coadministran con otro agente farmacéutico para producir un efecto combinado. En ciertas realizaciones, una o más composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento se coadministran con otro agente farmacéutico para producir un efecto sinérgico.

[0168] En ciertas realizaciones, una o más composiciones farmacéuticas descritas en este documento y uno o más agentes farmacéuticos se administran al mismo tiempo. En ciertas realizaciones, una o más composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento y uno o más agentes farmacéuticos se administran en diferentes momentos. En ciertas realizaciones, una o más composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento y uno o más agentes farmacéuticos se preparan juntos en una única formulación. En ciertas realizaciones, una o más composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento y uno o más agentes farmacéuticos se preparan por separado.

[0169] En ciertas realizaciones, los agentes farmacéuticos que pueden coadministrarse con una composición farmacéutica descrita en este documento incluyen Riluzol (Rilutek), Lioresal (Lioresal) y Dexpramipexol.

[0170] En ciertas realizaciones, los agentes farmacéuticos que pueden coadministrarse con un inhibidor específico del transcrito antisentido C9ORF72 descrito en el presente documento incluyen, entre otros, un inhibidor adicional de C9ORF72. En ciertas realizaciones, el agente farmacéutico coadministrado se administra antes de la administración de una composición farmacéutica descrita en el presente documento. En ciertas realizaciones, el agente farmacéutico coadministrado se administra después de la administración de una composición farmacéutica descrita en el presente documento. En ciertas realizaciones, el agente farmacéutico coadministrado se administra al mismo tiempo que una composición farmacéutica descrita en este documento. En ciertas realizaciones, la dosis de un agente farmacéutico coadministrado es la misma que la dosis que se administraría si el agente farmacéutico coadministrado se administrara solo. En ciertas realizaciones, la dosis de un agente farmacéutico coadministrado es inferior a la dosis que se administraría si el agente farmacéutico coadministrado se administrara solo. En ciertas realizaciones, la dosis de un agente farmacéutico coadministrado es mayor que la dosis que se administraría si el agente farmacéutico coadministrado se administrara solo. En ciertas realizaciones, la administración concomitante de un segundo compuesto aumenta el efecto de un primer compuesto, de manera que la administración concomitante de los compuestos produce un efecto que es mayor que el efecto de administrar el primer compuesto solo.

[0171] En otras realizaciones, la administración conjunta da como resultado efectos que son aditivos a los efectos de los compuestos cuando se administran solos. En ciertas realizaciones, la administración conjunta produce efectos que son supra-aditivos de los efectos de los compuestos cuando se administran solos. En ciertas realizaciones, el primer compuesto es un compuesto antisentido. En ciertas realizaciones, el segundo compuesto es un compuesto antisentido.

Ciertos ensayos para medir la reducción de los focos antisentido C9ORF72

[0172] Ciertos ensayos descritos en el presente documento son para medir la reducción de los focos antisentido C9ORF72. Se pueden usar ensayos adicionales para medir la reducción de los focos antisentido C9ORF72.

Ciertos ensayos para medir transcripciones antisentido C9ORF72

[0173] Ciertos ensayos descritos en el presente documento se dirigen a la reducción del transcrito antisentido C9ORF72. Se pueden usar ensayos adicionales para medir la reducción del transcrito antisentido de C9ORF72. Se pueden usar controles adicionales como línea de base para medir la reducción del transcrito de C9ORF72.

Divulgación no limitativa

[0174] Aunque ciertos compuestos, composiciones y métodos descritos en este documento se han descrito con especificidad de acuerdo con ciertas realizaciones, los siguientes ejemplos sirven solo para ilustrar los compuestos descritos en este documento y no pretenden limitarlos.

Ejemplo 1: Visualización de los focos antisentido C9ORF72 en líneas de fibroblastos de pacientes C9ORF72

[0175] Se investigó la presencia de focos antisentido C9ORF72 en seis líneas de fibroblastos de pacientes con ALS/FTD C9orf72 y tres líneas de control. Los focos antisentido de C9ORF72 se visualizaron mediante hibridación in situ fluorescente con sondas de LNA con la repetición de hexanucleótidos GGCCCC, que se transcribió en la dirección antisentido del gen C9ORF72.

[0176] Se usó una sonda de ADN incorporada con ácido nucleico bloqueado (LNA) fluorescente de 16 unidades contra la repetición de hexanucleótidos que contiene el transcrito antisentido C9ORF72 (Exiqon, Inc. Woburn, MA). La secuencia de la sonda se presenta en la siguiente tabla. La sonda se marcó con 5' TYE-563 fluorescente. Se usó una sonda fluorescente marcada con TYE-563 5' dirigida a repeticiones CUG como control negativo. Los números de lote de Exiqon fueron 607565 (TYE563) para la sonda que reconoce la repetición del hexanucleótido que contiene el transcrito antisentido C9ORF72 y 607324 para la sonda que reconoce la repetición CUG.

