KR20220007104A - 올리고뉴클레오타이드의 수렴형 액상 합성 - Google Patents

올리고뉴클레오타이드의 수렴형 액상 합성 Download PDF

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KR20220007104A
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다이스케 이치마루
타쿠야 하마가키
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Abstract

본 개시내용은, 각각 2개 이상의 뉴클레오타이드를 갖는 2개 이상의 올리고뉴클레오타이드 단편을 커플링함으로써 올리고뉴클레오타이드를 제조하는 수렴형 액상 방법을 기재한다. 또한 본 개시내용에 의하면 수렴형 액상 방법에 수반되는 반응 단계들이 제공된다.

Description

올리고뉴클레오타이드의 수렴형 액상 합성
관련 출원
본 출원은 2019년 5월 8일자로 출원된 미국 가출원 제62/856,160호의 35 U.S.C. §119(e) 하에 출원일의 유익을 주장하며, 이의 전체 내용은 참조에 의해 본 명세서에 원용된다.
올리고뉴클레오타이드는 광범위한 적용을 위하여 화학적으로 합성될 수 있는 짧은 DNA 또는 RNA 올리고머이다. 치료제로서 합성 올리고뉴클레오타이드를 이용함에 있어서의 최근의 발전으로 고효율 및 순도로 대량의 올리고뉴클레오타이드를 생산할 수 있는 합성 방법에 대한 수요가 증가하고 있다.
전통적으로, 올리고뉴클레오타이드는 2몰 미만의 규모로 제한된 포스포아미다이트 화학(phosphoramidite chemistry)을 이용하는 고상 자동화 합성기에 의해 합성된다. 따라서, 고상 합성은 대규모 적응증에서 올리고뉴클레오타이드 약물의 임상 개발 및 상업화에 필요한 물질을 생산하기에는 불충분하다. 또한, 고상 합성은 종종 과잉 시약의 사용을 필요로 하고 결과적으로 표적 올리고뉴클레오타이드의 생산과 연관된 비용을 증가시킨다.
따라서, 고효율 및 순도를 갖는 대규모 제조 공정에 적합한 올리고뉴클레오티드를 합성하기 위한 강건한 방법이 필요하다.
본 개시내용은 2개 이상(예컨대, 3, 4, 5, 6개 등)의 올리고뉴클레오타이드 단편(이들의 각각은 2개 이상(예컨대, 3, 4, 5, 6개 등)의 뉴클레오타이드를 가짐)을 커플링시킴으로써 올리고뉴클레오타이드를 제조하기 위한 수렴형 액상 방법(convergent liquid phase process)을 기재한다. 놀랍게도 본 개시내용의 수렴형 액상 방법은 크로마토그래피(예컨대, 칼럼 크로마토그래피)에 의한 정제의 필요 없이 고순도로 보호된 올리고뉴클레오타이드를 합성하는데 사용될 수 있음을 발견하였고, 이는 대규모 제조 공정으로서 사용하는데 적합한 방법을 제공한다. 탈보호 및 표준 하류 정제 후에, 치료 용도에 적합한 고순도 ASO 올리고뉴클레오타이드가 얻어질 수 있다. 또한 본 개시내용에 의하면 수렴형 액상 방법과 연루된 반응 단계가 제공된다.
도 1은 생성물 화합물 1-7의 암모니아분해 후에 얻어진 화합물 1-7-a의 역상 HPLC 및 MS를 나타낸다.
도 2는 석출 후에 얻어진 생성물 화합물 2-9의 HPLC 및 MS를 나타낸다.
도 3은 석출 후에 얻어진 생성물 화합물 3-5의 HPLC 및 MS를 나타낸다.
도 4는 석출 후에 얻어진 생성물 화합물 4-9의 HPLC 및 MS를 나타낸다.
도 5는 생성물 화합물 5-2의 암모니아분해 후에 얻어진 화합물 5-2-a의 HPLC 및 MS를 나타낸다.
도 6은 생성물 화합물 5-3의 암모니아분해 후에 얻어진 화합물 5-3-a의 HPLC 및 MS를 나타낸다.
도 7은 생성물 화합물 5-5의 암모니아분해 후에 얻어진 화합물 5-5-a의 HPLC 및 MS를 나타낸다.
도 8은 생성물 화합물 5-6의 암모니아분해 후에 얻어진 화합물 5-6-a의 HPLC 및 MS를 나타낸다.
도 9는 생성물 화합물 1의 암모니아분해 후에 얻어진 화합물 1-a의 HPLC 및 MS를 나타낸다.
도 10은 UCC 삼량체 탈트라이틸화 반응 동안 얻어진 탈아민화 생성물의 HPLC 비교를 나타낸다.
도 11은 CC 이량체 탈트라이틸화 반응 동안 얻어진 탈아민화 생성물의 HPLC 비교를 나타낸다.
도 12는 생성물 ASO 9의 HPLC-MS를 나타낸다.
도 13은 6-량체 DMT-dG-dT- dT-dG-dT-dT-OTBDPS의 MS를 나타낸다.
도 14는 10-량체 DMT-Moe G-Moe U-Moe U-Moe U-Moe U-dT- dT- dG- dT- dT-OTBDPS의 MS를 나타낸다.
도 15는 화합물 1-3A-H의 MS를 나타낸다.
도 16은 화합물 4-3A-H의 MS를 나타낸다.
도 17은 화합물 5-3A-H의 MS를 나타낸다.
도 18은 15-량체 5'-ACoAGATATTTTTGTT-3'-OTBDPS의 HPLC 및 MS를 나타낸다.
도 19는 생성물 ASO 8의 HPLC 및 MS를 나타낸다.
도 20은 5'-DMT-GUUUUUGCAA-NO2-벤조일의 MS를 나타낸다.
도 21은 LHPG 탈보호된 화합물 7-a의 HPLC 및 MS를 나타낸다.
도 22는 LHPG 탈보호된 화합물 7-b의 HPLC 및 MS를 나타낸다.
도 23은 LHPG 탈보호된 화합물 7-c의 HPLC 및 MS를 나타낸다.
도 24는 LHPG 탈보호된 7-d 화합물의 HPLC 및 MS를 나타낸다.
도 25는 ASO-9-1의 HPLC 및 MS를 나타낸다.
도 26은 LHPG 탈보호된 7-e 화합물의 HPLC 및 MS를 나타낸다.
도 27은 ASO-9-2의 HPLC 및 MS를 나타낸다.
도 28은 화합물 8.4의 카이럴 SFC-MS를 나타낸다.
도 29는 화합물 8.4의 라세미 혼합물의 SFC-MS를 나타낸다.
도 30은 화합물 8A의 HPLC 및 MS를 나타낸다.
도 31은 화합물 8.2.12의 HPLC 및 MS를 나타낸다.
도 32는 화합물 8B의 HPLC 및 MS를 나타낸다.
도 33은 화합물 8C의 HPLC 및 MS를 나타낸다.
본 개시내용의 발명자들은 처음으로 표적 올리고뉴클레오타이드를 제조하기위한 수렴형 액상 방법을 개발하였다. 놀랍게도, 수렴형 액상 방법은 올리고뉴클레오타이드 단편의 조립체로부터 크로마토그래피 정제에 대한 필요 없이 고순도로 대규모로 보호된 표적 올리고뉴클레오타이드를 제조할 수 있다. 수렴형 액상 방법은 3'-말단에서 5'-말단으로(즉, 3'-5' 연장) 또는 5'-말단에서 3'-말단으로(즉, 5'-3' 연장)의 방향으로의 연장에 의해 표적 올리고뉴클레오타이드를 제조할 수 있다. 본 개시내용은 또한 부산물의 생산을 최소화하기 위하여 다른 민감성 기에 영향을 미치지 않는 3'-하이드록실 보호기의 선택적 탈보호 방법을 제공한다. 본 개시내용의 발명자들은 탈트라이틸화 반응에서의 물의 존재가 탈아민화 부반응(예컨대, 올리고뉴클레오타이드 합성에서 통상적으로 사용되는 사이토신 또는 5-메틸사이토신 또는 이들의 유도체의 탈아민화)를 초래할 수 있음을 발견하였다. 탈아민화 부산물(들)의 형성을 저감 또는 방지하기 위하여, 물 수준을 제어하여 최소화하는 반응 조건은 탈트라이틸화 단계 동안 탈아민화를 최소화하기 위하여 개발되었다. 또한, 탈트라이틸화 반응에서의 양이온 포착제(예컨대, RSH)의 사용은 탈트라이틸화 반응의 완결을 용이하게 하는(즉, 반응이 더욱 용이하게 완결되게 하는) 것도 발견하였다. 양이온 포착제의 존재는 또한 반응이 탈트라이틸화를 역전시키는 경향을 적게 한다(즉, DMT 보호기는 탈보호된 5'-OH기 상에 도로 첨가된다). 또한 3'-하이드록실기의 포스피틸화(phosphitylation)는 크로마토그래피에 의한 정제 없이 액상에서 수행될 수 있음을 입증하였다. 4 또는 5개의 뉴클레오타이드를 갖는 올리고뉴클레오타이드 단편이 본 개시내용의 방법을 이용해서 성공적으로 합성되어 액상에서 완전히 보호된 표적 올리고뉴클레오타이드에 커플링되었다. 일반적으로, 본 개시내용에 기재된 액상 방법은 크로마토그래피 정제 없이 대량의 목적하는 보호된 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 생성물을 합성하는데 사용될 수 있다. 탈보호 및 표준 하류 정제 후에, 치료 용도에 적합한 고순도 ASO 올리고뉴클레오타이드가 얻어진다.
정의
용어 "핵염기"는 뉴클레오사이드의 헤테로사이클릭 염기 부분을 의미한다. 핵염기는 천연형일 수 있거나 또는 변형될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 핵염기는 또 다른 핵산의 핵염기에 수소 결합할 수 있는 임의의 원자 또는 원자의 그룹을 포함할 수 있다. 특히, 핵염기는 헤테로사이클릭 염기, 전형적으로 퓨린 및 피리미딘이다. "미변형" 또는 "천연" 핵염기, 예컨대, 퓨린 핵염기인 아데닌(A) 및 구아닌(G), 및 피리미딘 핵염기인 티민(T), 사이토신(C) 및 우라실(U) 이외에도, 당업자에게 공지된 많은 변형된 핵염기 또는 핵염기 모방체는 본 명세서에 기재된 방법에 의해 합성된 화합물에 혼입되기 쉽다. 소정의 실시형태에서, 변형된 핵염기는 모 핵염기와 구조가 상당히 유사한 핵염기, 예컨대, 7-데아자 퓨린, 5-메틸 사이토신 또는 G-클램프이다. 소정의 실시형태에서, 핵염기 모방체는 더욱 복잡한 구조, 예를 들어, 삼환식 페녹사진 핵염기 모방체를 포함한다. 위에서 언급된 변형된 핵염기의 제조 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.
용어 "뉴클레오사이드"는, 2'-말단에서 변형될 수 있는 헤테로사이클릭 염기 모이어티 및 당 모이어티를 포함하는 화합물을 의미한다.
용어 "뉴클레오타이드"는 포스페이트 또는 티오포스페이트 또는 다이티오포스페이트 연결기를 포함하는 뉴클레오사이드를 의미한다.
용어 "올리고뉴클레오타이드"는 복수의 연결된 뉴클레오사이드를 포함하는 화합물을 지칭한다. 소정의 실시형태에서, 복수의 뉴클레오사이드 중 1개 이상이 변형된다. 소정의 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 1개 이상의 리보뉴클레오사이드(RNA) 및/또는 데옥시리보뉴클레오사이드(DNA)를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "표적 올리고뉴클레오타이드"는 본 개시내용의 수렴형 액상 방법에 의해 제조될 수 있는 올리고뉴클레오타이드 생성물을 지칭한다. 소정의 실시형태에서, 표적 올리고뉴클레오타이드는 적어도 10개 또는 적어도 15개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 표적 올리고뉴클레오타이드는 10 내지 500, 15 내지 500, 15 내지 200, 15 내지 100, 15 내지 50, 15 내지 40, 15 내지 30 또는 16 내지 30개의 뉴클레오타이드를 갖는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "수렴형 합성"은 표적 올리고뉴클레오타이드를 제조하기 위한 합성 공정을 지칭하며, 여기서 2개 이상의 올리고뉴클레오타이드 단편이 5'-3' 방향 또는 3'-5' 방향으로부터 조립된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "올리고뉴클레오타이드 단편"은 표적 올리고뉴클레오타이드를 제조하기 위하여 조립된 짧은 올리고뉴클레오타이드를 지칭한다. 소정의 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드 단편은 3 내지 10, 3 내지 8, 3 내지 6 또는 4 내지 6개의 뉴클레오타이드를 갖는다. 소정의 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드 단편은 4 또는 5개의 뉴클레오타이드를 갖는다.
용어 "뉴클레오사이드간 연결부"는 올리고뉴클레오타이드의 인접한 뉴클레오사이드 간의 공유 결합을 의미한다.
용어 "갭머"(gapmer)는, RNase H 절단을 지지하는 복수의 뉴클레오사이드를 갖는 내부 영역이 1개 이상의 뉴클레오사이드를 갖는 외부 영역 사이에 위치되고, 내부 영역을 포함하는 뉴클레오사이드가 외부 영역을 포함하는 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오사이드와는 화학적으로 구별되는, 키메라 안티센스 화합물을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "알킬"은 완전 포화된 분지형 또는 비분지형 탄화수소 모이어티를 지칭한다. 바람직하게는 알킬은 1 내지 20개의 탄소 원자, 더 바람직하게는 1 내지 16개의 탄소 원자, 1 내지 10개의 탄소 원자, 1 내지 6개의 탄소 원자, 또는 1 내지 4개의 탄소 원자를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 알킬은 6 내지 20개의 탄소 원자를 포함한다. 알킬의 대표적인 예는, 메틸, 에틸, n-프로필, 아이소-프로필, n-부틸, sec-부틸, 아이소-부틸, tert-부틸, n-펜틸, 아이소펜틸, 네오펜틸, n-헥실, 3-메틸헥실, 2,2-다이메틸펜틸, 2,3-다이메틸펜틸, n-헵틸, n-옥틸, n-노닐 또는 n-데실을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
용어 "아릴"은 고리 부분에 6 내지 14개의 탄소 원자를 갖는 단환식, 이환식 또는 삼환식 방향족 탄화수소기를 지칭한다. 일 실시형태에서, 용어 아릴은 6 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 단환식 및 이환식 방향족 탄화수소기를 지칭한다. 아릴기의 대표적인 예는 페닐, 나프틸, 플루오레닐 및 안트라세닐을 포함한다.
용어 "아릴"은 또한 적어도 하나의 고리가 방향족이고 1 또는 2개의 비-방향족 탄화수소 고리(들)에 접합된 이환식 또는 삼환식 기를 지칭한다. 비제한적인 예는 테트라하이드로나프탈렌, 다이하이드로나프틸렌일 및 인단일을 포함한다.
알킬기 또는 아릴기 둘 다에 대한 선택적 치환체는, 각 경우에, 독립적으로 C1-6알킬, C2-6알켄일, C2-6알킨일, 3- 내지 7-원 카보사이클릴, 3- 내지 7-원 헤테로사이클릴, 할로, -CN, -C(O)Ra, -C(O)2Ra, -C(O)N(Ra)2, -ORa, -N(Ra)2, -N(Ra)C(O)Ra, -N(Ra)N(Ra)2, -NO2, -N(Ra)C(O)2Ra, -N(Ra)C(O)N(Ra)2, -N(Ra)S(O)2Ra, -SRa, -S(O)Ra, -S(O)2Ra, -S(O)N(Ra)2 및 -S(O)2N(Ra)2로부터 선택되고; 그리고
Ra는 각 경우에 독립적으로 H, C1-6알킬, 3- 내지 6-원 단환식 카보사이클릴 및 3- 내지 6-원 단환식 헤테로사이클릴로부터 선택된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "카보사이클릴"은 3 내지 7개의 탄소 원자, 3 내지 6, 또는 5 내지 7개의 탄소 원자의 포화 또는 불포화 단환식 또는 이환식 탄화수소기를 지칭한다. 용어 "카보사이클릴"은 사이클로알킬기 및 방향족 기를 포함한다. 용어 "사이클로알킬"은 3 내지 7개의 탄소 원자, 3 내지 6개의 탄소 원자 또는 5 내지 7개의 탄소 원자의 완전 포화 단환식 또는 이환식 탄화수소기를 지칭한다. 예시적인 단환식 카보사이클릴기는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헵틸, 사이클로프로펜일, 사이클로부텐일, 사이클로페넨틸, 사이클로헥센일, 사이클로헵텐일, 사이클로부타다이엔일, 사이클로펜타다이엔일, 사이클로헥사다이엔일, 사이클로헵타다이엔일, 페닐 및 사이클로헵타트라이엔일을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 예시적인 이환식 카보사이클릴기는 바이사이클로[2.1.1]헥실, 바이사이클로[2.2.1]헵틸, 바이사이클로[2.2.1]헵텐일, 트라이사이클로[2.2.1.02,6]헵탄일, 6,6-다이메틸바이사이클로[3.1.1]헵틸, 또는 2,6,6-트라이메틸바이사이클로[3.1.1]헵틸, 스피로[2.2]펜탄일 및 스피로[3.3]헵탄일을 포함한다.
용어 "가교된 고리계"는, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 고리의 2개의 비인접 원자가 C, N, O 또는 S로부터 선택된 1개 이상(바람직하게는 1 내지 3개)의 원자에 의해 연결(가교)된 카보사이클릴 또는 헤테로사이클릴 고리를 갖는 고리계이다. 가교된 고리계는 6-7 고리 원을 가질 수 있다.
용어 "스피로 고리계"는, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 각각 독립적으로 카보사이클릴 또는 헤테로사이클릴로부터 선택된 2개의 고리를 갖고 2개의 고리 구조가 공통으로 하나의 고리 원자를 갖는 고리계이다. 스피로 고리계는 5 내지 7 고리 원을 갖는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "헤테로사이클릴"은 3- 내지 7-고리 원, 또는 특히 3- 내지 6-고리 원 또는 5- 내지 7-고리 원을 갖고, 이들 중 적어도 하나는 헤테로원자이고, 최대 4(예컨대, 1, 2, 3 또는 4)개는 헤테로원자일 수 있는 포화 또는 불포화, 단환식 또는 이환식 고리계(예컨대, 가교된 또는 스피로 고리계) 고리계를 지칭하며, 헤테로원자는 독립적으로 O, S 및 N으로부터 선택되고, C는 산화될 수 있고(예컨대, C(O)), N은 산화될 수 있거나(예컨대, N(O)) 또는 4차화될 수 있고, S는 선택적으로 설폭사이드 및 설폰으로 산화될 수 있다. 불포화 헤테로사이클릭 고리는 헤테로아릴 고리를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "헤테로아릴"은 O, S 및 N으로부터 독립적으로 선택된1 내지 4개의 헤테로원자를 갖는 방향족 5 또는 6원 단환식 고리계를 지칭하고, 여기서 N은 산화될 수 있거나(예컨대, N(O)) 또는 4차화될 수 있고, S는 선택적으로 설폭사이드 및 설폰으로 산화될 수 있다. 일 실시형태에서, 헤테로사이클릴은 3- 내지 7-원 포화 단환식 또는 3- 내지 6-원 포화 단환식 또는 5- 내지 7-원 포화 단환식 고리이다. 일 실시형태에서, 헤테로사이클릴은 3- 내지 7-원 단환식 또는 3- 내지 6-원 단환식 또는 5- 내지 7-원 단환식 고리이다. 다른 실시형태에서, 헤테로사이클릴은 6- 또는 7-원 이환식 고리이다. 헤테로사이클릴기는 헤테로원자 또는 탄소 원자에 부착될 수 있다. 헤테로사이클릴의 예는 아지리딘일, 옥시란일, 티이란일, 옥사지리딘일, 다이옥시란일, 아제티딘일, 옥세탄일, 티에탄일, 피롤리딘일, 테트라하이드로퓨란일, 티올란일, 이미다졸리딘일, 피라졸리딘일, 옥사졸리딘일, 아이소옥사졸리딘일, 티아졸리딘일, 아이소티아졸리딘일, 다이옥솔란일, 다이티올란일, 옥사티올란일, 피페리딘일, 테트라하이드로피라닐, 티안일, 피페라진일, 모르폴린일, 티오모르폴린일, 다이옥산일, 다이티안일, 트라이옥산일, 트라이티안일, 아제판일, 옥세판일, 티에판일, 다이하이드로퓨란일, 이미다졸린일, 다이하이드로피란일, 및 헤테로아릴 고리, 예컨대, 아지린일, 옥시렌일, 티이렌일, 다이아지린일, 아제틸, 옥세틸, 티에틸, 피롤릴, 퓨란일, 티오페닐(또는 티엔일), 이미다졸릴, 피라졸릴, 옥사졸릴, 아이소옥사졸릴, 티아졸릴, 아이소티아졸릴, 퓨라잔일, 옥사다이아졸릴, 티아다이아졸릴, 다이티아졸릴, 트라이아졸릴, 테트라졸릴, 피리딘일, 피란일, 티오피란일, 피라진일, 피리미딘일, 피리다진일, 옥사진일, 티아진일, 다이옥신일, 다이티인일, 옥사티안일, 트라이아진일, 테트라진일, 아제핀일, 옥세핀일, 티에핀일, 다이아제핀일 및 티아제핀일 등을 포함한다. 이환식 헤테로사이클릭 고리계의 예는 3-아자바이사이클로[3.1.0]헥산일, 3-아자바이사이클로[3.1.1]헵탄일, 2-아자스피로[3.3]헵탄일, 2-옥사-6-아자스피로[3.3]헵탄일, 및 5-아자스피로[2.3]헥산일을 포함한다.
"할로겐" 또는 "할로"는 플루오로, 클로로, 브로모 또는 아이오도일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "실질적으로 무수"는 대략 1000 백만분율(ppm) 이하, 바람직하게는 500 ppm 이하, 더 바람직하게는 100 ppm 이하의 수분 함량을 지칭한다. 수분 함량은 500 내지 1000 ppm, 100 내지 500 ppm, 50 내지 100 ppm, 또는 50 ppm 미만이다. 유기 용액 또는 용매는 건조제를 사용해서 또는 물(공비 증류)의 공비를 통해서 실질적으로 무수로 만들어진다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "건조제"는 유기 용매 또는 유기 화합물, 또는 유기 화합물의 용액으로부터 물을 제거하는데 사용되는 화학 시약을 지칭한다. 임의의 적합한 건조제가 사용될 수 있다. 예시적인 건조제는, 염화칼슘, 염화칼륨, 황산나트륨, 황산칼슘, 황산마그네슘 또는 분자체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 몇몇 실시형태에서, 분자체는 3Å 또는 4Å이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "하이드록실 보호기"는 다른 시약과의 반응으로부터 하이드록실기, -OH를 보호하는데 적합한 기를 지칭한다. 하이드록실 보호기의 예는 문헌[Greene, TW et al., Protective Groups in Organic Synthesis, 4th Ed., John Wiley and Sons (2007)]에서 찾을 수 있다.
소정의 실시형태에서, 하이드록실 보호기는, 예를 들어, 아세틸(Ac); 벤조일(Bz); 벤질(Bn); β-메톡시에톡시메틸 에터(MEM); 메톡시메틸 에터(MOM); 메톡시트라이틸[(4-메톡시페닐)다이페닐메틸, MMT); p-메톡시벤질 에터(PMB); 메틸티오메틸 에터; 피발로일(Piv); 테트라하이드로피라닐(THP); 테트라하이드로퓨란(THF); 실릴 에터(트라이메틸실릴(TMS), tert-부틸다이페닐실릴(TBDPS), tert-부틸다이메틸실릴(TBDMS), 트라이-아이소-프로필실릴옥시메틸(TOM) 및 트라이아이소프로필실릴(TIPS) 에터를 포함하지만, 이들로 제한되지 않음); 메틸 에터 및 에톡시에틸 에터(EE)로부터 선택될 수 있다.
소정의 실시형태에서, 하이드록실 보호기는 뉴클레오사이드의 3'-하이드록실을 보호한다(3'-하이드록실 보호기라 지칭됨). 소정의 실시형태에서, 3'-하이드록실 보호기는 실릴 하이드록실 보호기, 예컨대, 트라이메틸실릴, 트라이에틸실릴, 트라이아이소프로필실릴, 다이메틸아이소프로필실릴, 다이에틸아이소프로필실릴, 다이메틸t헥실실릴, t-부틸다이메틸실릴, t-부틸다이페닐실릴, 트라이벤질실릴, 트라이-p-자일릴실릴, 트라이페닐실릴, 다이페닐메틸실릴, 다이-t-부틸메틸실릴 트라이(트라이메틸실릴)실릴, t-부틸메톡시페닐실릴 및 t-부톡시다이페닐실릴을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 3'-하이드록실 보호기는 TBDPS이다. 소정의 실시형태에서, 3'-하이드록실 보호기는 커다란 소수성 보호기(LHPG), 예컨대, 본 명세서에 기재된 것들이다.
소정의 실시형태에서, 하이드록실 보호기는 뉴클레오사이드의 5'-하이드록실을 보호한다(5'-하이드록실 보호기라 지칭됨). 예시적인 5'-하이드록실기는 본 명세서에 기재된 바와 같은 것들(예컨대, 양상들 또는 실시형태들 중 어느 하나에서의 R15)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 특정 실시형태에서, 5'-하이드록실 보호기는 산-불안정성 4,4'-다이메톡시트라이틸(또는 비스-(4-메톡시페닐)페닐메틸)(DMT 또는 DMTr) 보호기이다. 소정의 실시형태에서, 5'-하이드록실 보호기는 커다란 소수성 보호기(LHPG), 예컨대, 본 명세서에 기재된 것들이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "공비 증류"는 물질 분리제를 사용하는 증류에 의해 유기 용액 또는 용매로부터의 물의 제거를 지칭한다. 물질 분리제는, 벤젠, 톨루엔을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "선택적 석출"은, 상기 용액을 생성물을 석출시키는 용매에 첨가함으로써 1종 이상의 불순물을 용액 중에 남기면서 1종 이상의 불순물로부터 목적하는 생성물을 분리시키는 정제 방법을 지칭한다. 대안적으로, 상기 용매는 조질의 생성물 및 1종 이상의 불순물을 포함하는 용액에 첨가되어 생성물을 석출시킬 수 있다. 소정의 실시형태에서, 본 개시내용의 목적하는 화합물 또는 올리고뉴클레오타이드는 소수성 기(예컨대, 소수성 3'-하이드록실 보호기 또는 소수성 5'-하이드록실 보호기(예컨대, 본 명세서에 기재된 LHPG기))를 포함하고, 화합물 또는 올리고뉴클레오타이드 및 1종 이상의 불순물을 함유하는 용액에 극성 용매(예컨대, CH3CN)의 첨가는 목적하는 올리고뉴클레오타이드를 석출시킨다. 소정의 실시형태에서, 본 개시내용의 목적하는 화합물 또는 올리고뉴클레오타이드는, 공-용매 또는 용매 혼합물(예컨대, 헵탄, tert-부틸메틸에터(TBME 또는 MBTE), 헵탄/MBTE 혼합물(예컨대, 20:1 내지 1:20, 9:1 내지 1:9, 또는 4:1 내지 1:4의 범위의 헵탄 대 MBTE의 용적비를 가진 헵탄/MBTE 혼합물, 또는 9:1, 4:1, 2:1, 1:1, 2:5, 1:2, 1:4 또는 1:9의 헵탄 대 MBTE 용적비를 가진 헵탄/MBTE 혼합물)를 유기 용매(예컨대, 다이클로로메탄(DCM) 또는 에틸아세테이트(EtOAc)) 중 조질의 생성물 및 1종 이상의 불순물을 포함하는 용액에 첨가하여 생성물을 석출시킴으로써 정제될 수 있다. 대안적으로, 조질의 생성물 및 1종 이상의 불순물을 포함하는 용액은 비극성 또는 더 적은 극성 용매 또는 용매 혼합물에 첨가되어 생성물을 석출시킬 수 있다. 적합한 공-용매는 생성물의 소수성에 기초하여 결정될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 공-용매는 생성물이 용해되는 유기 용매보다 덜 극성이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "추출"은, 용액을 1종 이상의 불순물이 불용성인 한편 생성물이 가용성인 용매와 접촉시킴으로써 용액 중 1종 이상의 불순물로부터 목적하는 생성물을 분리시키는 정제 방법을 지칭한다. 대안적으로, 생성물 및 1종 이상의 불순물을 함유하는 용액은 1종 이상의 불순물이 가용성인 한편 생성물이 불용성인 용매와 접촉될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 유기 용매(예컨대, DCM, EtOAc 또는 THF) 또는 유기 용매 혼합물 중에 생성물 및 1종 이상의 불순물을 함유하는 용액(예컨대, 조질의 생성물의 용액 또는 반응 혼합물)은 물 또는 수성 용액(예컨대, NaHCO3/H2O 용액 또는 NaCl/H2O 용액)과 접촉하여 친수성 불순물을 제거할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "강산"은 하기에 나타낸 바와 같이 용액 중에서 완전히 해리되는 산을 지칭한다:
Figure pct00001
S는 용매 분자를 나타낸다. 예시적인 강산은 HCl, HBr, HI, 트라이플릭산, 과염소산, CCl3COOH, CHCl2COOH 및 CH2ClCOOH를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 소정의 실시형태에서, 강산은 강한 유기 산, 예컨대, CF3COOH, CHCl2COOH 및 CH2ClCOOH이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "염기"는 수용액 중에서 하이드록사이드 이온(OH-)을 생산할 수 있는 물질 또는 한 쌍의 비결합 전자를 공여할 수 있는 물질을 지칭한다. 예시적인 염기는, 알칼리 수산화물, 알칼리 토류 수산화물, 알킬아민(예컨대, tert-부틸아민, sec-부틸아민, 트라이메틸아민, 트라이에틸아민, 다이아이소프로필에틸아민, 2-메틸프로판-2-아민), 8-다이아자바이사이클로[5.4. 0]운데크-7-엔(DBU), 이미다졸, N-메틸이미다졸, 피리딘 및 3-피콜린을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "염"은 본 명세서에 기재된 화합물, 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드의 유기 또는 무기 염을 지칭한다. 소정의 실시형태에서, 염은 약제학적으로 허용 가능한 이의 염이다. 어구 "약제학적으로 허용 가능한"은, 물질 또는 조성물이 제형을 포함하는 다른 성분과 화학적으로 및/또는 독성학적으로 양립 가능해야 하고 그리고/또는 포유류가 이에 의해 치료되는 것을 의미한다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 화합물, 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드의 염은 나트륨염, 칼륨염 또는 암모늄염이다. 소정의 실시형태에서, 염은 나트륨염 또는 암모늄염이다.
본 개시내용의 방법
I.단편 합성:
본 명세서에 기재된 방법은, 목적하는 올리고뉴클레오타이드 단편을 형성하기 위하여 액체(용액) 상에서 뉴클레오타이드의 단계적 첨가를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 각 뉴클레오타이드 첨가는 뉴클레오타이드를 성장하는 올리고뉴클레오타이드에 첨가하는 적어도 3개의 반응(커플링, 황화 또는 산화, 및 탈보호)을 포함한다. 우선, 제1 뉴클레오타이드의 5' 말단은 제2 뉴클레오타이드의 3' 말단에 커플링되어 이량체를 형성한다. 이어서, 이량체는 황화 또는 산화되어 포스포티오에이트(즉, P=S 결합) 또는 포스포다이에스터(즉, P=O 결합)를 형성한다. 이어서, 제2 뉴클레오타이드의 5'-하이드록실기는 탈보호되고, 상기 방법은 그 다음 뉴클레오타이드를 첨가하도록 반복된다.
a. 5'-탈보호 반응:
제1 양상에서, 본 개시내용은 뉴클레오타이드, 뉴클레오사이드 또는 올리고뉴클레오타이드 상의 5'-하이드록실 보호기를 제거하는 탈보호 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 탈보호 방법은 5'-트라이틸기를 제거하기 위한 탈트라이틸화 방법이다. 탈트라이틸화 반응이 무수 또는 실질적으로 무수 조건 하에 수행될 경우, 부반응(예컨대, 올리고뉴클레오타이드 합성에 통상적으로 사용되는 핵염기 사이토신 또는 5-메틸사이토신 또는 이들의 유도체의 탈아민화)의 상당한 저감이 달성될 수 있는 것(실시예 3 참조)이 발견되어 있다. 본 탈트라이틸화 방법은 또한 반응의 완결을 용이하게 하기 위하여 양이온 포착제의 첨가를 포함한다. 그 결과, 고순도를 가진 생성물이 크로마토그래피(예컨대, 칼럼 크로마토그래피)의 필요 없이 얻어질 수 있다. 탈트라이틸화 반응의 물 수준은 건조제(예컨대, 분자체), 공비 증류 또는 당업계에 공지된 기타 적합한 방법의 사용에 의해 제어될 수 있다. 대안적으로, 탈트라이틸화 반응에서 사용되는 용매, 산 및 기타 시약, 탈트라이틸화 반응을 겪게 될 기질, 및 반응 베셀은, 탈트라이틸화 반응에 사용하기 전에 잔류 물 수준을 충족시키기 위하여 건조될 수 있다.
제1 양상의 제1 실시형태는, 화학식 (AIa)의 화합물:
Figure pct00002
또는 이의 염을 제조하기 위한 액상 방법으로서,
화학식 (AIIa)의 화합물:
Figure pct00003
또는 이의 염을 탈보호하는 단계를 포함하되, 여기서, 탈보호 반응은 무수 또는 실질적으로 무수인 용액에서 수행되고,
R1은, 각 경우에, 독립적으로 핵염기이고, 핵염기 중의 NH2는, 존재할 경우, 아민 보호기에 의해 보호되고;
R2는, 각 경우에, 독립적으로 H, 할로, 및 C1-6알콕시로 선택적으로 치환된 C1-6알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R4는, 각 경우에, 독립적으로 H이거나 또는 R2의 알콕시기를 가진 고리를 형성하고;
R15는 하이드록실 보호기이고;
R16은, 각 경우에, 독립적으로 C1-6알킬기, C2-6알켄일기, 페닐 또는 벤질기이되, 이들의 각각은 -CN, -NO2 또는 할로겐으로 선택적으로 치환되거나; 또는
R16은
Figure pct00004
또는
Figure pct00005
이고;
z는 0이거나 또는 1 내지 200의 정수이고;
X는, 각 경우에, 독립적으로 O 또는 S이고;
W는 H, Y 또는 Z이고;
Y는 알킬 사슬을 함유하는 소수성 하이드록실 보호기이고; 그리고
Z는 하이드록실 보호기이다.
제1 양상의 제1 실시형태는 또한 화학식 (AI)의 화합물:
Figure pct00006
또는 이의 염을 제조하기 위한 액상 방법을 포함하되, 해당 방법은 하기 화학식 (AII)의 화합물 또는 이의 염을 탈보호하는 단계를 포함한다:
Figure pct00007
여기서 탈보호 반응은 무수 또는 실질적으로 무수인 용액에서 수행되고, 변수는 화학식 (AIa) 및 (AIIa)에 대해서 위에서 정의된 바와 같다.
또한 제1 실시형태에는 하기 화학식 (AI')의 화합물 또는 이의 염을 제조하기 위한 액상 방법이 포함되되:
Figure pct00008
상기 방법은 하기 화학식 (AII')의 화합물 또는 이의 염을 탈보호하는 단계를 포함한다:
Figure pct00009
여기서 탈보호 반응은 무수 또는 실질적으로 무수인 용액에서 수행되고, W는 H 또는 Z이고; Z는 실릴 하이드록실 보호기이고; 그리고 나머지 변수는 화학식 (AIa) 및 (AIIa)에 대해서 위에서 정의된 바와 같다.
특정 실시형태에서, R16은 하기 중 하나이다:
Figure pct00010
문헌[Nat Biotechnol. 2017 Sep;35(9):845-851; J. Org. Chem. 1999, 64, 7515-7522; Biopolymers (Peptide Science), 2001, 60, 3]을 참조하며, 이의 각각은 참조에 의해 본 명세서에 원용된다.
제2 실시형태에서, 탈보호 반응은 건조제의 존재 하에 수행된다. 임의의 적합한 건조제는 탈보호 반응에 사용될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 건조제는 염화칼슘, 염화칼륨, 황산나트륨, 황산칼슘, 황산마그네슘 및 분자체로부터 선택된다.
제3 실시형태에서, 제2 실시형태에 사용되는 건조제는 분자체이다.
제4 실시형에서, 제3 실시형태의 분자체의 크기는 3Å 또는 4Å이다. 바람직한 실시형태에서, 분자체의 크기는 3Å이다.
제5 실시형태에서, 탈보호 반응을 위한 무수 또는 실질적으로 무수 용액은 탈보호 반응 전에 공비 증류를 사용해서 물을 제거함으로써 얻어진다.
대안적으로, 용매, 산 또는 산 용액, 및 기타 시약 또는 탈트라이틸화 반응에 사용될 시약을 포함하는 용액, 탈트라이틸화 반응을 겪을 기질 또는 기질 용액, 및 반응 용기는 탈트라이틸화 반응 전에 개별적으로 건조되거나 조합될 수 있다.
제6 실시형태에서, 탈보호 반응은 -SH기를 포함하는 양이온 포착제, 실란 포착제(예컨대, HSiPh3, HSiBu3, 트라이아이소프로필실란 등), 실록산, 폴리스타이렌, 퓨란, 피롤 및 인돌로부터 선택된 포착제의 존재 하에 수행된다.
특정 실시형태에서, 탈보호 반응은 1-도데칸티올, 사이클로헥산티올, 1-옥탄티올, 트라이아이소프로필실란, 인돌, 2,3-다이메틸퓨란, 다이페닐실란, 2-머캅토이미다졸, 다이페닐메틸실란, 페닐실란, 5-메톡시인돌, 메틸페닐실란, 클로로다이메틸실란, 1,1,3,3-테트라메틸다이실록산, 1-티오글리세롤, 트라이페닐실란, tert-부틸다이메틸실란, 부틸실란, 메틸다이에톡시실란, 1,1,3,3,5,5-헥사메틸트라이실록산, 헥실실란, (머캅토메틸)폴리스타이렌 또는 다이메틸페닐실란으로부터 선택된 포착제의 존재 하에 수행된다.
제7 실시형태에서, 제6 실시형태의 양이온 포착제는 화학식 RSH의 화합물이되, R은 알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴기이고, 이들의 각각은 선택적으로 치환된다.
제8 실시형태에서, 제7 실시형태의 RSH기는 CH3(CH2)5SH, CH3(CH2)11SH, 사이클로헥산티올(CySH) 또는 CH3CH2OC(=O)CH2CH2SH이다.
본 개시내용의 제9 실시형태는 제1 내지 제8 실시형태 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 방법이되, 여기서 R15는 4,4'-다이메톡시트라이틸(DMT)기이다.
제10 실시형태에서, 탈보호 반응은 화학식 (AII)의 화합물을 탈트라이틸화 시약과 반응시킴으로써 수행된다. 임의의 적합한 탈트라이틸화 시약이 사용될 수 있다.
제11 실시형태에서, 제10 실시형태의 탈트라이틸화 시약은 강한 유기 산이다.
제12 실시형태에서, 탈트라이틸화 시약은 CF3COOH, CCl3COOH, CHCl2COOH, CH2ClCOOH, H3PO4, 메탄설폰산(MSA), 벤젠설폰산(BSA), CClF2COOH, CHF2COOH, PhSO2H(페닐설핀산) 등으로부터 선택된다. 바람직한 실시형태에서, 탈트라이틸화 시약은 CH2ClCOOH이다. 다른 구체적인 실시형태에서, 탈트라이틸화 시약은 CF3COOH이다. 또 다른 구체적인 실시형태에서, 탈트라이틸화 시약은 CHCl2COOH이다.
소정의 실시형태에서, 탈트라이틸화 시약은 시트르산이다. 소정의 실시형태에서, 탈트라이틸화 시약은 포화 시트르산 용액이다.
제1 양상의 제13 실시형태는 위에서 개시된 실시형태 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 방법이되, 여기서 W는 Z이다.
제14 실시형태에서, Z기는 실릴 하이드록실 보호기이다. 예시적인 실릴 보호기는, 트라이메틸실릴, 트라이에틸실릴, 트라이아이소프로필실릴, 다이메틸아이소프로필실릴, 다이에틸아이소프로필실릴, 다이메틸t헥실실릴, t-부틸다이메틸실릴, t-부틸다이페닐실릴, 트라이벤질실릴, 트라이-p-자일릴실릴, 트라이페닐실릴, 다이페닐메틸실릴, 다이-t-부틸메틸실릴 트라이(트라이메틸실릴)실릴, t-부틸메톡시페닐실릴 및 t-부톡시다이페닐실릴을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
제15 실시형태에서, 제14 실시형태의 실릴 하이드록실 보호기는 TBDPS, TBoDPS 및 TBDAS로부터 선택된다.
Figure pct00011
식 중, R5, R6 및 R7은 각각 독립적으로 H, C1-30알킬 또는 C1-30알콕시이다.
제16 실시형태에서, 제14 실시형태의 실릴 보호기는 하기이다:
Figure pct00012
여기서, s는 1 내지 30의 정수이다.
제17 실시형태에서, 제14 실시형태의 Z기는 TBDPS이다.
제18 실시형태는 제1 내지 제12 실시형태 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 방법을 개시하되, 여기서 W는 하기 화학식으로 표시되는 Y이고:
Figure pct00013
여기서, X0은 C1-10알킬이되, 1개 이상의 CH2기는 독립적으로 C(O), C(O)NH2, 사이클로알킬 또는 헤테로사이클릴기로 대체되고; 그리고 X1은 C1-25알킬 또는 C1-25알콕시이다. 특정 실시형태에서, Y는 하기 화학식으로 나타낸다:
Figure pct00014
여기서 p는 1 내지 10의 정수이고; Het는 포화 헤테로사이클이고; 그리고 나머지 변수는 위에서 기재된 바와 같다. 더욱 구체적인 실시형태에서, Het는 피페라진이다.
제19 실시형태에서, 제18 실시형태의 Y는 하기 화학식으로 나타낸다:
Figure pct00015
제20 실시형태는 제1 내지 제19 실시형태 중 어느 하나에 기재된 방법을 개시하되, 화학식 (AI)의 화합물 또는 (AI') 또는 이의 염은 크로마토그래피(예컨대, 칼럼 크로마토그래피)에 의해 정제되지 않는다.
제21 실시형태는 제1 내지 제20 실시형태에 기재된 방법을 개시하되, 화학식 (AI)의 화합물 또는 (AI') 또는 이의 염은 선택적 석출 및/또는 추출에 의해 정제된다. 소정의 실시형태에서, 화학식 (AI)의 화합물 또는 이의 염은 선택적 석출에 의해 정제된다. 소정의 실시형태에서, 화학식 (AI)의 화합물 또는 이의 염의 선택적 석출은 DCM 중 조질의 생성물의 용액에 아세토나이트릴을 첨가함으로써 달성될 수 있다. 대안적으로, 조질의 생성물의 용액이 아세토나이트릴에 첨가되어 목적하는 생성물을 석출시킬 수 있다.
소정의 실시형태에서, 화학식 (AI')의 화합물 또는 이의 염은 선택적 석출에 의해 정제된다. 소정의 실시형태에서, 화학식 (AI')의 화합물 또는 이의 염은 선택적 석출에 부가해서 유기 용매(MBTE, EtOAc, 헵탄/MBTE 혼합물, DCM 등) 중에 화학식 (AI')의 화합물 또는 이의 염을 포함하는 용액을 수성 용액(예컨대, NaHCO3/H2O 또는 NaCl/H2O)에 의한 추출에 의해 정제된다. 소정의 실시형태에서, 추출은 선택적 석출 전에 수행된다. 대안적으로, 추출은 선택적 석출 후에 수행된다. 소정의 실시형태에서, 화학식 (AI')의 화합물 또는 이의 염의 선택적 석출은 DCM 또는 EtOAc 중의 조질의 생성물의 용액에 헵탄 또는 헵탄/MBTE 혼합물을 첨가함으로써 달성될 수 있다. 대안적으로, 조질의 생성물의 용액이 헵탄 또는 헵탄/MBTE 혼합물에 첨가되어 목적하는 생성물을 석출시킬 수 있다. 적합한 용적비(예컨대, 본 명세서에 기재된 용적비)의 헵탄/MBTE 혼합물이 사용될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 제1 양상 또는 그 안에 기재된 임의의 실시형태의 방법(예컨대, 제1 내지 제21 실시형태 중 어느 하나에 기재된 방법)에 대해서, z는 1 내지 150, 1 내지 100, 1 내지 50, 1 내지 20, 1 내지 10 또는 1 내지 5이다.
몇몇 실시형태에서, 제1 양상 또는 그 안에 기재된 임의의 실시형태의 방법(예컨대, 제1 내지 제21 실시형태 중 어느 하나에 기재된 방법)에 대해서, R16은, 각 경우에, 독립적으로 C1-6알킬기, C2-6알켄일기, 페닐 또는 벤질기이되, 이들의 각각은 -CN, -NO2 또는 할로겐으로 선택적으로 치환되거나; 또는 R16은
Figure pct00016
또는
Figure pct00017
이다. 특정 실시형태에서, R16은 하기 중 하나이다:
Figure pct00018
몇몇 실시형태에서, 제1 양상 또는 그 안에 기재된 임의의 실시형태(예컨대, 제1 내지 제21 실시형태 중 어느 하나에 기재된 방법)의 방법에 대해서:
각각의 R2는 독립적으로 H, 할로겐, 또는 C1-4알콕시로 선택적으로 치환된 C1-4알콕시로부터 선택되고;
R4는 H이고; 그리고
R16은 -CH2CH2CN이다.
특정 실시형태에서, R2는 -OCH2CH2OMe이다.
b. 3'-탈보호 반응:
제2 양상에서, 본 개시내용은 올리고뉴클레오타이드 상의 3'-하이드록실 보호기를 제거하는 액상 탈보호 방법을 기재한다. 일 실시형태에서, 탈보호 방법은 탈실릴화 공정이다. 본 개시내용의 탈실릴화 공정이 올리고뉴클레오타이드 상의 다른 민감성 기에 영향을 미치는 일 없이 3'-하이드록실기의 실릴 보호기, 예컨대, 5'-트라이틸기, 핵염기의 각종 보호기(예컨대, 벤조일 또는 아이소부티릴기), 사이아노에틸 및 -OCH2CH2OMe(메톡시에틸(MOE)로도 공지됨)기를 선택적으로 제거할 수 있는 것을 발견하고 있다.
제22 실시형태에서, 본 개시내용의 제2 양상은 하기 화학식 (BI)의 화합물 또는 이의 염을 제조하기 위한 액상 방법에 관한 것으로서:
Figure pct00019
화학식 (BII)의 화합물:
Figure pct00020
또는 이의 염을 탈보호하여, 화학식 (BI)의 화합물 또는 이의 염을 형성하는 단계를 포함하되, 식 중,
R1은, 각 경우에, 독립적으로 핵염기이고, 핵염기 중의 NH2는, 존재할 경우, 아민 보호기에 의해 보호되고;
R2는, 각 경우에, 독립적으로 H, 할로, 및 C1-6알콕시로 선택적으로 치환된 C1-6알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R4는, 각 경우에, 독립적으로 H이거나 또는 R2의 알콕시기를 가진 고리를 형성하고;
R15는 하이드록실 보호기이고;
R16은, 각 경우에, 독립적으로 C1-6알킬기, C2-6알켄일기, 페닐 또는 벤질기이되, 이들의 각각은 -CN, -NO2 또는 할로겐으로 선택적으로 치환되거나; 또는
R16은
Figure pct00021
또는
Figure pct00022
이고;
q는 1 내지 200의 정수이고;
X는, 각 경우에, 독립적으로 O 또는 S이고; 그리고
Z는 하이드록실 보호기(예컨대, 실릴 하이드록실 보호기)이다.
제23 실시형태에서, 본 개시내용의 제2 양상은, 하기 화학식 (B2I)의 화합물 또는 이의 염을 제조하기 위한 액상 방법에 관한 것으로서:
Figure pct00023
화학식 (B2II)의 화합물
Figure pct00024
또는 이의 염을 탈보호하여, 화학식 (B2I)의 화합물 또는 이의 염을 형성하는 단계를 포함하되, 식 중,
R1은, 각 경우에, 독립적으로 핵염기이고, 핵염기 중의 NH2는, 존재할 경우, 아민 보호기에 의해 보호되고;
R2는, 각 경우에, 독립적으로 H, 할로, 및 C1-6알콕시로 선택적으로 치환된 C1-6알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R4는, 각 경우에, 독립적으로 H이거나 또는 R2의 알콕시기를 가진 고리를 형성하고;
R16은, 각 경우에, 독립적으로 C1-6알킬기, C2-6알켄일기, 페닐 또는 벤질기이되, 이들의 각각은 -CN, -NO2 또는 할로겐으로 선택적으로 치환되거나; 또는
R16은
Figure pct00025
또는
Figure pct00026
이고;
q는 1 내지 200의 정수이고;
X는, 각 경우에, 독립적으로 O 또는 S이고;
Y는 알킬 사슬을 함유하는 소수성 하이드록실 보호기이고; 그리고
Z는 하이드록실 보호기이다.
제24 실시형태에서, 제23 실시형태의 Y는 하기 화학식으로 표시된다:
Figure pct00027
식 중, Xa는 C1-10알킬이고, 여기서 1개 이상의 CH2기는 독립적으로 C(O), C(O)NH2, 사이클로알킬 또는 C1-6헤테로사이클릴기로 대체되고; 그리고 X1은 C1-25알킬 또는 C1-25알콕시. 특정 실시형태에서, Y는 하기 화학식으로 표시된다:
Figure pct00028
식 중, p는 1 내지 10의 정수이고; Het는 포화 헤테로사이클이고; 그리고 나머지 변수는 위에서 기재된 바와 같다. 더욱 구체적인 실시형태에서, Het는 피페라진이다.
제25 실시형태에서, 제23 실시형태의 Y는 하기 화학식으로 표시된다:
Figure pct00029
제26 실시형태에서, 탈보호 반응은 화학식 (BII) 또는 (B2II)의 화합물 또는 이의 염을 염기의 존재 하에 HF와 반응시킴으로써 수행된다.
제27 실시형태에서, 제26 실시형태에서의 염기는 이미다졸 또는 피리딘이되, 여기서 이미다졸 또는 피리딘은 선택적으로 치환된다.
제28 실시형태는 제22 내지 제27 실시형태 중 어느 하나에 기재된 방법을 개시하되, 여기서 HF에 대해서 과잉의 염기가 사용된다.
제29 실시형태에서, 탈보호 반응은 화학식 (BII) 또는 (B2II)의 화합물 또는 이의 염을 피리딘 및 이미다졸의 존재 하에 HF와 반응시킴으로써 수행된다.
제30 실시형태에서, 제29 실시형태의 이미다졸 대 HF의 몰비는 1.1:1 내지 5:1의 범위이다. 몇몇 실시형태에서, 이미다졸 대 HF의 몰비는 1.1:1 내지 3:1, 1.5:1 내지 3:1, 또는 1.5:1 내지 2.5:1의 범위이다.
제31 실시형태에서, 제30 실시형태의 이미다졸 대 HF의 몰비는 2:1이다.
제32 실시형태에서, 제29 내지 제31 실시형태 중 어느 하나에 기재된 방법에 대해서, 피리딘 대 HF의 몰비는 1.1:1 내지 20:1의 범위이다. 몇몇 실시형태에서, 피리딘 대 HF의 몰비는 5:1 내지 20:1 또는 5:1 내지 15:1의 범위이다. 특정 실시형태에서, 피리딘 대 HF의 몰비는 10:1이다.
제33 실시형태는 제22 내지 제32 실시형태 중 어느 하나에 기재된 방법을 개시하되 Z는 실릴 하이드록실 보호기이다. 소정의 실시형태에서, 실릴 보호기는 제14 실시형태에서 위에서 기재된 것들을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
제34 실시형태에서, 실릴 하이드록실 보호기는 제15, 제16 또는 제17 실시형태에 기재된 것과 같은 TBDPS, ToBDPS 또는 TBDAS이다. 소정의 실시형태에서, 실릴 하이드록실 보호기는 TBDPS이다.
소정의 실시형태에서, 위에서 (예컨대, 제23 내지 제34 실시형태 중 어느 하나에서) 기재된 탈보호 반응은 적합한 유기 용매, 예컨대, THF 중에서 수행된다.
제35 실시형태는 제22 내지 제34 실시형태 중 어느 하나에 기재된 방법을 개시하되, 화학식 (BI) 또는 (B2I)의 화합물 또는 이의 염은 크로마토그래피(예컨대, 칼럼 크로마토그래피)에 의해 정제되지 않는다.
제36 실시형태에서, 화학식 (BI) 또는 (B2I)의 화합물 또는 이의 염은 선택적 석출 및/또는 추출에 의해 정제된다. 소정의 실시형태에서, 화학식 (B2I)의 화합물 또는 이의 염은 선택적 석출에 의해 정제된다. 소정의 실시형태에서, 화학식 (B2I)의 화합물 또는 이의 염의 선택적 석출은 DCM 중 조질의 생성물의 용액에 아세토나이트릴을 첨가함으로써 달성될 수 있다. 대안적으로, 조질의 생성물의 용액은 아세토나이트릴에 첨가되어 목적하는 생성물을 석출시킬 수 있다.
소정의 실시형태에서, 화학식 (BI)의 화합물 또는 이의 염은 선택적 석출에 의해 정제된다. 소정의 실시형태에서, 화학식 (BI)의 화합물 또는 이의 염은 선택적 석출에 부가해서 수성 용액(예컨대, NaHCO3/H2O 또는 NaCl/H2O)에 의한 유기 용매(MBTE, EtOAc, 헵탄/MBTE 혼합물, DCM 등) 중의 화학식 (BI)의 화합물 또는 이의 염을 포함하는 용액의 추출에 의해 정제된다. 소정의 실시형태에서, 추출은 선택적 석출 전에 수행된다. 대안적으로, 추출은 선택적 석출 후에 수행된다. 소정의 실시형태에서, 화학식 (BI)의 화합물 또는 이의 염의 선택적 석출은 DCM 또는 EtOAc 중 조질의 생성물의 용액에 헵탄 또는 헵탄/MBTE 혼합물을 첨가함으로써 달성될 수 있다. 대안적으로, 조질의 생성물의 용액이 헵탄 또는 헵탄/MBTE 혼합물에 첨가되어 목적하는 생성물을 석출시킬 수 있다. 적합한 용적비(예컨대, 본 명세서에 기재된 용적비)를 가진 헵탄/MBTE 혼합물이 사용될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 제2 양상 또는 그 안에 기재된 임의의 실시형태(예컨대, 제22, 제26 내지 제36 실시형태)에 기재된 방법에 대해서, R15는 4,4'-다이메톡시트라이틸(DMT)기이다.
몇몇 실시형태에서, 제2 양상 또는 그 안에 기재된 임의의 실시형태(예컨대, 제22 내지 제36 실시형태)에 기재된 방법에 대해서, 각각의 R2는 독립적으로 H, 또는 C1-4알콕시로 선택적으로 치환된 C1-4알콕시로부터 선택되고; R4는 H이고; 그리고 R16은 -CH2CH2CN이다.
몇몇 실시형태에서, 제2 양상 또는 그 안에 기재된 임의의 실시형태(예컨대, 제22, 제26 내지 제36 실시형태)에 기재된 방법에 대해서, 각각의 R2는 독립적으로 H, 할로, 또는 C1-4알콕시로 선택적으로 치환된 C1-4알콕시로부터 선택되고; R4는 H이고; R15는 4,4'-다이메톡시트라이틸이고; 그리고 R16은 -CH2CH2CN이다. 특정 실시형태에서, R2는 MOE이다.
몇몇 실시형태에서, 제2 양상 또는 그 안에 기재된 임의의 실시형태(예컨대, 제22 내지 제36 실시형태)에 기재된 방법에 대해서, 각각의 R2는 독립적으로 H, 할로(예컨대, F), 또는 C1-4알콕시로 선택적으로 치환된 C1-4알콕시로부터 선택되고; R4는 H이고; 그리고 R16은 -CH2CH2CN이다. 특정 실시형태에서, R2는 -OCH2CH2OCH3(MOE)이다.
c. 포스피틸화 반응
본 개시내용의 제3 양상은 본 명세서에 기재된 올리고뉴클레오타이드의 액상 포스피틸화 방법을 제공한다. 상기 방법은 3'-OH기를 포스포다이아미다이트 또는 H-포스포네이트 (HO)P(O)H와 반응시키는 단계를 포함한다. 본 개시내용의 포스피틸화 방법은 크로마토그래피 정제 없이 고순도로 3개 이상의 뉴클레오타이드를 가진 올리고뉴클레오타이드 단편을 합성하는데 사용될 수 있다.
제37 실시형태는 하기 화학식 (CI) 또는 (CI')의 화합물 또는 이의 염을 제조하기 위한 액체 방법을 개시하되:
Figure pct00030
상기 방법은 화학식 (CII)의 화합물
Figure pct00031
또는 이의 염을 포스포다이아미다이트 (R16O)P(NR17aR17b)2 또는 H-포스포네이트 (HO)P(O)H와 반응시켜 각각 화학식 (CI) 또는 (CI')의 화합물을 형성하는 단계를 포함한다:
식 중,
R1은, 각 경우에, 독립적으로 핵염기이고, 핵염기 중의 NH2는, 존재할 경우, 아민 보호기에 의해 보호되고;
R2는, 각 경우에, 독립적으로 H, 할로, 및 할로겐 또는 C1-6알콕시로 선택적으로 치환된 C1-6알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R4는, 각 경우에, 독립적으로 H이거나 또는 R2의 알콕시기를 가진 고리를 형성하고;
R15는 하이드록실 보호기이고;
R16은, 각 경우에, 독립적으로 C1-6알킬기, C2-6알켄일기, 페닐 또는 벤질기이되, 이들의 각각은 -CN, -NO2 또는 할로겐으로 선택적으로 치환되거나; 또는
R16은
Figure pct00032
또는
Figure pct00033
이고;
R17a 및 R17b는 독립적으로 C1-6알킬이고;
q1은 2 내지 200의 정수이고;
X는, 각 경우에, 독립적으로 O 또는 S이고; 그리고
Z는 실릴 하이드록실 보호기이다.
제38 실시형태는 하기 화학식 (C2I)의 화합물 또는 이의 염을 제조하기 위한 액체 방법을 개시하되:
Figure pct00034
상기 방법은 화학식 (C2II)의 화합물
Figure pct00035
또는 이의 염을 포스포다이아미다이트 (R16O)P(NR17aR17b)2와 반응시켜, 화학식 (C2I)의 화합물 또는 이의 염을 형성하는 단계를 포함하며, 식 중,
R1은, 각 경우에, 독립적으로 핵염기이고, 핵염기 중의 NH2는, 존재할 경우, 아민 보호기에 의해 보호되고;
R2는, 각 경우에, 독립적으로 H, 할로, 및 할로겐 또는 C1-6알콕시로 선택적으로 치환된 C1-6알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R4는, 각 경우에, 독립적으로 H이거나 또는 R2의 알콕시기를 가진 고리를 형성하고;
R16은, 각 경우에, 독립적으로 C1-6알킬기, C2-6알켄일기, 페닐 또는 벤질기이되, 이들의 각각은 -CN, -NO2 또는 할로겐으로 선택적으로 치환되거나; 또는
R16은
Figure pct00036
또는
Figure pct00037
이고;
R17a 및 R17b는 독립적으로 C1-6알킬이고;
q1은 2 내지 200의 정수이고;
X는, 각 경우에, 독립적으로 O 또는 S이고; 그리고
Z는 실릴 하이드록실 보호기이다.
몇몇 실시형태에서, 제38 실시형태에 기재된 방법에 대해서, 각각의 R2는 독립적으로 H, F, 또는 C1-4알콕시로 선택적으로 치환된 C1-4알콕시로부터 선택되고; R4는 H이고; R16은 -CH2CH2CN이고; R17a 및 R17b는 독립적으로 C1-6알킬이고; 그리고 Z는 본 명세서에 기재된 실릴 하이드록실 보호기이다. 몇몇 실시형태에서, Z는 TBDPS, TBoDPS 및 TBDAS로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, R2는 H이고, R4는 H이고; R16은 -CH2CH2CN이고; R17a와 R17b는 둘 다 -CH(CH3)2이고; 그리고 Z는 TBDPS이다. 다른 구체적인 실시형태에서, R2는 MOE, R4는 H이고; R16은 -CH2CH2CN이고; R17a와 R17b는 둘 다 -CH(CH3)2이고; 그리고 Z는 TBDPS이다.
제39 실시형태는 제3 양상 또는 그 안에 기재된 임의의 실시형태(예컨대, 제37 또는 제38 실시형태)에 기재된 방법을 개시하되, 반응은 활성제의 존재 하에 수행된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 활성제는 올리고뉴클레오타이드(예컨대, 화학식 (CII)의 화합물 또는 (C2II))의 3'-하이드록실기와 포스포다이아미다이트 또는 H-포스포네이트 간의 반응을 용이하게 하는 화학 시약이다. 예시적인 활성제는 하기 시약을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다:
Figure pct00038
제40 실시형태에서, 본 개시내용은 제39 실시형태에 기재된 방법을 제공하되, 여기서 활성제는 피리딘 트라이플루오로아세테이트(Py
Figure pct00039
TFA) 또는 N-메틸이미다졸륨 트라이플레이트이다.
제41 실시형태는 제34 내지 제36 실시형태 중 어느 하나에 기재된 방법을 개시하되, 화학식 (CI), (CI') 또는 (C2I)의 화합물은 크로마토그래피(예컨대, 칼럼 크로마토그래피)에 의해 정제되지 않는다.
제42 실시형태는 제34 내지 제36 실시형태 중 어느 하나에 기재된 방법을 개시하되, 여기서 화학식 (CI), (CI') 또는 (C2I)의 화합물 또는 이의 염은 선택적 석출 및/또는 추출에 의해 정제된다. 소정의 실시형태에서, 화학식 (CI), (CI') 또는 (C2I)의 화합물 또는 이의 염은 선택적 석출에 의해 정제된다. 소정의 실시형태에서, 화학식 (CI), (CI') 또는 (C2I)의 화합물 또는 이의 염은, 선택적 석출에 부가해서 유기 용매(MBTE, EtOAc, 헵탄/MBTE 혼합물, DCM 등) 중 화학식 (CI), (CI') 또는 (C2I)의 화합물 또는 이의 염을 포함하는 용액을 수성 용액(예컨대, NaHCO3/H2O 또는 NaCl/H2O)에 의한 추출에 의해 정제된다. 소정의 실시형태에서, 추출은 선택적 석출 전에 수행된다. 대안적으로, 추출은 선택적 석출 후에 수행된다. 소정의 실시형태에서, 화학식 (CI), (CI') 또는 (C2I)의 화합물 또는 이의 염의 선택적 석출은 DCM 또는 EtOAc 중 조질의 생성물의 용액에 헵탄 또는 헵탄/MBTE 혼합물을 첨가함으로써 달성될 수 있다. 대안적으로, 조질의 생성물의 용액이 헵탄 또는 헵탄/MBTE 혼합물에 첨가되어 목적하는 생성물을 석출시킬 수 있다. 적합한 용적비(예컨대, 본 명세서에 기재된 용적비)를 가진 헵탄/MBTE 혼합물이 사용될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 제3 양상 또는 그 안에 기재된 임의의 실시형태(예컨대, 제37 실시형태)에 기재된 방법에 대해서, 화학식 (CI), (CI') 또는 (CII)에 대한 변수는 이하에 정의된 바와 같다:
각각의 R2는 독립적으로 H, F, 또는 C1-4알콕시로 선택적으로 치환된 C1-4알콕시로부터 선택되고;
R4는 H이고;
R15는 4,4'-다이메톡시트라이틸이고;
R16은 -CH2CH2CN이고; 그리고
R17a 및 R17b는 독립적으로 C1-6알킬이다.
