CN103290010B - 与胎儿先天性心脏病相关的母体血清/血浆miRNA标志物mir-375及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程和生殖医学领域,公开了与胎儿先天性心脏病相关的母体血清/血浆miRNA标志物mir-375及其应用。该标志物为mi-375,该标志物能够很好地将胎儿先天性心脏病病例组和健康对照组区分开,对胎儿先天性心脏病早期诊断有很好的辅助作用。
Description
发明领域
本发明属于医学领域和基因工程,涉及与胎儿先天性心脏病相关的母体血清/血浆miRNA标志物mir-375及其应用。
背景技术
先天性心脏病(congenital heart disease,CHD)是指心脏和胸内大血管的结构畸形及其可能导致的功能性异常,它是胎儿及新生儿缺陷中最常见的一种。每年约有5‰-8‰的新生儿患有CHD,这一发生率是染色体异常的6倍,神经管缺陷的4倍。CHD患儿中大约有50%病情严重,在出生后需要接受数次的外科治疗,而且很多时候即使在有外科干预的条件下,死于CHD的新生儿仍占新生儿总死亡率的40%,其中20%死于出生后第一个月。因此,早期诊断、早起干预、及时合理治疗是减少CHD发病率和死亡率的关键,是亟待解决的重大科学问题。
目前早期诊断CHD的方式主要是胎儿超声心动图。据统计,该方法诊断CHD的灵敏性和特异性分别可以达到85%(95%CI,78-90%),99%(95%CI,98-100%)。尽管这一数据表明心超诊断CHD的水平很高,但该方法仍受到多方面的的限制。被检查者的肥胖程度、超声设备的分辨率、检查者的技术及经验等都可能会影响到检查的最终结果。因此,我们亟需发现更加明确而有效的生物标记物,对CHD做出辅助早期诊断,这将有助于早期干预,早起治疗,减少CHD的发生率,提高患儿的生存率。
miRNA是近年来分子生物学研究领域的一个热点,它是一类生物体内自然生成的小分子非编码RNA,其成熟状态长约19-23个核苷酸,具有高度保守性。miRNA通过参与调节其特异靶基因的表达,来控制蛋白的产生,调节发育时序,从而参与细胞的增殖,分化,代谢与凋亡,在机体生长发育及疾病发生过程中发挥重要作用。自从发现lin-4与let-7参与调控线虫时序发育以来,越来越多的miRNAs被人们发现,miRNAs与疾病的关系也已经成为研究的热点与重点。近年来,已经发现miRNAs通过负反馈基因的表达与乳腺癌,肺癌,胃癌,糖尿病,心脏病等的发病密切相关。
生物标记物是指能将机体的生理和病理状态区分开来的生物分子。筛选到可用于CHD早期发现、早期诊断的生物标志物可大大提高CHD患儿的临床治疗效果。最新数据显示心脏组织有其特异性的miRNAs,即这些miRNAs的表达水平与相同组织的正常细胞存在显著差异,而特征性的miRNAs异常表达可望成为用于CHD早期诊断的生物标志物,显示了美好的临床应用前景。
近年来研究证实,miRNAs能稳定存在于血清/血浆中,且含量丰富、易于定量检测,具有显著的疾病特异性。这些特点都使得运用定性和定量miRNA分子技术,将血清miRNA作为生物标志物比传统的标记方法将更加有效,为生物标记技术及疾病诊断开拓了新境界。
目前有关血清/血浆miRNA的来源还没有定论,有些研究者认为肿瘤患者血清/血浆中的miRNA来源于靶组织,但其表达变化与靶组织的一致性还有待探讨;也有研究者认为miRNA可以被选择性富集到“microparticles(MPs)”或“exosomes”中,由细胞以“microvesicles微泡”脱落的方式主动向外分泌。具有共识的意见是,组织/细胞来源的miRNA表达谱与血清/血浆来源的miRNA表达谱是两个不同的体系,二者的表达谱并不完全一致,也没有文献报导二者存在关联性。不同来源的miRNA表达谱中特定miRNA的表达不一定在相同时段发挥相同的调控作用,组织/细胞中表达的miRNA不一定在血清/血浆中具有同样的表达量。鉴于目前还没有用于CHD辅助早期诊断的较为稳定的生物标志物的现状,将母血清/血浆miRNA作为筛选CHD的生物标志物,并研制相应的辅助早期诊断试剂盒,具有广泛的科研价值和临床应用的前景。
发明内容
本发明的目的是针对上述技术问题,提出一种与CHD相关的母血清/血浆miRNA标志物。
本发明另一个目的是提供上述miRNA标志物的引物或探针。