Tabla 6

[0177] Todas las etapas de hibridación se realizaron en condiciones libres de ARNasa. Los fibroblastos en placa se permeabilizaron en Triton X-100 al 0,2% (Sigma Aldrich n° T-8787) en PBS durante 10 minutos, se lavaron dos veces en PBS durante 5 minutos, se deshidrataron con etanol y luego se secaron al aire. Los portaobjetos se precalentaron en 400 ml de tampón de hibridación (50% de formamida desionizada, 2xSCC, 50 mM de fosfato de sodio, pH 7 y 10% de sulfato de dextrano) a 66°C durante 20-60 minutos bajo portaobjetos flotantes libres de ARNasa en una cámara humidificada con tampón de hibridación. Las sondas se desnaturalizaron a 80°C durante 75 segundos y se devolvieron inmediatamente al hielo antes de dilución con tampón de hibridación (concentración final 40 nM). El tampón de incubación se reemplazó con la mezcla que contiene la sonda (400 pl por portaobjetos), y las diapositivas se hibridaron bajo portaobjetos flotantes durante 12 -16 horas en una cámara sellada y protegida contra la luz.

[0178] Después de la hibridación, los portaobjetos flotantes se retiraron y los portaobjetos se lavaron a temperatura ambiente en Tween-20/2X SCC al 0,1% durante 5 minutos antes de someterlos a tres lavados de 10 minutos de rigurosidad en 0,1xSCC a 65°C. Los portaobjetos se deshidrataron luego a través de etanol y se secaron al aire.

[0179] La visualización primaria para la cuantificación y la obtención de imágenes de los focos se realizó con un aumento de 100x utilizando un sistema de microscopio confocal Nikon Eclipse Ti equipado con una diana de aceite Nikon CFI Apo TIRF 100X (NA 1,49).

[0180] La mayoría de los fibroblastos de pacientes con C9ORF72 contenían un solo foco que contenía un transcrito antisentido C9ORF72, pero también se observaron múltiples focos, con hasta 40 agregados fluorescentes individuales en el núcleo de unas pocas células afectadas. Los focos tenían formas asimétricas con dimensiones de ~0,2-0,5 micras. La mayoría eran intratucleares, pero se identificó un foco citoplásmico ocasional. El tratamiento con ARNasa A, pero no con ADNasa I, eliminó los focos antisentido C9ORF72, lo que demuestra que estaban compuestos principalmente de ARN. Los focos antisentido de C9ORF72 parecían ser más numerosos que los focos de sentido C9ORF72, lo que plantea la posibilidad de la necesidad de dirigirse específicamente a ellos terapéuticamente.

Ejemplo 2: Tratamiento de fibroblastos de pacientes con oligonucleótidos antisentido d irigidos al transcrito de sentido C9ORF72

[0181] Dos oligonucleótidos antisentido, ISIS 577065 e ISIS 576816, que fueron diseñados para apuntar al transcrito de sentido C9ORF72, fueron probados por su efectividad en la reducción de los focos antisentido C9ORF72.

[0182] El ISIS 577065 se dirige a un transcrito del gen C9ORF72, designado en este documento como SEQ ID NO: 2 (el complemento de GenBank N° de registro NT_008413,18 truncado desde los nucleótidos 27535000 al 27565000) en el sitio de inicio diana 1446, una región que está más arriba del exón 1B. ISIS 576816 se dirige a la SEQ ID NO: 2 en el sitio de inicio diana 7990, una región que se encuentra en el exón 2. Ambos oligonucleótidos ISIS son 5-10-5 gapmers, 20 nucleósidos de longitud, en donde el segmento de brecha central consta de diez 2'-desoxinudeósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprende cinco nucleósidos cada uno. Cada nucleósido en el segmento del ala 5' y cada nucleósido en el segmento del ala 3' tiene una modificación 2'-MOE. Los enlaces internucleosídicos a lo largo de cada gapmer son enlaces fosforotioato (P = S). Todos los residuos de citosina a lo largo de cada gapmer son 5-metilcitosinas.

[0183] Se sembraron células de fibroblastos de control o de paciente en placas de cámara 24 horas antes del tratamiento. Luego se lavaron en PBS y se transfectaron con ISIS 577065 e ISIS 576816 a una dosis de 25 nM usando 1 pl/ml de reactivo de transfección con citofectina (Genlantis, San Diego, Cat. T610001). Las células se incubaron durante 4 horas a 37°C y 5% de CO2, antes de reemplazar el medio con medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 20% de FBS libre de tetraciclina y 2% de penicilina/estreptomicina y 1% de anfotericina B. Veinticuatro horas después de la transfección, las células se fijaron en PFA al 4%. Las células se hibridaron inmediatamente con la sonda, como se describe en el Ejemplo 1.

