ES2762326T3 - Métodos para modular la expresión de C9ORF72 - Google Patents

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Abstract

Un compuesto que comprende un oligonucleótido antisentido modificado que consiste de 12 a 30 nucleósidos enlazados, en el que el oligonucleótido antisentido modificado es por lo menos un 90% complementario a un ácido nucleico de C9ORF72, para su uso en el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa reduciendo el porcentaje de células con focos nucleares y/o reduciendo el número de focos nucleares por célula en un animal al que se ha identificado que tiene focos, en donde el oligonucleótido antisentido modificado comprende por lo menos un enlace internucleósido de fosforotioato, por lo menos una 5-metilcitosina, por lo menos un azúcar bicíclico o por lo menos un grupo 2'-O-metoxietilo.

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos para modular la expresión de C9ORF72
Campo
En la presente se divulgan métodos para reducir la expresión de ARNm y proteína de C9ORF72 en un animal. Tales métodos son útiles para tratar, prevenir o mejorar enfermedades neurodegenerativas, incluyendo la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), la demencia frontotemporal (FTD), el síndrome de degeneración corticobasal (CBD), el síndrome de Parkinson atípico y la degeneración olivopontocerebelosa (OPCD).
Antecedentes
La esclerosis lateral amiotrófica (ELA) es una enfermedad neurodegenerativa fatal caracterizada clínicamente por parálisis progresiva que conduce a la muerte por insuficiencia respiratoria, típicamente en el plazo de los dos a tres años posteriores a la aparición de los síntomas (Rowland y Shneider, N. Engl. J. Med., 2001, 344, 1688-1700). La ELA es la tercera enfermedad neurodegenerativa más común en el mundo occidental (Hirtz et al., Neurology, 2007, 68, 326-337), y actualmente no existen terapias eficaces. Aproximadamente el 10% de los casos son de naturaleza familiar, mientras que la mayoría de los pacientes diagnosticados con la enfermedad se clasifican como esporádicos, ya que parecen ocurrir al azar en toda la población (Chio et al., Neurology, 2008, 70, 533-537) Hay un reconocimiento creciente, en base a datos clínicos, genéticos y epidemiológicos, de que la ELA y la demencia frontotemporal (FTD) representan un espectro superpuesto de la enfermedad, caracterizado patológicamente por la presencia de inclusiones positivas para TDP-43 en todo el sistema nervioso central (Lillo y Hodges)., J. Clin. Neurosci., 2009, 16, 1131-1135; Neumann et al., Science, 2006, 314, 130-133).
Hasta la fecha, se han descubierto una serie de genes causantes de la ELA familiar clásica, por ejemplo, SOD1, TARDBP, FUS, OPTN y VCP (Johnson et al., Neuron, 2010, 68, 857-864; Kwiatkowski et al., Science, 2009, 323, 1205-1208; Maruyama et al., Nature, 2010, 465, 223-226; Rosen et al., Nature, 1993, 362, 59-62; Sreedharan et al., Science, 2008, 319, 1668-1672; Vance et al., Brain, 2009, 129, 868-876). Recientemente, el análisis de enlace de afines que involucran múltiples casos de ELA, FTD y ELA-FTD había sugerido que había un locues importante para la enfermedad en el brazo corto del cromosoma 9 (Boxer et al., J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry, 2011,82, 196-203;Morita et al., Neurology, 2006, 66, 839-844; Pearson et al. J. Nerol., 2011, 258, 647-655; Vance et al., Brain, 2006, 129, 868-876). El locus del cromosoma 9p21ALS-FTD en el último gen autosómico dominante principal cuya mutación es causante de la ELA. La mutación causante de ELA-FTD es una expansión de repetición de hexanucleótidos grande (GGGGCC) en el primer intrón del gen C9ORF72 (Renton et al., Neuron, 2011,72, 257-268; DeJesus-Hemandez et al., Neuron, 2011, 72, 245-256). Un haplotipo fundador, que cubre el gen C9ORF72, está presente en la mayoría de los casos vinculados a esta región (Renton et al., Neuron, 2011, 72, 257-268) Este locus en el cromosoma 9p21 representa casi la mitad de la ELA familiar y casi una cuarta parte de todos los casos de ELA en una cohorte de 405 pacientes finlandeses (Laaksovirta et al, Lancet Neurol., 2010, 9, 978-985).
Un haplotipo fundador, que cubre el gen C9ORF72, está presente en la mayoría de los casos vinculados a esta región.
Actualmente no hay terapias eficaces para tratar tales enfermedades neurodegenerativas. Por lo tanto, es un objeto proporcionar composiciones y métodos para el tratamiento de tales enfermedades neurodegenerativas.
La WO 2013/030588 describe métodos para diagnosticar una enfermedad neurodegenerativa. La US 2012/214865 describe métodos para ralentizar la progresión de la enfermedad de ELA familiar. Donnelly et al., 2012, Annals of Neurology., 72(16), S67-S68 informa sobre el desarrollo de biomarcadores y agentes terapéuticos de ELA C9orf72. Madsen, 2012, revista de noticias MDA/ALS, 1-2 informa sobre antisentido contra C9ORF72. La WO 2012/092367 describe compuestos de unión a ácidos nucleicos, métodos de elaboración y uso de los mismos. Renton, 2011, Neuron, 72(2), 257-268 informa que una expansión de repetición de hexanucleótidos en C9OF72 es la causa del ELA-FTD ligada al cromosoma 9p21. Dejesus-Hernández, 2011, Neuron, 72(2), 245-256 informa que la repetición del hexanucleótidos GGGGCC expandida en la región no codificante de C9ORF72 causa FTD y ELA ligadas al cromosoma 9p. La WO 2012/012467 describe la modulación del ARN retenido nuclear. Sha et al., 2012, Alzheimers Res Ther., 4(6), 46 informa sobre las implicaciones del tratamiento de C9ORF72.
Sumario de la invención
La invención proporciona un compuesto que comprende un oligonucleótido antisentido modificado que consiste de 12 a 30 nucleósidos enlazados, en donde el oligonucleótido antisentido modificado es por lo menos un 90% complementario a un ácido nucleico de C9ORF72, para su uso en el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa reduciendo el porcentaje de células con focos nucleares y/o reduciendo el número de focos nucleares por célula en un animal que se ha identificado que tiene focos, en donde el oligonucleótido antisentido modificado comprende por lo menos un enlace internucleosídico de fosforotioato, por lo menos una 5-metilcitosina, por lo menos un azúcar bicíclico o por lo menos un Grupo 2'-O-metoxietilo.
Sumario de la divulgación
En la presente se describen métodos para modular los niveles de ARNm y proteína de C9ORF72 en células, tejidos y animales. En ciertos casos, los inhibidores específicos de C9ORF72 modulan la expresión de ARNm y proteína de C9ORF72. En ciertos casos, los inhibidores específicos de C9ORF72 son ácidos nucleicos, proteínas o moléculas pequeñas.
En la invención, la modulación tiene lugar en una célula o tejido en un animal. En ciertas realizaciones, el animal es un humano. En ciertas realizaciones, se reducen los niveles de ARNm de C9ORF72. En ciertas realizaciones, se reducen los niveles de proteína de C9ORF72. En ciertas realizaciones, se reducen preferentemente ciertas variantes de ARNm de C9ORF72. En ciertas realizaciones, se reducen preferentemente variantes de ARNm de C9ORF72 que contienen el intrón 1. En ciertas realizaciones, el intrón 1 contiene una expansión de repetición de hexanucleótidos. En ciertas realizaciones, la expansión de repetición de hexanucleótidos está asociada con una enfermedad asociada a C9ORF72. En ciertas realizaciones, la expansión de repetición de hexanucleótidos está asociada con una enfermedad asociada a la expansión de repetición de hexanucleótidos de C9ORF72. En ciertas realizaciones, la expansión de repetición de hexanucleótidos comprende por lo menos 30 repeticiones de GGGGCC. En ciertas realizaciones, la expansión de repetición de hexanucleótidos está asociada con focos nucleares. En ciertos casos, los métodos descritos en la presente son útiles para reducir el ARNm de C9ORF72, los niveles de proteína de C9ORF72, y los focos nucleares. Tal reducción puede producirse de una manera dependiente del tiempo o de una manera dependiente de la dosis.
También se describen métodos útiles para prevenir, tratar y mejorar enfermedades, trastornos y afecciones asociadas con C9ORF72. Tales enfermedades, trastornos y afecciones asociadas con C9ORF72 pueden ser enfermedades neurodegenerativas. La enfermedad neurodegenerativa puede ser ELA, FTD, síndrome de degeneración corticobasal (CBD), síndrome de Parkinson atípico y degeneración olivopontocerebelosa (OPCD).
Tales enfermedades, trastornos y afecciones pueden tener uno o más factores de riesgo, causas o resultados en común. Ciertos factores de riesgo y causas para el desarrollo de una enfermedad neurodegenerativa, y, en particular, ELA y FTD, incluyen la predisposición genética y la edad avanzada.
En ciertos casos, los métodos de tratamiento incluyen administrar un inhibidor específico de C9ORF72 a un individuo con necesidad de ello. En estos casos, el inhibidor específico de C9ORF72 puede ser un ácido nucleico. En estos casos, el ácido nucleico puede ser un compuesto antisentido. En estos casos, el compuesto antisentido puede ser un oligonucleótido antisentido de cadena sencilla. En estos casos, el oligonucleótido antisentido de cadena sencilla puede ser complementario a un ácido nucleico de C9ORF72.
Descripción detallada
Debe entenderse que tanto la descripción general anterior como la siguiente descripción detallada son ejemplares y explicativas únicamente y no son restrictivas de la invención, como se reivindica. En la presente, el uso del singular incluye el plural a menos que se indique específicamente lo contrario. Como se usa en la presente, el uso de "o" significa "y/o" a menos que se indique lo contrario. Adicionalmente, como se usa en la presente, el uso de "y" significa "y/o" a menos que se indique lo contrario. Además, el uso del término "incluyendo", así como otras formas, como "incluye" e "incluido", no es limitativo. Además, términos como "elemento" o "componente" abarcan tanto elementos como componentes que comprenden una unidad y elementos y componentes que comprenden más de una subunidad, a menos que se indique específicamente lo contrario.
Los encabezados de sección usados en la presente son solo con propósitos organizativos y no deben interpretarse como limitantes del tema descrito.
Definiciones
A menos que se proporcionen definiciones específicas, la nomenclatura utilizada en relación con, y los procedimientos y técnicas de química analítica, química orgánica sintética y química medicinal y farmacéutica descritas en la presente son las bien conocidas y comúnmente usadas en la técnica. Pueden usarse técnicas estándar para la síntesis química y el análisis químico.
A menos que se indique lo contrario, los siguientes términos tienen los siguientes significados:
"Grupo 2'-O-metoxietilo" (también 2'-MOE y 2'-OCH2CH2-OCH3 y MOE) se refiere a una modificación de O-metoxi-etilo de la posición 2' de un anillo de furanosilo. Un azúcar modificado con 2'-O-metoxietilo es un azúcar modificado.
"Nucleósido 2'-MOE" (también nucleósido 2'-O-metoxietilo) significa un nucleósido que comprende un grupo 2'-O-metoxietilo.
"5-metilcitosina" significa una citosina modificada con un grupo metilo unido a la posición 5'. Una 5-metilcitosina es una nucleobase modificada.
"Aproximadamente" significa dentro del ±7% de un valor. Por ejemplo, si se afirma que "los compuestos afectaron por lo menos aproximadamente un 70% de inhibición de C9ORF72", está implícito que los niveles de C9ORF72 se inhiben dentro de un intervalo del 63% y el 77%.
"Administrado concomitantemente" se refiere a la administración conjunta de dos agentes farmacéuticos de cualquier manera en la que los efectos farmacológicos de ambos se manifiesten en el paciente al mismo tiempo. La administración concomitante no requiere que ambos agentes farmacéuticos se administren en una única composición farmacéutica, en la misma forma de dosificación, o por la misma vía de administración. Los efectos de ambos agentes farmacéuticos no necesitan manifestarse al mismo tiempo. Los efectos solo necesitan superponerse durante un período de tiempo y no necesitan ser coextensivos.
"Administrar" significa proporcionar un agente farmacéutico a un animal e incluye, pero no está limitado a, la administración por un profesional médico y la autoadministración.
"Mejora" o "mejorar" o "mejorando" se refiere a una disminución de por lo menos un indicador, signo o síntoma de una enfermedad, trastorno o afección. La gravedad de los indicadores puede determinarse mediante medidas subjetivas u objetivas, que son conocidas por los expertos en la técnica.
"Animal" se refiere a un animal humano o no humano, incluyendo, pero no limitados a, ratones, ratas, conejos, perros, gatos, cerdos y primates no humanos incluyendo, pero no limitados a, monos y chimpancés.
"Anticuerpo" se refiere a una molécula caracterizada por reaccionar específicamente con un antígeno de alguna manera, donde el anticuerpo y el antígeno se definen cada uno en términos del otro. El anticuerpo puede referirse a una molécula de anticuerpo completa o cualquier fragmento o región de la misma, como la cadena pesada, la cadena ligera, la región Fab y la región Fc.
"Actividad antisentido" significa cualquier actividad detectable o medible atribuible a la hibridación de un compuesto antisentido con su ácido nucleico objetivo. En ciertas realizaciones, la actividad antisentido es una disminución en la cantidad o expresión de un ácido nucleico o proteína objetivo codificado por dicho ácido nucleico objetivo.
"Compuesto antisentido" significa un compuesto oligomérico que es capaz de experimentar hibridación con un ácido nucleico objetivo a través de enlaces de hidrógeno. Los ejemplos de compuestos antisentido incluyen compuestos de cadena sencilla y de cadena doble como oligonucleótidos antisentido, ARNip, ARNhc, ARNmc, y compuestos basados en la ocupación. Los mecanismos antisentido incluyen, sin limitación, antisentido mediado por RNasa H; Mecanismos de ARNi, que utilizan la vía RISC e incluyen, sin limitación, mecanismos de ARNip, ARNmc y microARN; y mecanismos basados en la ocupación que incluyen, sin limitación, oligonucleótidos modificados uniformes. Ciertos compuestos antisentido pueden actuar a través de más de uno de tales mecanismos y/o mediante mecanismos adicionales.
"Inhibición antisentido" significa la reducción de los niveles de ácido nucleico objetivo o los niveles de proteína objetivo en presencia de un compuesto antisentido complementario a un ácido nucleico objetivo en comparación con los niveles de ácido nucleico objetivo o los niveles de proteína objetivo en ausencia del compuesto antisentido. La inhibición puede ser por cualquier medio, incluyendo la degradación de RNasa H, como con un gapmer, y mecanismos basados en el bloqueo/ocupación estérica, como con un oligonucleótido modificado uniformemente.
Oligonucleótido antisentido significa un oligonucleótido de cadena sencilla que tiene una secuencia de nucleobases que permite la hibridación con un segmento correspondiente de un ácido nucleico objetivo.
"Azúcar bicíclico" significa un anillo de furanosilo modificado por el puente de dos átomos. Un azúcar bicíclico es un azúcar modificado.
“Nucleósido bicíclico” (también BNA) significa un nucleósido que tiene una fracción de azúcar que comprende un puente que conecta dos átomos de carbono del anillo de azúcar, formando de este modo un sistema de anillo bicíclico. En ciertas realizaciones, el puente conecta el carbono 4' y el carbono 2' del anillo de azúcar.
"Enfermedad asociada a C9ORF72" significa cualquier enfermedad asociada con cualquier ácido nucleico de C9ORF72 o producto de expresión del mismo. Tales enfermedades pueden incluir una enfermedad neurodegenerativa. Tales enfermedades neurodegenerativas pueden incluir ELA y FTD.
"Enfermedad asociada a la expansión de repetición de hexanucleótidos de C9ORF72" significa cualquier enfermedad asociada con un ácido nucleico de C9ORF72 que contiene una expansión de repetición de hexanucleótidos. En ciertas realizaciones, la expansión de repetición de hexanucleótidos puede comprender GGGGCC, GGGGGG, GGGGGC o GGGGCC repetido por lo menos 30 veces. Tales enfermedades pueden incluir una enfermedad neurodegenerativa. Tales enfermedades neurodegenerativas pueden incluir ELA y FTD.
"Ácido nucleico de C9ORF72" significa cualquier ácido nucleico que codifica C9ORF72. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, un ácido nucleico de C9ORF72 incluye una secuencia de ADN que codifica C9ORF72, una secuencia de ARN transcrita a partir de ADN que codifica C9ORF72 (incluyendo ADN genómico que comprende intrones y exones), y una secuencia de ARNm que codifica C9ORF72. "ARNm de C9ORF72" significa un ARNm que codifica una proteína de C9ORF72.
"Inhibidor específico de C9ORF72" se refiere a cualquier agente capaz de inhibir específicamente la expresión de ARNm de C9ORF72 y/o proteína de C9ORF72 a nivel molecular. Por ejemplo, los inhibidores específicos de C9ORF72 incluyen ácidos nucleicos (incluyendo compuestos antisentido), ARNip, aptámeros, anticuerpos, péptidos, moléculas pequeñas y otros agentes capaces de inhibir la expresión del ARNm de C9ORF72 y/o proteína de C9ORF72. De manera similar, los inhibidores específicos de C9ORF72 pueden afectar a otros procesos moleculares en un animal.
"Estructura de tapa" o "fracción de tapa terminal" significa modificaciones químicas, que se han incorporado en cualquier extremo terminal de un compuesto antisentido.
"cEt" o "etilo restringido" significa un nucleósido bicíclico que tiene una fracción de azúcar que comprende un puente que conecta el carbono 4' y el carbono 2', en donde el puente tiene la fórmula: 4'-CH (CH3)-O-2'.
"Nucleósido de etilo restringido " (también nucleósido de cET) significa un nucleósido que comprende una fracción de azúcar bicíclico que comprende un puente 4’-CH'(CH3)-O-2'.
"Región químicamente distinta" se refiere a una región de un compuesto antisentido que es de alguna manera químicamente diferente que otra región del mismo compuesto antisentido. Por ejemplo, una región que tiene nucleósidos de 2'-O-metoxietilo es químicamente distinta de una región que tiene nucleósidos sin modificaciones de 2'-O-metoxietilo.
"Compuesto antisentido quimérico" significa un compuesto antisentido que tiene por lo menos dos regiones químicamente distintas.
"Administración conjunta" significa la administración de dos o más agentes farmacéuticos a un individuo. Los dos o más agentes farmacéuticos pueden estar en una única composición farmacéutica, o pueden estar en composiciones farmacéuticas separadas. Cada uno de los dos o más agentes farmacéuticos puede administrarse a través de la misma vía o a través de diferentes vías de administración. La administración conjunta abarca la administración paralela o secuencial.
"Complementariedad" significa la capacidad de emparejamiento entre nucleobases de un primer ácido nucleico y un segundo ácido nucleico.
"Nucleobases contiguas" significa nucleobases inmediatamente adyacentes entre sí.
"Diluyente" significa un ingrediente en una composición que carece de actividad farmacológica, pero es farmacéuticamente necesario o deseable. Por ejemplo, el diluyente en una composición inyectada puede ser un líquido, por ejemplo, solución salina.