특정 실시형태에서, R2는 MOE이다. 다른 구체적인 실시형태에서, R2는 H이고; R4는 H이고; R16은 -CH2CH2CN이고; 그리고 R17a와 R17b는 둘 다 -CH(CH3)2이다. 다른 구체적인 실시형태에서, R2는 MOE이고, R4는 H이고; R16은 -CH2CH2CN이고; 그리고 R17a와 R17b는 둘 다 -CH(CH3)2이다.
제43 실시형태는 하기 화학식 (CI')의 화합물 또는 이의 염을 제조하기 위한 액체 방법을 개시하되:
Figure pct00040
상기 방법은,
1) 화학식 (CI'A)의 화합물
Figure pct00041
또는 이의 염을 화학식 (A1)의 화합물
Figure pct00042
또는 이의 염과 반응시켜, 화학식 (CI'B)의 화합물
Figure pct00043
또는 이의 염의 염을 형성하는 단계; 및
3) 화학식 (CI'B)의 화합물 또는 이의 염을 황화제 또는 산화제로 황화 또는 산화시켜, 화학식 (CI'C)의 화합물
Figure pct00044
또는 이의 염을 형성하는 단계;
4) 화학식 (CI'C)의 화합물 또는 이의 염을 탈보호하여, 화학식 (CI'D)의 화합물:
Figure pct00045
또는 이의 염을 형성하는 단계;
5) 화학식 (CI'D)의 화합물에서 시작해서, 단계 1), 2) 3) 및 4)를 q1-3회 동안 반복하고 나서, 단계 1), 2) 및 3)을 반복하여, 화학식 (CI')의 단편 또는 이의 염을 수득하는 단계
를 포함하되, 식 중,
R1은, 각 경우에, 독립적으로 핵염기이고, 핵염기 중의 NH2는, 존재할 경우, 아민 보호기에 의해 보호되고;
R2는, 각 경우에, 독립적으로 H, 할로, 및 C1-6알콕시로 선택적으로 치환된 C1-6알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R4는, 각 경우에, 독립적으로 H이거나 또는 R2의 알콕시기를 가진 고리를 형성하고;
R15는 하이드록실 보호기(예컨대, DMT기)이고;
R16은, 각 경우에, 독립적으로 C1-6알킬기, C2-6알켄일기, 페닐 또는 벤질기이되, 이들의 각각은 -CN, -NO2 또는 할로겐으로 선택적으로 치환되거나; 또는
R16은
Figure pct00046
또는
Figure pct00047
이고;
R17a 및 R17b는 독립적으로 C1-6알킬이고;
q1은 2 내지 200의 정수이고; 그리고
X는, 각 경우에, 독립적으로 O 또는 S이다.
제44 실시형태는, 하기 단계를 포함하는, 하기 화학식 (CIc)의 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염을 제조하기 위한 액상 방법을 개시한다:
Figure pct00048
화학식 (CIa)의 올리고뉴클레오타이드 단편:
Figure pct00049
또는 이의 염을 화학식 (CIb)의 올리고뉴클레오타이드 단편:
Figure pct00050
또는 이의 염과 커플링시켜, 화학식 (CIc)의 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염을 형성하는 단계, 식 중,
R1은, 각 경우에, 독립적으로 핵염기이고, 핵염기 중의 NH2는, 존재할 경우, 아민 보호기에 의해 보호되고;
R2는, 각 경우에, 독립적으로 H, 할로, 및 C1-6알콕시로 선택적으로 치환된 C1-6알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R4는, 각 경우에, 독립적으로 H이거나 또는 R2의 알콕시기를 가진 고리를 형성하고;
R15는 하이드록실 보호기이고;
R16은, 각 경우에, 독립적으로 C1-6알킬기, C2-6알켄일기, 페닐 또는 벤질기이되, 이들의 각각은 -CN, -NO2 또는 할로겐으로 선택적으로 치환되거나; 또는
R16은
Figure pct00051
또는
Figure pct00052
이고;
q1a는 2 내지 20의 정수이고;
q1b는 2 내지 20의 정수이고;
X는, 각 경우에, 독립적으로 O 또는 S이고; 그리고
Z는 하이드록실 보호기이다.
소정의 실시형태에서, 제44 실시형태의 커플링 반응은 아실 클로라이드의 존재 하에 수행된다. 특정 실시형태에서, 화학식 (CIa)의 올리고뉴클레오타이드와 화학식 (CIb)의 올리고뉴클레오타이드 간의 커플링 반응은 피발로일 클로라이드의 존재 하에 수행된다. 다른 구체적인 실시형태에서, 커플링 반응은 피발로일 클로라이드 및 염기(예컨대, 피리딘)의 존재 하에 수행된다.
소정의 실시형태에서, 제43 또는 제44 실시형태에 기재된 방법에 대해서, 그 안에 기재된 반응 단계 중 어느 하나의 단계의 반응 생성물을 정제시키기 위하여 크로마토그래피가 사용되지 않는다. 소정의 그 안에 기재된 반응 단계 중 어느 하나의 단계의 반응 생성물은 본 명세서에 기재된 바와 같은(예컨대, 제21, 제35 또는 제42 실시형태에 기재된 바와 같은) 선택적 석출 및/또는 추출에 의해 정제된다.
d. 3'-올리고뉴클레오타이드 단편의 합성
제4 양상에서, 본 개시내용은 3'-말단에 소수성 하이드록실 보호기를 보유하는 올리고뉴클레오타이드 단편(본 명세서에서 "3'-단편"이라 지칭됨)을 제조하는 액상 방법을 기재한다. 놀랍게도 3'-단편을 합성하기 위한 본 개시내용의 방법은 크로마토그래피 정제없이 고순도로 3 내지 20(예컨대, 3 내지 10, 3 내지 8, 3 내지 5 또는 4 내지 5)개의 뉴클레오타이드를 갖는 올리고뉴클레오타이드 단편을 제조하는데 사용될 수 있는 것이 발견되었다. 몇몇 실시형태에서, 소수성 3'-하이드록실 보호기가 사용되는데, 이는 선택적 석출에 의한 올리고뉴클레오타이드 단편 생성물의 분리를 용이하게 한다. 몇몇 실시형태에서, 액상 방법은 (1) 5'-OH 탈보호 단계, (2) 커플링 단계 및 (3) 산화 또는 황화 단계를 포함하되, 여기서 단계 (1), (2) 및 (3)은 목적하는 수의 뉴클레오타이드가 함께 연결되어 3'-올리고뉴클레오타이드 단편을 형성할 때까지 반복된다.
제45 실시형태는, 하기 단계들을 포함하는, 하기 화학식 (I)의 올리고뉴클레오타이드 단편 또는 이의 염을 제조하기 위한 액상 방법을 개시한다:
Figure pct00053
1) 화학식 (I'A)의 화합물:
Figure pct00054
또는 이의 염을 탈보호하여, 화학식 (IA)의 화합물:
Figure pct00055
또는 이의 염을 형성하는 단계;
2) 화학식 (IA)의 화합물 또는 이의 염을 화학식 (A1)의 화합물:
Figure pct00056
또는 이의 염과 반응시켜, 화학식 (IB)의 화합물:
Figure pct00057
또는 이의 염을 형성하는 단계; 및
3) 화학식 (IB)의 화합물 또는 이의 염을 황화제 또는 산화제로 황화 또는 산화시켜, 화학식 (IC)의 화합물:
Figure pct00058
또는 이의 염을 형성하는 단계;
4) 화학식 (IC)의 화합물 또는 이의 염을 탈보호하여, 화학식 (ID)의 화합물:
Figure pct00059
또는 이의 염을 형성하는 단계;
5) 화학식 (ID)의 화합물에서 시작해서, 단계 2), 3) 및 4)를 n-2회 동안 반복하여, 화학식 (I)의 단편 또는 이의 염을 수득하는 단계, 식 중,
R1은, 각 경우에, 독립적으로 핵염기이고, 핵염기 중의 NH2는, 존재할 경우, 아민 보호기에 의해 보호되고;
R2는, 각 경우에, 독립적으로 H, 할로, 및 C1-6알콕시로 선택적으로 치환된 C1-6알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R4는, 각 경우에, 독립적으로 H이거나 또는 R2의 알콕시기를 가진 고리를 형성하고;
R15는 하이드록실 보호기이고;
R16은, 각 경우에, 독립적으로 C1-6알킬기, C2-6알켄일기, 페닐 또는 벤질기이되, 이들의 각각은 -CN, -NO2 또는 할로겐으로 선택적으로 치환되거나; 또는
R16은
Figure pct00060
또는
Figure pct00061
이고;
R17a 및 R17b는 독립적으로 C1-6알킬이고;
n은 2 내지 20의 정수이고;
X는, 각 경우에, 독립적으로 O 또는 S이고;
Y는 알킬 사슬을 함유하는 소수성 하이드록실 보호기이다.
제46 실시형태는 제45 실시형태에 기재된 방법을 개시하되, 여기서 화학식 (I)의 단편은 크로마토그래피(예컨대, 칼럼 크로마토그래피)에 의해 정제되지 않는다.
제47 실시형태는 제45 또는 제46 실시형태에 기재된 방법을 개시하되, 여기서 화학식 (I)의 단편은 선택적 석출 및/또는 추출에 의해 정제된다. 소정의 실시형태에서, 화학식 (I)의 단편은 선택적 석출에 의해 정제된다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 단편은 조질의 생성물을 함유하는 반응 혼합물에 CH3CN을 첨가하고 나서, 여과에 의해 단편 생성물을 단리시킴으로써 정제된다.
제48 실시형태는 제45, 제46 또는 제47 실시형태에 기재된 방법을 개시하되, 단계 1), 2), 3) 및 4) 중 어느 하나의 단계의 반응 생성물을 정제시키기 위하여 크로마토그래피(예컨대, 칼럼 크로마토그래피)가 사용되지 않는다.
제49 실시형태는 제45 내지 제48 실시형태 중 어느 하나에 기재된 방법을 개시하되, 단계 1), 2), 3) 및 4) 중 어느 하나의 단계의 반응 생성물은 (예컨대, 제21, 제35 또는 제42 실시형태에 기재된 바와 같은) 선택적 석출에 의해 정제된다.
제50 실시형태에서, 제45 내지 제49 실시형태 중 어느 하나에 기재된 방법에 대해서, Y는 하기 화학식으로 표시된다:
Figure pct00062
식 중, X0은 C1-10알킬이고, 여기서 1개 이상의 CH2기는 독립적으로 C(O), C(O)NH2, 사이클로알킬 또는 헤테로사이클릴기로 대체되고; 그리고 X1은 C1-25알킬 또는 C1-25알콕시이다. 특정 실시형태에서, Y는 하기 화학식으로 표시된다:
Figure pct00063
식 중, p는 1 내지 10의 정수이고; Het는 포화 헤테로사이클이고; 그리고 나머지 변수는 위에서 기재된 바와 같다. 더욱 구체적인 실시형태에서, Het는 피페라진이다.
제51 실시형태는 제45 내지 제49 실시형태 중 어느 하나에 기재된 방법을 개시하되, 여기서 Y는
Figure pct00064
이다.
소정의 실시형태에서, 제4 양상 또는 그 안에 기재된 임의의 실시형태(예컨대, 제45 내지 제51 실시형태)에 기재된 방법에 대해서, 단계 1) 및/또는 단계 4)의 탈보호 반응은 제1 양상 또는 그 안에 기재된 임의의 실시형태(예컨대, 제2 내지 제12 실시형태)에 기재된 바와 같이 수행된다.
소정의 실시형태에서, 제4 양상 또는 그 안에 기재된 임의의 실시형태(예컨대, 제45 내지 제51 실시형태)에 기재된 방법에 대해서, 단계 2)의 커플링 반응은 본 명세서에 기재된 활성제(예컨대, 제39 실시형태에 기재된 활성제)의 존재 하에 수행될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 활성제는 4,5-다이사이아노이미다졸(DCI) 또는 5-에틸티오-1H-테트라졸(ETT)이다.
소정의 실시형태에서, 제4 양상 또는 그 안에 기재된 임의의 실시형태(예컨대, 제45 내지 제51 실시형태)에 기재된 방법에 대해서, 단계 3)의 황화 반응은 황화제, 예컨대, 3-아미노-1,2,4-다이티아졸-5-티온(잔탄 하이드라이드 또는 ADTT), 3-(N,N-다이메틸아미노-메틸리덴)아미노)-3H-1,2,4-다이티아졸(DDTT), 페닐아세틸 다이설파이드(PADS), 3H-1,2-벤조다이티올-3-온 1,1-다이옥사이드(Beaucage 시약), 또는 페닐-3H-1,2,4-다이티아졸-3-온(POS)을 사용해서 수행된다. 구체적인 실시형태에서, 황화제는 DDTT이다. 구체적인 실시형태에서, 황화제는 잔탄 하이드라이드이다. 소정의 실시형태에서, 황화 반응은 본 명세서에 기재된 바와 같이 염기의 존재 하에 수행된다. 소정의 실시형태에서, 염기는 피리딘 또는 이미다졸이다. 소정의 실시형태에서, 단계 3)의 황화 반응은 DDTT 및 4,5-다이사이아노이미다졸(DCI)의 존재 하에 수행된다.
소정의 실시형태에서, 제4 양상 또는 그 안에 기재된 임의의 실시형태(예컨대, 제45 내지 제51 실시형태)에 기재된 방법에 대해서, 단계 3)의 산화 반응은 문헌에 공지된 표준 산화제를 이용해서 수행된다. 예시적인 산화제는, tert-부틸하이드로퍼옥사이드(t-BuOOH), (1S)-(+)-(10-캄포설포닐)옥사지리딘(CSO), I2, 및 아이오딘-피리딘-물 산화제 용액을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 구체적인 실시형태에서, 산화제는 t-BuOOH이다.
e. 5'-올리고뉴클레오타이드 단편의 합성
제5 양상에서, 본 개시내용은 위에서 기재된 3'-단편에 커플링될 수 있는 포스포아미다이트기를 갖는 올리고뉴클레오타이드 단편(5'-단편)을 제조하는 액상 방법을 기재한다. 놀랍게도 5'-단편을 제조하기 위한 본 개시내용의 방법은 크로마토그래피 정제 없이 고순도로 3 내지 20(예컨대, 3 내지 10, 3 내지 8, 3 내지 5 또는 4 내지 5)개의 뉴클레오타이드를 갖는 올리고뉴클레오타이드 단편을 합성하는데 사용될 수 있는 것이 발견되었다. 몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 3'-하이드록실 보호기의 선택적 탈보호를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 액상 방법은 (1) 5'-OH 탈보호 단계, (2) 커플링 단계, 및 (3) 산화 또는 황화 단계를 포함하되, 여기서 단계 (1), (2) 및 (3)은 목적하는 수의 뉴클레오타이드가 함께 연결되어 5'-올리고뉴클레오타이드 단편을 형성할 때까지 반복된다.
제52 실시형태는, 하기 단계들을 포함하는, 하기 화학식 (II)의 올리고뉴클레오타이드 단편 또는 이의 염을 제조하기 위한 액상 방법을 개시한다:
Figure pct00065
1') 화학식 (IIA')의 화합물:
Figure pct00066
또는 이의 염을 탈보호하여, 화학식 (IIA)의 화합물:
Figure pct00067
또는 이의 염을 형성하는 단계;
2') 화학식 (IIA)의 화합물 또는 이의 염을 화학식 (A2)의 화합물:
Figure pct00068
또는 이의 염과 반응시켜, 화학식 (IIB)의 화합물:
Figure pct00069
또는 이의 염을 형성하는 단계; 및
3') 화학식 (IIB)의 화합물 또는 이의 염을 황화제 또는 산화제로 황화 또는 산화시켜, 화학식 (IIC)의 화합물:
Figure pct00070
또는 이의 염을 형성하는 단계;
4') 화학식 (IIC)의 화합물 또는 이의 염을 탈보호하여, 화학식 (IID)의 화합물:
Figure pct00071
또는 이의 염을 형성하는 단계;
5') m이 3인 경우, 화학식 (IID)의 화합물 또는 이의 염에서 시작해서, 단계 2') 및 단계 3')을 반복하여, 화학식 (IIE)의 화합물 또는 이의 염을 형성하거나, 또는
m이 3 초과인 경우, 화학식 (IID)의 화합물 또는 이의 염에서 시작해서 단계 2'), 3') 및 4')을 m-3회 동안 반복하고 나서, 단계 2') 및 단계 3')를 반복하여, 화학식 (IIE)의 화합물:
Figure pct00072
또는 이의 염을 형성하는 단계;
6') 화학식 (IIE)의 화합물 또는 이의 염을 탈보호하여, 화학식 (IIF)의 화합물:
Figure pct00073
또는 이의 염을 형성하는 단계; 및
7') 화학식 (IIF)의 화합물 또는 이의 염을 포스포다이아미다이트 (R16O)P(NR17aR17b )2와 반응시켜, 화학식 (II)의 단편 또는 이의 염을 수득하는 단계:
식 중,
R1은, 각 경우에, 독립적으로 핵염기이고, 핵염기 중의 NH2는, 존재할 경우, 아민 보호기에 의해 보호되고;
R2는, 각 경우에, 독립적으로 H, 할로, 및 C1-6알콕시로 선택적으로 치환된 C1-6알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R4는, 각 경우에, 독립적으로 H이거나 또는 R2의 알콕시기를 가진 고리를 형성하고;
R15는 하이드록실 보호기이고;
R16은, 각 경우에, 독립적으로 C1-6알킬기, C2-6알켄일기, 페닐 또는 벤질기이되, 이들의 각각은 -CN, -NO2 또는 할로겐으로 선택적으로 치환되거나; 또는
R16은
Figure pct00074
또는
Figure pct00075
이고;
R17a 및 R17b는 독립적으로 C1-6알킬이고;
m은 2 내지 20의 정수이고;
X는, 각 경우에, 독립적으로 O 또는 S이고; 그리고
Z는 하이드록실 실릴 보호기이다.
제53 실시형태에서, 제52 실시형태에 기재된 방법에 대해서, 화학식 (II)의 단편은 크로마토그래피(예컨대, 칼럼 크로마토그래피)에 의해 정제되지 않는다.
제54 실시형태는 제52 또는 제53 실시형태에 기재된 방법을 개시하되, 여기서 화학식 (II)의 화합물은 본 명세서에 기재된 바와 같은(예컨대, 제21, 제35 또는 제42 실시형태에 기재된 바와 같은) 추출 및/또는 선택적 석출에 의해 정제된다.
제55 실시형태는 제52 내지 제54 실시형태에 기재된 방법을 개시하되, 여기서 단계 1'), 2'), 3'), 4'), 5'), 6') 및 7') 중 어느 하나의 단계의 반응 생성물을 정제시키기 위하여 크로마토그래피가 사용되지 않는다.
제56 실시형태는 제52 내지 제55 실시형태에 기재된 방법을 개시하되, 여기서 단계 1'), 2') 3'), 4'), 5'), 6') 및 7') 중 어느 하나의 단계의 반응 생성물은 본 명세서에 기재된 바와 같은(예컨대, 제21, 제35 또는 제42 실시형태에 기재된 바와 같은) 추출 또는 선택적 석출에 의해 정제된다.
몇몇 실시형태에서, 단계 1') 및 단계 4')의 탈보호 반응은 제1 양상 또는 그 안에 기재된 임의의 실시형태(예컨대, 제2 내지 제12 실시형태 중 어느 하나)에 기재된 바와 같이 수행된다.
몇몇 실시형태에서, 단계 2')의 커플링 반응은 제4 양상에 기재된 바와 같이 수행된다. 소정의 실시형태에서, 커플링 반응은 본 명세서에 기재된 활성제(예컨대, 제39실시형태에 기재된 활성제)의 존재 하에 수행된다. 소정의 실시형태에서, 활성제는 4,5-다이사이아노이미다졸(DCI) 또는 5-에틸티오-1H-테트라졸(ETT)이다.
몇몇 실시형태에서, 단계 3')의 황화 또는 산화 반응은 제4 양상에 기재된 바와 같이 수행된다.
몇몇 실시형태에서, 단계 6')의 탈보호 반응은 제2 양상 또는 그 안에 기재된 임의의 실시형태(예컨대, 제26 내지 제34 실시형태 중 어느 하나)에 기재된 바와 같이 수행된다.
몇몇 실시형태에서, 단계 7')의 포스피틸화 반응은 제3 양상 또는 그 안에 기재된 임의의 실시형태(예컨대, 제39 내지 제42 실시형태 중 어느 하나)에 기재된 바와 같이 수행된다.
II. 표적 올리고뉴클레오타이드의 합성
i) 3'-5' 연장:
제6 양상에서, 본 개시내용은 표적 올리고뉴클레오타이드의 액상 수렴형 합성을 기재하되, 여기서 표적 올리고뉴클레오타이드는 3'-말단에서 5'-말단 방향(3'-5' 방향)으로 조립된다. 본 개시내용의 수렴형 액상 방법은 대량으로 표적 올리고뉴클레오타이드를 합성하는데 성공적으로 사용되는 것이 입증되었다. 또한, 고순도 보호된 표적 올리고뉴클레오타이드가 크로마토그래피 정제 없이 본 개시내용의 방법에 의해 얻어질 수 있다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 수렴형 액상 방법은, 표적 올리고뉴클레오타이드를 합성하기 위하여 액체(용액) 상에서 올리고뉴클레오타이드 단편의 단계적 첨가를 수반한다. 예를 들어, 5-량체 및 4-량체 단편을 우선 커플링시켜 9-량체 단편을 합성하고, 이를 더욱 또 다른 5-량체 단편과 반응시켜 14-량체 올리고뉴클레오타이드를 합성한다. 14-량체 올리고뉴클레오타이드는 목적하는 길이의 표적 올리고뉴클레오타이드가 얻어질 때까지 또 다른 단편과 더욱 커플링될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 3'-소수성 하이드록실 보호기(3'-LHPG)(3'-말단 단편)를 갖는 5-량체 단편을 먼저 5-량체 단편과 커플링시켜 3'-LHPG기를 갖는 10-량체 단편을 형성하고, 이어서 4-량체 단편과 더욱 반응시켜서 14-량체 단편을 형성하고, 계속해서 또 다른 4-량체 단편과 커플링시켜 목적하는 18-량체 올리고뉴클레오타이드를 형성한다. 소정의 실시형태에서, n개의 뉴클레오타이드를 갖는 3'-말단 단편(예컨대, 5-량체 단편)은 3'-LHPG기를 갖는 단일의 뉴클레오타이드를 n-1개 뉴클레오타이드를 갖는 단편(예컨대, 4-량체 단편)과 커플링시킴으로써 합성된다.
제57 실시형태는 하기 단계들을 포함하는, 표적 올리고뉴클레오타이드를 제조하기 위한 수렴형 액상 방법을 개시한다:
a) 화학식 (I)의 올리고뉴클레오타이드 단편:
Figure pct00076
또는 이의 염을 용액 중에서 화학식 (II)의 올리고뉴클레오타이드 단편:
Figure pct00077
또는 이의 염과 커플링시켜, 화학식 (III)의 올리고뉴클레오타이드:
Figure pct00078
또는 이의 염을 형성하는 단계; 및
b) 화학식 (III)의 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염을 황화 또는 산화시켜, 화학식 (IV)의 올리고뉴클레오타이드:
Figure pct00079
또는 이의 염을 형성하는 단계, 식 중,
R1은, 각 경우에, 독립적으로 핵염기이고, 핵염기 중의 NH2는, 존재할 경우, 아민 보호기에 의해 보호되고;
R2는, 각 경우에, 독립적으로 H, 할로, 및 C1-6알콕시로 선택적으로 치환된 C1-6알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R4는, 각 경우에, 독립적으로 H이거나 또는 R2의 알콕시기를 가진 고리를 형성하고;
R15는 하이드록실 보호기이고;
R16은, 각 경우에, 독립적으로 C1-6알킬기, C2-6알켄일기, 페닐 또는 벤질기이되, 이들의 각각은 -CN, -NO2 또는 할로겐으로 선택적으로 치환되거나; 또는
R16은
Figure pct00080
또는
Figure pct00081
이고;
R17a 및 R17b는 독립적으로 C1-6알킬이고;
n은 2 내지 200의 정수이고;
m은 2 내지 20의 정수이고
X는, 각 경우에, 독립적으로 O 또는 S이고;
Y는 알킬 사슬을 함유하는 소수성 하이드록실 보호기이다.
또한 제57 실시형태에는, 하기 단계를 포함하는, 표적 올리고뉴클레오타이드를 제조하기 위한 수렴형 액상 방법이 포함된다:
a) 화학식 (I)의 올리고뉴클레오타이드 단편:
Figure pct00082
또는 이의 염을 용액 중에서 화학식 (IIa)의 올리고뉴클레오타이드의 단편:
Figure pct00083
또는 이의 염과 커플링시켜, 화학식 (IIIa)의 올리고뉴클레오타이드:
Figure pct00084
또는 이의 염을 형성하는 단계; 식 중,
R1은, 각 경우에, 독립적으로 핵염기이고, 핵염기 중의 NH2는, 존재할 경우, 아민 보호기에 의해 보호되고;
R2는, 각 경우에, 독립적으로 H, 할로, 및 C1-6알콕시로 선택적으로 치환된 C1-6알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R4는, 각 경우에, 독립적으로 H이거나 또는 R2의 알콕시기를 가진 고리를 형성하고;
R15는 하이드록실 보호기이고;
R16은, 각 경우에, 독립적으로 C1-6알킬기, C2-6알켄일기, 페닐 또는 벤질기이되, 이들의 각각은 -CN, -NO2 또는 할로겐으로 선택적으로 치환되거나; 또는
R16은
Figure pct00085
또는
Figure pct00086
이고;
n은 2 내지 200의 정수이고;
m은 2 내지 20의 정수이고
X는, 각 경우에, 독립적으로 O 또는 S이고;
Y는 알킬 사슬을 함유하는 소수성 하이드록실 보호기이다.
제58 실시형태는 제57 실시형태에 기재된 방법을 개시하되, 화학식 (I)의 단편은 화학식 (Ia1)의 뉴클레오타이드:
Figure pct00087
또는 이의 염을 용액 중에서 화학식 (Ia2)의 올리고뉴클레오타이드 단편:
Figure pct00088
또는 이의 염과 커플링시켜, 화학식 (I)의 올리고뉴클레오타이드 단편 또는 이의 염을 형성함으로써 합성될 수 있다.
소정의 실시형태에서, 제58 실시형태에 기재된 방법에 대해서, n은 3 내지 20의 정수이다. 특정 실시형태에서, n은 3 내지 6이다. 다른 구체적인 실시형태에서, n은 5이다.
소정의 실시형태에서, 제58 실시형태에 기재된 방법에 대해서, 단편 (I)은 크로마토그래피에 의해 정제되지 않는다. 다른 실시형태에서, 단편 (I)은 (예컨대, 제46 및 제47 실시형태에 기재된 바와 같은) 선택적 석출 및/또는 추출에 의해 정제된다.
제58 실시형태는 제57 또는 제58 실시형태에 기재된 방법을 개시하되, 해당 방법은 화학식 (IV)의 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염을 탈보호하여, 화학식 (V)의 올리고뉴클레오타이드:
Figure pct00089
또는 이의 염을 형성하는 단계 c)를 더 포함한다.
또한 제59 실시형태에서는 제57 또는 제58 실시형태에 기재된 바와 같은 방법이 제공되되, 해당 방법은 화학식 (IIIa)의 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 염을 탈보호하여, 화학식 (Va)의 올리고뉴클레오타이드:
Figure pct00090
또는 이의 염을 형성하는 단계 b)를 더 포함한다.
제60 실시형태는 제59 실시형태에 기재된 방법을 개시하되, 해당 방법은 하기 단계들을 더 포함한다:
d) 화학식 (V)의 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염을 화학식 (II')의 올리고뉴클레오타이드 단편:
Figure pct00091
또는 이의 염과 커플링시켜, 화학식 (VI)의 올리고뉴클레오타이드:
Figure pct00092
또는 이의 염을 형성하는 단계,
e) 화학식 (VI)의 올리고뉴클레오타이드를 황화 또는 산화시켜, 화학식 (VII)의 올리고뉴클레오타이드:
Figure pct00093
또는 이의 염을 형성하는 단계,
f) 화학식 (VII)의 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염을 탈보호하여, 화학식 (VIII)의 올리고뉴클레오타이드:
Figure pct00094
또는 이의 염을 형성하는 단계,
g) 단계 d), e) 및 f)를 r-1회 동안 반복하고 나서 단계 d) 및 e)를 반복하여, 화학식 (IX)의 올리고뉴클레오타이드:
Figure pct00095
또는 이의 염을 형성하는 단계,
식 중,
r은 1 내지 50의 정수이고;
pi는, 각 경우에, 독립적으로 2 내지 20의 정수이고,
i는 1 내지 r의 정수이고; 그리고
Figure pct00096
.
제61 실시형태는 제60 실시형태에 기재된 방법을 개시하되, 여기서 r는 2이고 그리고 화학식 (IX)의 올리고뉴클레오타이드는 하기 화학식 (X)로 표시된다:
Figure pct00097
식 중, p1 및 p2는 각각 독립적으로 2 내지 20의 정수이다. 소정의 실시형태에서, m, n, p1 및 p2는 각각 독립적으로 3 내지 10, 3 내지 6 또는 4 내지 6이다. 소정의 실시형태에서, m, n, p1 및 p2는 각각 독립적으로 4 또는 5이다. 소정의 실시형태에서, m과 n은 둘 다 5이고; 그리고 p1과 p2는 둘 다 4이다.
제62 실시형태는 제57 내지 제61 실시형태에 기재된 방법을 개시하되, 크로마토그래피(예컨대, 칼럼 크로마토그래피)는 단계 a), b), c), d), e), f) 및 g) 중 어느 하나의 단계의 반응 생성물을 정제하는데 사용되지 않는다.
제63 실시형태는 제57 내지 제62 실시형태에 기재된 방법을 개시하되, 단계 a), b), c), d), e), f) 및 g) 중 어느 하나의 단계의 반응 생성물은 본 명세서에 기재된 바와 같은(예컨대, 제21, 제35, 제42, 제46 및 제47 실시형태에 기재된 바와 같은) 추출 및/또는 선택적 석출에 의해 정제된다.
소정의 실시형태에서는, 제60 내지 제63 실시형태에 기재된 방법에서, 상기 방법은
h1) 올리고뉴클레오타이드(IX) 또는 (X)을 탈보호하여, 하기 화학식 (IXA) 또는 (XA)의 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염을 형성하는 단계를 더 포함한다:
Figure pct00098
; 또는
Figure pct00099
.
소정의 실시형태에서는, 제60 내지 제63 실시형태에 기재된 방법에서, 상기 방법은 하기 단계들을 더 포함한다:
h1) 올리고뉴클레오타이드(IX) 또는 (X) 또는 이의 염을 탈보호하여, 하기 화학식 (IXA) 또는 (XA)의 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염을 형성하는 단계:
Figure pct00100
; 또는
Figure pct00101
;
h2) 올리고뉴클레오타이드(IXA) 또는 (XA) 또는 이의 염을 탈보호하여, 하기 화학식 (IXB) 또는 (XB)의 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염을 형성하는 단계:
Figure pct00102
.
소정의 실시형태에서, 위에서 기재된 단계 h1)에 대해서, 화학식 (IXA) 또는 (XA)의 올리고뉴클레오타이드는 화학식 (IX)의 올리고뉴클레오타이드 또는 (X)를 NH4OH와 반응시킴으로써 얻어진다. 소정의 실시형태에서, NH4OH에 의한 처리는 또한 올리고뉴클레오타이드에서의 다른 보호기, 예컨대, 임의의 핵염기에서의 보호기(예컨대, 핵염기 상의 NH2 보호기)를 제거한다. 소정의 실시형태에서, NH4OH에 의한 처리는 화학식 (IXA) 또는 (XA)의 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염을 초래하며, 여기서 R1은, 각 경우에, 독립적으로 핵염기이고, 핵염기의 NH2는, 존재할 경우, 미보호된다.
제64 실시형태에서는, 제60 내지 제63 실시형태에 기재된 방법에서, R16이 -CH2CH2CN인 경우, 올리고뉴클레오타이드(IX) 또는 (X) 또는 이의 염을 탈보호하여, 하기 화학식 (IXAb) 또는 (XAb)의 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염을 형성한다:
Figure pct00103
또는
Figure pct00104
.
소정의 실시형태에서, 탈보호 반응은 올리고뉴클레오타이드(IX) 또는 (X) 또는 이의 염을 NH4OH와 반응시킴으로써 수행되어 화학식 (IXAb) 또는 (XAb)의 올리고뉴클레오타이드를 형성한다. 소정의 실시형태에서, NH4OH에 의한 처리는 또한 올리고뉴클레오타이드에서의 다른 보호기, 예컨대, 임의의 핵염기에서의 보호기(예컨대, 핵염기 상의 NH2 보호기)를 제거한다. 소정의 실시형태에서, NH4OH에 의한 처리는 화학식 (IXAb) 또는 (XAb)의 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염을 초래하며, 여기서 R1은, 각 경우에, 독립적으로 핵염기이고, 핵염기의 NH2는, 존재할 경우, 미보호된다.
소정의 실시형태에서, 제64 실시형태에 기재된 방법에서, 상기 방법은,
올리고뉴클레오타이드(IXAb) 또는 (XAb) 또는 이의 염을 탈보호하여, 하기 화학식 (IXBa) 또는 (XBa)의 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염을 형성하는 단계를 더 포함한다:
Figure pct00105
; 또는
Figure pct00106
.
소정의 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드(IXA) 또는 (XA)는 시트르산과 반응하여 화학식 (IXBa) 또는 (XBa)의 올리고뉴클레오타이드를 형성한다.
제65 실시형태에서는, 제60 내지 제63 실시형태에 기재된 방법에서, R16은 -CH2CH2CN이고, 상기 방법은,
h1) 올리고뉴클레오타이드(IX) 또는 (X)을 탈보호하여, 하기 화학식 (IXAa) 또는 (XAa)의 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염을 형성하는 단계를 더 포함한다:
Figure pct00107
.
소정의 실시형태에서는, 제65 실시형태의 방법에서, 탈보호 반응은 올리고뉴클레오타이드(IX) 또는 (X) 또는 이의 염을 염기와 반응시킴으로써 수행된다. 소정의 실시형태에서, 염기는 1,8-다이아자바이사이클로[5.4.0]운데크-7-엔, 알킬아민(예컨대, tert-부틸아민, sec-부틸아민, 다이아이소프로필에틸아민, 트라이메틸아민) 및 기타 적합한 유기 염기로부터 선택된다.
제66 실시형태는 제65 실시형태에 기재된 방법을 개시하되, 상기 방법은 올리고뉴클레오타이드(IXAa) 또는 (XAa) 또는 이의 염을 탈보호하여, 하기 화학식 (IXAb) 또는 (XAb)의 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염을 형성하는 단계를 더 포함한다:
Figure pct00108
또는
Figure pct00109
.
소정의 실시형태에서, 제66 실시형태에 기재된 방법에서, 올리고뉴클레오타이드(IXAa) 또는 (XAa) 또는 이의 염의 탈보호는 올리고뉴클레오타이드(IXAa) 또는 (XAa) 또는 이의 염을 NH4OH와 반응시킴으로써 수행된다. 소정의 실시형태에서, NH4OH에 의한 처리는 또한 올리고뉴클레오타이드에서의 다른 보호기, 예컨대, 임의의 핵염기에서의 보호기(예컨대, 핵염기 상의 NH2 보호기)를 제거한다. 소정의 실시형태에서, NH4OH에 의한 처리는 화학식 (IXAb) 또는 (XAb)의 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염을 초래하며, 여기서 R1은, 각 경우에, 독립적으로 핵염기이고, 핵염기의 NH2는, 존재할 경우, 미보호된다.
소정의 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드(IXAb) 또는 (XAb) 또는 이의 염은 탈보호 시약(예컨대, 탈-트라이틸화 시약)과 더욱 반응하여 화학식 (IXBa) 또는 (XBa)의 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염을 형성할 수 있다.
일 실시형태에서, 제6 양상 또는 본 명세서에 기재된 임의의 실시형태(예컨대, 제57 내지 제66 실시형태)에 기재된 방법에 대해서, Y는
Figure pct00110
이다.
소정의 실시형태에서, 단계 h1)로부터 얻어진 화학식 (IXA) 또는 (XA)의 올리고뉴클레오타이드 또는 화학식 (IXAb) 또는 (XAb)의 올리고뉴클레오타이드는 심층 여과(depth filtration)에 의해 정제된다. 일 실시형태에서, 단계 h1)의 반응 혼합물은 심층 여과를 겪기 전에 황산암모늄 용액으로 희석된다. 황산암모늄에 의한 희석은 올리고뉴클레오타이드가 필터에 들러붙는 것을 방지할 수 있다.
소정의 실시형태에서, 황산암모늄 용액에 대한 농도는 100mM 내지 5M, 500mM 내지 2M, 500mM 내지 1500mM, 또는 1000mM 내지 1200mM이다.
임의의 적합한 심층 필터는 심층 여과에 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "심층 필터"는 단지 매체의 표면 상에가 아니라 매체를 통해서 입자를 유지하기 위하여 다공성 여과 매체를 사용하는 필터를 지칭한다. 이들 필터는, 다른 유형의 필터에 비해서, 막히기 전에 대량의 입자를 유지할 수 있기 때문에 여과될 유체가 고부하의 입자를 함유할 경우 통상 사용된다. 놀랍게도 심층 여과는, 혼합물을 HIC 정제에 적용하기 전에 반응 혼합물로부터 부산물인 LHPG-OH(예컨대, Y-OH)를 효율적으로 제거할 수 있는 것을 발견하였다.
소정의 실시형태에서, 심층 필터는 필터 조제, 예컨대, 규조토, 셀룰로스, 폴리아크릴 섬유 및 실리카 및 활성탄을 포함한다.
소정의 실시형태에서, 단계 h1)로부터 얻어진 화학식 (IXA), (IXAb), (XA) 또는 (XAb)의 올리고뉴클레오타이드는 심층 여과에 이어서 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)에 의해 정제된다.
소정의 실시형태에서, 위에서 기재된 단계 h2)에 대해서, 화학식 (IXA), (IXAa), (IXAb), (XA), (XAa) 또는 (XAb)의 올리고뉴클레오타이드는 본 명세서에 기재된 탈트라이틸화 시약과 반응하여 화학식 (IXB), (IXBa), (XB) 또는 (XBa)의 올리고뉴클레오타이드를 형성한다. 일 실시형태에서, 탈트라이틸화 시약은 유기 산이다. 일 실시형태에서, 유기 산은 아세트산 또는 시트르산이다. 특정 실시형태에서, 탈트라이틸화 시약은 시트르산이다. 일 실시형태에서, 화학식 (IXA), (IXAa), (IXAb), (XA), (XAa) 또는 (XAb) 중의 R15는 4,4'-다이메톡시트라이틸기이다. 소정의 실시형태에서, 단계 h2)의 탈트라이틸화 반응은 수성 용액에서 수행된다.
소정의 실시형태에서, 단계 h2)로부터 얻어진 화학식 (IXB), (IXBa), (XB) 또는 (XBa)의 올리고뉴클레오타이드는 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제된다.
제67 실시형태는 제57 내지 제66 실시형태에 기재된 방법을 개시하되, 단편 (I)은 하기 단계들에 의해 얻어진다:
1) 화학식 (I'A)의 화합물:
Figure pct00111
또는 이의 염을 탈보호하여, 화학식 (IA)의 화합물:
Figure pct00112
또는 이의 염을 형성하는 단계;
2) 화학식 (IA)의 화합물 또는 이의 염을 화학식 (A1)의 화합물:
Figure pct00113
또는 이의 염과 반응시켜, 화학식 (IB)의 화합물:
Figure pct00114
또는 이의 염을 형성하는 단계; 및
3) 화학식 (IB)의 화합물 또는 이의 염을 황화제 또는 산화제로 황화 또는 산화시켜, 화학식 (IC)의 화합물:
Figure pct00115
또는 이의 염을 형성하는 단계;
4) 화학식 (IC)의 화합물 또는 이의 염을 탈보호하여, 화학식 (ID)의 화합물:
Figure pct00116
또는 이의 염을 형성하는 단계;
5) 화학식 (ID)의 화합물에서 시작해서, 단계 2), 3) 및 4)를 n-2회 동안 반복하여, 화학식 (I)의 단편 또는 이의 염을 수득하는 단계.
제68 실시형태는 제67 실시형태에 기재된 방법을 개시하되, 여기서 단계 1), 2), 3), 4) 및 5) 중 어느 하나의 단계의 반응 생성물을 정제시키기 위하여 크로마토그래피(예컨대, 칼럼 크로마토그래피)가 사용되지 않는다.
제69 실시형태는 제67 또는 제68 실시형태에 기재된 방법을 개시하되, 여기서 단계 1), 2), 3), 4) 및 5) 중 어느 하나의 단계의 반응 생성물은 본 명세서에 기재된 바와 같은(예컨대, 제21, 제35, 제42, 제46 또는 제47 실시형태에 기재된 바와 같은) 추출 및/또는 선택적 석출에 의해 정제된다.
제70 실시형태는 제57 내지 제69 실시형태에 기재된 방법을 개시하되, 여기서 Y는 하기 화학식으로 표시된다:
Figure pct00117
식 중, X0은 C1-10알킬이되, 1개 이상의 CH2기는 독립적으로 C(O), C(O)NH2, 사이클로알킬 또는 헤테로사이클릴기로 대체되고; 그리고 X1은 C1-25알킬 또는 C1-25알콕시이다. 특정 실시형태에서, Y는 하기 화학식으로 표시된다:
Figure pct00118
식 중, p는 1 내지 10의 정수이고; Het는 포화 헤테로사이클이고; 그리고 나머지 변수는 위에서 기재된 바와 같다. 더욱 구체적인 실시형태에서, Het는 피페라진이다.
제71 실시형태는 제57 내지 제69 실시형태에 기재된 방법을 개시하되, Y는
Figure pct00119
이다.
제72 실시형태는 제57 내지 제71 실시형태에 기재된 방법을 개시하되, 여기서 화학식 (II)의 단편은 하기 단계들에 의해 얻어진다:
1') 화학식 (IIA')의 화합물:
Figure pct00120
또는 이의 염을 탈보호하여, 화학식 (IIA)의 화합물:
Figure pct00121
또는 이의 염을 형성하는 단계;
2') 화학식 (IIA)의 화합물 또는 이의 염을 하기 화학식 (A2)의 화합물:
Figure pct00122
또는 이의 염과 반응시켜, 화학식 (IIB)의 화합물:
Figure pct00123
또는 이의 염을 형성하는 단계; 및
3') 화학식 (IIB)의 화합물 또는 이의 염을 황화제 또는 산화제로 황화 또는 산화시켜, 화학식 (IIC)의 화합물:
Figure pct00124
또는 이의 염을 형성하는 단계,
4') 화학식 (IIC)의 화합물 또는 이의 염을 탈보호하여, 화학식 (IID)의 화합물:
Figure pct00125
또는 이의 염을 형성하는 단계;
5') m이 3인 경우, 화학식 (IID)의 화합물 또는 이의 염에서 시작해서, 단계 2') 및 단계 3')을 반복하여, 화학식 (IIE)의 화합물 또는 이의 염을 형성하거나, 또는
m이 3 초과인 경우, 상기 화학식 (IID)의 화합물 또는 이의 염에서 시작해서 단계 2'), 3') 및 4')을 m-3회 동안 반복하고 나서, 단계 2') 및 단계 3')를 반복하여, 화학식 (IIE)의 화합물:
Figure pct00126
또는 이의 염을 형성하는 단계;
6') 화학식 (IIE)의 화합물 또는 이의 염을 탈보호하여, 화학식 (IIF)의 화합물:
Figure pct00127
또는 이의 염을 형성하는 단계; 및
7') 화학식 (IIF)의 화합물 또는 이의 염을 포스포다이아미다이트 (R16O)P(NR17aR17b)2와 반응시켜, 화학식 (II)의 단편 또는 이의 염을 수득하는 단계, 여기서 Z는 하이드록실 보호기이다.
제73 실시형태는 제72 실시형태에 기재된 방법을 개시하되, 화학식 (II)의 단편은 화학식 (I)의 단편과의 반응 전에 크로마토그래피에 의해 정제되지 않는다.
제74 실시형태는 제72 또는 제73 실시형태에 기재된 방법을 개시하되, 단계 1'), 2'), 3'), 4'), 5'), 6') 및 7') 중 어느 하나의 단계의 반응 생성물은 (예컨대, 21, 제35, 제42, 제46 또는 제47 실시형태에 기재된 바와 같은) 추출 및/또는 선택적 석출에 의해 정제된다.
제75 실시형태는 제59 내지 제74 실시형태에 기재된 방법을 개시하되, 화학식 (II')의 단편은 하기 단계들에 의해 제조된다:
1") 화학식 (II'A')의 화합물:
Figure pct00128
또는 이의 염을 탈보호하여, 화학식 (II'A)의 화합물:
Figure pct00129
또는 이의 염을 형성하는 단계,
2") 화학식 (II'A)의 화합물 또는 이의 염을 화학식 (A2)의 화합물:
Figure pct00130
또는 이의 염과 반응시켜, 화학식 (II'B)의 화합물:
Figure pct00131
또는 이의 염을 형성하는 단계; 및
3") 화학식 (II'B)의 화합물 또는 이의 염을 황화제 또는 산화제로 황화 또는 산화시켜, 화학식 (II'C)의 화합물:
Figure pct00132
또는 이의 염을 형성하는 단계,
4") 화학식 (II'C)의 화합물 또는 이의 염을 탈보호하여, 화학식 (II'D)의 화합물:
Figure pct00133
또는 이의 염을 형성하는 단계;
5") 화학식 (II'D)의 화합물 또는 이의 염에서 시작해서, 단계 1'), 2') 및 3')을 pi-2회 동안 반복하고 나서, 단계 1') 및 단계 2')을 반복하여, 화학식 (II'E)의 화합물:
Figure pct00134
또는 이의 염을 형성하는 단계;
6") 화학식 (II'E)의 화합물 또는 이의 염을 탈보호하여, 화학식 (II'F)의 화합물:
Figure pct00135
또는 이의 염을 형성하는 단계;
7") 화학식 (II'F)의 화합물 또는 이의 염을 포스포다이아미다이트 (R16O)P(NR17aR17b)2와 반응시켜, 화학식 (II')의 단편 또는 이의 염을 수득하는 단계, 여기서 Z는 하이드록실 보호기이다.
제76 실시형태는 제75 실시형태에 기재된 방법을 개시하되, 화학식 (II')의 단편은 화학식 (V)의 올리고뉴클레오타이드와의 반응 전에 크로마토그래피(칼럼 크로마토그래피)에 의해 정제되지 않는다.
제77 실시형태는 제75 또는 제76 실시형태에 기재된 방법을 개시하되, 단계 1"), 2"), 3"), 4"), 5"), 6") 및 7") 중 어느 하나의 반응 생성물은 본 명세서에 기재된 바와 같이(예컨대, 제21, 제35, 제42, 제46 또는 제47 실시형태에 기재된 바와 같이) 추출 및/또는 선택적 석출에 의해 정제된다.
제78 실시형태는 제57 내지 제77 실시형태 중 어느 하나의 방법을 개시하되, 여기서 n은 3, 4, 5 또는 6이다.
제79 실시형태는 제57 내지 제78 실시형태 중 어느 하나의 방법을 개시하되, 여기서 m은 3, 4, 5 또는 6이다.
제80 실시형태는 제59 내지 제79 실시형태 중 어느 하나의 방법을 개시하되, 여기서 pi는, 각 경우에, 독립적으로 3, 4, 5 또는 6이다.
제81 실시형태는 제60 내지 제79 실시형태 중 어느 하나의 방법을 개시하되, 여기서 p1 및 p2는 각각 독립적으로 3, 4, 5 또는 6이다.
제82 실시형태는 제60 내지 제81 실시형태 중 어느 하나의 방법을 개시하되, 여기서 r은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다.
몇몇 실시형태에서, 단계 c), f), 1), 4), 1'), 4'), 1") 및 4")의 탈보호 반응 또는 탈-트라이틸화 반응은 제1 양상 또는 그 안에 기재된 임의의 실시형태(예컨대, 제2 내지 제12 실시형태)에 기재된 바와 같이 수행된다.
몇몇 실시형태에서, 단계 a), d), 2), 2') 및 2")의 커플링 반응은 3'-OH 보호된 뉴클레오타이드 단편 및 5'-OH 보호된 포스포아미다이트 또는 포스포네이트 단편을 함유하는 유기 용액에 활성제를 첨가함으로써 수행될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 단계 b), e), 3), 3') 및 3")의 황화 반응은 황화제(예컨대, 3-아미노-1,2,4-다이티아졸-5-티온(XH 또는 ADTT), 3-(N,N-다이메틸아미노-메틸리덴)아미노)-3H-1,2,4-다이티아졸(DDTT), 페닐아세틸 다이설파이드(PADS), 3H-1,2-벤조다이티올-3-온 1,1-다이옥사이드(Beaucage 시약), 또는 페닐-3H-1,2,4-다이티아졸-3-온(POS)을 사용함으로써 수행될 수 있다. 구체적인 실시형태에서, 황화제는 DDTT이다. 소정의 실시형태에서, 염기는 피리딘 또는 이미다졸이다.
소정의 실시형태에서, 단계 b), e), 3), 3') 및 3")의 산화 반응은 문헌에 공지된 표준 산화제를 사용함으로써 수행될 수 있다. 예시적인 산화제는 tert-부틸하이드로퍼옥사이드(t-BuOOH), (1S)-(+)-(10-캄포설포닐)옥사지리딘(CSO), I2, 및 아이오딘-피리딘-물 산화제 용액을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 구체적인 실시형태에서, 산화제는 t-BuOOH이다.
몇몇 실시형태에서, 단계 6') 또는 6")의 탈보호 반응은 제2 양상 또는 그 안에 기재된 임의의 실시형태(예컨대, 제23 내지 제31 실시형태)에 기재된 바와 같다.
몇몇 실시형태에서, 단계 7') 또는 7")의 포스피틸화 반응은 제3 양상 또는 그 안에 기재된 임의의 실시형태(예컨대, 제35 내지 제38 실시형태)에 기재된 바와 같다.
ii) 5'-3' 연장:
제7 양상에서, 본 개시내용은 표적 올리고뉴클레오타이드의 액상 수렴형 합성을 기재하되, 여기서 표적 올리고뉴클레오타이드는 5'-말단에서 3'-말단으로의 방향(5'-3' 방향)으로 조립된다. 5'-3' 방향에서의 본 개시내용의 수렴형 액상 방법이 표적 올리고뉴클레오타이드를 합성하는데 성공적으로 사용되는 것이 입증되었다. 또한, 고순도 보호된 표적 올리고뉴클레오타이드는 크로마토그래피 정제 없이 본 개시내용의 방법에 의해 얻어질 수 있다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 수렴형 액상 방법은 표적 올리고뉴클레오타이드를 합성하기 위하여 액체(용액) 상에서 올리고뉴클레오타이드 단편의 단계적 첨가를 수반한다. 예를 들어, 5'-소수성 하이드록실 보호기(5'-LHPG)를 갖는 5-량체 단편(5'-말단 단편)을 우선 5-량체 단편과 커플링시켜 5'-LHPG기를 갖는 10-량체 단편를 형성하고, 이를 더욱 또 다른 5-량체 단편과 반응시켜 15-량체 올리고뉴클레오타이드를 형성한다. 소정의 실시형태에서, n개의 뉴클레오타이드를 갖는 5'-말단 단편(예컨대, 5-량체 단편)은 5'-LHPG기를 갖는 단일의 뉴클레오타이드를 n-1개의 뉴클레오타이드를 갖는 단편(예컨대, 4-량체 단편)과 커플링시킴으로써 합성된다.
제83 실시형태는, 하기 단계들을 포함하는, 표적 올리고뉴클레오타이드를 제조하기 위한 수렴형 액상 방법을 개시한다:
a) 화학식 (II2)의 올리고뉴클레오타이드 단편:
Figure pct00136
또는 이의 염을 용액 중에서 화학식 (I2)의 올리고뉴클레오타이드 단편:
Figure pct00137
또는 이의 염과 커플링시켜, 화학식 (III2)의 올리고뉴클레오타이드:
Figure pct00138
또는 이의 염을 형성하는 단계; 및
b) 화학식 (III2)의 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염을 황화 또는 산화시켜, 화학식 (IV2)의 올리고뉴클레오타이드:
Figure pct00139
또는 이의 염을 형성하는 단계, 식 중,
R1은, 각 경우에, 독립적으로 핵염기이고, 핵염기 중의 NH2는, 존재할 경우, 아민 보호기에 의해 보호되고;
R2는, 각 경우에, 독립적으로 H, 할로, 및 C1-6알콕시로 선택적으로 치환된 C1-6알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R4는, 각 경우에, 독립적으로 H이거나 또는 R2의 알콕시기를 가진 고리를 형성하고;
R16은, 각 경우에, 독립적으로 C1-6알킬기, C2-6알켄일기, 페닐 또는 벤질기이되, 이들의 각각은 -CN, -NO2 또는 할로겐으로 선택적으로 치환되거나; 또는
R16은
Figure pct00140
또는
Figure pct00141
이고;
R17a 및 R17b는 독립적으로 C1-6알킬이고;
n1은 2 내지 20의 정수이고;
m1은 2 내지 200의 정수이고;
X는, 각 경우에, 독립적으로 O 또는 S이고;
Y는 알킬 사슬을 함유하는 소수성 하이드록실 보호기이고;
Z는 실릴 하이드록실 보호기이다.
제84 실시형태는 제83 실시형태에 기재된 방법을 개시하되, 여기서 단편 (II2)는 하기 단계들에 의해 제조된다:
ia) 화학식 (II2a1)의 뉴클레오타이드:
Figure pct00142
또는 이의 염을 용액 중에서 화학식 (II2a2)의 올리고뉴클레오타이드 단편:
Figure pct00143
또는 이의 염과 커플링시켜, 화학식 (II2a3)의 올리고뉴클레오타이드:
Figure pct00144
또는 이의 염을 형성하는 단계;
iia) 화학식 (II2a3)의 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염을 황화 또는 산화시켜, 화학식 (II2a4)의 올리고뉴클레오타이드:
Figure pct00145
또는 이의 염을 형성하는 단계;
iia) 화학식 (II2a4) 또는 이의 염을 탈보호하여, 화학식 (II2)의 올리고뉴클레오타이드를 형성하는 단계.
제85 실시형태는 제84 실시형태에 기재된 방법을 개시하되, 여기서 단편 (II2a2)는 화학식 (II2a5)의 올리고뉴클레오타이드:
Figure pct00146
또는 이의 염을 포스포다이아미다이트 (R16O)P(NR17aR17b)2와 반응시켜, (II2a2)의 화합물을 형성함으로써 얻어진다.
제86 실시형태는 제85 실시형태에 기재된 방법을 개시하되, 여기서 화학식 (II2a3)의 올리고뉴클레오타이드는 하기 단계들에 의해 얻어진다:
iA) 화학식 (II2A')의 화합물:
Figure pct00147
또는 이의 염을 탈보호하여, 화학식 (II2A)의 화합물:
Figure pct00148
또는 이의 염을 형성하는 단계;
iiA) 화학식 (II2A)의 화합물 또는 이의 염을 화학식 (A12)의 화합물:
Figure pct00149
또는 이의 염과 반응시켜, 화학식 (II2B)의 화합물:
Figure pct00150
또는 이의 염을 형성하는 단계; 및
iiiA) 화학식 (II2B)의 화합물 또는 이의 염을 황화제 또는 산화제로 황화 또는 산화시켜, 화학식 (II2C)의 화합물:
Figure pct00151
또는 이의 염을 형성하는 단계;
ivA) 화학식 (II2C)의 화합물 또는 이의 염을 탈보호하여, 화학식 (IID)의 화합물:
Figure pct00152
또는 이의 염을 형성하는 단계;
vA) m1이 3 초과인 경우, 화학식 (IID)의 화합물에서 시작해서, 단계 ii), iii) 및 iv)를 m1-3회 동안 반복하여, 화학식 (II2a3)의 화합물 또는 이의 염을 형성하는 단계.
소정의 실시형태에서는, 제84 내지 제86 실시형태 중 어느 하나에 개시된 방법에서, m1은 3 내지 20의 정수이다. 특정 실시형태에서, m1은 3 내지 6이다. 다른 구체적인 실시형태에서, m1은 4이다. 또 다른 구체적인 실시형태에서, m1은 5이다.
제87 실시형태는 제7 양상 또는 제83 내지 제86 실시형태에 기재된 방법 중 어느 하나를 개시하되, 여기서 단편 (I2)는 화학식 (I2a1)의 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염을 포스포다이아미다이트 (R16O)P(NR17aR17b)2와 반응시켜, 하기 화학식 (I2)의 단편을 형성하는 단계에 의해 얻어진다:
Figure pct00153
.
제88 실시형태는 제87 실시형태에 기재된 방법을 개시하되, 화학식 (I2a1)의 올리고뉴클레오타이드는 하기 단계들에 의해 얻어진다:
i') 화학식 (I2A')의 화합물:
Figure pct00154
또는 이의 염을 탈보호하여, 화학식 (I2A)의 화합물:
Figure pct00155
또는 이의 염을 형성하는 단계;
ii') 화학식 (I2A)의 화합물 또는 이의 염을 화학식 (A11)의 화합물:
Figure pct00156
또는 이의 염과 반응시켜, 화학식 (I2B)의 화합물:
Figure pct00157
또는 이의 염을 형성하는 단계; 및
iii') 화학식 (I2B)의 화합물 또는 이의 염을 황화제 또는 산화제로 황화 또는 산화시켜, 화학식 (I2C)의 화합물:
Figure pct00158
또는 이의 염을 형성하는 단계,
iv') 화학식 (I2C)의 화합물 또는 이의 염을 탈보호하여, 화학식 (I2D)의 화합물:
Figure pct00159
또는 이의 염을 형성하는 단계;
v') n1이 2 초과인 경우, 화학식 (I2D)의 화합물에서 시작해서, 단계 ii'), iii') 및 iv')을 n1-2회 동안 반복하여, 화학식 (I2a1)의 화합물 또는 이의 염을 형성하는 단계.
제89 실시형태는 제83 내지 제88 실시형태에 기재된 방법을 개시하되, 해당 방법은 화학식 (IV2)의 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염을 탈보호하여, 화학식 (V2)의 올리고뉴클레오타이드:
Figure pct00160
또는 이의 염을 형성하는 단계 c)를 더 포함한다.
제90 실시형태는 제89 실시형태에 기재된 방법을 개시하되, 해당 방법은 하기 단계들을 더 포함한다:
d) 화학식 (V2)의 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염을 화학식 (II2')의 올리고뉴클레오타이드 단편:
Figure pct00161
또는 이의 염과 커플링시켜, 화학식 (VI2)의 올리고뉴클레오타이드:
Figure pct00162
또는 이의 염을 형성하는 단계,
e) 화학식 (VI2)의 올리고뉴클레오타이드를 황화 또는 산화시켜, 화학식 (VII2)의 올리고뉴클레오타이드:
Figure pct00163
또는 이의 염을 형성하는 단계,
f) 화학식 (VII2)의 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염을 탈보호하여, 화학식 (VIII2)의 올리고뉴클레오타이드:
Figure pct00164
또는 이의 염을 형성하는 단계,
g) 단계 d), e) 및 f)를 r1-1회 동안 반복하고 나서 단계 d) 및 e)를 반복하여, 화학식 (IX2)의 올리고뉴클레오타이드:
Figure pct00165
또는 이의 염을 형성하는 단계
식 중,
r1은 1 내지 50의 정수이고;
si는, 각 경우에, 독립적으로 2 내지 20의 정수이고,
i는 1 내지 r1의 정수이고; 그리고
Figure pct00166
.
제91 실시형태는 제90 실시형태에 기재된 방법을 개시하되, 여기서 r1은 2이고 화학식 (IX2)의 올리고뉴클레오타이드는 하기 화학식 (X2) 또는 이의 염으로 표시된다:
Figure pct00167
식 중, s1 및 s2는 각각 독립적으로 2 내지 20의 정수이다.
제92 실시형태는 제90 실시형태에 기재된 방법을 개시하되, 여기서 r1은 1이고 화학식 (IX2)의 올리고뉴클레오타이드는 화학식 (X2') 또는 이의 염으로 표시된다:
Figure pct00168
식 중, s1은 2 내지 20의 정수이다.
소정의 실시형태에서, 제91 또는 제92 실시형태의 공정에 대해서, s1, s2, m1 및 n1은 각각 독립적으로 3 내지 10, 3 내지6 또는 4 내지 6의 정수이다. 소정의 실시형태에서, s1, s2, m1 및 n1은 각각 독립적으로 4 또는 5이다.
제93 실시형태는 제90, 제91 또는 제92 실시형태에 기재된 방법을 개시하되, 여기서 화학식 (II2')의 올리고뉴클레오타이드 단편은 하기 화학식 (II2a1')의 올리고뉴클레오타이드:
Figure pct00169
또는 이의 염을 포스포다이아미다이트 (R16O)P(NR17aR17b)2와 반응시켜, 화학식 (II2')의 단편 또는 이의 염을 형성시킴으로써 얻어진다.
제94 실시형태는 제93 실시형태에 기재된 방법을 개시하되, 여기서 화학식 (II2a1')의 올리고뉴클레오타이드는 하기 단계들에 의해 얻어진다:
i") 화학식 (II'2A')의 화합물:
Figure pct00170
또는 이의 염을 탈보호하여, 화학식 (II'2A)의 화합물:
Figure pct00171
또는 이의 염을 형성하는 단계;
ii") 화학식 (II'2A)의 화합물 또는 이의 염을 화학식 (A12')의 화합물:
Figure pct00172
또는 이의 염과 반응시켜, 화학식 (II'2B)의 화합물:
Figure pct00173
또는 이의 염을 형성하는 단계; 및
iii") 화학식 (II'2B)의 화합물 또는 이의 염을 황화제 또는 산화제와 황화 또는 산화시켜, 화학식 (II'2C)의 화합물:
Figure pct00174
또는 이의 염을 형성하는 단계,
iv") 화학식 (II'2C)의 화합물 또는 이의 염을 탈보호하여, 화학식 (II'2D)의 화합물:
Figure pct00175
또는 이의 염을 형성하는 단계;
v") si가 2 초과인 경우, (II'2D)의 화합물에서 시작해서, 단계 ii"), iii") 및 iv")을 si-2회 동안 반복하여, 화학식 (II2a1')의 화합물 또는 이의 염을 형성하는 단계.
제95 실시형태는 제83 내지 제94 실시형태에 기재된 방법을 개시하되, 여기서 단계 a), b), c), d), e), f) 및 g) 중 어느 하나의 단계의 반응 생성물을 정제시키기 위하여 크로마토그래피가 사용되지 않는다.