[0184] Los resultados se presentan en la Fig. 1. ASO-2 es ISIS 577065 y ASO-4 es ISIS 576816. El tratamiento con ISIS 577065 e ISIS 576816, los cuales reducen los focos de sentido C9ORF72, no redujo la frecuencia de los focos de antisentido C9ORF72, lo que indica que los focos de antisentido C9ORF72 son independientes de los focos de sentido C9ORF72.

Ejemplo 3: Análisis de perfil de ARN de todo el genoma relacionado con la expansión de C9ORF72 en pacientes con fibroblastos

[0185] Una firma de ARN de genoma completo se definió en fibroblastos con una expansión C9ORF72. Una estrategia de secuenciación de ARN a lo largo del genoma, análisis multiplexado de secuencias ligadas a PoliA (MAPS), que recientemente se ha desarrollado para medir los niveles de expresión génica en un gran número de muestras (Fox-Walsh, K. et al, Genomics. 98: 266-71) fue utilizado. Se determinaron los perfiles de ARN correspondientes en los fibroblastos C9ORF72 y las líneas de control después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido dirigidos al transcrito del sentido C9ORF72.

[0186] Las bibliotecas de MAPS se generaron usando ARN extraído con Trizol (Invitrogen) de fibroblastos humanos con la técnica descrita en Fox-Walsh et al. Las bibliotecas se secuenciaron en un secuenciador Illumina HiSeq-2000 utilizando índices para cada muestra para multiplexar 12 muestras por línea. Las lecturas de secuencia se asignaron al genoma humano (versión hgl9) utilizando el software Bowtie. Se determinó el número de lecturas para cada gen y se analizó la expresión diferencial utilizando el software edgeR.

[0187] Los resultados para los cambios en la expresión de ARN después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido se presentan en la Tabla 7. Los datos indican que solo seis cambios en la expresión acompañaron al tratamiento con oligonucleótidos antisentido (definido por la tasa de descubrimiento falso [FDR] <0,05). El tratamiento con oligonucleótidos antisentido dirigido a un transcrito de sentido C9ORF72 en pacientes con fibroblastos no alteró significativamente los perfiles de expresión génica. Este resultado puede deberse a la identificación de los focos antisentido C9ORF72, que no son la diana de los oligonucleótidos antisentido que se dirigen al transcrito de sentido.

Tabla 7

Ejemplo 4: Inhibición antisentido del transcrito antisentido C9ORF72

[0188] Los oligonucleótidos antisentido dirigidos al transcrito antisentido C9ORF72 se analizaron para determinar sus efectos sobre la expresión del transcrito antisentido C9ORF72 in vitro. Las células HepG2 cultivadas se transfectaron con oligonucleótido antisentido 50 nM o agua para los controles no transfectados. El ARN total se aisló de las células 24 horas después de la transfección con TRIzol (Life Technologies) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se realizaron dos reacciones de ADNasa, una en la columna durante la purificación del ARN y otra después de la purificación utilizando una ADNasa de grado de amplificación. El ARN aislado se transcribió de manera inversa para generar ADNc a partir del transcrito antisentido C9ORF72 utilizando un cebador complementario a la diana.

[0189] Se completaron dos etapas de amplificación por PCR para el ADNc antisentido C9ORF72. La primera amplificación por PCR se completó utilizando un cebador delantero externo y un cebador inverso. El producto de PCR de la primera amplificación por PCR se sometió a una PCR anidada utilizando un cebador directo anidado y el mismo cebador inverso utilizado en la primera amplificación por PCR. Se realizó una amplificación por PCR de GAPDH con el cebador directo GTc Aa CGGATTTGGTCGTATTG (SEQ ID NO: 14) y el cebador inverso TGGAAGATGGTGATGGGATTT (SEQ ID NO: 15). El ADNc amplificado se cargó luego en geles de acrilamida al 5% y se tiñó con bromuro de etidio. El análisis de densitometría se realizó con el software Gel Logic 200 y Kodak MI (Kodak Scientific Imaging Systems, Rochester, NY, EE.UU.). Se midieron las intensidades medias de las regiones de interés (ROI) que correspondían al ADNc antisentido C9ORF72 y las bandas de ADNc de GAPDH. La intensidad de cada banda de ADNc antisentido C9ORF72 se normalizó a su correspondiente banda de ADNc de GAPDH. Estos valores normalizados para la expresión de transcrito antisentido de C9ORF72 para células tratadas con oligonucleótido antisentido se compararon con los valores normalizados para la expresión de transcrito antisentido de C9ORF72 en un control no transfectado que se realizó en el mismo gel. Los valores finales para las intensidades de banda obtenidos se utilizaron para calcular el % de inhibición.