本发明还有一个目的是提供上述miRNA标志物及其引物或探针在制备CHD辅助早期诊断中的应用。
本发明再一个目的是提供CHD辅助早期诊断试剂盒。
本发明人通过分离和研究怀有CHD胎儿的孕妇及与其孕周相匹配的怀有正常胎儿的孕妇对照血清/血浆中的miRNAs,并研制出可便于临床应用的CHD辅助诊断试剂盒,为CHD的筛查和早期诊断提供数据支持,为CHD的干预提供可能。本发明人首先建立统一标准的标本库和数据库:按照标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本,系统收集完整的人口学资料和临床资料。而后选择怀有CHD胎儿的孕妇病例及与其孕周相匹配的怀有健康胎儿的孕妇对照,应用RT-PCR、Realtime PCR方法、SOLiD测序技术等检测病例及对照22-28孕周母血清/血浆miRNA表达谱及含量,分析CHD病例和健康对照间母血清/血浆miRNA的共性和特性,筛选差异表达miRNAs,进行进一步验证。对已筛选的母血清/血浆差异表达的miRNAs在大样本人群中进行定量分析,确定CHD特异母血清/血浆miRNAs。最后根据CHD病例和健康对照的特异母血清/血浆miRNA开发miRNAs辅助早期诊断试剂盒。该诊断试剂盒包括这些母血清/血浆miRNAs及其相应探针,以及缓冲液、Taq酶等试剂。
本发明的目的是通过下列技术方案实现的:
一种与胎儿先天性心脏病相关的母体血清/血浆miRNA标志物,该标志物为mir-375:UUUGUUCGUUCGGCUCGCGUGA(SEQ ID No.1)。
所述的母体血清/血浆miRNA标志物的引物或探针。这些单独的引物或探针可以通过商业渠道购买获得,也可以在了解这些miRNA的序列之后由技术人员自行设计合成,根据已知miRNA序列设计合成引物或探针的方法为本领域技术人员熟知的方法。
所述的血清/血浆miRNA标志物的探针,该探针为Assay ID:000564。(探针Assay均购自美国ABI公司)
所述的母体血清/血浆miRNA标志物及其引物或探针在制备胎儿先天性心脏病辅助诊断试剂盒中的应用。
一种胎儿先天性心脏病辅助诊断试剂盒,该试剂盒用于检测母体血清/血浆中mir-375。
所述的诊断试剂盒,该试剂盒含有母体血清/血浆miRNA中mir-375的引物或探针。特别地,该探针为Assay ID:000564。
所述诊断试剂盒,其特征在于该试剂盒还可以包括检测反应常用的酶和试剂。具体可根据采用的检测技术确定,这些技术均可采用现有的检测血清/血浆miRNA的技术。
本发明的有益效果
血清/血浆miRNAs是一种新型生物标志物,区别于传统生物标志物,不仅稳定、微创、易于检测,且定量精确,将大大提高疾病诊断的敏感性和特异性,该类小分子RNA生物标志物的成功开发有助于CHD的辅助诊断。本发明通过SOLiD测序及实时荧光定量的方法,发现母体血清/血浆中与CHD相关的异常表达的miRNAs,揭示其在胎儿CHD早期诊断中的宝贵价值。本发明获得了胎儿CHD发病特异的母血清/血浆中的miRNAs标志物,并研制出由其及其引物或探针构成的辅助诊断试剂盒,为临床诊断、干预等提供了巨大的便利。该诊断试剂盒最大的优点即为操作简单,结果精确客观可靠,能够很好地将CHD病例组和健康对照组区分开,而且只需通过采集血液样本即可进行,无需其他组织样本,大大提高了临床应用的可能性与可行性,指导实践,投入实践。
附图说明
图1、显示怀有CHD胎儿的孕妇病例和怀有健康胎儿的孕妇对照的mir-375的表达箱式图。
图中:CHD:病例组,Control:对照组。
图2显示mir-375在病例组和对照组中的ROC曲线。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。
实施例1
1.试验材料:miVana PARIS kit,Taqman MicroRNAreverse transcription kit,Taqmangene expression mix,Taqman MicroRNA assay-hsa-mir-375(Assay ID:000564),taqmanMicroRNA assay-cel-mir-39(Assay ID:000200)均购自美国ABI公司。人工合成cel-mir-39成熟体购自Invitrogen公司(序列为:UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG(SEQ IDNo.2))。
