ES2926869T3 - Composiciones para modular la expresión de SOD-1 - Google Patents

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Tracy Cole
Holly Kordasiewicz
Susan Freier
Thomas Condon
Edward Wancewicz
Trisha Lockhart
Timothy Vickers
Priyam Singh
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Abstract

En el presente documento se describen compuestos antisentido y métodos para disminuir la expresión de proteína y ARNm de SOD-1. Dichos métodos, compuestos y composiciones son útiles para tratar, prevenir o mejorar enfermedades, trastornos y afecciones asociados con SOD-1. Dichas enfermedades asociadas con SOD-1 incluyen la esclerosis amiotrófica (ALS). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones para modular la expresión de SOD-1
Lista de secuencias
La presente solicitud se deposita junto con una lista de secuencias en formato electrónico. La lista de secuencias se proporciona como un archivo titullado BIOL0240WOSEQ ST25.pdf creado el 30 de marzo de 2015, que tiene un tamaño de 320 Kb.
Campo
Se describen composiciones y procedimientos para reducir la expresión de ARNm de superóxido dismutasa 1 soluble (SOD-1) y proteína en un animal. Tales procedimientos son útiles para tratar, prevenir o mejorar enfermedades neurodegenerativas, incluida la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) al inhibir la expresión de SOD-1 en un animal.
Antecedentes
La enzima soluble SOD-1 (también conocida como Cu/Zn superóxido dismutasa) es una de las superóxido dismutasas que proporcionan defensa contra el daño oxidativo de las biomoléculas catalizando la dismutación de superóxido en peróxido de hidrógeno (H 202) (Fridovich, Annu. Rev. Biochem., 1995, 64, 97-112). El anión superóxido (02-) es un subproducto celular potencialmente dañino producido principalmente por errores de fosforilación oxidativa en las mitocondrias (Turrens, J. Physiol. 2003, 552, 335-344)
Las mutaciones en el gen SOD-1 están asociadas con una forma hereditaria dominante de esclerosis lateral amiotrófica (ELA, también conocida como enfermedad de Lou Gehrig), un trastorno caracterizado por una degeneración selectiva de las neuronas motoras superiores e inferiores (Rowland, N. Engl. J. Med. 2001,344, 1688-1700). Existe un estrecho vínculo genético entre la ELA familiar y las mutaciones sin sentido en el gen SOD1 (Rosen, Nature, 1993, 362, 59-62). Se cree que la toxicidad de la SOD1 mutante surge de un plegamiento incorrecto inicial (ganancia de función) que reduce la protección nuclear de la enzima activa (pérdida de función en los núcleos), un procedimiento que puede estar involucrado en la patogénesis de la ELA (Sau, Hum. Mol. Genet. 2007, 16, 1604-1618).
La ELA es una enfermedad neurodegenerativa progresiva devastadora que afecta a hasta 30.000 estadounidenses en un momento dado. La degeneración progresiva de las neuronas motoras en la ELA con el tiempo conduce a su muerte. Cuando las neuronas motoras mueren, se pierde la capacidad del cerebro para iniciar y controlar el movimiento muscular. Con la acción muscular voluntaria afectada progresivamente, los pacientes en las últimas etapas de la enfermedad pueden quedar totalmente paralizados.
Actualmente no existen opciones aceptables para tratar tales enfermedades neurodegenerativas. Por lo tanto, es un objetivo en esta invención proporcionar compuestos y composiciones para su uso en el tratamiento de tales enfermedades.
El documento WO 2009/102427 se refiere a construcciones de ARNi modificadas con actividad biológica óptima, toxicidad, estabilidad y especificidad de genes diana y usos de las mismas.
El documento WO 2006/066203 se refiere a moléculas de ARN interferente pequeño (siRNA) bicatenarias para modular un gen SOD en sujetos con trastornos neurológicos.
El documento US 2009/130195 se refiere a procedimientos para tratar el cáncer de próstata utilizando compuestos que comprenden pequeñas moléculas de siRNA para inhibir la expresión de PKC.
Resumen de la invención
La presente invención proporciona un compuesto antisentido según la siguiente fórmula:
mCes Aeo Ges Geo Aes Tds Ads mCds Ads Tds Tds Tds mCds Tds Ads mCeo Aes Geo mCes Te (secuencia de nucleobases de la SEQ ID NO:725)
donde,
A = una adenina,
mC = una 5-metilcitosina,
G = una guanina,
T = una timina,
e = un azúcar modificado con 2'-0-metoxietilrribosa,
d = un azúcar 2'-desoxirribosa,
s = un enlace internucleosídico fosforotioato y
o = un enlace internucleosídico fosfodiéster;
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Para su uso en terapia, donde dicho uso comprende la administración intratecal del compuesto antisentido o del sal farmacéuticamente aceptable del mismo
La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende, un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable o portador, y un compuesto de la siguiente estructura
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Resumen de la descripción
En esta invención se describen procedimientos, compuestos y composiciones para modular la expresión de ARNm de superóxido dismutasa 1 soluble (SOD-1) y proteína. En determinados aspectos, los compuestos útiles para modular la expresión de proteína y ARNm de SOD-1 son compuestos antisentido. En determinados aspectos, los compuestos antisentido son oligonucleótidos modificados.
En determinados aspectos, la modulación puede producirse en una célula o tejido. En determinados aspectos, la célula o el tejido está en un animal. En determinados aspectos, el animal es un ser humano. En determinados aspectos, se reducen los niveles de ARNm de SOD-1. En determinados aspectos, se reducen los niveles de proteína de SOD-1. Tal reducción puede producirse de una forma dependiente del tiempo o de una forma dependiente de la dosis.
También se describen procedimientos, compuestos y composiciones útiles para prevenir, tratar y mejorar enfermedades, trastornos y afecciones. En determinados aspectos, tales enfermedades, trastornos y afecciones relacionados con SOD-1 son enfermedades neurodegenerativas. En determinados aspectos, tales enfermedades, trastornos y afecciones neurodegenerativas incluyen la esclerosis lateral amiotrófica (ELA). Tales enfermedades, trastornos y afecciones pueden tener uno o más factores de riesgo, causas o resultados en común. Determinados factores de riesgo y causas para el desarrollo de ELA incluyen envejecer, tener antecedentes personales o familiares, o predisposición genética. Sin embargo, la mayoría de los casos de ELA son esporádicos y no se conocen factores de riesgo conocidos. Determinados síntomas y resultados asociados con el desarrollo de ELA Incluyen, pero no se limitan a: fasciculaciones, calambres, músculos tensos y rígidos (espastlcldad), debilidad muscular que afecta a un brazo o una pierna, dificultad para hablar y para respirar, dificultad para caminar, dificultad para masticar o tragar (dlsfagla), dificultad para hablar o formar palabras (dlsartrla), debilidad o atrofia, espastlcldad, reflejos exagerados (hlperreflexla) y presencia del signo de Babinski. A medida que progresa la ELA, los síntomas y los resultados Incluyen debilitamiento de otras extremidades, tal vez acompañado de espasmos, calambres musculares y reflejos exagerados y más rápidos; problemas para masticar, tragar y respirar; puede producirse babeo; parálisis eventual; y muerte.
En determinados aspectos, los procedimientos de tratamiento Incluyen administrar un compuesto antlsentldo de SOD-1 a un individuo que lo necesite. En determinados aspectos, los procedimientos de tratamiento Incluyen administrar un ollgonucleótldo modificado con SOD-1 a un individuo que lo necesite.
Descripción detallada
Debe entenderse que tanto la descripción general anterior como la descripción detallada siguiente son meramente ejemplares y explicativas y no son restrictivas de la Invención, tal y como se reivindica. En esta Invención, el uso del singular Incluye el plural, a menos que se Indique específicamente lo contrario. Como se usa en esta Invención, el uso de "o" significa "y/o" a menos que se Indique lo contrarío. Además, como se usa en esta Invención, el uso de "y" significa "y/o" a menos que se Indique lo contrarío. Además, el uso del término "que incluye", así como otras formas, tales como "incluye" e "incluido", no es limitante. Además, términos tales como "elemento" o "componente" abarcan ambos elementos y componentes que comprenden una unidad y elementos y componentes que comprenden más de una subunidad, salvo que se indique específicamente lo contrario. Además, todas las secuencias descritas en esta Invención se enumeran 5' a 3', a menos que se Indique lo contrarío.
Los encabezados de sección utilizados en esta Invención son solo para fines organizativos y no deben interpretarse como limitantes de la materia objeto descrita.
Definiciones
A menos que se proporcionen definiciones específicas, la nomenclatura utilizada en relación con, y los procedimientos y técnicas de, química analítica, química orgánica sintética y química medicinal y farmacéutica descritas en esta Invención, son las que se conocen y se utilizan comúnmente en la técnica. Se pueden usar técnicas estándar para la síntesis química y el análisis químico.
A menos que se Indique lo contrarío, los siguientes términos tienen los siguientes significados:
"2-desoxlnucleósldo" (también 2'-desoxlrrlbonucleós¡do) significa un nucleósldo que comprende un resto de azúcar 2'-H furanosllo, tal como se encuentra en los desoxlrrlbonucleósldos de origen natural (ADN). En determinados aspectos, un 2'-desoxlnucleósldo puede comprender una nucleobase modificada o puede comprender una nucleobase de ARN (por ejemplo, uracilo).
"Azúcar 2'-desoxlrrlbosa" significa un resto de azúcar 2'-H furanosllo, como se encuentra en los ácidos desoxlrrlbonuclelcos de origen natural (ADN).
"2'-0-metoxietilo" (también 2-MOE, 2'-OCH2CH2-OCH3 y MOE y 2'-0-metoxietilrribosa) se refiere a una modificación 0-metoxletllo de la posición 2' de un anillo de furanosa. Un azúcar modificado con 2 '-0-metoxietilrribosa es un azúcar modificado.
"Nucleósldo modificado con 2'-0-metoxietilrribosa" (también "nucleósldo 2'-MOE") significa un nucleósldo que comprende un resto de azúcar modificado con 2'-MOE.o.
"Nucleósldo sustituido en 2"" significa un nucleósldo que comprende un sustltuyente en la posición 2' del anillo de furanosa distinto de H u OH. En determinados aspectos, los nucleósidos sustituidos en 2' incluyen nucleósldos con modificaciones de azúcar blcícllcas.
"5-metilcitosina" significa una cltoslna modificada con un grupo metilo unido a la posición 5. Una 5-metllcltoslna es una nucleobase modificada.
"Aproximadamente" significa dentro de ±10 % de un valor. Por ejemplo, si se afirma que "los compuestos afectaron al menos aproximadamente el 50 % de la Inhibición de SOD-1", se Implica que los niveles de SOD-1 se inhiben en un intervalo de 45 % y 55 %. "Administrado de forma concomitante" se refiere a la administración conjunta de dos agentes farmacéuticos de cualquier forma en la que los efectos farmacológicos de ambos se manifiesten en el paciente al mismo tiempo. La administración concomitante no requiere que ambos agentes farmacéuticos se administren en una única composición farmacéutica, en la misma forma de dosificación o por la misma vía de administración. No es necesario que los efectos de ambos agentes farmacéuticos se manifiesten al mismo tiempo. Solo es necesario que los efectos se superpongan durante un período de tiempo y no es necesario que sean coextensivos.
"Administrar" significa proporcionar un agente farmacéutico a un animal e incluye, pero no se limita a, la administración por parte de un profesional médico y la autoadministración.
"Mejoría" se refiere a disminuir, ralentizar, detener o revertir al menos un indicador de la gravedad de una afección o enfermedad. La gravedad de los indicadores puede determinarse a través de medidas subjetivas u objetivas que conocen los expertos en la materia.
"Animal" se refiere a un ser humano o a un animal no humano que incluye, pero no se limita a, ratones, ratas, conejos, perros, gatos, cerdos y primates no humanos, que incluyen, pero no se limita a, monos y chimpancés. "Anticuerpo" se refiere a una molécula caracterizada por reaccionar específicamente con un antígeno de alguna manera, donde el anticuerpo y el antígeno se definen cada uno en términos del otro. El anticuerpo puede referirse a una molécula de anticuerpo completa o cualquier fragmento o región de la misma, como la cadena pesada, la cadena ligera, la región Fab y la región Fe.
"Actividad antisentido" significa cualquier actividad detectable o medible que se pueda atribuir a la hibridación de un compuesto antisentido a su ácido nucleico diana. En determinados aspectos, la actividad antisentido es una disminución en la cantidad o la expresión de un ácido nucleico o proteína diana codificada por tal ácido nucleico diana.
"Compuesto antisentido" significa un compuesto oligomérico que es capaz de experimentar hibridación con un ácido nucleico diana a través de enlaces de hidrógeno. Los ejemplos de compuestos antisentido incluyen compuestos monocatenarios y bicatenarios, tales como oligonucleótidos antisentido, siRNA, shRNA, ssRNA y compuestos basados en la ocupación.
"Inhibición antisentido" significa la reducción de los niveles de ácido nucleico diana en presencia de un compuesto antisentido complementario a un ácido nucleico diana en comparación con los niveles de ácido nucleico diana en ausencia del compuesto antisentido.
Los "mecanismos antisentido" son todos aquellos mecanismos que involucran la hibridación de un compuesto con un ácido nucleico diana, donde el resultado o el efecto de la hibridación es la degradación diana o la ocupación diana con el estancamiento concomitante de la maquinaria celular que implica, por ejemplo, transcripción o splicing.
"Oligonucleótido antisentido" significa un oligonucleótido monocatenario que tiene una secuencia de nucleobases que permite la hibridación con un segmento correspondiente de un ácido nucleico diana.
"Complementariedad de base" se refiere a la capacidad para el apareamiento de bases preciso de nucleobases de un oligonucleótido con nucleobases correspondientes en un ácido nucleico diana (es decir, hibridación), y está mediada por Watson-Crick, Hoogsteen o la unión invertida de hidrógeno de Hoogsteen entre las nucleobases correspondientes.
"Azúcar bicíclico" significa un anillo de furanosa modificado mediante la unión a través de un puente de dos átomos. Un azúcar bicíclico es un azúcar modificado.
"Ácido nucleico bicíclico" o "BNA" (por su sigla en inglés) se refiere a un nucleósido o nucleótido donde la porción de furanosa del nucleósido o nucleótido incluye un puente que conecta dos átomos de carbono en el anillo de furanosa, formando así un sistema de anillo bicíclico.
"Estructura de casquete" o "resto de casquete terminal" significa modificaciones químicas que se han incorporado en cada extremo de un compuesto antisentido.
"cEt" o "etilo constreñido" o "azúcar modificado cEt" significa un nucleósido bicíclico que tiene un resto de azúcar que comprende un puente que conecta el carbono de la posición 4' y el carbono de la posición 2', donde el puente tiene la fórmula:4'-CH(CH3)-0-2'. Un azúcar modificado cEt es un azúcar modificado.
"Nucleósido modificado con cEt" significa un nucleósido bicíclico que tiene un resto de azúcar que comprende un puente que conecta el carbono de la posición 4' y el carbono de la posición 2', donde el puente tiene la fórmula:4'-CH(CH3)-0-2'. Un azúcar modificado cEt es un azúcar modificado.
"Región químicamente diferenciada" se refiere a una región de un compuesto antisentido que de alguna manera es químicamente diferente de otra región del mismo compuesto antisentido. Por ejemplo, una región que tiene nucleósidos 2'-0-metoxietilo está químicamente diferenciada de una región que tiene nucleótidos sin modificaciones 2’-0-metoxietilo.
"Compuestos antisentido quiméricos" significa un compuesto antisentido que tiene al menos dos regiones químicamente diferenciadas, teniendo cada posición una pluralidad de subunidades.
"Administración conjunta" significa la administración de dos o más agentes farmacéuticos a un individuo. Los dos o más agentes farmacéuticos pueden estar en una única composición farmacéutica o pueden estar en composiciones farmacéuticas separadas. Cada uno de los dos o más agentes farmacéuticos puede administrarse mediante la misma o diferentes vías de administración. La administración conjunta abarca la administración secuencial o en paralelo.
"Complementariedad" significa la capacidad de formar pares entre nucleobases de un primer ácido nucleico y un segundo ácido nucleico.
Se entenderá que "comprenden", "comprende" y "que comprende" implican la inclusión de una etapa o elemento o grupo de etapas o elementos indicado, pero no la exclusión de cualquier otra etapa o elemento o grupo de etapas o elementos.
"Nucleobases contiguas" significa nucleobases inmediatamente adyacentes entre sí.
"Que diseña" o "diseñado para" se refiere al procedimiento de diseño de un compuesto oligomérico que se hibrida, específicamente, con una molécula de ácido nucleico seleccionada.
"Diluyente" significa un ingrediente en una composición que carece de actividad farmacológica, pero es farmacéuticamente necesario o deseable. Por ejemplo, en los fármacos que se inyectan, el diluyente puede ser un líquido, por ejemplo, una solución salina.
"Dosis" significa una cantidad especificada de un agente farmacéutico que se proporciona en una única administración o en un período de tiempo especificado. En determinados aspectos, se puede administrar una dosis en uno, dos o más bolos, comprimidos o inyecciones. Por ejemplo, en determinados aspectos en que se desea la administración subcutánea, la dosis deseada requiere un volumen que no se ajusta fácilmente mediante una única inyección, por lo tanto, se pueden usar dos o más inyecciones para lograr la dosis deseada. En determinados aspectos, el agente farmacéutico se administra por infusión durante un período prolongado de tiempo o de forma continua. Las dosis se pueden indicar como la cantidad de agente farmacéutico por hora, día, semana o mes.
"Cantidad efectiva", en el contexto de modular una actividad o de tratar o prevenir una afección, significa la administración de aquella cantidad de agente farmacéutico a un sujeto que necesita dicha modulación, tratamiento o profilaxis, ya sea en una sola dosis o como parte de una serie, que es efectiva para la modulación de ese efecto o para el tratamiento o profilaxis o mejora de esa afección. La cantidad efectiva puede variar entre los individuos dependiendo de la salud y el estado físico del individuo a tratar, el grupo taxonómico de los individuos a tratar, la formulación de la composición, la evaluación de la afección médica del individuo y otros factores relevantes.
"Eficacia" significa la capacidad de producir un efecto deseado.
La "expresión" incluye todas las funciones mediante las cuales la información codificada de un gen se convierte en estructuras presentes y que funcionan en una célula. Tales estructuras incluyen, pero no se limitan a, los productos de la transcripción y la traducción.
"Totalmente complementario" o "100 % complementario" significa que cada nucleobase de un primer ácido nucleico tiene una nucleobase complementaria en un segundo ácido nucleico. En determinados aspectos, un primer ácido nucleico es un compuesto antisentido y un ácido nucleico diana es un segundo ácido nucleico. "Gapmero" significa un compuesto antisentido quimérico en el que una región interna que tiene una pluralidad de nucleósidos que admiten la escisión de RNasa H se coloca entre las regiones externas que tienen uno o más nucleósidos, donde los nucleósidos que comprenden la región interna están químicamente diferenciados del nucleósido o los nucleósidos que comprenden las regiones externas. La región interna puede denominarse "brecha" y las regiones externas pueden denominarse "alas".
"Estrechado por brecha" significa un compuesto antisentido quimérico que tiene un segmento de brecha de 9 o menos 2'-desoxirribonucleósidos contiguos ubicados entre los segmentos de ala 5’ y 3’ que tienen de 1 a 6 nucleósidos e inmediatamente adyacentes a los mismos.
"Ensanchado por brecha" significa un compuesto antisentido quimérico que tiene un segmento de brecha de 12 o más 2'-desoxirribonucleósidos contiguos ubicados entre los segmentos de ala 5' y 3' que tienen de 1 a 6 nucleósidos e inmediatamente adyacentes a los mismos.
"Hibridación" significa el recocido de las moléculas de ácido nucleico complementarias. En determinados aspectos, las moléculas de ácido nucleico complementarias incluyen, pero no se limitan a, un compuesto antisentido y un ácido nucleico diana. En determinados aspectos, las moléculas de ácido nucleico complementarias incluyen, pero no se limitan a, un oligonucleótido antisentido y un ácido nucleico diana. "Identificar un animal que tiene una enfermedad asociada a SOD-1" se refiere a identificar un animal que ha sido diagnosticado con una enfermedad asociada a SOD-1 o que está predispuesto a desarrollar una enfermedad asociada a SOD-1. Los individuos que están predispuestos a desarrollar una enfermedad asociada a SOD-1 incluyen aquellos que presentan uno o más factores de riesgo para desarrollar una enfermedad asociada a SOD-1, que incluyen envejecer, tener antecedentes personales o familiares o una predisposición genética de una o más enfermedades asociadas a SOD-1. Tal identificación puede lograrse mediante cualquier procedimiento que incluye la evaluación del historial médico de un individuo y evaluaciones o pruebas clínicas estándar.
"Inmediatamente adyacente" significa que no hay elementos intermedios entre los elementos inmediatamente adyacentes.
"Individuo" significa un animal no humano o humano seleccionado para el tratamiento o la terapia.
"Inhibir SOD-1" significa reducir el nivel o la expresión de una proteína y/o ARNm de SOD-1. En determinados aspectos, los niveles de proteína y/o ARNm de SOD-1 se inhiben en presencia de un compuesto antisentido que se dirige a SOD-1, que incluye un oligonucleótido modificado que se dirige a SOD-1, en comparación con la expresión de los niveles de proteína y/o ARNm de SOD-1 en ausencia de un compuesto antisentido de SOD-1, tal como un oligonucleótido modificado.
"Inhibir la expresión o actividad" se refiere a una reducción o bloqueo de la expresión o actividad y no necesariamente indica una eliminación total de la expresión o actividad.
"Enlace internucleosídico" se refiere a la unión química entre nucleósidos.
"Nucleósidos unidos" significa nucleósidos adyacentes unidos mediante un enlace internucleosídico.
"Desapareamiento" o "nucleobase no complementaria" se refiere al caso en el que una nucleobase de un primer ácido nucleico no puede aparearse con la nucleobase correspondiente de un segundo ácido nucleico o ácido nucleico diana.
"Cadena principal mixta" significa un patrón de enlaces internucleosídicos que incluye al menos dos enlaces internucleosídicos diferentes. Por ejemplo, un oligonucleótido con una cadena principal mixta puede incluir al menos un enlace fosfodiéster y al menos un enlace fosforotioato.
"Enlace internucleosídico modificado" se refiere a una sustitución o cualquier cambio de un enlace internucleosídico de origen natural (es decir, un enlace internucleosídico fosfodiéster).
"Nucleobase modificada" significa cualquier nucleobase distinta de adenina, citosina, guanina, timidina o uracilo. Una "nucleobase no modificada" significa las bases de purina adenina (A) y guanina (G), y las bases de pirimidina timina (T), citosina (C) y uracilo (U).
"Un nucleósido modificado" significa un nucleósido que tiene, independientemente, un resto de azúcar modificado y/o una nucleobase modificada.
"Nucleótido modificado" significa un nucleótido que tiene, independientemente, un resto de azúcar modificado, un enlace internucleosídico modificado y/o una nucleobase modificada.
"Oligonucleótido modificado" significa un oligonucleótido que comprende al menos un enlace internucleosídico modificado, un azúcar modificado y/o una nucleobase modificada.
"Azúcar modificado" significa la sustitución y/o cualquier cambio de un resto de azúcar natural.
"Monómero" significa una sola unidad de un oligómero. Los monómeros incluyen, pero no se limitan a, nucleósidos y nucleótidos, ya sean de origen natural o modificados.
"Motivo" significa el patrón de nucleósidos modificados y no modificados en un compuesto antisentido.
"Resto de azúcar natural" significa un resto de azúcar que se encuentra en el ADN (2'-H) o ARN (2'-OH). "Enlace internucleosídico de origen natural" significa un enlace fosfodiéster 3' a 5'.
"Nucleobase no complementaria" se refiere a un par de nucleobases que no forman enlaces de hidrógeno entre sí o admiten de otro modo la hibridación.
"Ácido nucleico" se refiere a moléculas compuestas por nucleótidos monoméricos. Un ácido nucleico incluye, pero no se limita a, ácidos ribonucleicos (ARN), ácidos desoxirribonucleicos (ADN), ácidos nucleicos monocatenarios, ácidos nucleicos bicatenarios, ácidos ribonucleicos interferentes pequeños (siRNA) y microARN (miARN).
"Nucleobase" significa un resto heterocíclico que puede aparearse con una base de otro ácido nucleico. "Complementariedad de nucleobases" se refiere a una nucleobase que puede realizar el apareamiento de bases con otra nucleobase. Por ejemplo, en el ADN, la adenina (A) es complementaria a la timina (T). Por ejemplo, en el ARN, la adenina (A) es complementaria al uracilo (U). En determinados aspectos, la nucleobase complementaria se refiere a una nucleobase de un compuesto antisentido que puede realizar el apareamiento de bases con una nucleobase de su ácido nucleico diana. Por ejemplo, si una nucleobase en una determinada posición de un compuesto antisentido es capaz de formar enlaces de hidrógeno con una nucleobase en una determinada posición de un ácido nucleico diana, entonces la posición de los enlaces de hidrógeno entre el oligonucleótido y el ácido nucleico diana se considera complementaria en ese par de nucleobases.