[0190] ISIS N° 141923 es un control negativo que no coincide con la diana. Aunque ISIS N° 141923 es un control negativo en el hecho de que no coincide con la diana, no representa necesariamente una línea de base para comparar los ASO C9ORF72 que apuntan al transcrito antisentido porque causa la reducción del transcrito antisentido. ISIS N° 576816 es un control negativo que es complementario al transcrito de sentido C9ORF72. ISIS N° 576816 no causa actividad y representa una línea de base para comparar los ASO dirigidos al transcrito antisentido C9ORF72. Las ASO A y B están dirigidas a una secuencia de transcripción supuestamente antisentido (designada en este documento como SEQ ID NO: 11). La SEQ ID NO: 11 es una secuencia que es complementaria a los nucleótidos 1159 a 1734 de la SEQ ID NO: 2 (el complemento del N° de registro GENBANK NT_008413,18 truncado de los nucleótidos 27535000 a 27565000). Los cinco oligonucleótidos son 5-10-5 gapmers, 20 nucleósidos de longitud, en donde el segmento de brecha central comprende diez 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprende cinco nucleósidos cada uno. Cada nucleósido en el segmento del ala 5' y cada nucleósido en el segmento del ala 3' tiene una modificación 2'-MOE. Los enlaces internucleosídicos a lo largo de cada gapmer son enlaces fosforotioato. Todos los residuos de citosina a lo largo de cada gapmer son 5-metilcitosinas.

[0191] Los controles negativos de los números ISIS 141923 y 576816 lograron una inhibición del 27% y del 0% en relación con el control no transfectado, respectivamente. ASO A logró un 62% de inhibición y ASO B logró un 58% de inhibición.

Ejemplo 5: Inhibición y tolerabilidad de roedores in vivo con el tratamiento de oligonucleótidos antisentido C9ORF72

[0192] Para evaluar la tolerabilidad de la inhibición de la expresión de C9ORF72 in vivo, se diseñaron y evaluaron oligonucleótidos antisentido dirigidos a un ácido nucleico murino C9ORF72 en modelos de ratón y rata.

[0193] El ISIS 571883 (SEQ ID NO: 18) se diseñó como un espaciador de 5-10-5 MOE, con una longitud de 20 nucleósidos, en el que el segmento de brecha central comprende diez 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en el extremo 5' y en el extremo 3' que comprende cinco nucleósidos cada uno. Cada nucleósido en el segmento del ala 5' y cada nucleósido en el segmento del ala 3' tiene una modificación de MOE. Los enlaces internucleosídicos son enlaces fosforotioato. Todos los residuos de citosina en todo el gapmer son 5-metilcitosinas. ISIS 571883 tiene un sitio de inicio diana del nucleósido 33704 en la secuencia genómica C9ORF72 murina, designada en este documento como SEQ ID NO: 12 (el complemento del N° de acceso GENBANK NT_166289,1 truncado de los nucleósidos 3587000 a 3625000).

[0194] ISIS 603538 fue diseñado como un espaciador de 5-10-5 MOE, con 20 nucleósidos de longitud, en donde el segmento de brecha central comprende diez 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en el extremo 5' y en el extremo 3' compuesto por cinco nucleósidos cada uno. Cada nucleósido en el segmento del ala 5' y cada nucleósido en el segmento del ala 3' tiene una modificación de MOE. Los enlaces internucleosídicos son enlaces fosforotioato o enlaces éster fosfato (Gs Ao Co Co Gs Cs Ts Ts Gs As Gs Ts Ts Ts Gs Co Co Ao Cs A (SEQ ID NO: 19); en donde 's' denota un enlace internucleósido fosforotioato 'o' denota un enlace éster de fosfato y A, G, C, T denota los nucleósidos relevantes). Todos los residuos de citosina en todo el gapmer son 5-metilcitosinas. ISIS 603538 tiene un sitio de inicio diana del nucleósido 2872 en la secuencia de ARNm de C9ORF72, designada en este documento como SEQ ID NO: 13 (N° de acceso GENBANK NM_001007702,1).

Experimento del ratón 1

[0195] Se inyectaron grupos de 4 ratones C57BL/6 con 50 |jg, 100 |jg, 300 |jg, 500 |jg o 700 |jg de ISIS 571883 administrados mediante una inyección de bolos intracerebroventricular. Un grupo de control de cuatro ratones C57/BL6 se trató de manera similar con PBS. Los animales se anestesiaron con isofluorano al 3% y se colocaron en un marco estereotáctico. Después de esterilizar el sitio quirúrgico, a cada ratón se le inyectó anterio-posterior de -0,2 mm del bregma y dorsoventral de 3 mm al bregma con las dosis mencionadas anteriormente de ISIS 571883 usando una jeringa Hamilton. La incisión se cerró con suturas. Se dejó que los ratones se recuperaran durante 14 días, después de lo cual los animales se sacrificaron según un protocolo humanitario aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales. El tejido del cerebro y la médula espinal se recogieron y se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido. Antes de la congelación, el tejido cerebral se cortó transversalmente en cinco secciones utilizando una matriz cerebral de ratón.