제96 실시형태는 제83 내지 제94 실시형태에 기재된 방법을 개시하되, 여기서 단계 a), b), c), d), e), f) 및 g) 중 어느 하나의 단계의 반응 생성물은 본 명세서에 기재된 바와 같은(예컨대, 제21, 제35, 제42, 제46 또는 제47 실시형태에 기재된 바와 같은) 추출 및/또는 선택적 석출에 의해 정제된다.
제97 실시형태는 제90 내지 제96 실시형태에 기재된 방법을 개시하되, 상기 방법은 화학식 (IX2), (X2) 또는 (X2')의 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염을 탈보호하여, 화학식 (IX2A), (X2A) 또는 (X2A')의 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염을 형성하는 단계를 더 포함한다:
Figure pct00176
,
Figure pct00177
또는
Figure pct00178
.
소정의 실시형태에서, 화학식 (IX2), (X2) 또는 (X2') 내의 Z기는 TBDPS, ToBDPS 및 TBDAS로부터 선택된다. 소정의 실시형태에서, 탈보호 반응은 제2 양상 또는 그 안에 기재된 임의의 실시형태에(예컨대, 제26 내지 제32 실시형태에) 기재된 바와 같이 수행된다.
제98 실시형태는 제83 내지 제97 실시형태 중 어느 하나에 기재된 방법을 개시하되, R16이 -CH2CH2CN인 경우, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
h1) 올리고뉴클레오타이드(IX2A), (X2A) 또는 (X2A') 또는 이의 염을 탈보호하여, 화학식 (IX2Aa), (X2Aa) 또는 (X2Aa')의 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염을 형성하는 단계:
Figure pct00179
Figure pct00180
.
제99 실시형태는 제98 실시형태에 기재된 방법을 개시하되, 탈보호 반응은 올리고뉴클레오타이드(IX2A), (X2A) 또는 (X2A') 또는 이의 염을 염기와 반응시킴으로써 수행된다. 몇몇 실시형태에서, 염기는 1,8-다이아자바이사이클로[5.4.0]운데크-7-엔, 알킬아민(예컨대, tert-부틸아민, sec-부틸아민, 다이아이소프로필에틸아민 및 트라이에틸아민) 및 기타 적합한 유기 염기로부터 선택된다.
제100 실시형태는 제98 또는 제99 실시형태에 기재된 방법을 개시하되, 상기 방법은 올리고뉴클레오타이드(IX2Aa), (X2Aa) 또는 (X2Aa') 또는 이의 염을 탈보호하여, 하기 화학식 (IX2B), (X2B) 또는 (X2B')의 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염을 형성하는 단계를 더 포함한다:
Figure pct00181
Figure pct00182
또는
Figure pct00183
.
제101 실시형태는 제100 실시형태에 기재된 방법을 개시하되, 여기서 탈보호는 올리고뉴클레오타이드(IX2Aa) 또는 (X2Aa) 또는 이의 염을 NH4OH와 반응시킴으로써 수행된다. 소정의 실시형태에서, NH4OH에 의한 처리는 또한 올리고뉴클레오타이드에서의 다른 보호기, 예컨대, 임의의 핵염기에서의 보호기(예컨대, 핵염기 상의 NH2 보호기)를 제거한다. 소정의 실시형태에서, NH4OH에 의한 처리는 화학식 (IX2B), (X2B) 또는 (X2B') 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염을 초래하며, 여기서 R1은, 각 경우에, 독립적으로 핵염기이고, 핵염기의 NH2는, 존재할 경우, 미보호된다.
제102 실시형태는 제83 내지 제101 실시형태 중 어느 하나에 기재된 방법을 개시하되, 여기서 n1은 3, 4, 5 또는 6이다.
제103 실시형태는 제90 내지 제101 실시형태 중 어느 하나에 기재된 방법을 개시하되, 여기서 si는, 각 경우에, 독립적으로 3, 4, 5 또는 6이다.
제104 실시형태는 제91 내지 제101 실시형태 중 어느 하나에 기재된 방법을 개시하되, 여기서 s1 및 s2는 각각 독립적으로 3, 4, 5 또는 6이다.
제105 실시형태는 제83 내지 제101 실시형태 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 방법을 개시하되, 여기서 r1은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다.
제106 실시형태는 제1 내지 제105 실시형태 중 어느 하나에 기재된 방법을 개시하되, 여기서 화합물 또는 올리고뉴클레오타이드 중의 P=X기의 전부는 P=S이다.
제107 실시형태는 제1 내지 제105 실시형태 중 어느 하나에 기재된 방법을 개시하되, 여기서 화합물 또는 올리고뉴클레오타이드 중의 P=X기의 전부는 P=O이다.
제108 실시형태는 제1 내지 제105 실시형태 중 어느 하나에 기재된 방법을 개시하되, 여기서 화합물 또는 올리고뉴클레오타이드 중의 P=X기의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 초과는 P=S이다.
제109 실시형태는 제1 내지 제105 실시형태 중 어느 하나에 기재된 방법을 개시하되, 여기서 화합물 또는 올리고뉴클레오타이드 중의 P=X기의 10 내지 90%, 20 내지 80%, 30 내지 70% 또는 40 내지 60%는 P=S이다.
제110 실시형태는 제1 내지 제105 실시형태 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 방법을 개시하되, 여기서 화합물 또는 올리고뉴클레오타이드 중의 P=X기의 10 내지 90%, 20 내지 80%, 30 내지 70% 또는 40 내지 60%는 P=O이다.
몇몇 실시형태에서, 제84 내지 제90 실시형태 중 어느 하나의, 그리고 제96 실시형태의 단계 iia), 단계 c) 및 f)의 탈보호 반응은 제1 양상 또는 그 안에 기재된 임의의 실시형태(예컨대, 제26 내지 제34 실시형태)에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 제7 양상의 iA), ivA), i'), iv'), i") 및 iv")의 탈보호 단계는 제1 양상 또는 그 안에 기재된 임의의 실시형태(예컨대, 제2 내지 제12 실시형태)에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 단계 a), ia), ii), iiA), ii'), d) 및 ii")의 커플링 반응은 3'-OH 보호된 뉴클레오타이드 단편 및 5'-OH 보호된 포스포아미다이트 또는 포스포네이트 단편을 함유하는 유기 용액에 활성제를 첨가함으로써 수행될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 단계 b), iii), iiiA), iii'), e) 및 iii")의 황화 반응은 황화제(예컨대, 3-아미노-1,2,4-다이티아졸-5-티온(XH 또는 ADTT), 3-(N,N-다이메틸아미노-메틸리덴)아미노)-3H-1,2,4-다이티아졸(DDTT), 페닐아세틸 다이설파이드(PADS), 3H-1,2-벤조다이티올-3-온 1,1-다이옥사이드(Beaucage 시약), 또는 페닐-3H-1,2,4-다이티아졸-3-온(POS)을 사용함ㅇ로써 수행될 수 있다. 구체적인 실시형태에서, 황화제는 DDTT이다. 소정의 실시형태에서, 염기는 피리딘 또는 이미다졸이다.
소정의 실시형태에서, 단계 b), iii), iiiA), iii'), e) 및 iii")의 산화 반응은 문헌에 공지된 표준 산화제를 사용함으로써 수행될 수 있다. 예시적인 산화제는 tert-부틸하이드로퍼옥사이드(t-BuOOH), (1S)-(+)-(10-캄포설포닐)옥사지리딘(CSO), I2, 및 아이오딘-피리딘-물 산화제 용액을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 구체적인 실시형태에서, 산화제는 t-BuOOH이다.
몇몇 실시형태에서, 제85, 제87 및 제92 실시형태의 포스피틸화 반응은 제3 양상 또는 그 안에 기재된 임의의 실시형태(예컨대, 제39 내지 제42 실시형태)에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
일 실시형태에서, Y는
Figure pct00184
이다.
소정의 실시형태에서, 탈보호 반응으로부터 얻어진 화학식 (IX2B), (X2B) 또는 (X2B')의 올리고뉴클레오타이드는 심층 여과에 의해 정제된다. 일 실시형태에서, 탈보호 반응의 반응 혼합물은 심층 여과를 겪기 전에 황산암모늄 용액으로 희석된다. 황산암모늄에 의한 희석은 올리고뉴클레오타이드가 필터에 들러붙는 것을 방지할 수 있다.
소정의 실시형태에서, 황산암모늄 용액에 대한 농도는 100mM 내지 5M, 500mM 내지 2M, 500mM 내지 1500mM 또는 1000mM 내지 1200mM이다.
임의의 적합한 심층 필터, 예컨대, 본 명세서에 기재된 적합한 심층 필터가 심층 여과에 사용될 수 있다.
소정의 실시형태에서, 화학식 (IX2A), (IX2Aa), (IX2Aa'), (X2A), (X2A'), (X2Aa), (X2Aa'), (X2B) 또는 (X2B')의 올리고뉴클레오타이드는 심층 여과에 이어서 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)에 의해 정제될 수 있다.
소정의 실시형태에서, 제1 내지 제8 양상 또는 본 명세서에 기재된 임의의 실시형태(예컨대, 제1 내지 제135 실시형태)에 기재된 반응 중 어느 하나는 적합한 용매 또는 적합한 용매의 혼합물에 수행될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 반응은 적합한 유기 용매 또는 적합한 유기 용매의 혼합물에서 수행될 수 있다. 본 개시내용에서 사용될 수 있는 예시적인 유기 용매는, 다이클로로메탄(DCM), 아세토나이트릴(ACN), 테트라하이드로퓨란(THF), 아세톤, 2-메틸테트라하이드로퓨란, 메틸 tert-부틸 에터, 에틸 아세테이트 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
소정의 실시형태에서, 제1 내지 제8 양상 또는 본 명세서에 기재된 임의의 실시형태(예컨대, 제1 내지 제135 실시형태)에 기재된 반응 중 임의의 것은 적합한 온도에서 수행될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 반응은 실온에서 수행된다. 소정의 실시형태에서, 반응은 20℃ 내지 30℃의 온도에서 수행된다. 소정의 실시형태에서, 반응은 -10℃ 내지 10℃, -5℃ 내지 5℃의 온도에서 수행된다. 소정의 실시형태에서, 반응은 25±2℃에서 수행된다. 소정의 실시형태에서, 반응은 0±2℃에서 수행된다.
제111 실시형태는 본 명세서에 기재된 실시형태(예컨대, 제1 내지 제135 실시형태) 중 어느 하나의 방법을 개시하되, 여기서, 핵염기는 사이토신, 구아닌, 아데닌, 티민, 우라실, 하이포잔틴, 잔틴, 7-메틸구아닌, 5,6-다이하이드로우라실, 5-메틸사이토신 및 5-하이드록시메틸사이토신으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 핵염기 중의 NH2기는, 존재할 경우, PhCO-, CH3CO-, iPrCO-, Me2N-CH= 또는 Me2N-CMe=에 의해 보호된다.
제112 실시형태는 본 명세서에 기재된 실시형태(예컨대, 제1 내지 제135 실시형태) 중 어느 하나의 방법을 개시하되, 여기서 R1은 사이토신, 구아닌, 아데닌, 티민, 우라실 및 5-메틸사이토신으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 핵염기 중의 NH2기는, 존재할 경우, PhCO-, CH3CO-, iPrCO-, Me2N-CH= 또는 Me2N-CMe=에 의해 보호된다.
제113 실시형태는 본 명세서에 기재된 실시형태(예컨대, 제1 내지 제135 실시형태) 중 어느 하나의 방법을 개시하되, 여기서,
각각의 R2는 독립적으로 H, F, 및 C1-4알콕시로 선택적으로 치환된 C1-4알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 R4는 독립적으로 H이거나 또는 R2의 알콕시기를 갖는 고리를 형성하되, 여기서 고리는 1 내지 3개의 C1-4 알킬기로 선택적으로 치환된 5 또는 6-원 고리이고;
R16은 -CH2CH2CN이고; 그리고
R17a및 R17b는 독립적으로 C1-4알킬이다.
특정 실시형태에서, 방법은 제113 실시형태에 기재된 방법이고, 여기서
각각의 R2는 독립적으로 H 또는 -OCH2CH2OMe이고;
각각의 R4는 H이고;
R16은 -CH2CH2CN이고; 그리고
R17a 및 R17b는 둘 다 -CH(CH3)2이다.
제114 실시형태는 제51 내지 제135 실시형태 중 어느 하나에 기재된 방법을 개시하되, 여기서 표적 올리고뉴클레오타이드는 16 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하는 안티-센스 올리고뉴클레오타이드이다.
제115 실시형태는 제114 실시형태에 기재된 방법을 개시하되, 여기서 안티-센스 올리고뉴클레오타이드는 변형된 RNA만을 포함한다.
제116 실시형태는 제114 실시형태에 기재된 방법을 개시하되, 여기서 안티-센스 올리고뉴클레오타이드 DNA 및 변형된 RNA를 포함한다.
제117 실시형태는 제114 실시형태에 기재된 방법을 개시하되, 여기서 안티-센스 올리고뉴클레오타이드는 갭머이다.
제118 실시형태는 제114 실시형태에 기재된 방법을 개시하되, 여기서 안티-센스 올리고뉴클레오타이드는 DNA만을 포함한다.
소정의 실시형태에서, (R15로 표시되는) 5'-DMT기를 갖는 본 명세서에 기재된 표적 올리고뉴클레오타이드는 크로마토그래피(예컨대, 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC))에 이어서, 탈트라이틸화 반응에 의해 5'-DMT기를 제거하여 정제된다.
III. 카이럴 포스포로티오에이트 연결부를 갖는 올리고뉴클레오타이드의 합성
제8 양상에서, 본 개시내용은 P(V)-PSI 시약을 사용해서 입체특이적 올리고뉴클레오타이드의 합성을 위한 액상 방법을 기재한다(K.W. Knouse, J. N. deGruyter, M.A. Schmidt, et al. Science, Vol. 361, Issue 6408, pp1234-1238 (2018)). 선형 합성된 올리고뉴클레오타이드 단편은 본 명세서에 기재된 액상 수렴형 합성 방법을 사용해서 조합되어 입체선택적 표적 올리고뉴클레오타이드(예컨대, 안티센스 올리고뉴클레오타이드(ASO))를 수득할 수 있다.
제119 실시형태는 하기 화학식 (PI1) 또는 (PI2)의 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염을 제조하기 위한 액상 방법을 개시하되,
Figure pct00185
또는
Figure pct00186
상기 방법은 하기 단계들을 포함한다:
1) 화학식 (PIB)의 화합물:
Figure pct00187
또는 이의 염을 화학식 (PI1A) 또는 (PI2A)의 화합물:
Figure pct00188
Figure pct00189
또는 이의 염과 커플링시켜, 화학식 (PI1C) 또는 (PI2C)의 화합물:
Figure pct00190
Figure pct00191
또는 이의 염을 형성하는 단계;
2) 화학식 (PI1C) 또는 (PI2C)의 화합물 또는 이의 염을 탈보호하여, 화학식 (PI1D) 또는 (PI2D)의 화합물:
Figure pct00192
Figure pct00193
또는 이의 염을 형성하는 단계;
3) 화학식 (PI1D) 또는 (PI2D)의 화합물 또는 이의 염에서 시작해서, 단계 1) 및 2)를 t-3회 동안 반복하고 나서, 단계 1)을 반복하여, 화학식 (PI') 또는 이의 염을 수득하는 단계, 식 중,
R1은, 각 경우에, 독립적으로 핵염기이고, 핵염기 중의 NH2는, 존재할 경우, 아민 보호기에 의해 보호되고;
R2는, 각 경우에, 독립적으로 H, 할로, 및 C1-6알콕시로 선택적으로 치환된 C1-6알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R4는, 각 경우에, 독립적으로 H이거나 또는 R2의 알콕시기를 가진 고리를 형성하고;
R15는 하이드록실 보호기이고;
t는 3 내지 20의 정수이고; 그리고
Z는 실릴 하이드록실 보호기이다.
제120 실시형태에서는, 제119 실시형태에 기재된 방법에 대해서, 화학식 (PI1A)의 화합물은 화학식 (PIA1)의 화합물
Figure pct00194
또는 이의 염을 화학식 (1)의 화합물
Figure pct00195
과 반응시켜, 화학식 (PI1A)의 화합물 또는 이의 염을 형성함으로써 제조되고; 그리고
화학식 (PI2A)의 화합물은 화학식 (PIA1)의 화합물 또는 이의 염을 화학식 (2)의 화합물
Figure pct00196
와 반응시켜, 화학식 (PI2A)의 화합물 또는 이의 염을 형성함으로써 제조된다.
제121 실시형태는 제119 또는 제120 실시형태의 방법에 기재된 바와 같은 방법을 개시하되, 여기서 화학식 (PIB)의 단편은 화학식 (PIB1)의 화합물
Figure pct00197
또는 이의 염을 탈보호함으로써 제조된다.
제122 실시형태는 제119, 제120 또는 제121 실시형태의 방법에 기재된 바와 같은 방법을 개시하되, 여기서 단계 1)의 커플링 반응은 염기의 존재 하에 수행된다. 소정의 실시형태에서, 염기는 8-다이아자바이사이클로[5.4. 0]운데크-7-엔(DBU), 알킬아민(예컨대, tert-부틸아민, sec-부틸아민, 다이아이소프로필에틸아민, 트라이메틸아민, 트라이에틸아민, 2-메틸프로판-2-아민 등) 및 기타 적합한 유기 염기로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 염기는 DBU이다.
소정의 실시형태에서, 단계 1)의 커플링 반응은 무수 또는 실질적으로 무수 용액 염기의 존재 하에 수행된다. 소정의 실시형태에서, 무수 또는 실질적으로 무수 용액은 반응 전에 공비 증류를 이용해서 물을 제거함으로써 얻어진다. 소정의 실시형태에서, 무수 또는 실질적으로 무수 용액은 건조제의 첨가에 의해 얻어진다.
제123 실시형태는 제122 실시형태의 방법에 기재된 바와 같은 방법을 개시하되, 여기서 커플링 반응은 염기 및 건조제의 존재 하에 수행된다. 임의의 적합한 건조제가 사용될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 건조제는 염화칼슘, 염화칼륨, 황산나트륨, 황산칼슘, 황산마그네슘 및 분자체로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 건조제는 분자체이다.
소정의 실시형태에서, 염기는 DBU이고 건조제는 분자체이다. 특정 실시형태에서, 분자체의 크기는 3Å이다.
제124 실시형태는 제119 내지 제121 실시형태 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 방법을 개시하되, 여기서 탈보호 반응은 화합물을 탈트라이틸화 시약과 반응시킴으로써 수행된다. 소정의 실시형태에서, 탈트라이틸화 시약은 유기 산이다. 소정의 실시형태에서, 탈트라이틸화 시약은 CF3COOH, CCl3COOH, CHCl2COOH, CH2ClCOOH, 시트르산, 메탄설폰산, 벤젠설폰산, CClF2COOH, CHF2COOH 또는 PhSO2H이다. 특정 실시형태에서, 탈트라이틸화 시약은 CHCl2COOH이다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, 탈트라이틸화 시약은 시트르산이다.
제125 실시형태는 제119 실시형태 내지 제124 실시형태 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 방법을 개시하되, 여기서 R15는 4,4'-다이메톡시트라이틸기이다.
제126 실시형태는 제120 내지 제125 실시형태 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 방법을 개시하되, 여기서 화학식 (PIA1)의 화합물과 화학식 (1) 또는 (2)의 화합물 간의 반응은 무수 또는 실질적으로 무수 용액 염기의 존재 하에 수행된다.
소정의 실시형태에서, 무수 또는 실질적으로 무수 용액은 반응 전에 공비 증류를 사용해서 물을 제거함으로써 얻어진다. 소정의 실시형태에서, 무수 또는 실질적으로 무수 용액은 건조제의 첨가에 의해 얻어진다.
소정의 실시형태에서, 염기는 1,8-다이아자바이사이클로[5.4. 0]운데크-7-엔(DBU), 알킬아민(예컨대, tert-부틸아민, sec-부틸아민, 다이아이소프로필에틸아민, 트라이메틸아민, 트라이에틸아민 등) 및 기타 적합한 유기 염기로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 염기는 DBU이다.
제127 실시형태는 제119 내지 제126 실시형태 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 방법을 개시하되, 여기서 상기 방법은 화학식 (PI1) 또는 (PI2)의 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염을 탈보호하여, 화학식 (PI1') 또는 (PI2')의 올리고뉴클레오타이드:
Figure pct00198
Figure pct00199
또는 이의 염을 형성하는 단계를 더 포함한다.
제128 실시형태는 제127 실시형태에 기재된 바와 같은 방법을 개시하되, 여기서 실릴 보호기는 TBDPS, TBoDPS 및 TBDAS로부터 선택된다:
Figure pct00200
식 중, R5, R6 및 R7은 각각 독립적으로 H, C1-30알킬 또는 C1-30알콕시이다. 특정 실시형태에서, Z는 TBDPS이다.
제129 실시형태는 제128 실시형태에 기재된 바와 같은 방법을 개시하되, 여기서 탈보호 반응은, (예컨대, 제2 양상 또는 그 안에 기재된 임의의 실시형태에 기재된 바와 같은) 화학식 (PI1) 또는 (PI2)의 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염과 탈실릴화 시약의 반응에 의해 수행된다. 소정의 실시형태에서, 다이실릴화 시약은 테트라-n-부틸암모늄 플루오라이드(TEAF)이다.
제130 실시형태는 제119 내지 제129 실시형태 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 방법을 개시하되, 각각의 R2는 독립적으로 H, F, 또는 C1-4알콕시로 선택적으로 치환된 C1-4알콕시로부터 선택되고; R4는 H이다. 특정 실시형태에서, R2는 H이다. 다른 구체적인 실시형태에서, R2는 -OCH2CH2OCH3이다.
제131 실시형태는 제119 내지 제130 실시형태 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 방법을 개시하되, 화학식 (PI1A), (PI2A) (PIB), (PI1C), (PI2C), (PI1D), (PI2D), (PI1), (PI2), (PI1') 및/또는 (PI2')의 화합물은 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제된다.
본 개시내용은 또한 올리고뉴클레오타이드를 제조하기 위한 액상 방법을 제공하되, 여기서 올리고뉴클레오타이드 중의 포스포로티올레이트 연결부의 적어도 일부는 부분입체특이적 포스포로티올레이트이다.
제132 실시형태는, 올리고뉴클레오타이드를 제조하기 위한 액상 방법을 개시하되, 해당 방법은 화학식 (P1F1) 또는 (P2F1)의 올리고뉴클레오타이드 단편:
Figure pct00201
Figure pct00202
또는 이의 염을 화학식 (P1F2) 또는 (P2F2)의 올리고뉴클레오타이드:
Figure pct00203
Figure pct00204
또는 이의 염과 커플링시켜, 화학식 (PIII1) 또는 (PIII2)의 올리고뉴클레오타이드:
Figure pct00205
Figure pct00206
또는 이의 염을 형성하는 단계, 식 중,
R1은, 각 경우에, 독립적으로 핵염기이고, 핵염기 중의 NH2는, 존재할 경우, 아민 보호기에 의해 보호되고;
R2는, 각 경우에, 독립적으로 H, 할로, 및 C1-6알콕시로 선택적으로 치환된 C1-6알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R4는, 각 경우에, 독립적으로 H이거나 또는 R2의 알콕시기를 가진 고리를 형성하고;
R15는 하이드록실 보호기이고;
X는, 각 경우에, 독립적으로 O 또는 S이고;
t1은 3 내지 20의 정수이고;
x1은 3 내지 20의 정수이고; 그리고
Z는 실릴 하이드록실 보호기이다.
구체적으로, 화학식 (PIII1)의 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염은 화학식 (P1F1)의 올리고뉴클레오타이드 단편 또는 이의 염과 화학식 (P1F2)의 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염 간의 커플링 반응에 의해 형성된다. 유사하게, 화학식 (PIII2)의 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염은 화학식 (P2F1)의 올리고뉴클레오타이드 단편 또는 이의 염과 화학식 (P2F2)의 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염 간의 커플링 반응에 의해 형성된다.
소정의 실시형태에서, 화학식 (PIII1) 또는 (PIII2)의 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염은 크로마토그래피에 의해 정제된다.
제133 실시형태는 올리고뉴클레오타이드를 제조하기 위한 수렴형 액상 방법을 개시하되, 여기서 해당 방법은 화학식 (P1F3) 또는 (P2F3)의 올리고뉴클레오타이드 단편:
Figure pct00207
Figure pct00208
또는 이의 염을 화학식 (PF4)의 올리고뉴클레오타이드 단편:
Figure pct00209
또는 이의 염과 커플링시켜, 화학식 (PIV1) 또는 (PIV2)의 올리고뉴클레오타이드:
Figure pct00210
Figure pct00211
또는 이의 염을 형성하는 단계를 포함한다, 식 중,
R1은, 각 경우에, 독립적으로 핵염기이고, 핵염기 중의 NH2는, 존재할 경우, 아민 보호기에 의해 보호되고;
R2는, 각 경우에, 독립적으로 H, 할로, 및 C1-6알콕시로 선택적으로 치환된 C1-6알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R4는, 각 경우에, 독립적으로 H이거나 또는 R2의 알콕시기를 가진 고리를 형성하고;
R15는 하이드록실 보호기이고;
X는, 각 경우에, 독립적으로 O 또는 S이고;
t2는 3 내지 20의 정수이고;
x2는 3 내지 20의 정수이고; 그리고
Z는 실릴 하이드록실 보호기이다.
구체적으로, 화학식 (PIV1)의 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염은, 화학식 (P1F3)의 올리고뉴클레오타이드 단편 또는 이의 염을 화학식 (PF4)의 올리고뉴클레오타이드 단편 또는 이의 염과의 커플링 반응에 의해 형성된다. 유사하게, 화학식 (PIV2)의 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염은 화학식 (P2F3)의 올리고뉴클레오타이드 단편 또는 이의 염을 화학식 (PF4)의 올리고뉴클레오타이드 단편 또는 이의 염과의 커플링 반응에 의해 형성된다.
소정의 실시형태에서, 화학식 (PIV1) 또는 (PIV2)의 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염은 크로마토그래피에 의해 정제된다.
제134 실시형태는 제133 실시형태에 기재된 바와 같은 방법을 개시하되, 여기서 해당 방법은 하기 단계들을 포함한다:
a) 화학식 (PIV1) 또는 (PIV2)의 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염을 탈보호하여, 화학식 (PIV1') 또는 (PIV2')의 올리고뉴클레오타이드:
Figure pct00212
Figure pct00213
또는 이의 염을 형성하는 단계; 및
b) 화학식 (PIV1') 또는 (PIV2')의 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염을 화학식 (P1F5) 또는 (P2F5)의 올리고뉴클레오타이드 단편:
Figure pct00214
Figure pct00215
또는 이의 염과 커플링시켜, 화학식 (PV1) 또는 (PV2)의 올리고뉴클레오타이드:
Figure pct00216
Figure pct00217
또는 이의 염을 형성하는 단계, 여기서 y1은 3 내지 20의 정수이다.
구체적으로, 화학식 (PV1)의 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염은 화학식 (PIV1')의 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염을 화학식 (P1F5)의 올리고뉴클레오타이드 단편 또는 이의 염과의 커플링 반응에 의해 형성된다. 유사하게, 화학식 (PV2)의 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염은 화학식 (PIV2')의 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염을 화학식 (P2F5)의 올리고뉴클레오타이드 단편 또는 이의 염과의 커플링 반응에 의해 형성된다.
소정의 실시형태에서, 화학식 (PIV1') 또는 (PIV2')의 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염 및/또는 화학식 (PV1) 또는 (PV2)의 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염은 크로마토그래피에 의해 정제된다.
소정의 실시형태에서, 화학식 (P1F5) 또는 (P2F5)의 올리고뉴클레오타이드 단편 또는 이의 염은 화학식 (PF5a)의 올리고뉴클레오타이드 단편:
Figure pct00218
또는 이의 염을 PSI 시약(즉, 화학식 (1) 또는 (2)의 화합물 또는 이의 염)과 반응시킴으로써 제조된다.
소정의 실시형태에서, 화학식 (PF5a)의 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염은 화학식 (PF5b)의 올리고뉴클레오타이드:
Figure pct00219
또는 이의 염을 염기와 반응시킴으로써 제조된다, 여기서, R16은 -CH2CH2CN이다. 소정의 실시형태에서, 염기는 DBU, 알킬아민(예컨대, tert-부틸아민, sec-부틸아민, 다이아이소프로필에틸아민, 트라이메틸아민, 트라이에틸아민, 2-메틸프로판-2-아민 등) 및 기타 적합한 유기 염기로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 염기는 트라이에틸아민 또는 2-메틸프로판-2-아민이다. 다른 구체적인 실시형태에서, 염기는 트라이에틸아민이다.
제135 실시형태는 제133 실시형태에 기재된 바와 같은 방법을 개시하되, 여기서 상기 방법은 하기 단계를 더 포함한다:
a) 화학식 (PIV1) 또는 (PIV2)의 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염을 탈보호하여, 화학식 (PIV1') 또는 (PIV2')의 올리고뉴클레오타이드:
Figure pct00220
Figure pct00221
또는 이의 염을 형성하는 단계;
b) 화학식 (PIV1') 또는 (PIV2')의 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염을 화학식 (P1F6) 또는 (P2F6)의 올리고뉴클레오타이드 단편:
Figure pct00222
Figure pct00223
또는 이의 염과 커플링시켜, 화학식 (PVI1) 또는 (PVI2)의 올리고뉴클레오타이드:
Figure pct00224
또는
Figure pct00225
또는 이의 염을 형성하는 단계;
c) 화학식 (PVI1) 또는 (PIV2)의 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염을 탈보호하여, (PVI1') 또는 (PVI2')의 올리고뉴클레오타이드:
Figure pct00226
Figure pct00227
또는 이의 염을 형성하는 단계,
c) 화학식 (PVI1') 또는 (PVI2')의 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염을 화학식 (P1F5) 또는 (P2F5)의 올리고뉴클레오타이드 단편:
Figure pct00228
Figure pct00229
또는 이의 염과 커플링시켜, 화학식 (PVII1) 또는 (PVII2)의 올리고뉴클레오타이드:
Figure pct00230
Figure pct00231
또는 이의 염을 형성하는 단계, 여기서 y1은 3 내지 20의 정수이고; 그리고 z1은 3 내지 20의 정수이다.
구체적으로, 화학식 (PVI1)의 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염은 화학식 (PIV1')의 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염과 화학식 (P1F6)의 올리고뉴클레오타이드 단편 또는 이의 염의 커플링 반응에 의해 형성되고, 화학식 (PVII1)의 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염은 화학식 (PVI1')의 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염과 화학식 (P1F5)의 올리고뉴클레오타이드 단면 또는 이의 염의 커플링 반응에 의해 형성된다. 유사하게, 화학식 (PVI2)의 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염은 화학식 (PIV2')의 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염과 화학식 (P2F6)의 올리고뉴클레오타이드 단편 또는 이의 염의 커플링 반응에 의해 형성되고, 화학식 (PVII2)의 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염은 화학식 (PVI2')의 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염과 화학식 (P2F5)의 올리고뉴클레오타이드 단편 또는 이의 염의 커플링 반응에 의해 형성된다.
소정의 실시형태에서, 화학식 (PIV1'), (PIV2'), (PVI1), (PVI2), (PVI1'), (PVI2'), (PVII1) 및 (PVII2)의 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염 중의 어느 하나가 크로마토그래피에 의해 정제된다.
소정의 실시형태에서, 제132 내지 제135 실시형태 중 어느 하나에 기재된 커플링 반응은 제122 또는 제123 실시형태에 기재된 바와 같이 수행된다. 특정 실시형태에서, 커플링 반응은 염기의 존재 하에 수행된다. 다른 구체적인 실시형태에서, 커플링 반응은 염기 및 건조제의 존재 하에 수행된다. 또 다른 구체적인 실시형태에서, 커플링 반응은 DBU 및 분자체의 존재 하에 수행된다.
소정의 실시형태에서, 제132 내지 제135 실시형태 중 어느 하나에 기재된 탈보호 반응은 제124 실시형태에 기재된 바와 같이 수행된다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 이하의 올리고뉴클레오타이드의 제조를 수반한다:
1. ASO 1(BIIB 058)(서열번호 1), 18-량체 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오타이드, 여기서 각각 리보올리고뉴클레오타이드는 2' 위치에 메톡시-에틸(MoE)을 포함한다.
2. ASO 2(BIIB 067)(서열번호 2), 5-10-5 갭머 포스포티오에스터 및 포스포다이에스터 혼합 백본 올리고뉴클레오타이드. 갭머의 중심 블록은 10개의 데옥시 리보뉴클레오타이드이고, 이에는 2'-MoE 리보뉴클레오타이드의 블록들이 측접된다.
3. 이하의 표 2에 나타낸 바와 같은 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오타이드 A, B, C, D 및 E.
4. ASO 8(서열번호 8), 4-8-6 갭머 포스포티오에스터 및 포스포다이에스터 혼합 백본 올리고뉴클레오타이드. 갭머의 중심 블록은 8개의 데옥시 리보뉴클레오타이드이고, 이에는 2'-MoE 리보뉴클레오타이드의 블록들이 측접된다.
Figure pct00232
(서열번호 8)
5. ASO 9(서열번호9), 5-8-5 갭머 포스포티오에스터 및d 포스포다이에스터 혼합 백본 올리고뉴클레오타이드. 갭머의 중심 블록은 8개의 데옥시 리보뉴클레오타이드이고, 이에는 2'-MoE 리보뉴클레오타이드의 블록들이 측접된다.
Figure pct00233
(서열번호 9)
Figure pct00234
여기서: 밑줄: MOE 리보뉴클레오타이드
P=O: 포스포다이에스터
기타: 포스포티오에스터
Figure pct00235
소정의 실시형태에서, 표적 안티-센스 올리고뉴클레오타이드는 (5'에서 3'으로) 하기 서열을 갖는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오타이드이다:
Figure pct00236
(서열번호 1),
여기서 올리고뉴클레오타이드의 각각의 뉴클레오사이드간 연결부는 포스포로티오에이트 연결부이고, 올리고뉴클레오타이드의 각각의 뉴클레오사이드는 2'-O-메톡시에틸(MOE) 뉴클레오사이드이고, 각각의 사이토신은 5-메틸사이토신이다. 서열번호 1은 BIIB058로도 알려져 있고, WO2007/002390, WO2010/148249 및 US8,980,853에 기재되어 있으며, 이들 각각의 교시내용은 참조에 의해 본 명세서에 원용된다.
소정의 실시형태에서, 안티-센스 올리고뉴클레오타이드의 서열은 (5'에서 3'으로) 하기 서열을 갖는 5-10-5 MOE 갭머이다:
Figure pct00237
(서열번호 2)
여기서 뉴클레오사이드 1 내지 5 및 16 내지 20의 각각은 2'-O-메톡시에틸리보스 변형 뉴클레오사이드이고, 뉴클레오사이드 6 내지 15의 각각은 2'-데옥시뉴클레오사이드이고, 뉴클레오사이드 2에서 3, 4에서 5, 16에서 17, 및 18에서 19 사이 뉴클레오사이드간 연결부는 포스포다이에스터 연결부이고, 뉴클레오사이드 1에서 2, 3에서 4, 5에서 6, 6에서 7, 7에서 8, 8에서 9, 9에서 10, 10에서 11, 11에서 12, 12에서 13, 13에서 14, 14에서 15, 15에서 16, 17에서 18 및 19에서 20 사이의 뉴클레오사이드간 연결부는 포스포로티오에이트 연결부이고, 각각의 사이토신은 5'-메틸사이토신이다. 서열번호 2는 하기 화학 기호로 기재된다: mCes Aeo Ges Geo Aes Tds Ads mCds Ads Tds Tds Tds mCds Tds Ads mCeo Aes Geo mCes Te; 여기서,
A = 아데닌,
mC = 5'-메틸사이토신
G = 구아닌,
T = 티민,
e = 2'-O-메톡시에틸리보스 변형 당,
d = 2'-데옥시리보스 당,
s = 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 연결부, 및
o = 포스포다이에스터 뉴클레오사이드간 연결부.
서열번호 2는 BIIB067 또는 ISIS 666853으로서 공지된 바와 같고, WO2015153800에 기재되고, 이의 교시내용은 참조에 의해 본 명세서에 원용된다.
소정의 실시형태에서, 상기 방법은 상기 실시형태 중 어느 하나, 또는 이의 양상 중 어느 하나에 기재된 바와 같고, 여기서 안티-센스 올리고뉴클레오타이드는 하기 (5'에서 3'으로)의 서열을 갖는 4-8-6 갭머이다:
Figure pct00238
(서열번호 8)
여기서 뉴클레오사이드 1 내지 4 및 13 내지 18의 각각은 2'-O-메톡시에틸리보스 변형 뉴클레오사이드이고, 뉴클레오사이드 5 내지 12의 각각은 2'-데옥시 리보뉴클레오타이드이고, 뉴클레오사이드 2에서 3, 3에서 4, 13에서 14, 14에서 15, 그리고 15에서 16 사이의 뉴클레오사이드간 연결부는 포스포다이에스터 연결부이고, 뉴클레오사이드 1에서 2, 4에서 5, 5에서 6, 6에서 7, 7에서 8, 8에서 9, 9에서 10, 10에서 11, 11 내지 12, 12에서 13, 16에서 17 및 17에서 18 사이의 뉴클레오사이드간 연결부는 포스포로티오에이트 연결부이고, 각각의 사이토신은 5-메틸사이토신이고, 우라실은 5-메틸우라실이다. 서열번호 8은 하기 화학 기호로 기재된다:
Figure pct00239
밑줄 = MoE 리보뉴클레오타이드
G = 구아닌
MeC = 5-메틸사이토신
T = 티민
A = 아데닌
MeU = 5-메틸우라실 (티민으로도 알려짐)
P=O = 포스포다이에스터 뉴클레오사이드간 연결부
기타 뉴클레오사이드간 연결부는 포스포티오에스터 연결부이다.
소정의 실시형태에서, 상기 방법은 상기 실시형태 중 어느 하나, 또는 이의 양상 중 어느 하나에 기재된 바와 같고, 여기서 안티-센스 올리고뉴클레오타이드는 하기 (5'에서 3'으로)의 서열을 갖는 5-8-5 갭머(ASO 9)이다:
Figure pct00240
(서열번호 9)
여기서 뉴클레오사이드 1 내지 5 및 14 내지 18의 각각은 2'-O-메톡시에틸리보스 변형 뉴클레오사이드이고, 뉴클레오사이드 6 내지 13의 각각은 2'-데옥시 리보뉴클레오타이드이고, 뉴클레오사이드 3에서 4, 및 16에서 17 사이의 뉴클레오사이드간 연결부는 포스포다이에스터 연결부이고, 뉴클레오사이드 1에서 2, 2에서 3, 4에서 5, 5 에서 6, 6에서 7, 7에서 8, 8에서 9, 9에서 10, 10에서 11, 11 내지 12, 12에서 13, 13에서 14, 14에서 15, 15에서 16 및 17에서 18 사이의 뉴클레오사이드간 연결부는 포스포로티오에이트 연결부이고, 각각의 사이토신은 5-메틸사이토신이고, 우라실은 5-메틸우라실이다.
서열번호 9는 하기 화학 기호로 기재된다:
Figure pct00241
(서열번호 9)
밑줄 = MoE 리보뉴클레오타이드
G = 구아닌
MeC = 5-메틸사이토신
T = 티민
A = 아데닌
MeU = 5-메틸우라실(티민으로도 알려짐)
P=O = 포스포다이에스터 뉴클레오사이드간 연결부
소정의 실시형태에서, ASO 9는 다음과 같이 본 개시내용의 올리고뉴클레오타이드 합성의 수렴형 액상 방법을 이용해서 제조되었다:
소정의 실시형태에서, ASO 9는 본 개시내용의 올리고뉴클레오타이드 합성의 수렴형 액상 방법을 이용해서 제조되었다. 소정의 실시형태에서, 상기 방법은 단편 DMTrO-TsTsAsCsCs-OH에 대해서 3'-하이드록실에 포스포아미다이트의 첨가에 의해 단편 DMTrO-TsTsAsCsCs-OP를 수득하는 것을 포함한다. 단편 DMTrO-TsTsAsCsCs-OP는 HO-AsCoCsCsU-LHPG에 커플링되고 나서, 황화에 의해 DMTrO-TsTsAsCsCsAsCoCsCsU-LHPG를 제공한다. 이 DMT-보호된 단편은 5'-하이드록실 탈보호(탈트라이틸화)를 겪어 HO-TsTsAsCsCsAsCoCsCsU-LHPG를 수득하고, 이것을 (위에서 논의된 바와 같은 DMTrO-TsTsAsCsCs-OP 합성과 유사한 방법으로 합성된) 포스포아미다이트 단편 DMTrO-UsTsTsC-OP와 더욱 커플링시키고 나서 황화시켜, DMTrO-UsTsTsCsTsTsAsCsCsAsCoCsCsU-LHPG를 제공한다. 이 DMT-보호된 단편은 5'-하이드록실 탈보호(탈트라이틸화)를 겪어 HO-UsTsTsCsTsTsAsCsCsAsCoCsCsU-LHPG를 수득하고, 이것을 (위에서 논의된 바와 같은 DMTrO-TsTsAsCsCs-OP 합성과 유사한 방법으로 합성된) DMTrO-CsCoGsU-OP와 커플링시키고 나서 황화시켜 DMTrO-CsCoGsUsUsTsTsCsTsTsAsCsCsAsCoCsCsU-LHPG (완전 보호된 ASO 9)를 제공한다. 소정의 실시형태에서, 단편 HO-AsCoCsCsU-LHPG는 HO-U-LHPG를 DMTrOAsCoCsCP와 커플링시키고 나서, 황화 및 5'-하이드록실 탈보호(탈트라이틸화)함으로써 제조될 수 있다. 단편 DMTrOAsCoCsCP는 단편 DMTrOAsCoCsC-OH의 3'하이드록실에서 포스포아미다이트의 첨가에 의해 제조될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, O는 포스포다이에스터 연결부이고, s는 포스포티올레이트 연결부이다.
예증
약어
ACN = 아세토나이트릴
DBU = 8-다이아자바이사이클로[5.4. 0]운데크-7-엔
DCA = CHCl2COOH 또는 다이클로로아세트산
DCM = 다이클로로메탄
DDTT = 3-(N,N-다이메틸아미노-메틸리덴)아미노)-3H-1,2,4-다이티아졸
DCI = 4,5-다이사이아노이미다졸 DI =
DIEA = N,N-다이아이소프로필에틸아민
DMT 또는 DMTr = 4,4'-다이메톡시트라이틸 또는 비스-(4-메톡시페닐)페닐메틸
DMSO = 다이메틸 설폭사이드
EtOAc 또는 EA = 에틸 아세테이트
ETT = 5-에틸티오-1H-테트라졸
h 또는 hr = 시간
HBTU = 3-[비스(다이메틸아미노)메틸리움일]-3H-벤조트라이아졸-1-옥사이드 헥사플루오로포스페이트
HOBt = 하이드록시벤조트라이아졸
imid = 이미다졸
iPrOH = 아이소프로필 알코올
MOE = 메톡시에틸
MS = 분자체(molecular sieve)
MTBE 또는 TBME = 메틸 tert-부틸 에터
Py = 피리딘
RT = 체류 시간
TBAF = 테트라-n-부틸암모늄 플루오라이드
TBuAA = 트라이부틸아민 아세테이트
TBDPSCl = tert-부틸(클로로)다이페닐실란
TCA = 트라이클로로아세트산
TEA = 트라이에틸아민
TEAB = 테트라에틸암모늄 브로마이드
TFA = 트라이플루오로아세트산
THF = 테트라하이드로퓨란
실시예 1. ASO 9의 합성
A. 3'-단편의 제조:
1. 5'-OH-ACCCU-LHPG 단편(단편 1) 의 합성
화합물 1-2의 제조를 위한 일반 절차
Figure pct00242
DCM(1800㎖) 중 화합물 1-1(176g, 103 m㏖, 1.00 eq)의 용액에 DCA(66.8g, 518 m㏖, 42.6㎖, 5.00 eq) 및 CySH(24.1g, 207 m㏖, 25.3㎖, 2.00 eq)를 0℃에서 첨가하였다. 이 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 교반하였다. TLC(다이클로로메탄:에틸 아세테이트:메탄올 = 10:10:1, 생성물 Rf = 0.43)는 화합물 1-1이 완전히 소비되었고 하나의 새로운 반점이 형성된 것을 나타낸다. 반응물은 TLC에 따르면 투명하였다. 이 반응 혼합물을 NaHCO3(2.50%, 2000㎖)의 첨가에 의해 ??칭(quench)시키고, 다이클로로메탄(DCM)층을 수집하였다. 무수 아세토나이트릴(ACN)(5000㎖, 30.0V)을 25℃에서 서서히 첨가하여 생성물을 석출시켰다. 화합물 1-2(144g, 103 m㏖, 99.5% 수율)를 백색 고체로서 얻었다.
화합물 1-3의 제조를 위한 일반 절차
Figure pct00243
화합물 1-2(125g, 89.6 m㏖, 1.00 eq) 및 5'-DMT-MOE C-3'-P 아미다이트(124g, 134 m㏖, 1.50 eq)를 ACN(300㎖) 및 DCM(700㎖)과 공증발시켰다. DCM/ACN = 3:1(1800㎖) 중 화합물 1-2(125g, 89.6 m㏖, 1.00 eq) 및 5'-DMT-MOE C-3'-P 아미다이트(124g, 134 m㏖, 1.50 eq)의 용액에 분자체 3A(54.0g)를 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 1시간 동안 교반하였다. 이 혼합물에 DCI(21.1g, 179 m㏖, 2.00 eq)를 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 1시간 동안 교반하였다. TLC(다이클로로메탄:에틸 아세테이트:메탄올 = 10:10:1, 생성물 Rf = 0.55)는 화합물 1-2가 완전히 소비되었고 하나의 새로운 반점이 형성된 것을 나타낸다. 반응물은 TLC에 따르면 투명하였다.
이 혼합물에 DDTT(36.7g, 178 m㏖, 2.00 eq) 및 프로판-2-올(3.22g, 53.6 m㏖, 4.11㎖, 0.600 eq)을 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. TLC(다이클로로메탄:에틸 아세테이트:메탄올 = 10:10:1, 생성물 Rf = 0.55)는 하나의 새로운 반점이 형성되었다. 반응물은 TLC에 따르면 투명하였다.
이 혼합물에 CySH(20.6g, 178 m㏖, 21.7㎖, 2.00 eq) 및 TFA(101g, 890 m㏖, 65.9㎖, 10.0 eq)를 0℃에서 첨가하였다. 이 혼합물을 0℃에서 2시간 동안 교반하였다. TLC(다이클로로메탄:에틸 아세테이트:메탄올 = 10:10:1, 생성물 Rf = 0.51)는 하나의 새로운 반점이 형성되었다. 반응물은 TLC에 따르면 투명하였다.
이 혼합물에 피리딘(Py)(84.4g, 1.07 ㏖, 86.2㎖, 12.0 eq)을 첨가하였다. 분자체를 여과에 의해 제거하고, 고체 케이크를 DCM(500㎖)으로 세척하였다. 반응 혼합물의 pH값을 2.5% 수성 NaHCO3(1000㎖)로 6 내지 7로 조절하였다. 합한 유기층을 Mg2SO4 위에서 건조시키고, 위에서 건조시키고, 여과시키고, 농축시켰다. 조질물을 DCM(450㎖)에 재용해시키고, 격렬하게 교반하면서 ACN(4000㎖, 30.0V)에 적가하였다. 목적하는 생성물이 석출되었다. 화합물 1-3(173g, 88.9 m㏖, 99.9% 수율)을 백색 고체로서 얻었다.
화합물 1-4의 제조를 위한 일반 절차
Figure pct00244
화합물 1-3(123g, 63.2 m㏖, 1 eq) 및 5'-DMT-MOE C-3'-P 아미다이트(87.4g, 94.8 m㏖, 1.50 eq)를 ACN(500㎖) 및 DCM(1500㎖)와 공증발시켰다. DCM/ACN = 3:1(1600㎖) 중화합물 1-3 (123g, 63.2 m㏖, 1.00 eq) 및 5'-DMT-MOE C-3'-P 아미다이트(87.4g, 94.8 m㏖, 1.50 eq)의 용액에 분자체 3A(48.0g)를 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 1시간 동안 교반하였다. 이 혼합물을 DCI(14.9g, 126 m㏖, 2.00 eq)를 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 1시간 동안 교반하였다. TLC(다이클로로메탄:에틸 아세테이트:메탄올 = 10:10:1, 생성물 Rf = 0.64)는 화합물 1-3가 완전히 소비되었고 하나의 새로운 반점이 형성된 것을 나타낸다. 반응물은 TLC에 따르면 투명하였다.
이 혼합물에 DDTT(25.9g, 126 m㏖, 2.00 eq)를 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. 이 혼합물을 프로판-2-올(2.28g, 37.95 m㏖, 2.91㎖, 0.6 eq)을 25℃에서 첨가하였다. TLC(다이클로로메탄:에틸 아세테이트:메탄올 = 10:10:1, 생성물 Rf = 0.68)는 하나의 새로운 반점이 형성되었다. 반응물은 TLC에 따르면 투명하였다.
이 혼합물에 트라이플루오로아세트산(TFA)(86.5g, 758 m㏖, 56.1㎖, 12.0 eq) 및 CySH(14.7g, 126 m㏖, 15.4㎖, 2.00 eq)를 0℃에서 첨가하였다. 이 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 교반하였다. TLC(다이클로로메탄:에틸 아세테이트:메탄올 = 10:10:1, 생성물 Rf = 0.56)는 하나의 새로운 반점이 형성되었다. 반응물은 TLC에 따르면 투명하였다.
이 혼합물에 Py(70.03g, 885.31 m㏖, 71.46㎖, 14 eq)를 첨가하였다. 분자체를 여과에 의해 제거하고, 고체 케이크를 DCM(1000㎖)으로 세척하였다. 반응 혼합물의 pH값을 2.5% 수성 NaHCO3(2000㎖)로 6 내지 7로 조절하였다. 합한 유기층을 Mg2SO4 위에 건조시켰다. 조질물을 DCM(600㎖)에 재용해시키고, 격렬하게 교반하면서 ACN(5000㎖, 30V)을 적가하였다. 목적하는 생성물이 석출되었다. 화합물 1-4(143g, 57.31 m㏖, 90.63% 수율)를 백색 고체로서 얻었다.
화합물 1-5의 제조를 위한 일반 절차
Figure pct00245
화합물 1-4(290g, 116 m㏖, 1.00 eq) 및 5'-DMT-MOE C-3'-P 아미다이트(160g, 174 m㏖, 1.50 eq)를 ACN(500㎖) 및 DCM(1500㎖)과 공증발시켰다. DCM/ACN = 3:1(2300㎖) 중 화합물 1-4(290g, 116.23 m㏖, 1 eq) 및 5'-DMT-MOE C-3'-P 아미다이트(160g, 174 m㏖, 1.50 eq)의 용액에 분자체 3Å(69.0g)을 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 1시간 동안 교반하였다. 이 혼합물을 DCI(34.3g, 290 m㏖, 2.50 eq)를 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 1시간 동안 교반하였다. TLC(다이클로로메탄:에틸 아세테이트:메탄올 = 10:10:1, 생성물 Rf = 0.70)는 화합물 1-4가 완전히 소비되었고 하나의 새로운 반점이 형성된 것을 나타낸다. 반응물은 TLC에 따르면 투명하였다.
이 혼합물에 t-BuOOH(H2O, 31.8㎖, 70.0% 순도, 2.00 eq)를 첨가하고, 얻어진 혼합물을 25℃에서 1시간 동안 교반하였다. TLC(다이클로로메탄:에틸 아세테이트:메탄올 = 10:10:1, 생성물 Rf = 0.72)는 하나의 새로운 반점이 형성되었다. 반응물은 TLC에 따르면 투명하였다. 분자체를 여과에 의해 제거하고, 고체 케이크를 DCM(1000㎖)으로 세척하였다. 조질물을 격렬하게 교반하면서 ACN(9000㎖, 30.0V)에 적가하였다. 목적하는 생성물이 석출되었다. 화합물 1-5(386g, 116 m㏖, 99.8% 수율)를 백색 고체로서 얻었다.
화합물 1-6의 제조를 위한 일반 절차
Figure pct00246
DCM(5700㎖) 중 화합물 1-5(386g, 115 m㏖, 1.00 eq)의 용액에 CySH(40.3g, 347 m㏖, 42.5㎖, 3.00 eq) 및 다이클로로아세트산(DCA)(298g, 2.32 ㏖, 190㎖, 20.0 eq)을 0℃에서 첨가하였다. 이 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 교반하였다. TLC(다이클로로메탄:에틸 아세테이트:메탄올 = 10:10:1, 생성물 Rf = 0.46)는 화합물 1-5가 완전히 소비되었고 하나의 새로운 반점이 형성된 것을 나타낸다. 반응물은 TLC에 따르면 투명하였다. 이 혼합물에 Py(201g, 2.55 ㏖, 205㎖, 22.0 eq)를 첨가하였다. 분자체를 여과에 의해 제거하고, 고체 케이크를 DCM(800㎖)으로 세척하였다. 반응 혼합물의 pH값을 2.5% 수성 NaHCO3(4000㎖)로 6 내지 7로 조절하였다. 합한 유기층을 Mg2SO4 위에 건조시켰다. 조질물을 DCM(500㎖)에 재용해시키고, 격렬하게 교반하면서 ACN(12000㎖, 30V)을 적가하였다. 목적하는 생성물이 석출되었다. 화합물 1-6(310g, 102 m㏖, 88.3% 수율)을 백색 고체로서 얻었다.
화합물 1-7(5'-OH-ACCCU-LHPG)의 제조를 위한 일반 절차
Figure pct00247
화합물 1-6(154g, 50.8 m㏖, 1.00 eq) 및 5'-DMT-MOE A-3'-P 아미다이트(71.0g, 76.2 m㏖, 1.50 eq)를 ACN(500㎖) 및 DCM(1500㎖)과 공증발시켰다.
DCM/ACN = 3:1(1200㎖) 중 화합물 1-6(154g, 50.8 m㏖, 1.00 eq) 및 5'-DMT-MOE A-3'-P 아미다이트(71.0g, 76.2 m㏖, 1.50 eq)의 용액에 분자체 3A(36.0g)를 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 1시간 동안 교반하였다. 이 혼합물에 DCI(15.0g, 127 m㏖, 2.50 eq)를 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 1시간 동안 교반하였다. TLC(다이클로로메탄:에틸 아세테이트:메탄올 = 10:10:1, 생성물 Rf = 0.57)는 화합물 1-6이 완전히 소비되었고 하나의 새로운 반점이 형성된 것을 나타낸다. 반응물은 TLC에 따르면 투명하였다.
이 혼합물에 DDTT(17.7g, 86.3 m㏖, 1.70 eq) 및 프로판-2-올(iPrOH)(1.83g, 30.4 m㏖, 2.33㎖, 0.600 eq)을 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. TLC(다이클로로메탄:에틸 아세테이트:메탄올 = 10:10:1, 생성물 Rf = 0.59)는 하나의 새로운 반점이 형성되었다. 반응물은 TLC에 따르면 투명하였다.
이 혼합물에 TFA(75.2g, 659 m㏖, 48.8㎖, 13.0 eq) 및 CySH(11.7g, 101 m㏖, 12.4㎖, 2.00 eq)를 0℃에서 첨가하였다. 이 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 교반하였다. TLC(다이클로로메탄:에틸 아세테이트:메탄올 = 10:10:1, 생성물 Rf = 0.47)는 하나의 새로운 반점이 형성되었다. 반응물은 TLC에 따르면 투명하였다.
이 혼합물에 Py(58.5g, 739 m㏖, 59.7㎖, 15.0 eq)를 첨가하였다. 분자체를 여과에 의해 제거하고, 고체 케이크를 DCM(300㎖)으로 세척하였다. 반응 혼합물의 pH값을 2.5% 수성 NaHCO3(2000㎖)로 6 내지 7로 조절하였다. 합한 유기층을 Mg2SO4 위에 건조시켰다. 조질물을 DCM(400㎖)에 재용해시키고, 격렬하게 교반하면서 ACN(4500㎖, 30.0V)에 적가하였다 . 목적하는 생성물이 석출되었다. 화합물 1-7(5'-OH-ACCCU-LHPG)(169g, 47.0 m㏖, 92.7% 수율)는 백색 고체로서 얻었다. 화합물 1-7의 HPLC 및 LC-MS 분석을 위하여, 이하에 개시된 화합물 1 암모니아분해에 대해서 사용한 것과 유사한 암모니아분해(NH3/H2O) 절차를 이용해서 탈보호하여 1-7-a(5'-OH-ACCCU-OH)를 얻었다. 화합물 1-7-a의 HPLC 및 LC-MS는 도 1에 도시되어 있다.
Figure pct00248
화합물 1-7-a에 대한 HPLC-MS 방법은 이하에 기재되어 있다:
Figure pct00249
칼럼 -ACQUITY UPLC BEH Shield RP18 칼럼, 130Å, 1.7㎛, 2.1㎜×150㎜;
Figure pct00250
칼럼 온도: 65℃;
Figure pct00251
질량 스펙트럼 스캔 범위: 300 내지 2000 m/z;
Figure pct00252
MS 극성: 음성
Figure pct00253
용액 A: 10% CH3CN 중 5mM 트라이부틸아민 아세테이트(TBuAA), 1μM EDTA; 용액 B: 80% CH3CN 중 5mM TBuAA, 1μM EDTA