"Dosis" significa una cantidad especificada de un agente farmacéutico proporcionado en una única administración, o en un período de tiempo especificado. En ciertos casos, una dosis puede administrarse en uno, dos o más bolos, comprimidos o inyecciones. Por ejemplo, en ciertos casos en los que se desea la administración subcutánea, la dosis deseada requiere un volumen que no se acomoda fácilmente con una sola inyección, por lo tanto, pueden usarse dos o más inyecciones para lograr la dosis deseada. En ciertos casos, el agente farmacéutico se administra por infusión durante un período prolongado de tiempo o de forma continua. Las dosis pueden indicarse como la cantidad de agente farmacéutico por hora, día, semana o mes.
"Cantidad eficaz" significa la cantidad de agente farmacéutico suficiente para efectuar un resultado fisiológico deseado en un individuo que necesita el agente farmacéutico. La cantidad eficaz puede variar entre individuos dependiendo de la salud y la condición física del individuo a tratar, el grupo taxonómico de los individuos a tratar, la formulación de la composición, la evaluación de la condición médica del individuo y otros factores relevantes.
"Expresión" significa la conversión de la información de un gen de C9ORF72 en ARNm mediante transcripción y luego a proteína mediante traducción. La expresión puede dar como resultado una manifestación fenotípica del gen de C9ORF72.
"Completamente complementario" o "100% complementario" significa que cada nucleobase de un primer ácido nucleico tiene una nucleobase complementaria en un segundo ácido nucleico. En ciertas realizaciones, un primer ácido nucleico es un compuesto antisentido y un ácido nucleico objetivo es un segundo ácido nucleico.
"Gapmer" significa un compuesto antisentido quimérico en el que una región interna que tiene una pluralidad de nucleósidos que soportan la escisión de RNasa H está colocada entre regiones externas que tienen uno o más nucleósidos, en donde los nucleósidos que comprenden la región interna son químicamente distintos del nucleósido o nucleósidos que comprenden las regiones externas. La región interna puede denominarse "brecha" y las regiones externas pueden denominarse "alas".
"Hueco reducido" significa un compuesto antisentido quimérico que tiene un segmento de hueco de 9 o menos 2'-desoxirribonucleósidos contiguos colocados entre e inmediatamente adyacentes a los segmentos de ala 5' y 3' que tienen de 1 a 6 nucleósidos.
"Hueco ampliado" significa un compuesto antisentido quimérico que tiene un segmento de hueco de 12 o más 2'-desoxirribonucleósidos contiguos colocados entre e inmediatamente adyacentes a segmentos de ala 5' y 3' que tienen de 1 a 6 nucleósidos.
"Expansión de repetición de hexanucleótidos" significa una serie de seis bases (por ejemplo, GGGGCC, GGGGGG, GGGGCG o GGGGGC) repetidas por lo menos dos veces. En ciertas realizaciones, la expansión de repetición de hexanucleótidos puede localizarse en el intrón 1 de un ácido nucleico de C9ORF72. En ciertas realizaciones, una expansión de repetición de hexanucleótidos patogénica incluye por lo menos 30 repeticiones de GGGGCC, GGGGGG, GGGGCG o GGGGGC en un ácido nucleico de C9ORF72 y está asociada con la enfermedad. En ciertas realizaciones, las repeticiones son consecutivas. En ciertas realizaciones, las repeticiones están interrumpidas por 1 o más nucleobases. En ciertas realizaciones, una expansión de repetición de hexanucleótidos de tipo salvaje incluye 23 repeticiones o menos de GGGGCC, GGGGGG, GGGGCG o GGGGGC en un ácido nucleico de C9ORF72. En ciertas realizaciones, las repeticiones son consecutivas. En ciertas realizaciones, las repeticiones están interrumpidas por 1 o más nucleobases.
"Hibridación" significa el apareamiento de moléculas de ácido nucleico complementarias. En la invención, las moléculas de ácido nucleico complementarias incluyen un compuesto antisentido y un ácido nucleico objetivo.
"Identificar un animal que tiene una enfermedad asociada a C9ORF72" significa identificar un animal al que se le ha diagnosticado una enfermedad asociada a C9ORF72 o que está predispuesto a desarrollar una enfermedad asociada a C9ORF72. Los individuos predispuestos a desarrollar una enfermedad asociada a C9ORF72 incluyen aquellos que tienen uno o más factores de riesgo para desarrollar una enfermedad asociada a C9ORF72, incluyendo que tienen un historial personal o familiar o predisposición genética de una o más enfermedades asociadas a C9ORF72. Dicha identificación puede lograrse mediante cualquier método, incluyendo la evaluación del historial médico de un individuo y pruebas o evaluaciones clínicas estándar, como las pruebas genéticas.
"Inmediatamente adyacente" significa que no hay elementos intermedios entre los elementos inmediatamente adyacentes.
"Individuo" significa un animal humano o no humano seleccionado para tratamiento o terapia.
"Inhibir C9ORF72" significa reducir la expresión del ARNm y/o los niveles de proteína de C9ORF72en presencia de un inhibidor específico de C9ORF72, que incluye un oligonucleótido antisentido de C9ORF72, en comparación con la expresión del ARNm y/o niveles de proteína de C9ORF72 en ausencia de un inhibidor específico de C9ORF72, como un oligonucleótido antisentido de C9ORF72.
"Enlace internucleosídico" se refiere al enlace químico entre nucleósidos.
“Nucleósidos enlazados” significa nucleósidos adyacentes que están unidos entre sí.
"Malapareamiento" o "nucleobase no complementaria" se refiere al caso en el que una nucleobase de un primer ácido nucleico no es capaz de emparejarse con la nucleobase correspondiente de un segundo ácido nucleico u objetivo.
"Enlace internucleosídico modificado" se refiere a una sustitución o cualquier cambio de un enlace internucleósido de origen natural (es decir, un enlace internucleósido de fosfodiéster).
“Nucleobase modificada” se refiere a cualquier nucleobase distinta de adenina, citosina, guanina, timidina o uracilo. Una "nucleobase no modificada" significa las bases de purina adenina (A) y guanina (G), y las bases de pirimidina timina (T), citosina (C) y uracilo (U).
“Nucleótido modificado” significa un nucleótido que tiene, independientemente, una fracción de azúcar modificado, enlace internucleósido modificado o nucleobase modificada. Un "nucleósido modificado" significa un nucleósido que tiene, independientemente, una fracción de azúcar modificado o una nucleobase modificada.
"Oligonucleótido modificado" significa un oligonucleótido que comprende un enlace internucleosídico modificado, un azúcar modificado o una nucleobase modificada.
"Azúcar modificado" se refiere a una sustitución o cambio de un azúcar natural.
"Motivo" significa el patrón de regiones químicamente distintas en un compuesto antisentido.
"Enlace internucleosídico natural" significa un enlace fosfodiéster de 3' a 5'.
"Fracción de azúcar natural" significa un azúcar que se encuentra en el ADN (2'-H) o ARN (2'-OH).
"Ácido nucleico" se refiere a moléculas compuestas de nucleótidos monoméricos. Un ácido nucleico incluye ácidos ribonucleicos (ARN), ácidos desoxirribonucleicos (ADN), ácidos nucleicos de cadena sencilla, ácidos nucleicos de cadena doble, ácidos ribonucleicos interferentes pequeños (ARNip) y microARN (ARNmi).
Nucleobase significa una fracción heterocíclica capaz de emparejarse con una base de otro ácido nucleico. "Secuencia de nucleobase" significa el orden de nucleobases contiguas independientes de cualquier azúcar, enlace o modificación de nucleobase.
"Nucleósido" significa una nucleobase unida a un azúcar.
"Mimético de nucleósido" incluye aquellas estructuras usadas para reemplazar el azúcar o el azúcar y la base y no necesariamente el enlace en una o más posiciones de un compuesto oligomérico como, por ejemplo, miméticos de nucleósidos que tienen morfolino, ciclohexenilo, ciclohexilo, tetrahidropiranilo, biciclo o miméticos de azúcar triciclo, por ejemplo, unidades de azúcar no de furanosa. El mimético de nucleótidos incluye aquellas estructuras usadas para reemplazar el nucleósido y el enlace en una o más posiciones de un compuesto oligomérico como, por ejemplo, ácidos nucleicos peptídicos o morfolinos (morfolinos enlazados por -N(H)-C(=O)-O- u otro enlace no fosfodiéster). El sustituto del azúcar se superpone con el término nucleósido mimético ligeramente más amplio, pero se pretende que indique el reemplazo de la unidad de azúcar (anillo de furanosa) solamente. Los anillos de tetrahidropiranilo proporcionados en la presente son ilustrativos de un ejemplo de un sustituto de azúcar en el que el grupo azúcar de furanosa se ha reemplazado con un sistema de anillo de tetrahidropiranilo.
Nucleótido significa un nucleósido que tiene un grupo fosfato enlazado covalentemente a la porción de azúcar del nucleósido.
"Compuesto oligomérico" u "oligómero" significa un polímero de subunidades monoméricas enlazadas que es capaz de hibridar con por lo menos una región de una molécula de ácido nucleico.
"Oligonucleótido" significa un polímero de nucleósidos enlazados, cada uno de los cuales puede estar modificado o no modificado, uno independientemente del otro.
"Administración parenteral" significa administración por inyección o infusión. La administración parenteral incluye administración subcutánea, administración intravenosa, administración intramuscular, administración intraarterial, administración intraperitoneal o administración intracraneal, por ejemplo, administración intratecal o intracerebroventricular.
"Péptido" significa una molécula formada enlazando por lo menos dos aminoácidos por enlaces amida. Péptido se refiere a polipéptidos y proteínas.
"Agente farmacéutico" significa la sustancia o sustancias en una composición farmacéutica que proporcionan un beneficio terapéutico cuando se administran a un individuo. Por ejemplo, en ciertos casos, un oligonucleótido antisentido dirigido a C9ORF72 es un agente farmacéutico.
"Composición farmacéutica" significa una mezcla de sustancias adecuadas para administrar a un individuo. Por ejemplo, una composición farmacéutica puede comprender uno o más agentes farmacéuticos y una solución acuosa estéril.
"Derivado farmacéuticamente aceptable" abarca sales, conjugados, profármacos o isómeros farmacéuticamente aceptables de los compuestos descritos en la presente.
"Sales farmacéuticamente aceptables" significa sales fisiológica y farmacéuticamente aceptables de compuestos antisentido, es decir, sales que retienen la actividad biológica deseada del oligonucleótido original y no imparten efectos toxicológicos no deseados a los mismos.
"Enlace de fosforotioato" significa un enlace entre nucleósidos en donde el enlace de fosfodiéster se modifica reemplazando uno de los átomos de oxígeno no puente con un átomo de azufre. Un enlace de fosforotioato (P=S) es un enlace internucleosídico modificado.
Porción significa un número definido de nucleobases contiguas (es decir, enlazadas) de un ácido nucleico. En ciertas realizaciones, una porción es un número definido de nucleobases contiguas de un ácido nucleico objetivo. En ciertas realizaciones, una porción es un número definido de nucleobases contiguas de un compuesto antisentido.
"Prevenir" o "prevención" se refiere a retrasar o impedir el inicio o desarrollo de una enfermedad, trastorno o afección durante un período de tiempo de minutos a indefinidamente. Prevenir también significa reducir el riesgo de desarrollar una enfermedad, trastorno o afección.
"Profármaco" significa un agente terapéutico que se prepara en una forma inactiva que se convierte en una forma activa dentro del cuerpo o las células del mismo mediante la acción de enzimas endógenas u otras sustancias químicas o afecciones.
"Efectos secundarios" significa respuestas fisiológicas atribuibles a un tratamiento distintas de los efectos deseados. En ciertas realizaciones, los efectos secundarios incluyen reacciones en el sitio de inyección, anormalidades de la prueba de función hepática, anormalidades de la función renal, toxicidad hepática, toxicidad renal, anormalidades del sistema nervioso central, miopatías y malestar general.
“Oligonucleótido de cadena sencilla” significa un oligonucleótido que no hibrida con una cadena complementaria.
"Específicamente hibridable" se refiere a un compuesto antisentido que tiene un grado suficiente de complementariedad entre un oligonucleótido antisentido y un ácido nucleico objetivo para inducir un efecto deseado, a la vez que muestra efectos mínimos o ningún efecto sobre los ácidos nucleicos no objetivo bajo condiciones en las que se desea una unión específica, es decir, bajo condiciones fisiológicas en el caso de ensayos in vivo y tratamientos terapéuticos.
"Dirigir" o "dirigido" significa el proceso de diseño y selección de un compuesto antisentido que se hibridará específicamente con un ácido nucleico objetivo e inducirá un efecto deseado.
"Ácido nucleico objetivo", "ARN objetivo" y "transcrito de ARN objetivo" se refieren todos a un ácido nucleico capaz de ser el objetivo de compuestos antisentido.
"Segmento objetivo" significa la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico objetivo al que se dirige un compuesto antisentido. "Sitio objetivo 5' " se refiere al nucleótido más 5' de un segmento objetivo. "Sitio objetivo 3’ " se refiere al nucleótido más 3' de un segmento objetivo.
"Cantidad terapéuticamente eficaz" significa una cantidad de un agente farmacéutico que proporciona un beneficio terapéutico a un individuo.
"Tratar" o "tratamiento" se refiere a administrar una composición farmacéutica para efectuar una alteración o mejora de una enfermedad, trastorno o afección.
"Nucleótido no modificado" significa un nucleótido compuesto de nucleobases, fracciones de azúcar y enlaces internucleosídicos de origen natural. En ciertas realizaciones, un nucleótido no modificado es un nucleótido de ARN (es decir, p-D-ribonucleósidos) o un nucleótido de ADN (es decir, p-D-desoxirribonucleósido).
Ciertas realizaciones
En la presente se divulgan métodos para disminuir la expresión de ARNm y proteína de C9ORF72.
En la presente se divulgan métodos para el tratamiento, prevención o mejora de enfermedades, trastornos y afecciones asociadas con C9ORF72 en un individuo con necesidad de ello. También se contemplan métodos para la preparación de un medicamento para el tratamiento, prevención o mejora de una enfermedad, trastorno o afección asociada con C9ORF72. Las enfermedades, trastornos y afecciones asociadas a C9ORF72 incluyen enfermedades neurodegenerativas. La enfermedad neurodegenerativa puede ser ELA o FTD. La enfermedad neurodegenerativa puede ser familiar o esporádica.
En la presente se divulga el uso de un inhibidor específico de C9ORF72 para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad asociada a C9ORF72. En la presente se divulga el uso de un inhibidor específico de C9ORF72 para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad asociada a la expansión de repetición de hexanucleótidos de C9ORF72. La expansión de repetición de hexanucleótidos puede comprender GGGGCC, GGGGGG, GGGGGC o GGGGCG. En ciertos casos, los inhibidores específicos de C9ORF72 son ácidos nucleicos (incluyendo compuestos antisentido), péptidos, anticuerpos, moléculas pequeñas y otros agentes capaces de inhibir la expresión del ARNm de C9ORF72 y/o proteína de C9ORF72.
En la presente se divulgan métodos que comprenden administrar un inhibidor específico de C9ORF72 u homólogo de C9ORF72 a un animal.
En la presente se divulgan métodos que comprenden:
identificar un animal que tiene una enfermedad asociada a C9ORF72; y
administrar un inhibidor específico de C9ORF72.
En ciertas realizaciones, el animal es un humano.
En ciertos casos, el inhibidor específico de C9ORF72 es cualquiera de un compuesto antisentido, un aptámero, un anticuerpo, un péptido o una molécula pequeña.
En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido comprende un oligonucleótido antisentido de cadena sencilla complementario a un ácido nucleico de C9ORF72.
En ciertas realizaciones, el ácido nucleico de C9ORF72 es un ácido nucleico de C9ORF72 humano.
En ciertas realizaciones, el animal tiene una enfermedad asociada a C9ORF72.
En ciertas realizaciones, la enfermedad asociada a C9ORF72 es una enfermedad asociada a la expansión de repetición de hexanucleótidos de C9ORF72.
En ciertas realizaciones, la enfermedad asociada a C9ORF72 es esclerosis lateral amiotrófica (ELA) o demencia frontotemporal (FTD).
En ciertas realizaciones, la enfermedad asociada a la expansión de repetición de hexanucleótidos de C9ORF72 es esclerosis lateral amiotrófica (ELA) o demencia frontotemporal (FTD).
En ciertas realizaciones, la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) es ELA familiar o ELA esporádica.
En ciertas realizaciones, el oligonucleótido antisentido de cadena sencilla comprende por lo menos una modificación.
En ciertas realizaciones, el oligonucleótido antisentido de cadena sencilla es específicamente hibridable con un ácido nucleico de C9ORF72 humano.
En ciertos casos, el oligonucleótido antisentido de cadena sencilla es por lo menos un 75%, por lo menos un 80%, por lo menos un 85%, por lo menos un 90% o por lo menos un 95% complementario a una porción de igual longitud de un ácido nucleico de C9ORF72 humano.
En ciertas realizaciones, el oligonucleótido antisentido de cadena sencilla es 100% complementario a una porción de igual longitud de un ácido nucleico de C9ORF72 humano.
En ciertas realizaciones, el oligonucleótido antisentido de cadena sencilla comprende por lo menos un enlace internucleósido modificado.
En ciertas realizaciones, cada enlace internucleosídico del oligonucleótido antisentido de cadena sencilla es un enlace internucleósido modificado.
En ciertas realizaciones, el enlace internucleosídico modificado es un enlace internucleósido de fosforotioato.
En ciertas realizaciones, el oligonucleótido antisentido de cadena sencilla comprende por lo menos un nucleósido modificado.
En ciertas realizaciones, el oligonucleótido antisentido de cadena sencilla comprende por lo menos un nucleósido modificado que tiene un azúcar modificado.
En ciertas realizaciones, el oligonucleótido antisentido de cadena sencilla comprende por lo menos un nucleósido modificado que comprende un azúcar bicíclico.
En ciertas realizaciones, el azúcar bicíclico comprende un puente de 4' a 2' seleccionado entre: puente 4'-(CH2)n-O-2', en donde n es 1 o 2; y 4'CH2-O-CH2-2'.
En ciertas realizaciones, el azúcar bicíclico comprende un puente 4’-CH'(CH3)-O-2'.
En ciertas realizaciones, por lo menos un nucleósido modificado que tiene un azúcar modificado comprende una fracción de azúcar modificado 2 ’-modificado no bicíclico.
En ciertas realizaciones, la fracción de azúcar 2’-modificado comprende un grupo 2'-O-metoxietilo.
En ciertas realizaciones, la fracción de azúcar 2’-modificado comprende un grupo 2'-O-metilo.
En ciertas realizaciones, el por lo menos un nucleósido modificado que tiene un azúcar modificado comprende un sustituto de azúcar.
En ciertas realizaciones, el sustituto del azúcar es un morfolino.
En ciertas realizaciones, el sustituto del azúcar es un ácido nucleico peptídico.
En ciertas realizaciones, cada nucleósido está modificado.
En ciertas realizaciones, el oligonucleótido antisentido de cadena sencilla comprende por lo menos una nucleobase modificada.
En ciertas realizaciones, la nucleobase modificada es una 5'-metilcitosina.
En ciertas realizaciones, el oligonucleótido antisentido de cadena sencilla comprende:
un segmento de hueco que consiste de desoxinucleósidos enlazados;
un segmento de ala 5 ' que consiste de nucleósidos enlazados;
un segmento de ala 3 ' que consiste de nucleósidos enlazados;
en donde el segmento de hueco está colocado inmediatamente adyacente a y entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3 ' y en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido antisentido de cadena sencilla comprende:
un segmento de hueco que consiste de diez desoxinucleósidos enlazados;
un segmento de ala 5' que consiste de cinco nucleósidos enlazados;
un segmento de ala 3' que consiste de cinco nucleósidos enlazados;
en donde el segmento de hueco está colocado inmediatamente adyacente y entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3', en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar 2'-O-metoxietilo; y en donde cada enlace internucleosídico es un enlace fosforotioato.