Análisis de ARN

[0196] El ARN se extrajo de una sección cerebral de 2-3 mm posterior al sitio de inyección, de la corteza frontal cerebral y de la sección lumbar del tejido de la médula espinal para el análisis de la expresión del ARNm de C9ORF72. La expresión del ARNm de C9ORF72 se midió mediante RT-PCR. Los datos se presentan en la Tabla 8. Los resultados indican que el tratamiento con dosis crecientes de ISIS 571883 dio como resultado una inhibición dependiente de la dosis de la expresión del ARNm de C9ORF72.

[0197] También se evaluó la inducción del marcador microglial AIF-1 como una medida de la toxicidad del SNC. Los datos se presentan en la Tabla 9. Los resultados indican que el tratamiento con dosis crecientes de ISIS 571883 no produjo aumentos significativos en la expresión del ARNm de AIF-1. Por lo tanto, la inyección de ISIS 571883 se consideró tolerable en este modelo.

Tabla 8

Tabla 9

Experimento del ratón 2

[0198] Los grupos de 4 ratones C57BL/6 fueron inyectados con 500 jig de ISIS 571883 administrados a través de una inyección de bolus intracerebroventricular en un procedimiento similar al descrito anteriormente. Un grupo de control de cuatro ratones C57/BL6 se trató de manera similar con PBS. Los ratones se probaron en puntos de tiempo regulares después de la administración de ICV.

Análisis de comportamiento

[0199] Se emplearon dos ensayos estándar para evaluar el comportamiento motor; el ensayo rotarod y el ensayo de fuerza de agarre. En el caso de los ensayos rotarod, se midió el tiempo de latencia para caer. Los datos para los ensayos se presentan en las Tablas 10 y 11. Los resultados indican que no hubo cambios significativos en el comportamiento motor de los ratones como resultado de la inhibición antisentido de ISIS 571883 o debido a la inyección de ICV. Por lo tanto, la inhibición antisentido de C9ORF72 se consideró tolerable en este modelo.

Tabla 10

Experimento de rata

[0200] Se inyectaron grupos de 4 ratas Sprague-Dawley con 700 |jg, 1.000 |jg o 3.000 |jg de ISIS 603538 administrados mediante una inyección de bolos intratecal. Un grupo de control de cuatro ratas Sprague-Dawley se trató de manera similar con PBS. Los animales se anestesiaron con isofluorano al 3% y se colocaron en un marco estereotáctico. Después de esterilizar el sitio quirúrgico, a cada rata se le inyectó 30 j l de solución de ASO administrada a través de un catéter intratecal de 8 cm en el canal espinal con una descarga de 50 jl. Se dejó que las ratas se recuperaran durante 4 semanas, después de lo cual los animales se sacrificaron según un protocolo humanitario aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales.

Análisis de ARN

[0201] El ARN se extrajo de una sección cerebral de 2-3 mm posterior a la inyección, del córtex frontal cerebral y de las secciones cervical y lumbar del tejido medular para el análisis de la expresión del ARNm C9ORF72. La expresión del ARNm de C9ORF72 se midió mediante RT-PCr . Los datos se presentan en la Tabla 12. Los resultados indican que el tratamiento con dosis crecientes de ISIS 603538 dio como resultado una inhibición dependiente de la dosis de la expresión del ARNm de C9ORF72.

[0202] También se evaluó la inducción del marcador microglial AIF-1 como una medida de la toxicidad del SNC. Los datos se presentan en la Tabla 13. Los resultados indican que el tratamiento con dosis crecientes de ISIS 603538 no produjo aumentos significativos en la expresión de ARNm de AIF-1. Por lo tanto, la inyección de ISIS 603538 se consideró tolerable en este modelo.

Tabla 12

Tabla 13

Análisis de peso corporal

[0203] Los pesos corporales de las ratas se midieron a intervalos de puntos de tiempo regulares. Los datos se presentan en la Tabla 14. Los resultados indican que el tratamiento con dosis crecientes de ISIS 603538 no tuvo ningún cambio significativo en el peso corporal de las ratas.

Tabla 14

Ejemplo 6: Cribados de respuesta a la dosis de oligonucleótidos antisentido que se dirigen al transcrito de sentido C9ORF72 humano en dos líneas de fibroblastos de pacientes

[0204] Se analizaron dos líneas celulares de fibroblastos diferentes de pacientes humanos (F09-152 y F09-229) con oligonucleótidos antisentido que se dirigen al transcrito de secuencia C9ORF72 antes del exón 1B; es decir, oligonucleótidos antisentido que se dirigen a la expansión de repetición del hexanucleótido que contiene transcritos y oligonucleótidos antisentido que se dirigen aguas abajo del exón 1. Los sitios de inicio y parada diana y las regiones diana con respecto a las SEQ ID NO:1 y 2 para cada oligonucleótido se proporcionan en la Tabla 15. ISIS 577061 e ISIS 577065 apuntan a C9ORF72 aguas arriba del exón 1B y justo aguas arriba de la repetición del hexanucleótido. El resto de los oligonucleótidos ISIS de la Tabla 24 apuntan a C9ORF72 aguas abajo del exón 1B y la repetición del hexanucleótido.