"Secuencia de nucleobases" significa el orden de nucleobases contiguas independientes de cualquier azúcar, enlace y/o modificación de nucleobases.
"Nucleósido" significa una nucleobase unida a un azúcar.
"Mimético de nucleósido" incluye aquellas estructuras usadas para reemplazar el azúcar o el azúcar y la base, y no necesariamente el enlace en una o más posiciones de un compuesto oligomérico, tal como, por ejemplo, miméticos de nucleósidos que tienen morfolino, ciclohexenilo, ciclohexilo, tetrahidropiranilo, miméticos de azúcar biciclos- y tricícliclos por ejemplo, unidades de azúcar diferentes a furanosa. El mimético de nucleótido incluye aquellas estructuras usadas para remplazar el nucleósido y el enlace en una o más posiciones de un compuesto oligomérico tal como, por ejemplo, ácidos nucleicos peptídicos o morfolinos (morfolinos unidos por -N (H )-C (=0)-0- u otro enlace diferente a fosfodiéster). El sustituto de azúcar se superpone con el término mimético de nucleósido ligeramente más amplio, pero se pretende que indique el reemplazo únicamente de la unidad de azúcar (anillo de furanosa). Los anillos de tetrahidropiranilo proporcionados en esta invención ilustran un ejemplo de un sustituto de azúcar, donde el grupo de azúcar de furanosa se ha reemplazado con un sistema de anillo de tetrahidropiranilo. "Mimético" se refiere a grupos que son sustituidos por un azúcar, una nucleobase, y/o un enlace internucleosídico. En general, un mimético se utiliza en lugar del azúcar o combinación de enlace internucleosídico-azúcar, y la nucleobase se mantiene para su hibridación a una diana seleccionada.
"Nucleótido" significa un nucleósido que tiene un grupo fosfato unido covalentemente a la porción de azúcar del nucleósido.
"Efecto fuera de la diana" se refiere a un efecto biológico no deseado o perjudicial asociado a la modulación de la expresión de ARN o proteína de un gen distinto del ácido nucleico diana deseado.
"Compuesto oligomérico" u "oligómero" significa un polímero de subunidades monoméricas unidas que se puede hibridar con al menos una región de una molécula de ácido nucleico.
"Oligonucleótido" significa un polímero de nucleósidos unidos, cada uno de los cuales puede ser modificado o no modificado, independiente uno del otro.
Según la invención, el compuesto antisentido o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en terapia se administra por vía intratecal.
"Péptido" significa una molécula formada mediante la unión de al menos dos aminoácidos a través de enlaces amida. Sin limitación, como se usa en esta invención, péptido se refiere a polipéptidos y proteínas.
"Agente farmacéutico" significa una sustancia que proporciona un beneficio terapéutico cuando se administra a un individuo. Por ejemplo, en determinados aspectos, un oligonucleótido modificado dirigido a SOD-1 es un agente farmacéutico.
"Composición farmacéutica" significa una mezcla de sustancias adecuadas para su administración a un sujeto.
Por ejemplo, una composición farmacéutica puede comprender un oligonucleótido modificado y una solución acuosa estéril.
"Derivado farmacéuticamente aceptable" abarca sales, conjugados, profármacos o isómeros farmacéuticamente aceptables de los compuestos descritos en esta invención.
"Sales farmacéuticamente aceptables" significa sales fisiológica y farmacéuticamente aceptables de compuestos antisentido, es decir, sales que conservan la actividad biológica deseada del oligonucleótido original y no transmiten efectos toxicológicos no deseados en el mismo.
"Enlace fosforotioato" significa un enlace entre nucleósidos donde la unión fosfodiéster se modifica remplazando uno de los átomos de oxígeno que no forman puentes con un átomo de azufre. Un enlace fosforotioato es un enlace internucleosídico modificado.
"Porción" significa una cantidad definida de nucleobases contiguas (es decir, unidas) de un ácido nucleico. En determinados aspectos, una porción es una cantidad definida de nucleobases contiguas de un ácido nucleico diana. En determinados aspectos, una porción es una cantidad definida de nucleobases contiguas de uncompuesto antisentido.
"Prevenir" o "que previene" rse refiere a retrasar o impedir la aparición o el desarrollo de una enfermedad, un trastorno o una afección durante un período de tiempo que va desde minutos a días, semanas a meses o indefinidamente.
"Profármaco" significa un agente terapéutico que está preparado en una forma inactiva que se convierte a una forma activa (es decir, fármaco) dentro del cuerpo o las células del mismo mediante la acción de enzimas endógenas y otros productos químicos y/o condiciones.
"Cantidad profilácticamente efectiva" se refiere a una cantidad de un agente farmacéutico que proporciona un beneficio profiláctico o preventivo a un animal.
"Región" se define como una porción del ácido nucleico diana que tiene al menos una estructura, función o característica identificable.
"Ribonucleótido" significa un nucleótido que tiene un hidroxi en la posición 2' en la porción de azúcar del nucleótido. Los ribonucleótidos pueden ser modificados con cualquiera de una variedad de sustituyentes. "Sales" significa sales fisiológica y farmacéuticamente aceptables de compuestos antisentido, es decir, sales que conservan la actividad biológica deseada del oligonucleótido original y no transmiten efectos toxicológicos no deseados en el mismo.
Los "segmentos" se definen como porciones más pequeñas o sub-porciones de regiones dentro de un ácido nucleico diana.
Las versiones "acortadas" o "truncadas" de oligonucleótidos SOD-1ght en esta invención tienen uno, dos o más nucleósidos eliminados.
"Efectos secundarios" significa las respuestas fisiológicas atribuibles a un tratamiento distinto de los efectos deseados. En determinados aspectos, los efectos secundarios incluyen, sin limitación, reacciones en el lugar de inyección, anomalías en las pruebas de función hepática, anomalías en la función renal, toxicidad hepática, toxicidad renal, anomalías en el sistema nervioso central y miopatías.
"Oligonucleótido monocatenario" significa un oligonucleótido que no está hibridado a una cadena complementaria.
Los "sitios", como se usan en esta invención, se definen como posiciones de nucleobases únicas dentro de un ácido nucleico diana. "Retrasa la progresión" significa una disminución en el desarrollo de la enfermedad. "SOD-1" significa el gen de mamífero superóxido dismutasa 1 soluble (SOD-1), incluido el gen humano superóxido dismutasa 1 soluble (SOD-1).
"Enfermedad asociada a SOD-1" significa cualquier enfermedad asociada a cualquier ácido nucleico de SOD-1 o producto de expresión del mismo. Tales enfermedades pueden incluir una enfermedad neurodegenerativa. Tales enfermedades neurodegenerativas pueden incluir la esclerosis lateral amiotrófica (ELA).
"ARNm de SOD-1" significa cualquier producto de expresión de ARN mensajero de una secuencia de ADN que codifica SOD-1.
"Ácido nucleico de SOD-1" significa cualquier ácido nucleico que codifica SOD-1. Por ejemplo, en determinados aspectos, un ácido nucleico de SOD-1 incluye una secuencia de ADN que codifica SOD-1, una secuencia de ARN transcrita a partir de ADN que codifica SOD-1 (inclusive ADN genómico que comprende intrones y exones) y una secuencia de ARNm que codifica SOD-1. "ARNm de SOD-1" significa un ARNm que codifica una proteína SOD-1.
"Proteína SOD-1" significa el producto de expresión de polipéptido de un ácido nucleico de SOD-1.
"Específicamente hibridable" se refiere a un compuesto antisentido que tiene un grado suficiente de complementariedad entre un oligonucleótido y un ácido nucleico diana para inducir un efecto deseado, a la vez que presenta efectos mínimos o ninguno en ácidos nucleicos diana en condiciones en las cuales se desea una unión específica, es decir en condiciones fisiológicas en el caso de ensayos in vivo y tratamientos terapéuticos. "Condiciones de hibridación rigurosas" o "condiciones rigurosas" se refieren a condiciones en las que un compuesto oligomérico se hibridará con su secuencia diana, pero con una cantidad mínima de otras secuencias.
"Sujeto" significa un animal humano o no humano seleccionado para el tratamiento o la terapia.
"Motivo de la química del azúcar" significa un patrón de modificaciones de azúcar que incluye al menos dos modificaciones de azúcar diferentes. Por ejemplo, un oligonucleótido con una cadena principal mixta puede incluir al menos un nucleósido modificado con 2'-0-metoxietilo, y/o un nucleósido modificado con cEt, y/o un 2'-desoxinucleósido.
"Diana" se refiere a una proteína, cuya modulación se desea.
"Gen diana" se refiere a un gen que codifica una diana.
"Que se dirige a" o "dirigido a " significa el procedimiento de diseñar y seleccionar un compuesto antisentido que se hibridará específicamente con un ácido nucleico diana e inducirá un efecto deseado.
"Ácido nucleico diana", "ARN diana" "transcripto de ARN diana" y "diana de ácido nucleico" significan todos un ácido nucleico al que se pueden dirigir compuestos antisentido.
"Región diana" significa una porción de un ácido nucleico diana al cual se dirigen uno o más compuestos anti sentido.
"Segmento diana" significa la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico diana al que se dirige un compuesto antisentido. "Sitio diana 5" se refiere al nucleótido más próximo a 5' de un segmento diana. "Sitio diana 3" se refiere al nucleótido más próximo a 3' de un segmento diana.
"Cantidad terapéuticamente efectiva" significa una cantidad de un agente farmacéutico que proporciona un beneficio terapéutico a un individuo.
"Tratar'’ o "que trata" o "tratamiento" se refiere a la administración de una composición para provocar una alteración o mejora de la enfermedad o afección.
"Nucleobases no modificadas" significa las bases de purina adenina (A) y guanina (G), y las bases de pirimidina timina (T), citosina (C) y uracilo (U).
"Nucleótido no modificado" significa un nucleótido compuesto de nucleobases de origen natural, restos de azúcar y enlaces internucleosídicos. En determinadoas aspectos, un nucleótido no modificado es un nucleótido de ARN (es decir, 3-D-ribonucleósidos) o un nucleótido de ADN (es decir, 3-D-desoxirribonucleósido).
"Segmento de ala" significa una pluralidad de nucleósidos modificados para transmitir propiedades a un oligonucleótido, tales como actividad inhibidora mejorada, mayor afinidad de unión por un ácido nucleico diana o resistencia a la degradación mediante nucleasas in vivo.
Determinados aspectos
Determinados aspectos en esta invención son procedimientos, compuestos y composiciones para inhibir la expresión de proteína y ARNm de SOD-1. Determinados aspectos en esta invención son procedimientos, compuestos y composiciones para disminuir los niveles de proteína y ARNm de SOD-1.
Determinados aspectos son compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de SOD-1. En determinados aspectos, el ácido nucleico de SOD-1 es la secuencia establecida en el n.° de acceso GENBANK NM 000454.4 (incorporado en esta invención como la SEQ ID NO:1), n.° de acceso GENBANK. N T 011512.10 truncado de los nucleótldos 18693000 a 18704000 (Incorporado en esta Invención como la SEQ ID NO:2), y el complemento de n.° de acceso GENBANK NW 001114168.1 truncado de los nucleótidos 2258000 a 2271000 (incorporado en esta Invención como la SEQ ID NO:3).
Determinados aspectos son procedimientos para el tratamiento, prevención o mejora de enfermedades, trastornos y afecciones asociados a SOD-1 en un Individuo que lo necesita. También se contemplan procedimientos para la preparación de un medicamento para el tratamiento, prevención o mejora de una enfermedad, trastorno o afección asociado a SOD-1. Las enfermedades, trastornos y afecciones asociados a SOD-1 Incluyen enfermedades neurodegenerativas. En determinados aspectos, las enfermedades asociadas a SOD-1 Incluyen la esclerosis lateral amlotróflca (ELA).
Un aspecto ejemplar es un compuesto que consiste en un ollgonucleótldo modificado según la siguiente fórmula:
mCes Aeo Ges Geo Aes Tds Ads mCds Ads Tds Tds Tds mCds Tds Ads mCeo Aes Geo mCes Te (secuencia de nucleobase de SEQ ID NO: 725)
donde,
A = una adenlna,
mC = una 5-metilcitosina,
G = una guanina,
T = una timina,
e = un azúcar modificado con 2'-0-metoxietilrribosa,
d = un azúcar 2'-desoxlrrlbosa,
s = un enlace internucleosídico fosforotioato y
o = un enlace Internucleosídico fosfodléster.
Otro aspecto ejemplar es una composición que comprende el compuesto o la sal del mismo y al menos uno de un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. Otro aspecto ejemplar es el uso del compuesto o composición para la fabricación de un medicamento para tratar un trastorno neurodegenerativo. Por lo tanto, un aspecto ejemplar es el uso del compuesto o composición para la fabricación de un medicamento para tratar la ELA.
Compuestos antisentido
Los compuestos ollgomérlcos Incluyen, pero no se limitan a, ollgonucleótldos, oligonucleósidos, análogos de ollgonucleótldos, miméticos de ollgonucleótldos, compuestos antlsentldo, ollgonucleótldos antlsentldo, oligonucleótidos modificados y siRNA. Un compuesto oligomérico puede ser "antisentido" con respecto a un ácido nucleico diana, lo cual significa que puede experimentar hibridación con un ácido nucleico diana a través de un enlace de hidrógeno.
En determinados aspectos, un compuesto antlsentldo tiene una secuencia de nucleobases que, cuando se escribe en el sentido de 5' a 3', comprende el complemento Inverso del segmento diana de un ácido nucleico diana al que se dirige. En algunos de tales aspectos, un ollgonucleótldo tiene una secuencia de nucleobases que, cuando se escribe en el sentido de 5' a 3', comprende el complemento Inverso del segmento diana de un ácido nucleico diana al que se dirige.
En determinados aspectos, un compuesto antlsentldo dirigido a un ácido nucleico de SOD-1 tiene una longitud de 12 a 30 subunldades. En determinados aspectos, un compuesto antlsentldo dirigido a un ácido nucleico de SOD-1 tiene una longitud de 12 a 25 subunldades. En determinados aspectos, un compuesto antlsentldo dirigido a un ácido nucleico de SOD-1 tiene una longitud de 12 a 22 subunldades. En determinados aspectos, un compuesto antlsentldo dirigido a un ácido nucleico de SOD-1 tiene una longitud de 14 a 20 subunldades. En determinados aspectos, un compuesto antlsentldo dirigido a un ácido nucleico de SOD-1 tiene una longitud de 15 a 25 subunldades. En determinados aspectos, un compuesto antlsentldo dirigido a un ácido nucleico de SOD-1 tiene una longitud de 18 a 22 subunldades. En determinados aspectos, un compuesto antlsentldo dirigido a un ácido nucleico de SOD-1 tiene una longitud de 19 a 21 subunldades. En determinados aspectos, el compuesto antisentido tiene una longitud de 8 a 80, 12 a 50, 13 a 30, 13 a 50, 14 a 30, 14 a 50, 15 a 30, 15 a 50 ,16 a 30 ,16 a 50 ,17 a 30, 17 a 50 ,18 a 30 ,18 a 50 ,19 a 30 ,19 a 50, o 20 a 30 subunidades unidas. En determinados aspectos, un compuesto antlsentldo dirigido a un ácido nucleico de SOD-1 tiene una longitud de 12 subunldades. En determinados aspectos, un compuesto antlsentldo dirigido a un ácido nucleico de SOD-1 tiene una longitud de 13 subunldades. En determinados aspectos, un compuesto antlsentldo dirigido a un ácido nucleico de SOD-1 tiene una longitud de 14 subunldades. En determinados aspectos, un compuesto antlsentldo dirigido a un ácido nucleico de SOD-1 tiene una longitud de 15 subunldades. En determinados aspectos, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de SOD-1 tiene una longitud de 16 subunidades. En determinados aspectos, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de SOD-1 tiene una longitud de 17 subunidades. En determinados aspectos, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de SOD-1 tiene una longitud de 18 subunidades. En determinados aspectos, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de SOD-1 tiene una longitud de 19 subunidades. En determinados aspectos, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de SOD-1 tiene una longitud de 20 subunidades. En determinados aspectos, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de SOD-1 tiene una longitud de 21 subunidades. En determinados aspectos, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de SOD-1 tiene una longitud de 22 subunidades. En determinados aspectos, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de SOD-1 tiene una longitud de 23 subunidades. En determinados aspectos, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de SOD-1 tiene una longitud de 24 subunidades. En determinados aspectos, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de SOD-1 tiene una longitud de 25 subunidades. En determinados aspectos, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de SOD-1 tiene una longitud de 26 subunidades. En determinados aspectos, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de SOD-1 tiene una longitud de 27 subunidades. En determinados aspectos, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de SOD-1 tiene una longitud de 28 subunidades. En determinados aspectos, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de SOD-1 tiene una longitud de 29 subunidades. En determinados aspectos, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de SOD-1 tiene una longitud de 30 subunidades. En determinados aspectos, el compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de SOD-1 tiene una longitud de 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 o 80 subunidades unidas o un intervalo definido por cualesquiera dos de los valores anteriores. En algunos aspectos, el compuesto antisentido es un oligonucleótido modificado y las subunidades unidas son nucleósidos.
En determinados aspectos, los oligonucleótidos dirigidos a un ácido nucleico de SOD-1 pueden estar acortados o truncados. Por ejemplo, puede eliminarse una única subunidad del extremo 5' (truncado en 5') o, de manera alternativa, del extremo 3' (truncado en 3'). Un compuesto antisentido acortado o truncado dirigido a un ácido nucleico de SOD-1 puede tener dos subunidades eliminadas del extremo 5' o, de manera alternativa, puede tener dos subunidades eliminadas del extremo 3', del compuesto antisentido. De manera alternativa, los nucleósidos eliminados se pueden dispersar a lo largo del compuesto antisentido, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tiene un nucleósido eliminado del extremo 5' y un nucleósido eliminado del extremo 3'.
Cuando una sola subunidad adicional está presente en un compuesto antisentido alargado, la subunidad adicional puede ubicarse en el extremo 5' o 3' del compuesto antisentido. Cuando dos o más subunidades adicionales están presentes, las subunidades agregadas pueden ser adyacentes entre sí, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tiene dos subunidades agregadas al extremo 5' (agregado en 5') o, de manera alternativa, al extremo 3' (agregado en 3') del compuesto antisentido. De manera alternativa, las subunidades agregadas se pueden dispersar a lo largo del compuesto antisentido, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tiene una subunidad agregada al extremo 5' y una subunidad agregada al extremo 3'.
Es posible aumentar o disminuir la longitud de un compuesto antisentido, tal como un oligonucleótido modificado, y/o introducir bases con desapareamientos sin eliminar la actividad. Por ejemplo, en Woolf y col. (Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 89:7305-7309, 1992), se sometió a prueba una serie de oligonucleótidos con una longitud de 13-25 nucleobases para determinar su capacidad de inducir la escisión de un ARN diana en un modelo de inyección de ovocitos. Los oligonucleótidos de 25 nucleobases de longitud con 8 u 11 bases con desapareamientos cerca de los extremos de los oligonucleótidos fueron capaces de dirigir la escisión específica del ARNm diana, aunque en menor grado que los oligonucleótidos que no contenían desapareamientos. De manera similar, la escisión específica diana se consiguió utilizando oligonucleótidos de 13 nucleobases, incluyendo los que tenían 1 o 3 desapareamientos.
Gautschi y col (J. Nati. Cáncer Inst. 93:463-471, marzo de 2001) demostraron la capacidad de un oligonucleótido que tiene un 100% de complementariedad con el ARNm de bcl-2 y que tiene 3 desapareamientos con el ARNm de bcl-xL de reducir la expresión tanto de bcl-2 como de bcl-xL in vitro e in v/Vo.Además, este oligonucleótido demostró una potente actividad antitumoral in vivo.
Maher y Dolnick (Nuc. Acid. Res. 16:3341-3358,1988) sometieron a prueba una serie de oligonucleótidos de 14 nucleobases en tándem, y oligonucleótidos de 28 y 42 nucleobases compuestos por la secuencia de dos o tres de los oligonucleótidos en tándem, respectivamente, para determinar su capacidad de detener la traducción de DHFR humana en un ensayo de reticulocitos de conejo. Cada uno de los tres oligonucleótidos de 14 nucleobases solo era capaz de inhibir la traducción, aunque a un nivel más moderado que los oligonucleótidos de 28 o 42 nucleobases.
Motivos de compuestos antisentido
En determinados aspectos, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de SOD-1 tienen subunidades químicamente modificadas dispuestas en patrones, o motivos, para conferir propiedades a los compuestos antisentido tales como actividad inhibidora mejorada, mayor afinidad de unión por un ácido nucleico diana o resistencia a la degradación mediante nucleasas/n vivo.
Los compuestos antisentido quiméricos típicamente contienen al menos una región modificada para conferir mayor resistencia a la degradación de nucleasas, mayor captación celular, mayor afinidad de unión por el ácido nucleico diana y/o mayor afinidad inhibidora. Una segunda región de un compuesto antisentido quimérico puede servir opcionalmente como un sustrato para la endonucleasa celular RNasa H, que escinde la cadena de ARN de un dúplex de ARN:ADN.
Los compuestos antisentido que tienen un motivo gapmero se consideran compuestos antisentido quiméricos. En un gapmero, una región interna que tiene una pluralidad de nucleótidos que admite la escisión de RNasa H se coloca entre las regiones externas que tienen una pluralidad de nucleótidos químicamente diferenciados de los nucleósidos de la región interna. En el caso de un oligonucleótido que tiene un motivo gapmero, el segmento de brecha en general sirve como el sustrato para la escisión de endonucleasas, mientras que los segmentos de ala comprenden nucleósidos modificados. En determinados aspectos, las regiones de un gapmero se diferencian según los tipos de restos de azúcar que comprende cada región diferenciada. Los tipos de restos de azúcar que se utilizan para diferenciar las regiones de un gapmero pueden, en algunos aspectos, incluir 0-D-ribonucleósidos, 3-D-desoxirribonucleósidos, nucleósidos modificados en 2' (tales nucleósidos modificados en 2' pueden incluir 2'-MOE y 2'-0-CH3, entre otros) y nucleósidos modificados con azúcar bicíclico (tales nucleósidos modificados con azúcar bicíclico pueden incluir aquellos que tienen un puente 4'-(CH2)n-0-2', donde n=1 o n=2 y 4'-CH2-0-CH2-2'). En determinados aspectos, las alas pueden incluir varios restos de azúcar modificados, que incluyen, por ejemplo, 2'-MOE. En determinados aspectos, las alas pueden incluir varios restos de azúcar modificados y no modificados. En determinados aspectos, las alas pueden incluir diversas combinaciones de nucleósidos 2'-MOE y 2'-desoxinucleósidos.
Cada región diferenciada puede comprender restos de azúcar uniformes, variantes o alternativos. El motivo ala-brecha-ala se describe frecuentemente como "X-Y-Z", donde "X' representa la longitud del ala 5', "Y" representa la longitud de la región de brecha y "Z" representa la longitud del ala 3'. "X' y "Z" pueden comprender restos de azúcar uniformes, variantes o alternativos. En determinados aspectos, "X" e "Y" pueden incluir uno o más 2'-desoxinucleósidos. "Y" puede comprender 2'-desoxinucleósidos. Como se usa en esta invención, un gapmero descrito como "X-Y-Z" tiene una configuración tal que la brecha se ubica inmediatamente adyacente a cada uno del ala 5' y el ala 3'. Por lo tanto, no existen nucleótidos intermedios entre el ala 5' y la brecha o la brecha y el ala 3'. Cualquiera de los compuestos antisentido descritos en esta invención puede tener un motivo gapmero. En determinados aspectos, "X" y "Z" son iguales; en otros aspectos son diferentes.
En determinados aspectos, los gapmeros descritos en esta invención incluyen, por ejemplo, 20 meros que tienen un motivo de 5-10-5.
En determinados aspectos, los gapmeros descritos en esta invención incluyen, por ejemplo, 19 meros que tienen un motivo de 5-9-5.
En determinados aspectos, los gapmeros descritos en esta invención incluyen, por ejemplo, 18 meros que tienen un motivo de 5-8-5.
En determinados aspectos, los gapmeros descritos en esta invención incluyen, por ejemplo, 18 meros que tienen un motivo de 4-8-5.
En determinados aspectos, los gapmeros descritos en esta invención incluyen, por ejemplo, 18 meros que tienen un motivo de 5-8-7.
En determinados aspectos, los gapmeros descritos en esta invención incluyen, por ejemplo, 18 meros que tienen un motivo de 6-8-6.
En determinados aspectos, los gapmeros descritos en esta invención incluyen, por ejemplo, 18 meros que tienen un motivo de 6-8-5.