En ciertas realizaciones, el oligonucleótido antisentido de cadena sencilla consiste de 15 nucleósidos unidos.
En ciertas realizaciones, el oligonucleótido antisentido de cadena sencilla consiste de 16 nucleósidos enlazados.
En ciertas realizaciones, el oligonucleótido antisentido de cadena sencilla consiste de 17 nucleósidos enlazados.
En ciertas realizaciones, el oligonucleótido antisentido de cadena sencilla consiste de 18 nucleósidos enlazados.
En ciertas realizaciones, el oligonucleótido antisentido de cadena sencilla consiste de 19 nucleósidos enlazados.
En ciertas realizaciones, el oligonucleótido antisentido de cadena sencilla consiste de 20 nucleósidos enlazados.
En ciertas realizaciones, el oligonucleótido antisentido de cadena sencilla consiste de 21 nucleósidos enlazados.
En ciertas realizaciones, el oligonucleótido antisentido de cadena sencilla consiste de 22 nucleósidos enlazados.
En ciertas realizaciones, el oligonucleótido antisentido de cadena sencilla consiste de 23 nucleósidos enlazados.
En ciertas realizaciones, el oligonucleótido antisentido de cadena sencilla consiste de 24 nucleósidos enlazados.
En ciertas realizaciones, el oligonucleótido antisentido de cadena sencilla consiste de 25 nucleósidos enlazados.
En ciertas realizaciones, el oligonucleótido antisentido de cadena sencilla complementario a un ácido nucleico de C9ORF72 es complementario a cualquiera de un intrón, un exón, una unión de corte y empalme, una unión de exón:exón, una repetición, la UTR 3’ o la UTR 5’ del ácido nucleico deC9ORF72.
En ciertas realizaciones, el intrón es cualquiera de los intrones 1, intrón 2, intrón 3, intrón 4, intrón 5, intrón 6, intrón 7, intrón 8, intrón 9 o intrón 10.
En ciertas realizaciones, el exón es cualquiera de exón 1a, exón 1b, exón 1c, exón 1d, exón 1d, exón 2, exón 3, exón 4, exón 5, exón 6, exón 7, exón 8, exón 9, exón 10 o exón 11.
En ciertas realizaciones, la repetición es una repetición de hexanucleótido.
En ciertas realizaciones, la repetición del hexanucleótido es cualquiera de GGGGCC, GGGGGG, GGGGCG o GGGGGC.
En ciertas realizaciones, se reduce la expresión de ARN de C9ORF72.
En ciertas realizaciones, la expresión de ARN de C9ORF72 se reduce en un núcleo.
En ciertas realizaciones, se reduce la expresión de proteína de C9ORF72.
En ciertas realizaciones, la expresión de proteína de C9ORF72 se reduce en un núcleo.
En ciertas realizaciones, la expresión se reduce en cualquiera de fibroblastos, linfoblastos inmortalizados, neuronas motoras espinales, células de purkinje y granulares en el cerebelo, neuronas corticales, astrocitos o microglia.
En ciertas realizaciones, se reduce la expresión de ARN de la isoforma V1 de C9ORF72.
En ciertas realizaciones, se reduce la expresión de proteína de la isoforma V1 de C9ORF72.
En ciertas realizaciones, se reduce la expresión de ARN de la isoforma V2 de C9ORF72.
En ciertas realizaciones, se reduce la expresión de proteína de la isoforma V2 de C9ORF72.
En ciertas realizaciones, se reduce la expresión de ARN de la isoforma V3 de C9ORF72.
En ciertas realizaciones, se reduce la expresión de proteína de la isoforma V3 de C9ORF72.
En ciertas realizaciones, se reduce la expresión del ARN de la isoforma V2 de C9ORF72 y la expresión del ARN de la isoforma V3 de C9ORF72 y no se reduce el ARN de la isoforma V1 de C9ORF72.
En ciertas realizaciones, se reduce la expresión de proteína de la isoforma V2 de C9ORF72 y la expresión de proteína de la isoforma V3 de C9ORF72 y no se reduce la proteína de la isoforma V1 de C9ORF72.
En ciertos casos, se reducen los focos de ARN de C9ORF72.
En la invención, los focos de ARN de C9ORF72 se reducen en un núcleo.
En ciertos casos, las composiciones descritas en la presente se administran por administración parenteral. En ciertos casos, la administración parenteral es cualquiera de inyección o infusión.
En ciertos casos, la administración parenteral es cualquiera de administración intratecal o administración intracerebroventricular.
En ciertas realizaciones, se mejora o previene por lo menos un síntoma de una enfermedad asociada a C9ORF72.
En ciertas realizaciones, se mejora o previene por lo menos un síntoma de una enfermedad asociada a la expansión de repetición de hexanucleótidos de C9ORF72.
En ciertas realizaciones, se ralentiza la progresión de por lo menos un síntoma de una enfermedad asociada a C9ORF72.
En ciertas realizaciones, se ralentiza la progresión de por lo menos un síntoma de una enfermedad asociada a la expansión de repetición de hexanucleótidos de C9ORF72.
En ciertas realizaciones, el por lo menos un síntoma es cualquiera de la función motora, respiración, debilidad muscular, fasciculación y calambres musculares, dificultad para proyectar la voz, falta de aire, dificultad para respirar y tragar, comportamiento social inapropiado, falta de empatía, distracción, cambios en las preferencias alimentarias, agitación, emociones embotadas, descuido de la higiene personal, comportamiento repetitivo o compulsivo, y energía y motivación disminuidas.
Compuestos antisentido
Los compuestos oligoméricos incluyen, pero no están limitados a, oligonucleótidos, oligonucleósidos, análogos de oligonucleótidos, miméticos de oligonucleótidos, compuestos antisentido, oligonucleótidos antisentido y ARNip. Un compuesto oligomérico puede ser "antisentido" para un ácido nucleico objetivo, lo que significa que es capaz de experimentar hibridación con un ácido nucleico objetivo a través de enlaces de hidrógeno.
En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido tiene una secuencia de nucleobases que, cuando se escribe en la dirección 5' a 3', comprende el complemento inverso del segmento objetivo de un ácido nucleico objetivo al que está dirigido. En ciertas de tales realizaciones, un oligonucleótido antisentido tiene una secuencia de nucleobases que, cuando se escribe en la dirección 5' a 3', comprende el complemento inverso del segmento objetivo de un ácido nucleico objetivo al que está dirigido.
En la invención, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de C9ORF72 tiene una longitud de 12 a 30 subunidades. En ciertos casos, el compuesto antisentido es de 8 a 80, de 12 a 50, de 15 a 30, de 18 a 24, de 19 a 22, o de 20 subunidades enlazadas. En ciertos casos, los compuestos antisentido tienen 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 u 80 subunidades enlazadas de longitud, o un intervalo definido por dos cualquiera de los valores anteriores. En la invención, el compuesto antisentido es un oligonucleótido antisentido modificado, y las subunidades enlazadas son nucleósidos.
En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de C9ORF72 pueden acortarse o truncarse. Por ejemplo, puede eliminarse una sola subunidad del extremo 5' (truncamiento 5'), o alternativamente del extremo 3' (truncamiento 3'). Un compuesto antisentido acortado o truncado dirigido a un ácido nucleico de C9ORF72 puede tener dos subunidades eliminadas del extremo 5', o alternativamente puede tener dos subunidades eliminadas del extremo 3' del compuesto antisentido. Alternativamente, los nucleósidos eliminados pueden dispersarse por todo el compuesto antisentido, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tiene un nucleósido eliminado del extremo 5' y un nucleósido eliminado del extremo 3'.
Cuando hay una única subunidad adicional en un compuesto antisentido alargado, la subunidad adicional puede localizarse en el extremo 5' o 3' del compuesto antisentido. Cuando hay dos o más subunidades adicionales, las subunidades añadidas pueden estar adyacentes entre sí, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tiene dos subunidades añadidas al extremo 5' (adición 5'), o alternativamente al extremo 3' (adición 3’), del compuesto antisentido. Alternativamente, las subunidades añadidas pueden estar dispersas por todo el compuesto antisentido, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tiene una subunidad añadida al extremo 5' y una subunidad añadida al extremo 3'.
Es posible aumentar o disminuir la longitud de un compuesto antisentido, como un oligonucleótido antisentido, y/o introducir bases malapareadas sin eliminar la actividad. Por ejemplo, en Woolf et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7305-7309, 1992), se probó una serie de oligonucleótidos antisentido de 13-25 nucleobases de longitud para determinar su capacidad de inducir la escisión de un ARN objetivo en un modelo de inyección de ovocitos. Los oligonucleótidos antisentido de 25 nucleobases de longitud con 8 u 11 bases malapareadas cerca de los extremos de los oligonucleótidos antisentido fueron capaces de dirigir la escisión específica del ARNm objetivo, aunque en menor medida que los oligonucleótidos antisentido que no contenían malapareamientos. De manera similar, se logró la escisión específica del objetivo usando oligonucleótidos antisentido de 13 nucleobases, incluyendo aquellos con 1 o 3 malapareamientos.
Gautschi et al (J. Natl. Cancer Inst. 93 463-471, marzo de 2001) demostraron la capacidad de un oligonucleótido que tiene un 100% de complementariedad con el ARNm de bcl-2 y que tiene 3 malapareamientos con el ARNm de bcl-xL para reducir la expresión tanto de bcl-2 como de bcl-xL in vitro e in vivo. Además, este oligonucleótido demostró una potente actividad antitumoral in vivo.
Maher y Dolnick (Nuc. Acid. Res. 16: 3341-3358,1988) probaron una serie de oligonucleótidos antisentido en tándem de 14 nucleobases, y un oligonucleótido antisentido de 28 y 42 nucleobases compuesto por la secuencia de dos o tres de los oligonucleótidos antisentido en tándem, respectivamente, para su capacidad para detener la traducción de DHFR humano en un ensayo de reticulocitos de conejo. Cada uno de los tres oligonucleótidos antisentido de 14 nucleobases solo fue capaz de inhibir la traducción, aunque en menor nivel que los oligonucleótidos antisentido de 28 o 42 nucleobases.
Motivos de compuestos antisentido
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de C9ORF72 tienen subunidades modificadas químicamente dispuestas en patrones, o motivos, para conferir a los compuestos antisentido propiedades como actividad inhibidora mejorada, afinidad de unión aumentada para un ácido nucleico objetivo o resistencia a la degradación por nucleasas in vivo.
Los compuestos antisentido quiméricos contienen típicamente por lo menos una región modificada para conferir una resistencia aumentada a la degradación de la nucleasa, una captación celular aumentada, una afinidad de unión aumentada por el ácido nucleico objetivo y/o una actividad inhibidora aumentada. Una segunda región de un compuesto antisentido quimérico puede servir opcionalmente como sustrato para la endonucleasa celular RNasa H, que escinde la cadena de ARN de un dúplex de ARN:ADN.
Los compuestos antisentido que tienen un motivo gapmer se consideran compuestos antisentido quiméricos. En un gapmer, una región interna que tiene una pluralidad de nucleótidos que soporta la escisión de RNasaH se coloca entre regiones externas que tienen una pluralidad de nucleótidos que son químicamente distintos de los nucleósidos de la región interna. En el caso de un oligonucleótido antisentido que tiene un motivo gapmer, el segmento de hueco sirve generalmente como sustrato para la escisión de la endonucleasa, mientras que los segmentos de ala comprenden nucleósidos modificados. En ciertas realizaciones, las regiones de un gapmer se diferencian por los tipos de fracciones de azúcar que comprenden cada región distinta. Los tipos de fracciones de azúcar que se usan para diferenciar las regiones de un gapmer pueden incluir en algunas realizaciones p-D-ribonucleósidos, p-D-desoxirribonucleósidos, nucleósidos 2’-modificados (tales nucleósidos 2’-modificados pueden incluir 2’-MOE, y 2’-O-CH3, entre otros), y nucleósidos modificados con azúcar bicíclico (tales nucleósidos modificados con azúcar bicíclico pueden incluir aquellos que tienen un puente 4'-(CH2)nO-2', donde n=1 o n=2 y 4'-CH2-O-CH2-2'). Preferiblemente, cada región distinta comprende fracciones de azúcar uniformes. El motivo alahueco-ala se describe con frecuencia como "X-Y-Z", donde "X" representa la longitud de la región de ala 5', "Y" representa la longitud de la región del hueco, y "Z" representa la longitud de la región de ala 3’. Como se usa en la presente, un gapmer descrito como "X-Y-Z" tiene una configuración tal que el segmento de hueco está colocado inmediatamente adyacente a cada uno de los segmentos de ala 5' y el segmento de ala 3'. Por tanto, no existen nucleótidos intermedios entre el segmento de ala 5' y el segmento de hueco, o el segmento de hueco y el segmento de ala 3'. Cualquiera de los compuestos antisentido descritos en la presente puede tener un motivo gapmer. En algunas realizaciones, X y Z son iguales, en otras realizaciones son diferentes. En una realización preferida, Y tiene entre 8 y 15 nucleótidos. X, Y o Z pueden ser cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 o más nucleótidos. Por tanto, los gapmers descritos en la presente incluyen, pero no están limitados a, por ejemplo 5-10-5, 5-10-4, 4-10-4, 4-10-3, 3-10-3, 2-10-2, 5-9-5, 5-9-4, 4-9-5, 5-8-5, 5-8-4, 4-8-5, 5-7-5, 4-7-5, 5-7-4, o 4-7-4.
En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido tiene un motivo "wingmer", que tiene una configuración ala-hueco o hueco-ala, es decir, una configuración X-Y o Y-Z como se ha descrito anteriormente para la configuración gapmer. Por tanto, las configuraciones wingmer descritas en la presente incluyen, pero no están limitadas a, por ejemplo 5-10, 8-4, 4-12, 12-4, 3-14, 16-2, 18-1, 10-3, 2- 10, 1 -10, 8-2, 2-13, 5-13, 5-8 o 6-8.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de C9ORF72 poseen un motivo gapmer 5-10-5.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de C9ORF72 poseen un motivo gapmer 5-10-4.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de C9ORF72 poseen un motivo gapmer 4-10-4.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de C9ORF72 poseen un motivo gapmer 4-10-3.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de C9ORF72 poseen un motivo gapmer 5-9-5.
En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de C9ORF72 tiene un motivo de hueco reducido. En ciertas realizaciones, un oligonucleótido antisentido de hueco reducido dirigido a un ácido nucleico de C9ORF72 tiene un segmento de hueco de 9, 8, 7 o 6 2'-desoxinucleótidos colocados inmediatamente adyacentes y entre los segmentos de ala de 5, 4, 3, 2, o 1 nucleósidos modificados químicamente. En ciertas realizaciones, la modificación química comprende un azúcar bicíclico. En ciertas realizaciones, el azúcar bicíclico comprende un puente de 4' a 2' seleccionado de entre: puente 4'-(CH2)n-O-2', en donde n es 1 o 2; y 4'-CH2-O-CH2-2'. En ciertas realizaciones, el azúcar bicíclico está comprende un puente 4'-CH(CH3)-O-2'. En ciertas realizaciones, la modificación química comprende una fracción de azúcar 2’-modificado no bicíclico. En ciertas realizaciones, la fracción de azúcar 2’-modificado no bicíclico comprende un grupo 2'-O-metiletilo o un grupo 2'-O-metilo.
En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de C9ORF72 se modifica uniformemente. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido comprende 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 nucleósidos. En ciertas realizaciones, cada nucleósido se modifica químicamente. En ciertas realizaciones, la modificación química comprende una fracción de azúcar 2’-modificado bicíclico. En ciertas realizaciones, la fracción de azúcar 2’-modificado comprende un grupo 2'-O-metoxietilo. En ciertas realizaciones, la fracción de azúcar 2’-modificado comprende un grupo 2'-O-metilo. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido modificado uniformemente puede dirigirse a C9ORF72, o cualquier porción del mismo, como una expansión de repetición de hexanucleótidos. En ciertas realizaciones, dirigirse a la expansión de repetición de hexanucleótidos con un compuesto antisentido modificado uniformemente redujo la repetición de ARN bloqueando la interacción con proteínas de unión a ARN. En ciertas realizaciones, esto dio como resultado que el ARN tóxico esté ausente de los focos y en su lugar se degrade.
Ácidos nucleicos objetivo, regiones objetivo y secuencias de nucleótidos
Las secuencias de nucleótidos que codifican C9ORF72 incluyen, sin limitación, las siguientes: el complemento de GENBANK N° de registro NM_001256054.1 (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 1), GENBANK N° de registro NT_008413.18 truncado de la nucleobase 27535000 a 27565000 (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 2), GENBANK N° de registro BQ068108.1 (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 3), GENBANK N° de registro NM_018325.3 (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 4), GENBANK N° de registro DN993522. 1 (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 5), GENBANK N° de registro NM_145005.5 (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 6), GENBANK N° de registro DB079375.1 (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 7), GENBANK N° de registro BU194591.1 (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 8), Identificador de secuencia 4141_014_A (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 9),e identificador de secuencia 4008_73_A (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 10).
Se entiende que la secuencia expuesta en cada SEQ ID NO en los Ejemplos contenidos en la presente es independiente de cualquier modificación a una fracción de azúcar, un enlace internucleosídico o una nucleobase. Como tal, los compuestos antisentido definidos por una SEQ ID NO pueden comprender, independientemente, una o más modificaciones a una fracción de azúcar, un enlace internucleosídico o una nucleobase. Los compuestos antisentido descritos por el Número Isis (Isis N°) indican una combinación de secuencia de nucleobase y motivo.
En ciertas realizaciones, una región objetivo es una región estructuralmente definida del ácido nucleico objetivo. Por ejemplo, una región objetivo puede abarcar una UTR 3', una UTR 5', un exón, un intrón, una unión exón/intrón, una región de codificación, una región de inicio de traducción, una región de terminación de traducción, u otra región de ácido nucleico definida. Las regiones estructuralmente definidas para C9ORF72 pueden obtenerse mediante el número de registro de bases de datos de secuencias como NCBI. En ciertas realizaciones, una región objetivo puede abarcar la secuencia desde un sitio objetivo 5' de un segmento objetivo dentro de la región objetivo hasta un sitio objetivo 3' de otro segmento objetivo dentro de la misma región objetivo.
Dirigir incluye la determinación de por lo menos un segmento objetivo con el que hibrida un compuesto antisentido, de tal manera que se produce un efecto deseado. En ciertas realizaciones, el efecto deseado es una reducción en los niveles de ácido nucleico objetivo del ARNm. En ciertas realizaciones, el efecto deseado es la reducción de los niveles de proteína codificada por el ácido nucleico objetivo o un cambio fenotípico asociado con el ácido nucleico objetivo.
Una región objetivo puede contener uno o más segmentos objetivo. Pueden superponerse múltiples segmentos objetivo dentro de una región objetivo. Alternativamente, pueden no superponerse. En ciertas realizaciones, los segmentos objetivo dentro de una región objetivo están separados por no más de aproximadamente 300 nucleótidos. En ciertas realizaciones, los segmentos objetivo dentro de una región objetivo están separados por una cantidad de nucleótidos que es, es aproximadamente, no es más que, no es más que aproximadamente, 250, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 o 10 nucleótidos en el ácido nucleico objetivo, o es un intervalo definido por dos cualquiera de los valores anteriores. En ciertas realizaciones, los segmentos objetivo dentro de una región objetivo están separados por no más de, o no más de aproximadamente, 5 nucleótidos en el ácido nucleico objetivo. En ciertas realizaciones, los segmentos objetivo son contiguos. Se contemplan regiones objetivo definidas por un intervalo que tiene un ácido nucleico de partida que es cualquiera de los sitios objetivo 5’ o sitios objetivo 3’ enumerados en la presente.