Tabla 15

[0205] Las células se sembraron en placas a una densidad de 20.000 células por pocilio y se transfectaron usando electroporación con concentraciones de 246,9 nM, 740,7 nM, 2.222,2 nM, 6.666,7 nM y 20.000,0 nM de oligonudeótido antisentido. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de C9ORF72 mediante p Cr cuantitativa en tiempo real. Se utilizaron dos conjuntos de sondas de cebador: (1) el conjunto de sondas de cebador C9ORF72 humano RTS3750, que mide los niveles totales de ARNm, y (2) RTS3905, que se dirige a la expansión de repetición del hexanucleótido, que mide solo los transcritos de ARNm que contienen la expansión de repetición del hexanucleótido. Los niveles de ARNm de C9ORF72 se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de C9ORF72, en relación con las células de control no tratadas.

[0206] Como se ilustra en la Tabla 16, a continuación, los dos oligonucleótidos que se dirigen en sentido ascendente al exón 1B y, por lo tanto, los transcritos de ARNm diana que contienen la expansión de repetición del hexanucleótido (ISIS 577061 e ISIS 577065), no inhiben los niveles totales de ARNm de C9ORF72 (como medido por RTS3750), así como ISIS 576974, 576816 y 577083, que se dirigen aguas abajo del exón 1B y, por lo tanto, no se dirigen al transcrito de ARNm que contiene la expansión de repetición del hexanucleótido. Los niveles de expresión del transcrito de ARNm de C9ORF72 que contiene la expansión de repetición del hexanucleótido son bajos (aproximadamente el 10% del total de los productos de expresión de C9ORF72), por lo tanto, los oligonucleótidos que apuntan al transcrito de ARNm que contiene la expansión de repetición del hexanucleótido no inhiben de manera sólida el ARNm de C9ORF72 total (según lo medido por RTS3905)), como se ha sugerido en la Tabla 16 a continuación. Por lo tanto, ISIS 577061 e ISIS 577065 inhiben preferentemente la expresión de transcritos de ARNm que contienen la expansión de repetición de hexanucleótidos.

Tabla 16

Tabla 18

Tabla 19

Ejemplo 7: Direccionamiento de focos de ARN antisentido con oligonucleótidos antisentido

[0207] ASO C, ASO D y ASO E se probaron en células HepG2 para determinar su potencia en la selección del transcrito antisentido C9ORF72. Los oligonucleótidos ISIS se probaron posteriormente en fibroblastos C9-5 para la reducción de los focos antisentido. ASO C, ASO D y ASO E se dirigen a una secuencia de transcripción supuestamente antisentido (designada en este documento como SEQ ID NO: 11). ASO C, ASO D y ASO E son separadores de 5-10­ 5, con 20 nucleósidos de longitud, en donde el segmento central de la brecha se compone de diez 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y en la dirección 3' que comprende cinco nucleósidos cada uno. Cada nucleósido en el segmento del ala 5' y cada nucleósido en el segmento del ala 3' tiene una modificación 2'-MOE. Los enlaces internucleosídicos a lo largo de cada gapmer son enlaces fosforotioato. Todos los residuos de citosina a lo largo de cada gapmer son 5-metilcitosinas.

Pruebas en células HepG2

[0208] Las células HepG2 cultivadas se transfectaron con oligonucleótido antisentido 50 nM o agua para los controles no transfectados. El ARN total se aisló de las células 24 horas después de la transfección con TRIzol (Life Technologies) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se realizaron dos reacciones de ADNasa, una en la columna durante la purificación del ARN y otra después de la purificación utilizando una ADNasa de grado de amplificación. El ARN aislado se transcribió de manera inversa para generar ADNc a partir del transcrito antisentido C9ORF72 utilizando un cebador complementario a la diana.