Figure pct00254
구배:
Figure pct00255
2. 5'-OH-ACCCU-LHPG 단편(단편 1)의 대안적인 합성
5'-DMT-ACCC-3' OH의 제조
Figure pct00256
5'-DMT-ACCC-3'-OH(1-8)은 화합물 1-3에 대해서 위에서 기재된 바와 같은 유사한 절차를 이용해서 위에서 묘사된 반응식에 기초하여 제조하였다.
5'-DMT-ACCC-3'-P 아미다이트(1-8a) 의 제조를 위한 일반 절차
Figure pct00257
5'-DMT-ACCC-3'-OH(280.0g, 1.0 eq.)를 반응기(R1)에 N2 보호 하에 주입하였다. DCM(1000㎖ 3.57V)을 플라스크에 N2 보호 하에 주입하였다. 이 화합물을 25 내지 30℃에서 진공 하에 DCM과 공증발시켰다. 잔류하는 물 수준이 0.01% 미만이 될 때까지 DCM과의 공증발을 3회 반복하였다. THF(1400㎖ 5V)를 R1에 N2 보호 하에 주입하였다. 샘플을 분석을 위하여 수집하였다. R1의 온도를 -5℃ 내지 5℃로 조절하였다. P-시약(106.7g, 2.992 eq.)을 R1에 N2 보호 하에 주입하였다. (피리딘;2,2,2-트라이플루오로아세트산 45.7g, 2.001 eq.)을 R1에 N2 보호 하에 주입하고, 이 반응 혼합물을 1시간 동안 -5℃ 내지 5℃에서 교반하였다.
메틸 tert-부틸 에터(MTBE)(10080㎖ 36V)를 N2 보호 하에 또 다른 플라스크(R2)에 주입하였다. Py(70㎖ 0.25V)를 N2 보호 하에 R2에 주입하였다. 헵탄(3920㎖ 14V)을 N2 보호 하에 R1에 주입하였다. R2를 N2로 -5℃ 내지 5℃에서 30분 동안 퍼지시켰다. R1로부터의 용액을 R2의 용액에 N2 보호 하에 서서히 주입하였다. R2를 -5℃ 내지 5℃에서 1시간 동안 교반하였다. 이 반응 혼합물을 여과시켰다. 케이크를 MTBE:헵탄(5:2, 700㎖)의 용액으로 2회 세척하였다. 여과액의 샘플을 분석을 위하여 수집하였다. 케이크를 25℃ 내지 30℃에서 24시간 동안 건조시켜 5'-DMT-ACCC-3'-P 아미다이트 1-8a(292.3g, 수율: 96.25%, 순도: 98%)를 얻었다.
5'-DMT-ACCCU-3'-LHPG (1-9)의 제조를 위한 일반 절차
Figure pct00258
5'-HO-U-3'-LHPG(120.0g)를 반응기에 주입하고 나서 분자체(3Å)(300.0g), 5'-DMT-ACCC-P-아미다이트(280.68g, 1.27 eq.) 및 DCM(3000㎖, 25V)을 주입하였다. 이 반응 혼합물을 20℃ 내지 30℃에서 1시간 동안 교반하였다. 이 반응 혼합물에 DCI(20.33g, 2.00 eq.)를 주입하고, 이 혼합물을 20℃ 내지 30℃에서 30분 동안 교반하였다. 샘플을 분석을 위하여 수집하였다. 이 반응 혼합물에 DDTT(35.35g, 2.0 eq.)를 주입하였다. 샘플을 분석을 위하여 수집하였다. 이 반응 혼합물을 여과시키고, 농축시키고, DCM(720㎖,6V)에 용해시켰다. DCM 용액을 ACN(9000㎖, 75V)의 용액에 적가하고 나서, 대부분의 DCM을 회전 증류에 의해 제거하였다. 이 혼합물을 여과시키고, 케이크를 ACN(600㎖, 10V)으로 2회 세척하였다. 습윤 케이크를 20℃ 내지 30℃에서 16시간 동안 건조시켜 5'-DMT-ACCCU-3'-LHPG(287.15g, 85.7% 수율)를 얻었다.
5'-OH-ACCCU-3'-LHPG(1-7)의 제조를 위한 일반 절차
Figure pct00259
5'-DMT-ACCCC-3'-LHPG(285.54g), 분자체(3A)(142.77g) 및 DCM(2855㎖, 10V)을 반응기에 주입하였다. 이 반응 혼합물을 20℃ 내지 30℃에서 1시간 동안 교반하고, 반응 온도를 -5℃ 내지 5℃로 조절하였다. 반응기에 도데칸-1-티올(51.97g, 3.5 eq.)을 주입하고 나서 TFA(58.55g, 7.0 eq.)을 주입하고, 이 반응 혼합물을 1시간 동안 -5℃ 내지 5℃에서 교반하였다. 반응기에 1-메틸이미다졸(NMI)(54.21g, 9.0 eq.)을 주입하고, 이 반응 혼합물을 20℃ 내지 30℃에서 5분 동안 교반하였다. 이 반응 혼합물을 여과시키고, 얻어진 용액을 농축시켜 DCM을 제거하였다. 조질의 생성물을 DCM(427.5㎖, 1.5V)에 용해시키고, 이 용액을 ACN(8566㎖, 30V)의 용액에 적가하였다. 얻어진 혼합물을 회전 증류에 의해 DCM의 대부분을 제거함으로써 농축시키고 여과시켰다. 케이크를 ACN(571㎖, 4V)으로 2회 세척하고 20℃ 내지 30℃에서 건조시켜 화합물 1-7(239.92 g; 91.1% 수율)을 얻었다.
B. 5'-단편의 제조를 위한 일반 절차:
1. 데옥시-TTACC 5량체 단편(단편 2)의 합성
화합물 2-2의 제조를 위한 일반 절차
Figure pct00260
DCM(2300㎖) 중 화합물 2-1(300g, 463 m㏖, 1.00 eq)의 용액에 이미다졸(94.6g, 1.39 ㏖, 3.00 eq)을 25℃에서 첨가하였다. 이 혼합물은 밝은 황색 균질 용액이었다. TBDPSCl(tert-부틸(클로로)다이페닐실란)(166g, 602 m㏖, 155㎖, 1.30 eq)을 25℃에서 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 12시간 동안 교반하였다. 주: TBDPSCl의 첨가 동안 온도는 5℃씩 증가되었다. HPLC는 반응물이 완전히 소비된 것을 나타내었다. 프로판-2-올(27.8g, 463 m㏖, 35.5㎖, 1.00 eq)을 첨가하고 이 혼합물을 25℃에서 0.5시간 동안 교반하였다.
상기 용액에 사이클로헥산티올(70.0g, 602 m㏖, 73.7㎖, 1.30 eq)을 0℃에서 첨가하였다. 이 혼합물을 0℃에서 15분 동안 교반하였다. TFA(264.06g, 2.32 ㏖, 171.47㎖, 5 eq)를 0℃에서 45분의 기간에 걸쳐서 적가하였다. 이 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 교반하였다. 용액의 색은 밝은 황색에서 짙은 적색으로 변하였고, 백색 고체는 TFA의 첨가 동안 관찰되었다. HPLC는 반응이 완결된 것을 나타내었다.
반응 혼합물을 Na2CO3 용액(1.5ℓ 물 중 245g Na2CO3)에 붓고, 메틸 tert-부틸 에터(TBME 또는 MTBE)(1.5ℓ)로 희석시키고, 두 층을 분리시켰다. 유기층을 염수(750㎖×2)로 세척하고, 무수 MgSO4(232g)로 건조시키고, 셀라이트를 통해서 여과시키고, 농축시켰다. 일부 백색 고체가 수성 Na2CO3의 첨가 동안 관찰되었고, 생성물은 조질의 생성물을 황색 발포물 고체로서 제공하기 위하여 건조 상태로 증발될 때까지 농축 공정 동안 석출되지 않았음에 유의한다.
조질의 생성물을 DCM(300㎖)에 용해시키고 1000㎖ 분리 깔때기에 장입하였다. 헵탄/TBME(v/v 9:1, 3.0ℓ)의 용매 혼합물에 깔때기로부터 조질의 생성물의 용액을 서서히 적가하여 석출 공정을 수행하였다. 이 공정은 약 30분 걸렸다. 이 순수한 생성물을 부흐너 깔때기로 백색 고체로서 수집하고, 생성물의 케이크를 헵탄(100㎖×2)의 용매 혼합물로 세척하고, 건조 상태로 농축시켰다. 화합물 2-2(235g, 395 m㏖, 85.2% 수율, 98.0% 순도)를 백색 고체로서 얻었다.
화합물 2-4의 제조를 위한 일반 절차
Figure pct00261
화합물 2-2(10.0g, 17.1 m㏖, 1.00 eq) 및 화합물 단량체 2-3(17.4g, 20.6 m㏖, 1.20 eq)을 250㎖ 1구 둥근 병(single-necked round bottle)에서 Ar2 하에 CH3CN(20㎖×2)과 공증발시켰다.
화합물 2-2(10.0g, 17.1 m㏖, 1.00 eq) 및 화합물 단량체 2-3(17.4g, 20.6 m㏖, 1.20 eq)을 ACN(80㎖) 및 DCM(80㎖)(CH3CN/DCM = 1/1)에 25℃에서 용해시켰다. ETT(3.34g, 25.7 m㏖, 1.50 eq)를 첨가하고, 이 혼합물 용액을 25℃에서 Ar2 하에 30분 동안 교반하였다. 반응에 사용되는 아세토나이트릴은 99.9% 순수하였고, 분자체로 더욱 건조시켜, 50ppm 이하의 수분 함량을 얻었음에 유의하는 것이 중요하다. 사용된 DCM은 또한 무수 DCM이다. 이 혼합물은 밝은 황색 균질 용액으로부터 밝은 탁한 황색으로 변하였다. HPLC는 화합물 2-2가 완전히 소비된 것을 나타내었다.
상기 용액에 잔탄 하이드라이드(2.83g, 18.8 m㏖, 1.10 eq)를 25℃에서 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. 주: 이 혼합물은 밝은 황색 균질 용액에서 탁한 황색으로 변하였다. HPLC는 반응이 완결된 것을 나타내었다.
상기 용액을 빙수에서 0℃까지 30분 동안 냉각시켰다. 반응 혼합물에 0℃에서 TFA(13.7g, 120 m㏖, 8.88㎖, 7.00 eq)를 첨가하였다. 이 혼합물을 0℃에서 2.5시간 동안 교반하였다. 혼합물의 색은 탁한 황색에서 적색으로 변하였다. HPLC는 반응이 완결된 것을 나타내었다.
이 반응 혼합물에 Na2CO3 용액(83㎖ 물 중 12.7g Na2CO3)을 서서히 첨가하였다(반응 용액의 범핑(bumping)을 피하기 위하여 CO2 방출 속도를 주시하였다). 중화 공정을 약 12시간에 행하고, 이어서 반응 혼합물 중의 모든 용매를 회전증발농축기에 의해 제거하여 조질의 생성물의 유백색 물 현탁액을 제공하였다.
조질의 생성물을 EtOAc/TBME(v/v 1:3, 800㎖)의 혼합 용매에 용해시키고, 두 층을 분리시켰다. 유기층을 물(400㎖), 염수(2×400㎖)로 세척하고, 무수 MgSO4(~42.0g)에 의해 건조시키고, 셀라이트를 통해서 여과시키고 농축시켰다.
조질의 생성물을 DCM(55㎖)에 용해시키고 100㎖ 분리 깔때기에 장입하였다. 헵탄/TBME(v/v 9:1, 1600㎖)의 용매 혼합물에 깔때기로부터 조질의 생성물의 용액을 서서히 첨가하여 석출 공정을 수행하였다. 이 공정은 약 60분 걸렸다. ??칭 단계의 시간은 1시간 동안 연장되었다.
순수한 생성물을 부흐너 깔때기로 백색 고체로서 수집하였다. 생성물의 케이크를 헵탄(50㎖×2)의 용매 혼합물로 세척하고, 건조 상태로 농축시켰다. 화합물 이량체 2-4(25.5g, 16.6 m㏖, 96.6% 수율, 68.2% 순도)를 밝은 황색 고체로서 얻었다.
화합물 2-6의 제조를 위한 일반 절차
Figure pct00262
화합물 이량체 2-4(10.0g, 9.43 m㏖, 1.00 eq) 및 화합물 단량체 2-5(8.90g, 10.4 m㏖, 1.10 eq)를 500㎖ 1구 둥근 병에서 ACN(100㎖×3)과 공증발시키고, 이어서 ACN(30㎖) 및 DCM(30㎖)(CH3CN/DCM=1/1)에 25℃에서 용해시켰다. 5-에틸설파닐-2H-테트라졸(1.84g, 14.2 m㏖, 1.5 eq)을 25℃에서 첨가하고, 이 혼합물을 25℃에서 30분 동안 교반하였다. HPLC는 반응물 이량체 2-4가 완전히 소비된 것을 나타내었다.
상기 용액에 5-아미노-1,2,4-다이티아졸-3-티온(1.56g, 10.4 m㏖, 1.10 eq)을 25℃에서 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. 이 혼합물은 밝은 황색 균질 용액에서 탁한 황색으로 변하였다. HPLC는 반응이 완결된 것을 나타내었다.
상기 용액을 0℃까지 냉각시켰다. TFA(6.45g, 56.6 m㏖, 4.20㎖, 6.00 eq)를 0℃에서 적가하였다. 이 혼합물을 0 내지 25℃에서 3시간 동안 교반하였다. 혼합물의 색은 탁한 황색에서 황등색 현탁액으로 변하였다. HPLC는 반응이 완결된 것을 나타내었다.
반응 혼합물에 Na2CO3 용액(6.00g, 46.6㎖ 물 중 Na2CO3)을 서서히 첨가하였다(반응 용액의 범핑을 피하기 위하여 CO2 방출 속도를 잘 살폈다). 중화 공정을 약 1시간에 행하고, 이어서 반응 혼합물 중의 모든 용매를 회전증발농축기에 의해 제거하여 조질의 생성물의 유백색 물 현탁액을 제공하였다.
조질의 생성물을 EtOAc/TBME(v/v 3:1, 622㎖)의 혼합 용매에 용해시키고 두 층을 분리시켰다. 유기층을 물(155㎖), 염수(2×155㎖)에 용해시키고, 무수 MgSO4(~15.5g)로 건조시키고, 여과시키고, 진공 중 농축시켰다. 이 공정에서, 황색 겔 고체가 석출되지 않았음에 유의한다. 조질의 생성물을 DCM(70㎖)에 용해시키고 100㎖ 분리 깔때기에 장입하였다.
TBME(1.24ℓ)의 용매에 깔때기로부터 조질의 생성물의 용액을 서서히 첨가하여 석출 공정을 수행하였다. 이 공정은 약 1.5시간 걸렸다. 순수한 생성물을 부흐너 깔때기로 백색 고체로서 수집하고, 생성물의 케이크를 헵탄(50㎖×2)의 용매 혼합물로 세척하고, 건조 상태로 농축시켰다. 화합물 삼량체 2-6(11.4g, 6.63 m㏖, 70.3% 수율, 90.0% 순도)을 밝은 황색 고체로서 얻었다.
화합물 2-8의 제조를 위한 일반 절차
Figure pct00263
CH3CN(10㎖) 중 화합물 삼량체 2-6(4.20g, 2.72 m㏖, 1.00 eq)의 용액에 단량체 2-7(3.03g, 4.07 m㏖, 1.50 eq)을 첨가하고, 이 용액을 100㎖ 1구 둥근 병에서 Ar2 하에 CH3CN(10㎖×2)과 공증발시켰다.
화합물 삼량체 2-6(4.20g, 2.72 m㏖, 1.00 eq) 및 단량체 2-7(3.03g, 4.07 m㏖, 1.50 eq)을 CH3CN(12㎖) 및 DCM(12㎖)(CH3CN/DCM = 1/1)에 25℃에서 용해시켰다. 분자체 3Å(4.00g, 1.00 eq)을 첨가하고, 이 혼합물 용액을 25℃에서 Ar2 하에 1시간 동안 교반하였다. 5-에틸설파닐-2H-테트라졸(530㎎, 4.07 m㏖, 1.50 eq)을 25℃에서 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. 이 혼합물은 밝은 황색 균질 용액에서 밝은 탁한 황색으로 변하였다. 이 반응 혼합물을 여과시켜 3Å 분자체를 제거하였다.
아세토나이트릴 및 DCM을 둘 다 갓(freshly) 재증류시키는 것에 유의하는 것이 중요하다. HPLC는 삼량체가 완전히 소비된 것을 나타내었다.
상기 용액에 5-아미노-1,2,4-다이티아졸-3-티온(449㎎, 2.99 m㏖, 1.10 eq)을 25℃에서 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. 이 혼합물은 밝은 황색 균질 용액에서 탁한 황색으로 변하였다. HPLC는 반응이 완결된 것을 나타내었다.
상기 혼합물에 반응물 TFA(2.48g, 21.7 m㏖, 1.61㎖, 8.00 eq)를 0℃에서 적가하였다. 이 혼합물을 0℃에서 4.5시간 동안 교반하였다. 이 혼합물은 탁한 황색에서 황등색 현탁액으로 변하였다. HPLC는 반응이 완결된 것을 나타내었다.
이 반응 혼합물에 Na2CO3 용액(20㎖ 물 중 2.88g Na2CO3)을 서서히 첨가하였다(반응 용액의 범핑을 피하기 위하여 CO2 방출 속도를 주시하였다). 중화 공정은 약 1시간에 행하고, 이어서 반응 혼합물 중의 모든 용매를 회전증발농축기에 의해 제거하여 조질의 생성물의 유백색 물 현탁액을 제공하였다.
조질의 생성물을 EtOAc/TBME의 혼합 용매(v/v 3:1, 260㎖)에 용해시키고, 두 층을 분리시켰다. 유기층을 물(64㎖), 염수(2×64㎖)로 세척하고, 무수 MgSO4(~6.44g)에 의해 전조시키고, 셀라이트를 통해서 여과시키고 농축시켰다.
조질의 생성물을 DCM(28㎖)에 용해시키고, 100㎖ 분리 깔때기에 장입시켰다. 용매 TBME(518㎖)에 깔때기로부터 조질의 생성물의 용액을 서서히 적가하여 석출 공정을 수행하였다. 이 공정은 약 30분 걸렸다.
순수한 생성물을 부흐너 깔때기로 백색 고체로서 수집하였다. 생성물의 케이크를 헵탄(20㎖×2)의 용매 혼합물로 세척하고, 건조 상태로 농축시켰다. 화합물 사량체 2-8(4.37g, 2.07 m㏖, 76.2% 수율, 91.0% 순도)을 밝은 황색 고체로서 얻었다.
화합물 2-9(데옥시-TTACC 5량체)의 제조를 위한 일반 절차
Figure pct00264
사량체 2-8(120g, 62.5 m㏖, 1.00 eq)을 ACN(500㎖×2)과 공증발시키고, 이어서 단량체 2-7(51.2g, 68.8 m㏖, 1.10 eq)을 첨가하고, 이 용액을 3ℓ 1구 둥근 병에서 Ar2 하에 ACN(500㎖×2)과 공증발시켰다.
ACN(485㎖) 중 사량체 2-8(120g, 62.5 m㏖, 1.00 eq) 및 단량체 2-7(51.2g, 68.8 m㏖, 1.10 eq)의 혼합물 용액에 분자체 3A(36g)를 25℃에서 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 1시간 동안 교반하였다. Py
Figure pct00265
TFA(1M, 93.8㎖, 1.50 eq)를 25℃에서 첨가하였다. 얻어진 혼합물을 25℃에서 30분 동안 교반하였다. 아세토나이트릴이 갓 재증발된 것에 유의하는 것이 중요하다. HPLC는 사량체 2-8이 완전히 소비된 것을 나타내었다.
상기 혼합물에 DDTT(14.1g, 68.8 m㏖, 1.10 eq)를 25℃에서 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. 황화 완결 후, 상기 혼합물을 재증류된 MeCN(480㎖)으로 희석시키고, 이어서 0℃까지 냉각시켰다. Py(49.4g, 625 m㏖, 50.5㎖, 10.0 eq)를 0℃에서 첨가하였다.
동시에, 1ℓ 3구 둥근 바닥 플라스크에 이미다졸(85.1g, 1.25 ㏖, 20.0 eq) 및 무수 THF(240㎖)를 주입하고, 빙욕에 30분 동안 배치하였다. HF(17.9g, 625 m㏖, 16.3㎖, 70% 순도, 10.0 eq)를 서서히 첨가하고, 이어서 더욱 15분 동안 교반하였다(균질물이 이 단계로부터 얻어졌다). 이 용액을 상기 현탁액에 0℃에서 시린지 펌프(2㎖/분 적가 속도)에 의해 첨가하였다. 이 혼합물을 0℃에서 3시간 동안 교반하였다. HPLC는 반응이 완결된 것을 나타내었다.
이 반응 혼합물을 EtOAc(2.8ℓ)에 용해시켰다. 유기층을 포화 수성 NaHCO3(1.4ℓ×2), 물(1.4ℓ×3), 염수(1.4ℓ)로 세척하고, 무수 MgSO4(대략 208g)에 의해 건조시키고, 여과시키고 진공 중 농축시켰다. 이 공정에서, 황색 겔 고체가 석출되지 않았다.
조질의 생성물을 1ℓ 분리 깔때기에 장입된 DCM(840㎖) 및 ACN(240㎖)에 용해시켰다. TBME(8.5ℓ)의 용매에 깔때기로부터 조질의 생성물의 용액을 서서히 첨가하여 석출 공정을 수행하였다. 이 공정은 약 3시간 걸렸다. 순수한 생성물을 부흐너 깔때기로 백색 고체로서 수집하고, 생성물의 케이크를 TBME(1ℓ×2)의 용매 혼합물로 세척하고, 건조 상태로 농축시켰다. 데옥시-TTACC 5량체(145.5g, 57.8 m㏖, 92.4% 수율, 93.6% 순도)를 백색 고체로서 얻었다. RT = 7.174분을 가진 데옥시-TTACC 5량체(2-9)에 대한 HPLC-MS는 도 2에 도시되어 있다.
화합물 2-9에 대한 HPLC-MS 방법:
Figure pct00266
칼럼: ACQUITY UPLC BEH Shield RP18 칼럼, 130Å, 1.7㎛, 2.1㎜×150㎜;
Figure pct00267
칼럼 온도: 60℃;
Figure pct00268
MS 분석은 60k 분해능 및 700 내지 2000의 질량 범위를 갖는 Thermo Orbitrap Fusion 상에서 행하였다;
Figure pct00269
MS 극성: 양성
Figure pct00270
이동상 A: ACN:물=25:75 중 20mM 아세트산암모늄; 이동상 B: 아세토나이트릴;
Figure pct00271
구배:
Figure pct00272
2. UTTC 4량체(단편 3)의 합성
화합물 3-2의 제조를 위한 일반 절차
Figure pct00273
DCM(3800㎖) 중 화합물 3-1(500g, 772 m㏖, 1.00 eq)의 용액에 이미다졸(158g, 2.32 ㏖, 3.00 eq)을 첨가하였다. TBDPSCl(276g, 1.00 ㏖, 258㎖, 1.30 eq)을 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 16시간 동안 교반하였다. TLC(석유 에터/에틸 아세테이트 = 5/1, 생성물: Rf = 0.40)는 화합물 3-1이 완전히 소비된 것을 나타내었다. 프로판-2-올(46.4g, 59.1㎖, 1.00 eq)을 첨가하고, 이 혼합물을 30분에 교반하였다.
상기 용액에 CySH(117g, 1.00 ㏖, 123㎖, 1.30 eq)를 0℃에서 첨가하였다. 이 혼합물을 0℃에서 15분 동안 교반하였다. TFA(440g, 3.86 ㏖, 286㎖, 5.00 eq)를 30분의 기간에 걸쳐서 0℃에서 적가하였다. 이 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 교반하였다. HPLC는 반응이 완결된 것을 나타내었다. TFA의 첨가 동안 밝은 황색에서 짙은 적색으로 변화된 용액의 색이 관찰된 것에 유의해야 한다.
반응 혼합물을 Na2CO3 용액(2.5ℓ 물 중 410g Na2CO3)에 붓고, TBME(2.5ℓ)로 희석시키고, 두 층을 분리시켰다. 유기층을 염수(1.3ℓ×2)로 세척하고, 무수 MgSO4(321g)로 건조시키고 셀라이트를 통해서 여과시키고, 농축시켰다.
조질의 생성물을 DCM(600㎖)에 용해시키고, 1000㎖ 분리 깔때기에 로딩하였다. 헵탄/TBME(v/v 9:1, 5.0ℓ)의 용매 혼합물에 깔때기로부터 조질의 생성물의 용액을 서서히 첨가하여 석출 공정을 수행하였다. 이 공정은 약 30분 걸렸다. 이 순수한 생성물을 부흐너 깔때기로 백색 고체로서 수집하고, 생성물의 케이크를 헵탄(500㎖×2)의 용매 혼합물로 세척하고, 건조 상태로 농축시켰다. 화합물 3-2(390g, 660 m㏖, 85.5% 수율, 98.8% 순도)를 백색 고체로서 얻었다.
화합물 3-3의 제조를 위한 일반 절차
Figure pct00274
화합물 3-2(110g, 188 m㏖, 1.00 eq) 및 dT 아미다이트(168g, 226 m㏖, 1.20 eq)를 CH3CN(1.0ℓ×3)과 공증발시켰다. 이 혼합물을 CH3CN(500㎖) 및 DCM(500㎖)에 25℃에서 용해시켰다. 5-(에틸티오)-1H-테트라졸(ETT)(1.67g, 12.8 m㏖, 1.50 eq)을 교반하면서 첨가하고, 이 혼합물 용액을 25℃에서 Ar2 분위기 하에 30분 동안 교반하였다. 아세토나이트릴 및 DCM을 둘 다 갓 재증발된 것에 유의한다. HPLC는 화합물 3-2가 완전히 소비된 것을 나타내었다. dT 아미다이트는 DMT-2'-데옥시티미딘-포스포아미다이트인 것에 유의한다:
Figure pct00275
상기 용액에 잔탄 하이드라이드(31.1g, 207 m㏖, 1.10 eq)를 25℃에서 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. HPLC는 반응이 완결된 것을 나타내었다.
상기 용액에 빙수에서 0℃까지 냉각시켰다. 반응 혼합물에 0℃에서 CySH(24.1g, 207 m㏖, 25.4㎖, 1.10 eq)를 첨가하였다. 이 반응 혼합물에 0℃에서 TFA(215g, 1.88 ㏖, 140㎖, 10.0 eq)를 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 2시간 동안 교반하였다. HPLC는 반응이 완결된 것을 나타내었다. 혼합물의 색은 탁한 황색에서 적색으로 변하였다.
반응 혼합물에 Na2CO3 용액(254g, 3.4ℓ 물 중 Na2CO3)을 서서히 첨가하였다(반응 용액의 범핑을 피하기 위하여 CO2 방출 속도를 주시하였다). 중화 공정을 약 1시간에 행하고, 이어서 반응 혼합물 중의 모든 용매를 회전증발농축기에 의해 제거하여 조질의 생성물의 유백색 물 현탁액을 제공하였다.
두 반응물을 여기서 합하여, 조질의 생성물의 얻어진 수용액을 7.5ℓ MeCN으로 희석시키고(MeCN의 첨가는 조질의 생성물의 케이크를 용해시킬 수 있음), TBME/헵탄(3×3.4ℓ, v/v, 1:4)으로 3회 추출하여 비극성 불순물(예컨대, CySH 및 DMTrSCy 등)을 제거하였다. 수층 분획을 3.0ℓ 둥근-바닥 플라스크에 수집하고, 회전증발농축기에 의해 감압을 인가해서 모든 MeCN을 제거하여 조질의 생성물의 황색-겔 케이크를 가진 수용액을 재차 제공하였다.
조질의 생성물의 수용액을 EtOAc/TBME의 혼합 용매(v/v = 1:3, 5.1ℓ)로 희석시키고(용액 중 겔 고체를 남겨두지 않는 것을 확실하게 함), 두 층을 분리시켰다. 유기층을 DI수 3회(3×2.5ℓ), 염수(2.5ℓ)로 세척하고, 무수 MgSO4(대략 500g)로 건조시키고, 건조 상태로 응축시켜 조질의 생성물의 황색 발포물을 수득하였으며, 이것은 추가의 처리 없이 다음 단계에 직접 사용하였다. 화합물 3-3(420g, 330 m㏖, 88.5% 수율, 76.0% 순도)을 밝은 황색 고체로서 얻었다.
화합물 3-4의 제조를 위한 일반 절차
Figure pct00276
화합물 3-3(200g, 208 m㏖, 1.00 eq) 및 dT 아미다이트(186g, 250 m㏖, 1.20 eq)를 3ℓ 1구 둥근 병에 Ar2 하에 ACN(1.0ℓ×3)과 공증발시켰다. ACN(525㎖) 및 DCM(525㎖) 중 상기 용액에 분자체 3A(52.0g)를 25℃에서 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 1시간 동안 교반하였다. ETT(40.8g, 313 m㏖, 1.50 eq)를 25℃에서 첨가하였다. 얻어진 혼합물을 25℃에서 30분 동안 교반하였다. 아세토나이트릴 및 DCM이 둘 다 갓 재용해된 것에 유의해야 한다. HPLC는 화합물 3-3이 완전히 소비된 것을 나타내었다.
상기 용액에 잔탄 하이드라이드(34.5g, 229 m㏖, 1.10 eq)를 25℃에서 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. HPLC는 반응이 완결된 것을 나타내었다.
상기 용액을 빙수에 0℃까지 냉각시켰다. 상기 반응 혼합물에 0℃에서 10분 동안 CySH(26.7g, 229 m㏖, 28.1㎖, 1.10 eq)를 첨가하였다. 반응 혼합물에 0℃에서 TFA(238g, 2.09 ㏖, 154㎖, 10.0 eq)를 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 2시간 동안 교반하였다. HPLC는 반응이 완결된 것을 나타내었다. 혼합물의 색은 탁한 황색에서 적색으로 변한 것에 유의해야 한다.
반응 혼합물에 Na2CO3 용액(156g, 2100㎖ 물 중 Na2CO3)을 서서히 첨가하였다(반응 용액의 범핑을 피하기 위하여 CO2 방출 속도를 주시하였다). 중화 공정은 약 1시간에 행해졌고, 이어서 반응 혼합물의 용매를 모두 회전증발농축기에 의해 제거하여 조질의 생성물의 유백색 물 현탁액을 제공하였다.
조질의 생성물을 EtOAc/TBME(v/v 1:2, 6400㎖)의 혼합 용매에 용해시키고, 두 층을 분리시켰다. 유기층을 물(3×3200㎖), 염수(3200㎖)로 세척하고, 무수 MgSO4(대략 520g)로 건조시키고, 여과시키고, 진공 중 농축시켰다.
두 반응물을 여기서 합하여, 조질의 생성물을 DCM(1.0ℓ×2)에 용해시키고, 1000㎖ 분리 깔때기에 장입하였다. TBME/헵탄(v/v = 9:1, 21ℓ)의 용매에 깔때기로부터 조질의 생성물의 용액을 서서히 첨가하여 석출 공정을 수행하였다. 이 공정은 약 3시간 걸렸다. 순수한 생성물을 부흐너 깔때기로 백색 고체로서 수집하였고, 생성물의 케이크를 헵탄(800㎖×2)의 용매 혼합물로 세척하고, 건조 상태로 농축시켰다. 화합물 3-4(301g, 216 m㏖, 51.8% 수율, 95.8% 순도)를 밝은 황색 고체로서 얻었다. HPLC는 화합물 2-4를 나타낸다: RT = 6.778분.
3-5(UTTC 4량체)의 제조를 위한 일반 절차
Figure pct00277
화합물 3-4(200g, 150 m㏖, 1.00 eq) 및 MOE U 아미다이트(129g, 157.85 m㏖, 1.05 eq)를 CH3CN(500㎖×3)과 공증발시켰다. 무수 CH3CN(800㎖) 중 화합물 3-4(200g, 150 m㏖, 1.00 eq) 및 MOE U 아미다이트(129g, 157 m㏖, 1.05 eq)의 용액에 분자체(MS) 3Å(40.0g, 150 m㏖, 1.00 eq)을 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 혼합 반응물에 25℃에서 Py-TFA(1.00M, 225㎖, 1.50 eq)를 첨가하였다. 얻어진 혼합물을 25℃에서 30분 동안 교반하였다. 아세토나이트릴 및 DCM이 둘 다 갓 재증류된 것에 유의해야 한다. HPLC는 화합물 2-4가 완전히 소비된 것을 나타내었다. MOE U 아미다이트가 하기임에 유의해야 한다:
Figure pct00278
상기 용액에 DDTT(33.9g, 165 m㏖, 1.10 eq)를 25℃에서 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. 이어서, 이 혼합물을 빙욕에서 30분 동안 0℃까지 냉각시켰다. HPLC는 반응이 완결된 것을 나타내었다. 이 혼합물이 탁한 황색에서 황색 균질 용액으로 변한 것에 유의해야 한다.
동시에, 1ℓ 3-구 둥근 바닥 플라스크에 이미다졸(204g, 3.01 ㏖, 20.0 eq) 및 무수 THF(400㎖)를 주입하고, 빙욕에 30분 동안 놓았다. HF(43.0g, 1.50 ㏖, 39.1㎖, 70.0% 순도, 10.0 eq)를 서서히 첨가하고, 이어서 더욱 15분 동안 교반하였다. 이 혼합물을 상기 현탁액에 0℃에서 1시간 동안 첨가하였다. 이 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 교반하였다. HPLC는 반응이 완결된 것을 나타내었다.
이 반응 혼합물을 EtOAc(5.2ℓ)에 용해시켰다. 유기층을 포화 수성 NaHCO3(3.6ℓ×2), 물(2.6ℓ×3), 염수(2.6ℓ)로 세척하고, 무수 MgSO4(대략 440g)로 건조시키고, 여과시키고, 진공 중 농축시켰다. 이 공정에서, 황색 겔 고체가 석출되지 않았음에 유의한다.
조질의 생성물을 DCM(2.0ℓ)에 용해시키고, 1ℓ 분리 깔때기에 장입하였다. TBME(17.6ℓ)의 용매 혼합물에 깔때기로부터 조질의 생성물의 용액을 서서히 첨가하여 석출 공정을 수행하였다. 이 공정은 약 30분 걸렸다. 순수한 생성물을 부흐너 깔때기로 백색 고체로서 수집하고, 생성물의 케이크를 TBME(500㎖×2)의 용매 혼합물로 세척하고, 건조 상태로 농축시켰다. 화합물 3-5(UTTC 4량체)(258g, 134 m㏖, 89.0% 수율, 95.6% 순도)를 밝은 황색 고체로서 얻었다. 화합물 UTTC 4량체(3-5)에 대한 HPLC-MS는 도 3에 도시되어 있다.
화합물 3-5에 대한 HPLC-MS 방법:
Figure pct00279
칼럼: ACQUITY UPLC BEH Shield RP18 칼럼, 130Å, 1.7㎛, 2.1㎜×150㎜;
Figure pct00280
칼럼 온도: 60℃;
Figure pct00281
MS 분석은 60k 분해능 및 300 내지 2000의 질량 범위를 가진 Thermo Orbitrap Fusion 상에서 행하였다;
Figure pct00282
MS 극성: 양성;
Figure pct00283
이동상 A: ACN:물=25:75 중 20mM 아세트산암모늄; 이동상 B: 아세토나이트릴;
Figure pct00284
구배:
Figure pct00285
3. 5' DMT-MOE CCGU-OH(단편 4)의 합성
화합물 4-2의 제조를 위한 일반 절차
Figure pct00286
DCM(1600㎖) 중 화합물 4-1(200g, 323 m㏖)의 용액에 이미다졸(66.0g, 969 m㏖) 및 TBDPSCl(115g, 420 m㏖, 107㎖)을 25℃에서 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 12시간 동안 교반하였다. TLC(석유 에터/에틸 아세테이트 = 1/1, Rf = 0.63분)는 보다 낮은 극성을 가진 하나의 주된 새로운 반점과 함께 화합물 4-1을 나타내었다. 이 혼합물에 프로판-2-올(19.4g, 323 m㏖, 24.7㎖)을 첨가하고, 25℃에서 0.5시간 동안 교반하였다.
최종 단계의 용액에 CySH(48.8g, 420 m㏖) 및 TFA(184g, 1.62 ㏖)에 0℃에서 적가하였다. 이 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 교반하였다. TLC(석유 에터/에틸 아세테이트 = 1/1, Rf = 0.50)는 반응이 완결된 것을 나타내었다. 반응 혼합물을 25℃에서 Na2CO3 용액(185g, 1600㎖ DI H2O)의 첨가에 의해 ??칭시키고, 이어서 TBME(500㎖)로 희석시키고, 두 층을 분리시켰다. 합한 유기층을 염수(500㎖)로 세척하고, MgSO4 위에서 건조시키고, 여과시키고, 감압 하에 농축시켜 잔사를 제공하였다. 조질의 생성물인 화합물 4-2를 ACN(2000㎖) 및 DI H2O(300㎖)에 용해시키고, 헵탄/TBME(4/1, 8ℓ, 1.6ℓ×5)로 추출하였다. ACN층을 DCM(3.2ℓ)로 희석시키고, 물을 분리시키고, 건조 MgSO4 위에서 건조시키고, 여과시키고, 감압 하에 농축시켜 잔사를 제공하였다. 화합물 4-2(176g, 98.1% 수율, 95.8% 순도)를 백색 발포물로서 얻었다. 1 H NMR: 400 MHz DMSO: 11.30 (s, 1H), 7.69 (m, J = 6.4 Hz, 3H), 7.61 (dd, J = 7.73, 1.47 Hz, 2H), 7.44 (m, 6H), 5.97 (d, J = 5.87 Hz, 1H), 5.12 (t, J = 4.89, 4.89 Hz, 1H), 4.31 (m, 1H), 3.9 (q, J = 2.8, 2.8, 2.8 Hz, 1H), 3.76 (t, J = 5.38, 5.38 Hz, 1H), 3.46 (m, 2H), 3.28 (m, 2H), 3.21 (ddd, J = 12.23, 4.4, 3.13 Hz， 1H), 3.14 (s, 3H), 1.73 (s, 3H), 1.05 (s, 9H)
화합물 4-4의 제조를 위한 일반 절차
Figure pct00287
화합물 4-3(164g, 179 m㏖) 및 화합물 4-2(90.5g, 163 m㏖)을 3000㎖ 1구 둥근 병에 Ar2 하에 ACN(450㎖×3)과 공증발시키고, 3Å 분자체(10.0g)를 이 1구 병에 첨가하고, Ar2 압력 하에 ACN(1000㎖)을 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 1시간 동안 교반하고, 이어서 이 혼합물에 DCI(28.9g, 244 m㏖)를 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. HPLC는 출발 물질이 완전히 소비된 것을 나타내었다.
커플링 반응의 완결 후, 이 혼합물에 DDTT(37.7g, 183 m㏖)를 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 25℃에서 0.5시간 동안 교반하고, 이어서 이 혼합물에 DI H2O(0.12㎖), PPh3(4.38g, 16.7 m㏖)를 첨가하고, 이 혼합물을 25℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. HPLC는 출발 물질이 완전히 소비된 것을 나타내었다.
ACN의 대부분을 회전증발농축기에 의해 제거하고, 이어서 반응물을 tBuOMe/EtOAc(3/1, 1500㎖)로 희석시켰다. 황색 고체가 석출되었다. 여과하고, 여과액을 DI H2O(1000㎖×2), 염수(600㎖×2)로 세척하였다. 유기층을 건조시키고, 건조 상태로 농축시켰다. 화합물 4-4(233.8g, 조질물, 80.1% 순도)를 밝은 황색 고체로서 얻었으며, 이를 추가의 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다.
화합물 4-5의 제조를 위한 일반 절차
Figure pct00288
화합물 4-4(234g, 167 m㏖)를 무수 DCM(1600㎖)에 용해시키고, 이어서 0℃에서 TCA(81.8g, 501 m㏖) 및 CySH(29.1g, 250 m㏖)를 첨가하였다. 이 혼합물을 0℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. HPLC는 출발 물질이 완전히 소비된 것을 나타내었다.
NaHCO3/H2O(1200㎖ DI H2O 중 84.0g NaHCO3)를 서서히 첨가함으로써 반응을 ??칭시켰다. 이 혼합물을 10분 동안 격렬하게 교반하고, 두 층을 분리시켰다. H2O층을 DCM(600㎖)으로 추출하고, 합한 유기층을 건조시키고, 건조 상태로 응축시켰다. 이 혼합물을 CH3CN/DI H2O(2/1, 1200㎖)에 재용해시키고, CH3CN/H2O층을 헵탄/tBuOMe(4/1, 1000㎖×5)에 의해 세척하였다. CH3CN의 대부분을 회전증발농축기에 의해 제거하고, 이어서 혼합물을 tBuOMe/EtOAc(2/1, 1500㎖)로 희석시키고, 이 혼합물을 NaHCO3/H2O(1000㎖×2, DCI 제거)로 세척하고, 염수(600㎖ x2)로 세척하였다. 유기층을 MgSO4로 건조시키고, 여과시키고, 건조 상태로 농축시켰다. 조질의 생성물은 추가의 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다. 조질의 생성물인 화합물 4-5(180g, 98.2% 수율, 94.6% 순도)를 밝은 황색 고체로서 얻었으며, 이를 추가의 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다.
화합물 4-7의 제조를 위한 일반 절차
Figure pct00289
화합물 4-5(115g, 104 m㏖) 및 화합물 4-6(106g, 115 m㏖)을 2000㎖ 1구 둥근 병에 Ar2 하에 ACN(500㎖ x3)과 공증발시키고, 이 1구 병에 3Å 분자체(45.0g)를 첨가하고, Ar2 압력 하에 ACN(1050㎖)을 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 1시간 동안 교반하고, 이어서 이 혼합물에 DCI(18.6g, 157 m㏖)를 첨가하였다. HPLC는 출발 물질이 완전히 소비된 것을 나타내었다.
커플링 반응이 완료된 후에, 반응 혼합물에 tBuOOH(5.5M, 38.1㎖) 및 H2O(10㎖)를 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 25℃에서 30분 동안 교반하였다. HPLC는 출발 물질이 완전히 소비된 것을 나타내었다.
산화의 완결 후, 이 반응 혼합물을 빙수욕에서 0℃까지 5분 동안 냉각시키고, 이 혼합물에 상업적 등급 I2 산화 용액(피리딘/H2O, v/v 9:1 중 628.87㎖ 0.05M)을 20분 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 0℃에서 추가로 5분 동안 교반하였다. HPLC는 출발 물질이 완전히 소비된 것을 나타내었다.
이 반응 혼합물을 Na2S2O3/H2O 용액(2300㎖ H2O 중 Na2S2O3 33.1g)에 서서히 붓고, 이 용액을 10분 동안 격렬하게 교반하였다. 이어서, 이 혼합물을 3000㎖의 EtOAc/tBuOMe(1/3)의 혼합 용매로 희석시켰다. 유기층을 분리시키고, NaHCO3/H2O(2000㎖), 염수(1000㎖)로 세척하였다. 유기층을 건조시키고, 건조 상태로 농축시켰다. 조질의 생성물을 DCM/tBuOMe(1/1, 460㎖)에 재용해시켰다. 조질의 용매를 헵탄/tBuOMe(2/1, 2300㎖)의 용매 혼합물에 서서히 적가하였다. 목적하는 생성물이 석출되었다. 여과 후에 생성물을 밝은-황색 고체로서 수집하고, 고체 케이크를 헵탄/tBuOMe(1/1, 230㎖×2)로 세척하였다. 화합물 7(217g, 조질물, 87.6% 순도)을 밝은 황색 고체로서 얻었으며, 이를 추가의 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다.
화합물 4-8의 제조를 위한 일반 절차
Figure pct00290
화합물 4-7(204g, 104 m㏖)을 무수 DCM(2000㎖)에 용해시키고, 이어서 0℃에서 DCA(67.5g, 524 m㏖) 및 CySH(18.2g, 157 m㏖)를 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃까지 가온시키고, 2시간 동안 교반하였다. HPLC는 출발 물질이 완전히 소비된 것을 나타내었다.
Na2CO3/H2O(1200㎖ DI H2O 중 77.4g Na2CO3)를 서서히 첨가함으로써 반응을 ??칭시켰다. 이 혼합물을 10분 동안 격렬하게 교반하고, 두 층을 분리시켰다. H2O층을 DCM(600㎖)으로 추출하고, 합한 유기층을 건조시키고, 건조 상태로 응축시켰다. 이 혼합물을 CH3CN/H2O(2/1, 900㎖)에 재용해시키고, CH3CN/H2O층을 헵탄/tBuOMe = (4/1, 800㎖×5)에 의해 세척하였다. CN3CN의 대부분을 회전증발농축기에 의해 제거하고, 이어서 이 혼합물을 tBuOMe/EtOAc(1/3, 1800㎖)로 희석시키고, 이 혼합물을 NaHCO3/H2O(900㎖×2), 염수(600㎖)로 세척하였다. 유기층을 건조시키고, 건조 상태로 농축시켰다. 조질의 생성물은 추가의 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다. 화합물 4-8(130g, 75.3% 수율, 92.4% 순도)을 밝은 황색 고체로서 얻었으며, 이를 추가의 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다.
5' DMT-MOE CCGU-OH의 제조를 위한 일반 절차
Figure pct00291
화합물 4-8(153g, 92.8 m㏖) 및 화합물 4-6(89.9g, 97.5 m㏖)을 3000㎖ 1구 둥근 병에 Ar2 하에 ACN(400㎖×3)과 공증발시키고, 이 1구 병에 3A 분자체(45.0g)를 첨가하고, Ar2 압력 하에 ACN(928㎖)을 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 1시간 동안 교반하고, 이어서 이 혼합물에 Py-TFA(1M, 139㎖)를 첨가하였다. HPLC는 출발 물질이 완전히 소비된 것을 나타내었다.
커플링 반응이 완결된 후에, 이 혼합물에 DDTT(20.0g, 97.5 m㏖)를 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 25℃에서 0.5시간 동안 교반하고, 탁한 황색에서 황색의 균질한 용액으로 변하였는데, 이것은 반응이 완결된 것을 시사하였으며, 이어서 빙욕에서 30분 동안 0℃까지 냉각시켰다.
동시에, 500㎖ 둥근 바닥 플라스크에 이미다졸(127g, 1.87 ㏖) 및 무수 THF(232㎖)를 주입하고, 30분 동안 빙욕에 배치하였다. HF-Py(24.3㎖, 70.0% 순도)를 서서히 첨가하고 이어서 더욱 15분 동안 교반하였다(이 단계에서 균질한 용액이 얻어졌다). 마지막 단계로부터의 용액을 연동 펌프(1㎖/5분 적가 속도)에 의해 반응 혼합물에 서서히 첨가하고, 0℃에서 1 내지 2시간 동안 교반하였다. 반응의 완결은 HPLC에 의해 모니터링할 수 있다. HPLC는 출발 물질이 완전히 소비된 것을 나타내었다. 이 혼합물을 EA(4500㎖)로 희석시키고, NaHCO3/H2O(2500㎖)로 0℃에서 서서히 중화시켰다. 유기층을 분리시키고 NaHCO3/H2O(2500㎖), 염수(2000㎖)로 세척하였다. 유기층을 건조시키고, 건조 상태로 농축시켰다. 조질물을 DCM(600㎖)에 재용해시켰다. 조질의 용매를 tBuOMe(6000㎖)의 용매에 서서히 적가하였다. 목적하는 생성물이 석출되었다. 생성물을 여과 후에 밝은 황새 고체로서 수집하고 고체 케이크를 tBuOMe(600㎖×2)로 세척하였다. 4-9(5' DMT-MOE CCGU-OH)(190g, 90.5% 수율, 94.8% 순도)를 밝은 황색 고체로서 얻었다. MOE-CCGU 4량체(4-9)에 대한 HPLC-MS는 도 4에 도시되어 있다.
화합물 4-9에 대한 HPLC-MS 방법:
Figure pct00292
칼럼: ACQUITY UPLC BEH Shield RP18 칼럼, 130Å, 1.7㎛, 2.1㎜×150㎜;
Figure pct00293
칼럼 온도: 60℃;
Figure pct00294
MS 분석은 60k 분해능 및 400 내지 2000의 질량 범위를 가진 Thermo Orbitrap Fusion 상에서 행하였다;
Figure pct00295
MS 극성: 양성
Figure pct00296
이동상 A: ACN:물=25:75 중 20mM 아세트산암모늄; 이동상 B: 아세토나이트릴;
Figure pct00297
구배:
Figure pct00298
C. 표적 올리고뉴클레오타이드의 수렴형 합성
화합물 5-1 의 제조를 위한 일반 절차
Figure pct00299
THF(400㎖) 중 아미다이트 시약(63.9g, 212 m㏖, 67.3㎖, 5.0 eq) 및 화합물 2-9(100g, 42.4 m㏖, 1.0 eq)의 용액에 Py-TFA(24.5g, 127 m㏖, 15.9㎖, 3.0 eq)를 0℃에서 첨가하였다. 이 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 교반하였다. HPLC는 화합물 2-9가 완전히 소비된 것을 나타내었다.
이 반응 혼합물(DCM 세척액 용적과 합한 후 대략 20㎖)을 500㎖ 분리 깔때기로 옮겼다. 용매 TBME/py(v/v 100: 0.7, 15ℓ)에 깔때기로부터 조질의 생성물의 용액을 서서히 적가하여 석출 공정을 수행하였다. 이 공정은 약 90분 걸렸다. 순수한 생성물을 이전의 단계로부터 회백색 고체로서 수집하고, 생성물의 케이크를 순수한 TBME(1.0ℓ×3)로 세척하고, 진공 건조시켰다. 화합물 5-1(106g, 90.8% 수율, 93% 순도)을 백색 고체로서 얻었다. 무수 THF가 사용된 것에 유의하자. 화합물 2-9 및 Py-TFA를 THF와 3회 공증발시켰다. 아미다이트 생성물의 가수분해를 최소화하기 위하여 피리딘을 첨가하여 염기성 환경을 유지시켰다.
화합물 5-2의 제조를 위한 일반 절차
Figure pct00300
DCM/ACN =2/1(900㎖) 중 화합물 5-1(122g, 48.0 m㏖, 1.5 eq), 3Å 분자체(45.0g) 및 화합물 1-7(115g, 32.0 m㏖, 1.0 eq)에 DCI(9.46g, 80.08 m㏖, 2.5 eq)를 첨가하였다. 이 혼합물을 10℃에서 1시간 동안 교반하였다.
반응을 TLC(60분 완전 전환)에 의해 모니터링하였다. 커플링 반응이 완결된 후에, 이 혼합물에 DDTT(9.87g, 48.05 m㏖, 1.5 eq)를 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 10℃에서 30분 동안 교반하였다. 이 반응 혼합물을 여과시키고, 여과액을 1/2 용적으로 농축시켰다, 잔류 용액을 ACN(5.0ℓ)에 첨가하였다. 생성물이 석출되었다. 여과시키고 필터 케이크를 수집하였다. 필터 케이크를 ACN(1ℓ)으로 세척하고, 진공 하에 건조시켰다. 화합물 5-2(194g, 99.6% 수율)를 밝은 황색 고체로서 얻었다. 아세토나이트릴과 DCM이 둘 다 갖 재증발된 것에 유의해야 한다. 화합물 5-1 및 화합물 1-7을 DCM/ACN과 3회 공증발시켰다.
화합물 5-2의 HPLC 및 LC-MS 분석을 위하여, 이하에 개시된 화합물 1 암모니아분해에 대해서 사용한 것과 유사한 암모니아분해(NH3/H2O) 절차를 이용해서 탈보호하여 5-2-a(DMTrO-TsTsAsCsCsAsCoCsCsU-OH)를 얻었다. 화합물 5-2-a의 HPLC 및 LC-MS는 도 5에 도시되어 있다.
화합물 5-3의 제조를 위한 일반 절차
Figure pct00301
화합물 5-2(194g, 31.9 m㏖, 1.0 eq) 및 3Å 분자체(65.0g)를 둥근 플라스크에 첨가하고, Ar 압력 하에 무수 DCM(1.3ℓ)을 첨가하였다. 이 혼합물을 15℃에서 1시간 동안 교반하고, 이어서 이 혼합물에 0℃에서 CySH(7.42g, 63.8 m㏖, 7.81㎖, 2.0 eq) 및 TCA(52.1g, 319 m㏖, 32.1㎖, 10.0 eq)를 첨가하였다.
이 반응물을 0℃에서 90분 동안 교반하고(TLC에 의해 반응을 체크), 이어서 이 혼합물에 Py(30.2g, 382 m㏖, 30.9㎖, 12.0 eq)를 첨가하였다. 이 혼합물을 15℃에서 5분 동안 교반하였다. 3A 분자체를 여과에 의해 제거하였다. DCM 용매를 CH3CN(7.0ℓ)에 서서히 첨가하고, 밝은 황색 고체가 석출되었다. DCM의 대부분을 회전증발농축기에 의해 제거하고, 백색 석출물을 수집하고, CH3CN(500㎖×3)으로 세척하였다. 화합물 5-3(180g, 97.6% 수율)을 밝은 황색 고체로서 얻었다. DCM이 갓 재증류된 것에 유의하자. 화합물 5-2를 DCM과 3회 공증발시켰다. 생성물은 DCM 중 양호한 가용성(dissolvability)을 가지는데, 여과 전에 대부분의 DCM을 제거하는 것이 중요하다. 화합물 5-3의 HPLC 및 LC-MS 분석을 위하여, 이하에 개시된 화합물 1 암모니아분해에 대해서 사용한 것과 유사한 암모니아분해(NH3/H2O) 절차를 이용해서 탈보호하여 5-3-a(HO-TsTsAsCsCsAsCoCsCsU-OH)를 얻었다. 화합물 5-3-a의 HPLC 및 LC-MS는 도 6에 도시되어 있다.
5-3-a에 대한 HPLC-MS 방법
Figure pct00302
칼럼: ACQUITY UPLC BEH C18 칼럼, 1.7㎛, 2.1㎜×50㎜;
Figure pct00303
칼럼 온도: 50℃;
Figure pct00304
이온화 방식: API-ES;
Figure pct00305
1350 내지 2300의 질량 범위;
Figure pct00306
MS 극성: 음성;
Figure pct00307
이동상 A: 10% CH3CN 중 5mM TBuAA, 1 μM EDTA; 용액 B: 80% CH3CN 중 5mM TBuAA, 1μM EDTA;
Figure pct00308
구배
Figure pct00309
화합물 5-4의 제조를 위한 일반 절차
Figure pct00310
화합물 3-5(102g, 55.3 m㏖, 1.0 eq)를 THF(300㎖×3)와 공증발시켰다. Py-TFA(32.0g, 166 m㏖, 3.0 eq)를 THF(300㎖×3)와 공증발시켰다. 2000㎖ 둥근 바닥 플라스크에, 화합물 3-5(102g, 55.3 m㏖, 1.0 eq) 및 아미다이트 시약(83.4g, 276 m㏖, 87.9㎖, 5.0 eq)를 무수 THF(400㎖)에 첨가하고, 빙욕에서 0℃까지 30분 동안 냉각시켰다. 활성제 Py-TFA(32.0g, 166 m㏖, 3.0 eq)를 첨가하고, 이어서 이 반응 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 교반하였다. HPLC는 출발 물질이 완전히 소비된 것을 나타내었다.
용매 TBME/헵탄/Py(95/5/1, 15.8ℓ)에 깔때기로부터 조질의 생성물의 용액을 서서히 적가하여 석출 공정을 수행하였다. 이 공정은 약 30분 걸렸다. 순수한 생성물을 이전의 단계로부터 회백색 고체로서 수집하고, 생성물의 케이크를 순수한 TBME(500㎖×3)로 세척하고, 고진공으로 3시간 동안 건조시켰다.
화합물 5-4(107g, 52.4 m㏖, 94.6% 수율)를 백색 고체로서 얻었다. THF는 무수였고, 화합물 3-5 및 Py-TFA를 무수 THF와 3회 공증발시킨 것에 유의해야 한다.
화합물 5-5의 제조를 위한 일반 절차
Figure pct00311
화합물 5-3(177g, 30.6 m㏖, 1.0 eq), 화합물 5-4(106g, 52.0 m㏖, 1.7 eq) 및 3Å 분자체(60g)를 둥근 플라스크에, Ar 압력 하에 무수 DCM(850㎖, H2O < 50 ppm)에 첨가하고, ACN(425㎖, H2O < 50 PPM)를 첨가하였다. 이 혼합물을 15℃에서 1시간 동안 교반하고, 이어서 이 혼합물에 DCI(9.05g, 76.6 m㏖, 2.5 eq)를 첨가하였다. 이 혼합물을 15℃에서 0.67시간 동안 교반하였다. TLC(DCM:MeOH = 10:1)는 화합물 5-3이 완전히 소비된 것을 나타내었다.
커플링 반응이 완료된 후에, 이 혼합물에 DDTT(10.7g, 52.0 m㏖, 1.7 eq)를 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 15℃에서 10분 동안 교반하였다.
3Å 분자체를 여과에 의해 제거하고, 이 반응물을 6000㎖ CH3CN로 희석시켰다(백색 고체가 석출된다). DCM을 회전증발농축기에 의해 제거하고, 백색 고체를 수집하고, CH3CN(500㎖×3)으로 세척하였다. 밝은 황색 고체를 어떠한 정제도 없이 다음 단계에 직접 사용하였다. 화합물 5-5(237g, 99.6% 수율)를 밝은 황색 고체로서 얻었다.
화합물 5-5의 HPLC 및 LC-MS 분석을 위하여, 이하에 개시된 화합물 1 암모니아분해에 대해서 사용한 것과 유사한 암모니아분해(NH3/H2O) 절차를 이용해서 탈보호하여 5-5-a(DMTrO-UsTsTsCsTsTsAsCsCsAsCoCsCsU-OH)를 얻었다. 화합물 5-5-a의 HPLC 및 LC-MS는 도 7에 도시되어 있다.
5-5-a에 대한 HPLC-MS 방법
Figure pct00312
칼럼: ACQUITY UPLC BEH C18 칼럼, 1.7㎛, 2.1㎜×50㎜;
Figure pct00313
칼럼 온도: 50℃;
Figure pct00314
이온화 방식: API-ES;
Figure pct00315
1350 내지 2300의 질량 범위;
Figure pct00316
MS 극성: 음성;
Figure pct00317
이동상 A: 10% CH3CN 중 5mM TBuAA, 1μM EDTA; 용액 B: 80% CH3CN 중 5mM TBuAA, 1μM EDTA;
Figure pct00318
구배:
Figure pct00319
화합물 5-6의 제조를 위한 일반 절차
Figure pct00320
화합물 5-5(234g, 30.2 m㏖, 1.0 eq) 및 3Å 분자체(12.5g)를 둥근 플라스크에 첨가하고, Ar 압력 하에 무수 DCM(1500㎖, H2O < 50 ppm)을 첨가하였다. 이 혼합물을 15℃에서 1시간 동안 교반하고, 이어서 이 혼합물에 CySH(10.5g, 90.5 m㏖, 11.1㎖, 3.0 eq) 및 TCA(59.2g, 362 m㏖, 12.0 eq)를 첨가하였다.
이 반응물을 0℃에서 60분 동안 교반하고(TLC에 의해 반응을 체크하고), 이어서 이 혼합물에 Py(35.8g, 452 m㏖, 36.5㎖, 15.0 eq)를 첨가하였다. 이 혼합물을 15℃에서 5분 동안 교반하였다.
3Å 분자체가 여과에 의해 제거하였다. DCM 용매를 CH3CN 10ℓ에 서서히 첨가하였다, 밝은 황색 고체가 석출되었다. DCM의 대부분을 회전증발농축기에 의해 제거하고, 백색 석출물을 수집하고, CH3CN(500㎖×3)으로 세척하였다. 화합물 5-6(210g, 93.3% 수율)을 밝은 황색 고체로서 얻었다.
화합물 5-6의 HPLC 및 LC-MS 분석을 위하여, 이하에 개시된 화합물 1 암모니아분해에 대해서 사용한 것과 유사한 암모니아분해(NH3/H2O) 절차를 이용해서 탈보호하여 5-6-a(HO-UsTsTsCsTsTsAsCsCsAsCoCsCsU-OH)를 얻었다. 화합물 5-6-a의 HPLC 및 LC-MS는 도 8에 도시되어 있다.
5-6-a에 대한 HPLC-MS 방법
Figure pct00321
칼럼: ACQUITY UPLC BEH C18 칼럼, 1.7㎛, 2.1㎜×50㎜;
Figure pct00322
칼럼 온도: 50℃;
Figure pct00323
이온화 방식: API-ES;
Figure pct00324
1350 내지 2300의 질량 범위;
Figure pct00325
MS 극성: 음성;
Figure pct00326
이동상 A: 10% CH3CN 중 5mM TBuAA, 1μM EDTA; 용액 B: 80% CH3CN 중 5mM TBuAA, 1μM EDTA;
Figure pct00327
구배:
Figure pct00328
화합물 5-7의 제조를 위한 일반 절차
Figure pct00329
2000㎖ 둥근 바닥 플라스크에, 화합물 4-9(130g, 57.8 m㏖, 1.0 eq), 아미다이트 시약(87.2g, 289 m㏖, 91.9㎖, 5.0 eq)을 무수 THF(520㎖)에 첨가하고, 빙욕에서 0℃까지 30분 동안 냉각시켰다. 활성제 Py-TFA(33.5g, 173 m㏖, 34.2㎖, 3.0 eq)를 첨가하고, 이어서 이 반응 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 교반하였다. HPLC는 출발 물질이 완전히 소비된 것을 나타내었다.
용매 TBME/헵탄/Py(95/5/1, 15850㎖)에 깔때기로부터 조질의 생성물의 용액을 서서히 첨가하여 석출 공정을 수행하였다. 이 공정은 약 30분 걸렸다. 순수한 생성물이 이전 단계로부터 회백색 고체로서 수집되었고, 생성물의 케이크를 순수한 TBME(500㎖×3)로 세척하고, 고진공 하에 3시간 동안 건조시켰다.
화합물 5-7(133g, 93.9% 수율)을 백색 고체로서 얻었다.
화합물 1, 완전 보호된 ASO 9의 제조를 위한 일반 절차
Figure pct00330
둥근 플라스크에서 화합물 5-6(242g, 32.5 m㏖, 1.0 eq), 화합물 5-7(135g, 55.2 m㏖, 1.7 eq) 및 3Å 분자체(80.0g)에 무수 DCM(1200㎖, H2O < 50 ppm) 및 ACN(600㎖, H2O < 50 PPM)을 Ar 압력 하에 첨가하였다. 이 혼합물을 15℃에서 1시간 동안 교반하고, 이어서 이 혼합물에 DCI(9.60g, 81.2 m㏖, 2.5 eq)를 첨가하였다. 이 혼합물을 15℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 완결은 TLC로 확인하였다.
커플링 반응이 완료된 후에, 이 혼합물에 DDTT(11.3g, 55.2 m㏖, 1.7 eq)를 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 15℃에서 10분 동안 교반하였다. 3Å 분자체를 여과에 의해 제거하고, 이 반응물을 10ℓ CH3CN으로 희석시켰다(밝은 황색 고체가 석출된다). DCM을 회전증발농축기에 의해 제거하고, 밝은 황색 고체를 수집하고, CH3CN(500㎖×3)으로 세척하였다. 화합물 1(264g, 82.8% 수율)을 밝은 황색 고체로서 얻었다.
화합물 1의 HPLC 및 LC-MS 분석, 이 화합물을 아래에 기재된 암모니아분해(NH3/H2O) 절차를 이용해서 탈보호하여 1-a(DMTrO-CsCoGsUsUsTsTsCsTsTsAsCsCsAsCoCsCsU-OH)를 얻었다. 화합물 1-a에 대한 HPLC 및 LC-MS는 도 9에 도시되어 있다.
1-a에 대한 HPLC-MS 방법
Figure pct00331
칼럼: ACQUITY UPLC BEH C18 칼럼, 1.7㎛, 2.1㎜×50㎜;
Figure pct00332
칼럼 온도: 50℃;
Figure pct00333
이온화 방식: API-ES;
Figure pct00334
1350 내지 2300의 질량 범위;
Figure pct00335
MS 극성: 음성;
Figure pct00336
이동상 A: 10% CH3CN 중 5mM TBuAA, 1μM EDTA; 용액 B: 80% CH3CN 중 5mM TBuAA, 1μM EDTA;
Figure pct00337
구배:
Figure pct00338