Segmentos objetivo adecuados pueden encontrarse dentro de una UTR 5', una región de codificación, una UTR 3', un intrón, un exón o una unión exón/intrón. Los segmentos objetivo que contienen un codón de inicio o un codón de parada también son segmentos objetivo adecuados. Un segmento objetivo adecuado puede excluir específicamente una determinada región estructuralmente definida, como el codón de inicio o el codón de parada.
La determinación de segmentos objetivo adecuados puede incluir una comparación de la secuencia de un ácido nucleico objetivo con otras secuencias en todo el genoma. Por ejemplo, puede usarse el algoritmo BLAST para identificar regiones de similitud entre diferentes ácidos nucleicos. Esta comparación puede evitar la selección de secuencias de compuestos antisentido que pueden hibridar de manera no específica con secuencias distintas de un ácido nucleico objetivo seleccionado (es decir, secuencias no objetivo o fuera de objetivo).
Puede haber variación en la actividad (por ejemplo, como se define por el porcentaje de reducción de los niveles de ácido nucleico objetivo) de los compuestos antisentido dentro de una región objetivo. En ciertas realizaciones, las reducciones en los niveles de ARNm de C9ORF72 son indicativas de la inhibición de la expresión de C9ORF72. Las reducciones en los niveles de una proteína de C9ORF72 también son indicativas de inhibición de la expresión del ARNm objetivo. La reducción en presencia de focos de ARN de C9ORF72 expandidos es indicativa de la inhibición de la expresión de C9ORF72. Además, los cambios fenotípicos son indicativos de la inhibición de la expresión de C9ORF72. Por ejemplo, la función motora y la respiración mejoradas pueden ser indicativas de inhibición de la expresión de C9ORF72.
Hibridación
La hibridación se produce entre un compuesto antisentido divulgado en la presente y un ácido nucleico de C9ORF72. El mecanismo más común de hibridación implica la unión de hidrógeno (por ejemplo, unión de hidrógeno de Watson-Crick, Hoogsteen o Hoogsteen invertida) entre nucleobases complementarias de las moléculas de ácido nucleico.
La hibridación puede producirse bajo varias condiciones. Las condiciones estrictas dependen de la secuencia y están determinadas por la naturaleza y la composición de las moléculas de ácido nucleico que se hibridarán.
Los métodos para determinar si una secuencia es específicamente hibridable con un ácido nucleico objetivo son bien conocidos en la técnica. Los compuestos antisentido proporcionados en la presente son hibridables específicamente con un ácido nucleico de C9ORF72.
Complementariedad
Un compuesto antisentido y un ácido nucleico objetivo son complementarios entre sí cuando un número suficiente de nucleobases del compuesto antisentido puede unirse por hidrógeno con las nucleobases correspondientes del ácido nucleico objetivo, de tal manera que se produzca un efecto deseado (por ejemplo, inhibición antisentido de un ácido nucleico objetivo, tal como un ácido nucleico de C9ORF72).
Las nucleobases no complementarias entre un compuesto antisentido y un ácido nucleico de C9ORF72 pueden tolerarse siempre que el compuesto antisentido siga siendo capaz de hibridar específicamente con un ácido nucleico objetivo. Además, un compuesto antisentido puede hibridar sobre uno o más segmentos de un ácido nucleico de C9ORF72 de tal manera que los segmentos intermedios o adyacentes no estén involucrados en el evento de hibridación (por ejemplo, una estructura de giro, malapareamiento o estructura de horquilla).
En ciertos casos, los compuestos antisentido divulgados en la presente, o una porción especificada de los mismos, son, o son por lo menos, un 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% complementarios a un ácido nucleico de C9ORF72, una región objetivo, un segmento objetivo o una porción específica del mismo. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con un ácido nucleico objetivo puede determinarse usando métodos rutinarios.
Por ejemplo, un compuesto antisentido en el que 18 de 20 nucleobases del compuesto antisentido son complementarias con una región objetivo y, por lo tanto, se hibridarían específicamente, representarían un 90 por ciento de complementariedad. En este ejemplo, las nucleobases no complementarias restantes pueden estar agrupadas o intercaladas con nucleobases complementarias y no necesitan ser contiguas entre sí o con nucleobases complementarias. Como tal, un compuesto antisentido que tiene 18 nucleobases de longitud que tiene 4 (cuatro) nucleobases no complementarias que están flanqueadas por dos regiones de complementariedad completa con el ácido nucleico objetivo tendría un 77,8% de complementariedad total con el ácido nucleico objetivo. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con una región de un ácido nucleico objetivo puede determinarse rutinariamente usando programas BLAST (herramientas de búsqueda de alineación local básica) y los programas PowerBLAST conocidos en la técnica (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403 410; Zhang y Madden, Genome Res., 1997, 7, 649 656). El porcentaje de homología, identidad de secuencia o complementariedad puede determinarse, por ejemplo, mediante el programa Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.), usando los ajustes por defecto, que usa el algoritmo de Smith y Waterman (Adv. Appl. Math., 1981,2, 482489).
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido proporcionados en la presente, o porciones especificadas de los mismos, son completamente complementarios (es decir, 100% complementarias) con un ácido nucleico objetivo, o una porción especificada del mismo. Por ejemplo, un compuesto antisentido puede ser completamente complementario con un ácido nucleico de C9ORF72, o una región objetivo, o un segmento objetivo o secuencia objetivo del mismo. Como se usa en la presente, "completamente complementario" significa que cada nucleobase de un compuesto antisentido es capaz de emparejar bases precisas con las nucleobases correspondientes de un ácido nucleico objetivo. Por ejemplo, un compuesto antisentido de 20 nucleobases es completamente complementario con una secuencia objetivo que tiene una longitud de 400 nucleobases, siempre que haya una porción correspondiente de 20 nucleobases del ácido nucleico objetivo que sea completamente complementaria con el compuesto antisentido. Completamente complementario también puede usarse en referencia a una porción especificada del primer y/o el segundo ácido nucleico. Por ejemplo, una porción de 20 nucleobases de un compuesto antisentido de 30 nucleobases puede ser "completamente complementaria" con una secuencia objetivo que tiene una longitud de 400 nucleobases. La porción de 20 nucleobases del oligonucleótido de 30 nucleobases es completamente complementaria con la secuencia objetivo si la secuencia objetivo tiene una porción correspondiente de 20 nucleobases en donde cada nucleobase es complementaria con la porción de 20 nucleobases del compuesto antisentido. Al mismo tiempo, el compuesto antisentido de 30 nucleobases entero puede o no ser completamente complementario con la secuencia objetivo, dependiendo de si las 10 nucleobases restantes del compuesto antisentido también son complementarias con la secuencia objetivo.
La localización de una nucleobase no complementaria puede estar en el extremo 5' o en el extremo 3' del compuesto antisentido. Alternativamente, la nucleobase o nucleobases no complementarias pueden estar en una posición interna del compuesto antisentido. Cuando están presentes dos o más nucleobases no complementarias, pueden ser contiguas (es decir, enlazadas) o no contiguas. En una realización, una nucleobase no complementaria está localizada en el segmento de ala de un oligonucleótido antisentido gapmer.
En ciertos casos, los compuestos antisentido que tienen, o tienen hasta 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleobases de longitud no comprenden más de 4, no más de 3, no más de 2, o no más de 1 nucleobases no complementarias con respecto a un ácido nucleico objetivo, como un ácido nucleico de C9ORF72, o una porción especificada del mismo.
En ciertos casos, los compuestos antisentido que tienen, o tienen hasta 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleobases de longitud comprenden no más de 6, no más de 5, no más de 4, no más de 3, no más de 2, o no más de 1 nucleobases no complementarias con respecto a un ácido nucleico objetivo, como como un ácido nucleico de C9ORF72, o una porción especificada del mismo.
Los compuestos antisentido proporcionados en la presente también incluyen aquellos que son complementarios con una porción de un ácido nucleico objetivo. Como se usa en la presente, "porción" se refiere a un número definido de nucleobases contiguas (es decir, enlazadas) dentro de una región o segmento de un ácido nucleico objetivo. Una "porción" también puede referirse a un número definido de nucleobases contiguas de un compuesto antisentido. En ciertos casos, los compuestos antisentido son complementarios con por lo menos una porción de 8 nucleobases de un segmento objetivo. En ciertos casos, los compuestos antisentido son complementarios con por lo menos una porción de 9 nucleobases de un segmento objetivo. En ciertos casos, los compuestos antisentido son complementarios con por lo menos una porción de 10 nucleobases de un segmento objetivo. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido, son complementarios con por lo menos una porción de 11 nucleobases de un segmento objetivo. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios con por lo menos una porción de 12 nucleobases de un segmento objetivo. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios con por lo menos una porción de 13 nucleobases de un segmento objetivo. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios con por lo menos una porción de 14 nucleobases de un segmento objetivo. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios con por lo menos una porción de 15 nucleobases de un segmento objetivo. También se contemplan compuestos antisentido que son complementarios con por lo menos una porción de 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más nucleobases de un segmento objetivo, o un intervalo definido por dos cualquiera de estos valores.
Identidad
Los compuestos antisentido proporcionados en la presente también pueden tener un porcentaje de identidad definido para una secuencia de nucleótidos particular, SEQ ID NO, o compuesto representado por un número Isis específico, o una porción del mismo. Como se usa en la presente, un compuesto antisentido es idéntico a la secuencia divulgada en la presente si tiene la misma capacidad de emparejamiento de nucleobases. Por ejemplo, un ARN que contiene uracilo en lugar de timidina en una secuencia de ADN divulgada se consideraría idéntico a la secuencia de ADN ya que tanto el uracilo como la timidina se emparejan con adenina. También se contemplan versiones acortadas y alargadas de los compuestos antisentido descritos en la presente, así como compuestos que tienen bases no idénticas con respecto a los compuestos antisentido proporcionados en la presente. Las bases no idénticas pueden ser adyacentes entre sí o estar dispersas por todo el compuesto antisentido. El porcentaje de identidad de un compuesto antisentido se calcula de acuerdo con el número de bases que tienen un emparejamiento de bases idéntico con respecto a la secuencia con la que se está comparando.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido, o porciones de los mismos, son por lo menos un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idénticos a uno o más de los compuestos antisentido o SEQ ID NO, o una porción de los mismos, divulgados en la presente.
En ciertas realizaciones, una porción del compuesto antisentido se compara con una porción de igual longitud del ácido nucleico objetivo. En ciertas realizaciones, una porción de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 nucleobases se compara con una porción de igual longitud del ácido nucleico objetivo.
En ciertas realizaciones, una porción del oligonucleótido antisentido se compara con una porción de igual longitud del ácido nucleico objetivo. En ciertas realizaciones, una porción de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24 o 25 nucleobases se compara con una porción de igual longitud del ácido nucleico objetivo. Modificaciones
Un nucleósido es una combinación de azúcar-base. La porción de nucleobases (también conocida como base) del nucleósido es normalmente una fracción de base heterocíclica. Los nucleótidos son nucleósidos que incluyen además un grupo fosfato enlazado covalentemente a la porción de azúcar del nucleósido. Para aquellos nucleósidos que incluyen un azúcar pentofuranosilo, el grupo fosfato puede unirse a la fracción de hidroxilo 2', 3' o 5' del azúcar. Los oligonucleótidos se forman a través del enlace covalente de nucleósidos adyacentes entre sí, para formar un oligonucleótido polimérico lineal. Dentro de la estructura oligonucleotídica, los grupos fosfato son referidos comúnmente como formadores de los enlaces internucleosídicos del oligonucleótido.
Las modificaciones a los compuestos antisentido abarcan sustituciones o cambios en los enlaces internucleosídicos, fracciones de azúcar o nucleobases. Los compuestos antisentido modificados se prefieren a menudo a las formas nativas debido a propiedades deseables como, por ejemplo, captación celular mejorada, afinidad mejorada por la objetivo de ácido nucleico, estabilidad aumentada en presencia de nucleasas o actividad inhibidora mejorada.
Los nucleósidos modificados químicamente también pueden emplearse para aumentar la afinidad de unión de un oligonucleótido antisentido acortado o truncado para su ácido nucleico objetivo. En consecuencia, a menudo pueden obtenerse resultados comparables con compuestos antisentido más cortos que tienen tales nucleósidos modificados químicamente.
Enlaces internucleosídicos modificados
El enlace internucleósido de origen natural del ARN y el ADN es un enlace fosfodiéster de 3' a 5'. Los compuestos antisentido que tienen uno o más enlaces internucleosídicos modificados, es decir, de origen no natural, se seleccionan a menudo sobre los compuestos antisentido que tienen enlaces internucleósidos de origen natural debido a propiedades deseables como, por ejemplo, captación celular mejorada, afinidad mejorada por los ácidos nucleicos objetivo y estabilidad aumentada en presencia de nucleasas.
Los oligonucleótidos que tienen enlaces internucleosídicos modificados incluyen enlaces internucleosídicos que retienen un átomo de fósforo, así como enlaces internucleósidos que no tienen un átomo de fósforo. Los enlaces internucleosídicos que contienen fósforo representativos incluyen, pero no están limitados a, fosfodiésteres, fosfotriésteres, metilfosfonatos, fosforamidato y fosforotioatos. Los métodos de preparación de enlaces que contienen fósforo y que no contienen fósforo son bien conocidos.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de C9ORF72 comprenden uno o más enlaces internucleosídicos modificados. En ciertas realizaciones, los enlaces internucleosídicos modificados se intercalan en todo el compuesto antisentido. En ciertas realizaciones, los enlaces internucleosídicos modificados son enlaces de fosforotioato. En ciertas realizaciones, cada enlace internucleosídico de un compuesto antisentido es un enlace internucleósido de fosforotioato.
Fracciones de azúcar modificado
Los compuestos antisentido pueden contener opcionalmente uno o más nucleósidos en los que se ha modificado el grupo azúcar. Tales nucleósidos modificados en el azúcar pueden impartir una estabilidad de nucleasas mejorada, afinidad de unión mejorada, alguna otra propiedad biológica beneficiosa a los compuestos antisentido. En ciertas realizaciones, los nucleósidos comprenden fracciones del anillo de ribofuranosa modificado químicamente. Los ejemplos de anillos de ribofuranosa modificados químicamente incluyen, sin limitación, la adición de grupos sustituyentes (incluyendo grupos sustituyentes 5' y 2', formación de puentes de átomos del anillo no geminales para formar ácidos nucleicos bicíclicos (BNA), la sustitución del átomo de oxígeno del anillo ribosilo con S, N(R) o C(R1)(R2) (R, R1 y R son cada uno independientemente H, alquilo C1-C12 o un grupo protector) y combinaciones de los mismos. Los ejemplos de azúcares modificados químicamente incluyen nucleósido 2'-F-5'-metilo sustituido (ver Solicitud Internacional de PCT WO 2008/101157 publicada el 21/08/08 para otros nucleósidos 5',2'-bis sustituidos divulgados) o reemplazo del átomo de oxígeno del anillo de ribosilo con S con sustitución adicional en la posición 2' (ver la Solicitud de Patente de Estados Unidos publicada US2005-0130923, publicada el 16 de junio de 2005) o alternativamente la sustitución 5' de un BNA (ver Solicitud internacional de PCT WO 2007/134181 publicada el 22/11/07 en donde el LNA está sustituido con, por ejemplo, un grupo 5'-metilo o uno 5'-vinilo).
Los ejemplos de nucleósidos que tienen fracciones de azúcar modificado incluyen, sin limitación, nucleósidos que comprenden grupos sustituyentes 5'-vinilo, 5'-metilo (R o S), 4'-S, 2'-F, 2'-OCH3, 2'-OCH2CH3, 2'-OCH2CH2F y 2'O-(CH2)2OCH3. El sustituyente en la posición 2' también puede seleccionase de alilo, amino, azido, tio, O-alilo, O-alquilo C1-C10, OCF3, OCH2 F, O(CH2)2SCH3, O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn) y O-CH2-C(=O)-N(Rl)-(CH2)2-N(Rm)(Rn), donde cada R1, Rm y Rn es, independientemente, H o alquilo C1-C10 sustituido o no sustituido.
Como se usa en la presente, "nucleósidos bicíclicos" se refiere a nucleósidos modificados que comprenden una fracción de azúcar bicíclico. Los ejemplos de nucleósidos bicíclicos incluyen, sin limitación, nucleósidos que comprenden un puente entre los átomos del anillo ribosilo 4' y 2'. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido proporcionados en la presente incluyen uno o más nucleósidos bicíclicos que comprenden un puente de 4' a 2'. Los ejemplos de tales nucleósidos bicíclicos con puente de 4' a 2' incluyen, pero no están limitados a, una de las fórmulas: 4'-(CH2)-O-2' (LNA); 4'-(CH2)-S-2'; 4'-(CH2)2-O-2' (ENA); 4'-CH(CH3)-O-2' y 4'-CH(CH2OCH3)-O-2' (y análogos de los mismos ver Patente de Estados Unidos 7.399.845, concedida el 15 de julio de 2008); 4'-C(CH3)(CH3)-O-2' (y análogos de la misma, ver la Solicitud internacional publicada WO/2009/006478, publicada el 8 de enero de 2009); 4'-CH2-N(OCH3)-2' (y análogos de la misma, ver la Solicitud internacional publicada WO/2008/150729, publicada el 11 de diciembre de 2008); 4'-CH2-ON(CH3)-2' (ver la solicitud de patente publicada de Estados Unidos US2004-0171570, publicada el 2 de septiembre de 2004); 4'-CH2-N(R)-O-2', en donde R es H, alquilo C1-C12, o un grupo protector (ver la Patente de Estados Unidos 7.427.672, concedida el 23 de septiembre de 2008); 4'-CH2-C(H)(CH3)-2' (ver Chattopadhyaya et al, J. Org Chem, 2009, 74, 118-134); y 4'-CH2-C-(=CH2)-2' (y análogos de la misma, ver la Solicitud internacional publicada WO 2008/154401, publicada el 8 de diciembre de 2008)
También pueden encontrarse informes adicionales relacionados con los nucleósidos bicíclicos en la bibliografía publicada (ver por ejemplo: Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2000, 97, 5633-5638; Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039; Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(26) 8362-8379; Elayadi et al., Curr. Opinion Invest. Drugs, 2001, 2, 558-561; Braasch et al., Chem. Biol., 2001, 8, 1-7; and Orum et al., Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243; Patentes de Estados Unidos N26.268.490; 6.525.191; 6.670.461; 6.770.748; 6.794.499; 7.034.133; 7.053.207; 7.399.845; 7.547.684; y 7.696.345; Publicaciones de Patente de Estados Unidos N° US2008-0039618; US2009-0012281; N° de Serie de Patente de Estados Unidos 60/989,574; 61/026,995; 61/026,998; 61/056,564; 61/086,231; 61/097,787; y 61/099,844; Solicitudes internacionales de PCT publicadas WO 1994/014226; WO 2004/106356; WO 2005/021570; WO 2007/134181; WO 2008/150729; WO 2008/154401; y WO 2009/006478. Cada uno de los nucleósidos bicíclicos anteriores puede prepararse con una o más configuraciones de azúcar estereoquímicas que incluyen, por ejemplo, a-L-ribofuranosa y p-D-ribofuranosa (ver la solicitud internacional de PCT PCT/DK98/00393, publicada el 25 de marzo de 1999 como WO 99/14226)
En ciertas realizaciones, las fracciones de azúcar bicíclicos de nucleósidos de BNA incluyen, pero no están limitadas a, compuestos que tienen por lo menos un puente entre la posición 4’ y 2’ de la fracción de azúcar pentofuranosilo en donde dichos puentes comprenden independientemente 1 o de 2 a 4 grupos enlazados seleccionados independientemente de -[C(Ra)(Rb)]n-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -C(=O)-, -C(=NRa)-, -C(=S)-, -O-, -Si(Ra)2-, -S(=O)x-, y -N(Ra)-;
en donde:
x es 0, 1 o 2 ;
n es 1, 2, 3 o 4;
cada Ra y R b es, independientemente, H, un grupo protector, hidroxilo, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, arilo C5-C20, arilo C5-C20 sustituido, radical heterociclo, radical heterociclo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, radical alicíclico C5-C7, radical alicíclico C5-C7 sustituido, halógeno, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, COOJ1, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, CN, sulfonilo (S(=O)2-J1), o sulfoxilo (S(=O)-J1); y
cada J1 y J2 es, independientemente, H, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, arilo C5-C20, arilo C5-C20 sustituido, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, un radical heterociclo, un radical heterociclo sustituido, aminoalquilo C1-C12, aminoalquilo C1-C12 sustituido o un grupo protector.