En determinados aspectos, el oligonucleótido modificado contiene al menos un nucleósido modificado con 2'-O-metoxietilo, al menos un nucleósido modificado con cEty al menos un 2'-desoxinucleósido. En determinados aspectos, el oligonucleótido modificado tiene un motivo químico de azúcar de cualquiera de los siguientes: ekddddddddekekee
kekeddddddddekek
eeeedddddddddkkee
eeeeddddddddekeke
eeeeddddddddkekee
eeeeddddddddkkeee
eeeeeddddddddkkee
eeeekddddddddkeee
eeeekdddddddkeeee
eeekddddddddkeeee
eeekkdddddddkkeee
eekkdddddddddkkee
eekkddddddddeeeee
eekkddddddddkkeee
ekekddddddddeeeee
ekekddddddddkekee
kekeddddddddeeeee,donde
e = un azúcar modificado con 2'-0-metoxietilrribosa,
k = un azúcar modificado con cET,
d = un azúcar 2'-desoxirribosa,
Ácidos nucleicos diana, regiones diana y secuencias de nucleótidos
Las secuencias de nucleótidos que codifican SOD-1 incluyen, sin limitación, las siguientes: n.° de acceso GENBANK NM 000454.4 (incorporado en esta invención como la SEQ ID NO:1), n.° de acceso GENBANK. N T 011512.10 truncado de los nucleótidos 18693000 a 18704000 (incorporado en esta invención como la SEQ ID NO:2), y el complemento de n.° de acceso GENBANK NW 001114168.1 truncado de los nucleótidos 2258000 a 2271000 (incorporado en esta invención como la SEQ ID NO:3).
Se comprende que la secuencia que se indica en cada SEQ ID NO en los ejemplos contenidos en esta invención es independiente de cualquier modificación de un resto de azúcar, un enlace internucleosídico o una nucleobase. Como tales, los compuestos antisentido definidos por una SEQ ID NO pueden comprender, independientemente, una o más modificaciones de un resto de azúcar, un enlace internucleosídico o una nucleobase. Los compuestos antisentido descritos mediante el número Isis (n.° Isis) indican una combinación de secuencia de nucleobases y motivo.
En determinados aspectos, una región diana es una región estructuralmente definida del ácido nucleico diana. Por ejemplo, una región diana puede comprender una UTR 3', una UTR 5', un exón, un intrón, una unión exón/intrón, una región de codificación, una región de inicio de la traducción, región de fin de la traducción u otra región de ácido nucleico definida. Las regiones estructuralmente definidas para SOD-1 se pueden obtener mediante el número de acceso de bases de datos de secuencias, como NCBI. En determinados aspectos, una región diana puede abarcar la secuencia desde un sitio diana 5' de un segmento diana dentro de la región diana hasta un sitio diana 3' de otro segmento diana dentro de la misma región diana.
El direccionamiento incluye la determinación de al menos un segmento diana al que se hibrida un compuesto antisentido, para que se produzca un efecto deseado. En determinados aspectos, el efecto deseado es una reducción de los niveles de ácido nucleico diana del ARNm. En determinados aspectos, el efecto deseado es la reducción de los niveles de proteína codificada por el ácido nucleico diana o un cambio fenotípico asociado con el ácido nucleico diana.
Una región diana puede contener uno o más segmentos diana. Múltiples segmentos diana dentro de una región diana pueden estar superpuestos. Alternativamente, pueden no superponerse. En determinados aspectos, los segmentos diana dentro de una región diana están separados por no más de aproximadamente 300 nucleótidos. En determinados aspectos, los segmentos diana dentro de una región diana están separados por una cantidad de nucleótidos que es de, es aproximadamente de, es no más de, es no más de aproximadamente 250, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 o 10 nucleótidos en el ácido nucleico diana o es un intervalo definido por dos cualesquiera de los valores anteriores. En determinados aspectos, los segmentos diana dentro de una región diana están separados por no más de, o no más de aproximadamente 5 nucleótidos en el ácido nucleico diana. En determinados aspectos, los segmentos diana son contiguos. Se contemplan regiones diana definidas por un intervalo que tiene un ácido nucleico inicial que es cualquiera de los sitios diana 5' o sitios diana 3' enumerados en esta invención.
Los segmentos diana adecuados se pueden encontrar en una UTR 5', una región de codificación, una UTR 3', un intrón, un exón o una unión exón/intrón. Los segmentos diana que contienen un codón de inicio o un codón de terminación también son segmentos diana adecuados. Un segmento diana adecuado puede excluir específicamente una determinada región definida estructuralmente, tal como el codón de inicio o el codón de terminación.
La determinación de segmentos diana adecuados puede incluir una comparación de la secuencia de un ácido nucleico diana con respecto a otras secuencias en todo el genoma. Por ejemplo, se puede usar el algoritmo BLAST para identificar regiones de similitud entre diferentes ácidos nucleicos. Esta comparación puede impedir la selección de secuencias de compuestos antlsentldo que se pueden hibridar de manera no específica con secuencias distintas de un ácido nucleico diana seleccionado (es decir, secuencias que no son la diana o que están fuera de la diana).
Puede haber una variación en la actividad (por ejemplo, según se define mediante el porcentaje de reducción de los niveles de ácido nucleico diana) de los compuestos antlsentido dentro de una reglón diana activa. En determinados aspectos, las reducciones en los niveles de ARNm de SOD-1 Indican la Inhibición de la expresión de SOD-1. Las reducciones en los niveles de una proteína de SOD-1 también Indican la Inhibición de la expresión del ARNm diana. Además, los cambios fenotíplcos Indican la Inhibición de la expresión de SOD-1. La mejora en la fundón neurológlca Indica la Inhibición de la expresión de SOD-1. La función motora mejorada Indica la Inhibición de la expresión de SOD-1.
Hibridación
En algunos aspectos, la hibridación se produce entre un compuesto antisentido descrito en esta invención y un ácido nucleico de SOD-1. El mecanismo más común de hibridación Implica enlaces de hidrógeno (por ejemplo, enlaces de hidrógeno Watson-Crlck, Hoogsteen o Hoogsteen Inverso) entre nucleobases complementarlas de las moléculas de ácido nucleico.
La hibridación puede producirse en condiciones variables. Las condiciones rigurosas dependen de las secuencias y se determinan según la naturaleza y la composición de las moléculas de ácido nucleico que se desea hibridar.
Los procedimientos para determinar si una secuencia es específicamente hlbrldable con un ácido nucleico diana son bien conocidos en la técnica. En determinados aspectos, los compuestos antlsentldo descritos en esta Invención son específicamente hlbrldables con un ácido nucleico de SOD-1.
Complementariedad
Un compuesto antlsentldo y un ácido nucleico diana son complementarlos entre sí cuando una cantidad suficiente de nucleobases del compuesto antlsentldo puede unirse mediante un enlace de hidrógeno con las nucleobases correspondientes del ácido nucleico diana, de manera que se produzca un efecto deseado (por ejemplo, la Inhibición antlsentldo de un ácido nucleico diana, como un ácido nucleico de SOD-1).
Las nucleobases no complementarias entre un compuesto antisentido y un ácido nucleico de SOD-1 pueden tolerarse siempre que el compuesto antlsentldo siga teniendo la capacidad de hlbrldarse de manera específica con un ácido nucleico diana. Además, un compuesto antlsentldo puede hlbrldarse con respecto a uno o más segmentos de un ácido nucleico de SOD-1, de modo que los segmentos intermedios o adyacentes no estén Implicados en el acontecimiento de hibridación (por ejemplo, una estructura en bucle, desapareamlento o estructura de horquilla).
En determinados aspectos, los compuestos antisentido descritos en esta invención o una porción específica de los mismos son o son al menos 70 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % complementarios a un ácido nucleico de SOD-1, una región diana, un segmento diana o una porción específica de los mismos. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antlsentldo con un ácido nucleico diana se puede determinar mediante procedimientos habituales.
Por ejemplo, un compuesto antlsentldo en el que 18 de las 20 nucleobases del compuesto antlsentldo son complementarlas a una reglón diana y, por lo tanto, hlbrldarían específicamente, representaría el 90 por ciento de complementariedad. En este ejemplo, las nucleobases no complementarías restantes pueden agruparse o Intercalarse con nucleobases complementarías y no necesitan ser contiguas entre sí o a nucleobases complementarias. De esta forma, un compuesto antisentido que tiene 18 nucleobases de longitud con 4 (cuatro) nucleobases no complementarías flanqueadas por dos reglones de complementariedad completa con el ácido nucleico diana tendría un 77,8 % de complementariedad global con el ácido nucleico diana y, por lo tanto, estaría comprendido en el alcance de la presente invención. Se puede determinar el porcentaje de complementariedad de un compuesto antlsentldo con una reglón de un ácido nucleico diana de forma habitual con programas BLAST (herramientas de búsqueda de alineación local básica) y programas PowerBLAST conocidos en la técnica (Altschul y col., J. Mol. Blol., 1990, 215, 403 410; Zhang y Madden, Genome Res., 1997, 7, 649 656). El porcentaje de homología, la identidad de secuencia o complementariedad se pueden determinar, por ejemplo, mediante el programa Gap (Wlsconsln Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.) con ajustes por defecto, que utiliza el algoritmo de Smith y Waterman (Adv. Appl. Math., 1981 2, 482489).
En determinados aspectos, los compuestos antisentido descritos en esta invención o porciones específicas de los mismos son totalmente complementarlos (es decir, 100 % complementarlos) a un ácido nucleico diana o una porción específica del mismo. Por ejemplo, un compuesto antisentido puede ser totalmente complementario a un ácido nucleico de SOD-1 o a una región diana o a un segmento diana o secuencia diana del mismo. Como se usa en esta invención, "totalmente complementario" significa que cada nucleobase de un compuesto antisentido tiene la capacidad de realizar un apareamiento de bases preciso con las nucleobases correspondientes de un ácido nucleico diana. Por ejemplo, un compuesto antisentido de 20 nucleobases es totalmente complementario a una secuencia diana que tiene una longitud de 400 nucleobases, siempre que haya una porción de 20 nucleobases correspondiente del ácido nucleico diana totalmente complementaria al compuesto antisentido. Totalmente complementario también puede utilizarse en referencia a una porción específica del primer y/o el segundo ácido nucleico. Por ejemplo, una porción de 20 nucleobases de un compuesto antisentido de 30 nucleobases puede ser "totalmente complementaria" a una secuencia diana que tiene una longitud de 400 nucleobases. La porción de 20 nucleobases del oligonucleótido de 30 nucleobases es totalmente complementaria a la secuencia diana si la secuencia diana tiene una porción de 20 nucleobases correspondiente donde cada nucleobase es complementaria a la porción de 20 nucleobases del compuesto antisentido. Al mismo tiempo, todo el compuesto antisentido de 30 nucleobases puede ser o no totalmente complementario a la secuencia diana, dependiendo de si las 10 nucleobases restantes del compuesto antisentido también son complementarias a la secuencia diana.
La ubicación de una nucleobase no complementaria puede encontrarse en el extremo 5' o extremo 3' del compuesto antisentido. De manera alternativa, la nucleobase o las nucleobases no complementarias pueden estar en una posición interna del compuesto antisentido. Cuando dos o más nucleobases no complementarias están presentes, pueden ser contiguas (es decir, estar unidas) o no contiguas. En un aspecto, una nucleobase no complementaria se ubica en el segmento de ala de un oligonucleótido gapmero.
En determinados aspectos, los compuestos antisentido que tienen una longitud de, o de hasta 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleobases comprenden no más de 4, no más de 3, no más de 2 o no más de 1 nucleobase(s) no complementaria(s) en relación con un ácido nucleico diana, como un ácido nucleico de SOD-1 o una porción específica del mismo.
En determinados aspectos, los compuestos antisentido que tienen una longitud de, o de hasta 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleobases comprenden no más de 6, no más de 5, no más de 4, no más de 3, no más de 2 o no más de 1 nucleobase(s) no complementaria(s) en relación con un ácido nucleico diana, como un ácido nucleico de SOD-1 o una porción específica del mismo.
Los compuestos antisentido descritos en esta invención también incluyen los que son complementarios a una porción de un ácido nucleico diana. Como se usa en esta invención, "porción" se refiere a una cantidad definida de nucleobases contiguas (es decir, unidas) dentro de una región o un segmento de un ácido nucleico diana. Una "porción" también puede referirse a una cantidad definida de nucleobases contiguas de un compuesto antisentido. En determinados aspectos, los compuestos antisentido son complementarios a al menos una porción de 8 nucleobases de un segmento diana. En determinados aspectos, los compuestos antisentido son complementarios a al menos una porción de 9 nucleobases de un segmento diana. En determinados aspectos, los compuestos antisentido son complementarios a al menos una porción de 10 nucleobases de un segmento diana. En determinados aspectos, los compuestos antisentido son complementarios a al menos una porción de 11 nucleobases de un segmento diana. En determinados aspectos, los compuestos antisentido son complementarios a al menos una porción de 12 nucleobases de un segmento diana. En determinados aspectos, los compuestos antisentido son complementarios a al menos una porción de 13 nucleobases de un segmento diana. En determinados aspectos, los compuestos antisentido son complementarios a al menos una porción de 14 nucleobases de un segmento diana. En determinados aspectos, los compuestos antisentido son complementarios a al menos una porción de 15 nucleobases de un segmento diana. También se contemplan compuestos antisentido que son complementarios a al menos una porción de 9, 10,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más nucleobases de un segmento diana o un intervalo definido por cualesquiera dos de estos valores.
Identidad
Los compuestos antisentido descritos en esta invención también pueden tener un porcentaje de identidad definido para una secuencia de nucleótidos en particular, SEQ ID NO,o un compuesto representado por un número Isis específico o porción del mismo. Como se usa en esta invención, un compuesto antisentido es idéntico a la secuencia descrita en esta invención si tiene la misma capacidad de apareamiento de nucleobases. Por ejemplo, un ARN que contiene uracilo en lugar de timidina en una secuencia de ADN descrita se consideraría idéntico a la secuencia de ADN, ya que tanto el uracilo como la timidina se aparean con la adenina. También se contemplan las versiones acortadas y extendidas de los compuestos antisentido descritos en esta invención, así como los compuestos que tienen bases no idénticas en relación con los compuestos antisentido descritos en esta invención. Las bases no idénticas pueden ser adyacentes entre sí o estar dispersadas en todo el compuesto antisentido. El porcentaje de identidad de un compuesto antisentido se calcula según la cantidad de bases que tienen apareamiento de bases idéntico en relación con la secuencia a la que se se está comparando.
En determinados aspectos, los compuestos antisentido o porciones de los mismos son al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idénticos a uno o más de los compuestos antisentido o las SEQ ID NO, o una porción de los mismos, descritos en esta invención.
En determinados aspectos, una porción del compuesto antisentido se compara con una porción de igual longitud del ácido nucleico diana. En determinados aspectos una porción de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ,18 ,19 ,20 ,21,22 ,23 ,24 o 25 nucleobases se compara con una porción de igual longitud del ácido nucleico diana.
En determinados aspectos, una porción del oligonucleótido se compara con una porción de igual longitud del ácido nucleico diana. En determinados aspectos una porción de 8, 9 ,10 , 11, 12 ,13 ,14 ,15 ,16 , 17 ,18 ,19 , 20, 21, 22, 23, 24 o 25 nucleobases se compara con una porción de igual longitud del ácido nucleico diana. Modificaciones
Un nucleósido es una combinación de azúcar y una base. La porción de nucleobase (también conocida como "base") del nucleósido es comúnmente un resto de base heterocíclica. Los nucleótidos son nucleósidos que incluyen además un grupo fosfato unido de forma covalente a la porción de azúcar del nucleósido. Para aquellos nucleósidos que incluyen un azúcar pentofuranosilo, el grupo fosfato puede estar unido al resto hidroxilo 2', 3' o 5' del azúcar. Se forman oligonucleótidos a través del enlace covalente de los nucleósidos adyacentes entre sí, para formar un oligonucleótido polimérico lineal. Dentro de la estructura de oligonucleótido, los grupos fosfato son comúnmente denominados como formadores de los enlaces internucleosídicos del oligonucleótido.
Las modificaciones de los compuestos antisentido abarcan sustituciones o cambios de enlaces internucleosídicos, restos de azúcar o nucleobases. Los compuestos antisentido modificados a menudo se prefieren con respecto a las formas nativas debido a propiedades deseables tales como, por ejemplo, captación celular mejorada, afinidad mejorada por un ácido nucleico diana, mayor estabilidad en presencia de nucleasas o mayor actividad inhibidora.
Los nucleósidos modificados químicamente también pueden emplearse para aumentar la afinidad de unión de un oligonucleótido acortado o truncado por su ácido nucleico diana. Por consiguiente, a menudo se pueden obtener resultados comparables con compuestos antisentido más cortos que tienen tales nucleósidos modificados químicamente.
Enlaces internucleosídicos modificados
El enlace internucleosídico de origen natural de ARN y ADN es un enlace fosfodiéster de 3' a 5'. A menudo se seleccionan compuestos antisentido que tienen uno o más enlaces internucleosídicos modificados, es decir, de origen no natural, en vez de compuestos antisentido que tienen enlaces internucleosídicos de origen natural, debido a propiedades deseables como, por ejemplo, captación celular mejorada, afinidad mejorada por los ácidos nucleicos diana y mayor estabilidad en presencia de nucleasas.
Los oligonucleótidos que tienen enlaces internucleosídicos modificados incluyen enlaces internucleosídicos que conservan un átomo de fósforo, así como enlaces internucleosídicos que no tienen átomo de fósforo. Los enlaces internucleosídicos representativos que contienen fósforo incluyen, pero no se limitan a, fosfodiésteres, fosfotriésteres, metilfosfonatos, fosforamidato, y fosforotioatos. Los procedimientos para la preparación de enlaces que contienen fósforo y que no contienen fósforo son bien conocidos.
En determinados aspectos, los oligonucleótidos modificados dirigidos a un ácido nucleico de SOD-1 comprenden uno o más enlaces internucleosídicos modificados. En determinados aspectos, los enlaces internucleosídicos modificados se intercalan en todo el compuesto antisentido. En determinados aspectos, los enlaces internucleosídicos modificados son enlaces fosforotioato. En determinados aspectos, cada enlace internucleosídico de un oligonucleótido modificado es un enlace internucleosídico fosforotioato.
En determinados aspectos, los oligonucleótidos modificados dirigidos a un ácido nucleico de SOD-1 comprenden uno o más enlaces internucleosídicos fosfodiéster. En determinados aspectos, los oligonucleótidos modificados dirigidos a un ácido nucleico de SOD-1 comprenden al menos un enlace internucleosídico fosforotioato y al menos un enlace internucleosídico fosfodiéster. En determinados aspectos, el oligonucleótido modificado tiene un motivo de la cadena principal mixta de lo siguiente: sossssssssoooss,
sooossssssssoss,
sooosssssssssoss,
soosssssssssooss,
sooossssssssooss,
sooosssssssssooss,
sooossssssssssooss,
sooosssssssssssooos,
soooossssssssssooss,
sooosssssssssssooss,
sososssssssssssosos, y
sooossssssssssoooss, donde
s = un enlace internucleosídico fosforotioato y
o = un enlace Internucleosídico fosfodiéster.
Restos de azúcar modificado
Los compuestos antisentido de la Invención pueden contener opclonalmente uno o más nucleósldos, donde el grupo azúcar ha sido modificado. Tales nucleósldos de azúcar modificado pueden transmitir estabilidad de nucleasas mejorada, mayor afinidad de unión o alguna otra propiedad biológica beneficiosa a los compuestos antlsentldo. En determinados aspectos, los nucleósldos comprenden restos de anillo de rlbofuranosa químicamente modificados. Los ejemplos de anillos de rlbofuranosa modificados químicamente Incluyen, sin limitación, la adición de grupos sustltuyentes (Incluidos los grupos sustltuyentes 5' y 2', puentes de átomos del anillo no gemlnal para formar ácidos nucleicos blcícllcos (BNA), el reemplazo del átomo de oxígeno del anillo ribosilo con S, N(R), o C(R i )(R 2 ) (R, Ri y R 2 son cada uno independientemente H, alquilo C 1 -C 12 o un grupo protector) y combinaciones de los mismos. Los ejemplos de azúcares modificados químicamente Incluyen nucleósido sustituido con 2'-F-5'-metilo (véase la solicitud internacional PCTWO 2008/101157 publicada el 21/08/08 para otros nucleósldos sustituidos con 5',2'-bis descritos) o el reemplazo del átomo de oxígeno del anillo de ribosilo con S con sustitución adicional en la posición 2' (véase la solicitud de patente de los EE. UU. publicada US2005-0130923, publicada el 16 de junio de 2005) o, alternadamente, una sustitución 5' de un BNA (véase la solicitud Internacional PCT WO 2007/134181 publicada el 22/11/07 donde LNA está sustltudo con, por ejemplo, un grupo 5'-metilo o S'-vinilo).
Los ejemplos de nucleósldos que tienen restos de azúcar modificados Incluyen, sin limitación, nucleósldos que comprenden grupos sustltuyentes S'-vinilo, 5'-metilo (R o S), 4'-S, 2'-F, 2'-OCH3, 2'-OCH2CH3, 2'-OCH2CH2F y 2'-0(CH2)20CH3. El sustituyente en la posición 2' se puede seleccionar de entre alilo, amino, azido, tio, O-alilo, O-alquilo C1-C10, OCF3, OCH2F, 0 (CH2)2S C H 3, 0 (CH2)2-0 -N(Rm)(Rn), 0 -C H 2-C (=0 )-N(Rm)(Rn), y O-CH2-C(=0 )-N(Ri)-(CH2)2-N(Rm)(Rn), donde cada R1, Rm y Rn es, independientemente, H o alquilo C1-C10 sustituido o no sustituido.
Como se usa en esta Invención, "nucleósldos blcícllcos" se refiere a nucleósldos modificados que comprenden un resto de azúcar blcícllco. Los ejemplos de ácidos nucleicos blcícllcos (BNA)) Incluyen, sin limitación, nucleósldos que comprenden un puente entre los átomos del anillo ribosilo 4' y 2'. En determinados aspectos, los compuestos antlsentldo descritos en esta Invención Incluyen uno o más nucleósldos BNA donde el puente comprende una de las fórmulas: 4'-(CH2)-0-2' (LNA); 4'-(CH2)-S-2'; 4'-(CH2)2-0-2' (ENA); 4'-CH(CH3)-0-2' y 4'-CH(CH20CH3)-0-2' (y análogos de los mismos véase la patente de los EE.U. 7.399.845, concedida el 15 de julio de 2008); 4'-C(CH3)(CH3)-0-2' (y análogos del mismo véase el documento PCT/US2008/068922 publicado como el documento WÓ/2009/006478, publicado el 8 de enero de 2009); 4'-CH2-N(OCH3)-2' (y análogos del mismo véase el documento PCT/US2008/064591 publicado como el documento WO/2008/150729, publicado el 11 de diciembre de 2008); 4-CH2-ON(CH3)-2' (véase la solicitud de patente de los EE.UU. publicada US2004-0171570, publicada el 2 de septiembre de 2004); 4'-CH2-N(R)-0-2', donde R es H, alquilo C 1 -C 12 , o un grupo protector (véase la patente de los EE.UU. 7.427.672, concedida el 23 de septiembre de 2008); 4'-CH2-C(H)(CH3)-2' (véase Chattopadhyaya y col., J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134); y 4'-CH2-C(=CH2)-2' (y análogos del mismo véase el documento PCT/US2008/066154 publicado como el documento WO 2008/154401, publicado el 8 de diciembre de 2008).
Se han presentado más nucleósldos blcícllcos en la bibliografía publicada (véase por ejemplo: Srlvastava y col., J. Am. Chem Soc., 2007, 129(26) 8362-8379; Frieden y col., Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365- 6372; Elayadi y col., Curr. Opinión Invens. Drugs, 2001, 2, 558-561; Braasch y col., Chem. Biol., 2001, 8, 1-7; Orum y col., Curr. Opinión Mol. Ther., 2001,3, 239-243; Wahlestedt y col., Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU., 2000, 97, 5633-5638; Singh y col., Chem. Commun., 1998, 4,455-456; Koshkin y col., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Kumary col., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998,8,2219-2222; Singh y col., J. Org. Chem., 1998,63,10035-10039; las patentes de los EE.UU.n.0: 7.399.845; 7.053.207; 7.034.133; 6.794.499; 6.770.748; 6.670.461; 6.525.191; 6.268.490; la publicación de patente de los EE.UU. n.°: US2008-0039618; US2007-0287831; US2004-0171570; las solicitudes de patente de los EE.UU., n-° de serie: 12/129.154; 61/099.844; 61/097.787; 61/086.231; 61/056.564; 61/026.998; 61/026.995; 60/989.574; las solicitudes internacionales WO 2007/134181; WO 2005/021570; WO 2004/106356; WO 94/14226; y las solicitudes internacionales n.°: PCT/US2008/068922; PCT/US2008/066154; y PCT/US2008/064591). Cada uno de los nucleósidos bicíclicos anteriores se puede preparar con una o más configuraciones de azúcar estereoquímicas que Incluyen, por ejemplo, a-L-ribofuranosa y 3-D-ribofuranosa (véase la solicitud internacional PCT PCT/DK98/00393, publicada el 25 de marzo de 1999 como el documento WO 99/14226).