화합물 1, 완전 보호된 ASO 9의 탈보호 및 암모니아분해
Figure pct00339
1-ℓ 플라스크에 화합물 1(64g) 및 CH3CN:Et3N(640㎖, v/v)을 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 2시간 동안 교반하고, 이어서 용매를 Rotovap에 의해 제거하였다. 이 플라스크에 500㎖ NH4OH(대략 30% wt)를 첨가하고, 이 혼합물을 25℃에서 대략 30분 동안 교반하였다. 얻어진 용액을 1-ℓ 유리 압력 플라스크에 옮기고, 이 혼합물을 65℃까지 5시간 동안 가열하였다. 이 혼합물을 하류 정제를 위하여 주위 온도로 냉각시켰다.
ASO 9 정제 공정 :
암모니아분해(2ℓ)로부터의 DMT-on ASO 9를 1111mM 황산암모늄 용액(18L)으로 최종 황산암모늄 농도인 대략 1000mM로 희석시켰다. 이어서, 현탁액을 심층 필터를 통해서 여과시켰으며, 이것을 3 베드 용적의 용액(1000mM 황산암모늄, 50mM tris, pH 8.5)으로 습윤, 플러싱 및 평형화시켰다.
소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 단계에 대해서, 20cm 베드 높이(bed height: BH)×14㎝ 내부 직경(ID) HIC 칼럼을 4 칼럼 용적(CV)의 평형 완충액(1000mM 황산암모늄, 50mM tris, pH 8.5)으로 평형화하였다. 심층 필터로부터의 여과액을 칼럼에 장입하였다. 칼럼을 4 CV의 완충액(1000mM 황산암모늄, 50mM tris, pH 8.5)으로 세척하고, UV 게이트(2㎜ 플로우셀(flowcell))가 0.5 AU로 적중될 때까지 완충액(800mM 황산암모늄, 50mM tris, pH 8.5)으로 100cm/hr로 세척하였다. 일단 UV 게이트가 0.5 AU로 적중되면, 칼럼을 2 초과의 CV의 동일한 완충액(800mM 황산암모늄, 50mM tris, pH 8.5)으로 세척하였다. 세척 단계 동안, 유량은 100 cm/hr였다. 칼럼을 8 CV의 완충액(50mM 황산암모늄, 50mM tris, pH 8.5)으로 용리시켜 DMT-on ASO 9를 제공하였다. 칼럼을 4 CV의 탈이온수로 스트리핑하였다. 칼럼을 3 CV의 1N 수산화나트륨으로 세정하고, 0.1N 수산화나트륨에 저장하였다. 세척을 100cm/hr에서 가동시킨 것을 제외하고 HIC 공정은 200cm/hr에서 가동시켰다.
DMT-on ASO 9를 함유하는 HIC 용출액(대략 9ℓ)을 10℃까지 냉각시키고 25% (w/w) 시트르산의 용액(0.9ℓ)을 첨가하여 혼합물의 pH를 2.7로 만들었다. 이 혼합물을 10℃에서 4.5시간 동안 교반하고, 5N 수산화나트륨(0.8ℓ)를 첨가하여 pH 8.5를 만들었다. 이어서, 이 혼합물을 여과시켜 0.22㎛ 멸균 필터를 이용해서 DMT-OH 부산물을 제거하였다. 이어서, 여과액을 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제시켰다.
음이온 교환 크로마토그래피(AEX)를 위하여, 15cm BH×14cm ID AEX 칼럼에 2 CV의 고염완충 용액(2000mM 염화나트륨, 250mM tris, pH 8.5)을 주입하고, 4CV의 평형 완충 용액(100mM 염화나트륨, 50mM tris, pH 8.5)으로 평형화하였다. 탈트라이틸화 단계로부터의 여과액을 물로 대략 20 mS의 전도도로 희석시키고, 칼럼에 장입하였다. 칼럼을 UV 게이트(2mm 플로우셀)가 0.4 AU에 도달할 때까지 완충 용액(300mM 염화나트륨, 50mM tris, pH 8.5)으로 세척하였다. 칼럼을 4CV 초과의 동일한 완충액(300mM 염화나트륨, 50mM tris, pH 8.5)으로 계속해서 세척하였다. 칼럼을 7CV의 완충액(525mM 염화나트륨, 50mM tris, pH 8.5)으로 용리시켜 ASO 9 용액을 제공하였다. 이 칼럼을 4CV의 완충액(2000mM 염화나트륨, 250mM tris, pH 8.5)으로 스트리핑하고, 이어서 3CV의 1N 수산화나트륨으로 세정하고, 0.1N 수산화나트륨에 보관하였다. AEX 공정은 200cm/hr에서 가동시켰다. ASO 9에 대한 HPLC-MS는 도 12에 도시되어 있다.
실시예 2. 5' 말단에서 3'말단으로의 연장 전략(10-량체)을 사용한 ASO의 합성
1. 5' P 아미다이트단편(5-량체)의 일반적 합성
Figure pct00340
1-2A 및 포스포아미다이트에서 시작해서, 화합물 1-8a의 합성을 위하여 위에서 기재된 바와 같은 유사한 절차를 이용해서 화합물 2-2A를 98% 초과의 수율로 얻었다.
2. ASO 6-량체의 합성
Figure pct00341
단편 1-9의 합성에 대해서 위에서 기재된 바와 같은 유사한 절차에 이어서 4-9 합성의 단계 3에 기재된 탈실릴화 절차를 이용해서, 화합물 4-2A를 화합물 3-2A와 커플링시켜 98% 초과의 수율로 6-량체(화합물 5-2A)를 수득하였다. 탈실릴화 전의 ASO 6-량체의 질량 스펙트럼이 도 13에 도시되어 있다.
3. ASO 10-량체의 합성
Figure pct00342
단편 1-9의 합성에 대해서 위에서 기재된 바와 같은 유사한 절차를 이용해서, ASO 5-량체 6-2A를 5-량체 단편 2-2A와 커플링시켜 98% 초과의 수율로 ASO 10-량체를 수득하였다. ASO 10-량체의 질량 스펙트럼은 도 14에 도시되어 있다.
4. ASO 15-량체 5'-ACoAGATATTTTTGTT-3'-OH 의 수렴형 합성
Figure pct00343
위에서 기재된 바와 같은 유사한 절차를 이용해서 상기 반응식에 나타낸 수렴형 합성 방법에 기초하여 ASO 15-량체를 합성하였다. 수렴형 합성에 사용된 3개의 단편은 5'-LHPG-ACoAGA-3'-OH(단편 1); 5'-P-TATTT-3'-OTBDPS(단편 2); 및 5'-P-TTGTT-3'-OTBDPS(단편 3)이다.
1) 단편 1의 합성: 5'-LHPG-ACoAGA-3'-OH(1-3A)
Figure pct00344
단편 1(화합물 1-3A)은 위에서 기재된 바와 같은 유사한 절차를 이용해서 상기 반응식에 나타낸 바와 같이 합성하였다. 탈보호된 단편 1(화합물 1-3A-H)에 대한 질량 스펙트럼은 도 15에 도시되어 있다.
Figure pct00345
2) 단편 2의 합성: 5'-P-TATTT-3'-OTBDPS(화합물 2-3A )
단편 2는 2-2A 합성에 대해서 위에서 기재된 바와 같은 유사한 절차를 이용해서 합성하였다.
3) 단편 3의 합성: 5'-P-TTGTT-3'-OTBDPS(화합물 3-3A)
단편 3은 또한 2-2A 합성에 대해서 위에서 기재된 바와 같은 유사한 절차를 이용해서 합성하였다.
4) ASO 15-량체의 수렴형 합성:
ASO 15-량체는 본 명세서에 기재된 액상 수렴형 합성 방법을 이용해서 합성하였다. 단편 1과 단편 2를 커플링시키고 나서 황화시켜 화합물 4-3A를 형성하였다. 3'-TBDPS기를 제거하기 위하여 화합물 4-3A의 탈실릴화에 의해 화합물 5-3A를 수득하였고, 이것을 이어서 단편 3과 커플링시키고 나서, 황화시켜 ASO 15-량체 6-3A를 수득하였다. 4-3A 및 5-3A의 형성은 대응하는 탈보호된 생성물 4-3A-H 및 5-3A-H의 LC-MS 분석에 의해 확인하였고, 이것은 화합물 4-3A 또는 5-3A를 NH3/H2O로 처리함으로써 형성되었다. 화합물 4-3A-H 및 5-3A-H의 질량 스펙트럼은 도 16 및 도 17에 각각 도시되어 있다. 화합물 4-3A 및 5-3A의 암모니아분해 반응은 이하에 나타낸다:
Figure pct00346
Figure pct00347
5) ASO 15-량체 6-3A 의 탈보호 및 암모니아분해
Figure pct00348
DMT-on ASO 9 합성에 대해서 위에서 기재된 바와 같은 유사한 탈보호 및 암모니아분해 절차를 이용해서, NH4OH에 의한 ASO 15-량체 6-3A의 처리 결과 6a 및 6b의 혼합물을 얻었으며, 이것은 3'-말단에서의 TBDPS기의 부분적인 제거 및 5'-LHPG 보호기의 완전한 제거를 나타낸다(도 18 참조).
실시예 3: 5'OH 탈보호 동안의 탈아민화 연구:
UCC 삼량체 및 CC 이량체의 탈트라이틸화 연구
1. UCC 삼량체 탈아민화 연구:
UCC 삼량체의 탈트라이틸화는 최상의 조건을 발견하기 위하여 상이한 반응 조건 하에 연구되었고, 시약은 탈아민화 부반응을 최소화하기 위하여 필요로 되었다. 표 1은 상이한 반응 조건의 비교 및 이들 조건 하의 바람직하지 않은 탈아민화 생성물의 양을 나타낸다. 도 9에서 알 수 있는 바와 같이, 3Å 분자체 및 피리딘에 의한 반응 ??칭의 사용은 체 없는 7% 탈아민화 및 체 없고 피리딘 ??치 없는 10% 탈아민화와 비교해서 0.5% 초과의 탈아민화를 초래하였다.
Figure pct00349
Figure pct00350
2. CC 이량체 탈아민화 연구:
UCC 삼량체에 대해서 행해진 상기 연구와 유사하게, 탈트라이틸화는 탈아민화 반응을 최소화 또는 회피하기 위하여 각종 시약 및 조건으로 CC 이량체에 대해 수행되었다. 표 2 및 도 11에서 알 수 있는 바와 같이, DCA, 티올 및 3Å 분자체가 사용된 경우 물의 첨에 의해서도 실온에서 14시간 후에 탈아민화 생성물이 검출되지 않았다. 다른 한편, 분자체가 없고 물이 첨가되지 않은 경우 4.46% 탈아민화 생성물이 얻어졌고, 실온에서 14시간 동안 교반하면서 분자체가 없지만 물을 가진 49% 탈아민화 생성물이 얻어졌다.
Figure pct00351
Figure pct00352
3. 단편 합성으로부터의 탈트라이틸화의 탈아민화 연구 결과
(DMTO-ACCCU-OLHPG로부터의) 5-량체 MOE DMTO-ACoCCU-OH는 대략 10% 탈아민화 불순물을 함유하였다(Ia, Ib 및 Ic를 합하였고, 비는 결정되지 않았다) (반응식 A).
반응식 A. DMTO-ACCCU-OLHPG에서의 높은 수준의 탈아민화 불순물
Figure pct00353
이의 유사체인 HO-CCC-OTBDPS의 합성은 이어서 동일한 절차를 이용해서 완결되었고, 이 삼량체 생성물이 적어도 10%의 총 탈아민화 불순물을 함유한 것으로 발견되었다(반응식 B).
반응식 B: HO-CCC-OTBDPS에서의 높은 수준의 탈아민화 불순물
Figure pct00354
MOE 단편-LHPG (I): 상기 결과로, 5-량체 MOE DMTO-ACoCCU-OH는, 탈트라이틸화 동안 절차를 변형하여 반복하였다. 이 합성에서, 탈트라이틸화 반응마다 산을 첨가하기 전에 상기 용액을 3Å 분자체 위에서 건조시켰다. 탈아민화 부산물은 완전히 억제되었다(표 3).
Figure pct00355
Figure pct00356
실시예 4. ASO 8의 합성
5'-말단에 DMT기, 그리고 3'-말단에 LHPS기를 갖는 완전 보호된 ASO 8은, ASO 9에 대해서 실시예 1에 기재된 유사한 절차를 이용해서 제조하였다. 합성에 사용되는 올리고뉴클레오타이드 단편은 이하의 도식에 나타낸다.
1. 5+6+(4+5) 커플링을 통한 ASO 8의 합성
Figure pct00357
2.5+6+4+5 커플링을 통한 ASO 8의 합성
Figure pct00358
DMT-on ASO 8을 탈트라이틸화하고 ASO 9에 대해서 실시예 1의 것과 유사한 절차를 이용해서 정제하였다. ASO 8에 대한 HPLC-MS는 도 19에 도시되어 있다.
ASO 8에 대한 HPLC-MS 방법:
Figure pct00359
칼럼: ACQUITY UPLC BEH C18 칼럼, 1.7㎛, 2.1㎜×50㎜;
Figure pct00360
칼럼 온도: 50℃;
Figure pct00361
이온화 방식: API-ES;
Figure pct00362
1350 내지 2300의 질량 범위;
Figure pct00363
MS 극성: 음성;
Figure pct00364
이동상 A: 10% CH3CN 중 5mM TBuAA, 1μM EDTA; 용액 B: 80% CH3CN 중 5mM TBuAA, 1μM EDTA;
Figure pct00365
구배:
Figure pct00366
실시예 5. 탈실릴화 연구
불순물 형성을 최소화하기 위하여 3'-OTBDPS의 신규한 손쉬운, 가벼운, 깨끗한 탈보호 방법을 개발하였다. 이미다졸의 존재는 TBDPS 탈보호를 크게 가속시켰고 최소량의 불순물을 생성하는 것이 발견되었다. 이하에 기재된 비교 연구는, 공지된 조건을 이용한 탈실릴화가 다양한 부산물, 예컨대, N-2 및 다이올 부산물의 형성을 초래한 것을 나타낸다. 이와 대조적으로, 새로운 탈실릴화 방법은 이들 부산물의 상당한 저감을 초래한다.
a. 공지된 탈실릴화 조건을 이용한 CCGU 사량체의 탈실릴화:
Figure pct00367
250㎎의 CCGU 사량체를 20 eq.의 HF 및 30 eq.의 피리딘으로 0℃에서 7시간 동안 처리하였다. N-2 및 다이올 부산물을 관찰하였다. 기타 공지된 방법, 예컨대, TBAF 또는 CsF에 의한 탈실릴화 반응은 복합 혼합물을 초래하였다.
N-2 및 다이올 부산물의 존재는 최종 표적 올리고뉴클레오타이드의 순도에 상당히 영향을 미칠 수 있다.
b. HF/이미다졸 탈실릴화 조건 하에서의 CCGU 사량체의 탈실릴화:
Figure pct00368
위에서 기재된 공지된 조건으로 수행된 탈실릴화 반응과 대조적으로, HF/이미다졸에 의한 탈실릴화는 2시간에 탈실릴화 반응의 완결을 초래하였고 0.5% 미만의 다이올 및 N-2 부산물이 관찰되었다. 또한, 20 당량의 HF가 공지된 탈실릴화 조건으로 요구되던 것에 비해서, 출발 물질의 완전 전환을 달성하기 위하여 단지 5 당량의 HF가 요구되었다.
실시예 6. H 포스포네이트 화학을 통한 5'-DMT-GUUUUUGCAA-NO 2 -벤조일의 합성
Figure pct00369
SM 1(3.78g) 및 SM 2(2.64g)를 20㎖ CH3CN에 용해시켰다. 0℃에서, 이 혼합물에 피리딘 2.4㎖ 및 피발로일 클로라이드 0.62㎖를 서서히 첨가하였다. 0℃에서 40분 동안 교반 후, 이 혼합물에 I2/py(0.05M 40㎖)를 첨가하였다. 0℃에서 30분 동안 교반 후, 반응을 Na2S2O3/H2O 용액에 의해 ??칭시키고, 5'-DMT-GUUUUUGCAA-NO2-벤조일을 밝은 황색 고체로서 얻었다. 5'-DMT-GUUUUUGCAA-NO2-벤조일의 구조는 MS에 의해 확인되었다(도 20 참조).
실시예 7. 각종 PO/PS 연결부를 갖는 ASO 9 유사체의 수렴형 액상 합성의 가능성의 평가
HPLC 방법 (A).
칼럼: Xbridge Shield RP18 5㎛, 2.1㎜×50㎜ 칼럼.
칼럼 온도: 40℃;
이동상:
용액 A: 10mM NH4HCO3 수용액
용액 B: 100% 아세토나이트릴
구배:
Figure pct00370
HPLC 방법(B).
칼럼: Xbridge C18 3.5㎛, 4.6㎜×150㎜ 칼럼.
칼럼 온도: 40℃;
이동상:
용액 A: 10mM NH4HCO3 수용액
용액 B: 100% 아세토나이트릴
구배:
Figure pct00371
HPLC 방법(C).
칼럼: Xbridge Shield RP18 5㎛, 2.1㎜×50㎜ 칼럼.
칼럼 온도: 40℃;
이동상:
용액 A: 10mM NH4HCO3 수용액
용액 B: 100% 아세토나이트릴
구배:
Figure pct00372
HPLC-MS 방법(D).
칼럼: Xbridge Shield RP18 5㎛, 2.1㎜×50㎜ 칼럼.
칼럼 온도: 40℃;
100 내지 1000의 질량 범위;
MS 극성: 음성
이동상:
용액 A: 10mM NH4HCO3 수용액
용액 B: 100% 아세토나이트릴
구배:
Figure pct00373
HPLC-MS 방법(E).
칼럼: Luna C18 3.0㎛, 2.0㎜×30㎜ 칼럼.
칼럼 온도: 40℃;
100 내지 2000의 질량 범위;
MS 극성: 양성
이동상:
용액 A: 0.037% TFA(v/v) 수용액
용액 B: 0.018% TFA(v/v) 아세토나이트릴 용액.
구배:
Figure pct00374
HPLC-MS 방법(F).
칼럼: Xbridge Shield RP18 5㎛, 2.1㎜×50㎜ 칼럼.
칼럼 온도: 40℃;
100 내지 1000의 질량 범위;
MS 극성: 양성
이동상:
용액 A: 10mM NH4HCO3 수용액
용액 B: 100% 아세토나이트릴
구배:
Figure pct00375
아미다이트화합물 7-1-6a, 7-3-10a 및 7-4-8a에 대한 HPLC-MS 방법(G).
칼럼: ACQUITY UPLC BEH C18 1.7㎛, 2.1㎜×50㎜ 칼럼.
칼럼 온도: 50℃;
500 내지 2200의 질량 범위;
MS 극성: 음성
이동상:
용액 A: 10% CH3CN 중 5mM 트라이부틸아민 아세테이트(TBuAA), 1μM EDTA;
용액 B: 80% CH3CN 중 5mM TBuAA, 1μM EDTA
구배:
Figure pct00376
상이한 수의 P=O/S 연결부를 가진 ASO 9 유사체를 합성하였다.
Figure pct00377
A. 5' 단편의 제조
1. 5'-DMTr-CCGU-OH 또는 5'-OH-CCGU-TBDPS 4량체(단편 4)의 제조
화합물 7-1-2의 합성
Figure pct00378
DCM(85㎖) 중 화합물 7-1-1(8.50g, 13.7 m㏖, 1.00 eq) 및 이미다졸(4.68g, 68.7 m㏖, 5.00 eq)의 용액에 TBDPSCl(4.15g, 15.1 m㏖, 3.88㎖, 1.10 eq)을 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 16시간 동안 교반하였다. TLC(석유 에터:에틸 아세테이트 = 1:2, 생성물: Rf = 0.55)는 화합물 7-1-1이 완전히 소비되었고 하나의 새로운 반점이 형성된 것을 나타낸다. 반응물은 TLC에 따르면 투명하였다. 프로판-2-올(825㎎, 13.7 m㏖, 1.00 eq)을 첨가하고, 이 혼합물을 25℃에서 0.5시간 동안 교반하였다.
상기 용액에 0℃까지 냉각된 도데칸-1-티올(7.23g, 35.7 m㏖, 8.56㎖, 1.30 eq)을 첨가하고, 이어서 이 반응 혼합물에 0℃에서 TFA(25.0g, 219 m㏖, 16.2㎖, 8.00 eq)를 첨가하였다. 이 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 교반하였다. TLC(석유 에터:에틸 아세테이트 = 1:2, 생성물: Rf = 0.28)는 출발 물질이 완전히 소비되었고 하나의 새로운 반점이 형성된 것을 나타낸다. 반응물은 TLC에 따르면 투명하였다.
이 반응 혼합물을 NaHCO3(500㎖)의 첨가에 의해 ??칭시키고, 이어서 DCM(100㎖)으로 희석시키고, NaHCO3(200㎖)로 추출하였다. 합한 유기층을 염수 200㎖(100㎖×2)로 세척하고, MgSO4 위에서 건조시키고, 여과시키고, 감압 하에 농축시켜 잔사를 제공하였다. 조질의 생성물을 DCM(600㎖)에 용해시키고, 1000㎖ 분리 깔때기에 장입하였다.
조질의 생성물을 ACN 100㎖ 및 50㎖ DI수에 용해시키고, 이 혼합물을 헵탄:TBME = 4:1(120㎖×4)으로 추출하였다. (TLC는 생성물이 ACN 및 DI수에서 투명한 것을 나타내었다). 생성물은 ACN 및 물에 있었다. 이 혼합물을 TBME(100㎖)로 추출하고, 유기층을 건조시키고 건조 상태로 백색 고체로서 농축시켰다. 화합물 7-2(14.0g, 23.4 m㏖, 85.1% 수율, 92.7% 순도)를 백색 발포물로서 얻었다.
HPLC(방법 A): RT = 3.446분; LCMS(방법 F): RT = 1.371분; m/z: [M+H]+ = 화합물 7-1-2에 대해서 555.3.
화합물 7-1-3 의 합성
Figure pct00379
화합물 7-1-2(12.0g, 21.6 m㏖, 1.00 eq) 및 MOE G 아미다이트(21.7g, 23.8 m㏖, 1.10 eq)를 250㎖ 1구 둥근 병에 아르곤 하에 ACN(10㎖×3)과 공증발시키고, 3Å 분자체(3.00g)를 상기 1구 병에, 아르곤 압력 하에 ACN(60㎖)에 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 1시간 동안 교반하고, 이어서 이 혼합물에 DCI(3.83g, 32.4 m㏖, 1.50 eq)를 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 25℃에서 1시간 동안 교반하였다. TLC(다이클로로메탄:메탄올 = 15:1, 생성물: Rf = 0.39)는 화합물 7-1-2가 완전히 소비되었고 하나의 새로운 반점이 형성된 것을 나타낸다. 반응물은 TLC에 따르면 투명하였다. HPLC(생성물: RT = 7.199분; 출발 물질: RT = 5.194분)는 화합물 2가 완전히 소비된 것을 나타내었다.
상기 용액에 BuOOH(3.90g, 43.2 m㏖, 4.15㎖, 2.00 eq)를 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. HPLC(7-1-3, 생성물: RT = 6.869분; 출발 물질: RT = 7.199분)는 반응이 완결된 것을 나타내었다. 이 반응 혼합물을 NaHCO3 및 Na2SO3 용액(400㎖ DI수 중 10.0 eq NaHCO3 및 5.00 eq Na2SO3)에 붓고, 이어서 이 혼합물을 DCM(100㎖)으로 희석시키고, 두 층을 분리시키고, 유기층을 NaHCO3(200㎖), 염수(200㎖)로 세척하고, 건조시키고, 여과시키고, 농축시켰다. 화합물 7-1-3(32.0g, 18.9 m㏖, 87.6% 수율, 82.0% 순도)을 밝은 황색 발포물로서 얻었다.
HPLC(방법 A): RT = 6.868분; LCMS(방법 F): RT = 1.501, 1.520분; m/z: [M+H]+ = 화합물 7-1-3에 대해서 1383.5.
화합물 7-1-3a 의 제조를 위한 일반 절차
Figure pct00380
DCM(120㎖) 중 화합물 7-1-3(25.0g, 18.0 m㏖, 1.00 eq)에 도데칸-1-티올(4.75g, 23.4 m㏖, 5.63㎖, 1.30 eq)을 0℃에서 첨가하고, 이어서 반응 혼합물에 0℃에서 TFA(16.4g, 144 m㏖, 10.7㎖, 8.00 eq)를 첨가하였다. 이 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 교반하였다. TLC(다이클로로메탄:메탄올 = 10:1, 생성물: Rf = 0.24)는 화합물 7-1-3이 완전히 소비되었고 하나의 새로운 반점이 형성된 것을 나타낸다. 반응물은 TLC에 따르면 투명하였다.
이 반응 혼합물을 NaHCO3 용액(300㎖ DI수 중 10.0 eq NaHCO3)에 붓고, 이어서 이 혼합물을 DCM(100㎖)으로 희석시키고, 두 층을 분리시키고, 유기층을 NaHCO3(100㎖), 염수(100㎖)로 세척하고, 건조시키고, 여과시키고, 농축시켰다.
이 혼합물을 CH3CN:H2O(2:1, 70㎖)에 재용해시키고, CH3CN/H2O층을 헵탄:MTBE = 4:1(100㎖×4)로 세척하고, 이어서 CH3CN 및 H2O의 층을 EtOAc(100㎖)로 희석시키고, 유기층을 염수(100㎖)로 세척하고, 건조시키고, 여과시키고, 농축시켰다. 화합물 7-1-3a(17.0g, 15.0 m㏖, 83.3% 수율, 95.8% 순도)를 밝은 황색 발포물로서 얻었다.
HPLC(방법 A): RT = 6.778분; LCMS(방법 F): RT = 1.322분; m/z: [M+H]+ = 화합물 7-1-3a에 대해서 1081.4.
화합물 7-1-4의 합성
Figure pct00381
화합물 7-1-3a(17.0g, 15.7 m㏖, 1.00 eq) 및 MOE C 아미다이트(15.9g, 17.2 m㏖, 1.10 eq)를 250㎖ 1구 둥근 병에서 Ar하에 ACN(50㎖×3)과 공증발시키고, 이 1구 병에 3Å 분자체(4.00g)를 첨가하고, Ar 압력 하에 ACN(85㎖)을 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 1시간 동안 교반하고, 이어서 이 혼합물에 DCI(2.78g, 23.5 m㏖, 1.50 eq)을 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 25℃에서 1시간 동안 교반하였다. HPLC(생성물: RT = 7.932, 8.001분; 출발 물질: RT = 5.111, 5.169분)는 출발 물질이 완전히 소비된 것을 나타내었다.
상기 용액에 BuOOH(4.05g, 31.4 m㏖, 4.31㎖, 70.0% 순도, 2.00 eq)를 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. HPLC(7-1-4, 생성물: RT = 7.746, 7.832, 7.916분; 출발 물질: RT = 7.932, 8.001분)는 출발 물질이 완전히 소비된 것을 나타내었다.
이 반응 혼합물을 NaHCO3 및 Na2SO3 용액(400㎖ DI수 중 10.0 eq NaHCO3 및 5.00 eq Na2SO3)에 붓고, 이어서 이 혼합물을 EtOAc(100㎖)로 희석시키고, 두 층을 분리시키고, 유기층을 NaHCO3(200㎖), 염수(200㎖)로 세척하고, 건조시키고, 여과시키고, 농축시켰다. 화합물 7-1-4(33.4g, 12.7 m㏖, 81.3% 수율, 73.5% 순도)를 백색 고체로서 얻었다.
HPLC(방법 A): RT = 7.746, 7.832, 7.916분; LCMS(방법 F): RT = 1.603분; m/z: [M+H]+ = 화합물 7-1-4에 대해서 1917.7.
화합물 7-1-4a 의 합성
Figure pct00382
ACN(120㎖) 중 화합물 7-1-4(23.0g, 11.9 m㏖, 1.00 eq)에 도데칸-1-티올(3.15g, 15.5 m㏖, 3.73㎖, 1.30 eq)을 0℃에서 첨가하고, 이어서 이 반응 혼합물에 0℃에서 TFA(10.9g, 95.8 m㏖, 7.10㎖, 8.00 eq)를 첨가하였다. 이 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 교반하였다. TLC(다이클로로메탄:메탄올 = 7:1, 생성물: Rf = 0.40)는 화합물 7-1-4가 완전히 소비되었고 하나의 새로운 반점이 형성된 것을 나타낸다. 반응물은 TLC에 따르면 투명하였다.
이 반응 혼합물을 NaHCO3(400㎖ DI수 중 10.0 eq NaHCO3)에 붓고, 이어서 이 혼합물을 EtOAc(200㎖)로 희석시키고, 두 층을 분리시키고, 유기층을 수성 NaHCO3(150㎖), 염수(150㎖)로 세척하고, 건조시키고, 여과시키고, 농축시켰다. 조질물을 DCM(50㎖)에 재용해시켰다. 조질의 용매를 아이소프로필 에터(500㎖)의 용매에 서서히 적가하였다. 목적하는 생성물이 석출되었다. 생성물을 여과 후 밝은 황색 고체로서 수집하고, 고체 케이크를 아이소프로필 에터(50㎖×2)로 세척하였다. 화합물 7-1-4a(22.0g, 11.1 m㏖, 93.0% 수율, 81.9% 순도)를 밝은 황색 고체로서 얻었다.
화합물 7-1-4a(13.0g, 8.04 m㏖, 86.9% 수율, 98.3% 순도)를 HPLC 정제 후에 백색 발포물로서 얻었다. HPLC(방법 A): RT= 6.127, 6.193, 6.277분, 및 LCMS(방법 F): RT = 1.431분; m/z: [M+H]+ = 1615.5.
CCGU 4량체의 제조
Figure pct00383
화합물 7-1-4a(13.0g, 8.04 m㏖, 1.00 eq) 및 MOE C 아미다이트(8.17g, 8.84 m㏖, 1.10 eq)를 250㎖ 1구 둥근 병에서 Ar하에 ACN(30㎖×3)과 공증발시키고, 이 1구 병에 3Å 분자체(3.50g)를 첨가하고, Ar 압력 하에 ACN(65㎖)을 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 1시간 동안 교반하고, 이어서 이 혼합물에 DCI(1.42g, 12.0 m㏖, 1.50 eq)를 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 1시간 동안 교반하였다.
HPLC(생성물: RT = 8.547분; 출발 물질: RT = 6.127, 6.193, 6.277분)는 출발 물질이 완전히 소비된 것을 나타내었다.
상기 용액에 BuOOH(2.07g, 16.0 m㏖, 2.20㎖, 70.0% 순도, 2.00 eq)를 25℃에서 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. HPLC(7-5, 생성물: RT = 8.400분; 출발 물질: RT = 8.547분)는 출발 물질이 완전히 소비된 것을 나타내었다.
이 반응 혼합물을 NaHCO3 및 Na2SO3 용액(500㎖ DI수 중 10.0 eq NaHCO3 및 5.00 eq Na2SO3)에 붓고, 이어서 이 혼합물을 EtOAc(300㎖)로 희석시키고, 두 층을 분리시키고, 유기층을 NaHCO3(200㎖), 염수(200㎖)로 세척하고, 건조시키고, 여과시키고, 농축시켰다. 조질물을 DCM(50㎖)에 재용해시켰다. 조질의 용매를 아이소프로필 에터(600㎖)의 용매에 서서히 적가하였다. 목적하는 생성물이 석출되었다. 생성물을 여과 후 밝은 황색 고체로서 수집하고, 고체 케이크를 아이소프로필 에터(50㎖×2)로 세척하였다. 화합물 7-1-5(CCGU)(15.0g, 5.94 m㏖, 73.9% 수율, 97.3% 순도)를 HPLC 정제 후에 황색 고체로서 얻었다. HPLC(방법 B): RT= 8.400분 및 LCMS(방법 F): RT = 1.665분; m/z: [M+2H]2+/2 = 1226.4
DMTr-CCGU-OH (7-1-6)의 제조
Figure pct00384
ACN(35㎖) 중 7-1-5(6.00g, 2.44 m㏖, 1.00 eq)에, 이어서 THF(8㎖) 중 피리딘;하이드로플루오라이드(698㎎, 24.4 m㏖, 634 uL, 70.0% 순도, 10.0 eq) 및 이미다졸(3.33g, 48.8 m㏖, 20.0 eq)을 0℃에서 적가하였다. 이 혼합물을 0℃에서 3시간 동안 교반하였다. TLC(다이클로로메탄:메탄올 = 10:1, 생성물: Rf = 10:1)는 화합물 7-1-5가 완전히 소비되어 2개의 새로운 반점이 형성된 것을 나타내었다. 반응은 TLC에 따르면 난잡(messy)하였다.
이 반응 혼합물을 EtOAc(20㎖)에 용해시켰다. 유기층을 포화 수성 NaHCO3(20㎖×2), 염수(20㎖)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과시키고, 진공 중 농축시켰다. 조질물을 DCM(5㎖)에 재용해시켰다. 조질의 용매를 MTBE(50㎖)의 용매에 서서히 적가하였다. 목적하는 생성물이 석출되었다. 이 생성물을 여과 후에 백색 고체로서 수집하고, 고체 케이크를 아이소프로필 에터 MTBE(50㎖×2)로 세척하였다. 화합물 7-1-6(4.90g, 2.07 m㏖, 84.5% 수율, 93.5% 순도)을 백색 고체로서 얻었다. HPLC(방법 B): RT = 10.986, 11.182, 11.264분 및 LCMS(방법 F): RT = 1.502분; m/z: [M+2H]2+/2 = 1107.4.
DMTr-CCGU-OH(7-1-6a) 의 제조
Figure pct00385
7-1-6a는 포스포아미다이트 합성에 대해서 위에서 기재된 바와 같은 유사한 절차를 이용해서 7-1-6으로부터 합성하였다. HPLC-MS(방법 G): RT = 9.740, 9.843, 9.949분; m/z: [M-2H]2-/2 = 화합물 7-1-6a에 대해서 1205.8.
HO-CCGU-OTBDPS(7-1-7)의 제조
Figure pct00386
ACN(30㎖) 중 7-1-5(6.20g, 2.52 m㏖, 1.00 eq)의 용액에 도데칸-1-티올(766㎎, 3.79 m㏖, 906 uL, 1.50 eq)을 0℃에서 첨가하고, 이어서 TFA(2.30g, 20.1 m㏖, 1.49㎖, 8.00 eq)를 0℃에서 적가하였다. 이 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 교반하였다. TLC(DCM:MeOH=10:1, 생성물: Rf = 0.35)는 화합물 7-1-5가 완전히 소비되어 2개의 새로운 반점이 형성된 것을 나타내었다. 반응은 TLC에 따르면 난잡하였다.
이 반응 혼합물을 NaHCO3(100㎖ DI수 중 10.0 eq NaHCO3)에 붓고, 이어서 EtOAc 50㎖로 희석시키고, 수성 NaHCO3 100㎖로 추출하였다. 합한 유기층을 염수 200㎖(100㎖×2)로 세척하고, Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과시키고, 감압 하에 농축시켜 잔사를 제공하였다. 조질물을 DCM(80㎖)에 재용해시켰다. 조질의 용매를 MTBE(300㎖)의 용매에 서서히 적가하였다. 목적하는 생성물이 석출되었다. 이 생성물을 여과 후에 백색 고체로서 수집하고, 고체 케이크를 아이소프로필 에터 MTBE(50㎖×2)로 세척하였다.
화합물 7-1-7(4.86g, 2.18 m㏖, 86.4% 수율, 96.6% 순도)을 HPLC 정제에 의해 백색 고체로서 얻었다. HPLC(방법 B): RT = 0.664, 10.794, 10.917분 및 LCMS(방법 F): RT = 1.431분; m/z: [M+2H]2+/2 = 1075.9.
B. 3' 단편의 제조
1. 5'-OH-ACCCU-LHPG 5량체(단편 1)의 제조를 위한 일반 절차
화합물 7-2-1의 제조를 위한 일반 절차
Figure pct00387
화합물 7-2-a를 톨루엔(60.0㎖×3)과 공증발시켰다. DCM(100㎖) 중 화합물 7-2-a(10.0g, 16.1 m㏖, 1.00 eq)의 용액에 N,N-다이에틸에탄아민(8.18g, 80.8 m㏖, 11.2㎖, 5.00 eq) 및 테트라하이드로퓨란-2,5-다이온(3.24g, 32.3 m㏖, 2.00 eq)을 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 4시간 동안 교반하였다. HPLC는 화합물 7-2-a가 완전히 소비된 것을 나타내었다. 이 반응 혼합물을 TEAB(0.5M, 300㎖)로 세척하고, 무수 Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과시키고, 감압 하에 농축시켜 잔사를 제공하였다. 화합물 7-2-1(11.0g, 15.3 m㏖, 94.6% 수율)을 갈색 고체로서 얻었다.
HPLC(방법 A): RT = 2.405분
화합물 7-2 - 2의 제조를 위한 일반 절차
Figure pct00388
DCM(300㎖) 중 화합물 7-2-1a(10.1g, 10.2 m㏖, 1.00 eq)의 용액에 화합물 7-2-2(11.0g, 14.5 m㏖, 1.43 eq, HCl), HBTU(13.1g, 34.6 m㏖, 3.40 eq), HOBt(4.69g, 34.6 m㏖, 3.40 eq) 및 DIEA(4.48g, 34.6 m㏖, 6.04㎖, 3.40 eq)를 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. TLC(출발 물질, Rf = 0.38, 생성물, Rf = 0.42)는 화합물 7-2-1a가 완전히 소비된 것을 나타내었다. 이 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켜 용매를 제거하였다. 조질의 생성물을 ACN(700㎖)과 25℃에서 15분 동안 배산(triturate)시켰다. 이어서, 여과시키고, ACN(100㎖×2)으로 세척하였다. 화합물 7-2-2(16.0g, 9.43 m㏖, 92.4% 수율)를 갈색 고체로서 얻었다.
화합물 7-2-3의 제조를 위한 일반 절차
Figure pct00389
DCM(160㎖) 중 화합물 7-2-2(16.0g, 9.43 m㏖, 1.00 eq)의 용액에 도데칸-1-티올(5.73g, 28.3 m㏖, 6.78㎖, 3.00 eq) 및 TFA(10.7g, 94.3 m㏖, 6.98㎖, 10.0 eq)을 첨가하였다. 이 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 교반하였다. TLC(DCM:MeOH = 10:1, 출발 물질, Rf = 0.50, 생성물, Rf = 0.43)는 화합물 7-2-2가 완전히 소비된 것을 나타내었다. 이 반응 혼합물을 pH>7이 될 때까지 포화 수성 NaHCO3로 세척하고, 다이클로로메탄(300㎖)으로 추출하고, 염수(200㎖)로 세척하고, 무수 Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과시키고, 감압 하에 농축시켜 잔사를 제공하였다. 조질의 생성물을 ACN(800㎖)과 25℃에서 30분 동안 배산시켰다. 이어서 여과시키고 ACN(100㎖×2)으로 세척하였다. 화합물 7-2-3(11.7g, 8.39 m㏖, 88.9% 수율)을 백색 고체로서 얻었다.
화합물 7-2-4 의 제조를 위한 일반 절차
Figure pct00390
화합물 7-2-3 및 MOE C 아미다이트를 (ACN 60.0㎖×3) 및 (DCM 20.0㎖×3)과 공증발시켰다. 화합물 7-2-3(11.7g, 8.39 m㏖, 1.00 eq) 및 MOE C 아미다이트(15.4g, 16.7 m㏖, 2.00 eq)의 용액에 DCM(120㎖) 및 ACN(20㎖)을 첨가하고, 이어서 3A MS를 첨가하고, 이 혼합물을 1시간 동안 교반하고, 이어서 이 혼합물에 DCI(2.98g, 20.98 m㏖, 2.50 eq)를 첨가하고, 이 혼합물을 0.5시간 동안 교반하고, 이어서 혼합물에 2-하이드로퍼옥시-2-메틸-프로판(3.24g, 25.1 m㏖, 5.04㎖, 5M, 3.00 eq)을 첨가하고, 이 혼합물을 25℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. TLC(DCM:MeOH = 20:1, 출발 물질, Rf = 0.43, 생성물, Rf = 0.48)는 화합물 7-2-3이 완전히 소비된 것을 나타내었다. 이 반응 혼합물을 수성 NaHCO3 및 수성 Na2SO3(200㎖)로 세척하고, 염수(200㎖)로 세척하고, 여과시키고, 감압 하에 농축시켜 잔사를 제공하였다. 조질의 생성물을 ACN(350㎖)과 25℃에서 30분 동안 배산시켰다. 이어서 여과시키고, ACN(100㎖×2)으로 세척하였다. 화합물 7-2-4(17.1g, 7.33 m㏖, 87.2% 수율)를 백색 고체로서 얻었다.
화합물 7-2-5 의 제조를 위한 일반 절차
Figure pct00391
DCM(170㎖) 중 화합물 7-2-4(17.1g, 7.33 m㏖, 1.00 eq)의 용액에 도데칸-1-티올(4.45g, 21.9 m㏖, 5.26㎖, 3.00 eq) 및 TFA(8.35g, 73.2 m㏖, 5.42㎖, 10.0 eq)를 첨가하였다. 이 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 교반하였다. TLC(DCM:MeOH=10:1, 출발 물질, Rf = 0.43, 생성물, Rf = 0.48)는 화합물 7-2-4가 완전히 소비된 것을 나타내었다. pH>7이 될 때까지 이 반응 혼합물을 수성 포화 NaHCO3로 세척하고, 다이클로로메탄(300㎖)로 추출하고, 염수(200㎖)로 세척하고, 무수 Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과시키고, 감압 하에 농축시켜 잔사를 제공하였다. 조질의 생성물을 ACN으로 0℃에서 30분 동안 배산시켰다. 이어서 여과시키고, ACN(100㎖×2)으로 세척하였다. 화합물 7-2-5(13.7g, 6.74 m㏖, 92.0% 수율)를 백색 고체로서 얻었다.
화합물 7-2-6의 제조를 위한 일반 절차
Figure pct00392
화합물 5 및 MOE C 아미다이트를 (ACN 80.0㎖×3) 및 (DCM 30.0㎖×3)과 공증발시켰다. 화합물 7-2-5(13.7g, 6.74 m㏖, 1.00 eq) 및 MOE C 아미다이트(12.4g, 13.4 m㏖, 2.00 eq)의 용액에 DCM(80.0㎖) 및 ACN(20.0㎖)을 첨가하고, 이어서 3Å 분자체를 첨가하고, 이 혼합물을 1시간 동안 교반하고, 이어서 이 혼합물에 DCI(2.39g, 16.8 m㏖, 2.50 eq)를 첨가하고, 이 혼합물을 0.5시간 동안 교반하고, 이어서 이 혼합물에 2-하이드로퍼옥시-2-메틸-프로판(5M, 4.05㎖, 3.00 eq)을 첨가하고, 이 혼합물을 25℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. TLC(DCM:MeOH = 15:1, 출발 물질, Rf = 0.43, 생성물, Rf = 0.50)는 화합물 7-2-5가 완전히 소비된 것을 나타내었다. 이 반응 혼합물을 여과시켰다. 여과액을 ACN과 25℃에서 30분 동안 배산시켰다. 이어서 여과시키고, ACN(100㎖×2)으로 세척하였다. 화합물 7-2-6(17.0g, 6.15 m㏖, 91.1% 수율)을 백색 고체로서 얻었다.
화합물 7-2-7의 제조를 위한 일반 절차
Figure pct00393
DCM(190㎖) 중 화합물 7-2-6(17.0g, 6.15 m㏖, 1.00 eq)의 용액에 도데칸-1-티올(3.73g, 18.4 m㏖, 4.42㎖, 3.00 eq) 및 TFA(7.01g, 61.4 m㏖, 4.55㎖, 10.0 eq)를 첨가하였다. 이 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 교반하였다. TLC(DCM:MeOH = 10:1, 출발 물질, Rf = 0.43, 생성물, Rf = 0.38)는 화합물 7-2-6이 완전히 소비된 것을 나타내었다. 이 반응 혼합물을 pH>7이 될 때까지 포화 수성 NaHCO3로 세척하고, 다이클로로메탄(300㎖)으로 추출하고, 염수(200㎖)로 세척하고, 무수 Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과시키고, 감압 하에 농축시켜 잔사를 제공하였다. 조질의 생성물을 ACN과 0℃에서 30분 동안 배산시켰다. 이어서 여과시키고, ACN(100㎖×2)으로 세척하였다. 화합물 7-2-7(14.7g, 5.97 m㏖, 97.0% 수율)을 백색 고체로서 얻었다.
화합물 7-2-8의 제조를 위한 일반 절차
Figure pct00394
화합물 7-2-7 및 MOE C 아미다이트를 (ACN 60.0㎖×3) 및 (DCM 20.0㎖×3)과 공증발시켰다. 화합물 7-2-7 (13.0g, 5.31 m㏖, 1.00 eq) 및 MOE C 아미다이트(9.80g, 10.6 m㏖, 2.00 eq)의 용액에 DCM(60.0㎖) 및 ACN(20.0㎖)에 첨가하고, 이어서 3Å 분자체(MS)를 첨가하고, 이 혼합물을 1시간 동안 교반하고, 이어서 이 혼합물에 DCI(1.89g, 13.2 m㏖, 2.50 eq)를 첨가하고, 이 혼합물을 0.5시간 동안 교반하고, 이어서 이 혼합물에 2-하이드로퍼옥시-2-메틸-프로판(5M, 3.19㎖, 3.00 eq)을 첨가하였다, 이 혼합물을 25℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. TLC(DCM:MeOH = 15:1, 출발 물질, Rf = 0.43, 생성물, Rf = 0.48)는 화합물 7-2-7이 완전히 소비된 것을 나타내었다. 이 반응 혼합물을 여과시켰다. 여과액을 ACN(800㎖)과 25℃에서 30분 동안 배산시켰다. 이어서 여과시키고, ACN(100㎖×2)으로 세척하였다. 화합물 7-2-8(14.4g, 4.36 m㏖, 82.1% 수율)을 백색 고체로서 얻었다.
화합물 7-2-9 의 제조를 위한 일반 절차
Figure pct00395
DCM(70.0㎖) 중 화합물 7-2-8(14.47g, 4.39 m㏖, 1.00 eq)의 용액에 도데칸-1-티올(2.66g, 13.1 m㏖, 3.15㎖, 3.00 eq) 및 TFA(5.00g, 43.8 m㏖, 3.25㎖, 10.0 eq)를 첨가하였다. 이 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 교반하였다. TLC(DCM:MeOH = 10:1,출발 물질, Rf = 0.43, 생성물, Rf = 0.38)는 화합물 7-2-8이 완전히 소비된 것을 나타내었다. 이 반응 혼합물을 pH>7이 될 때까지 포화 수성 NaHCO3로 세척하고, 다이클로로메탄(300㎖)으로 추출하고, 염수(200㎖)로 세척하고, 무수 Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과시키고, 감압 하에 농축시켜 잔사를 제공하였다. 조질의 생성물을 ACN(800㎖)과 25℃에서 30분 동안 배산시켰다. 이어서 여과시키고, ACN(100㎖×2)으로 세척하였다. 화합물 7-2-9(11.6g, 3.88 m㏖, 88.5% 수율)을 백색 고체로서 얻었다.
화합물 7-2-10 의 제조를 위한 일반 절차
Figure pct00396
화합물 7-2-9 및 MOE A 아미다이트를 (ACN 60㎖×3) 및 (DCM 20㎖×3)과 공증발시켰다. 화합물 7-2-9(11.6g, 3.87 m㏖, 1.00 eq) 및 MOE A 아미다이트(7.21g, 7.74 m㏖, 2.00 eq)의 용액에 DCM(60.0㎖) 및 ACN(20.0㎖)을 첨가하고, 이어서 3Å MS를 첨가하고, 이 혼합물을 1시간 동안 교반하고, 이어서 이 혼합물에 DCI(1.37g, 9.67 m㏖, 2.50 eq)를 첨가하고, 이 혼합물을 0.5시간 동안 교반하고, 이어서 혼합물에 2-하이드로퍼옥시-2-메틸-프로판(5M, 2.32㎖, 3.00 eq)을 첨가하였다, 이 혼합물을 25℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. TLC(DCM:MeOH = 15:1, 출발 물질, Rf = 0.43, 생성물, Rf = 0.47)는 화합물 7-2-9이 완전히 소비된 것을 나타내었다. 이 반응 혼합물을 여과시켰다. 여과액을 ACN(800㎖)과 25℃에서 30분 동안 배산시켰다. 이어서 여과시키고, ACN(100㎖×2)으로 세척하였다. 화합물 7-2-10(14.0g, 3.64 m㏖, 94.1% 수율)을 백색 고체로서 얻었다.
단편 1 의 제조를 위한 일반 절차
Figure pct00397
DCM(70.0㎖) 중 화합물 7-2-10(14.0g, 3.64 m㏖, 1.00 eq)의 용액에 도데칸-1-티올(2.21g, 10.9 m㏖, 2.62㎖, 3.00 eq)을 첨가하였다. 이 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 교반하였다. TLC(DCM:MeOH = 15:1, 출발 물질, Rf = 0.43, 생성물, Rf = 0.39)는 화합물 7-2-10이 완전히 소비된 것을 나타내었다. 이 반응 혼합물을 pH>7이 될 때까지 포화 수성 NaHCO3로 세척하고, 다이클로로메탄(300㎖)으로 추출하고, 염수(200㎖)로 세척하고, 무수 Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과시키고, 감압 하에 농축시켜 잔사를 제공하였다. 조질의 생성물을 ACN(800㎖)과 25℃에서 30분 동안 배산시켰다. 이어서 여과시키고, ACN(100㎖×2)으로 세척하였다. 화합물 7-2-10(단편 1)(10.0g, 2.82 m㏖, 77.5% 수율)을 백색 고체로서 얻었다. 7-2-10(단편 1)은 암모니아분해를 이용해서 LHPG기를 탈보호 후에 HPLC 및 질량 분광분석법에 의해 특성규명하였다. HPLC(방법 C): RT = 2.11분 및 LCMS(방법 D): RT = 0.219분; m/z: [M-2H]2-/2 = 916.6.
2 . 5'-데옥시-TTACC 5량체 또는 5'-DMTr-TTACC-OH 또는 5'-OH-TTACC-TBDPS 5량체(단편 2)의 제조를 위한 일반 절차
화합물 7-3-2 의 제조를 위한 일반 절차
Figure pct00398
DCM(200㎖) 중 화합물 7-3-1(40.0g, 61.7 m㏖, 1.00 eq)의 용액에 이미다졸(21.0g, 308 m㏖, 5.00 eq)을 첨가하였다. 이 혼합물은 밝은 황색 균질 용액이었다. TBDPSCl(22.0g, 80.2 m㏖, 20.6㎖, 1.30 eq)을 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 16시간 동안 교반하였다. TLC(석유 에터:에틸 아세테이트 = 2:1, 생성물: Rf = 0.46)는 화합물 7-3-1이 완전히 소비되었고 하나의 새로운 반점이 형성된 것을 나타낸다. 반응물은 TLC에 따르면 투명하였다.
프로판-2-올(4.73㎖, 1.00 eq)을 첨가하고, 이 혼합물을 0.5시간 교반하였다. 상기 혼합물을 빙욕에서 0℃까지 냉각시켰다. 도데칸-1-티올(16.2g, 80.2 m㏖, 19.2㎖, 1.30 eq)을 첨가하고, 이 혼합물을 0℃에서 15분 동안 교반하였다. TFA(56.3g, 494 m㏖, 36.5㎖, 8.00 eq)를 0℃에서 적가하였다. 이 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 교반하였다. TLC(석유 에터:에틸 아세테이트 = 2:1, Rf = 0.24)는 출발 물질이 완전히 소비되었고 하나의 새로운 반점이 형성된 것을 나타낸다. 반응물은 TLC에 따르면 투명하였다. 이 반응 혼합물을 NaHCO3(500㎖ DI수 중 10.0 eq NaHCO3)에 붓고, 이어서 DCM 100㎖로 희석시키고 수성 NaHCO3 200㎖로 추출하였다. 합한 유기층을 염수 200㎖(100㎖×2)로 세척하고, Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과시키고, 감압 하에 농축시켜 잔사를 제공하였다.
조질의 생성물을 DCM 100㎖에 용해시키고, 헵탄/TBME(v/v 9:1, 1200㎖)의 용매 혼합물에 깔때기로부터 조질의 생성물의 용액을 서서히 적가하여 석출 공정을 수행하였다. 이 공정은 약 30분 걸렸다. 순수한 생성물을 부흐너 깔때기로 백색 고체로서 수집하고, 생성물의 케이크를 헵탄(100㎖×2)의 용매 혼합물로 세척하고, 건조 상태로 농축시켰다.
화합물 7-3-2(34.8g, 56.1 m㏖, 91.0% 수율, 94.2% 순도)를 백색 고체로서 얻었다.
HPLC(방법 A): RT = 7.136분, 및 LCMS(방법 F): RT = 1.570분; m/z: [M+H]+ = 584.2.
화합물 7-3-3 의 제조를 위한 일반 절차
Figure pct00399
화합물 7-3-2(13.0g, 22.2 m㏖, 1.00 eq) 및 dC 아미다이트(20.7g, 24.5 m㏖, 1.10 eq)의 용액에 250㎖ 1구 둥근 병에서 Ar하에 ACN(100㎖×3)과 공증발시키고, 이 1구 병에 3Å 분자체(3.00g)를 첨가하고, Ar 압력 하에 ACN/DCM=1:1(100㎖)을 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 1시간 동안 교반하고, 이어서 이 혼합물에 DCI(3.94g, 33.4 m㏖, 1.50 eq)를 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 1시간 동안 교반하였다. HPLC(생성물: RT = 6.207분; 출발 물질: RT = 7.136분)는 출발 물질이 완전히 소비된 것을 나타내었다.
커플링 반응이 완료된 후에, 상기 용액에 BuOOH(5.73g, 44.5 m㏖, 6.10㎖, 70.0% 순도, 2.00 eq)를 25℃에서 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 1시간 동안 교반하였다. HPLC(7-3-3, 생성물: RT = 9.028분; 출발 물질: RT = 6.027분)는 출발 물질이 완전히 소비된 것을 나타내었다. 이 반응 혼합물을 NaHCO3 및 Na2SO3 용액(400㎖ DI수 중 10.0 eq NaHCO3 및 5.00 eq Na2SO3)에 붓고, 이어서 이 혼합물을 EtOAc(200㎖)로 희석시키고, 두 층을 분리시키고, 유기층을 NaHCO3(200㎖), 염수(100㎖)로 세척하고, 건조시키고, 여과시키고, 농축시켰다.
화합물 7-3-3(33.0g, 22.0 m㏖, 98.7% 수율, 89.7% 순도)을 백색 발포물로서 얻었다. HPLC(방법 A): RT = 5.518분 및 LCMS(방법 D): RT = 1.787분; m/z: [M-H]- = 1344.6.
화합물 7-3-4 의 제조를 위한 일반 절차
Figure pct00400
ACN(120㎖) 중 화합물 7-3-3(24.0g, 17.8 m㏖, 1.00 eq)에 도데칸-1-티올(4.69g, 23.1 m㏖, 5.55㎖, 1.30 eq)을 0℃에서 첨가하고, 이어서 TFA(16.2g, 142 m㏖, 10.5㎖, 8.00 eq)를 0℃에서 적가하였다. 이 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 교반하였다. TLC(다이클로로메탄:메탄올 = 10:1, 생성물: Rf = 0.55)는 화합물 7-3-3이 완전히 소비되어 2개의 새로운 반점이 형성된 것을 나타내었다. 반응은 TLC에 따르면 난잡하였다. 이 반응 혼합물을 NaHCO3(300㎖ DI수 중 10.0 eq NaHCO3)에 붓고, 이어서 EtOAc 100㎖로 희석시키고, 수성 NaHCO3 100㎖로 추출하였다. 합한 유기층을 염수 200㎖(100㎖×2)로 세척하고, Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과시키고, 감압 하에 농축시켜 잔사를 제공하였다.
이 혼합물을 CH3CN:H2O(2:1, 100㎖)에 재용해시키고, CH3CN/H2O을 헵탄:tBuOMe = 4:1(200㎖×4)로 세척하고, 이어서 CH3CN 및 H2O의 층을 EtOAc/MTBE(1/3, 120㎖)로 희석시켰다. 유기층을 DI수(100㎖)로 세척하고, 유기층을 염수(100㎖)로 세척하고, Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과시키고, 감압 하에 농축시켜 잔사를 제공하였다. 화합물 7-3-4(16.4g, 14.3 m㏖, 80.4% 수율, 91.2% 순도)를 백색 고체로서 얻었다. 조질의 생성물을 역상 HPLC(pH = 7 조건)에 의해 정제시켰다. 화합물 7-3-4(14.7g, 13.4 m㏖, 87.4% 수율, 95.2% 순도)를 백색 발포물로서 얻었다. HPLC(방법 A): RT = 7.344분 및 LCMS(방법 E): RT = 1.451분; m/z: [M+H]+ = 1044.7.
화합물 7-3-5 의 제조를 위한 일반 절차
Figure pct00401
화합물 7-3-4(14.7g, 14.0 m㏖, 1.00 eq) 및 dA 아미다이트(13.2g, 15.4 m㏖, 1.10 eq)의 용액을 250㎖ 1구 둥근 병에서 Ar하에 ACN(100㎖×3)과 공증발시키고, 이 1구 병에 3Å 분자체(4.00g)를 첨가하고, Ar 압력 하에 ACN(75㎖)을 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 1시간 동안 교반하고, 이어서 이 혼합물에 DCI(2.49g, 21.1 m㏖, 1.50 eq)를 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 1시간 동안 교반하였다. HPLC(생성물: RT = 7.344분; 출발 물질: RT =8.501분)는 출발 물질이 완전히 소비된 것을 나타내었다.
커플링 반응이 완료된 후에, 상기 용액에 BuOOH(3.62g, 28.1 m㏖, 3.86㎖, 70.0% 순도, 2.00 eq)를 25℃에서 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. HPLC(7-3-5, 생성물: RT = 8.232분; 출발 물질: RT = 8.501분)는 출발 물질이 완전히 소비된 것을 나타내었다. 이 반응 혼합물을 NaHCO3 및 Na2SO3 용액(500㎖ DI수 중 10.0 eq NaHCO3 및 5.00 eq Na2SO3)에 붓고, 이어서 이 혼합물을 EtOAc(200㎖)로 희석시키고, 두 층을 분리시키고, 유기층을 NaHCO3(200㎖), 염수(100㎖)로 세척하고, 건조시키고, 여과시키고, 농축시켰다.
조질물을 DCM(80㎖)에 재용해시켰다. 조질의 용매를 MTBE(1000㎖)의 용매에 서서히 적가하였다. 목적하는 생성물이 석출되었다. 이 생성물을 여과 후에 백색 고체로서 수집하고, 고체 케이크를 아이소프로필 에터 MTBE(50㎖×2)로 세척하였다. 화합물 7-3-5(30.0g, 13.4 m㏖, 95.7% 수율, 81.6% 순도)를 백색 고체로서 얻었다. 조질의 생성물을 역상 HPLC(pH=7 조건)에 의해 정제시켰다. 화합물 7-3-5(24.0g, 13.0 m㏖, 96.9% 수율, 98.8% 순도)를 백색 고체로서 얻었다.
HPLC(방법 A): RT = 8.233분; LCMS(방법 D): RT = 1.622분; m/z: [M-2H]2-/2 = 906.8.
화합물 7-3-6 의 제조를 위한 일반 절차
Figure pct00402
ACN(90㎖) 중 화합물 7-3-5(18.3g, 10.0 m㏖, 1.00 eq )의 용액에 도데칸-1-티올(2.65g, 13.0 m㏖, 3.14㎖, 1.30 eq)을 0℃에서 첨가하고, 이어서 TFA(9.19g, 80.5 m㏖, 5.97㎖, 8.00 eq)를 0℃에서 적가하였다. 이 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 교반하였다. TLC(DCM:MeOH = 10:1, 생성물: Rf = 0.43)는 화합물 7-3-5가 완전히 소비되었고 2개 반점이 형성된 것을 나타내었다. 반응은 TLC에 따르면 난잡하였다.
이 반응 혼합물을 NaHCO3(300㎖ DI수 중 10.0 eq NaHCO3)에 붓고, 이어서 EtOAc 100㎖로 희석시키고, 수성 NaHCO3 100㎖로 추출하였다. 합한 유기층을 염수 200㎖(100㎖×2)로 세척하고, Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과시키고, 감압 하에 농축시켜 잔사를 제공하였다. 조질물을 DCM(80㎖)에 재용해시켰다. 조질의 용매를 MTBE(1000㎖)의 용매에 서서히 적가하였다. 목적하는 생성물이 석출되었다. 이 생성물을 여과 후에 백색 고체로서 수집하고, 고체 케이크를 아이소프로필 에터 헵탄(50㎖×2)으로 세척하였다. 화합물 7-3-6(14.3g, 9.34 m㏖, 92.7% 수율, 98.8% 순도)을 백색 고체로서 얻었다.
HPLC(방법 A): RT = 7.008분; LCMS(방법 E): RT = 1.444분; m/z: [M+H]+ = 1514.8.
화합물 7-3-7 의 제조를 위한 일반 절차
Figure pct00403
화합물 7-3-6(14.3g, 9.44 m㏖, 1.00 eq) 및 dT 아미다이트(7.73g, 10.3 m㏖, 1.10 eq)를 250㎖ 1구 둥근 병에서 Ar하에 ACN(50㎖×3)과 공증발시키고, 이 1구 병에 3Å 분자체(4.00g)를 첨가하고, Ar 압력 하에 ACN(75㎖)을 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 1시간 동안 교반하고, 이어서 이 혼합물에 DCI(1.67g, 14.1 m㏖, 1.50 eq)을 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 1시간 동안 교반하였다. HPLC(생성물: RT = 8.061분; 출발 물질: RT = 7.008분)는 출발 물질이 완전히 소비된 것을 나타내었다.
커플링 반응이 완료된 후에, 상기 용액에 BuOOH(2.43g, 18.8 m㏖, 2.59㎖, 70.0% 순도, 2.00 eq)를 25℃에서 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 1시간 동안 교반하였다. HPLC(7-3-7, 생성물: RT = 7.856분; 출발 물질: RT = 8.061분)는 출발 물질이 완전히 소비된 것을 나타내었다. 이 반응 혼합물을 NaHCO3 및 Na2SO3 용액(400㎖ DI수 중 10.0 eq NaHCO3 및 5.00 eq Na2SO3)에 붓고, 이어서 이 혼합물을 EtOAc(200㎖)로 희석시키고, 두 층을 분리시키고, 유기층을 NaHCO3(200㎖), 염수(100㎖)로 세척하고, 건조시키고, 여과시키고, 농축시켰다.