En ciertas realizaciones, el puente de un fracción de azúcar bicíclico es -[C(Ra)(Rb)]n-, -[C(Ra)(Rb)]n-O-, -C(RaRb)-N(R)-O- o -C(RaRb)-O-N(R)-. En ciertas realizaciones, el puente es 4’-CH2-2’, 4’-(CH2)2-2 ’, 4’-(Ch2)3-2 ’, 4’-CH2-O-2 ’, 4’-(CH2)2-O-2 ’, 4’-CH2-ON(R)-2’ y 4’-CH2-N(R)-O-2 ’-, en donde cada R es, independientemente, H, un grupo protector o alquilo C1-C12.
En ciertas realizaciones, los nucleósidos bicíclicos se definen adicionalmente por configuración isomérica. Por ejemplo, un nucleósido que comprende un puente 4’-2’ metileno-oxi, puede estar en la configuración a-L o en la configuración p-D. Anteriormente, se han incorporado a-L-metilenoxi (4’-CH2-O-2 ’) BNA en oligonucleótidos antisentido que mostraban actividad antisentido (Frieden et al., Nucleic Acids Research, 2003, 21,6365-6372).
En ciertas realizaciones, los nucleósidos bicíclicos incluyen, pero no están limitados a, (A) a-L-metileneoxi (4’-CH2-O-2 ’) BNA, (B) p-D-metileneoxi (4’-CH2-O-2’) BNA, (C) etilenoxi (4’-(CH2)2-O-2 ’) BNA, (D) aminooxi (4’-CH2-O-N(R)-2’) BNA, (E) oxiamino (4’-CH2-N(R)-O-2 ’) BNA y (F) metil(metileneoxi) (4’-CH(CH3)-O-2 ’) BNA, (G) metilen-tio (4’-CH2-S-2’) BNA, (H) metilen-amino (4’-CH2-N(R)-2 ’) BNA, (I) metil carbocíclico (4’-CH2-CH(CH3)-2 ’) BNA, y (J) propileno carbocíclico (4’-(CH2)3-2 ’) BNA como se representa a continuación.
Figure imgf000019_0001
en donde Bx es la fracción de base y R es independientemente H, un grupo protector o alquilo C1-C12.
En ciertas realizaciones, se proporcionan nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula I:
Figure imgf000020_0001
en donde:
Bx es una fracción de base heterocíclica;
-Qa-Qb-Qc- es -CH2-N(Rc)-CH2-, -C(=O)-N(Rc)-CH2-, -CH2-ON(Rc)-, -CH2-N(Rc)-O- o -N(Rc)-O-CH2;
Rc es alquilo C1-C12 o un grupo protector de amino; y
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, una fracción de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte.
En ciertas realizaciones, se proporcionan nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula II:
Figure imgf000020_0002
en donde:
Bx es una fracción de base heterocíclica;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, una fracción de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
Za es alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 sustituido, acilo, acilo sustituido, amida sustituida, tiol o tio sustituido.
En una realización, cada uno de los grupos sustituidos está, independientemente, mono o poli sustituido con grupos sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, oxo, hidroxilo, OJc, NJcJd, SJc, N3, OC(=X)Jc, y NJeC(=X)NJcJd, en donde cada Jc, Jd y Je es, independientemente, H, alquilo C1-C6, o alquilo C1-C6 sustituido y X es O NJc.
En ciertas realizaciones, se proporcionan nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula III:
Figure imgf000020_0003
en donde:
Bx es una fracción de base heterocíclica;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, una fracción de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
Zb es alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 sustituido o acilo sustituido (C(=O)-).
En ciertas realizaciones, se proporcionan nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula IV:
Figure imgf000021_0001
en donde:
Bx es una fracción de base heterocíclica;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, una fracción de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
Rd es alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo alquinilo C2-C6 sustituido;
cada qa, qb, qc y qd es, independientemente, H, halógeno, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6, o alquinilo C2-C6 sustituido, alcoxilo C1-C6, alcoxilo C1-C6 sustituido, acilo, acilo sustituido, aminoalquilo C1-C6 o aminoalquilo C1-C6 sustituido6;
En ciertas realizaciones, se proporcionan nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula V:
Figure imgf000021_0002
en donde:
Bx es una fracción de base heterocíclica;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, una fracción de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
qa, qb, qe q y qf son cada uno, independientemente, hidrógeno, halógeno, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, alcoxi C1-C12, alcoxi C1-C12 sustituido, OJj, SJj, SOJj, SO2Jj, NJjJk, N3, CN, C(=O)OJj, C(=O)NJjJk, C(=O)Jj, O-C(=O)NJjJ k, N(H)C(=NH)NJjJk, N(H)C(=O)NJjJk o N(H)C(=S)NJjJk;
o qe y qf juntos son = C(qg)(qh);
qg y qh son cada uno, independientemente, H, halógeno, alquilo C1-C12 o alquilo C1-C12 sustituido.
Se han descrito la síntesis y preparación de los monómeros de metileneoxi (4'-CH2-O-2') BNA adenina, citosina, guanina, 5-metil-citosina, timina y uracilo, junto con su oligomerización y propiedades de reconocimiento de ácidos nucleicos. (Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630). Los BNA y la preparación de los mismos también se describen en la WO 98/39352 y la WO 99/14226.
También se han preparado análogos de metilenoxi (4'-CH2-O-2 ') BNA y 2’-tio-BNA, (Kumar et al., Bioorg.
Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222) También se ha descrito la preparación de análogos de nucleósidos bloqueados que comprenden dúplex de oligodesoxirribonucleótidos como sustratos para polimerasas de ácidos nucleicos (Wengel et al., WO 99/14226) Además, en la técnica se ha descrito la síntesis de 2’-amino-BNA, un nuevo análogo de oligonucleótido de alta afinidad conformacionalmente restringido (Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039). Además, se han preparado 2’-amino- y 2’-metilamino-BNA y se ha informado anteriormente sobre la estabilidad térmica de sus dúplex con cadenas de ARN y ADN complementarias.
En ciertas realizaciones, se proporcionan nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula VI:
Figure imgf000022_0001
en donde:
Bx es una fracción de base heterocíclica;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, una fracción de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
cada qi, qj, qk y ql es, independientemente, H, halógeno, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, alcoxilo C1-C12, alcoxil sustituido, OJj, SJj, SOJj, SO2Jj, NJjJk, N3, CN, C(=O)OJj, C(=O)NJjJk, C(=O)Jj, O-C(=O)NJjJk, N(H)C(=NH)NJjJk, N(H)C(=O)NJjJk or N(H)C(=S)NJjJk; y
qi y qj o ql y q juntos son =C(qg)(qh), en donde qg y qh son cada uno, independientemente, H, halógeno, alquilo C1-C12 o alquilo C1-C12 sustituido.
Se ha descrito un nucleósido bicíclico carbocíclico que tiene un puente 4'-(CH2)3-2' y el puente análogo de alquenilo 4’-CH=CH-CH2-2’ (Freier et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4429-4443 y Albaek et al., J. Org.
Chem., 2006, 71, 7731-7740). También se ha descrito la síntesis y preparación de nucleósidos bicíclicos carbocíclicos junto con su oligomerización y estudios bioquímicos (Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(26), 8362-8379).
Como se usa en la presente, "nucleósido bicíclico 4’-2’ " o "nucleósido bicíclico de 4’ a 2’ " se refiere a un nucleósido bicíclico que comprende un anillo de furanosa que comprende un puente que conecta dos átomos de carbono del anillo de furanosa que conecta el átomo de carbono 2’ y el átomo de carbono 4’ del anillo de azúcar.
Como se usa en la presente, "nucleósidos monocíclicos" se refiere a nucleósidos que comprenden fracciones de azúcar modificado que no son fracciones de azúcar bicíclico. En ciertas realizaciones, la fracción de azúcar, o análogo de fracción de azúcar, de un nucleósido puede modificarse o sustituirse en cualquier posición.
Como se usa en la presente, "azúcar 2’-modificado" significa un azúcar de furanosilo modificado en la posición 2’. En ciertas realizaciones, tales modificaciones incluyen sustituyentes seleccionados de: un haluro, que incluye, pero no está limitado a, alcoxi sustituido y no sustituido, tioalquilo sustituido y no sustituido, amino alquilo sustituido y no sustituido, alquilo sustituido y no sustituido, alilo sustituido y no sustituido, y alquinilo sustituido y no sustituido. En ciertas realizaciones, las modificaciones 2’ se seleccionan de sustituyentes que incluyen, pero no están limitados a: O [(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nF, O(CH2)nONH2, OCH2C(=O)N(H)CH3 y O(CH2)nON[(CH2)nCH3]2, donde n y m son de 1 a aproximadamente 10. Otros grupos 2’-sustituyentes también pueden seleccionarse de: alquilo C1-C12, alquilo sustituido, alquenilo, alquinilo, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo o O-aralquilo, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, F, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, heterocicloalq heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo de escisión de ARN, un grupo informador, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas, o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un compuesto antisentido, y otros sustituyentes que tienen propiedades similares.
En ciertas realizaciones, los nucleósidos modificados comprenden una cadena lateral 2’-MOE (Baker et al., J. Biol.
Chem., 1997, 272, 11944-12000). Se ha descrito que tal sustitución de 2’-MOE tiene una afinidad de unión mejorada en comparación con nucleósidos no modificados y con otros nucleósidos modificados como 2’-O-metilo, O-propilo y
O-aminopropilo. También se ha demostrado que los oligonucleótidos que tienen el sustituyente 2’-MOE son inhibidores antisentido de la expresión génica con características prometedoras para uso in vivo (Martin, Helv. Chim.
Acta, 1995, 78, 486-504; Altmann et al., Chimia, 1996, 50, 168-176; Altmann et al., Biochem. Soc. Trans., 1996, 24,
630-637; y Altmann et al., Nucleosides Nucleotides, 1997, 16, 917-926).
Como se usa en la presente, un "nucleósido de tetrahidropirano modificado" o "nucleósido de THP modificado" significa un nucleósido que tiene un "azúcar" de tetrahidropirano de seis miembros sustituido por el residuo de pentofuranosilo en nucleósidos normales (un sustituto del azúcar). Los nucleósidos de THP modificados incluyen, pero no están limitados a, lo que es referido en la técnica como ácido nucleico de hexitol (HNA), ácido nucleico de anitol (ANA), ácido nucleico de manitol (MNA) (ver Leumann, Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 841-854), fluoro HNA (F-HNA) o aquellos compuestos que tienen la fórmula VII:
Figure imgf000023_0001
en donde independientemente para cada uno de dichos por lo menos un análogo de nucleósido de tetrahidropirano de Fórmula VII:
Bx es una fracción de base heterocíclica;
Ta y Tb son cada uno, independientemente, un grupo de enlace internucleosídico que enlaza el análogo de nucleósido de tetrahidropirano con el compuesto antisentido o uno de Ta y Tb es un grupo de enlace internucleósido que enlaza el análogo de nucleósido de tetrahidropirano con el compuesto antisentido y el otro de Ta y Tb es H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado enlazado o un grupo 5' o 3' terminal; q1, q2, q3, q4, q5, q6 y q7 son cada uno independientemente, H, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6, o alquinilo C2-C6 sustituido; y cada uno de R1 selecciona de hidrógeno, hidroxilo, halógeno, alcoxi sustituido o no sustituido, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)J1, OC(=X)NJJ2, NJ3C(=X)NJJ2 y CN, en donde X es O, S o NJ1 y cada J1, J2 y J3 es, independientemente, H o alquilo C1-C6.
En ciertas realizaciones, se proporcionan nucleósidos de THP modificados de Fórmula VII en donde q1, q2, q3, q4, q5, q6 y q7 son cada uno H. En ciertas realizaciones, por lo menos uno de q1, q2, q3, q4, q5, q6 y q7 es diferente de H. En ciertas realizaciones, por lo menos uno de q1, q2, q3, q4, q5, q6 y q7 es metilo. En ciertas realizaciones, se proporcionan nucleósidos THP de fórmula VII en donde uno de R1 y R2 es fluoro. En ciertas realizaciones, R1 es fluoro y R2 es H; R1 es metoxi y R2 es H, y R1 es H y R2 es metoxietoxi.
Como se usa en la presente, "2’-modificado" o "2’-sustituido" se refiere a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un sustituyente en la posición 2’ diferente de H u OH. Los nucleósidos 2’-modificados incluyen, pero no están limitados a, nucleósidos bicíclicos en los que el puente que conecta dos átomos de carbono del anillo de azúcar conecta el carbono 2 ’ y otro carbono del anillo de azúcar; y nucleósidos con sustituyentes 2 ’ que no forman puentes como alilo, amino, azido, tio, O-alilo, O- alquilo C1-C10, -OCF3, O-(CH2)2-O-CH3, 2 ’-O(CH2)2SCH3, O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), u O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn), donde cada Rm y Rn es, independientemente, H o alquilo C1-C10 sustituido o no sustituido. Los nucleósidos 2’-modificados pueden comprender además otras modificaciones, por ejemplo en otras posiciones del azúcar y/o en la nucleobase.
Como se usa en la presente, "2’-F" se refiere a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un grupo fluoro en la posición 2 ’.
Como se usa en la presente, "2’-OMe" o "2 ’-OCH3" o "2’-O-metilo" se refiere cada uno a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un grupo -OCH3 en la posición 2’ del anillo de azúcar.
Como se usa en la presente, "MOE" o "2’-MOE" o "2 ’-OCH2CH2OCH3 " o "2’-O-metoxietilo" se refieren cada uno a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un grupo -OCH2CH2OCH3 en la posición 2’ del anillo de azúcar.
Como se usa en la presente, "oligonucleótido" se refiere a un compuesto que comprende una pluralidad de nucleósidos enlazados. En la invención, se modifica uno o más de la pluralidad de nucleósidos. En ciertas realizaciones, un oligonucleótido comprende uno o más ribonucleósidos (ARN) y/o desoxirribonucleósidos (ADN).
También se conocen muchos otros sistemas de anillos sustitutos de azúcar biciclo y triciclo en la técnica que pueden usarse para modificar nucleósidos para su incorporación en compuestos antisentido (ver, por ejemplo, el artículo de revisión: Leumann, Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 841-854) Dichos sistemas de anillo pueden experimentar varias sustituciones adicionales para mejorar la actividad.
Los métodos para la preparación de azúcares modificados son bien conocidos por los expertos en la técnica.
En los nucleótidos que tienen fracciones de azúcar modificado, las fracciones de nucleobases (naturales, modificados o una combinación de las mismas) se mantienen para la hibridación con un objetivo de ácido nucleico apropiado.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido comprenden uno o más nucleósidos que tienen fracciones de azúcar modificado. En ciertas realizaciones, la fracción de azúcar modificado es 2'-MOE. En ciertas realizaciones, los nucleósidos modificados con 2'-MOE están dispuestos en un motivo gapmer. En ciertas realizaciones, la fracción de azúcar modificado es un nucleósido bicíclico que tiene un grupo de puente (4'-CH(CH3)-O-2'). En ciertas realizaciones, los nucleósidos modificados con (4'-CH(CH3)-O-2') están dispuestos a lo largo de las alas de un motivo gapmer.
Composiciones y métodos para formular composiciones farmacéuticas
Los oligonucleótidos antisentido pueden mezclarse con sustancias activas o inertes farmacéuticamente aceptables para la preparación de composiciones o formulaciones farmacéuticas. Las composiciones y los métodos para la formulación de composiciones farmacéuticas dependen de una serie de criterios, incluyendo, pero no limitados a, la vía de administración, el alcance de la enfermedad, o la dosis a ser administrada.
Un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de C9ORF72 puede utilizarse en composiciones farmacéuticas combinando el compuesto antisentido con un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable adecuado. Un diluyente farmacéuticamente aceptable incluye solución salina tamponada con fosfato (PBS). El PBS es un diluyente adecuado para su uso en composiciones que se administran por vía parenteral. Por consiguiente, en un caso, en los métodos descritos en la presente se emplea una composición farmacéutica que comprende un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de C9ORF72 y un diluyente farmacéuticamente aceptable. En ciertos casos, el diluyente farmacéuticamente aceptable es PBS. En la invención, el compuesto antisentido es un oligonucleótido antisentido modificado.
Las composiciones farmacéuticas que comprenden compuestos antisentido abarcan cualquier sal, éster farmacéuticamente aceptable, o sales de tales ésteres, o cualquier otro oligonucleótido que, tras la administración a un animal, incluido un humano, sea capaz de proporcionar (directa o indirectamente) el metabolito biológicamente activo o residuo del mismo. Por consiguiente, por ejemplo, la divulgación también se refiere a sales farmacéuticamente aceptables de compuestos antisentido, profármacos, sales farmacéuticamente aceptables de tales profármacos y otros bioequivalentes. Las sales farmacéuticamente aceptables adecuadas incluyen, pero no están limitadas a, sales de sodio y potasio.
Un profármaco puede incluir la incorporación de nucleósidos adicionales en uno o ambos extremos de un compuesto antisentido que se escinden por nucleasas endógenas dentro del cuerpo, para formar el compuesto antisentido activo.
Compuestos antisentido conjugados
Los compuestos antisentido pueden estar enlazados covalentemente a una o más fracciones o conjugados que mejoran la actividad, distribución celular o captación celular de los oligonucleótidos antisentido resultantes. Los grupos conjugados típicos incluyen fracciones de colesterol y fracciones de lípidos. Los grupos conjugados adicionales incluyen carbohidratos, fosfolípidos, biotina, fenazina, ácido fólico, fenantridina, antraquinona, acridina, fluoresceínas, rodaminas, cumarinas y colorantes.