[0209] Se completaron dos etapas de amplificación por PCR para el ADNc antisentido C9ORF72. La primera amplificación por PCR se completó utilizando un cebador delantero externo y un cebador inverso. El producto de PCR de la primera amplificación por PCR se sometió a una PCR anidada utilizando un cebador directo anidado y el mismo cebador inverso utilizado en la primera amplificación por PCR. Se realizó una amplificación por PCR de GAPDH con el cebador directo GTc Aa CGGATTTGGTCGTATTG (SEQ ID NO: 14) y el cebador inverso TGGAAGATGGTGATGGGATTT (SEQ ID NO: 15). El ADNc amplificado se cargó luego en geles de acrilamida al 5% y se tiñó con bromuro de etidio. El análisis de densitometría se realizó con el software Gel Logic 200 y Kodak MI (Kodak Scientific Imaging Systems, Rochester, NY, EE.UU.). Se midieron las intensidades medias de las regiones de interés (ROI) que correspondían al ADNc antisentido C9ORF72 y las bandas de ADNc de GAPDH. La intensidad de cada banda de ADNc antisentido C9ORF72 se normalizó a su correspondiente banda de ADNc de GAPDH. Estos valores normalizados para la expresión de transcrito antisentido de C9ORF72 para células tratadas con oligonucleótido antisentido se compararon con los valores normalizados para la expresión de transcrito antisentido de C9ORF72 en un control no transfectado que se realizó en el mismo gel. Los valores finales para las intensidades de banda obtenidos se utilizaron para calcular el % de inhibición. ASO C logró una inhibición del 91% de la expresión del transcrito antisentido de C9ORF72, la ASO D logró una inhibición del 87% de la expresión del transcrito antisentido de C9ORF72 y la ASO E logró una inhibición del 58% de la expresión del transcrito antisentido de C9ORF72.

Pruebas en fibroblastos de pacientes

[0210] Se visualizaron focos antisentido. Todas las etapas de hibridación se realizaron en condiciones libres de ARNasa. Los fibroblastos en placa se permeabilizaron en Triton X-100 al 0,2% (Sigma Aldrich n° t-8787) en PBS durante 10 minutos, se lavaron dos veces en PBS durante 5 minutos, se deshidrataron con etanol y luego se secaron al aire. Los portaobjetos se precalentaron en 400 pl de tampón de hibridación (50% de formamida desionizada, 2xSCC, 50 mM de fosfato de sodio, pH 7 y 10% de sulfato de dextrano) a 66°C durante 20-60 minutos bajo portaobjetos flotantes libres de ARNasa en una cámara humidificada con tampón de hibridación. Las sondas se diluyeron en tampón de hibridación (concentración final 40 nM), se desnaturalizaron a 80°C durante 5 minutos y se devolvieron inmediatamente al hielo durante 5 minutos. El tampón de incubación se reemplazó con la mezcla que contiene la sonda (400 pl por portaobjetos), y los portaobjetos se hibridaron bajo portaobjetos flotantes durante 12-16 horas en una cámara sellada y protegida contra la luz.

[0211] Después de la hibridación, los portaobjetos flotantes se retiraron y los portaobjetos se lavaron a temperatura ambiente en Tween-20/2X SCC al 0,1% durante 5 minutos antes de someterlos a tres lavados de 10 minutos de rigurosidad en 0,1xSCC a 65°C. Los portaobjetos se cubrieron con ProLong Gold con DAPI para su visualización.

[0212] La visualización primaria para la cuantificación y la obtención de imágenes de los focos se realizó con un aumento de 100X utilizando un sistema de microscopio confocal Nikon Eclipse Ti equipado con una diana de aceite Nikon CFI Apo TIRF 100X (NA 1,49).

[0213] La ASO C redujo los focos antisentido C9ORF72 en 1,8 veces en comparación con la ASO de control (de un promedio de 72 focos por 100 células contados un promedio de 39 focos por 104 células en el tratamiento con ASO), ASO D redujo los focos antisentido C9ORF72 en 5,8 veces (de un promedio de 72 focos por 100 células contados hasta un promedio de 13 focos por 104 células con el tratamiento de ASO), y ASO E redujo los focos antisentido de C9ORF72 en 1,4 veces (de un promedio de 72 focos por 100 células contados hasta un promedio de 52 focos por 100 células con el tratamiento con ASO).

Ejemplo 8: Orientación de los focos de ARN antisentido con oligonucleótidos antisentido

[0214] Se probaron ASO F y ASO G en fibroblastos C9-5 para la reducción de focos antisentido. Estos ASO están dirigidos a una secuencia de transcrito antisentido putativa (designada aquí como SEQ ID NO: 11) y tienen 5-10-5 gapmers, 20 nucleósidos de longitud, en donde el segmento de brecha central comprende diez 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cinco nucleósidos cada uno. Cada nucleósido en el segmento del ala 5' y cada nucleósido en el segmento del ala 3' tiene una modificación 2'-MOE. Los enlaces internucleosídicos a lo largo de cada gapmer son enlaces fosforotioato. Todos los residuos de citosina a lo largo de cada gapmer son 5-metilcitosinas.

Pruebas en células HepG2

[0215] Las células HepG2 cultivadas se transfectaron con oligonucleótido antisentido 50 nM o agua para los controles no transfectados. El ARN total se aisló de las células 24 horas después de la transfección con TRIzol (Life Technologies) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se realizaron dos reacciones de ADNasa, una en la columna durante la purificación del ARN y otra después de la purificación utilizando una ADNasa de grado de amplificación. El ARN aislado se transcribió de manera inversa para generar ADNc a partir del transcrito antisentido C9ORF72 utilizando un cebador complementario a la diana.