화합물 7-3-7(21.9g, 8.78 m㏖, 93.0% 수율, 87.1% 순도)을 백색 고체로서 얻었다. 조질의 생성물을 역상 HPLC(pH=7 조건)에 의해 정제시켰다. 화합물 7-3-7(19.0g, 8.57 m㏖, 97.6% 수율, 98.0% 순도)을 백색 발포물로서 얻었다.
HPLC(방법 A): RT = 7.848분; LCMS(방법 D): RT = 1.569분; m/z: [M-2H]2-/2 = 1085.5.
화합물 7-3-8 의 제조를 위한 일반 절차
Figure pct00404
ACN(70㎖) 중 화합물 7-3-7(14.0g, 6.44 m㏖, 1.00 eq)의 용액에 도데칸-1-티올(1.69g, 8.37 m㏖, 2.01㎖, 1.30 eq)을 0℃에서 첨가하고, 이어서 TFA(5.87g, 51.5 m㏖, 3.81㎖, 8.00 eq)를 0℃에서 적가하였다. 이 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 교반하였다. TLC(메탄올:다이클로로메탄 = 10:1, 생성물: Rf = 0.41)는 화합물 7-3-7이 완전히 소비되어 2개의 새로운 반점이 형성된 것을 나타내었다. 반응은 TLC에 따르면 난잡하였다. 이 반응 혼합물을 NaHCO3(300㎖ 탈이온(DI)수 중 10.0 eq NaHCO3)에 붓고, 이어서 EtOAc 100㎖로 희석시키고, 수성 NaHCO3 100㎖로 추출하였다. 합한 유기층을 염수 200㎖(100㎖×2)로 세척하고, Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과시키고, 감압 하에 농축시켜 잔사를 제공하였다.
조질물을 DCM(80㎖)에 재용해시켰다. 조질의 용매를 MTBE(1000㎖)의 용매에 서서히 적가하였다. 목적하는 생성물이 석출되었다. 생성물을 여과 후 백색 고체로서 수집하고, 고체 케이크를 아이소프로필 에터 MTBE(50㎖×2)로 세척하였다. 화합물 7-3-8(11.5g, 6.00 m㏖, 93.1% 수율, 97.6% 순도)을 백색 고체로서 얻었다.
HPLC(방법 A): RT = 6.705 분.
데옥시-TTACC 5량체 7-3-9 의 제조를 위한 일반 절차
Figure pct00405
화합물 7-3-8(11.5g, 6.14 m㏖, 1.00 eq) 및 dT 아미다이트(5.03g, 6.76 m㏖, 1.10 eq)의 용액을 250㎖ 1구 둥근 병에서 Ar하에 ACN(50㎖×3)과 공증발시키고, 이 1구 병에 3Å 분자체(4.00g)를 첨가하고, Ar 압력 하에 ACN(75㎖)을 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 1시간 동안 교반하고, 이어서 이 혼합물에 DCI(1.67g, 14.1 m㏖, 1.50 eq)를 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 1시간 동안 교반하였다. HPLC(생성물: RT =7.730분; 출발 물질: RT =6.705분)는 출발 물질이 완전히 소비된 것을 나타내었다.
커플링 반응이 완료된 후에, 상기 용액에 BuOOH(1.58g, 12.2 m㏖, 1.68㎖, 70.0% 순도, 2.00 eq)를 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 1시간 동안 교반하였다. HPLC(생성물: RT = 7.517분; 출발 물질: RT = 7.730분)는 출발 물질이 완전히 소비된 것을 나타내었다. 이 반응 혼합물을 NaHCO3 및 Na2SO3 용액(500㎖ DI수 중 10.0 eq NaHCO3 및 5.00 eq Na2SO3)에 붓고, 이어서 이 혼합물을 EtOAc(200㎖)로 희석시키고, 두 층을 분리시키고, 유기층을 NaHCO3(200㎖), 염수(100㎖)로 세척하고, 건조시키고, 여과시키고, 농축시켰다.
조질물을 DCM(80㎖)에 재용해시켰다. 조질의 용매를 MTBE(800㎖)의 용매에 서서히 적가하였다. 목적하는 생성물이 석출되었다. 이 생성물을 여과 후에 백색 고체로서 수집하고, 고체 케이크를 아이소프로필 에터 MTBE(50㎖×2)로 세척하였다. LCMS: 생성물: RT = 1.443 분.
조질의 생성물을 역상 HPLC(pH=7 조건)에 의해 정제시켰다.
7-3-9(데옥시-TTACC 5량체)(14.3g, 5.47 m㏖, 89.3% 수율, 96.8% 순도)를 밝은 황색 고체로서 얻었다.
HPLC(방법 B): RT = 11.993, 12.120, 12.240분; LCMS(방법 D): RT = 1.443분; m/z: [M-2H]2-/2 = 1263.7.
DMTr-TTACC-OH 7-3-10 의 제조를 위한 일반 절차
Figure pct00406
ACN(35㎖) 중 화합물 7-3-9(7.20g, 2.84 m㏖, 1.00 eq)의 용액에 이어서 THF(12㎖) 중 피리딘; 하이드로플루오라이드(813㎎, 28.4 m㏖, 739 uL, 70.0% 순도, 10.0 eq) 및 이미다졸(3.87g, 56.8 m㏖, 20.0 eq)을 0℃에서 적가하였다. 이 혼합물을 0℃에서 3시간 동안 교반하였다. TLC(다이클로로메탄:메탄올 = 10:1, 순도: Rf = 0.30)는 화합물 7-3-9가 완전히 소비되어 2개의 새로운 반점이 형성된 것을 나타내었다. 반응은 TLC에 따르면 난잡하였다.
이 반응 혼합물을 EtOAc(50㎖)에 용해시켰다. 유기층을 포화 수성 NaHCO3(100㎖×2), 염수(100㎖)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과시키고, 진공 중 농축시켰다.
조질물을 DCM(5㎖)에 재용해시켰다. 조질의 용매를 MTBE(300㎖)의 용매에 서서히 적가하였다. 목적하는 생성물이 석출되었다. 이 생성물을 여과 후에 백색 고체로서 수집하고, 고체 케이크를 아이소프로필 에터 MTBE(50㎖×2)로 세척하였다.
화합물 7-3-10 DMTr-TTACC-OH(6.00g, 2.33 m㏖, 82.0% 수율, 89.1% 순도)를 백색 고체로서 얻었다.
HPLC(방법 B): RT= 6.449, 6.591분; LCMS(방법 F): RT= 1.312분; m/z: [M+2H]2+/2 = 1147.4.
화합물 7-3-10a의 제조
Figure pct00407
화합물 7-3-10a는 포스포아미다이트 합성에 대해서 위에서 기재된 바와 같은 유사한 절차를 이용해서 7-3-10으로부터 합성하였다. HPLC-MS(방법 G): RT = 8.174, 8.251, 8.420, 8.494분; m/z: [M-2H]2-/2 = 화합물 7-3-10a에 대해서 1245.4.
HO-TTACC-OTBDPS 7-3-11 의 제조
Figure pct00408
ACN(35㎖) 중 화합물 7-3-9(6.60g, 2.61 m㏖, 1.00 eq)의 용액에 도데칸-1-티올(791㎎, 3.91 m㏖, 936 uL, 1.50 eq)을 0℃에서 첨가하고, 이어서 TFA(2.38g, 20.8 m㏖, 1.54㎖, 8.00 eq)를 0℃에서 적가하였다. 이 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 교반하였다. TLC(DCM:MeOH=10:1, 생성물: Rf = 0.35)는 화합물 7-3-9가 완전히 소비되어 2개의 새로운 반점이 형성된 것을 나타내었다. 반응은 TLC에 따르면 난잡하였다. 이 반응 혼합물을 NaHCO3(100㎖ DI수 중 10.0 eq NaHCO3)에 붓고, 이어서 EtOAc 50㎖로 희석시키고, 수성 NaHCO3 100㎖로 추출하였다. 합한 유기층을 염수 200㎖(100㎖×2)로 세척하고, Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과시키고, 감압 하에 농축시켜 잔사를 제공하였다.
조질물을 DCM(80㎖)에 재용해시켰다. 조질의 용매를 MTBE(300㎖)의 용매에 서서히 적가하였다. 목적하는 생성물이 석출되었다. 이 생성물을 여과 후에 백색 고체로서 수집하고, 고체 케이크를 아이소프로필 에터 MTBE(50㎖×2)로 세척하였다. 화합물 7-3-11(HO-TTACC-OTBDPS)(5.35g, 2.37 m㏖, 90.7% 수율, 98.6% 순도)을 백색 고체로서 얻었다.
HPLC(방법 B): RT = 9.508, 9.650분; LCMS(방법 D): RT=1.444분; m/z: [M-2H]2-/2 = 1113.3.
3 . 5'-UTTC 4량체 또는 5'-DMTr-UTTC-OH 또는 5'-OH-UTTC-TBDPS 4량체(단편 3)의 제조를 위한 일반 절차
화합물 7-4-2의 제조를 위한 일반 절차
Figure pct00409
DCM(200㎖) 중 화합물 7-4-1(40.0g, 61.7 m㏖, 1.00 eq)의 용액에 이미다졸(21.0g, 308 m㏖, 5.00 eq)을 첨가하였다. 이 혼합물은 밝은 황색 균질 용액이었다. TBDPSCl(22.0g, 80.2 m㏖, 20.6㎖, 1.30 eq)을 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 16시간 동안 교반하였다. TLC(석유 에터:에틸 아세테이트 = 2:1, 생성물: Rf = 0.46)는 화합물 7-4-1이 완전히 소비되었고 하나의 새로운 반점이 형성된 것을 나타낸다. 반응물은 TLC에 따르면 투명하였다.
프로판-2-올(4.73㎖, 1.00 eq)을 첨가하고, 이 혼합물을 0.5시간 교반하였다. 상기 혼합물을 빙욕에서 0℃까지 냉각시켰다. 도데칸-1-티올(16.2g, 80.2 m㏖, 19.2㎖, 1.30 eq)을 첨가하고, 이 혼합물을 0℃에서 15분 동안 교반하였다. TFA(56.3g, 494 m㏖, 36.5㎖, 8.00 eq)를 0℃에서 적가하였다. 이 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 교반하였다. TLC(석유 에터:에틸 아세테이트 = 2:1, Rf = 0.24)는 출발 혼합물이 완전히 소비되었고 하나의 새로운 반점이 형성된 것을 나타낸다. 반응물은 TLC에 따르면 투명하였다. 이 반응 혼합물을 NaHCO3(500㎖ DI수 중 10.0 eq NaHCO3)에 붓고, 이어서 DCM 100㎖로 희석시키고, 수성 NaHCO3 200㎖로 추출하였다. 합한 유기층을 염수 200㎖(100㎖×2)로 세척하고, Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과시키고, 감압 하에 농축시켜 잔사를 제공하였다.
조질의 생성물을 DCM 100㎖에 용해시키고, 헵탄/TBME(v/v 9:1, 1200㎖)의 용매 혼합물에 깔때기로부터 조질의 생성물의 용액을 서서히 적가하여 석출 공정을 수행하였다. 이 공정은 약 0.5시간 걸렸다. 순수한 생성물을 부흐너 깔대기로 백색 고체로서 수집하고, 생성물의 케이크를 헵탄(100㎖×2)의 용매 혼합물로 세척하고, 건조 상태로 농축시켰다. 화합물 7-4-2(34.8g, 56.1 m㏖, 91.0% 수율, 94.2% 순도)를 백색 고체로서 얻었다.
HPLC(방법 A): RT = 7.136분 및 LCMS(방법 F): RT = 1.570분; m/z: [M+H]+ = 584.2
화합물 7-4-3 의 제조를 위한 일반 절차
Figure pct00410
화합물 7-4-2(15.0g, 25.7 m㏖, 1.00 eq) 및 dT 아미다이트(21.0g, 28.2 m㏖, 1.10 eq)를 250㎖ 1구 둥근 병에서 Ar하에 ACN/DCM(1/1, 100㎖×3)과 공증발시키고, 이 1구 병에 3Å 분자체(6.50g)를 첨가하고, Ar 압력 하에 ACN(60㎖) 및 DCM(60㎖)을 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 1시간 동안 교반하고, 이어서 이 혼합물에 DCI(4.55g, 38.5 m㏖, 1.50 eq)를 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 1시간 동안 교반하였다. HPLC(생성물: RT = 8.233분)는 화합물 7-4-2가 완전히 소비된 것을 나타내었다.
커플링 반응이 완료된 후에, 상기 용액에 BuOOH(6.62g, 51.3 m㏖, 7.04㎖, 70.0% 순도, 2.00 eq)를 25℃에서 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. HPLC(생성물: RT = 7.764, 7.826분)는 반응이 완결된 것을 나타내었다. 이 반응 혼합물을 NaHCO3 및 Na2SO3 용액(400㎖ DI수 중 10.0 eq NaHCO3 및 5.00 eq Na2SO3)에 붓고, 이어서 이 혼합물을 DCM(200㎖)으로 희석시키고, 두 층을 분리시키고, 유기층을 NaHCO3(200㎖), 염수(100㎖)로 세척하고, 건조시키고, 여과시키고, 농축시켰다.
화합물 7-4-3(36.0g, 24.9 m㏖, 97.1% 수율, 86.2% 순도)을 백색 고체로서 얻었다. HPLC: 생성물: RT = 7.764, 7.826분; LCMS: 화합물 7-4-3, RT = 1.602 분. 조질의 화합물 3은 다음 단계에서 사용하였다.
화합물 7-4-3(10.0g, 6.93 m㏖, 86.2% 순도)을 역상 MPLC(pH = 7 조건 MeCN/물)에 의해 정제시켰다. 화합물 7-4-3(8.00g, 6.19 m㏖, 89.2% 수율, 96.1% 순도)을 백색 발포물로서 얻었다. HPLC(방법 A): RT = 7.792, 7.845분 및 LCMS(방법 F): RT = 1.602분; m/z: [M+H]+ = 1243.4.
화합물 7-4-4 의 제조를 위한 일반 절차
Figure pct00411
ACN(120㎖) 중 화합물 7-4-3(26.0g, 20.9 m㏖, 1.00 eq)의 용액에 0℃로 냉각된 도데칸-1-티올(5.50g, 27.18 m㏖, 6.51㎖, 1.30 eq)을 첨가하고, 이어서 TFA(19.0g, 167 m㏖, 12.3㎖, 8.00 eq)를 0℃에서 적가하였다. 이 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 교반하였다. TLC(다이클로로메탄:메탄올 = 10:1, 생성물: Rf = 0.46)는 화합물 7-4-3이 완전히 소비되었고 하나의 새로운 반점이 형성된 것을 나타낸다. 반응물은 TLC에 따르면 투명하였다. 반응 혼합물을 NaHCO3 용액(400㎖ DI수 중 10.0 eq NaHCO3)에 붓고, 이어서 이 혼합물을 EtOAc(300㎖)로 희석시키고, 두 층을 분리시키고, 유기층을 NaHCO3(200㎖), 염수(200㎖)로 세척하고, Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과시키고, 감압 하에 농축시켜 잔사를 제공하였다.
이 혼합물을 CH3CN:H2O(2:1, 100㎖)에 재용해시키고, CH3CN/H2O층을 헵탄:tBuOMe = 4:1(200㎖×4)로 세척하고, 이어서 CH3CN 및 H2O의층을 EtOAc/MTBE(1/3, 120㎖)로 희석시켰다. 유기층을 DI수(100㎖)로 세척하고, 유기층을 염수(100㎖)로 세척하고, Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과시키고, 감압 하에 농축시켜 잔사를 제공하였다.
화합물 7-4-4(17.0g, 16.7 m㏖, 80.0% 수율, 92.6% 순도)를 백색 발포물로서 얻었다.
HPLC(방법 A): RT = 5.977분 및 LCMS(방법 E): RT = 1.241분; m/z: [M+H]+ = 941.5.
화합물 7-4-5의 제조를 위한 일반 절차
Figure pct00412
화합물 7-4-4(17.0g, 18.0 m㏖, 1.00 eq) 및 dT 아미다이트(14.8g, 19.8 m㏖, 1.10 eq)를 250㎖ 1구 둥근 병에서 Ar하에 ACN(100㎖×3)과 공증발시키고, 이 1구 병에 3Å 분자체(4.50g)를 첨가하고, Ar 압력 하에 ACN(85㎖)을 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 1시간 동안 교반하고, 이어서 이 혼합물에 DCI(3.20g, 27.1 m㏖, 1.50 eq)를 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 1시간 동안 교반하였다. HPLC(생성물: RT = 7.451분; 출발 물질: RT = 5.977분)는 출발 물질이 완전히 소비된 것을 나타내었다.
커플링 반응이 완료된 후에, 상기 용액에 BuOOH(4.65g, 36.1 m㏖, 4.95㎖, 70.0% 순도, 2.00 eq)를 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. HPLC(생성물: RT = 7.810분; 출발 물질: RT = 7.451분)는 출발 물질이 완전히 소비된 것을 나타내었다. 이 반응 혼합물을 NaHCO3 및 Na2SO3 용액(400㎖ DI수 중 10.0 eq NaHCO3 및 5.00 eq Na2SO3)에 붓고, 이어서 이 혼합물을 EtOAc(200㎖)로 희석시키고, 두 층을 분리시키고, 유기층을 NaHCO3(200㎖), 염수(100㎖)로 세척하고, 건조시키고, 여과시키고, 농축시켰다. 화합물 7-4-5(34.0g, 17.2 m㏖, 95.2% 수율, 81.0% 순도)를 백색 발포물로서 얻었다.
화합물 7-4-5(24.0g, 15.0 m㏖, 81.0% 순도)를 역상 HPLC(pH = 7 조건; MeCN/물)로 정제시켰다. 화합물 7-4-5(17.8g, 11.1 m㏖, 89.7% 수율, 98.2% 순도)를 백색 발포물로서 얻었다.
HPLC(방법 A): RT = 7.179분 및 LCMS(방법 D): RT = 1.530분; m/z: [M-H]- = 1599.6.
화합물 7-4-6 의 제조를 위한 일반 절차
Figure pct00413
ACN(65㎖) 중 화합물 7-4-5(12.6g, 7.87 m㏖, 1.00 eq)의 용액에 도데칸-1-티올(2.07g, 10.2 m㏖, 2.45㎖, 1.30 eq)을 0℃에서 첨가하고, 이어서 TFA(7.18g, 62.9 m㏖, 4.66㎖, 8.00 eq)를 0℃에서 적가하였다. 이 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 교반하였다. TLC(다이클로로메탄:메탄올 = 10:1, 생성물: Rf = 0.36)는 화합물 7-4-5가 완전히 소비되었고 하나의 새로운 반점이 형성된 것을 나타낸다. 반응물은 TLC에 따르면 투명하였다. 이 반응 혼합물을 NaHCO3(200㎖ DI수 중 10.0 eq NaHCO3)에 붓고, 이어서 EtOAc 100㎖로 희석시키고, 수성 NaHCO3 100㎖로 추출하였다. 합한 유기층을 염수 200㎖(100㎖×2)로 세척하고, Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과시키고, 감압 하에 농축시켜 잔사를 제공하였다.
조질의 생성물을 DCM 100㎖에 용해시키고, 헵탄/TBME(v/v 9:1, 500㎖)의 용매 혼합물에 깔때기로부터 조질의 생성물의 용액을 서서히 적가하여 석출 공정을 수행하였다. 이 공정은 약 0.5시간 걸렸다. 순수한 생성물을 부흐너 깔때기로 백색 고체로서 수집하고, 생성물의 케이크를 헵탄(100㎖×2)의 용매 혼합물로 세척하고, 건조 상태로 농축시켰다.
화합물 7-4-6(11.0g, 7.75 m㏖, 98.4% 수율, 91.4% 순도)을 백색 고체로서 얻었다.
HPLC(방법 A): RT = 5.661분 및 LCMS(방법 F): RT = 1.365분; m/z: [M+H]+ = 1298.4.
UTTC 4량체 7-4-7 의 제조를 위한 일반 절차
Figure pct00414
화합물 7-4-6 (11.0g, 8.47 m㏖, 1.00 eq) 및 MOE T 아미다이트(7.63g, 9.32 m㏖, 1.10 eq)를 250㎖ 1구 둥근 병에서 Ar하에 ACN(100㎖×3)과 공증발시키고, 이 1구 병에 3Å 분자체(3.00g)를 첨가하고, Ar 압력 하에 ACN(55㎖)을 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 1시간 동안 교반하고, 이어서 이 혼합물에 DCI(1.50g, 12.7 m㏖, 1.50 eq)를 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 1시간 동안 교반하였다. HPLC(생성물: RT = 7.056, 7.180분; 출발 물질: RT = 5.661분)는 출발 물질이 완전히 소비된 것을 나타내었다.
커플링 반응이 완료된 후에, 상기 용액에 BuOOH(2.18g, 16.9 m㏖, 2.32㎖, 70.0% 순도, 2.00 eq)를 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. HPLC(생성물: RT = 6.897, 6.961분; 출발 물질: RT =7.056, 7.180분)는 출발 물질이 완전히 소비된 것을 나타내었다. 이 반응 혼합물을 NaHCO3 및 Na2SO3 용액(500㎖ DI수 중 10.0 eq NaHCO3 및 5.00 eq Na2SO3)에 붓고, 이어서 이 혼합물을 EtOAc(200㎖)로 희석시키고, 두 층을 분리시키고, 유기층을 NaHCO3(200㎖), 염수(200㎖)로 세척하고, 건조시키고, 여과시키고, 농축시켰다.
조질물을 DCM(50㎖)에 재용해시켰다. 조질의 용매를 MTBE(600㎖)의 용매에 서서히 적가하였다. 목적하는 생성물이 석출되었다. 이 생성물을 여과 후에 백색 고체로서 수집하고, 고체 케이크를 아이소프로필 에터 MTBE(50㎖×2)로 세척하였다. 조질의 고체를 역상 HPLC(pH = 7 조건; MeCN/물)에 의해 정제시켰다. 화합물 7-4-7(UTTC 4량체)(14.5g, 7.06 m㏖, 83.3% 수율, 98.9% 순도)을 백색 고체로서 얻었다.
HPLC(방법 B): RT = 10.638, 10.822분 및 LCMS(방법 D): RT = 1.396분; m/z: [M-H]- = 1014.3.
7-4-8(DMTr-UTTC-OH) 의 제조를 위한 일반 절차
Figure pct00415
ACN(35㎖) 중 7-4-7(6.60g, 3.25 m㏖, 1.00 eq)의 용액에, 이어서 THF(8㎖) 중 피리딘; 하이드로플루오라이드(928㎎, 32.4 m㏖, 844 uL, 70.0% 순도, 10.0 eq) 및 이미다졸(4.42g, 64.9 m㏖, 20.0 eq)을 0℃에서 적가하였다. 이 혼합물을 0℃에서 3시간 동안 교반하였다. TLC(다이클로로메탄:메탄올 = 10:1, 생성물: Rf = 0.33)는 화합물 7-4-7이 완전히 소비되어 2개의 새로운 반점이 형성된 것을 나타내었다. 반응은 TLC에 따르면 난잡하였다.
이 반응 혼합물을 EtOAc(20㎖)에 용해시켰다. 유기층을 포화 수성 NaHCO3(50㎖×2), 염수(20㎖)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과시키고, 진공 중 농축시켰다. 조질물을 DCM(5㎖)에 재용해시켰다. 조질의 용매를 MTBE(300㎖)의 용매에 서서히 적가하였다. 목적하는 생성물이 석출되었다. 이 생성물을 여과 후에 백색 고체로서 수집하고, 고체 케이크를 아이소프로필 에터 MTBE(50㎖×2)로 세척하였다.
화합물 7-4-8(DMTr-UTTC-OH)(5.57g, 2.90 m㏖, 89.3% 수율, 93.4% 순도)을 백색 고체로서 얻었다.
HPLC(방법 B): RT = 4.461, 4.761분 및 LCMS(방법 D): RT = 1.237분; m/z: [M-H]- = 1791.5.
7-4-8a(단편 3) 의 제조를 위한 일반 절차
Figure pct00416
화합물 7-4-8a는 포스포아미다이트 합성에 대해서 위에서 기재된 바와 같이 유사한 절차를 이용해서 7-4-8로부터 합성하였다. HPLC-MS(방법 G): RT = 7.335, 7.446, 7.583, 7.637분; m/z: [M-H]- = 화합물 7-4-8a에 대해서 1991.6.
7-4-9(HO-UTTC-OTBDPS) 의 제조를 위한 일반 절차
Figure pct00417
ACN(30㎖) 중 7-4-7(6.00g, 2.95 m㏖, 1.00 eq)의 용액에 도데칸-1-티올(896㎎, 4.43 m㏖, 1.06㎖, 1.50 eq)을 첨가하고, 이어서 TFA(2.69g, 23.6 m㏖, 1.75㎖, 8.00 eq)를 0℃에서 적가하였다. 이 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 교반하였다. TLC(DCM: MeOH = 10:1, 생성물: Rf = 0.35)는 7-4-7이 완전히 소비되어 2개의 새로운 반점이 형성된 것을 나타내었다. 반응은 TLC에 따르면 난잡하였다.
이 반응 혼합물을 NaHCO3(100㎖ DI수 중 10.0 eq NaHCO3)에 붓고, 이어서 EtOAc 50㎖로 희석시키고, 수성 NaHCO3 100㎖로 추출하였다. 합한 유기층을 염수 200㎖(100㎖×2)로 세척하고, Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과시키고, 감압 하에 농축시켜 잔사를 제공하였다.
조질물을 DCM(80㎖)에 재용해시켰다. 조질의 용매를 MTBE(300㎖)의 용매에 서서히 적가하였다. 목적하는 생성물이 석출되었다. 이 생성물을 여과 후에 백색 고체로서 수집하고, 고체 케이크를 아이소프로필 에터 MTBE(50㎖×2)로 세척하였다.
화합물 7-4-9(HO-UTTC-OTBDPS)(4.97g, 2.86 m㏖, 96.6% 수율, 및 99.3% 순도)를 백색 고체로서 얻었다.
HPLC(방법 B): RT = 6.895분; LCMS(방법 F): RT = 1.323분; m/z: [M+H]+ = 1729.6.
C. 표적 올리고뉴클레오타이드 ASO 9-1의 수렴형 합성
ASO 9-1 및 9-2 및 이들의 중간체 7a-e의 합성에 대한 HPLC-MS 방법.
칼럼: ACQUITY UPLC 올리고뉴클레오타이드 BEH C18 칼럼, 130Å, 1.7㎛, 2.1㎜×150㎜;
칼럼 온도: 35℃;
200 내지 2300의 질량 범위;
MS 극성: 음성
이동상:
용액 A: 10% CH3CN 중 5mM 트라이부틸아민 아세테이트(TBuAA), 1μM EDTA;
용액 B: 80% CH3CN 중 5mM TBuAA, 1μM EDTA
구배:
Figure pct00418
ASO 9-1은 ASO 9 합성에 대해서 위에서 개시된 방법과 유사한 수렴형 합성 절차를 이용해서 합성하였다.
화합물 7-a 의 제조를 위한 일반 절차
Figure pct00419
위에서 개시된 바와 같은 유사한 절차를 이용해서 단편 1 및 2를 커플링시켜 7-a를 합성하였다. 7-a는 암모니아분해를 이용해서 LHPG기를 탈보호 후에 HPLC 및 질량 분광분석법에 의해 특성규명하였다; HPLC-MS: RT = 7.247분 및 m/z = 1831.5(도 21 참조).
화합물 7-b 의 제조를 위한 일반 절차
Figure pct00420
화합물 7-b는 위에 개시된 탈트라이틸화 방법을 이용해서 7-a로부터 합성하였다. 7-b는 암모니아분해를 이용해서 LHPG기를 탈보호 후에 HPLC 및 질량 분광분석법에 의해 특성규명하였다. HPLC-MS: RT = 6.250분 및 m/z = 1680.4(도 22 참조)
화합물 7-c 의 제조를 위한 일반 절차
Figure pct00421
위에서 개시된 바와 같은 유사한 절차를 이용해서 단편 3 및 7-b를 커플링시켜 7-c를 합성하였다. 7-c는 암모니아분해를 이용해서 LHPG기를 탈보호 후에 HPLC 및 질량 분광분석법에 의해 특성규명하였다. HPLC-MS: RT = 7.627분 및 m/z = 1650.6(도 23 참조)
화합물 7-d 의 제조를 위한 일반 절차
Figure pct00422
화합물 7-d는 위에서 개시된 탈트라이틸화 방법을 이용해서 7-c로부터 합성하였다. 7-d는 암모니아분해를 이용해서 LHPG기를 탈보호 후에 HPLC 및 질량 분광분석법에 의해 특성규명하였다; HPLC-MS: RT = 7.801분 및 m/z = 1549.9(도 24 참조).
화합물 ASO-9-1 의 제조를 위한 일반 절차
Figure pct00423
ASO-9-1은 ASO 9의 합성에 대해서 개시된 바와 같은 유사한 절차를 이용해서 단편 7-d와 단편 4를 커플링시킴으로써 합성하였다. ASO-9-1은 HPLC-MS에 의해 확인하였다: RT = 10.224분 및 m/z: = 2168.0(도 25 참조).
D. 표적 올리고뉴클레오타이드 ASO-9-2의 수렴형 합성
Figure pct00424
ASO 9-2는 ASO 9 및 ASO-9-1 합성에 대해서 위에서 개시된 방법과 유사한 수렴형 합성 절차를 이용해서 합성하였다.
Figure pct00425
화합물 7-e는 위에서 개시된 커플링 절차에 이어서 위에서 개시된 탈트라이틸화 방법을 이용해서 단편 5-4 및 단편 7-b에 의를 커플링시킴으로써 합성하였다. 7-e는 암모니아분해를 이용해서 LHPG기를 탈보호 후에 HPLC 및 질량 분광분석법에 의해 특성규명하였다; HPLC-MS: RT = 7.773분 및 m/z = 1570.9(도 26 참조)
화합물 ASO-9-2 의 제조를 위한 일반 절차
Figure pct00426
ASO-9-2는 ASO 9 및 ASO-9-1의 합성에 대해서 개시된 바와 같은 유사한 절차를 이용해서 단편 7-e와 단편 4를 커플링시킴으로써 합성하였다. ASO-9-2는 HPLC-MS: RT = 9.917분 및 m/z: = 2189.4에 의해 확인되었다(도 27 참조).
실시예 8. PSI 화학을 이용한 입체특이적 올리고뉴클레오타이드의 합성
하기에 기재된 분취-HPLC 방법에 대해서, 이동상 용매는 [A-B]의 형태로 기재되는데, 여기서 A는이동상 A를 지칭하고, B는 이동상 B를 지칭한다. 예를 들어, 이동상[TEAB(10mM)-ACN]은 10mM TEAB가 이동상 A로서 사용되었고 HPLC 등급 아세토나이트릴이 이동상 B로서 사용된 것을 의미한다.
실시예 8에 기재된 화합물 및 올리고뉴클레오타이드의 합성에 대해서 이하의 분석 방법을 사용하였다.
HPLC 방법:
Figure pct00427
LC-MC 방법:
Figure pct00428
1.1 dTdAdCdC 단편의 선형 합성
Figure pct00429
화합물 8.2의 제조
화합물 dC(10g, 15.44 m㏖, 1 eq)를 ACN(10㎖×2)과 공비시켰다. 화합물 dC(10g, 15.44 m㏖, 1 eq) 및 PSI 시약의 용액에, ACN(60㎖) 중 화합물 8.1(8.96g, 20.07 m㏖, 1.3 eq)에 DBU(3.06g, 20.07 m㏖, 3.03㎖, 1.3 eq)를 0℃에서 N2 하에 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. TLC(석유 에터/에틸 아세테이트=2:1, Rf = 0.54)는 화합물 dC가 완전히 소비된 것을 나타내었다. 이 혼합물을 실리카겔의 짧은 패드를 통해서 여과시키고, 이어서 실리카겔을 EA(60㎖×2)로 세척하였다. 유기상을 포화 KH2PO4(30㎖), 포화 NaHCO3(30㎖), 염수(30㎖×2)로 세척하고, 무수 Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과시키고, 용매를 진공 중 제거하였다. 조질의 생성물을 크로마토그래피(SiO2, 석유 에터/에틸 아세테이트=50/1 내지 1/1)에 의해 정제시켰다. 화합물 8.2(7.3g, 8.00 m㏖, 51.83% 수율, 98% 순도)를 백색 고체로서 얻었다. IPC(공정 제어에서): TLC(석유 에터/에틸 아세테이트= 2:1, 생성물(Rf) = 0.54) HPLC는 RT = 8.666을 나타낸다.
화합물 8.4의 제조
화합물 8.3(4g, 6.85 m㏖, 1 eq)을 ACN(10㎖×2)과 공비시켰다. ACN(24㎖) 중 화합물 8.3(3.5g, 6.00 m㏖, 1 eq)에 분자체 3A(1g, 1.00 eq)를 25℃에서 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. 이어서, 화합물 8.2(5.90g, 6.60 m㏖, 1.1 eq) 및 DBU(2.74g, 17.99 m㏖, 2.71㎖, 3 eq)를 25℃에서 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. LCMS(생성물: RT = 1.469분)는 화합물 8.2이 완전히 소비된 것을 나타내었다. 이 혼합물을 에틸 아세테이트(10㎖), 20% 시트르산(10㎖)로 희석시켰다. 유기상을 H2O(10㎖), 포화 NaHCO3(10㎖), 염수(10㎖)로 세척하고, 무수 Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과시키고, 용매를 진공 중 제거하였다. 조질의 생성물을 정제 없이 사용하였다. 화합물 8.4[(m/z-H+)=1307.6, 9.48g, 조질물]를 황색 고체로서 얻었다.
화합물 8.4의 입체선택성을 초유체 크로마토그래프(SFC)(이하에 기재됨)에 의해 시험하였다. 화합물 8.4는 RT = 2.30분에 단일 피크를 입증하였다(도 28 참조). 다른 피크는 검출되지 않는다. 입체선택성은 99.5% 초과이다.
SFC 방법:
기기: CAS-TJ-ANA-SFC-1 (Waters SFC-MS)
칼럼: chiralcel OD-3, 4.6*100㎜, 3um
이동상: SFC CO2에 대해서 A 그리고 EtOH에 대해서 B(0.05%IPAm)
구배: B는 10분에 40%이다
유량: 4.0㎖/분
칼럼 온도: 35℃
파장: 220㎚
시스템 배압: 100 bar
비교를 위하여, 라세미 샘플은 2가지 체류 시간: 2.79분 및 4.33분을 가진 표준품으로서 아미다이트 화학에 의해 합성되었다(도 29 참조).
Figure pct00430
화합물 8.5의 제조
DCM(55㎖) 중 화합물 8.4(7.85g, 5.99 m㏖, 1 eq)의 용액에 2,2-다이클로로아세트산(5.18g, 40.18 m㏖, 3.3㎖, 6.70 eq)을 25℃에서 N2 하에 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 1시간 동안 교반하였다. LCMS(생성물: RT = 1.352분)는 화합물 8.4가 완전히 소비된 것을 나타내었다. 이 혼합물을 TEAB(10㎖), DCM(10㎖)으로 희석시켰다. 유기상을 H2O(10㎖), 포화 NaHCO3(10㎖), 염수(10㎖×2)로 세척하고, 무수 Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과시키고, 용매를 진공 중 제거하였다. 잔사를 분취-HPLC(중성 조건)(칼럼: YMC-Triart Prep C18 250*50㎜*10um; 이동상: [TEAB(10mM)-ACN]; B%: 45%-65%, 22분)에 의해 정제시켰다. 화합물 8.5(3.8g, 3.70 m㏖, 61.68% 수율, 98% 순도)를 백색 고체로서 얻었다. MS (m-H+)/z =1005.4,
화합물 8.7의 제조
화합물 8.5(3.5g, 3.48 m㏖, 1 eq)를 ACN(10㎖×2)과 공비시켰다. ACN(25㎖) 중 화합물 8.5(3.5g, 3.48 m㏖, 1 eq)에 분자체 3Å(0.5g, 3.48 m㏖, 1.00 eq)를 25℃에서 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. 이어서, 화합물 8.6(4.71g, 5.21 m㏖, 1.5 eq) 및 DBU(1.59g, 10.43 m㏖, 1.57㎖, 3 eq)를 25℃에서 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. LCMS(생성물: RT = 1.314분, (m-H+)/z = 1740.4)는 화합물 8.5가 완전히 소비된 것을 나타내었다. 이 혼합물을 DCM(10㎖), 20% 시트르산(10㎖×2)으로 희석시켰다. 유기상을 H2O(10㎖), NaHCO3(10㎖), 염수(10㎖)로 세척하고, 무수 Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과시키고, 용매를 진공 중 제거하였다. 조질의 생성물을 분취-HPLC(기기: Shimadzu 20AP; 칼럼: YMC-Actus Triart C18 150*30㎜*5um; 이동상: [TEAB(10mM)-ACN]; B%: 20%-60%, 12분)에 의해 정제시켰다. 화합물 8.7(2.7g, 53.79% 수율, 97% 순도)을 황색 고체로서 얻었다.
화합물 8.9의 제조
화합물 8.7(1g, 694.20 u㏖, 1 eq)을 ACN(5㎖×2)과 공비시켰다. ACN(7㎖) 중 화합물 8.7(1g, 694.20 u㏖, 1 eq)에 분자체 3Å(0.5g, 208.26 u㏖, 1.00 eq)을 25℃에서 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. 이어서, 화합물 8.8(1.10g, 1.39 m㏖, 2 eq) 및 DBU(317.06㎎, 2.08 m㏖, 313.92 uL, 3 eq)를 25℃에서 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. LCMS(생성물: RT = 1.254분)는 화합물 8.7이 완전히 소비된 것을 나타내었다. 이 혼합물을 DCM(30㎖), pH=3 시트르산(20㎖)으로 희석시켰다. 유기상을 H2O(20㎖), TEAB(20㎖), 염수(20㎖)로 세척하고, 무수 Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과시키고, 용매를 진공 중 제거하였다. 조질의 생성물을 정제 없이 사용하였다. 화합물 8.9를 황색 고체(MS(m-2H+)/z=807.3, 2.1g, 75.49% LCMS 순도)로서 얻었다.
화합물 8A의 제조
DCM(12㎖) 중 화합물 8.9(1.43g, 693.12 u㏖, 1 eq)의 용액에 2,2-다이클로로아세트산(1.13g, 8.77 m㏖, 720.00 uL, 12.65 eq)을 25℃에서 N2 하에 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 1시간 동안 교반하였다. LCMS(생성물: RT = 1.168분)는 출발 물질이 완전히 소비된 것을 나타내었다. 이 혼합물을 TEAB(15㎖), DCM(25㎖)로 희석시켰다. 유기상을 H2O(20㎖), 염수(20㎖)로 세척하고, 무수 Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과시키고, 용매를 진공 중 제거하였다. 조질의 생성물을 분취-HPLC(중성 조건)(칼럼: YMC-Actus Triart C18 150*30㎜*5um; 이동상: [TEAB(10mM)-ACN]; B%: 10%-40%, 10분)에 의해 정제시켰다. 화합물 8A[(m-2H+)/z=879.6, 522㎎, 2개 단계에 대해서 41.0% 수율, 97.6% 순도)를 백색 고체로서 얻었고 HPLC 및 MS에 의해 특성규명하였다(도 30 참조).
1.1.1 TACC 사량체 합성 동안의 커플링 조건:
커플링 반응 후 IPC에 기초하여, 커플링 단계의 전환이 완결되었다. 상이한 단계 및 HPLC 순도에서의 요약된 커플링 단계 조건은 다음과 같았다:
Figure pct00431
결론으로서, 사량체 올리고뉴클레오타이드는 PSI-시약으로 액상 선형 연장 방법을 이용해서 합성하였다. DCA에 의한 탈트라이틸화는 아데노신의 탈순화(de-prunination)를 초래하였다. 삼량체의 탈-트라이틸화는 20% 시트르산을 이용하는 산성 워크업 단계에 의해 달성되었다. 커플링 효율은 올리고뉴클레오타이드가 더 길게 성장함에 따라서 감소된다. 추가의 당량의 PSI-아미다이트의 및 DBU가 커플링의 후기 단계에서 필요하다. 벤질 및 아이소부티릴 보호기의 존재는, 커플링 조건 하에, 특히 DBU의 처리 하에 방해되지 않는다.
1.2 PSI 화학을 이용함에 의한 MOE-단편 DMTO-AGUCU-OH의 선형 연장
PSI 시약을 이용함에 의한 MOE-올리고의 합성은 보고되어 있지 않다. PSI 화학은 2' MOE 뉴클레오사이드의 커플링 반응에 적용되었고, 2' MOE 올리고 8B의 연장에 대한 액상 합성 공정이 개발되었다.
Figure pct00432
Figure pct00433
화합물 8.2.2의 합성
ACN(35㎖) 중 화합물 8.2.1(5.00g, 6.93 m㏖, 1 eq) 및 PSI 시약(4.02g, 9.01 m㏖, 1.3 eq)의 용액에 DBU(1.37g, 9.01 m㏖, 1.36㎖, 1.3 eq)를 0℃에서 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. TLC(석유 에터:에틸 아세테이트=0:1, Rf =0.82)는 반응물 8.2.1이 완전히 소비된 것을 나타내었다. 이 혼합물을 실리카겔의 짧은 패드를 통해서 여과시키고, 이어서 실리카겔을 EA(80㎖×2)로 세척하였다. 여과액을 포화 KH2PO4(100㎖), 포화 NaHCO3(100㎖), 염수(100㎖)로 세척하고, 무수 Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과시키고, 농축시켰다. 잔사를 크로마토그래피(SiO2, 석유 에터/에틸 아세테이트=30/1 내지 0/1)로 정제시켰다. 화합물 8.2.2[(m-H+)/z =966.4, 5.5g, 5.51 m㏖, 79.55% 수율, 97% 순도]를 백색 고체로서 얻었다.
화합물 8.2.4의 합성
화합물 8.2.2(5.00g, 9.01 m㏖, 1 eq)를 ACN(40㎖×2)과 공비시키고, 화합물 8.2.3(9.60g, 9.92 m㏖, 1.1 eq)을 ACN(40㎖×2)과 공증발시켰다. ACN(35㎖) 중 화합물 8.2.2(5g, 9.01 m㏖, 1 eq) 및 화합물 8.2.3(9.60g, 9.92 m㏖, 1.1 eq)의 용액에 DBU(4.12g, 27.04 m㏖, 4.08㎖, 3 eq)를 25℃에서 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. LCMS는 화합물 8.2.2가 완전히 소비된 것을 나타내었다. 이 혼합물을 EA(150㎖), 20% 시트르산(80㎖)으로 희석시켰다. 유기상을 포화 NaHCO3(150㎖), H2O(150㎖), 염수(150㎖×2)로 세척하고, 무수 Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과시키고, 용매를 진공 중 제거하였다. 조질의 생성물은 정제 없이 다음 단계에 사용하였다. 화합물 8.2.4[(m-H+)/z =1353.6, 12.21g, 조질물]를 황색 고체로서 얻었다.
화합물 8.2.5의 합성
DCM(85㎖) 중 화합물 8.2.4(12.21g, 9.01 m㏖, 1 eq)의 용액에 2,2-다이클로로아세트산(8.01g, 62.10 m㏖, 5.1㎖, 6.89 eq)을 25℃에서 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 1시간 동안 교반하였다. LCMS는 화합물 8.2.4가 완전히 소비된 것을 나타내었다. 이 혼합물을 TEAB(150㎖)를 서서히 첨가하고, DCM(150㎖)으로 추출하였다. 이어서, 유기상을 포화 NaHCO3(150㎖), H2O(150㎖), 염수(150㎖)로 세척하고, 무수 Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과시키고, 용매를 진공 중 제거하였다. 조질의 생성물을 분취-HPLC에 의해 정제시켰다: 칼럼: Agela DuraShell C18 250*50㎜*10um; 이동상: [TEAB(10mM)-ACN]; B%: 30%-53%, 22분. 화합물 8.2.5[(m-H+)/z =1050.5, 6.9g, 6.36 m㏖, 70.57% 수율, 97% 순도]를 백색 고체로서 얻었다.
화합물 8.2.7의 합성
화합물 8.2.5(4.50g, 4.28 m㏖, 1 eq)를 ACN(40㎖×2)과 공비시키고, 화합물 8.2.6(5.55g, 6.42 m㏖, 1.5 eq)를 ACN(40㎖×2)과 공증발시켰다. ACN(30㎖) 중 화합물 8.2.5(4.5g, 4.28 m㏖, 1 eq)의 용액에 분자체 3A(2.40g, 4.28 m㏖, 1.00 eq)를 25℃에서 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. 이어서, 화합물 8.2.6(5.55g, 6.42 m㏖, 1.5 eq)을 25℃에서 첨가하였다. DBU(1.95g, 12.83 m㏖, 1.93㎖, 3 eq)를 25℃에서 서서히 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. LCMS는 8.2.5가 완전히 소비된 것을 나타내었다. 이 혼합물을 DCM(200㎖), pH~3 시트르산(150㎖)으로 희석시켰다. 유기상을 NaHCO3(200㎖), H2O(200㎖), 염수(200㎖)로 세척하고, 무수 Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과시키고, 용매를 진공 중 제거하였다. 조질의 생성물은 정제 없이 다음 단계에 사용하였다. 화합물 8.2.7(9.3g, 조질물)을 황색 고체로서 얻었다.
화합물 8.2.8의 합성
DCM(60㎖) 중 화합물 8.2.7(7.48g, 4.28 m㏖, 1 eq)의 용액에 2,2-다이클로로아세트산(7.85g, 60.88 m㏖, 5㎖, 14.23 eq)을 25℃에서 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 1시간 동안 교반하였다. LCMS는 화합물 8.2.7이 완전히 소비된 것을 나타내었다. 이 혼합물을 DCM(150㎖)으로 희석시키고, TEAB(150㎖)에 의해 ??칭시켰다. 유기상을 NaHCO3(150㎖), H2O(150㎖), 염수(150㎖)로 세척하고, 무수 Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과시키고, 용매를 진공 중 제거하였다. 조질의 생성물을 TBME(250㎖)와 배산시키고, 이어서 여과시키고, 고체를 TEAB로 세척하였다. 조질의 생성물을 분취-HPLC: 칼럼: YMC-Triart Prep C18 250*50㎜*10um; 이동상: [TEAB(10mM)-ACN]; B%: 25%-48%, 22분]에 의해 정제시켰다. 화합물 8.2.8[(m-H+)/z =1444.5, 3.3g, 2.21 m㏖, 51.74% 수율, 97% 순도]을 황색 고체로서 얻었다.
화합물 8.2.10의 합성
화합물 2.18(3.3g, 2.28 m㏖, 1 eq)을 ACN(20㎖×2)과 공비시키고, 화합물 8.2.9(3.29g, 3.42 m㏖, 1.5 eq)를 ACN(20㎖×2)와 공증발시켰다. ACN(20㎖) 중 화합물 8.2.8(3.3g, 2.28 m㏖, 1 eq)의 용액에 분자체 3A(1.6g, 2.28 m㏖, 1 eq)를 25℃에서 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. 이어서, 화합물 8.2.9(3.29g, 3.42 m㏖, 1.5 eq) 및 DBU(1.74g, 11.41 m㏖, 1.72㎖, 5 eq)를 25℃에서 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. LCMS는 화합물 8.2.8이 완전히 소비된 것을 나타내었다. 이 혼합물을 DCM(50㎖), 20% 시트르산(50㎖)으로 희석시켰다. 유기상을 TEAB(50㎖)로 세척하고, 무수 Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과시키고, 용매를 진공 중 제거하였다. 조질의 생성물을 분취-HPLC에 의해 정제시켰다: 칼럼: Agela DuraShell C18 250*50㎜*10um; 이동상: [TEAB(10mM)-ACN]; B%: 15%-45%, 22분. 화합물 8.2.10[(m-2H+)/z =967.1, 3.1g, 1.54 m㏖, 67.38% 수율, 96% 순도)을 백색 고체로서 얻었다.
화합물 8.2.12의 합성
화합물 8.2.10(2.1g, 1.08 m㏖, 1 eq)을 ACN(20㎖×2)과 공비시키고, 화합물 8.2.11(2.12g, 2.17 m㏖, 2 eq)을 ACN(20㎖×2)과 공증발시켰다. ACN(14㎖) 중 화합물 8.2.10(2.1g, 1.08 m㏖, 1 eq)의 용액에 분자체 3Å(1.2g, 1.08 m㏖, 1.00 eq)을 25℃에서 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. 이어서, 화합물 8.2.11(2.12g, 2.17 m㏖, 2 eq) 및 DBU(495.42㎎, 3.25 m㏖, 490.51 uL, 3 eq)를 25℃에서 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. LCMS는 화합물 8.2.10이 완전히 소비된 것을 나타내었다. 이 혼합물을 3A MS로 여과시키고, 그 여과 케이크를 ACN(5㎖)으로 세척하였다. 조질의 생성물을 분취-HPLC(칼럼: YMC-Triart Prep C18 250*50㎜*10um; 이동상: [TEAB(10mM)-ACN]; B%: 18%-50%, 22분)에 의해 정제시켰다. 화합물 8.2.12[(m-2H+)/z =1371.8, 1.92g, 678.28 u㏖, 62.53% 수율, 97% 순도]를 백색 고체로서 얻었으며, HPLC 및 LCMS에 의해 특성규명되었다(도 31 참조).
화합물 8B의 합성
THF(2㎖) 중 화합물 8.2.12(0.18g, 65.56 u㏖, 1 eq)의 용액에 TBAF(1M, 196.67 uL, 3 eq)를 25℃에서 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 24동안 교반하였다. LCMS는 화합물 8.2.12이 완전히 소비된 것을 나타내었다. 이 혼합물을 TEAB(10㎖)로 세척하고, DCM(10㎖)으로 희석시키고, 무수 Na2SO4 위에서 건조시키고, 이어서 여과시키고 농축시켰다. 조질의 생성물을 분취-HPLC(칼럼: YMC-Actus Triart C18 150*30㎜*5um; 이동상: [TEAB(10mM)-ACN]; B%: 30%-60%, 12분)에 의해 정제시켰다. 화합물 8B[(m-3H+)/z = 834.8, 0.124g, 47.48 u㏖, 72.42% 수율, 96% 순도]를 백색 고체로서 얻었으며, HPLC 및 LCMS에 의해 특성규명되었다(도 32 참조).
1.2.1 MOE 단편에 대한 커플링 조건
커플링 반응 후 IPC에 기초하여, 커플링 단계의 전환이 완결되었다. 상이한 단계에서의 요약된 커플링 단계 조건 및 HPLC 순도는 다음과 같이 나열된다:
Figure pct00434
결론으로서, 오량체 올리고뉴클레오타이드는 PSI-시약에 의한 2'-MOE 아미다이트의 액산 선형 연장을 이용해서 합성하였다. DCA에 의한 탈트라이틸화는 아데노신의 탈순화를 초래하였다. 삼량체의 탈-트라이틸화는 20% 시트르산을 이용하는 산성 워크업 단계에 의해 달성되었다. 데옥시 올리고뉴클레오타이드의 연장과 유사하게, 커플링 효율은 올리고뉴클레오타이드가 더 길게 성장함에 따라서 감소된다. 추가의 당량의 PSI-아미다이트의 및 DBU가 커플링의 후기 단계에서 필요하다.
1.3 단편의 수렴형 합성.
Figure pct00435
단편 8C는 단편 8A와 8B-2를 합하여 합성하였다. 단편 8B-2는 8B-1로부터 합성하였으며, 단편 8A의 합성은 위에 기재되어 있었다.
Figure pct00436
UdTdTdC 단편 8B-2의 합성
ASO 9 합성 동안 아미다이트 화학으로부터 얻어진 사량체 단편의 아민의 처리로 사이아노에틸기의 절단에 의해 UdTdTdC 단편의 형성을 제공하고, 이어서 ACN 중 PSI 시약(10 eq)과 0℃에서 커플링시켰다. 생성물 8B-2는 물에 극히 민감하다. 워크업이 공기 중에 노출된다면, 생성물은 수분에 의해 가수분해될 것이다.
Figure pct00437
사이아노에틸기의 절단을 위한 2종의 아민, 즉, 2-메틸프로판-2-아민 및 TEA가 스크리닝되었다. 그 결과는 하기 표에 나열되어 있다:
Figure pct00438
ASO 8C의 수렴형 합성
Figure pct00439
화합물 8A(0.05g, 28.40 u㏖, 1 eq)를 ACN(2㎖*2)과 공비시켰다. 화합물 8B-2(164.32㎎, 85.19 u㏖, 3 eq)를 ACN(2㎖*2)과 공비시켰다. ACN(0.1㎖) 중 화합물 8B-2에 분자체 3Å(0.015g, 1.00 eq)을 25℃에서 첨가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. 화합물 8A(0.05g, 28.40 u㏖, 1 eq)을 ACN(0.2㎖) 중 DBU(30.26㎎, 198.78 μ㏖, 29.96㎕, 7 eq)와 사전 혼합하고, 이어서 상기 혼합물을 ACN(0.1㎖) 중 화합물 8B-2(164.32㎎, 85.19 u㏖, 3 eq)에 25℃에서 Ar 하에 적가하였다. 이 혼합물을 25℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. LCMS 및 HPLC는, 출발 물질이 90% 초과분 소비된 것을 나타내었다. 이 반응 혼합물을 여과시켰다. 이 혼합물을 분취-HPLC(중성 조건, 칼럼: Phenomenex Gemini-NX 80*30㎜*3um; 이동상: [물(10mM NH4HCO3)-ACN]; B%: 25%-55%, 7분)에 의해 정제시켰다. 화합물 8C[(m-4H+)/z = 879.4, 40.0㎎, 9.77 u㏖, 34.4% 수율, 86% 순도]를 백색 고체로서 얻었으며, HPLC 및 LCMS에 의해 특성규명되었다(도 33 참조).
결론으로서, PSI 화학은, 입체조절된 ASO의 수렴형 액상 합성에서뿐만 아니라 데옥시 사량체 및 2'-MOE 오량체의 액상 합성에서 성공적으로 적용되었다. 수렴형 커플링 반응은 수분에 매우 민감하다. H2O의 ACN과의 사전-공비혼합물은 높은 반응 전환율을 확보하는데 필요하다. 또한, DBU의 농도는, 높은 전환을 위하여 권장되는 바와 같이, 0.64M(ACN에 대한 10 용적%의 DBU)의 전환 수율에 중요하다.
실시예 9. ASO 전장 생성물의 탈보호
Figure pct00440
처음에, 사이아노에틸기는 640㎖의 CH3CN:Et3N = 1:1 용액에 64그램의 보호된 ASO 9를 용해시킴으로써 탈보호하였다. 이 혼합물을 25℃에서 2시간 동안 교반한 후에 Rotovap에 의해 용매를 제거하였다. 조질물을 LHPG 및 아민 보호기를 탈보호하기 위하여 다음 단계에서 취하였다. 조질의 혼합물에 500㎖ 농축물 NH3/H2O를 첨가하고, 고체가 전체적으로 용해될 때까지(약 20 내지 30분) 이 반응 혼합물을 25℃에서 교반하였다. 상기 고체를 NH3/H2O에 용해시키고, 이 혼합물을 1ℓ 유리 압력 플라스크에 옮기고, 이어서 65℃에서 5시간 동안 가열하였다. 이 반응 혼합물을 실온까지 냉각시키고, 탈보호된 ASO 9를 하류 정제를 위하여 준비하였다. ASO 9 상의 모든 보호기(5'-DMTr 제외)를 이 작업에서 탈보호하였다. DMTr기는 하류 HIC 정제 후에 제거되었다.
SEQUENCE LISTING <110> BIOGEN MA INC. AJINOMOTO CO., INC. <120> CONVERGENT LIQUID PHASE SYNTHESES OF OLIGONUCLEOTIDES <130> 123429-05220 <140> PCT/US2020/032070 <141> 2020-05-08 <150> US 62/845,160 <151> 2019-05-08 <160> 17 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1 tcactttcat aatgctgg 18 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2 caggatacat ttctacagct 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 3 cgactatacg cgcaatatgg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> source <223> /note="Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide" <400> 4 cgacuatacg cgcaauaugg 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> source <223> /note="Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide" <400> 5 cgactatacg cgcaatatgg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> source <223> /note="Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide" <400> 6 cgacuatacg cgcaauaugg 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> source <223> /note="Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide" <400> 7 cgacuatacg cgcaauaugg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> source <223> /note="Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide" <400> 8 guuuucatca atatcugcaa 20 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> source <223> /note="Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide" <400> 9 ccguuttctt accacccu 18 <210> 10 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> source <223> /note="Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide" <400> 10 guuuuttgtt 10 <210> 11 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 11 acagatattt ttgtt 15 <210> 12 <211> 10 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 12 guuuuugcaa 10 <210> 13 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> source <223> /note="Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide" <400> 13 ttaccacccu 10 <210> 14 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> source <223> /note="Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide" <400> 14 uttcttacca cccu 14 <210> 15 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 15 acagatattt 10 <210> 16 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> source <223> /note="Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide" <400> 16 aatatcugca a 11 <210> 17 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> source <223> /note="Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide" <400> 17 catcaatatc ugcaa 15