Los compuestos antisentido también pueden modificarse para tener uno o más grupos estabilizadores que generalmente están unidos a uno o ambos extremos terminales de los compuestos antisentido para mejorar propiedades como, por ejemplo, la estabilidad de la nucleasa. En los grupos estabilizadores se incluyen las estructuras de tapa. Estas modificaciones terminales protegen el compuesto antisentido que tiene ácido nucleico terminal de la degradación de exonucleasas, y pueden ayudar en la administración y/o localización dentro de una célula. La tapa puede estar presente en el extremo terminal 5'(tapa 5'), o en el extremo terminal 3' (tapa 3'), o puede estar presente en ambos extremos terminales. Las estructuras de tapa son bien conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, tapas invertidas de desoxi abásicas. Grupos estabilizadores 3' y 5' adicionales que pueden usarse para tapar uno o ambos extremos de un compuesto antisentido para impartir estabilidad de nucleasas incluyen los divulgados en la WO 03/004602 publicada el 16 de enero de 2003.
Cultivo celular y tratamiento de compuestos antisentido
Los efectos de los compuestos antisentido sobre el nivel, la actividad o la expresión de los ácidos nucleicos de C9ORF72 pueden probarse in vitro en una variedad de tipos de células. Los tipos de células usados para tales análisis están disponibles de proveedores comerciales (por ejemplo, American Type Culture Collection, Manassus, VA; Zen-Bio, Inc., Research Triangle Park, NC; Clonetics Corporation, Walkersville, MD) y se cultivan de acuerdo con las instrucciones del vendedor usando reactivos disponibles comercialmente (por ejemplo, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). Los tipos de células ilustrativas incluyen, pero no están limitadas a, células HepG2, células Hep3B y hepatocitos primarios.
Pruebas in vitro de oligonucleótidos antisentido
En la presente se describen métodos para el tratamiento de células con oligonucleótidos antisentido, que pueden modificarse adecuadamente para el tratamiento con otros compuestos antisentido.
En general, las células se tratan con oligonucleótidos antisentido cuando las células alcanzan aproximadamente un 60-80% de confluencia en cultivo.
Un reactivo usado comúnmente para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye el reactivo de transfección de lípidos catiónicos LIPOFECTINA (Invitrogen, Carlsbad, CA). Los oligonucleótidos antisentido se mezclan con LIPOFECTINA en OPTI-MEM 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para lograr la concentración final deseada de oligonucleótido antisentido y una concentración de LIPOFECTINA que varía típicamente de 2 a 12 ug/ml por 100 nM de oligonucleótido antisentido.
Otro reactivo usado para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye la LIPOFECTAMINA (Invitrogen, Carlsbad, CA). El oligonucleótido antisentido se mezcla con LIPOFECTAMINA en medio sérico reducido OPTI-MEM 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para lograr la concentración deseada de oligonucleótido antisentido y una concentración de LIPOFECTAMINA que generalmente varía de 2 a 12 ug/ml por 100nM de oligonucleótido antisentido.
Otra técnica usada para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye la electroporación.
Las células se tratan con oligonucleótidos antisentido mediante métodos rutinarios. Las células se recogen típicamente 16-24 horas después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido, momento en el cual se miden los niveles de ARN o proteína de los ácidos nucleicos objetivo mediante métodos conocidos en la técnica y descritos en la presente. En general, cuando los tratamientos se realizan en múltiples replicados, los datos se presentan como la media de los tratamientos replicados.
La concentración de oligonucleótido antisentido usada varía de una línea celular a otra. Los métodos para determinar la concentración óptima de oligonucleótidos antisentido para una línea celular particular son bien conocidos en la técnica. Los oligonucleótidos antisentido se usan típicamente a concentraciones que varían de 1 nM a 300 nM cuando se transfectan con LIPOFECTAMINA. Los oligonucleótidos antisentido se usan a concentraciones más altas que varían de 625 a 20.000 nM cuando se transfectan usando electroporación.
Aislamiento de ARN
El análisis de ARN puede realizarse en ARN celular total o poli(A)+ARNm. Los métodos de aislamiento de ARN son bien conocidos en la técnica. El ARN se prepara usando métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, usando el reactivo TRIZOL (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acuerdo con los protocolos recomendados por el fabricante.
Análisis de inhibición de niveles objetivo o expresión
La inhibición de los niveles o la expresión de un ácido nucleico de C9ORF72 puede ensayarse de varias maneras conocidas en la técnica. Por ejemplo, los niveles de ácido nucleico objetivo pueden cuantificarse mediante, por ejemplo, análisis de transferencia Northern, reacción en cadena de polimerasa competitiva (PCR), o PCR cuantitativa en tiempo real. El análisis de ARN puede realizarse en ARN celular total o poli(A)+ARNm. Los métodos de aislamiento de ARN son bien conocidos en la técnica. El análisis de transferencia Northern también es rutinario en la técnica. La PCR cuantitativa en tiempo real puede realizarse convenientemente usando el sistema de detección de secuencias ABI PRISM 7600, 7700 o 7900 disponible comercialmente, disponible en PE-Applied Biosystems, Foster City, CA y usado de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Análisis cuantitativo por PCR en tiempo real de los niveles de ARN objetivo
La cuantificación de los niveles de ARN objetivo puede lograrse mediante PCR cuantitativa en tiempo real usando el sistema de detección de secuencias ABI PRISM 7600, 7700 o 7900 (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los métodos de PCR cuantitativa en tiempo real son bien conocidos en la técnica.
Antes de la PCR en tiempo real, el ARN aislado se somete a una reacción de transcriptasa inversa (RT), que produce ADN complementario (ADNc) que luego se usa como sustrato para la amplificación por PCR en tiempo real. Las reacciones de RT y PCR en tiempo real se realizan secuencialmente en el mismo pocillo de muestra. Los reactivos de RT y PCR en tiempo real se obtienen de Invitrogen (Carlsbad, CA). Las reacciones de PCR en tiempo real RT se llevan a cabo mediante métodos bien conocidos por los expertos en la técnica.
Las cantidades objetivo del gen (o ARN) obtenidas por PCR en tiempo real se normalizan usando o el nivel de expresión de un gen cuya expresión es constante, como la ciclofilina A, o cuantificando el ARN total usando RIBOGREEN (Invitrogen, Inc. Carlsbad, CA). La expresión de ciclofilina A se cuantifica por PCR en tiempo real, ejecutándose simultáneamente con el objetivo, multiplexando o por separado. El ARN total se cuantifica usando el reactivo de cuantificación de ARN RIBOGREEN (Invetrogen, Inc. Eugene, OR). Los métodos de cuantificación de ARN por RIBOGREEN se enseñan en Jones, L.J. y et al., (Analytical Biochemistry, 1998, 265, 368-374). Se usa un instrumento CYTOFLUOR 4000 (PE Applied Biosystems) para medir la fluorescencia de RIBOGREEN.
Las sondas y los cebadores están diseñados para hibridar con un ácido nucleico de C9ORF72. Los métodos para diseñar sondas y cebadores de PCR en tiempo real son bien conocidos en la técnica, y pueden incluir el uso de software como el software PRIMER EXPRESS (Applied Biosystems, Foster City, CA).
Análisis de niveles de proteínas
La inhibición antisentido de los ácidos nucleicos de C9ORF72 puede evaluarse midiendo los niveles de proteína de C9ORF72. Los niveles de proteína de C9ORF72 pueden evaluarse o cuantificarse de una variedad de maneras bien conocidas en la técnica como inmunoprecipitación, análisis de transferencia Western (inmunotransferencia), análisis de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), análisis cuantitativos de proteínas, análisis de actividad de proteínas (por ejemplo, ensayos de actividad de caspasa), inmunohistoquímica, inmunocitoquímica o clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). Los anticuerpos dirigidos a un objetivo pueden identificarse y obtenerse de una variedad de fuentes, como el catálogo de anticuerpos MSRS (Aerie Corporation, Birmingham, MI), o pueden prepararse mediante métodos convencionales de generación de anticuerpos monoclonales o policlonales bien conocidos en la técnica. Hay disponibles comercialmente anticuerpos útiles para la detección de C9ORF72 de ratón, rata, mono y humano.
Pruebas in vivo de compuestos antisentido.
Los compuestos antisentido, por ejemplo, los oligonucleótidos antisentido, se prueban en animales para evaluar su capacidad de inhibir la expresión de C9ORF72 y producir cambios fenotípicos, como la función motora y la respiración mejoradas. En ciertas realizaciones, la función motora se mide mediante rotarod, fuerza de agarre, ascenso de poste, rendimiento en campo abierto, haz de equilibrio, prueba de huella de pata trasera en el animal. En ciertas realizaciones, la respiración se mide mediante pletismógrafo de cuerpo entero, resistencia invasiva y medidas de cumplimiento en el animal. Las pruebas pueden realizarse en animales normales o en modelos experimentales de enfermedades. Para la administración a animales, los oligonucleótidos antisentido se formulan en un diluyente farmacéuticamente aceptable como solución salina tamponada con fosfato. La administración incluye vías de administración parenteral como intraperitoneal, intravenosa y subcutánea. El cálculo de la dosificación de oligonucleótidos antisentido y la frecuencia de dosificación está dentro de las capacidades de los expertos en la técnica, y depende de factores tales como la vía de administración y el peso corporal del animal. Después de un período de tratamiento con oligonucleótidos antisentido, se aísla el ARN del tejido del SNC o el CSF y se miden los cambios en la expresión del ácido nucleico de C9ORF72.
Dirigiendo a C9ORF72
Los oligonucleótidos antisentido descritos en la presente pueden hibridar con un ácido nucleico de C9ORF72 en cualquier etapa del procesamiento de ARN. Por ejemplo, en la presente se describen oligonucleótidos antisentido que son complementarios a un pre-ARNm o un ARNm maduro. Adicionalmente, los oligonucleótidos antisentido descritos en la presente pueden hibridar con cualquier elemento de un ácido nucleico de C9ORF72. Por ejemplo, en la presente se describen oligonucleótidos antisentido que son complementarios a un exón, un intrón, la UTR 5', la UTR 3', una región de repetición, una expansión de repetición de hexanucleótidos, una unión de corte y empalme, un exón: unión de corte y empalme de exón, un silenciador de corte y empalme exónico (ESS), un potenciador de corte y empalme exónico (ESE), exón 1a, exón 1b, exón 1c, exón Id, exón 1e, exón 2, exón 3, exón 4, exón 5, exón 6, exón 7, exón 8, exón 9, exón 10, exón 11, intrón 1, intrón 2, intrón 3, intrón 4, intrón 5, intrón 6, intrón 7, intrón 8, intrón 9, o intrón 10 de un ácido nucleico de C9ORF72.
En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos antisentido descritos en la presente hibridan con todas las variantes de C9ORF72. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos antisentido descritos en la presente hibridan selectivamente con ciertas variantes de C9ORF72. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos antisentido descritos en la presente hibridan selectivamente con variantes de C9ORF72 que contienen una expansión de repetición de hexanucleótidos. En ciertas realizaciones, tales variantes de C9ORF72 que contienen una expansión de repetición de hexanucleótidos incluyen las SEQ ID NO: 1-3 y 6-10. En ciertas realizaciones, dicha expansión de repetición de hexanucleótidos comprende por lo menos 30 repeticiones de cualquiera de GGGGCC, GGGGGG, GGGGGC o GGGGCG.
En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos antisentido descritos en la presente inhiben la expresión de todas las variantes de C9ORF72. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos antisentido descritos en la presente inhiben la expresión de todas las variantes de C9ORF72 por igual. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos antisentido descritos en la presente inhiben preferiblemente la expresión de ciertas variantes de C9ORF72. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos antisentido descritos en la presente inhiben preferiblemente la expresión de variantes de C9ORF72 que contienen una expansión de repetición de hexanucleótidos. En ciertas realizaciones, tales variantes de C9ORF72 que contienen una expansión de repetición de hexanucleótidos incluyen las SEQ ID NO: 1-3 y 6-10. En ciertas realizaciones, dicha expansión de repetición de hexanucleótidos comprende por lo menos 30 repeticiones de cualquiera de GGGGCC, GGGGGG, GGGGGC o GGGGCG. En ciertas realizaciones, la expansión de repetición de hexanucleótidos forma focos nucleares. Los oligonucleótidos antisentido descritos en la presente son útiles para reducir los focos nucleares. Los focos nucleares pueden reducirse en términos de porcentaje de células con focos así como en número de focos por célula.
En base a estudios anteriores dirigidos a expansiones de repetición, no es posible predecir si los oligonucleótidos antisentido dirigidos a C9ORF72 fuera de la expansión de repetición de hexanucleótidos inhibirían con éxito la expresión de C9ORF72 por dos razones. Primero, la expansión de repetición de C9ORF72 está localizada en un intrón y no se sabe si el ARN en los focos contiene solo las repeticiones o también la secuencia intrónica flanqueante. Por ejemplo, un estudio anterior sobre la distrofia miotónica tipo 2 (DM2), que es una enfermedad provocada por una mutación de expansión de CCTG en el intrón 1 del gen ZNF9, determinó que las expansiones de DM2 grandes no previenen el corte y empalme pre-ARNm específico de alelos, la exportación nuclear de los transcritos, o niveles de ARNm o proteína en estado estacionario. El estudio demostró además que las inclusiones ribonucleares encontradas asociadas con la enfermedad están enriquecidas para la expansión de CCUG, pero no las secuencias intrónicas flanqueantes. Estos datos sugieren que los efectos moleculares en sentido descendente de la mutación DM2 pueden desencadenarse por la acumulación del tracto de repetición de CCUG solo. Por lo tanto, este estudio implica que dirigir la expansión de repeticionesn de CCUG solamente llevaría a una mejoría de la enfermedad, ya que dirigir las secuencias flanqueantes, especialmente la región en sentido descendente de la expansión de repeticiones, no afectaría a la formación de inclusiones ribonucleares (Margolis et al. Tararear. Mol. Genet., 2006, 15:1808-1815). En segundo lugar, no se sabe cómo de rápido se corta y acumulo en los focos el intrón 1 de C9ORF72 que contiene las repeticiones. Por lo tanto, no es posible predecir si dirigir el pre-ARNm daría como resultado la eliminación de la repetición de ARN y los focos.
Características de C9OFF72
Los oligonucleótidos antisentido descritos en la presente pueden hibridar con cualquier variante de C9ORF72 en cualquier estado de procesamiento dentro de cualquier elemento del gen de C9ORF72. Por ejemplo, los oligonucleótidos antisentido descritos en la presente pueden hibridar con un exón, un intrón, la UTR 5', la UTR 3' una región de repetición, una expansión de repetición hexanucleotídica, una unión de corte y empalme, un exón: unión de corte y empalme de exón, un silenciador de empalme exónico (ESS), un potenciador de empalme exónico (ESE), exón 1a, exón 1b, exón 1c, exón 1d, exón 1e, exón 2, exón 3, exón 4, exón 5, exón 6, exón 7, exón 8, exón 9, exón 10, exón 11, intrón 1, intrón 2, intrón 3, intrón 4, intrón 5, intrón 6, intrón 7, intrón 8, intrón 9 o intrón 10. Por ejemplo, los oligonucleótidos antisentido pueden dirigirse a cualquiera de los exones caracterizados a continuación en las Tablas 1-5 para las varias variantes de C9ORF72 descritas a continuación. Los oligonucleótidos antisentido descritos en la presente también pueden dirigirse a variantes no caracterizadas a continuación y tales variantes se caracterizan en GENBANK. Además, los oligonucleótidos antisentido descritos en la presente también pueden dirigirse a elementos distintos de los exones y tales elementos se caracterizan en GENBANK.
Tabla 1
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continuación
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Tabla 2
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Tab la 3
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Tabla 4
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Tabla 5
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Ciertas indicaciones
En ciertos casos, en la presente se divulgan métodos para tratar a un individuo que comprenden administrar una o más composiciones farmacéuticas descritas en la presente. En ciertos casos, el individuo tiene una enfermedad neurodegenerativa. En ciertos casos, el individuo puede estar en riesgo de desarrollar una enfermedad neurodegenerativa incluyendo, pero no limitada a, ELA o FTD. Puede haberse identificado que el individuo tiene una enfermedad asociada a C9ORF72. Puede haberse identificado que el individuo tiene una enfermedad asociada a la expansión de repetición de hexanucleótidos de C9ORF72. En la presente se divulgan métodos para reducir profilácticamente la expresión de C9ORF72 en un individuo. Ciertos casos incluyen tratar a un individuo con necesidad de ello mediante la administración a un individuo de una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de C9ORF72.
En un caso, la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de C9ORF72 se acompaña de la monitorización de los niveles de C9ORF72 en un individuo, para determinar la respuesta de un individuo a la administración del compuesto antisentido. La respuesta de un individuo a la administración del compuesto antisentido puede usarse por un médico para determinar la cantidad y la duración de la intervención terapéutica.
En ciertos casos, la administración de un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de C9ORF72 da como resultado la reducción de la expresión de C9ORF72 en por lo menos un 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 99%, o un intervalo definido por dos cualquiera de estos valores. En ciertos casos, la administración de un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de C9ORF72 da como resultado una función motora y respiración mejoradas en un animal. En ciertos casos, la administración de un compuesto antisentido de C9ORF72 mejora la función motora y la respiración en por lo menos un 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 99%, o un intervalo definido por dos cualquiera de estos valores.
En ciertos casos, las composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto antisentido dirigido a C9ORF72 se usan para la preparación de un medicamento para tratar a un paciente que padece o es susceptible a una enfermedad neurodegenerativa, incluyendo ELA y FTD.
Ciertas terapias de combinación
En ciertos casos, una o más composiciones farmacéuticas descritas en la presente se administran conjuntamente con uno o más de otros agentes farmacéuticos. En ciertos casos, uno o más de estos otros agentes farmacéuticos están diseñados para tratar la misma enfermedad, trastorno o afección que la una o más composiciones farmacéuticas descritas en la presente. En ciertos casos, uno o más de estos otros agentes farmacéuticos están diseñados para tratar una enfermedad, trastorno o afección diferente a la una o más composiciones farmacéuticas descritas en la presente. En ciertos casos, el uno o más de estos otros agentes farmacéuticos están diseñados para tratar un efecto secundario no deseado de una o más composiciones farmacéuticas descritas en la presente. En ciertos casos, una o más composiciones farmacéuticas descritas en la presente se administran conjuntamente con otro agente farmacéutico para tratar un efecto no deseado de ese otro agente farmacéutico. En ciertos casos, una o más composiciones farmacéuticas descritas en la presente se administran conjuntamente con otro agente farmacéutico para producir un efecto combinatorio. En ciertos casos, una o más composiciones farmacéuticas descritas en la presente se administran conjuntamente con otro agente farmacéutico para producir un efecto sinérgico.
En ciertos casos, una o más composiciones farmacéuticas descritas en la presente y uno o más agentes farmacéuticos de otros se administran al mismo tiempo. En ciertos casos, una o más composiciones farmacéuticas descritas en la presente y uno o más de otros agentes farmacéuticos se administran en momentos diferentes. En ciertos casos, una o más composiciones farmacéuticas descritas en la presente y uno o más de otros agentes farmacéuticos se preparan juntos en una única formulación. En ciertos casos, una o más composiciones farmacéuticas descritas en la presente y uno o más de otros agentes farmacéuticos se preparan por separado.
En ciertos casos, los agentes farmacéuticos que pueden administrarse conjuntamente con una composición farmacéutica descrita en la presente incluyen Riluzol (Rilutek), Lioresal (Lioresal) y Dexpramipexol.