Como se usa en esta Invención, "nucleósidos monocícllcos" se refiere a nucleósidos que comprenden restos de azúcar modificados que no son restos de azúcar bicíclicos. En determinados aspectos, el resto de azúcar o análogo del resto de azúcar de un nucleósldo puede estar modificado o sustituido en cualquier posición.
Como se usa en esta Invención, "nucleósldo blcícllco 4'-2"' o "nucleósldo blcícllco 4' a 2"' se refiere a un nucleósldo blcícllco que comprende un anillo de furanosa que comprende un puente que conecta dos átomos de carbono del anillo de furanosa que conecta el átomo de carbono en la posición 2' y el átomo de carbono en la posición 4' del anillo de azúcar.
En determinados aspectos, los restos de azúcar bicíclicos de los nucleósidos BNA Incluyen, pero no se limitan a, compuestos que tienen al menos un puente entre los átomos de carbono 4' y 2' del resto de azúcar pentofuranosilo, que incluyen, sin limitación, puentes que comprenden 1 o de 1 a 4 grupos unidos seleccionados independientemente de entre -[C(Ra)(Rb)]n-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -C(=NRa)-, - C(=0 )-, -C (= S )-, -O-, -Si(Ra)2-, -S(=0 )x-, y -N(Ra)-; donde: x es 0, 1, o 2; n es 1, 2, 3, o 4; cada Ra y Rb es, independientemente, H, un grupo protector, hidroxilo, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, arilo C5-C20, arilo C5-C20 sustituido, radical de heteroclclo, radical de heteroclclo sustituido, heteroarllo, heteroarilo sustituido, radical allcícllco C5-C7, radical alicíclico C5-C7 sustituido, halógeno, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, COOJ1, acilo (C(=0 )-H), acilo sustituido, CN, sulfonilo (S(=0 )2-Ji), o sulfoxilo (S(=0 )-Ji); y
cada J1 y J2 es, independientemente, H, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, arilo C5-C20, arilo C5-C20 sustituido, acilo (C(=0 )-H), acilo sustituido, un radical de heteroclclo, un radical de heteroclclo sustituido, amlnoalqullo C1-C12, aminoalquilo C1-C12 sustituido o un grupo protector.
En determinados aspectos, el puente de un resto de azúcar bicíclico es, -[C(Ra)(Rb)]n-, -[C(Ra)(Rb)]n-0 -, -C(RaRb)-N(R)-0 - o -C(RaRb)-0 -N(R)-. En determinados aspectos, el puente es 4'-CH2-2', 4'-(CH2)2-2', 4'-(CH2)3-2', 4'-CH2-0 -2', 4'-(CH2)2-0 -2', 4'-CH2-0 -N(R)-2' y 4'-CH2-N(R)-0 -2'- donde cada R es, independientemente, H, un grupo protector o alquilo C i-C i2.
En determinados aspectos, los nucleósidos bicíclicos se definen además según la configuración Isomérica. Por ejemplo, un nucleósido que comprende un puente 4'-(CH2)-0-2', puede estar en la configuración a-L o en la configuración 3-D. Anteriormente, se han incorporado los BNA a-L-metilenoxi (4'-CH2-0-2 ') en oligonucleótidos antisentido que mostraban actividad antlsentldo (Frieden y col., Nucleic Acids Research, 2003,21,6365-6372).
En determinados aspectos, los nucleósidos bicíclicos Incluyen los que tienen un puente 4' a 2' donde tales puentes incluyen, sin limitación, a-L-4'-(CH2)-0-2', P-D-4’-CH2-0 -2 ’, 4 ’-(CH2)2-0 -2 ’, 4 ’-CH2-ON(R)-2’, 4 ’-CH2-N(R)-0-2’, 4 ’-CH(CH3)-0 -2 ’, 4 ’-CH2-S-2’, 4 ’-CH2-N(R)-2’, 4 ’-CH2-CH(CH3)-2’, y 4 ’-(CH2)3-2’, donde R es H, un grupo protector o alquilo C i-C i2.v
En determinado aspecto, los nucleósidos bicíclicos tienen la fórmula:
Figure imgf000019_0001
donde:
Bx es un resto de base heterocíclico;
-Qa-Qb-Qc- es -CH2-N(Rc)-CH2-, -C (=0)-N(R c)-CH2-, -CH2-0-N(R c)-, -CH2-N(Rc)-0 - o - N(Rc)-0-CH 2; Re es alquilo C i-C i2 o un grupo protector amino; y
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte.
En determinados aspectos, los nucleósidos bicíclicos tienen la fórmula:
Figure imgf000020_0001
donde:
Bx es un resto de base heterocíclico;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte.
Za es alquilo C 1 -C 6 , alquenilo C2-Ce, alquinilo C 2 -C 6 , alquilo C 1 -C 6 sustituido, alquenilo C 2 -C 6 sustituido, alquinilo C 2 -C 6 sustituido, acilo, acilo sustituido, amida sustituida, tiol o tiol sustituido.
En un aspecto, cada uno de los grupos sustituidos, es, independientemente, mono o poli sustituido con grupos sustituyentes independientemente seleccionados de entre halógeno, oxo, hidroxilo, OJc, NJcJd, SJC, N3, OC(=X)Jc, y NJeC(=X)NJcJd, donde cada Je, Jd y Je es, independientemente, H, alquilo C 1 -C 6 , o alquilo C 1 -C 6 sustituido y X es O o NJC.
En determinados aspectos, los nucleósidos bicíclicos tienen la fórmula:
Figure imgf000020_0002
donde:
Bx es un resto de base heterocíclico;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte.
Zb es alquilo C 1 -C 6 , alquenilo C2-C6 , alquinilo C2-C6 , alquilo C 1 -C 6 sustituido, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 sustituido o acilo sustituido (C(=0)-).
En determinados aspectos, los nucleósidos bicíclicos tienen la fórmula:
Figure imgf000020_0003
donde:
Bx es un resto de base heterocíclico;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte.
Rd es alquilo C 1 -C 6 , alquilo C 1 -C 6 sustituido, alquenilo C2-C6 , alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 o alquinilo C 2 -C 6 sustituido;
cada qa, qt>, qc y qd es, independientemente, H, halógeno, alquilo C 1 -C 6 , alquilo C 1 -C 6 sustituido, alquenilo C 2 -C 6 , alquenilo C 2 -C 6 sustituido, alquinilo C 2 -C 6 o alquinilo C 2 -C 6 sustituido, alcoxilo Ci-Ce, alcoxilo Ci-Ce sustituido, acilo, acilo sustituido, aminoalquilo Ci-Ce o aminoalquilo Ci-Ce sustituido;
En determinados aspectos, los nucleósidos bicíclicos tienen la fórmula:
Figure imgf000021_0001
donde:
Bx es un resto de base heterocíclico;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte.
qa, qb, qa y qf son cada uno, independientemente, hidrógeno, halógeno, alquilo C 1 -C 12 alquilo C 1 -C 12 sustituido, alquenilo C 2 -C 12 , alquenilo C 2 -C 12 sustituido, alquinilo C 2 -C 12 , alquinilo C 2 -C 12 sustituido, alcoxi C 1 -C 12 , alcoxi C 1 -C 12 sustituido, OJj; SJj, SOJj, S 02Jj, NJjJk, N3, CN, C(=0)OJj; C(=0)NJjJk, C(=0)Jj; O-C(=0)NJjJk, N(H)C(=NH)NJjJk, N(H)C(=0)NJjJk o N(H)C(=S)NJjJk;
o qa y qf juntos son =C(qg)(qh);
qg y qh son cada uno, independientemente, H, halógeno, alquilo C 1 -C 12 o alquilo C 1 -C 12 sustituido.
Se han descrito la síntesis y la preparación de nucleósidos bicíclicos de adenina, citosina, guanina, 5-metilcitosina, timina y uracilo que tienen un puente 4'-CH2-0-2', junto con su oligomerización y propiedades de reconocimiento de ácidos nucleicos (Koshkin y col., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630). La síntesis de nucleósidos bicíclicos también se ha descrito en el documento WO 98/39352 y el documento WO 99/14226.
También se han preparado análogos de diversos nucleósidos bicíclicos que tienen grupos puente 4' a 2' tales como 4'-CH2-0-2' y 4'-CH2-S-2' (Kumar y col., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222). También se ha descrito la preparación de dúplex de oligodesoxirribonucleótidos que comprenden nucleósidos bicíclicos para su uso como sustratos para las polimerasas de ácido nucleico (Wengel y col., documento WO 99/14226). Además, en la técnica se ha descrito la síntesis de BNA 2'-amino, un novedoso análogo de oligonucleótido de alta afinidad restringido conformacionalmente (Singh y col., J. Org.Chem., 1998, 63, 10035-10039). Además, se han preparado BNA 2'-amino y 2'-metilamino y se ha presentado previamente la estabilidad térmica de sus dúplex con cadenas complementarias de ARN y ADN.
En determinados aspectos, los nucleósidos bicíclicos tienen la fórmula:
Figure imgf000021_0002
donde:
Bx es un resto de base heterocíclico;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
cada q¡, q¡, qk y qi es, independientemente, H, halógeno, alquilo C 1 -C 12 alquilo C 1 -C 12 sustituido, alquenilo C 2 -C 12 , alquenilo C 2 -C 12 sustituido, alquinilo C 2 -C 12 , alquinilo C 2 -C 12 sustituido, alcoxi C 1 -C 12 , alcoxi C 1 -C 12 sustituido, OJj, SJj, SOJj, S 02Jj, NJjJk, N3, CN, C(=0)OJj; C(=0)NJjJk, C(=0)Jj; 0-C(=0)NJjJk, N(H)C(=NH)NJjJk, N(H)C(=0)NJjJk o N(H)C(=S)NJjJk; y
q¡ y qj o qi y qk juntos son =C(qg)(qh), donde qg y qh son cada uno, independientemente, H, halógeno, alquilo C 1 -C 12 o alquilo C 1 -C 12 sustituido.
Se han descrito un nucleósido carbocíclico bicíclico que tiene un puente 4'-(CH2)3-2' y el puente análogo de alquenilo 4'-CH=CH-CH2-2' (Frier y col., Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4429-4443 y Albaek y col., J.
Org. Chem., 2006, 71, 7731-7740). También se han descrito la síntesis y la preparación de nucleósidos carbocíclicos bicíclicos, junto con su oligomerización y estudios bioquímicos (Srivastava y col., J. Am. Chem. Soc. 2007,129(26), 8362-8379).
En determinados aspectos, los nucleósidos bicíclicos incluyen, pero no se limitan a, (A) BNA a-L-metilenoxi (4'-CH2-0-2'), (B) BNA 3-D-metilenoxi (4'-CH2-0-2'), (C) BNA etilenoxi (4'-(CH2)2-0-2'), (D) BNA aminooxi (4'-CH2-0-N(R)-2'), (E) BNA oxiamino (4'-CH2-N(R)-0-2'), (F) BNA metil(metilenoxi) (4'-CH(CH3)-0-2') (también denominado etilo constreñido o cEt), (G) BNA metilen-tio (4'-CH2-S-2'), (H) BNA metilen-amino (4'-CH2-N(R)-2'), (I) BNA metilo carbocíclico (4'-CH2-CH(CH3)-2') y (J) BNA propileno carbocíclico (4'-(CH2)3-2') y (K) BNA de vinilo, tal como se ilustra a continuación.
Figure imgf000022_0001
donde Bx es el resto de base y R es, independientemente, H, un grupo protector, alquilo C 1 -C 6 o alcoxi C 1 -C 6 .
Como se usa en esta invención, el término "nucleósido de tetrahidropirano modificado" o "nucleósido de THP modificado" significa un nucleósido que tiene un "azúcar" de tetrahidropirano de seis miembros sustituido por el residuo de pentofuranosilo en nucleósidos normales y puede denominarse sustituto de azúcar. Los nucleósidos de THP modificados incluyen, pero no se limitan a, lo que se denomina en la técnica como ácido nucleico de hexitol (HNA, por su sigla en inglés), ácido nucleico de anitol (ANA, por su sigla en inglés), ácido nucleico de manitol (MNA, por su sigla en inglés) (véase Leumann, Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 841-854) o fluoro HNA (F-HNA) que tiene un sistema de anillo de tetrahidropiranilo como se ilustra a continuación.
Figure imgf000022_0002
En determinados aspectos, se seleccionan sustitutos de azúcar que tienen la fórmula:
Figure imgf000022_0003
donde:
Bx es un resto de base heterocíclico;
T3 y T 4 son cada uno, independientemente, un grupo de enlace internucleosídico que une el análogo de nucleósido de tetrahidropirano al compuesto oligomérico o uno de T3 y T 4 es un grupo de enlace internucleosídico que une el análogo de nucleósido de tetrahidropirano a un compuesto oligomérico u oligonucleótido y el otro de T 3 y T 4 es H, un grupo protector hidroxilo, un grupo conjugado unido o un grupo terminal 5' o 3';
q-i, q 2 , q3, q4, qs, qe y q7 son cada uno independientemente, H, alquilo C 1 -C 6 , alquilo C 1 -C 6 sustituido, alquenilo C 2 -C 6 , alquenilo C 2 -C 6 sustituido, alquinilo C 2 -C 6 o alquinilo C 2 -C 6 sustituido; y
uno de R 1 y R 2 es hidrógeno y el otro se selecciona de entre halógeno, alcoxi sustituido o no sustituido, NJ 1 J 2 , SJ 1 , N3, OC(=X)Ji , OC(=X)NJi J2, NJ3C(=X)NJi J2 y CN, donde X es O, S o NJ 1 y cada J 1 , J 2 y J3 es, independientemente, H o alquilo C 1 -C 6 .
En determinados aspectos, q-i, q 2 , q3, q4, qs, q6 y q7 son cada uno H. En determinados aspectos, al menos uno de q-i, q 2 , q3, q4, qs, q6 y q7 es distinto de H. En determinados aspectos, al menos uno de q-i, q 2 , q3, q4, qs, q6 y q7 es metilo. En determinados aspectos, se proporcionan nucleósidos de THP donde uno de R 1 y R 2 es F. En determinados aspectos, R 1 es fluoro y R 2 es H; R 1 es metoxi y R 2 es H, y R 1 es metoxietoxi y R 2 es H.
En determinados aspectos, los sustitutos de azúcar comprenden anillos que tienen más de 5 átomos y más de un heteroátomo. Por ejemplo, se han presentado nucleósidos que comprenden restos de azúcar morfolino y su uso en compuestos oligoméricos (véase por ejemplo: Braasch y col., Biochemistry, 2002, 41,4503-4510; y las patentes de los EE.UU. 5.698.685; 5.166.315; 5.185.444; y 5.034.506). Como se usa en esta invención, el término "morfolino" significa un sustituto de azúcar que tiene la siguiente fórmula:
Figure imgf000023_0001
En determinados aspectos, los morfolinos pueden estar modificados, por ejemplo, mediante la adición o alteración de diversos grupos sustituyentes de la estructura de morfolino anterior. Dichos sustitutos de azúcar se denominan en esta invención "morfolinos modificados".
También se proporcionan sin limitación combinaciones de modificaciones, tales como los nucleósidos sustituidos con 2'-F-5'-metilo (véase la solicitud internacional PCT WO 2008/101157 publicada el 21/08/08 para otros nucleósidos sustituidos en 5',2'-bis descritos) y el reemplazo del átomo de oxígeno del anillo de ribosilo con S con sustitución adicional en la posición 2' (véase la solicitud de patente de los EE. UU. publicada US2005-0130923, publicada el 16 de junio de 2005) o, alternativamente, una sustitución 5' de un ácido nucleico bicíclico (véase la solicitud internacional PCT WO 2007/134181 publicada el 22/11/07 donde un nucleósido bicíclico 4'-CH 2 -O- 2 ' está sustitudo adicionalmente en la posición 5' con un 5'-metilo o un grupo 5'-vinilo). También se han descrito la síntesis y la preparación de nucleósidos carbocíclicos bicíclicos, junto con su oligomerización y estudios bioquímicos (véase, por ejemplo, Srivastava y col., J. Am. Chem. Soc. 2007,129(26), 8362-8379). En determinados aspectos, los compuestos antisentido comprenden uno o más nucleósidos de ciclohexenilo modificados, que es un nucleósido que tiene un ciclohexenilo de seis miembros en lugar del residuo de pentafuranosilo en los nucleósidos de origen natural. Los nucleósidos de ciclohexenilo modificados incluyen, pero no se limitan a los descritos en la técnica (véase, por ejemplo, la solicitud PCT publicada W 02010/036696 de propiedad común, publicada el 10 de abril de 2010, Robeyns y col., J. Am. Chem Soc., 2008,130(6), 1979-1984; Horváth y col., Tetrahedron Letters, 2007, 48, 3621-3623; Nauwelaerts y col., J. Am. Chem Soc., 2007, 129(30), 9340-9348; Gu y col., Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 2005,24(5-7), 993-998; Nauwelaerts y col., Nucleic Acids Research, 2005, 33(8), 2452-2463; Robeyns y col., Acta Crystallographica, sección F: Structural Biology and Crystallization Communications, 2005, F61(6), 585-586; Gu y col., Tetrahedron, 2004, 60(9), 2111-2123; Gu y col., Oligonucleotidess, 2003, 13(6), 479-489; Wang y col., J. Org. Chem., 2003, 68, 4499-4505; Verbeure y col., Nucleic Acids Research, 2001, 29(24), 4941-4947; Wang y col., J. Org. Chem., 2001, 66, 8478-82;Wang y col., Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 2001, 20(4-7), 785-788; Wang y col., J. Am. Chem., 2000, 122, 8595-8602; la solicitud PCT publicada, WO 06/047842; y la solicitud PCT publicada WO 01/049687). Determinados nucleósidos de ciclohexenilo modificados tienen la fórmula X.
Figure imgf000023_0002
donde, independientemente, para cada uno de dichos al menos un análogo nucleósido de ciclohexenilo de fórmula X:
Bx es un resto de base heterocíclico;
T 3 y T 4 son cada uno, independientemente, un grupo de enlace internucleosídico que une el análogo de nucleósido de ciclohexenilo a un compuesto antisentido o uno de T 3 y T 4 es un grupo de enlace internucleosídico que une el análogo de nucleósido de tetrahldropirano a un compuesto antisentido y el otro de T 3 y T 4 es H, un grupo protector hidroxilo, un grupo conjugado unido o un grupo termina 5' o 3'; y q-i, q 2 , q3, q4, qs, qe, q7, qs y qg son cada uno, independientemente, H, alquilo C 1 -C 6 , alquilo C 1 -C 6 sustituido, alquenilo C 2 -C 6 , alquenilo C 2 -C 6 sustituido, alquinilo C 2 -C 6 , alquinilo C 2 -C 6 sustituido u otro grupo sustituyente de azúcar.
Muchos otros sistemas de anillo monocíclicos, bicíclicos y tricíclicos son conocidos en la técnica y son adecuados como sustitutos de azúcar que pueden ser usados para modificar nucleósidos para su incorporación en compuestos oligoméricos, tal como se proporciona en esta invención (véase, por ejemplo, el artículo de reseña:Leumann, Christian J. Bioorg. & Med. Chem., 2002, 10, 841-854). Tales sistemas de anillos pueden experimentar diversas sustituciones adicionales para mejorar adicionalmente su actividad.
Como se usa en esta invención, "azúcar modificado en 2"' significa un azúcar de furanosilo modificado en la posición 2'. En determinados aspectos, tales modificaciones incluyen sustituyeles seleccionados de entre: un haluro, que incluye, pero no se limita a, alcoxi sustituido y no sustituido, tioalquilo sustituido y no sustituido, aminoalquilo sustituido y no sustituido, alquilo sustituido y no sustituido, alilo sustituido y no sustituido y alquinilo sustituido y no sustituido. En determinados aspectos, las modificaciones 2' se seleccionan de entre sustituyentes que incluyen, pero no se limitan a: 0[(CH2)n0]mCH3, 0(CH2)nNH2, 0(CH2)nCH3, 0(CH2)nF, 0(CH2)n0NH2, 0CH2C(=0)N(H)CH3, y 0(CH2)n0N[(CH2)nCH3]2, donde n y m son de 1 a aproximadamente 10. Otros grupos sustituyentes 2' también pueden seleccionarse de entre: alquilo C 1 -C 12 , alquilo sustituido, alquenilo, alquinilo, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo u 0-aralquilo,SH, SCH 3 , OCN, Cl, Br, CN, CF 3 , OCF 3 , SOCH 3 , SO 2 CH 3 , ONO 2 , NO 2 , N 3 , NH 2 , heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo de escisión de ARN, un grupo indicador, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas, o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un compuesto antisentido, y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. En determinados aspectos, los nucleósidos modificados comprenden una cadena lateral 2’-MOE (Baker ey col, J. Biol.Chem., 1997, 272, 11944-12000). Se ha descrito que tal sustitución 2'-MOE tiene una afinidad de unión mejorada en comparación con nucleósidos no modificados y con otros nucleósidos modificados, como2'- O-metilo, O-propilo, y O-aminopropilo. También se ha demostrado que los oligonucleótidos que tienen el sustituyente 2'-MOE son inhibidores antisentido de la expresión génica con características prometedoras para su uso in vivo (Martin, Helv. Chim. Acta, 1995, 78,486-504; Altmann y col., Chimia, 1996, 50,168-176; Altmann y col., Biochem. Soc. Trans., 1996, 24, 630-637; y Altmann y col., Nucleosides Nucleotides, 1997, 16, 917-926).
Como se usa en esta invención, "modificado en 2"' o "sustituido en 2"' se refiere a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un sustituyente en la posición 2' distinto de H u OH. Los nucleósidos modificados en 2' incluyen, pero no se limitan a, nucleósidos bicíclicos donde el puente que conecta dos átomos de carbono del anillo de azúcar conecta el carbono 2' y otro carbono del anillo de azúcar; y nucleósidos con sustituyentes 2' que no forman puentes, como alilo, amino, azido, tio, O-alilo, O-alquilo C 1 -C 10 , -OCF 3 , 0-(CH2)2-0-CH3, 2'-0(CH2)2SCH3,0-(CH2)2-0-N(Rm)(Rn), o 0-CH2-C(=Ó)-N(Rm)(Rn), donde cada Rm y Rn es, independientemente, H o alquilo C 1 -C 10 sustituido o no sustituido. Los nucleósidos modificados en 2' pueden comprender además otras modficaciones, por ejemplo, en otras posiciones del azúcar y/o en la nucleobase.
Como se usa en esta invención, "2'-F" se refiere a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un grupo fluoro en la posición 2' del anillo de azúcar.
Como se usa en esta invención, "2'-OMe" o "2'-OCH3", "2’-0-metilo" o "2'-metoxi" se refiere a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un grupo -OCH 3 en la posición 2' del anillo de azúcar.
Como se usa en esta invención, "MOE" o "2'-MOE" o "2'-0CH2CH20CH3" o "2'-0-metoxietilo" se refiere a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un grupo -OCH2CH2OCH3 en la posición 2' del anillo de azúcar.
Los procedimientos para las preparaciones de azúcares modificados son bien conocidos por los expertos en la materia. Algunas patentes representativas de los EE.UU. que enseñan la preparación de tales azúcares modificados incluyen, sin limitación, los documentos U.S.: 4.981.957; 5.118.800; 5.319.080; 5.359.044; 5.393.878; 5.446.137; 5.466.786; 5.514.785; 5.519.134; 5.567.811; 5.576.427; 5.591.722; 5.597.909; 5.610.300; 5.627.053; 5.639.873; 5.646.265; 5.670.633; 5.700.920; 5.792.847 y 6.600.032 y la solicitud International PCT/US2005/019219, depositada el 2 de junio de 2005 y publicada como WO 2005/121371 el 22 de diciembre de 2005.
Como se usa en esta invención, "oligonucleótido" se refiere a un compuesto que comprende una pluralidad de nucleósidos unidos. En determinados aspectos, uno o más de la pluralidad de nucleósidos está modificado. En determinados aspectos, un oligonucleótido comprende uno o más ribonucleósidos (ARN) y/o desoxirribonucleósidos (ADN).
En los nucleótidos que tienen restos de azúcar modificados, los restos de nucleobases (naturales, modificados o una combinación de los mismos) se mantienen para la hibridación con un ácido nucleico diana adecuado. En determinados aspectos, los compuestos antisentido comprenden uno o más nucleósidos que tienen restos de azúcar modificados. En determinados aspectos, el resto de azúcar modificado es 2'-MOE. En determinados aspectos, los nucleósidos modificados con 2'-MOE están dispuestos en un motivo gapmero. En determinados aspectos, el resto azúcar modificado es un nucleósido bicíclico que tiene un grupo formador de puentes (4'-CH(CH3)-0-2'). En determinados aspectos, los nucleósidos modificados (4'-CH(CH3)-0-2') están dispuestos en las alas de un motivo gapmero.
Composiciones y procedimientos de formulación de composiciones farmacéuticas
Los oligonucleótidos pueden mezclarse con sustancias inertes o activas farmacéuticamente aceptables para la preparación de formulaciones o composiciones farmacéuticas. Las composiciones y los procedimientos para la formulación de composiciones farmacéuticas dependen de diversos criterios que incluyen, pero no se limitan a, la vía de administración, el grado de la enfermedad o la dosis que se desea administrar.