Claims (148)

  1. 화학식 (AI)의 화합물 또는 이의 염을 제조하기 위한 액상 방법으로서,
    Figure pct00441

    화학식 (AII)의 화합물:
    Figure pct00442
    또는 이의 염을 탈보호하는 단계를 포함하되, 탈보호 반응은 무수 또는 실질적으로 무수인 용액에서 수행되고, 식 중,
    R1은, 각 경우에, 독립적으로 핵염기이고, 상기 핵염기 중의 NH2는, 존재할 경우, 아민 보호기에 의해 보호되고;
    R2는, 각 경우에, 독립적으로 H, 할로, 및 C1-6알콕시로 선택적으로 치환된 C1-6알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R4는, 각 경우에, 독립적으로 H이거나 또는 R2의 알콕시기를 가진 고리를 형성하고;
    R15는 하이드록실 보호기이고;
    R16은, 각 경우에, 독립적으로 C1-6알킬기, C2-6알켄일기, 페닐 또는 벤질기이되, 이들의 각각은 -CN, -NO2 또는 할로겐으로 선택적으로 치환되거나; 또는
    R16은
    Figure pct00443
    또는
    Figure pct00444
    이고;
    z는 0이거나 또는 1 내지 200의 정수이고;
    X는, 각 경우에, 독립적으로 O 또는 S이고; 그리고
    Y는 알킬 사슬을 함유하는 소수성 하이드록실 보호기이다.
  2. 제1항에 있어서, R15는 4,4'-다이메톡시트라이틸기인, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 탈보호 반응은 건조제의 존재 하에 수행되는, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 건조제는 분자체인, 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 분자체의 크기는 3Å인, 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 무수 또는 실질적으로 무수 용액은 상기 탈보호 반응 전에 공비 증류를 사용해서 물을 제거함으로써 얻어지는, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탈보호 반응은 -SH기, 실란기, 실록산기, 폴리스타이렌기, 퓨란, 피롤 또는 인돌을 포함하는 양이온 포착제의 존재 하에 수행되는, 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 양이온 포착제는 화학식 RSH의 화합물이되, R은 알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴기이고, 이들의 각각은 선택적으로 치환되는, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 RSH는 CH3(CH2)5SH, CH3(CH2)11SH, 사이클로헥산티올, CH3CH2OC(=O)CH2CH2SH인, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탈보호 반응은 상기 화학식 (AII)의 화합물을 탈트라이틸화 시약과 반응함으로써 수행되는, 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 탈트라이틸화 시약은 강한 유기 산인, 방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 탈트라이틸화 시약은 CF3COOH, CCl3COOH, CHCl2COOH, CH2ClCOOH, H3PO4, 메탄설폰산, 벤젠설폰산, CClF2COOH, CHF2COOH 또는 PhSO2H인, 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 탈트라이틸화 시약은 CH2ClCOOH인, 방법.
  14. 제10항에 있어서, 상기 탈트라이틸화 시약은 CF3COOH 또는 CHCl2COOH인, 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, Y는 하기 화학식으로 표시되는, 방법:
    Figure pct00445