En ciertos casos, los agentes farmacéuticos que pueden administrarse conjuntamente con un inhibidor específico de C9ORF72 descrito en la presente incluyen, pero no están limitados a, un inhibidor adicional de C9ORF72. En ciertos casos, el agente farmacéutico administrado conjuntamente se administra antes de la administración de una composición farmacéutica descrita en la presente. En ciertos casos, el agente farmacéutico administrado conjuntamente se administra después de la administración de una composición farmacéutica descrita en la presente. En ciertos casos, el agente farmacéutico administrado conjuntamente se administra al mismo tiempo que una composición farmacéutica descrita en la presente. En ciertos casos, la dosis de un agente farmacéutico administrado conjuntamente es la misma que la dosis que se administraría si el agente farmacéutico administrado conjuntamente se administrara solo. En ciertos casos, la dosis de un agente farmacéutico administrado conjuntamente es menor que la dosis que se administraría si el agente farmacéutico administrado conjuntamente se administrara solo. En ciertos casos, la dosis de un agente farmacéutico administrado conjuntamente es mayor que la dosis que se administraría si el agente farmacéutico administrado conjuntamente se administrara solo.
En ciertos casos, la administración conjunta de un segundo compuesto aumenta el efecto de un primer compuesto, de tal manera que la administración conjunta de los compuestos da como resultado un efecto que es mayor que el efecto de administrar el primer compuesto solo. En otros casos, la administración conjunta da como resultado efectos que son aditivos a los efectos de los compuestos cuando se administran solos. En ciertos casos, la administración conjunta produce efectos que son supra-aditivos de los efectos de los compuestos cuando se administran solos. En ciertos casos, el primer compuesto es un compuesto antisentido. En ciertos casos, el segundo compuesto es un compuesto antisentido.
EJEMPLOS
Divulgación no limitativa
Aunque se han descrito ciertos compuestos, composiciones y métodos descritos en la presente con especificidad de acuerdo con ciertas realizaciones, los siguientes ejemplos sirven solo para ilustrar los compuestos descritos en la presente y no se pretende que limiten los mismos.
Ejemplo 1: inhibición antisentido de C9ORF72 humano en células HepG2
Se diseñaron oligonucleótidos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de C9ORF72 y se probaron para sus efectos sobre el ARNm de C9ORF72 in vitro. Los oligonucleótidos antisentido se probaron en una serie de experimentos que tenían condiciones de cultivo similares. Los resultados para cada experimento se presentan en tablas separadas mostradas a continuación. Las células HepG2 cultivadas a una densidad de 20.000 células por pocillo se transfectaron usando electroporación con oligonucleótido antisentido 7.000 nM. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 24 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de C9ORF72 por PCR cuantitativa en tiempo real. Se usó el conjunto de cebador sonda humano RTS3750 (secuencia directa TGTGACAGTTGGAATGCAGTGA, designada en la presente como SEQ ID NO: 15; secuencia inversa GCCACTTAAAGCAATCTCTGTCTTG, designada en la presente como SEQ ID NO: 16; secuencia de sonda TCGACTCTTTGCCCACCGCCA, designada en la presente como SEQ ID NO: 17) para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de C9ORF72 se ajustaron de acuerdo con el contenido de ARN total, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de C9ORF72, con respecto a las células de control no tratadas.
Los oligonucleótidos antisentido en las Tablas 6-8 se diseñaron como gapmers MOE 5-10-5. Los gapmers tienen una longitud de 20 nucleósidos, en donde el segmento de hueco central comprende diez 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala tanto en el extremo 5' como en el extremo 3' que comprenden cinco nucleósidos cada uno. Cada nucleósido en el segmento de ala 5' y cada nucleósido en el segmento de ala 3' tiene una modificación MOE. Los enlaces internucleosídicos en cada gapmer son enlaces de fosforotioato. Todos los residuos de citosina en cada gapmer son 5-metilcitosinas. El "sitio de inicio" indica el nucleósido más 5' al que está dirigido el oligonucleótido antisentido en la secuencia del gen humano. El "sitio de parada" indica el nucleósido más 3' al que está dirigido el oligonucleótido antisentido en la secuencia del gen humano. Cada oligonucleótido antisentido enumerado en las Tablas 6-7 está dirigido o a la secuencia de ARNm de C9ORF72 humano, designada en la presente como SEQ ID NO: 1 (N° de registro GENBANK NM_001256054.1) o la secuencia genómica de C9ORF72 humano, designada en la presente como SEQ ID NO: 2 (el complemento del N° de registro GENBANK NT_008413.18 truncado de los nucleósidos 27535000 a 27565000), o ambos. 'n/a' indica que el oligonucleótido antisentido no se dirigió a esa secuencia génica particular. Los oligonucleótidos antisentido de la Tabla 8 están dirigidos o a la SEQ ID NO: 3 (N° de registro de GENBANK BQ068108.1) o a la SEQ ID NO: 4 (N° de registro de GENBANK NM_018325.3).
Tabla 6
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Tabla 7
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Tabla 8
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Ejemplo 2: inhibición antisentido dependiente de la dosis de C9ORF72 humano en células HepG2
Se seleccionaron los oligonucleótidos antisentido del estudio descrito anteriormente que mostraban una inhibición in vitro significativa del ARNm de C9ORF72 y se probaron a varias dosis en células HepG2. Los oligonucleótidos antisentido se probaron en una serie de experimentos que tenían condiciones de cultivo similares. Los resultados para cada experimento se presentan en tablas separadas que se muestran a continuación. Las células se colocaron en placas a una densidad de 20.000 células por pocillo y se transfectaron usando electroporación con concentraciones de oligonucleótido antisentido de 82,3 nM, 246,9 nM, 740,7 nM, 2.222,2 nM, 6.666,7 nM o 20.000 nM. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles del ARNm de C9ORF72 por PCR cuantitativa en tiempo real. Se usó el conjunto de cebador sonda de C9ORF72 humano RTS3750 para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de C9ORF72 se ajustaron de acuerdo con el contenido de ARN total, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de C9ORF72,
En la Tablas 9-10 también se presenta la concentración inhibidora máxima media (IC50) de cada oligonucleótido. Como se ilustra, los niveles de ARNm de C9ORF72 se redujeron de una manera dependiente de la dosis en las células tratadas con oligonucleótidos antisentido.
Tabla 9
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Tabla 10
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Ejemplo 3: inhibición antisentido dependiente de la dosis de C9ORF72 humano en células HepG2
Se seleccionaron oligonucleótidos antisentido del estudio descrito anteriormente que mostraban una inhibición in vitro significativa del ARNm de C9ORF72 y se probaron a varias dosis en células HepG2. Los oligonucleótidos antisentido se probaron en una serie de experimentos que tenían condiciones de cultivo similares. Los resultados para cada experimento se presentan en tablas separadas mostradas a continuación. Las células se colocaron en placas a una densidad de 20.000 células por pocillo y se transfectaron usando electroporación con concentraciones de oligonucleótido antisentido de 246,9 nM, 740,7 nM, 2.222,2 nM, 6.666,7 nM o 20.000 nM. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm total de C9ORF72, así como los niveles de ARNm de la transcripción del exón 1, mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se usó el conjunto de cebador sonda de C9ORF72 humano RTS3750 para medir los niveles totales del ARNm de C9ORF72. Se uso el conjunto cebador sonda RTS3905 (secuencia directa GGGTCTAGCAAGAGCAGGTG, designada en la presente como SEQ ID NO: 18; secuencia inversa GTCTTGGCAACAGCTGGAGAT, designada en la presente como SEQ ID NO: 19; secuencia de sonda TGATGTCGACTCTTTGCCCACCGC, designada en la presente como SEQ ID NO: 20) para medir la transcripción del mensaje del exón 1. Los niveles de ARNm de C9ORF72 se ajustaron de acuerdo con el contenido de ARN total, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de C9ORF72, con respecto a las células de control no tratadas.
En las Tablas 11 y 12 también se presenta la concentración inhibidora máxima media (IC50) de cada oligonucleótido. Como se ilustra, los niveles del ARNm de C9ORF72 se redujeron de una manera dependiente de la dosis en las células tratadas con oligonucleótidos antisentido. 'nd' indica que no hay datos para esa dosis particular.
Tabla 11
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Tabla 12
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Ejemplo 4: Efecto de la inhibición antisentido de C9ORF72 humano en fibroblastos primarios de pacientes con ElA
Los oligonucleótidos antisentido, de los estudios descritos anteriormente y dirigidos a varias regiones del gen de C9ORF72 (SEQ ID NO: 2), se probaron en fibroblastos primarios de pacientes con ELA. La localización objetivo de cada oligonucleótido antisentido se especifica en la Tabla 13 a continuación. Como se observa en la Tabla, varios de los oligonucleótidos antisentido se dirigen al intrón 1 y, por lo tanto, a la secuencia pre-ARNm de C9ORF72. El intrón 1 contiene una repetición de hexanucleótidos (GGGGCC), que se expande por lo menos a 30 repeticiones en una célula patógena (Renton et al., Neuron, 2011,72, 257-268).
Tabla 13
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El efecto del tratamiento del oligonucleótido antisentido dirigido a C9ORF72 se evaluó en fibroblastos primarios derivados de pacientes con ELA. Los fibroblastos primarios derivados de biopsia de piel de un paciente humano con ELA (laboratorio del Dr. John Ravits) se colocaron en placas en medio DMEM suplementado con suero bovino fetal al 20%. Las células se trataron con los oligonucleótidos antisentido dirigidos a C9ORF72 a una concentración de 25 nM durante 4 h. Se trató un conjunto de células con un oligonucleótido de control (control ASO), sin objetivo humano conocido, y sirvió como control negativo. Después de 24 horas de transfección, las células se recogieron en reactivo TriZol para cuantificación del ARN, o se fijaron con paraformaldehído al 4% para hibridación in situ.
Análisis de ARN
Se recogieron las células y se analizaron los niveles de ciertas variantes de ARNm de C9ORF72, así como del ARNm de C9ORF72 total. Las variantes de ARNm medidas fueron SEQ ID NO: 1 (variante 3) y SEQ ID NO: 6 (variante 2). Como se presenta en las Tablas 1 y 3 enumeradas anteriormente, las SEQ ID NO 1 y 6 codifican porciones de la secuencia de C9ORF72 que incluyen el intrón 1. Debido a que el intrón 1 incluye la repetición de hexanucleótidos, la reducción de los niveles de ARNm de estas variantes es terapéutica en las células patógenas (células que contienen expansiones de repetición de hexanucleótidos de más de 30 repeticiones). Ciertas otras variantes de ARNm no incluyen la repetición de hexanucleótidos; por ejemplo, la SEQ ID NO: 4. Por lo tanto, es posible inhibir preferencialmente ciertas variantes de C9ORF72 diseñando oligonucleótidos antisentido para dirigirse a ciertas regiones del ácido nucleico de C9ORF72 objetivo, como, por ejemplo, el intrón 1.
Se midieron los niveles de la SEQ ID NO: 1 y 6 (variantes 3 y 2, respectivamente) en combinación mediante el conjunto de cebador sonda RTS3905, que se dirige al exón 1. El nivel de ARNm de C9orf72 total se midió mediante el conjunto de cebador sonda RTS3750, que se dirige al exón 2. Los datos se presentan en la Tabla 14. En comparación con el control PBS, Isis 577061 e Isis 577065 (cada uno dirigido a intrón 1) redujeron la expresión de la variante de ARN 2/3 en más del 90% y redujeron el ARN total en un 18% y un 8%, respectivamente. Isis 577083 (dirigido al intrón 1), Isis 576816 (dirigido al exón 2), Isis 576860 (dirigido al exón 5) e Isis 576974 (dirigido al exón 11) lograron entre un 75% y un 96% de inhibición de la expresión de la variante de ARN 2/3 y la expresión del ARN total. El control ASO no inhibió significativamente los niveles de ARN, como se esperaba.
Tabla 14
Figure imgf000034_0001
Análisis de los focos de ARN de C9ORF72
En años recientes, la acumulación intracelular de repeticiones de nucleótidos expandida como focos de ARN en el núcleo de las células afectadas ha aparecido como un mecanismo de enfermedad importante en pacientes con demencia frontotemporal y ELA (DeJesus-Hernandez, M. et al., Neuron. 2011. 72: 245 -56). Los focos nucleares de C9ORF72 se detectaron usando FISH con (5'TYE563-CCCCGGCCCCGGCCCC) (SEQ ID NO: 23) sonda de LNA (Exiqon). Los datos para el porcentaje de células con focos se presentan en la Tabla 15. Los resultados indican que los oligonucleótidos antisentido dirigidos al ARN de C9ORF72 disminuyeron el porcentaje de células que contenían focos de ARN de C9ORF72.
Se detectan focos de ARN individuales y múltiples en fibroblastos de pacientes. Se contaron los números de células con focos individuales o múltiples de fibroblastos que fueron tratados con ISIS 576816 o el control ASO. Los datos se presentan en la Tabla 16 e indican que el oligonucleótido antisentido dirigido a C9ORF72 redujo el número de focos por célula en comparación con el control ASO.
Tabla 15
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Tabla 16
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Ejemplo 5: Efecto de la inhibición de ARNip de C9ORF72 humano en fibroblastos primarios de pacientes con ELA
Se obtuvieron ARNip dirigido a C9ORF72 y ARNip de control dirigido a GAPDH se obtuvieron de Thermo Scientific Dharmacon (On-Target más Smartpool). Se evaluó el efecto del tratamiento de ARNip en fibroblastos de pacientes con ELA.
Los fibroblastos primarios derivados de una biopsia de piel de pacientes humanos con ELA se colocaron en placas en medio DMEM suplementado con suero bovino fetal al 20%. Las células se trataron con el ARNip dirigido a C9ORF72 a una concentración de 40 nM durante 4 horas. También se trató un conjunto de células con ARNip dirigido a GAPDH a una concentración de 40 nM durante 4 horas y sirvió como control. Después de la transfección durante 24 horas, las células se recogieron en reactivo TriZol para cuantificación de ARN, o se fijaron con paraformaldehído al 4% para hibridación in situ.
Los niveles de ARN de C9ORF72 totales se midieron usando un conjunto de cebador (Directo: TCCTGTAATGGAACTGCTTTCA, designado en la presente como SEQ ID NO: 21; Inverso: GGTATCTGCTTCATCCAGCTTT, designado en la presente como SEQ ID NO: 22). El tratamiento con ARNip resultó en una inhibición del 73% de los niveles totales de ARN de C9ORF72 en comparación con el control.
Los focos nucleares de C9ORF72 se detectaron usando FISH con (5'TYE563-CCCCGGCCCCGGCCCC) (SEQ ID NO: 23) sonda de LNA (Exiqon). Los datos se presentan en la Tabla 17. Los resultados indican que el tratamiento con ARNip contra C9ORF72 no reduce los focos nucleares en los fibroblastos en comparación con el control.
Tabla 17
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Ejemplo 6: Inhibición y tolerabilidad in vivo de roedores con tratamiento de oligonucleótidos antisentido de C9ORF72
Para evaluar la tolerabilidad de la inhibición de la expresión de C9orf72 in vivo, se diseñaron y evaluaron oligonucleótidos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de C9orf72 murino en modelos de ratón y rata.
El ISIS 571883 se diseñó como un gapmer 5-10-5 MOE, de 20 nucleósidos de longitud, en el que el segmento de hueco central comprende diez 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en tanto el extremo 5' como en el extremo 3' que comprenden cinco nucleósidos cada uno. Cada nucleósido en el segmento de ala 5' y cada nucleósido en el segmento de ala 3' tiene una modificación MOE. Los enlaces internucleosídicos son enlaces de fosforotioato. Todos los residuos de citosina en todo el gapmer son 5-metilcitosinas. El ISIS 571883 tiene un sitio de inicio objetivo del nucleósido 33704 en la secuencia genómica murina de C9ORF72, designada en la presente como SEQ ID NO: 11 (el complemento del N° de registro de GENBANK NT_166289.1 truncado de los nucleósidos 3587000 a 3625000).
El ISIS 603538 se diseñó como un gapmer 5-10-5 MOE, de 20 nucleósidos de longitud, en el que el segmento de hueco central comprende diez 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en tanto el extremo 5' como en el extremo 3' que comprenden cinco nucleósidos cada uno. Cada nucleósido en el segmento de ala 5' y cada nucleósido en el segmento de ala 3' tiene una modificación MOE. Los enlaces internucleosídicos son o enlaces de fosforotioato o enlaces de éster de fosfato (Gs Ao Co Co Gs Cs Ts Ts Gs As Gs Ts Ts Ts Gs Co Co Ao Cs A; en donde 's' indica un enlace internucleósido de fosforotioato, 'o' denota un enlace de éster de fosfato; y A, G, C, T denotan los nucleósidos relevantes). Todos los residuos de citosina en todo el gapmer son 5-metilcitosinas. EL ISIS 603538 tiene un sitio de inicio objetivo del nucleósido 2872 en la secuencia de ARNm de C9ORF72 de rata,
Experimento en ratones 1
Se inyectaron a grupos de 4 ratones C57BL/6 50 gg, 100 gg, 300 gg, 500 gg o 700 gg de ISIS 571883 administrado mediante una inyección intracerebroventricular en bolo. Un grupo de control de cuatro ratones C57/BL6 se trató de manera similar con PBS. Los animales se anestesiaron con isofluorano al 3% y se colocaron en un marco estereotáctico. Después de esterilizar el sitio quirúrgico, se inyectaron a cada ratón -0,2 mm anteroposterior desde el bregma na d 3 mm dorsoventral al bregma las dosis mencionadas anteriormente de ISIS 571883 usando una jeringuilla Hamilton. La incisión se cerró con suturas. Se permitió que los ratones se recuperaran durante 14 días, después de lo cual los animales se sacrificaron de acuerdo con un protocolo humano aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales. Se recogieron el cerebro y el tejido de la médula espinal y se congelaron al instante en nitrógeno líquido. Antes de congelar, el tejido cerebral se cortó transversalmente en cinco secciones usando una matriz de cerebro de ratón.
Análisis de ARN
El ARN se extrajo de una sección del cerebro de 2-3 mm posterior al sitio de inyección, de la corteza frontal del cerebro y de la sección lumbar del tejido de la médula espinal para el análisis de la expresión del ARNm de C9orf72. La expresión del ARNm de C9orf72 se midió por RT-PCR. Los datos se presentan en la Tabla 18. Los resultados indican que el tratamiento con dosis crecientes de ISIS 571883 dio como resultado una inhibición dependiente de la dosis de la expresión del ARNm de C9orf72.
También se evaluó la inducción del marcador microglial AIF-1 como medida de la toxicidad del SNC. Los datos se presentan en la Tabla 19. Los resultados indican que el tratamiento con dosis crecientes de ISIS 571883 no dio como resultado aumentos significativos en la expresión de ARNm de AIF-1. Por lo tanto, la inyección de ISIS 571883 se consideró tolerable en este modelo.
Tabla 18
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Tabla 19
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Experimento en ratones 2
Se inyectaron a grupos de 4 ratones C57BL/6 cada uno 500 gg de ISIS 571883 administrados mediante una inyección intracerebroventricular en bolo en un procedimiento similar al descrito anteriormente. Un grupo de control de cuatro ratones C57/BL6 fueron tratados de manera similar con PBS. Los ratones se probaron en puntos temporales regulares después de la administración de ICV.
Análisis de comportamiento.
Se emplearon dos ensayos estándar para evaluar el comportamiento motor; el ensayo rotarod y el ensayo de fuerza de agarre. En el caso de los ensayos de rotarod, se midió el tiempo de latencia para caer. Los datos para los ensayos se presentan en las Tablas 20 y 21. Los resultados indican que no hubo cambios significativos en el comportamiento motor de los ratones como resultado de la inhibición antisentido de ISIS 571883 o debido a la inyección de ICV. Por lo tanto, la inhibición antisentido de C9orf72 se consideró tolerable en este modelo.