Un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de SOD-1 puede utilizarse en composiciones farmacéuticas combinando el compuesto antisentido con un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable. Un diluyente farmacéuticamente aceptable incluye solución salina amortiguada con fosfato (PBS, por su sigla en inglés). PBS es un diluyente adecuado para su uso en composiciones que se suministran de forma parenteral. Por consiguiente, en un aspecto, en los procedimientos descritos en esta invención se emplea una composición farmacéutica que comprende un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de SOD-1 y un diluyente farmacéuticamente aceptable. En determinados aspectos, el diluyente farmacéuticamente aceptable es PBS. En determinados aspectos, los compuestos antisentido es un oligonucleótido modificado. Las composiciones farmacéuticas que comprenden compuestos antisentido abarcan cualquier sal, éster o sal de tales ésteres farmacéuticamente aceptables, o cualquier otro oligonucleótido que, tras la administración a un animal, que incluye un ser humano, es capaz de proporcionar (directa o indirectamente) el metabolito biológicamente activo o residuo del mismo. Por consiguiente, por ejemplo, la descripción también se dirige a sales farmacéuticamente aceptables de compuestos antisentido, profármacos, sales farmacéuticamente aceptables de tales profármacos y otros bioequivalentes. Las sales farmacéuticamente aceptables adecuadas incluyen, pero no se limitan a, sales de sodio y potasio.
Un profármaco puede incluir la incorporación de nucleósidos adicionales en uno o ambos extremos de un compuesto antisentido que se escinden mediante nucleasas endógenas dentro del cuerpo para formar el compuesto antisentido activo.
Compuestos antisentido conjugados
Los compuestos antisentido pueden unirse de forma covalente a uno o más restos o conjugados que mejoran la actividad, la distribución celular o captación celular de los oligonucleótidos resultantes. Los grupos conjugados típicos incluyen restos de colesterol y restos de lípidos. Los grupos conjugados adicionales incluyen carbohidratos, fosfolípidos, biotina, fenazina, folato, fenantridina, antraquinona, acridina, fluoresceínas, rodaminas, cumarinas y colorantes.
Los compuestos antisentido también se pueden modificar para tener uno o más grupos estabilizadores unidos por lo general a uno o ambos extremos de compuestos antisentido para mejorar las propiedades como, por ejemplo, la estabilidad de la nucleasa. En los grupos estabilizadores se incluyen estructuras de casquetes. Estas modificaciones terminales protegen al compuesto antisentido que tiene ácido nucleico terminal de la degradación de exonucleasas y puede ayudar en el suministro y/o localización dentro de una célula. El casquete puede estar presente en el extremo 5' (casquete 5') o en el extremo 3' (casquete 3') o puede estar en ambos extremos. Las estructuras de casquete se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, casquetes abásicos desoxi invertidos. Otros grupos estabilizadores 3' y 5' que se pueden usar para tapar uno o ambos extremos de un compuesto antisentido para transmitir estabilidad de nucleasa incluyen los descritos en el documento WO 03/004602 publicado el 16 de enero de 2003.
Cultivo celular y tratamiento con compuestos antisentido
Los efectos de los compuestos antisentido en el nivel, la actividad o la expresión de los ácidos nucleicos de SOD-1 pueden someterse a prueba in vitro en una diversidad de tipos celulares. Los tipos de células que se utilizan para tales análisis se pueden adquirir de los vendedores comerciales (por ejemplo, American Type Culture Collection, Manassus, VA; Zen-Bio, Inc., Research Triangle Park, NC; Clonetics Corporation, Walkersville, MD) y se cultivan según las Instrucciones del vendedor utilizando reactivos disponibles en el mercado (por ejemplo, Invltrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). Los tipos de células Ilustrativas Incluyen, pero no se limitan a, células HepG2, células Hep3B„ hepatocitos primarios, células A431, y células SH-SY5Y.
Pruebas in vitro de oligonucleótidos
En esta Invención se describen procedimientos para el tratamiento de células con oligonucleótidos que pueden modificarse de manera adecuada para el tratamiento con otros compuestos antisentido.
Las células pueden ser tratadas con oligonucleótidos cuando las células alcanzan aproximadamente 60-80 % de confluencia en el cultivo.
Un reactivo comúnmente utilizado para Introducir oligonucleótidos en células cultivadas Incluye el reactivo de transfecclón de lípldos catiónicos LIPOFECTIN (Invltrogen, Carlsbad, CA). Los oligonucleótidos pueden mezclarse con LIPOFECTIN en OPTI-MEM 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para lograr la concentración final deseada de oligonucleótido y una concentración de LIPOFECTIN, que puede variar de 2 a 12 ug/ml por 100 nM de oligonucleótido.
Otro reactivo utilizado para Introducir oligonucleótidos en células cultivadas Incluye LIPOFECTAMINE (Invitrogen, Carlsbad, CA). El oligonucleótido se mezcla con LIPOFECTAMINE en medio reducido en suero OPTI-MEM 1 (Invltrogen, Carlsbad, CA) para lograr la concentración deseada de oligonucleótido y una concentración de LIPOFECTAMINE que puede variar de 2 a 12 ug/ml por 100 nM de oligonucleótido.
Otra técnica que se utiliza para Introducir oligonucleótidos en células cultivadas Incluye la electroporaclón. Las células se tratan con oligonucleótidos con procedimientos habituales. Las células pueden recogerse 16-24 horas después del tratamiento con oligonucleótidos, momento en el cual se miden los niveles de ARN o proteína de los ácidos nucleicos diana mediante procedimientos conocidos en la técnica y descritos en esta Invención. En general, cuando los tratamientos se llevan a cabo en múltiples réplicas, los datos se presentan como el promedio de los tratamientos en réplica.
La concentración de oligonucleótido que se utiliza varía de una línea celular a otra. Los procedimientos para determinar la concentración óptima de oligonucleótidos para una línea celular particular son bien conocidos en la técnica. Los oligonucleótidos se usan típicamente en concentraciones que varían de 1 nM a 300 nM cuando se transfectan con LIPOFECTAMINE. Los oligonucleótidos se utilizan en concentraciones más elevadas que varían de 625 a 20.000 nM cuando se transfectan utilizando electroporaclón.
Aislamiento de ARN
El análisis de ARN se puede llevar a cabo en ARN celular total o poli(A)+ ARNm. Los procedimientos de aislamiento de ARN son bien conocidos en la técnica. El ARN se prepara utilizando procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, usando el reactivo TRIZOL (Invitrogen, Carlsbad, CA) según los protocolos recomendados por el fabricante.
Análisis de la inhibición de niveles o expresión diana
La Inhibición de los niveles o la expresión de un ácido nucleico de SOD-1 se puede analizar de diversas maneras conocidas en la técnica. Por ejemplo, los niveles de ácido nucleico diana pueden cuantlficarse mediante, por ejemplo, análisis Northern blot, reacción en cadena de la pollmerasa (PCR, por su sigla en Inglés) competitiva o PCR en tiempo real cuantitativa. El análisis de ARN se puede llevar a cabo en ARN celular total o poli(A)+ ARNm. Los procedimientos de aislamiento de ARN son bien conocidos en la técnica. El análisis Northern blot también es habitual en la técnica. La PCR en tiempo real cuantitativa puede lograrse de manera conveniente usando el sistema de detección de secuencias ABI PRISM 7600, 7700, o 7900 disponible en el mercado, de PE-Applied Biosystems, Foster City, CA y se utiliza según las instrucciones del fabricante. Análisis PCR cuantitativa en tiempo real de niveles de ARN diana
La cuantlflcaclón de los niveles de ARN diana puede lograrse mediante PCR en tiempo real cuantitativa utilizando el sistema de detección de secuencias ABI PRISM 7600, 7700 o 7900 (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA), según las instrucciones de fabricante. Los procedimientos de PCR cuantitativa en tiempo real se conocen en la técnica.
Antes de la PCR en tiempo real, el ARN aislado se somete a una reacción con transcrlptasa Inversa (RT, por su sigla en Inglés), que produce ADN complementarlo (ADNc) que a continuación se utiliza como el sustrato para la amplificación mediante PCR en tiempo real. Las reacciones con RT y PCR en tiempo real se llevan a cabo de manera secuenclal en el mismo pocilio de muestra. Los reactivos de RT y PCR en tiempo real se pueden obtener de Invitrogen (Carlsbad, CA). Las reacciones de RT PCR en tiempo real se llevan a cabo mediante procedimientos conocidos por los expertos en la materia.
Las cantidades de gen (o ARN) diana obtenidas mediante PCR en tiempo real se normalizan utilizando el nivel de expresión de un gen cuya expresión es constante, como la ciclofilina A, o cuantificando el ARN total con RIBOGREEN (Invitrogen, Inc. Carlsbad, CA). La expresión de la ciclofilina A se cuantifica mediante PCR en tiempo real, ejecutándose de forma simultánea con la diana, mediante multiplexación o por separado. El ARN total se cuantifica mediante el reactivo de cuantificación de ARN RIBOGREEN (Invetrogen, Inc. Eugene, OR). Los procedimientos de cuantificación de ARN mediante RIBOGREEN son SOD-1ght en Jones, L.J., y col., (Analytical Biochemistry, 1998, 265, 368-374). Se utiliza un instrumento CYTOFLUOR 4000 (PE Applied Biosystems) para medir la fluorescencia de RIBOGREEN.
Las sondas y los cebadores se diseñan para que se hibriden con un ácido nucleico de SOD-1. Los procedimientos para diseñar sondas y cebadores para PCR en tiempo real se conocen en la técnica y pueden incluir el uso de software como PRIMER EXPRESS Software (Applied Biosystems, Foster City, CA).
Análisis de los niveles de proteína
La inhibición antisentido de los ácidos nucleicos de SOD-1 se puede evaluar mediante la medición de los niveles de proteína de SOD-1. Los niveles de proteína de SOD-1 pueden evaluarse o cuantificarse de diferentes formas conocidas en la técnica, como la inmunoprecipitación, el análisis de Western blot (inmunotransferencia), el ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), ensayos cuantitativos de proteínas, ensayos de la actividad de las proteínas (por ejemplo, ensayos de la actividad de la caspasa), inmunohistoquímica, inmunocitoquímica o clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). Los anticuerpos dirigidos a una diana se pueden identificar y obtener a partir de diversas fuentes, como el catálogo de anticuerpos de MSRS (Aerie Corporation, Birmingham, MI) o pueden prepararse mediante procedimientos convencionales de generación de anticuerpos monoclonales o policlonales conocidos en la técnica. En determinados aspectos, los compuestos en esta invención proporcionan una reducción mejorada en los niveles de proteína.
Pruebas in vivo de compuestos antisentido
Los compuestos antisentido, por ejemplo, los oligonucleótidos modificados, se someten a prueba en animales para evaluar su capacidad para inhibir la expresión de SOD-1 y producir cambios fenotípicos, tal como la función motora mejorada. En determinados aspectos, la función motora se mide mediante análisis de iniciación al caminar, rotarod, fuerza de agarre, ascenso al poste, rendimiento en campo abierto, barra de equilibrio, prueba de huella de la pata trasera en el animal. Las pruebas se pueden realizar en animales normales o en modelos experimentales de enfermedades. Para la administración en animales, los oligonucleótidos se formulan en un diluyente farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina amortiguada con fosfato. La administración incluye vías de administración parenteral, como intraperitoneal, intravenosa y subcutánea. La dosificación de oligonucleótidos y la frecuencia de dosificación dependen de múltiples factores, tales como, pero no se limitan a, la vía de administración y el peso corporal del animal. Después de un período de tratamiento con oligonucleótidos, se aísla ARN del tejido del SNC o el LCR y se miden los cambios en la expresión de ácidos nucleicos de SOD-1.
Algunas indicaciones
En determinados aspectos, en esta invención se describen procedimientos, compuestos y composiciones para tratar a un individuo que comprenden administrar una o más composiciones farmacéuticas descritas en esta invención. En determinados aspectos, el individuo tiene una enfermedad neurodegenerativa. En determinados aspectos, el individuo está en riesgo de desarrollar una enfermedad neurodegenerativa, que incluye, pero no se limita a, la esclerosis lateral amiotrófica (ELA). En determinados aspectos, se ha identificado que el individuo tiene una enfermedad asociada a SOD-1. En determinados aspectos, en esta invención se describen procedimientos para reducir profilácticamente la expresión de SOD-1 en un individuo. Determinados aspectos incluyen el tratamiento de un individuo que lo necesita mediante la administración a un individuo de una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de SOD-1. En un aspecto, la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de SOD-1 se acompaña del monitoreo de los niveles de SOD-1 en un individuo para determinar la respuesta de un individuo a la administración del compuesto antisentido. Un médico puede utilizar la respuesta de un individuo a la administración del compuesto antisentido para determinar la cantidad y duración de la intervención terapéutica.
En determinados aspectos, la administración de un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de SOD-1 provoca una reducción de la expresión de SOD-1 en al menos un 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 %, o un intervalo definido por cualesquiera dos de estos valores. En determinados aspectos, la administración de un compuesto antlsentldo dirigido a un ácido nucleico de SOD-1 provoca una función motora mejorada en un animal. En determinados aspectos, la administración de un compuesto antisentido de SOD-1 mejora la función motora en al menos un 15, 20, 25,30, 35 ,40 ,45 , 50, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 %, o un intervalo definido por cualesquiera dos de estos valores.
En determinados aspectos, las composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto antisentido dirigido a SOD-1 se utilizan para la preparación de un medicamento para tratar a un paciente que padece o es susceptible de padecer una enfermedad neurodegenerativa Incluida la esclerosis lateral amlotrófica (ELA).
Algunas composiciones comparativas
Los ollgonucleótldos antlsentldo dirigidos a SOD-1 humano se describieron en una publicación anterior (véase el documento WO 2005/040180). Varios oligonucleótidos (ISIS 333611, ISIS 146144, ISIS 146145, ISIS 150437, ISIS 150441, ISIS 150443, ISIS 150444, ISIS 150445, ISIS 150446, ISIS 150447, ISIS 150448, ISIS 150449, ISIS 150452, ISIS 150454, ISIS 150458, ISIS 150460, 150462-150467, ISIS 150470, ISIS 150472, ISIS 150474, ISIS 150475, ISIS 150476, ISIS 150479-150483, ISIS 150488, ISIS 150489, ISIS 150490, ISIS 150491-150493, ISIS 150495-150498, ISIS 150511, ISIS 333605, ISIS 333606, ISIS 333609-333617, ISIS 333619, ISIS 333620-333636, ISIS 333638 e ISIS 333640) descritos en esta invención, se usaron como compuestos de comparación en pantallas seleccionadas para los nuevos compuestos antlsentldo descritos en esta Invención.
En determinados aspectos, ISIS 333611, un gapmero 5-10-5 MOE, que tiene una secuencia de (de 5' a 3') CCGTCGCCCTTCAGCACGCA (incorporado en esta invención como la SEQ ID NO:21), donde cada enlace ¡nternucleosídlco es un enlace fosforotloato, cada cltoslna es una 5-metllcltoslna, y cada uno de los nucleósldos 1-5 y 16-20 (de 5' a 3') comprenden un resto 2'-0-metoxietilo se usó como compuesto de comparación. ISIS 333611 fue seleccionado como un compuesto de comparación porque presentaba altos niveles de inhibición dependiente de la dosis en diversos estudios como se describe enel documento WO 2005/040180. Además, los ensayos clínicos de fase 1 en humanos se completaron con ISIS 333611. Véase,MILLER y col., "An antisense oligonucleotide against SOD1 delivered ¡ntrathecally for patlents with SOD1 familial amyotrophic lateral sclerosis: a phase 1, randomised, first-in-man study" Lancet Neurol. (2013) 12(5): 435-442. Por lo tanto, ISIS 333611 se consideró un compuesto altamente eficaz y potente con un perfil de seguridad aceptable (tal que se sometió a prueba en pacientes humanos).
En determinados aspectos, los compuestos descritos en esta invención se benefician de una o más propiedades mejoradas en relación con los compuestos antisentido descritos en el documento WO 2005/040180. Algunas de las propiedades mejoradas se demuestran en los ejemplos proporcionados en esta invención. En determinados aspectos, los compuestos descritos en esta invención son más eficaces, potentes, y/o tolerables en diversos estudios in vitro e in vivo que los compuestos de comparación descritos en esta Invención, Incluido ISIS 333611. En determinados aspectos, ISIS 666853, ISIS 666859, ISIS 666919, ISIS 666921, ISIS 666922, ISIS 666869, ISIS 666870 e ISIS 666867 son más eficaces y/o potentes en diversos estudios ¡n vitro e in vivo que los compuestos de comparación descritos en esta Invención, Incluido ISIS 333611. En determinados aspectos, ISIS 666853, ISIS 666859, ISIS 666919, ISIS 666921, ISIS 666922, ISIS 666869, ISIS 666870 e ISIS 666867 son más tolerables en uno o más ensayos de tolerabllldad en animales que los compuestos de comparación descritos en esta invención, incluido ISIS 333611. Esto, a pesar de que 333611 es lo suficientemente bien tolerado como para avanzar a ensayos clínicos en humanos.
En determinados aspectos, determinados compuestos descritos en esta invención son más eficaces que los compuestos de comparación en virtud de una CI50 in vitro de menos de 2 pM, menos de 1,9 pM, menos de 1,8 pM, menos de 1,7 pM, menos de 1,6 pM, menos de 1,5 pM, menos de 1,4 pM, menos de 1,3 pM, menos de 1,2 pM, menos de 1,1 pM, menos de 1 pM, menos de 0,9 pM, menos de 0,8 pM, menos de 0,7 pM, menos de 0,6 pM, o menos de 0,5 pM menos de 0,4 pM, menos de 0,3 pM, menos de 0,2 pM, menos de 0,1 pM, cuando se somete a prueba en células humanas, por ejemplo, en las líneas celulares HepG2 A431 o SH-SY5Y (por ejemplo, véase los ejemplos 6-11).
En determinados aspectos, determinados compuestos descritos en esta invención son más eficaces que los compuestos de comparación en virtud de su capacidad para Inhibir la expresión de SOD-1 ¡n vivo. En determinados aspectos, los compuestos Inhiben SOD-1 en la médula espinal lumbar y la médula espinal cervical en al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % en, por ejemplo, un modelo de animal transgénico.
En determinados aspectos, determinados compuestos descritos en esta invención son más tolerables que los compuestos de comparación sobre la base de niveles reducidos de marcadores mlcrogllales (por ejemplo, IBA1), niveles reducidos de marcadores astrocíticos (por ejemplo, GFAP), y/o Puntajes FOB en ratas, ratones y/o monos. Véase, por ejemplo, los ejemplos 14, 15, 18, y 19.
ISIS 666853
Por ejemplo, como se proporciona en el ejemplo 12 (más adelante), ISIS 666853 logró un 81 % de Inhibición en la médula espinal lumbar y un 74 % en la médula espinal cervical de un modelo de rata transgénlca SOD-1 cuando se dosificó con 30 pl de solución de 16,67 mg/ml de oligonucleótido de diluido en PBS (dosis final de 500 pg), mientras que ISIS 333611 logró un 51 % de Inhibición en la médula espinal lumbar y un 47 % de Inhibición en la médula espinal cervical.
Por ejemplo, como se proporciona en el ejemplo 14 (más adelante), ISIS 666853 logró un puntaje FOB de 0, mientras que ISIS 333611 logró un puntaje FOB de 4 en ratas Sprague-Dawley después de 3 horas cuando se trató con 3 mg de oligonucleótido. Los niveles de marcador mlcroglial (IBA1) y los niveles de marcador astrocítico (GFAP) también se redujeron en ratas tratadas con ISIS 666853 en comparación con ratas tratadas con ISIS 333611.
Por ejemplo, como se proporciona en el ejemplo 15 (más adelante), ISIS 666853 logró una DE 50 de 81,3 y 242,6 en tejido lumbar y tejido cervical (respectivamente) en ratas transgénicas SOD-1 cuando se trató por vía intratecal con 10, 30, 100, 300 o 3000 pg de oligonucleótido. La DEsoen tejidos lumbares y cervicales no se pudo calcular en ratas transgénicas tratadas con ISIS 333611 porque la concentración más alta que se sometió a prueba (3.000 pg) presentó para inhibir ARNm de SOD-1 humano mayor que 55-65 %.
Por ejemplo, como se proporciona en el ejemplo 16 (más adelante), a dosis de 1 mg y 3 mg, ISIS 666853 logró puntajes FOB de 3 horas de 0,0 y 0,5 (respectivamente) mientras que ISIS 333611 logró puntajes FOB de 3,0 y 4,9 (respectivamente). A dosis de 1 mg y 3 mg, ISIS 666853 logró puntajes FOB de 8 semanas de 0,0 y 0,0 (respectivamente) mientras que ISIS 333611 logró puntajes FOB de 0,0 y 1,2 (respectivamente).
Por ejemplo, como se proporciona en el ejemplo 17 (más adelante), ISIS 666853 logró una DE 50 de 136 y 188 en tejido lumbar y tejido cortical (respectivamente) mientras que ISIS 333611 logró una DE 50 de 401 y 786 en tejido lumbar y tejido cortical (respectivamente) en ratones transgénicos SOD-1 cuando se trató con un bolo ventricular intracerebral de 10, 30, 100, 300 o 700 pg de oligonucleótido.
Por ejemplo, como se proporciona en el ejemplo 18 (más adelante), ISIS 666853 logró un puntaje FOB de 1,25, mientras que ISIS 333611 logró un puntaje FOB de 6,5 en ratones C57bl6 después de 3 horas cuando se trató con 700 pg de oligonucleótido. Los niveles de marcador mlcroglial (IBA1) y los niveles de marcador astrocítico (GFAP) también se redujeron en ratones tratados con ISIS 666853 en comparación con ratones tratados con ISIS 333611.
ISIS 666859
Por ejemplo, como se proporciona en el ejemplo 12 (más adelante), ISIS 666859 logró un 79 % de Inhibición en la médula espinal lumbar y un 64 % en la médula espinal cervical de un modelo de rata transgénlca SOD-1 cuando se dosificó con 30 pl de solución de 16,67 mg/ml de oligonucleótido diluido en PBS (dosis final de 500 pg), mientras que ISIS 333611 logró un 51 % de Inhibición en la médula espinal lumbar y un 47 % de Inhibición en la médula espinal cervical.
Por ejemplo, como se proporciona en el ejemplo 14 (más adelante), ISIS 666859 logró un puntaje FOB de 1, mientras que ISIS 333611 logró un puntaje FOB de 4 en ratas Sprague-Dawley después de 3 horas cuando se trató con 3 mg de oligonucleótido. Los niveles de marcador mlcroglial (IBA1) y los niveles de marcador astrocítico (GFAP) también se redujeron en ratas tratadas con ISIS 666859 en comparación con ratas tratadas con ISIS 333611.
Por ejemplo, como se proporciona en el ejemplo 15 (más adelante), ISIS 666859 logró una DE 50 de 74,0 y 358,8 en tejido lumbar y tejido cervical (respectivamente) en ratas transgénicas SOD-1 cuando se trató por vía intratecal con 10, 30, 100, 300 o 3000 pg de oligonucleótido. La DEsoen tejidos lumbares y cervicales no se pudo calcular en ratas transgénicas tratadas con ISIS 333611 porque la concentración más alta que se sometió a prueba (3.000 pg) presentó para inhibir ARNm de SOD-1 humano mayor que 55-65 %.
Por ejemplo, como se proporciona en el ejemplo 16 (más adelante), a dosis de 1 mg y 3 mg, ISIS 666859 logró puntajes FOB de 3 horas de 0,0 y 2,1 (respectivamente) mientras que ISIS 333611 logró puntajes FOB de 3,0 y 4,9 (respectivamente). A dosis de 1 mg y 3 mg, ISIS 666859 logró puntajes FOB de 8 semanas de 0,0 y 0,3 (respectivamente) mientras que ISIS 333611 logró puntajes FOB de 0,0 y 1,2 (respectivamente).
Por ejemplo, como se proporciona en el ejemplo 17 (más adelante), ISIS 666859 logró una DE 50 de 106 y 206 en tejido lumbar y tejido cortical (respectivamente) mientras que ISIS 333611 logró una DE 50 de 401 y 786 en tejido lumbar y tejido cortical (respectivamente) en ratones transgénicos SOD-1 cuando se trató con un bolo ventricular intracerebral de 10, 30, 100, 300 o 700 pg de oligonucleótido.
Por ejemplo, como se proporciona en el ejemplo 18 (más adelante), ISIS 666859 logró un puntaje FOB de 1,75, mientras que ISIS 333611 logró un puntaje FOB de 6,5 en ratones C57bl6 después de 3 horas cuando se trató con 700 pg de ollgonucleótldo. Los niveles de marcador mlcrogllal (IBA1) y los niveles de marcador astrocítlco (GFAP) también se redujeron en ratones tratados con ISIS 666859 en comparación con ratones tratados con ISIS 333611.