    식 중, X는 C1-10알킬이고, 1개 이상의 CH2기는 독립적으로 C(O), C(O)NH2, 사이클로알킬 또는 C1-6헤테로사이클릴기로 대체되고; 그리고 X1은 C1-25알킬 또는 C1-25알콕시인, 방법.
  16. 제15항에 있어서, Y는 하기 화학식으로 표시되는, 방법:
    Figure pct00446
    .
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    각각의 R2는 독립적으로 mj, kH, F, 또는 C1-4알콕시로 선택적으로 치환된 C1-4알콕시이고;
    R4는 H이고; 그리고
    R16은 -CH2CH2CN이다.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학식 (AI)의 화합물은 크로마토그래피에 의해 정제되지 않는, 방법.
  19. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학식 (AI)의 화합물은 선택적 석출 및/또는 추출에 의해 정제되는, 방법.
  20. 하기 화학식 (I)의 올리고뉴클레오타이드 단편, 또는 이의 염을 제조하기 위한 액상 방법으로서,
    Figure pct00447

    1) 화학식 (I'A)의 화합물:
    Figure pct00448
    또는 이의 염을 탈보호하여, 화학식 (IA)의 화합물:
    Figure pct00449
    또는 이의 염을 형성하는 단계;
    2) 상기 화학식 (IA)의 화합물 또는 이의 염을 화학식 (A1)의 화합물:
    Figure pct00450
    또는 이의 염과 반응시켜, 화학식 (IB)의 화합물:
    Figure pct00451
    또는 이의 염을 형성하는 단계; 및
    3) 상기 화학식 (IB)의 화합물 또는 이의 염을 황화제 또는 산화제로 황화 또는 산화시켜, 화학식 (IC)의 화합물:
    Figure pct00452
    또는 이의 염을 형성하는 단계;
    4) 상기 화학식 (IC)의 화합물 또는 이의 염을 탈보호하여, 화학식 (ID)의 화합물:
    Figure pct00453
    또는 이의 염을 형성하는 단계;
    5) 상기 화학식 (ID)의 화합물에서 시작해서, 단계 2), 3) 및 4)를 n-2회 동안 반복하여, 상기 화학식 (I)의 단편 또는 이의 염을 수득하는 단계
    를 포함하되, 식 중,
    R1은, 각 경우에, 독립적으로 핵염기이고, 상기 핵염기 중의 NH2는, 존재할 경우, 아민 보호기에 의해 보호되고;
    R2는, 각 경우에, 독립적으로 H, 할로, 및 C1-6알콕시로 선택적으로 치환된 C1-6알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R4는, 각 경우에, 독립적으로 H이거나 또는 R2의 알콕시기를 가진 고리를 형성하고;
    R15는 하이드록실 보호기이고;
    R16은, 각 경우에, 독립적으로 C1-6알킬기, C2-6알켄일기, 페닐 또는 벤질기이되, 이들의 각각은 -CN, -NO2 또는 할로겐으로 선택적으로 치환되거나; 또는
    R16은
    Figure pct00454
    또는
    Figure pct00455
    이고;
    R17a 및 R17b는 독립적으로 C1-6알킬이고;
    n은 2 내지 20의 정수이고;
    X는, 각 경우에, 독립적으로 O 또는 S이고;
    Y는 알킬 사슬을 함유하는 소수성 하이드록실 보호기인, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 화학식 (I)에 대한 단편은 크로마토그래피에 의해 정제되지 않는, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 화학식 (I)의 단편은 선택적 석출 및/또는 추출에 의해 정제되는, 방법.
  23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 1), 2), 3) 및 4) 중 어느 하나의 단계의 반응 생성물을 정제시키기 위하여 크로마토그래피가 사용되지 않는, 방법.
  24. 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 1), 2), 3) 및 4) 중 어느 하나의 단계의 반응 생성물은 선택적 석출에 의해 정제되는, 방법.
  25. 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, Y는
    Figure pct00456
    인, 방법.
  26. 제20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 1) 및 단계 4)에서의 탈보호 반응 중 어느 하나는 제2항 내지 제14항에 정의된 바와 같이 수행되는, 방법.
  27. 표적 올리고뉴클레오타이드를 제조하기 위한 수렴형 액상 방법(convergent liquid phase process)으로서,
    a) 화학식 (I)의 올리고뉴클레오타이드 단편:
    Figure pct00457
    또는 이의 염을 용액 중에서 화학식 (II)의 올리고뉴클레오타이드 단편:
    Figure pct00458
    또는 이의 염과 커플링시켜, 화학식 (III)의 올리고뉴클레오타이드:
    Figure pct00459
    또는 이의 염을 형성하는 단계; 및
    b) 상기 화학식 (III)의 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염을 황화 또는 산화시켜, 화학식 (IV)의 올리고뉴클레오타이드:
    Figure pct00460
    또는 이의 염을 형성하는 단계
    를 포함하되, 식 중,
    R1은, 각 경우에, 독립적으로 핵염기이고, 상기 핵염기 중의 NH2는, 존재할 경우, 아민 보호기에 의해 보호되고;
    R2는, 각 경우에, 독립적으로 H, 할로, 및 C1-6알콕시로 선택적으로 치환된 C1-6알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R4는, 각 경우에, 독립적으로 H이거나 또는 R2의 알콕시기를 가진 고리를 형성하고;
    R15는 하이드록실 보호기이고;
    R16은, 각 경우에, 독립적으로 C1-6알킬기, C2-6알켄일기, 페닐 또는 벤질기이되, 이들의 각각은 -CN, -NO2 또는 할로겐으로 선택적으로 치환되거나; 또는
    R16은
    Figure pct00461
    또는
    Figure pct00462
    이고;
    R17a 및 R17b는 독립적으로 C1-6알킬이고;
    n은 2 내지 200의 정수이고;
    m은 2 내지 20의 정수이고;
    X는, 각 경우에, 독립적으로 O 또는 S이고;
    Y는 알킬 사슬을 함유하는 소수성 하이드록실 보호기인, 방법.
  28. 제27항에 있어서, 단편 (I)은 화학식 (Ia1)의 뉴클레오타이드:
    Figure pct00463
    또는 이의 염을 화학식 (Ia2)의 올리고뉴클레오타이드 단편:
    Figure pct00464
    또는 이의 염과 커플링시켜, 상기 화학식 (I)의 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염을 형성함으로써 합성될 수 있는, 방법.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, n은 3 내지 20의 정수인, 방법.
  30. 제27항 또는 제28항에 있어서, n은 3 내지 6인, 방법.
  31. 제27항 또는 제28항에 있어서, n은 5인, 방법.
  32. 제27항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학식 (IV)의 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염을 탈보호시켜, 화학식 (V)의 올리고뉴클레오타이드:
    Figure pct00465
    또는 이의 염을 형성하는 단계 c)를 더 포함하는, 방법.
  33. 제32항에 있어서,
    d) 상기 화학식 (V)의 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염을 화학식 (II')의 올리고뉴클레오타이드 단편:
    Figure pct00466
    또는 이의 염과 커플링시켜, 화학식 (VI)의 올리고뉴클레오타이드:
    Figure pct00467
    또는 이의 염을 형성하는 단계,
    e) 상기 화학식 (VI)의 올리고뉴클레오타이드를 황화 또는 산화시켜, 화학식 (VII)의 올리고뉴클레오타이드:
    Figure pct00468
    또는 이의 염을 형성하는 단계,
    f) 상기 화학식 (VII)의 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염을 탈보호시켜, 화학식 (VIII)의 올리고뉴클레오타이드:
    Figure pct00469
    또는 이의 염을 형성하는 단계,
    g) 단계 d), e) 및 f)를 r-1회 동안 반복하고 나서 단계 d) 및 e)를 반복하여, 화학식 (IX)의 올리고뉴클레오타이드:
    Figure pct00470
    또는 이의 염을 형성하는 단계
    를 포함하되, 식 중,
    r은 1 내지 50의 정수이고;
    pi는, 각 경우에, 독립적으로 2 내지 20의 정수이고,
    i는 1 내지 r의 정수이고; 그리고
    Figure pct00471
    인, 방법.
  34. 제33항에 있어서, r는 2이고 그리고 상기 화학식 (IX)의 올리고뉴클레오타이드는 하기 화학식 (X)로 표시되는, 방법:
    Figure pct00472

    식 중, p1 및 p2는 각각 독립적으로 2 내지 20의 정수이다.
  35. 제27항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a), b), c), d), e), f) 및 g) 중 어느 하나의 단계의 반응 생성물을 정제시키기 위하여 크로마토그래피가 사용되지 않는, 방법.
  36. 제27항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a), b), c), d), e), f) 및 g) 중 어느 하나의 단계의 반응 생성물은 추출 또는 선택적 석출에 의해 정제되는, 방법.
  37. 제33항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은,
    h1) 올리고뉴클레오타이드(IX) 또는 (X) 또는 이의 염을 탈보호하여, 화학식 (IXA) 또는 (XA)의 올리고뉴클레오타이드:
    Figure pct00473
    또는
    Figure pct00474
    또는 이의 염을 형성하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 방법은,
    h2) 상기 올리고뉴클레오타이드(IXA) 또는 (XA)를 탈보호하여, 화학식 (IXB) 또는 (XB)의 올리고뉴클레오타이드:
    Figure pct00475
    또는
    Figure pct00476
    또는 이의 염을 형성하는 단계를 더 포함하고, 선택적으로 상기 올리고뉴클레오타이드(IXA) 또는 (XA)는 시트르산과 반응하여 상기 화학식 (IXB) 또는 (XB)의 올리고뉴클레오타이드를 형성하는, 방법.
  39. 제37항에 있어서, R16이 -CH2CH2CN인 경우, 상기 올리고뉴클레오타이드(IX) 또는 (X) 또는 이의 염을 탈보호하여, 화학식 (IXAb) 또는 (XAb)의 올리고뉴클레오타이드:
    Figure pct00477
    또는
    Figure pct00478
    또는 이의 염을 형성하는, 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 방법은,
    상기 올리고뉴클레오타이드(IXAb) 또는 (XAb) 또는 이의 염을 탈보호하여, 화학식 (IXBa) 또는 (XBa)의 올리고뉴클레오타이드:
    Figure pct00479
    또는
    Figure pct00480
    또는 이의 염을 형성하는 단계를 더 포함하고, 선택적으로 상기 올리고뉴클레오타이드(IXA) 또는 (XA)는 시트르산과 반응하여 상기 화학식 (IXBa) 또는 (XBa)의 올리고뉴클레오타이드를 형성하는, 방법.
  41. 제33항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, R16이 -CH2CH2CN인 경우, 상기 방법은,
    h1) 상기올리고뉴클레오타이드(IX) 또는 (X)을 탈보호하여, 화학식 (IXAa) 또는 (XAa)의 올리고뉴클레오타이드:
    Figure pct00481
    또는
    Figure pct00482
    또는 이의 염을 형성하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 탈보호 반응은 상기 올리고뉴클레오타이드(IX) 또는 (X) 또는 이의 염을 염기와 반응시킴으로써 수행되는, 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 염기는 1,8-다이아자바이사이클로[5.4.0]운데크-7-엔, tert-부틸아민, sec-부틸아민, 다이아이소프로필에틸아민 및 트라이에틸아민으로부터 선택되는, 방법.
  44. 제41항, 제42항 및 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 올리고뉴클레오타이드(IXAa) 또는 (XAa) 또는 이의 염을 탈보호하여, 화학식 (IXAb) 또는 (XAb)의 올리고뉴클레오타이드:
    Figure pct00483
    또는
    Figure pct00484
    또는 이의 염을 형성하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  45. 제44항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드(IXAa) 또는 (XAa) 또는 이의 염의 탈보호는 상기 올리고뉴클레오타이드(IXAa) 또는 (XAa) 또는 이의 염을 NH4OH와 반응시킴으로써 수행되는, 방법.
  46. 제27항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, n은 3, 4, 5 또는 6인, 방법.
  47. 제27항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, m은 3, 4, 5 또는 6인, 방법.
  48. 제33항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, pi는, 각 경우에, 독립적으로 3, 4, 5 또는 6인, 방법.
  49. 제34항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, p1 및 p2는 각각 독립적으로 3, 4, 5, 또는 6인, 방법.
  50. 제33항 및 제35항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, r은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6인, 방법.
  51. 표적 올리고뉴클레오타이드를 제조하기 위한 수렴형 액상 방법으로서,
    a) 화학식 (II2)의 올리고뉴클레오타이드 단편:
    Figure pct00485
    또는 이의 염을 용액 중에서 화학식 (I2)의 올리고뉴클레오타이드 단편:
    Figure pct00486
    또는 이의 염과 커플링시켜, 화학식 (III2)의 올리고뉴클레오타이드:
    Figure pct00487
    또는 이의 염을 형성하는 단계; 및
    b) 상기 화학식 (III2)의 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 염을 황화 또는 산화시켜, 화학식 (IV2)의 올리고뉴클레오타이드:
    Figure pct00488
    또는 이의 염을 형성하는 단계
    를 더 포함하되, 식 중,
    R1은, 각 경우에, 독립적으로 핵염기이고, 상기 핵염기 중의 NH2는, 존재할 경우, 아민 보호기에 의해 보호되고;
    R2는, 각 경우에, 독립적으로 H, 할로, 및 C1-6알콕시로 선택적으로 치환된 C1-6알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R4는, 각 경우에, 독립적으로 H이거나 또는 R2의 알콕시기를 가진 고리를 형성하고;
    R16은, 각 경우에, 독립적으로 C1-6알킬기, C2-6알켄일기, 페닐 또는 벤질기이되, 이들의 각각은 -CN, -NO2 또는 할로겐으로 선택적으로 치환되거나; 또는
    R16은
    Figure pct00489
    또는
    Figure pct00490
    이고;
    R17a 및 R17b는 독립적으로 C1-6알킬이고;
    n1은 2 내지 20의 정수이고;
    m1은 2 내지 200의 정수이고;
    X는, 각 경우에, 독립적으로 O 또는 S이고;
    Y는 알킬 사슬을 함유하는 소수성 하이드록실 보호기이고;
    Z는 실릴 하이드록실 보호기이다.
  52. 제51항에 있어서, 단편 (II2)는,
    ia) 화학식 (II2a1)의 뉴클레오타이드:
    Figure pct00491
    또는 이의 염을 용액 중에서 화학식 (II2a2)의 올리고뉴클레오타이드 단편:
    Figure pct00492
    또는 이의 염과 커플링시켜, 화학식 (II2a3)의 올리고뉴클레오타이드:
    Figure pct00493
    또는 이의 염을 형성하는 단계;
    iia) 상기 화학식 (II2a3)의 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염을 황화 또는 산화시켜, 화학식 (II2a4)의 올리고뉴클레오타이드:
    Figure pct00494
    또는 이의 염을 형성하는 단계,
    iia) 상기 화학식 (II2a4) 또는 이의 염을 탈보호하여, 화학식 (II2)의 올리고뉴클레오타이드를 형성하는 단계
    에 의해 제조되는, 방법.
  53. 제51항 또는 제52항에 있어서, 상기 화학식 (IV2)의 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염을 탈보호하여, 화학식 (V2)의 올리고뉴클레오타이드:
    Figure pct00495
    또는 이의 염을 형성하는 단계 c)를 더 포함하는, 방법.
  54. 제53항에 있어서,
    d) 상기 화학식 (V2)의 올리고뉴클레오타이드, 또는 이의 염을 화학식 (II2')의 올리고뉴클레오타이드 단편:
    Figure pct00496
    또는 이의 염과 커플링시켜, 화학식 (VI2)의 올리고뉴클레오타이드:
    Figure pct00497
    또는 이의 염을 형성하는 단계,
    e) 상기 화학식 (VI2)의 올리고뉴클레오타이드를 황화 또는 산화시켜, 화학식 (VII2)의 올리고뉴클레오타이드:
    Figure pct00498
    또는 이의 염을 형성하는 단계,
    f) 상기 화학식 (VII2)의 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염을 탈보호하여, 화학식 (VIII2)의 올리고뉴클레오타이드:
    Figure pct00499
    또는 이의 염을 형성하는 단계,
    g) 단계 d), e) 및 f)를 r1-1회 동안 반복하고 나서 단계 d) 및 e)를 반복하여, 화학식 (IX2)의 올리고뉴클레오타이드:
    Figure pct00500
    또는 이의 염을 형성하는 단계
    를 더 포함하되, 식 중,
    r1은 1 내지 50의 정수이고;
    si는, 각 경우에, 독립적으로 2 내지 20의 정수이고,
    i는 1 내지 r1의 정수이고; 그리고
    Figure pct00501
    인, 방법.
  55. 제54항에 있어서, r1은 2이고 상기 화학식 (IX2)의 올리고뉴클레오타이드는 화학식 (X2)로 표시되는, 방법:
    Figure pct00502

    식 중, s1 및 s2는 각각 독립적으로 2 내지 20의 정수이다.
  56. 제51항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a), b), c), d), e), f) 및 g) 중 어느 하나의 단계의 반응 생성물을 정제시키기 위하여 크로마토그래피를 사용하지 않는, 방법.
  57. 제51항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a), b), c), d), e), f) 및 g) 중 어느 하나의 단계의 반응 생성물은 추출 또는 선택적 석출에 의해 정제되는, 방법.
  58. 제54항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 화학식 (IX2) 또는 (X2)의 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염을 탈보호하여, 화학식 (IX2A) 또는 (X2A)의 올리고뉴클레오타이드:
    Figure pct00503
    또는
    Figure pct00504
    또는 이의 염을 형성하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  59. 제54항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, R16이 -CH2CH2CN인 경우, 상기 방법은
    h1) 상기 올리고뉴클레오타이드(IX2A) 또는 (X2A) 또는 이의 염을 탈보호하여, 화학식 (IX2Aa) 또는 (X2Aa)의 올리고뉴클레오타이드:
    Figure pct00505
    또는
    Figure pct00506
    또는 이의 염을 형성하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  60. 제59항에 있어서, 상기 탈보호 반응은 상기 올리고뉴클레오타이드(IX2A) 또는 (X2A) 또는 이의 염을 염기와 반응시킴으로써 수행되는, 방법.
  61. 제60항에 있어서, 상기 염기는 1,8-다이아자바이사이클로[5.4.0]운데크-7-엔, tert-부틸아민, sec-부틸아민, 다이아이소프로필에틸아민 및 트라이에틸아민으로부터 선택되는, 방법.
  62. 제59항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 올리고뉴클레오타이드(IX2Aa) 또는 (X2Aa) 또는 이의 염을 탈보호하여, 화학식 (IX2B) 또는 (X2B)의 올리고뉴클레오타이드:
    Figure pct00507
    ; 또는
    Figure pct00508
    또는 이의 염을 형성하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  63. 제62항에 있어서, 상기 탈보호는 상기 올리고뉴클레오타이드(IX2Aa) 또는 (X2Aa) 또는 이의 염을 NH4OH와 반응시킴으로써 수행되는, 방법.
  64. 제54항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 올리고뉴클레오타이드(IX2) 또는 (X2) 또는 이의 염을 NH4OH로 탈보호시켜, 화학식 (IX2B) 또는 (X2B)의 올리고뉴클레오타이드:
    Figure pct00509
    또는
    Figure pct00510
    또는 이의 염을 형성하는 단계를 더 포함하되, R16이 -CH2CH2CN인 경우, 상기 올리고뉴클레오타이드(IX2) 또는 (X2) 또는 이의 염의 탈보호는 화학식 (IX2A) 또는 (X2A)의 올리고뉴클레오타이드:
    Figure pct00511
    또는
    Figure pct00512
    또는 이의 염을 형성하는, 방법.
  65. 제51항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, n1은 3, 4, 5 또는 6인, 방법.
  66. 제51항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, m1은 3, 4, 5 또는 6인, 방법.
  67. 제54항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, si는, 각 경우에, 독립적으로 3, 4, 5 또는 6인, 방법.
  68. 제55항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, s1 및 s2는 각각 독립적으로 3, 4, 5 또는 6인, 방법.
  69. 제54항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, r1은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6인, 방법.
  70. 제1항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물 또는 올리고뉴클레오타이드 중의 P=X기의 전부가 P=S인, 방법.
  71. 제1항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물 또는 올리고뉴클레오타이드 중의 P=X기의 전부가 P=O인, 방법.
  72. 제1항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물 또는 올리고뉴클레오타이드 중의 P=X기의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 초과가 P=S인, 방법
  73. 제1항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물 또는 올리고뉴클레오타이드 중의 P=X기의 10 내지 90%, 20 내지 80%, 30 내지 70% 또는 40 내지 60%가 P=S인, 방법.
  74. 제1항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵염기는 사이토신, 구아닌, 아데닌, 티민, 우라실, 하이포잔틴, 잔틴, 7-메틸구아닌, 5,6-다이하이드로우라실, 5-메틸사이토신 및 5-하이드록시메틸사이토신으로 이루어진 군으로부터 선택되되, 상기 핵염기 중의 NH2기는, 존재할 경우, PhCO-, CH3CO-, iPrCO-, Me2N-CH= 또는 Me2N-CMe=에 의해 보호되는, 방법.
  75. 제1항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵염기는 사이토신, 구아닌, 아데닌, 티민, 우라실 및 5-메틸사이토신으로 이루어진 군으로부터 선택되되, 상기 핵염기 중의 NH2기는, 존재할 경우, PhCO-, CH3CO-, iPrCO-, Me2N-CH= 또는 Me2N-CMe=에 의해 보호되는, 방법.
  76. 제1항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서,
    각각의 R2는 독립적으로 H, F, 및 C1-4알콕시로 선택적으로 치환된 C1-4알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    각각의 R4는 독립적으로 H이거나 또는 R2의 알콕시기를 갖는 고리를 형성하되, 상기 고리는 1 내지 3개의 C1-4 알킬기로 선택적으로 치환된 5 또는 6-원 고리이고;
    R16은 -CH2CH2CN이고; 그리고
    R17a 및 R17b는 독립적으로 C1-4알킬인, 방법.
  77. 제76항에 있어서,
    각각의 R2는 독립적으로 H 또는 -OCH2CH2OMe로부터 선택되고;
    각각의 R4는 H이고;
    R16은 -CH2CH2CN이고; 그리고
    R17a와 R17b는 둘 다 -CH(CH3)2인, 방법.
  78. 제27항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 올리고뉴클레오타이드는 16 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하는 안티-센스 올리고뉴클레오타이드인, 방법.
  79. 제78항에 있어서, 상기 안티-센스 올리고뉴클레오타이드는 변형된 RNA만을 포함하는, 방법.
  80. 제78항에 있어서, 상기 안티-센스 올리고뉴클레오타이드는 DNA 및 변형된 RNA를 포함하는, 방법.
  81. 제78항에 있어서, 상기 안티-센스 올리고뉴클레오타이드는 갭머인, 방법.
  82. 제78항에 있어서, 상기 안티-센스 올리고뉴클레오타이드는 DNA만을 포함하는, 방법.
  83. 하기 화학식 (AI')의 화합물 또는 이의 염을 제조하기 위한 액상 방법으로서,
    Figure pct00513

    화학식 (AII')의 화합물:
    Figure pct00514
    또는 이의 염을 탈보호하는 단계를 포함하되, 탈보호 반응은 무수 또는 실질적으로 무수인 용액에서 수행되고, 식 중,
    R1은, 각 경우에, 독립적으로 핵염기이고, 상기 핵염기 중의 NH2는, 존재할 경우, 아민 보호기에 의해 보호되고;
    R2는, 각 경우에, 독립적으로 H, 할로, 및 C1-6알콕시로 선택적으로 치환된 C1-6알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R4는, 각 경우에, 독립적으로 H이거나 또는 R2의 알콕시기를 가진 고리를 형성하고;
    R15는 하이드록실 보호기이고;
    R16은, 각 경우에, 독립적으로 C1-6알킬기, C2-6알켄일기, 페닐 또는 벤질기이되, 이들의 각각은 -CN, -NO2 또는 할로겐으로 선택적으로 치환되거나; 또는
    R16은
    Figure pct00515
    또는
    Figure pct00516
    이고;
    z는 0이거나 또는 1 내지 200의 정수이고;
    X는, 각 경우에, 독립적으로 O 또는 S이고;
    W는 H 또는 Z이고; 그리고
    Z는 실릴 하이드록실 보호기인, 방법.
  84. 제83항에 있어서, R15는 4,4'-다이메톡시트라이틸기인, 방법.
  85. 제83항 또는 제84항에 있어서, 상기 탈보호 반응은 건조제의 존재 하에 수행되는, 방법.
  86. 제85항에 있어서, 상기 건조제는 분자체인, 방법.
  87. 제86항에 있어서, 상기 분자체의 크기는 3Å인, 방법.
  88. 제83항 또는 제84항에 있어서, 상기 무수 또는 실질적으로 무수 용액은 상기 탈보호 반응 전에 공비 증류를 사용해서 물을 제거함으로써 얻어지는, 방법.
  89. 제83항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탈보호 반응은 -SH기, 실란기, 실록산기, 폴리스타이렌기, 퓨란, 피롤 또는 인돌을 포함하는 양이온 포착제의 존재 하에 수행되는, 방법.
  90. 제89항에 있어서, 상기 양이온 포착제는 화학식 RSH의 화합물이되, R은 알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴기이고, 이들의 각각은 선택적으로 치환되는, 방법.
  91. 제90항에 있어서, RSH는 CH3(CH2)5SH, CH3(CH2)11SH, 사이클로헥산티올, CH3CH2OC(=O)CH2CH2SH인, 방법.
  92. 제83항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탈보호 반응은 상기 화학식 (AII')의 화합물을 탈트라이틸화 시약과 반응시킴으로써 수행되는, 방법.
  93. 제92항에 있어서, 상기 탈트라이틸화 시약은 강한 유기 산인, 방법.
  94. 제92항에 있어서, 상기 탈트라이틸화 시약은 CF3COOH, CCl3COOH, CHCl2COOH, CH2ClCOOH, H3PO4, 메탄설폰산, 벤젠설폰산, CClF2COOH, CHF2COOH 또는 PhSO2H인, 방법.
  95. 제93항에 있어서, 상기 탈트라이틸화 시약은 CH2ClCOOH인, 방법.
  96. 제92항에 있어서, 상기 탈트라이틸화 시약은 CF3COOH 또는 CHCl2COOH인, 방법.
  97. 제83항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, W는 Z인, 방법.
  98. 제97항에 있어서, Z는 TBDPS, TBoDPS 및 TBDAS로부터 선택된 실릴 보호기인, 방법:
    Figure pct00517

    식 중 R5, R6 및 R7은 각각 독립적으로 H, C1-30알킬, 또는 C1-30알콕시이다.
  99. 제98항에 있어서, 상기 TBDAS기는 하기인, 방법:
    Figure pct00518

    식 중, s는 1 내지 30의 정수이다.
  100. 제97항에 있어서, Z는 TBDPS인, 방법.
  101. 제83항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, z는 0이거나 또는 1 내지 10의 정수인, 방법.
  102. 제83항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서,
    각각의 R2는 독립적으로 H, F, 또는 C1-4알콕시로 선택적으로 치환된 C1-4알콕시로부터 선택되고;
    R4는 H이고; 그리고
    R16은 -CH2CH2CN인, 방법.
  103. 제83항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학식 (AI')의 화합물은 크로마토그래피에 의해 정제되지 않는, 방법.
  104. 제83항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학식 (AI')의 화합물은 선택적 석출 및/또는 추출에 의해 정제되는, 방법.
  105. 하기 화학식 (BI)의 화합물 또는 이의 염을 제조하기 위한 액체 방법으로서:
    Figure pct00519

    화학식 (BII)의 화합물:
    Figure pct00520
    또는 이의 염을 탈보호하여, 상기 화학식 (BI)의 화합물 또는 이의 염을 형성하는 단계를 포함하되, 식 중,
    R1은, 각 경우에, 독립적으로 핵염기이고, 상기 핵염기 중의 NH2는, 존재할 경우, 아민 보호기에 의해 보호되고;
    R2는, 각 경우에, 독립적으로 H, 할로, 및 C1-6알콕시로 선택적으로 치환된 C1-6알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R4는, 각 경우에, 독립적으로 H이거나 또는 R2의 알콕시기를 가진 고리를 형성하고;
    R15는 하이드록실 보호기이고;
    R16은, 각 경우에, 독립적으로 C1-6알킬기, C2-6알켄일기, 페닐 또는 벤질기이되, 이들의 각각은 -CN, -NO2 또는 할로겐으로 선택적으로 치환되거나; 또는
    R16은
    Figure pct00521
    또는
    Figure pct00522
    이고;
    q는 1 내지 200의 정수이고;
    X는, 각 경우에, 독립적으로 O 또는 S이고; 그리고
    Z는 실릴 하이드록실 보호기인, 방법.
  106. 제105항에 있어서, 상기 탈보호 반응은 상기 화학식 (BII)의 화합물을 염기의 존재 하에 HF와 반응시킴으로써 수행되는, 방법.
  107. 제106항에 있어서, 상기 염기는 이미다졸 또는 피리딘이되, 이미다졸 또는 피리딘은 선택적으로 치환되는, 방법.
  108. 제106항 또는 제107항에 있어서, HF에 비해서 과잉량의 염기가 사용되는, 방법.
  109. 제105항에 있어서, 상기 탈보호 반응은 상기 화학식 (BII)의 화합물을 피리딘 및 이미다졸의 존재 하에 HF와 반응시킴으로써 수행되는, 방법.
  110. 제109항에 있어서, 이미다졸 대 HF의 몰비는 1.1:1 내지 5:1의 범위인, 방법.
  111. 제110항에 있어서, 상기 이미다졸 대 HF의 몰비는 2:1인, 방법.
  112. 제109항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 피리딘 대 HF의 몰비는 1.1:1 내지 20:1인, 방법.
  113. 제105항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, Z는 TBDPS, TBoDPS 및 TBDAS로부터 선택된 실릴 보호기인, 방법:
    Figure pct00523

    식 중, R5, R6 및 R7은 각각 독립적으로 H, C1-30알킬, 또는 C1-30알콕시이다.
  114. 제113항에 있어서, 상기 TBDAS 기는 하기인, 방법:
    Figure pct00524

    식 중, s는 1 내지 30의 정수이다.
  115. 제113항에 있어서, Z는 TBDPS인, 방법.
  116. 제105항 내지 제115항 중 어느 한 항에 있어서, R15는 4,4'-다이메톡시트라이틸기인, 방법.
  117. 제105항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서,
    각각의 R2는 독립적으로 H, F, 및 C1-4알콕시로 선택적으로 치환된 C1-4알콕시로부터 선택되고;
    R4는 H이고; 그리고
    R16은 -CH2CH2CN인, 방법.
  118. 제105항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, q는 2 내지 10의 정수인, 방법.
  119. 제105항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학식 (BI)의 화합물은 크로마토그래피에 의해 정제되지 않은, 방법.
  120. 제105항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학식 (BI)의 화합물은 선택적 석출 및/또는 추출에 의해 정제되는, 방법.
  121. 화학식 (CI) 또는 (CI')의 화합물 또는 이의 염을 제조하기 위한 액체 방법으로서,
    Figure pct00525

    Figure pct00526

    화학식 (CII)의 화합물:
    Figure pct00527
    또는 이의 염을 포스포다이아미다이트 (R16O)P(NR17aR17b)2 또는 H-포스포네이트와 반응시켜, 화학식 (CI) 또는 (CI')의 화합물을 형성하는 단계를 포함하되, 식 중,
    R1은, 각 경우에, 독립적으로 핵염기이고, 상기 핵염기 중의 NH2는, 존재할 경우, 아민 보호기에 의해 보호되고;
    R2는, 각 경우에, 독립적으로 H, 할로, 및 할로겐 또는 C1-6알콕시로 선택적으로 치환된 C1-6알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R4는, 각 경우에, 독립적으로 H이거나 또는 R2의 알콕시기를 가진 고리를 형성하고;
    R15는 하이드록실 보호기이고;
    R16은, 각 경우에, 독립적으로 C1-6알킬기, C2-6알켄일기, 페닐 또는 벤질기이되, 이들의 각각은 -CN, -NO2 또는 할로겐으로 선택적으로 치환되거나; 또는
    R16은
    Figure pct00528
    또는
    Figure pct00529
    이고;
    R17a 및 R17b는 독립적으로 C1-6알킬이고;
    q1은 2 내지 200의 정수이고;
    X는, 각 경우에, 독립적으로 O 또는 S이고; 그리고
    Z는 실릴 하이드록실 보호기인, 방법.
  122. 하기 화학식 (C2I)의 화합물 또는 이의 염을 제조하기 위한 액체 방법으로서:
    Figure pct00530

    하기 화학식 (C2II)의 화합물 또는 이의 염을 포스포다이아미다이트 (R16O)P(NR17aR17b)2와 반응시켜 상기 화학식 (C2I)의 화합물 또는 이의 염을 형성하는 단계를 포함하는, 방법:
    Figure pct00531

    식 중,
    R1은, 각 경우에, 독립적으로 핵염기이고, 상기 핵염기 중의 NH2는, 존재할 경우, 아민 보호기에 의해 보호되고;
    R2는, 각 경우에, 독립적으로 H, 할로, 및 할로겐 또는 C1-6알콕시로 선택적으로 치환된 C1-6알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R4는, 각 경우에, 독립적으로 H이거나 또는 R2의 알콕시기를 가진 고리를 형성하고;
    R16은, 각 경우에, 독립적으로 C1-6알킬기, C2-6알켄일기, 페닐 또는 벤질기이되, 이들의 각각은 -CN, -NO2 또는 할로겐으로 선택적으로 치환되거나; 또는
    R16은
    Figure pct00532
    또는
    Figure pct00533
    이고;
    R17a 및 R17b는 독립적으로 C1-6알킬이고;
    q1은 2 내지 200의 정수이고;
    X는, 각 경우에, 독립적으로 O 또는 S이고; 그리고
    Z는 실릴 하이드록실 보호기이다.
  123. 제121항에 있어서,
    각각의 R2는 독립적으로 H, F, 또는 C1-4알콕시로 선택적으로 치환된 C1-4알콕시로부터 선택되고;
    R4는 H이고;
    R15는 4,4'-다이메톡시트라이틸이고;
    R16은 -CH2CH2CN이고; 그리고
    R17a 및 R17b는 독립적으로 C1-6알킬인, 방법.
  124. 제122항에 있어서,
    각각의 R2는 독립적으로 H, F, 또는 C1-4알콕시로 선택적으로 치환된 C1-4알콕시로부터 선택되고;
    R4는 H이고;
    R16은 -CH2CH2CN이고;
    R4는 H이고;
    R16은 -CH2CH2CN이고;
    R17a 및 R17b는 독립적으로 C1-6알킬이고; 그리고
    Z는 실릴 하이드록실 보호기인, 방법.
  125. 제121항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, q1은 2 내지 10의 정수인, 방법.
  126. 제122항, 제124항 및 제125항 중 어느 한 항에 있어서, Z는 TBDPS, TBoDPS 및 TBDAS로로부터 선택되는, 방법.
  127. 제121항 내지 제126항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응은 활성제의 존재 하에 수행되는, 방법.
  128. 제127항에 있어서, 상기 활성제는 피리딘 트라이플루오로아세테이트 또는 N-메틸이미다졸 트라이플레이트인, 방법.
  129. 제121항 내지 제128항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학식 (CI), (CI') 또는 (C2I)의 화합물은 크로마토그래피에 의해 정제되지 않는, 방법.
  130. 제121항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학식 (CI), (CI') 또는 (C2I)의 화합물은 선택적 석출 및/또는 추출에 의해 정제되는, 방법.
  131. 하기 화학식 (CI') 또는 이의 염을 제조하기 위한 액상 방법으로서:
    Figure pct00534

    1) 화학식 (CI'A)의 화합물:
    Figure pct00535
    또는 이의 염을 화학식 (A1)의 화합물:
    Figure pct00536
    또는 이의 염과 반응시켜, 화학식 (CI'B)의 화합물:
    Figure pct00537
    또는 이의 염을 형성하는 단계; 및
    3) 상기 화학식 (CI'B)의 화합물 또는 이의 염을, 황화제 또는 산화제로 황화 또는 산화시켜, 화학식 (CI'C)의 화합물:
    Figure pct00538
    또는 이의 염을 형성하는 단계;
    4) 상기 화학식 (CI'C)의 화합물 또는 이의 염을 탈보호하여, 화학식 (CI'D)의 화합물:
    Figure pct00539
    또는 이의 염을 형성하는 단계;
    5) 상기 화학식 (CI'D)의 화합물에서 시작해서, 단계 1), 2) 3) 및 4)를 q1-3회 동안 반복하고 나서, 단계 1), 2) 및 3)을 반복하여, 화학식 (CI')의 단편 또는 이의 염을 수득하는 단계
    를 포함하되, 식 중,
    R1은, 각 경우에, 독립적으로 핵염기이고, 상기 핵염기 중의 NH2는, 존재할 경우, 아민 보호기에 의해 보호되고;
    R2는, 각 경우에, 독립적으로 H, 할로, 및 C1-6알콕시로 선택적으로 치환된 C1-6알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R4는, 각 경우에, 독립적으로 H이거나 또는 R2의 알콕시기를 가진 고리를 형성하고;
    R15는 하이드록실 보호기이고;
    R16은, 각 경우에, 독립적으로 C1-6알킬기, C2-6알켄일기, 페닐 또는 벤질기이되, 이들의 각각은 -CN, -NO2 또는 할로겐으로 선택적으로 치환되거나; 또는
    R16은
    Figure pct00540
    또는
    Figure pct00541
    이고;
    R17a 및 R17b는 독립적으로 C1-6알킬이고;
    q1은 2 내지 200의 정수이고; 그리고
    X는, 각 경우에, 독립적으로 O 또는 S인, 방법.
  132. 하기 화학식 (CIc)의 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 염을 제조하기 위한 액상 방법으로서:
    Figure pct00542

    화학식 (CIa)의 올리고뉴클레오타이드 단편:
    Figure pct00543
    또는 이의 염을 화학식 (CIb)의 올리고뉴클레오타이드 단편:
    Figure pct00544
    또는 이의 염과 커플링시켜, 상기 화학식 (CIc)의 올리고뉴클레오타이드를 형성하는 단계를 포함하되, 식 중,
    R1은, 각 경우에, 독립적으로 핵염기이고, 상기 핵염기 중의 NH2는, 존재할 경우, 아민 보호기에 의해 보호되고;
    R2는, 각 경우에, 독립적으로 H, 할로, 및 C1-6알콕시로 선택적으로 치환된 C1-6알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R4는, 각 경우에, 독립적으로 H이거나 또는 R2의 알콕시기를 가진 고리를 형성하고;
    R15는 하이드록실 보호기이고;
    R16은, 각 경우에, 독립적으로 C1-6알킬기, C2-6알켄일기, 페닐 또는 벤질기이되, 이들의 각각은 -CN, -NO2 또는 할로겐으로 선택적으로 치환되거나; 또는
    R16은
    Figure pct00545
    또는
    Figure pct00546
    이고;
    q1a는 2 내지 20의 정수이고;
    q1b는 2 내지 20의 정수이고;
    X는, 각 경우에, 독립적으로 O 또는 S이고; 그리고
    Z는 하이드록실 보호기인, 방법.
  133. 하기 화학식 (II)의 올리고뉴클레오타이드 단편 또는 이의 염을 제조하기 위한 액상 방법으로서:
    Figure pct00547

    1') 화학식 (IIA')의 화합물:
    Figure pct00548
    또는 이의 염을 탈보호하여, 화학식 (IIA)의 화합물:
    Figure pct00549
    또는 이의 염을 형성하는 단계;
    2') 상기 화학식 (IIA)의 화합물 또는 이의 염을 화학식 (A2)의 화합물:
    Figure pct00550
    또는 이의 염과 반응시켜, 화학식 (IIB)의 화합물:
    Figure pct00551
    또는 이의 염을 형성하는 단계; 및
    3') 상기 화학식 (IIB)의 화합물 또는 이의 염을 황화제 또는 산화제로 황화 또는 산화시켜, 화학식 (IIC)의 화합물:
    Figure pct00552
    또는 이의 염을 형성하는 단계,
    4') 상기 화학식 (IIC)의 화합물 또는 이의 염을 탈보호하여, 화학식 (IID)의 화합물:
    Figure pct00553
    또는 이의 염을 형성하는 단계;
    5') m이 3인 경우, 화학식 (IID)의 화합물 또는 이의 염에서 시작해서, 단계 2') 및 단계 3')을 반복하여, 화학식 (IIE)의 화합물 또는 이의 염을 형성하거나, 또는
    m이 3 초과인 경우, 상기 화학식 (IID)의 화합물 또는 이의 염에서 시작해서 단계 2'), 3') 및 4')을 m-3회 동안 반복하고 나서, 단계 2') 및 단계 3')를 반복하여, 화학식 (IIE)의 화합물:
    Figure pct00554
    또는 이의 염을 형성하는 단계;
    6') 상기 화학식 (IIE)의 화합물 또는 이의 염을 탈보호하여, 화학식 (IIF)의 화합물:
    Figure pct00555
    또는 이의 염을 형성하는 단계; 및
    7') 상기 화학식 (IIF)의 화합물 또는 이의 염을 포스포다이아미다이트 (R16O)P(NR17aR17b)2와 반응시켜, 화학식 (II)의 단편 또는 이의 염을 수득하는 단계
    를 포함하되, 식 중,
    R1은, 각 경우에, 독립적으로 핵염기이고, 상기 핵염기 중의 NH2는, 존재할 경우, 아민 보호기에 의해 보호되고;
    R2는, 각 경우에, 독립적으로 H, 할로, 및 C1-6알콕시로 선택적으로 치환된 C1-6알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R4는, 각 경우에, 독립적으로 H이거나 또는 R2의 알콕시기를 가진 고리를 형성하고;
    R15는 하이드록실 보호기이고;
    R16은, 각 경우에, 독립적으로 C1-6알킬기, C2-6알켄일기, 페닐 또는 벤질기이되, 이들의 각각은 -CN, -NO2 또는 할로겐으로 선택적으로 치환되거나; 또는
    R16은
    Figure pct00556
    또는
    Figure pct00557
    이고;
    R17a 및 R17b는 독립적으로 C1-6알킬이고;
    m은 2 내지 20의 정수이고;
    X는, 각 경우에, 독립적으로 O 또는 S이고; 그리고
    Z는 하이드록실 실릴 보호기인, 방법.
  134. 제133항에 있어서, m은 3 내지 10의 정수인, 방법.
  135. 제133항 또는 제134항에 있어서, 상기 화학식 (II)의 단편은 크로마토그래피에 의해 정제되지 않는, 방법.
  136. 제133항 내지 제135항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 1'), 2'), 3'), 4'), 5'), 6') 및 7') 중 어느 하나의 단계의 반응 생성물을 정제시키기 위하여 크로마토그래피가 사용되지 않는, 방법.
  137. 제133항 내지 제135항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 1'), 2'), 3'), 4'), 5'), 6') 및 7') 중 어느 하나의 단계의 반응 생성물은 추출 또는 선택적 석출에 의해 정제되는, 방법.
  138. 제133항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 1) 및 단계 4)에서의 탈보호 반응 중 어느 하나는 제85항 내지 제96항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같이 수행되는, 방법.
  139. 제133항 내지 제138항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 6')의 상기 탈보호 반응은 제106항 내지 제112항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같이 수행되는, 방법.
  140. 제133항 내지 제139항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 7')의 포스피틸화 반응(phosphitylation reaction)은 제127항 또는 제128항에 정의된 바와 같이 수행되는, 방법.
  141. 제83항 내지 제140항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물 또는 올리고뉴클레오타이드 중의 P=X기의 전부가 P=S인, 방법.
  142. 제83항 내지 제140항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물 또는 올리고뉴클레오타이드 중의 P=X기의 전부가 P=O인, 방법.
  143. 제83항 내지 제140항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물 또는 올리고뉴클레오타이드 중의 P=X기의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 초과가 P=S인, 방법.
  144. 제83항 내지 제140항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물 또는 올리고뉴클레오타이드 중의 P=X기의 10 내지 90%, 20 내지 80%, 30 내지 70% 또는 40 내지 60%가 P=S인, 방법.
  145. 제83항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵염기는 사이토신, 구아닌, 아데닌, 티민, 우라실, 하이포잔틴, 잔틴, 7-메틸구아닌, 5,6-다이하이드로우라실, 5-메틸사이토신 및 5-하이드록시메틸사이토신으로 이루어진 군으로부터 선택되되, 상기 핵염기 중의 NH2기는, 존재할 경우, PhCO-, CH3CO-, iPrCO-, Me2N-CH= 또는 Me2N-CMe=에 의해 보호되는, 방법.
  146. 제83항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵염기는 사이토신, 구아닌, 아데닌, 티민, 우라실 및 5-메틸사이토신으로 이루어진 군으로부터 선택되되, 상기 핵염기 중의 NH2기는, 존재할 경우, PhCO-, CH3CO-, iPrCO-, Me2N-CH= 또는 Me2N-CMe=에 의해 보호되는, 방법.
  147. 제83항 내지 제146항 중 어느 한 항에 있어서,
    각각의 R2는 독립적으로 H, F, 및 C1-4알콕시로 선택적으로 치환된 C1-4알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    각각의 R4는 독립적으로 H이거나 또는 R2의 알콕시기를 갖는 고리를 형성하되, 상기 고리는 1 내지 3개의 C1-4 알킬기로 선택적으로 치환된 5 또는 6-원 고리이고;
    R16은 -CH2CH2CN이고; 그리고
    R17a및 R17b는 독립적으로 C1-4알킬인, 방법.
  148. 제147항에 있어서,
    각각의 R2는 독립적으로 H 또는 -OCH2CH2OMe로부터 선택되고;
    각각의 R4는 H이고;
    R16은 -CH2CH2CN이고; 그리고
    R17a와 R17b는 둘 다 -CH(CH3)2인, 방법.
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