Tabla 20
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Tabla 21
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Experimento en ratas
A grupos de 4 ratas Sprague-Dawley cada uno se les inyectaron 700 gg, 1.000 gg o 3.000 gg de ISIS 603538 administrados mediante una inyección de bolo intratecal. Un grupo de control de cuatro ratas Sprague-Dawley se trató de manera similar con PBS. Los animales se anestesiaron con isofluorano al 3% y se colocaron en una estructura estereotáctica. Después de esterilizar el sitio quirúrgico, se inyectaron a cada rata 30 gl de solución de ASO administrada a través de un catéter intratecal de 8 cm a 2 cm en el canal espinal con un lavado de 50 gl. Se permitió que las ratas se recuperaran durante 4 semanas, después de lo cual los animales se sacrificaron de acuerdo con un protocolo humano aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales.
Análisis de ARN
El ARN se extrajo de una sección del cerebro de 2-3 mm posterior al sitio de inyección, de la corteza frontal del cerebro y de las secciones cervicales y lumbares del tejido de la médula espinal para el análisis de la expresión del ARNm de C9orf72. La expresión del ARNm de C9orf72 se midió por RT-PCR. Los datos se presentan en la Tabla 22. Los resultados indican que el tratamiento con dosis crecientes de ISIS 603538 dio como resultado una inhibición dependiente de la dosis de la expresión del ARNm de C9orf72.
También se evaluó la inducción del marcador microglial AIF-1 como medida de la toxicidad en el SNC. Los datos se presentan en la Tabla 23. Los resultados indican que el tratamiento con dosis crecientes de ISIS 603538 no produjo aumentos significativos en la expresión del ARNm de AIF-1. Por lo tanto, la inyección de ISIS 603538 se consideró tolerable en este modelo.
Tabl a 22
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Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto que comprende un oligonucleótido antisentido modificado que consiste de 12 a 30 nucleósidos enlazados, en el que el oligonucleótido antisentido modificado es por lo menos un 90% complementario a un ácido nucleico de C9ORF72, para su uso en el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa reduciendo el porcentaje de células con focos nucleares y/o reduciendo el número de focos nucleares por célula en un animal al que se ha identificado que tiene focos, en donde el oligonucleótido antisentido modificado comprende por lo menos un enlace internucleósido de fosforotioato, por lo menos una 5-metilcitosina, por lo menos un azúcar bicíclico o por lo menos un grupo 2'-O-metoxietilo.
2. El compuesto para el uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la enfermedad está asociada con la expansión de repetición de hexanucleótidos de C9ORF72.
3. El compuesto para el uso de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la enfermedad es cualquiera de esclerosis lateral amiotrófica (ELA), demencia frontotemporal (FTD), síndrome de degeneración corticobasal (CBD), síndrome de Parkinson atípico o degeneración olivopontocerebelosa (OPCD).
4. El compuesto para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que la secuencia de nucleobases del oligonucleótido antisentido modificado es 100% complementaria a una porción de igual longitud de un ácido nucleico de C9ORF72.
5. El compuesto para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que la secuencia de nucleobases del oligonucleótido antisentido modificado es complementaria a una expansión de repetición de hexanucleótidos, opcionalmente en donde la expansión de repetición de hexanucleótidos es cualquiera de GGGGCC, GGGGGG, GGGGGC o GGGGCG.
6. El compuesto para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el ácido nucleico de C9ORF72 tiene la secuencia de nucleobases de cualquiera de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, o SEQ ID NO: 10.
7. El compuesto para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el oligonucleótido antisentido modificado es un oligonucleótido de cadena sencilla.
8. El compuesto para el uso de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el oligonucleótido antisentido modificado de cadena sencilla comprende:
un segmento de hueco que consiste de desoxinucleósidos enlazados;
un segmento de ala 5' que consiste de nucleósidos enlazados;
un segmento de ala 3' que consiste de nucleósidos enlazados;
en donde el segmento de hueco está colocado inmediatamente adyacente a y entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3' y en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado.
9. El compuesto para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que el oligonucleótido antisentido modificado comprende por lo menos un enlace internucleosídico de fosforotioato.
10. El compuesto para el uso de acuerdo con la reivindicación 9, en el que cada enlace internucleosídico es un enlace internucleósido de fosforotioato.
11. El compuesto para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que el oligonucleótido antisentido modificado comprende por lo menos una 5-metilcitosina.
12. El compuesto para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el que el oligonucleótido antisentido modificado comprende por lo menos un nucleósido modificado que comprende un azúcar bicíclico.
13. El compuesto para el uso de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el azúcar bicíclico comprende un puente químico entre las posiciones 4' y 2' del azúcar.
14. El compuesto para el uso de acuerdo con la reivindicación 13, en el que el puente químico es a) 4'-CH(R)-O-2' y en el que R es metilo; b) 4'-CH(R)-O-2' y en el que R es H; o c) 4'-CH(R)-O-2' y en el que R es -CH2-O-CH3.
15. El compuesto para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en el que el oligonucleótido antisentido modificado comprende por lo menos un nucleósido modificado que comprende un grupo 2'-O-metoxietilo.
16. El compuesto para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-15, en donde el compuesto es un compuesto conjugado.
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Families Citing this family (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010064146A2 (en) 2008-12-02 2010-06-10 Chiralgen, Ltd. Method for the synthesis of phosphorus atom modified nucleic acids
IN2012DN00720A (es) 2009-07-06 2015-06-19 Ontorii Inc
WO2012039448A1 (ja) 2010-09-24 2012-03-29 株式会社キラルジェン 不斉補助基
RU2014105311A (ru) 2011-07-19 2015-08-27 Уэйв Лайф Сайенсес Пте. Лтд. Способы синтеза функционализованных нуклеиновых кислот
PT2872485T (pt) 2012-07-13 2021-03-05 Wave Life Sciences Ltd Grupo auxiliar assimétrico
WO2014062736A1 (en) 2012-10-15 2014-04-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for monitoring c9orf72 expression
US10443052B2 (en) 2012-10-15 2019-10-15 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions for modulating C9ORF72 expression
PT2906696T (pt) 2012-10-15 2019-12-16 Univ California Métodos para modular a expressão de c9orf72
KR20160062069A (ko) * 2013-10-11 2016-06-01 아이오니스 파마수티컬즈, 인코포레이티드 Ｃ９ｏｒｆ７２ 발현을 조절하기 위한 조성물
US11162096B2 (en) 2013-10-14 2021-11-02 Ionis Pharmaceuticals, Inc Methods for modulating expression of C9ORF72 antisense transcript
CN106068325B (zh) 2014-01-16 2021-07-09 波涛生命科学有限公司 手性设计
WO2016024205A1 (en) * 2014-08-15 2016-02-18 Pfizer Inc. Oligomers targeting hexanucleotide repeat expansion in human c9orf72 gene
US10793855B2 (en) 2015-01-06 2020-10-06 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions for modulating expression of C9ORF72 antisense transcript
WO2016167780A1 (en) 2015-04-16 2016-10-20 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions for modulating expression of c9orf72 antisense transcript
KR102104163B1 (ko) * 2015-04-16 2020-04-23 아이오니스 파마수티컬즈, 인코포레이티드 C9orf72 발현을 조절하기 위한 조성물
AU2016270587B2 (en) 2015-05-29 2020-12-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals having a disruption in a C9ORF72 locus
EP4285912A2 (en) 2015-09-25 2023-12-06 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modulating ataxin 3 expression
AU2016335032B2 (en) * 2015-10-05 2022-04-14 Proqr Therapeutics Ii B.V. Use of single-stranded antisense oligonucleotide in prevention or treatment of genetic diseases involving a trinucleotide repeat expansion
US11260073B2 (en) 2015-11-02 2022-03-01 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulating C90RF72
ES2933435T3 (es) 2016-04-13 2023-02-08 Ionis Pharmaceuticals Inc Métodos para reducir la expresión de C9ORF72
EP3518667A1 (en) 2016-09-30 2019-08-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals having a hexanucleotide repeat expansion in a c9orf72 locus
JOP20190104A1 (ar) 2016-11-10 2019-05-07 Ionis Pharmaceuticals Inc مركبات وطرق لتقليل التعبير عن atxn3
EP4035659A1 (en) 2016-11-29 2022-08-03 PureTech LYT, Inc. Exosomes for delivery of therapeutic agents
KR102636384B1 (ko) 2017-08-04 2024-02-14 스카이호크 테라퓨틱스, 인코포레이티드 스플라이싱을 조절하는 방법 및 조성물
WO2019032607A1 (en) * 2017-08-08 2019-02-14 Wave Life Sciences Ltd. OLIGONUCLEOTIDE COMPOSITIONS AND RELATED METHODS
EP3716767A4 (en) * 2017-10-24 2021-11-24 Sangamo Therapeutics, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATMENT OF RARE DISEASES
WO2019094694A1 (en) 2017-11-10 2019-05-16 University Of Massachusetts Compositions and methods for the treatment of expanded repeat-associated disorders
KR20210008497A (ko) 2018-05-09 2021-01-22 아이오니스 파마수티컬즈, 인코포레이티드 Atxn3 발현 감소용 화합물 및 방법
BR112021010660A2 (pt) 2018-12-06 2021-08-24 Biogen Ma Inc. Proteína de neurofilamento para guiar intervenção terapêutica sobre esclerose lateral amiotrófica
EP3732291A1 (en) 2018-12-20 2020-11-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Nuclease-mediated repeat expansion
KR20210135241A (ko) 2019-02-05 2021-11-12 스카이호크 테라퓨틱스, 인코포레이티드 스플라이싱을 조절하는 방법 및 조성물
KR20210135507A (ko) 2019-02-06 2021-11-15 스카이호크 테라퓨틱스, 인코포레이티드 스플라이싱을 조절하는 방법 및 조성물
JP2022519523A (ja) 2019-02-08 2022-03-24 デューポイント セラピューティクス， インコーポレイテッド 化合物の凝縮物に関連する特性を特性評価する方法およびその使用
EP4031876A1 (en) 2019-09-18 2022-07-27 Dewpoint Therapeutics, Inc. Methods of screening for condensate-associated specificity and uses thereof
EP4073251A1 (en) * 2019-12-13 2022-10-19 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Human chromosome 9 open reading frame 72 (c9orf72) irna agent compositions and methods of use thereof
WO2021159008A2 (en) 2020-02-07 2021-08-12 Maze Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treating neurodegenerative diseases
IL307305A (en) 2021-04-06 2023-11-01 Maze Therapeutics Inc Preparations and methods for the treatment of TDP-43 proteinopathy
WO2023108071A2 (en) * 2021-12-08 2023-06-15 Thomas Jefferson University Methods for amyotrophic lateral sclerosis
WO2023220740A2 (en) * 2022-05-12 2023-11-16 The Regents Of The University Of California Therapeutic crispr/cas9 gene editing approaches to the c9orf72 repeat expansion mutation in ipscs
WO2024077109A1 (en) 2022-10-05 2024-04-11 Maze Therapeutics, Inc. Unc13a antisense oligonucleotides and uses thereof

Family Cites Families (59)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2699808A (en) 1944-10-06 1955-01-18 Mark W Lowe Apparatus for peeling tomatoes
US2699508A (en) 1951-12-21 1955-01-11 Selectronics Inc Method of mounting and construction of mounting for low frequency piezoelectric crystals
US6582908B2 (en) 1990-12-06 2003-06-24 Affymetrix, Inc. Oligonucleotides
RU95114435A (ru) 1992-12-14 1997-05-20 Ханивелл Инк. (Us) Система с бесщеточным двигателем постоянного тока
US5801154A (en) 1993-10-18 1998-09-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of multidrug resistance-associated protein
US5656408A (en) 1996-04-29 1997-08-12 Xerox Corporation Coated carrier particles
JP3756313B2 (ja) 1997-03-07 2006-03-15 武 今西 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
US6770748B2 (en) 1997-03-07 2004-08-03 Takeshi Imanishi Bicyclonucleoside and oligonucleotide analogue
US6794499B2 (en) 1997-09-12 2004-09-21 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
AU9063398A (en) 1997-09-12 1999-04-05 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
US20030228597A1 (en) 1998-04-13 2003-12-11 Cowsert Lex M. Identification of genetic targets for modulation by oligonucleotides and generation of oligonucleotides for gene modulation
US5998148A (en) * 1999-04-08 1999-12-07 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of microtubule-associated protein 4 expression
CN102180924A (zh) 1999-05-04 2011-09-14 桑塔里斯制药公司 L-核糖-lna类似物
US6525191B1 (en) 1999-05-11 2003-02-25 Kanda S. Ramasamy Conformationally constrained L-nucleosides
USH2191H1 (en) 2000-10-24 2007-06-05 Snp Consortium Identification and mapping of single nucleotide polymorphisms in the human genome
US20050019915A1 (en) * 2001-06-21 2005-01-27 Bennett C. Frank Antisense modulation of superoxide dismutase 1, soluble expression
JP2005504020A (ja) 2001-07-03 2005-02-10 アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド ヌクレアーゼ耐性キメラオリゴヌクレオチド
CA2504694C (en) 2002-11-05 2013-10-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Polycyclic sugar surrogate-containing oligomeric compounds and compositions for use in gene modulation
WO2004044136A2 (en) 2002-11-05 2004-05-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions comprising alternating 2’-modified nucleosides for use in gene modulation
EP1560931B1 (en) 2002-11-14 2011-07-27 Dharmacon, Inc. Functional and hyperfunctional sirna
WO2004106356A1 (en) 2003-05-27 2004-12-09 Syddansk Universitet Functionalized nucleotide derivatives
ES2382807T3 (es) 2003-08-28 2012-06-13 Takeshi Imanishi Nuevos ácidos nucleicos artificiales del tipo de enlace N-O con reticulación
AU2004274021B2 (en) 2003-09-18 2009-08-13 Isis Pharmaceuticals, Inc. 4'-thionucleosides and oligomeric compounds
AU2005248147A1 (en) 2004-05-11 2005-12-08 Alphagen Co., Ltd. Polynucleotides for causing RNA interference and method for inhibiting gene expression using the same
ES2516815T3 (es) 2006-01-27 2014-10-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. Análogos de ácidos nucleicos bicíclicos modificados en la posición 6
AU2007249349B2 (en) 2006-05-11 2012-03-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. 5'-Modified bicyclic nucleic acid analogs
JP2010505432A (ja) 2006-10-09 2010-02-25 サンタリス ファーマ アー／エス Ｐｃｓｋ９を調節するためのｒｎａアンタゴニスト化合物
EP2125852B1 (en) 2007-02-15 2016-04-06 Ionis Pharmaceuticals, Inc. 5'-substituted-2'-f modified nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
AU2008260277C1 (en) 2007-05-30 2014-04-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-substituted-aminomethylene bridged bicyclic nucleic acid analogs
EP2173760B2 (en) 2007-06-08 2015-11-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Carbocyclic bicyclic nucleic acid analogs
CN101796062B (zh) 2007-07-05 2014-07-30 Isis制药公司 6-双取代双环核酸类似物
US8546556B2 (en) 2007-11-21 2013-10-01 Isis Pharmaceuticals, Inc Carbocyclic alpha-L-bicyclic nucleic acid analogs
WO2009100320A2 (en) 2008-02-07 2009-08-13 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bicyclic cyclohexitol nucleic acid analogs
WO2010019270A1 (en) 2008-08-14 2010-02-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of prion expression
EP2356129B1 (en) 2008-09-24 2013-04-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted alpha-l-bicyclic nucleosides
AT507215B1 (de) 2009-01-14 2010-03-15 Boehler Edelstahl Gmbh & Co Kg Verschleissbeständiger werkstoff
WO2010120820A1 (en) 2009-04-13 2010-10-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modulation of smn2 splicing
US9012421B2 (en) 2009-08-06 2015-04-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bicyclic cyclohexose nucleic acid analogs
EP2563921B1 (en) 2010-04-30 2016-11-23 Cellectis Method for modulating double-strand break-induced homologous recombination
DK3031920T3 (da) 2010-07-19 2019-10-14 Ionis Pharmaceuticals Inc Modulation af dystrofi myotonica-protein kinase (dmpk) ekspression
US20140050778A1 (en) 2010-12-28 2014-02-20 University Of Rochester Nucleic acid binding compounds, methods of making, and use thereof
EP3505528B1 (en) 2011-04-21 2020-11-25 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of hepatitis b virus (hbv) expression
WO2013030588A1 (en) 2011-08-31 2013-03-07 The University Of Manchester Method for diagnosing a neurodegenerative disease
US20140255936A1 (en) 2011-09-09 2014-09-11 Mayo Foundation For Medical Education And Research Detecting frontotemporal dementia and amyotrophic lateral sclerosis
EP2785729B1 (en) 2011-11-30 2020-11-04 Sarepta Therapeutics, Inc. Oligonucleotides for treating expanded repeat diseases
US9725716B2 (en) 2011-12-06 2017-08-08 Ohio State Innovation Foundation and Research Institute at Nationwide Children's Hospital Non-ionic, low osmolar contrast agents for delivery of antisense oligonucleotides and treatment of disease
RS56319B1 (sr) 2012-04-23 2017-12-29 Biomarin Tech Bv Oligonukleotidi koji moduliraju rnk sa poboljšanim karakteristikama za lečenje neuromišićnih poremećaja
US9984408B1 (en) 2012-05-30 2018-05-29 Amazon Technologies, Inc. Method, medium, and system for live video cooperative shopping
WO2014062736A1 (en) 2012-10-15 2014-04-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for monitoring c9orf72 expression
US10443052B2 (en) 2012-10-15 2019-10-15 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions for modulating C9ORF72 expression
PT2906696T (pt) 2012-10-15 2019-12-16 Univ California Métodos para modular a expressão de c9orf72
DK2948777T3 (da) 2013-01-22 2019-09-23 Deutsches Zentrum Fuer Neurodegenerative Erkrankungen E V Dipeptid-repeat-proteiner som terapeutisk mål i neurodegenerative sygdomme med hexanukleotid-repeat-udvidelse
KR20160062069A (ko) 2013-10-11 2016-06-01 아이오니스 파마수티컬즈, 인코포레이티드 Ｃ９ｏｒｆ７２ 발현을 조절하기 위한 조성물
EP2868746A1 (en) 2013-10-29 2015-05-06 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des Öffentlichen Rechts Micrornas modulating the effect of glucocorticoid signaling
DE102014204360A1 (de) 2014-03-10 2015-09-10 Ford Global Technologies, Llc Verfahren sowie Vorrichtung zur Abschätzung des Abstandes eines in Bewegung befindlichen Fahrzeuges von einem Objekt
WO2016024205A1 (en) 2014-08-15 2016-02-18 Pfizer Inc. Oligomers targeting hexanucleotide repeat expansion in human c9orf72 gene
US10538762B2 (en) 2014-10-14 2020-01-21 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Allele selective inhibition of mutant C9orf72 foci expression by duplex RNAS targeting the expanded hexanucleotide repeat
KR102104163B1 (ko) 2015-04-16 2020-04-23 아이오니스 파마수티컬즈, 인코포레이티드 C9orf72 발현을 조절하기 위한 조성물
US9778708B1 (en) 2016-07-18 2017-10-03 Lenovo Enterprise Solutions (Singapore) Pte. Ltd. Dual sided latching retainer for computer modules

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