[0216] Se completaron dos etapas de amplificación por PCR para el ADNc antisentido C9ORF72. La primera amplificación por PCR se completó utilizando un cebador delantero externo y un cebador inverso. El producto de PCR de la primera amplificación por PCR se sometió a una PCR anidada utilizando un cebador directo anidado y el mismo cebador inverso utilizado en la primera amplificación por PCR. Se realizó una amplificación por PCR de GAPDH con el cebador directo GTc Aa CGGATTTGGTCGTATTG (SEQ ID NO: 14) y el cebador inverso TGGAAGATGGTGATGGGATTT (SEQ ID NO: 15). El ADNc amplificado se cargó luego en geles de acrilamida al 5% y se tiñó con bromuro de etidio. El análisis de densitometría se realizó con el software Gel Logic 200 y Kodak MI (Kodak Scientific Imaging Systems, Rochester, NY, EE.UU.). Se midieron las intensidades medias de las regiones de interés (ROI) que correspondían al ADNc antisentido C9ORF72 y las bandas de ADNc de GAPDH. La intensidad de cada banda de ADNc antisentido C9ORF72 se normalizó a su correspondiente banda de ADNc de GAPDH. Estos valores normalizados para la expresión de transcrito antisentido de C9ORF72 para células tratadas con oligonucleótido antisentido se compararon con los valores normalizados para la expresión de transcrito antisentido de C9ORF72 en un control no transfectado que se realizó en el mismo gel. Los valores finales para las intensidades de banda obtenidos se utilizaron para calcular el % de inhibición. ASO F logró una inhibición del 79% de la expresión de transcrito antisentido C9ORF72 y ASO G logró una inhibición del 50% de la expresión de transcrito antisentido C9ORF72.

Pruebas en fibroblastos de pacientes.

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste de 12 a 30 nucleósidos unidos, en donde el oligonucleótido modificado es al menos 90% complementario a un transcrito antisentido C9ORF72 que tiene la secuencia de nucleobases de la SEQ ID NO: 11, para uso en el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa, en donde el compuesto es capaz de reducir el porcentaje de células con focos antisentido C9ORF72 y/o reducir el número de focos antisentido C9ORF72 por célula en un animal que tiene focos.

2. El compuesto para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la secuencia de nucleobases del oligonucleótido modificado es 100% complementaria a una porción de igual longitud del transcrito antisentido C9ORF72 que tiene la secuencia de nucleobases de la SEQ ID NO: 11.

3. El compuesto para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la enfermedad está asociada con una expansión de repetición de hexnucleótido C9ORF72.

4. El compuesto para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que la enfermedad es cualquiera de esclerosis lateral amiotrófica (ALS), demencia frontotemporal (FTD), síndrome de degeneración cortical de base (CBD), síndrome Parkinsoniano atípico, o degeneración olivopontocerelar (OPCD).

5. El compuesto para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el oligonucleótido modificado es un oligonucleótido monocatenario.

6. El compuesto para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que:

a) al menos un enlace internucleósido del oligonucleótido modificado es un enlace internucleósido modificado; b) al menos un nucleósido del oligonucleótido modificado comprende una nucleobase modificada; y/o c) al menos un nucleósido del oligonucleótido modificado comprende un azúcar modificado.

7. El compuesto para su uso de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el enlace internucleósido modificado es un enlace internucleósido fosforotioato.

8. El compuesto para uso de acuerdo con la reivindicación 6, en el que la nucleobase modificada es una 5-metilcitosina.

9. El compuesto para su uso de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el oligonucleótido comprende al menos un nucleósido modificado que comprende un azúcar bicíclico.

10. El compuesto para uso de acuerdo con la reivindicación 9, en el que el azúcar bicíclico comprende un puente químico entre las posiciones 4' y 2' del azúcar.

11. El compuesto para uso de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el puente químico es

a) 4'-CH(R)-O-2' y en la que R es metilo;

b) 4'-CH(R)-O-2' y en la que R es H; o

c) 4'-CH(R)-O-2' y en donde R es -CH2-O-CH3.

12. El compuesto para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que el oligonucleótido comprende al menos un nucleósido modificado que comprende un grupo 2'-O-metoxietilo.

13. El compuesto para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en el que el oligonucleótido modificado de cadena sencilla comprende:

un segmento gapmer que consiste en desoxinucleósidos unidos;

un segmento del ala 5' que consta de nucleósidos unidos;

un segmento de ala 3' que consiste en nucleósidos unidos;

en donde el segmento de la brecha se coloca inmediatamente adyacente y entre el segmento del ala 5' y el segmento del ala 3' y en donde cada nucleósido de cada segmento del ala comprende un azúcar modificado.

14. El compuesto para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en el que el compuesto es un compuesto conjugado.