ISIS 666919
Por ejemplo, como se proporciona en el ejemplo 12 (más adelante), ISIS 666919 logró un 76 % de Inhibición en la médula espinal lumbar y un 68 % en la médula espinal cervical de un modelo de rata transgénlca SOD-1 cuando se dosificó con 30 pl de solución de 16,67 mg/ml de ollgonucleótldo diluido en PBS (dosis final de 500 pg), mientras que ISIS 333611 logró un 51 % de Inhibición en la médula espinal lumbar y un 47 % de Inhibición en la médula espinal cervical.
Por ejemplo, como se proporciona en el ejemplo 14 (más adelante), ISIS 666919 logró un puntaje FOB de 2, mientras que ISIS 333611 logró un puntaje FOB de 4 en ratas Sprague-Dawley después de 3 horas cuando se trató con 3 mg de ollgonucleótldo. Los niveles de marcador mlcrogllal (IBA1) y los niveles de marcador astrocítico (GFAP) también se redujeron en ratas tratadas con ISIS 666919 en comparación con ratas tratadas con ISIS 333611.
Por ejemplo, como se proporciona en el ejemplo 15 (más adelante), ISIS 666919 logró una DEso de 104,1 y 613,5 en tejido lumbar y tejido cervical (respectivamente) en ratas transgénicas SOD-1 cuando se trató por vía intratecal con 10, 30, 100, 300 o 3000 pg de oligonucleótido. La DEso en tejidos lumbares y cervicales no se pudo calcular en ratas transgénicas tratadas con ISIS 333611 porque la concentración más alta que se sometió a prueba (3.000 pg) presentó para inhibir ARNm de SOD-1 humano mayor que 55-65 %.
Por ejemplo, como se proporciona en el ejemplo 16 (más adelante), a dosis de 1 mg y 3 mg, ISIS 666919 logró puntajes FOB de 3 horas de 1,3 y 3,5 (respectivamente) mientras que ISIS 333611 logró puntajes FOB de 3,0 y 4,9 (respectivamente). A dosis de 1 mg y 3 mg, ISIS 666919 logró puntajes FOB de 8 semanas de 0,0 y 0,1 (respectivamente) mientras que ISIS 333611 logró puntajes FOB de 0,0 y 1,2 (respectivamente).
Por ejemplo, como se proporciona en el ejemplo 17 (más adelante), ISIS 666919 logró una DEso de 168 en tejido lumbar mientras que ISIS 333611 logró una DEso de 401 en tejido lumbar en ratones transgénlcos SOD-1 cuando se trató con un bolo ventricular intracerebral de 10, 30, 100, 300 o 700 pg de oligonucleótido.
Por ejemplo, como se proporciona en el ejemplo 18 (más adelante), ISIS 666919 logró un puntaje FOB de 0,0, mientras que ISIS 333611 logró un puntaje FOB de 6,5 en ratones C57bl6 después de 3 horas cuando se trató con 700 pg de ollgonucleótldo. Los niveles de marcador mlcrogllal (IBA1) y los niveles de marcador astrocítlco (GFAP) también se redujeron en ratones tratados con ISIS 666919 en comparación con ratones tratados con ISIS 333611.
ISIS 666921
Por ejemplo, como se proporciona en el ejemplo 12 (más adelante), ISIS 66621 logró un 71 % de Inhibición en la médula espinal lumbar y un 65 % en la médula espinal cervical de un modelo de rata transgénlca SOD-1 cuando se dosificó con 30 pl de solución de 16,67 mg/ml de ollgonucleótldo diluido en PBS (dosis final de 500 pg), mientras que ISIS 333611 logró un 51 % de Inhibición en la médula espinal lumbar y un 47 % de Inhibición en la médula espinal cervical.
Por ejemplo, como se proporciona en el ejemplo 14 (más adelante), ISIS 666921 logró un puntaje FOB de 2, mientras que ISIS 333611 logró un puntaje FOB de 4 en ratas Sprague-Dawley después de 3 horas cuando se trató con 3 mg de ollgonucleótldo. Los niveles de marcador mlcrogllal (IBA1) y los niveles de marcador astrocítico (GFAP) también se redujeron en ratas tratadas con ISIS 666919 en comparación con ratas tratadas con ISIS 333611.
ISIS 666922
Por ejemplo, como se proporciona en el ejemplo 12 (más adelante), ISIS 666922 logró un 67 % de Inhibición en la médula espinal lumbar y un 62 % en la médula espinal cervical de un modelo de rata transgénlca SOD-1 cuando se dosificó con 30 pl de solución de 16,67 mg/ml de ollgonucleótldo diluido en PBS (dosis final de 500 pg), mientras que ISIS 333611 logró un 51 % de Inhibición en la médula espinal lumbar y un 47 % de Inhibición en la médula espinal cervical.
Por ejemplo, como se proporciona en el ejemplo 14 (más adelante), ISIS 666922 logró un puntaje FOB de 3, mientras que ISIS 333611 logró un puntaje FOB de 4 en ratas Sprague-Dawley después de 3 horas cuando se trató con 3 mg de oligonucleótido. Los niveles de marcador mlcroglial (IBA1) y los niveles de marcador astrocítico (GFAP) también se redujeron en ratas tratadas con ISIS 666919 en comparación con ratas tratadas con ISIS 333611.
ISIS 666869
Por ejemplo, como se proporciona en el ejemplo 12 (más adelante), ISIS 666869 logró un 82 % de inhibición en la médula espinal lumbar y un 81 % en la médula espinal cervical de un modelo de rata transgénica SOD-1 cuando se dosificó con 30 pl de solución de 16,67 mg/ml de oligonucleótido diluido en PBS (dosis final de 500 pg), mientras que ISIS 333611 logró un 51 % de inhibición en la médula espinal lumbar y un 47 % de inhibición en la médula espinal cervical.
ISIS 666870
Por ejemplo, como se proporciona en el ejemplo 12 (más adelante), ISIS 666870 logró un 76 % de inhibición en la médula espinal lumbar y un 68 % en la médula espinal cervical de un modelo de rata transgénica SOD-1 cuando se dosificó con 30 pl de solución de 16,67 mg/ml de oligonucleótido diluido en PBS (dosis final de 500 pg), mientras que ISIS 333611 logró un 51 % de inhibición en la médula espinal lumbar y un 47 % de inhibición en la médula espinal cervical.
Por ejemplo, como se proporciona en el ejemplo 15 (más adelante), ISIS 666870 logró una DEso de 139,4 y 1111 en tejido lumbar y tejido cervical (respectivamente) en ratas transgénicas SOD-1 cuando se trató por vía intratecal con 10, 30, 100, 300 o 3000 pg de oligonucleótido. La DEso en tejidos lumbares y cervicales no se pudo calcular en ratas transgénicas tratadas con ISIS 333611 porque la concentración más alta que se sometió a prueba (3.000 pg) presentó para inhibir ARNm de SOD-1 humano mayor que 55-65 %.
Por ejemplo, como se proporciona en el ejemplo 17 (más adelante), ISIS 666870 logró una DEso de 148 y 409 en tejido lumbar y tejido cortical (respectivamente) mientras que ISIS 333611 logró una DEso de 401 y 786 en tejido lumbar y tejido cortical (respectivamente) en ratones transgénicos SOD-1 cuando se trató con un bolo ventricular intracerebral de 10, 30, 100, 300 o 700 pg de oligonucleótido.
Por ejemplo, como se proporciona en el ejemplo 18 (más adelante), ISIS 666870 logró un puntaje FOB de 4,75, mientras que ISIS 333611 logró un puntaje FOB de 6,5 en ratones C57bl6 después de 3 horas cuando se trató con 700 pg de oligonucleótido.
ISIS 666867
Por ejemplo, como se proporciona en el ejemplo 12 (más adelante), ISIS 666867 logró un 59 % de inhibición en la médula espinal lumbar y un 48 % en la médula espinal cervical de un modelo de rata transgénica SOD-1 cuando se dosificó con 30 pl de solución de 16,67 mg/ml de oligonucleótido diluido en PBS (dosis final de 500 pg), mientras que ISIS 333611 logró un 51 % de inhibición en la médula espinal lumbar y un 47 % de inhibición en la médula espinal cervical.
Algunas composiciones
1. ISIS 666853
En determinados aspectos, ISIS 666853 se caracteriza como un gapmero 5-10-5 MOE, que tiene una secuencia de (de 5' a 3') CAGGATACATTTCTACAGCT (incorporada en esta invención como la SEQ ID NO:725), donde cada uno de los nucleósldos 1-5 y 16-20 son nucleósldos modificados con 2 '-0-metoxletllrrlbosa, y cada uno de los nucleósldos 6-15 son 2'-desoxinucleósldos, donde los enlaces ¡nternucleosídlcos entre los nucleósldos 2 a 3, 4 a 5, 16 a 17 y 18 a 19 son enlaces fosfodléster y los enlaces ¡nternucleosídlcos entre los nucleósldos 1 a 2, 3 a 4, 5 a 6, 6 a 7, 7 a 8, 8 a 9, 9 a 10, 10 a 11, 11 a 12, 12 a 13, 13 a 14, 14 a 15, 15 a 16, 17 a 18 y 19 a 20 son enlaces fosforotioato, y donde cada citosina es una 5-metllcltoslna.
En determinados aspectos, ISIS 666853 se describe mediante la siguiente notación química: mCes Aeo Ges Geo Aes Tds Ads mCds Ads Tds Tds Tds mCds Tds Ads mCeo Aes Geo mCes Te; donde,
A = una adenina,
mC = una 5-metilcitosina
G = una guanina,
T = una timina,
e = un azúcar modificado con 2'-0-metoxietilrribosa,
d = un azúcar 2'-desoxirribosa,
s = un enlace internucleosídico fosforotioato y
o = un enlace ¡nternucleosídico fosfodiéster.
En determinados aspectos, ISIS 666853 se describe mediante la siguiente estructura química:
Figure imgf000032_0001
Estructura 1. ISIS 666853
2. ISIS 666859
En determinados aspectos, ISIS 666859 se caracteriza como un ollgonucleótldo modificado, que tiene la secuencia de nucleobases (de 5' a 3') TTAATGTTTATCAGGAT (incorporada en esta invención como la SEQ ID NO:1351), que consiste en diecisiete nucleósidos, donde cada uno de los nucleósidos 1-4 y 15-17 son nucleósldos 2'-0-metoxietilrribosa, donde cado de los nucleósidos 13 y 14 son nucleósidos modificados con cEt, donde cada uno de los nucleósidos 5-12 son 2'-desoxlrríbonucleós¡dos, donde los enlaces ¡nternucleosídlcos entre los nucleósidos 2 a 3, 3 a 4, 13 a 14 y 14 a 15 son enlaces fosfodiéster y los enlaces ¡nternucleosídlcos entre los nucleósidos 1 a 2, 4 a 5, 5 a 6, 6 a 7, 7 a 8, 8 a 9, 9 a 10, 10 a 11, 11 a 12, 12 a 13, 15 a 16 y 16 a 17 son enlaces fosforotioato, y donde cada citosina es una 5-metilcitosina.
En determinados aspectos, ISIS 666859 se describe mediante la siguiente notación química: Tes Teo Aeo Aes Tds Gds Tds Tds Tds Ads Tds mCds Ako Gko Ges Aes Te; donde,
A = una adenlna,
mC = una 5-metilcitosina
G = una guanina,
T = una timina,
e = un azúcar modificado con 2'-0-metoxietilrribosa,
k = un azúcar modificado con cET,
d = un azúcar 2'-desoxlrrlbosa,
s = un enlace ¡nternucleosídico fosforotioato y
o = un enlace ¡nternucleosídico fosfodiéster.
En determinados aspectos, ISIS 666859 se describe mediante la siguiente estructura química:
Figure imgf000033_0001
Estructura 2. ISIS 666859
3. ISIS 666919
En determinados aspectos, ISIS 666919 se caracteriza como un oligonucleótido modificado, que tiene la secuencia de nucleobases (de 5' a 3') GGATACATTTCTACAGC (incorporada en esta invención como la SEQ ID NO:1342), que consiste en diecisiete nucleósidos, donde cada uno de los nucleósidos 1-4 y 16-17 son nucleósidos modificados con 2'-0-metoxietilrribosa, donde cada uno de los nucleósidos 14 y 15 son nucleósidos modificados con cEt, donde cada uno de los nucleósidos 5-13 son 2'-desoxirribonucleósidos, donde los enlaces internucleosídicos entre los nucleósidos 2 a 3, 3 a 4 , 4 a 5 y 14 a 15 son enlaces fosfodiéster y los enlaces internucleosídicos entre los nucleósidos 1 a 2, 5 a 6, 6 a 7, 7 a 8, 8 a 9, 9 a 10, 10 a 11,11 a12 , 12 a 13, 13a 14 , 15 a 16 y 16 a 17 son enlaces fosforotioato, y donde cada citosina es una 5-metilcitosina. En determinados aspectos, ISIS 666919 se describe mediante la siguiente notación química: Ges Geo Aeo Teo Ads mCds Ads Tds Tds Tds mCds Tds Ads mCko Aks Ges mCe; donde,
A = una adenina,
mC = una 5-metilcitosina
G = una guanina,
T = una timina,
e = un azúcar modificado con 2'-0-metoxietilrribosa,
k = un azúcar modificado con cET,
d = un azúcar 2'-desoxirribosa,
s = un enlace internucleosídico fosforotioato y
o = un enlace internucleosídico fosfodiéster.
En determ inados aspectos, IS IS 666919 se describe m ediante la siguiente estructura quím ica:
Figure imgf000034_0001
Estructura 3. ISIS 666919
4. ISIS 666921
En determinados aspectos, ISIS 666921 se caracteriza como un oligonucleótido modificado, que tiene la secuencia de nucleobases (de 5' a 3') GGATACATTTCTACAGC (incorporada en esta invención como la SEQ ID NO:1342), que consiste en diecisiete nucleósidos, donde cada uno de los nucleósidos 1-5 y 16-17 son nucleósidos modificados con 2'-0-metoxietilrribosa, donde cada uno de los nucleósidos 14-15 son nucleósidos modificados con cEt, donde cada uno de los nucleósidos 6-13 son 2'-desoxirribonucleósidos, donde los enlaces internucleosídicos entre los nucleósidos 2 a 3, 3 a 4, 4 a 5 y 14 a 15 son enlaces fosfodiéster y los enlaces internucleosídicos entre los nucleósidos 1 a 2, 5 a 6, 6 a 7, 7 a 8, 8 a 9, 9 a 10 , 10a 11, 11 a 12, 12a 13 , 13a 14, 15 a 16 y 16 a 17 son enlaces fosforotioato, y donde cada citosina es una 5-metilcitosina.
En determinados aspectos, ISIS 666921 se describe mediante la siguiente notación química: Ges Geo Aeo Teo Aes mCds Ads Tds Tds Tds mCds Tds Ads mCko Aks Ges mCe; donde,
A = una adenina,
mC = una 5-metilcitosina
G = una guanina,
T = una timina,
e = un azúcar modificado con 2'-0-metoxietilrribosa,
k = un azúcar modificado con cET,
d = un azúcar 2'-desoxirribosa,
s = un enlace internucleosídico fosforotioato y
o = un enlace internucleosídico fosfodiéster.
En determ inados aspectos, IS IS 666921 se describe m ediante la siguiente estructura quím ica:
Figure imgf000035_0001
Estructura 4. ISIS 666921
5. ISIS 666922
En determinados aspectos, ISIS 666922 se caracteriza como un oligonucleótido modificado, que tiene la secuencia de nucleobases (de 5' a 3') GGATACATTTCTACAGC (incorporada en esta invención como la SEQ ID NO:1342), que consiste en diecisiete nucleósidos, donde cada uno de los nucleósidos 1-4 y 15-17 son nucleósidos modificados con 2'-0-metoxietilrribosa, donde cada uno de los nucleósidos 5 y 14 son nucleósidos modificados con cEt, donde cada uno de los nucleósidos 6-13 son 2'-desoxirribonucleósidos, donde los enlaces internucleosídicos entre los nucleósidos 2 a 3, 3 a 4, 4 a 5 y 14 a 15 son enlaces fosfodiéster y los enlaces internucleosídicos entre los nucleósidos 1 a 2, 5 a 6, 6 a 7, 7 a 8, 8 a 9, 9 a 10 , 10a 11, 11 a 12, 12a 13 , 13a 14, 15 a 16 y 16 a 17 son enlaces fosforotioato, y donde cada citosina es una 5-metilcitosina.
En determinados aspectos, ISIS 666922 se describe mediante la siguiente notación química: Ges Geo Aeo Teo Aks mCds Ads Tds Tds Tds mCds Tds Ads mCko Aes Ges mCe; donde,
A = una adenina,
mC = una 5-metilcitosina
G = una guanina,
T = una timina,
e = un azúcar modificado con 2'-0-metoxietilrribosa,
k = un azúcar modificado con cET,
d = un azúcar 2'-desoxirribosa,
s = un enlace internucleosídico fosforotioato y
o = un enlace internucleosídico fosfodiéster.
En determ inados aspectos, IS IS 666922 se describe m ediante la siguiente estructura quím ica:
Figure imgf000036_0001
Estructura 5. ISIS 666922
6. ISIS 666869
En determinados aspectos, ISIS 666869 se caracteriza como un oligonucleótido modificado, que tiene la secuencia de nucleobases (de 5' a 3') AGTGTTTAATGTTTATC (incorporada en esta invención como la SEQ ID NO:1173), que consiste en diecisiete nucleósidos, donde cada uno de los nucleósidos 1,3, 14 y 16-17 son nucleósidos modificados con 2'-0-metoxietilrribosa, donde cada uno de los nucleósidos 2, 4, 13 y 15 son nucleósidos modificados con cEt, donde cada uno de los nucleósidos 5-12 son 2'-desoxirribonucleósidos, donde los enlaces internucleosídicos entre los nucleósidos 2 a 3, 3 a 4, 13 a 14 y 14 a 15 son enlaces fosfodiéster y los enlaces internucleosídicos entre los nucleósidos 1 a 2 ,4 a 5, 5 a 6, 6 a 7, 7 a 8, 8 a 9, 9 a 10, 10 a 11, 11 a 12, 12 a 13, 15 a 16 y 16 a 17 son enlaces fosforotioato, y donde cada citosina es una 5-metilcitosina.
En determinados aspectos, ISIS 666869 se describe mediante la siguiente notación química: Aes Gko Teo Gks Tds Tds Tds Ads Ads Tds Gds Tds Tko Teo Aks Tes mCe; donde,
A = una adenina,
mC = una 5-metilcitosina
G = una guanina,
T = una timina,
e = un azúcar modificado con 2'-0-metoxietilrribosa,
k = un azúcar modificado con cET,
d = un azúcar 2'-desoxirribosa,
s = un enlace internucleosídico fosforotioato y
o = un enlace internucleosídico fosfodiéster.
En determ inados aspectos, IS IS 666869 se describe m ediante la siguiente estructura quím ica:
Figure imgf000037_0001
Estructura 6. ISIS 666869
7. ISIS 666870
En determinados aspectos, ISIS 666870 se caracteriza como un oligonucleótido modificado, que tiene la secuencia de nucleobases (de 5' a 3') AGTGTTTAATGTTTATC (incorporada en esta invención como la SEQ ID NO:1173), que consiste en diecisiete nucleósidos, donde cada uno de los nucleósidos 1, 3, 13-17 son nucleósidos modificados con 2'-0-metoxietilrribosa, donde cada uno de los nucleósidos 2 y 4 son nucleósidos modificados con cEt, donde cada uno de los nucleósidos 5-12 son 2'-desoxirribonucleósidos, donde los enlaces internucleosídicos entre los nucleósidos 2 a 3, 3 a 4, 13 a 14 y 14 a 15 son enlaces fosfodiéster y los enlaces internucleosídicos entre los nucleósidos 1 a 2, 4 a 5, 5 a 6, 6 a 7, 7 a 8, 8 a 9, 9 a 10, 10 a 11, 11 a 12, 12 a 13, 15 a 16 y 16 a 17 son enlaces fosforotioato, y donde cada citosina es una 5-metilcitosina.
En determinados aspectos, ISIS 666870 se describe mediante la siguiente notación química: Aes Gko Teo Gks Tds Tds Tds Ads Ads Tds Gds Tds Teo Teo Aes Tes mCe; donde,
A = una adenina,
mC = una 5-metilcitosina
G = una guanina,
T = una timina,
e = un azúcar modificado con 2'-0-metoxietilrribosa,
k = un azúcar modificado con cET,
d = un azúcar 2'-desoxirribosa,
s = un enlace internucleosídico fosforotioato y
o = un enlace internucleosídico fosfodiéster.
En determ inados aspectos, IS IS 666870 se describe m ediante la siguiente estructura quím ica:
Figure imgf000038_0001
Estructura 7. ISIS 666870
8. ISIS 666867
En determinados aspectos, ISIS 666867 se caracteriza como un oligonucleótido modificado, que tiene la secuencia de nucleobases (de 5' a 3') AGTGTTTAATGTTTATC (incorporada en esta invención como la SEQ ID NO:1173), que consiste en diecisiete nucleósidos, donde cada uno de los nucleósidos 1-2 y 13-17 son nucleósidos modificados con 2'-0-metoxietilrribosa, donde cada uno de los nucleósidos 3 y 4 son nucleósidos modificados con cEt, donde cada uno de los nucleósidos 5-12 son 2'-desoxirribonucleósidos, donde los enlaces internucleosídicos entre los nucleósidos 2 a 3, 3 a 4, 13 a 14 y 14 a 15 son enlaces fosfodiéster y los enlaces internucleosídicos entre los nucleósidos 1 a 2, 4 a 5, 5 a 6, 6 a 7, 7 a 8, 8 a 9, 9 a 10, 10 a 11, 11 a 12, 12 a 13, 15 a 16 y 16 a 17 son enlaces fosforotioato, y donde cada citosina es una 5-metilcitosina.
En determinados aspectos, ISIS 666867 se describe mediante la siguiente notación química: Aes Geo Tko Gks Tds Tds Tds Ads Ads Tds Gds Tds Teo Teo Aes Tes mCe; donde,
A = una adenina,
mC = una 5-metilcitosina
G = una guanina,
T = una timina,
e = un azúcar modificado con 2'-0-metoxietilrribosa,
k = un azúcar modificado con cET,
d = un azúcar 2'-desoxirribosa,
s = un enlace internucleosídico fosforotioato y
o = un enlace internucleosídico fosfodiéster.
En determ inados aspectos, IS IS 666867 se describe m ediante la siguiente estructura quím ica:
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Estructura 8. ISIS 666867
Ejemplos
Descripción no limitativa e incorporación por referencia
Mientras que determinados compuestos, composiciones y procedimientos descritos en esta invención se han descrito con especificidad conforme a determinados aspectos, los siguientes ejemplos sirven solo para ilustrar los compuestos descritos en esta invención y no pretenden limitarla.
Ejemplo 1: Inhibición de la superóxido dismutasa 1 humana soluble (SOD-1) en células HepG2 por gapmeros MOE
Los oligonucleótidos modificados se diseñaron para dirigirse a un ácido nucleico de superóxido dismutasa 1 soluble (SOD-1) y se sometieron a prueba para determinar sus efectos en el ARNm de SOD-1 in vitro. ISIS 146144, ISIS 146145, ISIS 150437, ISIS 150441, ISIS 150443, ISIS 150444, ISIS 150445, ISIS 150446, ISIS 150447, ISIS 150448, ISIS 150449, ISIS 150452, ISIS 150454, ISIS 150458, ISIS 150460, ISIS 150462-150467, ISIS 150470, ISIS 150472, ISIS 150474, ISIS 150475, ISIS 150476, ISIS 150479-150483, ISIS 150488, ISIS 150489, ISIS 150490, ISIS 150491-150493, ISIS 150495-150498, ISIS 150511, ISIS 333605, ISIS 333606, ISIS 333609-333617, ISIS 333619, ISIS 333620-333636, ISIS 333638 e ISIS 333640, previamente descritos en el documento WO 2005/040180, también se incluyeron en este ensayo. ISIS 333611, previamente descrito en el documento WO 2005/040180, también se designó como un oligonucleótido de referencia o de comparación. ISIS 333611 se sometió a prueba recientemente en ensayos clínicos en humanos. Véase, MILLER y col., "An antisense oligonucleotide against SOD1 delivered intrathecally for patients with SOD1 familial amyotrophic lateral sclerosis: a phase 1, randomised, first-in-man study" Lancet Neurol. 2013; 12(5): 435-442.
Los oligonucleótidos modificados se sometieron a prueba en una serie de experimentos que tenían condiciones de cultivo similares. Los resultados de cada experimento se presentan en tablas separadas que se muestran más adelante. Las células HepG2 cultivadas a una densidad de 20.000 células por pocilio se transfectaron utilizando electroporación con oligonucleótido modificado 7.000 nM. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 24 horas, el ARN se aisló de las células y los niveles de ARNm de SOD-1 se midieron mediante PCR cuantitativa en tiempo real.