2.样本收集和样本资料的整理:本发明人于2011年开始至今从南京市妇幼保健院收集了大量22-28孕周孕妇的外周血液样品(用于研究的血液样本采集、分装、保存条件均一致)。整理样本资料,发明人根据事先制订的统一标准从中选择了60例样本作为后续SOLiD测序及实时荧光定量PCR验证的实验样本:
(1)经胎儿超生心动图明确诊断胎儿为CHD的孕妇病例;
(2)采血前未接受任何干预处理;
(3)将与病例孕周匹配的怀有健康胎儿的孕妇作为对照。
3.提取总RNA(使用ABI公司的mirVana PARIS kit):
1)取400μl血清,加入等体积的2*变性液,立即混匀,将混合液冰上静置5min,后加入5μl浓度为10-4pmol/μl的人工合成cel-mir-39(外参,以标准化目的miRNA的表达量);
2)加入与上述混合液等体积的酸-酚即氯仿:震荡30-60s混匀,室温下以12000g/min离心5min,分离水相和有机相;
3)将上层水相转移到新的离心管中,记录下体积;
4)向上述离心管中加入1.25倍体积100%乙醇,彻底混匀;
5)按样本数量准备离心柱和收集管;
6)吸取700μl上述裂解液/乙醇混合液到离心柱中,室温离心1min直至混合液通过过滤柱(1000g/min)(若混合液体积大于700μl,则将离心后的滤液倒掉,加入剩余的混合液到同一过滤柱中,继续离心);
7)离心后倒掉滤液,向过滤柱中加入700μl miRNA Wash Solution1,室温下10000g/min离心1min,弃掉收集管中的滤液;
8)吸取500μl Wash Solution2/3(Wash Solution2/3是试剂盒里一种洗脱液的名称)到各过滤柱中,室温10000g/min离心1min,弃掉滤液;
9)重复步骤8;
10)滤液弃掉后,将过滤柱室温离心1min,10000g/min,除去残留液体;11)将所有过滤柱转移到新的收集管中,加入20μl预热的洗脱液,10000g离心1min,收集总RNA,冰上放置待用或-80℃保存。
4.下一代测序检测(从上述符合条件的60例样本中选取3例怀有CHD胎儿的孕妇病例和3例怀有健康胎儿的孕妇对照进行SOLiD测序,并获得相关结果):分别等量总RNA,用于小分子RNA文库构建。总RNA经15%PAGE变性胶电泳分离,将长度范围在17~24nt的小分子RNA切胶回收,纯化后的小分子RNA分别经5′接头和3′接头连接后经RT-PCR扩增,形成小分子RNA的cDNA文库,直接用于下一代测序。下一代测序采用SOLiD测序仪于东南大学分子与生物分子电子学实验室完成。SOLiD测序获得35nt序列,通过去接头、去低质量、去污染、统计序列长度分布等过程完成初级分析。将初级分析得到的序列进行分类注释,可以获得样品中包含的各组分及表达量信息。剩余的小分子RNA序列与miRNA数据库(Sanger miRBase14.0数据库)中人的miRNA序列进行比对,得到样品中已知miRNA的含量、首位点碱基分布及表达丰度等信息。
5.根据SOLiD测序结果,选择mir-22,mir-29c,mir-21,mir-221,mir-375,let-7a,mir-26a,mir-24,mir-27b,mir-19b,mir-15b等11个miRNAs设计逆转录和qRT-PCR的探针(探针ID分别为Taqman MicroRNA assay-has-mir-22(Assay ID:000398),TaqmanMicroRNA assay-has-mir-29c(Assay ID:000587),Taqman MicroRNA assay-has-mir-21(Assay ID:000397);Taqman MicroRNA assay-has-mir-221(Assay ID:000524),TaqmanMicroRNA assay-has-mir-375(Assay ID:000564),Taqman MicroRNA assay-has-let-7a(Assay ID:000377),Taqman MicroRNA assay-has-mir-26a(Assay ID:000405),TaqmanMicroRNA assay-has-mir-24(Assay ID:000402),Taqman MicroRNAassay-has-mir-27b(Assay ID:000409),Taqman MicroRNA assay-hsa-mir-19b(Assay ID:000396),Taqman MicroRNA assay-has-mir-15b(Assay ID:000390),Taqman MicroRNAassay-cel-mir-39(Assay ID:000200),均购自美国ABI公司)。