Se utilizó un conjunto de sonda de cebador RTS3898 humano (secuencia directa CTCTCAGGAGACCATTGCATCA, designada en esta invención como la SEQ ID NO:11; secuencia inversa TCCTGTCTTTGTACTTTCTTCATTTCC; designada en esta invención como la SEQ ID NO: 12; secuencia de sonda CCGCACACTGGTGGTCCATGAAAA, designada en esta invención como la SEQ ID NO: 13) para medir los niveles de ARNm. En los casos en que el oligonucleótido solapaba el amplicón del conjunto de sonda de cebador, se utilizó un conjunto de sonda de cebador alternativo, HTS90 (secuencia directa CGTGGCCTAGCGAGTTATGG, designada en esta invención como la SEQ ID NO:14; secuencia inversa GAAATTGATGATGCCCTGCA; designada en esta invención como la SEQ ID NO: 15; secuencia de sonda ACGAAGGCCGTGTGCGTGCTGX, designada en esta invención como la SEQ ID NO: 16),para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de SOD-1 se ajustaron según el contenido de ARN total, tal como se midió por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de SOD-1, en relación con las células de control no tratadas, 'nd' indica que los niveles de inhibición no se midieron usando el conjunto particular de sonda de cebador.
Los oligonucleótidos modificados de nuevo diseño en las tablas a continuación se diseñaron como los gapmeros 5-10-5 MOE. Los gapmeros 5-10-5MOE tienen una longitud de 20 nucleósidos, donde el segmento de brecha central comprende diez 2'-desoxirribonucleósidos y se encuentra flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cinco nucleósidos cada una. Cada nucleósido en el segmento de ala 5' y cada nucleósido en el segmento de ala 3' tiene una modificación 2'-MOE. Los enlaces internucleosídicos en cada gapmero son enlaces fosforotioato. Todos los residuos de citosina en cada gapmero son 5-metilcitosinas. El "sitio de inicio" indica el nucleósido más cercano a la posición 5', al cual se dirige el gapmero en la secuencia génica humana. El "sitio de detención" indica el nucleósido más cercano a la posición 3' al cual se dirige el gapmero en la secuencia génica humana. Cada gapmero enumerado en las tablas a continuación está dirigido al ARNm de SOD-1 humano, designado en esta invención como la SEQ ID NO:1 (n.° de acceso GENBANK NM 000454.4) o la secuencia genómica de SOD-1 humano, designada en esta invención como la SEQ ID NO:2 (n.° de acceso GENBANK NT 011512.10 truncado de los nucleótidos 18693000 a 18704000). 'n/a' indica que el oligonucleótido modificado no se dirige a esa secuencia génica particular con un 100 % de complementariedad.
Tabla 1
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Tabla 2
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Tabla 3
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Tabla 4
Figure imgf000046_0003
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Tabla 5
Figure imgf000048_0002
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Tabla 6
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Tabla 7
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Tabla 8
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Tabla 9
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Tabla 10
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Ejemplo 2: Inhibición de SOD-1 humano en células HepG2 por gapmeros MOE
Los oligonucleótidos modificados se diseñaron para dirigirse a un ácido nucleico de superóxido dismutasa 1 soluble (SOD-1) y se sometieron a prueba para determinar sus efectos en el ARNm de SOD-1 ¡n vitro. ISIS 146143, ISIS 150438-150440, ISIS 150442, ISIS 150450, ISIS 150455-150457, ISIS 150459, ISIS 150461, ISIS 150469, ISIS 150473, ISIS 150478, ISIS 150484, ISIS 150486, ISIS 150494, ISIS 150508-150510, ISIS 333607, ISIS 333608, ISIS 333611, ISIS 333618, previamente descritos enel documento WO 2005/040180, también se Incluyeron en este ensayo. Los ollgonucleótldos modificados se sometieron a prueba en una serle de experimentos que tenían condiciones de cultivo similares. Los resultados de cada experimento se presentan en tablas separadas que se muestran más adelante. Las células HepG2 cultivadas a una densidad de 20.000 células por pocilio se transfectaron utilizando electroporaclón con ollgonucleótldo modificado 5.000 nM. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 24 horas, el ARN se aisló de las células y los niveles de ARNm de SOD-1 se midieron mediante PCR cuantitativa en tiempo real.
'Se utilizó un conjunto de sonda de cebador RTS3898 humano para medir los niveles de ARNm. En los casos en que el ollgonucleótldo solapaba el ampllcón del conjunto de sonda de cebador, se utilizó un conjunto de sonda de cebador alternativo, HTS90, para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de SOD-1 se ajustaron según el contenido de ARN total, tal como se midió por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de Inhibición de SOD-1, en relación con las células de control no tratadas, 'nd' Indica que los niveles de Inhibición no se midieron usando el conjunto particular de sonda de cebador.
Los ollgonucleótldos modificados de nuevo diseño en las tablas a continuación se diseñaron como los gapmeros 5-10-5 MOE. Los gapmeros 5-10-5MOE tienen una longitud de 20 nucleósldos, donde el segmento de brecha central comprende diez 2'-desoxirribonucleósidos y se encuentra flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cinco nucleósldos cada una. Cada nucleósldo en el segmento de ala 5' y cada nucleósldo en el segmento de ala 3' tiene una modificación 2'-MOE. Los enlaces ¡nternucleosídlcos en cada gapmero son enlaces fosforotloato. Todos los residuos de cltoslna en cada gapmero son 5-metllcltoslnas. El "sitio de ¡nielo" Indica el nucleósldo más cercano a la posición 5', al cual se dirige el gapmero en la secuencia génlca humana. El "sitio de detención" Indica el nucleósldo más cercano a la posición 3' al cual se dirige el gapmero en la secuencia génlca humana. Cada gapmero enumerado en las tablas a continuación está dirigido al ARNm de SOD-1 humano, designado en esta Invención como la SEQ ID NO:1 (n.° de acceso GENBANK NM 000454.4) o la secuencia genómlca de SOD-1 humano, designada en esta invención como la SEQ ID NO:2 (n.° de acceso GENBANK NT 011512.10 truncado de los nucleótidos 18693000 a 18704000). 'n/a' Indica que el ollgonucleótldo modificado no se dirige a esa secuencia génlca particular con un 100 % de complementariedad.
Tabla 11
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Tabla 12
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Ejemplo 3: Inhibicición de SOD-1 humano en células HepG2 por gapmeros desoxl, MOE y cEt
Los ollgonucleótldos modificados se diseñaron para dirigirse a un ácido nucleico de superóxldo dismutasa 1 soluble (SOD-1) y se sometieron a prueba para determinar sus efectos en el ARNm de SOD-1 ¡n vitro. ISIS 333611, que se describió previamente en el documento WO 2005/040180, se incluyó como punto de referencia. ISIS 590067, ISIS 590074, ISIS 590082, ISIS 590130, ISIS 590138 e ISIS 590146, que son gapmeros 5-10-5 MOE como se describió anteriormente en el ejemplo 1, también se Incluyeron en este ensayo. ISIS 590512, que tiene una secuencia similar a ISIS 333611 pero con modificaciones de azúcar desoxl, MOE y cEt, también se Incluyó en este estudio.
Los ollgonucleótldos modificados se sometieron a prueba en una serle de experimentos que tenían condiciones de cultivo similares. Los resultados de cada experimento se presentan en tablas separadas que se muestran más adelante. Las células HepG2 cultivadas a una densidad de 20.000 células por pocilio se transfectaron utilizando electroporación con oligonucleótido modificado 3.000 nM. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 24 horas, el ARN se aisló de las células y los niveles de ARNm de SOD-1 se midieron mediante PCR cuantitativa en tiempo real.
'Se utilizó un conjunto de sonda de cebador RTS3898 humano para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de SOD-1 se ajustaron según el contenido de ARN total, tal como se midió por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de Inhibición de SOD-1, en relación con las células de control no tratadas, 'nd' Indica que no se midieron los niveles de Inhibición.
Los ollgonucleótldos modificados de nuevo diseño en las tablas a continuación se diseñaron como los gapmeros desoxl, MOE y cEt. Los gapmeros tienen una longitud de 17 nucleósldos, donde cada nucleósldo tiene una modificación de azúcar MOE, una modificación de azúcar cEt o un resto desoxl. La química del azúcar de cada ollgonucleótldo se denota como en la columna Química, donde 'k' Indica un azúcar modificado con cEt; ’d' Indica una 2'-desoxlrrlbosa; y ’e' Indica un azúcar modificado con 2'-MOE. Los enlaces internucleosídicos en cada gapmero son enlaces fosforotioato. Todos los residuos de citosina en cada gapmero son 5-metllcltoslnas. El "sitio de ¡nielo" Indica el nucleósldo más cercano a la posición 5', al cual se dirige el gapmero en la secuencia génlca humana. El "sitio de detención" Indica el nucleósldo más cercano a la posición 3' al cual se dirige el gapmero en la secuencia génlca humana. Cada gapmero enumerado en las tablas a continuación está dirigido al ARNm de SOD-1 humano, designado en esta Invención como la SEQ ID NO:1 (n.° de acceso GENBANK NM 000454.4) o la secuencia genómlca de SOD-1 humano, designada en esta invención como la SEQ ID NO:2 (n.° de acceso GENBANK NT 011512.10 truncado de los nucleótidos 18693000 a 18704000). 'n/a' Indica que el ollgonucleótldo modificado no se dirige a esa secuencia génlca particular con un 100 % de complementariedad.
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Ejemplo 4: Inhibicición de SOD-1 humano en células HepG2 por gapmeros desoxl, MOE y cEt
Los ollgonucleótldos modificados se diseñaron para dirigirse a un ácido nucleico de superóxldo dismutasa 1 soluble (SOD-1) y se sometieron a prueba para determinar sus efectos en el ARNm de SOD-1 ¡n vitro. ISIS 333611, un gapmero 5-10-5 MOE que se describió previamente en el documento WO 2005/040180, se incluyó como punto de referencia.
Los ollgonucleótldos modificados se sometieron a prueba en una serle de experimentos que tenían condiciones de cultivo similares. Los resultados de cada experimento se presentan en tablas separadas que se muestran más adelante. Las células HepG2 cultivadas a una densidad de 20.000 células por pocilio se transfectaron utilizando electroporaclón con ollgonucleótldo modificado 4.000 nM. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 24 horas, el ARN se aisló de las células y los niveles de ARNm de SOD-1 se midieron mediante PCR cuantitativa en tiempo real.
'Se utilizó un conjunto de sonda de cebador RTS3898 humano para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de SOD-1 se ajustaron según el contenido de ARN total, tal como se midió por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de Inhibición de SOD-1, en relación con las células de control no tratadas, 'nd' Indica que no se midieron los niveles de Inhibición.
Los ollgonucleótldos modificados de nuevo diseño en las tablas a continuación se diseñaron como los gapmeros desoxl, MOE y cEt o los gapmeros 5-10-5. Los gapmeros 5-10-5 MOE tienen una longitud de 20 nucleósldos, donde el segmento de brecha central comprende diez 2'-desoxlrríbonucleós¡dos y se encuentra flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cinco nucleósldos cada una. Cada nucleósldo en el segmento de ala 5' y cada nucleósldo en el segmento de ala 3' tiene una modificación 2'-MOE. Los ollgonucleótldos desoxl, MOE y cEt tienen una longitud de 17 nucleósldos donde el nucleósldo tiene una modificación de azúcar MOE, una modificación de azúcar cEt o una modificación desoxl. La química del azúcar de cada ollgonucleótldo se denota como en la columna Química, donde 'k' Indica un azúcar modificado con cEt; ’d' Indica una 2'-desoxlrrlbosa; y ’e' Indica un azúcar modificado con 2'-MOE. Los enlaces ¡nternucleosídlcos en cada gapmero son enlaces fosforotloato. Todos los residuos de cltoslna en cada gapmero son 5-metllcltoslnas. El "sitio de ¡nielo" Indica el nucleósldo más cercano a la posición 5', al cual se dirige el gapmero en la secuencia génlca humana. Cada gapmero enumerado en las tablas a continuación está dirigido al ARNm de SOD-1 humano, designado en esta Invención como la SEQ ID NO:1 (n.° de acceso GENBANK NM 000454.4) o la secuencia genómlca de SOD-1 humano, designada en esta Invención como la SEQ ID NO:2 (n.° de acceso GENBANK NT_011512.10 truncado de los nucleótidos 18693000 a 18704000). 'n/a' Indica que el ollgonucleótldo modificado no se dirige a esa secuencia génlca particular con un 100 % de complementariedad.
Tabla 18
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Ejemplo 5: Inhibicición de SOD-1 humano en células HepG2 por gapmeros desoxl, MOE y cEt
Los ollgonucleótldos modificados se diseñaron para dirigirse a un ácido nucleico de SOD-1 y se sometieron a prueba para determinar sus efectos en el ARNm de SOD-1 in vitro. ISIS 333611, un gapmero 5-10-5 MOE, que se describió previamente en el documento WO 2005/040180, se Incluyó como punto de referencia.
Los ollgonucleótldos modificados se sometieron a prueba en una serle de experimentos que tenían condiciones de cultivo similares. Los resultados de cada experimento se presentan en tablas separadas que se muestran más adelante. Las células HepG2 cultivadas a una densidad de 20.000 células por pocilio se transfectaron utilizando electroporación con oligonucleótido modificado 5.000 nM. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 24 horas, el ARN se aisló de las células y los niveles de ARNm de SOD-1 se midieron mediante PCR cuantitativa en tiempo real.
'Se utilizó un conjunto de sonda de cebador RTS3898 humano para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de SOD-1 se ajustaron según el contenido de ARN total, tal como se midió por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de Inhibición de SOD-1, en relación con las células de control no tratadas, 'nd' Indica que no se midieron los niveles de Inhibición.
Los ollgonucleótldos modificados de nuevo diseño en las tablas a continuación se diseñaron como los gapmeros desoxl, MOE y cEt. Los gapmeros tienen una longitud de 17 nucleósldos, donde cada nucleósldo tiene una modificación de azúcar MOE, una modificación de azúcar cEt o un resto desoxl. La química del azúcar de cada oligonucleótido se denota como en la columna Química, donde 'k' Indica un azúcar modificado con cEt; ’d' Indica una 2'-desoxlrrlbosa; y ’e' Indica un azúcar modificado con 2'-MOE. Los enlaces ¡nternucleosídlcos en cada gapmero son enlaces fosforotloato. Todos los residuos de cltoslna en cada gapmero son 5-metllcltoslnas. El "sitio de ¡nielo" Indica el nucleósldo más cercano a la posición 5', al cual se dirige el gapmero en la secuencia génlca humana. Cada gapmero enumerado en las tablas a continuación está dirigido al ARNm de SOD-1 humano, designado en esta invención como la SEQ ID NO:1 (n.° de acceso GENBANK NM 000454.4) o la secuencia genómlca de SOD-1 humano, designada en esta Invención como la SEQ ID NO:2 (n.° de acceso GENBANK NT_011512.10 truncado de los nucleótidos 18693000 a 18704000). ’n/a' indica que el oligonucleótido modificado no se dirige a esa secuencia génlca particular con un 100% de complementariedad.
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Ejemplo 6: Inhibición dependiente de la dosis de SOD-1 humano con oligonucleótidos modificados en células HepG2
Los gapmeros de los estudios descritos anteriormente que presentaban una inhibición significativa in vitro del ARNm de SOD-1 se seleccionaron y sometieron a prueba con diversas dosis en células HepG2. El compuesto de referencia ISIS 333611 y otros compuestos descritos previamente enel documento WO 2005/040180, incluidos ISIS 146144, 146145, 150445, 150446, 150447, 150454, 150463, 150465, 333606, 333609 y 333611.también se sometieron a prueba.
Los oligonucleótidos modificados se sometieron a prueba en una serie de experimentos que tenían condiciones de cultivo similares. Los resultados de cada experimento se presentan en tablas separadas que se muestran más adelante. Las células se colocaron en placas a una densidad de 20.000 células por pocilio y se transfectaron usando electroporación con concentraciones de 0,813 pM, 1,625 pM, 3,250 pM, 6,500 pM y 13,000 pM de oligonucleótido modificado, como se especifica en las tablas a continuación. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, el ARN se aisló de las células y los niveles de ARNm de SOD-1 se midieron mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se utilizó un conjunto de sonda de cebador RTS3898 humano para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de SOD-1 se ajustaron según el contenido de ARN total, tal como se midió por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de SOD-1, en relación con las células de control no tratadas.
También se presenta la concentración inhibitoria máxima media (CI 50 ) de cada oligonucleótido. Los niveles de ARNm de SOD-1 se redujeron significativamente de una manera dependiente de la dosis en células tratadas con oligonucleótido modificado.
Tabla 24
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Tabla 25
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Tabla 26
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Tabla 27
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Ejemplo 7: Inhibición dependiente de la dosis de SOD-1 humano con ollgonucleótldos modificados en células HepG2
Los gapmeros de los estudios descritos anteriormente que presentaban una Inhibición significativa in vitro del ARNm de SOD-1 se seleccionaron y sometieron a prueba con diversas dosis en células HepG2. El compuesto de referencia, ISIS 333611, e ISIS 333625, los cuales fueron descritos previamente enel documento WO 2005/040180 también se sometieron a prueba..
Los ollgonucleótldos modificados se sometieron a prueba en una serle de experimentos que tenían condiciones de cultivo similares. Los resultados de cada experimento se presentan en tablas separadas que se muestran más adelante. Las células se colocaron en placas a una densidad de 20.000 células por pocilio y se transfectaron usando electroporaclón con concentraciones de 0,148 pM, 0,444 pM, 1,330 pM, 4,000 pM y 12,000 pM de ollgonucleótldo modificado, como se especifica en las tablas a continuación. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, el ARN se aisló de las células y los niveles de ARNm de SOD-1 se midieron mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se utilizaron conjuntos de sondas de cebadores RTS3898 o HTS90 humanos para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de SOD-1 se ajustaron según el contenido de ARN total, tal como se midió por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de Inhibición de SOD-1, en relación con las células de control no tratadas.
También se presenta la concentración Inhibitoria máxima media (CI 50 ) de cada ollgonucleótldo. Los niveles de ARNm de SOD-1 se redujeron significativamente de una manera dependiente de la dosis en células tratadas con ollgonucleótldo modificado.
Tabla 28
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Tabla 29
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Ejemplo 8: Inhibición dependiente de la dosis de SOD-1 humano con ollgonucleótldos modificados en células HepG2
Los gapmeros de los estudios descritos anteriormente que presentaban una inhibición significativa in vitro del ARNm de SOD-1 se seleccionaron y sometieron a prueba con diversas dosis en células HepG2. El compuesto de referencia, ISIS 333611 y compuestos adicionales, incluidos, ISIS 146143, 150442, 195753, 333607 y 333608, fueron descritos previamente enel documento WO 2005/040180 también se sometieron a prueba.
Los oligonucleótidos modificados se sometieron a prueba en una serie de experimentos que tenían condiciones de cultivo similares. Los resultados de cada experimento se presentan en tablas separadas que se muestran más adelante. Las células se colocaron en placas a una densidad de 20.000 células por pocilio y se transfectaron usando electroporación con concentraciones de 0,1875 pM, 0,7500 pM, 3,0000 pM y 12,0000 pM de oligonucleótido modificado, como se especifica en las tablas a continuación. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, el ARN se aisló de las células y los niveles de ARNm de SOD-1 se midieron mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se utilizaron conjuntos de sondas de cebadores RTS3898 humanos para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de SOD-1 se ajustaron según el contenido de ARN total, tal como se midió por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de SOD-1, en relación con las células de control no tratadas.
También se presenta la concentración inhibitoria máxima media (CI 50 ) de cada oligonucleótido. Los niveles de ARNm de SOD-1 se redujeron significativamente de una manera dependiente de la dosis en células tratadas con oligonucleótido modificado.
Tabla 30
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Tabla 31
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Tabla 32
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Tabla 34
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Ejemplo 9: Inhibición dependiente de la dosis de SOD-1 humano en células HepG2 por gapmeros con química de la cadena principal mixta
Se diseñaron gapmeros adicionales basados en las secuencias de los ollgonucleótldos descritos en los estudios descritos anteriormente. Los ollgonucleótldos se diseñaron como 5-10-5 MOE, 5-8-5 MOE y ollgonucleótldos desoxl, MOE y cEt. Los gapmeros 5-10-5 MOE tienen una longitud de 20 nucleósldos, donde el segmento de brecha central comprende diez 2'-desoxlrrlbonucleós¡dos y se encuentra flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cinco nucleósldos cada una. Los gapmeros 5-8-5 MOE tienen una longitud de 18 nucleósldos, donde el segmento de brecha central comprende ocho 2'-desox¡rr¡bonucleós¡dos y se encuentra flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cinco nucleósldos cada una. Cada nucleósldo en el segmento de ala 5' y cada nucleósldo en el segmento de ala 3' tiene una modificación 2'-MOE. Los ollgonucleótldos desoxl, MOE y cEt tienen una longitud de 16 o 17 nucleósldos donde cada nucleósldo tiene una modificación de azúcar MOE, una modificación de azúcar cEt o un resto desoxl. La química del azúcar de cada ollgonucleótldo se denota como en la columna Química, donde 'k' Indica un azúcar modificado con cEt; ’d' Indica una 2'-desoxlrríbosa; y ’e' Indica un azúcar modificado con 2'-MOE. Los enlaces ¡nternucleosídlcos en cada gapmero son enlaces fosfodléster o fosforotioato. Los enlaces ¡nternucleosídlcos de cada ollgonucleótldo se denotan en la columna Química de la cadena principal, donde 'o' indica un enlace fosfodiéster y 's' denota un enlace fosforotioato. Todos los residuos de cltoslna en cada gapmero son 5-metllcltoslnas. El "sitio de ¡nielo" Indica el nucleósldo más cercano a la posición 5', al cual se dirige el gapmero en la secuencia génlca humana. El "sitio de detención" Indica el nucleósldo más cercano a la posición 3' al cual se dirige el gapmero en la secuencia génlca humana. Cada gapmero enumerado en las tablas a continuación está dirigido al ARNm de SOD-1 humano, designado en esta invención como la SEQ ID NO:1 (n.° de acceso GENBANK NM 000454.4) o la secuencia genómica de SOD-1 humano, designada en esta Invención como la SEQ ID NO:2 (n.° de acceso GENBANK N T 011512.10 truncado de los nucleótidos 18693000 a 18704000).
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 Los oligonucleótidos de nuevo diseño se sometieron a prueba con diversas dosis en células HepG2. Los oligonucleótidos modificados se sometieron a prueba en una serie de experimentos que tenían condiciones de cultivo similares. Los resultados de cada experimento se presentan en tablas separadas que se muestran más adelante. Las células se colocaron en placas a una densidad de 20.000 células por pocilio y se transfectaron usando electroporación con concentraciones de 0,222 pM, 0,667 pM, 2,000 pM y 6,000 pM de oligonucleótido modificado, como se especifica en las tablas a continuación. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, el ARN se aisló de las células y los niveles de ARNm de SOD-1 se midieron mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se utilizaron conjuntos de sondas de cebadores RTS3898 humanos para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de SOD-1 se ajustaron según el contenido de ARN total, tal como se midió por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de SOD-1, en relación con las células de control no tratadas.
También se presenta la concentración inhibitoria máxima media (CI50) de cada oligonucleótido. Los niveles de ARNm de SOD-1 se redujeron significativamente de una manera dependiente de la dosis en células tratadas con oligonucleótido modificado.
Tabla 36
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Tabla 37
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Tabla 38
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Tabla 39
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Ejemplo 10: Inhibición dependiente de la dosis de SOD-1 humano por gapmeros con química de la cadena principal mixta
Se diseñaron gapmeros adicionales basados en las secuencias de los oligonucleótidos descritos en los estudios descritos anteriormente. Los oligonucleótidos se diseñaron como oligonucleótidos desoxi, MOE y cEt. Los oligonucleótidos desoxi, MOE y cEt tienen una longitud de 16 o 17 nucleósidos donde cada nucleósido tiene una modificación de azúcar MOE, una modificación de azúcar cEt o un resto desoxi. La química del azúcar de cada oligonucleótido se denota como en la columna Química, donde 'k' indica un azúcar modificado con cEt; ’d' indica una 2'-desoxirribosa; y ’e' indica un azúcar modificado con 2'-MOE. Los enlaces internucleosídicos en cada gapmero son enlaces fosfodiéster o fosforotioato. Los enlaces internucleosídicos de cada oligonucleótido se denotan en la columna Química de la cadena principal, donde 'o' indica un enlace fosfodiéster y 's' indica un enlace fosforotioato. Todos los residuos de citosina en cada gapmero son 5-metilcitosinas. El "sitio de inicio" indica el nucleósido más cercano a la posición 5', al cual se dirige el gapmero en la secuencia génica humana. El "sitio de detención" indica el nucleósido más cercano a la posición 3' al cual se dirige el gapmero en la secuencia génica humana. Cada gapmero enumerado en las tablas a continuación está dirigido al ARNm de SOD-1 humano, designado en esta invención como la SEQ ID NO:1 (n.° de acceso GENBANK NM 000454.4) o la secuencia genómica de SOD-1 humano, designada en esta invención como la SEQ ID NO:2 (n.° de acceso GENBANK NT_011512.10 truncado de los nucleótidos 18693000 a 18704000).