对“怀有CHD胎儿的孕妇病例”组和“怀有健康胎儿的孕妇对照”组母血清单个个体进行miRNA的实时荧光定量PCR检测。用探针法进行qRT-PCR检测,每个样本连续检测3次,对整个实验过程严格质控,并采用盲法,以避免偏倚出现。
6.探针法:使用ABI公司的逆转录试剂盒(Taqman MicroRNAreverse transcription kit+Taqman gene expression master mix+Taqman MicroRNA assay-hsa-mir-375+taqmanMicroRNA assay-cel-mir-39)
1)通过RNA逆转录反应得到cDNA。探针法的逆转录体系包括:dNTP mix0.15μl,RT酶1μl,10*RT Buffer1.5μl,RNA Inhibitor0.19μl,DEPC水4.16μl以及3μl mir-19的逆转录引物,再加入5μl事先提取的总RNA。逆转录反应热循环为16℃孵育30min,42℃孵育30min,85℃孵育5min,4℃孵育10min;
2)q-PCR:探针法的q-PCR的反应体系包括:cDNA1μl,mir-375的探针1μl,taqmangene expression master mix10μl及DEPC水8μl。反应步骤为95℃,5min进行一个循环→95℃、15s,60℃、1min进行45个循环,使用ABI Prism7500荧光定量PCR仪操作。
7.数据处理与分析
7.1样本的人口学及临床特征运用student t检验进行分析。
7.2SOLiD测序:病例组目的miRNA的相对表达量(H2)与对照组目的miRNA的相对表达量(H1)的比值大于2者进行探针法qRT-PCR验证实验。(其中hsa-mir-375的H2/H1=3.029。)
7.3探针法qRT-PCR验证试验数据分析:
1)我们用方程2-△△Ct表示两组样本血清miRNAs的相对表达量,其中△△Ct=△CT 病例-△CT对照-△CTcel-mir-39,我们在每个样本提取RNA时加入人工合成的cel-mir-39的成熟RNA作为参照,计算母血清/血浆中miRNAs的相对表达量。以上数据,即Ct值(扩增循环数)均可用荧光定量检测仪配带的检测软件阅读出。最后数据均用SPSS17.0进行统计分析。
2)结果发现在27例CHD病例与27例匹配的健康对照中,mir-375在CHD病例组的母血清中表达高于对照组,该结果具有显著统计学意义(见表1,图1)。
3)母血清/血浆mir-375对胎儿CHD的诊断效率,绘制ROC曲线(Receiver OperatingCurve)计算AUC(Area Under the ROC Curve)(见图2)。显示mir-375以69.3%的AUC将健康对照组和CHD病例组分开,最佳临界点的灵敏度为55.6%,特异度:85.2%。
表1在27例病例组和27例对照组中的验证结果
*Mann-Whitney检验;#△CT=CT病例-CT外参
Claims (3)
1.母体血清/血浆中的mir-375在制备胎儿先天性心脏病辅助诊断试剂盒中的应用。
2.母体血清/血浆中的mir-375的引物或探针在制备胎儿先天性心脏病辅助诊断试剂盒中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于所述mir-375的探针为Assay ID:000564。
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The developmental genetics of congenital heart disease;Benoit G. Bruneau;《Nature》;20080821(第451期);第946页倒数第二段 * |
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