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Los oligonucleótidos de nuevo diseño se sometieron a prueba con diversas dosis en células A431. Los oligonucleótidos modificados se sometieron a prueba en una serie de experimentos que tenían condiciones de cultivo similares. Los resultados de cada experimento se presentan en tablas separadas que se muestran más adelante. Las células se colocaron en placas a una densidad de 5.000 células por pocilio y se añadieron oligonucleótidos modificados a los medios a concentraciones de 0,12 pM, 0,60 pM, 3,00 pM y 15,00 pM de oligonucleótido modificado para la captación libre por las células, como se especifica en las tablas a continuación. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, el ARN se aisló de las células y los niveles de ARNm de SOD-1 se midieron mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se utilizaron conjuntos de sondas de cebadores RTS3898 humanos para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de SOD-1 se ajustaron según el contenido de ARN total, tal como se midió por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de SOD-1, en relación con las células de control no tratadas.
Tabla 41
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Tabla 42
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Tabla 43
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Tabla 44
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Ejemplo 11: Inhibición dependiente de la dosis de SOD-1 humano por gapmeros con química de la cadena principal mixta
Se diseñaron gapmeros adicionales basados en las secuencias de los oligonucleótidos descritos en los estudios descritos anteriormente. Los oligonucleótidos se diseñaron como gapmeros 5-10-5 MOE, gapmeros 4-8-5 MOE, gapmeros 5-8-5 MOE, gapmeros 5-8-7 MOE, gapmeros 6-8-6 MOE, gapmeros 6-9-5 MOE u oligonucleótidos desoxi, MOE y cEt.
Los gapmeros 5-10-5 MOE tienen una longitud de 20 nucleósidos, donde el segmento de brecha central comprende diez 2'-desoxinucleósidos y se encuentra flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cinco nucleósidos cada una. Los gapmeros 4-8-5 MOE tienen una longitud de 17 nucleósidos, donde el segmento de brecha central comprende ocho 2'-desoxirribonucleósidos y se encuentra flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cuatro y cinco nucleósidos respectivamente. Los gapmeros 5-8-5 MOE tienen una longitud de 18 nucleósidos, donde el segmento de brecha central comprende ocho 2'-desoxinucleósidos y se encuentra flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cinco nucleósidos cada una. Los gapmeros 5-8-7 MOE tienen una longitud de 20 nucleósidos, donde el segmento de brecha central comprende ocho 2'-desoxinucleósidos y se encuentra flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cinco y siete nucleósidos respectivamente. Los gapmeros 6-8-6 MOE tienen una longitud de 20 nucleósidos, donde el segmento de brecha central comprende ocho 2'-desoxinucleósidos y se encuentra flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden seis nucleósidos cada una. Los gapmeros 6-9-5 MOE tienen una longitud de 20 nucleósidos, donde el segmento de brecha central comprende nueve 2'-desoxinucleósidos y se encuentra flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden seis y cinco nucleósidos respectivamente. Cada nucleósido en el segmento de ala 5' y cada nucleósido en el segmento de ala 3' tiene una modificación 2-MOE.
Los oligonucleótidos desoxi, MOE y cEt tienen una longitud de 17 nucleósidos donde cada nucleósido tienen una modificación de azúcar MOE, una modificación de azúcar cEt o un resto desoxi. La química del azúcar de cada oligonucleótido se denota como en la columna Química, donde 'k' indica un azúcar modificado con cEt; ’d' indica una 2'-desoxirribosa; y ’e' indica un azúcar modificado con 2'-MOE.
Los enlaces internucleosídicos en cada gapmero son enlaces fosfodiéster o fosforotioato. Los enlaces internucleosídicos de cada oligonucleótido se denotan en la columna Química de la cadena principal, donde 'o' indica un enlace fosfodiéster y ’s' indica un enlace fosforotioato. Todos los residuos de citosina en cada gapmero son 5-metilcitosinas. El "sitio de inicio" indica el nucleósido más cercano a la posición 5', al cual se dirige el gapmero en la secuencia génica humana. El "sitio de detención" indica el nucleósido más cercano a la posición 3' al cual se dirige el gapmero en la secuencia génica humana. Cada gapmero enumerado en las tablas a continuación está dirigido al ARNm de SOD-1 humano, designado en esta invención como la SEQ ID NO:1 (n.° de acceso GENBANK NM 000454.4) o la secuencia genómica de SOD-1 humano, designada en esta invención como la SEQ ID NO:2 (n.° de acceso GENBANK N T 011512.10 truncado de los nucleótidos 18693000 a 18704000).
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Los oligonucleótidos de nuevo diseño se sometieron a prueba con diversas dosis en células A431. Los oligonucleótidos modificados se sometieron a prueba en una serie de experimentos que tenían condiciones de cultivo similares. Los resultados de cada experimento se presentan en tablas separadas que se muestran más adelante. Las células se colocaron en placas a una densidad de 5.000 células por pocilio y se añadieron oligonucleótidos modificados a los medios a concentraciones de 0,062 pM, 0,185 pM, 0,556 pM, 1,667 pM, 5,000 pM y 15,000 pM de oligonucleótido modificado para la captación libre por las células, como se especifica en las tablas a continuación. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, el ARN se aisló de las células y los niveles de ARNm de SOD-1 se midieron mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se utilizaron conjuntos de sondas de cebadores RTS3898 humanos para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de SOD-1 se ajustaron según el contenido de ARN total, tal como se midió por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de SOD-1, en relación con las células de control no tratadas.
Tabla 46
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Tabla 47
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Los oligonucleótidos de nuevo diseño también se sometieron a prueba con diversas dosis en células SH-SY5Y. Los oligonucleótidos modificados se sometieron a prueba en una serie de experimentos que tenían condiciones de cultivo similares. Los resultados de cada experimento se presentan en tablas separadas que se muestran más adelante. Las células se colocaron en placas a una densidad de 20.000 células por pocilio y los oligonucleótidos modificados se transfectaron usando electroporación a concentraciones de 0,062 pM, 0,185 pM, 0,556 pM, 1,667 pM, 5,000 pM y 15,000 pM de oligonucleótido modificado, como se especifica en las tablas a continuación. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, el ARN se aisló de las células y los niveles de ARNm de SOD-1 se midieron mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se utilizó un conjunto de sonda de cebador RTS3898 humano para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de SOD-1 se ajustaron según el contenido de ARN total, tal como se midió por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de SOD-1, en relación con las células de control no tratadas.
Tabla 48
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Tabla 49
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Ejemplo 12: Inhibición de SOD-1 humano en un modelo de rata transgénlca
Los gapmeros de los estudios descritos anteriormente, incluido el compuesto de referencia ISIS 333611, que se describió previamente en el documento WO 2005/040180, se sometieron a prueba en un modelo de rata transgénica SOD-1 (Taconic, Cat n.° 2148-F y 2148-M). Estas ratas hemizigotas expresan SOD-1 humano mutante en la médula espinal.
Se diseñaron gapmeros adicionales basados en las secuencias de los ollgonucleótldos descritos en los estudios descritos anteriormente. Los oligonucleótidos se diseñaron como gapmeros 5-9-5 MOE, gapmeros 5-10-5 MOE u ollgonucleótldos desoxl, MOE y cEt. Los gapmeros 5-9-5 MOE tienen una longitud de 19 nucleósldos, donde el segmento de brecha central comprende nueve 2'-desoxlrríbonucleós¡dos y se encuentra flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cinco nucleósidos cada una. Los gapmeros 5-10-5MOE tienen una longitud de 20 nucleósldos, donde el segmento de brecha central comprende diez 2'-desoxlrríbonucleósldos y se encuentra flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cinco nucleósldos cada una. Cada nucleósldo en el segmento de ala 5' y cada nucleósldo en el segmento de ala 3' tiene una modificación 2'-MOE. Los ollgonucleótldos desoxl, MOE y cEt tienen una longitud de 17 nucleósldos donde cada nucleósldo tiene una modificación de azúcar MOE, una modificación de azúcar cEt o un resto desoxl La química del azúcar de cada ollgonucleótldo se denota como en la columna Química, donde 'k' Indica un azúcar modificado con cEt; ’d' Indica una 2'-desoxlrr¡bosa; y ’e' Indica un azúcar modificado con 2'-MOE. Los enlaces ¡nternucleosídlcos en cada gapmero son enlaces fosfodléster o fosforotioato. Los enlaces ¡nternucleosídlcos de cada ollgonucleótldo se denota en la columna Química de la cadena principal, donde 'o' Indica un enlace fosfodiéster y ’s' Indica un enlace fosforotioato. Todos los residuos de cltoslna en cada ollgonucleótldo son 5-metllcltoslnas. El "sitio de ¡nielo" Indica el nucleósldo más cercano a la posición 5', al cual se dirige el gapmero en la secuencia génlca humana. El "sitio de detención" Indica el nucleósldo más cercano a la posición 3' al cual se dirige el gapmero en la secuencia génlca humana. Cada gapmero enumerado en la tabla a continuación está dirigido al ARNm de SOD-1 humano, designado en esta invención como la SEQ ID NO:1 (n.° de acceso GENBANK NM 000454.4) o la secuencia genómica de SOD-1 humano, designada en esta invención como la SEQ ID NO:2 (n.° de acceso GENBANK NT_011512.10 truncado de los nucleótidos 18693000 a 18704000).
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Los oligonucleótidos modificados se sometieron a prueba en una serie de experimentos que tenían condiciones de cultivo similares. Los resultados de cada experimento se presentan en tablas separadas que se muestran más adelante. Las ratas fueron inyectadas por vía intratecal con 30 pl de una solución de 16,67 mg/ml de oligonucleótido modificado diluido en PBS (dosis final de 500 pg). Un grupo de control de ratas fue inyectado por vía intratecal con PBS. Se evaluaron los niveles de inhibición de SOD-1 en la médula espinal lumbar, la médula espinal torácica y la médula espinal cervical. Los datos se presentan a continuación e indican que varios oligonucleótidos modificados inhibieron los niveles de SOD-1 humano en este modelo.
Tabla 51
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Tabla 52
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Tabla 53
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Tabla 54
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Tabla 55
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T ab la 56
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Tabla 57
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Tabla 58
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T ab la 59
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Tabla 60
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T ab la 61
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Ejemplo 13: Inhibición dependiente de la dosis de SOD-1 humano con oligonucleótidos modificados en células LLC-MK2
Los gapmeros de los estudios descritos anteriormente, incluido el compuesto de referencia ISIS 333611, que presentaban una inhibición significativa in vitro del ARNm de SOD-1 se seleccionaron y sometieron a prueba con diversas dosis en células LLC-MK2. La reactividad cruzada de los oligonucleótidos modificados humanos sometidos a prueba en este estudio con la secuencia genómica del mono rhesus (el complemento de n.° de acceso GENBANK NW 001114168.1 truncado de los nucleótidos 2258000 a 2271000, designado en esta invención como la SEQ ID NO:3) se muestra en la tabla a continuación.
Tabla 62
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Las células se colocaron en placas a una densidad de 20.000 células por pocilio y se transfectaron usando electroporación con concentraciones de 0,078 pM, 0,156 pM, 0,313 pM, 0,625 pM, 1,25 pM, 2,50 pM, 5,00 pM y 10,000 pM de oligonucleótido modificado, como se especifica en las tablas a continuación. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, el ARN se aisló de las células y se midieron los niveles de ARNm de SOD-1 mediante un conjunto de sonda de cebador de PCR en tiempo real cuantitativa RTS3121 (secuencia directa TGGAGATAATACACAAGGCTGTACCA, designada en esta invención como la SEQ ID NO:17; secuencia inversa CAACATGCCTCTCTTCATCCTTT, designada en esta invención como la SEQ ID NO: 18; secuencia de sonda ATCCTCTATCCAGACAACACGGTGGGC, designada en esta invención como la SEQ ID NO:19) se usó para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de SOD-1 se ajustaron según el contenido de ARN total, tal como se midió por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de SOD-1, en relación con las células de control no tratadas. También se presenta la concentración inhibitoria máxima media (CI 50 ) de cada oligonucleótido. Como se presenta en la tabla, varios de los oligonucleótidos de nuevo diseño fueron más potentes que el punto de referencia, ISIS 336611.
Tabla 63
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Ejemplo 14: Tolerabilidad de oligonucleótidos modificados con SOD-1 en un modelo de rata
Los gapmeros de los estudios descritos anteriormente, incluido el compuesto de referencia ISIS 333611, que se describió previamente en el documento WO 2005/040180, se sometieron a prueba para determinar su tolerabilidad en ratas Sprague-Dawley.
Los oligonucleótidos modificados se sometieron a prueba en una serie de experimentos que tenían condiciones similares. Las ratas fueron inyectadas por vía intratecal con 3 mg de una dosis única de oligonucleótido ISIS. Un grupo de control de ratas fue inyectado por vía intratecal con PBS. La tolerabilidad aguda se evaluó 3 horas después de la dosis utilizando una batería de observación funcional (FOB, por su sigla en inglés). Este puntaje se usa para evaluar la tolerabilidad aguda de un compuesto con puntajes más bajos que denotan compuestos mejor tolerados. Los animales de control generalmente tienen una putaje de '0' o '1'. A las 3 horas después de la inyección, las ratas se observan colocando cada rata en la parte superior de la jaula y evaluando determinadas funciones, asignando un número de '0' o '1' dependiendo de si la rata presenta una función normal en la región de interés (0) o no (1) para cada función, y a continuación sumando los puntajes totales. Se evalúan siete regiones, que incluyen cola, patas traseras, patas traseras, extremo posterior, postura frontal, patas delanteras y cabeza. Los resultados de los puntajes se presentan en la tabla a continuación. Como se presenta en la tabla, varios oligonucleótidos de nuevo diseño demostraron una tolerabilidad más aguda en comparación con el punto de referencia, ISIS 333611.
Tabla 64
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La tolerabilidad también se evaluó 8 semanas después de la dosis midiendo los niveles de IBA1, un marcador microglial, y GFAP, un marcador astrocítico, en la región de la médula espinal lumbar. Tanto IBA1 como GFAP son marcadores de inflamación del SNC (Frank, MG, Brain Behav. Immun 2007,21,47-59), por lo tanto, cuanto mayor sea el nivel de cualquiera de los marcadores, menos tolerable será el oligonucleótido antisentido en este modelo de rata.
Los niveles de ARNm de IBA1 se midieron con el conjunto de sonda de cebador rAIF1_LTS00219 (secuencia directa AGGAGAAAAACAAAGAACACCAGAA, designada en esta invención como la SEQ ID NO:5; secuencia inversa CAATTAGGGCAACTCAGAAATAGCT, designada en esta invención como la SEQ ID NO:6; secuencia de sonda CCAACTGGTCCCCCAGCCAAGA, designada en esta invención como la SEQ ID NO:7). Los niveles de ARNm de GFAP se midieron con el conjunto de sonda de cebador mGFAP_LTS00370 (secuencia directa GAAACCAGCCTGGACACCAA, designada en esta invención como la SEQ ID NO:8; secuencia inversa TCCACAGTCTTTACCACGATGTTC, designada en esta invención como la SEQ ID NO:9; secuencia de sonda TCCGTGTCAGAAGGCCACCTCAAG, designada en esta invención como la SEQ ID NQ:10).
Los resultados se presentan en la tabla a continuación. Como se presenta en la tabla, varios ollgonucleótldos de nuevo diseño fueron más tolerables en comparación con el punto de referencia, ISIS 333611.
Tabla 65
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Ejemplo 15: Inhibición dependiente de la dosis de SOD-1- humano en un modelo de rata transgénica Los gapmeros de los estudios descritos anteriormente, incluido el compuesto de referencia ISIS 333611, se sometieron a prueba en un modelo de rata transgénica SOD-1 (Taconic, cat n.° 2148-F y 2148-M). Estas ratas hemizigotas expresan SOD-1 humano mutante en la médula espinal, muchas regiones del cerebro y órganos periféricos.
Las ratas fueron inyectadas por vía intratecal con 10, 30,100, 300,1000 o 3000 pg de un gapmero enumerado en la tabla a continuación o solo con PBS. Dos semanas después, los animales fueron sacrificados. La Inhibición del ARNm de SOD-1 en la médula espinal lumbar, la médula espinal cervical, la corteza rostral y la corteza caudal se evaluó mediante RT-PCR usando el conjunto de sonda de cebador RTS3898, descrito en el ejemplo 1. Los datos se presentan a continuación como valores DEso, e Indica que los oligonucleótidos Inhibieron el ARNm de SOD1 en múltiples tejidos del SNC de forma más potente que Isis 333611. De hecho, los valores DEsopara Isis n.° 333611 ni siquiera se pudieron calcular, como lo Indica una entrada de "n/a," porque incluso la concentración más alta sometida a prueba (3000 pg) no Inhibió el ARNm de SOD-1 más de 55-65 %. "nd" indica que no hay datos disponibles para la muestra indicada.
Tabla 66
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Ejemplo 16: Tolerabilidad de oligonucleótidos modificados con SOD-1 en ratas
Los gapmeros de los estudios descritos anteriormente, incluido el compuesto de referencia ISIS 333611, se sometieron a prueba para determinar su tolerabilidad en ratas Sprague-Dawley. Grupos de 4 a 6 ratas fueron inyectadas por vía intratecal con 1 mg o 3 mg de una dosis única de un oligonucleótido ISIS. Un grupo de control de ratas fue inyectado por vía intratecal con PBS. La tolerabilidad aguda se evaluó 3 horas después de la dosis, como se describió en el ejemplo 14. Los resultados para la dosis de 1 mg son los promedios para cada grupo después de un experimento. Los resultados para la dosis de 3 mg son los promedios para cada grupo en dos experimentos replicados. Los resultados del estudio, presentados en la tabla a continuación, indican que varios oligonucleótidos de nuevo diseño fueron más tolerables que el punto de referencia, ISIS 333611.
Tabla 67
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Ejemplo 17: Inhibición dependiente de la dosis de SOD-1 humano en un modelo de ratón transgénlco Para confirmar los resultados obtenidos en ratas transgénlcas en otra especie, los gapmeros de los estudios descritos anteriormente se sometieron a prueba en un modelo de ratón transgénico SOD-1 que expresa el mismo gen SOD1 mutante humano G93A que expresa la rata transgénica (véase los ejemplos 12 y 15). Los ratones recibieron un bolo ventrlcular ¡ntracerebral (ICVB, por su sigla en Inglés) de 10, 30,100, 300 o 700 pg de un gapmero enumerado en la tabla a continuación, o PBS. Dos semanas después, los animales fueron sacrificados. La Inhibición del ARNm de SOD-1 en la médula espinal lumbar y la corteza se evaluó mediante RT-PCR utilizando el conjunto de sonda de cebador RTS3898 descrito en el ejemplo 1. Los datos se presentan a continuación como valores de DEso, e Indica que los oligonucleótidos Inhibieron el ARNm de SOD-1 de forma más potente que Isis 333611 en ratas y ratones.
Tabla 68
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Ejemplo 18: Tolerabllldad de ollgonucleótldos modificados con SOD-1 en ratones
Los gapmeros de los estudios descritos anteriormente, incluido el compuesto de referencia ISIS 333611, se sometieron a prueba para determinar su tolerabilidad en ratones C57bl6. Los ratones fueron inyectados estereotáxicamente en los ventrículos cerebrales con 700ug de una dosis única de ollgonucleótldo ISIS. Un grupo control de ratones fue inyectado en el ventrículo cerebral con PBS. La tolerabilidad aguda se evaluó a las 3 horas después de la Inyección utilizando una batería de observación funcional (FOB) diferente de la utilizada para las ratas. Cada ratón fue evaluado según 7 criterios diferentes. Los 7 criterios son (1) el ratón estaba despierto, alerta y receptivo; (2) el ratón estaba parado o encorvado sin estímulos; (3) el ratón muestra cualquier movimiento sin estímulos (4) el ratón muestra movimiento hada adelante después de ser levantado; (5) el ratón muestra cualquier movimiento después de ser levantado; (6) el ratón responde al pellizco de la cola; (7) respiración regular. Para cada uno de los 7 criterios diferentes, a cada ratón se le asignó un puntaje secundarlo de 0 si cumplía con los criterios o 1 si no lo hacía. Después de evaluar cada una de los 7 criterios, se sumaron los puntajes secundarios de cada ratón y a continuación se promediaron para cada grupo. Por ejemplo, si un ratón estaba despierto, alerta y receptivo 3 horas después de la dosis de 700 pg de ICV, y cumplía con todos los demás criterios, obtendría un puntaje sumado de 0. Si otro ratón no estaba despierto, alerta y receptivo 3 horas después de la dosis de 700 pg de ICV pero cumplía con todos los demás criterios, recibiría una puntuación de 1. Los ratones tratados con solución salina generalmente reciben un puntaje de 0. Un puntaje en el extremo superior del Intervalo sugeriría toxicidad aguda.
Los pesos corporales se midieron durante todo el estudio y se presentan a continuación como un cambio porcentual a las 8 semanas en relación con el valor Inicial. La tolerabilidad a largo plazo se evaluó 8 semanas después de la dosis midiendo los niveles de IBA1 y GFAP, como se describe en el ejemplo 14. Los niveles de ARNm de IBA1 y GFAP se presentan en relación con los animales tratados con PBS. Los resultados del estudio, presentados en las tablas a continuación, Indican que varios ollgonucleótldos de nuevo diseño fueron más tolerables, en ratas y ratones, en comparación con el punto de referencia, ISIS 333611.
Tabla 69
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Tabla 70
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Ejemplo 19: Inhibición dependiente de la dosis de SOD-1 de mono en mono cynomolgus
Isis n.° 666853 se sometió a prueba en el mono cynomolgus. Hay un desapareamiento entre Isis n.° 666853 y el SOD-1 de mono cynomolgus, y hay 17 bases contiguas en Isis n.° 666853 que son 100 % complementarias al SOD-1 de mono cynomolgus.
Grupos de 6-10 monos machos y hembras recibieron un bolo lumbar ¡ntratecal de PBS o 4 ,12 o 35 mg de Isis n.° 666853 los días 1, 14, 28, 56 y 84 del estudio. Cada grupo recibió la misma dosis en los cinco días de dosificación. El día 91, los animales fueron sacrificados. La inhibición del ARNm de SOD-1 en la médula espinal lumbar, torácica y cervical y la corteza frontal, la corteza motora, el hipocampo, la protuberancia anular y el cerebelo se evaluó mediante RT-PCR usando el conjunto de sonda de cebador RTS3898. Los datos se presentan a continuación como el porcentaje de inhibición promedio para cada grupo de tratamiento, en relación con el grupo tratado con PBS. Los resultados indican que Isis n.° 666853 inhibió el ARNm de SOD-1 en múltiples tejidos diana en mono cynomolgus.
El tratamiento con 666853 fue bien tolerado durante la duración del estudio de 13 semanas y no hubo observaciones clínicas de reacciones adversas en monos.
Tabla 71
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Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto antisentido según la siguiente fórmula:
mCes Aeo Ges Geo Aes Tds Ads mCds Ads Tds Tds Tds mCds Tds Ads mCeo Aes Geo mCes Te (secuencia de nucleobases de la SEQ ID NO:725) donde,
A = una adenina,
mC = una 5-metilcitosina,
G = una guanina,
T = una timina,
e = un azúcar modificado con 2'-0-metoxietilrribosa,
d = un azúcar 2'-desoxirribosa,
s = un enlace internucleosídico fosforotioato y
o = un enlace internucleosídico fosfodiéster;
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
2. El compuesto antisentido de la reivindicación 1.
3. La sal farmacéuticamente aceptable del compuesto antisentido de la reivindicación 1.
4. Una composición farmacéutica que comprende el compuesto antisentido o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo de la reivindicación 1, el compuesto antisentido de la reivindicación 2 o la sal farmacéuticamente aceptable de la reivindicación 3, y al menos uno de un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
5. La composición farmacéutica de la reivindicación 4, donde el diluyente farmacéuticamente aceptable es solución salina amortiguada con fosfato.
6 . El compuesto antisentido o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo de la reivindicación 1, el compuesto antisentido de la reivindicación 2, la sal farmacéuticamente aceptable de la reivindicación 3, o la composición farmacéutica de la reivindicación 4 o 5, para su uso en terapia en un sujeto humano.
7. El compuesto antisentido o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo de la reivindicación 1, el compuesto antisentido de la reivindicación 2, la sal farmacéuticamente aceptable de la reivindicación 3, o la composición farmacéutica de la reivindicación 4 o 5, para su uso en el tratamiento de una enfermedad asociada aSO D-1.
8 . El compuesto antisentido o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo de la reivindicación 1, el compuesto antisentido de la reivindicación 2, la sal farmacéuticamente aceptable de la reivindicación 3, o la composición farmacéutica de la reivindicación 4 o 5, para su uso en la prevención de una enfermedad asociada aSO D-1.
9. El compuesto antisentido, la sal farmacéuticamente aceptable, o la composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 7 u 8, donde la enfermedad asociada a SOD-1 es un trastorno neurodegenerativo.
10. El compuesto antisentido, la sal farmacéuticamente aceptable, o la composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 7 u 8, donde la enfermedad asociada a SOD-1 es la esclerosis lateral amiotrópica.
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